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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-06-26
(45)【発行日】2024-07-05
(54)【発明の名称】新規ＣＤＰ－リビトール誘導体
(51)【国際特許分類】
C07H 19/10 20060101AFI20240627BHJP
A61K 31/7068 20060101ALI20240627BHJP
A61P 21/04 20060101ALI20240627BHJP
【ＦＩ】
C07H19/10 CSP
A61K31/7068
A61P21/04
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2020067017
(22)【出願日】2020-04-02
(65)【公開番号】P2021161092
(43)【公開日】2021-10-11
【審査請求日】2023-03-15
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２９年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、「革新的先端研究開発支援事業ユニットタイプ「メカノバイオロジー機構の解明による革新的医療機器及び医療技術の創出」」「機械受容応答を支える膜・糖鎖環境の解明と筋疾患治療への展開」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願 平成２９年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、「難治性疾患実用化研究事業」「新規修飾体リビトールリン酸の病態生理機能に着目した福山型 筋ジストロフィーの発症機序の解明と治療法の開発」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(73)【特許権者】
【識別番号】504150450
【氏名又は名称】国立大学法人神戸大学
(74)【代理人】
【識別番号】110002837
【氏名又は名称】弁理士法人アスフィ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】金川 基
(72)【発明者】
【氏名】戸田 達史
(72)【発明者】
【氏名】小林 千浩
(72)【発明者】
【氏名】徳岡 秀紀
【審査官】早川 裕之
(56)【参考文献】
【文献】Glycobiology，2012年，22，1760-1767
【文献】Cell Reports，2016年，14，2209-2223
【文献】J. Chem. Soc.，1959年，2192-2196
【文献】Nature Communications，2022年，13，1847(1-13)
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｈ
Ａ６１Ｋ ３１／
Ａ６１Ｐ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記式（Ｉ1）で表されることを特徴とするＣＤＰ－リビトール誘導体またはその薬学的に許容される塩。【化1】
Ｒ1～Ｒ4は、独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキル－カルボニル基、またはＣ1-6アルコキシ－カルボニル基を示し、
Ｒ5とＲ6は、独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキル基、置換基を有していてもよいＣ6-12アリール基、またはＣ6-12アリール基上に置換基を有していてもよいＣ6-12アリール－メチル基を示し、
Ｃ6-12アリール基上の置換基は、Ｃ1-6アルコキシ基、またはＣ1-6アルキル－カルボニルオキシ基を示し、
Ｒ7とＲ8は、独立して、ＯＨ、Ｃ1-6アルキル－カルボニルオキシ基、Ｃ1-6アルコキシ－カルボニルオキシ基、Ｃ1-6アルコキシ基、またはハロゲノ基を示し、
但し、Ｒ1～Ｒ6がＨである場合、Ｒ7とＲ8は、独立して、Ｃ1-6アルキル－カルボニルオキシ基、Ｃ1-6アルコキシ－カルボニルオキシ基、Ｃ1-6アルコキシ基、またはハロゲノ基を示す。］
【請求項2】
ＣＤＰ－リビトール誘導体が下記式（Ｉ2）で表されるＣＤＰ－リビトール誘導体である請求項１に記載のＣＤＰ－リビトール誘導体またはその薬学的に許容される塩。【化2】
【請求項3】
Ｒ1～Ｒ4が、独立して、Ｃ1-4アルキル－カルボニル基である請求項１または２に記載のＣＤＰ－リビトール誘導体またはその薬学的に許容される塩。
【請求項4】
Ｒ5とＲ6がＨである請求項１～３のいずれかに記載のＣＤＰ－リビトール誘導体またはその薬学的に許容される塩。
【請求項5】
Ｒ5とＲ6が、独立して、Ｃ6-12アリール基上に置換基を有していてもよいＣ6-12アリール－メチル基である請求項１～３のいずれかに記載のＣＤＰ－リビトール誘導体またはその薬学的に許容される塩。
【請求項6】
Ｒ5とＲ6が、独立して、フェニル基上に置換基としてＣ1-6アルキル－カルボニルオキシ基を有するベンジル基である請求項１～３のいずれかに記載のＣＤＰ－リビトール誘導体またはその薬学的に許容される塩。
【請求項7】
Ｒ7とＲ8がＯＨである請求項１～６のいずれかに記載のＣＤＰ－リビトール誘導体またはその薬学的に許容される塩。
【請求項8】
請求項１～７のいずれかに記載のＣＤＰ－リビトール誘導体またはその薬学的に許容される塩を含有することを特徴とする医薬。
【請求項9】
請求項１～７のいずれかに記載のＣＤＰ－リビトール誘導体またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とするジストログリカン異常症治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ジストログリカン異常症の治療に有効な新規ＣＤＰ－リビトール誘導体、当該ＣＤＰ－リビトール誘導体を含む医薬、および当該ＣＤＰ－リビトール誘導体を含むジストログリカン異常症治療剤に関するものである。
【背景技術】
【0002】
筋ジストロフィーは、進行性の筋力低下が認められる遺伝性疾患の総称であり、５０以上の原因遺伝子が解明されている。筋ジストロフィーのうち福山型筋ジストロフィーは日本に多くみられ、その原因はフクチン（ｆｕｋｕｔｉｎまたはＦＫＴＮ）遺伝子の異常であることが知られている。肢帯型筋ジストロフィー、先天型筋ジストロフィー、Ｗａｌｋｅｒ－Ｗａｒｂｕｒｇ症候群など、福山型筋ジストロフィーの類縁疾患は世界中にみられ、福山型も含めてジストログリカン異常症と呼ばれている。
【0003】
ジストログリカンは膜タンパク質であり、ジストロフィンを介して細胞内の細胞骨格と結合していると共に、糖鎖とラミニンを介して細胞外の基底膜とも結合しており、筋収縮に伴う筋細胞の損傷を防ぐ杭のような役割を果たしている。ジストログリカンは、糖鎖形成など様々な翻訳後修飾を受け、本発明者らは、リビトールリン酸という糖アルコールリン酸がジストログリカンの糖鎖の中に存在し、その生合成障害によりジストログリカン異常症が生じることを報告している（非特許文献１）。ジストログリカンの糖鎖中には２分子のリビトールリン酸が含まれており、これらリビトールリン酸は、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）－リビトールからフクチン（ＦＫＴＮ）とＦＫＲＰにより糖鎖中に組み込まれる。
【0004】
また、本発明者らは、ＩＳＰＤ（ＩｓｏＰｒｅｎｏｉｄ ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）がシチジン三リン酸（ＣＴＰ）とリビトール－５－リン酸からＣＤＰ－リビトールを生合成する酵素であることも明らかにしている（非特許文献１）。つまり、ＩＳＰＤ、フクチン、ＦＫＲＰの遺伝子異常を原因とする疾患は、リビトールリン酸不全症ということができる。そこで本発明者らは、ＣＤＰ－リビトールを有効成分として含有するジストログリカン糖修飾異常に伴う疾患の治療剤を開発している（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】国際公開第２０１８／０３４３３４号パンフレット
【非特許文献】
【0006】
【文献】Ｋａｎａｇａｗａ Ｍら，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．，２０１６，１４（９），２２０９－２２２３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
上述したように、本発明者らは、ジストログリカン異常症などジストログリカン糖修飾異常に伴う疾患の治療剤を開発している。しかし、より一層優れたジストログリカン異常症の治療のための有効成分が求められている。
そこで本発明は、ジストログリカン異常症の治療に有効な新規ＣＤＰ－リビトール誘導体、当該ＣＤＰ－リビトール誘導体を含む医薬、および当該ＣＤＰ－リビトール誘導体を含むジストログリカン異常症治療剤を提供することを目的とする。
そこで本発明は、ジストログリカン異常症の治療に有効な新規ＣＤＰ－リビトール誘導体、当該ＣＤＰ－リビトール誘導体を含む医薬、および当該ＣＤＰ－リビトール誘導体を含むジストログリカン異常症治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、ＣＤＰ－リビトールの特定の誘導体が、ＣＤＰ－リビトール生合成酵素（ＩＳＰＤ）遺伝子をノックダウンした細胞やマウスにおけるジストログリカンの糖鎖形成を回復させることを見出して、本発明を完成した。
以下、本発明を示す。
以下、本発明を示す。
【0009】
［１］ 下記式（Ｉ1）で表されることを特徴とするＣＤＰ－リビトール誘導体またはその薬学的に許容される塩。
［式中、
Ｒ1～Ｒ4は、独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキル－カルボニル基、またはＣ1-6アルコキシ－カルボニル基を示し、
Ｒ5とＲ6は、独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキル基、置換基を有していてもよいＣ6-12アリール基、Ｃ6-12アリール基上に置換基を有していてもよいＣ6-12アリール－アミノ基、またはＣ6-12アリール基上に置換基を有していてもよいＣ6-12アリール－メチル基を示し、
Ｃ6-12アリール基上の置換基は、Ｃ1-6アルコキシ基、またはＣ1-6アルキル－カルボニルオキシ基を示し、
Ｒ7とＲ8は、独立して、ＯＨ、Ｃ1-6アルキル－カルボニルオキシ基、Ｃ1-6アルコキシ－カルボニルオキシ基、Ｃ1-6アルコキシ基、またはハロゲノ基を示し、
但し、Ｒ1～Ｒ6がＨである場合、Ｒ7とＲ8は、独立して、Ｃ1-6アルキル－カルボニルオキシ基、Ｃ1-6アルコキシ－カルボニルオキシ基、Ｃ1-6アルコキシ基、またはハロゲノ基を示す。］
［２］ ＣＤＰ－リビトール誘導体が下記式（Ｉ2）で表されるＣＤＰ－リビトール誘導体である上記［１］に記載のＣＤＰ－リビトール誘導体またはその薬学的に許容される塩。
［式中、Ｒ1～Ｒ8は上記と同義を示す。］
［３］ Ｒ1～Ｒ4が、独立して、Ｃ1-4アルキル－カルボニル基である上記［１］または［２］に記載のＣＤＰ－リビトール誘導体またはその薬学的に許容される塩。
［４］ Ｒ5とＲ6がＨである上記［１］～［３］のいずれかに記載のＣＤＰ－リビトール誘導体またはその薬学的に許容される塩。
［５］ Ｒ5とＲ6が、独立して、Ｃ6-12アリール基上に置換基を有していてもよいＣ6-12アリール－メチル基である上記［１］～［３］のいずれかに記載のＣＤＰ－リビトール誘導体またはその薬学的に許容される塩。
［６］ Ｒ5とＲ6が、独立して、フェニル基上に置換基としてＣ1-6アルキル－カルボニルオキシ基を有するベンジル基である上記［１］～［３］のいずれかに記載のＣＤＰ－リビトール誘導体またはその薬学的に許容される塩。
［７］ Ｒ7とＲ8がＯＨである上記［１］～［６］のいずれかに記載のＣＤＰ－リビトール誘導体またはその薬学的に許容される塩。
［８］ 上記［１］～［７］のいずれかに記載のＣＤＰ－リビトール誘導体またはその薬学的に許容される塩を含有することを特徴とする医薬。
［９］ 上記［１］～［７］のいずれかに記載のＣＤＰ－リビトール誘導体またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とするジストログリカン異常症治療剤。
【化1】
Ｒ1～Ｒ4は、独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキル－カルボニル基、またはＣ1-6アルコキシ－カルボニル基を示し、
Ｒ5とＲ6は、独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキル基、置換基を有していてもよいＣ6-12アリール基、Ｃ6-12アリール基上に置換基を有していてもよいＣ6-12アリール－アミノ基、またはＣ6-12アリール基上に置換基を有していてもよいＣ6-12アリール－メチル基を示し、
Ｃ6-12アリール基上の置換基は、Ｃ1-6アルコキシ基、またはＣ1-6アルキル－カルボニルオキシ基を示し、
Ｒ7とＲ8は、独立して、ＯＨ、Ｃ1-6アルキル－カルボニルオキシ基、Ｃ1-6アルコキシ－カルボニルオキシ基、Ｃ1-6アルコキシ基、またはハロゲノ基を示し、
但し、Ｒ1～Ｒ6がＨである場合、Ｒ7とＲ8は、独立して、Ｃ1-6アルキル－カルボニルオキシ基、Ｃ1-6アルコキシ－カルボニルオキシ基、Ｃ1-6アルコキシ基、またはハロゲノ基を示す。］
［２］ ＣＤＰ－リビトール誘導体が下記式（Ｉ2）で表されるＣＤＰ－リビトール誘導体である上記［１］に記載のＣＤＰ－リビトール誘導体またはその薬学的に許容される塩。
【化2】
［３］ Ｒ1～Ｒ4が、独立して、Ｃ1-4アルキル－カルボニル基である上記［１］または［２］に記載のＣＤＰ－リビトール誘導体またはその薬学的に許容される塩。
［４］ Ｒ5とＲ6がＨである上記［１］～［３］のいずれかに記載のＣＤＰ－リビトール誘導体またはその薬学的に許容される塩。
［５］ Ｒ5とＲ6が、独立して、Ｃ6-12アリール基上に置換基を有していてもよいＣ6-12アリール－メチル基である上記［１］～［３］のいずれかに記載のＣＤＰ－リビトール誘導体またはその薬学的に許容される塩。
［６］ Ｒ5とＲ6が、独立して、フェニル基上に置換基としてＣ1-6アルキル－カルボニルオキシ基を有するベンジル基である上記［１］～［３］のいずれかに記載のＣＤＰ－リビトール誘導体またはその薬学的に許容される塩。
［７］ Ｒ7とＲ8がＯＨである上記［１］～［６］のいずれかに記載のＣＤＰ－リビトール誘導体またはその薬学的に許容される塩。
［８］ 上記［１］～［７］のいずれかに記載のＣＤＰ－リビトール誘導体またはその薬学的に許容される塩を含有することを特徴とする医薬。
［９］ 上記［１］～［７］のいずれかに記載のＣＤＰ－リビトール誘導体またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とするジストログリカン異常症治療剤。
【発明の効果】
【0010】
本発明に係る新規ＣＤＰ－リビトール誘導体は、ＣＤＰ－リビトールに比べて、ＣＤＰ－リビトール生合成酵素（ＩＳＰＤ）遺伝子をノックダウンした細胞やマウスにおけるジストログリカンの糖鎖形成の回復活性が優れていた。よって本発明に係る新規ＣＤＰ－リビトール誘導体は、ジストログリカンの糖鎖形成異常を原因とするジストログリカン異常症の治療に有効である。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【発明を実施するための形態】
【0012】
式（Ｉ1）で表されるＣＤＰ－リビトール誘導体（以下、「ＣＤＰ－リビトール誘導体（Ｉ1）」という）において、絶対構造に関して、還元糖部分はリビトールが好ましく、フラノース部分はリボースが好ましい。即ち、ＣＤＰ－リビトール誘導体（Ｉ1）は生体内で加水分解されて、ヌクレアーゼ耐性および／または活性がＣＤＰ－リビトールよりも優れるヌクレオシド二リン酸－還元糖となる可能性もあるが、生体内でＣＤＰ－リビトールに変換される式（Ｉ2）で表されるＣＤＰ－リビトール誘導体（以下、「ＣＤＰ－リビトール誘導体（Ｉ2）」という）が好ましい。以下、ＣＤＰ－リビトール誘導体（Ｉ1）とＣＤＰ－リビトール誘導体（Ｉ2）をまとめてＣＤＰ－リビトール誘導体（Ｉ）という。
【0013】
ＣＤＰ－リビトール誘導体（Ｉ）において、Ｒ1～Ｒ4は、水酸基を構成するＨ、またはリビトール部分の水酸基の保護基である。Ｒ1～Ｒ4がＨである場合、ＣＤＰ－リビトール誘導体（Ｉ）の親水性は比較的高く、毒性が比較的低いと考えられる。一方、Ｒ1～Ｒ4がＣ1-6アルキル－カルボニル基またはＣ1-6アルコキシ－カルボニル基である場合、ＣＤＰ－リビトール誘導体（Ｉ）の脂溶性は高くなり、細胞内に取り込まれ易くなる一方で、Ｃ1-6アルキル－カルボニル基またはＣ1-6アルコキシ－カルボニル基は、細胞内に取り込まれた後、細胞内のエステラーゼ等の加水分解酵素により除去されると考えられる。特にＣ1-6アルコキシ－カルボニル基は炭酸エステル構造のため加水分解され易いと考えられる。
【0014】
「Ｃ1-6アルキル基」は、炭素数１以上、６以下の直鎖状または分枝鎖状の一価飽和脂肪族炭化水素基をいう。例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓ－ブチル、ｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル等である。
【0015】
「Ｃ1-6アルコキシ基」は、炭素数１以上、６以下の直鎖状または分枝鎖状の脂肪族炭化水素オキシ基をいう。例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ－ブトキシ、イソブトキシ、ｔ－ブトキシ、ｎ－ペントキシ、ｎ－ヘキソキシ等である。
【0016】
Ｒ1～Ｒ4のＣ1-6アルキル－カルボニル基またはＣ1-6アルコキシ－カルボニル基を構成するＣ1-6アルキル基またはＣ1-6アルコキシ基の炭素数が少ないほど毒性が低下する可能性があるため、これら基の炭素数としては１以上、４以下が好ましく、１または２がより好ましく、１がより更に好ましい。特にアセチル基およびメトキシカルボニル基は、生体適合性が高いといえる。但し、これら基の炭素数が多いほど脂溶性が上がり、細胞内取込量が増加する可能性もある。
【0017】
ＣＤＰ－リビトール誘導体（Ｉ）においてＲ5およびＲ6がＨであるか、更にリン酸基が薬学的に許容される塩になっている場合、ＣＤＰ－リビトール誘導体（Ｉ）の親水性が高く、水溶液または懸濁液である液状医薬へ製剤化し易く、また、毒性が比較的低いと考えられる。一方、Ｒ5およびＲ6の少なくとも一方が、Ｃ1-6アルキル基、置換基を有していてもよいＣ6-12アリール基、Ｃ6-12アリール基上に置換基を有していてもよいＣ6-12アリール－アミノ基、またはＣ6-12アリール基上に置換基を有していてもよいＣ6-12アリール－メチル基である場合、ＣＤＰ－リビトール誘導体（Ｉ）の脂溶性が上がり、細胞内取込量が増加する可能性がある。
【0018】
「Ｃ6-12アリール基」とは、炭素数が６以上、１２以下の一価芳香族炭化水素基をいう。例えば、フェニル、ナフチル、インデニル、ビフェニル等であり、好ましくはフェニルである。
【0019】
リン酸基の保護基であるＣ1-6アルキル基、置換基を有していてもよいＣ6-12アリール基、Ｃ6-12アリール基上に置換基を有していてもよいＣ6-12アリール－アミノ基、およびＣ6-12アリール基上に置換基を有していてもよいＣ6-12アリール－メチル基のうち、Ｃ6-12アリール基上に置換基を有していてもよいＣ6-12アリール－アミノ基、およびＣ6-12アリール基上に置換基を有していてもよいＣ6-12アリール－メチル基が細胞内で除去され易く、Ｃ6-12アリール基上に置換基を有していてもよいＣ6-12アリール－メチル基が細胞内でより除去され易く、フェニル基上に置換基を有していてもよいベンジル基が細胞内でより更に除去され易い。特にＣ6-12アリールまたはフェニル基が置換基としてＣ1-6アルコキシ基、またはＣ1-6アルキル－カルボニルオキシ基を有する場合には、その置換位置によって除去され易くなる。例えばベンジル基のｐ位および／またはｏ位にＣ1-6アルコキシ基、またはＣ1-6アルキル－カルボニルオキシ基、特にＣ1-6アルキル－カルボニルオキシ基が置換していると、生体内で先ずこれら基が除去されてフェノール性水酸基が生じると、当該フェノール性水酸基が電子を引張り、結果としてリン酸基からこれら基が脱離する。
【0020】
Ｒ5およびＲ6としてのＣ1-6アルキル基としては、Ｃ1-4アルキル基が好ましく、Ｃ1-2アルキル基がより好ましく、メチルがより更に好ましい。また、Ｃ6-12アリール基またはフェニル基上の置換基であるＣ1-6アルコキシ基、またはＣ1-6アルキル－カルボニルオキシ基の炭素数としては１以上、４以下が好ましく、１または２がより好ましく、１がより更に好ましい。
【0021】
Ｒ7およびＲ8がＯＨである場合、リボース本来の機能がそのまま発揮され、また、毒性が低いと考えられる。Ｒ7およびＲ8がＣ1-6アルキル－カルボニルオキシ基またはＣ1-6アルコキシ－カルボニルオキシ基である場合、脂溶性が比較的高くなり細胞内に取り込まれ易くなる一方で、細胞内に取り込まれた後は加水分解されてＯＨとなり、リボース本来の機能が発揮されると考えられる。また、Ｒ7およびＲ8がＣ1-6アルキル－カルボニルオキシ基、Ｃ1-6アルコキシ－カルボニルオキシ基、Ｃ1-6アルコキシ基、またはハロゲノ基である場合には、ＣＤＰ－リビトール誘導体（Ｉ）のヌクレアーゼ耐性が向上すると考えられる。
【0022】
Ｒ7およびＲ8に含まれるＣ1-6アルキル基およびＣ1-6アルコキシの炭素数としては１以上、４以下が好ましく、１または２がより好ましく、１がより更に好ましい。
【0023】
ＣＤＰ－リビトール誘導体（Ｉ）において、Ｒ1～Ｒ6が全てＨである場合、Ｒ7とＲ8は、独立して、Ｃ1-6アルキル－カルボニルオキシ基、Ｃ1-6アルコキシ－カルボニルオキシ基、Ｃ1-6アルコキシ基、またはハロゲノ基を示す。即ち、ＣＤＰ－リビトール誘導体（Ｉ）には、無置換のＣＤＰ－リビトールは含まれない。
【0024】
ＣＤＰ－リビトール誘導体（Ｉ）は、ピロリン酸基により塩を形成することができるが、当該塩は薬学的に許容される塩である。ＣＤＰ－リビトール誘導体（Ｉ）の薬学的に許容される塩を構成するカウンターカチオンとしては、薬学的に許容されるものであれば特に制限されないが、例えば、ナトリウムイオン、カリウムイオン等のアルカリ金属塩イオンや、マグネシウムイオン、カルシウムイオン等の第２族金属イオンが挙げられる。リン酸基の少なくとも一方は、例えば溶液中で、－Ｏ－Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ-）－Ｏ－の状態にあってもよい。また、ＣＤＰ－リビトール誘導体（Ｉ）が全体として塩基性を示し、シトシンのアミノ基により塩が形成される可能性がある。かかる塩は、薬学的に許容される塩であれば特に制限されないが、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩などの無機酸塩；シュウ酸塩、マロン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、酢酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩などの有機酸塩が挙げられる。
【0025】
ＣＤＰ－リビトール誘導体（Ｉ）は、例えば下記スキームにより合成することができる。
【化3】
【0026】
上記反応では、溶媒中、還元糖モノリン酸エステル（ＩＩ）とモルフォリデート（ＩＩＩ）を反応させる。モルフォリデート（ＩＩＩ）のリン酸基はモルホリン基により活性化されているため、還元糖に水酸基が残っていたり、Ｒ7およびＲ8が水酸基である場合であっても、容易に還元糖モノリン酸エステル（ＩＩ）と反応してピロリン酸基を形成する。
【0027】
上記反応で用いる溶媒としては、ジメチルホルムアミドやピリジン等、塩基性を呈する溶媒が好ましい。また、反応の促進のために、テトラゾール、ベンズイミダゾリウムトリフラート、トリクロロ酢酸などを用いてもよい。
【0028】
反応条件は適宜調整すればよい。例えば、溶媒としては脱水したものを用い、水分や酸素の混入を抑制するために、窒素ガスやアルゴンガス等の不活性ガス雰囲気下で反応を行うことが好ましい。また、反応温度は常温でよく、例えば０℃以上、４０℃以下とすることができる。反応温度としては、１０℃以上または１５℃以上が好ましく、２０℃以上がより好ましく、また、３５℃以下が好ましく、３０℃以下がより好ましい。反応時間は、予備実験で決定したり、目的化合物の増量が認められなくなるまでや、クロマトグラフィー等で還元糖モノリン酸エステル（ＩＩ）またはモルフォリデート（ＩＩＩ）の一方が消費されるまでとすればよいが、例えば、１０時間以上、１０日以下とすることができる。
【0029】
反応終了後は、通常の後処理を行えばよい。例えば、溶媒を留去した後、クロマトグラフィーや再結晶などで目的化合物を精製すればよい。また、水酸基やリン酸基の保護や脱保護、また、Ｒ1～Ｒ8の変更などを行ってもよい。
【0030】
還元糖モノリン酸エステル（ＩＩ）は、容易に合成することができる。例えば下記スキームの通り、アルドン酸またはその誘導体のカルボキシ基を還元し、塩化ホスホリル（ＰＯＣｌ3）を使って５位にリン酸基を導入する。この際、アルドン酸の水酸基を保護しておくことにより、５位へ選択的にリン酸基を導入することが可能になる。
【0031】
【化4】
【0032】
また、モルフォリデート（ＩＩＩ）は、ヌクレオシドまたはその２’位および／または３’位における誘導体の５’－モノホスフェート体から、常法により合成可能である。
【0033】
本発明に係るＣＤＰ－リビトール誘導体（Ｉ）またはその薬学的に許容される塩は、細胞に取り込まれた後、細胞内の酵素により加水分解されてＣＤＰ－リビトールに変換される。ジストログリカン異常症の原因の一つとして、α－ジストログリカンの糖鎖に２分子のリビトールリン酸が導入されず、糖鎖が完全に形成されないことがある。α－ジストログリカンの糖鎖へのリビトールリン酸の導入は、先ずＣＤＰ－リビトール生合成酵素であるＩＳＰＤによりリビトールリン酸とシチジン三リン酸（ＣＴＰ）からＣＤＰ－リビトールが合成され、次にＣＤＰ－リビトールからフクチン（ＦＫＴＮ）とＦＫＲＰの作用により実施される。よってジストログリカン異常症は、ＩＳＰＤ、ＦＫＴＮおよび／またはＦＫＲＰの遺伝子の異常により発症すると考えられる。それに対して、本発明に係るＣＤＰ－リビトール誘導体（Ｉ）またはその薬学的に許容される塩の投与により、ＩＳＰＤ遺伝子に異常があっても細胞内にＣＤＰ－リビトールが供給され、また、ＦＫＴＮとＦＫＲＰが完全に欠損していれば生存できないため、ジストログリカン異常症患者は僅かであってもＦＫＴＮとＦＫＲＰの活性を有しているはずであり、十分量のＣＤＰ－リビトールの供給により、ＦＫＴＮとＦＫＲＰの活性が低くてもα－ジストログリカンの糖鎖が形成され、症状が軽減されると考えられる。よって、本発明に係るＣＤＰ－リビトール誘導体（Ｉ）またはその薬学的に許容される塩は、医薬の有効成分として、特にジストログリカン異常症治療剤の有効成分として利用できる。
【0034】
ジストログリカン異常症は、上記の通りα－ジストログリカンの糖鎖が形成不良により引き起こされる疾患であり、例えば、福山型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、先天型筋ジストロフィー、Ｗａｌｋｅｒ－Ｗａｒｂｕｒｇ症候群が挙げられる。
【0035】
本発明に係るＣＤＰ－リビトール誘導体（Ｉ）またはその薬学的に許容される塩を含有する医薬の形態は特に制限されず、経口剤や非経口剤とすることができる。経口剤としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、細粒剤、丸剤、トローチ剤、舌下剤、乳剤、懸濁剤、シロップ剤などが挙げられる。非経口剤としては、注射剤、軟膏剤、坐剤、クリーム剤などが挙げられる。注射剤は、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与などすることができ、軟膏剤やクリーム剤は、粘膜や局所に塗布すればよい。
【0036】
本発明に係る医薬は、ＣＤＰ－リビトール誘導体（Ｉ）またはその薬学的に許容される塩に加えて、医薬添加剤を含んでいてもよい。医薬添加剤としては、例えば、溶媒、ｐＨ調整剤、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素などが挙げられるが、特に制限されない。
【0037】
本発明に係る医薬としては、注射剤が好ましい。注射剤の溶媒としては、水の他、緩衝液や生理食塩水を用いてもよい。また、注射剤は等張または略等張である必要があるため、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、塩化物イオン、酢酸イオン、炭酸水素イオン、乳酸、ブドウ糖などを含んでいてもよい。
【0038】
本発明に係るＣＤＰ－リビトール誘導体（Ｉ）またはその薬学的に許容される塩の投与量は、患者の症状、重篤度、年齢、性別などに応じて適宜調整すればよいが、例えば、１日あたり０．０１ｍｇ以上、６０ｇ以下とすることができる。当該投与量としては、０．１ｍｇ以上が好ましく、また、２４ｇ以下が好ましく、６ｇ以下がより好ましい。また、１日の投与回数は１回以上、５回以下とすることができ、４回以下または３回以下が好ましく、２回以下がより好ましい。また、経過を観察しつつ、１日以上、２週間以下の投与間隔をあけてもよい。
【実施例】
【0039】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【0040】
実施例１： ＣＤＰ－リビトール ジアセテートの合成
（１）２’，３’－ジ－Ｏ－アセチル－シチジン ５’－モノホスフェートの合成
シチジン ５’－モノホスフェート（２．５ｇ）を水（１００ｍＬ）に懸濁し、次にトリエチルアミン（２．１５ｍＬ）を加えて溶解し、ｐＨを７～８に調整した。これに１－アセチルイミダゾール（８．５ｇ）を加えて室温で約３時間攪拌した。次いでトリエチルアミン（２１５μＬ）と１－アセチルイミダゾール（２．０ｇ）を追加した。反応溶液を濾過した後に、逆相系のＨＰＬＣで精製した。目的のフラクションを集め、凍結乾燥により目的化合物を得た（粗収量：３．０ｇ（トリエチルアミンを含む）。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）：δ７．９５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），６．２２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），６．１３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），５．４７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７，５．５Ｈｚ），５．４４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５，５．５Ｈｚ），４．５１（ｍ，１Ｈ），４．１６（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７，４．６，１１．９Ｈｚ），４．０８（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７，５．０，１１．９Ｈｚ），２．１８（ｓ，３Ｈ），２．１１（ｓ，３Ｈ）
（１）２’，３’－ジ－Ｏ－アセチル－シチジン ５’－モノホスフェートの合成
【化5】
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）：δ７．９５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），６．２２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），６．１３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），５．４７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７，５．５Ｈｚ），５．４４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５，５．５Ｈｚ），４．５１（ｍ，１Ｈ），４．１６（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７，４．６，１１．９Ｈｚ），４．０８（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７，５．０，１１．９Ｈｚ），２．１８（ｓ，３Ｈ），２．１１（ｓ，３Ｈ）
【0041】
（２）２’，３’－ジ－Ｏ－アセチル－シチジン ５’－モノホスフェート モルフォリデート ４－モルホリン－Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボキシアミジン塩の合成
２’，３’－ジ－Ｏ－アセチル－シチジン ５’－モノホスフェート（２．５ｇ）とモルホリン（１．８ｍＬ）をｔ－ブタノール（５０ｍＬ）と水（５０ｍＬ）の混合溶媒に懸濁し、還流した。これにＮ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（２．７ｍＬ）をｔ－ブタノール（５０ｍＬ）に溶解した溶液を滴下した。室温に戻した後に、減圧濃縮した。得られた残渣に水を加えて凍結乾燥した。凍結乾燥品（５．２ｇ）を逆相系のＨＰＬＣで精製した。目的のフラクションを集め、凍結乾燥により目的化合物を得た（粗収量：２．０ｇ（溶媒や塩を含む））。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）：δ７．９２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），６．２１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），６．１１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），５．４８－５．４４（ｍ，２Ｈ），４．５２（ｍ，１Ｈ），４．１１（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．３，４．１，１１．９Ｈｚ），４．０５（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，５．０，１１．９Ｈｚ），３．７９（ｂｒ．ｔ，４Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．７５（ｍ，２Ｈ），３．６７（ｂｒ．ｔ，４Ｈ，Ｊ＝４．３Ｈｚ），３．４４（ｂｒ．ｔ，４Ｈ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），３．０６（ｍ，４Ｈ），２．１９（ｓ，３Ｈ），２．１２（ｓ，３Ｈ），１．２５（ｄ，１２Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ）
【化6】
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）：δ７．９２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），６．２１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），６．１１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），５．４８－５．４４（ｍ，２Ｈ），４．５２（ｍ，１Ｈ），４．１１（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．３，４．１，１１．９Ｈｚ），４．０５（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，５．０，１１．９Ｈｚ），３．７９（ｂｒ．ｔ，４Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．７５（ｍ，２Ｈ），３．６７（ｂｒ．ｔ，４Ｈ，Ｊ＝４．３Ｈｚ），３．４４（ｂｒ．ｔ，４Ｈ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），３．０６（ｍ，４Ｈ），２．１９（ｓ，３Ｈ），２．１２（ｓ，３Ｈ），１．２５（ｄ，１２Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ）
【0042】
（３）ＣＤＰ－リビトール ジアセテート
参考文献（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９８４，２７，７１７－７２６）の方法でＤ－リボース ５－ホスフェートから得られるＤ－リビトール ５－ホスフェート（９７０ｍｇ）と、トリ－ｎ－オクチルアミン（２．０５ｍＬ）に脱水ＤＭＦ（５０ｍＬ）を加えて減圧濃縮する操作を２回繰り返した。得られた残渣にアルゴン雰囲気下で脱水ＤＭＦ（５０ｍＬ）を加えて溶解した（Ａ液）。別途、２’，３’－ジ－Ｏ－アセチル－シチジン ５’－モノホスフェート モルフォリデート（２．０ｇ）に脱水ＤＭＦ（５０ｍＬ）を加えて減圧濃縮した。得られた残渣にアルゴン雰囲気下で脱水ピリジン（５０ｍＬ）を加えて溶解した（Ｂ液）。Ａ液とＢ液の２つの溶液を混合し、アルゴン雰囲気下で１Ｈ－テトラゾール（２９４ｍｇ）を加えて室温で攪拌した。５日後に反応混合物を減圧濃縮した。得られた残渣を逆相系のＨＰＬＣで精製した。目的のフラクションを集め、凍結乾燥及びイオン交換樹脂に通すことにより、白色粉末であるＣＤＰ－リビトール ジアセテートの２Ｎａ塩を得た（収量：１１３ｍｇ，収率：４．３％）。
1Ｈ－ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）：δ７．９４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），６．２２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），６．１５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），５．４８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１，５．５Ｈｚ），５．４４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５，５．５Ｈｚ），４．５３（ｍ，１Ｈ），４．２９（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．３，５．０，１１．９Ｈｚ），４．２１（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，５．０，１１．９Ｈｚ），４．１５（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．０，５．７，１１．０Ｈｚ），４．０６（ｍ，１Ｈ），３．９１（ｍ，１Ｈ），３．８７（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，１１．９Ｈｚ），３．７６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．９，６．９Ｈｚ），３．６４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９，１１．９Ｈｚ），２．１８（ｓ，３Ｈ），２．１２（ｓ，３Ｈ）
ＥＳＩ－ＭＳスペクトル（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｅ） Ｃ18Ｈ28Ｎ3Ｏ17Ｐ2：［Ｍ－Ｈ］-，ｃａｌｃｄ：６２０．０９，ｆｏｕｎｄ：６２０．１
【化7】
1Ｈ－ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）：δ７．９４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），６．２２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），６．１５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），５．４８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１，５．５Ｈｚ），５．４４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５，５．５Ｈｚ），４．５３（ｍ，１Ｈ），４．２９（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．３，５．０，１１．９Ｈｚ），４．２１（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，５．０，１１．９Ｈｚ），４．１５（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．０，５．７，１１．０Ｈｚ），４．０６（ｍ，１Ｈ），３．９１（ｍ，１Ｈ），３．８７（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，１１．９Ｈｚ），３．７６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．９，６．９Ｈｚ），３．６４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９，１１．９Ｈｚ），２．１８（ｓ，３Ｈ），２．１２（ｓ，３Ｈ）
ＥＳＩ－ＭＳスペクトル（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｅ） Ｃ18Ｈ28Ｎ3Ｏ17Ｐ2：［Ｍ－Ｈ］-，ｃａｌｃｄ：６２０．０９，ｆｏｕｎｄ：６２０．１
【0043】
実施例２： ＣＤＰ－リビトール テトラアセテートの合成
（１）２，３，４，５－テトラ－Ｏ－アセチル－Ｌ－リボン酸
Ｌ－リボン酸－１，４－ラクトン（２．０ｇ）を水（１０ｍＬ）に溶解し、１Ｍ ＮａＯＨ水溶液（１４．２ｍＬ）を加えた。２０分後に反応溶液を減圧濃縮した（残渣Ａ）。別の容器に無水酢酸（３０ｍＬ）を入れて氷冷した。これに７０％ＨＣｌＯ4水溶液（１．５ｍＬ）を加えることで、淡黄色溶液が得られた。前記残渣Ａを０℃以下に冷却し、この淡黄色溶液を加えた。反応混合物を４０℃まで昇温した後に、さらに１時間攪拌した。反応溶液を氷冷し、酢酸ナトリウム（２．４ｇ）と水（４０ｍＬ）を順次加えた。減圧濃縮により得られた残渣に水を加えて再度減圧濃縮した。残渣を逆相系のＨＰＬＣで精製し、目的のフラクションを集め、凍結乾燥により白色粉末である目的化合物を得た（収量：３．７８ｇ，収率：８３％）。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ５．６３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７，９．２Ｈｚ），５．４６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．３Ｈｚ），５．３６（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．５，４．３，９．２Ｈｚ），４．３５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．５，１２．６Ｈｚ），４．１７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．３，１２．６Ｈｚ），２．１７（ｓ，３Ｈ），２．１０（ｓ，３Ｈ），２．０７（ｓ，３Ｈ），２．０３（ｓ，３Ｈ）
（１）２，３，４，５－テトラ－Ｏ－アセチル－Ｌ－リボン酸
【化8】
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ５．６３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７，９．２Ｈｚ），５．４６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．３Ｈｚ），５．３６（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．５，４．３，９．２Ｈｚ），４．３５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．５，１２．６Ｈｚ），４．１７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．３，１２．６Ｈｚ），２．１７（ｓ，３Ｈ），２．１０（ｓ，３Ｈ），２．０７（ｓ，３Ｈ），２．０３（ｓ，３Ｈ）
【0044】
（２）１，２，３，４－テトラ－Ｏ－アセチル－Ｄ－リビトールの合成
２，３，４，５－テトラ－Ｏ－アセチル－Ｌ－リボン酸（３．７８ｇ）を脱水ＴＨＦ（５０ｍＬ）に溶解し、－１０℃に冷却した。これにＮ－メチルモルホリン（１．３６ｍＬ）とクロロギ酸イソブチル（１．６１ｍＬ）を順次加えて１０分間攪拌した。さらにＮａＢＨ4（１．２８ｇ）を加えた後に、－５０℃に冷却した。これにメタノール（８０ｍＬ）を１０分間で滴下した。氷浴し、６Ｍ塩酸（２．７ｍＬ）を加えてｐＨを４に調整した。減圧濃縮し、得られた残渣に酢酸エチルと水を加えて抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。これを濾過し、濾液と洗浄液を合わせて減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。目的のフラクションを集めて減圧濃縮、乾燥することで白色粉末として目的化合物を得た（収量：２．６６ｇ，収率：７３％）。なお、目的化合物である２，３，４，５－テトラ－Ｏ－アセチル－Ｌ－リビトールは、１，２，３，４－テトラ－Ｏ－アセチル－Ｄ－リビトールともいう。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ５．３７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．６，５．９Ｈｚ），５．３３（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，４．６，６．９Ｈｚ），５．０７（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７，５．５，５．５Ｈｚ），４．３８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，１１．９Ｈｚ），４．１６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９，１１．９Ｈｚ），３．８４（ｍ，１Ｈ），３．６９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０，１２．８Ｈｚ），２．１４（ｓ，３Ｈ），２．１１（ｓ，３Ｈ），２．１０（ｓ，３Ｈ），２．０５（ｓ，３Ｈ）
【化9】
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ５．３７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．６，５．９Ｈｚ），５．３３（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，４．６，６．９Ｈｚ），５．０７（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７，５．５，５．５Ｈｚ），４．３８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，１１．９Ｈｚ），４．１６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９，１１．９Ｈｚ），３．８４（ｍ，１Ｈ），３．６９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０，１２．８Ｈｚ），２．１４（ｓ，３Ｈ），２．１１（ｓ，３Ｈ），２．１０（ｓ，３Ｈ），２．０５（ｓ，３Ｈ）
【0045】
（３）１，２，３，４－テトラ－Ｏ－アセチル－Ｄ－リビトール ５－ホスフェートの合成
１，２，３，４－テトラ－Ｏ－アセチル－Ｄ－リビトール（１．０ｇ）を脱水ＴＨＦ（２０ｍＬ）に溶解し、－１０℃以下に冷却した。これにジイソプロピルエチルアミン（４．２ｍＬ）とＰＯＣｌ3（２．０ｍＬ）を順次加えて３０分間攪拌した。反応混合物を－７８℃に冷却し、水（２０ｍＬ）を徐々に加えた。室温で飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて中和し、減圧濃縮によりＴＨＦを留去した。得られた残渣（水層）に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液とクロロホルムを加えて分液した。有機層に水を加えて抽出し、水層を合わせた。減圧濃縮により液量を減じた。６Ｍ塩酸（１．５ｍＬ）を加えてｐＨを１～２に調整した後、逆相ＨＰＬＣで精製した。目的のフラクションを集めて凍結乾燥し、得られた残渣に水を加えて溶解して再度凍結乾燥し、含水軟性油状物として目的化合物を得た（粗収量：１．１１ｇ（水を含む））。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）：δ５．４１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５，５．５Ｈｚ），５．３５－５．２８（ｍ，２Ｈ），４．４４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，１２．４Ｈｚ），４．３１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．９，１２．４Ｈｚ），４．１４（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，５．９，１１．９Ｈｚ），４．０４（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．９，６．９，１１．９Ｈｚ），２．１６（ｓ，３Ｈ），２．１５（ｓ，３Ｈ），２．１３（ｓ，３Ｈ），２．０８（ｓ，３Ｈ）
【化10】
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）：δ５．４１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５，５．５Ｈｚ），５．３５－５．２８（ｍ，２Ｈ），４．４４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，１２．４Ｈｚ），４．３１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．９，１２．４Ｈｚ），４．１４（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，５．９，１１．９Ｈｚ），４．０４（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．９，６．９，１１．９Ｈｚ），２．１６（ｓ，３Ｈ），２．１５（ｓ，３Ｈ），２．１３（ｓ，３Ｈ），２．０８（ｓ，３Ｈ）
【0046】
（４）ＣＤＰ－リビトール テトラアセテートの合成
１，２，３，４－テトラ－Ｏ－アセチル－Ｄ－リビトール ５－ホスフェート（１．１１ｇ）を脱水ＤＭＦに溶解し、トリエチルアミン（０．６９ｍＬ）を加えて減圧濃縮した。得られた残渣に脱水ＤＭＦを加えて減圧濃縮する操作を２回繰り返した。アルゴン雰囲気下、得られた残渣を脱水ピリジンに溶解し、トリエチルアミン（０．６９ｍＬ）を加えた（Ａ液）。１Ｈ－テトラゾール（０．２７ｇ）と、別途調製したシチジン ５’－モノホスフェート モルフォリデート（定法によりシチジン ５’－モノホスフェートから調製が可能）（１．８９ｇ）をそれぞれ別の容器Ｂと容器Ｃに入れ、脱水ＤＭＦを加えて減圧濃縮する操作を２回繰り返した。それぞれ得られた残渣をアルゴン雰囲気下で脱水ピリジンに溶解した（順にＢ液およびＣ液）。続いてアルゴン雰囲気下でＡ液に対してＢ液とＣ液を順次加えた。溶媒量は合計で約２０ｍＬであった。アルゴン雰囲気下、室温で５日間攪拌した。反応混合物を減圧濃縮した。得られた残渣に脱水ＤＭＦを加えて再度減圧濃縮した。残渣を逆相系のＨＰＬＣで精製した。目的のフラクションを集め、凍結乾燥、およびイオン交換樹脂に通すことにより、白色粉末として目的化合物の２Ｎａ塩を得た（収量：５４８ｍｇ，収率：２８％）。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）：δ８．００（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），６．１２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），５．９７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１Ｈｚ），５．３６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５，５．５Ｈｚ），５．３１－５．２６（ｍ，２Ｈ），４．４０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，１２．４Ｈｚ），４．３５－４．２３（ｍ，５Ｈ），４．２０－４．１５（ｍ，２Ｈ），４．０６（ｍ，１Ｈ），２．１２９（ｓ，３Ｈ），２．１１８（ｓ，３Ｈ），２．１１８（ｓ，３Ｈ），２．０７１（ｓ，３Ｈ）
ＥＳＩ－ＭＳスペクトル（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｅ） Ｃ22Ｈ32Ｎ3Ｏ19Ｐ2：［Ｍ－Ｈ］-，ｃａｌｃｄ：７０４．１１，ｆｏｕｎｄ：７０４．０
【化11】
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）：δ８．００（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），６．１２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），５．９７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１Ｈｚ），５．３６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５，５．５Ｈｚ），５．３１－５．２６（ｍ，２Ｈ），４．４０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，１２．４Ｈｚ），４．３５－４．２３（ｍ，５Ｈ），４．２０－４．１５（ｍ，２Ｈ），４．０６（ｍ，１Ｈ），２．１２９（ｓ，３Ｈ），２．１１８（ｓ，３Ｈ），２．１１８（ｓ，３Ｈ），２．０７１（ｓ，３Ｈ）
ＥＳＩ－ＭＳスペクトル（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｅ） Ｃ22Ｈ32Ｎ3Ｏ19Ｐ2：［Ｍ－Ｈ］-，ｃａｌｃｄ：７０４．１１，ｆｏｕｎｄ：７０４．０
【0047】
実施例３： ＣＤＰ－リビトール ヘキサアセテートの合成
ＣＤＰ－リビトール テトラアセテート（２５０ｍｇ）を水（３．３４ｍＬ）に溶解し、１－アセチルイミダゾール（３６８ｍｇ）を加えて室温で攪拌した。その後、４回に分けて１－アセチルイミダゾール（合計で６２６ｍｇ）を追加した。反応開始から約４時間後に反応混合物を水で希釈して、逆相系のＨＰＬＣで精製した。目的のフラクションを集め、凍結乾燥、およびイオン交換樹脂に通すことにより、白色粉末である目的化合物の２Ｎａ塩を得た（収量：２２８ｍｇ，収率：７５％）。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）：δ７．９７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），６．２２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），６．１６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），５．４６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１，５．５Ｈｚ），５．４１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５，５．５Ｈｚ），５．３６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５，５．５Ｈｚ），５．３１－５．２６（ｍ，２Ｈ），４．５２（ｍ，１Ｈ），４．４１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，１２．４Ｈｚ），４．３１－４．２６（ｍ，２Ｈ），４．２０－４．１６（ｍ，２Ｈ），４．０７（ｍ，１Ｈ），２．１８（ｓ，３Ｈ），２．１４（ｓ，３Ｈ），２．１３（ｓ，３Ｈ），２．１２０（ｓ，３Ｈ），２．１１８（ｓ，３Ｈ），２．０８（ｓ，３Ｈ）
ＥＳＩ－ＭＳスペクトル（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｅ） Ｃ26Ｈ36Ｎ3Ｏ21Ｐ2：［Ｍ－Ｈ］-，ｃａｌｃｄ：７８８．１３，ｆｏｕｎｄ：７８８．１
【化12】
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）：δ７．９７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），６．２２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），６．１６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），５．４６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１，５．５Ｈｚ），５．４１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５，５．５Ｈｚ），５．３６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５，５．５Ｈｚ），５．３１－５．２６（ｍ，２Ｈ），４．５２（ｍ，１Ｈ），４．４１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，１２．４Ｈｚ），４．３１－４．２６（ｍ，２Ｈ），４．２０－４．１６（ｍ，２Ｈ），４．０７（ｍ，１Ｈ），２．１８（ｓ，３Ｈ），２．１４（ｓ，３Ｈ），２．１３（ｓ，３Ｈ），２．１２０（ｓ，３Ｈ），２．１１８（ｓ，３Ｈ），２．０８（ｓ，３Ｈ）
ＥＳＩ－ＭＳスペクトル（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｅ） Ｃ26Ｈ36Ｎ3Ｏ21Ｐ2：［Ｍ－Ｈ］-，ｃａｌｃｄ：７８８．１３，ｆｏｕｎｄ：７８８．１
【0048】
実施例４： ＣＤＰ－リビトール テトラブチレートの合成
（１）１，２，３，４－テトラ－Ｏ－ブチリル－５－Ｏ－トリチル－Ｄ－リビトールの合成
参考文献（ＷＯ２０１６／０４４１６４）の方法などによりＤ－リボースから得られる５－Ｏ－トリチル－Ｄ－リビトール（６．０ｇ）を脱水ピリジン（６０ｍＬ）に溶解し、４－ジメチルアミノピリジン（０．９３ｇ）を加えて氷冷した。これにブタン酸無水物（１４．９ｍＬ）を加え、続いて脱水クロロホルム（５０ｍＬ）と脱水ピリジン（６０ｍＬ）を加えた。反応容器を氷浴からはずして室温で攪拌した。４０分後に減圧濃縮し、得られた残渣にジメチルエーテルと水を加えて分液、抽出した。有機層を合わせ、飽和炭酸水素ナトリウム水、水、および飽和食塩水で順次洗浄した後に、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。これを濾過し、濾液と洗浄液を合わせて減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。目的のフラクションを集めて減圧濃縮し、得られた残渣にｎ－ヘキサンを加えて減圧濃縮および乾燥することで、無色油状物として目的化合物を得た（粗収量：６．７３ｇ（溶媒及び試薬由来物を含む））。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ７．４０－７．２０（ｍ，１５Ｈ），５．４２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０，５．９Ｈｚ），５．３４（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，５．９，５．９Ｈｚ），５．２８（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，５．０，６．９Ｈｚ），４．３２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，１２．４Ｈｚ），４．１０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９，１２．４Ｈｚ），３．２９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，１０．５Ｈｚ），３．１６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．９，１０．５Ｈｚ），２．４１－２．０６（ｍ，８Ｈ），１．７５－１．４６（ｍ，８Ｈ），０．９７６（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），０．９１０（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），０．９０５（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），０．８７３（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）
（１）１，２，３，４－テトラ－Ｏ－ブチリル－５－Ｏ－トリチル－Ｄ－リビトールの合成
【化13】
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ７．４０－７．２０（ｍ，１５Ｈ），５．４２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０，５．９Ｈｚ），５．３４（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，５．９，５．９Ｈｚ），５．２８（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，５．０，６．９Ｈｚ），４．３２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，１２．４Ｈｚ），４．１０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９，１２．４Ｈｚ），３．２９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，１０．５Ｈｚ），３．１６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．９，１０．５Ｈｚ），２．４１－２．０６（ｍ，８Ｈ），１．７５－１．４６（ｍ，８Ｈ），０．９７６（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），０．９１０（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），０．９０５（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），０．８７３（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）
【0049】
（２）１，２，３，４－テトラ－Ｏ－ｂｕｔｙｒｙｌ－Ｄ－リビトールの合成
１，２，３，４－テトラ－Ｏ－ブチリル－５－Ｏ－トリチル－Ｄ－リビトール（３．８４ｇ）を酢酸（４０ｍＬ）に溶解し、５５℃に加温すると共に水（９ｍＬ）を加えた。５５℃で３時間攪拌した後に、反応混合物を減圧濃縮した。得られた残渣にジエチルエーテルを加え、飽和炭酸水素ナトリウム水、水および飽和食塩水で順次洗浄した後に、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。これを濾過し、濾液と洗浄液を合わせて減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。目的のフラクションを集めて減圧濃縮し、残渣にｎ－ヘキサンを加えて減圧濃縮、乾燥することで、無色油状物である目的化合物を得た（収量：１．５１ｇ，収率：６１％）。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ５．３９－５．３３（ｍ，２Ｈ），５．０８（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７，５．５，５．５Ｈｚ），４．３９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，１２．４Ｈｚ），４．１５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９，１２．４Ｈｚ），３．８３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７，１２．４Ｈｚ），３．６８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５，１２．４Ｈｚ），２．３９－２．２５（ｍ，８Ｈ），１．７３－１．６０（ｍ，８Ｈ），０．９６８（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），０．９６７（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），０．９５４（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），０．９３５（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）
ＥＳＩ－ＭＳスペクトル（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｏｄｅ） Ｃ21Ｈ36Ｏ9Ｎａ：［Ｍ＋Ｎａ］+，ｃａｌｃｄ：４５５．２３，ｆｏｕｎｄ：４５５．２
【化14】
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ５．３９－５．３３（ｍ，２Ｈ），５．０８（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７，５．５，５．５Ｈｚ），４．３９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，１２．４Ｈｚ），４．１５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９，１２．４Ｈｚ），３．８３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７，１２．４Ｈｚ），３．６８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５，１２．４Ｈｚ），２．３９－２．２５（ｍ，８Ｈ），１．７３－１．６０（ｍ，８Ｈ），０．９６８（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），０．９６７（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），０．９５４（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），０．９３５（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）
ＥＳＩ－ＭＳスペクトル（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｏｄｅ） Ｃ21Ｈ36Ｏ9Ｎａ：［Ｍ＋Ｎａ］+，ｃａｌｃｄ：４５５．２３，ｆｏｕｎｄ：４５５．２
【0050】
（３）１，２，３，４－テトラ－Ｏ－ブチリル－Ｄ－リビトール ５－ホスフェートの合成
１，２，３，４－テトラ－Ｏ－ブチリル－Ｄ－リビトール（１．５１ｇ）を脱水ＴＨＦ（３０ｍＬ）に溶解し、－１０℃以下に冷却した。これにジイソプロピルエチルアミン（４．８６ｍＬ）とＰＯＣｌ3（２．２７ｍＬ）を順次加えて４０分間攪拌した。反応混合物を－７８℃に冷却し、水（２０ｍＬ）を徐々に加えた。室温で飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて中和後に減圧濃縮により液量を減じ、残渣（水層）をｎ－ヘキサンで２回洗浄し、ジエチルエーテル（１５０ｍＬ）を加えて氷冷、攪拌した。６Ｍ塩酸（１４ｍＬ）を加えてｐＨを１～２に調整した後に分液した。分離した水層にジエチルエーテルを加えて抽出し、有機層を合わせた。これを水と飽和食塩水で順次洗浄後に、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。これを濾過し、濾液と洗浄液を合わせ、トリエチルアミン（０．４８ｍＬ）を加えて減圧濃縮、乾燥することで、無色油状物である目的化合物を得た（粗収量：１．９５ｇ（トリエチルアミンを含む））。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）：δ５．４４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５，５．５Ｈｚ），５．３７（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７，５．９，５．９Ｈｚ），５．３１（ｍ，１Ｈ），４．５１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７，１２．４Ｈｚ），４．３０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．９，１２．４Ｈｚ），４．１０（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，５．５，１１．４Ｈｚ），３．９８（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．４，６．４，１１．４Ｈｚ），２．４５－２．３３（ｍ，８Ｈ），１．６９－１．５５（ｍ，８Ｈ），０．９３６（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），０．９２９（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），０．９２３（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），０．９００（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）
ＥＳＩ－ＭＳスペクトル（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｅ） Ｃ21Ｈ36Ｏ12Ｐ：［Ｍ－Ｈ］-，ｃａｌｃｄ：５１１．１９，ｆｏｕｎｄ：５１１．２
【化15】
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）：δ５．４４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５，５．５Ｈｚ），５．３７（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７，５．９，５．９Ｈｚ），５．３１（ｍ，１Ｈ），４．５１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７，１２．４Ｈｚ），４．３０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．９，１２．４Ｈｚ），４．１０（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，５．５，１１．４Ｈｚ），３．９８（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．４，６．４，１１．４Ｈｚ），２．４５－２．３３（ｍ，８Ｈ），１．６９－１．５５（ｍ，８Ｈ），０．９３６（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），０．９２９（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），０．９２３（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），０．９００（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）
ＥＳＩ－ＭＳスペクトル（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｅ） Ｃ21Ｈ36Ｏ12Ｐ：［Ｍ－Ｈ］-，ｃａｌｃｄ：５１１．１９，ｆｏｕｎｄ：５１１．２
【0051】
（４）ＣＤＰ－リビトール テトラブチレートの合成
１，２，３，４－テトラ－Ｏ－ブチリル－Ｄ－リビトール ５－ホスフェート（１．９５ｇ）を脱水ＤＭＦに溶解し、減圧濃縮した。得られた残渣に脱水ＤＭＦを加えて減圧濃縮した。得られた残渣をアルゴン雰囲気下で脱水ピリジンに溶解した（Ａ液）。これとは別に、１Ｈ－テトラゾール（０．３８ｇ）、および別途調製したシチジン ５’－モノホスフェート ホルホリン塩（定法によりシチジン ５’－モノホスフェートから調製が可能）（２．６３ｇ）をそれぞれ別の容器Ｂと容器Ｃに入れ、同じく脱水ＤＭＦを加えて減圧濃縮する操作を２回繰り返し、それぞれ得られた残渣をアルゴン雰囲気下で脱水ピリジンに溶解した（順にＢ液とＣ液）。続いてアルゴン雰囲気下でＡ液に対してＢ液とＣ液を順次加えた。更に脱水ＤＭＦ（５ｍＬ）を加え、アルゴン雰囲気下、室温で１９時間攪拌した。脱水ＤＭＦを加えて減圧濃縮する操作を２回繰り返して得られたシチジン ５’－モノホスフェート モルフォリデート（０．４４ｇ）を脱水ＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解して反応混合物に加え、アルゴン雰囲気下室温で終夜攪拌した。減圧濃縮により得られた残渣を逆相系のＨＰＬＣで精製した。目的のフラクションを集め、凍結乾燥により得られた１．１２ｇのうちの０．８７ｇをイオン交換樹脂に通すことにより、白色粉末である目的化合物の２Ｎａ塩を得た（収量：７１０ｍｇ，収率：４７％）。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）：δ８．０２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），６．１３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），５．９６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），５．３９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．６，５．９Ｈｚ），５．３１（ｍ，２Ｈ），４．４８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７，１２．４Ｈｚ），４．３３－４．１５（ｍ，７Ｈ），４．０５（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．４，６．４，１１．４Ｈｚ），２．４０－２．３２（ｍ，８Ｈ），１．６５－１．５４（ｍ，８Ｈ），０．９１（ｂｒ．ｔ，３Ｈ＋３Ｈ＋３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），０．８９（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）
ＥＳＩ－ＭＳスペクトル（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｅ） Ｃ30Ｈ48Ｎ3Ｏ19Ｐ2：［Ｍ－Ｈ］-，ｃａｌｃｄ：８１６．２４，ｆｏｕｎｄ：８１６．２
【化16】
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）：δ８．０２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），６．１３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），５．９６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），５．３９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．６，５．９Ｈｚ），５．３１（ｍ，２Ｈ），４．４８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７，１２．４Ｈｚ），４．３３－４．１５（ｍ，７Ｈ），４．０５（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．４，６．４，１１．４Ｈｚ），２．４０－２．３２（ｍ，８Ｈ），１．６５－１．５４（ｍ，８Ｈ），０．９１（ｂｒ．ｔ，３Ｈ＋３Ｈ＋３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），０．８９（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）
ＥＳＩ－ＭＳスペクトル（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｅ） Ｃ30Ｈ48Ｎ3Ｏ19Ｐ2：［Ｍ－Ｈ］-，ｃａｌｃｄ：８１６．２４，ｆｏｕｎｄ：８１６．２
【0052】
実施例５： ＣＤＰ－リビトール テトラブチレート，ジアセテートの合成
ＣＤＰ－リビトール テトラブチレート（２５７ｍｇ）を水（１５ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（１０μＬ）を加えてｐＨを７～８に調整した。これに１－アセチルイミダゾール（２７７ｍｇ）を加えて室温で攪拌した。その後、８回に分けて１－アセチルイミダゾール（合計で２．２２ｇ）を追加した。反応開始から約７時間後に反応混合物が入った容器を約６℃の低温下で終夜（約１６時間）保管した。翌日、反応混合物を逆相系のＨＰＬＣで精製した。目的のフラクションを集め、凍結乾燥、およびイオン交換樹脂に通すことにより、白色粉末である目的化合物の２Ｎａ塩を得た（収量：１２６ｍｇ，収率：５２％）。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）：δ７．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），６．２１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），６．１６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），５．４５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１，５．０Ｈｚ），５．４１－５．３７（ｍ，２Ｈ），５．３２－５．２９（ｍ，２Ｈ），４．５１（ｍ，１Ｈ），４．４７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．３，１２．４Ｈｚ），４．３１－４．１５（ｍ，４Ｈ），４．０５（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．９，５．９，１１．９Ｈｚ），２．４１－２．３２（ｍ，８Ｈ），２．１７（ｓ，３Ｈ），２．１２（ｓ，３Ｈ），１．６５－１．５４（ｍ，８Ｈ），０．９１（ｂｒ．ｔ，３Ｈ＋３Ｈ＋３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），０．８９（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）
ＥＳＩ－ＭＳスペクトル（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｅ） Ｃ34Ｈ52Ｎ3Ｏ21Ｐ2：［Ｍ－Ｈ］-，ｃａｌｃｄ：９００．２６，ｆｏｕｎｄ：９００．３
【化17】
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）：δ７．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），６．２１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），６．１６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），５．４５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１，５．０Ｈｚ），５．４１－５．３７（ｍ，２Ｈ），５．３２－５．２９（ｍ，２Ｈ），４．５１（ｍ，１Ｈ），４．４７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．３，１２．４Ｈｚ），４．３１－４．１５（ｍ，４Ｈ），４．０５（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．９，５．９，１１．９Ｈｚ），２．４１－２．３２（ｍ，８Ｈ），２．１７（ｓ，３Ｈ），２．１２（ｓ，３Ｈ），１．６５－１．５４（ｍ，８Ｈ），０．９１（ｂｒ．ｔ，３Ｈ＋３Ｈ＋３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），０．８９（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）
ＥＳＩ－ＭＳスペクトル（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｅ） Ｃ34Ｈ52Ｎ3Ｏ21Ｐ2：［Ｍ－Ｈ］-，ｃａｌｃｄ：９００．２６，ｆｏｕｎｄ：９００．３
【0053】
実施例６： ＣＤＰ－リビトール ヘキサブチレートの合成
ＣＤＰ－リビトール テトラブチレートを水（２０ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（１０μＬ）を加えてｐＨを７～８に調整した。これに別途調製した１－ブチリルイミダゾール（０．３９ｍＬ）を加えて室温で攪拌した。その後、６回に分けて１－ブチリルイミダゾール（合計で１．３５ｍＬ）を追加した。反応開始から約６時間後に反応混合物が入った容器を約１３℃の低温下で終夜（約１５時間）保管した。翌日、反応混合物を逆相系のＨＰＬＣで精製した。目的のフラクションを集め、凍結乾燥、およびイオン交換樹脂に通すことにより、白色粉末である目的化合物の２Ｎａ塩を得た（収量：８９ｍｇ，収率：３６％）。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）：δ７．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），６．２１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），６．１６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），５．４８（ｍ，１Ｈ），５．４２（ｍ，１Ｈ），５．３８（ｍ，１Ｈ），５．３４－５．２８（ｍ，２Ｈ），４．５０－４．４５（ｍ，２Ｈ），４．３０－４．２４（ｍ，２Ｈ），４．２１－４．１５（ｍ，２Ｈ），４．０５（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．９，５．９，１１．９Ｈｚ），２．４５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），２．４０－２．３２（ｍ，１０Ｈ），１．７０－１．５４（ｍ，１２Ｈ），０．９７－０．８６（ｍ，１８Ｈ）
ＥＳＩ－ＭＳスペクトル（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｅ） Ｃ38Ｈ60Ｎ3Ｏ21Ｐ2：［Ｍ－Ｈ］-，ｃａｌｃｄ：９５６．３２，ｆｏｕｎｄ：９５６．３
【化18】
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）：δ７．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），６．２１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），６．１６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），５．４８（ｍ，１Ｈ），５．４２（ｍ，１Ｈ），５．３８（ｍ，１Ｈ），５．３４－５．２８（ｍ，２Ｈ），４．５０－４．４５（ｍ，２Ｈ），４．３０－４．２４（ｍ，２Ｈ），４．２１－４．１５（ｍ，２Ｈ），４．０５（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．９，５．９，１１．９Ｈｚ），２．４５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），２．４０－２．３２（ｍ，１０Ｈ），１．７０－１．５４（ｍ，１２Ｈ），０．９７－０．８６（ｍ，１８Ｈ）
ＥＳＩ－ＭＳスペクトル（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｅ） Ｃ38Ｈ60Ｎ3Ｏ21Ｐ2：［Ｍ－Ｈ］-，ｃａｌｃｄ：９５６．３２，ｆｏｕｎｄ：９５６．３
【0054】
実施例７： ＣＤＰ－リビトール テトライソブチレート，ジアセテートの合成
（１）１，２，３，４－テトラ－Ｏ－イソブチリル－５－Ｏ－トリチル－Ｄ－リビトールの合成
Ｄ－リボースから誘導した５－Ｏ－トリチル－Ｄ－リビトール（１．７６ｇ，４．４６ｍｍｏｌ）を脱水ピリジン（１８ｍＬ）に溶解し、Ｎ，Ｎ－４－ジメチルアミノピリジン（５４５ｍｇ，４．４６ｍｍｏｌ）を加えて氷冷した。これにイソブタン酸無水物（４．４６ｍＬ，２６．８ｍｍｏｌ）を加え、反応容器を氷浴からはずして室温で攪拌した。１時間３０分後にＮ，Ｎ－ジメチル－１，３－プロパンジアミン（１．３９ｍＬ，１１．１５ｍｍｏｌ）を加えて未反応のイソブタン酸無水物を分解させた後に減圧濃縮した。得られた残渣にｎ－ヘキサン－酢酸エチル（２：１）の混合溶媒を加え、水、１Ｍ塩酸、水、飽和炭酸水素ナトリウム水、水、および飽和食塩水で順次洗浄した後に、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。これを濾過し、濾液と洗浄液を合わせて減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。目的のフラクションを集めて減圧濃縮、乾燥することで、無色油状物である目的化合物を得た（収量：１．８９ｇ，収率：６３％）。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ７．４０－７．２０（ｍ，１５Ｈ），５．４０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５，５．５Ｈｚ），５．３７（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，５．９，５．９Ｈｚ），５．２６（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．８，５．０，７．３Ｈｚ），４．３１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，１１．９Ｈｚ），４．１１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３，１１．９Ｈｚ），３．２９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，１０．５Ｈｚ），３．１９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．４，１０．５Ｈｚ），２．６４（ｑｑ，１Ｈ，Ｊ＝６．９，６．９Ｈｚ），２．５０（ｑｑ，１Ｈ，Ｊ＝６．９，６．９Ｈｚ），２．４４－２．３３（ｍ，２Ｈ），１．２４（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），１．２２（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），１．１２（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．１１（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．０９（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．０８（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），１．０４（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），１．０１（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）
ＥＳＩ－ＭＳスペクトル（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｏｄｅ） Ｃ40Ｈ50Ｏ9Ｎａ：［Ｍ＋Ｎａ］+，ｃａｌｃｄ：６９７．３４，ｆｏｕｎｄ：６９７．３
（１）１，２，３，４－テトラ－Ｏ－イソブチリル－５－Ｏ－トリチル－Ｄ－リビトールの合成
【化19】
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ７．４０－７．２０（ｍ，１５Ｈ），５．４０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５，５．５Ｈｚ），５．３７（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，５．９，５．９Ｈｚ），５．２６（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．８，５．０，７．３Ｈｚ），４．３１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，１１．９Ｈｚ），４．１１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３，１１．９Ｈｚ），３．２９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，１０．５Ｈｚ），３．１９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．４，１０．５Ｈｚ），２．６４（ｑｑ，１Ｈ，Ｊ＝６．９，６．９Ｈｚ），２．５０（ｑｑ，１Ｈ，Ｊ＝６．９，６．９Ｈｚ），２．４４－２．３３（ｍ，２Ｈ），１．２４（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），１．２２（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），１．１２（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．１１（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．０９（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．０８（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），１．０４（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），１．０１（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）
ＥＳＩ－ＭＳスペクトル（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｏｄｅ） Ｃ40Ｈ50Ｏ9Ｎａ：［Ｍ＋Ｎａ］+，ｃａｌｃｄ：６９７．３４，ｆｏｕｎｄ：６９７．３
【0055】
（２）１，２，３，４－テトラ－Ｏ－イソブチリル－Ｄ－リビトールの合成
１，２，３，４－テトラ－Ｏ－イソブチリル－５－Ｏ－トリチル－Ｄ－リビトール（１．４２ｇ，２．１０ｍｍｏｌ）に９０％ギ酸水（１５ｍＬ）を加え、さらにメタノール（２ｍＬ）を加えて均一な溶液として室温で攪拌した。２０分後に反応混合物を減圧濃縮した。得られた残渣をｎ－ヘキサン：酢酸エチル＝１：１の混合溶媒に溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム水、水、および飽和食塩水で順次洗浄した後に、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。これを濾過し、濾液と洗浄液を合わせて減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。目的のフラクションを集めて減圧濃縮、乾燥することで、目的化合物を得た（収量：６０４ｍｇ，収率：６７％）。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ５．３９－５．３４（ｍ，２Ｈ），５．０７（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７，５．５，５．５Ｈｚ），４．４０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７，１２．４Ｈｚ），４．１６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９，１２．４Ｈｚ），３．８４（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７，７．３，１２．４Ｈｚ），３．６８（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５，５．５，１２．４Ｈｚ），２．６８－２．４８（ｍ，４Ｈ），２．０７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．０，７．３Ｈｚ），１．２２－１．１６（ｍ，１８Ｈ），１．１５（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．１４（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ）
ＥＳＩ－ＭＳスペクトル（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｏｄｅ） Ｃ21Ｈ36Ｏ9Ｎａ：［Ｍ＋Ｎａ］+，ｃａｌｃｄ：４５５．２３，ｆｏｕｎｄ：４５５．２
【化20】
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ５．３９－５．３４（ｍ，２Ｈ），５．０７（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７，５．５，５．５Ｈｚ），４．４０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７，１２．４Ｈｚ），４．１６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９，１２．４Ｈｚ），３．８４（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７，７．３，１２．４Ｈｚ），３．６８（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５，５．５，１２．４Ｈｚ），２．６８－２．４８（ｍ，４Ｈ），２．０７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．０，７．３Ｈｚ），１．２２－１．１６（ｍ，１８Ｈ），１．１５（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．１４（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ）
ＥＳＩ－ＭＳスペクトル（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｏｄｅ） Ｃ21Ｈ36Ｏ9Ｎａ：［Ｍ＋Ｎａ］+，ｃａｌｃｄ：４５５．２３，ｆｏｕｎｄ：４５５．２
【0056】
（３）１，２，３，４－テトラ－Ｏ－イソブチリル－Ｄ－リビトール ５－ホスフェートの合成
１，２，３，４－テトラ－Ｏ－イソブチリル－Ｄ－リビトール（３００ｍｇ，０．６９４ｍｍｏｌ）を脱水ＴＨＦ（６ｍＬ）に溶解し、－１０℃以下に冷却した。これにジイソプロピルエチルアミン（９４４μＬ，５．５５ｍｍｏｌ）とＰＯＣｌ3（４５２μＬ，４．８６ｍｍｏｌ）を順次加えて２時間攪拌した。反応混合物を－７８℃に冷却し、水（計４ｍＬ）を加えた。室温で飽和炭酸水素ナトリウム水（計８ｍＬ）を加えて中和し、減圧濃縮によりＴＨＦをほぼ留去する際には、途中で飽和炭酸水素ナトリウム水を加えてｐＨを中性にした。得られた残渣（水層）をｎ－ヘキサンで洗浄した後に、６Ｍ塩酸を加えてｐＨを１～２に調整した後に、ジエチルエーテルを加えて分液した。分離した水層にジエチルエーテルを加えて抽出し、有機層を合わせた。水および飽和食塩水で順次洗浄後に無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。これを濾過し、濾液と洗浄液を合わせ、トリエチルアミンを加えて減圧濃縮、乾燥することで、無色油状物である目的化合物を得た（収量：３２４ｍｇ，収率：９１％）。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）：δ５．４５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０，５．９Ｈｚ），５．３７（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．８，６．０，６．０Ｈｚ），５．３０（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７，４．６，６．９Ｈｚ），４．５２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．８，１２．４Ｈｚ），４．３０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．０，１２．４Ｈｚ），４．１３（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，５．５，１１．４Ｈｚ），４．００（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．４，６．４，１１．４Ｈｚ），２．７６－２．６２（ｍ，３Ｈ），２．６１（ｑｑ，１Ｈ，Ｊ＝６．９，６．９Ｈｚ），１．１９－１．１５（ｍ，１８Ｈ），１．１３（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．１２（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ）
ＥＳＩ－ＭＳスペクトル（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｅ） Ｃ21Ｈ36Ｏ12Ｐ：［Ｍ－Ｈ］-，ｃａｌｃｄ：５１１．１９，ｆｏｕｎｄ：５１１．２
【化21】
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）：δ５．４５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０，５．９Ｈｚ），５．３７（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．８，６．０，６．０Ｈｚ），５．３０（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７，４．６，６．９Ｈｚ），４．５２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．８，１２．４Ｈｚ），４．３０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．０，１２．４Ｈｚ），４．１３（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，５．５，１１．４Ｈｚ），４．００（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．４，６．４，１１．４Ｈｚ），２．７６－２．６２（ｍ，３Ｈ），２．６１（ｑｑ，１Ｈ，Ｊ＝６．９，６．９Ｈｚ），１．１９－１．１５（ｍ，１８Ｈ），１．１３（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．１２（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ）
ＥＳＩ－ＭＳスペクトル（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｅ） Ｃ21Ｈ36Ｏ12Ｐ：［Ｍ－Ｈ］-，ｃａｌｃｄ：５１１．１９，ｆｏｕｎｄ：５１１．２
【0057】
（４）ＣＤＰ－リビトール テトライソブチレート，ジアセテートの合成
１，２，３，４－テトラ－Ｏ－イソブチリル－Ｄ－リビトール ５－ホスフェート（３１９ｍｇ，０．６２２ｍｍｏｌ）を脱水ピリジンに溶解し、減圧濃縮する操作を３回繰り返した。得られた残渣をアルゴン雰囲気下で脱水ピリジンに溶解した（Ａ液）。これとは別に、１Ｈ－テトラゾール（９６．０ｍｇ，１．３７ｍｍｏｌ）と、別途調製した２’，３’－ジ－Ｏ－アセチル－シチジン ５’－モノホスフェート モルフォリデート（定法によりシチジン５’－モノホスフェートから調製が可能）（４４４ｍｇ，０．９３３ｍｍｏｌ）をそれぞれ別の容器Ｂと容器Ｃに入れ、同じく脱水ピリジンを加えて減圧濃縮する操作を３回繰り返し、それぞれ得られた残渣をアルゴン雰囲気下で脱水ピリジンに溶解した（順にＢ液とＣ液）。続いてアルゴン雰囲気下でＡ液に対してＢ液とＣ液を順次加えた。アルゴン雰囲気下、室温で終夜攪拌した。減圧濃縮により得られた残渣に脱水ＤＭＦを加えて減圧濃縮した。得られた残渣を逆相系のＨＰＬＣで精製した。目的のフラクションを集め、凍結乾燥、およびイオン交換樹脂に通すことにより、白色粉末である目的化合物の２Ｎａ塩を得た（収量：２７１ｍｇ，収率：４６％）。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）：δ８．００（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），６．２０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），６．１６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），５．４４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．６，５．５Ｈｚ），５．４１－５．３７（ｍ，２Ｈ），５．３１－５．２６（ｍ，２Ｈ），４．５２－４．４６（ｍ，２Ｈ），４．３０－４．１３（ｍ，４Ｈ），４．０６（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９，６．９，１１．４Ｈｚ），２．６８－２．５４（ｍ，４Ｈ），２．１６（ｓ，３Ｈ），２．１１（ｓ，３Ｈ），１．１５－１．１２（ｍ，１８Ｈ），１．１１（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），１．１０（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ）
ＥＳＩ－ＭＳスペクトル（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｅ） Ｃ34Ｈ52Ｎ3Ｏ21Ｐ2：［Ｍ－Ｈ］-，ｃａｌｃｄ：９００．２６，ｆｏｕｎｄ：９００．２
【化22】
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）：δ８．００（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），６．２０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），６．１６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），５．４４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．６，５．５Ｈｚ），５．４１－５．３７（ｍ，２Ｈ），５．３１－５．２６（ｍ，２Ｈ），４．５２－４．４６（ｍ，２Ｈ），４．３０－４．１３（ｍ，４Ｈ），４．０６（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９，６．９，１１．４Ｈｚ），２．６８－２．５４（ｍ，４Ｈ），２．１６（ｓ，３Ｈ），２．１１（ｓ，３Ｈ），１．１５－１．１２（ｍ，１８Ｈ），１．１１（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），１．１０（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ）
ＥＳＩ－ＭＳスペクトル（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｅ） Ｃ34Ｈ52Ｎ3Ｏ21Ｐ2：［Ｍ－Ｈ］-，ｃａｌｃｄ：９００．２６，ｆｏｕｎｄ：９００．２
【0058】
実施例８： ＣＤＰ－リビトール テトラメトキシカルボニル，ジアセテート
（１）１，２，３，４－テトラ－Ｏ－メトキシカルボニル－５－Ｏ－トリチル－Ｄ－リビトールの合成
Ｄ－リボースから誘導した５－Ｏ－トリチル－Ｄ－リビトール（１．５０ｇ，３．８０ｍｍｏｌ）を脱水クロロホルム（１５ｍＬ）に溶解し、Ｎ，Ｎ－４－ジメチルアミノピリジン（２．７９ｇ，２２．８ｍｍｏｌ）を加えて氷冷した。これにクロロギ酸メチル（１．７５ｍＬ，２２．８ｍｍｏｌ）を加え、反応容器を氷浴からはずして室温で攪拌した。２時間３０分後にクロロギ酸メチル（０．２９２ｍＬ，３．８０ｍｍｏｌ）を追加し、更に１時間室温で攪拌した。１Ｍ塩酸、水および飽和食塩水で順次洗浄した後に、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。これを濾過し、濾液と洗浄液を合わせて減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。目的のフラクションを集めて減圧濃縮、乾燥することで、無色油状物である目的化合物を得た（収量：１．２２ｇ，収率：５１％）。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ７．４３－７．２０（ｍ，１５Ｈ），５．３５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１，５．９Ｈｚ），５．２２（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，３．７，７．３Ｈｚ），５．１２（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７，５．５，５．５Ｈｚ），４．４９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，１２．４Ｈｚ），４．２６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９，１２．４Ｈｚ），３．８２（ｓ，３Ｈ），３．７７（ｓ，３Ｈ），３．７４（ｓ，３Ｈ），３．７２（ｓ，３Ｈ），３．３８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，１０．５Ｈｚ），３．２６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５，１０．５Ｈｚ）
ＥＳＩ－ＭＳスペクトル（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｏｄｅ） Ｃ32Ｈ34Ｏ13Ｎａ：［Ｍ＋Ｎａ］+，ｃａｌｃｄ：６４９．１９，ｆｏｕｎｄ：６４９．２
（１）１，２，３，４－テトラ－Ｏ－メトキシカルボニル－５－Ｏ－トリチル－Ｄ－リビトールの合成
【化23】
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ７．４３－７．２０（ｍ，１５Ｈ），５．３５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１，５．９Ｈｚ），５．２２（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，３．７，７．３Ｈｚ），５．１２（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７，５．５，５．５Ｈｚ），４．４９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，１２．４Ｈｚ），４．２６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９，１２．４Ｈｚ），３．８２（ｓ，３Ｈ），３．７７（ｓ，３Ｈ），３．７４（ｓ，３Ｈ），３．７２（ｓ，３Ｈ），３．３８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，１０．５Ｈｚ），３．２６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５，１０．５Ｈｚ）
ＥＳＩ－ＭＳスペクトル（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｏｄｅ） Ｃ32Ｈ34Ｏ13Ｎａ：［Ｍ＋Ｎａ］+，ｃａｌｃｄ：６４９．１９，ｆｏｕｎｄ：６４９．２
【0059】
（２）１，２，３，４－テトラ－ Ｏ－メトキシカルボニル－Ｄ－リビトールの合成
１，２，３，４－テトラ－Ｏ－メトキシカルボニル－５－Ｏ－トリチル－Ｄ－リビトール（１．１９ｇ，１．９０ｍｍｏｌ）に８０％ギ酸／メタノール（１５ｍＬ）を加えて室温で攪拌した。３０分後に反応混合物を減圧濃縮した。得られた残渣をｎ－ヘキサン：酢酸エチル＝１：１の混合溶媒に溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム水、水および飽和食塩水で順次洗浄した後に無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。これを濾過し、濾液と洗浄液を合わせて減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。目的のフラクションを集めて減圧濃縮、乾燥することで目的化合物を得た（収量：３８８ｍｇ，収率：５３％）。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ５．２８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１，５．０Ｈｚ），５．２５（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．８，４．１，６．９Ｈｚ），５．０２（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１，５．５，５．５Ｈｚ），４．５４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．８，１２．４Ｈｚ），４．３１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９，１２．４Ｈｚ），３．９４（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１，６．４，１２．４Ｈｚ），３．８５－３．８０（ｍ，７Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ），３．７９（ｓ，３Ｈ），２．０９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．４，６．４Ｈｚ）
ＥＳＩ－ＭＳスペクトル（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｏｄｅ） Ｃ13Ｈ20Ｏ13Ｎａ：［Ｍ＋Ｎａ］+，ｃａｌｃｄ：４０７．０８，ｆｏｕｎｄ：４０７．１
【化24】
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ５．２８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１，５．０Ｈｚ），５．２５（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．８，４．１，６．９Ｈｚ），５．０２（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１，５．５，５．５Ｈｚ），４．５４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．８，１２．４Ｈｚ），４．３１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９，１２．４Ｈｚ），３．９４（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１，６．４，１２．４Ｈｚ），３．８５－３．８０（ｍ，７Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ），３．７９（ｓ，３Ｈ），２．０９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．４，６．４Ｈｚ）
ＥＳＩ－ＭＳスペクトル（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｏｄｅ） Ｃ13Ｈ20Ｏ13Ｎａ：［Ｍ＋Ｎａ］+，ｃａｌｃｄ：４０７．０８，ｆｏｕｎｄ：４０７．１
【0060】
（３）１，２，３，４－テトラ－Ｏ－メトキシカルボニル－Ｄ－リビトール ５－ホスフェートの合成
１，２，３，４－テトラ－ Ｏ－メトキシカルボニル－Ｄ－リビトール（３３５ｍｇ，０．８７２ｍｍｏｌ）を脱水ＴＨＦ（１５ｍＬ）に溶解し、－１０℃以下に冷却した。これにジイソプロピルエチルアミン（１．２１ｍＬ，６．９８ｍｍｏｌ）とＰＯＣｌ3（５６７μＬ，６．１０ｍｍｏｌ）を順次加えて２時間攪拌した。反応混合物を－７８℃に冷却し、水（計５ｍＬ）を加えた。室温で飽和炭酸水素ナトリウム水（計８ｍＬ）を加えて中和し、減圧濃縮によりＴＨＦをほぼ留去する際には途中で飽和炭酸水素ナトリウム水を加えてｐＨを中性にした。得られた残渣（水層）をジエチルエーテルで洗浄した後に、６Ｍ塩酸を加えてｐＨを１～２に調整した後に酢酸エチルを加えて分液した。分離した水層に酢酸エチルを加えて抽出し、有機層を合わせた。水と飽和食塩水で順次洗浄後に無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。これを濾過し、濾液と洗浄液を合わせ、トリエチルアミンを加えて減圧濃縮、乾燥することで、無色油状物である目的化合物を得た（収量：３０３ｍｇ（1Ｈ－ＮＭＲの積分値からの補正収量），収率：７４％）。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ５．２９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１，６．４Ｈｚ），５．２３（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，４．１，６．９Ｈｚ），５．１２（ｍ，１Ｈ），４．５０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，１２．４Ｈｚ），４．３１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９，１２．４Ｈｚ），４．２１（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，５．５，１１．９Ｈｚ），４．０９（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０，６．９，１１．９Ｈｚ），３．８０１（ｓ，３Ｈ），３．７９５（ｓ，３Ｈ），３．７９２（ｓ，３Ｈ），３．７７（ｓ，３Ｈ）
ＥＳＩ－ＭＳスペクトル（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｅ） Ｃ13Ｈ20Ｏ16Ｐ：［Ｍ－Ｈ］-，ｃａｌｃｄ：４６３．０５，ｆｏｕｎｄ： ４６３．０
【化25】
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ５．２９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１，６．４Ｈｚ），５．２３（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，４．１，６．９Ｈｚ），５．１２（ｍ，１Ｈ），４．５０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，１２．４Ｈｚ），４．３１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９，１２．４Ｈｚ），４．２１（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，５．５，１１．９Ｈｚ），４．０９（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０，６．９，１１．９Ｈｚ），３．８０１（ｓ，３Ｈ），３．７９５（ｓ，３Ｈ），３．７９２（ｓ，３Ｈ），３．７７（ｓ，３Ｈ）
ＥＳＩ－ＭＳスペクトル（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｅ） Ｃ13Ｈ20Ｏ16Ｐ：［Ｍ－Ｈ］-，ｃａｌｃｄ：４６３．０５，ｆｏｕｎｄ： ４６３．０
【0061】
（４）ＣＤＰ－リビトール テトラメトキシカルボニル，ジアセテート
１，２，３，４－テトラ－Ｏ－メトキシカルボニル－Ｄ－リビトール ５－ホスフェート（３０３ｍｇ，０．６５ｍｍｏｌ）、２’，３’－ジ－Ｏ－アセチル－シチジン ５’－モノホスフェート モルフォリデート（６９７ｍｇ，０．９８ｍｍｏｌ）と１Ｈ－テトラゾール（１００ｍｇ，１．４３ｍｍｏｌ）を脱水ピリジン（７ｍＬ）に溶解し、アルゴン雰囲気下、室温で２日間攪拌した。反応液を減圧濃縮し、残渣に脱水ＤＭＦを加えて減圧濃縮した。得られた残渣を逆相系のＨＰＬＣで精製した。目的のフラクションを集め、凍結乾燥、およびイオン交換樹脂に通すことにより、白色粉末である目的化合物の２Ｎａ塩を得た（収量：３２５ｍｇ，収率：５５％）。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）：δ７．９８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），６．２１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），６．１６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），５．４４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１，５．５Ｈｚ），５．４０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５，５．５Ｈｚ），５．２９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０，５．０Ｈｚ），５．２３－５．１６（ｍ，２Ｈ），４．５５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，１２．８Ｈｚ），４．５２（ｍ，１Ｈ），４．３８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．０，１２．４Ｈｚ），４．３０（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．３，４．１，１１．９Ｈｚ），４．２３（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，５．５，１１．９Ｈｚ），４．１８（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，４．１，１１．９Ｈｚ），４．１１（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．０，６．０，１１．９Ｈｚ），３．８２（ｍ，６Ｈ），３．８１（ｓ，３Ｈ），３．７９（ｓ，３Ｈ），２．１７（ｓ，３Ｈ），２．１２（ｓ，３Ｈ）
ＥＳＩ－ＭＳスペクトル（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｅ） Ｃ26Ｈ36Ｎ3Ｏ25Ｐ2：［Ｍ－Ｈ］-，ｃａｌｃｄ：８５２．１１，ｆｏｕｎｄ：８５２．１
【化26】
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）：δ７．９８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），６．２１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），６．１６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），５．４４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１，５．５Ｈｚ），５．４０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５，５．５Ｈｚ），５．２９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０，５．０Ｈｚ），５．２３－５．１６（ｍ，２Ｈ），４．５５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，１２．８Ｈｚ），４．５２（ｍ，１Ｈ），４．３８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．０，１２．４Ｈｚ），４．３０（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．３，４．１，１１．９Ｈｚ），４．２３（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，５．５，１１．９Ｈｚ），４．１８（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，４．１，１１．９Ｈｚ），４．１１（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．０，６．０，１１．９Ｈｚ），３．８２（ｍ，６Ｈ），３．８１（ｓ，３Ｈ），３．７９（ｓ，３Ｈ），２．１７（ｓ，３Ｈ），２．１２（ｓ，３Ｈ）
ＥＳＩ－ＭＳスペクトル（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｅ） Ｃ26Ｈ36Ｎ3Ｏ25Ｐ2：［Ｍ－Ｈ］-，ｃａｌｃｄ：８５２．１１，ｆｏｕｎｄ：８５２．１
【0062】
実施例９： ＣＤＰ－リビトール ヘキサアセテート－ＰＢ１の合成
（１）２’，３’－ジ－Ｏ－アセチル－シチジン－５’－（４－ペンタノイルオキシベンジル Ｎ，Ｎ－ジイソプソピル ホスホロアミダイトの合成
参考文献（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００９，１８，１９６７－１９７５）に記載の方法で得られる２’，３’－ジ－Ｏ－アセチル－シチジン（０．５０ｇ）を脱水ＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解し、アルゴン雰囲気下で氷冷した。これに参考文献（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２０１５，５８，６１１４－６１３０）に記載の方法で得られるペンタノイルオキシベンジツ ビス（ジイソプロピルアミノ）－ホスホロアミダイト（１．３４ｇ）を加え、更に４，５－ジシアノイミダゾール（０．１８ｇ）の脱水ＤＭＦ（０．８０ｍＬ）溶液をアルゴン雰囲気下で滴下した。アルゴン雰囲気下、室温で３０分間攪拌した後に酢酸エチルを加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水および飽和食塩水で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後に濾過し、濾液と洗浄液を合わせて減圧濃縮により得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。目的のフラクションを集めて減圧濃縮、乾燥することで、油状物である目的化合物を得た（粗収量：０．４９１ｇ（溶媒等を含む））。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ７．９０（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．７２（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．４１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），７．３８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），７．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），７．０２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），６．４８（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），６．３８（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），５．４２（ｄｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝４．１，５．５Ｈｚ），５．３９－５．３６（ｍ，１Ｈ），５．２９（ｄｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝５．５，７．３Ｈｚ），５．０１（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），４．７８（ｄｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝７．３，１２．４Ｈｚ），４．７４－４．６９（ｍ，１Ｈ），４．５７－４．５２（ｍ，１Ｈ），４．２６（ｍ，１Ｈ），４．０２（ｄｄｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝２．３，５．５，１１．０Ｈｚ），３．８３－３．８１（ｍ，１Ｈ），３．７９（ｄｄｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝１．４，４．６，１１．０Ｈｚ），３．７５－３．４９（ｍ，２Ｈ），２．５９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），２．５７（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），２．１０１（ｓ，１．５Ｈ），２．０９６（ｓ，１．５Ｈ），２．０８２（ｓ，１．５Ｈ），２．０４５（ｓ，１．５Ｈ），１．７７－１．６９（ｍ，２Ｈ），１．５０－１．４０（ｍ，２Ｈ），１．２９－１．２０（ｍ，１２Ｈ），０．９８０（ｔ，１．５Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），０．９７７（ｔ，１．５Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）
ＥＳＩ－ＭＳスペクトル（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｏｄｅ） Ｃ31Ｈ46Ｎ4Ｏ10Ｐ：［Ｍ＋Ｈ］+，ｃａｌｃｄ：６６５．３０，ｆｏｕｎｄ：６６５．３
（１）２’，３’－ジ－Ｏ－アセチル－シチジン－５’－（４－ペンタノイルオキシベンジル Ｎ，Ｎ－ジイソプソピル ホスホロアミダイトの合成
【化27】
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ７．９０（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．７２（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．４１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），７．３８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），７．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），７．０２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），６．４８（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），６．３８（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），５．４２（ｄｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝４．１，５．５Ｈｚ），５．３９－５．３６（ｍ，１Ｈ），５．２９（ｄｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝５．５，７．３Ｈｚ），５．０１（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），４．７８（ｄｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝７．３，１２．４Ｈｚ），４．７４－４．６９（ｍ，１Ｈ），４．５７－４．５２（ｍ，１Ｈ），４．２６（ｍ，１Ｈ），４．０２（ｄｄｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝２．３，５．５，１１．０Ｈｚ），３．８３－３．８１（ｍ，１Ｈ），３．７９（ｄｄｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝１．４，４．６，１１．０Ｈｚ），３．７５－３．４９（ｍ，２Ｈ），２．５９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），２．５７（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），２．１０１（ｓ，１．５Ｈ），２．０９６（ｓ，１．５Ｈ），２．０８２（ｓ，１．５Ｈ），２．０４５（ｓ，１．５Ｈ），１．７７－１．６９（ｍ，２Ｈ），１．５０－１．４０（ｍ，２Ｈ），１．２９－１．２０（ｍ，１２Ｈ），０．９８０（ｔ，１．５Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），０．９７７（ｔ，１．５Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）
ＥＳＩ－ＭＳスペクトル（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｏｄｅ） Ｃ31Ｈ46Ｎ4Ｏ10Ｐ：［Ｍ＋Ｈ］+，ｃａｌｃｄ：６６５．３０，ｆｏｕｎｄ：６６５．３
【0063】
（２）ＣＤＰ－リビトール ヘキサアセテート－ＰＢ１の合成
アルゴン雰囲気下で１，２，３，４－テトラ－Ｏ－アセチル－Ｄ－リビトール ５－ホスフェート（２３２ｍｇ）、トリエチルアミン（５８μＬ）、および２’，３’－ジ－Ｏ－アセチル－シチジン－５’－（４－ペンタノイルオキシベンジル Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル ホスホロアミダイト）（４６３ｍｇ）を脱水アセトニトリル（１４ｍＬ）に溶解して室温で攪拌した。これに４，５－ジシアノイミダゾール（８２ｍｇ）を脱水アセトニトリル（１ｍＬ）に溶解したものを少しずつ計７回に分けて加えた。２０分間攪拌した後に、約５．０Ｍ ｔ－ブチルヒドロペルオキシド／デカン溶液（１９０μＬ）を加えた。更に４０分間攪拌した後に、約５．０Ｍ ｔ－ブチルヒドロペルオキシド／デカン溶液（８０μＬ）を追加した。２０分後にｎ－ヘキサンで洗浄した後に、減圧濃縮によりアセトニトリルを留去した。残渣に脱水アセトニトリルを加えて再度減圧濃縮した。得られた残渣を逆相系のＨＰＬＣで精製した。目的のフラクションを集め、凍結乾燥に得られた２２６ｍｇのうちの１４０ｍｇをイオン交換樹脂に通すことにより、白色粉末である目的化合物のＮａ塩を得た（収量：１１９ｍｇ，収率：４１％）。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）：δ７．６０（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．５７（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．５６－７．５１（ｍ，２Ｈ），７．１８－７．１２（ｍ，２Ｈ），６．１０－６．０７（ｍ，１Ｈ），５．９７（ｄ，０．５Ｈ， Ｊ＝７．８ Ｈｚ）， ５．９０（ｄ， ０．５Ｈ， Ｊ＝７．３ Ｈｚ）， ５．３６（ｄｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝５．５，５．５Ｈｚ），５．３３（ｄｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝５．５，５．５Ｈｚ），５．２８－５．２１（ｍ，６Ｈ），４．４４－４．３４（ｍ，３Ｈ），４．３２－４．２２（ｍ，２Ｈ），４．２０－４．１２（ｍ，１Ｈ），４．０９－４．０２（ｍ，１Ｈ），２．６４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），２．６３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），２．１４４（ｓ，３Ｈ），２．１２２（ｓ，１．５Ｈ），２．１２０（ｓ，１．５Ｈ），２．１０３（ｓ，１．５Ｈ），２．０９８（ｓ，３Ｈ），２．０８８（ｓ，３Ｈ），２．０８０（ｓ，１．５Ｈ），２．０６０（ｓ，１．５Ｈ），２．０５７（ｓ，１．５Ｈ），１．７４－１．６６（ｍ，２Ｈ），１．４６－１．３６（ｍ，２Ｈ），０．９３（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）
ＥＳＩ－ＭＳスペクトル（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｅ） Ｃ38Ｈ50Ｎ3Ｏ23Ｐ2：［Ｍ－Ｈ］-，ｃａｌｃｄ：９７８．２３，ｆｏｕｎｄ：９７８．２
【化28】
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）：δ７．６０（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．５７（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．５６－７．５１（ｍ，２Ｈ），７．１８－７．１２（ｍ，２Ｈ），６．１０－６．０７（ｍ，１Ｈ），５．９７（ｄ，０．５Ｈ， Ｊ＝７．８ Ｈｚ）， ５．９０（ｄ， ０．５Ｈ， Ｊ＝７．３ Ｈｚ）， ５．３６（ｄｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝５．５，５．５Ｈｚ），５．３３（ｄｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝５．５，５．５Ｈｚ），５．２８－５．２１（ｍ，６Ｈ），４．４４－４．３４（ｍ，３Ｈ），４．３２－４．２２（ｍ，２Ｈ），４．２０－４．１２（ｍ，１Ｈ），４．０９－４．０２（ｍ，１Ｈ），２．６４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），２．６３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），２．１４４（ｓ，３Ｈ），２．１２２（ｓ，１．５Ｈ），２．１２０（ｓ，１．５Ｈ），２．１０３（ｓ，１．５Ｈ），２．０９８（ｓ，３Ｈ），２．０８８（ｓ，３Ｈ），２．０８０（ｓ，１．５Ｈ），２．０６０（ｓ，１．５Ｈ），２．０５７（ｓ，１．５Ｈ），１．７４－１．６６（ｍ，２Ｈ），１．４６－１．３６（ｍ，２Ｈ），０．９３（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）
ＥＳＩ－ＭＳスペクトル（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｅ） Ｃ38Ｈ50Ｎ3Ｏ23Ｐ2：［Ｍ－Ｈ］-，ｃａｌｃｄ：９７８．２３，ｆｏｕｎｄ：９７８．２
【0064】
実施例１０： ＣＤＰ－リビトール ヘキサアセテート－ＰＢ２の合成
（１）１，２，３，４－テトラ－Ｏ－アセチル－Ｄ－リビトール－５－（４－ペンタノイルオキシベンジル Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル ホスホロアミダイトの合成
１，２，３，４－テトラ－Ｏ－アセチル－Ｄ－リビトール（３８４ｍｇ，１．２０ｍｍｏｌ）を脱水ジクロロメタン（１５ｍＬ）に溶解し、アルゴン雰囲気下で氷冷した。これに参考文献（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２０１５，５８，６１１４－６１３０）に記載の方法で得られる４－ペンタノイルオキシベンジル ビス（ジイソプロピルアミノ）－ホスホロアミダイト（１．０５ｇ，２．４０ｍｍｏｌ）を加えた。４，５－ジシアノイミダゾール（１４２ｍｇ，１２０ｍｍｏｌ）／脱水ＤＭＦ（６３０μＬ）の溶液を滴下し、反応容器を氷浴からはずしてアルゴン雰囲気下で攪拌した。３０分後に酢酸エチルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水、水および飽和食塩水で順次洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥後に濾過し、濾液と洗浄液を合わせて減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。目的のフラクションを集めて減圧濃縮、乾燥することで目的化合物を得た（粗収量：７８２ｍｇ，粗収率：９９％）。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ７．３６－７．３２（ｍ，２Ｈ），７．０４－７．０２（ｍ，２Ｈ），５．３９（ｄｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝５．０，６．０Ｈｚ），５．３５（ｄｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝５．０，５．０Ｈｚ），５．３２（ｍ，１Ｈ），５．２６－５．２０（ｍ，１Ｈ），４．７７－４．５７（ｍ，２Ｈ），４．３４（ｄｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝３．２，１１．９Ｈｚ），４．３３（ｄｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝３．２，１２．４Ｈｚ），４．１６（ｄｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝１．８，１２．４Ｈｚ），４．１５（ｄｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝１．８，１２．４Ｈｚ），３．８４（ｄｄｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝３．７，６．９，１１．４Ｈｚ），３．７８－３．７４（ｍ，１Ｈ），３．６７（ｍ，０．５Ｈ），３．６６－３．５６（ｍ，２Ｈ），２．５５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），２．０８（ｓ，１．５Ｈ），２．０６２（ｓ，１．５Ｈ），２．０５６（ｓ，３Ｈ），２．０４６（ｓ，３Ｈ），２．０３４（ｓ，１．５Ｈ），２．０３０（ｓ，１．５Ｈ），１．７７－１．７０（ｍ，２Ｈ），１．４９－１．４０（ｍ，２Ｈ），１．２１－１．１５（ｍ，１２Ｈ），０．９７（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）
ＥＳＩ－ＭＳスペクトル（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｏｄｅ） Ｃ31Ｈ49ＮＯ12Ｐ：［Ｍ＋Ｈ］+，ｃａｌｃｄ：６５８．３０，ｆｏｕｎｄ：６５８．３
（１）１，２，３，４－テトラ－Ｏ－アセチル－Ｄ－リビトール－５－（４－ペンタノイルオキシベンジル Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル ホスホロアミダイトの合成
【化29】
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ７．３６－７．３２（ｍ，２Ｈ），７．０４－７．０２（ｍ，２Ｈ），５．３９（ｄｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝５．０，６．０Ｈｚ），５．３５（ｄｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝５．０，５．０Ｈｚ），５．３２（ｍ，１Ｈ），５．２６－５．２０（ｍ，１Ｈ），４．７７－４．５７（ｍ，２Ｈ），４．３４（ｄｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝３．２，１１．９Ｈｚ），４．３３（ｄｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝３．２，１２．４Ｈｚ），４．１６（ｄｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝１．８，１２．４Ｈｚ），４．１５（ｄｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝１．８，１２．４Ｈｚ），３．８４（ｄｄｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝３．７，６．９，１１．４Ｈｚ），３．７８－３．７４（ｍ，１Ｈ），３．６７（ｍ，０．５Ｈ），３．６６－３．５６（ｍ，２Ｈ），２．５５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），２．０８（ｓ，１．５Ｈ），２．０６２（ｓ，１．５Ｈ），２．０５６（ｓ，３Ｈ），２．０４６（ｓ，３Ｈ），２．０３４（ｓ，１．５Ｈ），２．０３０（ｓ，１．５Ｈ），１．７７－１．７０（ｍ，２Ｈ），１．４９－１．４０（ｍ，２Ｈ），１．２１－１．１５（ｍ，１２Ｈ），０．９７（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）
ＥＳＩ－ＭＳスペクトル（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｏｄｅ） Ｃ31Ｈ49ＮＯ12Ｐ：［Ｍ＋Ｈ］+，ｃａｌｃｄ：６５８．３０，ｆｏｕｎｄ：６５８．３
【0065】
（２）ＣＤＰ－リビトール ヘキサアセテート－ＰＢ２の合成
ＣＭＰ ジアセテート（２７０ｍｇ，０．６６３ｍｍｏｌ）を脱水ＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解し、減圧濃縮する操作を２回繰り返した。得られた残渣を脱水ＤＭＦ（３０ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（８３．１μＬ，０．５７７ｍｍｏｌ）を加えて中和した（Ａ液）。これとは別に、１，２，３，４－テトラ－Ｏ－アセチル－Ｄ－リビトール－５－（４－ペンタノイルオキシベンジル Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル ホスホロアミダイト）（４７９ｍｇ，０．７２９ｍｍｏｌ）を脱水アセトニトリル（２７ｍＬ）に溶解し、これに前記Ａ液を加えた。更に脱水ＤＭＦ（５ｍＬ）で２回洗浄した。続いて４，５－ジシアノイミダゾール（８６．１ｍｇ，０．７２９ｍｍｏｌ）の脱水ＤＭＦ（１ｍＬ）溶液を室温で加えた。２０分間攪拌した後に、７０％ｔ－ブチルヒドロペルオキシド水溶液（４２７μＬ，３．３２ｍｍｏｌ）を加えた。更に２時間後に７０％ｔ－ブチルヒドロペルオキシド水溶液（１７１μＬ，１．３３ｍｍｏｌ）を追加した。更に１時間３０分間攪拌した後に反応混合物を減圧濃縮し、得られた残渣を逆相系のＨＰＬＣで精製した。目的のフラクションを集め、凍結乾燥、およびイオン交換樹脂に通すことにより、白色粉末である目的化合物のＮａ塩を得た（収量：３２８ｍｇ，収率：５０％）。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）：δ７．７５（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．７３（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．５０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），７．１５（ｍ，２Ｈ），６．１４（ｍ，１Ｈ），５．９９（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），５．９６（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），５．３９－５．２８（ｍ，３Ｈ），５．２４－５．１７（ｍ，４Ｈ），４．４６（ｍ，１Ｈ），４．３７－４．１３（ｍ，６Ｈ），２．６４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），２．１５５（ｓ，１．５Ｈ），２．１５１（ｓ，１．５Ｈ），２．１０９（ｓ，１．５Ｈ），２．１０４（ｓ，１．５Ｈ），２．１００（ｍ，３Ｈ），２．０８４（ｓ，１．５Ｈ），２．０７６（ｍ，４．５Ｈ），２．０６（ｓ，１．５Ｈ），２．０５（ｓ，１．５Ｈ），１．７４－１．６７（ｍ，２Ｈ），１．４６－１．３７（ｍ，２Ｈ），０．９４（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）
ＥＳＩ－ＭＳスペクトル（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｅ） Ｃ38Ｈ50Ｎ3Ｏ23Ｐ2：［Ｍ－Ｈ］-，ｃａｌｃｄ：９７８．２３，ｆｏｕｎｄ：９７８．２
【化30】
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）：δ７．７５（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．７３（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．５０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），７．１５（ｍ，２Ｈ），６．１４（ｍ，１Ｈ），５．９９（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），５．９６（ｄ，０．５Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），５．３９－５．２８（ｍ，３Ｈ），５．２４－５．１７（ｍ，４Ｈ），４．４６（ｍ，１Ｈ），４．３７－４．１３（ｍ，６Ｈ），２．６４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），２．１５５（ｓ，１．５Ｈ），２．１５１（ｓ，１．５Ｈ），２．１０９（ｓ，１．５Ｈ），２．１０４（ｓ，１．５Ｈ），２．１００（ｍ，３Ｈ），２．０８４（ｓ，１．５Ｈ），２．０７６（ｍ，４．５Ｈ），２．０６（ｓ，１．５Ｈ），２．０５（ｓ，１．５Ｈ），１．７４－１．６７（ｍ，２Ｈ），１．４６－１．３７（ｍ，２Ｈ），０．９４（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）
ＥＳＩ－ＭＳスペクトル（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｅ） Ｃ38Ｈ50Ｎ3Ｏ23Ｐ2：［Ｍ－Ｈ］-，ｃａｌｃｄ：９７８．２３，ｆｏｕｎｄ：９７８．２
【0066】
試験例１： Ｉｎ ｖｉｔｒｏ解析
公知技術（Ｋａｎａｇａｗａ ｅｔ ａｌ，２０１６）に従って、ＣＤＰ－リビトール合成酵素（ＩＳＰＤ）をノックアウトしたヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ細胞）を作製した。作製したＩＳＰＤ－ＫＯ ＨＥＫ細胞を６ｗｅｌｌプレートに１．０×１０6ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種し、１０％非働化ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ社製）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ＷＡＫＯ社製）を含有した高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＷＡＫＯ社製）で一晩培養して細胞が定着した後、各濃度の被検化合物を添加した。２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１％界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）とプロテアーゼ阻害剤（Ｎａｃａｌａｉ社製）を含むＴＢＳにて細胞を剥離した。４℃で１時間撹拌した後、可溶画分に１０μＬのＷｈｅａｔ Ｇｅｒｍ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＷＧＡ）－ａｇａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を加え、４℃で１６時間撹拌した。０．１％界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）を含むＴＢＳにて洗浄後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒにて溶出した。タンパク質を４～１５％ ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ ＳＤＳ ｇｅｌ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）にて分離し，ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒ社製）に転写した。ブロットを以下の抗体を用いて標識し、ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）－ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅａｇｅｎｔ（「Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ ＰＬＵＳ ｏｒ ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ」ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）にて現像した。また、比較のために、被検化合物を用いない場合と、正常ＨＥＫ細胞を用いた場合でも同様に実験を行った。結果を図１～３に示す。
抗体
マウス抗完全糖鎖修飾型－ＤＧ（「ＩＩＨ６」 Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）
ラット抗－ＤＧコア（「３Ｄ７」Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，２０１５）
マウス抗－ＤＧ（「８Ｄ５」Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ社製）
なお、「ＩＩＨ６」はα－ジストログリカン（ＤＧ）の糖鎖に結合し、「３Ｄ７」はα－ＤＧのコアに結合し、「８Ｄ５」はβ－ＤＧに結合する。
公知技術（Ｋａｎａｇａｗａ ｅｔ ａｌ，２０１６）に従って、ＣＤＰ－リビトール合成酵素（ＩＳＰＤ）をノックアウトしたヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ細胞）を作製した。作製したＩＳＰＤ－ＫＯ ＨＥＫ細胞を６ｗｅｌｌプレートに１．０×１０6ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種し、１０％非働化ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ社製）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ＷＡＫＯ社製）を含有した高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＷＡＫＯ社製）で一晩培養して細胞が定着した後、各濃度の被検化合物を添加した。２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１％界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）とプロテアーゼ阻害剤（Ｎａｃａｌａｉ社製）を含むＴＢＳにて細胞を剥離した。４℃で１時間撹拌した後、可溶画分に１０μＬのＷｈｅａｔ Ｇｅｒｍ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＷＧＡ）－ａｇａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を加え、４℃で１６時間撹拌した。０．１％界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）を含むＴＢＳにて洗浄後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒにて溶出した。タンパク質を４～１５％ ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ ＳＤＳ ｇｅｌ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）にて分離し，ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒ社製）に転写した。ブロットを以下の抗体を用いて標識し、ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）－ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅａｇｅｎｔ（「Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ ＰＬＵＳ ｏｒ ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ」ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）にて現像した。また、比較のために、被検化合物を用いない場合と、正常ＨＥＫ細胞を用いた場合でも同様に実験を行った。結果を図１～３に示す。
抗体
マウス抗完全糖鎖修飾型－ＤＧ（「ＩＩＨ６」 Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）
ラット抗－ＤＧコア（「３Ｄ７」Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，２０１５）
マウス抗－ＤＧ（「８Ｄ５」Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ社製）
なお、「ＩＩＨ６」はα－ジストログリカン（ＤＧ）の糖鎖に結合し、「３Ｄ７」はα－ＤＧのコアに結合し、「８Ｄ５」はβ－ＤＧに結合する。
【0067】
（１）ＣＤＰ－リビトール アセテートの結果
図１に示された結果の通り、ＣＤＰ－リビトール（ＣＤＰ－Ｒｂｏ）は５００μＭで糖鎖の形成が回復したが、ＣＤＰ－リビトール テトラアセテート（ＴｅｔＡ，実施例２）は２００μＭで糖鎖の形成が回復しており、ＣＤＰ－リビトール テトラアセテートによる糖鎖回復効果はＣＤＰ－リビトールよりも強いことが示された。
図１に示された結果の通り、ＣＤＰ－リビトール（ＣＤＰ－Ｒｂｏ）は５００μＭで糖鎖の形成が回復したが、ＣＤＰ－リビトール テトラアセテート（ＴｅｔＡ，実施例２）は２００μＭで糖鎖の形成が回復しており、ＣＤＰ－リビトール テトラアセテートによる糖鎖回復効果はＣＤＰ－リビトールよりも強いことが示された。
【0068】
（２）ＣＤＰ－リビトール ブチレートの結果
図２に示された結果の通り、ＣＤＰ－リビトール テトラアセテート（ＴｅｔＡ，実施例２）は２００μＭで糖鎖の形成が回復したのに対して、ＣＤＰ－リビトール テトラブチレート（ＴｅｔＢ，実施例４）とＣＤＰ－リビトール テトラブチレート，ジアセテート（ＴｅｔＢ／ＤｉＡ，実施例５）は１００μＭで、ＣＤＰ－リビトール ヘキサブチレート（ＨｅｘＢ，実施例６）は５０μで糖鎖の形成が回復しており、ＣＤＰ－リビトール ブチレートはＣＤＰ－リビトール アセテートよりも糖鎖回復効果が強い傾向が認められた。
図２に示された結果の通り、ＣＤＰ－リビトール テトラアセテート（ＴｅｔＡ，実施例２）は２００μＭで糖鎖の形成が回復したのに対して、ＣＤＰ－リビトール テトラブチレート（ＴｅｔＢ，実施例４）とＣＤＰ－リビトール テトラブチレート，ジアセテート（ＴｅｔＢ／ＤｉＡ，実施例５）は１００μＭで、ＣＤＰ－リビトール ヘキサブチレート（ＨｅｘＢ，実施例６）は５０μで糖鎖の形成が回復しており、ＣＤＰ－リビトール ブチレートはＣＤＰ－リビトール アセテートよりも糖鎖回復効果が強い傾向が認められた。
【0069】
（３）ＣＤＰ－リビトール ＰＢの結果
図３に示された結果の通り、シチジン側のリン酸がエステル化されているＣＤＰ－リビトール ヘキサアセテート－ＰＢ１ＣＤＰ－リビトール イソブチレート（ＢＰ１，実施例９）は１０μＭで、リビトール側のリン酸がエステル化されているＣＤＰ－リビトール ヘキサアセテート－ＰＢ２（ＢＰ２，実施例１０）は５０μＭで、糖鎖の形成が回復した。マイナス電荷を有するピロリン酸基がエステル化されることにより、ＣＤＰ－リビトールの細胞内取込量が増加したことが考えられる。
図３に示された結果の通り、シチジン側のリン酸がエステル化されているＣＤＰ－リビトール ヘキサアセテート－ＰＢ１ＣＤＰ－リビトール イソブチレート（ＢＰ１，実施例９）は１０μＭで、リビトール側のリン酸がエステル化されているＣＤＰ－リビトール ヘキサアセテート－ＰＢ２（ＢＰ２，実施例１０）は５０μＭで、糖鎖の形成が回復した。マイナス電荷を有するピロリン酸基がエステル化されることにより、ＣＤＰ－リビトールの細胞内取込量が増加したことが考えられる。
【0070】
試験例２： Ｉｎ ｖｉｖｏ解析 － 筋組織観察
（１）モデルマウスの作製
マウスＩｓｐｄ遺伝子ｅｘｏｎ２の５’側および３’側にｌｏｘＰ配列をそれぞれ挿入したＩｓｐｄlox/loxマウス（Ｌｅｅ，ｅｔ ａｌ．，２０１４）に、筋前駆細胞特異的に発現するＭｙｆ５をプロモーターに持つＣｒｅ発現ノックイン（ＣｒｅＫＩ）マウスを交配した（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ，Ｂ６．１２９Ｓ４－Ｍｙｆ５tm3(cre)Sor／Ｊ）。更にＭｙｆ５－Ｃｒｅを持つＩｓｐｄloxP/+ヘテロマウスをＩｓｐｄlox/loxマウスと交配し、Ｍｙｆ５の発現と共にＣＤＰ－リビトール合成酵素（ＩＳＰＤ）がノックアウトされたＭｙｆ５－Ｉｓｐｄ－ｃＫＯマウスを作成した。以下、［Ｉｓｐｄlox/lox：Ｍｙｆ５－ＣｒｅＫＩ（＋）］をｃＫＯ、［Ｉｓｐｄlox/+：Ｍｙｆ５－ＣｒｅＫＩ（＋）］をＨＥＴ、［Ｉｓｐｄlox/lox：Ｍｙｆ５－ＣｒｅＫＩ（－）］をＷＴと表記する。動物実験は、神戸大学大学院動物実験管理委員会の許可を得て実施した。
なお、ｃＫＯはＷＴに比べて低体重で、ＷＴとＨＥＴに比べて短命であり、ＷＴとＨＥＴに比べて４週齢でも握力が弱く、筋機能が低かった。
また、ｃＫＯはＷＴとＨＥＴに比べて筋重量が低く筋萎縮傾向にあり、且つ筋破壊の指標であるクレアチンキナーゼ（ＣＫ）値が高かった。
更に、ウェスタンブロットによれば、ＷＴとＨＥＴでは完全に糖鎖化されたジストログリカン（ＤＧ）が検出されたが、ｃＫＯでは検出されなかった。また、ＷＴとＨＥＴでもＤＧのコアタンパク質は認められたが、糖鎖修飾されたＤＧのバンドの方が濃く検出された。それに対してｃＫＯでは、糖鎖修飾されていないコアタンパク質のバンドのみが認められた。かかる結果より、ｃＫＯの筋組織においてはＤＧの糖鎖が脱落していることが示された。
（１）モデルマウスの作製
マウスＩｓｐｄ遺伝子ｅｘｏｎ２の５’側および３’側にｌｏｘＰ配列をそれぞれ挿入したＩｓｐｄlox/loxマウス（Ｌｅｅ，ｅｔ ａｌ．，２０１４）に、筋前駆細胞特異的に発現するＭｙｆ５をプロモーターに持つＣｒｅ発現ノックイン（ＣｒｅＫＩ）マウスを交配した（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ，Ｂ６．１２９Ｓ４－Ｍｙｆ５tm3(cre)Sor／Ｊ）。更にＭｙｆ５－Ｃｒｅを持つＩｓｐｄloxP/+ヘテロマウスをＩｓｐｄlox/loxマウスと交配し、Ｍｙｆ５の発現と共にＣＤＰ－リビトール合成酵素（ＩＳＰＤ）がノックアウトされたＭｙｆ５－Ｉｓｐｄ－ｃＫＯマウスを作成した。以下、［Ｉｓｐｄlox/lox：Ｍｙｆ５－ＣｒｅＫＩ（＋）］をｃＫＯ、［Ｉｓｐｄlox/+：Ｍｙｆ５－ＣｒｅＫＩ（＋）］をＨＥＴ、［Ｉｓｐｄlox/lox：Ｍｙｆ５－ＣｒｅＫＩ（－）］をＷＴと表記する。動物実験は、神戸大学大学院動物実験管理委員会の許可を得て実施した。
なお、ｃＫＯはＷＴに比べて低体重で、ＷＴとＨＥＴに比べて短命であり、ＷＴとＨＥＴに比べて４週齢でも握力が弱く、筋機能が低かった。
また、ｃＫＯはＷＴとＨＥＴに比べて筋重量が低く筋萎縮傾向にあり、且つ筋破壊の指標であるクレアチンキナーゼ（ＣＫ）値が高かった。
更に、ウェスタンブロットによれば、ＷＴとＨＥＴでは完全に糖鎖化されたジストログリカン（ＤＧ）が検出されたが、ｃＫＯでは検出されなかった。また、ＷＴとＨＥＴでもＤＧのコアタンパク質は認められたが、糖鎖修飾されたＤＧのバンドの方が濃く検出された。それに対してｃＫＯでは、糖鎖修飾されていないコアタンパク質のバンドのみが認められた。かかる結果より、ｃＫＯの筋組織においてはＤＧの糖鎖が脱落していることが示された。
【0071】
（２）筋組織試料の作製
マウスから摘出した筋組織をＯＴＣコンパウンド（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｔｅｋ社製）に包埋し、液体窒素で冷却したイソペンタン（Ｎａｃａｌａｉ社製）中で凍結処理した。クリオスタットを用いて７μｍの凍結切片を作製し、組織解析と蛍光免疫染色に用いた。
マウスから摘出した筋組織をＯＴＣコンパウンド（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｔｅｋ社製）に包埋し、液体窒素で冷却したイソペンタン（Ｎａｃａｌａｉ社製）中で凍結処理した。クリオスタットを用いて７μｍの凍結切片を作製し、組織解析と蛍光免疫染色に用いた。
【0072】
（３）Ｈ＆Ｅ染色と免疫染色による病理解析
Ｈ＆Ｅ染色では，ヘマトキシリンで２分間、エオジンで１分間の染色を行った後、エタノールとキシレンで脱水した。
ＩＩＨ６による免疫染色では、切片を冷エタノール：酢酸＝１：１の混合溶媒で１分固定した後、５％ヤギ血清を含むＭＯＭブロッキング試薬（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて室温で１時間ブロッキングした。ＭＯＭ希釈液に希釈した１次抗体を用いて、４℃で一晩反応させた。
Ｈ＆Ｅ染色については凍結切片作製用包埋剤として「Ｐｅｒｍｏｕｎｔ」Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製で、免疫染色については「ＴＩＳＳＵ ＭＯＵＮＴ」Ｓｈｉｒａｉｍａｔｓｕ Ｋｉｋａｉ社製で封入した。切片は蛍光顕微鏡（「Ｌｅｉｃａ ＤＭＲ」Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で観察した。結果を図４に示す。
図４に示される結果の通り、ｃＫＯの組織では、ＷＴとＨＥＴに比べて、筋線維の大小不同、中心核の増加、および線維化の増加など筋ジストロフィーに特徴的な所見が認められた。また、α－ジストログリカン（ＤＧ）の糖鎖に結合するＩＩＨ６を用いた免疫染色では蛍光信号が低下しており、ＤＧの糖鎖が脱落していることが示された。
Ｈ＆Ｅ染色では，ヘマトキシリンで２分間、エオジンで１分間の染色を行った後、エタノールとキシレンで脱水した。
ＩＩＨ６による免疫染色では、切片を冷エタノール：酢酸＝１：１の混合溶媒で１分固定した後、５％ヤギ血清を含むＭＯＭブロッキング試薬（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて室温で１時間ブロッキングした。ＭＯＭ希釈液に希釈した１次抗体を用いて、４℃で一晩反応させた。
Ｈ＆Ｅ染色については凍結切片作製用包埋剤として「Ｐｅｒｍｏｕｎｔ」Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製で、免疫染色については「ＴＩＳＳＵ ＭＯＵＮＴ」Ｓｈｉｒａｉｍａｔｓｕ Ｋｉｋａｉ社製で封入した。切片は蛍光顕微鏡（「Ｌｅｉｃａ ＤＭＲ」Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で観察した。結果を図４に示す。
図４に示される結果の通り、ｃＫＯの組織では、ＷＴとＨＥＴに比べて、筋線維の大小不同、中心核の増加、および線維化の増加など筋ジストロフィーに特徴的な所見が認められた。また、α－ジストログリカン（ＤＧ）の糖鎖に結合するＩＩＨ６を用いた免疫染色では蛍光信号が低下しており、ＤＧの糖鎖が脱落していることが示された。
【0073】
また、以下の抗体を用いて、免疫染色を行った。
ラット抗ｌａｍｉｎｉｎ（「４Ｈ８－２」Ａｌｅｘｉｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）
ウサギ抗ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）
ラット抗Ｆ４／８０（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）
ラミニン、Ｆ４／８０およびｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉによる免疫染色では、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳを用いて１時間室温で切片をブロッキングした後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで希釈した１次抗体を用いて４℃で一晩反応させた。翌日、切片をＰＢＳで洗浄し、色素（「Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８」または「Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）を用いて２次抗体と室温で３０分間反応させた後、ＰＢＳにて洗浄した。
ラミニン染色の結果、ｃＫＯの筋線維サイズは、ＷＴとＨＥＴに比べて大きなものや小さなものが相対的に多く、筋線維サイズが均一でなくばらつきが大きいことが示された。また、ｃＫＯの筋組織では、ＷＴに比べて中心核を持つ筋線維の割合が顕著に増加していた。更に、マクロファージマーカーとして汎用されている抗体Ｆ４／８０による染色の結果、ｃＫＯの筋組織においてはＷＴに比べてマクロファージの浸潤が強く、コラーゲン染色の結果、筋組織の線維化が進行していることが示された。これらはいずれも筋ジストロフィーに典型的な所見であり、筋特異的ＩＳＰＤ欠損マウスであるｃＫＯは、福山型筋ジストロフィー類縁疾患のモデルになるといえる。
ラット抗ｌａｍｉｎｉｎ（「４Ｈ８－２」Ａｌｅｘｉｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）
ウサギ抗ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）
ラット抗Ｆ４／８０（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）
ラミニン、Ｆ４／８０およびｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉによる免疫染色では、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳを用いて１時間室温で切片をブロッキングした後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで希釈した１次抗体を用いて４℃で一晩反応させた。翌日、切片をＰＢＳで洗浄し、色素（「Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８」または「Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）を用いて２次抗体と室温で３０分間反応させた後、ＰＢＳにて洗浄した。
ラミニン染色の結果、ｃＫＯの筋線維サイズは、ＷＴとＨＥＴに比べて大きなものや小さなものが相対的に多く、筋線維サイズが均一でなくばらつきが大きいことが示された。また、ｃＫＯの筋組織では、ＷＴに比べて中心核を持つ筋線維の割合が顕著に増加していた。更に、マクロファージマーカーとして汎用されている抗体Ｆ４／８０による染色の結果、ｃＫＯの筋組織においてはＷＴに比べてマクロファージの浸潤が強く、コラーゲン染色の結果、筋組織の線維化が進行していることが示された。これらはいずれも筋ジストロフィーに典型的な所見であり、筋特異的ＩＳＰＤ欠損マウスであるｃＫＯは、福山型筋ジストロフィー類縁疾患のモデルになるといえる。
【0074】
試験例３： Ｉｎ ｖｉｖｏ解析 － ウェスタンブロット解析
７週齢の前記ｃＫＯモデルマウス４匹を麻酔した後、ＣＤＰ－リビトール（ＣＤＰ－Ｒｂｏ）またはＣＤＰ－リビトール テトラアセテート（ＴｅｔＡ，実施例２）を生理食塩水に溶解した０．１Ｍ水溶液、または生理食塩水を、前脛骨筋に４０μＬ、腓腹筋に６０μＬ注射し、また、３日後、同様に麻酔してから各水溶液を注射した。２回目の注射から３日目に筋組織を摘出した。
プロテアーゼ阻害剤を添加したＴＢＳ中、ポリトロンホモジナイザーを使って筋組織を破砕した後、終濃度１％の界面活性剤（ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）を添加し、４℃で１時間転倒混和した。可溶画分に１０～３０μＬのＷｈｅａｔ Ｇｅｒｍ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＷＧＡ）－ａｇａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を加え、４℃で１６時間撹拌した。０．１％界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）を含むＴＢＳにて洗浄後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒにて溶出した。得られた試料を試験例１と同様にウェスタンブロットに付した。結果を図５に示す。
図５に示された結果の通り、ＣＤＰ－リビトールを投与した場合には、生理食塩水を投与した場合に比べて、α－ジストログリカン（ＤＧ）の糖鎖形成が僅かに認められた。
それに対して、ＣＤＰ－リビトール テトラアセテート（ＴｅｔＡ）を投与した場合にはＤＧの糖鎖形成が明確に認められ、高い糖鎖回復活性が示された。また、ＣＤＰ－リビトール テトラアセテート（ＴｅｔＡ）を投与されたモデルマウスは、８週齢の時点で同量の生理食塩水を投与されたモデルマウスと変わるところがなかったことから、ＣＤＰ－リビトール テトラアセテート（ＴｅｔＡ）の毒性は低いと考えられる。
７週齢の前記ｃＫＯモデルマウス４匹を麻酔した後、ＣＤＰ－リビトール（ＣＤＰ－Ｒｂｏ）またはＣＤＰ－リビトール テトラアセテート（ＴｅｔＡ，実施例２）を生理食塩水に溶解した０．１Ｍ水溶液、または生理食塩水を、前脛骨筋に４０μＬ、腓腹筋に６０μＬ注射し、また、３日後、同様に麻酔してから各水溶液を注射した。２回目の注射から３日目に筋組織を摘出した。
プロテアーゼ阻害剤を添加したＴＢＳ中、ポリトロンホモジナイザーを使って筋組織を破砕した後、終濃度１％の界面活性剤（ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）を添加し、４℃で１時間転倒混和した。可溶画分に１０～３０μＬのＷｈｅａｔ Ｇｅｒｍ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＷＧＡ）－ａｇａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を加え、４℃で１６時間撹拌した。０．１％界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）を含むＴＢＳにて洗浄後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒにて溶出した。得られた試料を試験例１と同様にウェスタンブロットに付した。結果を図５に示す。
図５に示された結果の通り、ＣＤＰ－リビトールを投与した場合には、生理食塩水を投与した場合に比べて、α－ジストログリカン（ＤＧ）の糖鎖形成が僅かに認められた。
それに対して、ＣＤＰ－リビトール テトラアセテート（ＴｅｔＡ）を投与した場合にはＤＧの糖鎖形成が明確に認められ、高い糖鎖回復活性が示された。また、ＣＤＰ－リビトール テトラアセテート（ＴｅｔＡ）を投与されたモデルマウスは、８週齢の時点で同量の生理食塩水を投与されたモデルマウスと変わるところがなかったことから、ＣＤＰ－リビトール テトラアセテート（ＴｅｔＡ）の毒性は低いと考えられる。
【0075】
試験例４： Ｉｎ ｖｉｖｏ解析 － 免疫染色解析
１週あたり２回の投与を３週連続して続けた以外は試験例３と同様にし、最終投与の３日後に組織を摘出し、試験例２と同様の条件でラミニン、Ｆ４／８０およびｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉによる免疫染色による病理解析を行った。ラミニンによる免疫染色結果を図６に、Ｆ４／８０による免疫染色結果を図７（１）に、ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉによる免疫染色結果を図７（２）に示す。なお、図６において「＊」は、平均値をＴｕｒｋｅｙの多重比較検定して一元配置分散分析した結果、ｐ＜０．０５で有意差がある場合を示し、「＊＊＊」はｐ＜０．００１で有意差がある場合を示す。図７において、「＊」は、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定の後のＤｕｎｎ’ｓ多重比較でｐ＜０．０５で有意差がある場合を示す。
図６に示される結果の通り、対照例（生理食塩水）に比べて、ＣＤＰ－リビトール（ＣＤＰ－Ｒｂｏ）を投与した場合でも筋線維径が僅かに増加する傾向があったが、ＣＤＰ－リビトール テトラアセテート（ＴｅｔＡ）を投与した場合、対照例に比べてもＣＤＰ－リビトールを投与した場合に比べても、有意に筋線維径が増加した。筋線維径分布（図６（２））を見ると、ＣＤＰ－リビトール テトラアセテート（ＴｅｔＡ）を投与した場合には、小径の筋線維が減少し、大径の筋線維が増加したことが分かる。
図７（１）に示される結果の通り、ＣＤＰ－リビトール テトラアセテート（ＴｅｔＡ）を投与した場合には、対照例に比べて、筋組織へのマクロファージの浸潤が有意に減少していた。
また、図７（２）に示される結果の通り、ＣＤＰ－リビトール テトラアセテート（ＴｅｔＡ）を投与した場合には、対照例に比べてもＣＤＰ－リビトールを投与した場合に比べても、筋線維化が有意に減少したことが分かる。
以上の結果は、ＴｅｔＡが福山型筋ジストロフィーおよびその類縁疾患の治療に有効であることを示している。
１週あたり２回の投与を３週連続して続けた以外は試験例３と同様にし、最終投与の３日後に組織を摘出し、試験例２と同様の条件でラミニン、Ｆ４／８０およびｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉによる免疫染色による病理解析を行った。ラミニンによる免疫染色結果を図６に、Ｆ４／８０による免疫染色結果を図７（１）に、ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉによる免疫染色結果を図７（２）に示す。なお、図６において「＊」は、平均値をＴｕｒｋｅｙの多重比較検定して一元配置分散分析した結果、ｐ＜０．０５で有意差がある場合を示し、「＊＊＊」はｐ＜０．００１で有意差がある場合を示す。図７において、「＊」は、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定の後のＤｕｎｎ’ｓ多重比較でｐ＜０．０５で有意差がある場合を示す。
図６に示される結果の通り、対照例（生理食塩水）に比べて、ＣＤＰ－リビトール（ＣＤＰ－Ｒｂｏ）を投与した場合でも筋線維径が僅かに増加する傾向があったが、ＣＤＰ－リビトール テトラアセテート（ＴｅｔＡ）を投与した場合、対照例に比べてもＣＤＰ－リビトールを投与した場合に比べても、有意に筋線維径が増加した。筋線維径分布（図６（２））を見ると、ＣＤＰ－リビトール テトラアセテート（ＴｅｔＡ）を投与した場合には、小径の筋線維が減少し、大径の筋線維が増加したことが分かる。
図７（１）に示される結果の通り、ＣＤＰ－リビトール テトラアセテート（ＴｅｔＡ）を投与した場合には、対照例に比べて、筋組織へのマクロファージの浸潤が有意に減少していた。
また、図７（２）に示される結果の通り、ＣＤＰ－リビトール テトラアセテート（ＴｅｔＡ）を投与した場合には、対照例に比べてもＣＤＰ－リビトールを投与した場合に比べても、筋線維化が有意に減少したことが分かる。
以上の結果は、ＴｅｔＡが福山型筋ジストロフィーおよびその類縁疾患の治療に有効であることを示している。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
