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特許7511478ウイルス様粒子中へのオリゴヌクレオチドのパッケージ化

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-06-27

(45)【発行日】2024-07-05

(54)【発明の名称】ウイルス様粒子中へのオリゴヌクレオチドのパッケージ化

(51)【国際特許分類】

C12N 15/117 20100101AFI20240628BHJP

C12N 7/00 20060101ALI20240628BHJP

A61K 48/00 20060101ALN20240628BHJP

A61K 35/76 20150101ALN20240628BHJP

A61K 31/7088 20060101ALN20240628BHJP

A61P 43/00 20060101ALN20240628BHJP

C07K 14/08 20060101ALN20240628BHJP

【ＦＩ】

C12N15/117 Z

C12N7/00

A61K48/00 ZNA

A61K35/76

A61K31/7088

A61P43/00 105

C07K14/08

【請求項の数】 17

(21)【出願番号】P 2020556292

(86)(22)【出願日】2019-04-08

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-09-24

(86)【国際出願番号】 IB2019052867

(87)【国際公開番号】W WO2019197965

(87)【国際公開日】2019-10-17

【審査請求日】2022-04-06

(31)【優先権主張番号】62/654,586

(32)【優先日】2018-04-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】520391701

【氏名又は名称】チェックメイトファーマシューティカルズ

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】ウォルターズ，エヴァンデーヴィッド

(72)【発明者】

【氏名】ヘンネケ，フランク

【審査官】田中晴絵

(56)【参考文献】

【文献】特表２００９－５３９９０７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００９－５１９２９９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表平１０－５０３４６９（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１７／１９７００９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】Nat Rev Genet.，2012年，13(11)，770-780

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ１５／００－１５／９０

Ｃ１２Ｎ７／００－７／０８

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

凝集オリゴヌクレオチドを含むヌクレオチド組成物を生成するためのプロセスであって、
（ａ）オリゴヌクレオチドを提供するステップであって、前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのポリＧストレッチを含む、ステップと、
（ｂ）前記オリゴヌクレオチドを変性させるステップであって、前記変性させるステップが、
（ｉ）前記オリゴヌクレオチドおよびカオトロピック剤を含む水溶液Ｉを、前記オリゴヌクレオチドの平均直径が１ｎｍ以下になるまで温度Ｉでインキュベートするステップであって、前記平均直径が、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定され、前記温度Ｉが、７５℃～９９℃である、ステップを含む、ステップと、
（ｃ）前記オリゴヌクレオチドを凝集させるステップであって、前記凝集させるステップが、
（ｉ）ステップ（ｂ）で得られた１ｎｍ以下の前記平均直径を有する前記オリゴヌクレオチド、カオトロピック剤、およびカチオンを含む水溶液ＩＩを、温度ＩＩでインキュベートして、前記凝集オリゴヌクレオチドを形成するステップであって、前記インキュベートすることが、前記形成された凝集オリゴヌクレオチドの前記平均直径が、７～１４ｎｍになるまで実行され、前記平均直径が、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定され、前記温度ＩＩが、７５℃～９９℃である、ステップと、
（ｉｉ）前記水溶液ＩＩの温度を温度ＩＩＩに調整するステップであって、前記温度ＩＩＩが、４０℃未満または３０℃未満である、ステップと、を含む、ステップと
を含み、
前記オリゴヌクレオチドが、
（ａ）Ｇ１０：ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号１）、
（ｂ）Ｇ１０－１１：ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号３）、
（ｃ）Ｇ１２－１１：ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号４）、
（ｄ）Ｇ６：ＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号５）、
（ｅ）Ｇ７：ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号６）、
（ｆ）Ｇ８：ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号７）、
（ｇ）Ｇ９：ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号８）、
（ｈ）Ｇ１１：ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号９）、
（ｉ）Ｇ６－１０：ＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２４）、
（ｊ）Ｇ７－１０：ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２５）、
（ｋ）Ｇ８－１０：ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２６）、および
（ｌ）Ｇ９－１０：ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２７）からなる群から選択される核酸配列を含み、
前記オリゴヌクレオチドが、１０～２００ヌクレオチドからなり、
前記オリゴヌクレオチドが、ホスホジエステル結合デオキシヌクレオチドからなり、
前記カチオンが、Ｎａ^＋、Ｋ^＋、ＮＨ_４ ^＋、Ｌｉ^＋、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、及びＺｎ^２＋から選択され、
カオトロピック剤の濃度が、０．２Ｍから１．０Ｍまでである、
プロセス。

【請求項2】

前記水溶液Ｉが、前記オリゴヌクレオチドが自発的に自己凝集するような濃度の一価または二価のイオンを含まない、請求項１に記載のプロセス。

【請求項3】

前記水溶液Ｉ中に含まれる前記カオトロピック剤が、尿素、フェノール、イソプロピルアルコール、エタノール、および塩化グアニジニウムから選択される、請求項１または２に記載のプロセス。

【請求項4】

前記オリゴヌクレオチドが、
（ａ）その５’末端に３から１５個のグアノシン実体、およびその３’末端に３から１５個のグアノシン実体;
（ｂ）その５’末端に６から１３個のグアノシン実体、およびその３’末端に６から１３個のグアノシン実体；または
（ｃ）その５’末端に８から１１個のグアノシン実体、およびその３’末端に８から１１個のグアノシン実体
を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のプロセス。

【請求項5】

請求項１のステップ（ａ）における前記オリゴヌクレオチドの純度が、ＨＰＬＣによって決定して、９０％以上である、請求項１～４のいずれか一項に記載のプロセス。

【請求項6】

前記水溶液ＩＩ中に含まれる前記カオトロピック剤が、尿素、フェノール、イソプロピルアルコール、エタノール、および塩化グアニジニウムから選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載のプロセス。

【請求項7】

前記水溶液Ｉ中に含まれる前記カオトロピック剤および前記水溶液ＩＩ中に含まれる前記カオトロピック剤が、同じであり、前記水溶液Ｉ中に含まれる前記カオトロピック剤および前記水溶液ＩＩ中に含まれる前記カオトロピック剤が、尿素である、請求項１～６のいずれか一項に記載のプロセス。

【請求項8】

前記凝集オリゴヌクレオチドが、核酸配列ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号１）を有する、請求項１～７のいずれか一項に記載のプロセス。

【請求項9】

ヌクレオチド組成物中の前記凝集オリゴヌクレオチドの少なくとも９０％が、１０．８ｎｍ～１３．２ｎｍの直径を有し、前記直径が、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定される、請求項１～８のいずれか一項に記載のプロセス。

【請求項10】

ヌクレオチド組成物中の前記凝集オリゴヌクレオチドの少なくとも６５％が、１１．４ｎｍ～１２．６ｎｍの直径を有し、前記直径が、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定される、請求項１～９のいずれか一項に記載のプロセス。

【請求項11】

（ｉ）ウイルス様粒子であって、ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、（ｉｉ）凝集オリゴヌクレオチドであって、前記ウイルス様粒子中にパッケージ化されている、凝集オリゴヌクレオチドと、を含む、組成物を生成するためのプロセスであって、
（ａ）混合物を生成するステップであって、前記混合物が、
（ｉ）前記ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質と、
（ｉｉ）前記コートタンパク質の自己集合を予防することができる薬剤と、
（ｉｉｉ）凝集オリゴヌクレオチドであって、少なくとも１つのポリＧストレッチを含むオリゴヌクレオチドを含み、７～１４ｎｍの平均直径を有し、前記平均直径が、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定される、凝集オリゴヌクレオチドと、を含む、ステップと、
（ｂ）前記混合物から前記薬剤を除去するステップと、
（ｃ）前記コートタンパク質がウイルス様粒子に自己集合し、前記凝集オリゴヌクレオチドをパッケージ化することを可能にするステップと
を含み、
請求項１～１０のいずれか一項に記載のプロセスによって、前記凝集オリゴヌクレオチドを得ることをさらに含む、
プロセス。

【請求項12】

前記ＲＮＡバクテリオファージが、
（ａ）バクテリオファージＱβ、
（ｂ）バクテリオファージＲ１７、
（ｃ）バクテリオファージｆｒ、
（ｄ）バクテリオファージＧＡ、
（ｄ）バクテリオファージＳＰ、
（ｅ）バクテリオファージＭＳ２、
（ｆ）バクテリオファージＭ１１、
（ｇ）バクテリオファージＭＸ１、
（ｈ）バクテリオファージＮＬ９５、
（ｉ）バクテリオファージｆ２、
（ｊ）バクテリオファージＰＰ７、および
（ｋ）バクテリオファージＡＰ２０５
からなる群から選択される、請求項１１に記載のプロセス。

【請求項13】

ウイルス様粒子と凝集オリゴヌクレオチドとを含む前記組成物の純度が、サイズ排除クロマトグラフィーによって決定して、少なくとも９９．５％である、請求項１１又は１２に記載のプロセス。

【請求項14】

前記ＲＮＡバクテリオファージが、バクテリオファージＱβである、請求項１１～１３のいずれか一項に記載のプロセス。

【請求項15】

前記凝集オリゴヌクレオチドが、核酸配列Ｇ１０ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号１）を有し、前記凝集オリゴヌクレオチドが、ホスホジエステル結合デオキシヌクレオチドからなる、請求項１１～１４のいずれか一項に記載のプロセス。

【請求項16】

ヌクレオチド組成物中の前記凝集オリゴヌクレオチドの少なくとも９０％が、１０．８ｎｍ～１３．２ｎｍの直径を有し、前記直径が、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定される、請求項１１～１５のいずれか一項に記載のプロセス。

【請求項17】

ヌクレオチド組成物中の前記凝集オリゴヌクレオチドの少なくとも６５％が、１１．４ｎｍ～１２．６ｎｍの直径を有し、前記直径が、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定される、請求項１１～１６のいずれか一項に記載のプロセス。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、（ｉ）ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子と、（ｉｉ）凝集オリゴヌクレオチドであって、ウイルス様粒子内にパッケージ化されている、凝集オリゴヌクレオチドと、を含む、組成物を生成するための方法に関する。本発明は、前述のプロセスでの使用に好適な凝集オリゴヌクレオチドを含むヌクレオチド組成物を生成するためのプロセスをさらに提供する。さらに、本発明は、凝集オリゴヌクレオチドを含むヌクレオチド組成物をさらに提供する。さらに、本発明は、（ｉ）ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子と、（ｉｉ）凝集オリゴヌクレオチドであって、ウイルス様粒子中にパッケージ化されている、凝集オリゴヌクレオチドと、を含む、組成物をさらに提供する。

【背景技術】

【0002】

オリゴヌクレオチド、具体的にはグアニン（Ｇ）に富むオリゴヌクレオチドがパッケージ化されたＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子が、免疫系の強力な刺激物質として提案されている。そのようなウイルス様粒子およびその中にパッケージ化されたオリゴヌクレオチド、ならびにそれらの生成のためのプロセスは、例えば、ＷＯ２００３／０２４４８１、ＷＯ２００４／０００３５１、ＷＯ２００４／０８４９４０、ＷＯ２００４／００７５３８、ＷＯ２００７／０６８７４７、およびＷＯ２００７／１４４１５０に記載されており、これらの開示の全体が、参照により本明細書に組み込まれる。典型的には、プロセスは、ＲＮＡバクテリオファージの組換えウイルス様粒子の分解、該ウイルス様粒子のコートタンパク質の精製、およびオリゴヌクレオチドがパッケージ化されたウイルス様粒子をもたらすオリゴヌクレオチドの存在下での該コートタンパク質の再集合に基づく。ＲＮＡバクテリオファージの組換えウイルス様粒子の生成のための効率的かつ拡張可能なプロセスは、例えば、ＷＯ２００５／１１７９６３、ＷＯ２００６／１２５８２１、およびＷＯ２００７／０３９５５２にさらに開示されており、これらの全体が、参照により本明細書に組み込まれる。

【0003】

オリゴヌクレオチド合成の方法は、３０年以上にわたって利用可能となっており、ホスホルアミダイト化学による合成が、その最も一般的に使用される方法である（Ｂｅａｕｃａｇｅｅｔａｌ．，ＣｕｒｒＰｒｏｔｏｃＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＣｈｅｍ３．３．１－３．３．２０（２０００）、この開示の全体が、参照により本明細書に組み込まれる）。ホスホラミダイト合成には、合成時間を低減し、より高い収率の生成物を生成するための多くの有意な改善があった。グアニン（Ｇ）に富むオリゴヌクレオチド、具体的には連続したグアニン残基を有するオリゴヌクレオチドの合成は、大きな製造規模で、具体的には高純度かつ高収率で達成するのが常により困難であったが、これは、カップリング段階で活性化ホスホラミダイトが５’－ヒドロキシル基に到達しづらいことによる可能性が高い。具体的には、支持体に結合した保護されたＧに富むオリゴマーは、二次構造を形成し、特定の長さの後に不純物および合成失敗をもたらす問題、最も支配的にはより少ない数のＧ残基またはより多い数のＧ残基さえも有するオリゴヌクレオチド配列をもたらす問題を有する可能性がある。結果として、市販のグアニン（Ｇ）に富むオリゴヌクレオチドの純度は、ホスホラミダイト合成に対して行われた該改善から有意に恩恵を受けている。したがって、１０～２０年前には、６０～８０％の、該グアニン（Ｇ）に富むオリゴヌクレオチドの純度が受け入れられることがあったが、グアニン（Ｇ）に富んでいないオリゴヌクレオチドに類似する、９３％、９５％ほどの高い純度、または９７もしくは９９％ほどの高い純度が今日では一般的に実現可能である。さらに、該（Ｇ）に富むオリゴヌクレオチドが医薬品の一部である場合、そのようなより高純度の（Ｇ）に富むオリゴヌクレオチドの使用が、規制当局の承認のために必要とされ、要求される。

【0004】

Ｇに富むオリゴヌクレオチド、具体的には５’および３’末端にポリ（Ｇ）を有し、さらに非メチル化ＣＧジヌクレオチドモチーフおよび中央回文構造を含むオリゴヌクレオチドは、それらのポリ（Ｇ）モチーフのＧ四分子形成を介して、より高次の二次および三次構造に自己集合する傾向がある（Ｋｅｒｋｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（２００５）２８０（９），８０８６－９３、Ｂｏｃｈｍａｎ，ＭＬｅｔａｌ．ＮａｔＲｅｖＧｅｎｅｔ．，（２０１２）１３（１１）：７７０－７８０、これらの開示全体が、参照により本明細書に組み込まれる）。これらのＧ四重鎖は、分子間または分子内経路を介して形成することができ、非常に安定した二次構造である。結果として、これらの四重鎖のサイズおよび形状および立体構造は、反応経路に応じてかなり可変的である可能性がある。

【0005】

ＷＯ２００７／１４４１５０は、ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子中にパッケージ化されたグアニン（Ｇ）に富むオリゴヌクレオチドを含む組成物を生成するためのプロセスを記載しており、ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質の自己集合は、脱凝集／凝集プロセスによって得られたオリゴヌクレオチド凝集体の存在下で実行される。オリゴヌクレオチドの凝集状態は、該ＲＮＡバクテリオファージのキャプシドを標準として使用したサイズ排除ＨＰＬＣにおける相対ピーク開始時間（ＰＳＴ）によって特性評価され、５０～１１０％、好ましくは８０～９５％のＰＳＴが、最適であることが見出されている。そのようなＰＳＴは、該ＲＮＡバクテリオファージのキャプシドの見かけの分子量の範囲内、またはそれよりもわずかに低い見かけの分子量を有するオリゴヌクレオチド凝集体に対応することが示されている。ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子中にパッケージ化されたグアニン（Ｇ）に富むオリゴヌクレオチドを含む組成物を生成するための既知のプロセスに対するその改善にもかかわらず、本発明者らは、ＷＯ２００７／１４４１５０のこの先行技術のプロセスの実質的に不利な点を特定した。

【発明の概要】

【0006】

具体的には、ＷＯ２００７／１４４１５０の先行技術のプロセスに従って調製され、ＷＯ２００７／１４４１５０に定義されるサイズ分布による、凝集オリゴヌクレオチドは、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定して、形成された凝集オリゴヌクレオチドの特定のサイズおよび立体構造に関する実質的な不一致および大きな変動を示した。加えて、形成された凝集オリゴヌクレオチドの特定のサイズおよび立体構造に関する該不一致は、該凝集オリゴヌクレオチドがパッケージ化されたウイルス様粒子の実質的な不一致をさらにもたらし、所望の球状パッケージ化ＶＬＰの形成だけでなく、加えて形成異常の桿状の凝集体または高次の凝集体の形成も引き起こした。さらに、該高度に多分散した凝集オリゴヌクレオチドがパッケージ化された該得られたＶＬＰは、より低い純度だけでなく、不安定性の増加もさらに示した。

【0007】

重要なことに、ＷＯ２００７／１４４１５０の先行技術の脱凝集／凝集プロセスは、該脱凝集／凝集ステップに使用されるオリゴヌクレオチドの初期純度に大きく依存することがさらに見出されている。具体的には、ＷＯ２００７／１４４１５０の脱凝集／凝集プロセスで使用されるオリゴヌクレオチドの初期純度は、オリゴヌクレオチドの凝集、すなわち凝集および故にＧ－四重鎖形成の速度による、定義された所望のサイズおよび立体構造の凝集オリゴヌクレオチドの形成に影響を有することが見出されている。典型的には、ＷＯ２００７／１４４１５０の脱凝集／凝集プロセスで使用されるオリゴヌクレオチドの純度がより高いほど、より速く、かつより制御されない無秩序な状態で凝集が生じ、所望のサイズウィンドウ外の典型的に非常に大きな凝集オリゴヌクレオチドの量の増加をもたらした。結果として、得られた凝集オリゴヌクレオチドを適切にパッケージ化することができないため、最終オリゴヌクレオチドパッケージ化ＶＬＰは、強力で費用のかかる精製を必要とする低下した純度、およびＳＥＣクロマトグラムの経時的な変化によって証明される低下した安定性を有した。特に、低分子量ピークの増加が経時的に観察され、これは、ＶＬＰのいくつかが安定しておらず、元々パッケージ化されていたＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドをそれぞれ放出したことを示唆している。

【0008】

本発明者らによる発見に基づいて、かつ具体的にはＷＯ２００７／１４４１５０の脱凝集／凝集プロセスに最初に使用されたオリゴヌクレオチドの純度への大きな依存に基づいて、ＷＯ２００７／１４４１５０のプロセス、具体的にはＷＯ２００７／１４４１５０の脱凝集／凝集プロセスが、低純度のＧに富むオリゴヌクレオチドのために開発および最適化されている。示されているように、高純度のＧに富むオリゴヌクレオチドは、今日では広範に利用可能であるだけでなく、さらに医薬品のためのそれらの使用もまた、規制当局の承認の必要条件である。さらに、最初に使用されたオリゴヌクレオチドの純度に応じた、形成された凝集オリゴヌクレオチドの特定のサイズおよび立体構造に関するその不一致および大きな変動に加えて、ＷＯ２００７／１４４１５０の先行技術のプロセスのさらなる実質的に不利な点は、制御されない無秩序な凝集による、定義されたサイズ範囲内の凝集オリゴヌクレオチドの調製を達成するための、これに添えて関連する非常に狭い時間ウィンドウである。

【0009】

結果として、かつこれらの生じる不一致および変動、ならびに最初に使用されたオリゴヌクレオチドの純度への強い依存のために、ＷＯ２００７／１４４１５０のプロセスは、大規模な製造には好適ではなく、具体的にはＧＭＰ製造（特にバッチ間の一貫性が重要な臨床試験材料用のもの）には好適ではない。

【0010】

したがって、本発明は、凝集オリゴヌクレオチドを含むヌクレオチド組成物を生成するためのプロセス、ならびにＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子および該ウイルス様粒子中にパッケージ化された凝集オリゴヌクレオチドを含む組成物を生成するためのプロセスを提供し、故に先行技術のプロセスの不利な点を回避または低減する。

【0011】

したがって、第１の態様では、本発明は、凝集オリゴヌクレオチドを含むヌクレオチド組成物を生成するためのプロセスであって、
（ａ）オリゴヌクレオチドを提供するステップであって、該オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのポリＧストレッチを含む、ステップと、
（ｂ）該オリゴヌクレオチドを変性させるステップであって、該変性させるステップが、
（ｉ）該オリゴヌクレオチドおよびカオトロピック剤を含む水溶液Ｉを、該オリゴヌクレオチドの平均直径が１ｎｍ以下になるまで温度Ｉでインキュベートするステップであって、該平均直径が、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定され、該温度Ｉが、７５℃～９９℃であり、好ましくは、該カオトロピック剤が、尿素である、ステップを含む、ステップと、
（ｃ）該オリゴヌクレオチドを凝集させるステップであって、該凝集させるステップが、
（ｉ）ステップ（ｂ）で得られた１ｎｍ以下の該平均直径を有する該オリゴヌクレオチド、カオトロピック剤、およびカチオンを含む水溶液ＩＩを、温度ＩＩでインキュベートして、該凝集オリゴヌクレオチドを形成するステップであって、該インキュベートすることが、該形成された凝集オリゴヌクレオチドの平均直径が、６～１６ｎｍになるまで実行され、該平均直径が、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定され、該温度ＩＩが、７５℃～９９℃であり、好ましくは該カオトロピック剤が、尿素である、ステップと、
（ｉｉ）該溶液ＩＩの温度を温度ＩＩＩに調整するステップであって、該温度ＩＩＩが、４０℃未満、好ましくは３０℃未満である、ステップと、を含む、ステップと、を含み、
該ステップが、好ましくは所与の順序で実行される、プロセスを提供する。

【0012】

有利なことに、本発明のプロセスは、形成された凝集オリゴヌクレオチドのサイズ、およびこれにより凝集オリゴヌクレオチドの立体構造の制御、その結果として、高度に純粋で、安定し、良好に形成された、すなわち典型的には専ら球状の、オリゴヌクレオチドがパッケージ化されたＶＬＰの一貫した形成を可能にする。

【0013】

したがって、本発明のプロセスは、６～１６ｎｍ、好ましくは７～１４ｎｍ、さらに好ましくは８～１４ｎｍ、再びさらに好ましくは９～１４ｎｍ、再びさらに好ましくは１０～１４ｎｍ、再びさらに好ましくは１１～１３ｎｍ、故に１１、１２、または１３ｎｍ、および最も好ましくは１２ｎｍの、それらの直径による凝集オリゴヌクレオチドのサイズの制御を可能にし、該直径は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定される。

【0014】

重要なことに、本発明のプロセスは、形成された凝集オリゴヌクレオチドのサイズ、および故に立体構造の制御を可能にするだけでなく、それを行うことに加えて、変性ステップに使用されるオリゴヌクレオチドの純度に関わらず、それを行う。さらに、本発明のプロセスは、凝集の制御を可能にするため、それは、凝集ステップを実行するためのより広い操作ウィンドウをさらに可能にし、それを提供する。そのような制御ならびに追加の時間およびより広い操作ウィンドウはそれぞれ、プロセス制御におけるより高い精度とともに、本発明のプロセスを、ＧＭＰ品質、具体的には大規模なＧＭＰ品質での費用のかかる生成にとって非常に有益なものとする。さらに、最終的に得られたオリゴヌクレオチドパッケージ化ＶＬＰの収率は、具体的にはさらに費用のかかる精製ステップを必要とせずに、追加的にはるかにより高く、かつより純粋である。

【0015】

示されているように、ＷＯ２００７／１４４１５０の先行技術のプロセスは、本発明のプロセスによって形成された凝集オリゴヌクレオチドとは対照的に、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定して、形成された凝集オリゴヌクレオチドの特定のサイズおよび立体構造に関する実質的な不一致および大きな変動を示す、凝集オリゴヌクレオチドの形成をもたらした。しかしながら、本発明のプロセスによって形成された凝集オリゴヌクレオチドはすべて、対応する最適範囲がわずかにシフトしているが、ＷＯ２００７／１４４１５０に定義されるように、該ＲＮＡバクテリオファージのキャプシドを標準として使用したサイズ排除ＨＰＬＣにおいて、相対ピーク開始時間（ＰＳＴ）の仕様基準を満たした。したがって、本発明のプロセスによって形成された好ましい凝集オリゴヌクレオチドは、これに従って決定して、９０～１０５％、好ましくは９２％～１０２％のＰＳＴを有する。

【0016】

本発明のプロセスのさらなる利点は、ＷＯ２００７／１４４１５０の先行技術のプロセスと比較して、変性ステップのための塩、特にカオトロピック剤、好ましくは尿素の使用の回避である。結果として、変性した、典型的には単量体のオリゴヌクレオチドを含有する本発明のプロセスの得られた溶液は、再凝集の脅威がなく安定しており、故にさらなる使用のために保管することができる。したがって、これらの溶液は、凝集物を形成することなく複数回加熱または冷却することができ、有利には、将来の使用のために凍結することができる。後者は、おそらく、示されているように、オリゴヌクレオチド分解の前の変性ステップの停止に必要とされる中和ステップ中に生成される塩の存在のために、先行技術のプロセスでは可能ではなかった。したがって、該調製された先行技術の溶液は、保管の可能性がなく、その後使用しなければならなかった。

【0017】

本発明の場合、オリゴヌクレオチドの凝集状態は、散乱光の時間依存性変動を測定する動的光散乱（ＤＬＳ）によって特性評価される。次に、溶媒を通した凝集体の拡散速度を関連付けることによって、凝集オリゴヌクレオチドの流体力学的半径および直径が計算される。６～１６ｎｍ、好ましくは７～１４ｎｍ、さらに好ましくは８～１４ｎｍ、再びさらに好ましくは９～１４ｎｍ、再びさらに好ましくは１０～１４ｎｍ、再びさらに好ましくは１１～１３ｎｍ、故に１１、１２、または１３ｎｍ、および最も好ましくは１２ｎｍの平均流体力学的直径を含む凝集オリゴヌクレオチドが、最適であることが見出されている。

【0018】

したがって、さらなる態様では、本発明は、（ｉ）ウイルス様粒子であって、ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、（ｉｉ）凝集オリゴヌクレオチドであって、該ウイルス内にパッケージ化されている、凝集オリゴヌクレオチドと、を含む、組成物を生成するためのプロセスであって、
（ａ）混合物を生成するステップであって、該混合物が、
（ｉ）該ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質と、
（ｉｉ）該コートタンパク質の自己集合を予防することができる薬剤と、
（ｉｉｉ）凝集オリゴヌクレオチドであって、少なくとも１つのポリＧストレッチを含むオリゴヌクレオチドを含み、６～１６ｎｍの平均直径を有し、該平均直径が、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定される、凝集オリゴヌクレオチドと、を含む、ステップと、
（ｂ）該混合物から該薬剤を除去するステップと、
（ｃ）該コートタンパク質がウイルス様粒子に自己集合し、該凝集オリゴヌクレオチドをパッケージ化することを可能にするステップと、を含む、プロセスを提供する。

【0019】

再びさらなる態様では、本発明は、（ｉ）ウイルス様粒子であって、ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、（ｉｉ）凝集オリゴヌクレオチドであって、該ウイルス内にパッケージ化されている、凝集オリゴヌクレオチドと、を含む、組成物を生成するためのプロセスであって、
（ａ）混合物を生成するステップであって、該混合物が、
（ｉ）該ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質と、
（ｉｉ）該コートタンパク質の自己集合を予防することができる薬剤と、
（ｉｉｉ）凝集オリゴヌクレオチドであって、少なくとも１つのポリＧストレッチを含むオリゴヌクレオチドを含み、本発明の第１の態様に記載のプロセスによって得ることができ、６～１６ｎｍの平均直径を有し、該平均直径が、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定される、凝集オリゴヌクレオチドと、を含む、ステップと、
（ｂ）該混合物から該薬剤を除去するステップと、
（ｃ）該コートタンパク質がウイルス様粒子に自己集合し、該凝集オリゴヌクレオチドをパッケージ化することを可能にするステップと、を含む、プロセスを提供する。

【0020】

再びさらなる態様では、本発明は、（ｉ）ウイルス様粒子であって、ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、（ｉｉ）凝集オリゴヌクレオチドであって、該ウイルス内にパッケージ化されている、凝集オリゴヌクレオチドと、を含む、組成物を生成するためのプロセスであって、
（ａ）混合物を生成するステップであって、該混合物が、
（ｉ）該ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質と、
（ｉｉ）該コートタンパク質の自己集合を予防することができる薬剤と、
（ｉｉｉ）該凝集オリゴヌクレオチドを含むヌクレオチド組成物であって、本発明による凝集オリゴヌクレオチドを含むヌクレオチド組成物を生成するための方法によって得ることができ、該凝集オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのポリＧストレッチを含むオリゴヌクレオチドを含み、該凝集オリゴヌクレオチドが、６～１６ｎｍの平均直径を有し、該平均直径が、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定される、ヌクレオチド組成物と、を含む、ステップと、
（ｂ）該混合物から該薬剤を除去するステップと、
（ｃ）該コートタンパク質がウイルス様粒子に自己集合し、該凝集オリゴヌクレオチドをパッケージ化することを可能にするステップと、を含む、プロセスを提供する。

【0021】

該プロセス中、該ウイルス様粒子は、該凝集オリゴヌクレオチドの存在下で該ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質の自己集合によって形成される。

【0022】

再びさらなる態様では、本発明は、凝集オリゴヌクレオチドを含むヌクレオチド組成物であって、本発明による凝集オリゴヌクレオチドを含むヌクレオチド組成物を生成するためのプロセスによって得ることができ、好ましくは該凝集オリゴヌクレオチドが、６～１６ｎｍ、好ましくは７～１４ｎｍの平均直径を有し、該平均直径が、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定される、ヌクレオチド組成物を提供する。

【0023】

再びさらなる態様では、本発明は、凝集オリゴヌクレオチドを含むヌクレオチド組成物であって、該凝集オリゴヌクレオチドが、７～１４ｎｍの平均直径を有し、該平均直径が、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定される、ヌクレオチド組成物を提供する。

【0024】

再びさらなる態様では、本発明は、（ｉ）ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子と、（ｉｉ）凝集オリゴヌクレオチドと、を含む、組成物であって、該凝集オリゴヌクレオチドが、該ウイルス様粒子中にパッケージ化され、該組成物が、（ｉ）ウイルス様粒子であって、ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、（ｉｉ）本発明による凝集オリゴヌクレオチドと、を含む、組成物を生成するためのプロセスによって得ることができる、組成物を提供する。

【0025】

再びさらなる態様では、本発明は、（ｉ）ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子と、（ｉｉ）凝集オリゴヌクレオチドであって、該ウイルス様粒子中にパッケージ化され、６～１６、好ましくは７～１４ｎｍの平均直径を有し、該平均直径が、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定される、凝集オリゴヌクレオチドと、を含む組成物を提供する。

【0026】

本発明のさらなる態様および実施形態は、この説明が続くにつれて明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0027】

【図1A】本発明のプロセスによって得られた、変性オリゴヌクレオチドＧ１０および凝集オリゴヌクレオチドＧ１０の動的光散乱（ＤＬＳ）。ＤＬＳは、実施例３に記載のように実行した。図１Ａは、０．９０ｎｍの平均粒子径を有する変性高純度Ｇ１０オリゴヌクレオチドを示し、これは、Ｇ１０オリゴヌクレオチドの二次構造が破壊され、変性が完了し、単量体が達成されたことを示している。重複する曲線によって示されるように、複数のスキャンを実行した。これらのスキャンの平均直径（Ｄ_ｈｙｄ）および一次ピークのパーセント（平均）を、グラフ内のデータボックスの挿入図に報告する。

【図1B】本発明のプロセスによって得られた、変性オリゴヌクレオチドＧ１０および凝集オリゴヌクレオチドＧ１０の動的光散乱（ＤＬＳ）。ＤＬＳは、実施例３に記載のように実行した。図１Ｂは、適切な凝集および１２ｎｍの直径で得られた、その後凝集したＧ１０オリゴヌクレオチドを示す。重複する曲線によって示されるように、複数のスキャンを実行した。これらのスキャンの平均直径（Ｄ_ｈｙｄ）および一次ピークのパーセント（平均）を、グラフ内のデータボックスの挿入図に報告する。

【図2A】変性オリゴヌクレオチドＧ１０のＤＬＳ。ＤＬＳは、実施例３に記載のように実行した。配列番号１の低純度オリゴヌクレオチドＧ１０（逆相ＨＰＬＣおよびアニオン交換ＨＰＬＣによって決定して、約７９％）を、先行技術（ＷＯ２００７／１４４１５０）に記載のように脱凝集（変性）に使用した。ＤＬＳは、２．２ｎｍの平均直径を有する粒子を示し、これは、すべてのオリゴヌクレオチドＧ１０の二次構造が破壊され、単量体に変性しているわけではないことを示している。重複する曲線によって示されるように、複数のスキャンを実行した。これらのスキャンの平均直径（Ｄ_ｈｙｄ）および一次ピークのパーセント（平均）を、グラフ内のデータボックスの挿入図に報告する。

【図2B】変性オリゴヌクレオチドＧ１０のＤＬＳ。ＤＬＳは、実施例３に記載のように実行した。配列番号１の高純度オリゴヌクレオチドＧ１０（逆相ＨＰＬＣおよびアニオン交換ＨＰＬＣによって決定して、約９４％）を、先行技術（ＷＯ２００７／１４４１５０）に記載のように脱凝集（変性）に使用した。ＤＬＳは、２．８ｎｍの平均直径を有する粒子を示し、これは、すべてのオリゴヌクレオチドＧ１０の二次構造が破壊され、単量体に変性しているわけではないことを示している。重複する曲線によって示されるように、複数のスキャンを実行した。これらのスキャンの平均直径（Ｄ_ｈｙｄ）および一次ピークのパーセント（平均）を、グラフ内のデータボックスの挿入図に報告する。

【図2C】変性オリゴヌクレオチドＧ１０のＤＬＳ。ＤＬＳは、実施例３に記載のように実行した。配列番号１の高純度オリゴヌクレオチドＧ１０（逆相ＨＰＬＣおよびアニオン交換ＨＰＬＣによって決定して、約９４％）を、本発明のプロセスの脱凝集に使用した。ＤＬＳは、０．９ｎｍの平均直径を有する粒子を示し、これは、オリゴヌクレオチドＧ１０が完全にまたは実質的に完全に単量体に変性していることを示している。重複する曲線によって示されるように、複数のスキャンを実行した。これらのスキャンの平均直径（Ｄ_ｈｙｄ）および一次ピークのパーセント（平均）を、グラフ内のデータボックスの挿入図に報告する。

【図3A】凝集オリゴヌクレオチドＧ１０のＤＬＳ。ＤＬＳは、実施例３に記載のように実行した。実施例５から得られた変性オリゴヌクレオチド（図２Ａ～２Ｃ）を使用した。先行技術のプロセスによって変性させた、先行技術（ＷＯ２００７／１４４１５０）に記載の低純度Ｇ１０の凝集。配列番号１の低純度オリゴヌクレオチドＧ１０は、逆相ＨＰＬＣおよびアニオン交換ＨＰＬＣによって決定して、約７９％の純度に対応する。ＤＬＳは、所望の粒子範囲の高い側にある（１５ｎｍ）だけでなく、加えて材料の１０％が有意により大きい（３０～５０ｎｍ）、凝集オリゴヌクレオチドを示す。重複する曲線によって示されるように、複数のスキャンを実行した。これらのスキャンの平均直径（Ｄ_ｈｙｄ）および一次ピークのパーセント（平均）を、グラフ内のデータボックスの挿入図に報告する。

【図3B】凝集オリゴヌクレオチドＧ１０のＤＬＳ。ＤＬＳは、実施例３に記載のように実行した。実施例５から得られた変性オリゴヌクレオチド（図２Ａ～２Ｃ）を使用した。先行技術のプロセスによって変性させた、先行技術（ＷＯ２００７／１４４１５０）に記載の高純度Ｇ１０の凝集。配列番号ＸＸの高純度オリゴヌクレオチドＧ１０は、逆相ＨＰＬＣおよびアニオン交換ＨＰＬＣによって決定して、約９４％の純度に対応する。ＤＬＳは、網掛けのボックスによって例示されているように、平均直径が完全に（１００％）６～１６ｎｍの直径範囲（所望の範囲）外にある、凝集オリゴヌクレオチドを示す。重複する曲線によって示されるように、複数のスキャンを実行した。これらのスキャンの平均直径（Ｄ_ｈｙｄ）および一次ピークのパーセント（平均）を、グラフ内のデータボックスの挿入図に報告する。

【図3C】凝集オリゴヌクレオチドＧ１０のＤＬＳ。ＤＬＳは、実施例３に記載のように実行した。実施例５から得られた変性オリゴヌクレオチド（図２Ａ～２Ｃ）を使用した。本発明のプロセスによる高純度Ｇ１０の凝集。配列番号１の高純度オリゴヌクレオチドＧ１０は、逆相ＨＰＬＣおよびアニオン交換ＨＰＬＣによって決定して、約９４％の純度に対応する。ＤＬＳは、網掛けのボックスによって例示されているように、該凝集オリゴヌクレオチドの平均直径が完全に（１００％）６～１６ｎｍの直径範囲（所望の範囲）内にある、凝集オリゴヌクレオチドを示す。重複する曲線によって示されるように、複数のスキャンを実行した。これらのスキャンの平均直径（Ｄ_ｈｙｄ）および一次ピークのパーセント（平均）を、グラフ内のデータボックスの挿入図に報告する。

【図4A】分析サイズ排除クロマトグラフィーによる精製Ｑβコートタンパク質の特性評価。精製ＱβＶＬＰの試料。２６０ｎｍでのＲＮＡの吸収係数は、コートタンパク質の吸収係数よりも約１００倍高いため、観測されたピーク（比率Ａ２６０／Ａ２８０＝２）は、ＶＬＰのＲＮＡコアによって支配される。

【図4B】分析サイズ排除クロマトグラフィーによる精製Ｑβコートタンパク質の特性評価。分解反応の上清の試料。放出されたコートタンパク質は、約１２分でのタンパク質様ピークの存在によって示される。さらに、沈殿していないＲＮＡ分子のいくつかの種が、６．８～１１分の範囲内に存在する。

【図4C】分析サイズ排除クロマトグラフィーによる精製Ｑβコートタンパク質の特性評価。精製Ｑβコートタンパク質の試料。分析は、カラムＴＳＫＧ５０００ＰＷｘｌ（ＴｏｓｏｈＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で、ＰＢＳ中で実行した。

【図5A】先行技術の脱凝集－凝集法によって、ならびに本発明の変性および凝集によって得られた、凝集オリゴヌクレオチドＧ１０がパッケージ化されたＲＮＡバクテリオファージＱβのウイルス様粒子（ＶＬＰ）のＤＬＳおよび電子顕微鏡写真（ＥＭ）。ＤＬＳは、実施例３に記載のように実行し、ＥＭは、実施例８に記載のように取得した。先行技術の脱凝集－凝集法によって得られた凝集オリゴヌクレオチドＧ１０がパッケージ化されたＱβＶＬＰのＤＬＳ。重複する曲線によって示されるように、複数のスキャンを実行した。これらのスキャンの平均直径（Ｄ_ｈｙｄ）および一次ピークのパーセント（平均）を、グラフ内のデータボックスの挿入図に報告する。

【図5B】先行技術の脱凝集－凝集法によって、ならびに本発明の変性および凝集によって得られた、凝集オリゴヌクレオチドＧ１０がパッケージ化されたＲＮＡバクテリオファージＱβのウイルス様粒子（ＶＬＰ）のＤＬＳおよび電子顕微鏡写真（ＥＭ）。ＤＬＳは、実施例３に記載のように実行し、ＥＭは、実施例８に記載のように取得した。先行技術の脱凝集－凝集法によって得られた凝集オリゴヌクレオチドＧ１０がパッケージ化されたＱβＶＬＰのＥＭ。矢印は、桿状構造を特定するために含まれている。

【図5C】先行技術の脱凝集－凝集法によって、ならびに本発明の変性および凝集によって得られた、凝集オリゴヌクレオチドＧ１０がパッケージ化されたＲＮＡバクテリオファージＱβのウイルス様粒子（ＶＬＰ）のＤＬＳおよび電子顕微鏡写真（ＥＭ）。ＤＬＳは、実施例３に記載のように実行し、ＥＭは、実施例８に記載のように取得した。本発明のプロセスによって得られた凝集オリゴヌクレオチドＧ１０がパッケージ化されたＱβＶＬＰのＤＬＳ。重複する曲線によって示されるように、複数のスキャンを実行した。これらのスキャンの平均直径（Ｄ_ｈｙｄ）および一次ピークのパーセント（平均）を、グラフ内のデータボックスの挿入図に報告する。

【図5D】先行技術の脱凝集－凝集法によって、ならびに本発明の変性および凝集によって得られた、凝集オリゴヌクレオチドＧ１０がパッケージ化されたＲＮＡバクテリオファージＱβのウイルス様粒子（ＶＬＰ）のＤＬＳおよび電子顕微鏡写真（ＥＭ）。ＤＬＳは、実施例３に記載のように実行し、ＥＭは、実施例８に記載のように取得した。本発明のプロセスによって得られた凝集オリゴヌクレオチドＧ１０がパッケージ化されたＱβＶＬＰのＥＭ。

【発明を実施するための形態】

【0028】

別段、定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。

【0029】

平均直径：本明細書で使用される場合、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定される「平均直径」という用語は、実施例３に記載の方法で、典型的に、かつ好ましくはＤＬＳによって測定される直径を指し、測定される粒子の所与の平均直径値は、正規分布（ガウス分布）における平均として該直径を有する粒子を指す。したがって、本明細書で使用される場合、典型的に、かつ好ましくはオリゴヌクレオチド、凝集オリゴヌクレオチド、および本発明による凝集オリゴヌクレオチドがパッケージ化されたＶＬＰに適用される、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定される「平均直径」という用語は、典型的に、かつ好ましくは実施例３に記載の方法で、ＤＬＳによって測定される直径を典型的に、かつ好ましくは指し、測定される粒子の所与の平均直径値は、該粒子の少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％が、該所与の値の直径または該所与の値の±１０％の直径を有する、粒子を指す。明確化のために、例えば、本発明の凝集オリゴヌクレオチドの１２ｎｍの平均直径値は、該本発明の凝集オリゴヌクレオチドの少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％が、１０．８ｎｍ～１３．２ｎｍの直径を有する、該本発明の凝集オリゴヌクレオチドを指す。さらに、本明細書で使用される場合、典型的に、かつ好ましくはオリゴヌクレオチド、凝集オリゴヌクレオチド、および本発明による凝集オリゴヌクレオチドがパッケージ化されたＶＬＰに適用される、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定される「平均直径」という用語は、典型的に、かつ好ましくは実施例３に記載の方法で、ＤＬＳによって測定される直径を典型的に、かつ好ましくは指し、測定される粒子の所与の平均直径値は、該粒子の少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％が該所与の値の直径または該所与の値の±５％の直径を有する粒子を指す。明確化のために、例えば、本発明の凝集オリゴヌクレオチドの１２ｎｍの平均直径値は、該本発明の凝集オリゴヌクレオチドの少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％が、１１．４ｎｍ～１２．６ｎｍの直径を有する、該本発明の凝集オリゴヌクレオチドを指す。

【0030】

値のすべての範囲、具体的には平均直径または本明細書に開示される直径のすべての範囲は、その範囲を定義する値を含む、該範囲内にあるすべての値を指すものとする。明確化のために、例えば、１２ｎｍ～１３ｎｍの直径値は、１２ｎｍもしくは１３ｎｍの直径、または１２ｎｍ～１３ｎｍの範囲内にあるすべての直径を指すものとする。

【0031】

カオトロピック剤：本明細書で使用される場合、「カオトロピック剤」という用語は、タンパク質、オリゴヌクレオチド、または他の巨大分子の秩序構造を破壊する、分子または物質を指す。この安定性の低下は、典型的には水素結合ネットワークの破壊によって引き起こされる。例には、中でも特に、尿素、フェノール、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）、エタノール、および塩化グアニジニウムが含まれる。

【0032】

オリゴヌクレオチド：本明細書で使用される場合、オリゴヌクレオチドという用語は、一本鎖デオキシリボヌクレオチドを指す。好ましいオリゴヌクレオチドは、以下に定義される少なくとも１つのポリＧストレッチを含む。より好ましいオリゴヌクレオチドは、２、３、４、５または６つの該ポリＧストレッチを含む。非常に好ましいオリゴヌクレオチドは、正確に２つのポリＧストレッチを含み、好ましくは該２つのポリＧストレッチのうちの１つが、該オリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端に位置する。さらにより好ましいオリゴヌクレオチドは、正確に２つのポリＧストレッチを含み、該２つのポリＧストレッチのうちの１つが、該オリゴヌクレオチドの５’末端に位置し、該２つのポリＧストレッチのうちの１つが、該オリゴヌクレオチドの３’末端に位置する。典型的に、かつ好ましくは、本明細書で使用される場合、オリゴヌクレオチドは、６～１０００個、好ましくは１０～１０００個、より好ましくは１０～２００個、さらにより好ましくは１０～１００個、さらにより好ましくは２０～４０個、最も好ましくは３０個のヌクレオチドからなる。さらに好ましいオリゴヌクレオチドは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個のヌクレオチドからなる。さらにより好ましいオリゴヌクレオチドは、２４～３２個のヌクレオチド、より好ましくは約３０個のヌクレオチドからなる。

【0033】

オリゴヌクレオチドという用語はまた、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む分子も指し、好ましくは該修飾ヌクレオチドは、（ａ）ヌクレオチド類似体または（ｂ）骨格修飾を含むヌクレオチドから選択される。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、（ａ）ペプチド核酸、（ｂ）イノシン、（ｃ）トリチル化塩基、（ｄ）ホスホロチオエート、（ｅ）アルキルホスホロチオエート、（ｆ）５－ニトロインドールデスオキシリボフラノシル、（ｇ）５－メチルデオキシシトシン、および（ｈ）５，６－ジヒドロ－５，６－ジヒドロキシデオキシチミジンからなる群から選択される、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。さらなる実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート化ヌクレオチドを含むか、あるいはそれからなる。ホスホロチオエート化ヌクレオチドは、細胞または生物における分解に対して保護されており、したがって好ましいヌクレオチド修飾である。さらに好ましいのは、典型的に天然に見られる、化学的、酵素的、または代謝的に修飾された形態のポリヌクレオチドである。しかしながら、好ましいオリゴヌクレオチドは、専ら修飾されていないヌクレオチド、すなわちアデノシン、チミジン、グアノシン、および／またはシチジンからなる。さらに好ましいオリゴヌクレオチドは、専らホスホジエステル結合ヌクレオチドからなる。

【0034】

非常に好ましいオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つ、好ましくは１つ、２つ、３つ、または４つのＣｐＧモチーフを含む、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである。さらにより好ましいオリゴヌクレオチドは、パリンドローム配列を含み、好ましくは該パリンドローム配列は、少なくとも１つ、好ましくは１つ、２つ、３つ、または４つのＣｐＧモチーフを含む。さらにより好ましいオリゴヌクレオチドは、パリンドローム配列を含み、好ましくは該パリンドローム配列は、配列ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号２）を含むか、または好ましくはそれからなる。さらにより好ましいオリゴヌクレオチドは、パリンドローム配列を含み、該パリンドローム配列は、その５’末端にポリＧストレッチが隣接し、該パリンドローム配列は、その３’末端にポリＧストレッチが隣接し、好ましくは該パリンドローム配列は、ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号２）である。非常に好ましいオリゴヌクレオチドは、パリンドローム配列を含み、該パリンドローム配列は、その５’末端に少なくとも３～１５個、好ましくは６～１０個のグアノシン実体が隣接し、該パリンドローム配列は、その３’末端に少なくとも３～１５個、好ましくは６～１０個のグアノシン実体が隣接し、好ましくは該パリンドローム配列は、ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号２）である。

【0035】

ポリＧストレッチ：ポリＧストレッチという用語は、オリゴヌクレオチドのセグメントに関連し、該セグメントは、少なくとも３つの連続したグアノシン残基からなる。好ましいポリＧストレッチは、３～２５個、好ましくは４～２０個、より好ましくは４～１５個、最も好ましくは４～１０個の連続したグアノシン実体からなる。さらに好ましいポリＧストレッチは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続したグアノシン実体からなる。

【0036】

ＣｐＧモチーフ：本明細書で使用される場合、ＣｐＧモチーフという用語は、シトシン（Ｃ）－グアノシン（Ｇ）ジヌクレオチドを含む、短鎖ＤＮＡ配列、好ましくは一本鎖ＤＮＡ配列を指し、Ｃは、メチル化されておらず、好ましくは該ＣＧジヌクレオチドは、ホスホジエステル結合である。好ましくは、ＣｐＧモチーフは、該ＣＧジヌクレオチドの少なくとも１つ、好ましくは１つ、２つ、または３つの追加のヌクレオチド５’および／または３’を含み、さらに好ましくは該追加のヌクレオチドは、ＣＧジヌクレオチドを含まない。

【0037】

相対ピーク開始時間：「相対ピーク開始時間」という用語は、オリゴヌクレオチドの凝集状態を示すパラメータであり、ＷＯ２００７／１４４１５０に記載のように、実施例４に記載の条件を使用した分析サイズ排除ＨＰＬＣによって本質的に分析したものである。

【0038】

パッケージ化された：本明細書で使用される場合、「パッケージ化された」という用語は、ウイルス様粒子に関連したオリゴヌクレオチドの状態、典型的に、かつ好ましくは凝集オリゴヌクレオチドの状態を指す。「ＶＬＰ中にパッケージ化された凝集オリゴヌクレオチド」または「凝集オリゴヌクレオチドがパッケージ化されたＶＬＰ」という用語の使用は、同等である。本明細書で使用される場合、「パッケージ化された」という用語は、典型的に、かつ好ましくは非共有結合、好ましくはイオン相互作用、疎水性相互作用、または水素結合を指す。典型的に、かつ非常に好ましくは、本明細書で使用される場合、「パッケージ化された」という用語は、ＶＬＰ内への該凝集オリゴヌクレオチドの封入を指す。典型的に、かつ好ましくは、凝集オリゴヌクレオチドがパッケージ化されたＶＬＰは、該凝集オリゴヌクレオチドを、分解から、好ましくはデオキシリボヌクレアーゼ加水分解から保護する。したがって、好ましい意味では、「パッケージ化された」という用語は、パッケージ化された状態の凝集オリゴヌクレオチドがデオキシリボヌクレアーゼ加水分解には利用できないことを示す。より好ましくは、「パッケージ化」という用語は、凝集オリゴヌクレオチドがデオキシリボヌクレアーゼ加水分解には利用できないことを示し、さらに好ましくはデオキシリボヌクレアーゼは、デオキシリボヌクレアーゼＩまたはベンゾナーゼである。さらにより好ましくは、「パッケージ化された」という用語は、凝集オリゴヌクレオチドがベンゾナーゼ加水分解には利用できないことを示す。

【0039】

オリゴヌクレオチドがデオキシリボヌクレアーゼ（例えば、デオキシリボヌクレアーゼＩまたはベンゾナーゼ）に利用可能であるかは、好ましくはＷＯ２００３／０２４４８１Ａ２の実施例１１～１７に記載のようにアッセイされる（その中の１１１頁を参照されたい）。好ましい意味では、ベンゾナーゼでの処理（２ｍＭのＭｇＣｌ_２を含む緩衝液中、１ｍｇあたり１９０Ｕのベンゾナーゼのコートタンパク質、ｐＨ７．２、２０～２５℃、１８時間）後、該オリゴヌクレオチドの少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％を、該ＶＬＰから回収することができる場合に、ＶＬＰは、オリゴヌクレオチドがパッケージ化されているものと見なされる。そのようなアッセイが適切な対照を必要とし、ＶＬＰとオリゴヌクレオチドとの特定の組み合わせへの適合を必要とし得ることは、当業者にとって明らかである。非常に好ましい意味では、ベンゾナーゼでの処理（２ｍＭのＭｇＣｌ_２を含む緩衝液中、１ｍｇあたり１９０Ｕのベンゾナーゼのコートタンパク質、ｐＨ７．２、２０～２５℃、１８時間）後、該Ｇ１０の少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％を、ＲＮＡバクテリオファージＱβの該ＶＬＰから回収することができる場合に、オリゴヌクレオチドＧ１０（配列番号１）は、ＲＮＡバクテリオファージＱβのＶＬＰ中にパッケージ化されているものと見なされる。

【0040】

コートタンパク質：本明細書で使用される場合、「コートタンパク質」という用語は、バクテリオファージまたはＲＮＡバクテリオファージのキャプシド集合内に組み込まれることができるＲＮＡバクテリオファージのタンパク質（複数可）を指す。したがって、コートタンパク質という用語は、ＲＮＡバクテリオファージのキャプシドまたはＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰを形成するタンパク質を指す。典型的に、かつ好ましくは、ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質は、二量体構造を有する。

【0041】

組換えコートタンパク質の断片：本明細書で使用される場合、組換えコートタンパク質の断片は、それぞれ野生型コートタンパク質または野生型組換えタンパク質の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％の長さのものであるポリペプチドとして定義され、野生型コートタンパク質または野生型組換えタンパク質は、好ましくはＶＬＰを形成する能力を保持する。好ましくは、断片は、少なくとも１つの内部欠失、少なくとも１つのトランケーション、またはそれらの少なくとも１つの組み合わせによって得られる。「組換えコートタンパク質の断片」または「コートタンパク質の断片」という用語は、それぞれ野生型コートタンパク質と少なくとも８０％、好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをさらに包含するものとし、野生型コートタンパク質は、好ましくはウイルス様粒子へと集合することができる。「変異コートタンパク質」という用語は、それぞれ野生型組換えタンパク質またはコートタンパク質に由来するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指し、アミノ酸配列は、野生型配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一であり、好ましくはＶＬＰへと集合する能力を保持する。

【0042】

ウイルス様粒子（ＶＬＰ）：本明細書で使用される場合、ＶＬＰは、非複製性もしくは非感染性、好ましくは非複製性かつ非感染性のウイルス粒子を指すか、またはウイルス粒子、好ましくはウイルスのキャプシドに似た非複製性もしくは非感染性、好ましくは非複製性かつ非感染性の構造を指す。本明細書で使用される場合、「非複製性」という用語は、ＶＬＰに含まれるゲノムを複製することができないことを指す。本明細書で使用される場合、「非感染性」という用語は、宿主細胞に侵入することができないことを指す。好ましくは、本発明によるウイルス様粒子は、ウイルスゲノムまたはゲノム機能の全部または一部を欠くため、非複製性かつ／または非感染性である。一実施形態では、ウイルス様粒子は、ウイルスゲノムが、物理的または化学的に不活性化され、分解および再集合によって、またはＶＬＰへの精製タンパク質の集合によって除去されている、ウイルス粒子である。典型的に、かつより好ましくは、ウイルス様粒子は、ウイルスゲノムの複製性および感染性構成要素の全部または一部を欠く。本発明によるウイルス様粒子は、それらのゲノムとは異なる核酸を含有し得る。本発明によるウイルス様粒子の典型的かつ好ましい実施形態は、対応するウイルス、バクテリオファージ、好ましくはＲＮＡバクテリオファージのウイルスキャプシドなどのウイルスキャプシドである。「キャプシド」という用語は、ウイルスタンパク質サブユニットで構成される巨大分子集合を指す。典型的には、６０、１２０、１８０、２４０、３００、３６０、および３６０超のウイルスタンパク質サブユニットがある。典型的に、かつ好ましくは、これらのサブユニットの相互作用は、固有の反復組織を有するウイルスキャプシドの形成をもたらし、該構造は、典型的に、かつ好ましくは球状である。例えば、ＲＮＡバクテリオファージのキャプシドは、正二十面体対称の球状形態を有する。

【0043】

ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子：本明細書で使用される場合、「ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子」という用語は、ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質、それらの変異体または断片を含むか、または好ましくは本質的にそれらからなるか、もしくはそれらからなるウイルス様粒子を指す。加えて、ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子は、ＲＮＡバクテリオファージの構造に似ており、非複製性かつ／または非感染性であり、ＲＮＡバクテリオファージの複製機構をコードする少なくとも１つの遺伝子（複数可）を欠き、典型的にはウイルスの宿主への付着または侵入に関与するタンパク質（複数可）をコードする遺伝子（複数可）もまた欠く。ＲＮＡバクテリオファージに由来する好ましいＶＬＰは、二十面体対称性を示し、１８０個のサブユニットからなる。本発明の文脈では、ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子という用語は、好ましくはＲＮＡバクテリオファージの組換えコートタンパク質、またはその断片もしくは変異体の自己集合によって得られる巨大分子構造に関し、好ましくは該自己集合はそれぞれ、オリゴヌクレオチドおよび凝集オリゴヌクレオチドの存在下で発生した。

【0044】

コートタンパク質の自己集合を予防することができる薬剤：コートタンパク質の自己集合を予防することができる薬剤は、該混合物中でのウイルス様粒子の自発的形成を予防する薬剤である。当業者は、例えば、ＷＯ２００７／１４４１５０の実施例９に開示されるように、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーによって該混合物を分析することによって、該薬剤の化学的性質および適切な濃度を実験的に決定することができる。薬剤は、該混合物を、室温、好ましくは２２℃で１時間インキュベートした後、例えば、ＷＯ２００７／１４４１５０の実施例９に開示されるように、サイズ排除クロマトグラフィーによってウイルス様粒子が検出できなくなる場合に、コートタンパク質の自己集合を予防することができる。しかしながら、コートタンパク質の自己集合を予防することができる薬剤は、該コートタンパク質を不可逆的には修飾せず、該薬剤を該混合物から除去することで、ウイルス様粒子の自発的形成がもたらされる。コートタンパク質の自己集合を予防することができる好ましい薬剤は、洗剤、塩酸グアニジニウム、および尿素、最も好ましくは尿素を含む。好ましい洗剤は、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ１００などである。典型的に、かつ好ましくは、コートタンパク質の自己集合を予防することができる薬剤は、典型的に、かつ好ましくは該コートタンパク質のシステイン残基によって形成される分子間ジスルフィド結合を還元状態に保つ、ＤＤＴなどの還元剤をさらに含む。

【0045】

純度：（ｉ）ウイルス様粒子であって、ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、（ｉｉ）本発明による凝集オリゴヌクレオチドと、を含む、本発明の組成物であって、該凝集オリゴヌクレオチドが、該ウイルス様粒子中にパッケージ化されている、本発明の組成物の純度は、分析サイズ排除ＨＰＬＣによって決定され、該ＨＰＬＣは、本質的に実施例４に開示されるような条件下、好ましくは正確にそのとおりの条件下で実行される。該組成物の純度は、同じクロマトグラムのすべてのピークの合計ピーク面積に対する、該組成物中に含有される該ウイルス様粒子のピーク面積のパーセンテージとして決定される。

【0046】

「１つの（Ｏｎｅ）」、「１つの（ａ／ａｎ）」：「１つの（Ｏｎｅ）」、「１つの（ａ）」、または「１つの（ａｎ）」という用語が本開示で使用される場合、別段明記しない限り、それらは、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味する。

【0047】

約：本出願の意味の範囲内で、約という表現は、＋／－４％、典型的に、かつ好ましくは＋／－２％の意味を有するものとする。例えば、約１００は、９６～１０４、典型的に、かつ好ましくは９８～１０２を意味するものとする。

【0048】

本発明は、凝集オリゴヌクレオチドを含むヌクレオチド組成物を生成するためのプロセスであって、（ａ）オリゴヌクレオチドを提供するステップであって、該オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのポリＧストレッチを含む、ステップと、（ｂ）該オリゴヌクレオチドを変性させるステップであって、該変性させるステップが、（ｉ）該オリゴヌクレオチドおよびカオトロピック剤を含む水溶液Ｉを、該オリゴヌクレオチドの平均直径が１ｎｍ以下になるまで温度Ｉでインキュベートするステップであって、好ましくは該平均直径が、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定され、該温度Ｉが、７５℃～９９℃であり、好ましくは該カオトロピック剤が、尿素である、ステップを含む、ステップと、（ｃ）該オリゴヌクレオチドを凝集させるステップであって、該凝集させるステップが、（ｉ）ステップ（ｂ）で得られた１ｎｍ以下の該平均直径を有する該オリゴヌクレオチド、カオトロピック剤、およびカチオンを含む水溶液ＩＩを、温度ＩＩでインキュベートして、該凝集オリゴヌクレオチドを形成するステップであって、該インキュベートすることが、該形成された凝集オリゴヌクレオチドの平均直径が、６～１６ｎｍになるまで実行され、好ましくは該平均直径が、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定され、該温度ＩＩが、７５℃～９９℃であり、好ましくは該カオトロピック剤が、尿素である、ステップと、（ｉｉ）該溶液ＩＩの温度を温度ＩＩＩに調整するステップであって、該温度ＩＩＩが、４０℃未満、好ましくは３０℃未満である、ステップと、を含む、ステップと、を含み、該ステップが、好ましくは所与の順序で実行される、プロセスを提供する。

【0049】

本発明は、凝集オリゴヌクレオチドを生成するためのプロセスであって、（ａ）オリゴヌクレオチドを提供するステップであって、該オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのポリＧストレッチを含む、ステップと、（ｂ）該オリゴヌクレオチドを変性させるステップであって、該変性させるステップが、（ｉ）該オリゴヌクレオチドおよびカオトロピック剤を含む水溶液Ｉを、該オリゴヌクレオチドの平均直径が１ｎｍ以下になるまで温度Ｉでインキュベートするステップであって、好ましくは該平均直径が、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定され、該温度Ｉが、７５℃～９９℃であり、好ましくは該カオトロピック剤が、尿素である、ステップを含む、ステップと、（ｃ）該オリゴヌクレオチドを凝集させるステップであって、該凝集させるステップが、（ｉ）ステップ（ｂ）で得られた１ｎｍ以下の該平均直径を有する該オリゴヌクレオチド、カオトロピック剤、およびカチオンを含む水溶液ＩＩを、温度ＩＩでインキュベートして、該凝集オリゴヌクレオチドを形成するステップであって、該インキュベートすることが、該形成された凝集オリゴヌクレオチドの平均直径が、６～１６ｎｍになるまで実行され、好ましくは該平均直径が、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定され、該温度ＩＩが、７５℃～９９℃であり、好ましくは該カオトロピック剤が、尿素である、ステップと、（ｉｉ）該溶液ＩＩの温度を温度ＩＩＩに調整するステップであって、該温度ＩＩＩが、４０℃未満、好ましくは３０℃未満である、ステップと、を含む、ステップと、を含み、該ステップが、好ましくは所与の順序で実行される、プロセスをさらに提供する。

【0050】

好ましい実施形態では、該オリゴヌクレオチドを該変性させることは、該オリゴヌクレオチドを該カオトロピック剤を含む水溶液中に可溶化して、該水溶液Ｉを形成するステップであって、該水溶液が、１ｍＭよりも高い濃度の一価または二価イオンを含まず、該水溶液が、５００μＭよりも高い濃度、好ましくは２５０μＭよりも高い濃度、好ましくは１００μＭよりも高い濃度、好ましくは５０μＭよりも高い濃度、好ましくは１０μＭよりも高い濃度の一価または二価イオンを含まない、ステップを含む。

【0051】

さらに好ましい実施形態では、該オリゴヌクレオチドを該変性させることは、該オリゴヌクレオチドを該カオトロピック剤を含む水溶液に可溶化して、該水溶液Ｉを形成するステップであって、該水溶液が、オリゴヌクレオチドの添加後に該オリゴヌクレオチドの自己凝集を引き起こす濃度の一価または二価イオンを含まない、ステップを含む。

【0052】

さらに好ましい実施形態では、該水溶液Ｉは、該オリゴヌクレオチドが自己凝集するような濃度の一価または二価イオンを含まない。

【0053】

さらに好ましい実施形態では、該オリゴヌクレオチドを該変性させることは、該オリゴヌクレオチドを該カオトロピック剤を含む水溶液に可溶化して、該水溶液Ｉを形成するステップであって、該水溶液が、オリゴヌクレオチドの添加後に該オリゴヌクレオチドの自発的な自己凝集を引き起こす濃度の一価または二価イオンを含まない、ステップを含む。

【0054】

さらに好ましい実施形態では、該水溶液Ｉは、該オリゴヌクレオチドが自発的に自己凝集するような濃度の一価または二価のイオンを含まない。

【0055】

さらに好ましい実施形態では、該オリゴヌクレオチドを該変性させることは、該オリゴヌクレオチドおよび該カオトロピック剤を可溶化して、該水溶液Ｉを形成し、該溶液Ｉの温度を温度Ｉに調整するステップを含む。

【0056】

さらに好ましい実施形態では、該溶液Ｉ中に含まれる該カオトロピック剤は、尿素、フェノール、イソプロピルアルコール、エタノール、および塩化グアニジニウムから選択される。

【0057】

さらに好ましい実施形態では、該溶液Ｉ中に含まれる該カオトロピック剤は、尿素である。

【0058】

さらに好ましい実施形態では、該温度Ｉは、７５℃～９０℃、好ましくは８０℃～９０℃、さらに好ましくは８３℃～８７℃、再びさらに好ましくは約８５℃、および最も好ましくは８５℃である。

【0059】

さらに好ましい実施形態では、該オリゴヌクレオチドを該温度Ｉの該溶液Ｉ中で該インキュベートすることは、１０～１２０分間、好ましくは２０～６０分間、さらに好ましくは２０～３０分間、および再びさらに好ましくは１５～１８分間実行される。

【0060】

さらに好ましい実施形態では、該溶液Ｉ中の該カオトロピック剤、好ましくは該尿素の該濃度は、２００ｎＭ～５Ｍ、好ましくは５００ｍＭ～２Ｍ、さらに好ましくは５００ｍＭ～１．５Ｍ、および再びさらに好ましくは１Ｍである。

【0061】

さらに好ましい実施形態では、該溶液Ｉ中の該オリゴヌクレオチド、好ましくは配列番号１の該オリゴヌクレオチドの該濃度は、１００μＭ～１ｍＭ、好ましくは１００μＭ～７５０μＭ、さらに好ましくは２００μＭ～６００μＭ、および再びさらに好ましくは３５０μＭ～５００μＭである。

【0062】

さらに好ましい実施形態では、該オリゴヌクレオチドを該温度Ｉの該溶液Ｉ中で該インキュベートすることは、１５分～１２０分間、好ましくは１５分～６０分間、およびさらに好ましくは１５分～３０分間、再びさらに好ましくは１５分～２５分間実行される。

【0063】

さらに好ましい実施形態では、該オリゴヌクレオチドは、その５’末端に少なくとも３かつ最大１５個のグアノシン実体、およびその３’末端に少なくとも３かつ最大１５個のグアノシン実体、好ましくは少なくとも６かつ最大１３個のグアノシン実体、およびその３’末端に少なくとも６かつ最大１３個のグアノシン実体、さらに好ましくは少なくとも８かつ最大１１個のグアノシン実体、およびその３’末端に少なくとも８かつ最大１１個のグアノシン実体を含む。

【0064】

さらに好ましい実施形態では、該オリゴヌクレオチドは、パリンドローム配列を含み、好ましくは該パリンドローム配列は、ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号２）であり、さらに好ましくは該パリンドローム配列は、その５’末端に少なくとも３かつ最大１５個のグアノシン実体が隣接し、該パリンドローム配列は、その３’末端に少なくとも３かつ最大１５個のグアノシン実体が隣接し、再びさらに好ましくは該パリンドローム配列は、その５’末端に少なくとも６かつ最大１３個のグアノシン実体が隣接し、該パリンドローム配列は、その３’末端に少なくとも６かつ最大１３個のグアノシン実体が隣接し、再びさらに好ましくは該パリンドローム配列は、その５’末端に少なくとも８かつ最大１１個のグアノシン実体が隣接し、該パリンドローム配列は、その３’末端に少なくとも８かつ最大１１個のグアノシン実体が隣接している。

【0065】

さらに好ましい実施形態では、該オリゴヌクレオチドは、１０～１０００個のヌクレオチド、好ましくは１０～２００個のヌクレオチド、さらに好ましくは１０～１００個のヌクレオチド、さらにより好ましくは２０～４０個のヌクレオチド、およびさらにより好ましくは３０個のヌクレオチドを含む。

【0066】

さらに好ましい実施形態では、該オリゴヌクレオチドは、
（ａ）Ｇ１０：ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号１）、
（ｂ）Ｇ１０－１１：ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号３）、
（ｃ）Ｇ１２－１１：ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号４）、
（ｄ）Ｇ６：ＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号５）、
（ｅ）Ｇ７：ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号６）、
（ｆ）Ｇ８：ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号７）、
（ｇ）Ｇ９：ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号８）、
（ｈ）Ｇ１１：ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号９）、
（ｉ）Ｇ６－１０：ＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２４）、
（ｊ）Ｇ７－１０：ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２５）、
（ｋ）Ｇ８－１０：ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２６）、および
（ｌ）Ｇ９－１０：ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２７）からなる群から選択される核酸配列を含む。

【0067】

さらに好ましい実施形態では、該オリゴヌクレオチドは、核酸配列Ｇ１０ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号１）を有する。

【0068】

さらに好ましい実施形態では、該オリゴヌクレオチドは、専らホスホジエステル結合デオキシヌクレオチドからなる。

【0069】

さらに好ましい実施形態では、該オリゴヌクレオチドの純度、好ましくは配列番号１の該オリゴヌクレオチドの純度は、ＨＰＬＣによって、好ましくは逆相ＨＰＬＣまたはアニオン交換ＨＰＬＣによって、より好ましくは逆相ＨＰＬＣによって決定して、９０％以上である。

【0070】

さらに好ましい実施形態では、ＨＰＬＣによって、好ましくは逆相ＨＰＬＣまたはアニオン交換ＨＰＬＣによって、より好ましくは逆相ＨＰＬＣによって決定して、該オリゴヌクレオチドの純度、好ましくは配列番号１の該オリゴヌクレオチドの純度は、９２％以上、好ましくは９４％以上、さらに好ましくは９５％以上、再びさらに好ましくは９７％以上、再びさらに好ましくは９８％以上、再びさらに好ましくは９９％以上である。

【0071】

さらに好ましい実施形態では、該オリゴヌクレオチドは、配列番号１の配列を含み、該オリゴヌクレオチドは、専らホスホジエステル結合デオキシヌクレオチドからなる。

【0072】

さらに好ましい実施形態では、該オリゴヌクレオチドは、配列番号１の配列からなる。

【0073】

さらに好ましい実施形態では、該オリゴヌクレオチドは、配列番号１の配列からなり、該オリゴヌクレオチドは、専らホスホジエステル結合デオキシヌクレオチドからなる。

【0074】

さらに好ましい実施形態では、該溶液ＩＩ中に含まれる該カオトロピック剤は、尿素、フェノール、イソプロピルアルコール、エタノール、および塩化グアニジニウムから選択される。

【0075】

さらに好ましい実施形態では、該溶液ＩＩ中に含まれる該カオトロピック剤は、尿素である。

【0076】

したがって、さらに好ましい実施形態では、該溶液ＩＩ中、すなわち凝集用該溶液中に含まれる該カオトロピック剤は、尿素である。

【0077】

さらに好ましい実施形態では、該温度ＩＩは、７５℃～９０℃、好ましくは８０℃～９０℃、さらに好ましくは８３℃～８７℃、再びさらに好ましくは約８５℃、および最も好ましくは８５℃である。

【0078】

さらに好ましい実施形態では、該溶液ＩＩ中の該カオトロピック剤、好ましくは該尿素の該濃度は、２００ｎＭ～５Ｍ、好ましくは５００ｍＭ～２Ｍ、さらに好ましくは５００ｍＭ～１．５Ｍ、および再びさらに好ましくは１Ｍである。

【0079】

さらに好ましい実施形態では、該カチオンは、Ｎａ^＋、Ｋ^＋、ＮＨ_４ ^＋、Ｌｉ^＋、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、およびＺｎ^２＋から選択される。

【0080】

該カチオンは、典型的に、かつ好ましくは無機塩によって提供され、さらに好ましくは該無機塩は、塩化物および硫酸塩から選択される。好ましくは、該カチオンとしての該Ｎａ^＋、Ｋ^＋、ＮＨ_４ ^＋、Ｌｉ^＋、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｚｎ^２＋は、その塩化物塩によって提供される。あるいは、該カチオンとしての該Ｎａ^＋、Ｋ^＋、ＮＨ_４ ^＋、Ｌｉ^＋、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｚｎ^２＋は、その硫酸塩によって提供される。再びさらに好ましくは、該カチオンとしての該Ｎａ^＋、Ｋ^＋、ＮＨ_４ ^＋、Ｌｉ^＋、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋は、その塩化物塩によって提供され、該カチオンとしての該Ｚｎ^２＋は、好ましくはその硫酸塩として提供される。

【0081】

さらに好ましい実施形態では、該溶液ＩＩ中の該カチオンの該濃度は、２０ｍＭ～２Ｍ、好ましくは５０ｍＭ～１Ｍ、さらに好ましくは１００ｍＭ～５００ｍＭ、および再びさらに好ましくは２５０ｍＭである。

【0082】

さらに好ましい実施形態では、該溶液Ｉ中に含まれる該カオトロピック剤および該溶液ＩＩ中に含まれる該カオトロピック剤は、同じである。

【0083】

さらに好ましい実施形態では、該溶液Ｉ中に含まれる該カオトロピック剤および該溶液ＩＩ中に含まれる該カオトロピック剤の濃度は、同じである。

【0084】

さらに好ましい実施形態では、該溶液Ｉ中に含まれる該カオトロピック剤および該溶液ＩＩ中に含まれる該カオトロピック剤は、尿素である。

【0085】

さらなる好ましい実施形態では、該オリゴヌクレオチドを該凝集させることは、（ｉ）該カオトロピック剤および該カチオンを可溶化して、水溶液ＩＩａを形成するステップと、（ｉｉ）該水溶液ＩＩａと、ステップ（ｂ）で得られた１ｎｍ以下の該平均直径を有する該オリゴヌクレオチドを含む該水溶液Ｉとを混合して、該水溶液ＩＩを形成するステップと、（ｉｉｉ）該溶液ＩＩの温度を温度ＩＩに調整するステップと、を含む。

【0086】

さらに好ましい実施形態では、該温度Ｉおよび該温度ＩＩの温度差は、５℃以下、好ましくは４℃以下、さらに好ましくは３℃以下、再びさらに好ましくは２℃以下、再びさらに好ましくは１℃以下であり、最も好ましくは該温度Ｉおよび該温度ＩＩは、等しい。

【0087】

さらに好ましい実施形態では、該インキュベートすることは、該凝集オリゴヌクレオチドの平均直径が、７～１４ｎｍになるまで実行され、該平均直径は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定される。

【0088】

さらに好ましい実施形態では、該インキュベートすることは、該凝集オリゴヌクレオチドの平均直径が、８～１４ｎｍになるまで実行され、該平均直径は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定される。

【0089】

さらに好ましい実施形態では、該インキュベートすることは、該凝集オリゴヌクレオチドの平均直径が、９～１４ｎｍになるまで実行され、該平均直径は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定される。

【0090】

さらに好ましい実施形態では、該インキュベートすることは、該凝集オリゴヌクレオチドの平均直径が、１０～１４ｎｍになるまで実行され、該平均直径は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定される。

【0091】

さらに好ましい実施形態では、該インキュベートすることは、該凝集オリゴヌクレオチドの平均直径が、１１～１３ｎｍになるまで実行され、該平均直径は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定される。

【0092】

さらに好ましい実施形態では、該インキュベートすることは、該凝集オリゴヌクレオチドの平均直径が、１１、１２、または１３ｎｍになるまで実行され、該平均直径は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定される。

【0093】

さらに好ましい実施形態では、該インキュベートすることは、該凝集オリゴヌクレオチドの平均直径が、１２ｎｍになるまで実行され、該平均直径は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定される。

【0094】

本発明による動的光散乱（ＤＬＳ）による平均直径の決定は、それが変性の過程における該オリゴヌクレオチドのものであろうと、それが凝集の過程における該凝集オリゴヌクレオチドのものであろうと、非常に有益であるが、これは、該決定が、プロセスの実行中に容易にもたらすことができるためである。これはさらに、それぞれオリゴヌクレオチドおよび凝集オリゴヌクレオチドの所望のサイズの非常に高い精度および非常に高い制御を確実にする。

【0095】

さらに好ましい実施形態では、該インキュベートすることは、該凝集オリゴヌクレオチドが、８０～１１０％の相対ピーク開始時間を含むまで実行され、該相対ピーク開始時間は、標準としてＲＮＡバクテリオファージのキャプシドを用いたサイズ排除ＨＰＬＣによって決定される。

【0096】

さらに好ましい実施形態では、該プロセスは、該凝集オリゴヌクレオチドを精製するステップをさらに含み、好ましくは該精製することは、該凝集オリゴヌクレオチド、好ましくは該凝集オリゴヌクレオチドを含む該溶液ＩＩを、５０ｎｍのフィルターを通して濾過することを含む。

【0097】

さらに好ましい実施形態では、該５０ｎｍのフィルターは、５０ｎｍのＰＴＦＥフィルターである。

【0098】

さらに好ましい実施形態では、該凝集オリゴヌクレオチド、好ましくは該凝集オリゴヌクレオチドを含む該溶液ＩＩを、該５０ｎｍのフィルター、好ましくは該５０ｎｍのＰＴＦＥフィルターを通して濾過することは、０℃～２０℃で実行される。

【0099】

精製、好ましくは濾過する該さらに好ましいステップは、ＶＬＰへのパッケー化ステップ前にいかなる大きな凝集体も除去することを可能にし、故に典型的には最終生成物、すなわち凝集オリゴヌクレオチドがパッケージ化された本発明のＶＬＰの純度を、典型的には約５％だけさらに増加させる。したがって、純度の増加は、ＳＥＣＨＬＰＣまたはＤＬＳによって証明されるように、典型的には最終生成物中のより高分子量の材料の低下と関連している。

【0100】

さらに好ましい実施形態では、該プロセスは、該凝集オリゴヌクレオチドを精製するステップを含まない。

【0101】

さらに好ましい実施形態では、該凝集オリゴヌクレオチドは、その５’末端に少なくとも３かつ最大１５個のグアノシン実体、およびその３’末端に少なくとも３かつ最大１５個のグアノシン実体、好ましくは少なくとも６かつ最大１３個のグアノシン実体、およびその３’末端に少なくとも６かつ最大１３個のグアノシン実体、さらに好ましくは少なくとも８かつ最大１１個のグアノシン実体、およびその３’末端に少なくとも８かつ最大１１個のグアノシン実体を含む。

【0102】

さらに好ましい実施形態では、該凝集オリゴヌクレオチドは、パリンドローム配列を含み、好ましくは該パリンドローム配列は、ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号２）であり、さらに好ましくは該パリンドローム配列は、その５’末端に少なくとも３かつ最大１５個のグアノシン実体が隣接し、該パリンドローム配列は、その３’末端に少なくとも３かつ最大１５個のグアノシン実体が隣接し、再びさらに好ましくは該パリンドローム配列は、その５’末端に少なくとも６かつ最大１３個のグアノシン実体が隣接し、該パリンドローム配列は、その３’末端に少なくとも６かつ最大１３個のグアノシン実体が隣接し、再びさらに好ましくは該パリンドローム配列は、その５’末端に少なくとも８かつ最大１１個のグアノシン実体が隣接し、該パリンドローム配列は、その３’末端に少なくとも８かつ最大１１個のグアノシン実体が隣接している。

【0103】

さらに好ましい実施形態では、該凝集オリゴヌクレオチドは、１０～１０００個のヌクレオチド、好ましくは１０～２００個のヌクレオチド、さらに好ましくは１０～１００個のヌクレオチド、さらにより好ましくは２０～４０個のヌクレオチド、およびさらにより好ましくは３０個のヌクレオチドを含む。

【0104】

さらに好ましい実施形態では、該凝集オリゴヌクレオチドは、
（ａ）Ｇ１０：ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号１）、
（ｂ）Ｇ１０－１１：ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号３）、
（ｃ）Ｇ１２－１１：ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号４）、
（ｄ）Ｇ６：ＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号５）、
（ｅ）Ｇ７：ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号６）、
（ｆ）Ｇ８：ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号７）、
（ｇ）Ｇ９：ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号８）、
（ｈ）Ｇ１１：ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号９）、
（ｉ）Ｇ６－１０：ＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２４）、
（ｊ）Ｇ７－１０：ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２５）、
（ｋ）Ｇ８－１０：ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２６）、および
（ｌ）Ｇ９－１０：ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２７）からなる群から選択される核酸配列を含む。

【0105】

さらに好ましい実施形態では、該凝集オリゴヌクレオチドは、核酸配列ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号１）（Ｇ１０）を有する。

【0106】

さらに好ましい実施形態では、該凝集オリゴヌクレオチドは、専らホスホジエステル結合デオキシヌクレオチドからなる。

【0107】

さらなる態様では、本発明は、凝集オリゴヌクレオチドを含むヌクレオチド組成物であって、本発明による凝集オリゴヌクレオチドを含むヌクレオチド組成物を生成するためのプロセスによって得ることができ、好ましくは該凝集オリゴヌクレオチドが、６～１６ｎｍ、好ましくは７～１４ｎｍの平均直径を有し、該平均直径が、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定される、ヌクレオチド組成物を提供する。

【0108】

好ましい実施形態では、該凝集オリゴヌクレオチドは、８～１４ｎｍ、好ましくは９～１４ｎｍ、さらに好ましくは１０～１４ｎｍの平均直径を有し、該平均直径は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定される。

【0109】

さらに好ましい実施形態では、該凝集オリゴヌクレオチドは、１１～１３ｎｍ、好ましくは１１、１２、または１３ｎｍ、さらに好ましくは１２ｎｍの平均直径を有し、該平均直径は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定される。

【0110】

さらに好ましい実施形態では、該凝集オリゴヌクレオチドの少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％は、１０．８ｎｍ～１３．２ｎｍの直径を有し、該直径は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定される。

【0111】

さらに好ましい実施形態では、該凝集オリゴヌクレオチドの該少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％は、１１．４ｎｍ～１２．６ｎｍの直径を有し、該直径は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定される

【0112】

該ヌクレオチド組成物のさらに好ましい実施形態では、該凝集オリゴヌクレオチドの少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％は、１２ｎｍ±１０％、すなわち１０．８ｎｍ～１３．２ｎｍの直径を有し、該直径は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定される。

【0113】

該ヌクレオチド組成物のさらに好ましい実施形態では、該凝集オリゴヌクレオチドの少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％は、１２ｎｍ±５％、すなわち１１．４ｎｍ～１２．６ｎｍの直径を有し、該直径は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定される。

【0114】

さらに好ましい実施形態では、該凝集オリゴヌクレオチドは、核酸配列Ｇ１０ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号１）を有する。

【0115】

さらに好ましい実施形態では、該凝集オリゴヌクレオチドは、核酸配列Ｇ１０ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号１）を有し、該凝集オリゴヌクレオチドは、専らホスホジエステル結合デオキシヌクレオチドからなる。

【0116】

【0117】

【0118】

【0119】

さらに好ましい実施形態では、該凝集オリゴヌクレオチドの少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％は、１０．８ｎｍ～１３．２ｎｍの直径を有し、該直径は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定される

【0120】

さらに好ましい実施形態では、該凝集オリゴヌクレオチドの少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％は、１１．４ｎｍ～１２．６ｎｍの直径を有し、該直径は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定される

【0121】

【0122】

【0123】

【0124】

【0125】

さらなる態様では、本発明は、（ｉ）ウイルス様粒子であって、ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、（ｉｉ）凝集オリゴヌクレオチドであって、該ウイルス内にパッケージ化されている、凝集オリゴヌクレオチドと、を含む、組成物を生成するためのプロセスであって、（ａ）混合物を生成するステップであって、該混合物が、（ｉ）該ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質と、（ｉｉ）該コートタンパク質の自己集合を予防することができる薬剤と、（ｉｉｉ）凝集オリゴヌクレオチドであって、少なくとも１つのポリＧストレッチを含むオリゴヌクレオチドを含み、６～１６ｎｍの平均直径を有し、該平均直径が、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定される、凝集オリゴヌクレオチドと、を含む、ステップと、（ｂ）該混合物から該薬剤を除去するステップと、（ｃ）該コートタンパク質がウイルス様粒子に自己集合し、該凝集オリゴヌクレオチドをパッケージ化することを可能にするステップと、を含む、プロセスを提供する。

【0126】

再びさらなる態様では、本発明は、（ｉ）ウイルス様粒子であって、ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、（ｉｉ）凝集オリゴヌクレオチドであって、該ウイルス内にパッケージ化されている、凝集オリゴヌクレオチドと、を含む、組成物を生成するためのプロセスであって、（ａ）混合物を生成するステップであって、該混合物が、（ｉ）該ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質と、（ｉｉ）該コートタンパク質の自己集合を予防することができる薬剤と、（ｉｉｉ）凝集オリゴヌクレオチドであって、少なくとも１つのポリＧストレッチを含むオリゴヌクレオチドを含み、本発明の第１の態様に記載のプロセスによって得ることができ、６～１６ｎｍの平均直径を有し、該平均直径が、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定される、凝集オリゴヌクレオチドと、を含む、ステップと、（ｂ）該混合物から該薬剤を除去するステップと、（ｃ）該コートタンパク質がウイルス様粒子に自己集合し、該凝集オリゴヌクレオチドをパッケージ化することを可能にするステップと、を含む、プロセスを提供する。

【0127】

再びさらなる態様では、本発明は、（ｉ）ウイルス様粒子であって、ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、（ｉｉ）凝集オリゴヌクレオチドであって、該ウイルス内にパッケージ化されている、凝集オリゴヌクレオチドと、を含む、組成物を生成するためのプロセスであって、（ａ）混合物を生成するステップであって、該混合物が、（ｉ）該ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質と、（ｉｉ）該コートタンパク質の自己集合を予防することができる薬剤と、（ｉｉｉ）ヌクレオチド組成物であって、本発明による凝集オリゴヌクレオチドを含むヌクレオチド組成物を生成するためのプロセスによって得ることができ、該ヌクレオチド組成物が、該凝集オリゴヌクレオチドを含み、該凝集オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのポリＧストレッチを含むオリゴヌクレオチドを含み、６～１６ｎｍの平均直径を有し、該平均直径が、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定される、凝集オリゴヌクレオチドと、を含む、ステップと、（ｂ）該混合物から該薬剤を除去するステップと、（ｃ）該コートタンパク質がウイルス様粒子に自己集合し、該凝集オリゴヌクレオチドをパッケージ化することを可能にするステップと、を含む、プロセスを提供する。

【0128】

【0129】

【0130】

【0131】

さらに好ましい実施形態では、該コートタンパク質は、自己集合することができる、ＲＮＡバクテリオファージの組換えタンパク質またはそれらの断片を含む。

【0132】

さらに好ましい実施形態では、該コートタンパク質は、自己集合することができる、ＲＮＡバクテリオファージの組換えタンパク質またはそれらの断片からなる。

【0133】

さらに好ましい実施形態では、該ＲＮＡバクテリオファージは、
（ａ）バクテリオファージＱβ、
（ｂ）バクテリオファージＲ１７、
（ｃ）バクテリオファージｆｒ、
（ｄ）バクテリオファージＧＡ、
（ｄ）バクテリオファージＳＰ、
（ｅ）バクテリオファージＭＳ２、
（ｆ）バクテリオファージＭ１１、
（ｇ）バクテリオファージＭＸ１、
（ｈ）バクテリオファージＮＬ９５、
（ｉ）バクテリオファージｆ２、
（ｊ）バクテリオファージＰＰ７、および
（ｋ）バクテリオファージＡＰ２０５からなる群から選択される。

【0134】

さらに好ましい実施形態では、該ＲＮＡバクテリオファージは、Ｑβである。

【0135】

さらに好ましい実施形態では、該コートタンパク質は、
（ａ）配列番号１０（ＱβＣＰ）、
（ｂ）配列番号１０と配列番号１１との混合物（ＱβＡ１タンパク質）、
（ｃ）配列番号１２（Ｒ１７コートタンパク質）、
（ｄ）配列番号１３（ｆｒコートタンパク質）、
（ｅ）配列番号１４（ＧＡコートタンパク質）、
（ｆ）配列番号１５（ＳＰコートタンパク質）、
（ｇ）配列番号１５と配列番号１６との混合物、
（ｈ）配列番号１７（ＭＳ２コートタンパク質）、
（ｉ）配列番号１８（Ｍ１１コートタンパク質）、
（ｊ）配列番号１９（ＭＸＩコートタンパク質）、
（ｋ）配列番号２０（ＮＬ９５コートタンパク質）、
（１）配列番号２１（ｆ２コートタンパク質）、
（ｍ）配列番号２２（ＰＰ７コートタンパク質）、および
（ｎ）配列番号２３（ＡＰ２０５コートタンパク質）からなる群から選択される配列を含む。

【0136】

さらに好ましい実施形態では、該コートタンパク質は、配列番号１０（ＱβＣＰ）の配列を含む。

【0137】

さらに好ましい実施形態では、該コートタンパク質は、配列番号１０と配列番号１１との混合物（ＱβＡ１タンパク質）を含む。

【0138】

さらに好ましい実施形態では、該コートタンパク質は、配列番号１０（ＱβＣＰ）の配列からなる。

【0139】

さらに好ましい実施形態では、該コートタンパク質は、配列番号１０と配列番号１１との混合物（ＱβＡ１タンパク質）からなる。

【0140】

さらに好ましい実施形態では、該混合物中の該コートタンパク質の濃度は、１～４ｍｇ／ｍｌ、好ましくは２．５ｍｇ／ｍｌである。

【0141】

さらに好ましい実施形態では、該混合物中の該凝集オリゴヌクレオチドの濃度は、２５～１００μＭ、好ましくは６２．５μＭである。

【0142】

さらに好ましい実施形態では、該混合物中の該凝集オリゴヌクレオチドおよび該コートタンパク質の該モル比は、０．５～１．２、好ましくは０．７である。

【0143】

さらに好ましい実施形態では、該薬剤は、尿素および塩酸グアニジニウムから選択される変性化合物を含む。

【0144】

さらに好ましい実施形態では、該薬剤は、変性化合物を含み、該変性化合物は、尿素であり、好ましくは該混合物中の該尿素の濃度は、０．２５～７．２Ｍ、好ましくは１Ｍである。

【0145】

さらに好ましい実施形態では、該薬剤は、還元剤をさらに含む。

【0146】

さらに好ましい実施形態では、該還元剤は、ＤＴＴであり、好ましくは該混合物中の該ＤＴＴの濃度は、１～２５ｍＭ、好ましくは２．５ｍＭである。

【0147】

さらに好ましい実施形態では、該混合物から該薬剤を該除去することは、第１の緩衝液での第１の緩衝液交換によって実行され、該第１の緩衝液は、塩化ナトリウムを含み、好ましくは該第１の緩衝液中の該塩化ナトリウムの濃度は、５０～３５０ｍＭ、好ましくは２５０ｍＭである。

【0148】

さらに好ましい実施形態では、該第１の緩衝液交換は、膜を横切って実行され、該膜は、１～５０ｋＤ、好ましくは５～３０ｋＤ、最も好ましくは３０ｋＤの分子量カットオフを含む。

【0149】

さらに好ましい実施形態では、該プロセスは、該ウイルス様粒子を酸化剤と接触させるステップをさらに含み、好ましくは該酸化剤は、
（ａ）過酸化水素であって、好ましくは該過酸化水素の濃度が、０．２５～５０ｍＭ、好ましくは２ｍＭである、過酸化水素、
（ｂ）酸素、
（ｃ）グルタチオン、
（ｄ）Ｃｕ^２＋、および
（ｅ）Ｆｅ^３＋からなる群から選択される。

【0150】

さらに好ましい実施形態では、酸化剤としての該酸素は、無菌濾過空気、典型的に、かつ好ましくは無菌濾過周囲空気であり得る。

【0151】

さらに好ましい実施形態では、該プロセスは、該ウイルス様粒子を精製するステップをさらに含み、該精製することは、第２の緩衝液での第２の緩衝液交換を含み、該第２の緩衝液は、薬学的に許容される緩衝液である。

【0152】

さらに好ましい実施形態では、該第２の緩衝液交換は、膜を使用して実行され、該膜は、５０～１０００ｋＤの分子量カットオフを含む。

【0153】

さらに好ましい実施形態では、該第２の緩衝液交換は、膜を使用して実行され、該膜は、１００～３００ｋＤの分子量カットオフを含む。

【0154】

さらに好ましい実施形態では、該組成物の該純度は、サイズ排除クロマトグラフィーによって決定して、少なくとも９９．５％、好ましくは少なくとも９９．６％、より好ましくは少なくとも９９．７％、さらにより好ましくは少なくとも９９．８％、および最も好ましくは少なくとも９９．９％である。

【0155】

【0156】

【0157】

さらに好ましい実施形態では、該ＲＮＡバクテリオファージは、バクテリオファージＱβである。

【0158】

さらに好ましい実施形態では、ＲＮＡバクテリオファージＱβの該ウイルス様粒子は、配列番号１０の配列を含むコートタンパク質（ＱβＣＰ）からなる。

【0159】

さらに好ましい実施形態では、ＲＮＡバクテリオファージＱβの該ウイルス様粒子は、配列番号１０と配列番号１１との混合物を含むコートタンパク質（ＱβＡ１タンパク質）からなる。

【0160】

さらに好ましい実施形態では、ＲＮＡバクテリオファージＱβの該ウイルス様粒子は、配列番号１０の配列からなるコートタンパク質（ＱβＣＰ）からなる。

【0161】

さらに好ましい実施形態では、ＲＮＡバクテリオファージＱβの該ウイルス様粒子は、配列番号１０と配列番号１１との混合物からなるコートタンパク質（ＱβＡ１タンパク質）からなる。

【0162】

【0163】

【0164】

さらに好ましい実施形態では、該組成物の純度は、サイズ排除クロマトグラフィーによって決定して、少なくとも９９．５％、好ましくは少なくとも９９．６％、より好ましくは少なくとも９９．７％、さらにより好ましくは少なくとも９９．８％、および最も好ましくは少なくとも９９．９％である。

【0165】

さらに好ましい実施形態では、該凝集オリゴヌクレオチドは、６～１６、好ましくは７～１４ｎｍの平均直径を有し、該平均直径は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定される。

【0166】

さらに好ましい実施形態では、該凝集オリゴヌクレオチドは、８～１４ｎｍ、好ましくは９～１４ｎｍ、さらに好ましくは１０～１４ｎｍの平均直径を有し、該平均直径は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定される。

【0167】

【0168】

【0169】

【0170】

該組成物のさらに好ましい実施形態では、該凝集オリゴヌクレオチドの少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％は、１２ｎｍ±１０％、すなわち１０．８ｎｍ～１３．２ｎｍの直径を有し、該直径は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定される。

【0171】

該組成物のさらに好ましい実施形態では、該凝集オリゴヌクレオチドの少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％は、１２ｎｍ±５％、すなわち１１．４ｎｍ～１２．６ｎｍの直径を有し、該直径は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定される。

【実施例】

【0172】

実施例は、本発明を制限することなく、本発明を例示することを意図している。以下に記載される実施例では、別段明記しない限り、すべての温度は、摂氏（℃）で示されている。試薬は、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、ＢｏｓｔｏｎＢｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＡｌｆａＡｅｓａｒなどの商業供給業者から購入し、特に明記しない限り、さらに精製することなく使用した。記載の反応で使用される水は、すべての汚染物質および塩を除去するために精製または処理されている。無機イオン性不純物の除去は、水の導電率を測定することによって確認する。この用途で使用される水は、典型的に、かつ好ましくは２５℃で少なくとも１８ＭΩ・ｃｍの抵抗力を有する。これは、塩などの残留無機不純物が１ｐｐｂ未満であることを確実にする。

【0173】

オリゴヌクレオチド、具体的には配列番号１のオリゴヌクレオチドＧ１０の純度は、イオン対逆相高速液体クロマトグラフィー（ＩＰ－ＲＰ－ＨＰＬＣ）によって、またはアニオン交換－高速液体クロマトグラフィー（ＩＥＸ－ＨＰＬＣ）によって決定した。

【0174】

ＩＰ－ＲＰ－ＨＰＬＣは、４．６×７５ｍｍのＷａｔｅｒｓＸｂｒｉｄｇｅＢＥＨＣ１８、７０±２℃のカラム温度の２．５μｍのカラム、０．４ｍＬ／分の流量、２６０ｎｍの波長、５μＬの注入量、および４０分間の実行時間を使用して、もたらした。

【0175】

ＩＥＸ－ＨＰＬＣは、４．０×２５０ｍｍのＤｉｏｎｅｘＤＮＡＰａｃＰＡ２００、３０±２℃のカラム温度のパーツ番号０６３０００カラム、１．０ｍＬ／分の流量、２６０ｎｍの波長、２０μＬの注入量、および４５分間の実行時間を使用して、もたらした。

【0176】

ＩＰ－ＲＰ－ＨＰＬ．Ｃ／／Ｇ１０：試料を、オリゴヌクレオチドイオン対合カラムに注入し、溶出を、ＴＥＡおよびＨＦＩＰで修飾した混合水アセトニトリル勾配を対合緩衝液として使用して実行し、２６０ｎｍで検出した。得られたオリゴヌクレオチドＧ１０ピークは、Ｇ１０＋１ｎ、Ｇ１０－１ｎ、Ｇ１０－２ｎ、Ｇ１０－３ｎ、＞Ｇ１０＋１ｎ、および＜Ｇ１０－３ｎなどのオリゴヌクレオチドＧ１０下位集団からなる残りのピークとは別個に統合される（それによってｎ＝デオキシヌクレオチドである）。

【0177】

ＩＥＸ－ＨＰＬＣ／／Ｇ１０：試料を、強力なアニオン交換カラムに注入し、変性条件（ｐＨ≧１０）下で分析する。溶出を、混合塩およびメタノール勾配を使用して実行し、２６０ｎｍで検出した。得られたオリゴヌクレオチドＧ１０ピークは、Ｇ１０＋１ｎ、Ｇ１０－１ｎ、Ｇ１０－２ｎ、Ｇ１０－３ｎ、＞Ｇ１０＋１ｎ、および＜Ｇ１０－３ｎなどのオリゴヌクレオチドＧ１０下位集団からなる残りのピークとは別個に統合される（それによってｎ＝デオキシヌクレオチドである）。

【0178】

実施例１
オリゴヌクレオチドＧ１０（配列番号１）の変性および凝集
Ｇ１０の定量化：オリゴヌクレオチドＧ１０（配列番号１）を、３４０ｎｍでの吸収によって補正した２６０ｎｍでのＵＶ吸収によって定量化し、１Ａ_{２６０－３４０}は、１ｃｍの経路長での２７．８μｇ／ｍｌの濃度に対応する。

【0179】

変性：（１０．０ｍｌの規模、逆相ＨＰＬＣおよびアニオン交換ＨＰＬＣ（この実施例の節では高純度Ｇ１０オリゴヌクレオチドと称される）によって決定して、約９４％の純度の５００μＭのＧ１０、１Ｍの尿素、８５℃、２０分間）：７０．６ｍｇのＧ１０を、１５ｍｌのチューブに秤量した。粉末を、１Ｍの尿素（ｃ＝５００μＭ、分光測定による希釈前に決定したバルク粉末の含有量）を含有する（１８．２ＭΩ・ｃｍの、２５℃での抵抗力を有する）１０．０ｍｌの精製水中に溶解した。混合物を、水浴中、８５℃で２０分間脱凝集させた。アリコートを取得し、氷／水浴中で０℃まで直ちに冷却し、氷浴から取り出し、自然に室温まで温め、実施例３および実施例４に記載のように、ＤＬＳおよび任意のサイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥＣ）測定を実行した。残りの試料を８５℃に保ち、凝集ステップを実行した。

【0180】

図１Ａは、本発明のプロセスで得られた変性高純度Ｇ１０オリゴヌクレオチドのＤＬＳを単一ピークとして示す。０．９０ｎｍのＧ１０オリゴヌクレオチドの測定された平均直径は、変性が完了し、単量体が達成されたことを示す。この完全に変性したＧ１０オリゴヌクレオチドは、以下に概説するように、本発明による所望の範囲内の良好に制御かつ定義された凝集Ｇ１０オリゴヌクレオチドの形成を確実にし、それを可能にする。

【0181】

凝集（２０．０ｍｌの規模、上記のように変性させた２５０μＭのＧ１０、２５０ｍＭのＮａ^＋Ｃｌ^－２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ＝７．２）、１Ｍの尿素、８５℃、８～３０分間）：上記で言及した８５℃の１０ｍｌの変性した５００μＭのＧ１０溶液を、２５ｍｌのチューブ内、８５℃で、１０ｍｌの５００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのリン酸ナトリウム、および１Ｍの尿素の溶液と混合した。混合物を、水浴中、８５℃で１５分間インキュベートした。溶液を、氷／水浴中で０℃まで冷却した。そこからアリコートを取得し、室温まで温め、ＤＬＳおよび任意のサイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥＣ）測定を実行した。凝集オリゴヌクレオチド溶液は、２０℃未満で保管した場合、典型的に、かつ好ましくは３時間以内に使用した。

【0182】

最終濾過ステップを利用して、最終的な微量（１％未満）の大きな粒子を除去した。これは、以前に冷却した、凝集オリゴヌクレオチドの室温の溶液を、５０ｎｍのフィルターに通すことによって実行する。

【0183】

図１Ｂは、本発明のプロセスで得られた、その後凝集したＧ１０オリゴヌクレオチドのＤＬＳを示す。得られた非常に好ましい凝集Ｇ１０オリゴヌクレオチドは、適切な凝集および１２ｎｍの平均直径を示す。本発明による所望の好ましい範囲内のこれらの良好に制御かつ定義された凝集Ｇ１０オリゴヌクレオチドは、以下に概説するように、非常に高純度のパッケージ化され、良好に形成されたＶＬＰをもたらす。

【0184】

非常に好ましいオリゴヌクレオチドＧ１０（配列番号１）の変性および凝集を、異なるオリゴヌクレオチド濃度でさらに実行し、図１Ａおよび図１Ｂに示されるＤＬＳと基本的に同じＤＬＳを得た。したがって、変性は、１００μｍ～１ｍＭの様々な濃度のオリゴヌクレオチドＧ１０を使用して、もたらした。次に、本明細書に記載のように、２つの溶液を１：１で混合するため、便宜上、変性に使用した濃度の正確に半分によって、その後の凝集ステップをもたらした。

【0185】

実施例２
オリゴヌクレオチドＧ１０－１１、Ｇ１２－１１、Ｇ６、Ｇ７、Ｇ８、Ｇ９、Ｇ１１、Ｇ６－１０、Ｇ７－１０、Ｇ８－１０、およびＧ９－１０の変性および凝集（配列番号３～９、２４～２７）
変性：１Ｍの尿素中、５００μＭのオリゴヌクレオチドＧ１０－１１（配列番号３）、Ｇ１２－１１（配列番号４）、Ｇ６（配列番号５）、Ｇ７（配列番号６）、Ｇ８（配列番号７）、Ｇ９（配列番号８）、Ｇ１１（配列番号９）、Ｇ６－１０（配列番号２４）、Ｇ７－１０（配列番号２５）、Ｇ８－１０（配列番号２６）、またはＧ９－１０（配列番号２７）の溶液を、８５℃、水浴中で２０分間脱凝集させた。

【0186】

凝集：（１０．０ｍｌの規模、２５０μＭのＧ１０、２５０ｍＭのＮａ^＋、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１Ｍの尿素、８５℃、８～３０分間）：８５℃の、５ｍｌのオリゴヌクレオチドＧ１０－１１（配列番号３）、Ｇ１２－１１（配列番号４）、Ｇ６（配列番号５）、Ｇ７（配列番号６）、Ｇ８（配列番号７）、Ｇ９（配列番号８）、Ｇ１１（配列番号９）、Ｇ６－１０（配列番号２４）、Ｇ７－１０（配列番号２５）、Ｇ８－１０（配列番号２６）、またはＧ９－１０（配列番号２７）、５ｍｌの５００ｍＭのＮａ^＋、４０ｍＭのリン酸ナトリウム、および１Ｍの尿素の変性溶液（８５℃）を、１５ｍｌのチューブ内で混合した（２５０μＭのオリゴ、１Ｍの尿素、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２５０ｍＭのＮａ^＋）。混合物を、水浴中、８５℃で１５分間インキュベートした。溶液を、氷／水浴中で０℃まで冷却した。そこからアリコートを取得し、室温まで温め、ＤＬＳおよび任意のサイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥＣ）測定を実行した。凝集オリゴヌクレオチド溶液は、２０℃未満で保管した場合、典型的に、かつ好ましくは３時間以内に使用した。

【0187】

凝集プロセスの生成物を、実施例３に記載の動的光散乱（ＤＬＳ）によって、および実施例４に記載のサイズ排除ＨＰＬＣによって分析した。凝集オリゴヌクレオチドのＤＬＳは、すべての凝集オリゴヌクレオチドの平均直径が、動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定して、１１～１３ｎｍであり、サイズ排除ＨＰＬＣによって決定して、すべて８０～１１０％のＰＳＴ以内であることを明らかにした。

【0188】

実施例３
動的光散乱によるオリゴヌクレオチドＧ１０の凝集の分析
本発明によるオリゴヌクレオチド、凝集オリゴヌクレオチド、および凝集オリゴヌクレオチドがパッケージ化されたＶＬＰの粒子サイズを、動的光散乱（ＤＬＳ）を使用して決定した。本実施例で使用され、本発明によるオリゴヌクレオチド、凝集オリゴヌクレオチド、および凝集オリゴヌクレオチドがパッケージ化されたＶＬＰの粒子サイズの決定に好ましい機器設定を、以下に示す。
機器：ＭａｌｖｅｒｎＺｅｔａｓｉｚｅｒＮａｎｏＺＳ
光源：Ｈｅ－Ｎｅレーザー（４ｎＷで６３３ｎｍ（最大））

【0189】

表１の中央の列は、参照標準（ポリスチレン微粒子）に適用した設定、および機器が適切に機能していることを確認した較正に適用した設定を表す。右の列は、オリゴヌクレオチド、凝集オリゴヌクレオチド、および凝集オリゴヌクレオチドがパッケージ化されたＶＬＰの我々の分析および測定に使用した方法で適用した設定を表す。

【0190】

ＤＬＳソフトウェアは平均流体力学的半径を計算し、基本的な乗算により、粒子の平均直径を決定する。２×粒子の平均半径＝粒子直径。一貫性のために、粒子サイズは、以後、本発明全体を通して、ナノメートルで測定される平均直径（Ｄ_Ｈｙｄ）として報告および使用する。

【0191】

実施例４
サイズ排除ＨＰＬＣによるオリゴヌクレオチドＧ１０の凝集の分析
凝集Ｇ１０オリゴヌクレオチドの凝集状態を、本質的にＷＯ２００７／１４４１５０に記載のように、以下の条件を使用した分析サイズ排除ＨＰＬＣによって分析した。

【0192】

Ｑβキャプシドに対するＧ１０のピーク開始時間Ｘ％（相対ピーク開始時間Ｑβ）を、以下のように計算した。Ｘ％＝オリゴヌクレオチドのピーク開始時間［分］を、Ｑβキャプシド標準の保持時間［分］で割ったもの×１００％（式中、オリゴヌクレオチドのピーク開始時間は、オリゴヌクレオチドの溶出が検出可能になった時間として決定し、Ｑβキャプシド標準の保持時間は、標準の最大ピークの発生時間として決定した）。オリゴヌクレオチドＧ１０および標準としてのバクテリオファージＱβのキャプシドの溶出プロファイルの例は、ＷＯ２００７／１４４１５０の図１に示されている。ＷＯ２００７／１４４１５０の図１に示されているクロマトグラムに基づいて、凝集オリゴヌクレオチドについて、８８％の相対ピーク開始時間が計算された。

【0193】

実施例５
本発明のプロセスによって得られた変性オリゴヌクレオチドＧ１０と、先行技術のプロセスによって得られた変性オリゴヌクレオチドＧ１０との比較
２つの異なる純度（逆相ＨＰＬＣおよびアニオン交換ＨＰＬＣによって決定して、７９％および９４％、本実施例の節では低純度および高純度のＧ１０オリゴヌクレオチドと称される）を有する配列番号１のオリゴヌクレオチドＧ１０を各々、先行技術（ＷＯ２００７／１４４１５０）に記載の脱凝集（変性）に供した。本明細書の実施例１に記載のように、同じ高純度（９４％）のオリゴヌクレオチドＧ１０を、変性に供した。使用されるオリゴヌクレオチドＧ１０の不純物は、ほとんどが「失敗配列」であり、これは、２６量体、２７量体、２８量体、および２９量体であろうと、より少ない数のＧ残基を有するオリゴヌクレオチド配列を意味する。

【0194】

得られた生成物を、実施例３に記載のようにＤＬＳによって分析し、図２Ａ（低純度のＧ１０、先行技術のプロセス）および図２Ｂ（高純度のＧ１０、先行技術のプロセス）および図２Ｃ（高純度のＧ１０、本発明のプロセス）に示す。完全に変性したオリゴヌクレオチドＧ１０単量体は、約１ｎｍの流体力学的平均直径を有する。

【0195】

先行技術の変性プロセスに供した低純度のＧ１０は、２．２ｎｍの平均直径を有する粒子をもたらし、これは、二次構造の存在、およびすべてのオリゴヌクレオチドＧ１０が単量体に完全に変性しているわけではないことを示す（図２Ａ）。先行技術の変性プロセスに供した高純度のＧ１０は、２．８ｎｍの平均直径を有する粒子をもたらし、これは、二次構造の存在、およびすべてのオリゴヌクレオチドＧ１０が単量体に完全に変性しているわけではないことを示す（図２Ｂ）。実施例６に考察するように、この不完全な変性は、より可変的な凝集オリゴヌクレオチド、およびさらにより大きな凝集オリゴヌクレオチドをもたらす。

【0196】

本発明のプロセスの変性に供した高純度のＧ１０は、０．９ｎｍの平均直径を有する粒子をもたらし、これは、オリゴヌクレオチドＧ１０が完全にまたは実質的に完全に単量体に変性していることを示す（図２Ｃ）。示されるように、この完全に変性したＧ１０オリゴヌクレオチドは、本発明による所望の範囲内の良好に制御かつ定義された凝集Ｇ１０オリゴヌクレオチドの形成を確実にし、それを可能にする。

【0197】

凝集ステップの開始前に、完全なまたは少なくともほぼ完全な変性、および単量体をもたらす非常に好ましいオリゴヌクレオチドＧ１０について示されるようなオリゴヌクレオチドの適切な変性は、非常に好ましく、かつ重要である。二次構造が存在する場合、オリゴヌクレオチドの二量体、三量体、または四重鎖、凝集ステップは、より可変的であり、最終的な凝集オリゴヌクレオチドは、より大きく、サイズ分布がより広いものとなる。

【0198】

実施例６
本発明のプロセスによって得られた凝集オリゴヌクレオチドＧ１０と、先行技術のプロセスによって得られた凝集オリゴヌクレオチドＧ１０との比較
実施例５に記載の変性実験から得られたＧ１０材料を、先行技術（ＷＯ２００７／１４４１５０）に記載のように、または本発明のプロセスによって記載のように、かつその結果として上記の実施例１に記載のように、凝集に供した。

【0199】

得られた凝集オリゴヌクレオチドを、本明細書の実施例３に記載のようにＤＬＳによって分析し、図３Ａ（先行技術のプロセスによって変性させた低純度のＧ１０の先行技術の凝集）および図３Ｂ（先行技術のプロセスによって変性させた高純度のＧ１０の先行技術の凝集）および図３Ｃ（本発明のプロセスによって変性させた高純度のＧ１０の本発明の凝集）に示す。

【0200】

先行技術のプロセスで変性および凝集した低純度の材料は、所望の平均直径範囲の高い側にある（６～１６ｎｍ）だけでなく、加えて材料の１０％が、ＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰ、好ましくはＲＮＡバクテリオファージＱβのＶＬＰへのその後の適切なパッケージ化には大きすぎる（３０～４０ｎｍ）、凝集オリゴヌクレオチドをもたらした（図３Ａ）。このより大きく広い粒子分布の結果として、最終パッケージ化ＶＬＰは、ＳＥＣおよびＤＬＳによって純度がより低くなり、電子顕微鏡写真で桿状構造が観察される（以下の実施例８を参照されたい）。該桿状構造は、典型的には濾過による精製によって分離することができないが、大規模な製造、および具体的にはＧＭＰ製造にとって非常に有害であるクロマトグラフィーによるより高価で強力な精製を必要とすることに留意されたい。

【0201】

先行技術のプロセスで変性および凝集した高純度の材料は、それらのすべてが、ＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰ、好ましくはＲＮＡバクテリオファージＱβのＶＬＰへのパッケージ化には大きすぎる凝集オリゴヌクレオチドをもたらし、したがって不安定なＶＬＰをもたらす（図３Ｂ）。加えて、約１００ｎｍで、第２のピークが特定される。その後に必要とされる加熱および冷却時間が、実験室または製造規模のいずれかでは容易に制御することができるものよりも短いという事実のために、凝集時間を低下させることによる高純度の材料を使用した先行技術のプロセスの最適化が実行されなかったことは、注目に値する。本発明のプロセスは、実際に、先行技術のプロセスの該不利な点を克服することができた。

【0202】

したがって、対照的に、本発明のプロセスで変性および凝集した高純度の材料は、１２ｎｍの平均直径を有する凝集オリゴヌクレオチドをもたらし、これは、適切な凝集を示した（図３Ｂ）。本発明による所望の非常に好ましい範囲内のこの良好に制御かつ定義された凝集Ｇ１０オリゴヌクレオチドは、非常に高純度で良好に形成されたパッケージ化ＶＬＰをもたらす。

【0203】

完全なまたは少なくともほぼ完全な、狭く定義された直径サイズ分布をもたらす非常に好ましいオリゴヌクレオチドＧ１０について示されるようなオリゴヌクレオチドの適切な凝集は、さらに非常に好ましく、かつ重要である。実施例３に記載のようにＤＬＳによって決定して、１１～１３ｎｍの平均直径、好ましくは１２ｎｍの平均直径の凝集オリゴヌクレオチドをもたらす凝集を制御することにより、高純度のパッケージ化ＶＬＰの達成を確実にし、それを可能にすることができる。

【0204】

凝集オリゴヌクレオチドが大きすぎる場合、ＤＬＳに示されているように、パッケージ化ステップ後の得られた材料が、ＤＬＳで示される大きな不純物、および電子顕微鏡写真に示される桿状構造などの形成異常のＶＬＰを有する。凝集オリゴヌクレオチドが５０ｎｍ超で非常に大きい場合、不安定なＶＬＰが結果として生じる可能性がある。

【0205】

実施例７
分解／再集合による凝集オリゴヌクレオチドＧ１０を有するＱβＶＬＰのパッケージ化
ＱβＶＬＰの分解：ＰＢＳ（２０ｍＭのリン酸塩、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中の４５ｍｇのＱβＶＬＰ（ブラッドフォード分析によって測定して２．５ｍｇ／ｍｌ）を、室温、撹拌条件下で、１０ｍＭのＤＴＴで１５分間還元した。次に、塩化マグネシウムを、０．７Ｍの最終濃度になるまで添加し、インキュベーションを、室温、撹拌条件下で１５分間継続し、カプセル化された宿主細胞ＲＮＡの沈殿、およびそれと同時のＶＬＰの崩壊をもたらした。溶液から沈殿したＲＮＡを除去するために、溶液を、４℃、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ５８１０Ｒ、すべての以下のステップで使用した、固定角度ローターＡ－４－６２）。放出された二量体Ｑβコートタンパク質を含有する上清を、クロマトグラフィー精製ステップに使用した。

【0206】

代替的かつ好ましい方法では、１ＭのＤＴＴを、１０ｍＭのＤＴＴの最終濃度になるまで添加することによって、Ｑベータキャプシドを、Ｑベータ二量体に分解した。１Ｍのリン酸ナトリウム、０．７５Ｍのクエン酸を添加することによって、ＮａＣｌ濃度を６００ｍＭに増加させ、ｐＨをｐＨ２．６に調整することによって、核酸および宿主細胞タンパク質を沈殿させた。以下の操作パラメータ（Ｐ_フィード＝０．９、Ｐ_残余分＝０．４バール、およびＰ_透過分＝０．２バール、０．４５バールのＴＭＰをもたらす）で実行した、２×０．５ｍ^２のＭｉｌｌｉｐｏｒｅＢｉｏｍａｘ３００膜を備えたＳａｒｔｏｆｌｏｗＢｅｔａＣｒｏｓｓｆｌｏｗシステムを使用したＴＦＦによって、沈殿した核酸およびＨＣＰを除去した。この材料を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸、３００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ３．３の３つのＤＶに対して透析濾過した。

【0207】

カチオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーによるＱβコートタンパク質の精製：二量体コートタンパク質、宿主細胞タンパク質、および残留宿主細胞ＲＮＡを含有する分解反応の上清を、ＳＰ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦカラム（ｘｋ１６／２０、６ｍｌ、ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に充填した。カラムへのコートタンパク質の適切な結合を達成するために、カラムを、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）で平衡化し、試料を、水で１：１５に希釈して、１０ｍＳ／ｃｍ未満の導電率に調整した。結合したコートタンパク質の溶出を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム／５００ｍＭの塩化ナトリウムへの段階的勾配によって達成し、タンパク質を、約２５ｍｌの画分体積で収集した。クロマトグラフィーを、すべてのステップ中、室温、５ｍｌ／分の流量で実行し、２６０ｎｍおよび２８０°ｎｍで吸光度を監視した。第２のステップでは、単離したＱβコートタンパク質（カチオン交換カラムからの溶出画分）を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム／２５０ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ７．２）で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－１００ＨＲカラム（ｘｋ２６／６０、３２０ｍｌ、ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に充填した。クロマトグラフィーを、室温、２．５ｍｌ／分の流量で実行し、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍで吸光度を監視した。５ｍｌの画分を収集した。

【0208】

分析サイズ排除クロマトグラフィーによる精製Ｑβコートタンパク質の特性評価：精製Ｑβコートタンパク質の試料を、分析サイズ排除クロマトグラフィー（図４Ｃ）によって分析し、ｉ）Ｅ．ｃｏｌｉ溶菌液から精製し、精製手順の原材料として使用した無傷のＱβＶＬＰ（図４Ａ）、およびｉｉ）分解反応の上清（図４Ｂ）と比較した。コートタンパク質からのＲＮＡ分子の効率的な分離は、図４ＣにおけるＲＮＡ様ピーク（Ａ２８０／Ａ２６０＝０．５の典型的な比）の欠如、および特有のタンパク質様ピーク（Ａ２８０／Ａ２６０＝１．７の典型的な比）の存在によって示される。

【0209】

代替的かつ好ましい方法では、Ｑβコートタンパク質の精製は、カチオン交換クロマトグラフィーおよびＭｕｓｔａｎｇＱ膜によってもたらした：ＣＥＸクロマトグラフィーを、Ｑベータ二量体の捕捉ステップとして実行した。ＳＰＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ樹脂を、ＡＫＴＡＲｅａｄｙＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙシステムおよび充填緩衝液としての１５０ｍＭのＮａＣｌを使用して、ＢＰＧ１４０カラムに充填した。充填したカラムの床高さは、１４．０ｃｍであり、これは、２．２Ｌの床体積に相当した。ＨＥＴＰ分析は、１．５５の非対称係数、および１メートルあたり２５６０枚のプレートの理論的なプレート計数をもたらした。分解ステップからの透析濾過液を、装填前にＭｉｌｌｉｐｏｒｅＯｐｔｉｃａｐＸＬ５カプセルを通して濾過した。表２に示す方法を使用して、クロマトグラフィーを実行した。

【0210】

ＭｕｓｔａｎｇＱカプセルを通した濾過を実行して、エンドトキシンおよびあらゆる残留核酸を低減した。で２００ｍｌ／分の流量でＭｕｓｔａｎｇＱフィルターを通して濾過する前に、ＣＥＸプールを、０．２μｍのＭｉｌｌｉｐａｋ６０フィルター（カタログ番号ＭＰＧＬ０６ＧＨ２）を使用して最初に濾過した。次に、ＭｕｓｔａｎｇＱフィルターから収集した通過画分を、第２の０．２μｍのＭｉｌｌｉｐａｋ６０フィルターに通した。

【0211】

透析濾過によるＱβＧ１０の集合：精製コートタンパク質（２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、２５０ｍＭのＮａＣｌ中）を、水ならびに尿素、ＮａＣｌ、ＤＴＴ、および凝集Ｇ１０オリゴヌクレオチド（実施例１に記載のように調製）の原液と混合した。混合物の体積は、５０ｍｌであり、構成要素の最終濃度は、１ｍｇ／ｍｌのコートタンパク質、１．０Ｍの尿素、２５０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＤＴＴ、および０．２４ｍｇ／ｍｌのＧ１０であった。次に、溶液を、３０ｋＤａカットオフカートリッジ（ＰｅｌｌｉｃｏｎＸＬ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、１０ｍＬ／分の直交流量、および２．５ｍｌ／分の透過分流量を使用して、３００ｍｌの２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．２）に対して室温で透析濾過した。Ｈ_２Ｏ_２を、７ｍＭの最終濃度になるまで添加し、ジスルフィド結合の形成を誘導するために、溶液を室温で１時間インキュベートした。次に、集合したＱβＧ１０生成物から過剰量のＨ_２Ｏ_２およびパッケージ化されていないＧ１０オリゴヌクレオチドを除去するために、溶液を、３００ｋＤａカットオフカートリッジ（ＰｅｌｌｉｃｏｎＸＬ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、１０ｍＬ／分の直交流量、および２．５ｍｌ／分の透過分流量を使用して、５００ｍｌの２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．２）に対して透析濾過した。

【0212】

あるいは、本発明によって得られる凝集オリゴヌクレオチドＧ１０を有するＱβＶＬＰのパッケージ化はまた、ＷＯ２００７／１４４１５０の実施例１０に記載のように、もたらすこともできる。

【0213】

実施例８
本発明のプロセスによって、および先行技術のプロセスによって得られる、凝集オリゴヌクレオチドＧ１０がパッケージ化されたＱβＶＬＰの比較－ＤＬＳおよびＥＭ
ＱβＶＬＰを、実施例１に記載のように調製した凝集Ｇ１０オリゴヌクレオチドを使用するだけでなく、上記の実施例６に記載の先行技術のプロセスによって調製した凝集Ｇ１０オリゴヌクレオチドをさらに使用して、上記の実施例７と同様に調製した。

【0214】

先行技術のプロセスによって変性させた低純度のＧ１０の先行技術の凝集によって得られ、パッケージ化ステップに供したときに、１０％がパッケージ化には大きすぎる広いサイズ分布を有する、図３Ａに示される凝集オリゴヌクレオチドは、図５Ａに示されるＤＬＳおよび図５Ｂに示されるＥＭを有するＶＬＰをもたらした。ＤＬＳは、適切に形成されたＶＬＰ（３０ｎｍ±２ｎｍ）に対応する、２８ｎｍの平均直径の主要ピーク（９６％）を明らかにしたが、追加の大きな粒子ピークもまた、観察された。対応するＥＭは、該平均直径を有するが、所望の３０ｎｍのＶＬＰよりもはるかに大きい桿状構造も有する、球状ＶＬＰを示す。

【0215】

対照的に、本発明のプロセスで変性および凝集した高純度の材料は、パッケージＶＬＰステップに供したときに、１つの平均直径のパッケージ化ＶＬＰおよび純粋に形成されたＶＬＰをもたらした。ＤＬＳは、３０ｎｍで１つの単一ピークを示し、大きな粒子は示さず（図５Ｃ）、ＥＭは、桿状構造を有しないすべての球状ＶＬＰを示す（図５Ｄ）。

【0216】

実施例９
様々なパラメータでもたらした本発明のプロセスの変性ステップ
実施例１に記載のオリゴヌクレオチドＧ１０（配列番号１）の変性を、尿素の濃度、変性時間、および該変性に適用される温度を変化させることによって調査した。Ｇ１０（９４％の高純度）を１ｍＭの濃度になるように水に溶解することによって、バルクオリゴヌクレオチドＧ１０溶液を得た。尿素溶液を添加して、０．１Ｍ～１Ｍの尿素濃度を有する５００μＭのＧ１０の最終変性溶液を得た。次に、これらの試料のアリコートを、２５℃～８５℃の範囲の温度で２０分または６０分間インキュベートした。試料を、氷／水浴中で０℃まで直ちに冷却し、氷浴から取り出し、自然に室温まで温め、実施例３に記載のＤＬＳ測定を実行した。表３は、０．２Ｍ～１．０Ｍの尿素濃度に関係なく、変性の成功、すなわち１ｎｍ以下の平均直径を達成することができることを示す。