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特許7511271多剤耐性菌に対する活性を有する重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン抽出物ならびにその調製および使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-06-27
(45)【発行日】2024-07-05
(54)【発明の名称】多剤耐性菌に対する活性を有する重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン抽出物ならびにその調製および使用
(51)【国際特許分類】
A61K 36/88 20060101AFI20240628BHJP
A61K 31/7048 20060101ALI20240628BHJP
A61P 31/04 20060101ALN20240628BHJP
【ＦＩ】
A61K36/88
A61K31/7048
A61P31/04
【請求項の数】
4
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2022160198
(22)【出願日】2022-10-04
(65)【公開番号】P2023063243
(43)【公開日】2023-05-09
【審査請求日】2023-01-11
(31)【優先権主張番号】202111236303.X
(32)【優先日】2021-10-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】521378163
【氏名又は名称】シーアン・カンユアンシェン・バイオメディカル・テクノロジー・カンパニー・リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＸＩ’ＡＮ ＫＡＮＧＹＵＡＮＳＨＥＮＧ ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】ＲＯＯＭ Ａ‐１１７‐１１， Ｉ ＣＨＵＡＮＧＴＵ ＺＨＯＮＧＣＨＵＡＮＧ ＰＡＲＫ， ＮＯ． １４ ＧＡＯＸＩＮ ２ＮＤ ＲＯＡＤ， ＨＩＧＨ‐ＴＥＣＨ ＺＯＮＥ， ＸＩ’ＡＮ， ７１００７５ ＳＨＡＡＮＸＩ， ＣＨＩＮＡ
(74)【代理人】
【識別番号】110001818
【氏名又は名称】弁理士法人Ｒ＆Ｃ
(72)【発明者】
【氏名】ワン，ジャ
(72)【発明者】
【氏名】コン，チュンチュン
(72)【発明者】
【氏名】ディン，シュンジュン
(72)【発明者】
【氏名】リ，ジンイ
(72)【発明者】
【氏名】ティエン，レイ
【審査官】柴原 直司
(56)【参考文献】
【文献】特表２００５－５３３０２７（ＪＰ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０７３７５３１５（ＣＮ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１８９９４９１（ＣＮ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０２１９９１８５（ＣＮ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０７３１２０６１（ＣＮ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３６／８８
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン抽出物を調製する方法であって、（１）６０～９０％エタノール中に重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニンを加えて混合物を得て、前記混合物を還流下で２～４時間加熱するステップと、
（２）前記混合物を１／４容量に濃縮し、前記混合物を遠心分離して上清Ａおよび沈殿物Ａを得て、前記沈殿物Ａを６０～８０％エタノールに加え、撹拌し、遠心分離して上清Ｂおよび沈殿物Ｂを得て、前記沈殿物Ｂを水および石油エーテルで洗浄し、乾燥させるステップと、
（３）前記上清Ａと前記上清Ｂとを合わせ、マクロポーラス吸着樹脂と混合し、クロマトグラフィーカラムに充填し、前記クロマトグラフィーカラムを水および８０～９０％エタノールで溶出し、エタノール溶出液を回収し、前記エタノール溶出液を濃縮して溶出抽出液を得て、前記溶出抽出液と前記沈殿物Ｂと合わせ、乾燥させて、重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン抽出物を得るステップであって、
前記マクロポーラス吸着樹脂が、ＡＢ－８、ＬＸ－Ｔ５、および、Ｄ１０１から選択される、ステップと、を含む、方法。
【請求項2】
ステップ（１）において、前記重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニンと６０～９０％エタノールとの重量比が、１：８～２４である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ステップ（２）において、前記沈殿物Ａと６０～８０％エタノールとの重量比が、１：４～１０である、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン抽出物が、０．１２％～０．１４％のポリフィリンＩＩと、０．０６％～０．１１％のポリフィリンＶＩと、０．１１％～０．１５％のポリフィリンＶＩＩとを含有する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０２１年１０月２２日に出願された中国特許出願第２０２１１１２３６３０３.Ｘ号の優先権を主張し、これは、本明細書に完全に記載されているかのように全ての目的のために参照により援用される。
【0002】
本発明は、多剤耐性菌に対して活性を有する重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン抽出物、ならびにその調製および使用に関する。
【背景技術】
【0003】
重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニンは、漢方薬の主原料の一つである。現在、重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン抽出物の調製方法は多数存在するが、分離精製方法が煩雑であり、収率も低い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン抽出物の改良された調製方法が、必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【0005】
１つの実施形態では、本出願は、重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン抽出物を調製する方法を提供する。本方法は、（１）６０～９０％エタノール中に重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニンを加えて混合物を得て、前記混合物を還流下で２～４時間加熱するステップ、（２）前記混合物を１／４容量に濃縮し、前記混合物を遠心分離して上清Ａおよび沈殿物Ａを得て、前記沈殿物Ａを６０～８０％エタノールに加えて上清Ｂおよび沈殿物Ｂを得て、前記沈殿物Ｂを水および石油エーテルで洗浄し、乾燥させるステップ、および、（３）前記上清Ａと前記上清Ｂとを合わせ、マクロポーラス吸着樹脂と混合し、クロマトグラフィーカラムに充填し、前記クロマトグラフィーカラムを水および８０～９０％エタノールで溶出し、エタノール溶出液を回収し、前記エタノール溶出液を濃縮して溶出抽出液を得て、前記溶出抽出液と前記沈殿物Ｂと合わせ、乾燥させて、重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン抽出物を得るステップ、を含む。
【0006】
別の実施形態において、ステップ（１）では、前記重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニンと６０～９０％エタノールとの重量比は、１：８～２４である。
【0007】
別の実施形態において、ステップ（２）では、前記沈殿物Ａと６０～８０％エタノールとの重量比は、１：４～１０である。
【0008】
別の実施形態において、前記重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン抽出物は、０．１２％～０．１４％のポリフィリン（ｐｏｌｙｐｈｙｌｌｉｎ）ＩＩと、０．０６％～０．１１％のポリフィリンＶＩと、０．１１％～０．１５％のポリフィリンＶＩＩとを含有する。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【発明を実施するための形態】
【0010】
当業者に本発明の解決策をよりよく理解させるために、本発明の実施形態における技術的解決策を、添付図面を参照して以下で明確かつ完全に説明する。明らかに、記載される実施形態は、本発明の一部に過ぎない。本発明の実施形態に基づいて、当業者が創造的な努力なしに得ることができる他のすべての実施形態は、本発明の保護範囲内である。
【0011】
以下に、添付の図面と併せて、本発明をさらに詳細に説明する。
【0012】
１．重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）抽出物の調製
【0013】
実施例１
重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン１ｋｇを６０％エタノール８ｋｇに加え、一晩浸漬した後、還流下で２回、各回２時間ずつ加熱した。混合物を１／４量まで濃縮し、濾過して上清１および沈殿物１を得た。前記沈殿物１を４倍量の６０％エタノールに加え、撹拌し、遠心分離して上清２および沈殿物２を得た。前記沈殿物２を水１００ｍＬ、石油エーテルで順次洗浄し、乾燥させた。前記上清１と上清２とを合わせ、マクロポーラス吸着樹脂（ＡＢ－８）と１：１０の重量比で混合し、クロマトグラフィーカラムに充填した。前記クロマトグラフィーカラムにおいて、５倍量の水と４倍量の８０％エタノールとで、１ＢＶ／時の速度で溶出を行った。エタノール溶出液を回収、濃縮し、前記沈殿物２と合わせて乾燥し、重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン抽出物１７．５３ｇを得た。
重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン１ｋｇを６０％エタノール８ｋｇに加え、一晩浸漬した後、還流下で２回、各回２時間ずつ加熱した。混合物を１／４量まで濃縮し、濾過して上清１および沈殿物１を得た。前記沈殿物１を４倍量の６０％エタノールに加え、撹拌し、遠心分離して上清２および沈殿物２を得た。前記沈殿物２を水１００ｍＬ、石油エーテルで順次洗浄し、乾燥させた。前記上清１と上清２とを合わせ、マクロポーラス吸着樹脂（ＡＢ－８）と１：１０の重量比で混合し、クロマトグラフィーカラムに充填した。前記クロマトグラフィーカラムにおいて、５倍量の水と４倍量の８０％エタノールとで、１ＢＶ／時の速度で溶出を行った。エタノール溶出液を回収、濃縮し、前記沈殿物２と合わせて乾燥し、重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン抽出物１７．５３ｇを得た。
【0014】
実施例２
重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン１ｋｇを８０％エタノール１６ｋｇに加え、一晩浸漬した後、還流下で１回目３時間、２回目２時間の計２回加熱した。混合物を１／４量まで濃縮し、濾過して上清１および沈殿物１を得た。前記沈殿物１を７倍量の７０％エタノールに加え、撹拌し、遠心分離して上清２および沈殿物２を得た。前記沈殿物２を水１００ｍＬ、石油エーテルで順次洗浄し、乾燥させた。前記上清１と上清２とを合わせ、マクロポーラス吸着樹脂（ＡＢ－８）と１：７の重量比で混合し、クロマトグラフィーカラムに充填した。前記クロマトグラフィーカラムにおいて、７倍量の水と６倍量の８０％エタノールとで、２ＢＶ／時の速度で溶出を行った。エタノール溶出液を回収、濃縮し、前記沈殿物２と合わせて乾燥し、重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン抽出物１８．０４ｇを得た。
重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン１ｋｇを８０％エタノール１６ｋｇに加え、一晩浸漬した後、還流下で１回目３時間、２回目２時間の計２回加熱した。混合物を１／４量まで濃縮し、濾過して上清１および沈殿物１を得た。前記沈殿物１を７倍量の７０％エタノールに加え、撹拌し、遠心分離して上清２および沈殿物２を得た。前記沈殿物２を水１００ｍＬ、石油エーテルで順次洗浄し、乾燥させた。前記上清１と上清２とを合わせ、マクロポーラス吸着樹脂（ＡＢ－８）と１：７の重量比で混合し、クロマトグラフィーカラムに充填した。前記クロマトグラフィーカラムにおいて、７倍量の水と６倍量の８０％エタノールとで、２ＢＶ／時の速度で溶出を行った。エタノール溶出液を回収、濃縮し、前記沈殿物２と合わせて乾燥し、重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン抽出物１８．０４ｇを得た。
【0015】
実施例３
重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン１ｋｇを６０～９５％エタノール２４ｋｇに加え、一晩浸漬した後、還流下で２回、各回２時間ずつ加熱した。混合物を１／４量まで濃縮し、濾過して上清１および沈殿物１を得た。前記沈殿物１を１０倍量の８０％エタノールに加え、撹拌し、遠心分離して上清２および沈殿物２を得た。前記沈殿物２を水１００ｍＬ、石油エーテルで順次洗浄し、乾燥させた。前記上清１と上清２とを合わせ、マクロポーラス吸着樹脂（ＡＢ－８）と１：１０の重量比で混合し、クロマトグラフィーカラムに充填した。前記クロマトグラフィーカラムにおいて、１０倍量の水と８倍量の８０％エタノールとで、３ＢＶ／時の速度で溶出を行った。エタノール溶出液を回収、濃縮し、前記沈殿物２と合わせて乾燥し、重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン抽出物１８．６５ｇを得た。
重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン１ｋｇを６０～９５％エタノール２４ｋｇに加え、一晩浸漬した後、還流下で２回、各回２時間ずつ加熱した。混合物を１／４量まで濃縮し、濾過して上清１および沈殿物１を得た。前記沈殿物１を１０倍量の８０％エタノールに加え、撹拌し、遠心分離して上清２および沈殿物２を得た。前記沈殿物２を水１００ｍＬ、石油エーテルで順次洗浄し、乾燥させた。前記上清１と上清２とを合わせ、マクロポーラス吸着樹脂（ＡＢ－８）と１：１０の重量比で混合し、クロマトグラフィーカラムに充填した。前記クロマトグラフィーカラムにおいて、１０倍量の水と８倍量の８０％エタノールとで、３ＢＶ／時の速度で溶出を行った。エタノール溶出液を回収、濃縮し、前記沈殿物２と合わせて乾燥し、重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン抽出物１８．６５ｇを得た。
【0016】
実施例４
重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン１ｋｇを６０％エタノール８ｋｇに加え、一晩浸漬した後、還流下で３回、各回２時間ずつ加熱した。混合物を１／４量まで濃縮し、濾過して上清１および沈殿物１を得た。前記沈殿物１を７倍量の８０％エタノールに加え、撹拌し、遠心分離して上清２および沈殿物２を得た。前記沈殿物２を水１００ｍＬ、石油エーテルで順次洗浄し、乾燥させた。前記上清１と上清２とを合わせ、マクロポーラス吸着樹脂（ＡＢ－８）と１：７の重量比で混合し、クロマトグラフィーカラムに充填した。前記クロマトグラフィーカラムにおいて、５倍量の水と８倍量の９５％エタノールとで、１ＢＶ／時の速度で溶出を行った。エタノール溶出液を回収、濃縮し、前記沈殿物２と合わせて乾燥し、重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン抽出物１８．９２ｇを得た。
重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン１ｋｇを６０％エタノール８ｋｇに加え、一晩浸漬した後、還流下で３回、各回２時間ずつ加熱した。混合物を１／４量まで濃縮し、濾過して上清１および沈殿物１を得た。前記沈殿物１を７倍量の８０％エタノールに加え、撹拌し、遠心分離して上清２および沈殿物２を得た。前記沈殿物２を水１００ｍＬ、石油エーテルで順次洗浄し、乾燥させた。前記上清１と上清２とを合わせ、マクロポーラス吸着樹脂（ＡＢ－８）と１：７の重量比で混合し、クロマトグラフィーカラムに充填した。前記クロマトグラフィーカラムにおいて、５倍量の水と８倍量の９５％エタノールとで、１ＢＶ／時の速度で溶出を行った。エタノール溶出液を回収、濃縮し、前記沈殿物２と合わせて乾燥し、重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン抽出物１８．９２ｇを得た。
【0017】
実施例５
重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン１ｋｇを９５％エタノール８ｋｇに加え、一晩浸漬した後、還流下で１回目３時間、２回目２時間の計２回加熱した。混合物を１／４量まで濃縮し、濾過して上清１および沈殿物１を得た。前記沈殿物１を７倍量の８０％エタノールに加え、撹拌し、遠心分離して上清２および沈殿物２を得た。前記沈殿物２を水１００ｍＬ、石油エーテルで順次洗浄し、乾燥させた。前記上清１と上清２とを合わせ、マクロポーラス吸着樹脂（ＡＢ－８）と１：５の重量比で混合し、クロマトグラフィーカラムに充填した。前記クロマトグラフィーカラムにおいて、５倍量の水と８倍量の８０％エタノールとで、２ＢＶ／時の速度で溶出を行った。エタノール溶出液を回収、濃縮し、前記沈殿物２と合わせて乾燥し、重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン抽出物１９．８３ｇを得た。
重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン１ｋｇを９５％エタノール８ｋｇに加え、一晩浸漬した後、還流下で１回目３時間、２回目２時間の計２回加熱した。混合物を１／４量まで濃縮し、濾過して上清１および沈殿物１を得た。前記沈殿物１を７倍量の８０％エタノールに加え、撹拌し、遠心分離して上清２および沈殿物２を得た。前記沈殿物２を水１００ｍＬ、石油エーテルで順次洗浄し、乾燥させた。前記上清１と上清２とを合わせ、マクロポーラス吸着樹脂（ＡＢ－８）と１：５の重量比で混合し、クロマトグラフィーカラムに充填した。前記クロマトグラフィーカラムにおいて、５倍量の水と８倍量の８０％エタノールとで、２ＢＶ／時の速度で溶出を行った。エタノール溶出液を回収、濃縮し、前記沈殿物２と合わせて乾燥し、重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン抽出物１９．８３ｇを得た。
【0018】
実施例６
重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン１ｋｇを９５％エタノール１６ｋｇに加え、一晩浸漬した後、還流下で１回目３時間、２回目２時間の計２回加熱した。混合物を１／４量まで濃縮し、濾過して上清１および沈殿物１を得た。前記沈殿物１を７倍量の８０％エタノールに加え、撹拌し、遠心分離して上清２および沈殿物２を得た。前記沈殿物２を水１００ｍＬ、石油エーテルで順次洗浄し、乾燥させた。前記上清１と上清２とを合わせ、マクロポーラス吸着樹脂（ＬＸ－Ｔ５）と１：５の重量比で混合し、クロマトグラフィーカラムに充填した。前記クロマトグラフィーカラムにおいて、５倍量の水と８倍量の８０％エタノールとで、２ＢＶ／時の速度で溶出を行った。エタノール溶出液を回収、濃縮し、前記沈殿物２と合わせて乾燥し、重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン抽出物１８．２１ｇを得た。
重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン１ｋｇを９５％エタノール１６ｋｇに加え、一晩浸漬した後、還流下で１回目３時間、２回目２時間の計２回加熱した。混合物を１／４量まで濃縮し、濾過して上清１および沈殿物１を得た。前記沈殿物１を７倍量の８０％エタノールに加え、撹拌し、遠心分離して上清２および沈殿物２を得た。前記沈殿物２を水１００ｍＬ、石油エーテルで順次洗浄し、乾燥させた。前記上清１と上清２とを合わせ、マクロポーラス吸着樹脂（ＬＸ－Ｔ５）と１：５の重量比で混合し、クロマトグラフィーカラムに充填した。前記クロマトグラフィーカラムにおいて、５倍量の水と８倍量の８０％エタノールとで、２ＢＶ／時の速度で溶出を行った。エタノール溶出液を回収、濃縮し、前記沈殿物２と合わせて乾燥し、重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン抽出物１８．２１ｇを得た。
【0019】
実施例７
重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン１ｋｇを９５％エタノール８ｋｇに加え、一晩浸漬した後、還流下で１回目３時間、２回目２時間の計２回加熱した。混合物を１／４量まで濃縮し、濾過して上清１および沈殿物１を得た。前記沈殿物１を７倍量の８０％エタノールに加え、撹拌し、遠心分離して上清２および沈殿物２を得た。前記沈殿物２を水１００ｍＬ、石油エーテルで順次洗浄し、乾燥させた。前記上清１と上清２とを合わせ、マクロポーラス吸着樹脂（Ｄ１０１）と１：５の重量比で混合し、クロマトグラフィーカラムに充填した。前記クロマトグラフィーカラムにおいて、５倍量の水と８倍量の８０％エタノールとで、２ＢＶ／時の速度で溶出を行った。エタノール溶出液を回収、濃縮し、前記沈殿物２と合わせて乾燥し、重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン抽出物１７．３７ｇを得た。
重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン１ｋｇを９５％エタノール８ｋｇに加え、一晩浸漬した後、還流下で１回目３時間、２回目２時間の計２回加熱した。混合物を１／４量まで濃縮し、濾過して上清１および沈殿物１を得た。前記沈殿物１を７倍量の８０％エタノールに加え、撹拌し、遠心分離して上清２および沈殿物２を得た。前記沈殿物２を水１００ｍＬ、石油エーテルで順次洗浄し、乾燥させた。前記上清１と上清２とを合わせ、マクロポーラス吸着樹脂（Ｄ１０１）と１：５の重量比で混合し、クロマトグラフィーカラムに充填した。前記クロマトグラフィーカラムにおいて、５倍量の水と８倍量の８０％エタノールとで、２ＢＶ／時の速度で溶出を行った。エタノール溶出液を回収、濃縮し、前記沈殿物２と合わせて乾燥し、重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン抽出物１７．３７ｇを得た。
【0020】
実施例８
重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン１ｋｇを９５％エタノール２４ｋｇに加え、一晩浸漬した後、還流下で１回目３時間、２回目２時間の計２回加熱した。混合物を１／４量まで濃縮し、濾過して上清１および沈殿物１を得た。前記沈殿物１を７倍量の８０％エタノールに加え、撹拌し、遠心分離して上清２および沈殿物２を得た。前記沈殿物２を水１００ｍＬ、石油エーテルで順次洗浄し、乾燥させた。前記上清１と上清２とを合わせ、マクロポーラス吸着樹脂（ＬＸ－１００Ｂ）と１：５の重量比で混合し、クロマトグラフィーカラムに充填した。前記クロマトグラフィーカラムにおいて、５倍量の水と８倍量の８０％エタノールとで、２ＢＶ／時の速度で溶出を行った。エタノール溶出液を回収、濃縮し、前記沈殿物２と合わせて乾燥し、重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン抽出物１８．５１ｇを得た。
重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン１ｋｇを９５％エタノール２４ｋｇに加え、一晩浸漬した後、還流下で１回目３時間、２回目２時間の計２回加熱した。混合物を１／４量まで濃縮し、濾過して上清１および沈殿物１を得た。前記沈殿物１を７倍量の８０％エタノールに加え、撹拌し、遠心分離して上清２および沈殿物２を得た。前記沈殿物２を水１００ｍＬ、石油エーテルで順次洗浄し、乾燥させた。前記上清１と上清２とを合わせ、マクロポーラス吸着樹脂（ＬＸ－１００Ｂ）と１：５の重量比で混合し、クロマトグラフィーカラムに充填した。前記クロマトグラフィーカラムにおいて、５倍量の水と８倍量の８０％エタノールとで、２ＢＶ／時の速度で溶出を行った。エタノール溶出液を回収、濃縮し、前記沈殿物２と合わせて乾燥し、重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン抽出物１８．５１ｇを得た。
【0021】
２．含有量の測定
【0022】
実施例５～８の重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン抽出物中のポリフィリンＩＩ、ポリフィリンＶＩおよびポリフィリンＶＩＩの含有量を、ＨＰＬＣによって測定した。充填剤はオクタデシルシラン結合シリカゲル；移動相Ａはアセトニトリル、移動相Ｂは水であり、表１に規定する勾配溶出、検出波長：２０３ｎｍ、注入量：１０μＬ、およびカラム温度：３０℃で測定を行った。溶出勾配を表１に示す。
【0023】
【表1】
【0024】
実施例５～８の重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン抽出物中のポリフィリンＩＩ、ポリフィリンＶＩおよびポリフィリンＶＩＩの含有量を、図１および表２に示す。
【0025】
【表2】
【0026】
実施例１の重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン抽出物１グラムを分取液相クロマトグラフィーシステム（Ｈａｎｂａｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ実験室グレードの分取液体クロマトグラフィーシステムＮＳ４２１０）によって精製した。条件は、クロマトグラフィーカラム：ＨｅｄｅｒａＯＤＳ－２（２５０ｍｍ＊２０ｍｍ、１０μｍ）、移動相：メタノール－水（１～３０分、メタノール４０％～７０％、３０～５０分、７０％～４０％）、流速：６ｍＬ／分であり、ポリフィリンＩＩ（２７５．３２μｇ）、ポリフィリンＶＩ（６１．１７μｇ）およびポリフィリンＶＩＩ（１４８．８５μｇ）が得られた。
【0027】
３.重楼（ＰａｒｉｓＰｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン抽出物の評価
【0028】
（１）最小発育阻止濃度法による重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン抽出物の抗菌活性の測定
液体微量希釈法により、前記抽出物の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を測定した。
液体微量希釈法により、前記抽出物の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を測定した。
【0029】
実験器具の消毒
実験前に、実験に使用するペトリ皿、試験管、ピペット、調製培地などは、滅菌ポットで１２１℃、１５分間オートクレーブ処理を行った。実験前に、微生物実験台および９６ウェルプレートを紫外線照射により滅菌し、浄化台を７５％アルコールで拭いた。
実験前に、実験に使用するペトリ皿、試験管、ピペット、調製培地などは、滅菌ポットで１２１℃、１５分間オートクレーブ処理を行った。実験前に、微生物実験台および９６ウェルプレートを紫外線照射により滅菌し、浄化台を７５％アルコールで拭いた。
【0030】
（２）増殖培地
乾燥した増殖培地粉末１８ｇを三角フラスコに入れ、水１０００ｍＬを加えた。この混合物を恒温水槽に入れて加熱溶解した後、１２１℃で２０分間オートクレーブ処理した。
乾燥した増殖培地粉末１８ｇを三角フラスコに入れ、水１０００ｍＬを加えた。この混合物を恒温水槽に入れて加熱溶解した後、１２１℃で２０分間オートクレーブ処理した。
【0031】
（３）細菌懸濁液の調製
実験の２４時間前に、低温保存していた試験菌株を取り出し、室温で静置した。細菌液をピペットで少量ずつ採取し、滅菌・冷却した増殖培地に接種し、３５℃のインキュベーターに２４時間静置した。ピペットを使用して、少量の活性化した細菌コロニーを滅菌済み乾燥試験管に移し、０．５マクファーランド比濁管と同程度の濁度（１．５×１０８ＣＦＵ／ｍＬ）まで培地で希釈し、さらに培地で１００倍に希釈し、細菌懸濁液濃度を１．０×１０６ＣＦＵ／ｍＬ（ウェルに加える前に２倍に希釈し、システム内の最終細菌濃度が５×１０５ＣＦＵ／ｍＬ）としたものを、ＭＩＣ測定に供した。
実験の２４時間前に、低温保存していた試験菌株を取り出し、室温で静置した。細菌液をピペットで少量ずつ採取し、滅菌・冷却した増殖培地に接種し、３５℃のインキュベーターに２４時間静置した。ピペットを使用して、少量の活性化した細菌コロニーを滅菌済み乾燥試験管に移し、０．５マクファーランド比濁管と同程度の濁度（１．５×１０８ＣＦＵ／ｍＬ）まで培地で希釈し、さらに培地で１００倍に希釈し、細菌懸濁液濃度を１．０×１０６ＣＦＵ／ｍＬ（ウェルに加える前に２倍に希釈し、システム内の最終細菌濃度が５×１０５ＣＦＵ／ｍＬ）としたものを、ＭＩＣ測定に供した。
【0032】
（４）微量希釈法による最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の測定
滅菌済み９６ウェル平底マイクロ培養プレートに、陽性対照として１２８μｇ／ｍＬ陽性対照液１００μＬを各列Ｎｏ．１に添加した。Ｎｏ．２～１１ウェルにそれぞれ１２８μｇ／ｍＬ、６４μｇ／ｍＬ、３２μｇ／ｍＬ、１６μｇ／ｍＬ、８μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、０．２５μｇ／ｍＬの重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン抽出物を１００μＬ添加した。Ｎｏ.１２のウェルは溶媒とした。
滅菌済み９６ウェル平底マイクロ培養プレートに、陽性対照として１２８μｇ／ｍＬ陽性対照液１００μＬを各列Ｎｏ．１に添加した。Ｎｏ．２～１１ウェルにそれぞれ１２８μｇ／ｍＬ、６４μｇ／ｍＬ、３２μｇ／ｍＬ、１６μｇ／ｍＬ、８μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、０．２５μｇ／ｍＬの重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン抽出物を１００μＬ添加した。Ｎｏ.１２のウェルは溶媒とした。
【0033】
このプレートを３０℃のインキュベーターで２４時間培養し、実験結果を観察し、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）値を測定した。ＭＩＣ値が最高濃度の２５６μｇ／ｍｌより高い場合は「＞２５６μｇ／ｍＬ」とカウントし、ＭＩＣ値が最低濃度または最低濃度以下の場合はカウントしなかった。その差を、「≦０．５μｇ／ｍＬ」とカウントした。上記の実験を３回並行して行った。ＭＩＣ値が正確に繰り返せる場合、または１つの濃度だけが異なる場合は、それを受け入れた。高い方の濃度をＭＩＣ値として使用した。２つを超える濃度でＭＩＣ値が異なる場合は、要求された条件を満たすまで実験を繰り返した。
【0034】
その結果を、表３、表４、表５、表６、表７、表８、および表９に示す。
【0035】
【表3】
【0036】
【表4】
【0037】
【表5】
【0038】
【表6】
【0039】
【表7】
【0040】
【表8】
【0041】
【表9】
【0042】
本発明の重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン抽出物は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、多剤耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）２２２、および多剤耐性緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）１７４に対して阻害活性を有する。また、実験菌株に対するポリフィリンＩＩ、ポリフィリンＶＩおよびポリフィリンＶＩＩのＭＩＣ値も測定した。いずれも１２８μｇ／ｍＬを超え、良好な抗菌効果を発揮しなかった。これは、ポリフィリンＩＩ、ポリフィリンＶＩおよびポリフィリンＶＩＩの相乗的な抗菌活性によるものである。また、重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン抽出物と陽性対照（セフトリアキソンナトリウム、レボフロキサシン塩酸塩、セファゾリンナトリウム、ゲンタマイシン硫酸塩）との組み合わせのＭＩＣ値も測定した。実験の結果、重楼（Ｐａｒｉｓ Ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）サポニン抽出物とセフトリアキソンナトリウムとの組み合わせは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の阻害に相乗効果を発揮し、レボフロキサシン塩酸塩との組み合わせは、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の阻害に相加効果を発揮することが明らかになった。
【0043】
上記の内容は、本発明の技術的思想を説明するためのものであり、本発明の保護範囲を限定するものではない。本発明が提案する技術的思想による技術的解決策に基づいて行われるいかなる変更も、すべて本発明の特許請求の範囲に含まれる。
【図1】