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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-06-26
(45)【発行日】2024-07-04
(54)【発明の名称】光照射型美容機器
(51)【国際特許分類】
A61N 5/06 20060101AFI20240627BHJP
【ＦＩ】
A61N5/06 Z
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2019122880
(22)【出願日】2019-07-01
(65)【公開番号】P2021007632
(43)【公開日】2021-01-28
【審査請求日】2022-04-26
(73)【特許権者】
【識別番号】000005810
【氏名又は名称】マクセル株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100122297
【弁理士】
【氏名又は名称】西下 正石
(72)【発明者】
【氏名】若林 寿枝
(72)【発明者】
【氏名】片山 秀昭
(72)【発明者】
【氏名】能勢 学
【審査官】豊田 直希
(56)【参考文献】
【文献】特表２００７－５０２６４２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００４－２４２７９０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００５－５１９６９２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００６－５１１２７５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開平１０－１６５５２４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１１－５００２５８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００５－３１２６４１（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｎ ５／０６
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
可視光線を含む広波長帯域の光線を放射する光源と、該光源から放射される光線のうちの特定の波長成分を選択的に透過させる光学フィルターと、光照射エネルギー量を制御する手段とを備える光照射型美容機器であって、該光照射エネルギー量を制御する手段は、照射部位における光照射エネルギー量を３８Ｊ／ｃｍ２以下に制限し、
該光源は、電極における色温度が摂氏３０００度未満であるハロゲンランプであり、
照射光は８００～２４００ｎｍの波長成分から成り、
該光照射型美容機器は、使用者の皮膚に対し所定波長の光を照射することにより、皮膚の美観の改善を図るものである、光照射型美容機器。
【請求項2】
前記該光照射エネルギー量を制御する手段は、照射部位における光照射エネルギー量を３～３８Ｊ／ｃｍ２に制御する、請求項１に記載の光照射型美容機器。
【請求項3】
前記該光照射エネルギー量を制御する手段は、照射部位における光照射エネルギー量を３～１１Ｊ／ｃｍ２に制御する、請求項１に記載の光照射型美容機器。
【請求項4】
光源の照射形態は連続照射である、請求項１～３のいずれか一項に記載の光照射美容機器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、使用者の皮膚に対し、光照射による美容効果を与える機器に関する。美容効果とは、皮膚表面の外見を含む人の容姿を美しくする効果をいう。
【背景技術】
【0002】
使用者の顔等の皮膚（即ち、肌）に対し所定波長の光を照射することにより、皮膚の美観の改善を図る美容機器は、従来から知られている。
【0003】
特許文献１及び特許文献２には、使用者の皮膚に対し可視光及び近赤外線を照射して、シミ、シワの改善、殺菌等を図る美容機器が記載されている。しかしながら、これらの従来の美容機器は、光源として発光ダイオード（即ち、ＬＥＤ）を用いている。ＬＥＤは照射強度が小さく、照射波長範囲が狭い。それゆえ、従来の美容機器では、実質的な美容効果を得るためには、長時間にわたって照射を行う必要があり、利便性が低い。
【0004】
特許文献３には、光源として、照射強度が大きく、照射波長範囲が広いハロゲンランプを使用した光治療装置が記載されている。この光治療装置は、非レーザー光の照射により、疼痛緩和、細胞の活性化による諸種の効果を奏し得るものである。しかしながら、特許文献３には、この装置を使用して美容効果を得ることは記載されていない。
【0005】
皮膚に光を照射する場合、適切な照射エネルギー量で行われた場合は細胞を活性化させる。一方で、光照射エネルギーが過多になると、過剰な細胞刺激を引き起こし、大きな美容効果が期待できない問題がある。それゆえ、美容機器にハロゲンランプ等の照射強度の大きい光源を使用する場合は、過剰な細胞刺激が生じない光照射エネルギー量の閾値を決定する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【文献】特開２００５－１２５０７５号公報
【文献】特開２００７－３３０６９０号公報
【文献】特開２００８－１８８２５８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は上記従来の問題を解決するものであり、その目的とするところは、短時間の光照射によって美容効果を得ることができ、照射過多による美容効果の低減が生じない光照射型美容機器を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明は、可視光線を含む広波長帯域の光線を放射する光源と、該光源から放射される光線のうちの特定の波長成分を選択的に透過させる光学フィルターと、光照射エネルギー量を制御する手段とを備え、
該光照射エネルギー量を制御する手段は、照射部位における光照射エネルギー量を３８Ｊ／ｃｍ２以下に制限する、光照射型美容機器を提供する。
該光照射エネルギー量を制御する手段は、照射部位における光照射エネルギー量を３８Ｊ／ｃｍ２以下に制限する、光照射型美容機器を提供する。
【0009】
ある一形態においては、前記該光照射エネルギー量を制御する手段は、照射部位における光照射エネルギー量を３～３８Ｊ／ｃｍ２に制御する。
【0010】
ある一形態においては、前記光源は、電極における色温度が摂氏３０００度未満であるハロゲンランプである。
【発明の効果】
【0011】
本発明によれば、短時間の光照射によって美容効果を得ることができ、照射過多による美容効果の低減が生じない光照射型美容機器が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】本発明の光照射型美容機器の構成を示した模式図である。
【図2】ヒト三次元培養表皮の細胞増殖率に及ぼす連続的光照射の影響を示したグラフである。
【図3】ヒト三次元培養表皮の細胞増殖率に及ぼす間欠的光照射の影響を示したグラフである。
【図4】皮膚の保湿機能に関わる遺伝子であるＴＧＭ１に関し、照射時間０分の発現量を１とした時の光照射後の発現量を示したグラフである。
【図5】皮膚の保湿機能に関わる遺伝子であるＨＡＳ３に関し、照射時間０分の発現量を１とした時の光照射後の発現量を示したグラフである。
【図6】抗老化に関わる遺伝子であるＣＯＬ１Ａ１に関し、照射時間０分の発現量を１とした時の光照射後の発現量を示したグラフである。
【図7】抗老化に関わる遺伝子であるＭＭＰ１に関し、照射時間０分の発現量を１とした時の光照射後の発現量を示したグラフである。
【図8】抗老化に関わる遺伝子であるＥＬＮに関し、照射時間０分の発現量を１とした時の光照射後の発現量を示したグラフである。
【図9】抗老化に関わる遺伝子であるＭＭＥに関し、照射時間０分の発現量を１とした時の光照射後の発現量を示したグラフである。
【図10】抗老化成分であるヒアルロン酸に関し、照射時間０分の酸産生量を１００％とした場合の光照射による産生量を示したグラフである。
【図11】抗老化成分であるヒアルロン酸に関し、照射時間０分の細胞あたりの産生量を１００％とした場合の光照射による細胞あたりの産生量を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0013】
図１は本発明の光照射型美容機器の構成を示した模式図である。光照射型美容機器は、光源１と、光源が放射する光線を遮るように配置された光学フィルター２とを、有する。光源が放射する光線は光学フィルター２を透過して、特定範囲の波長を有する照射光３になる。一般に、照射光３は皮膚の表面に照射される。
【0014】
光源としてはハロゲンランプ、キセノンランプ、ＬＥＤなどの非レーザー光源が使用可能である。これらのうち、照射強度が大きく、照射効率が高く、取り扱いが容易なハロゲンランプを光源として使用することが好ましい。
【0015】
光源の電極における色温度は３０００度未満である。光源の電極における色温度が３０００度以上であると、美容効果に寄与しない光が増加する。光源の電極における色温度は、好ましくは２０００～２９００度、より好ましくは２５００～２８００度である。
【0016】
光学フィルターは、光源が発した光のうち特定の波長領域の光線を選択的に透過もしくはカットする部材をいう。美容効果に寄与する光を増加させる観点から、好ましくは、透過率が５０％になるカット波長が８００ｎｍ未満である光学フィルターを使用する。その結果、照射光は、好ましくは８００ｎｍ以上、より好ましくは８００～２４００ｎｍ、更に好ましくは８３０～２２００ｎｍの波長成分を有する。
【0017】
本発明の光照射型美容機器は、光照射エネルギー量を制御する手段（図示せず。）を有する。光照射エネルギー量を制御する手段は、放射照度を調節し、光照射時間を調節し、機器と皮膚の距離をモニターし、照射をＯＮ／ＯＦＦする機能を有する。
【0018】
光照射は適度に行うことで細胞を活性化させて、美容効果を実現する。一方、光照射が過多になると過剰な細胞刺激が発生し、美容効果が期待できない問題がある。照射過多による美容効果の低減を防止するために、光照射エネルギー量を制御する手段は、光照射エネルギー量が、照射対象である人体の照射部位に過剰な細胞刺激が発生する量に達する前に光照射を停止する。
【0019】
照射部位に過剰な細胞刺激を発生させない光照射エネルギーの最大量は、放射照度に依存して変化する。放射照度が低い場合はその照射時間が長くなり、放射照度が高い場合はその照射時間が短くなる。光照射エネルギーは、光源の出力、照射の断続性、照射距離、フィルターの特性に依存して変化する。
【0020】
照射部位に過剰な細胞刺激を発生させない光照射エネルギーの最大量が最も高くなる照射形態は、光源の出力が最大、連続照射、及び近接照射である。安全性を重視する場合、照射部位に過剰な細胞刺激を発生させない光照射エネルギーの最大量は、上記最大量が最も高くなる照射形態の下で決定することが好ましい。
【0021】
本発明の光照射型美容機器において、照射部位に過剰な細胞刺激を発生させない光照射エネルギーの最大量は、好ましくは３８Ｊ／ｃｍ２である。上記最大量が３８Ｊ／ｃｍ２を超えると皮膚の美容に美容効果が期待できない問題が生じる可能性がある。
【0022】
本発明の光照射型美容機器において、照射部位に過剰な細胞刺激を発生させない光照射エネルギー量は、より好ましくは３～１９Ｊ／ｃｍ２である。上記光照射エネルギー量が３Ｊ／ｃｍ２未満であると、美容効果が不十分となり、１９Ｊ／ｃｍ２を超えて照射しても、光照射エネルギー量の増大に対応した美容効果が得られない。
【0023】
光照射エネルギーは、放射照度、照射時間および照射距離の調整を行うことにより決定することができる。
【0024】
照射光は人体のいずれかの表面、例えば、皮膚の表面に照射される。光照射部位は、一般に、人体の美容効果が要求される部位、例えば、外部に露出する部位における皮膚の表面である。光照射部位は、例えば、顔面、手足の甲、上腕、前腕、上腿、下肢、手のひら、頭皮、首筋の皮膚の表面である。
【0025】
照射部位から光源までの距離、即ち、照射距離は２～５０ｃｍである。照射距離が２ｃｍ以下であると、照射過多による美容効果の低減が生じ易くなり、５０ｃｍを超えると、美容効果を得るために長時間の照射が必要になり、利便性が低下する。照射距離は、好ましくは５～４５ｃｍ、より好ましくは１０～４０ｃｍである。
【実施例】
【0026】
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【0027】
＜実施例１＞
ヒト三次元培養表皮に光照射し、細胞生存率試験を実施した。材料、試験方法及び結果を以下に説明する。
ヒト三次元培養表皮に光照射し、細胞生存率試験を実施した。材料、試験方法及び結果を以下に説明する。
【0028】
１．細胞と培地
ヒト三次元培養表皮（ＬａｂＣｙｔｅ ＥＰＩ－ＭＯＤＥＬ２４、Ｊ－ＴＥＣ社製）は、アッセイ培地（Ｊ－ＴＥＣ社製）を用い、ＣＯ２インキュベータ（ＣＯ２濃度５％、３７℃）内で培養した。
ヒト三次元培養表皮（ＬａｂＣｙｔｅ ＥＰＩ－ＭＯＤＥＬ２４、Ｊ－ＴＥＣ社製）は、アッセイ培地（Ｊ－ＴＥＣ社製）を用い、ＣＯ２インキュベータ（ＣＯ２濃度５％、３７℃）内で培養した。
【0029】
２．被験機器
１）ハロゲンランプ（ウシオ電機社製）
出力：６００Ｗ、１００Ｖ
色温度：２８００Ｋ
発光波長：３００～２４００ｎｍ
２）光学フィルター（伊藤光学社製「カットフィルター」（商品名））
透過波長：８００ｎｍ以上
１）ハロゲンランプ（ウシオ電機社製）
出力：６００Ｗ、１００Ｖ
色温度：２８００Ｋ
発光波長：３００～２４００ｎｍ
２）光学フィルター（伊藤光学社製「カットフィルター」（商品名））
透過波長：８００ｎｍ以上
【0030】
３．試験操作
１）ＥＰＩ－ＭＯＤＥＬ２４の説明書に従いウェルプレートに培地を加え、ヒト三次元培養表皮を移し、ＣＯ２インキュベータ内で１５時間培養後、ＰＢＳ（―）で洗浄した。
２）ハロゲンランプと細胞を入れたディッシュとの間に光学フィルターを設置した。ディッシュ内の細胞に対し、光学フィルターを介して光照射した。ハロゲンランプからディッシュまでの距離は４０ｃｍとした。照射は連続して行い、照射時間は計９種類（０分、１分、２分、４分、８分、１５分）とした。
３）分光分布および放射照度の測定を行うことにより、照射光（波長３００～２４００ｎｍ）の照射部位（照射距離４０ｃｍ）における照射エネルギーを決定したところ、１秒当たり８０ｍＪ／ｃｍ２であった。照射時間を照射エネルギーに換算した結果を以下の表に示す。
１）ＥＰＩ－ＭＯＤＥＬ２４の説明書に従いウェルプレートに培地を加え、ヒト三次元培養表皮を移し、ＣＯ２インキュベータ内で１５時間培養後、ＰＢＳ（―）で洗浄した。
２）ハロゲンランプと細胞を入れたディッシュとの間に光学フィルターを設置した。ディッシュ内の細胞に対し、光学フィルターを介して光照射した。ハロゲンランプからディッシュまでの距離は４０ｃｍとした。照射は連続して行い、照射時間は計９種類（０分、１分、２分、４分、８分、１５分）とした。
３）分光分布および放射照度の測定を行うことにより、照射光（波長３００～２４００ｎｍ）の照射部位（照射距離４０ｃｍ）における照射エネルギーを決定したところ、１秒当たり８０ｍＪ／ｃｍ２であった。照射時間を照射エネルギーに換算した結果を以下の表に示す。
【0031】
［表１］
【0032】
４）培地を加えたウェルに、光照射及び洗浄したヒト三次元培養表皮を移して４２時間ＣＯ２インキュベータ内で培養した。
５）培養終了後、ＭＴＴ溶液（０．５ｍｇ／ｍＬ培地）を加えたヒト三次元培養表皮を移して３時間ＣＯ２インキュベータ内で培養した。
６）３時間後、２－プロパノール（Ｗａｋｏ社製）を加えたマイクロチューブに、ピンセットで取り出した培養表皮片を移した。
７）１５時間以上遮光冷蔵で不溶性ホルマザンを抽出した。
８）マイクロチューブ内の色素を均一分散した後、９６ウェルプレートに移し、マイクロプレートリーダーを用いて５７０ｎｍ及び６５０ｎｍの吸光度（ＯＤ５７０、ＯＤ６５０）を測定した。また、ブランクには２－プロパノールを用いた。
５）培養終了後、ＭＴＴ溶液（０．５ｍｇ／ｍＬ培地）を加えたヒト三次元培養表皮を移して３時間ＣＯ２インキュベータ内で培養した。
６）３時間後、２－プロパノール（Ｗａｋｏ社製）を加えたマイクロチューブに、ピンセットで取り出した培養表皮片を移した。
７）１５時間以上遮光冷蔵で不溶性ホルマザンを抽出した。
８）マイクロチューブ内の色素を均一分散した後、９６ウェルプレートに移し、マイクロプレートリーダーを用いて５７０ｎｍ及び６５０ｎｍの吸光度（ＯＤ５７０、ＯＤ６５０）を測定した。また、ブランクには２－プロパノールを用いた。
【0033】
９）細胞生存率の計算
各ウェルのＯＤ５７０から、それぞれのＯＤ６５０を差し引いた。算出した光照射の吸光度（ＯＤ５７０－ＯＤ６５０）から、ブランクの値（ＯＤ５７０－ＯＤ６５０）を差し引いた。それらの値を用いて、０分の光照射に対する各照射時間の細胞生存率を以下の式に従い算出した。
細胞生存率（％）＝（照射時間１～４分の測定値／ 照射時間０分の測定値）×１００
測定値：（Ａ－Ｂ）－（Ｃ－Ｄ）
Ａ：照射時間０～４分の５７０ｎｍでの吸光度
Ｂ：照射時間０～４分の６５０ｎｍでの吸光度
Ｃ：ブランクの５７０ｎｍでの吸光度
Ｄ：ブランクの６５０ｎｍでの吸光度
各ウェルのＯＤ５７０から、それぞれのＯＤ６５０を差し引いた。算出した光照射の吸光度（ＯＤ５７０－ＯＤ６５０）から、ブランクの値（ＯＤ５７０－ＯＤ６５０）を差し引いた。それらの値を用いて、０分の光照射に対する各照射時間の細胞生存率を以下の式に従い算出した。
細胞生存率（％）＝（照射時間１～４分の測定値／ 照射時間０分の測定値）×１００
測定値：（Ａ－Ｂ）－（Ｃ－Ｄ）
Ａ：照射時間０～４分の５７０ｎｍでの吸光度
Ｂ：照射時間０～４分の６５０ｎｍでの吸光度
Ｃ：ブランクの５７０ｎｍでの吸光度
Ｄ：ブランクの６５０ｎｍでの吸光度
【0034】
４．試験結果
ヒト三次元培養表皮の細胞増殖率に及ぼす光照射の影響を図２に示した。
ヒト三次元培養表皮の細胞増殖率に及ぼす光照射の影響を図２に示した。
【0035】
＜実施例２＞
ハロゲンランプの電源を１２秒周期でＯＮ／ＯＦＦさせて、光を間欠的に照射したこと以外は実施例１と同様にして、ヒト三次元培養表皮の細胞増殖率試験を実施した。ヒト三次元培養表皮の細胞増殖率に及ぼす光照射の影響を図３に示した。
ハロゲンランプの電源を１２秒周期でＯＮ／ＯＦＦさせて、光を間欠的に照射したこと以外は実施例１と同様にして、ヒト三次元培養表皮の細胞増殖率試験を実施した。ヒト三次元培養表皮の細胞増殖率に及ぼす光照射の影響を図３に示した。
【0036】
＜実施例３＞
皮膚の保湿機能に関わる遺伝子の発現に対する光照射の効果を、リアルタイムＰＣＲ法により評価した。材料、試験方法及び結果を以下に説明する。
皮膚の保湿機能に関わる遺伝子の発現に対する光照射の効果を、リアルタイムＰＣＲ法により評価した。材料、試験方法及び結果を以下に説明する。
【0037】
１．細胞
ヒト由来表皮角化細胞株「ＨａＣａＴ」細胞を、ＣＯ２インキュベータ（ＣＯ２濃度５％、３７℃）を用いて培養した。
ヒト由来表皮角化細胞株「ＨａＣａＴ」細胞を、ＣＯ２インキュベータ（ＣＯ２濃度５％、３７℃）を用いて培養した。
【0038】
２．培地
１０．０％（ｖ／ｖ）のＦｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）、及び１．０％（ｖ／ｖ）の抗真菌剤（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ １００Ｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ、Ｗａｋｏ社製）を用いた。
１０．０％（ｖ／ｖ）のＦｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）、及び１．０％（ｖ／ｖ）の抗真菌剤（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ １００Ｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ、Ｗａｋｏ社製）を用いた。
【0039】
３．被験機器
１）ハロゲンランプ（岩崎電機社製）
出力：６００Ｗ、１００Ｖ
色温度：２８００Ｋ
発光波長：３００～２４００ｎｍ
２）光学フィルター（渋谷光学社製「ＣＭ０３０」）
透過波長：８００ｎｍ以上
１）ハロゲンランプ（岩崎電機社製）
出力：６００Ｗ、１００Ｖ
色温度：２８００Ｋ
発光波長：３００～２４００ｎｍ
２）光学フィルター（渋谷光学社製「ＣＭ０３０」）
透過波長：８００ｎｍ以上
【0040】
４．遺伝子
ＴａｑＭａｎ Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて遺伝子発現解析を実施した。
ＴａｑＭａｎ Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて遺伝子発現解析を実施した。
【0041】
４－１．対象遺伝子
１）皮膚のバリア機能に関わる ＣＥ 形成や成熟を促進する酵素をコードするトランスグルタミナーゼ１遺伝子である、Ｈｕｍａｎ Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ－１（ＴＧＭ１，Ａｓｓａｙ ＩＤ． Ｈｓ００１６５９２９＿ｍ１）
２）表皮細胞で産生され、皮膚の水分保持に関与するヒアルロン酸合成酵素３をコードする遺伝子である、Ｈｕｍａｎ Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ Ｓｙｎｔｈａｓｅ ３（ＨＡＳ３，Ａｓｓａｙ ＩＤ． Ｈｓ００１９３４３６＿ｍ１）
１）皮膚のバリア機能に関わる ＣＥ 形成や成熟を促進する酵素をコードするトランスグルタミナーゼ１遺伝子である、Ｈｕｍａｎ Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ－１（ＴＧＭ１，Ａｓｓａｙ ＩＤ． Ｈｓ００１６５９２９＿ｍ１）
２）表皮細胞で産生され、皮膚の水分保持に関与するヒアルロン酸合成酵素３をコードする遺伝子である、Ｈｕｍａｎ Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ Ｓｙｎｔｈａｓｅ ３（ＨＡＳ３，Ａｓｓａｙ ＩＤ． Ｈｓ００１９３４３６＿ｍ１）
【0042】
４－２．内部標準遺伝子
Ｈｕｍａｎ Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ （ＧＡＰＤＨ， Ａｓｓａｙ ＩＤ． Ｈｓ０２７８６６２４＿ｇ１）
Ｈｕｍａｎ Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ （ＧＡＰＤＨ， Ａｓｓａｙ ＩＤ． Ｈｓ０２７８６６２４＿ｇ１）
【0043】
５．試験方法
光照射を含め、試験に関わる操作は別途記載のないかぎり室温で実施した。
光照射を含め、試験に関わる操作は別途記載のないかぎり室温で実施した。
【0044】
５－１．細胞培養および照射
１）ディッシュに８×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの「ＨａＣａＴ」細胞を播種し、ＣＯ２インキュベータ内で２４時間培養した。
２）細胞の培地を除去し、ＰＢＳ（－）で洗浄、置換した。
３）ハロゲンランプと細胞を入れたディッシュとの間に光学フィルターを設置した。ディッシュ内の細胞に対し、光学フィルターを介して光照射した。ハロゲンランプからディッシュまでの距離は４０ｃｍとした。照射は連続して行い、照射時間は計５種類（０分、０．２５分、０．５分、１分、２分）とした。
放射照度測定を行うことにより、照射光（波長３００～２４００ｎｍ）の照射部位（照射距離４０ｃｍ）における照射エネルギーを決定したところ、１秒当たり９１ｍＪ／ｃｍ２であった。照射時間を照射エネルギーに換算した結果を以下の表に示す。
１）ディッシュに８×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの「ＨａＣａＴ」細胞を播種し、ＣＯ２インキュベータ内で２４時間培養した。
２）細胞の培地を除去し、ＰＢＳ（－）で洗浄、置換した。
３）ハロゲンランプと細胞を入れたディッシュとの間に光学フィルターを設置した。ディッシュ内の細胞に対し、光学フィルターを介して光照射した。ハロゲンランプからディッシュまでの距離は４０ｃｍとした。照射は連続して行い、照射時間は計５種類（０分、０．２５分、０．５分、１分、２分）とした。
放射照度測定を行うことにより、照射光（波長３００～２４００ｎｍ）の照射部位（照射距離４０ｃｍ）における照射エネルギーを決定したところ、１秒当たり９１ｍＪ／ｃｍ２であった。照射時間を照射エネルギーに換算した結果を以下の表に示す。
【0045】
［表２］
【0046】
４）細胞へ光照射した後、ＰＢＳ（－）を培地に置換し、ＣＯ２インキュベータ内で１８時間培養した。
【0047】
５－２．ＲＮＡ抽出・精製および定量
ＰｕｒｅＬｉｎｋＴＭ ＲＮＡ ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（商品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、説明書に従いＲＮＡを抽出及び精製した。その後、Ｔｒｉｓ―ＥＤＴＡ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）により希釈して、ＲＮＡ濃度を１０μｇ／ｍＬに調整した。
ＰｕｒｅＬｉｎｋＴＭ ＲＮＡ ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（商品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、説明書に従いＲＮＡを抽出及び精製した。その後、Ｔｒｉｓ―ＥＤＴＡ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）により希釈して、ＲＮＡ濃度を１０μｇ／ｍＬに調整した。
【0048】
５－３．リアルタイム ＰＣＲ 法による遺伝子発現解析
１）ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商品名） ＩＶ ＶＩＬＯ（商品名） Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ｅｚＤＮａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、説明書に従いｃＤＮＡを合成した。
２）ＰＣＲプレートに１０μＬのＴａｑＭａｎ（商品名） Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、１μＬのＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｒ、７μＬのＵｌｔｒａＰｕｒｅ（商品名） Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）及び２μＬのｃＤＮＡを加えた。
３）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ｑＰＣＲを行い、照射時間０～２分における各遺伝子の蛍光シグナルが任意の閾値に達する時のサイクル数であるＴｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ（Ｃｔ）値を算出した。内部標準遺伝子によりＣｔ値を補正し、ΔＣｔ値とした。光未照射のΔＣｔ値によりΔＣｔ値を補正し、これをΔΔＣｔ値とした。ΔΔＣｔ法によって１サイクルあたりの検出差を２倍量とし、２－ΔΔＣｔに代入して照射時間０分の遺伝子発現量を１とした場合の光照射時の遺伝子発現量を評価した。
１）ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商品名） ＩＶ ＶＩＬＯ（商品名） Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ｅｚＤＮａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、説明書に従いｃＤＮＡを合成した。
２）ＰＣＲプレートに１０μＬのＴａｑＭａｎ（商品名） Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、１μＬのＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｒ、７μＬのＵｌｔｒａＰｕｒｅ（商品名） Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）及び２μＬのｃＤＮＡを加えた。
３）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ｑＰＣＲを行い、照射時間０～２分における各遺伝子の蛍光シグナルが任意の閾値に達する時のサイクル数であるＴｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ（Ｃｔ）値を算出した。内部標準遺伝子によりＣｔ値を補正し、ΔＣｔ値とした。光未照射のΔＣｔ値によりΔＣｔ値を補正し、これをΔΔＣｔ値とした。ΔΔＣｔ法によって１サイクルあたりの検出差を２倍量とし、２－ΔΔＣｔに代入して照射時間０分の遺伝子発現量を１とした場合の光照射時の遺伝子発現量を評価した。
【0049】
【0050】
７．得られる美容効果
トランスグルタミナーゼ１遺伝子の発現により、肌のバリア機能や水分保持が維持向上する。
ヒアルロン酸合成酵素３遺伝子の発現により、表皮中のヒアルロン酸産生が増加し、水分量が保たれ保湿機能が維持される。
トランスグルタミナーゼ１遺伝子の発現により、肌のバリア機能や水分保持が維持向上する。
ヒアルロン酸合成酵素３遺伝子の発現により、表皮中のヒアルロン酸産生が増加し、水分量が保たれ保湿機能が維持される。
【0051】
＜実施例４＞
抗老化に関わる遺伝子の発現に対する光照射の効果を、リアルタイムＰＣＲ法により評価した。材料、試験方法及び結果を以下に説明する。
抗老化に関わる遺伝子の発現に対する光照射の効果を、リアルタイムＰＣＲ法により評価した。材料、試験方法及び結果を以下に説明する。
【0052】
１．細胞
ヒト新生児由来の真皮線維芽細胞株「ＮＢ１ＲＧＢ」細胞を、ＣＯ２インキュベータ（ＣＯ２濃度５％、３７℃）を用いて培養した。
ヒト新生児由来の真皮線維芽細胞株「ＮＢ１ＲＧＢ」細胞を、ＣＯ２インキュベータ（ＣＯ２濃度５％、３７℃）を用いて培養した。
【0053】
２．培地
１０．０％（ｖ／ｖ）のＦｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ （ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）、及び１．０％（ｖ／ｖ）の抗真菌剤（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ １００Ｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＥａｇｌｅ’ｓ ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ、Ｗａｋｏ社製）を用いた。
１０．０％（ｖ／ｖ）のＦｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ （ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）、及び１．０％（ｖ／ｖ）の抗真菌剤（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ １００Ｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＥａｇｌｅ’ｓ ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ、Ｗａｋｏ社製）を用いた。
【0054】
３．被験機器
実施例３と同様
実施例３と同様
【0055】
４．遺伝子
ＴａｑＭａｎ Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて遺伝子発現解析を実施した。
ＴａｑＭａｎ Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて遺伝子発現解析を実施した。
【0056】
４－１．対象遺伝子
１）真皮線維芽細胞によって産生され、皮膚のハリ弾力に関与するＩ型コラーゲンをコードする遺伝子である、Ｈｕｍａｎ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｔｙｐｅ １ Ａｌｐｈａ １（ＣＯＬ１Ａ１，Ａｓｓａｙ ＩＤ． Ｈｓ００１６４００４＿ｍ１）
２）皮膚のハリ弾力に関与するコラーゲンの分解酵素をコードする遺伝子である、Ｈｕｍａｎ Ｍａｔｒｉｘ Ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ １（ＭＭＰ１，Ａｓｓａｙ ＩＤ． Ｈｓ００８９９６５８＿ｍ１）
３）真皮線維芽細胞によって産生され、皮膚のハリ弾力に関与するエラスチンをコードする遺伝子である、Ｈｕｍａｎ Ｅｌａｓｔｉｎ（ＥＬＮ，Ａｓｓａｙ ＩＤ． Ｈｓ００３５５７８３＿ｍ１）。
４）皮膚のハリ弾力に関与するエラスチンの分解酵素をコードする遺伝子である、Ｈｕｍａｎ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｍｅｔａｌｌｏｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ（ＭＭＥ，Ａｓｓａｙ ＩＤ． Ｈｓ００１５３５１０＿ｍ１）。
１）真皮線維芽細胞によって産生され、皮膚のハリ弾力に関与するＩ型コラーゲンをコードする遺伝子である、Ｈｕｍａｎ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｔｙｐｅ １ Ａｌｐｈａ １（ＣＯＬ１Ａ１，Ａｓｓａｙ ＩＤ． Ｈｓ００１６４００４＿ｍ１）
２）皮膚のハリ弾力に関与するコラーゲンの分解酵素をコードする遺伝子である、Ｈｕｍａｎ Ｍａｔｒｉｘ Ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ １（ＭＭＰ１，Ａｓｓａｙ ＩＤ． Ｈｓ００８９９６５８＿ｍ１）
３）真皮線維芽細胞によって産生され、皮膚のハリ弾力に関与するエラスチンをコードする遺伝子である、Ｈｕｍａｎ Ｅｌａｓｔｉｎ（ＥＬＮ，Ａｓｓａｙ ＩＤ． Ｈｓ００３５５７８３＿ｍ１）。
４）皮膚のハリ弾力に関与するエラスチンの分解酵素をコードする遺伝子である、Ｈｕｍａｎ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｍｅｔａｌｌｏｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ（ＭＭＥ，Ａｓｓａｙ ＩＤ． Ｈｓ００１５３５１０＿ｍ１）。
【0057】
４－２．内部標準遺伝子
Ｈｕｍａｎ Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ （ＧＡＰＤＨ，Ａｓｓａｙ ＩＤ． Ｈｓ０２７８６６２４＿ｇ１）
Ｈｕｍａｎ Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ （ＧＡＰＤＨ，Ａｓｓａｙ ＩＤ． Ｈｓ０２７８６６２４＿ｇ１）
【0058】
５．試験条件及び試験方法
実施例３と同様
実施例３と同様
【0059】
【0060】
７．得られる美容効果
Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現により、肌の弾力や強度に関与するコラーゲンが真皮線維芽細胞から産生される。さらにコラーゲン分解酵素遺伝子が抑制され、より肌に弾力を与えハリのある肌を保つ。
エラスチン遺伝子の発現により、肌の弾力を維持しコラーゲンを支えるエラスチンが真皮線維芽細胞から産生される。さらにエラスチン分解酵素遺伝子が抑制され、より肌に弾力やしなやかさを与え、ハリのある肌を保つ。
Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現により、肌の弾力や強度に関与するコラーゲンが真皮線維芽細胞から産生される。さらにコラーゲン分解酵素遺伝子が抑制され、より肌に弾力を与えハリのある肌を保つ。
エラスチン遺伝子の発現により、肌の弾力を維持しコラーゲンを支えるエラスチンが真皮線維芽細胞から産生される。さらにエラスチン分解酵素遺伝子が抑制され、より肌に弾力やしなやかさを与え、ハリのある肌を保つ。
【0061】
＜実施例５＞
抗老化成分であるヒアルロン酸の産生に対する光照射被験物質の効果を評価した。材料、試験方法及び結果を以下に説明する。
抗老化成分であるヒアルロン酸の産生に対する光照射被験物質の効果を評価した。材料、試験方法及び結果を以下に説明する。
【0062】
１．細胞、培地及び被験機器
実施例４と同様
実施例４と同様
【0063】
２．試験方法
光照射を含め、試験に関わる操作は別途記載のないかぎり室温で実施した。
光照射を含め、試験に関わる操作は別途記載のないかぎり室温で実施した。
【0064】
１）ディッシュに３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの「ＮＢ１ＲＧＢ」細胞を播種し、ＣＯ２インキュベータ内で２４時間培養した。
２）細胞の培地を除去し、ＰＢＳ（－）で置換、洗浄した。
３）ハロゲンランプと細胞を入れたディッシュとの間に光学フィルターを設置した。ディッシュ内の細胞に対し、光学フィルターを介して光照射した。ハロゲンランプからディッシュまでの距離は４０ｃｍとした。照射は連続して行い、照射時間は計５種類（０分、０．２５分、０．５分、１分、２分）とした。
４）放射照度測定を行うことにより、照射光（波長３００～２４００ｎｍ）の照射部位（照射距離４０ｃｍ）における照射エネルギーを決定したところ、１秒当たり９１ｍＪ／ｃｍ２であった。照射時間を照射エネルギーに換算した結果を以下の表に示す。
２）細胞の培地を除去し、ＰＢＳ（－）で置換、洗浄した。
３）ハロゲンランプと細胞を入れたディッシュとの間に光学フィルターを設置した。ディッシュ内の細胞に対し、光学フィルターを介して光照射した。ハロゲンランプからディッシュまでの距離は４０ｃｍとした。照射は連続して行い、照射時間は計５種類（０分、０．２５分、０．５分、１分、２分）とした。
４）放射照度測定を行うことにより、照射光（波長３００～２４００ｎｍ）の照射部位（照射距離４０ｃｍ）における照射エネルギーを決定したところ、１秒当たり９１ｍＪ／ｃｍ２であった。照射時間を照射エネルギーに換算した結果を以下の表に示す。
【0065】
［表３］
【0066】
５）光照射した後、ＰＢＳ（－）を培地に置換し、ＣＯ２インキュベータ内で１８時間培養した。
【0067】
３．細胞賦活作用評価
１）培地を除去、およびＰＢＳ（－）洗浄後、テトラゾリウム塩ＷＳＴ－８含有培地を加えてＣＯ２インキュベータ内で２時間培養した。
２）培養終了後、ウェルプレートに培養上清を分取し、マイクロプレートリーダーを用いて水溶性ＷＳＴ－８ホルマザンの極大吸収波長である４５０ｎｍの吸光度（ＯＤ４５０）を測定した。
３）照射時間０～２分のＯＤ４５０からブランクを減算し、照射時間０分 の ＯＤ４５０ を １００％として細胞賦活作用（％）を算出した。
１）培地を除去、およびＰＢＳ（－）洗浄後、テトラゾリウム塩ＷＳＴ－８含有培地を加えてＣＯ２インキュベータ内で２時間培養した。
２）培養終了後、ウェルプレートに培養上清を分取し、マイクロプレートリーダーを用いて水溶性ＷＳＴ－８ホルマザンの極大吸収波長である４５０ｎｍの吸光度（ＯＤ４５０）を測定した。
３）照射時間０～２分のＯＤ４５０からブランクを減算し、照射時間０分 の ＯＤ４５０ を １００％として細胞賦活作用（％）を算出した。
【0068】
４．ヒアルロン酸産生促進作用評価
ヒアルロン酸産生促進作用評価は、サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）で評価した。
１）高吸着型プレートにＨｙａｌｕｒｏｎａｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＡＢＰ）溶液を静置固定後、余分なＨＡＢＰ溶液を除去、洗浄した。
２）Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）溶液を加え、４℃で１７時間静置後、ＢＳＡ溶液を除去し、プレートを洗浄、乾燥させた。
３）照射時間０～２分の真皮繊維芽細胞の培養上清を０．５ＭのＮａＣｌ、０．０２％のＴｗｅｅｎ２０および１％のＢＳＡを含有するＰＢＳ（－）で適宜希釈し、プレートに添加し２時間静置した。
４）洗浄後、１００μＬのビオチン標識ＨＡＢＰ溶液を加え３０分静置、洗浄後、ストレプトアビジン標識ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）溶液を加え、３０分静置した。
５）洗浄後、２，２’－ａｚｉｎｏｂｉｓ（３－ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ－６－ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）ｄｉａｍｍｏｎｉｕｍ ｓａｌｔ （ＡＢＴＳ）を加えて１０分静置した。
６）４０５ｎｍの吸光度（ＯＤ４０５）を測定し、照射時間０分のＯＤ４０５を１００％として、光照射のヒアルロン酸産生率を算出した。
７）照射時間０～２分のＯＤ４０５を、細胞賦活作用評価で測定したブランク減算後のＯＤ４５０で除して細胞あたりのヒアルロン酸産生率を求めた。照射時間０分の細胞あたりのヒアルロン酸産生率を１００％として光照射によるヒアルロン酸産生率を算出した。
ヒアルロン酸産生促進作用評価は、サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）で評価した。
１）高吸着型プレートにＨｙａｌｕｒｏｎａｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＡＢＰ）溶液を静置固定後、余分なＨＡＢＰ溶液を除去、洗浄した。
２）Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）溶液を加え、４℃で１７時間静置後、ＢＳＡ溶液を除去し、プレートを洗浄、乾燥させた。
３）照射時間０～２分の真皮繊維芽細胞の培養上清を０．５ＭのＮａＣｌ、０．０２％のＴｗｅｅｎ２０および１％のＢＳＡを含有するＰＢＳ（－）で適宜希釈し、プレートに添加し２時間静置した。
４）洗浄後、１００μＬのビオチン標識ＨＡＢＰ溶液を加え３０分静置、洗浄後、ストレプトアビジン標識ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）溶液を加え、３０分静置した。
５）洗浄後、２，２’－ａｚｉｎｏｂｉｓ（３－ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ－６－ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）ｄｉａｍｍｏｎｉｕｍ ｓａｌｔ （ＡＢＴＳ）を加えて１０分静置した。
６）４０５ｎｍの吸光度（ＯＤ４０５）を測定し、照射時間０分のＯＤ４０５を１００％として、光照射のヒアルロン酸産生率を算出した。
７）照射時間０～２分のＯＤ４０５を、細胞賦活作用評価で測定したブランク減算後のＯＤ４５０で除して細胞あたりのヒアルロン酸産生率を求めた。照射時間０分の細胞あたりのヒアルロン酸産生率を１００％として光照射によるヒアルロン酸産生率を算出した。
【0069】
５．試験結果
照射時間０分のヒアルロン酸産生量を１００％とした場合の光照射によるヒアルロン酸産生量を図１０に示した。照射時間０分の細胞あたりのヒアルロン酸産生量を１００％とした場合の光照射による細胞あたりのヒアルロン酸産生量を図１１に示した。
照射時間０分のヒアルロン酸産生量を１００％とした場合の光照射によるヒアルロン酸産生量を図１０に示した。照射時間０分の細胞あたりのヒアルロン酸産生量を１００％とした場合の光照射による細胞あたりのヒアルロン酸産生量を図１１に示した。
【0070】
６．得られる美容効果
ヒアルロン酸産生が増加することで、コラーゲンやエラスチンの間に水分を抱え込み、真皮に水分を保持してハリのある肌を保つ。
ヒアルロン酸産生が増加することで、コラーゲンやエラスチンの間に水分を抱え込み、真皮に水分を保持してハリのある肌を保つ。
【符号の説明】
【0071】
１…光源
２…光学フィルター
３…照射光
２…光学フィルター
３…照射光
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】