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特許7510360死滅したまたは不活化されたメタノブレビバクター古細菌（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞を含む組成物を調製するための方法およびそれによって得られる組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-06-25
(45)【発行日】2024-07-03
(54)【発明の名称】死滅したまたは不活化されたメタノブレビバクター古細菌（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞を含む組成物を調製するための方法およびそれによって得られる組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 35/74 20150101AFI20240626BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240626BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20240626BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20240626BHJP
A61K 47/46 20060101ALI20240626BHJP
A61K 9/20 20060101ALI20240626BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240626BHJP
A23L 33/135 20160101ALI20240626BHJP
A23K 10/16 20160101ALI20240626BHJP
A23K 10/30 20160101ALI20240626BHJP
【ＦＩ】
A61K35/74 A
A61P29/00
A61P31/00
A61P1/04
A61K47/46
A61K9/20
A61P31/00 171
A61P43/00 171
A23L33/135
A23K10/16
A23K10/30
【請求項の数】
17
(21)【出願番号】P 2020573267
(86)(22)【出願日】2019-06-27
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-10-21
(86)【国際出願番号】 EP2019067236
(87)【国際公開番号】W WO2020002543
(87)【国際公開日】2020-01-02
【審査請求日】2022-06-24
(31)【優先権主張番号】18180236.4
(32)【優先日】2018-06-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】523327385
【氏名又は名称】アルカイヤ アーゲー
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】サザーランド、ダンカン － ブルース
【審査官】吉森 晃
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１８－５０９１６１（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００５／０１８０９６２（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特開２００５－１１０７９９（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１２／００３４１９８（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特開２０１７－０８１８３８（ＪＰ，Ａ）
【文献】Corinna BANG et al.，“The Intestinal Archaea Methanosphaera stadtmanae and Methanobrevibacter smithii Activate Human Dendritic Cells”，PLoS ONE，2014年06月10日，Vol. 9, No. 6，p.e99411，DOI: 10.1371/journal.pone.0099411
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３５／７４
Ａ６１Ｐ ２９／００
Ａ６１Ｐ ３１／００
Ａ６１Ｐ １／０４
Ａ６１Ｋ ４７／４６
Ａ６１Ｋ ９／２０
Ａ６１Ｐ ４３／００
Ａ２３Ｌ ３３／１３５
Ａ２３Ｋ １０／１６
Ａ２３Ｋ １０／３０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒトの食品／錠剤および／または動物の飼料／錠剤に組み込むための、弱毒化または死滅したメタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞を含む組成物を調製する方法であって、ａ）メタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞を収集すること；
ｂ）前記メタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞を、５～６０秒間の低温殺菌、凍結処理、赤外線照射または空気乾燥技術によって弱毒化または死滅させること；
ｃ）前記弱毒化または死滅したメタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞を凍結乾燥して、前記細胞を含む組成物を得ること
を含む、方法。
【請求項2】
前記弱毒化または死滅したメタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞が、宿主パターン認識受容体システムを介した微生物関連分子パターン（ＭＡＭＰ）のシグナル伝達能力を維持している、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記弱毒化または死滅したメタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞組成物を、植物由来の担体または従来の担体に添加し、前記植物由来の担体が、スピルリナ、クローバ、アルファルファ、ムラサキウマゴヤシ、オート麦、小麦、微細藻類、大型藻類、大麦、トウモロコシ、大豆、米、穀物、草、果物、野菜、および／またはそれらの抽出物もしくは混合物の中から選択されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記低温殺菌が、５０℃～８０℃の温度で５～６０秒間実施され、前記赤外線照射が、７５０ｎｍ～１ミリメートルの波長で実施される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記メタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞がメタノブレビバクター・スミシイ（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ ｓｍｉｔｈｉｉ）である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
対象における腸内病原体感染に対する耐性を改善するためおよび／または腸の炎症を減少させるための、弱毒化または死滅したメタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞を含む組成物であって、前記組成物が、前記組成物１グラム当たり少なくとも１０８個の弱毒化または死滅したメタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞を含むことを特徴とする、組成物。
【請求項7】
前記弱毒化または死滅したメタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞が、宿主パターン認識受容体システムを介した微生物関連分子パターン（ＭＡＭＰ）のシグナル伝達能力を維持している、請求項６に記載の組成物。
【請求項8】
対象における腸内病原体感染に対する耐性を改善するためおよび／または腸の炎症を減少させるための、弱毒化または死滅したメタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞を含む組成物であって、前記弱毒化または死滅したメタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞が、宿主パターン認識受容体システムを介した前記微生物関連分子パターン（ＭＡＭＰ）のシグナル伝達能力を維持していることを特徴とする、組成物。
【請求項9】
前記対象が、それを必要とする動物またはヒト対象である、請求項６～８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項10】
前記動物が家畜である、請求項９に記載の組成物。
【請求項11】
前記動物が鳥、哺乳動物または水生動物である、請求項９または１０に記載の組成物。
【請求項12】
前記組成物が、前記対象の１キログラム当たりおよび１日当たり、少なくとも１０９個の弱毒化または死滅したメタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞の投与量で投与される、請求項６～１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項13】
前記メタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞が、メタノブレビバクター・スミシイ（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ ｓｍｉｔｈｉｉ）である、請求項６～１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項14】
動物対象のワクチン接種治療と組み合わせた、請求項６～１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項15】
前記腸の炎症の軽減が、ヒトまたは動物対象における炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に対する感受性を低下させることを含む、請求項６～１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項16】
前記腸の炎症の軽減が、ヒトまたは動物対象における感染によって引き起こされる免疫病理および疾患の重症度を軽減することを含む、請求項６～１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項17】
前記腸内病原体感染に対する耐性が、ヒトまたは動物対象における自然免疫バリア機能を促進すること、および寄生虫感染に対する感受性を低下させることを含む、請求項６～１４のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、対象における腸内病原体感染に対する耐性を改善するため、および／または腸の炎症を軽減するために、食品／飼料／錠剤に高用量で組み込むための培養されたメタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ ａｒｃｈａｅａ）を濃縮および不活化する方法に関する。動物対象のワクチン接種治療と組み合わせて、ヒトの炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に対する感受性を低下させる方法において、感染症によって引き起こされる免疫病理および疾患の重症度を軽減するための方法において、ならびに動物またはヒト対象において自然免疫バリア機能を促進し、寄生虫感染症に対する感受性を低下させるための方法において、使用するための組成物も開示される。
【背景技術】
【0002】
プロバイオティクスは、食事補助剤として摂取した場合、免疫系および代謝機能の改善を含む健康上の利益をレシピエントに与える生きた微生物である。消化と免疫学的健康状態を支持する微生物の密な共生群集は、脊椎動物の腸にコロニーを形成する。進化を通して、共生微生物はそれらの微小環境内に共局在することが公知であり、集合的に微生物叢と称され、例えば、反芻動物（例えばウシ）では、酵母、セルロース分解細菌および古細菌を含む、腸内の繊維消化を促進する微生物がルーメンに共局在する。飼料に添加された古細菌プロバイオティクスは、微生物叢の機能を支持することに優れている。
【0003】
例えば、国際公開第２０１６／１４７１２１ Ａ１号（ＥＣＯＬＥ ＰＯＬＹＴＥＣＨＮＩＱＵＥ ＦＥＤＥＲＡＬＥ ＤＥ ＬＡＵＳＡＮＮＥ）は、動物の飼料のプロバイオティクス補助剤として使用される古細菌、特にメタン生成古細菌（Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）を含む、またはそれらからなる栄養補助食品を開示する。サプリメントは、標準的な飼料に加えて、または食品組成物として、例えば畜産動物に提供することができる。そのようなサプリメントは、水産養殖で特に有用であり、動物の成長率を高め、寄生虫感染に対する動物の感受性を低減し、および／または環境への動物の糞便廃棄物の影響を改善できることが証明されている。生物活性食品サプリメントを含む組成物を製造する方法およびその使用も包含される。
【0004】
メタノブレビバクター属（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）（Ｍｂｂ）古細菌は、多くの草食脊椎動物にとって腸内細菌叢の重要な割合を構成する。健康なヒトでは、メタノブレビバクター・スミシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ ｓｍｉｔｈｉｉ）が、大腸に存在する嫌気性微生物叢の約１０％を占める。Ｍｂｂは、セルロース分解細菌によって生成された水素を代謝してメタンガスを生成し、セルロース消化微生物叢が繁殖するために必要な「水素シンク」を生成する。したがって、メタンを生成するＭｂｂは、草食動物（特に反芻動物）の食餌代謝において重要な役割を果たす。
【0005】
共生腸内細菌叢が健康な宿主の免疫系によって寛容されることは十分に確立されている。共生微生物叢は腸の免疫恒常性を促進する。これは、炎症および病理を誘発する病原性微生物とは対照的である。
【0006】
Ｍｂｂは草食動物の腸内細菌叢の主成分であるため、Ｍｂｂと宿主の免疫系は、おそらく、免疫寛容と腸の恒常性を促進するような方法で進化を通して共適応している。国際公開第２０１６／１４７１２１ Ａ１号は、以前にＭｂｂの有益な免疫調節特性を明らかにした。したがって、プロバイオティクスまたは食品／飼料サプリメントとしてのＭｂｂの使用は、免疫系の機能を改善することができる。
【0007】
欧州特許第２２５１ ０１７ Ａ１号（ＣＥＤＡＲＳ ＳＩＮＡＩ ＭＥＤＩＣＡＬ ＣＥＮＴＥＲ）および米国特許第６，３２８，９５９ Ｂ１号（Ｋａｙａｒ Ｓ．ｅｔ ａｌ．）は、特定の状況でのメタン生成の利点を記載しており、特にメタン生成菌送達を使用したメタン生成について報告している。
【0008】
米国特許第２０１２／０３４１９８ Ａ１号（Ｇａｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．）は、乾燥微生物の投与および保存のための方法および製剤を記載する。微生物の投与および保存のためのプレバイオティクス製剤を含む微生物ベースの製品が開示されている。これらのプレバイオティクス製剤は、動物またはヒトの対象への投与のために作用することができ、乾燥微生物を保存または貯蔵するように作用することができる。特に、周囲温度および３７℃での保存中の凍結乾燥された乳酸菌を保護するための方法が記載されている。
【0009】
ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種は、病原菌の増殖を阻害し、胃腸の免疫機能を高めることによって、ヒトの健康と福利および動物の健康と生産性を高めることができるため、プレバイオティクスとして広く使用されている。プロバイオティクス化合物は、プレバイオティクス細菌と一緒に投与することができ、好ましくはプレバイオティクス細菌によって代謝されるため、プレバイオティクス細菌による胃腸管のコロニー形成を刺激することができる。ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種をプレバイオティクスとして使用するために、重要なプロセスは、例えば遠心分離および凍結乾燥または低温での保存による細菌の濃縮である。輸送、棚保管などを含むプレバイオティクスとしての実際の使用のためには、室温および３７℃までの温度でのインキュベーション中、ならびにプロバイオティクスとしてのフラクトオリゴ糖および乾燥細菌を凍結するための流動剤としてのステアリン酸カルシウムを添加することによって、微生物が生存能力を維持することが重要である。著者らは、いくつかのラクトバチルス種を用いた実験で、これらの成分の添加が、高温でのインキュベーション中のこれらの細菌の生存能力を高めることを示した。ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種は発酵性の中程度の嫌気性菌であるが、酸素に対する耐性が、無菌培養で少量の酸素に極めて感受性であるメタン生成菌よりもはるかに高いため、嫌気性チャンバおよびガス処理マニホールドのような特定の機器なしで取り扱うおよびプレートすることができる。したがって、標準的な条件を使用したメタン生成菌の凍結乾燥がメタン生成菌の保存方法として機能することは期待できない。５％グルコースおよび３ｍｇ／ｍｌの硫化鉄を添加したウマ血清での凍結乾燥とそれに続く８℃または－７０℃での保存は、メタノバクテリウム科（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）の一部の種を保存する方法として報告されているが、メタノコッカス属（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）およびメタノスピリルム属（Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）では良好に機能しなかった（Ｔｈｅ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．２０１４，ｐｐ．１２３－１６３，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ ＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇにおいてＷｈｉｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．によって総説されている）。
【0010】
米国特許第２０１６／０７４４４０ Ａ１号（Ｂｒｕｇｅｒｅ ｅｔ ａｌ．）は、腸または膣などのヒトの体腔のレベルでトリメチルアミン（ＴＭＡ）を治療、低減または排除するための薬剤として使用するための、ＴＭＡメチルトランスフェラーゼおよびＴＭＡメチル基アクセプタコリノイドタンパク質を発現する微生物、好ましくは古細菌を含み、ヒトの体腔において水素の存在下でＴＭＡを代謝することができる組成物を開示する。さらに、ＴＭＡメチルトランスフェラーゼおよびＴＭＡメチル基アクセプタコリノイドタンパク質を含む組成物。これらの組成物は、トリメチルアミン尿症を治療するため、細菌性膣症の場合に膣液を治療するため、およびＴＭＡによる臭気を低減または除去するために使用される。これらの組成物はまた、血漿ＴＭＡＯのレベルを低下させるため、アテローム斑の形成を防止するため、および／または心血管疾患を予防するために有用である。特に、Ｂｒｕｇｅｒｅ ｅｔ ａｌ．は、生きているＭｂｂ古細菌（特にトリメチルアミン（ＴＭＡ）を代謝できるＴＭＡメチルトランスフェラーゼ）の代謝機能を利用して、膣症および治療のためにＴＭＡを代謝する必要がある他の医学的状態を治療できることを示している。
【0011】
Ｃｏｒｉｎｎａ Ｂａｎｇ ｅｔ ａｌ．“Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ａｒｃｈａｅａ Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ ｓｔａｄｔｍａｎａｅ ａｎｄ Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ ｓｍｉｔｈｉｉ Ａｃｔｉｖａｔｅ Ｈｕｍａｎ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ”ＰＬＯＳ ＯＮＥ Ｖｏｌ．９，ｎｏ ６，Ｅ９９４１１，１０ Ｊｕｎｅ ２０１４（ＸＰ０５５５９０６５４）は、生きている古細菌Ｍ．スタットマナエ（Ｍ．ｓｔａｄｔｍａｎａｅ）およびＭ．スミシイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ）が、ヒト樹状細胞におけるＴＮＦ－ａおよびＩＬ－１ｂ分泌を刺激できることを示す（２×１０５ ｍｏＤＣの２０時間刺激とそれに続くＥＬＩＳＡ検出法）。この試験の古細菌細胞は、不活化されていない生細胞である。この試験は、炎症反応を阻害するＭｂｂ古細菌細胞能力の実証していない。
【0012】
Ｍｂｂを生のプロバイオティクスまたは食品／飼料サプリメントとして使用することの潜在的な負の副作用は、メタンガスの過剰な生成である。胃腸管での過度の鼓腸またはメタンの蓄積は、動物またはヒト消費者にとって望ましい作用ではない。例えば、Ｕｄａｙ Ｃ Ｇｈｏｓｈａｌ ｅｔ ａｌ．“Ｓｌｏｗ Ｔｒａｎｓｉｔ Ｃｏｎｓｔｉｐａｔｉｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｅｘｃｅｓｓ Ｍｅｔｈａｎｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ Ｒｉｆａｘｉｍｉｎ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｃａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔ”ｉｎ Ｊ．Ｎｅｕｒｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｍｏｔｉｌ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎ ２０１１ Ａｐｒ．２７：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ３０９３０１２／およびＡｔｔａｌｕｒｉ Ａ．ｅｔ ａｌ．“Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｃ ｆｌｏｒａ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｌｔｅｒｅｄ ｃｏｌｏｎｉｃ ｔｒａｎｓｉｔ ｂｕｔ ｎｏｔ ｓｔｏｏｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｉｎ ｃｏｎｓｔｉｐａｔｉｏｎ ｗｉｔｈｏｕｔ ＩＢＳ”Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２０１０ Ｊｕｎｅ；１０５（６）：１４０７－１１：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／１９９５３０９０は、排便に関連する過剰なメタンの難点を強調している。
【0013】
農業の場合、メタンは地球温暖化の原因となる問題のある温室効果ガスである。したがって、免疫系の機能を支持するためにＭｂｂを使用することの重要な難点は、望ましくない過剰なメタン生成である。
【0014】
動物の飼料中の組成物１グラム当たり１０５～１０８のプロバイオティクスサプリメントとして使用された場合の生きた腸古細菌は、成長速度を改善し、免疫系機能を改善することが示されている。
【0015】
古細菌のプロバイオティクスサプリメントの免疫刺激特性は用量反応性であるが、高微生物バイオマスの非効率的な培養は、飼料および食品への適用のための高用量の使用を制限する。食品および飼料産業のために腸内古細菌を富化するより効率的な手段は、依然として重要なイノベーションギャップである。第二に、加工食品／飼料中のプロバイオティクスの生存能力を確保することは、品質管理および認証プロセスに課題をもたらす。したがって、免疫刺激効力を高め、品質管理の容易さを改善する方法は、食品／飼料でのヒトおよび動物の消費のための古細菌ベースのサプリメントの主要な障壁のままである。
【0016】
レシピエントにおいてメタン副産物を増加させることなくＭｂｂの免疫調節効果を可能にする技術的解決策が必要とされている。対象における腸内病原体感染に対する耐性または腸の炎症の減少などの免疫調節効力を高めることも望ましい。したがって、とりわけ、これらの技術的問題を克服することが本発明の目的である。
【発明の概要】
【0017】
興味深いことに、出願人は、腸内古細菌の免疫調節特性が、腸内古細菌の生存能力に一意的に依存するわけではないことを観察した；その代わりに、出願人は、非生存メタノブレビバクター（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）（Ｍｂｂ）古細菌に存在する微生物関連分子パターン（ＭＡＭＰ）も、食品および飼料に組み込まれた場合に免疫原性であると認められることを観察した。腸内古細菌は厳密に嫌気性であり、酸素の存在下では成長しないが、いくつかの菌株は空気耐性であると報告されている。古細菌は、極限条件下で生き残ることを可能にする別個の細胞機能を適応させた。したがって、腸内メタノブレビバクター（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）古細菌を不活化するために必要な治療条件は不明なままである。免疫原性ＭＡＭＰを維持しながらメタノブレビバクター（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）古細菌を不活化する方法は、食品／飼料でのヒトおよび動物の消費のための古細菌ベースのサプリメントを実現するために必要な品質管理を容易にする。さらに、先行技術では、Ｍｂｂ古細菌の不活化閾値は検討されていないと考えられる。
【0018】
本明細書で、出願人は、ＭＡＭＰを維持する方法で、空気、熱または赤外線照射曝露の組合せを使用して、得られた濃縮バイオマスを不活化する方法を説明する。濃縮された不活化古細菌製剤が飼料組成物１グラム当たり１０５～１０１２古細菌細胞に相当する比率で飼料に含まれる場合、実験動物は、食餌療法または感染によって誘発される免疫病理、疾患および死亡に対して有意により耐性であった。
【0019】
本発明の１つの目的は、ヒトの食品／錠剤および／または動物の飼料／錠剤に組み込むための、不活化または死滅したメタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞を含む組成物を調製する方法を対象とし、この方法は、
ａ）メタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞の液体懸濁液を収集すること；
ｂ）前記液体懸濁液中の前記メタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞を不活化または死滅させること；
ｃ）前記液体懸濁液を凍結乾燥して、不活化または死滅したメタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞組成物を得ることであって、ここで、前記不活化または死滅したメタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞は、宿主のパターン認識受容体システムを介した微生物関連分子パターン（ＭＡＭＰ）のシグナル伝達能力の少なくとも８０％を維持していること、
を含む。
ａ）メタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞の液体懸濁液を収集すること；
ｂ）前記液体懸濁液中の前記メタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞を不活化または死滅させること；
ｃ）前記液体懸濁液を凍結乾燥して、不活化または死滅したメタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞組成物を得ることであって、ここで、前記不活化または死滅したメタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞は、宿主のパターン認識受容体システムを介した微生物関連分子パターン（ＭＡＭＰ）のシグナル伝達能力の少なくとも８０％を維持していること、
を含む。
【0020】
本発明の別の目的は、対象における腸内病原体感染に対する耐性を改善するためおよび／または腸の炎症を減少させるための方法において使用するための、本発明の方法に従って得られる不活化または死滅したメタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞を含む組成物を提供することであり、前記不活化または死滅したメタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞は、宿主のパターン認識受容体システムを介した微生物関連分子パターン（ＭＡＭＰ）のシグナル伝達能力の少なくとも８０％を維持しており、および前記組成物は、前記組成物１グラム当たり少なくとも１０８個の不活化または死滅したメタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞を含む。
【0021】
本発明のさらなる目的は、
－動物対象のワクチン接種治療と組み合わせて；
－ヒトの炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に対する感受性を低下させる方法において；
－感染症によって引き起こされる免疫病理および疾患の重症度を軽減するための方法において；
－ヒトまたは動物対象において自然免疫バリア機能を促進し、寄生虫感染に対する感受性を低下させるための方法において
使用するための、本発明の方法に従って得られる不活化または死滅したメタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞を含む組成物を提供することであり、前記不活化または死滅したメタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞は、宿主のパターン認識受容体システムを介した微生物関連分子パターン（ＭＡＭＰ）のシグナル伝達能力の少なくとも８０％を維持しており、および前記組成物は、前記組成物１グラム当たり少なくとも１０８個の不活化または死滅したメタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞を含む。
－動物対象のワクチン接種治療と組み合わせて；
－ヒトの炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に対する感受性を低下させる方法において；
－感染症によって引き起こされる免疫病理および疾患の重症度を軽減するための方法において；
－ヒトまたは動物対象において自然免疫バリア機能を促進し、寄生虫感染に対する感受性を低下させるための方法において
使用するための、本発明の方法に従って得られる不活化または死滅したメタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞を含む組成物を提供することであり、前記不活化または死滅したメタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞は、宿主のパターン認識受容体システムを介した微生物関連分子パターン（ＭＡＭＰ）のシグナル伝達能力の少なくとも８０％を維持しており、および前記組成物は、前記組成物１グラム当たり少なくとも１０８個の不活化または死滅したメタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞を含む。
【0022】
本発明の他の目的および利点は、以下の例示的な図面および付随する特許請求の範囲を参照して進行する、次の詳細な説明の検討から当業者に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図1】図１は、Ｍ．スミシイ（Ｍ．Ｓｍｉｔｈｉｉ）がマス上皮細胞においてＬＰＳを介したＩＬ－１ｂ、ＴＮＦ－α、ＮＦ－ｋＢを阻害することを示す。各処理の３つの重複する生物学的複製物で測定された平均発現値と標準偏差が示されている。対照との統計的な有意な差（（ａ）＝陰性対照細胞培地との比較、（ｂ）＝陽性対照であるＬＰＳ ５０ｍｇ／ｌとの比較、および（ｃ）＝ＬＰＳ ５０ｍｇ／ｌ ６時間－Ｌ１５／ｅｘ ６時間との比較）を、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続くダネット検定（Ｐ＜０．０５）で決定した。試験項目Ａ）は凍結不活化Ｍ．スミシイ（Ｍ．Ｓｍｉｔｈｉｉ）古細菌抽出物を示し、Ｂ）は高温不活化Ｍ．スミシイ（Ｍ．Ｓｍｉｔｈｉｉ）古細菌抽出物を示す。
【図2】図２は、細菌の細胞壁構造と比較した古細菌の細胞壁構造を示す。図中の参照は次の通りである：１．古細菌（Ｍ．スミシイ）；２．古細菌脂質；３．細菌脂質；４．分岐イソプロペン鎖；５．非分岐脂肪酸；６．エーテル結合および７．エステル結合。
【図3】ＬＰＳが誘導するＮＦ－ｋＢ発現は、生きている不活化されたＭｂｂ古細菌抽出物によって阻害される。（Ａ）紫外線照射処理、得られたＭｂｂ古細菌抽出物はＬＰＳ誘導ＮＦ－ｋＢ発現を阻害しない；（Ｂ）生細胞＋ｖｅ対照、この試料はＬＰＳ誘導ＮＦ－ｋＢ発現を阻害する；（Ｃ）凍結処理、得られたＭｂｂ古細菌抽出物はＬＰＳ誘導ＮＦ－ｋＢ発現を阻害する；（Ｄ）７２℃で１５分の処理、得られたＭｂｂ古細菌抽出物はＬＰＳ誘導ＮＦ－ｋＢ発現を阻害しない；（Ｅ）８０℃で１分の処理、得られたＭｂｂ古細菌抽出物はＬＰＳ誘導ＮＦ－ｋＢ発現を阻害する。
【図4】エルシニア・ルッケリ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｒｕｃｋｅｒｉ）に感染した魚の累積死亡率
【発明を実施するための形態】
【0024】
本明細書に記載されているものと類似または等価の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書中で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。本明細書で論じられる刊行物および出願は、本出願の出願日前のそれらの開示のためにのみ提供される。本明細書中のいかなる内容も、本発明が先行発明によりそのような刊行物に先行する権利を与えられないことの承認として解釈されるべきではない。さらに、材料、方法、および例は例示にすぎず、限定することを意図するものではない。
【0025】
矛盾する場合は、定義を含めて本明細書が優先される。
【0026】
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本明細書の主題が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、本発明の理解を容易にするために以下の定義が提供される。
【0027】
「含む」という用語は、一般に含有するという意味で使用され、すなわち１つ以上の機能または成分の存在を許容する。
【0028】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの」および「その」は、文脈上明らかに異なる指示がない限り、複数の指示対象を含む。
【0029】
動物の摂食において、「繊維（ｆｉｂｅｒまたはｆｉｂｒｅ）」は、化学的または植物の解剖学的概念ではなく、栄養を定義するために使用される用語である。繊維は、「消化管の空間を占める、消化されにくく、緩やかに消化される、または不完全に利用可能な、飼料の画分」（Ｍｅｒｔｅｎｓ，１９８９）であり、繊維を不溶性成分と定義している。栄養的には、繊維は、消化の機械的過程（咀嚼と通過）および発酵に関連する酵素分解に関連する物理的属性と化学的属性の両方を有する。
【0030】
ウシおよびヒツジなどの反芻動物は、茎葉飼料消費者として進化した。我々が繊維として測定する植物細胞壁は、動物によって消化されることはできず、微生物によって発酵されなければならない。繊維の発酵消化は緩やかで不完全であり、反芻動物は、効率的な消化をもたらす多くの属性を発達させてきた。反芻動物は、茎葉飼料の大きな粒子を飲み込み、発酵に十分な時間を与えるためにそれらをルーメン内に選択的に保持する。消化を促進し、消化管を通過できるようにするために、大きな粒子を逆流させ、噛み直す（反芻）。咀嚼中に、ルーメン内のｐＨを維持するのに役立つ唾液緩衝液を生成する。理想的には、粗飼料は、反芻動物の独特の消化能力を利用するための食餌の不可欠な部分であり得る。
【0031】
共生微生物群集を形成することにより、プロバイオティクスサプリメントとして提供されたときの繊維溶解性古細菌は、植物ベースの食事の消化を促進するのに役立ち得る。微生物群集は腸内の繊維にコロニーを形成する。セルロースを含む植物繊維を分解するこれらの微生物群集は、集合的に繊維分解性およびセルロース分解性微生物と称される。さらに、脊椎動物の免疫細胞（白血球）の大部分は腸に含まれるため、繊維にコロニーを形成する微生物およびその発酵副産物が免疫細胞を調節できることは公知である。
【0032】
「生物活性」という用語は、生体、組織／細胞に影響を及ぼす化合物を指す。栄養学の分野では、生物活性化合物は必須栄養素とは区別される。栄養素は身体の持続可能性に不可欠であるが、生物活性化合物または物質は、それらなしでも身体が適切に機能できるため、または栄養素が同じ機能を果たすため、必須ではない。生物活性化合物は健康に影響を及ぼし得る。
【0033】
「プレバイオティクス」は、有益な微生物（例えば細菌および真菌）の成長または活性を誘導する食品成分である。最も一般的な例は胃腸管内であり、プレバイオティクスは腸内細菌叢の生物の組成を変化させ得る。食事療法では、プレバイオティクスは、典型的には消化されないまま胃腸管の上部を通過し、大腸にコロニーを形成する有益な細菌の成長または活性を、それらの基質として働くことによって刺激する非消化性繊維化合物である。
【0034】
本明細書で使用される場合、「プロバイオティクス」という用語は、適切な量で投与された場合、宿主に健康上の利益を与える生きた微生物飼料サプリメントである。この概念は、腸内微生物が食物に依存することで、動物の体内の叢を改変し、有害な微生物を有用な微生物に置き換える手段を取ることが可能になると主張することによって、前世紀の前半に導入された。プロバイオティクスの一般的に主張されている利点には、潜在的に病原性の胃腸微生物の減少、胃腸の不快感の軽減、免疫系の強化、皮膚機能の改善、腸の規則性の改善、スギ花粉アレルゲンに対する耐性の強化、体内病原菌の減少、膨満と鼓腸の軽減、ＤＮＡの保護、酸化的損傷からのタンパク質と脂質の保護、および抗生物質治療を受けている対象の個々の腸内細菌叢の維持が含まれる。
【0035】
プロバイオティクスのより詳細な定義は、宿主に関連するまたは周囲の微生物群集を改変することによって、飼料の改善された使用を保証することによって、またはその栄養を増強することによって、疾患に対する宿主の応答を増強することによって、または周囲環境の質を改善することによって、宿主動物に有益な影響を及ぼす微生物に関する。この定義は水産養殖に関して特に適切である。実際に、腸が、水が限られた世界の湿った生息地である陸生環境とは対照的に、水生環境では宿主と微生物が生態系を共有する。したがって、水生動物の環境は陸生生物よりも微生物叢にはるかに大きな影響を及ぼし、水生媒質中の細菌は宿主の腸内細菌叢の組成に大きく影響する。水生動物は、宿主動物とは独立してそれらの病原体を支持する環境に取り囲まれているため、日和見病原体は魚の周囲に高密度で到達することができ、したがって一般に、飼料でまたは飲み込むことによって摂取される。さらに、母親からの固有のコロニー形成細菌を有する陸生生物とは対照的に、水生生物は主に無菌卵として生まれた。周囲の細菌は卵の表面にコロニーを形成し、若齢幼虫はしばしば発達した腸を有さず（例えばエビ）、および／または腸、鰓または皮膚に微生物群集を持たない。結果として、周囲の水中の細菌の特性は非常に重要であるため、周囲環境の改善は繁殖動物の健康にとって極めて重要である。
【0036】
ウシなどの反芻動物は、共生するルーメン微生物の豊かで多様な群集に依存して飼料を消化する。これらの共生生物は、宿主が消化できない飼料を、揮発性脂肪酸などの宿主が使用できる栄養源に発酵させることができる。ルーメン微生物は、多種多様な飼料成分を分解する、または他の微生物によって形成された生成物の一部をさらに代謝する、セルロース分解物、デンプン分解物、タンパク質分解物などの様々な機能群に割り当てることができる。
【0037】
本明細書で「繊維関連微生物叢」とも称される「繊維分解微生物叢」、特に「ルーメン微生物叢」は、セルロースを集合的に分解する細菌、原生動物、真菌および古細菌を含む嫌気性微生物の共生群集からなる。ルーメン微生物叢は、セルロース発酵から生じる水素副産物をメタンに代謝するメタノブレビバクター（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）（Ｍｂｂ）種を特徴とする。ルーメン微生物叢という用語は、反芻動物のルーメンから抽出された微生物叢および当業者によって実験室で調製された人工ルーメン微生物叢の両方を指す。
【0038】
より好ましくは、繊維分解微生物叢培養物またはプロバイオティクスは、本明細書でメタン生成古細菌（Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）種とも称される古細菌（Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）種から選択される少なくとも１つの集団を含む。
【0039】
本明細書で使用される「集団」という用語は、時間および空間によって定義される同じ種の個々の生物の群に関する。ただし、この用語は、群集、すなわち、いくつもの種を含み得る、特定の生態的地位に生息する生物の群も意味し得る。この文脈では、「集団」という用語は「混合集団」とも称される。
【0040】
本発明を実施するのに適した「メタン生成古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｃ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）種」のリストは、メタノバクテリウム・ブライアンティイ（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｙａｎｔｉｉ）、メタノバクテリウム・フォルミカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｏｒｍｉｃｕｍ）、メタノブレビバクター・アルボリフィリクス（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ ａｒｂｏｒｉｐｈｉｌｉｃｕｓ）、メタノブレビバクター・ゴットシャルキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋｉｉ）、メタノブレビバクター・ルミナンチウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）、メタノブレビバクター・スミシイ、（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ ｓｍｉｔｈｉｉ）、メタノコッカス・チュングシンゲンシス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｃｈｕｎｇｈｓｉｎｇｅｎｓｉｓ）、メタノコッカス・ブルトニイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｂｕｒｔｏｎｉｉ）、メタノコッカス・エオリクス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ａｅｏｌｉｃｕｓ）、メタノコッカス・デルタエ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｄｅｌｔａｅ）、メタノコッカス・ヤンナシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、メタノコッカス・マリパルディス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）、メタノコッカス・バンニエリ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｖａｎｎｉｅｌｉｉ）、メタノコーパスクラム・ラブレアナム（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌｕｍ ｌａｂｒｅａｎｕｍ）、メタノクレウス・ブルゲンシス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ ｂｏｕｒｇｅｎｓｉｓ）、メタノクレウス・マリスニグリ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ ｍａｒｉｓｎｉｇｒｉ）、メタノフロレンス・ストーダレンミレンシス（Ｍｅｔｈａｎｏｆｌｏｒｅｎｓ ｓｔｏｒｄａｌｅｎｍｉｒｅｎｓｉｓ）、メタノフォリス・リミナタンス（Ｍｅｔｈａｎｏｆｏｌｌｉｓ ｌｉｍｉｎａｔａｎｓ）、メタノゲニウム・カリアシ（Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ ｃａｒｉａｃｉ）、メタノゲニウム・フリギダム（Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ ｆｒｉｇｉｄｕｍ）、メタノゲニウム・オルガノフィルム（Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ ｏｒｇａｎｏｐｈｉｌｕｍ）、メタノゲニウム・ウォルフェイ（Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｕｍ ｗｏｌｆｅｉ）、メタノミクロビウム・モービレ（Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｍｏｂｉｌｅ）、メタノピルス・カンドレリ（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ ｋａｎｄｌｅｒｉ）、メタノレグラ・ブーネイ（Ｍｅｔｈａｎｏｒｅｇｕｌａ ｂｏｏｎｅｉ）、メタノサエタ・コンシリイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ ｃｏｎｃｉｌｉｉ）、メタノサエタ・サーモフィラ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、メタノサルキナ・アセチボランス（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ）、メタノサルキナ・バーケリ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ）、メタノサルキナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ）、メタノスファエラ・スタッドマナエ（Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ ｓｔａｄｔｍａｎａｅ）、メタノスピリリウム・フンガテイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｉｕｍ ｈｕｎｇａｔｅｉ）、メタノサーモバクター・デフルビイ（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ ｄｅｆｌｕｖｉｉ）、メタノサーモバクター・サームオートトロフィカス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、メタノサーモバクター・サーモフレクサス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍｏｆｌｅｘｕｓ）、メタノサーモバクター・ウォルフェイ（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ ｗｏｌｆｅｉ）およびメタノスリックス・ソーエンゲニイ（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｒｉｘ ｓｏｃｈｎｇｅｎｉｉ）を含む。好ましい一実施形態では、古細菌（Ａｒｃｈｅａｂａｃｔｅｒｉａ）種はメタノブレビバクター（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）（Ｍｂｂ）である。さらにより好ましくは、本発明の組成物の活性薬剤として使用されるメタノブレビバクター（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）種は、メタノブレビバクター・スミシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ ｓｍｉｔｈｉｉ）種である。
【0041】
メタン生成古細菌（Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）種は、無酸素状態で代謝副産物としてメタンを生成する。メタン生成菌は、自然界に広く分布する厳密な嫌気性菌の多様な群であり、湛水土壌、堆積物、下水汚泥消化槽または特定の動物の消化管のような様々な恒久的無酸素生息地で見出すことができる。公知のメタン生成菌はすべて古細菌（Ａｒｃｈａｅａ）に属し、酸素に極めて感受性である。メタン生成菌の顕著な特徴は、Ｃ－１化合物（例えばＣＯ２、メタノール、ホルマート、またはＮ－メチル基）のメタン（ＣＨ４）への還元である。メタン生成菌は、嫌気性環境において他の形態の嫌気性呼吸によって生成された過剰な水素および発酵生成物を除去する極めて重要な生態学的役割を果たす。メタン生成古細菌（Ａｒｃｈａｅａ）は、メタンの酸化からエネルギーを引き出す生物が存在する生態系でも極めて重要な役割を果たし、その多くはバクテリアであり、そのような環境ではメタンの主要な供給源であり、一次生産者としての役割を果たすことができる。メタン生成菌はまた、炭素循環に重要な役割を果たし、有機炭素を、主要な温室効果ガスでもあるメタンに分解する。
【0042】
メタン生成は、ヒトおよび他の動物、特に反芻動物の腸でも起こる。ルーメンでは、メタン生成菌を含む嫌気性生物がセルロースを動物が使用できる形態に消化する。これらの微生物が存在しなければ、ウシなどの動物は草を摂取することができないであろう。メタン生成の有用な生成物は腸によって吸収され、一方、メタンは動物によって放出される。
【0043】
脊椎動物の腸は、消化と宿主の免疫学的健康状態を支持する微生物の密な共生群集によってコロニー形成されている。進化を通して、共生微生物はそれらの微小環境内に共局在することが公知であり、例えば反芻動物（例えばウシ）では、酵母、セルロース分解細菌および古細菌を含む、腸内の繊維消化を促進する微生物が、個々の草の繊維ストランドに付着し、共局在する。
【0044】
「病原体関連分子パターン」またはＰＡＭＰは、自然免疫系の細胞によって認識される病原体の群に関連する分子である。これらの分子は、微生物のクラス内で保存された小分子モチーフと称することができる。それらは、植物および動物の両方においてトール様受容体（ＴＬＲ）および他のパターン認識受容体（ＰＲＲ）によって認識される。グリカンおよび複合糖質を含む多種多様な異なる種類の分子がＰＡＭＰとして機能することができる。ＰＡＭＰは、いくつかの保存された非自己分子を同定することによって自然免疫応答を活性化し、感染から宿主を保護する。
【0045】
グラム陰性菌の細胞膜上に見出される内毒素である細菌リポ多糖（ＬＰＳ）は、ＰＡＭＰの原型クラスであると考えられている。ＬＰＳは、自然免疫系の認識受容体であるＴＬＲ４によって特異的に認識される。他のＰＡＭＰには、細菌フラジェリン（ＴＬＲ５によって認識される）、グラム陽性菌由来のリポテイコ酸、ペプチドグリカン、および通常はウイルスに関連する核酸変異体、例えばＴＬＲ３によって認識される二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）またはＴＬＲ９によって認識される非メチル化ＣｐＧモチーフが含まれる。「ＰＡＭＰ」という用語は比較的新しいが、微生物に由来する分子は多細胞生物から受容体によって検出されるに違いないという概念は何十年もの間保持されており、「内毒素受容体」への言及は多くの古い文献に見出される。
【0046】
「ＰＡＭＰ」という用語は、病原体だけでなく、ほとんどの微生物が検出された分子を発現するという理由で批判されてきた；そのため、「微生物関連分子パターン」（ＭＡＭＰ）という用語が提案されている。ＭＡＭＰと組み合わせて、病原体受容体に結合することができるビルレンスシグナルが、（病原体特異的）ＰＡＭＰを構成する１つの方法として提案されている。ＭＡＭＰは微生物にとって不可欠な構造であり、その理由で保存されている。ＭＡＭＰには、リポ多糖（ＬＰＳ）細胞膜、フラジェリン、ベータグリカン、ペプチドグリカン、キチンなどが含まれるが、これらに限定されない。ＭＡＭＰは、パターン認識受容体（ＰＲＲ）によって認識される。
【0047】
本発明の１つの目的は、ヒトの食品／錠剤および／または動物の飼料／錠剤に組み込むための、不活化または死滅したメタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞を含む組成物を調製する方法を提供することであり、この方法は、
ａ）メタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞の液体懸濁液を収集すること；
ｂ）前記液体懸濁液中の前記メタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞を不活化または死滅させること；
ｃ）前記液体懸濁液を凍結乾燥して、不活化または死滅したメタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞組成物を得ることであって、ここで、前記不活化または死滅したメタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞は、宿主のパターン認識受容体（ＰＲＲ）システムを介した微生物関連分子パターン（ＭＡＭＰ）のシグナル伝達能力の少なくとも８０％を維持していること、
を含む。
ａ）メタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞の液体懸濁液を収集すること；
ｂ）前記液体懸濁液中の前記メタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞を不活化または死滅させること；
ｃ）前記液体懸濁液を凍結乾燥して、不活化または死滅したメタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞組成物を得ることであって、ここで、前記不活化または死滅したメタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞は、宿主のパターン認識受容体（ＰＲＲ）システムを介した微生物関連分子パターン（ＭＡＭＰ）のシグナル伝達能力の少なくとも８０％を維持していること、
を含む。
【0048】
例４で証明されるように、本発明の方法に従って不活化されたＭｂｂは、ＮＦ－ｋＢレポータシステムを調節できることが証明され、生物活性ＭＡＭＰが不活化処理後に保存されたことを示す。
【0049】
Ｔｒｉｎｅ Ｈ．Ｍｏｇｅｎｓｅｎ“Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｉｎ Ｉｎｎａｔｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｅｎｓｅｓ”Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ．２００９ Ａｐｒ；２２（２）：２４０－２７３：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ２６６８２３２／には、ＰＲＲおよびＮＦ－Ｋｂ誘導性遺伝子の説明を含む、パターン認識に関する一般的な総説がある。この論文はまた、治療法におけるＴＬＲアンタゴニストの利点（不活化メタノブレビバクター（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）古細菌抽出物を用いて例４で行われたＬＰＳ誘発炎症を有効に阻害することによる）も記載している。
【0050】
試料の段階希釈およびＭＡＭＰ（例えばＬＰＳ）を制御するための比較分析は、ＭＡＭＰシグナル伝達の可能性および宿主ＰＲＲシステムとの相互作用の効力を定量化する方法である。Ｃｏｒｉｎｎａ Ｂａｎｇ ｅｔ ａｌ．“Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ａｒｃｈａｅａ Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ ｓｔａｄｔｍａｎａｅ ａｎｄ Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ ｓｍｉｔｈｉｉ Ａｃｔｉｖａｔｅ Ｈｕｍａｎ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ”ＰＬＯＳ ＯＮＥ Ｖｏｌ．９，ｎｏ ６，Ｅ９９４１１，１０ Ｊｕｎｅ ２０１４（ＸＰ０５５５９０６５４）ｈｔｔｐｓ：／／ｊｏｕｒｎａｌｓ．ｐｌｏｓ．ｏｒｇ／ｐｌｏｓｏｎｅ／ａｒｔｉｃｌｅ？ｉｄ＝１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００９９４１１では、１００万個の古細菌細胞が２００，０００個の樹状細胞からのシグナルをトリガすることができた。これらは、不活化されたメタノブレビバクター（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）古細菌細胞ではなく、段階希釈が行われた。これは、インビトロで２００，０００個の細胞を刺激するための１マイクログラムの古細菌に相当する。
【0051】
当業者には明らかなように、ＭＡＭＰの最小値の量は相対的である。同族受容体（ＴＬＲ－４）が定義されているＬＰＳなどの精製ＭＡＭＰは、特定の細胞株でのシグナル活性化に必要な用量閾値（ｍｇ／Ｌ）を確立することができる。これは、他のＭＡＭＰの参照値および対照としての役割を果たすことができる。
【0052】
古細菌抽出物はＭＡＭＰの組合せ（タンパク質、細胞壁断片、グリコシル化分子）を含み、市販のＬＰＳなどの精製産物ではないため、本発明は、インビトロモデルでＮＦ－ｋＢシグナル伝達を調節するために必要な最小用量を指す。他の細胞株では、検出可能なシグナル伝達をトリガするために必要なＭＡＭＰの最小量はより少ない可能性がある。刺激も、より長期間にわたって実施することができ、その後、検出可能なシグナルをトリガするために必要なＭＡＭＰの最小用量が減少する。
【0053】
したがって、検出可能なシグナルのためのＭＡＭＰの相対的最小量は、所与の細胞株におけるそのＭＡＭＰ（またはＭＡＭＰの組合せ）の同族ＰＲＲ、レポータ細胞の種類、および刺激の持続時間に依存する。
【0054】
本発明の文脈において、最小用量または量は、インビトロ細胞アッセイにおける生物学的シグナルの検出のための、２００，０００個の標的細胞当たり１０ｍｇ／Ｌまたは１マイクログラムの不活化メタノブレビバクター（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）古細菌ＭＡＭＰ生成物である。
【0055】
好ましくは、前記不活化または死滅したメタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞は、宿主のパターン認識受容体システムを介した微生物関連分子パターン（ＭＡＭＰ）のシグナル伝達能力の９０％、理想的には９５％、より好ましくは９９％、最も好ましくは１００％までを維持している。
【0056】
好ましくは、宿主のパターン認識受容体システムを介した微生物関連分子パターン（ＭＡＭＰ）のシグナル伝達能力の維持は、ＮＦ－ｋＢレポータ経路によって測定される。ＮＦ－ｋＢは、パターン認識受容体（ＰＲＲ）の下流にシグナル伝達する転写因子である。ＮＦ－ｋＢの転写調節を測定することは、上流のパターン認識受容体の相互作用を決定する方法である。
【0057】
ＮＦ－ｋＢは、炎症反応の包括的な主要調節因子である。ＮＦ－ｋＢに依存しない経路が存在するが、ＮＦ－ｋＢレポータモデルは、パターン認識シグナル伝達能力を決定するための優れた方法である。
【0058】
パターン認識受容体（ＰＲＲ）は、動物とヒトの自然免疫系において重要な役割を果たす。パターン認識受容体は、病原体に特有の分子を検出する生殖細胞系列にコードされたホストセンサである。それらは、微生物関連分子パターン（ＭＡＭＰ）とも称される病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を同定するために、上皮細胞などの自然免疫系の細胞によって発現されるタンパク質である。
【0059】
リポ多糖（ＬＰＳ）は、グラム陰性菌の外膜の主成分である。ＬＰＳは、宿主のパターン認識受容体を活性化することによって強力な炎症性免疫応答を誘発することができる、重要な種類のＭＡＭＰである。哺乳動物では、パターン認識受容体ＴＬＲ４がＬＰＳを認識し、炎症反応を誘発することができる。魚では、パターン認識受容体ＮＯＤ１がＬＰＳを識別し、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路を活性化することができる。
【0060】
ＮＦ－κＢ（活性化Ｂ細胞の核因子カッパ軽鎖エンハンサ）は、ＤＮＡの転写とサイトカイン産生を調節するタンパク質複合体である。ＮＦ－κＢは、感染に対する免疫応答の調節に重要な役割を果たす。ＮＦ－κＢの誤った調節は、癌、炎症性疾患および自己免疫疾患に関連している。
【0061】
細胞表面受容体の刺激を介して細菌のＭＡＭＰは、ＮＦ－κＢの活性化および遺伝子発現の急速な変化をもたらす。例えば、Ｔｏｌｌ様受容体は、ＮＦ－κＢの活性化をもたらすパターン認識分子である（グラム陰性菌のＬＰＳ成分の受容体としてのＴＬＲ４）。インビトロ細胞培養物におけるＮＦ－ｋＢのＲＮＡ発現レベルは、様々な種類のＭＡＭＰによる細胞表面のパターン認識受容体の活性化についての有効なレポータシステムを提供する。
【0062】
宿主のパターン認識受容体（ＰＲＲ）システムを介したＭＡＭＰのシグナル伝達能力とは、所与の生成物（例えば古細菌抽出物からの細胞壁）由来のＭＡＭＰがＰＲＲと相互作用し、それによってその後の下流シグナルカスケード（例えばＮＦ－ｋＢ経路、ＮＦ－ｋＢ遺伝子転写の調節）に変化を及ぼす能力を指す。宿主のパターン認識受容体システムを介したＭＡＭＰのシグナル伝達能力が維持されている場合にのみ、シグナル伝達および下流の遺伝子転写（例えばＮｆ－ｋＢ）の調節が調整され得る。
【0063】
好ましい実施形態では、得られた本発明の不活化または死滅したメタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞組成物を、植物由来の担体または従来の担体、好ましくは生体適合性担体に添加する。
【0064】
不活化古細菌はまた、典型的な凍結乾燥担体材料などの凍結乾燥で日常的に使用されるような、スクロース、糖またはデンプンベースの担体などの従来の担体と組み合わせて使用することができる。
【0065】
「担体材料」とは、不活化古細菌に固体マトリックス支持体を提供する、剤形賦形剤を意味する。不活化メタノブレビバクター（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）古細菌は、担体材料のマトリックス内に組み込まれる。本発明の担体材料はゼラチンを含み得る。適切なゼラチンの例には、プレーンゼラチンおよび、例えばゼラチンを水中で加熱することによって部分的に加水分解されているゼラチンが含まれる。例えば、多糖類、プレーンゼラチン、および加水分解ゼラチン。他の適切な担体材料の例は、不活性であり、食品／飼料／飲料での使用のためまたは医薬剤形を調製するために薬学的に許容されるものである。そのような担体材料は、デキストランおよびポリペプチドなどの多糖類を含む。
【0066】
好ましくは、植物担体はプレバイオティクスである。より好ましくは、植物由来の担体は、スピルリナ、クローバ、アルファルファ、ムラサキウマゴヤシ、オート麦、小麦、微細藻類、大型藻類、大麦、トウモロコシ、大豆、米（穀物、草、藻類など、果物、野菜；セルロース、糖、炭水化物もしくは葉緑素を含む材料）および／またはそれらの抽出物もしくは混合物の中から選択される。
【0067】
あるいは、植物由来の担体は繊維である。
【0068】
細胞壁の構造が古細菌と細菌を区別する決定的な特徴であることは公知である。古細菌の脂質細胞壁は、エーテル結合によって結合された分岐イソプレン鎖で形成されている。これは、エステル結合によって結合された非分岐脂肪酸で形成される細菌の脂質細胞壁とは対照的である。この異なる細胞壁の生化学が、古細菌が極限環境で生活することを可能にしている。古細菌ドメインは、「極限環境」微生物を進化させてきた。例えば、好熱菌メタノブレビバクター（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）種は、１００℃を超える温度で繁殖することが公知である。極限条件へのそのような適応は、部分的には細胞膜構造によるが、熱ショックタンパク質を含む分子シャペロンにも起因する。草食哺乳動物の大腸にコロニーを形成するように進化したＭ．スミシイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ）の特定の構造的および機能的特徴は、好熱菌と同じように保存されていると考えられる（例えば細胞膜構造）。
【0069】
ＤＮＡ抽出手順中に、メタノブレビバクター・スミシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖａｃｔｅｒ ｓｍｉｔｈｉｉ）種は、ＤＮＡを分離するためにより厳しい細胞破壊手順を必要とすることが観察された。この所見は、より堅固な細胞壁構造を有する古細菌と一致する。
【0070】
したがって、本発明による組成物のメタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞を不活化または死滅させる方法は、微生物関連分子分子パターン（ＭＡＭＰ）の少なくとも８０％を保存できることが不可欠である。
【0071】
したがって、メタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞を、ＭＡＭＰの役割を通してその免疫学的活性および機能を維持しながら、有効に不活化または死滅させる方法を提供することが本発明の目的である。
【0072】
本発明の文脈において、「不活化、不活化された、または不活化する」という用語は、細胞を死滅させる方法を指し、それにより、処理後のこの細胞は完全に死滅している。
【0073】
凍結乾燥は、メタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞の１００％の不活化または死滅を可能にする好都合な技術ではなく、したがって、この技術は本発明の方法の不活化工程ｂ）では使用されない。
【0074】
本発明の別の実施形態によれば、もはや複製することができず、いかなる代謝活性も有さない不活化細胞として本明細書で定義される「弱毒化メタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞」もまた、本発明の方法で使用され得る（すなわち例４ §３．２参照）。
【0075】
不活化工程ｂ）がメタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞の液体懸濁液に対して行われること（湿式工程）は本発明の重要な特徴であり、さもなければ不活化（細胞の死滅）は満足のいくものとならない。しかしながら、生細胞と非生細胞の組合せが好ましい場合は、動物飼料押出（蒸気および機械的圧力を組み合わせた乾燥細胞の十分な高温曝露）などの工業的プロセスを使用して、乾燥Ｍｂｂを不活化し得る。後者の場合、生細胞と死細胞の望ましい比率が得られるように押出機の操作条件を最適化すべきである。
【0076】
メタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞を懸濁するための当業者に公知の任意の好都合な液体を使用することができる。ＭＢＢを懸濁するための好都合な液体の例は、ＰＢＳ、生理食塩水、水、スクロース溶液、増殖培地、ルーメン液、アセタート、揮発性脂肪酸溶液などの中から選択される。
【0077】
本発明の一実施形態では、メタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞の不活化プロセスは、低温殺菌、凍結処理、紫外線もしくは赤外線照射、または空気乾燥技術によって実施される。好ましくは、メタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞は、極低温化を介するか、または短い熱パルス処理で構成される低温殺菌によって不活化される。
【0078】
「極低温化」または「凍結処理」または「凍結不活化」は、古細菌細胞を不活化するために凍結融解サイクルを繰り返すプロセスである。古細菌細胞を凍結不活化する方法を例２に示す。
【0079】
本発明では、凍結不活化は、通常、－２１０℃～－２０℃の範囲で少なくとも５秒間の凍結サイクル、続いて０℃～３７℃の範囲で少なくとも５秒間の解凍サイクルで実施される。凍結融解サイクルは少なくとも２回実施される。
【0080】
例えば、液体窒素凍結保存の場合、温度範囲は、好ましくは－１９６℃～－２１０℃に含まれるであろう。
【0081】
「空気乾燥技術」は、古細菌細胞を不活化するための曝気のプロセスを含む。空気乾燥によって古細菌細胞を不活化する方法を例３に示す。
【0082】
一実施形態では、好ましくは短い熱パルス処理で構成される低温殺菌は、５５℃～８０℃の温度で少なくとも５～６０秒間以上実施される。
【0083】
好ましくは、低温殺菌は少なくとも２０秒間実施される。
【0084】
別の実施形態では、紫外線照射は、１０～４００ナノメートルの波長で実施される。
【0085】
紫外（ＵＶ）光は、可視光線よりも高い周波数（より短い波長）を有する光である。ＵＶ光は、８＊１０１４～３＊１０１６Ｈｚ（８００ＴＨｚ～３０ＰＨｚ）の範囲の周波数、および１０－８ｍから３．８＊１０－７ｍ（１０ｎｍ～３８０ｎｍ）の波長を有する。
【0086】
さらに別の実施形態では、赤外線照射は、７５０ｎｍ～１ミリメートルの波長で実施される。
【0087】
赤外光の波長は１ミリメートル～７５０ナノメートルであり、紫外光の波長は４００ナノメートル～１０ナノメートルである。赤外線は、７００ナノメートル（ｎｍ）の可視スペクトルの名目上の赤色の端から１ミリメートル（ｍｍ）に及ぶ。この波長範囲は、約４３０ＴＨｚ～３００ＧＨｚの周波数範囲に対応する。
【0088】
やはり当業者には明らかなように、メタノブレビバクター（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）種などの少なくとも１つの古細菌（Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）の集団は、単離された古細菌（Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）株（その凍結乾燥形態を含む）の商業的な購入、ペレット化工程を伴うまたは伴わない適切な培養ブロス（例えばＬｅｉｂｎｉｚ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＤＳＭＺ－Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ＧｍｂＨのメタノスフェラ（Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ）培地Ｉまたはメタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）培地など）での古細菌（Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）の培養などの任意の公知の方法で得ることができる。
【0089】
ルーメン抽出物は、完全な培養条件（ウシのルーメン中の嫌気性条件）下で微生物（特にメタン生成古細菌（Ａｒｃｈａｅａ）に栄養を与える栄養素を含むため、古細菌（Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）のための完全な培地補助剤である。日常的な実験手順を通して、１日に１頭のウシから大量のルーメン抽出物を抽出することができる；これはおそらく滅菌することができ（例えば酸素および／または極端な温度への曝露を介して）、そこから得られるルーメン液を、嫌気性の制御された実験室条件下で古細菌（Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）を培養するための基礎として使用することができる。
【0090】
好ましくは、本発明による組成物の不活化古細菌（Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞は、メタノブレビバクター・スミシイ（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ ｓｍｉｔｈｉｉ）である。
【0091】
対象における腸内病原体感染に対する耐性を改善するためおよび／または腸の炎症を減少させるための方法において使用するための、本発明の方法に従って得られた不活化または死滅したメタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞を含む組成物を提供することが本発明の別の目的であり、前記不活化または死滅したメタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞は、宿主のパターン認識受容体システムを介した微生物関連分子パターン（ＭＡＭＰ）のシグナル伝達能力の少なくとも８０％を維持しており、および前記組成物は、前記組成物１グラム当たり少なくとも１０８個の不活化または死滅したメタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞を含む。
【0092】
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、前記組成物１グラム当たり１０９個、好ましくは１０１０個、より好ましくは１０１１個、さらにより好ましくは１０１２個の不活化メタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａｌ）細胞を含む。
【0093】
好ましくは、前記不活化または死滅したメタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞は、宿主のパターン認識受容体システムを介した微生物関連分子パターン（ＭＡＭＰ）のシグナル伝達能力の９０％、理想的には９５％、より好ましくは９９％、最も好ましくは１００％までを維持している。
【0094】
好ましくは、宿主のパターン認識受容体システムを介した微生物関連分子パターン（ＭＡＭＰ）のシグナル伝達能力の維持は、ＮＦ－ｋＢレポータ経路によって測定される。
【0095】
本発明によれば、対象は、それを必要とする動物またはヒト対象である。
【0096】
好ましくは、動物は、鳥、哺乳動物または水生動物である。
【0097】
好ましくは、対象は家畜である。本発明の他の実施形態では、対象はヒトである。
【0098】
本発明の好ましい実施形態では、本発明で言及される家畜は、鳥、哺乳動物または水生動物（エビ、甲殻類もしくは魚など）である。
【0099】
しかしながら、本発明はこの用途に限定されない。本発明の組成物は、ペット、捕獲動物またはヒトにも投与され得る。
【0100】
したがって、特定の実施形態によれば、本発明の組成物は、例えば栄養補助食品または錠剤などのヒトの食品において使用するためのものである。
【0101】
「錠剤」は、圧縮された固体物質の小さな円盤または円筒であり、本出願の文脈では、典型的にはそれを必要とする対象に経口投与される測定された量の不活化メタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞である。
【0102】
好ましい実施形態では、本発明に従って使用するための組成物は、前記対象の１キログラム当たりおよび１日当たり、少なくとも１０９個の不活化または死滅したメタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞の投与量で投与される。好ましくは、組成物は、少なくとも１０１０個の不活化または死滅したメタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞の投与量で、より好ましくは、前記対象の１キログラム当たりおよび１日当たり少なくとも２．１０１０個またはさらにそれ以上の不活化または死滅したメタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞の投与量で投与される。
【0103】
特に、本発明による不活化メタノブレビバクター（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）古細菌を含む組成物は、食物アレルギー／非感受性（グルテン、ラクトースなど）によって引き起こされる腸の炎症を軽減するために使用することができる。
【0104】
メタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａｌ）細胞を不活化することの利点は、生細胞で可能であるよりも多くのメタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞を、例えば食品／飼料／錠剤／飲料／坐剤に組み込む可能性をもたらす。これは、結果として、腸内病原体感染に対する耐性のより良い改善、および／または不活化メタノブレビバクター古細菌（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）細胞にも存在する微生物関連分子パターン（ＭＡＭＰ）の作用と活性を介して対象における腸の炎症を軽減するための改善をもたらす。
【0105】
一実施形態では、本発明の組成物は、動物対象のワクチン接種治療と組み合わせて使用することができる。
【0106】
動物は、疾患を予防するためにワクチンを接種される。動物にワクチンを接種することは、動物の苦痛を軽減し、動物集団における微生物の伝染を減らし、しばしば疾患動物の治療に支払うよりも手頃な費用である。ペットは、狂犬病、パルボウイルス、ジステンパーおよび肝炎などの感染症のワクチンを接種される。
【0107】
シチメンチョウ、ニワトリ、ウシおよびブタなどの家畜は、ロタウイルス、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、伝染性角結膜炎およびブルセラ症のような疾患から保護するためにワクチン接種を受ける。ワクチン接種は、個々の動物、集団および群れ、ならびに人々を健康に保つ。動物用ワクチンは、動物用生物学的製剤として公知の動物用医薬品のカテゴリーの一部であり、主に動物の免疫系を刺激して疾患を予防または治療することによって機能する。本発明の組成物と組み合わせたワクチン接種治療は、ワクチン接種の副作用を低減し、免疫を回復するのに役立つ。
【0108】
本発明の別の実施形態によれば、本発明の組成物は、腸の炎症の軽減に使用され、これは、ヒトまたは動物対象における炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に対する感受性を低下させることを含む。
【0109】
「炎症性腸疾患」（ＩＢＤ）は、消化管の慢性炎症を伴う障害を表すために使用される包括的な用語である。これは複雑な疾患であり、食事に対する過敏症を含む様々な原因があり得る。炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、結腸と小腸の炎症状態の群である。クローン病および潰瘍性大腸炎は、炎症性腸疾患の主要な種類である。クローン病は小腸と大腸に影響を及ぼすだけでなく、口、食道、胃および肛門にも影響を与える可能性があるのに対し、潰瘍性大腸炎は主に結腸と直腸に影響を及ぼすことに留意することが重要である。
【0110】
特に、本発明による不活化メタノブレビバクター（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）古細菌を含む組成物は、食物アレルギー／非感受性（グルテン、ラクトースなど）によって引き起こされる腸の炎症を軽減するために使用することができる。
【0111】
さらに、本発明による不活化メタノブレビバクター（ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）古細菌を含む組成物は、ガスを発生させることなく免疫系を調節するための坐剤として（および結腸浣腸などのために）使用することができる。
【0112】
別の実施形態によれば、本発明の組成物は、ヒトまたは動物対象における感染によって引き起こされる免疫病理および疾患の重症度を軽減することを含む、腸の炎症を軽減するための方法において使用される。
【0113】
「免疫病理」は、炎症および宿主組織への損傷を引き起こす過剰なまたは過敏な免疫応答に起因する。例としては、サイトカイン放出症候群、好酸球増加症、好中球増加症、１～４型過敏症（アレルギー反応など）が含まれる。
【0114】
免疫病理は、自己免疫（宿主の微生物叢、宿主の食事抗原、宿主の分子を標的とする宿主免疫応答）の結果であり得る。炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は免疫病理の一例である。
【0115】
免疫病理は、高等脊椎動物と低等脊椎動物で発生し得るが、例えば哺乳動物の免疫系は硬骨魚の免疫系よりも高度に進化しているため、その機序は異なり得る。ＩＢＤの症状は、ヒトだけでなく下等脊椎動物でも起こり得る。例えば、サケは、それらがうまく適応していない植物の豊富な食餌を与えられた場合、多くのＩＢＤ症状（炎症性サイトカイン、腸の腫脹など）を発症する。２０１５年には、米国の成人の推定１．３％がＩＢＤと診断されたと報告した（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｉｂｄ／ｄａｔａ－ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ．ｈｔｍ）。
【0116】
「感染によって引き起こされる疾患の重症度」とは、体重減少、上皮病変、腫脹、組織中の病原体負荷、線維症、糞便の柔らかさ、行動（嗜眠、姿勢、食欲）、血清中の免疫マーカ（炎症性サイトカインなど．．．）を含む症状のレベル／程度を指す。感染によって引き起こされる疾患の重症度は、生存率も指す。
【0117】
別の実施形態によれば、本発明の組成物は、自然免疫バリア機能を促進し、ヒトまたは動物対象における寄生虫感染に対する感受性を低下させるための方法において使用される。
【0118】
「自然免疫バリア」は、病原性微生物による侵入を回避し、病原体を封じ込め、それらの拡散を防ぐための複数の成分／層を含む。上皮表面（例えば腸を裏打ちする）は機械的バリアを提供する。粘液層（抗菌ペプチド、ムチン、ディフェンシンおよび免疫グロブリンを含む）は、病原体の侵入を阻止する生化学的バリアを提供する。固有層に存在する先天性白血球（マクロファージ、樹状細胞、顆粒球などを含む）は、免疫活性化分子（サイトカイン）を感知し、分泌する免疫系の歩哨である。先天性白血球はまた、侵入する微生物を捕獲して中和する機構を有する。まとめると、多層の自然免疫バリアは、感染から宿主を保護する上で重要な役割を果たす。
【0119】
対象の免疫学的健康状態の改善などの、本発明による組成物を使用するための非治療的適応症も包含される。
【0120】
「免疫」とは、免疫されている質または状態、特に、中でも病原性微生物の発生を防ぐことによって、またはその生成物の作用に対抗することによって、特定の疾患に抵抗することができる状態である。
【0121】
「健康状態」という用語は、全身の健康状態（健康および福利の状態）を指す。身体的健康状態とは、心臓、血管、肺、腸および筋肉が最適な効率で働くように機能することであり、したがって、身体が効率的に機能する能力として定義される。
【0122】
「免疫学的健康状態」を改善するとは、
－感染に抵抗する、
－共生微生物を許容／育成する、
－自然免疫系を調節する、
－パターン認識シグナル伝達を調節する、
－適切なサイトカインネットワークを調節する、
－白血球の分布を調節する、
－粘膜免疫グロブリン分泌を調節する、
－粘液の質を調節する、
－創傷修復システムを調節し、宿主組織の完全性を維持する（「ハウスキーピング」機能）
ための非治療的方法を意味する。
－感染に抵抗する、
－共生微生物を許容／育成する、
－自然免疫系を調節する、
－パターン認識シグナル伝達を調節する、
－適切なサイトカインネットワークを調節する、
－白血球の分布を調節する、
－粘膜免疫グロブリン分泌を調節する、
－粘液の質を調節する、
－創傷修復システムを調節し、宿主組織の完全性を維持する（「ハウスキーピング」機能）
ための非治療的方法を意味する。
【0123】
本発明の文脈において、免疫系の機能の改善は、腸の恒常性の調節、炎症バランスの調節、免疫遺伝子の活性化および／または免疫認識を含む。
【0124】
本発明に従って、「腸の恒常性」という用語は、腸の免疫系が共生微生物叢を許容し、育成するときの相利共生の状態を指す。腸内免疫系は、共生微生物叢と共に、「ディスバイオシス（ｄｙｓｂｉｏｓｉｓ）」とも呼ばれる微生物の日和見的過剰増殖を防止する。ディスバイオシスは、微生物叢の組成が乱される場合に起こる。ディスバイオシスは、免疫系を活性化して炎症因子（例えばサイトカイン：ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦ－ａなど）を産生することができる。これは、腸の正常な（または通常の）機能を妨げる（したがって腸の恒常性が妨げられる）可能性がある。
【0125】
「炎症バランス」とは、細胞および分子の炎症ネットワークの調節を指す。炎症の主な機能は、病原体を排除することである。炎症は感染に抵抗するために重要であるが、宿主組織に損傷を引き起こし得る。したがって、免疫病理を最小限に抑えながら病原体の適切な排除を確保するために、炎症は十分に調節／バランスがとられなければならない。いくつかの場合には、十分に調節されない炎症は、病原体自体によって引き起こされる損傷よりも宿主に対して有害であり得る。
【0126】
「免疫遺伝子の活性化および／または免疫認識」は、微生物パターンの微小環境を感知し、最も一般的にはサイトカイン（免疫系のホルモン型分子）を産生することによって免疫系を制御するシグナル伝達カスケードを調節する受容体を含むパターン認識システムを指す。免疫遺伝子は、白血球（ＷＢＣ）の増殖、分布および活性化状態を調節する。病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）は、炎症を誘発することが公知である。共生微生物叢の微生物関連分子パターン（ＭＡＭＰ）は、炎症を軽減し、代わりに腸内の耐性状態を促進することが公知である。適切な免疫認識とそれに続く適切な免疫遺伝子の活性化は、適切な免疫系機能に不可欠である。
【0127】
さらに、米国特許出願第２０１６／０７４４４０ Ａ１号（Ｂｒｕｇｅｒｅ ｅｔ ａｌ．）などの先行技術のいずれも、不活化（死滅）したＭｂｂ古細菌（活性なＴＭＡメチルトランスフェラーゼを欠く）の適用を実証していないと考えられる。さらに、Ｂｒｕｇｅｒｅ ｅｔ ａｌ．は、不活化Ｍｂｂ古細菌によって誘導されるパターン認識受容体シグナル伝達を検討していない。
【0128】
当業者は、本明細書に記載されている本発明が、具体的に記載されているもの以外の変形および修正を受け入れる余地があることを理解するであろう。本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱することなくそのようなすべての変形および修正を含むことが理解されるべきである。本発明はまた、個別にまたは集合的に、本明細書で参照または指示されるすべての方法、特徴、組成物および化合物、ならびに前記方法または特徴の任意の２つ以上のありとあらゆる組合せを含む。したがって、本開示は、すべての態様において例示的であり、限定的ではないと見なされるべきであり、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって示され、同等の意味および範囲内に含まれるすべての変更は、その中に包含されることが意図されている。
【0129】
本明細書全体を通して様々な参考文献が引用されており、それらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0130】
前述の説明は、以下の例を参照してより十分に理解されるであろう。しかしながら、そのような例は、本発明を実施する方法の例示であり、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【0131】
例
例１：
不活化されたＭ．スミシイ（Ｍ．Ｓｍｉｔｈｉｉ）古細菌抽出物は腸の炎症を抑制する
１．緒言
上皮細胞は、脊椎動物の腸における重要な免疫メディエータおよび機能的バリアである。
例１：
不活化されたＭ．スミシイ（Ｍ．Ｓｍｉｔｈｉｉ）古細菌抽出物は腸の炎症を抑制する
１．緒言
上皮細胞は、脊椎動物の腸における重要な免疫メディエータおよび機能的バリアである。
【0132】
細菌の細胞膜に由来するＬＰＳは、プロトタイプの炎症試薬である。
【0133】
ＩＬ－１ｂおよびＴＮＦ－ａはどちらも、上皮細胞のＬＰＳ刺激によって誘発される炎症性サイトカインマーカである。ＮＦ－ｋＢは、炎症性サイトカインの主要な調節因子である。
【0134】
目的：
この試験では、不活化Ｍ．スミシイ（Ｍ．Ｓｍｉｔｈｉｉ）の免疫調節作用を、ＬＰＳで活性化したマス上皮細胞にＭ．スミシイ（Ｍ．Ｓｍｉｔｈｉｉ）を曝露し、ＩＬ－１ｂ、ＴＮＦ－ａおよびＮＦ－ｋＢのＲＮＡ発現レベルを決定することによって評価した。
この試験では、不活化Ｍ．スミシイ（Ｍ．Ｓｍｉｔｈｉｉ）の免疫調節作用を、ＬＰＳで活性化したマス上皮細胞にＭ．スミシイ（Ｍ．Ｓｍｉｔｈｉｉ）を曝露し、ＩＬ－１ｂ、ＴＮＦ－ａおよびＮＦ－ｋＢのＲＮＡ発現レベルを決定することによって評価した。
【0135】
２．材料および方法
２．１ 細胞
２４ウェルプレートおよび６ウェルプレート中の６８継代のＲＴｇｕｔＧＣ（ニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍｙｋｉｓｓ）の腸）細胞株の細胞。濃度ごとに、３つの複製ウェルに、それぞれ２４ウェルおよび６ウェルごとに２ｍｌおよび８ｍｌの曝露溶液を添加した。試験は１９±１℃で実施した。
２．１ 細胞
２４ウェルプレートおよび６ウェルプレート中の６８継代のＲＴｇｕｔＧＣ（ニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍｙｋｉｓｓ）の腸）細胞株の細胞。濃度ごとに、３つの複製ウェルに、それぞれ２４ウェルおよび６ウェルごとに２ｍｌおよび８ｍｌの曝露溶液を添加した。試験は１９±１℃で実施した。
【0136】
２．２ マーカ遺伝子
【表1】
【0137】
２．３ ＲＮＡの単離／ｃＤＮＡの合成
Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ ＭｉｎｉＫｉｔを使用して、ＲＴＧｕｔＧＣ細胞から全ＲＮＡを抽出した。
Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ ＭｉｎｉＫｉｔを使用して、ＲＴＧｕｔＧＣ細胞から全ＲＮＡを抽出した。
【0138】
ゲノム：
ＤＮＡ汚染物質を、ｇＤＮＡ Ｅｌｉｍｉｎａｔｏｒスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して除去した。ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（ＰＥＱＬＡＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ ＧＭＢＨ）を使用してＲＮＡの量と質を決定した。高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。
ＤＮＡ汚染物質を、ｇＤＮＡ Ｅｌｉｍｉｎａｔｏｒスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して除去した。ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（ＰＥＱＬＡＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ ＧＭＢＨ）を使用してＲＮＡの量と質を決定した。高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。
【0139】
２．４ マーカ遺伝子のｍＲＮＡ発現の定量化
選択したすべてのマーカ遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを、ＧｏＴａｑ（登録商標）ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して分析した。すべての試料を、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、白色３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅ）で３回重複して分析した。転写レベルを、独立したＲＮＡ単離からの試料のｃＤＮＡで測定した。ｑＰＣＲの結果を、様々なＰＣＲ増幅効率を考慮に入れたＱ－Ｇｅｎｅ Ｃｏｒｅ Ｍｏｄｕｌｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｑｇｅｎｅ．ｏｒｇ／）の正規化手順に従って、ハウスキーピング遺伝子ＥＦ１ａと比較して計算した。
選択したすべてのマーカ遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを、ＧｏＴａｑ（登録商標）ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して分析した。すべての試料を、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、白色３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅ）で３回重複して分析した。転写レベルを、独立したＲＮＡ単離からの試料のｃＤＮＡで測定した。ｑＰＣＲの結果を、様々なＰＣＲ増幅効率を考慮に入れたＱ－Ｇｅｎｅ Ｃｏｒｅ Ｍｏｄｕｌｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｑｇｅｎｅ．ｏｒｇ／）の正規化手順に従って、ハウスキーピング遺伝子ＥＦ１ａと比較して計算した。
【0140】
２．５ 遺伝子発現解析試験項目ＡおよびＢの結果：
図１ａ、１ｂ、１ｃ：遺伝子発現の結果。
図１ａ、１ｂ、１ｃ：遺伝子発現の結果。
【0141】
各処理の３つの重複する生物学的複製物で測定された平均発現値と標準偏差が示されている。
【0142】
対照との統計的な有意な差（ａ＝陰性対照細胞培地との比較、ｂ＝陽性対照であるＬＰＳ ５０ｍｇ／ｌとの比較、およびｃ＝ＬＰＳ ５０ｍｇ／ｌ ６時間－Ｌ１５／ｅｘ ６時間との比較）を、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続くダネット検定（Ｐ＜０．０５）で決定した。
【0143】
結果：
標準的な炎症性試薬であるＬＰＳ ５０ｍｇ／Ｌにマスの上皮細胞を６時間曝露すると、Ｌ１５／ｅｘ培地対照と比較して、炎症マーカ遺伝子ＮＦ－ｋＢ、ＩＬ－１ｂおよびＴＮＦαの遺伝子発現が大幅に増加した。ＬＰＳを除去し、１００ｍｇ／Ｌの試験項目Ａ（凍結不活化Ｍ．スミシイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ）古細菌抽出物）に置き換えると、Ｌ１５／ｅｘ培地対照に置き換えた場合と比較して、すべての炎症マーカの発現レベルが有意に低下した。対照的に、試験項目Ｂ（高温不活化Ｍ．スミシイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ）古細菌抽出物）は、ＮＦ－ｋＢ発現の有意な減少のみをもたらし、ＩＬ－１ｂまたはＴＮＦ－αの発現減少はもたらさなかった。不活化されたＭ．スミシイ（Ｍ．Ｓｍｉｔｈｉｉ）古細菌抽出物はＬＰＳを介した炎症を抑制した。凍結不活化Ｍ．スミシイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ）古細菌抽出物は、高温不活化Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ古細菌抽出物よりも広く、より強力な抗炎症作用を及ぼした。
標準的な炎症性試薬であるＬＰＳ ５０ｍｇ／Ｌにマスの上皮細胞を６時間曝露すると、Ｌ１５／ｅｘ培地対照と比較して、炎症マーカ遺伝子ＮＦ－ｋＢ、ＩＬ－１ｂおよびＴＮＦαの遺伝子発現が大幅に増加した。ＬＰＳを除去し、１００ｍｇ／Ｌの試験項目Ａ（凍結不活化Ｍ．スミシイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ）古細菌抽出物）に置き換えると、Ｌ１５／ｅｘ培地対照に置き換えた場合と比較して、すべての炎症マーカの発現レベルが有意に低下した。対照的に、試験項目Ｂ（高温不活化Ｍ．スミシイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ）古細菌抽出物）は、ＮＦ－ｋＢ発現の有意な減少のみをもたらし、ＩＬ－１ｂまたはＴＮＦ－αの発現減少はもたらさなかった。不活化されたＭ．スミシイ（Ｍ．Ｓｍｉｔｈｉｉ）古細菌抽出物はＬＰＳを介した炎症を抑制した。凍結不活化Ｍ．スミシイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ）古細菌抽出物は、高温不活化Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ古細菌抽出物よりも広く、より強力な抗炎症作用を及ぼした。
【0144】
図１ａ、１ｂ、１ｃ：Ｍ．スミシイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ）は、マス上皮細胞においてＬＰＳを介したＩＬ－１ｂ、ＴＮＦ－αおよびＮＦ－ｋＢを阻害する
試験項目：
凍結不活化Ｍ．スミシイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ）古細菌抽出物
高温不活化Ｍ．スミシイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ）古細菌抽出物
試験項目：
凍結不活化Ｍ．スミシイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ）古細菌抽出物
高温不活化Ｍ．スミシイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ）古細菌抽出物
【0145】
遺伝子発現の結果：
各処理の３つの重複する生物学的複製物で測定された平均発現値と標準偏差が示されている。対照との統計的な有意な差（ａ＝陰性対照細胞培地との比較、ｂ＝陽性対照であるＬＰＳ ５０ｍｇ／ｌとの比較、およびｃ＝ＬＰＳ ５０ｍｇ／ｌ ６時間－Ｌ１５／ｅｘ ６時間との比較）を、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続くダネット検定（Ｐ＜０．０５）で決定した。
各処理の３つの重複する生物学的複製物で測定された平均発現値と標準偏差が示されている。対照との統計的な有意な差（ａ＝陰性対照細胞培地との比較、ｂ＝陽性対照であるＬＰＳ ５０ｍｇ／ｌとの比較、およびｃ＝ＬＰＳ ５０ｍｇ／ｌ ６時間－Ｌ１５／ｅｘ ６時間との比較）を、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続くダネット検定（Ｐ＜０．０５）で決定した。
【0146】
考察：
ＬＰＳを介した炎症は、主要なパターン認識受容体であるＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）およびＮＯＤ－１によって媒介されることが広く公知である。この試験は、不活化された古細菌抽出物がＬＰＳを介した炎症を阻害することを示す。さらに、凍結不活化古細菌抽出物は、高温不活化古細菌抽出物よりも強力に抗炎症性である。これらのデータは、不活化された古細菌が、適切に処理された場合、不活化後に免疫学的に活性なＭＡＭＰを保持できることを明らかにする。古細菌のＭＡＭＰは、おそらくＴＬＲ４との競合的架橋を介して、ＬＰＳ－ＴＬＲ４媒介炎症を妨げると予想される。
ＬＰＳを介した炎症は、主要なパターン認識受容体であるＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）およびＮＯＤ－１によって媒介されることが広く公知である。この試験は、不活化された古細菌抽出物がＬＰＳを介した炎症を阻害することを示す。さらに、凍結不活化古細菌抽出物は、高温不活化古細菌抽出物よりも強力に抗炎症性である。これらのデータは、不活化された古細菌が、適切に処理された場合、不活化後に免疫学的に活性なＭＡＭＰを保持できることを明らかにする。古細菌のＭＡＭＰは、おそらくＴＬＲ４との競合的架橋を介して、ＬＰＳ－ＴＬＲ４媒介炎症を妨げると予想される。
【0147】
ＭＡＭＰを保持する適切に不活化された古細菌抽出物は、免疫病理を軽減する優れた可能性を示し、また腸内の免疫恒常性を促進し、ディスバイオシス、感染および疾患のリスクを全身的に軽減する優れた可能性を示す。
【0148】
結論：
メタノブレビバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｃｅａｅ）科の不活化されたＭ．スミシイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ）古細菌は、腸上皮細胞において抗炎症特性を示す。Ｍ．スミシイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ）古細菌抽出物の低温不活化は、高温不活化Ｍ．スミシイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ）古細菌抽出物よりも免疫機能性ＭＡＭＰのより良い保存を提供する。
メタノブレビバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｃｅａｅ）科の不活化されたＭ．スミシイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ）古細菌は、腸上皮細胞において抗炎症特性を示す。Ｍ．スミシイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ）古細菌抽出物の低温不活化は、高温不活化Ｍ．スミシイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ）古細菌抽出物よりも免疫機能性ＭＡＭＰのより良い保存を提供する。
【0149】
例２
極低温化
生きている遠心分離したＭ．スミシイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ）古細菌バイオマス１０ｇを１５ｍＬファルコンチューブに移す。生きている遠心分離された古細菌を、ファルコンチューブを液体窒素に５分間浸すことによって急速凍結する。次に、凍結古細菌を含むファルコンチューブを、１３℃に維持した水浴中で１０分間解凍する。この凍結融解サイクルをさらに３～１０回実施する。
極低温化
生きている遠心分離したＭ．スミシイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ）古細菌バイオマス１０ｇを１５ｍＬファルコンチューブに移す。生きている遠心分離された古細菌を、ファルコンチューブを液体窒素に５分間浸すことによって急速凍結する。次に、凍結古細菌を含むファルコンチューブを、１３℃に維持した水浴中で１０分間解凍する。この凍結融解サイクルをさらに３～１０回実施する。
【0150】
不活化された古細菌抽出物は、直ちに使用するか、あるいは、例えば通常の凍結乾燥製剤化および処理によって保存することができる。
【0151】
得られた粉末は、純粋な不活化Ｍ．スミシイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ）古細菌抽出物を含む。Ｍ．スミシイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ）の生存不能性は、通常のＭ．スミシイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ）嫌気性培養法およびＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒのＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ ＢａｃＬｉｇｈｔ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｋｉｔを使用して検証可能である。
【0152】
例３
空気乾燥
生きている遠心分離されたＭ．スミシイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ）古細菌バイオマス１０ｇを、直径１０ｃｍ（４０～５００ミクロン、好ましくは７０ミクロンの細孔）のナイロンメッシュストレーナに薄く塗布する。次に、乾燥のために３７℃の温風をバイオマスの表面に吹き付ける（例えば空気乾燥装置、工業用オーブンなどを使用して）。２時間乾燥し、バイオマスをナイロンメッシュに対して平らな面で２０分間隔で穏やかに混合することによって均一にして、バイオマス内のすべての細胞が空気に持続的に曝露されることを確実にする。回収後１～５時間、Ｍ．スミシイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ）を空気に長時間曝露すると、細胞が不活化される。空気乾燥プロセスの後、不活化された古細菌抽出物は、直ちに使用するか、あるいは、例えば通常の凍結乾燥製剤化および処理によって保存することができる。
空気乾燥
生きている遠心分離されたＭ．スミシイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ）古細菌バイオマス１０ｇを、直径１０ｃｍ（４０～５００ミクロン、好ましくは７０ミクロンの細孔）のナイロンメッシュストレーナに薄く塗布する。次に、乾燥のために３７℃の温風をバイオマスの表面に吹き付ける（例えば空気乾燥装置、工業用オーブンなどを使用して）。２時間乾燥し、バイオマスをナイロンメッシュに対して平らな面で２０分間隔で穏やかに混合することによって均一にして、バイオマス内のすべての細胞が空気に持続的に曝露されることを確実にする。回収後１～５時間、Ｍ．スミシイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ）を空気に長時間曝露すると、細胞が不活化される。空気乾燥プロセスの後、不活化された古細菌抽出物は、直ちに使用するか、あるいは、例えば通常の凍結乾燥製剤化および処理によって保存することができる。
【0153】
得られた粉末は、純粋な不活化Ｍ．スミシイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ）古細菌抽出物を含む。Ｍ．スミシイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ）の生存不能性は、通常のＭ．スミシイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ）嫌気性培養法およびＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒのＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ ＢａｃＬｉｇｈｔ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｋｉｔを使用して検証可能である。
【0154】
例４：
宿主のパターン認識受容体システムを介した微生物関連分子パターン（ＭＡＭＰ）のシグナル伝達能力を維持することができるメタノブレビバクター（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）（Ｍｂｂ）古細菌の不活化のための方法
宿主のパターン認識受容体システムを介した微生物関連分子パターン（ＭＡＭＰ）のシグナル伝達能力を維持することができるメタノブレビバクター（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）（Ｍｂｂ）古細菌の不活化のための方法
【0155】
１．緒言
１．１．メタノブレビバクター（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）（Ｍｂｂ）の熱に対する耐性
古細菌ドメインの属であるメタノブレビバクター（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）（Ｍｂｂ）は、生命科学における新たな商業的用途（例えばプロバイオティクスとして）を有する。Ｍｂｂは厳密な嫌気性菌であるため、ほとんどの種の空気に対する耐性は低いと考えられる。さらに、草食動物の腸に固有のＭｂｂは、好熱菌Ｍｂｂとは対照的に、一般に生理学的温度に適応する。腸のＭｂｂが空気および極端な温度への曝露にどの程度耐性であるかは不明なままである。
１．１．メタノブレビバクター（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）（Ｍｂｂ）の熱に対する耐性
古細菌ドメインの属であるメタノブレビバクター（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）（Ｍｂｂ）は、生命科学における新たな商業的用途（例えばプロバイオティクスとして）を有する。Ｍｂｂは厳密な嫌気性菌であるため、ほとんどの種の空気に対する耐性は低いと考えられる。さらに、草食動物の腸に固有のＭｂｂは、好熱菌Ｍｂｂとは対照的に、一般に生理学的温度に適応する。腸のＭｂｂが空気および極端な温度への曝露にどの程度耐性であるかは不明なままである。
【0156】
細胞壁の構造は、古細菌を細菌と区別する古細菌の決定的な特徴である（図２）。古細菌の脂質細胞壁は、エーテル結合によって結合された分岐イソプレン鎖で形成されている。これは、エステル結合によって結合された非分岐脂肪酸で形成される細菌の脂質細胞壁とは対照的である。この異なる細胞壁の生化学が、古細菌が極限環境で生活することを可能にしている。古細菌ドメインは、「極限環境」微生物を進化させてきた。例えば、好熱菌メタノブレビバクター（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）種は、１００℃を超える温度で繁殖することが公知である。極限条件へのそのような適応は、部分的には細胞膜構造によるが、熱ショックタンパク質を含む分子シャペロンにも起因する。草食哺乳動物の大腸にコロニーを形成するように進化したＭ．スミシイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ）の特定の構造的および機能的特徴は、好熱菌と同じように保存されていると考えられる（例えば細胞膜構造）。
【0157】
ＤＮＡ抽出手順中に、Ｍ．スミシイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ）種は、ＤＮＡを分離するためにより厳しい細胞破壊手順を必要とすることが観察された。この所見は、より堅固な細胞壁構造を有する古細菌と一致する。
【0158】
極限環境微生物の特徴（例えば細胞壁構造）が保存されているため、熱処理、空気および照射に対するＭｂｂの耐性は不明なままである。古細菌は、細胞壁の構造が異なるため、抗生物質処理に耐性であることが公知である。処理後の生存能力は、生死染色および培養技術を使用して評価することができる。さらに、レシピエント動物の腸の免疫系と相互作用する微生物関連分子パターン（ＭＡＭＰ）に対するそのような処理の影響は不明なままである。
【0159】
１．２．不活化処理後の古細菌のＭＡＭＰ－ＰＲＲ相互作用は不明である
パターン認識受容体（ＰＲＲ）は、動物の自然免疫系において重要な役割を果たす。パターン認識受容体は、病原体に特有の分子を検出する生殖細胞系列にコードされたホストセンサである。それらは、微生物関連分子パターン（ＭＡＭＰ）とも称される病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を同定するために、上皮細胞などの自然免疫系の細胞によって発現されるタンパク質である。
パターン認識受容体（ＰＲＲ）は、動物の自然免疫系において重要な役割を果たす。パターン認識受容体は、病原体に特有の分子を検出する生殖細胞系列にコードされたホストセンサである。それらは、微生物関連分子パターン（ＭＡＭＰ）とも称される病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を同定するために、上皮細胞などの自然免疫系の細胞によって発現されるタンパク質である。
【0160】
リポ多糖（ＬＰＳ）は、グラム陰性菌の外膜の主成分である。ＬＰＳは、宿主のパターン認識受容体を活性化することによって強力な炎症性免疫応答を誘発することができる、重要な種類のＭＡＭＰである。哺乳動物では、パターン認識受容体ＴＬＲ４がＬＰＳを認識し、炎症反応を誘発することができる。魚では、パターン認識受容体ＮＯＤ１がＬＰＳを識別し、ＮＦ－κＢシグナル伝達経路を活性化することができる。
【0161】
ＮＦ－κＢ（活性化Ｂ細胞の核因子カッパ軽鎖エンハンサ）は、ＤＮＡの転写とサイトカイン産生を調節するタンパク質複合体である。ＮＦ－κＢは、感染に対する免疫応答の調節に重要な役割を果たす。ＮＦ－κＢの誤った調節は、癌、炎症性疾患および自己免疫疾患に関連している。
【0162】
１．３．ＭＡＭＰ－ＰＲＲシグナル伝達：ＮＦ－ｋＢレポータモデル
細胞表面受容体の刺激を介して細菌のＭＡＭＰは、ＮＦ－κＢの活性化および遺伝子発現の急速な変化をもたらす。例えば、Ｔｏｌｌ様受容体は、ＮＦ－κＢの活性化をもたらすパターン認識分子である（グラム陰性菌のＬＰＳ成分の受容体としてのＴＬＲ４）。
細胞表面受容体の刺激を介して細菌のＭＡＭＰは、ＮＦ－κＢの活性化および遺伝子発現の急速な変化をもたらす。例えば、Ｔｏｌｌ様受容体は、ＮＦ－κＢの活性化をもたらすパターン認識分子である（グラム陰性菌のＬＰＳ成分の受容体としてのＴＬＲ４）。
【0163】
インビトロ細胞培養物におけるＮＦ－ｋＢのＲＮＡ発現レベルは、様々な種類のＭＡＭＰによる細胞表面のパターン認識受容体の活性化についての明確なレポータシステムを提供する。
【0164】
この試験では、出願人は、主要な腸のＭｂｂプロトタイプであるＭ．スミシイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ）を不活化するために必要な閾値を明らかにし、不活化古細菌抽出物に由来するＭＡＭＰがニジマスの上皮細胞においてＬＰＳ誘導ＮＦ－ｋＢ活性化を阻害する能力を評価する。
【0165】
２．材料および方法
２．１．Ｍｂｂ処理
ＤＳＭＺから得られたＭ．スミシイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ）（Ｍｂｂ）の菌株を嫌気性バイオリアクタで培養した。
２．１．Ｍｂｂ処理
ＤＳＭＺから得られたＭ．スミシイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ）（Ｍｂｂ）の菌株を嫌気性バイオリアクタで培養した。
【0166】
＊定常増殖期に、細胞を回収し、ＰＢＳで２回すすいで、微量の培地をすべて除去した。
【0167】
次に、細胞を以下に記載するように様々な処理に曝露し、それらの生存能力を生死細胞染色および培養法を使用して評価した。
【0168】
２．１．１．生細胞、陽性対照
１００ｍｌの滅菌血清ボトルで、増殖培地２０ｍｌ中０．０１ｇの湿ったＭｂｂバイオマスの懸濁液を調製する－＞生存能力を評価する。
残りの細胞をＰＢＳ中１０％スクロース溶液５ｍＬに懸濁する。
急速凍結する。
ドライアイス上に保存し、その後凍結乾燥する。
１００ｍｌの滅菌血清ボトルで、増殖培地２０ｍｌ中０．０１ｇの湿ったＭｂｂバイオマスの懸濁液を調製する－＞生存能力を評価する。
残りの細胞をＰＢＳ中１０％スクロース溶液５ｍＬに懸濁する。
急速凍結する。
ドライアイス上に保存し、その後凍結乾燥する。
【0169】
２．１．２．紫外線不活化処理
紫外線照射のために、ＰＢＳ ７Ｌに湿ったＭｂｂバイオマス５ｇを懸濁する。
紫外線照射のために、ＰＢＳ ７Ｌに湿ったＭｂｂバイオマス５ｇを懸濁する。
【0170】
照射後（照射パラメータ：２ＫＪ／Ｌ放射線量、処理時間４０秒）、遠心分離し、ペレット化する。
【0171】
１００ｍｌの滅菌血清ボトルで、増殖培地２０ｍｌ中０．０１ｇの湿ったＭｂｂバイオマス（新しいＵＶ処理ペレットから）の懸濁液を調製する－＞生存能力を評価する。
残りの細胞をＰＢＳ中１０％スクロース溶液５ｍＬに懸濁する。
ドライアイス上に保存し、その後凍結乾燥する。
残りの細胞をＰＢＳ中１０％スクロース溶液５ｍＬに懸濁する。
ドライアイス上に保存し、その後凍結乾燥する。
【0172】
２．１．３．７２℃で１５分間－持続的熱処理
湿ったＭｂｂバイオマス５ｇを７２℃で１５分間置く（チューブを水浴に入れる）。
１００ｍｌの滅菌血清ボトルで、増殖培地２０ｍｌ中０．０１ｇの湿ったＭｂｂバイオマスの懸濁液を調製する－＞生存能力を評価する。
残りの細胞をＰＢＳ中１０％スクロース溶液５ｍＬに懸濁する。
急速凍結する。
ドライアイス上に保存し、その後凍結乾燥する。
湿ったＭｂｂバイオマス５ｇを７２℃で１５分間置く（チューブを水浴に入れる）。
１００ｍｌの滅菌血清ボトルで、増殖培地２０ｍｌ中０．０１ｇの湿ったＭｂｂバイオマスの懸濁液を調製する－＞生存能力を評価する。
残りの細胞をＰＢＳ中１０％スクロース溶液５ｍＬに懸濁する。
急速凍結する。
ドライアイス上に保存し、その後凍結乾燥する。
【0173】
２．１．４．８０℃で１分間－パルス熱処理
湿ったＭｂｂバイオマス５ｇを８０℃で１分間置く（チューブを水浴に入れる）。
１００ｍｌの滅菌血清ボトルで、増殖培地２０ｍｌ中０．０１ｇの湿ったＭｂｂバイオマスの懸濁液を調製する－＞生存能力を評価する。
残りの細胞をＰＢＳ中１０％スクロース溶液５ｍＬに懸濁する。
急速凍結する。
ドライアイス上に保存し、その後凍結乾燥する。
湿ったＭｂｂバイオマス５ｇを８０℃で１分間置く（チューブを水浴に入れる）。
１００ｍｌの滅菌血清ボトルで、増殖培地２０ｍｌ中０．０１ｇの湿ったＭｂｂバイオマスの懸濁液を調製する－＞生存能力を評価する。
残りの細胞をＰＢＳ中１０％スクロース溶液５ｍＬに懸濁する。
急速凍結する。
ドライアイス上に保存し、その後凍結乾燥する。
【0174】
２．１．５．凍結不活化処理
湿ったＭｂｂバイオマス５ｇを液体窒素（ＬＮ）中に１０分間入れる。
細胞を１０分間室温に移す（解凍されるまで）
凍結融解（ＬＮ＜－＞ＲＴ）をさらに１０回繰り返す。
１００ｍｌの滅菌血清ボトルで、増殖培地２０ｍｌ中０．０１ｇの湿ったＭｂｂバイオマスの懸濁液を調製する－＞生存能力を評価する。
残りの処理した細胞をＰＢＳ中１０％スクロース溶液５ｍＬに懸濁する。ドライアイス上に保存し、その後凍結乾燥する。
湿ったＭｂｂバイオマス５ｇを液体窒素（ＬＮ）中に１０分間入れる。
細胞を１０分間室温に移す（解凍されるまで）
凍結融解（ＬＮ＜－＞ＲＴ）をさらに１０回繰り返す。
１００ｍｌの滅菌血清ボトルで、増殖培地２０ｍｌ中０．０１ｇの湿ったＭｂｂバイオマスの懸濁液を調製する－＞生存能力を評価する。
残りの処理した細胞をＰＢＳ中１０％スクロース溶液５ｍＬに懸濁する。ドライアイス上に保存し、その後凍結乾燥する。
【0175】
２．１．６．湿潤細胞を空気に曝露することによる減弱
バイオリアクター内の空気を１０分間スパージする。
バイオリアクター内の空気を１０分間スパージする。
【0176】
２．２．生存能力試験
様々な処理後の古細菌の生存能力および不活化を、以下に記載するように生死染色および培養法を使用して評価した。
様々な処理後の古細菌の生存能力および不活化を、以下に記載するように生死染色および培養法を使用して評価した。
【0177】
２．２．１．生死染色
細胞の生存能力を、Ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ Ｂａｃｌｉｇｈｔ（登録商標）キットＬ７０１２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して評価した。
細胞の生存能力を、Ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ Ｂａｃｌｉｇｈｔ（登録商標）キットＬ７０１２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して評価した。
【0178】
２．２．１．１．フローサイトメトリ
Ｍ．スミシイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ）細胞を、製造者の指示に従って、Ｓｙｔｏ ９およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含むＬｉｖｅ／ｄｅａｄ Ｂａｃｌｉｇｈｔ（登録商標）キットＬ７０１２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で染色した。簡単に説明すると、Ｍ．スミシイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ）懸濁液２５０μＬを２０００×ｇまたは３０００×ｇでそれぞれ５分間遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを同じ初期容量の０．８５％ＮａＣｌで再懸濁した。懸濁液を約１ｘ１０８微生物／ｍＬ（約０．０３ ＯＤ６７０）に調整し、さらに０．８５％ＮａＣｌで１：１００に希釈して、最終密度を約１×１０６微生物／ｍＬにした。別途に、１の割合のＳｙｔｏ ９を１の割合のＰＩと混合し、この色素混合物０．７５μＬを各微生物懸濁液２５０μｌに添加し、最終混合物を暗所にて室温で２０分間インキュベートした。対照用に二組、試料用に三組調製した。
Ｍ．スミシイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ）細胞を、製造者の指示に従って、Ｓｙｔｏ ９およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含むＬｉｖｅ／ｄｅａｄ Ｂａｃｌｉｇｈｔ（登録商標）キットＬ７０１２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で染色した。簡単に説明すると、Ｍ．スミシイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ）懸濁液２５０μＬを２０００×ｇまたは３０００×ｇでそれぞれ５分間遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを同じ初期容量の０．８５％ＮａＣｌで再懸濁した。懸濁液を約１ｘ１０８微生物／ｍＬ（約０．０３ ＯＤ６７０）に調整し、さらに０．８５％ＮａＣｌで１：１００に希釈して、最終密度を約１×１０６微生物／ｍＬにした。別途に、１の割合のＳｙｔｏ ９を１の割合のＰＩと混合し、この色素混合物０．７５μＬを各微生物懸濁液２５０μｌに添加し、最終混合物を暗所にて室温で２０分間インキュベートした。対照用に二組、試料用に三組調製した。
【0179】
絶対計数を行う場合は、ＢＤ Ｔｒｕｃｏｕｎｔ（商標）チューブ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用した。各時点の複製物のアリコートを遠心分離し、前述のように処理した。約１ｘ１０６微生物／ｍＬの懸濁液の最終的な２５０μＬを、対応するＴｒｕｃｏｕｎｔ（商標）チューブ（各試料につき１チューブ）で製造者の指示に従って調製し、Ｓｙｔｏ ９＋ＰＩ混合物０．７５μＬを添加し、懸濁液を暗所にて室温で２０分間インキュベートした。
【0180】
フローサイトメトリの取得は、Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｃｏｒｅ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ｏｆ ｔｈｅ Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で実施された。取得は、チャネルＦＬ－１～ＦＬ－３に４８８ｎｍ励起レーザー、チャネルＦＬ－４に６３５ｎｍ励起レーザーを備えたＢＤ Ａｃｃｕｒｉ（商標）Ｃ６フローサイトメータ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して実施した。前方散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）を、４８８／１０ｎｍのバンドパスフィルタを通して４８８ｎｍ励起から収集した。Ｓｙｔｏ ９を４８８ｎｍレーザーで励起し、その発光を５３３／３０ｎｍのバンドパスフィルタを使用してＦＬ－１チャネルで収集した。ＰＩは、４８８ｎｍレーザーで励起し、その発光をＦＬ－３チャネルで６７０ｎｍのロングパスフィルタを通して収集した。絶対計数用のＴｒｕｃｏｕｎｔ（商標）チューブのビーズを６３５ｎｍレーザーで励起し、ＦＬ－４チャネルの６７５／２５ｎｍバンドパスフィルタを通して赤色蛍光を収集した。電圧補償は設定しなかった。細胞は、サイズ（ＦＳＣチャネル）よりも蛍光によってノイズからよりよく識別されるため、ＳＳＣ対ＦＬ－１プロットからゲートした。各試料について、「細胞」ゲートで１０，０００事象が記録された。データはＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６ソフトウェアで取得した。
【0181】
２．２．１．２．フローサイトメトリデータ解析
フローサイトメトリデータをＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェア（バージョン１０；（著作権）ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ，ＵＳＡ）で解析し、絶対計数を行う場合はＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６ソフトウェアも使用した。この装置での取得にはダブレットの排除を必要としなかった。生対照と死対照は、それぞれ「生」と「死」の集団のゲートを配置するのに役立った。「生」ゲートと「死」ゲートの間に出現する事象のために、「損傷」と名付けた別のゲートを設定した。各ゲートまたは集団の細胞の割合は、解析ソフトウェアによって与えられた。
フローサイトメトリデータをＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェア（バージョン１０；（著作権）ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ，ＵＳＡ）で解析し、絶対計数を行う場合はＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６ソフトウェアも使用した。この装置での取得にはダブレットの排除を必要としなかった。生対照と死対照は、それぞれ「生」と「死」の集団のゲートを配置するのに役立った。「生」ゲートと「死」ゲートの間に出現する事象のために、「損傷」と名付けた別のゲートを設定した。各ゲートまたは集団の細胞の割合は、解析ソフトウェアによって与えられた。
【0182】
各試料の生細胞の絶対濃度を、方程式３：
に従って生ゲートで計数された事象の数から決定し、ここで、Ｆはフラスコ内の濃度からフローサイトメトリで分析された画分までの希釈係数である。
【数1】
に従って生ゲートで計数された事象の数から決定し、ここで、Ｆはフラスコ内の濃度からフローサイトメトリで分析された画分までの希釈係数である。
【0183】
２．２．１．３．蛍光顕微鏡検査法
０．８５％ＮａＣｌに再懸濁した、遠心分離したＭ．スミシイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ）懸濁液（フローサイトメトリと同じ条件）を、０．８５％ＮａＣｌ（５０μＬ調製した）でさらに１：１０に希釈した。Ｓｙｔｏ ９／ＰＩ混合物０．１５μＬを細胞懸濁液に添加し、暗所にて室温で２０分間インキュベートした。続いて、各試料４μＬをスライド（７６×２６ｍｍ）に載せ、カバーガラス（２２×２２ｍｍ）で覆い、マニキュア液で密封した。画像取得と画像解析は、Ｂｉｏｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で実施された。Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ Ｚ１（Ｚｅｉｓｓ）に取り付けたＡｘｉｏＣａｍ ５０６ ｍｏｎｏ ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ｚｅｉｓｓ，Ｆｅｌｄｂａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用した。これに、０．０７２×０．０７２μｍの解像度を有する６３ｘ／１．４ＮＡオイルＰｌａｎ－Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ対物レンズを取り付けた。Ｓｙｔｏ ９を、励起用のＢＰ ４５０－４９０、ビームスプリッターとしてのＦＴ ５１０、および発光用のＢＰ ５１５－５６５で構成されるＦＩＴＣ（緑色）フィルタセットを通して励起し、検出した。ＰＩは、励起用のＢＰ ５４６／１２、ビームスプリッターとしてのＦＴ ５８０、および発光用のＬＰ ５９０で構成されるＣｙ３（赤色）フィルタセットを通して励起し、検出した。露光時間は、緑色チャネルについては１２０ミリ秒、赤色チャネルについては１５０ミリ秒に設定した。画像を、Ｗｉｎｄｏｗｓ １０ ＯＳで動作するＰＣ上でソフトウェアＺｅｎ（バージョン２．３、Ｚｅｉｓｓ）で記録し、処理した。示されている画像は、補間フィルタを使用して処理した。
０．８５％ＮａＣｌに再懸濁した、遠心分離したＭ．スミシイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ）懸濁液（フローサイトメトリと同じ条件）を、０．８５％ＮａＣｌ（５０μＬ調製した）でさらに１：１０に希釈した。Ｓｙｔｏ ９／ＰＩ混合物０．１５μＬを細胞懸濁液に添加し、暗所にて室温で２０分間インキュベートした。続いて、各試料４μＬをスライド（７６×２６ｍｍ）に載せ、カバーガラス（２２×２２ｍｍ）で覆い、マニキュア液で密封した。画像取得と画像解析は、Ｂｉｏｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で実施された。Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ Ｚ１（Ｚｅｉｓｓ）に取り付けたＡｘｉｏＣａｍ ５０６ ｍｏｎｏ ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ｚｅｉｓｓ，Ｆｅｌｄｂａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用した。これに、０．０７２×０．０７２μｍの解像度を有する６３ｘ／１．４ＮＡオイルＰｌａｎ－Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ対物レンズを取り付けた。Ｓｙｔｏ ９を、励起用のＢＰ ４５０－４９０、ビームスプリッターとしてのＦＴ ５１０、および発光用のＢＰ ５１５－５６５で構成されるＦＩＴＣ（緑色）フィルタセットを通して励起し、検出した。ＰＩは、励起用のＢＰ ５４６／１２、ビームスプリッターとしてのＦＴ ５８０、および発光用のＬＰ ５９０で構成されるＣｙ３（赤色）フィルタセットを通して励起し、検出した。露光時間は、緑色チャネルについては１２０ミリ秒、赤色チャネルについては１５０ミリ秒に設定した。画像を、Ｗｉｎｄｏｗｓ １０ ＯＳで動作するＰＣ上でソフトウェアＺｅｎ（バージョン２．３、Ｚｅｉｓｓ）で記録し、処理した。示されている画像は、補間フィルタを使用して処理した。
【0184】
２．２．１．４．統計分析
所与の温度での曝露後のＭ．スミシイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ）の増殖の程度を、処理後０日目から６日目までのＯＤ６００対時間のグラフの曲線下面積（ＡＵＣ）を決定することによって評価した。ＡＵＣ平均値間の有意差は、平均の多重比較のために一元配置分散分析およびテューキーのＨＳＤ検定によって評価した。
所与の温度での曝露後のＭ．スミシイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ）の増殖の程度を、処理後０日目から６日目までのＯＤ６００対時間のグラフの曲線下面積（ＡＵＣ）を決定することによって評価した。ＡＵＣ平均値間の有意差は、平均の多重比較のために一元配置分散分析およびテューキーのＨＳＤ検定によって評価した。
【0185】
Ｐ値が０．０５未満である場合に差は有意であると見なした。
【0186】
Ｏ．Ｄ．読み取りによる生細胞培養物の決定
細胞懸濁液の試料２ｍＬを取り、キュベットに入れる。（ブランクは水に対して測定される）。６００ｎｍの波長で光学密度（ＯＤ）を測定する。線形吸光度範囲は０．１～０．３であり、測定値がこの範囲よりも高い場合は、試料をＤＩ水で希釈しなければならない。
細胞懸濁液の試料２ｍＬを取り、キュベットに入れる。（ブランクは水に対して測定される）。６００ｎｍの波長で光学密度（ＯＤ）を測定する。線形吸光度範囲は０．１～０．３であり、測定値がこの範囲よりも高い場合は、試料をＤＩ水で希釈しなければならない。
【0187】
光学密度は、所与の範囲の細胞懸濁液中のバイオマスに正比例する。
【0188】
２．３．ＮＦ－ｋＢレポータシステム
ＮＦ－ｋＢは、パターン認識受容体（ＰＲＲ）の下流にシグナル伝達する転写因子である。ＮＦ－ｋＢの転写調節を測定することは、上流のパターン認識受容体の相互作用を決定する方法である。
ＮＦ－ｋＢは、パターン認識受容体（ＰＲＲ）の下流にシグナル伝達する転写因子である。ＮＦ－ｋＢの転写調節を測定することは、上流のパターン認識受容体の相互作用を決定する方法である。
【0189】
２．３．１．細胞
２４ウェルプレートおよび６ウェルプレート中の６８継代のＲＴｇｕｔＧＣ（ニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍｙｋｉｓｓ）の腸）細胞株の細胞。濃度ごとに、３つの複製ウェルに、それぞれ２４ウェルおよび６ウェルごとに２ｍｌおよび８ｍｌの曝露溶液を添加した。試験は１９±１℃で実施した。
２４ウェルプレートおよび６ウェルプレート中の６８継代のＲＴｇｕｔＧＣ（ニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍｙｋｉｓｓ）の腸）細胞株の細胞。濃度ごとに、３つの複製ウェルに、それぞれ２４ウェルおよび６ウェルごとに２ｍｌおよび８ｍｌの曝露溶液を添加した。試験は１９±１℃で実施した。
【表2】
【0190】
２．３．２．マーカ遺伝子
【表3】
【0191】
２．３．３．ＲＮＡの単離／ｃＤＮＡの合成
Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ ＭｉｎｉＫｉｔを使用して、ＲＴＧｕｔＧＣ細胞から全ＲＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡ汚染物質を、ｇＤＮＡ Ｅｌｉｍｉｎａｔｏｒスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して除去した。ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（ＰＥＱＬＡＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ ＧＭＢＨ）を使用してＲＮＡの量と質を決定した（付属書参照）。高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。
Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ ＭｉｎｉＫｉｔを使用して、ＲＴＧｕｔＧＣ細胞から全ＲＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡ汚染物質を、ｇＤＮＡ Ｅｌｉｍｉｎａｔｏｒスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して除去した。ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（ＰＥＱＬＡＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ ＧＭＢＨ）を使用してＲＮＡの量と質を決定した（付属書参照）。高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。
【0192】
２．３．４．マーカ遺伝子のｍＲＮＡ発現の定量化
選択したすべてのマーカ遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを、ＧｏＴａｑ（登録商標）ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して分析した。すべての試料を、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、白色３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅ）で３回重複して分析した。転写レベルを、独立したＲＮＡ単離からの試料のｃＤＮＡで測定した。ｑＰＣＲの結果を、様々なＰＣＲ増幅効率を考慮に入れたＱ－Ｇｅｎｅ Ｃｏｒｅ Ｍｏｄｕｌｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｑｇｅｎｅ．ｏｒｇ／）の正規化手順に従って、ハウスキーピング遺伝子ＥＦ１ａと比較して計算した。
選択したすべてのマーカ遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを、ＧｏＴａｑ（登録商標）ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して分析した。すべての試料を、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、白色３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅ）で３回重複して分析した。転写レベルを、独立したＲＮＡ単離からの試料のｃＤＮＡで測定した。ｑＰＣＲの結果を、様々なＰＣＲ増幅効率を考慮に入れたＱ－Ｇｅｎｅ Ｃｏｒｅ Ｍｏｄｕｌｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｑｇｅｎｅ．ｏｒｇ／）の正規化手順に従って、ハウスキーピング遺伝子ＥＦ１ａと比較して計算した。
【0193】
２．３．５．遺伝子発現解析試験項目の結果
各処理の３つの重複する生物学的複製物で測定された平均発現値と標準偏差が示されている。対照との統計的な有意な差（ａ＝陰性対照細胞培地との比較、ｂ＝陽性対照であるＬＰＳ ５０ｍｇ／ｌとの比較、およびｃ＝ＬＰＳ ５０ｍｇ／ｌ ６時間－Ｌ１５／ｅｘ ６時間との比較）を、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続くダネット検定（Ｐ＜０．０５）で決定した。
各処理の３つの重複する生物学的複製物で測定された平均発現値と標準偏差が示されている。対照との統計的な有意な差（ａ＝陰性対照細胞培地との比較、ｂ＝陽性対照であるＬＰＳ ５０ｍｇ／ｌとの比較、およびｃ＝ＬＰＳ ５０ｍｇ／ｌ ６時間－Ｌ１５／ｅｘ ６時間との比較）を、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続くダネット検定（Ｐ＜０．０５）で決定した。
【0194】
３．結果
３．１．不活化の閾値を決定し、パターン認識シグナル伝達能力を試験した
凍結乾燥されたＭｂｂは、極端な熱処理に対して耐性であった。不活化は、処理前に、最初にＭｂｂ細胞を湿潤培養物に懸濁する必要があった。Ｍｂｂ不活化閾値の要約を表２に示す。ＮＦ－ｋＢのシグナル伝達能力に対する処理の種類の影響も表４に示す。
３．１．不活化の閾値を決定し、パターン認識シグナル伝達能力を試験した
凍結乾燥されたＭｂｂは、極端な熱処理に対して耐性であった。不活化は、処理前に、最初にＭｂｂ細胞を湿潤培養物に懸濁する必要があった。Ｍｂｂ不活化閾値の要約を表２に示す。ＮＦ－ｋＢのシグナル伝達能力に対する処理の種類の影響も表４に示す。
【表4】
【0195】
凍結処理または短い熱パルス（８０℃で１分間）によるＭｂｂの不活化は、どちらもＮＦ－ｋＢレポータシグナル伝達経路との相互作用を維持する方法であり、これらの処理方法を使用した場合、ＭＡＭＰのシグナル伝達能力が維持されることを示す。
【0196】
対照的に、紫外線照射または持続的な熱（７２℃で１５分間）のいずれかを使用したＭｂｂの不活化は、ＮＦ－ｋＢパターン認識との相互作用を維持しなかった。
【0197】
３．２．培養中の細胞を空気に曝露することによる減弱
増殖培地の激しいスパージングによる湿ったＭｂｂ細胞の空気（酸素）への１０分間の曝露は、弱毒化状態を生じさせる。細胞は生存特徴（Ｆ４２０酵素および生細胞の染色特徴）を示すが、細胞内に空気が蓄積するため複製することができない。対照的に、凍結乾燥された乾燥細胞は、細胞内に空気を吸収しないため、空気に耐性である。
増殖培地の激しいスパージングによる湿ったＭｂｂ細胞の空気（酸素）への１０分間の曝露は、弱毒化状態を生じさせる。細胞は生存特徴（Ｆ４２０酵素および生細胞の染色特徴）を示すが、細胞内に空気が蓄積するため複製することができない。対照的に、凍結乾燥された乾燥細胞は、細胞内に空気を吸収しないため、空気に耐性である。
【0198】
３．３ ＮＦ－ｋＢレポータ経路を介したパターン認識シグナル伝達を維持するＭｂｂ不活化処理。
図３（Ａ）～（Ｅ）に示されている結果の統計的有意性：
Ａ）
培地対照Ｌ－１５／ｅｘとの有意差：
ＬＰＳ、試験項目１００ｍｇ／ｌ＋ＬＰＳ、ＬＰＳ（５時間）－Ｌ－１５／ｅｘ（５時間）、ＬＰＳ（５時間）－Ｐ／Ｓ ０．１ｍｇ／ｍｌ（５時間）、ＬＰＳ（５時間）－試験項目１００ｍｇ／ｌ（５時間）
Ｂ）
ＬＰＳ対照との有意差：
Ｌ－１５／ｅｘ、Ｐ／Ｓ ０．１ｍｇ／ｍｌ、試験項目１００ｍｇ／ｌ、試験項目
１００ｍｇ／ｌ＋ＬＰＳ、ＬＰＳ（５時間）－Ｌ－１５／ｅｘ（５時間）、ＬＰＳ（５時間）－Ｐ／Ｓ
０．１ｍｇ／ｍｌ（５時間）、ＬＰＳ（５時間）－試験項目１００ｍｇ／ｌ（５時間）
Ｃ）
ＬＰＳ ５０ｍｇ／ｌ ５時間－Ｌ－１５／ｅｘ ５時間との有意差：
Ｌ－１５／ｅｘ、ＬＰＳ、Ｐ／Ｓ ０．１ｍｇ／ｍｌ、試験項目１００ｍｇ／ｌ
図３（Ａ）～（Ｅ）に示されている結果の統計的有意性：
Ａ）
培地対照Ｌ－１５／ｅｘとの有意差：
ＬＰＳ、試験項目１００ｍｇ／ｌ＋ＬＰＳ、ＬＰＳ（５時間）－Ｌ－１５／ｅｘ（５時間）、ＬＰＳ（５時間）－Ｐ／Ｓ ０．１ｍｇ／ｍｌ（５時間）、ＬＰＳ（５時間）－試験項目１００ｍｇ／ｌ（５時間）
Ｂ）
ＬＰＳ対照との有意差：
Ｌ－１５／ｅｘ、Ｐ／Ｓ ０．１ｍｇ／ｍｌ、試験項目１００ｍｇ／ｌ、試験項目
１００ｍｇ／ｌ＋ＬＰＳ、ＬＰＳ（５時間）－Ｌ－１５／ｅｘ（５時間）、ＬＰＳ（５時間）－Ｐ／Ｓ
０．１ｍｇ／ｍｌ（５時間）、ＬＰＳ（５時間）－試験項目１００ｍｇ／ｌ（５時間）
Ｃ）
ＬＰＳ ５０ｍｇ／ｌ ５時間－Ｌ－１５／ｅｘ ５時間との有意差：
Ｌ－１５／ｅｘ、ＬＰＳ、Ｐ／Ｓ ０．１ｍｇ／ｍｌ、試験項目１００ｍｇ／ｌ
【0199】
結論
Ｍｂｂの不活化閾値を特徴づけた。短い熱パルスまたは凍結処理は、どちらもＬＰＳ誘発炎症の抑制に関与する機能的断片を保存する方法であった。
Ｍｂｂの不活化閾値を特徴づけた。短い熱パルスまたは凍結処理は、どちらもＬＰＳ誘発炎症の抑制に関与する機能的断片を保存する方法であった。
【0200】
本発明の方法に従って不活化されたＭｂｂは、ＮＦ－ｋＢレポータシステムを調節できることが証明され、生物活性ＭＡＭＰが不活化処理後に維持されることを示した。
【0201】
例５
ニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍｙｋｉｓｓ）の赤口病の経過に対する不活化古細菌抽出物の効果を試験するための実験
背景技術
養殖業は世界で最も急速に成長しつつある産業の１つであり、世界のタンパク質資源の重要な部分を生み出している。しかし、様々な要因、とりわけ疾患が、養殖の取り組みの生産性に影響を及ぼす。集中的な養魚条件では、細菌性疾患は壊滅的な影響を及ぼす可能性がある。感染を防止するまたはその影響を軽減するために、様々なアプローチを検討しなければならない。抗生物質に耐性のある細菌の問題が増加していることを考えると、代替手段が必要であり、大いに歓迎される。可能性のある１つのアプローチは、腸の免疫系に有益な作用をもたらし、細菌感染の有害な影響を軽減することができる添加物を含む飼料を飼育動物に与えることである。
ニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍｙｋｉｓｓ）の赤口病の経過に対する不活化古細菌抽出物の効果を試験するための実験
背景技術
養殖業は世界で最も急速に成長しつつある産業の１つであり、世界のタンパク質資源の重要な部分を生み出している。しかし、様々な要因、とりわけ疾患が、養殖の取り組みの生産性に影響を及ぼす。集中的な養魚条件では、細菌性疾患は壊滅的な影響を及ぼす可能性がある。感染を防止するまたはその影響を軽減するために、様々なアプローチを検討しなければならない。抗生物質に耐性のある細菌の問題が増加していることを考えると、代替手段が必要であり、大いに歓迎される。可能性のある１つのアプローチは、腸の免疫系に有益な作用をもたらし、細菌感染の有害な影響を軽減することができる添加物を含む飼料を飼育動物に与えることである。
【0202】
目的
この例は、ニジマスの腸内赤口病（Ｅｎｔｅｒｉｃ Ｒｅｄ Ｍｏｕｔｈ Ｄｉｓｅａｓｅ）（ＥＲＭ）の経過に対する不活化メタノブレビバクター（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）（Ｍｂｂ）古細菌抽出物の効果を試験することを目的とした。ＥＲＭの病因物質であるエルシニア・ルッケリ（Ｙｅｒｓｉｎａ ｒｕｃｋｅｒｉ）を魚に投与し、不活化古細菌抽出物を与えた群における疾患の経過を、対照食を与えた群の経過と比較した。
この例は、ニジマスの腸内赤口病（Ｅｎｔｅｒｉｃ Ｒｅｄ Ｍｏｕｔｈ Ｄｉｓｅａｓｅ）（ＥＲＭ）の経過に対する不活化メタノブレビバクター（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）（Ｍｂｂ）古細菌抽出物の効果を試験することを目的とした。ＥＲＭの病因物質であるエルシニア・ルッケリ（Ｙｅｒｓｉｎａ ｒｕｃｋｅｒｉ）を魚に投与し、不活化古細菌抽出物を与えた群における疾患の経過を、対照食を与えた群の経過と比較した。
【0203】
材料および方法
魚：
体重２９＋１グラムの若齢ニジマスを入手し、対照食および実験食（すなわち本発明の組成物）を１ヶ月間与えた。
魚：
体重２９＋１グラムの若齢ニジマスを入手し、対照食および実験食（すなわち本発明の組成物）を１ヶ月間与えた。
【0204】
タンク：
順化および攻撃誘発実験開始までのその後の期間には、水道水のフロースルーシステムと一定の曝気を備えた１３０リットルのガラス水槽を使用した。実験全体を通して水温は１５．５±１．０℃に維持した。
順化および攻撃誘発実験開始までのその後の期間には、水道水のフロースルーシステムと一定の曝気を備えた１３０リットルのガラス水槽を使用した。実験全体を通して水温は１５．５±１．０℃に維持した。
【0205】
攻撃誘発実験のために、試験魚を、水道水のフロースルーシステムと一定の曝気を備えた３８リットルのガラス水槽に移した。水温は１５．５±１．０℃に維持した。
【0206】
魚に体重の１％の割合で毎日給餌した。食餌の割合は、魚の体重増加に合わせて定期的に調整した。攻撃誘発実験では、すべての水槽で生き残った魚の数に合わせて食餌の割合を毎日調整した。
【0207】
試験食：
すべての食餌を魚の到着から実験の終了まで与えた。
すべての食餌を魚の到着から実験の終了まで与えた。
【表5】
【0208】
Ｍｂｂは出願人が調製した。Ｍ．スミシイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ）の純粋培養物を採取し、細胞計数チャンバを使用して数えた。熱処理を使用して湿潤細胞を不活化し（ＢＡＣ Ｌｉｇｈｔ生死染色法およびＯ．Ｄ．培養法で検証）、その後、魚の飼料ペレットに含める前に凍結乾燥した。
【0209】
魚の取り扱い
到着時に、魚を群およびタンクごとに計量した。その後、攻撃誘発実験のために実験タンクに移したときに魚を計量した。得られたデータに基づいて、タンク当たりの食餌の平均投与量を計算し、それに応じて調整した。
到着時に、魚を群およびタンクごとに計量した。その後、攻撃誘発実験のために実験タンクに移したときに魚を計量した。得られたデータに基づいて、タンク当たりの食餌の平均投与量を計算し、それに応じて調整した。
【0210】
細菌
実験室分離株およびＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（ＩＶＢ）から入手したエルシニア・ルッケリ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｒｕｃｋｅｒｉ）の分離株（指定名１７／Ｒｅｆ０２６４）を使用した。後者の分離株は、もともと商業的養魚場のニジマスから分離されていた。
実験室分離株およびＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（ＩＶＢ）から入手したエルシニア・ルッケリ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｒｕｃｋｅｒｉ）の分離株（指定名１７／Ｒｅｆ０２６４）を使用した。後者の分離株は、もともと商業的養魚場のニジマスから分離されていた。
【0211】
細菌を２５℃のＬＢ培地で増殖させ、１８時間後に回収した。次に、細菌の密度を分光光度法で評価し、ＰＢＳで濃度を必要な値に調整した。
【0212】
攻撃誘発用量の決定
適切な攻撃誘発用量を決定するために、予備実験を実施した。４つの用量：５＊１０４、１０５、５＊１０５および１０６細菌／ｍｌを評価した。各用量の実験室株を使用した最初の実験では、１０匹の魚を感染させた。２番目の同様の実験では、ただし今回は分離株１７／Ｒｅｆ０２６４を使用して、用量ごとに５匹の魚を使用した。これらの実験を、水道水のフロースルーシステムおよび一定の曝気を備えた４つの個別の３８リットルガラス水槽で実施した。水温は１５．５±０．５℃であった。予備攻撃誘発実験の魚には対照食を与えた。
適切な攻撃誘発用量を決定するために、予備実験を実施した。４つの用量：５＊１０４、１０５、５＊１０５および１０６細菌／ｍｌを評価した。各用量の実験室株を使用した最初の実験では、１０匹の魚を感染させた。２番目の同様の実験では、ただし今回は分離株１７／Ｒｅｆ０２６４を使用して、用量ごとに５匹の魚を使用した。これらの実験を、水道水のフロースルーシステムおよび一定の曝気を備えた４つの個別の３８リットルガラス水槽で実施した。水温は１５．５±０．５℃であった。予備攻撃誘発実験の魚には対照食を与えた。
【0213】
感染は、水量を１０リットルに下げ、魚を細菌に１時間曝露することによって実施した。この期間中、水流を停止し、曝気を増加させた。１時間後、水流を再開し、曝気を通常の力に設定した。
【0214】
その後、毎日の死亡率を１４日間にわたって記録した。
【0215】
攻撃誘発実験
適切な感染量を決定した後、各食餌群からの魚を群ごとに３つの３８リットルタンクに無作為に分配した（タンク当たり２０匹の魚）。これにより、合計１２のタンクが生じた。次に、魚を攻撃誘発し、手順は予備実験と同じであった。予備実験の結果に基づいて、感染量を３＊１０５細菌／ｍｌに設定し、分離株１７／Ｒｅｆ０２６４を使用した。
適切な感染量を決定した後、各食餌群からの魚を群ごとに３つの３８リットルタンクに無作為に分配した（タンク当たり２０匹の魚）。これにより、合計１２のタンクが生じた。次に、魚を攻撃誘発し、手順は予備実験と同じであった。予備実験の結果に基づいて、感染量を３＊１０５細菌／ｍｌに設定し、分離株１７／Ｒｅｆ０２６４を使用した。
【0216】
その後、毎日の死亡率を記録し、福祉上の理由から瀕死の魚を取り出し、安楽死させた。これらの動物は死亡として数えた。データから、経時的な死亡率および相対生存率（ＲＰＳ）の群平均値を計算した。後者については、次の式を使用した：
１－（特別食群の累積死亡率％／対照群の累積死亡率％）ｘ１００。
１－（特別食群の累積死亡率％／対照群の累積死亡率％）ｘ１００。
【0217】
疾患の経過は、いずれのタンクでも少なくとも３日間連続して死亡／瀕死の動物が認められなくなるまで、４週間追跡した。
【0218】
追加調査
主な実験では、各タンクからの最初に死亡した魚を細菌学的検討に供し、死亡を引き起こす細菌学的病因を確認した。これらの魚から増殖した細菌をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＦ ＭＳによって同定した。実験の終わりに、生き残ったすべての魚を感染の外部徴候について評価した。
主な実験では、各タンクからの最初に死亡した魚を細菌学的検討に供し、死亡を引き起こす細菌学的病因を確認した。これらの魚から増殖した細菌をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＦ ＭＳによって同定した。実験の終わりに、生き残ったすべての魚を感染の外部徴候について評価した。
【0219】
結果
感染量の決定
実験室株を使用した予備攻撃誘発では、死亡は全く発生せず、分離株が魚に対する病原性を失っていることを示した。２回目の予備攻撃誘発では、１０５、５＊１０５および１０６細菌／ｍｌで攻撃誘発した魚の死亡率が得られた（表６）。対照群の死亡率５０％を目標としたため、予備試験の結果に基づいて、３＊１０５細菌／ｍｌの攻撃誘発用量を選択した。
感染量の決定
実験室株を使用した予備攻撃誘発では、死亡は全く発生せず、分離株が魚に対する病原性を失っていることを示した。２回目の予備攻撃誘発では、１０５、５＊１０５および１０６細菌／ｍｌで攻撃誘発した魚の死亡率が得られた（表６）。対照群の死亡率５０％を目標としたため、予備試験の結果に基づいて、３＊１０５細菌／ｍｌの攻撃誘発用量を選択した。
【表6】
【0220】
攻撃誘発実験
最初の瀕死の魚は、感染の８日後（ｄ．ｐ．ｉ．）に対照群の１つの複製で発見された。感染後１０日目に、本発明の組成物を与えられた群の水槽でも瀕死の魚が報告された。累積死亡率の経過を図４に示す。
最初の瀕死の魚は、感染の８日後（ｄ．ｐ．ｉ．）に対照群の１つの複製で発見された。感染後１０日目に、本発明の組成物を与えられた群の水槽でも瀕死の魚が報告された。累積死亡率の経過を図４に示す。
【0221】
すべての水槽からの最初の瀕死の魚を安楽死させ、Ｙ．ルッケリ（Ｙ．ｒｕｃｋｅｒｉ）の存在について分析した。検討したすべての魚から細菌培養物を増殖させることができ、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＦ ＭＳによる同定でそれらがＹ．ルッケリ（Ｙ．ｒｕｃｋｅｒｉ）であることを確認した。他の細菌は見出されなかった。したがって、ＥＲＭ病原体を疾患の唯一の原因として決定することができた。瀕死の動物は、出血性のひれ、体腔の漿膜の点状出血、体の筋肉組織の出血、および胃と腸の水などの、ＥＲＭの典型的な特徴を示した。群間の病理学的な相違は明らかではなかった。
【0222】
群間の有意差を調べるために様々な統計方法を適用した；しかし、群間で差は有意ではなかった。
【0223】
考察
不活化されたＭｂｂ古細菌抽出物（本発明の組成物）を添加した食餌は、細菌エルシニア・ルッケリ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｒｕｃｋｅｒｉ）で攻撃誘発されたニジマスの経過および累積死亡率に影響を及ぼした。この影響は、対照食を与えられた魚と比較して、不活化されたＭｂｂ古細菌抽出物を与えられた魚において有益であった。プラスの作用は、不活化古細菌抽出物処理に帰することができる。累積死亡率がより低かっただけでなく、不活化古細菌抽出物を与えられた魚では死亡の始まりが対照よりも遅かった。
不活化されたＭｂｂ古細菌抽出物（本発明の組成物）を添加した食餌は、細菌エルシニア・ルッケリ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｒｕｃｋｅｒｉ）で攻撃誘発されたニジマスの経過および累積死亡率に影響を及ぼした。この影響は、対照食を与えられた魚と比較して、不活化されたＭｂｂ古細菌抽出物を与えられた魚において有益であった。プラスの作用は、不活化古細菌抽出物処理に帰することができる。累積死亡率がより低かっただけでなく、不活化古細菌抽出物を与えられた魚では死亡の始まりが対照よりも遅かった。
【0224】
不活化古細菌抽出物を与えられた魚が対照群よりも累積死亡率が低かったという所見は、新規で予想外である。
【0225】
要約すると、エルシニア・ルッケリ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｒｕｃｋｅｒｉ）で攻撃誘発された魚に対する不活化Ｍｂｂ古細菌抽出物の有益な作用を実証することができた。
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図3-3】
【図4】
