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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-06-26
(45)【発行日】2024-07-04
(54)【発明の名称】組換え酸性α－グルコシダーゼを含む製剤
(51)【国際特許分類】
A61K 38/47 20060101AFI20240627BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20240627BHJP
A61K 9/19 20060101ALI20240627BHJP
A61K 47/12 20060101ALI20240627BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20240627BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20240627BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240627BHJP
C12N 9/26 20060101ALN20240627BHJP
C12N 15/56 20060101ALN20240627BHJP
【ＦＩ】
A61K38/47
A61K9/08
A61K9/19
A61K47/12
A61K47/26
A61P3/00
A61P43/00 111
C12N9/26 Z ZNA
C12N15/56
【請求項の数】
22
(21)【出願番号】P 2018551370
(86)(22)【出願日】2017-03-30
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2019-04-11
(86)【国際出願番号】 US2017024982
(87)【国際公開番号】W WO2017173060
(87)【国際公開日】2017-10-05
【審査請求日】2020-03-30
【審判番号】
【審判請求日】2022-04-07
(31)【優先権主張番号】62/315,436
(32)【優先日】2016-03-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/457,588
(32)【優先日】2017-02-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】15/473,999
(32)【優先日】2017-03-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】507170099
【氏名又は名称】アミカス セラピューティックス インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】チャー， ヒング
(72)【発明者】
【氏名】テスラー， セルゲイ
(72)【発明者】
【氏名】サンダーランド， ウェンディ
(72)【発明者】
【氏名】ディローン， エンリケ
(72)【発明者】
【氏名】ドー， フン
(72)【発明者】
【氏名】ゴッシャル， ラッセル
【合議体】
【審判長】光本 美奈子
【審判官】山村 祥子
【審判官】井上 典之
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１２／０１４８５５６（ＵＳ，Ａ１）
【文献】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ２０１６年２月１１日 Ｖｏｌ．１１７，Ｎｏ．２ Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．１６０，Ｓ６６－Ｓ６７
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
A61K
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０
Ｃａｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
医薬製剤であって、（ａ）組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）分子の集団であって、ｒｈＧＡＡ分子におけるＮ－グリカンの４０％－６０％が複合型Ｎ－グリカンであり、
ｒｈＧＡＡ分子は、ｒｈＧＡＡ１モルあたり、少なくとも３モルのマンノース－６－リン酸（Ｍ６Ｐ）残基、及び２．０～８．０モルのシアル酸残基を含む、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）分子の集団；
（ｂ）クエン酸塩緩衝剤；および
（ｃ）マンニトール、ポリソルベート８０及びそれらの組合せからなる群より選択される、少なくとも１つの賦形剤
を含み、前記製剤のｐＨが５．０～７．０である、医薬製剤。
【請求項2】
医薬製剤であって、（ａ）組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）分子の集団であって、ｒｈＧＡＡ分子におけるＮ－グリカンの４０％－６０％が複合型Ｎ－グリカンであり、
ｒｈＧＡＡ分子は、ｒｈＧＡＡ１モルあたり、少なくとも３モルのマンノース－６－リン酸（Ｍ６Ｐ）残基を含む、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）分子の集団；
（ｂ）クエン酸塩緩衝剤；および
（ｃ）マンニトール、ポリソルベート８０及びそれらの組合せからなる群より選択される、少なくとも１つの賦形剤
を含み、前記製剤のｐＨが５．０～７．０であり、
ｒｈＧＡＡ分子が、配列番号２のＮ８４、Ｎ１７７、Ｎ３３４、Ｎ４１４、Ｎ５９６、Ｎ８２６およびＮ８６９にそれぞれ対応するアミノ酸に、第１の、第２の、第３の、第４の、第５の、第６の、第７の、潜在的なＮ－グリコシル化部位を含み、ｒｈＧＡＡ分子の少なくとも５０％が、第１の潜在的なＮ－グリコシル化部位でビス－マンノース－６－リン酸（ビス－Ｍ６Ｐ）を有するグリカンを含む、
医薬製剤。
【請求項3】
ｒｈＧＡＡ分子が、配列番号２のＮ８４、Ｎ１７７、Ｎ３３４、Ｎ４１４、Ｎ５９６、Ｎ８２６およびＮ８６９にそれぞれ対応するアミノ酸に、第１の、第２の、第３の、第４の、第５の、第６の、第７の、潜在的なＮ－グリコシル化部位を含み、ｒｈＧＡＡ分子の少なくとも５０％が、第１の潜在的なＮ－グリコシル化部位でビス－マンノース－６－リン酸（ビス－Ｍ６Ｐ）を有するグリカンを含む、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項4】
前記ｒｈＧＡＡが、５ｍｇ／ｍＬ～５０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し、１５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在してもよい、請求項１から３のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項5】
前記ｒｈＧＡＡが、１２ｍｇ／ｍＬ～１８ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項１から３のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項6】
前記製剤のｐＨが５．５～７．０であり、６．０であってもよい、請求項１～５のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項7】
前記製剤のｐＨが５．５～６．０である、請求項１から５のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項8】
クエン酸塩緩衝剤は、カリウム、ナトリウムまたはアンモニウム塩を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項9】
マンニトールは、１０ｍｇ／ｍＬから５０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し、且つ／又は、ポリソルベート８０は、０．２ｍｇ／ｍＬから０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項１～８のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項10】
マンニトールは、２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し、且つポリソルベート８０は、０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項９に記載の医薬製剤。
【請求項11】
（ｄ）アルカリ化剤；および／または（ｅ）酸性化剤、
をさらに含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の医薬製剤であって、
前記アルカリ化剤および酸性化剤は、前記医薬製剤のｐＨを５．０～６．０に維持する量で存在する、医薬製剤。
【請求項12】
前記ｒｈＧＡＡ分子が、ｒｈＧＡＡ１モルあたり少なくとも４モルのシアル酸残基を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項13】
前記ｒｈＧＡＡ分子が、ｒｈＧＡＡ１モルあたり２．０～８．０モル、３．０～８．０モル、又は４．０～８．０モルのシアル酸残基を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項14】
前記ｒｈＧＡＡ分子が、ｒｈＧＡＡ１モルあたり３．０～５．０モルのＭ６Ｐ残基を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項15】
（ａ）ｒｈＧＡＡ分子の集団；（ｂ）クエン酸ナトリウム；
（ｃ）クエン酸一水和物；
（ｄ）マンニトール；
（ｅ）ポリソルベート８０；
（ｆ）水；
（ｇ）任意選択により、酸性化剤；および
（ｈ）任意選択により、アルカリ化剤、
から本質的になる、請求項１～１４のいずれか一項に記載の医薬製剤であって、
前記製剤のｐＨが５．０～６．０であり、任意選択で、ｒｈＧＡＡ分子の集団は、１５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し、クエン酸ナトリウム緩衝剤は、２５ｍＭの濃度で存在し、マンニトールは、２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し、ポリソルベート８０は、０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、医薬製剤。
【請求項16】
請求項１～１５のいずれか一項に記載の医薬製剤であって、無色、透明、および可視粒子なしである、医薬製剤。
【請求項17】
請求項１～１５のいずれか一項に記載の医薬製剤を含む医薬組成物であって、医薬製剤は、凍結乾燥されている、医薬組成物。
【請求項18】
患者においてポンペ病を処置するための、請求項１～１６のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項19】
前記医薬製剤が患者に投与される前に希釈される、請求項１８に記載の医薬製剤。
【請求項20】
患者においてポンペ病を処置するための、請求項１７に記載の医薬組成物であって、患者に投与する前に前記医薬組成物が再構成される、医薬組成物。
【請求項21】
請求項１～１６のいずれか一項に記載の医薬製剤を調製する方法であって、前記方法が、（ａ）少なくとも１つの緩衝剤、少なくとも１つの賦形剤、およびｒｈＧＡＡ分子の集団を含む溶液を調製すること；
（ｂ）任意選択により、前記溶液のｐＨを調整すること；
（ｃ）任意選択により、前記溶液にさらなる水を加えること；
（ｄ）任意選択により、前記溶液をろ過すること；および
（ｅ）任意選択により、前記溶液を貯蔵すること
を含む、方法。
【請求項22】
請求項１～１６のいずれか一項に記載の医薬製剤を凍結乾燥することを含む、医薬組成物を調製する方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明の原理および実施形態は、一般に、組換え酸性α－グルコシダーゼ、および特に液体製剤を含む製剤に関する。
【背景技術】
【0002】
ポンペ病は、酸マルターゼ欠乏症またはＩＩ型糖源蓄積症としても知られ、いくつかのリソソーム蓄積症の１つである。リソソーム蓄積症は、リソソームと呼ばれる細胞内区画内の細胞スフィンゴ糖脂質、グリコーゲン、またはムコ多糖類の蓄積を特徴とする常染色体劣性遺伝疾患群である。これらの疾患を有する個体は、これらの物質の１つ以上の加水分解を触媒するのに欠陥がある酵素をコードする変異遺伝子を保有し、それらの物質はリソソームに蓄積する。リソソーム障害の他の例には、ゴーシェ病、ＧＭ１－ガングリオシドーシス、フコシドーシス、ムコ多糖症、ハーラー症候群、ニーマン－ピックＡおよびＢ病、およびファブリー病が含まれる。ポンペ病はまた、神経筋疾患または代謝性ミオパチーに分類される。
【0003】
ポンペ病は、約４０，０００出生で１人発生すると推定されており、酵素リソソームα－グルコシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．２０）（一般に酸性α－グルコシダーゼとしても知られる）をコードするＧＡＡ遺伝子の突然変異によって引き起こされる。酸性α－グルコシダーゼは、リソソーム内のグルコースへのその加水分解を触媒することにより、動物におけるグルコースの主要な貯蔵形態である分枝多糖、グリコーゲンの代謝に関与する。ポンペ病に罹患している個体は、不活性であるか、または活性が低下した変異体である欠損酸性α－グルコシダーゼを産生するため、グリコーゲン分解はゆっくりと起こるか、または全く起こらず、グリコーゲンは様々な組織、特に線条筋において、リソソームに蓄積し、進行性の筋力低下および呼吸器不全を含む広範囲の臨床症状を生じる。心臓および骨格筋などの組織は特に影響を受ける。
【0004】
ポンペ病は、酵素欠乏症の程度、発症の重症度および年齢によって大きく異なり、その多くが様々な重症度の疾患症状を引き起こす、ＧＡＡ遺伝子の５００以上の異なる突然変異が同定されている。この疾患は、早期発症または乳児期発症および後期発症という広範なタイプに分類されている。より早期の発症およびより低い酵素活性は、一般に、より重度の臨床経過に関連する。小児ポンペ病は最も重篤であり、完全またはほぼ完全な酸性α－グルコシダーゼ欠乏に起因し、筋緊張の重度な欠如、衰弱、肝臓および心臓の肥大、および心筋症を含む症状を呈する。舌が肥大して突出することがあり、嚥下が困難になることがある。ほとんどの患児は、２歳までに呼吸器または心臓の合併症で死亡する。後期発症のポンペ病は、１２ヵ月以上のいずれの年齢でも存在し得、心臓病の関与がなく、短期予後がより良好であることを特徴とする。症状は進行性の骨格筋機能不全に関連し、体幹、近位下肢および隔膜における一般的な筋力低下および呼吸筋の消耗を伴う。成人患者では、重大な症状または運動制限がない場合もある。予後は、一般に、呼吸筋の関与の程度に依存する。ポンペ病に罹患した対象の大部分は、徐々に車椅子の使用および補助換気を必要とする身体的衰弱が進行し、多くの場合に呼吸不全のために生じる早期死亡を伴う。
【0005】
ポンペ病の最近の処置の選択肢には、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）による酵素補充療法（ＥＲＴ）が含まれる。従来のｒｈＧＡＡ製品は、Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｉｎｃ．社のアルグルコシダーゼアルファ、マイオザイム（登録商標）またはルミザイム（登録商標）の名称で知られている。ＥＲＴは、患者の生涯にわたって必要とされる慢性処置であり、静脈内注入によって置換酵素を投与することを含む。次いで、補充酵素は循環中で輸送され、細胞内のリソソームに入り、そこで蓄積されたグリコーゲンを分解するよう作用し、内因性欠損突然変異酵素の欠損した活性を補い、そうして病気の症状を緩和する。
【0006】
ｒｈＧＡＡなどの代替酵素を調製し、貯蔵し、輸送し、患者に投与する方法は困難である。ＥＲＴに使用される酵素は、一般に比較的複雑で繊細であり、このため、付随する緩衝剤、賦形剤などの選択が重要なものとなっている。酵素が適切に保存されないと、多くの量を要し得、これにより処置が効果で非効率的なものとなる。
【0007】
いくつかの従来のｒｈＧＡＡ製品は、防腐剤を含まない単回使用バイアルに入った凍結乾燥（フリーズドライ）した粉末として患者に提供される。次いで、ｒｈＧＡＡは、バイアル中で再構成し、次いで希釈し、静脈内投与しなければならない。凍結乾燥は、製造後に酵素を患者に投与する準備が整うまで保存するのに役立つが、このプロセス自体がそれだけで酵素を損傷する可能性がある。したがって、ｒｈＧＡＡ製剤中の成分の選択には、タンパク質濃度および活性を保存するのに役立つよう、細心の注意が払われなければならない。
【0008】
さらに、組換え酵素は、野生型酵素と構造的に異なることが多い。組換え酵素のアミノ酸がその野生型の対応物と同一であったとしても、炭水化物の化学的性質に違いがある可能性がある。したがって、新しい組換え酵素が発見されると、酵素のための製剤は、新たに発見された酵素の化学的性質に特異的に開発されなければならない。
【0009】
したがって、酵素活性および濃度を保存する、ｒｈＧＡＡなどの組換え酵素を貯蔵および輸送するための製剤に対する継続的な必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明の１つの態様は、医薬製剤に関する。実施形態１において、製剤は、
（ａ）組換え酸性α－グルコシダーゼが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現し、アルグルコシダーゼアルファの１つまたは２つのマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位の含有量と比較して、増加した含有量の１つまたは２つのマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位を含む、組換え酸性α－グルコシダーゼ；
（ｂ）クエン酸塩、リン酸塩およびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの緩衝剤；および
（ｃ）マンニトール、ポリソルベート８０、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの賦形剤
を含み、製剤のｐＨは約５．０～約７．０である。
（ａ）組換え酸性α－グルコシダーゼが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現し、アルグルコシダーゼアルファの１つまたは２つのマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位の含有量と比較して、増加した含有量の１つまたは２つのマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位を含む、組換え酸性α－グルコシダーゼ；
（ｂ）クエン酸塩、リン酸塩およびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの緩衝剤；および
（ｃ）マンニトール、ポリソルベート８０、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの賦形剤
を含み、製剤のｐＨは約５．０～約７．０である。
【0011】
実施形態２は、実施形態１に記載の医薬製剤への改変を含み、組換え酸性α－グルコシダーゼは、約５ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。
【0012】
実施形態３は、実施形態１または２に記載の医薬製剤への改変を含み、組換え酸性α－グルコシダーゼは、約１５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。
【0013】
実施形態４は、実施形態１～３のいずれかに記載の医薬製剤への改変を含み、製剤のｐＨは約５．５～約７．０である。
【0014】
実施形態５は、実施形態１～４のいずれかに記載の医薬製剤への改変を含み、製剤のｐＨは約６．０である。
【0015】
実施形態６は、実施形態１～５のいずれかに記載の医薬製剤への改変を含み、少なくとも１つの緩衝剤はクエン酸塩を含む。
【0016】
実施形態７は、実施形態１～６のいずれかに記載の医薬製剤への改変を含み、少なくとも１つの緩衝剤はカリウム、ナトリウムまたはアンモニウム塩を含む。
【0017】
実施形態８は、実施形態１～７のいずれかに記載の医薬製剤への改変を含み、少なくとも１つの緩衝剤はクエン酸ナトリウムを含む。
【0018】
実施形態９は、実施形態１～８のいずれかに記載の医薬製剤への改変を含み、少なくとも１つの緩衝剤は、約１０ｍＭ～約１００ｍＭの濃度で存在する。
【0019】
実施形態１０は、実施形態１～９のいずれかに記載の医薬製剤への改変を含み、少なくとも１つの緩衝剤は、約２５ｍＭの濃度で存在する。
【0020】
実施形態１１は、実施形態１～１０のいずれかに記載の医薬製剤への改変を含み、トレハロース、スクロース、グリシンまたはそれらの組み合わせは排除される。
【0021】
実施形態１２は、実施形態１～１１のいずれかに記載の医薬製剤への改変を含み、少なくとも１つの賦形剤は、約１０ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在するマンニトールである。
【0022】
実施形態１３は、実施形態１～１２のいずれかに記載の医薬製剤への改変を含み、少なくとも１つの賦形剤は、約０．２ｍｇ／ｍＬ～約０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在するポリソルベート８０である。
【0023】
実施形態１４は、実施形態１～１３のいずれかに記載の医薬製剤への改変を含み、マンニトールは約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し、ポリソルベート８０は約０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。
【0024】
実施形態１５は、実施形態１～１４のいずれかに記載の医薬製剤への改変を含み、さらに、（ｄ）水、を含む。
【0025】
実施形態１６は、実施形態１～１５のいずれかに記載の医薬製剤への改変を含み、さらに、（ｄ）アルカリ化剤；および／または（ｅ）酸性化剤を含み、アルカリ化剤および酸性化剤は、医薬製剤のｐＨを約５．０～約６．０に維持する量で存在する。
【0026】
実施形態１７は、実施形態１～１６のいずれかに記載の医薬製剤への改変を含み、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの少なくとも３０％は、１つまたは２つのマンノース－６－リン酸残基を有する１つ以上のＮ－グリカン単位を含む。
【0027】
実施形態１８は、実施形態１～１７のいずれかに記載の医薬製剤への改変を含み、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、１つまたは２つのマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位を、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ１モルあたり平均で０．５～７．０モル含む。
【0028】
実施形態１９は、実施形態１～１８のいずれかに記載の医薬製剤への改変を含み、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、平均で、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ１モルあたり少なくとも３モルのマンノース－６－リン酸残基、および組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ１モルあたり少なくとも４モルのシアル酸残基を含む。
【0029】
実施形態２０は、実施形態１～１９のいずれかに記載の医薬製剤への改変を含み、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、７つの潜在的なＮ－グルコシル化部位を含み、前記組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの少なくとも５０％は、第１の部位に２つのマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位を含有し、前記組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの少なくとも３０％は、第２の部位に１つのマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位を含有し、前記組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの少なくとも３０％は、第４の部位に２つのマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位を含有し、および前記組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの少なくとも２０％は、第４の部位に１つのマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位を含有する。
【0030】
実施形態２１は、実施形態１～２０のいずれかに記載の医薬製剤への改変を含み、医薬製剤は、
（ａ）組換え酸性α－グルコシダーゼ；
（ｂ１）クエン酸ナトリウム；
（ｂ２）クエン酸一水和物；
（ｃ１）マンニトール；
（ｃ２）ポリソルベート８０；
（ｄ）水；
（ｅ）任意選択により、酸性化剤；および
（ｆ）任意選択により、アルカリ化剤、
から本質的になり、製剤のｐＨは約５．０～約６．０である。
（ａ）組換え酸性α－グルコシダーゼ；
（ｂ１）クエン酸ナトリウム；
（ｂ２）クエン酸一水和物；
（ｃ１）マンニトール；
（ｃ２）ポリソルベート８０；
（ｄ）水；
（ｅ）任意選択により、酸性化剤；および
（ｆ）任意選択により、アルカリ化剤、
から本質的になり、製剤のｐＨは約５．０～約６．０である。
【0031】
実施形態２２は、実施形態１～２１のいずれかに記載の医薬製剤への改変を含み、医薬製剤は、
（ａ）約１５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、前記組換え酸性α－グルコシダーゼ；
（ｂ）約２５ｍＭの濃度で存在する、クエン酸ナトリウム緩衝剤；
（ｃ１）約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、マンニトール；
（ｃ２）約０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、ポリソルベート８０；および
（ｄ）水；
（ｅ）任意選択により、酸性化剤；および
（ｆ）任意選択により、アルカリ化剤、
から本質的になり、製剤のｐＨは約５．０～約６．０である。
（ａ）約１５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、前記組換え酸性α－グルコシダーゼ；
（ｂ）約２５ｍＭの濃度で存在する、クエン酸ナトリウム緩衝剤；
（ｃ１）約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、マンニトール；
（ｃ２）約０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、ポリソルベート８０；および
（ｄ）水；
（ｅ）任意選択により、酸性化剤；および
（ｆ）任意選択により、アルカリ化剤、
から本質的になり、製剤のｐＨは約５．０～約６．０である。
【0032】
本発明の別の態様は、凍結乾燥した医薬組成物に関する。したがって、実施形態２３は、凍結乾燥後の実施形態１～２２のいずれかに記載の製剤を含む、医薬組成物に関する。実施形態２４は、
（ａ）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現し、アルグルコシダーゼアルファの１つまたは２つのマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位の含有量と比較して、増加した含有量の１つまたは２つのマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位を含む、組換え酸性α－グルコシダーゼ；
（ｂ）クエン酸塩、リン酸塩およびそれらの組み合わせからなる群から選択される緩衝剤；および
（ｃ）トレハロース、マンニトール、ポリソルベート８０、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの賦形剤、
を含む凍結乾燥した混合物を含む、医薬組成物に関する。
（ａ）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現し、アルグルコシダーゼアルファの１つまたは２つのマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位の含有量と比較して、増加した含有量の１つまたは２つのマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位を含む、組換え酸性α－グルコシダーゼ；
（ｂ）クエン酸塩、リン酸塩およびそれらの組み合わせからなる群から選択される緩衝剤；および
（ｃ）トレハロース、マンニトール、ポリソルベート８０、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの賦形剤、
を含む凍結乾燥した混合物を含む、医薬組成物に関する。
【0033】
本発明の別の態様は、ポンペ病を処置する方法に関する。したがって、実施形態２５は、実施形態１～２２に記載の医薬製剤を、それを必要とする患者へ投与することを含む。実施形態２６は、実施形態２５に記載の方法への改変を含み、さらに、医薬製剤を患者に投与する前に希釈することを含む。実施形態２７は、実施形態２３または２４に記載の医薬組成物を再構成すること；および再構成された医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、ポンペ病を処置する方法に関する。
【0034】
本発明の別の態様は、上記医薬製剤を調製する方法に関する。したがって、実施形態２８は、実施形態１～２２のいずれかに記載の医薬製剤を調製する方法であって、少なくとも１つの緩衝剤、少なくとも１つの賦形剤、および組換え酸性α－グルコシダーゼを水に加えて溶液を提供すること；任意選択により、前記溶液のｐＨを調整すること；および任意選択により、前記溶液にさらなる水を加えること、を含む方法に関する。実施形態２９は、実施形態２８に記載の方法への改変を含み、さらに、溶液をろ過することを含む。実施形態３０は、実施形態２７または２８に記載の方法への改変を含み、さらに、溶液を貯蔵することを含む。
【0035】
本発明のさらなる特徴は、以下の明細書記載および添付図面から明らかになる：
【図面の簡単な説明】
【0036】
【図1A】非リン酸化高マンノースグリカン、モノ－Ｍ６Ｐグリカン、およびビス－Ｍ６Ｐグリカンを示す。
【図1B】Ｍ６Ｐ基の化学構造を示す。
【図2A】標的組織（例えば、ポンペ病を有する対象の筋肉組織）に対するＭ６Ｐを有するグリカンを介したｒｈＧＡＡの生産的標的化を記載する。
【図2B】非標的組織（例えば、肝臓および脾臓）への非生産的薬物クリアランス、または非標的組織への非Ｍ６Ｐグリカンの結合によって説明される。
【図3A】それぞれルミザイム（登録商標）およびマイオザイム（登録商標）のＣＩＭＰＲアフィニティークロマトグラフィーの結果を示すグラフである。破線はＭ６Ｐ溶出勾配を示す。Ｍ６Ｐによる溶出により、Ｍ６Ｐ含有グリカンを介して結合したＧＡＡ分子がＣＩＭＰＲに置換された。図２Ａに示すように、ルミザイム（登録商標）におけるＧＡＡ活性の７８％がＭ６Ｐの添加前に溶出した。図２Ｂは、ＧＡＡマイオザイム（登録商標）活性の７３％がＭ６Ｐの添加前に溶出したことを示す。ルミザイム（登録商標）またはマイオザイム（登録商標）におけるｒｈＧＡＡの２２％または２７％のみがＭ６Ｐで溶出された。これらの図は、これら２つの従来のｒｈＧＡＡ製品における大部分のｒｈＧＡＡが、標的筋肉組織のＣＩＭＰＲを標的化するのに必要なＭ６Ｐを有するグリカンを欠いていることを示す。
【図3B】それぞれルミザイム（登録商標）およびマイオザイム（登録商標）のＣＩＭＰＲアフィニティークロマトグラフィーの結果を示すグラフである。破線はＭ６Ｐ溶出勾配を示す。Ｍ６Ｐによる溶出により、Ｍ６Ｐ含有グリカンを介して結合したＧＡＡ分子がＣＩＭＰＲに置換された。図２Ａに示すように、ルミザイム（登録商標）におけるＧＡＡ活性の７８％がＭ６Ｐの添加前に溶出した。図２Ｂは、ＧＡＡマイオザイム（登録商標）活性の７３％がＭ６Ｐの添加前に溶出したことを示す。ルミザイム（登録商標）またはマイオザイム（登録商標）におけるｒｈＧＡＡの２２％または２７％のみがＭ６Ｐで溶出された。これらの図は、これら２つの従来のｒｈＧＡＡ製品における大部分のｒｈＧＡＡが、標的筋肉組織のＣＩＭＰＲを標的化するのに必要なＭ６Ｐを有するグリカンを欠いていることを示す。
【図4】ｒｈＧＡＡをコードするＤＮＡでＣＨＯ細胞を形質転換するためのＤＮＡ構築物を示す。ＣＨＯ細胞を、ｒｈＧＡＡをコードするＤＮＡ構築物で形質転換した。
【図5A】それぞれマイオザイム（登録商標）およびＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡのＣＩＭＰＲ親和性クロマトグラフィーの結果を示すグラフである。図５Ｂから明らかなように、ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡ中のｒｈＧＡＡの約７０％はＭ６Ｐを含んでいた。
【図5B】それぞれマイオザイム（登録商標）およびＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡのＣＩＭＰＲ親和性クロマトグラフィーの結果を示すグラフである。図５Ｂから明らかなように、ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡ中のｒｈＧＡＡの約７０％はＭ６Ｐを含んでいた。
【図6】陰イオン交換（ＡＥＸ）カラムでの捕捉を伴うおよび伴わないＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡのＣＩＭＰＲ親和性クロマトグラフィーの結果を示すグラフである。
【図7】ルミザイム（登録商標）およびＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡのＰｏｌｙｗａｘ溶出プロファイルを示すグラフである。
【図8】ＢＰ－ｒｈＧＡＡ、ＡＴＢ２００－１およびＡＴＢ２００－２として同定されたＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡの３つの異なる調製物と比較した、ルミザイム（登録商標）のＮ－グリカン構造の概要を示す表である。
【図9A】ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡの部位特異的Ｎ－グリコシル化分析の結果を示す。
【図9B】ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡの部位特異的Ｎ－グリコシル化分析の結果を示す。
【図9C】ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡの部位特異的Ｎ－グリコシル化分析の結果を示す。
【図9D】ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡの部位特異的Ｎ－グリコシル化分析の結果を示す。
【図9E】ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡの部位特異的Ｎ－グリコシル化分析の結果を示す。
【図9F】ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡの部位特異的Ｎ－グリコシル化分析の結果を示す。
【図9G】ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡの部位特異的Ｎ－グリコシル化分析の結果を示す。
【図9H】ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡの部位特異的Ｎ－グリコシル化分析の結果を示す。
【図11B】図１１Ｂは、様々なＧＡＡ濃度でポンペ病を有する対象由来の線維芽細胞内のＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡ活性（左のトレース）とルミザイム（登録商標）ｒｈＧＡＡ活性（右のトレース）とを比較する表である。
【図12A】図１２Ａは、溶媒（ネガティブコントロール）、２０ｍｇ／ｍｌのアルグルコシダーゼアルファ（ルミザイム（登録商標））、または５、１０もしくは２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００と接触させた後の、マウス心筋における組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの用量に対するグリコーゲンの量を示すグラフである。
【図12B】図１２Ｂは、溶媒（ネガティブコントロール）、２０ｍｇ／ｍｌのアルグルコシダーゼアルファ（ルミザイム（登録商標））、または５、１０もしくは２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００と接触させた後の、マウス四頭筋における組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの用量に対するグリコーゲンの量を示すグラフである。
【図12C】図１２Ｃは、溶媒（ネガティブコントロール）、２０ｍｇ／ｍｌのアルグルコシダーゼアルファ（ルミザイム（登録商標））、または５、１０もしくは２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００と接触させた後の、マウス三頭筋における組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの用量に対するグリコーゲンの量を示すグラフである。
【図13】ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡとシャペロンミグルスタットとの組み合わせが、ミグルスタットシャペロンを含まないルミザイム（登録商標）またはＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡによる処置よりも、ＧＡＡノックアウトマウスにおいて著しく良好なグリコーゲンクリアランスを提供したことを示す表である。
【図14】ミグルスタットの存在下および非存在下で溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウス由来の心臓、隔膜およびヒラメ筋の一連の電子顕微鏡写真であり、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ－１）のレベルを示す。
【図15】ミグルスタットの存在下および非存在下で溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウス由来の心臓およびヒラメ筋の一連の電子顕微鏡写真であり、過ヨウ素酸シッフ試薬（ＰＡＳ）で染色することによりグリコーゲンレベルを示す。
【図16】ミグルスタットの存在下および非存在下で溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウス由来の四頭筋の一連の電子顕微鏡写真（１０００ｘ）であり、メチレンブルーで染色して空胞を示した（矢印で示す）。
【図17】ミグルスタットの存在下および非存在下で溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウス由来の四頭筋の一連の電子顕微鏡写真（４０ｘ）であり、これは、オートファジーマーカー微小管関連タンパク質１Ａ／１Ｂ型軽鎖３ホスファチジルエタノールアミンコンジュゲート（ＬＣ３Ａ ＩＩ）およびｐ６２、インスリン依存性グルコーストランスポーターＧＬＵＴ４およびインスリン非依存性グルコーストランスポーターＧＬＵＴ１のレベルを示す。
【図18A】ミグルスタットの存在下で溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウスのワイヤハンドおよび握力筋肉データを示すグラフである。
【図18B】ミグルスタットの存在下で溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウスのワイヤハンドおよび握力筋肉データを示すグラフである。
【図19A】ミグルスタットの存在下および非存在下で、溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウスからの四頭筋、三頭筋および心臓細胞におけるグリコーゲンレベルを示すグラフである。
【図19B】ミグルスタットの存在下および非存在下で、溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウスからの四頭筋、三頭筋および心臓細胞におけるグリコーゲンレベルを示すグラフである。
【図19C】ミグルスタットの存在下および非存在下で、溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウスからの四頭筋、三頭筋および心臓細胞におけるグリコーゲンレベルを示すグラフである。
【図19D】ミグルスタットの存在下および非存在下で、溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウスからの四頭筋、三頭筋および心臓細胞におけるグリコーゲンレベルを示すグラフである。
【図19E】ミグルスタットの存在下および非存在下で、溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウスからの四頭筋、三頭筋および心臓細胞におけるグリコーゲンレベルを示すグラフである。
【図19F】ミグルスタットの存在下および非存在下で、溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウスからの四頭筋、三頭筋および心臓細胞におけるグリコーゲンレベルを示すグラフである。
【図19G】ミグルスタットの存在下および非存在下で、溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウスからの四頭筋、三頭筋および心臓細胞におけるグリコーゲンレベルを示すグラフである。
【図20】ミグルスタットの存在下および非存在下で溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウス由来の外側広筋（ＶＬ）の筋線維の一連の顕微鏡写真（１００ｘおよび２００ｘ）であり、ジストロフィンシグナルを示す。
【図21】ポンペ病を有する成人における経口ミグルスタットと共投与したＡＴＢ２００の静脈内注入の安全性、忍容性、ＰＫ、ＰＤ、および有効性を評価するための、オープンラベル、一定連続、用量漸増、ヒト初回、第１／２相実験の実験デザインを示す。
【図22A】５、１０もしくは２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００、２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００および１３０ｍｇのミグルスタット、または２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００および２６０ｍｇのミグルスタットの投与後の、ヒト対象における血漿中のＧＡＡ総タンパク質の濃度－時間プロファイルを示すグラフである。
【図22B】５、１０もしくは２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００、２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００および１３０ｍｇのミグルスタット、または２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００および２６０ｍｇのミグルスタットの投与後の、ヒト対象における血漿中のＧＡＡ総タンパク質の濃度－時間プロファイルを示すグラフである。
【図22C】２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００、２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００および１３０ｍｇのミグルスタット、または２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００および２６０ｍｇのミグルスタットの投与後の、ヒト対象における血漿中のＧＡＡ総タンパク質のＡＵＣを示すグラフである。
【図22D】２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００および２６０ｍｇのミグルスタットの投与後の、２人の別個のヒト対象における血漿中のＧＡＡ総タンパク質の濃度－時間プロファイルを示すグラフである。
【図23】１３０ｍｇまたは２６０ｍｇのミグルスタットを投与した後のヒト対象における血漿中のミグルスタットの濃度－時間プロファイルを示すグラフである。
【図24A】ＡＴＢ２００（５，１０および２０ｍｇ／ｋｇ）の漸増用量の投与、次いでＡＴＢ２００（２０ｍｇ／ｋｇ）およびミグルスタット（１３０および２６０ｍｇ）の共投与後の、ヒト患者におけるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、クレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）およびヘキソース四糖（Ｈｅｘ４）レベルの変化を示すグラフである。
【図24B】ＡＴＢ２００（５，１０および２０ｍｇ／ｋｇ）の漸増用量の投与、次いでＡＴＢ２００（２０ｍｇ／ｋｇ）およびミグルスタット（１３０および２６０ｍｇ）の共投与後の、ヒト患者におけるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、クレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）およびヘキソース四糖（Ｈｅｘ４）レベルの変化を示すグラフである。
【図24C】ＡＴＢ２００（５，１０および２０ｍｇ／ｋｇ）の漸増用量の投与、次いでＡＴＢ２００（２０ｍｇ／ｋｇ）およびミグルスタット（１３０および２６０ｍｇ）の共投与後の、ヒト患者におけるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、クレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）およびヘキソース四糖（Ｈｅｘ４）レベルの変化を示すグラフである。
【図24D】ＡＴＢ２００（５，１０および２０ｍｇ／ｋｇ）の漸増用量の投与、次いでＡＴＢ２００（２０ｍｇ／ｋｇ）およびミグルスタット（１３０および２６０ｍｇ）の共投与後の、ヒト患者におけるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、クレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）およびヘキソース四糖（Ｈｅｘ４）レベルの変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0037】
本発明のいくつかの例示的な実施形態を説明する前に、本発明は、以下の説明に記載された構成またはプロセスステップの詳細に限定されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であり、様々な方法で実施または実行されることが可能である。以下に列挙される実施形態は、以下に列挙されるものだけでなく、本発明の範囲に従った他の適切な組み合わせで組み合わせられ得ることが理解されよう。
【0038】
驚くべきことに、緩衝液および賦形剤の慎重な選択により、優れた安定性を示し、酵素の活性および有効性を維持しつつも酵素の沈殿を最小限に抑えながら、製剤の調製、貯蔵、輸送、再構成および投与に関連するプロセスを行うことができる、組換えＧＡＡタンパク質ＡＴＢ２００の製剤が提供され得ることが発見された。したがって、本発明の一態様は、ｒｈＧＡＡ、緩衝剤、および少なくとも１つの賦形剤を含む製剤に関する。１つ以上の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、ＡＴＢ２００を含む。いくつかの実施形態において、製剤は液体製剤である。製剤の様々な成分に関する詳細および様々な実施形態を以下に記載する。
【0039】
定義
本明細書で使用される用語は、一般に、本発明の文脈内で、そして各用語が使用される具体的な文脈において、当該技術分野における通常の意味を有する。本発明の組成物および方法、ならびにそれらを製造および使用する方法を説明する上で、専門家に追加的な指針を提供するために、特定の用語については以下または本明細書の他の箇所で説明する。
本明細書で使用される用語は、一般に、本発明の文脈内で、そして各用語が使用される具体的な文脈において、当該技術分野における通常の意味を有する。本発明の組成物および方法、ならびにそれらを製造および使用する方法を説明する上で、専門家に追加的な指針を提供するために、特定の用語については以下または本明細書の他の箇所で説明する。
【0040】
本明細書では、文言の説明または必要な示唆のために、文脈が他に要する場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という単語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、包括的な意味、すなわち、述べられた特徴の存在を特定するために使用され、本発明の様々な実施形態におけるさらなる特徴の存在または追加を排除するものではない。
【0041】
本明細書で使用される場合、用語「ポンペ病」は、酸マルターゼ欠乏症、ＩＩ型糖源蓄積症（ＧＳＤＩＩ）、およびＩＩ型糖源病とも呼ばれ、ヒト酸性α－グルコシダーゼ酵素をコードするＧＡＡ遺伝子の突然変異を特徴とする、遺伝的リソソーム蓄積症を指すことが意図される。この用語には、乳児期、若年期および成人期発症のポンペ病が含まれるが、これらに限定されない、初期および後期発症形態が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0042】
本明細書で使用される場合、用語「酸性α－グルコシダーゼ」は、グリコーゲン、マルトース、およびイソマルトースのＤ－グルコース単位間のα－１，４結合を加水分解するリソソーム酵素を指すことが意図される。別の名称には、リソソームα－グルコシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．２０）；グルコアミラーゼ；１，４－α－Ｄ－グルカングルコヒドロラーゼ；アミログルコシダーゼ；ガンマ－アミラーゼおよびエキソ－１，４－α－グルコシダーゼが含まれるが、これらに限定されるものではない。ヒト酸性α－グルコシダーゼは、１７番染色体の長腕（位置１７ｑ２５．２－ｑ２５．３）にマッピングされているＧＡＡ遺伝子（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）Ｇｅｎｅ ＩＤ ２５４８）によってコードされている。野生型ＧＡＡアミノ酸全配列は、米国特許第８，５９２，３６２号明細書に記載される通り、配列番号１に記載され、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＨＥ２４１０４．１（ＧＩ：５６８７６０９７４）を有する。
【0043】
５００を超える突然変異が現在ヒトＧＡＡ遺伝子において同定されており、その多くはポンペ病に関連している。酸性α－グルコシダーゼ酵素のミスフォールディングまたは誤処理を生じる突然変異には、Ｔ１０６４Ｃ（Ｌｅｕ３５５Ｐｒｏ）およびＣ２１０４Ｔ（Ａｒｇ７０２Ｃｙｓ）が含まれる。さらに、酵素の成熟および処理に影響を及ぼすＧＡＡ突然変異には、Ｌｅｕ４０５ＰｒｏおよびＭｅｔ５１９Ｔｈｒが含まれる。酸性α－グルコシダーゼタンパク質の活性には、アミノ酸残基５１６～５２１で保存されたヘキサペプチドＷＩＤＭＮＥが必要である。本明細書で使用される場合、略語「ＧＡＡ」は、酸性α－グルコシダーゼ酵素を指すことが意図され、イタリック体の略語「ＧＡＡ」は、ヒト酸性α－グルコシダーゼ酵素をコードするヒト遺伝子を指すことが意図される。したがって、略語「ｒｈＧＡＡ」は、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ酵素を指すことが意図される。
【0044】
本明細書で使用される場合、用語「アルグルコシダーゼアルファ」は、［１９９－アルギニン、２２３－ヒスチジン］プレプロ－α－グルコシダーゼ（ヒト）；Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ登録番号４２０７９４－０５－０として同定された組換えヒト酸性α－グルコシダーゼを指すことが意図される。アルグルコシダーゼアルファは、ルミザイム（登録商標）およびマイオザイム（登録商標）として、２０１６年１月付けで米国におけるＧｅｎｚｙｍｅによる市販が承認されている。
【0045】
本明細書で使用される場合、用語「ＡＴＢ２００」は、同時係属中の特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１５／０５３２５２号明細書に記載される組換えヒト酸性α－グルコシダーゼを指すことが意図され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【0046】
本明細書で使用される場合、用語「グリカン」は、タンパク質またはポリペプチド上のアミノ酸残基に共有結合した多糖類鎖を指すことが意図される。本明細書で使用される場合、用語「Ｎ－グリカン」または「Ｎ－結合グリカン」は、アミノ酸残基の窒素原子に共有結合によってタンパク質またはポリペプチド上のアミノ酸残基に結合した多糖類鎖を指すことが意図される。例えば、Ｎ－グリカンは、アスパラギン残基の側鎖窒素原子に共有結合し得る。グリカンは、１個または数個の単糖単位を含み得、単糖単位は共有結合して直鎖または分枝鎖を形成し得る。少なくとも１つの実施形態において、ＡＴＢ２００に結合したＮ－グリカン単位は、Ｎ－アセチルグルコサミン、マンノース、ガラクトースまたはシアル酸からそれぞれ独立して選択される１つ以上の単糖単位を含み得る。タンパク質上のＮ－グリカン単位は、質量分析などの任意の適切な分析技術によって決定し得る。いくつかの実施形態において、Ｎ－グリカン単位は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓ Ｐｒｏ（商標）質量分析計、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ Ｔｒｉｂｉｄ（商標）質量分析計またはＷａｔｅｒｓＸｅｖｏ（登録商標）Ｇ２－ＸＳ ＱＴｏｆ質量分析計などの機器を利用する液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）によって決定され得る。
【0047】
本明細書で使用される場合、用語「高マンノースＮ－グリカン」は、１～６個またはそれを超えるマンノース単位を有するＮ－グリカンを指すことが意図される。少なくとも１つの実施形態において、高マンノースＮ－グリカン単位は、アスパラギン残基に結合したビス（Ｎ－アセチルグルコサミン）鎖を含有し、さらに分枝状ポリマンノース鎖に結合し得る。本明細書で交換可能に使用される場合、用語「Ｍ６Ｐ」または「マンノース－６－リン酸」は、６位がリン酸化された、すなわち、６位のヒドロキシル基に結合したリン酸基を有する、マンノース単位を指すことが意図される。少なくとも１つの実施形態において、１つ以上のＮ－グリカン単位の１つ以上のマンノース単位が６位でリン酸化されて、マンノース－６－リン酸単位を形成する。
【0048】
本明細書で使用される場合、用語「複合Ｎ－グリカン」は、１つ以上のガラクトースおよび／またはシアル酸単位を含むＮ－グリカンを指すことが意図される。少なくとも１つの実施形態において、複合Ｎ－グリカンは、Ｎ－アセチルグルコサミン、ガラクトースおよびシアル酸からそれぞれ独立して選択される１つ以上の単糖単位に、１つまたはマンノース単位がさらに結合した高マンノースＮ－グリカンであり得る。
【0049】
本明細書で使用される場合、「治療有効用量」および「有効量」は、対象において治療応答を生じる、酸性α－グルコシダーゼの量を指すことが意図される。治療応答は、本明細書に記載され、および当該技術分野で公知の、任意の代理臨床マーカーまたは症状を含む、ユーザ（例えば、臨床医）が治療に対する有効な応答として認識する任意の応答であり得る。したがって、少なくとも１つの実施形態において、治療応答は、当該技術分野で公知のものなどのポンペ病の１つ以上の症状またはマーカーの改善または抑制であり得る。ポンペ病の症状またはマーカーとしては、心筋症、心臓肥大、特に体幹または下肢における進行性筋力低下、重度の低血圧、巨舌（および場合により舌の突出）、嚥下、吸い込み、および／または摂食の困難、呼吸不全、肝腫（中度）、顔面筋肉の弛緩、反射消失、運動不耐性、労作性呼吸困難、起座呼吸、睡眠時無呼吸、朝の頭痛、傾眠、脊柱前弯および／または脊柱側弯症、深部腱反射の減少、腰痛、発達的運動マイルストーンの不達成が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0050】
本明細書で使用される場合、用語「酵素補充療法」または「ＥＲＴ」は、非天然の精製酵素を、そのような酵素の欠乏を有する個体に導入することを指すことが意図される。投与されるタンパク質は、天然源から、または組換え発現により、得ることができる。この用語はまた、その他の点で精製酵素の投与を必要とするか、または精製酵素の投与から恩恵を受ける個体における精製酵素の導入も指す。少なくとも１つの実施形態において、そのような個体は酵素不全を患っている。導入された酵素は、インビトロで産生された精製組換え酵素、または例えば胎盤または動物の乳などの単離された組織または液体から、または植物から精製されたタンパク質であってもよい。
【0051】
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される」は、生理学的に許容され、ヒトに投与される場合に典型的には有害な反応を生じない、分子実体および組成物を指すことが意図される。好ましくは、本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される」は、連邦または州政府の規制当局によって承認されているか、または米国薬局方または動物、特にヒトにおける使用のための他の一般に認められている薬局方に列挙されることを意味する。
【0052】
本明細書で使用される場合、「賦形剤」という用語は、製剤に含まれる活性成分以外の物質を指し、これは一般に不活性物質である。賦形剤は、活性薬物を、薬物を作用させようとする部位に輸送するのを助け、活性薬物の放出を制御し、または可溶化を助け、または様々な他の機能を果たし得る。賦形剤の例には、緩衝剤、界面活性剤、抗菌剤、抗酸化剤、増量剤、安定剤、等張化剤などが含まれるが、これらに限定されない。
【0053】
本明細書で使用される「緩衝剤」という用語は、弱酸およびその共役弱塩基の両方を含む溶液を指し、そのｐＨはアルカリまたは酸の添加によってわずかしか変化しない。以下にさらに説明するように、いくつかの実施形態において、医薬製剤に使用される緩衝剤は、クエン酸塩および／またはリン酸塩緩衝剤である。
【0054】
本明細書で使用される場合、用語「対象」または「患者」は、ヒトまたは非ヒト動物を指すことが意図される。少なくとも１つの実施形態において、対象は哺乳動物である。少なくとも１つの実施形態において、対象はヒトである。
【0055】
本明細書で使用される場合、用語「約」および「およそ」は、測定の性質または精度を考慮して、測定された量に対する許容可能な程度の誤差を指すことが意図される。例えば、誤差の程度は、当分野で理解されているように、測定に関して提供された有効数字の数によって示すことができ、測定に関して報告された最も正確な有効数字の±１の変化を含むが、これに限定されるものではない。典型的な例示的な誤差の程度は、所与の値または値の範囲の２０パーセント（％）以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内である。あるいは、特に生物系において、用語「約」および「およそ」は、所与の値の１桁倍以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内の値を意味し得る。本明細書に記載の数値は、他に明記しない限りおよそのものであり、用語「約」または「およそ」は、明示的に記載されていない場合に推測できることを意味する。
【0056】
本明細書を通じて、「１つの実施形態」、「特定の実施形態」、「様々な実施形態」、「１つ以上の実施形態」または「実施形態」は、実施形態に関連して説明される特定の特徴、構造、材料または性質が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書の様々な箇所における「１つ以上の実施形態において」、「特定の実施形態において」、「様々な実施形態において」、「１つの実施形態において」または「実施形態において」などの表現は、必ずしも本発明の同じ実施形態を指すものではない。さらに、特定の特徴、構造、材料、または特性は、１つまたは複数の実施形態において任意の適切な方法で組み合わせることができる。
【0057】
ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡ
この製剤は、酵素補充療法における使用に適した組換えＧＡＡ（ｒｈＧＡＡ）タンパク質であるＡＴＢ２００を含む。ＡＴＢ２００の構造および産生に関する詳細ならびに変異体を以下に提供する。
この製剤は、酵素補充療法における使用に適した組換えＧＡＡ（ｒｈＧＡＡ）タンパク質であるＡＴＢ２００を含む。ＡＴＢ２００の構造および産生に関する詳細ならびに変異体を以下に提供する。
【0058】
少なくとも１つの実施形態において、ＡＴＢ２００はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現し、アルグルコシダーゼアルファの１つ以上のマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位の含有量と比較して、増加した含有量の１つ以上のマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位を含む。ｒｈＧＡＡには７つの潜在的なＮ結合グリコシル化部位がある。存在するＮ－結合型オリゴ糖（Ｎ－グリカン）のタイプでは、それぞれのグリコシル化部位が不均一であるため、ｒｈＧＡＡは、Ｍ６Ｐ受容体および他の炭水化物受容体に対して様々な結合親和性を有するタンパク質とＮ－グリカンとの複合混合物からなる。１つのＭ６Ｐ基（モノ－Ｍ６Ｐ）を有するＮ－グリカンを有する高マンノースを含むｒｈＧＡＡは、低（約６，０００ｎＭ）親和性でＣＩＭＰＲに結合する一方、同じＮ－グリカン（ビス－Ｍ６Ｐ）上に２つのＭ６Ｐ基を含むｒｈＧＡＡは、高い（約２ｎＭ）親和性で結合する。非リン酸化、モノ－Ｍ６Ｐおよびビス－Ｍ６Ｐグリカンの代表的な構造を図１Ａに示す。マンノース－６－Ｐ基を図１Ｂに示す。リソソーム内に入ると、ｒｈＧＡＡは蓄積されたグリコーゲンを酵素的に分解することができる。しかしながら、従来のｒｈＧＡＡは、Ｍ６ＰおよびビスＭ６Ｐを有するグリカンの総レベルが低く、したがって、標的筋細胞は、リソソームへのｒｈＧＡＡの送達が劣る結果となる。ｒｈＧＡＡの生産的薬物標的化を図２Ａに示す。これらの従来の生成物中のｒｈＧＡＡ分子の大部分は、リン酸化されたＮ－グリカンを有さず、それによりＣＩＭＰＲに対する親和性が欠如している。非リン酸化高マンノースグリカンはまた、ＥＲＴの非生産的クリアランスをもたらすマンノース受容体によって除去され得る（図２Ｂ）。
【0059】
ガラクトースとシアル酸を含む他のタイプのＮ－グリカン、複合糖質もｒｈＧＡＡに存在する。複合Ｎ－グリカンはリン酸化されていないので、それらはＣＩＭＰＲに対する親和性を有しない。しかし、暴露されたガラクトース残基を有する複合型Ｎ－グリカンは、肝細胞上のアシアロ糖タンパク質受容体に対して中程度から高度の親和性を有し、ｒｈＧＡＡの迅速な非生産的クリアランスをもたらす（図２Ｂ）。
【0060】
少なくとも１つの実施形態において、酸性α－グルコシダーゼは、同時係属中の国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１５／０５３２５２号明細書に記載されるような、本明細書でＡＴＢ２００と称される組換えヒト酸性α－グルコシダーゼである。ＡＴＢ２００は、高親和性（ＫＤ～２～４ｎＭ）でカチオン非依存性マンノース－６－リン酸受容体（ＣＩＭＰＲ）に結合し、ポンペ線維芽細胞および骨格筋芽細胞（Ｋ取り込み～７～１４ｎＭ）によって効率的に内在化されることが示されている。ＡＴＢ２００はインビボで特徴付けられ、アルグルコシダーゼアルファ（ｔ１／２～６０分）よりも短い見かけの血漿半減期（ｔ１／２～４５分）を有することが示された。
【0061】
１つ以上の実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、配列番号２に示される野生型ＧＡＡアミノ酸配列を有する。これはアミノ酸残基５７～９５２に対応し、シグナルペプチドおよび前駆体ペプチドを含む最初の５６残基を除去する天然の細胞内タンパク質分解処理後の野生型（ＷＴ）ヒトＧＡＡと同一である。ＡＴＢ２００アミノ酸配列は、トリプシン消化、続いて液体クロマトグラフィー／質量分析ならびにアミノ酸配列決定によって確認されている。対照的に、現行のケアｒｈＧＡＡ酵素補充療法（ＥＲＴ）（市販されているアルグルコシダーゼアルファ含有製品はほとんどの国でマイオザイム（登録商標）であり、米国ではルミザイム（登録商標）、Ｇｅｎｚｙｍｅ、Ｓａｎｏｆｉ Ｃｏｍｐａｎｙである）はＷＴ ＧＡＡとは異なり、３アミノ酸残基置換：位置１９９でのヒスチジンのアルギニンへの変化、２２３でのアルギニンのヒスチジンへの変化、７８０でのバリンのイソロイシンへの変化を含有する。
【0062】
少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、タンパク質中の１つ以上のアミノ酸残基において翻訳後および／または化学修飾を受ける。例えば、メチオニンおよびトリプトファン残基は酸化を受け得る。別の例として、アスパラギン残基は、アスパラギン酸への脱アミノ化を受け得る。さらに別の例として、アスパラギン酸は、イソアスパラギン酸への異性化を受け得る。したがって、いくつかの実施形態において、酵素は、配列番号１、または配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するものとして最初に発現され、酵素はこれらの翻訳後および／または化学修飾の１つ以上を受ける。そのような改変もまた、本開示の範囲内である。
【0063】
少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、米国特許第８，５９２，３６２号明細書に記載されるような、配列番号１に記載の野生型ＧＡＡアミノ酸配列を有し、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＨＥ２４１０４．１（ＧＩ：５６８７６０９７４）を有する。少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、ＧＡＡ遺伝子の９つの観察されたハプロタイプのうちの最も優勢なものによってコードされるヒト酸性α－グルコシダーゼ酵素である、グルコシダーゼアルファである。
【0064】
少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、配列番号１に記載の野生型ＧＡＡの全長９５２アミノ酸配列を有するものとして最初に発現され、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、アミノ酸の一部、例えば最初の５６アミノ酸を除去する細胞内プロセシングを受ける。したがって、宿主細胞によって分泌される組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、細胞内で最初に発現される組換えヒト酸性α－グルコシダーゼよりも短いアミノ酸配列を有し得る。少なくとも１つの実施形態において、より短いタンパク質は、シグナルペプチドおよび前駆体ペプチドを含む最初の５６アミノ酸が除去され、したがって８９６個のアミノ酸を有するタンパク質が得られる点でのみ配列番号１と異なる、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し得る。配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれを超える欠失、置換および／または挿入を有するなど、アミノ酸の数における他の変更も可能である。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡ生成物は、異なるアミノ酸長を有する組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ分子の混合物を含む。
【0065】
少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、タンパク質中の１つ以上のアミノ酸残基において翻訳後および／または化学修飾を受ける。例えば、メチオニンおよびトリプトファン残基は酸化を受け得る。別の例として、Ｎ末端グルタミンはピログルタミン酸を形成することができる。別の例として、アスパラギン残基は、アスパラギン酸への脱アミノ化を受け得る。さらに別の例として、アスパラギン酸残基はイソアスパラギン酸への異性化を受け得る。さらに別の例として、タンパク質中の不対システイン残基は、遊離グルタチオンおよび／またはシステインとジスルフィド結合を形成し得る。したがって、いくつかの実施形態において、酵素は、配列番号１、または配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するものとして最初に発現され、酵素はこれらの翻訳後および／または化学修飾の１つ以上を受ける。そのような改変形態も本開示の範囲内である。
【0066】
好ましくは、全組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ分子の７０、６５、６０、５５、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０または５％以下が、１つ以上のマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位を欠くか、または陽イオン非依存性マンノース－６－リン酸受容体（ＣＩＭＰＲ）に結合する能力が欠如している。あるいは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ分子の３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９％、＜１００％以上が、１つ以上のマンノース－６－リン酸残基を有する少なくとも１つのＮ－グリカン単位を含む、またはＣＩＭＰＲに結合する能力を有する。
【0067】
組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ分子は、そのグリカン上に１、２、３または４個のマンノース－６－リン酸（Ｍ６Ｐ）基を有し得る。例えば、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ分子における１つのＮ－グリカンのみがＭ６Ｐ（モノ－リン酸化）を有していてもよく、単一のＮ－グリカンが２つのＭ６Ｐ基（ビス－リン酸化）を有していてもよく、または同じ組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ分子における２つの異なるＮ－グリカンがそれぞれ単一のＭ６Ｐ基を有していてもよい。組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ分子はまた、Ｍ６Ｐ基を有しないＮ－グリカンを有し得る。別の実施形態において、Ｎ－グリカンは、平均して３モル／モルを超えるＭ６Ｐおよび４モル／モルを超えるシアル酸を含み、その結果、ヒト酸性α－グルコシダーゼは、平均して組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ１モルあたり少なくとも３モルのマンノース－６－リン酸残基、および組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ１モルあたり少なくとも４モルのシアル酸を含む。平均して組換えヒト酸性α－グルコシダーゼにおける総グリカンの少なくとも約３、４、５、６、７、８、９または１０％は、モノ－Ｍ６Ｐグリカンの形態であってもよく、例えば、総グリカンの約６．２５％が単一のＭ６Ｐ基を有していてもよく、平均して組換えヒト酸性α－グルコシダーゼにおける総グリカンの少なくとも約０．５、１、１．５、２．０、２．５、３．０％がビス－Ｍ６Ｐグリカンの形態であり、平均して総組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの２５％未満が、ＣＩＭＰＲに結合するリン酸化グリカンを含まない。
【0068】
組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、０．５～７．０モル／モル組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの範囲、または０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５または７．０モル／モル組換えヒト酸性α－グルコシダーゼを含む部分範囲の任意の中間値のＭ６Ｐを担持するＮ－グリカンの平均含有量を有し得る。組換えヒト酸性α－グルコシダーゼを分画して、異なる平均数のＭ６Ｐ含有またはビス－Ｍ６Ｐ含有グリカンを有する組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ調製物を提供することができ、これにより、特定の画分を選択することにより、または選択的に異なる画分を組み合わせることにより、標的組織のリソソームへ標的化する組換えヒト酸性α－グルコシダーゼのさらなるカスタマイズが可能となる。
【0069】
いくつかの実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ１モル当たり平均して２．０～８．０モルのＭ６Ｐを有する。この範囲には、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５および８．０モルＭ６Ｐ／モル組換えヒト酸性α－グルコシダーゼを含む、すべての中間値および部分範囲が含まれる。
【0070】
組換えヒト酸性α－グルコシダーゼにおけるＮ－グリカンの最大６０％が完全にシアリル化されていてもよく、例えばＮ－グリカンの最大１０％、２０％、３０％、４０％、５０％または６０％が完全にシアリル化されていてもよい。いくつかの実施形態において、全Ｎ－グリカンの４～２０％が完全にシアリル化されている。他の実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼにおけるＮ－グリカンの５％、１０％、２０％または３０％以下がシアル酸および末端ガラクトース残基（Ｇａｌ）を有する。この範囲には、全ての中間値および部分範囲が含まれ、例えば、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼにおける全Ｎ－グリカンの７～３０％がシアル酸および末端ガラクトースを運ぶことができる。さらに他の実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼにおけるＮ－グリカンの５、１０、１５、１６、１７、１８、１９または２０％以下が末端ガラクトースのみを有し、シアル酸を含有しない。この範囲には、全ての中間値および部分範囲が含まれ、例えば、組成物中の組換えヒト酸性α－グルコシダーゼにおける全Ｎ－グリカンの８～１９％が、末端ガラクトースのみを有し、シアル酸を含有しない場合がある。
【0071】
本発明の他の実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼにおける総Ｎ－グリカンの４０、４５、５０、５５～６０％が複合型Ｎ－グリカンであり；または組換えヒト酸性α－グルコシダーゼにおける総Ｎ－グリカンの１、２、３、４、５、６、７％以下がハイブリッド型Ｎ－グリカンであり；組換えヒト酸性α－グルコシダーゼにおける高マンノース型Ｎ－グリカンの５、１０または１５％以下が非リン酸化されており；組換えヒト酸性α－グルコシダーゼにおける高マンノース型Ｎ－グリカンの少なくとも５％または１０％がリン酸化されたモノ－Ｍ６Ｐであり；および／または組換えヒト酸性α－グルコシダーゼにおける高マンノース型Ｎ－グリカンの少なくとも１または２％がリン酸化されたビス－Ｍ６Ｐである。これらの値には、全ての中間値および部分範囲が含まれる。組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、上記の１つ以上の含有量範囲を満たし得る。
【0072】
いくつかの実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ１モル当たり平均して２．０～８．０モルのシアル酸残基を有する。この範囲には、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５および８．０モル残基／モル組換えヒト酸性α－グルコシダーゼを含む、全ての中間値および部分範囲が含まれる。理論に拘束されるものではないが、シアル酸残基を有するＮ－グリカン単位の存在は、アシアロ糖タンパク質受容体による組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの非生産的クリアランスを防止し得ると考えられる。
【0073】
１つ以上の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、組換えヒトリソソームタンパク質の一定のＮ－グリコシル化部位にＭ６Ｐおよび／またはシアル酸単位を有する。例えば、ｒｈＧＡＡには７つの潜在的なＮ結合グリコシル化部位がある。これらの潜在的なグリコシル化部位は、配列番号２の次の位置に存在する：Ｎ８４、Ｎ１７７、Ｎ３３４、Ｎ４１４、Ｎ５９６、Ｎ８２６およびＮ８６９。同様に、配列番号１の全長アミノ酸配列に関して、これらの潜在的なグリコシル化部位は、以下の位置に存在する：Ｎ１４０、Ｎ２３３、Ｎ３９０、Ｎ４７０、Ｎ６５２、Ｎ８８２およびＮ９２５。ｒｈＧＡＡの他の変異体は、アスパラギン残基の位置に応じて、同様のグリコシル化部位を有し得る。一般に、タンパク質アミノ酸配列におけるＡＳＮ－Ｘ－ＳＥＲまたはＡＳＮ－Ｘ－ＴＨＲの配列は、潜在的なグリコシル化部位を示すが、例外として、ＸはＨＩＳまたはＰＲＯではあり得ない。
【0074】
様々な実施形態において、ｒｈＧＡＡは、特定のＮ－グリコシル化プロファイルを有する。１つ以上の実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも２０％が第１のＮ－グリコシル化部位でリン酸化される（例えば、配列番号２のＮ８４および配列番号１のＮ１４０）。例えば、ｒｈＧＡＡの少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％が第１のＮ－グリコシル化部位でリン酸化され得る。このリン酸化は、モノ－Ｍ６Ｐおよび／またはビス－Ｍ６Ｐ単位の結果であり得る。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％は、第１のＮ－グリコシル化部位でモノ－Ｍ６Ｐ単位を有する。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％は、第１のＮ－グリコシル化部位でビス－Ｍ６Ｐ単位を有する。
【0075】
１つ以上の実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも２０％が第２のＮ－グリコシル化部位でリン酸化される（例えば、配列番号２のＮ１７７および配列番号１のＮ２２３）。例えば、ｒｈＧＡＡの少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％が第２のＮ－グリコシル化部位でリン酸化され得る。このリン酸化は、モノ－Ｍ６Ｐおよび／またはビス－Ｍ６Ｐ単位の結果であり得る。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％は、第２のＮ－グリコシル化部位でモノ－Ｍ６Ｐ単位を有する。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％は、第２のＮ－グリコシル化部位でビス－Ｍ６Ｐ単位を有する。１つ以上の実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも５％が第３のＮ－グリコシル化部位でリン酸化される（例えば、配列番号２のＮ３３４および配列番号１のＮ３９０）。他の実施形態において、ｒｈＧＡＡの５％、１０％、１５％、２０％または２５％未満が第３のＮ－グリコシル化部位でリン酸化される。例えば、第３のＮ－グリコシル化部位は、非リン酸化高マンノースグリカン、ジ－、トリ－、およびテトラ－アンテナリ複合グリカン、ならびに主要な種としてのハイブリッドグリカンの混合物を有し得る。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも３％、５％、８％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％が第３のＮ－グリコシル化部位でシアリル化される。
【0076】
１つ以上の実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも２０％が第４のＮ－グリコシル化部位でリン酸化される（例えば、配列番号２のＮ４１４および配列番号１のＮ４７０）。例えば、ｒｈＧＡＡの少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％が第４のＮ－グリコシル化部位でリン酸化され得る。このリン酸化は、モノ－Ｍ６Ｐおよび／またはビス－Ｍ６Ｐ単位の結果であり得る。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％は、第４のＮ－グリコシル化部位でモノ－Ｍ６Ｐ単位を有する。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％は、第４のＮ－グリコシル化部位でビス－Ｍ６Ｐ単位を有する。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも３％、５％、８％、１０％、１５％、２０％または２５％が第４のＮ－グリコシル化部位でシアリル化される。
【0077】
１つ以上の実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも５％が第５のＮ－グリコシル化部位でリン酸化される（例えば、配列番号２のＮ５９６および配列番号１のＮ６９２）。他の実施形態において、ｒｈＧＡＡの５％、１０％、１５％、２０％または２５％未満が第５のＮ－グリコシル化部位でリン酸化される。例えば、第５のＮ－グリコシル化部位は、主要な種として、フコシル化されたジ－アンテナリ複合グリカンを有し得る。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも３％、５％、８％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％が第５のＮ－グリコシル化部位でシアリル化される。
【0078】
１つ以上の実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも５％が第６のＮ－グリコシル化部位でリン酸化される（例えば、配列番号２のＮ８２６および配列番号１のＮ８８２）。他の実施形態において、ｒｈＧＡＡの５％、１０％、１５％、２０％または２５％未満が第６のＮ－グリコシル化部位でリン酸化される。例えば、第６のＮ－グリコシル化部位は、主要な種として、ジ－、トリ－、およびテトラ－アンテナリ複合グリカンの混合物を有し得る。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも３％、５％、８％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％が第６のＮ－グリコシル化部位でシアリル化される。
【0079】
１つ以上の実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも５％が第７のＮ－グリコシル化部位でリン酸化される（例えば、配列番号２のＮ８６９および配列番号１のＮ９２５）。他の実施形態において、ｒｈＧＡＡの５％、１０％、１５％、２０％または２５％未満が第７のＮ－グリコシル化部位でリン酸化される。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの４０％、４５％、５０％、５５％、６０％または６５％未満が第７のＮ－グリコシル化部位に任意のグリカンを有する。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも３０％、３５％または４０％が第７のＮ－グリコシル化部位にグリカンを有する。
【0080】
様々な実施形態において、ｒｈＧＡＡは、モルｒｈＧＡＡ当たり０～５モルの平均フコース含量、モルｒｈＧＡＡ当たり１０～３０モルのＧｌｃＮＡｃ含量、モルｒｈＧＡＡ当たり５～２０モルのガラクトース含量、モルｒｈＧＡＡ当たり１０～４０モルのマンノース含量、モルｒｈＧＡＡ当たり２～８モルのＭ６Ｐ含有量、およびモルｒｈＧＡＡ当たり２～８モルのシアル酸含有量を有する。様々な実施形態において、ｒｈＧＡＡは、モルｒｈＧＡＡ当たり２～３モルの平均フコース含量、モルｒｈＧＡＡ当たり２０～２５モルのＧｌｃＮＡｃ含量、モルｒｈＧＡＡ当たり８～１２モルのガラクトース含量、モルｒｈＧＡＡ当たり２２～２７モルのマンノース含量、モルｒｈＧＡＡ当たり３～５モルのＭ６Ｐ含有量、およびモルｒｈＧＡＡ当たり４～７モルのシアル酸含有量を有する。
【0081】
組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、ＣＨＯ細胞株ＧＡ－ＡＴＢ２００またはＡＴＢ２００－００１－Ｘ５－１４などのチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞により、またはそのようなＣＨＯ細胞培養物の継代培養物もしくは誘導体により好ましく産生される。配列番号１と少なくとも９０％、９５％または９９％同一であるものなど、酸性α－グルコシダーゼまたは他の変異体酸性α－グルコシダーゼアミノ酸配列の対立遺伝子変異体を発現するＤＮＡ構築物を構築し、ＣＨＯ細胞で発現させることができる。これらの変異体酸性α－グルコシダーゼアミノ酸配列は、例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれを超える欠失、置換および／または挿入を有するなど、配列番号１に対して欠失、置換および／または挿入を含有してもよい。当業者は、そのようなＤＮＡ構築物の産生のためのＣＨＯ細胞の形質転換に適した代替的ベクターを選択し得る。
【0082】
ＧＣＧ配列分析パッケージ（ウィスコンシン大学、ウィスコンシン州マディソン）の一部として利用可能なＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴを含む、２つの配列間の同一性を計算するために、様々なアライメントアルゴリズムおよび／またはプログラムを使用することができ、例えば、デフォルト設定で使用することができる。例えば、本明細書に記載され、好ましくは実質的に同じ機能を示す特定のポリペプチドに対して少なくとも９０％、９５％または９９％の同一性を有するポリペプチド、ならびにそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが企図される。別段の指示がない限り、類似度スコアはＢＬＯＳＵＭ６２の使用に基づく。ＢＬＡＳＴＰが使用される場合、類似性割合はＢＬＡＳＴＰ陽性スコアに基づき、配列同一性割合はＢＬＡＳＴＰ同一性スコアに基づく。ＢＬＡＳＴＰの「同一性」は、同一の高スコア配列対における総残基の数および割合を示す；およびＢＬＡＳＴＰの「陽性」は、整列スコアが正の値を有し、互いに類似している残基の数および割合を示す。これらの同一性または類似性の程度または本明細書に開示されるアミノ酸配列との類似性の任意の中程度の同一性を有するアミノ酸配列が企図され、この開示によって包含される。類似のポリペプチドのポリヌクレオチド配列は、遺伝コードを使用して推定され、従来の手段、特に遺伝子コードを使用してそのアミノ酸配列を逆翻訳することによって得ることができる。
【0083】
いくつかの実施形態では、陽イオン非依存性マンノース－６－リン酸受容体（ＣＩＭＰＲ）および細胞リソソームを標的とする優れた能力を有する組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ、ならびにインビボでの非生産的クリアランスを減少させるグリコシル化パターンが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を使用して産生できることを見出した。これらの細胞は、アルグルコシダーゼアルファなどの従来の組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ製品よりも、１つ以上のマンノース－６－リン酸残基を有する有意に高いレベルのＮ－グリカン単位を有する組換えヒト酸性α－グルコシダーゼを発現するように誘導し得る。これらの細胞によって産生される組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、例えばＡＴＢ２００によって例示されるように、ルミザイム（登録商標）などの従来の酸性α－グルコシダーゼよりも、有意に多くの筋肉細胞標的化マンノース－６－リン酸（Ｍ６Ｐ）およびビス－マンノース－６－リン酸Ｎ－グリカン残基を有する。理論に拘束されるものではないが、この広範なグリコシル化により、ＡＴＢ２００酵素がより効果的に標的細胞に取り込まれることができ、したがって、例えば、はるかに低いＭ６Ｐおよびビス－Ｍ６Ｐ含有量を有するアルグルコシダーゼアルファなど、他の組換えヒト酸性α－グルコシダーゼよりも効率的に循環から除去され得ると考えられる。ＡＴＢ２００は、ＣＩＭＰＲに効率的に結合し、骨格筋および心筋によって効率的に取り込まれ、好ましい薬物動態プロファイルを提供しインビボでの非生産的クリアランスを減少させるグリコシル化パターンを有することが示されている。
【0084】
ＡＴＢ２００の広範なグリコシル化は、例えば、アルグルコシダーゼアルファと比較して、ＡＴＢ２００の免疫原性の低下に寄与し得ることも企図される。当業者によって理解されるように、保存された哺乳動物糖によるタンパク質のグリコシル化は、一般に、生成物の溶解性を高め、生成物の凝集および免疫原性を減少させる。グリコシル化は、タンパク質の凝集を最小限にし、免疫系からタンパク質免疫原性エピトープを遮断することにより、タンパク質免疫原性を間接的に変化させる（Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ－Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ａｕｇｕｓｔ ２０１４）。したがって、少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与は、抗薬物抗体を誘導しない。少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与は、アルグルコシダーゼアルファの投与によって誘導される抗薬物抗体のレベルよりも対象における抗薬物抗体の発生率を低下させる。
【0085】
同時係属中の国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１５／０５３２５２号明細書に記載されるように、ＣＨＯ細胞などの細胞を使用して同文献に記載されるｒｈＧＡＡを生成することができ、このｒｈＧＡＡは、本発明で使用され得る。そのようなＣＨＯ細胞株の例は、ＧＡ－ＡＴＢ２００またはＡＴＢ２００－００１－Ｘ５－１４、またはそこに記載されるようなｒｈＧＡＡ組成物を産生するその継代培養物である。そのようなＣＨＯ細胞株は、ＧＡＡをコードする１ポリヌクレオチドにつき５、１０、１５、２０またはそれを超えるコピーなどの遺伝子の複数のコピーを含有し得る。
【0086】
ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡなどの高Ｍ６Ｐおよびビス－Ｍ６Ｐ ｒｈＧＡＡは、ＧＡＡをコードするＤＮＡ構築物でＣＨＯ細胞を形質転換する。ＣＨＯ細胞は以前にｒｈＧＡＡを作製するために使用されていたが、形質転換ＣＨＯ細胞は、ＣＩＭＰＲを標的とするＭ６Ｐおよびビス－Ｍ６Ｐグリカンの高い含有量を有するｒｈＧＡＡを産生するように培養および選択できたことは認められなかった。
【0087】
驚くべきことに、ＣＨＯ細胞株を形質転換し、ＣＩＭＰＲを標的化するＭ６Ｐまたはビス－Ｍ６Ｐを有するグリカンの高含有量を含有するｒｈＧＡＡを生成する形質転換体を選択し、この高Ｍ６Ｐ ｒｈＧＡＡを安定に発現させることが可能であることが見出された。したがって、これらのＣＨＯ細胞株を作製するための方法はまた、同時係属中の国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１５／０５３２５２号明細書に記載されている。この方法は、ＣＨＯ細胞をＧＡＡまたはＧＡＡ変異体をコードするＤＮＡで形質転換すること、ＧＡＡをコードするＤＮＡをその染色体に安定に組み込み、安定にＧＡＡを発現するＣＨＯ細胞を選択すること、およびＭ６Ｐまたはビス－Ｍ６Ｐを有するグリカンの高い含有量を有するＧＡＡを発現するＣＨＯ細胞を選択すること、および任意選択により、高いシアル酸含有量を有するおよび／または低い非リン酸化高マンノース含有量を有するＮ－グリカンを有するＣＨＯ細胞を選択することを含む。これらのＣＨＯ細胞株は、ＣＨＯ細胞株を培養し、前記組成物をＣＨＯ細胞の培養物から回収することにより、ｒｈＧＡＡおよびｒｈＧＡＡ組成物を生産するために使用され得る。
【0088】
１つ以上の実施形態において、ＡＴＢ２００は、約５～約５０ｍｇ／ｍＬの範囲の量で存在する。さらなる実施形態において、ＡＴＢ２００は、約５、８、１０または１２～約１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ｍｇ／ｍＬの範囲の量で存在する。いくつかの実施形態では、ＡＴＢ２００は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ｍｇ／ｍＬの量で存在する。さらなる実施形態において、ＡＴＢ２００は、約１５ｍｇ／ｍＬの量で存在する。
【0089】
ｐＨおよび緩衝剤
製剤のｐＨは、約５．０～約７．０または約５．０～約６．０の範囲であり得る。１つ以上の実施形態において、製剤のｐＨは約５．５～約６．０の範囲である。いくつかの実施形態において、製剤は、約５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９または６．０、６．１、６．２、６．３、６．４または６．５のｐＨを有する。一般に、列挙される成分の量により、約５．０～約６．０の範囲のｐＨを生じる。しかし、水酸化ナトリウムおよび／または塩酸などのｐＨ調整剤（すなわち、アルカリ化剤および酸性化剤）を使用することにより、ｐＨを目標ｐＨに調整することができる。
製剤のｐＨは、約５．０～約７．０または約５．０～約６．０の範囲であり得る。１つ以上の実施形態において、製剤のｐＨは約５．５～約６．０の範囲である。いくつかの実施形態において、製剤は、約５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９または６．０、６．１、６．２、６．３、６．４または６．５のｐＨを有する。一般に、列挙される成分の量により、約５．０～約６．０の範囲のｐＨを生じる。しかし、水酸化ナトリウムおよび／または塩酸などのｐＨ調整剤（すなわち、アルカリ化剤および酸性化剤）を使用することにより、ｐＨを目標ｐＨに調整することができる。
【0090】
製剤はまた、クエン酸塩、リン酸塩およびそれらの組み合わせからなる群から選択される緩衝剤を含む。本明細書中で使用される場合、「緩衝剤」とは、ｐＨの変化を防止するのに役立つ弱酸およびその共役塩基を含有する緩衝剤を指す。クエン酸塩および／またはリン酸塩は、クエン酸ナトリウムまたはリン酸ナトリウムであってもよい。他の塩には、カリウム塩およびアンモニウム塩が含まれる。１つ以上の実施形態において、緩衝剤はクエン酸塩を含む。さらなる実施形態において、緩衝剤は、クエン酸ナトリウム（例えば、クエン酸ナトリウム二水和物およびクエン酸一水和物の混合物）を含む。１つ以上の実施形態において、クエン酸塩を含む緩衝剤は、クエン酸ナトリウムおよびクエン酸を含み得る。いくつかの実施形態において、クエン酸塩およびリン酸塩緩衝剤の両方が存在する。
【0091】
賦形剤
製剤はまた、少なくとも１つの賦形剤を含む。本発明のいくつかの実施形態は、等張化剤を補助するか、増量剤として作用するか、または安定剤として作用する賦形剤を含む。１つ以上の実施形態において、少なくとも１つの賦形剤は、マンニトール、ポリソルベートおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
製剤はまた、少なくとも１つの賦形剤を含む。本発明のいくつかの実施形態は、等張化剤を補助するか、増量剤として作用するか、または安定剤として作用する賦形剤を含む。１つ以上の実施形態において、少なくとも１つの賦形剤は、マンニトール、ポリソルベートおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0092】
１つ以上の実施形態において、賦形剤は、等張化剤および／または増量剤として作用することができる成分、特にマンニトールを含む。等張化剤は、製剤がヒトの血液と類似または同等の浸透圧を有することを確実にするのに役立つ成分である。増量剤は、製剤（例えば、凍結乾燥されたもの）に質量を加え、ケーキに適切な構造を提供する成分である。
【0093】
１つ以上の実施形態において、等張化剤および／または増量剤の総量は、約１０～約５０ｍｇ／ｍＬの量の範囲である。さらなる実施形態では、等張化剤および／または増量剤の総量は、約１０、１１、１２、１３、１４または１５～約１６、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ｍｇ／ｍＬの量の範囲である。いくつかの実施形態において、等張化剤および／または増量剤は、マンニトールを含む。１つ以上の実施形態において、マンニトールは、約１０～約５０ｍｇ／ｍＬの量で存在する。さらなる実施形態において、マンニトールは、約１０、１１、１２、１３、１４または１５～約１６、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ｍｇ／ｍＬの量で存在する。またさらなる実施形態において、マンニトールは、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ｍｇ／ｍＬの量で存在する。いくつかの実施形態において、マンニトールは唯一の等張化剤および／または増量剤である。他の等張化剤および／または増量剤の例には、塩化ナトリウム、スクロースおよびトレハロースが含まれる。
【0094】
いくつかの実施形態において、賦形剤は、ポリソルベート８０などの安定剤を作用させることができる成分を含む。安定剤は、疎水性の空気－水界面での凝集体形成を防止または最小限に抑えることができる化合物である。いくつかの実施形態において、安定剤は界面活性剤である。１つ以上の実施形態において、安定剤の総量は、約０．１～約１．０ｍｇ／ｍＬの範囲である。さらなる実施形態において、安定剤の総量は、約０．１、０．２、０．３、０．４または０．５～約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１．０ｍｇ／ｍＬの範囲である。またさらなる実施形態において、安定剤の総量は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１．０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態において、ポリソルベート８０のみが安定剤である。したがって、１つ以上の実施形態において、ポリソルベート８０は、約０．１～約１．０ｍｇ／ｍＬの範囲である。さらなる実施形態において、ポリソルベート８０の総量は、約０．１、０．２、０．３、０．４または０．５～約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１．０ｍｇ／ｍＬの範囲である。またさらなる実施形態において、ポリソルベート８０の総量は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１．０ｍｇ／ｍＬである。
【0095】
１つ以上の実施形態において、特定の化合物を製剤から除外することが望ましい場合がある。例えば、所与の疾患の処置のための製剤を調製する場合、基礎疾患を悪化させる特定の化合物を排除することが望ましいであろう。上記のように、ポンペ病を有する個体は、グリコーゲンを分解する能力が低下しているか、または存在しない。スクロース、トレハロースおよびグリシンなどのいくつかの一般的に使用される賦形剤は、体内のグルコースに変換され得、これはポンペ病を悪化させる。したがって、いくつかの実施形態において、スクロース、トレハロースおよび／またはグリシンは、製剤から除外される。同様に、所与の特定の状況では製剤に最も適したものではない、特定の成分は排除してもよい。例えば、いくつかの実施形態において、ポロクサマーを排除し得る。
【0096】
例示的な実施形態
１つ以上の実施形態において、製剤は、
（ａ）ＡＴＢ２００（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現し、アルグルコシダーゼアルファの１つまたは２つのマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位の含有量と比較して、増加した含有量の１つまたは２つのマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位を含む、組換え酸性α－グルコシダーゼ）；
（ｂ）クエン酸塩、リン酸塩およびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの緩衝剤；
（ｃ）マンニトール、ポリソルベート８０、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの賦形剤
を含み、または、から本質的になり、製剤のｐＨは約５．０～約７．０である。
１つ以上の実施形態において、製剤は、
（ａ）ＡＴＢ２００（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現し、アルグルコシダーゼアルファの１つまたは２つのマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位の含有量と比較して、増加した含有量の１つまたは２つのマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位を含む、組換え酸性α－グルコシダーゼ）；
（ｂ）クエン酸塩、リン酸塩およびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの緩衝剤；
（ｃ）マンニトール、ポリソルベート８０、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの賦形剤
を含み、または、から本質的になり、製剤のｐＨは約５．０～約７．０である。
【0097】
いくつかの実施形態において、製剤は、
（ａ）ＡＴＢ２００（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現し、アルグルコシダーゼアルファの１つまたは２つのマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位の含有量と比較して、増加した含有量の１つまたは２つのマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位を含む、組換え酸性α－グルコシダーゼ）；
（ｂ１）クエン酸ナトリウム；
（ｂ２）クエン酸一水和物；
（ｃ１）マンニトール；
（ｃ２）ポリソルベート８０；
（ｄ）水；
（ｅ）任意選択により、酸性化剤；および
（ｆ）任意選択により、アルカリ化剤、
を含み、または、から本質的になり、製剤のｐＨは約５．０～約７．０である。さらなる実施形態において、製剤のｐＨは約５．５～約６．０の範囲である。またさらなる実施形態において、製剤のｐＨは約６．０である。
（ａ）ＡＴＢ２００（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現し、アルグルコシダーゼアルファの１つまたは２つのマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位の含有量と比較して、増加した含有量の１つまたは２つのマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位を含む、組換え酸性α－グルコシダーゼ）；
（ｂ１）クエン酸ナトリウム；
（ｂ２）クエン酸一水和物；
（ｃ１）マンニトール；
（ｃ２）ポリソルベート８０；
（ｄ）水；
（ｅ）任意選択により、酸性化剤；および
（ｆ）任意選択により、アルカリ化剤、
を含み、または、から本質的になり、製剤のｐＨは約５．０～約７．０である。さらなる実施形態において、製剤のｐＨは約５．５～約６．０の範囲である。またさらなる実施形態において、製剤のｐＨは約６．０である。
【0098】
特定の実施形態において、製剤は、
（ａ）約５～３０ｍｇ／ｍＬまたは約１５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、ＡＴＢ２００（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現し、アルグルコシダーゼアルファの１つまたは２つのマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位の含有量と比較して、増加した含有量の１つまたは２つのマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位を含む、組換え酸性α－グルコシダーゼ）；
（ｂ）約１０～１００ｍＭまたは約２５ｍＭの濃度で存在する、クエン酸ナトリウム緩衝剤；
（ｃ１）約１０～５０ｍｇ／ｍＬまたは約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、マンニトール；
（ｃ２）約０．１～１ｍｇ／ｍＬまたは約０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、ポリソルベート８０；および
（ｄ）水；
（ｅ）任意選択により、酸性化剤；および
（ｆ）任意選択により、アルカリ化剤、
を含み、製剤のｐＨは約５．０～約７．０である。さらなる実施形態において、製剤のｐＨは約５．５～約６．０の範囲である。またさらなる実施形態において、製剤のｐＨは約６．０である。
（ａ）約５～３０ｍｇ／ｍＬまたは約１５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、ＡＴＢ２００（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現し、アルグルコシダーゼアルファの１つまたは２つのマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位の含有量と比較して、増加した含有量の１つまたは２つのマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位を含む、組換え酸性α－グルコシダーゼ）；
（ｂ）約１０～１００ｍＭまたは約２５ｍＭの濃度で存在する、クエン酸ナトリウム緩衝剤；
（ｃ１）約１０～５０ｍｇ／ｍＬまたは約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、マンニトール；
（ｃ２）約０．１～１ｍｇ／ｍＬまたは約０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、ポリソルベート８０；および
（ｄ）水；
（ｅ）任意選択により、酸性化剤；および
（ｆ）任意選択により、アルカリ化剤、
を含み、製剤のｐＨは約５．０～約７．０である。さらなる実施形態において、製剤のｐＨは約５．５～約６．０の範囲である。またさらなる実施形態において、製剤のｐＨは約６．０である。
【0099】
製剤の調製
本発明の別の態様は、本明細書に記載の製剤を調製する方法に関する。１つ以上の実施形態において、製剤は酵素溶液から調製することができる。当技術分野で公知の方法を使用して、必要に応じて、この溶液を濃縮し、標的濃度および緩衝剤に緩衝剤交換してもよい。次いで、さらなる成分（例えば、賦形剤およびｐＨ調節剤）を添加してもよい。次いで、製剤をろ過し、貯蔵容器に入れて貯蔵することができる。
本発明の別の態様は、本明細書に記載の製剤を調製する方法に関する。１つ以上の実施形態において、製剤は酵素溶液から調製することができる。当技術分野で公知の方法を使用して、必要に応じて、この溶液を濃縮し、標的濃度および緩衝剤に緩衝剤交換してもよい。次いで、さらなる成分（例えば、賦形剤およびｐＨ調節剤）を添加してもよい。次いで、製剤をろ過し、貯蔵容器に入れて貯蔵することができる。
【0100】
１つ以上の実施形態において、本明細書に記載の任意の医薬製剤を調製する方法は、少なくとも１つの緩衝剤、少なくとも１つの賦形剤、および組換え酸性α－グルコシダーゼを水に加えて溶液を提供すること；任意選択により、前記溶液のｐＨを調整すること；および任意選択により、前記溶液にさらなる水を加えること、を含む。さらなる実施形態において、本方法は、溶液をろ過することをさらに含む。またさらなる実施形態では、本方法は、溶液を貯蔵することをさらに含む。
【0101】
本明細書に記載の製剤の製造のための例示的で非限定的なプロセスは以下の通りである：
１．適切な製造容器内で、バッチ容量の約８５～９０％の注射用水を添加する。
２．所望の賦形剤および緩衝剤（例えば、クエン酸ナトリウム二水和物、クエン酸一水和物、ポリソルベート８０、マンニトール）を加えて溶解し、溶解するまで混合する。
３．ＡＴＢ２００原薬を加えて混合する。
４．必要に応じて調節剤（例えば、塩酸または水酸化ナトリウム溶液）を用いてｐＨを目的のｐＨ（例えば、６±０．１）に調節する。
５．注射用に十分な水を加えて最終容量とし、混合する。
６．溶液を滅菌フィルターを通して滅菌レシーバにろ過する。
７．薬品溶液をバイアルに無菌的に充填し、ストッパーを挿入する。
８．すべてのバイアルをキャップし、２～８℃で貯蔵する。
１．適切な製造容器内で、バッチ容量の約８５～９０％の注射用水を添加する。
２．所望の賦形剤および緩衝剤（例えば、クエン酸ナトリウム二水和物、クエン酸一水和物、ポリソルベート８０、マンニトール）を加えて溶解し、溶解するまで混合する。
３．ＡＴＢ２００原薬を加えて混合する。
４．必要に応じて調節剤（例えば、塩酸または水酸化ナトリウム溶液）を用いてｐＨを目的のｐＨ（例えば、６±０．１）に調節する。
５．注射用に十分な水を加えて最終容量とし、混合する。
６．溶液を滅菌フィルターを通して滅菌レシーバにろ過する。
７．薬品溶液をバイアルに無菌的に充填し、ストッパーを挿入する。
８．すべてのバイアルをキャップし、２～８℃で貯蔵する。
【0102】
１つ以上の実施形態において、調製した状態での製剤は液体形態である。すなわち、製剤は水を含む。この液体製剤は、ケーキまたは粉末を提供するために凍結乾燥（フリーズドライ）プロセスを受けてもよい。したがって、本発明の別の態様は、凍結乾燥後の上記の製剤のいずれかを含む医薬組成物に関する。凍結乾燥した混合物は、ＡＴＢ２００、クエン酸塩、リン酸塩およびそれらの組み合わせからなる群から選択される緩衝剤、ならびにトレハロース、マンニトール、ポリソルベート８０、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの賦形剤を含み得る。いくつかの実施形態において、他の成分（例えば、他の賦形剤）を凍結乾燥混合物に添加してもよい。凍結乾燥した製剤を含む医薬組成物は、バイアルで提供してもよく、次いで、貯蔵、輸送、再構成および／または患者に投与することができる。
【0103】
患者への処置および投与方法
本発明の別の態様は、ポンペ病の処置方法および／またはポンペ病の処置のための本明細書に記載の製剤の使用に関する。製剤は、調製した状態で、または凍結乾燥および再構成の後に投与することができる。したがって、１つ以上の実施形態において、本方法は、上記の医薬製剤のいずれかを、それを必要とする患者へ投与することを含む。他の実施形態において、本方法は、凍結乾燥した医薬組成物を再構成すること、および再構成された医薬組成物を、それを必要とする患者に投与すること、を含む。いくつかの実施形態において、再構成された医薬組成物は、凍結乾燥の前および／または調製した状態での医薬製剤と類似または同一の構成を有する。いずれの場合でも、医薬製剤または再構成された医薬組成物は、患者への投与前に希釈されてもよい。さらなる実施形態において、医薬製剤または再構成された医薬組成物は、静脈内投与される。
本発明の別の態様は、ポンペ病の処置方法および／またはポンペ病の処置のための本明細書に記載の製剤の使用に関する。製剤は、調製した状態で、または凍結乾燥および再構成の後に投与することができる。したがって、１つ以上の実施形態において、本方法は、上記の医薬製剤のいずれかを、それを必要とする患者へ投与することを含む。他の実施形態において、本方法は、凍結乾燥した医薬組成物を再構成すること、および再構成された医薬組成物を、それを必要とする患者に投与すること、を含む。いくつかの実施形態において、再構成された医薬組成物は、凍結乾燥の前および／または調製した状態での医薬製剤と類似または同一の構成を有する。いずれの場合でも、医薬製剤または再構成された医薬組成物は、患者への投与前に希釈されてもよい。さらなる実施形態において、医薬製剤または再構成された医薬組成物は、静脈内投与される。
【0104】
１つ以上の実施形態において、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要に応じて、組成物はまた、可溶化剤、および注射部位において痛みを和らげるための局所麻酔剤を含み得る。一般に、成分は、別個に供給されるか、または単位剤形中で一緒に混合されて、例えば、または活性物質の量を示すアンプルまたはサシェなどの密閉容器中の凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として供給される。組成物が注入によって投与される場合、医薬グレードの滅菌水、生理食塩水またはデキストロース／水を含有する注入ボトルで分注し得る。組成物が注射によって投与される場合、投与前に成分が混合され得るように、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。
【0105】
他の実施形態において、医薬製剤または再構成された医薬組成物は、心臓もしくは骨格筋（例えば、筋肉内）または神経系（例えば、脳への直接注射；脳室内；髄腔内）などの標的組織への直接投与によって投与される。必要に応じて、複数の経路を同時に使用できる。
【0106】
医薬製剤または再構成された組成物は、治療有効量（例えば、定期的に投与された場合、疾患に関連する症状を改善すること、疾患の発症を予防または遅延させること、および／または疾患の症状の重症度または頻度を軽減することなどにより、疾患を処置するのに十分な投与量）で投与される。疾患の処置における治療上有効量は、性質および疾患の影響の程度に依存し、標準的な臨床技術によって決定し得る。さらに、インビトロアッセイまたはインビボアッセイを、任意選択により、最適な投与量範囲の同定を促進するために使用し得る。少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、約１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約５ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇ、典型的には約５ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内注入によって投与される。少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇまたは約１００ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内注入によって投与される。少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、約２０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内注入によって投与される。少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、約２０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内注入によって投与される。特定の個体の有効用量は、個体の必要性に応じて、経時的に変化させる（例えば、増加または減少させる）ことができる。例えば、身体疾患もしくはストレスを有する時、または抗酸性α－グルコシダーゼ抗体が存在するようになったかもしくは増加する場合、または疾患の症状が悪化する場合、その量を増加することができる。
【0107】
組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ（または組換えヒト酸性α－グルコシダーゼを含有する組成物または医薬）の治療有効量は、性質および疾患の影響の程度に依存して定期的に、および継続的に投与される。本明細書で使用される場合、「定期的」な投与は、治療有効量が周期的に投与されることを示す（１回投与とは区別される）。間隔は、標準的な臨床技術によって決定することができる。好ましい実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは毎月、隔月；毎週；毎週２回；または毎日投与される。単一の個体に対する投与間隔は、一定間隔である必要はなく、個体の必要性に応じて、経時的に変化させることができる。例えば、身体疾患もしくはストレスを有する時、抗組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ抗体が存在するようになったかもしくは増加する場合、または疾患の症状が悪化する場合、投与の間隔を減少させることができる。
【0108】
１つ以上の実施形態において、医薬製剤または再構成された組成物は、シャペロンの経口投与および医薬製剤または再構成された組成物の静脈内投与などの薬理学的シャペロンと共投与される。様々な実施形態において、薬理学的シャペロンはミグルスタットである。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、約２００～約４００ｍｇの経口用量で、または約２００ｍｇ、約２５０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３５０ｍｇもしくは約４００ｍｇの経口用量で投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、約２３３ｍｇ～約４００ｍｇの経口用量で投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、約２５０～約２７０ｍｇの経口用量で、または約２５０ｍｇ、約２５５ｍｇ、約２６０ｍｇ、約２６５ｍｇもしくは約２７０ｍｇの経口用量で投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、約２６０ｍｇの経口用量として投与される。
【0109】
少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットおよび組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、同時に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットおよび組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、連続的に投与される。少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与前にミグルスタットを投与する。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与前３時間以内に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与の約２時間前に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与前の２時間以内に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与の約１．５時間前に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与の約１時間前に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与の約５０分～約７０分前に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与の約５５分～約６５分前に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与の約３０分前に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与の約２５分～約３５分前に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与の約２７分～約３３分前に投与される。
【0110】
キット
本発明の別の態様は、本明細書に記載の医薬製剤（凍結乾燥後を含む）を含むキットに関する。１つ以上の実施形態において、キットは、（凍結乾燥の前または後の）医薬製剤を含む容器（例えば、バイアル、チューブ、バッグなど）および再構成、希釈および投与のための説明書を含む。
本発明の別の態様は、本明細書に記載の医薬製剤（凍結乾燥後を含む）を含むキットに関する。１つ以上の実施形態において、キットは、（凍結乾燥の前または後の）医薬製剤を含む容器（例えば、バイアル、チューブ、バッグなど）および再構成、希釈および投与のための説明書を含む。
【実施例】
【0111】
酵素例１：既存のマイオザイム（登録商標）およびルミザイム（登録商標）のｒｈＧＡＡ製品の限界
現在承認されている唯一のポンペ病処置薬であるマイオザイム（登録商標）およびルミザイム（登録商標）におけるｒｈＧＡＡの能力を評価するために、これらのｒｈＧＡＡ調製物を（Ｍ６Ｐ基を有するｒｈＧＡＡに結合する）ＣＩＭＰＲカラムに注入し、続いて遊離Ｍ６勾配で溶出した。画分を９６ウェルプレートに集め、ＧＡＡ活性を４ＭＵ－α－グルコース基質によってアッセイした。結合および未結合ｒｈＧＡＡの相対量をＧＡＡ活性に基づいて決定し、全酵素の割合として報告した。
現在承認されている唯一のポンペ病処置薬であるマイオザイム（登録商標）およびルミザイム（登録商標）におけるｒｈＧＡＡの能力を評価するために、これらのｒｈＧＡＡ調製物を（Ｍ６Ｐ基を有するｒｈＧＡＡに結合する）ＣＩＭＰＲカラムに注入し、続いて遊離Ｍ６勾配で溶出した。画分を９６ウェルプレートに集め、ＧＡＡ活性を４ＭＵ－α－グルコース基質によってアッセイした。結合および未結合ｒｈＧＡＡの相対量をＧＡＡ活性に基づいて決定し、全酵素の割合として報告した。
【0112】
図３Ａ～Ｂは、従来のＥＲＴ（マイオザイム（登録商標）およびルミザイム（登録商標））に関連する問題を示す：マイオザイム（登録商標）のｒｈＧＡＡの７３％（図３Ｂ）およびルミザイム（登録商標）のｒｈＧＡＡの７８％（図３Ａ）は、ＣＩＭＰＲに結合しなかった（各図の一番左のピークを参照）。マイオザイム（登録商標）のｒｈＧＡＡの２７％およびルミザイム（登録商標）のｒｈＧＡＡの２２％のみが、筋肉細胞上のＣＩＭＰＲに標的化し得るＭ６Ｐを含んでいた。
【0113】
マイオザイム（登録商標）およびルミザイム（登録商標）の有効用量は、筋肉細胞上のＣＩＭＰＲを標的とするＭ６Ｐを含有するｒｈＧＡＡの量に対応する。しかしながら、これら２つの従来製品におけるｒｈＧＡＡの大部分は、標的筋肉細胞上のＣＩＭＰＲ受容体を標的としない。ｒｈＧＡＡの大部分が筋肉細胞に標的化されていない従来のｒｈＧＡＡの投与は、非標的化ｒｈＧＡＡに対するアレルギー反応または免疫誘導のリスクを増加させる。
【0114】
酵素例２：高含有量のモノ－またはビス－Ｍ６Ｐ含有Ｎ－グリカンを有するＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡを産生するＣＨＯ細胞の調製
ＣＨＯ細胞を、ｒｈＧＡＡを発現するＤＮＡでトランスフェクトし、続いてｒｈＧＡＡを産生する形質転換体を選択した。ｒｈＧＡＡをコードするＤＮＡでＣＨＯ細胞を形質転換するためのＤＮＡ構築物を図４に示す。ＣＨＯ細胞を、ｒｈＧＡＡを発現するＤＮＡでトランスフェクトし、続いてｒｈＧＡＡを産生する形質転換体を選択した。
ＣＨＯ細胞を、ｒｈＧＡＡを発現するＤＮＡでトランスフェクトし、続いてｒｈＧＡＡを産生する形質転換体を選択した。ｒｈＧＡＡをコードするＤＮＡでＣＨＯ細胞を形質転換するためのＤＮＡ構築物を図４に示す。ＣＨＯ細胞を、ｒｈＧＡＡを発現するＤＮＡでトランスフェクトし、続いてｒｈＧＡＡを産生する形質転換体を選択した。
【0115】
トランスフェクション後、安定的に組み込まれたＧＡＡ遺伝子を含むＤＧ４４ ＣＨＯ（ＤＨＦＲ－）細胞をヒポキサンチン／チミジン欠損（－ＨＴ）培地で選択した。
【0116】
これらの細胞におけるＧＡＡ発現の増幅は、メトトレキサート処理（ＭＴＸ、５００ｎＭ）によって誘導された。大量のＧＡＡを発現する細胞プールはＧＡＡ酵素活性アッセイによって同定され、ｒｈＧＡＡを産生する個々のクローンを確立するために使用された。個々のクローンを半固体培地プレート上で生成し、ＣｌｏｎｅＰｉｘシステムにより採取し、２４ディープウェルプレートに移した。個々のクローンをＧＡＡ酵素活性についてアッセイして、高レベルのＧＡＡを発現するクローンを同定した。ＧＡＡ活性を決定するための条件培地は、４－ＭＵ－α－グルコシダーゼ基質を用いた。ＧＡＡ酵素アッセイによって測定される、より高レベルのＧＡＡを産生するクローンを生存能力、成長能力、ＧＡＡ生産性、Ｎ－グリカン構造および安定なタンパク質発現についてさらに評価した。強化されたモノ－Ｍ６Ｐまたはビス－Ｍ６Ｐ Ｎ－グリカンを有するｒｈＧＡＡを発現するＣＨＯ細胞株ＧＡ－ＡＴＢ－２００を含むＣＨＯ細胞株を、この手順を用いて単離した。
【0117】
酵素例３：ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡの捕捉および精製
本発明によるｒｈＧＡＡの複数のバッチを、ＣＨＯ細胞株ＧＡ－ＡＴＢ－２００を用いて振盪フラスコおよび灌流バイオリアクタで産生し、ＣＩＭＰＲ結合を測定した。異なる産生バッチからの精製ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡについて、図５Ｂおよび図６に示されるものと同様のＣＩＭＰＲ受容体結合（約７０％）が観察され、これはＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡが一貫して産生され得ることを示す。図３Ａ～Ｂおよび５Ａ～Ｂに示されるように、マイオザイム（登録商標）およびルミザイム（登録商標）ｒｈＧＡＡは、ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡよりも有意に低いＣＩＭＰＲ結合を示した。
本発明によるｒｈＧＡＡの複数のバッチを、ＣＨＯ細胞株ＧＡ－ＡＴＢ－２００を用いて振盪フラスコおよび灌流バイオリアクタで産生し、ＣＩＭＰＲ結合を測定した。異なる産生バッチからの精製ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡについて、図５Ｂおよび図６に示されるものと同様のＣＩＭＰＲ受容体結合（約７０％）が観察され、これはＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡが一貫して産生され得ることを示す。図３Ａ～Ｂおよび５Ａ～Ｂに示されるように、マイオザイム（登録商標）およびルミザイム（登録商標）ｒｈＧＡＡは、ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡよりも有意に低いＣＩＭＰＲ結合を示した。
【0118】
酵素例４：ルミザイム（登録商標）に対するＡＴＢ２００の分析比較
弱いアニオン交換（「ＷＡＸ」）液体クロマトグラフィーを使用して、末端リン酸によりＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡを分画した。溶出プロファイルは、増加する量の塩でＥＲＴを溶出することによって生成された。プロファイルをＵＶ（Ａ２８０ｎｍ）でモニターした。ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡをＣＨＯ細胞から得て精製した。ルミザイム（登録商標）は商業的供給源から入手した。ルミザイム（登録商標）は、その溶出プロファイルの左側に高いピークを示した。ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡは、ルミザイム（登録商標）の右側に溶出する４つの顕著なピークを示した（図７）。これにより、この評価がＣＩＭＰＲ親和性ではなく末端電荷によるものであるため、ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡがルミザイム（登録商標）よりも大幅にリン酸化されたことを確認される。
弱いアニオン交換（「ＷＡＸ」）液体クロマトグラフィーを使用して、末端リン酸によりＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡを分画した。溶出プロファイルは、増加する量の塩でＥＲＴを溶出することによって生成された。プロファイルをＵＶ（Ａ２８０ｎｍ）でモニターした。ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡをＣＨＯ細胞から得て精製した。ルミザイム（登録商標）は商業的供給源から入手した。ルミザイム（登録商標）は、その溶出プロファイルの左側に高いピークを示した。ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡは、ルミザイム（登録商標）の右側に溶出する４つの顕著なピークを示した（図７）。これにより、この評価がＣＩＭＰＲ親和性ではなく末端電荷によるものであるため、ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡがルミザイム（登録商標）よりも大幅にリン酸化されたことを確認される。
【0119】
酵素例５：ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡのオリゴ糖特性
精製したＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡおよびルミザイム（登録商標）グリカンをＭＡＬＤＩ－ＴＯＦで評価し、各ＥＲＴ上に見出される個々のグリカン構造を決定した（図８）。ＡＴＢ２００試料は、ルミザイム（登録商標）より少ない量の非リン酸化高マンノース型Ｎ－グリカンを含有することが判明した。ルミザイム（登録商標）よりもＡＴＢ２００のＭ６Ｐグリカンの含有量が高いほど、ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡが筋肉細胞をより効果的に標的とする。ＭＡＬＤＩによって決定されるモノ－リン酸化およびビス－リン酸化構造の高いパーセンテージは、ＣＩＭＰＲ受容体へのＡＴＢ２００の結合が有意に大きいことを示したＣＩＭＰＲプロファイルと一致する。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析によるＮ－グリカン分析は、平均して各ＡＴＢ２００分子が少なくとも１つの天然ビス－Ｍ６Ｐ Ｎ－グリカン構造を含有することを確認した。ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡ上の、このビス－Ｍ６Ｐ Ｎ－グリカンのより高い含有量は、Ｍ６Ｐ受容体プレート結合アッセイ（ＫＤ約２～４ｎＭ）においてＣＩＭＰＲへの高親和性結合と直接相関していた、図１０Ａ。
精製したＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡおよびルミザイム（登録商標）グリカンをＭＡＬＤＩ－ＴＯＦで評価し、各ＥＲＴ上に見出される個々のグリカン構造を決定した（図８）。ＡＴＢ２００試料は、ルミザイム（登録商標）より少ない量の非リン酸化高マンノース型Ｎ－グリカンを含有することが判明した。ルミザイム（登録商標）よりもＡＴＢ２００のＭ６Ｐグリカンの含有量が高いほど、ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡが筋肉細胞をより効果的に標的とする。ＭＡＬＤＩによって決定されるモノ－リン酸化およびビス－リン酸化構造の高いパーセンテージは、ＣＩＭＰＲ受容体へのＡＴＢ２００の結合が有意に大きいことを示したＣＩＭＰＲプロファイルと一致する。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析によるＮ－グリカン分析は、平均して各ＡＴＢ２００分子が少なくとも１つの天然ビス－Ｍ６Ｐ Ｎ－グリカン構造を含有することを確認した。ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡ上の、このビス－Ｍ６Ｐ Ｎ－グリカンのより高い含有量は、Ｍ６Ｐ受容体プレート結合アッセイ（ＫＤ約２～４ｎＭ）においてＣＩＭＰＲへの高親和性結合と直接相関していた、図１０Ａ。
【0120】
ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡも、２つの異なるＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析技術を用いて部位特異的Ｎ－グリカンプロファイルについて分析した。第１の分析では、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析前にタンパク質を変性させ、還元し、アルキル化し、消化した。タンパク質の変性および還元中、２００μｇのタンパク質試料、５μｌの１モル／Ｌトリス－ＨＣｌ（最終濃度５０ｍＭ）、７５μＬの８モル／ＬグアニジンＨＣｌ（最終濃度６Ｍ）、１μＬの０．５モル／Ｌ ＥＤＴＡ（最終濃度５ｍＭ）、２μＬの１モル／Ｌ ＤＴＴ（最終濃度２０ｍＭ）およびＭｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）水を１．５ｍＬチューブに添加して、１００μＬの全容量を提供した。試料を混合し、乾燥浴中において５６℃で３０分間インキュベートした。アルキル化中、変性および還元タンパク質試料を５μＬの１モル／Ｌヨードアセトアミド（ＩＡＭ、最終濃度５０ｍＭ）と混合し、次いで暗所で３０分間インキュベートした。アルキル化後、４００μＬの予冷されたアセトンを試料に加え、混合物を－８０℃で４時間凍結させた。次いで、試料を４℃、１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去した。予冷されたアセトン４００μｌをペレットに添加し、次いでこれを４℃、１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去した。試料を暗所にて氷上で風乾し、アセトン残留物を除去した。４０μＬの８Ｍ尿素および１６０μＬの１００μＭＮＨ４ＨＣＯ３を試料に添加して、タンパク質を溶解させた。トリプシン消化中、５０μｇのタンパク質をトリプシン消化緩衝液と添加して最終容積１００μｌとし、５μＬの０．５μｇ／ｍＬトリプシン（タンパク質対酵素比２０／１ｗ／ｗ）を添加した。溶液をよく混合し、３７℃で一晩（１６±２時間）インキュベートした。２．５μｌの２０％ＴＦＡ（最終濃度０．５％）を加えて反応を停止させた。次に、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓ Ｐｒｏ（商標）質量分析計を用いて試料を分析した。
【0121】
第２のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析では、ＩＡＭの代わりにアルキル化試薬としてヨード酢酸（ＩＡＡ）を用いた以外、同様の変性、還元、アルキル化および消化手順に従ってＡＴＢ２００試料を調製し、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ Ｔｒｉｂｉｄ（商標）質量分析計を用いて分析した。
【0122】
第１および第２の分析の結果を図９Ａ～９Ｈに示す。図９Ａ～９Ｈにおいて、第１の分析の結果は左のバー（濃い灰色）で表され、第２の分析の結果は右のバー（薄い灰色）で表される。図９Ｂ～９Ｇにおいて、グリカンの記号命名法はＶａｒｋｉ，Ａ．，Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｒ．Ｄ．，Ｅｓｋｏ Ｊ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（２００９）に従う。
【0123】
図９Ａ～９Ｇから分かるように、２つの分析は同様の結果を示したが、その結果の間にはある程度の差異があった。この変化は、使用機器およびＮ－グリカン分析の完全性を含む多くの要因に起因し得る。例えば、リン酸化されたグリカンのいくつかの種が同定されていないか、および／または定量化されていない場合、リン酸化されたグリカンの総数は過小評価される可能性があり、その部位でリン酸化されたグリカンを有するｒｈＧＡＡのパーセンテージは、過小評価される可能性がある。別の例として、非リン酸化グリカンのいくつかの種が同定されていないか、および／または定量化されていない場合、非リン酸化グリカンの総数は過大評価される可能性があり、その部位でリン酸化されたグリカンを有するｒｈＧＡＡのパーセンテージは、過大評価される可能性がある。図９Ａは、ＡＴＢ２００のＮ－グリコシル化部位占有率を示す。図９Ａから分かるように、第１、第２、第３、第４、第５および第６のＮ－グリコシル化部位は、それぞれの潜在的部位で検出されたグリカンを有するＡＴＢ２００酵素の９０％超および最大約１００％を検出する両分析により、大部分が占有される。しかしながら、第７の潜在的Ｎ－グリコシル化部位は、約半分の時間でグリコシル化される。
【0124】
図９Ｂは、第１の部位であるＮ８４のＮ－グリコシル化プロファイルを示す。図９Ｂから分かるように、主要なグリカン種はビス－Ｍ６Ｐグリカンである。第１および第２の分析の両方で、ＡＴＢ２００の７５％以上が第１の部位にビス－Ｍ６Ｐグリカンを有していたことが検出された。
【0125】
図９Ｃは、第２の部位であるＮ１７７のＮ－グリコシル化プロファイルを示す。図９Ｃから分かるように、主要なグリカン種は、モノ－Ｍ６Ｐグリカンおよび非リン酸化高マンノースグリカンである。第１および第２の分析の両方で、ＡＴＢ２００の４０％以上が第２の部位にモノ－Ｍ６Ｐグリカンを有していたことが検出された。
【0126】
図９Ｄは、第３の部位であるＮ３３４のＮ－グリコシル化プロファイルを示す。図９Ｄから分かるように、主要なグリカン種は、非リン酸化高マンノースグリカン、ジ－、トリ－、およびテトラ－アンテナリ複合グリカン、ならびにハイブリッドグリカンである。第１および第２の分析の両方で、ＡＴＢ２００の２０％以上が第３の部位にシアル酸残基を有していたことが検出された。
【0127】
図９Ｅは、第４の部位であるＮ４１４のＮ－グリコシル化プロファイルを示す。図９Ｅから分かるように、主要なグリカン種はビス－Ｍ６Ｐおよびモノ－ＭＧＰグリカンである。第１および第２の分析の両方で、ＡＴＢ２００の４０％以上が第４の部位にビス－Ｍ６Ｐグリカンを有していたことが検出された。第１および第２の分析の両方で、ＡＴＢ２００の２５％以上が第４の部位にモノ－Ｍ６Ｐグリカンを有していたことも検出された。
【0128】
図９Ｆは、第５の部位であるＮ５９６のＮ－グリコシル化プロファイルを示す。図９Ｆから分かるように、主要なグリカン種は、フコシル化されたジ－アンテナリ複合グリカンである。第１および第２の分析の両方で、ＡＴＢ２００の７０％以上が第５の部位にシアル酸残基を有していたことが検出された。
【0129】
図９Ｇは、第６の部位であるＮ８２６のＮ－グリコシル化プロファイルを示す。図９Ｆから分かるように、主要なグリカン種は、ジ－、トリ－、およびテトラ－アンテナリ複合グリカンである。第１および第２の分析の両方で、ＡＴＢ２００の８０％以上が第６の部位にシアル酸残基を有していたことが検出された。
【0130】
第７の部位であるＮ８６９のグリコシル化の分析は、最も一般的なグリカンがＡ４Ｓ３Ｓ３ＧＦ（１２％）、Ａ５Ｓ３Ｇ２Ｆ（１０％）、Ａ４Ｓ２Ｇ２Ｆ（８％）およびＡ６Ｓ３Ｇ３Ｆ（８％）である、約４０％のグリコシル化を示した。
【0131】
図９Ｈは、７つの潜在的Ｎ－グリコシル化部位のそれぞれにおけるリン酸化の概要を示す。図９Ｇから分かるように、第１および第２の分析の両方で、第１、第２および第４の部位における高いリン酸化レベルが検出された。両方の分析は、ＡＴＢ２００の８０％以上が第１の部位でモノ－またはジ－リン酸化されていたこと、ＡＴＢ２００の４０％以上が第２の部位でモノ－リン酸化されていたこと、およびＡＴＢ２００の８０％以上が第４の部位でモノ－またはジ－リン酸化されていたことを検出した。
【0132】
親水性相互作用液体クロマトグラフィー－蛍光検出－質量分析（ＨＩＬＩＣ－ＦＬＤ－ＭＳ）法に従って、ＡＴＢ２００の別のグリカン分析を行った。
【0133】
ＨＩＬＩＣ－ＦＬＤ－ＭＳ分析の結果を以下の表Ａに示す。表Ａにおいて、３桁の数字の最初の数字はグリカンの枝の数を示し、２番目の数字はコアフコース単位の数を示し、３番目の数字は末端シアル酸単位の数を示す。この命名法を用いて、「３０３」は０個のコアフコース（２番目の０）および３つの末端シアル酸（最後の３）を有する３分岐型グリカン（最初の３）を表し、「２１２」は１つのコアフコースおよび２つの末端シアル酸を有する２分岐型グリカンを表し、「４０４」は０個のコアフコースおよび４つの末端シアル酸を含む４分岐型グリカンを表す、などである。
【0134】
【0135】
【0136】
【0137】
このＨＩＬＩＣ－ＦＬＤ－ＭＳ分析に基づいて、試験したＡＴＢ２００は、モルＡＴＢ２００当たり２～３モルの平均フコース含量、モルＡＴＢ２００当たり２０～２５モルのＧｌｃＮＡｃ含量、モルＡＴＢ２００当たり８～１２モルのガラクトース含量、モルＡＴＢ２００当たり２２～２７モルのマンノース含量、モルＡＴＢ２００当たり３～５モルのＭ６Ｐ含有量、およびモルＡＴＢ２００当たり４～７モルのシアル酸含有量を有することが期待される。
【0138】
酵素例６：ＡＴＢ２００のＣＩＭＰＲ親和性特性
ＣＩＭＰＲに結合し得るｒｈＧＡＡの割合がより高いことに加え、その相互作用の質を理解することが重要である。ルミザイム（登録商標）およびＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡ受容体結合を、ＣＩＭＰＲプレート結合アッセイを用いて測定した。簡潔には、ＣＩＭＰＲ被覆プレートを用いてＧＡＡを捕捉した。様々な濃度のｒｈＧＡＡを、固定化した受容体に適用し、未結合ｒｈＧＡＡを洗い流した。残りのｒｈＧＡＡ量は、ＧＡＡ活性によって決定された。図１０Ａに示すように、ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡは、ルミザイム（登録商標）より有意に良好に、ＣＩＭＰＲに結合した。
ＣＩＭＰＲに結合し得るｒｈＧＡＡの割合がより高いことに加え、その相互作用の質を理解することが重要である。ルミザイム（登録商標）およびＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡ受容体結合を、ＣＩＭＰＲプレート結合アッセイを用いて測定した。簡潔には、ＣＩＭＰＲ被覆プレートを用いてＧＡＡを捕捉した。様々な濃度のｒｈＧＡＡを、固定化した受容体に適用し、未結合ｒｈＧＡＡを洗い流した。残りのｒｈＧＡＡ量は、ＧＡＡ活性によって決定された。図１０Ａに示すように、ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡは、ルミザイム（登録商標）より有意に良好に、ＣＩＭＰＲに結合した。
【0139】
図１０Ｂは、ルミザイム（登録商標）、従来のｒｈＧＡＡ、および本発明によるＡＴＢ２００におけるビス－Ｍ６Ｐグリカンの相対含有量を示す。ルミザイム（ルミザイム）（登録商標）では、平均して１０％の分子のみがビス－リン酸化グリカンを有する。これを、平均して全てのｒｈＧＡＡ分子が少なくとも１つのビス－リン酸化グリカンを有するＡＴＢ２００と対比する。
【0140】
酵素例７：ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡは、ルミザイム（登録商標）よりも線維芽細胞により効率的に内在化された
ＡＴＢ２００およびルミザイム（登録商標）ｒｈＧＡＡの相対的な細胞取り込みを、正常およびポンペ（Ｐｏｍｐｅ）線維芽細胞系を用いて比較した。比較は、本発明による５～１００ｎＭのＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡと１０～５００ｎＭの従来のｒｈＧＡＡルミザイム（登録商標）との比較を含んでいた。１６時間のインキュベーション後、外部ｒｈＧＡＡをＴＲＩＳ塩基で不活性化し、細胞を収集前にＰＢＳで３回洗浄した。内在化ＧＡＡは、４ＭＵ－α－グルコシド加水分解によって測定され、総細胞タンパク質に対してグラフ化され、その結果は図１１Ａ～Ｂに表される。
ＡＴＢ２００およびルミザイム（登録商標）ｒｈＧＡＡの相対的な細胞取り込みを、正常およびポンペ（Ｐｏｍｐｅ）線維芽細胞系を用いて比較した。比較は、本発明による５～１００ｎＭのＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡと１０～５００ｎＭの従来のｒｈＧＡＡルミザイム（登録商標）との比較を含んでいた。１６時間のインキュベーション後、外部ｒｈＧＡＡをＴＲＩＳ塩基で不活性化し、細胞を収集前にＰＢＳで３回洗浄した。内在化ＧＡＡは、４ＭＵ－α－グルコシド加水分解によって測定され、総細胞タンパク質に対してグラフ化され、その結果は図１１Ａ～Ｂに表される。
【0141】
ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡはまた、それぞれ効率的に細胞内に内在化することが示され（図１１Ａおよび１１Ｂ）、ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡ正常およびポンペ線維芽細胞の両方に内在化し、従来のルミザイム（登録商標）ｒｈＧＡＡよりも高度に内在化していること示す。ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡは、約２０ｎＭで細胞受容体を飽和させる一方、ルミザイム（登録商標）は約２５０ｎＭ必要である。これらの結果から外挿される取り込み効率定数（Ｋ取り込み）は、図１１Ｃに示すように、ＡＴＢ２００では２～３ｎｍであり、ルミザイム（登録商標）では５６ｎＭである。これらの結果は、ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡがポンペ病によく標的化された処置であることを示唆している。
【0142】
酵素例８：Ｇａａノックアウトマウスにおけるグリコーゲン還元
図１２Ａ～１２Ｃは、アルグルコシダーゼアルファ（ルミザイム（登録商標））およびＡＴＢ２００の、Ｇａａノックアウトマウスにおける投与の効果を示す。動物は２回のＩＶボーラス投与（隔週）を受けた。最終投与の２週間後に組織を収集し、酸性α－グルコシダーゼ活性およびグリコーゲン含有量について分析した。
図１２Ａ～１２Ｃは、アルグルコシダーゼアルファ（ルミザイム（登録商標））およびＡＴＢ２００の、Ｇａａノックアウトマウスにおける投与の効果を示す。動物は２回のＩＶボーラス投与（隔週）を受けた。最終投与の２週間後に組織を収集し、酸性α－グルコシダーゼ活性およびグリコーゲン含有量について分析した。
【0143】
図１２Ａ～１２Ｃから分かるように、ＡＴＢ２００は、酸性α－グルコシダーゼ（Ｇａａ）ノックアウトマウスの組織グリコーゲンを用量依存的に激減させることが判明した。２０ｍｇ／ｋｇ用量のＡＴＢ２００は、Ｇａａノックアウトマウスにおいて、５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ用量レベルよりも大きい割合で貯蔵グリコーゲンを一貫して除去した。しかしながら、図１２Ａ～１２Ｃに見られるように、５ｍｇ／ｋｇで投与されたＡＴＢ２００は、マウス心臓および骨格筋（四頭筋および三頭筋）におけるグリコーゲンの、２０ｍｇ／ｋｇで投与されたルミザイム（登録商標）と同様の減少を示した一方、１０および２０ｍｇ／ｋｇで投与されたＡＴＢ２００は、ルミザイム（登録商標）よりも骨格筋におけるグリコーゲンレベルの著しく良好な低下を示した。
【0144】
図１５は、アルグルコシダーゼアルファ（ルミザイム（登録商標））およびＡＴＢ２００の、Ｇａａノックアウトマウスにおける投与の効果を示す。１２週齢のＧＡＡ ＫＯマウスを、Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）またはＡＴＢ２００、２０ｍｇ／ｋｇ ＩＶで４週間おきに注射した。グリコーゲン測定の最後の酵素用量の１４日後に組織を収集した。図１３は、四頭筋および三頭筋骨格筋におけるグリコーゲンの相対的減少を示し、ＡＴＢ２００は、ルミザイム（登録商標）よりも大きいグリコーゲンの減少を生じる。
【0145】
酵素例９：Ｇａａノックアウトマウスにおける筋肉生理学および形態学
Ｇａａノックアウトマウスに隔週で２０ｍｇ／ｋｇの組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ（アルグルコシダーゼアルファまたはＡＴＢ２００）の２回のＩＶボーラス投与を与えた。コントロールマウスは、溶媒のみで処置した。ヒラメ筋、四頭筋および隔膜組織は、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの最後の投与の２週間後に収集される。ヒラメ筋および隔膜組織は、グリコーゲンレベルについて過ヨウ素酸シッフ試薬（ＰＡＳ）で染色することにより、およびリソソーム増殖についてポンペ病においてアップレギュレートされたリソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ１）マーカーのレベルを測定することにより分析した。エポキシ樹脂（Ｅｐｏｎ）に包埋された四頭筋の半薄切片をメチレンブルーで染色し、電子顕微鏡（１０００×）で観察し、空胞の存在の程度を決定した。四頭筋試料を免疫組織化学的に分析して、オートファジーマーカー微小管関連タンパク質１Ａ／１Ｂ型軽鎖３ホスファチジルエタノールアミンコンジュゲート（ＬＣ３Ａ ＩＩ）およびｐ６２、インスリン依存性グルコーストランスポーターＧＬＵＴ４およびインスリン非依存性グルコーストランスポーターＧＬＵＴ１のレベルを決定した。
Ｇａａノックアウトマウスに隔週で２０ｍｇ／ｋｇの組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ（アルグルコシダーゼアルファまたはＡＴＢ２００）の２回のＩＶボーラス投与を与えた。コントロールマウスは、溶媒のみで処置した。ヒラメ筋、四頭筋および隔膜組織は、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの最後の投与の２週間後に収集される。ヒラメ筋および隔膜組織は、グリコーゲンレベルについて過ヨウ素酸シッフ試薬（ＰＡＳ）で染色することにより、およびリソソーム増殖についてポンペ病においてアップレギュレートされたリソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ１）マーカーのレベルを測定することにより分析した。エポキシ樹脂（Ｅｐｏｎ）に包埋された四頭筋の半薄切片をメチレンブルーで染色し、電子顕微鏡（１０００×）で観察し、空胞の存在の程度を決定した。四頭筋試料を免疫組織化学的に分析して、オートファジーマーカー微小管関連タンパク質１Ａ／１Ｂ型軽鎖３ホスファチジルエタノールアミンコンジュゲート（ＬＣ３Ａ ＩＩ）およびｐ６２、インスリン依存性グルコーストランスポーターＧＬＵＴ４およびインスリン非依存性グルコーストランスポーターＧＬＵＴ１のレベルを決定した。
【0146】
同様の実験において、Ｇａａノックアウトマウスに隔週で２０ｍｇ／ｋｇの組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ（アルグルコシダーゼアルファまたはＡＴＢ２００）の４回のＩＶボーラス投与を与えた。コントロールマウスは、溶媒のみで処置した。心臓筋肉組織を組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの最後の投与の２週間後に収集し、グリコーゲンレベルについて過ヨウ素酸シッフ試薬（ＰＡＳ）で染色することにより、およびリソソーム増殖についてＬＡＭＰ１のレベルを測定することにより分析した。
【0147】
図１４に見られるように、ＡＴＢ２００の投与は、アルグルコシダーゼアルファによる従来の処置と比較して、心臓および骨格筋（ヒラメ筋）組織におけるリソソーム増殖の減少を示した。さらに、図１５に見られるように、ＡＴＢ２００の投与は、アルグルコシダーゼアルファによる従来の処置と比較して、心臓および骨格筋（ヒラメ筋）組織における点状のグリコーゲンレベルの減少を示した。
【0148】
同様に、図１６に見られるように、ＡＴＢ２００は、未処置のマウスおよびアルグルコシダーゼアルファで処置したマウスと比較して、Ｇａａノックアウトマウスの四頭筋における筋線維中の空胞の数を有意に減少させた。図１７に見られるように、ＬＣ３ＩＩおよびｐ６２の両方のレベルは、野生型マウスと比較してＧａａノックアウトマウスで増加する。さらに、インスリン依存性グルコーストランスポーターＧＬＵＴ４およびインスリン非依存性グルコーストランスポーターＧＬＵＴ１のレベルは、野生型マウスと比較してＧａａノックアウトマウスにおいて増加する。酸性α－グルコシダーゼ欠乏に関連する上昇したＧＬＵＴ４およびＧＬＵＴ１レベルは、筋線維へのグルコース取り込みの増加に寄与し得、基礎および食物摂取後の両方でグリコーゲン合成の増加をもたらす。
【0149】
酵素例１０：Ｇａａノックアウトマウスにおける筋肉機能
１２回の隔週投与の長期実験では、２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００＋１０ｍｇ／ｋｇのミグルスタットは、握力およびワイヤハング試験（図１８Ａ～１８Ｂ）の両方によって測定されたベースラインからＧａａＫＯマウスの機能的筋力を進行的に増加させた。同一のＥＲＴ用量（２０ｍｇ／ｋｇ）を受けたアルグルコシダーゼアルファ（ルミザイム（登録商標））処置マウスは、実験の大部分を通して同一条件下で低下することが観察された（図１８Ａ～１８Ｂ）。短期実験と同様に、ＡＴＢ２００／ミグルスタットは、アルグルコシダーゼアルファよりも処置の３ヶ月後（図１９Ａ～１９Ｃ）および６ヶ月後（図１９Ｄ～１９Ｇ）に実質的により良好なグリコーゲンクリアランスを有していた。ＡＴＢ２００／ミグルスタットはまた、アルグルコシダーゼアルファと比較して、３ヶ月の処置後、オートファジーおよびＬＡＭＰ１およびジスフェリンの細胞内蓄積を減少させた（図２０）。図１８Ａにおいて、＊は、ルミザイム単独と比較して統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５、両側ｔ検定）。図１９Ａ～１９Ｇにおいて、＊は、ルミザイム（登録商標）単独と比較して統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５、一方向ＡＮＯＶＡ分析の下でＤｕｎｎｅｔｔの方法を用いた多重比較）。
１２回の隔週投与の長期実験では、２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００＋１０ｍｇ／ｋｇのミグルスタットは、握力およびワイヤハング試験（図１８Ａ～１８Ｂ）の両方によって測定されたベースラインからＧａａＫＯマウスの機能的筋力を進行的に増加させた。同一のＥＲＴ用量（２０ｍｇ／ｋｇ）を受けたアルグルコシダーゼアルファ（ルミザイム（登録商標））処置マウスは、実験の大部分を通して同一条件下で低下することが観察された（図１８Ａ～１８Ｂ）。短期実験と同様に、ＡＴＢ２００／ミグルスタットは、アルグルコシダーゼアルファよりも処置の３ヶ月後（図１９Ａ～１９Ｃ）および６ヶ月後（図１９Ｄ～１９Ｇ）に実質的により良好なグリコーゲンクリアランスを有していた。ＡＴＢ２００／ミグルスタットはまた、アルグルコシダーゼアルファと比較して、３ヶ月の処置後、オートファジーおよびＬＡＭＰ１およびジスフェリンの細胞内蓄積を減少させた（図２０）。図１８Ａにおいて、＊は、ルミザイム単独と比較して統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５、両側ｔ検定）。図１９Ａ～１９Ｇにおいて、＊は、ルミザイム（登録商標）単独と比較して統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５、一方向ＡＮＯＶＡ分析の下でＤｕｎｎｅｔｔの方法を用いた多重比較）。
【0150】
まとめると、これらのデータは、ＡＴＢ２００／ミグルスタットが効率的に筋肉を標的とし、細胞機能障害を逆行させ、筋肉機能を改善したことを示す。重要なことに、筋肉構造の明らかな改善ならびにＬＡＭＰ１およびジスフェリンのオートファジーおよび細胞内蓄積の減少は、機能的筋力の改善と相関する改善された筋肉生理学のための良い代替となり得る。これらの結果は、臨床実験における筋肉生検から有用なバイオマーカーであると判明する可能性のあるＧａａＫＯマウスにおけるポンペ病の治療的処置の効果を評価するために、オートファジーおよびこれらの重要な筋肉タンパク質のモニタリングが合理的で実用的な方法であることを示唆している。
【0151】
図２０は、ミグルスタットを伴うまたは伴わない６ヶ月のＡＴＢ２００投与が、ＧａａＫＯマウスにおけるジストロフィンの細胞内蓄積を低下させることを示す。ＡＴＢ２００±ミグルスタットについて、ルミザイム（登録商標）よりもジストロフィンの蓄積が大幅に減少した。
【0152】
製剤例１：ｐＨおよび緩衝剤
製剤例の分析方法
外見、ｐＨ、タンパク質濃度などについて本明細書に記載した実施例の分析は、特記しない限り、以下の方法に従って行った。
製剤例の分析方法
外見、ｐＨ、タンパク質濃度などについて本明細書に記載した実施例の分析は、特記しない限り、以下の方法に従って行った。
【0153】
外観
透明度、色および可視粒子を含む試料の外観を、ＹＢ－２ライトボックスを用いて白黒背景の下で調べた。
透明度、色および可視粒子を含む試料の外観を、ＹＢ－２ライトボックスを用いて白黒背景の下で調べた。
【0154】
ｐＨ
試料のｐＨはＳｅｖｅｎＭｕｌｔｉ（商標）ｐＨメーターで測定した。
試料のｐＨはＳｅｖｅｎＭｕｌｔｉ（商標）ｐＨメーターで測定した。
【0155】
タンパク質濃度
タンパク質濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）２０００分光光度計を使用してＵＶ２８０示度によって決定した。各回２．５μＬの試料ですべての測定を２回繰り返し、平均した。
タンパク質濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）２０００分光光度計を使用してＵＶ２８０示度によって決定した。各回２．５μＬの試料ですべての測定を２回繰り返し、平均した。
【0156】
サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）
ｐＨおよび緩衝剤、凍結融解および賦形剤の例については、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ ＨＰＬＣシステムで、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）Ｇ３０００ ＳＷＸＬカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、７．８×３００ｍｍ、５μｍ、２５℃）を用いてタンパク質モノマーおよびその高分子量種および断片の分離を行った。移動相は、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウムおよび２０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０±０．２）からなっていた。クロマトグラフィーシステムは、１．０ｍＬ／分の流速、５０μＬの注入容量（典型的には１ｍｇ／ｍＬ）、および均一濃度勾配を用いた２０分間の実行時間を使用した。２８０ｎｍでＵＶ検出器によりシグナルを検出した（参考：３６０ｎｍ）。
ｐＨおよび緩衝剤、凍結融解および賦形剤の例については、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ ＨＰＬＣシステムで、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）Ｇ３０００ ＳＷＸＬカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、７．８×３００ｍｍ、５μｍ、２５℃）を用いてタンパク質モノマーおよびその高分子量種および断片の分離を行った。移動相は、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウムおよび２０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０±０．２）からなっていた。クロマトグラフィーシステムは、１．０ｍＬ／分の流速、５０μＬの注入容量（典型的には１ｍｇ／ｍＬ）、および均一濃度勾配を用いた２０分間の実行時間を使用した。２８０ｎｍでＵＶ検出器によりシグナルを検出した（参考：３６０ｎｍ）。
【0157】
ＰＳ８０の例では、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ ＨＰＬＣシステムで、ＢｉｏＳｅｐＴＭ－ＳＥＣ－ｓ３０００カラム（Ｐｅｎｎｏｍｅｎｅｘ、７．８×３００ｍｍ、５μｍ、２５℃）を使用して、タンパク質モノマーおよびその高分子量種およびフラグメントの分離を行った。移動相は、５０ｍＭのリン酸ナトリウムおよび１００ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ６．２±０．２）からなっていた。クロマトグラフィーシステムは、１．１５ｍＬ／分の流速、５０μＬの注入容量（典型的には１ｍｇ／ｍＬ）、および均一濃度勾配を用いた２５分間の実行時間を使用した。シグナルはＵＶ検出器により２８０ｎｍで検出された。
【0158】
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（非還元）
報告できる値は、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおけるタンパク質の純度および分子量である。試料を過剰のＳＤＳの存在下で、非還元状態で変性させ、均一な負電荷を得た。印加電場（１６５Ｖ）において、これらのＳＤＳ被覆種は、ポリアクリルアミドゲルを通して見かけの分子量に基づいて分離された。分離したバンドを、クーマシーブルー染色によって検出した。
報告できる値は、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおけるタンパク質の純度および分子量である。試料を過剰のＳＤＳの存在下で、非還元状態で変性させ、均一な負電荷を得た。印加電場（１６５Ｖ）において、これらのＳＤＳ被覆種は、ポリアクリルアミドゲルを通して見かけの分子量に基づいて分離された。分離したバンドを、クーマシーブルー染色によって検出した。
【0159】
４－ＭＵＧ酵素活性
１０μＬの試料を希釈し、加水分解し（ＧＡＡにより、３７℃で６０分間）、蛍光生成物４－ＭＵを生成した。１２５μＬの１Ｍグリシンまたは０．１Ｍ ＮａＯＨを加えて反応を停止させた。
１０μＬの試料を希釈し、加水分解し（ＧＡＡにより、３７℃で６０分間）、蛍光生成物４－ＭＵを生成した。１２５μＬの１Ｍグリシンまたは０．１Ｍ ＮａＯＨを加えて反応を停止させた。
【0160】
一連の４－ＭＵ標準を試料で析し、蛍光シグナルに基づいて標準検量線を生成した。ＲＦＵの４－ＭＵ量への変換は、４パラメータロジスティック回帰モデルに従って回帰した標準曲線とのソフトウェア媒介比較によって達成された。次いで、試料中のＧＡＡ酵素活性（ナノモル ４－ＭＵ放出／ｈｒ／ｍｌ ＧＡＡ）を、４－ＭＵ標準曲線に基づいて計算した。
【0161】
４－ＭＵＧ酵素濃度
１０μＬの試料およびＧＡＡ参照標準を希釈し、蛍光生成物４－ＭＵを生成するために加水分解した（ＧＡＡにより、３７℃で６０分間）。１２５μＬの１Ｍ ＮａＯＨを加えて反応を停止させた。
１０μＬの試料およびＧＡＡ参照標準を希釈し、蛍光生成物４－ＭＵを生成するために加水分解した（ＧＡＡにより、３７℃で６０分間）。１２５μＬの１Ｍ ＮａＯＨを加えて反応を停止させた。
【0162】
一連のＧＡＡ参照標準を試料で分析し、蛍光シグナルに基づいて標準検量線を生成した。ＲＦＵの４－ＭＵ量への変換は、４パラメータロジスティック回帰モデルに従って回帰した標準曲線とのソフトウェア媒介比較によって達成された。次いで、試料中のＧＡＡ酵素濃度（ナノモル ４－ＭＵ放出／ｈｒ／ｍｌ ＧＡＡ）を、ＧＡＡ標準曲線に基づいて計算した。
【0163】
動的光散乱（ＤＬＳ）
マイクロピペットを用い、４０μＬの希釈されていない試料のアリコートを４０μＬの使い捨てキュベットに移した。３つの測定を各サンプルについて行った。
マイクロピペットを用い、４０μＬの希釈されていない試料のアリコートを４０μＬの使い捨てキュベットに移した。３つの測定を各サンプルについて行った。
【0164】
粒子：ＨＩＡＣ
２００μＬの各試料を、ろ過した参照緩衝剤で２０００μＬに希釈した。試料を３回試験し、４５０μＬを各試験に使用した。１ｍＬ当たり１μｍ、３μｍ、５μｍ、１０μｍおよび２５μｍの各サイズの粒子の平均数が報告された。
２００μＬの各試料を、ろ過した参照緩衝剤で２０００μＬに希釈した。試料を３回試験し、４５０μＬを各試験に使用した。１ｍＬ当たり１μｍ、３μｍ、５μｍ、１０μｍおよび２５μｍの各サイズの粒子の平均数が報告された。
【0165】
ＭｉｃｒｏＣａｌ示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
毛管細胞示差走査熱量測定（ＤＳＣ）は、試料の温度を上昇させるのに必要な熱量の差と温度の関数としての基準とを検出することにより、タンパク質の熱安定性を測定するために利用される。具体的には、溶液中のタンパク質の相対的安定性の指標である熱転移中点（Ｔｍ）を測定するために使用される。
毛管細胞示差走査熱量測定（ＤＳＣ）は、試料の温度を上昇させるのに必要な熱量の差と温度の関数としての基準とを検出することにより、タンパク質の熱安定性を測定するために利用される。具体的には、溶液中のタンパク質の相対的安定性の指標である熱転移中点（Ｔｍ）を測定するために使用される。
【0166】
試料を参照緩衝剤で約１ｍｇ／ｍＬに希釈した。４００μＬの参照バッファーのアリコートを９６ウェルプレートの各奇数番号のウェルに加え、各試料の４００μＬのアリコートを対応する偶数番号のウェルに加えた。走査温度は１０℃～１１０℃の範囲である。
【0167】
変調示差走査熱量測定（ｍＤＳＣ）
Ｎｅｔｚｓｃｈ示差走査熱量計（ＤＳＣ２０４ Ｆ１）を用いて、ガラス転移温度（Ｔｇ’）および共晶温度（Ｔｅ）を試験した。試験のために１５μＬの試料をローディングディスクに充填した。まず、１０℃／分の速度で２０℃から－６０℃まで降温し、このステップにおける冷却曲線からＴｅ値を得た。第２に、温度を１０℃／分の速度で－６０℃から４０℃に上昇させ、加熱曲線からＴｇ’値を分析した。
Ｎｅｔｚｓｃｈ示差走査熱量計（ＤＳＣ２０４ Ｆ１）を用いて、ガラス転移温度（Ｔｇ’）および共晶温度（Ｔｅ）を試験した。試験のために１５μＬの試料をローディングディスクに充填した。まず、１０℃／分の速度で２０℃から－６０℃まで降温し、このステップにおける冷却曲線からＴｅ値を得た。第２に、温度を１０℃／分の速度で－６０℃から４０℃に上昇させ、加熱曲線からＴｇ’値を分析した。
【0168】
Ｍ６Ｐ
Ｍ６Ｐを加水分解（４Ｍ ＴＦＡ、１００℃、４時間）によって試料から遊離させ、遠心減圧蒸発器で乾燥させた。乾燥したＭ６Ｐおよび参照標準を分析前に精製水に懸濁させた。ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１０ ＢｉｏＬＣＴＭ分析カラム（４ｍｍ×２５０ｍｍ、３．５μｍ、１００Å、３０℃）およびＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１０ ＢｉｏＬＣＧｕａｒｄカラム（４ｍｍ×５０ｍｍ、３．５μｍ、１００Å、３０℃）を使用した。移動相は、相Ａ（１００ｍＭ ＮａＯＨ）および相Ｂ（１Ｍ ＮａＯＡｃ、１００ｍＭ ＮａＯＨ）からなっていた。クロマトグラフィーシステムは、１ｍＬ／分の流速、２５μＬの注入容量、および勾配を伴う３０分間の実行時間を使用した。シグナルは、パルス電流法検出によって検出された。試料中のＭ６Ｐ含有量を標準曲線に基づいて計算した。
Ｍ６Ｐを加水分解（４Ｍ ＴＦＡ、１００℃、４時間）によって試料から遊離させ、遠心減圧蒸発器で乾燥させた。乾燥したＭ６Ｐおよび参照標準を分析前に精製水に懸濁させた。ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１０ ＢｉｏＬＣＴＭ分析カラム（４ｍｍ×２５０ｍｍ、３．５μｍ、１００Å、３０℃）およびＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１０ ＢｉｏＬＣＧｕａｒｄカラム（４ｍｍ×５０ｍｍ、３．５μｍ、１００Å、３０℃）を使用した。移動相は、相Ａ（１００ｍＭ ＮａＯＨ）および相Ｂ（１Ｍ ＮａＯＡｃ、１００ｍＭ ＮａＯＨ）からなっていた。クロマトグラフィーシステムは、１ｍＬ／分の流速、２５μＬの注入容量、および勾配を伴う３０分間の実行時間を使用した。シグナルは、パルス電流法検出によって検出された。試料中のＭ６Ｐ含有量を標準曲線に基づいて計算した。
【0169】
シアル酸
シアル酸は、加水分解（２Ｍ ＨＡｃ、８０℃、２時間）によって薬物分子から放出され、次いで、すべてのサンプルおよび混合標準溶液をＤＭＢで標識し（５０℃、暗所で１７±０．５時間）、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ ＨＰＬＣシステムで、Ｚｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｐｌｕｓ Ｃ１８カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ、４．６ｍｍ×１００ｍｍ、３．５μｍ、４５°Ｃ）を用いて分離した。移動相は、相Ａ（９％ＡＣＮ、７％ＭｅＯＨ）および相Ｂ（１００％ＡＣＮ）からなっていた。クロマトグラフィーシステムは、０．５ｍＬ／分の流速、２０μＬの注入容量、および勾配を伴う２０分間の実行時間を使用した。蛍光検出器（λｅｘ＝３７３ｎｍ、λｅｍ＝４４８ｎｍ）によりシグナルを検出した。試料中のＮｅｕ５ＧｃおよびＮｅｕ５Ａｃ含量を標準曲線に基づいて計算した。
シアル酸は、加水分解（２Ｍ ＨＡｃ、８０℃、２時間）によって薬物分子から放出され、次いで、すべてのサンプルおよび混合標準溶液をＤＭＢで標識し（５０℃、暗所で１７±０．５時間）、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ ＨＰＬＣシステムで、Ｚｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｐｌｕｓ Ｃ１８カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ、４．６ｍｍ×１００ｍｍ、３．５μｍ、４５°Ｃ）を用いて分離した。移動相は、相Ａ（９％ＡＣＮ、７％ＭｅＯＨ）および相Ｂ（１００％ＡＣＮ）からなっていた。クロマトグラフィーシステムは、０．５ｍＬ／分の流速、２０μＬの注入容量、および勾配を伴う２０分間の実行時間を使用した。蛍光検出器（λｅｘ＝３７３ｎｍ、λｅｍ＝４４８ｎｍ）によりシグナルを検出した。試料中のＮｅｕ５ＧｃおよびＮｅｕ５Ａｃ含量を標準曲線に基づいて計算した。
【0170】
表１に示すように、５０ｍＭ ＮａＣｌを含むかまたは含まない２５ｍＭリン酸ナトリウムまたは２５ｍＭクエン酸ナトリウムを含有する、４．０～８．０の範囲のｐＨを有する１０種類の緩衝剤製剤を調製した。ＡＴＢ２００ ４－ＭＵＧ酵素濃度は１ｍｇ／ｍＬであった。
【0171】
【0172】
試料の準備
ｐＨおよび緩衝剤評価実験で使用される物質は、以下の表２に記載されている通りである。
ｐＨおよび緩衝剤評価実験で使用される物質は、以下の表２に記載されている通りである。
【0173】
【0174】
ｐＨ４．０（Ｐ４０）、５．０（Ｐ５０）、６．０（Ｐ６０）、７．０（Ｐ７０）および８．０（Ｐ８０）の２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、ｐＨ６．０（ＮａＣｌを含まないＰ６０）の２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、ｐＨ５．０（Ｃ５０）、５．５（Ｃ５５）、６．０（Ｃ６０）および６．５（Ｃ６５）の５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２５ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝剤を調製した。ｐＨ４．０では、ＨＣｌを用いてリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ４．０）中のｐＨを調整した。
【0175】
ＡＴＢ２００酵素溶液を、最初に限外ろ過遠心分離装置を用いて１５℃および３５００ｒｐｍの条件下で４０分間濃縮した。その後、濃縮酵素溶液を１５℃および３５００ｒｐｍで５０分間および５５分間、２回の限外ろ過によって上記の３つの異なる緩衝剤へ緩衝剤交換した。続いて、緩衝剤交換した酵素溶液を、タンパク質濃度および４－ＭＵＧ酵素濃度について分析した。
【0176】
最後に、適切な容量の各緩衝剤を添加して、最終ＡＴＢ２００酵素濃度を１．０ｍｇ／ｍＬに調整した。最終ＡＴＢ２００濃度は、ＵＶ＿Ａ２８０吸光度および４－ＭＵＧ酵素濃度の両方によって確認された。
【0177】
溶液を０．２２μｍのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルターで無菌的にろ過した。
【0178】
各製剤を、分析試験の試料量要件に従って、５００μＬ～１０００μＬの充填容量で、バイオセーフティーフード内の２ｍＬガラスバイアルに無菌的に充填した。バイアルに栓をし、充填後速やかにクリンプオーバーシールした。
【0179】
試料試験
各製剤のバイアルを５℃および４０℃で最長８週間貯蔵し、２５℃、１００ｒｐｍで、回転式振騰器で最長５日間撹拌した（表３参照）。外観、ｐＨ、ＵＶ濃度、４－ＭＵＧ酵素濃度、ＳＥＣ、ＨＩＡＣ、ＤＬＳ、４－ＭＵＧ酵素活性、およびＤＳＣの試験について、表３に記載したように、製剤を初期（Ｔ０）、５日間（５Ｄ）、２週間（２Ｗ）、４週間（４Ｗ）および８週間（８Ｗ）でサンプリングした。
各製剤のバイアルを５℃および４０℃で最長８週間貯蔵し、２５℃、１００ｒｐｍで、回転式振騰器で最長５日間撹拌した（表３参照）。外観、ｐＨ、ＵＶ濃度、４－ＭＵＧ酵素濃度、ＳＥＣ、ＨＩＡＣ、ＤＬＳ、４－ＭＵＧ酵素活性、およびＤＳＣの試験について、表３に記載したように、製剤を初期（Ｔ０）、５日間（５Ｄ）、２週間（２Ｗ）、４週間（４Ｗ）および８週間（８Ｗ）でサンプリングした。
【0180】
【0181】
結果
熱安定性の結果－ＭｉｃｒｏＣａｌ ＤＳＣ
熱安定性測定の結果を以下の表４に示す。
熱安定性の結果－ＭｉｃｒｏＣａｌ ＤＳＣ
熱安定性測定の結果を以下の表４に示す。
【0182】
【0183】
より高いＴｍ発症は、特定の製剤においてタンパク質のより良好な熱安定性を示す。したがって、最高の熱安定性を示す製剤は、Ｐ５０、Ｃ５５、Ｃ５０、ＮａＣｌを含まないＰ６０、Ｐ６０およびＣ６０であった。これらの結果は、ＡＴＢ２００酵素が弱酸性緩衝剤中で、塩基性条件よりも良好な熱安定性を有することを示している。
【0184】
外観－撹拌
撹拌実験の外観の結果を以下の表５に示す：
撹拌実験の外観の結果を以下の表５に示す：
【0185】
【0186】
表から分かるように、５日間の撹拌後、ＮａＣｌを含まないＰ６０、Ｃ５０、Ｃ５５、Ｃ６０、およびＣ６５は、無色、透明、および可視粒子なしを維持したが、Ｐ４０、Ｐ５０、Ｐ６０、Ｐ７０、およびＰ８０においては、可視粒子が観察された。このデータは、クエン酸ナトリウム緩衝剤が、撹拌後、リン酸ナトリウム緩衝剤よりも製剤をより安定化させることを示している。
【0187】
ｐＨ
ｐＨ測定の結果を以下の表６に示す：
ｐＨ測定の結果を以下の表６に示す：
【0188】
【0189】
データから分かるように、ｐＨ５．０～６．５の範囲の５０ｍＭ ＮａＣｌを含むリン酸塩緩衝剤およびクエン酸緩衝剤の両方は、全体にわたって所定のｐＨを維持することができた。緩衝剤交換、濃度調整、５℃および４０℃での８週間の貯蔵、および撹拌の間、試料のｐＨに有意な変化はなかった。
【0190】
対照的に、ｐＨは５℃および４０℃の両方で８週間の貯蔵後にＮａＣｌを含まないＰ６０では減少し、緩衝剤交換および８週間の貯蔵後にＰ４０では両方の温度でｐＨが上昇した。しかし、撹拌は、ＮａＣｌを含まないＰ４０およびＰ６０の両方においてｐＨの変化をもたらさなかった。
【0191】
タンパク質濃度
タンパク質濃度測定の結果を以下の表７に示す：
タンパク質濃度測定の結果を以下の表７に示す：
【0192】
【0193】
５℃で８週間の貯蔵および５日間の撹拌は、タンパク質濃度に影響しなかった。すべての製剤の間に有意な変化は観察されなかった。
【0194】
対照的に、４０℃での貯蔵中、タンパク質濃度は、Ｐ５０、Ｐ６０、ＮａＣｌを含まないＰ６０、Ｃ６０、およびＣ６５ではわずかに増加し、Ｃ５０ではわずかに減少し、Ｐ４０、Ｐ７０、Ｐ８０、Ｃ５５では維持された。４０℃試料中に可視粒子が形成されたため、１２０００ｒｐｍで１分間遠心分離した後、４０℃／８週間試料を再試験した。この結果は、粒子を含む試料中の遠心分離後のタンパク質濃度の低下を示し、このことは、試料中に存在する粒子が２８０ｎｍでの吸光に影響を有することを示唆した。
【0195】
４－ＭＵＧ酵素濃度
４－ＭＵＧ酵素濃度測定の結果を以下の表８に示す。
４－ＭＵＧ酵素濃度測定の結果を以下の表８に示す。
【0196】
【0197】
緩衝剤交換後、Ｐ８０の４－ＭＵＧ酵素濃度は直ちに０．２７ｍｇ／ｍＬに低下した。これは、ｐＨ８．０が酵素活性に有意に影響を及ぼすことを示した。５℃および４０℃の両方で２週間貯蔵した後、酵素濃度はゼロに低下した。Ｐ８０を除き、５℃で８週間貯蔵した後、ほとんどの製剤の酵素濃度は安定し、Ｐ４０では少し低下した。
【0198】
対照的に、４０℃の貯蔵は明らかに酵素濃度に影響を与えた。２週間後、酵素濃度はＰ７０で消失し、Ｐ４０およびＣ６５では劇的に低下し、Ｐ５０では明らかに減少した。４週間後、酵素濃度は減少し続けた。最後に、８週間後、酵素濃度は、Ｐ４０およびＣ６５では０に近く、ｐＨ５．０緩衝剤（Ｐ５０およびＣ５０）中では０．３３ｍｇ／ｍＬに低下し、ｐＨ５．５～６．０の緩衝剤（Ｐ６０、ＮａＣｌを含まないＰ６０、Ｃ５５、およびＣ６０）中では０．５～０．７ｍｇ／ｍＬに低下した。中でも、ＮａＣｌを含まないＰ６０は最終的に酵素濃度が最も高かった（０．７３ｍｇ／ｍＬ）。この結果は、酵素濃度はｐＨ５．５～６．０の範囲で４－ＭＵＧ酵素濃度に関して最も保存されていたが、リン酸ナトリウム緩衝剤とクエン酸ナトリウム緩衝剤との間に有意差はなかったことを示す。
【0199】
Ｐ８０を除き、撹拌実験の間、酵素濃度は有意に変化しなかった。
【0200】
４－ＭＵＧ酵素活性
４－ＭＵＧ酵素活性測定の結果を以下の表９に示す：
４－ＭＵＧ酵素活性測定の結果を以下の表９に示す：
【0201】
【0202】
４－ＭＵＧ酵素活性の変化傾向は、４－ＭＵＧ酵素濃度の変化傾向と対応していた。
【0203】
Ｐ８０は、試験条件下で４－ＭＵＧ酵素活性において最悪の安定性を示した。Ｐ８０の酵素活性は、緩衝剤交換後約７０％の減少を示した。その後、酵素活性は、５℃および４０℃で２週間貯蔵した後、ほとんど完全に失われた。基本条件は酵素活性に有意に影響した。
【0204】
５℃で８週間貯蔵した後、ＰＳ８０の酵素活性はほぼ完全に失われ、Ｐ４０では２０％の低下が見られ、他の製剤では有意な変化は観察されなかった。
【0205】
対照的に、４０℃の貯蔵により、すべての製剤において酵素活性の明らかな低下が生じた。２週間後、酵素活性はＰ７０ではほとんど完全に失われ、Ｐ４０およびＣ６５では劇的に減少し、Ｐ５０では明らかに低下した。酵素活性は、２週間から４週間まで異なる度合で減少し続けた。実験の最後に、酵素活性はＣ６５でほとんど完全に失われ、Ｐ４０では２１１．５Ｕ／Ｌに、Ｐ５０およびＣ５０では約１５５０Ｕ／Ｌに、Ｃ６０、Ｐ６０およびＣ５５では２５００～３０００Ｕ／Ｌに低下した。製剤のうち、ＮａＣｌを含まないＰ６０は３５４９．７Ｕ／Ｌの最高活性を維持した。
【0206】
４－ＭＵＧ酵素活性の試験結果に基づくと、酵素はｐＨ５．５～６．０の範囲のｐＨで最も安定化したが、リン酸ナトリウム緩衝剤とクエン酸ナトリウム緩衝剤と間に区別は見られなかった。
【0207】
純度：ＳＥＣ－ＨＰＬＣ
ＳＥＣ測定の結果を以下の表１０に示す。
ＳＥＣ測定の結果を以下の表１０に示す。
【0208】
【0209】
緩衝剤交換後、いくつかの製剤のＳＥＣ純度は、出発材料（ＳＥＣモノマー：９８．９％）と比較して有意に減少した。Ｐ８０では、ＳＥＣの純度が４４．９％に低下し、５４．５％の凝集体が形成され；Ｐ４０では、交換前ＤＳと比較してモノマー％が４．９％減少し、ＨＭＷ分子より多くのＬＭＷフラグメントが形成され（４．７％ＶＳ１．３％）；Ｐ７０では、凝集体の増加に対応して、モノマー％のわずかな減少（１．２％）が見出され；ＮａＣｌを含まないＰ６０では、モノマー％が２．３％減少した。
【0210】
８週間の５℃貯蔵後、製剤Ｐ６０、ＮａＣｌを含まないＰ６０、およびＣ６５のＳＥＣ純度は良好に維持されたが、他の製剤のＳＥＣ純度はＴ０と比較して有意に低下した。Ｐ４０では、ＳＥＣ純度は７４．３％（Ｔ０：９４．０％）に劇的に低下し、２３．４％のＬＭＷ断片が形成され；Ｐ５０およびＣ５０では、モノマーのわずかな減少（５～７％）およびＬＭＷ断片の増加（５～７％）があった。Ｐ８０では、１８．２％の減少が見られ、それは主に凝集へ移動していた（１４．８％）。Ｐ７０についても同様に、単量体が１０．７％減少し、ＨＭＷ断片が９．２％増加した。Ｃ５５では、単量体、ＨＭＷおよびＬＭＷの割合がわずかに変化した。
【0211】
４０℃で貯蔵すると、すべての製剤において劇的なモノマー％の変化がもたらされた。Ｐ７０およびＰ８０では、ＳＥＣモノマーは２週間後に０～０．５％に低下し、Ｃ６５では２２．４％が残っており、８週間後には大部分が凝集体となった。Ｐ４０、Ｐ５０およびＣ５０では、主にＬＭＷ断片の形成に起因するモノマーの有意な低下（５０～９０％）があった。Ｐ６０、ＮａＣｌを含まないＰ６０、およびＣ６０では、８週間後、ＳＥＣモノマー％は、それぞれ８０．８％、８３．６％および７７．５％に減少した。
【0212】
ＳＥＣの結果は、ｐＨ６．０がＡＴＢ２００の安定性のために最もよく働き、リン酸ナトリウム緩衝剤とクエン酸ナトリウム緩衝剤との間には有意差が見出されなかったことを示した。さらに、製剤中の塩化ナトリウムの不在は、ＡＴＢ２００の安定性に影響を与えなかった。
【0213】
撹拌実験中、ＳＥＣ純度はＮａＣｌを含まないＰ６０およびＰ６０においてわずかに減少した。Ｐ４０、Ｐ５０、Ｐ７０、Ｐ８０、Ｃ５０、Ｃ６０およびＣ６５では、モノマー％が明らかに減少した。
【0214】
多分散性：ＤＬＳ
ＤＬＳ測定の結果を以下の表１１に示す。
ＤＬＳ測定の結果を以下の表１１に示す。
【0215】
【0216】
【0217】
【0218】
ＤＬＳデータは、タンパク質分子の流体力学的半径および粒子の多分散性を反映した。いくつかの試料では乳白色が観察されたので、ＤＬＳを使用して不可視粒子を分析した。ＤＬＳの結果は、外観による示唆と概ね一致していた。
【0219】
８週間の５℃貯蔵中、タンパク質分子の流体力学的半径および多分散指数（ＰＤＩ）は安定であり、Ｐ６０、Ｐ７０、Ｐ８０、ＮａＣｌを含まないＰ６０およびＣ６０と同等であった。流体力学的半径は、他のすべての５つの製剤、特に８週間後のＰ４０において、約１０ｎｍから数百ｎｍに変化した。
【0220】
８週間の４０℃貯蔵中、すべての製剤において流体力学的半径およびＰＤＩに劇的な変化があった。しかしながら、凝集体の複雑なプロファイルのために、結果に基づいてそれらの製剤を比較することは困難である。
【0221】
撹拌実験では、Ｐ８０の流体力学的半径およびＰＤＩは劇的に増加し；Ｐ４０、Ｐ５０およびＣ５０では、流体力学的半径およびＰＤＩはわずかに増加し；Ｐ６０、Ｐ７０、ＮａＣｌを含まないＰ６０、Ｃ５５、Ｃ６０、およびＣ６５では有意な変化は観察されなかった。
【0222】
上記のＤＬＳデータによれば、Ｐ６０、Ｐ７０、ＮａＣｌを含まないＰ６０、Ｃ５５、Ｃ６０、およびＣ６５は、Ｐ４０、Ｐ５０、Ｐ８０、およびＣ５０より良好であった。
【0223】
粒子：ＨＩＡＣ
撹拌実験のＨＩＡＣ測定の結果を以下の表１２に示す：
撹拌実験のＨＩＡＣ測定の結果を以下の表１２に示す：
【0224】
【0225】
撹拌実験中、Ｐ７０では２５℃で５日間撹拌した後の粒子数が有意に増加し、他のすべての製剤は同等の粒子数を有していた。
【0226】
概要
全体として、Ｐ６０およびＣ６０は他の製剤と比較して最も安定した製剤として優れていた。したがって、ＡＴＢ２００は５．０～６．０の範囲で最も安定であると結論付けられた。しかしながら、リン酸塩緩衝剤とクエン酸緩衝剤との区別はできなかった。さらに、製剤中に塩化ナトリウムが存在しないことは、ＡＴＢ２００の安定性に有意な影響を示さなかった。
全体として、Ｐ６０およびＣ６０は他の製剤と比較して最も安定した製剤として優れていた。したがって、ＡＴＢ２００は５．０～６．０の範囲で最も安定であると結論付けられた。しかしながら、リン酸塩緩衝剤とクエン酸緩衝剤との区別はできなかった。さらに、製剤中に塩化ナトリウムが存在しないことは、ＡＴＢ２００の安定性に有意な影響を示さなかった。
【0227】
製剤例２：凍結融解
凍結融解プロセス中の安定性について３つの製剤を評価した。３つの製剤を以下の表１３に要約する。ＡＴＢ２００酵素の標的濃度は５ｍｇ／ｍＬであった。
凍結融解プロセス中の安定性について３つの製剤を評価した。３つの製剤を以下の表１３に要約する。ＡＴＢ２００酵素の標的濃度は５ｍｇ／ｍＬであった。
【0228】
【0229】
試料の準備
ＡＴＢ２００ ＤＳを、透析カセット（２００００ＭＷＣＯ）を用いて３つの製剤緩衝剤に緩衝剤交換した。透析は、穏やかに撹拌しながら、５℃で、６～１０時間ごとに１回、各３回緩衝剤交換を用いて行った。
ＡＴＢ２００ ＤＳを、透析カセット（２００００ＭＷＣＯ）を用いて３つの製剤緩衝剤に緩衝剤交換した。透析は、穏やかに撹拌しながら、５℃で、６～１０時間ごとに１回、各３回緩衝剤交換を用いて行った。
【0230】
各透析後、適切な容量の製剤緩衝剤を添加して、最終ＵＶ濃度を５ｍｇ／ｍＬに調整した。次いで、溶液を０．２２μｍのＰＥＳフィルターで無菌的にろ過した。次いで、各製剤を、分析試験の試料量要件に従って、５００μＬ～１０００μＬの充填容量で、バイオセーフティーフード内の２ｍＬガラスバイアルに無菌的に充填した。バイアルに栓をし、充填後速やかにクリンプオーバーシールした。
【0231】
凍結融解の前に、各製剤についてバイアルを取り、残りの試料バイアルを凍結融解サイクルに供した。凍結融解後試料バイアルは、予め定められたサンプリング点で採取された。
【0232】
試料試験
３つの凍結融解プロセスを以下のように試験した：
３つの凍結融解プロセスを以下のように試験した：
【0233】
プロセス１：制御されない凍結および解凍。試料を－８０℃の冷凍機で凍結し、２５℃のチャンバーで解凍した。
【0234】
プロセス２：制御された凍結および制御されない融解。試料をＦｒｏｓｔｙ容器に入れ、－８０℃の冷凍機で凍結させた。Ｆｒｏｓｔｙ容器は、１℃／分の凍結速度制御を達成するためにイソプロパノールを使用した。凍結した容器を、試料を融解するために２５℃のチャンバーに入れた。温度上昇率は約１℃／分であった。
【0235】
プロセス３：制御された凍結および解凍。凍結乾燥機を用いて試料を凍結および融解した。凍結中に達成された最低試料温度は－４７℃であった。試料温度を２５℃に上げた。凍結および融解の両方についての温度変化率は、約０．５℃／分で制御した。実験を繰り返して結果を確認した。
【0236】
各プロセスを用いて５または３回の凍結融解サイクルを実施した。凍結融解前後の試料について、以下の試験を行った。外観、濃度（ＵＶおよび酵素）およびＳＥＣ－ＨＰＬＣ。試験パラメータの要約を以下の表１４に示す。
【0237】
【0238】
結果
外観－第１ラウンド
外観測定の第１ラウンドの結果を以下の表１５Ａおよび１５Ｂに示す：
外観－第１ラウンド
外観測定の第１ラウンドの結果を以下の表１５Ａおよび１５Ｂに示す：
【0239】
【0240】
【0241】
Ｔ０（凍結融解前）では、対応する製剤緩衝剤を参照として、すべての製剤が無色、わずかに乳白色、および可視粒子を含まないようであった。
【0242】
５サイクルの迅速な凍結融解（プロセス１）後、すべての製剤は、そのＴ０と比較してより多くの可視粒子を含むようであった。ＣＰ６０は、５ＦＴ後の３つの中で最も少ない粒子を含んでいた。
【0243】
５サイクルの低速凍結融解（プロセス２）後、すべての製剤はＴ０よりも多くの可視粒子を含むようであったが、プロセス１で処理したものよりは少なかった。５ＦＴサイクル後のＣＰ６０試料では、１ＦＴサイクル後のＰ６０およびＣ６０試料よりも少ない粒子が観察された。
【0244】
３サイクルの低速凍結融解（プロセス３）後、すべての製剤はＴ０よりも多い可視粒子を有するようであった。３つの製剤の間に差はなかった。
【0245】
外観－第２ラウンド
外観測定の第２ラウンドの結果を以下の表２３に示す：
外観測定の第２ラウンドの結果を以下の表２３に示す：
【0246】
【0247】
第２ラウンドの低速凍結融解試験（プロセス３）では、第１ラウンドよりも多くのＦＴサイクルが実施された。５ＦＴ後のＰ６０には、Ｔ０と比較して多数の可視粒子が現れたが、Ｃ６０とＣＰ６０の両方では少数の粒子が観察された。
【0248】
４－ＭＵＧ酵素濃度と活性
４－ＭＵＧ酵素濃度および活性測定の結果を以下の表１７（プロセス１～２およびプロセス３の第１ラウンド）および表１８（プロセス３の第２ラウンド）に示す。
４－ＭＵＧ酵素濃度および活性測定の結果を以下の表１７（プロセス１～２およびプロセス３の第１ラウンド）および表１８（プロセス３の第２ラウンド）に示す。
【0249】
【0250】
【0251】
５サイクルの高速凍結－解凍（プロセス１）後、Ｔ０試料と比較して、Ｐ６０では４－ＭＵＧの酵素濃度がわずかに低下したが、Ｃ６０およびＣＰ６０では有意差は認められなかった。
【0252】
Ｆｒｏｓｔｙ容器（プロセス２）を用いた５サイクルの低速凍結融解の後、３つの処方物のいずれにおいても、Ｔ０試料と比較した有意差は観察されなかった。
【0253】
凍結乾燥機を用いた３サイクルの低速凍結融解（プロセス３）の後、Ｔ０と比較して、Ｐ６０およびＣＰ６０の両方において明確な酵素濃度の減少があったが、Ｃ６０に有意な変化はなかった。プロセス３の凍結融解を５サイクルで繰り返し、同じ傾向が観察された。Ｐ６０試料の酵素濃度は１サイクルのＦ／Ｔ後に１８．８％低下し、３サイクル後（５３．１％低下）および５サイクル後（６８．９％低下）にさらに悪化した。ＣＰ６０では、３サイクル後に酵素濃度が低下し始め、最終的に５サイクル後にＰ６０と同じレベルまで低下した。Ｃ６０では、５サイクルの低速凍結融解後にほとんど変化はなかった。
【0254】
４－ＭＵＧ酵素濃度の結果は、凍結／加熱速度、Ｆ／Ｔサイクル数および緩衝剤タイプがＡＴＢ２００の安定性に影響を与え得ることを示した。クエン酸塩緩衝系（Ｃ６０）は、使用された凍結融解プロセスにかかわらず良好な安定化効果をもたらした。
【0255】
４－ＭＵＧ酵素活性の変化傾向は、４－ＭＵＧ酵素濃度と同じであった。
【0256】
迅速な凍結融解試験（プロセス１）の間、５サイクル後にＰ６０に酵素活性がわずかに低下したが、Ｃ６０およびＣＰ６０では有意な変化は観察されなかった。
【0257】
１℃／分の温度変化（プロセス２）を用いた低速凍結融解試験の間、いずれの試料でも明確な変化は観察されなかった。
【0258】
凍結乾燥機による低速凍結融解試験（プロセス３）では、Ｐ６０の酵素活性は明らかに低下し、ＣＰ６０ではわずかに低下した。しかし、Ｃ６０にはほとんど変化はなかった。プロセス３の凍結融解実験の第２ラウンドにおいて、Ｐ６０の酵素活性は、１サイクル後に１９．１％、３サイクル後に５４．１％、５サイクル後に７１．２％低下した。ＣＰ６０では、３サイクル後に酵素活性が低下し始め、５サイクル後にＰ６０と同様のレベルに低下した。５サイクル後のＣ６０の変化は無視できる程度であった。
【0259】
純度：ＳＥＣ－ＨＰＬＣ
純度測定の結果を以下の表２０（プロセス１～２およびプロセス３の第１ラウンド）および表２１（プロセス３の第２ラウンド）に示す。
純度測定の結果を以下の表２０（プロセス１～２およびプロセス３の第１ラウンド）および表２１（プロセス３の第２ラウンド）に示す。
【0260】
【0261】
【0262】
５サイクルの高速Ｆ／Ｔ（プロセス１）または低速Ｆ／Ｔ（プロセス２）後のいずれの試料においても、ＳＥＣモノマー％の変化は検出されなかった。
【0263】
最初の低速Ｆ／Ｔ試験（プロセス３）では、Ｐ６０試料は、３サイクル後に（主にＨＭＷ種の形成による）明らかなＳＥＣモノマー％の低下を示した。また、Ｃ６０とＣＰ６０では明確な変化が生じなかった。第２のプロセス３の低速Ｆ／Ｔ試験（０．５℃／分）では、Ｐ６０試料中のモノマーは１サイクル後に低下し始め、５サイクル後、最終的に６８．１％低下した。そしてＣＰ６０では、モノマー％は３サイクル後に低下し始めたが、Ｐ６０よりもはるかに程度が低かった。しかし、５サイクル後にはＰ６０と同じレベルに達した。最大５サイクル後のＣ６０における単量体百分率に変化はなかった。
【0264】
ＳＥＣ純度の結果は、酵素濃度および活性における性能と一致しており、凍結／加熱速度、Ｆ／Ｔサイクル数および緩衝剤タイプが凍結融解プロセス中のＡＴＢ２００安定性に影響を与え得ることを確認した。リン酸ナトリウムを含有する緩衝剤は、ＳＥＣ結果に基づいて、凍結融解サイクル中においてＡＴＢ２００も保護しなかった。
【0265】
概要
クエン酸緩衝剤（Ｃ６０）中に配合されたＡＴＢ２００は、他の２つの緩衝剤（Ｐ６０およびＣＰ６０）よりもよく複数の凍結融解サイクルに耐えた。凍結融解プロセスにかかわらず、ＡＴＢ２００はクエン酸緩衝剤中で安定したままであった。
クエン酸緩衝剤（Ｃ６０）中に配合されたＡＴＢ２００は、他の２つの緩衝剤（Ｐ６０およびＣＰ６０）よりもよく複数の凍結融解サイクルに耐えた。凍結融解プロセスにかかわらず、ＡＴＢ２００はクエン酸緩衝剤中で安定したままであった。
【0266】
製剤例３：賦形剤
８種の製剤（Ｅ１－８）を種々の賦形剤で調製した。賦形剤評価試験におけるＡＴＢ２００酵素濃度は５ｍｇ／ｍＬであった。３つの緩衝剤、２つの安定剤および１つの界面活性剤を選択して、以下の表２２に記載の製剤中のタンパク質安定性を評価した。
８種の製剤（Ｅ１－８）を種々の賦形剤で調製した。賦形剤評価試験におけるＡＴＢ２００酵素濃度は５ｍｇ／ｍＬであった。３つの緩衝剤、２つの安定剤および１つの界面活性剤を選択して、以下の表２２に記載の製剤中のタンパク質安定性を評価した。
【0267】
【0268】
試料の準備
ｐＨ６．０の５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、ｐＨ６．０の５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する２５ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝剤、およびｐＨ６．０の５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する２５ｍＭリン酸ナトリウム－クエン酸塩組み合わせ緩衝剤を別々に調製した。透析カセットを用いてＡＴＢ２００酵素溶液を３つの緩衝剤に交換した。透析は、穏やかに撹拌しながら、５℃で、６～１０時間ごとに１回、各３回緩衝剤交換をして行った。
ｐＨ６．０の５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤、ｐＨ６．０の５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する２５ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝剤、およびｐＨ６．０の５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する２５ｍＭリン酸ナトリウム－クエン酸塩組み合わせ緩衝剤を別々に調製した。透析カセットを用いてＡＴＢ２００酵素溶液を３つの緩衝剤に交換した。透析は、穏やかに撹拌しながら、５℃で、６～１０時間ごとに１回、各３回緩衝剤交換をして行った。
【0269】
透析後、透析液にトレハロース、マンニトールまたはＰＳ８０を添加して、表２２に示す処方物を調製した。最後に、適量の製剤緩衝剤を添加して、最終ＡＴＢ２００濃度を５ｍｇ／ｍＬに調整した。溶液を０．２２μｍのＰＥＳフィルターで無菌的にろ過した。
【0270】
各製剤を約１ｍＬの充填容量を有するバイオセーフティーフード内の２ｍＬガラスバイアルに無菌的に充填した。バイアルに栓をし、充填後速やかにクリンプした。
【0271】
試料試験
製剤Ｅ１～８を４つの異なる条件下で試験した。各製剤のバイアルを５℃で１２週間（１２Ｗ）および４０℃で８週間（８Ｗ）貯蔵し、５サイクルの凍結融解（０．５℃／分）を行い、１００ｒｐｍで５日間、２５℃で撹拌した。サンプリングおよび試験計画を表２３に記載する。初期（Ｔ０）、２週間（２Ｗ）、４週間（４Ｗ）、８週間（８Ｗ）および１２週間（１２Ｗ）で試料を試験した。
製剤Ｅ１～８を４つの異なる条件下で試験した。各製剤のバイアルを５℃で１２週間（１２Ｗ）および４０℃で８週間（８Ｗ）貯蔵し、５サイクルの凍結融解（０．５℃／分）を行い、１００ｒｐｍで５日間、２５℃で撹拌した。サンプリングおよび試験計画を表２３に記載する。初期（Ｔ０）、２週間（２Ｗ）、４週間（４Ｗ）、８週間（８Ｗ）および１２週間（１２Ｗ）で試料を試験した。
【0272】
【0273】
結果
外観
凍結融解実験測定の外観の結果を、下記表２４（冷却器を使用）および表２５（凍結乾燥機を使用）に示す。
外観
凍結融解実験測定の外観の結果を、下記表２４（冷却器を使用）および表２５（凍結乾燥機を使用）に示す。
【0274】
【0275】
【0276】
凍結融解試験の間、ＰＳ８０を含まないＦ５およびＦ６の凍結融解サイクルの増加とともに、可視粒子はわずかに増加した。他の製剤では差異は観察されなかった。
【0277】
概要
ＰＳ８０（Ｆ５およびＦ６）を含まない製剤は、凍結融解実験においてＰＳ８０を含む製剤と同様には機能しなかった。これは、複数回の凍結－解凍サイクル後の可視粒子の形成によって証明された。
ＰＳ８０（Ｆ５およびＦ６）を含まない製剤は、凍結融解実験においてＰＳ８０を含む製剤と同様には機能しなかった。これは、複数回の凍結－解凍サイクル後の可視粒子の形成によって証明された。
【0278】
製剤例４：ヒト全血の溶血
ヒトドナーからの血液の一連の希釈液（１：２、１：３、１：４、１：５および１：１０）を生理食塩水中で調製した。脱イオン水と混合した場合、アッセイでは５４０ｎｍでＯＤが０．８から１．２になるような希釈を使用し、これを血液基質と呼んだ。試験物質、プラセボ、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールの４種類の試料を試験した。試験物質は、ｐＨ６．０で２５ｍＭのクエン酸ナトリウム、２％のマンニトールおよび０．０５％のポリソルベート８０を含む製剤中のＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡを特徴とした。プラセボはＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡがないことを除き、試験物質と同じであった。ポジティブコントロールは、注射用の滅菌水であり、ｐＨは５であった。ネガティブコントロールは生理食塩水（０．９ＮａＣｌ）であり、ｐＨは５であった。
ヒトドナーからの血液の一連の希釈液（１：２、１：３、１：４、１：５および１：１０）を生理食塩水中で調製した。脱イオン水と混合した場合、アッセイでは５４０ｎｍでＯＤが０．８から１．２になるような希釈を使用し、これを血液基質と呼んだ。試験物質、プラセボ、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールの４種類の試料を試験した。試験物質は、ｐＨ６．０で２５ｍＭのクエン酸ナトリウム、２％のマンニトールおよび０．０５％のポリソルベート８０を含む製剤中のＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡを特徴とした。プラセボはＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡがないことを除き、試験物質と同じであった。ポジティブコントロールは、注射用の滅菌水であり、ｐＨは５であった。ネガティブコントロールは生理食塩水（０．９ＮａＣｌ）であり、ｐＨは５であった。
【0279】
生理食塩水、生理食塩水を含むプラセボ、ネガティブコントロール（生理食塩水）およびポジティブコントロール（水）を用いた３００、６００および１０００μｇ／ｍｌの試験物質（ＡＴＢ２００）をヒトドナーからの血液基質と混合した。試料を３７℃で１時間撹拌せずにインキュベートした。インキュベーション後、チューブを室温で、約１００ｘｇで１０分間遠心分離した。各試料の上清中のヘモグロビンの量を、５４０ｎｍで分光光度的に分析した。
【0280】
試験物質の溶血％は、式：
によって決定される。
【0281】
水＋血液の溶血率は１００％である。生理食塩水はネガティブコントロールであった。１０％以下の溶血は有意ではないと考えられた。試験物質およびプラセボの各濃度について、溶血％を計算した。
【0282】
下記の表２６は、試験した試料の結果を示す。
【0283】
【0284】
ヒト血液基質と、３つの試験物質用量と同じ割合で生理食塩水で希釈したプラセボの３つの試料とのインキュベーションは、ヒト血液の有意な溶血を引き起こさなかった。プラセボで希釈した試料の溶血％は、それぞれ－１．３、－１．３、および０．９％と計算された。３００、６００および１０００μｇ／ｍｌのＡＴＢ２００を用いたヒト血液基質のインキュベーションは、ヒト血液の有意な溶血を引き起こさなかった。試験物質試料の溶血％は、それぞれ－０．１、－１．５％および－１．５％と計算された。
【0285】
結論として、ＡＴＢ２００製剤は、すべての希釈度でヒト血液と適合性があった。
【0286】
製剤例５：ヒト血漿および血清中の凝集
試験物質投与溶液（３濃度）およびプラセボ（３濃度）を、ドナーからのヒト血漿および血清の等容量と混合した。試験物質は、ｐＨ６．０で２５ｍＭのクエン酸ナトリウム、２％のマンニトールおよび０．０５％のポリソルベート８０を含む製剤中のＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡを特徴とした。プラセボはＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡがないことを除き、試験物質と同じであった。
試験物質投与溶液（３濃度）およびプラセボ（３濃度）を、ドナーからのヒト血漿および血清の等容量と混合した。試験物質は、ｐＨ６．０で２５ｍＭのクエン酸ナトリウム、２％のマンニトールおよび０．０５％のポリソルベート８０を含む製剤中のＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡを特徴とした。プラセボはＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡがないことを除き、試験物質と同じであった。
【0287】
試験物質またはプラセボの各用量１ｍｌを、等容量の血漿、血清および生理食塩水と混合した。試料を室温で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、チューブを巨視的におよび顕微鏡的に沈殿または凝固について検査した。各チューブからのアリコートを、マイクロ遠心分離機で、１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。各チューブをペレットの有無について調べた。沈殿／凝固およびペレットを以下のように採点した：
０＝陰性
１＝非常にわずかな沈殿またはペレット
２＝最小限の沈殿またはペレット
３＝中程度の沈殿またはペレット
４＝著しい沈殿またはペレット
０＝陰性
１＝非常にわずかな沈殿またはペレット
２＝最小限の沈殿またはペレット
３＝中程度の沈殿またはペレット
４＝著しい沈殿またはペレット
【0288】
下記の表２７は、試験した試料の結果を示す。
【0289】
【0290】
各ＡＴＢ２００濃度と混合した場合、ヒトの血漿または血清中に巨視的または顕微鏡的に沈殿は観察されなかった。プラセボ試料では沈殿は認められなかった。すべてのプラセボまたはＡＴＢ２００試料を遠心分離したところ、ペレットは観察されなかった。
【0291】
この研究の結果に基づいて、ＡＴＢ２００製剤は最大１０００μｇ／ｍｌの最終濃度（１０００μｇ／ｍｌを含む）のヒト血漿および血清と適合性であることが判明した。
【0292】
実施例：ポンペ病を有するＥＲＴ経験患者およびＥＲＴ未経験患者における、ミグルスタットと共投与した組換え酸性α－グルコシダーゼＡＴＢ２００の薬物動態および安全性データ
この実験は、ミグルスタットと併用投与されたＡＴＢ２００の安全性、忍容性、および薬物動態（ＰＫ）を主に評価するよう設計された。ＧａａノックアウトマウスのＰＫ／薬力学（ＰＤ）翻訳モデルから、ヒトにおける２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００と高用量（例えば、２６０ｍｇ）のミグルスタットとの組み合わせが、最適なグリコーゲン低減を提供することが予測される。
この実験は、ミグルスタットと併用投与されたＡＴＢ２００の安全性、忍容性、および薬物動態（ＰＫ）を主に評価するよう設計された。ＧａａノックアウトマウスのＰＫ／薬力学（ＰＤ）翻訳モデルから、ヒトにおける２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００と高用量（例えば、２６０ｍｇ）のミグルスタットとの組み合わせが、最適なグリコーゲン低減を提供することが予測される。
【0293】
以下の説明において、ミグルスタットの「高用量」は約２６０ｍｇの用量を指し、「低用量」は約１３０ｍｇの用量を指す。
【0294】
この目的は、この第１／２相試験において、１０人の患者からの予備的総ＧＡＡタンパク質、ＡＴＢ２００およびミグルスタットＰＫデータ、および安全性マーカーを評価することであった。
【0295】
これは、ポンペ病を有する成人における経口ミグルスタットと共投与したＡＴＢ２００の静脈内注入の安全性、忍容性、ＰＫ、ＰＤ、および有効性を評価するための、オープンラベル、一定連続、用量漸増、ヒト初回、第１／２相実験の実験デザインを示す（図２１）。来診９を通じた最初の８人のコホート１患者、および最初の２人のコホート３患者からの、平均総ＧＡＡタンパク質およびミグルスタットＰＫの結果の評価を行った。
ａコホート２および３での投与前に、各用量レベルにおいて、コホート１の２人のセンチネル患者からの安全データをレビューした。
ｂステージ２および３では、ＡＴＢ２００静脈内注入の開始前にミグルスタットを経口投与した。すべての用量について、ＡＴＢ２００を静脈内に４時間注入した。
ｃコホート２および３の最初の２人の患者は、それぞれのコホートにつきセンチネル患者となった。
ａコホート２および３での投与前に、各用量レベルにおいて、コホート１の２人のセンチネル患者からの安全データをレビューした。
ｂステージ２および３では、ＡＴＢ２００静脈内注入の開始前にミグルスタットを経口投与した。すべての用量について、ＡＴＢ２００を静脈内に４時間注入した。
ｃコホート２および３の最初の２人の患者は、それぞれのコホートにつきセンチネル患者となった。
【0296】
主要な参加基準
・報告されたＧＡＡ酵素活性の欠乏に基づいて、またはＧＡＡ遺伝子型判定によって、ポンペ病と診断された１８～６５才の男性および女性
・試験開始前に２～６年間（コホート２については２年以上）、アルグルコシダーゼアルファを用いてＥＲＴを受けた（コホート１）
・現在、隔週の頻度でアルグルコシダーゼアルファを投与されており、投薬中断を生じる薬物関連有害事象なしに最後の２回の注入を完了した（コホート１および２）
・６分間歩行試験（コホート１および３）で２００～５００メートルを歩くことができなければならない
・直立努力性肺活量は、予測正常値の３０％～８０％でなければならない（コホート１および３）
・車椅子生活であり、補助なしで歩行することが不能でなければならない（コホート２）
ＰＫ分析：
・血漿総ＧＡＡタンパク質および活性濃度についての血液試料を収集した
・ステージ１：ＡＴＢ２００注入の開始前、および注入の１、２、３、３．５、４、４．５、５、６、８、１０、１２および２４時間後
・ステージ２および３：ミグルスタット経口投与後１、２、３、４、４．５、５、６、７、９、１１、１３および２５時間
・血漿ミグルスタット濃度の血液試料は、ミグルスタット経口投与の直前（時間０）およびミグルスタット経口投与後１、１．５、２、２．５、３、４、５、６、９、１１および２５時間後に採取した。血漿ミグルスタットは、有効なＬＣ－ＭＳ／ＭＳアッセイによって決定される
・ＡＴＢ２００についての血漿中の総ＧＡＡタンパク質濃度５、１０および２０ｍｇ／ｋｇを、ｒｈＧＡＡ特異的「シグネチャー」ペプチド（単数または複数）の有効なＬＣ－ＭＳ／ＭＳ定量化によって決定した
・報告されたＧＡＡ酵素活性の欠乏に基づいて、またはＧＡＡ遺伝子型判定によって、ポンペ病と診断された１８～６５才の男性および女性
・試験開始前に２～６年間（コホート２については２年以上）、アルグルコシダーゼアルファを用いてＥＲＴを受けた（コホート１）
・現在、隔週の頻度でアルグルコシダーゼアルファを投与されており、投薬中断を生じる薬物関連有害事象なしに最後の２回の注入を完了した（コホート１および２）
・６分間歩行試験（コホート１および３）で２００～５００メートルを歩くことができなければならない
・直立努力性肺活量は、予測正常値の３０％～８０％でなければならない（コホート１および３）
・車椅子生活であり、補助なしで歩行することが不能でなければならない（コホート２）
ＰＫ分析：
・血漿総ＧＡＡタンパク質および活性濃度についての血液試料を収集した
・ステージ１：ＡＴＢ２００注入の開始前、および注入の１、２、３、３．５、４、４．５、５、６、８、１０、１２および２４時間後
・ステージ２および３：ミグルスタット経口投与後１、２、３、４、４．５、５、６、７、９、１１、１３および２５時間
・血漿ミグルスタット濃度の血液試料は、ミグルスタット経口投与の直前（時間０）およびミグルスタット経口投与後１、１．５、２、２．５、３、４、５、６、９、１１および２５時間後に採取した。血漿ミグルスタットは、有効なＬＣ－ＭＳ／ＭＳアッセイによって決定される
・ＡＴＢ２００についての血漿中の総ＧＡＡタンパク質濃度５、１０および２０ｍｇ／ｋｇを、ｒｈＧＡＡ特異的「シグネチャー」ペプチド（単数または複数）の有効なＬＣ－ＭＳ／ＭＳ定量化によって決定した
【0297】
ステージ１およびステージ２を完了したコホート１の患者８人およびステージ３を開始したコホート３の患者２人について予備分析を完了した。
・最初のＥＲＴスイッチ患者は、ポンペ病の集団を代表しており、平均５．０２年のＥＲＴを受けていた（表２８）
・最初のＥＲＴスイッチ患者は、ポンペ病の集団を代表しており、平均５．０２年のＥＲＴを受けていた（表２８）
【0298】
【0299】
総ＧＡＡタンパク質
単独で投与された場合、ＡＴＢ２００はわずかに用量比例を上回って増加する（表２９および図２２Ａ～２２Ｄ）。変動性は、ミグルスタット投与量とともに増加するようである（図２２Ｃ）。２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００と高用量のミグルスタット（２６０ｍｇ）との共投与は、２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００単独と比較して総ＧＡＡタンパク質曝露（ＡＵＣ）を約２５％増加させた。分布半減期（α相）は４５％増加し、これは高用量のミグルスタットがＡＴＢ２００を血漿中で安定化させることを示唆している。分布半減期の増加には、投与後約１２時間までの、時間から最大血漿濃度までのＡＵＣの増加が付随する。ＡＵＣおよび半減期の増加は、末端排出段階の間、対数スケールで観察することができる（図２２Ｂ）。ＡＴＢ２００は比較的高い分布容積を示した。血漿総ＧＡＡタンパク質の性質は、ＥＲＴ未経験患者（コホート３）とＥＲＴ経験患者（コホート１）との間で類似しているようである（図２２Ａおよび２２Ｄ）。
単独で投与された場合、ＡＴＢ２００はわずかに用量比例を上回って増加する（表２９および図２２Ａ～２２Ｄ）。変動性は、ミグルスタット投与量とともに増加するようである（図２２Ｃ）。２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００と高用量のミグルスタット（２６０ｍｇ）との共投与は、２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００単独と比較して総ＧＡＡタンパク質曝露（ＡＵＣ）を約２５％増加させた。分布半減期（α相）は４５％増加し、これは高用量のミグルスタットがＡＴＢ２００を血漿中で安定化させることを示唆している。分布半減期の増加には、投与後約１２時間までの、時間から最大血漿濃度までのＡＵＣの増加が付随する。ＡＵＣおよび半減期の増加は、末端排出段階の間、対数スケールで観察することができる（図２２Ｂ）。ＡＴＢ２００は比較的高い分布容積を示した。血漿総ＧＡＡタンパク質の性質は、ＥＲＴ未経験患者（コホート３）とＥＲＴ経験患者（コホート１）との間で類似しているようである（図２２Ａおよび２２Ｄ）。
【0300】
【0301】
ミグルスタットＰＫ
ミグルスタットは用量比例的動態を示した（表３０および図２３）。血漿ミグルスタットは、単回投与と複数投与の間で同様のようである。
ミグルスタットは用量比例的動態を示した（表３０および図２３）。血漿ミグルスタットは、単回投与と複数投与の間で同様のようである。
【0302】
【0303】
薬力学
コホート１からのＥＲＴ経験患者における１１回目の来診までに（図２４Ａおよび２４Ｂ）：
・アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）は８人中５人の患者で減少し、上昇したベースラインレベルを有する４／４人の患者が標準化された
・アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）は８人中６人の患者で減少し、上昇したベースラインレベルを有する３／４人の患者が標準化された
・クレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）は８人中６人の患者で減少し、上昇したベースラインレベルを有する２／６人の患者が標準化された
・尿中グルコース四糖（ＨＥＸ４）濃度は、８人の患者のうち８人で減少した
コホート１からのＥＲＴ経験患者における１１回目の来診までに（図２４Ａおよび２４Ｂ）：
・アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）は８人中５人の患者で減少し、上昇したベースラインレベルを有する４／４人の患者が標準化された
・アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）は８人中６人の患者で減少し、上昇したベースラインレベルを有する３／４人の患者が標準化された
・クレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）は８人中６人の患者で減少し、上昇したベースラインレベルを有する２／６人の患者が標準化された
・尿中グルコース四糖（ＨＥＸ４）濃度は、８人の患者のうち８人で減少した
【0304】
第４週までに、治療未経験コホート（コホート３）の２人の患者において、４つのバイオマーカーレベルがすべて減少した（図２４Ｃおよび２４Ｄ）。
【0305】
図２４Ａ～２４Ｄにおいて、データは平均±標準誤差として表される。
【0306】
安全性
・すべての患者において１５５回以上の全注入後に重篤な有害事象（ＡＥ）または注入関連反応は報告されなかった
・１１／１３（８４％）の患者で報告された、処置により発生したＡＥは、一般に軽度かつ一時的であった。
・７／１３（５３％）の患者で報告された処置関連ＡＥ：悪心（ｎ＝１）、疲労（ｎ＝１）、頭痛（ｎ＝１）、振戦（ｎ＝２）、ざ瘡（ｎ＝１）、頻脈（ｎ＝１）および低血圧（ｎ＝１）。
・すべての患者において１５５回以上の全注入後に重篤な有害事象（ＡＥ）または注入関連反応は報告されなかった
・１１／１３（８４％）の患者で報告された、処置により発生したＡＥは、一般に軽度かつ一時的であった。
・７／１３（５３％）の患者で報告された処置関連ＡＥ：悪心（ｎ＝１）、疲労（ｎ＝１）、頭痛（ｎ＝１）、振戦（ｎ＝２）、ざ瘡（ｎ＝１）、頻脈（ｎ＝１）および低血圧（ｎ＝１）。
【0307】
結論
・ＡＴＢ２００単独およびミグルスタットとの併用は、安全かつ十分に忍容されており、これまで輸液関連反応はなかった。
・ＡＴＢ２００単独では暴露において用量比例を上回る増加を示し、これはミグルスタットでさらに増強され、ＡＴＢ２００に対するシャペロンの安定化効果を示唆している。
・標準治療からＡＴＢ２００／ミグルスタットに切り替えた後、患者は一般に筋肉損傷のバイオマーカーの改善を示し、多くの患者が１８週目までに正常化を示した。
・ＡＴＢ２００／ミグルスタットで治療された最初の２人の治療未経験患者は、筋肉損傷のすべてのバイオマーカーにおいて強い減少を示した
・ＡＴＢ２００単独およびミグルスタットとの併用は、安全かつ十分に忍容されており、これまで輸液関連反応はなかった。
・ＡＴＢ２００単独では暴露において用量比例を上回る増加を示し、これはミグルスタットでさらに増強され、ＡＴＢ２００に対するシャペロンの安定化効果を示唆している。
・標準治療からＡＴＢ２００／ミグルスタットに切り替えた後、患者は一般に筋肉損傷のバイオマーカーの改善を示し、多くの患者が１８週目までに正常化を示した。
・ＡＴＢ２００／ミグルスタットで治療された最初の２人の治療未経験患者は、筋肉損傷のすべてのバイオマーカーにおいて強い減少を示した
【0308】
配列
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図9E】
【図9F】
【図9G】
【図9H】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18A】
【図18B】
【図19A】
【図19B】
【図19C】
【図19D】
【図19E】
【図19F】
【図19G】
【図20】
【図21】
【図22A】
【図22B】
【図22C】
【図22D】
【図23】
【図24A】
【図24B】
【図24C】
【図24D】
【配列表】