特許 7511551 改変されたＭＨＣクラスＩＩ ＤＲα１ドメインを含む組換えポリペプチドおよび使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-06-27

(45)【発行日】2024-07-05

(54)【発明の名称】改変されたＭＨＣクラスＩＩ ＤＲα１ドメインを含む組換えポリペプチドおよび使用方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20240628BHJP

   C07K 14/74 20060101ALI20240628BHJP

   C07K 14/435 20060101ALI20240628BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240628BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240628BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240628BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240628BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240628BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240628BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20240628BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20240628BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20240628BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240628BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20240628BHJP

【ＦＩ】

C07K19/00

C07K14/74 ZNA

C07K14/435

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61K38/17

A61K39/00 H

A61P37/06

A61P29/00

A61P25/00

【請求項の数】 9

(21)【出願番号】P 2021518527

(86)(22)【出願日】2019-10-04

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-01-13

(86)【国際出願番号】 US2019054850

(87)【国際公開番号】W WO2020072992

(87)【国際公開日】2020-04-09

【審査請求日】2022-10-04

(31)【優先権主張番号】62/741,941

(32)【優先日】2018-10-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】513239243

【氏名又は名称】オレゴン ヘルス アンド サイエンス ユニバーシティー

(73)【特許権者】

【識別番号】513171172

【氏名又は名称】ザ ユナイテッド ステイツ ガバメント アズ レプリゼンテッド バイ ザ デパートメント オブ ベテランズ アフェアーズ

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】メザ－ロメロ， ロベルト

(72)【発明者】

【氏名】ヴァンデンバーグ， アーサー

(72)【発明者】

【氏名】オフナー， ハリーナ

【審査官】小林 薫

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１５－５０５３１５（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１５／００９８９５６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２００５／０１４２１４２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１８／０２７１９３５（ＵＳ，Ａ１）

【文献】J. Chem. Technol. Biotechnol.，2005年，Vol.80, No.1，pp.2-12

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ （ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号２のアミノ酸配列を含む、組換えポリペプチド。

【請求項2】

前記組換えポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の組換えポリペプチド。

【請求項3】

請求項１または請求項２に記載の組換えポリペプチドをコードする、核酸分子。

【請求項4】

請求項３に記載の核酸を含む、発現構築物。

【請求項5】

請求項４に記載の発現構築物を含む、細胞株。

【請求項6】

有効量の請求項１または請求項２に記載の組換えポリペプチドまたは請求項３に記載の核酸分子；および
薬学的に許容され得るキャリア
を含む、医薬組成物。

【請求項7】

前記組成物が、少なくとも５ｍｇ／ｋｇの前記組換えポリペプチドを含む、請求項６に記載の医薬組成物。

【請求項8】

炎症性障害を処置するための、請求項６または請求項７に記載の医薬組成物。

【請求項9】

前記炎症性障害が、多発性硬化症または実験的自己免疫性脳症（ＥＡＥ）である、請求項８に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本願は、２０１９年１０月５日出願の米国仮出願第６２／７４１，９４１号の利益を主張する。この仮出願は、その全体が参照により本明細書中に援用される。

【0002】

分野
本開示は、組換え治療タンパク質、特に、改変された部分的なＭＨＣ分子、および炎症性疾患の処置におけるそれらの使用に関する。

【0003】

政府支援の承認
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈが授与した助成金番号Ｒ４２ＡＩ１２２５７４ならびにＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｖｅｔｅｒａｎｓ Ａｆｆａｉｒｓが授与した助成金番号５ Ｉ０１ ＢＸ０００２２６－１０および１ＩＫ６ＢＸ００４２０９の下で、政府支援を受けて行われた。米国政府は、本発明における一定の権利を有する。

【背景技術】

【0004】

背景
多発性硬化症（ＭＳ）は、最も蔓延している、中枢神経系の白質と灰白質の両方の慢性炎症性疾患であり、世界の２００万人超および米国の少なくとも４０万人が罹患している（ＧＢＤ ２０１５ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ．１６：８７７－８９７，２０１７）。ＭＳにおける炎症過程は、自己免疫主導の脱髄によって媒介され、この脱髄は神経変性損傷を伴うことが多い。現在、ＭＳの治療法はない。したがって、ＭＳ患者は、疾患徴候のいくつかを回復させるために疾患修飾治療に頼らなければならない（Ｗｉｎｇｅｒｃｈｕｋら、Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．８９：２２５－２４０，２０１４）。再発寛解型のＭＳについては、約１５種の疾患修飾薬剤が利用可能である（Ｒｅｉｃｈら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３７８：１６９－１８０，２０１８）。しかしながら、引き続き、ＭＳに対する改善された治療が必要とされている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【文献】ＧＢＤ ２０１５ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ．１６：８７７－８９７，２０１７

【文献】Ｗｉｎｇｅｒｃｈｕｋら、Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．８９：２２５－２４０，２０１４

【文献】Ｒｅｉｃｈら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３７８：１６９－１８０，２０１８）

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

要旨
改変された主要組織適合（ＭＨＣ）クラスＩＩ ＤＲα１ポリペプチドが、本明細書中に開示される。これらの改変されたＤＲα１ポリペプチドは、ＣＤ７４に対する変更された親和性、およびＣＤ７４への結合についてマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）と競合する能力を、分子構造に対して明らかな影響なく示す。

【0007】

いくつかの実施形態において、配列番号１のアミノ酸位置１４に対応する位置にグルタミン残基（いくつかの場合はＬ１４Ｑ変異、またはＤＲα１－ＭＯＧ－３５－５５構築物の状況においてはＬ５０Ｑと称される）を含むＭＨＣクラスＩＩ ＤＲα１ドメインを含む組換えポリペプチドが開示される。そのグルタミン残基は、この位置における天然のロイシン残基を置換している（図１）。いくつかの例において、ＤＲα１ドメインは、ヒトＤＲα１ドメインである。この組換えＤＲα１ドメインの配列は、いくつかの例において、配列番号１のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

【0008】

他の実施形態において、配列番号１のアミノ酸位置１４に対応する位置にグルタミン残基を含むＤＲα１ドメイン、抗原ペプチドおよび必要に応じてリンカー配列を含む組換えポリペプチドが開示される。１つの例において、そのリンカー配列は、第１のグリシン－セリンスペーサー、トロンビン切断部位および第２のグリシン－セリンスペーサーを含む。その抗原ペプチドは、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）ポリペプチド、例えば、ヒトＭＯＧ－３５－５５またはマウスＭＯＧ－３５－５５であり得る。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドの配列は、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。

【0009】

本明細書中に開示される組換えポリペプチドをコードする核酸分子も提供される。例示的な核酸分子としては、配列番号４～６が挙げられる。いくつかの実施形態において、その核酸は、発現構築物および／またはベクターに含められる。その発現構築物またはベクターを含む細胞または細胞株も開示される。

【0010】

いくつかの実施形態において、開示される組換えポリペプチドまたはそれらの組換えポリペプチドをコードする核酸は、例えば、薬学的に許容され得るキャリアとともに、医薬組成物に含められる。いくつかの例において、その組成物は、少なくとも５ｍｇ／ｋｇの組換えポリペプチドを含む。

【0011】

炎症性障害を処置する方法がさらに本明細書中に開示され、その方法は、開示される組換えポリペプチドまたは医薬組成物（例えば、配列番号１～３のいずれか１つのポリペプチドを含む組成物）を、炎症性障害に罹患している被験体に投与する工程を含む。いくつかの例において、被験体は、多発性硬化症（またはそのマウスモデルであるＥＡＥ）を有する。

【0012】

本開示の前述の特徴および他の特徴は、添付の図面を参照して進められる以下の詳細な説明からさらに明らかになるだろう。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】図１は、ＨＬＡクラスＩＩα１ドメイン（配列番号７～１９）の１８位の残基（Ｑ１８、矢印）を示しているアミノ酸配列アラインメントである。この残基は、ヒトおよびマウスのクラスＩＩα１ドメインのほとんど（非抗原提示ＤＭおよびＤＯ制御性分子のドメインを含む）の間で保存されている。しかしながら、ＤＲα１は、この位置にロイシン（Ｌ）を有する。この残基は、このアラインメントにおける１８位として示されている。しかしながら、結晶構造では、この残基は、１４位に位置している。

【図2】図２Ａおよび２Ｂは、ＣＤ７４へのＤＲα１－ｈＭＯＧ－３５－５５、ヒトＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ由来ＲＴＬ３０２（ＤＲβ１５０１からのヒトβ１ドメインに続くヒトＤＲα１ドメイン；このＲＴＬは、抗原ペプチドおよびスペーサーを含まない）、ヒトクラスＩＩ ＤＲ由来ＲＴＬ３１２（ヒトＭＯＧ－３５－５５ペプチドに続く、グリシン－セリンスペーサー、トロンビン切断部位、グリシン－セリンスペーサー、ＤＲβ１５０１からのＤＲβ１ドメインおよびＤＲα１ドメイン）、ヒトクラスＩＩ由来ＤＰ２構築物（ＲＴＬ６００；抗原ペプチド、グリシン－セリンスペーサー、トロンビン切断部位、グリシン－セリンスペーサー、ＤＰβ１ドメインおよびＤＰα１ドメイン）およびＤＰ４構築物（ＲＴＬ６００；抗原ペプチド、グリシン－セリンスペーサー、トロンビン切断部位、グリシン－セリンスペーサー、ＤＰ４β１ドメインおよびＤＰα１ドメイン）の結合を示している。さらに、コーティングされたｒｈＣＤ７４（Ｃ２７Ｓ）へのマウスＭＨＣクラスＩＩ由来ＲＴＬ５５１（マウスＭＯＧ－３５－５５、グリシン－セリンスペーサー、トロンビン切断部位、グリシン－セリンスペーサー、ＩＡｂβ１ドメインおよびＩＡｂα１ドメイン）の結合を試験した。等モル濃度（２５０ｎｍ）の各タンパク質リガンドを用いて結合実験を行った（図２Ａ）。図２Ｂは、野生型バージョンと比較した、ＤＲα１変異体の部分的なアミノ酸配列を示しているアラインメントである。ＤＲα１－ｈＭＯＧ－３５－５５（ヒトＭＯＧ－３５－５５ペプチドを含むＤＲα１；配列番号２０）およびＤＲｈＱ（グルタミン置換を含むＤＲα１－ｈＭＯＧ－３５－５５；配列番号２１）に加えて、ＤＲα１－ｍＭＯＧ－３５－５５（マウスＭＯＧ－３５－５５ペプチドを含むＤＲα１；配列番号２２）およびＤＲｍＱ（グルタミン置換を含むＤＲα１－ｍＭＯＧ－３５－５５；配列番号２３）を合成した。矢印は、突然変異誘発の位置を指し示している。ＤＲα１－ｈＭＯＧおよびＤＲα１－ｍＭＯＧは、９位も異なる（Ｓの代わりにＰ）。

【図3】図３Ａおよび３Ｂは、ＤＲα１－ｈＭＯＧ－３５－５５とＤＲｈＱとＤＲα１－ｍＭＯＧ－３５－５５との間の免疫学的差異を評価するために、ＤＲα１由来構築物であるＤＲα１－ｈＭＯＧ－３５－５５、ＤＲα１－ｍＭＯＧ－３５－５５およびＤＲｈＱをＦａｂ Ｇ４でプロービングしたことを示しているグラフである（図３Ａ）。円偏光二色性を用いて、二次構造含有量の差を評価した（図３Ｂ）。

【図4】図４Ａ～４Ｃは、ＣＤ７４に対するＤＲα１結合部位の位置を特定するようにデザインされたストラテジーを示している。図４Ａは、ＣＤ７４に結合する領域を絞り込むために用いられた重複ペプチド（完全長（配列番号２４）およびＰ１～Ｐ７、それぞれ配列番号２５～３１）を示している概略図である。マウスＣＤ７４（図４Ｂ）またはマウスＨ２Ｍ（図４Ｃ）を、プロテインＡ／Ｇビーズに吸着された特異的なモノクローナル抗体を用いて免疫沈降し、次いで、重複ペプチドのプール（「すべて」）または個々のペプチドを加えた。免疫複合体をしっかり洗浄し、結合したペプチドを、１％ＳＤＳを含む電気泳動サンプル緩衝液で溶出した。溶出した材料を、Ｔｒｉｓ－トリシンにおけるＳＤＳ－ペプチドゲルによる電気泳動によって解析した。次いで、ゲルをＢｉｏＲａｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｅｒ ＦＸにおいてフルオロフォアについてスキャンした。

【図5A-B】図５Ａ～５Ｃは、ＣＤ７４またはＦａｂ Ｇ５へのＰ２またはＰ７ペプチドの結合を示している一連のパネルである。ペプチドＰ２およびＰ７を、それぞれプロテインＡ／ＧビーズおよびプロテインＬビーズに吸着された免疫沈降マウスＣＤ７４またはＦａｂ Ｇ４に結合する能力について個別に試験した（図５Ａ）。Ｐ２だけが、ＣＤ７４およびＦａｂ Ｇ４に結合することができた。Ｐ７は、いずれの標的にも結合することができなかった。ＤＲα１－ｈＭＯＧ－３５－５５ポリペプチドにおけるＰ２ペプチドの位置が図５Ｂに示されている。競合実験は、ＤＲα１－ｈＭＯＧ－３５－５５が、７５０ｎＭという相対親和性（Ｋ_Ｄ）で、免疫沈降ＣＤ７４へのＦＩＴＣ標識Ｐ２ペプチドの結合に打ち勝つことができたことを示した（図５Ｃ）。

【図5C】図５Ａ～５Ｃは、ＣＤ７４またはＦａｂ Ｇ５へのＰ２またはＰ７ペプチドの結合を示している一連のパネルである。ペプチドＰ２およびＰ７を、それぞれプロテインＡ／ＧビーズおよびプロテインＬビーズに吸着された免疫沈降マウスＣＤ７４またはＦａｂ Ｇ４に結合する能力について個別に試験した（図５Ａ）。Ｐ２だけが、ＣＤ７４およびＦａｂ Ｇ４に結合することができた。Ｐ７は、いずれの標的にも結合することができなかった。ＤＲα１－ｈＭＯＧ－３５－５５ポリペプチドにおけるＰ２ペプチドの位置が図５Ｂに示されている。競合実験は、ＤＲα１－ｈＭＯＧ－３５－５５が、７５０ｎＭという相対親和性（Ｋ_Ｄ）で、免疫沈降ＣＤ７４へのＦＩＴＣ標識Ｐ２ペプチドの結合に打ち勝つことができたことを示した（図５Ｃ）。

【図6】図６Ａおよび６Ｂは、ｒｈＣＤ７４への構築物の結合を示しているグラフである。構築物ＤＲα１－ｈＭＯＧ－３５－５５およびＤＲｈＱを、結合中にＧ４Ｆａｂありまたはなしの直接結合アッセイによってＥＬＩＳＡプレート上のｒｈＣＤ７４への直接結合について評価した（図６Ａ）。Ｋ_Ｄを計算したポリペプチドは、ＤＲα１－ｈＭＯＧ－３５－５５に対しては０．６５μＭ、ＤＲｈＱに対しては０．０８９μＭであった。競合実験において、ＤＲｈＱは、ＤＲα１－ｈＭＯＧ－３５－５５と比べて、ＣＤ７４への結合についてｒｈＭＩＦと対抗する高い活性を示した（図６Ｂ）。

【図7A】図７Ａおよび７Ｂは、ＥＡＥマウスにおける構築物の効果を示しているグラフである。８～１２週齢のＣ５７ＢＬ／６ＷＴ雄マウスを、材料および方法に記載されているように免疫した。≧２．０のＥＡＥスコアから開始して、ＤＲｈＱもしくはＤＲα１－ｈＭＯＧ－３５－５５タンパク質（図７Ａ）またはＤＲα１－ｍＭＯＧ－３５－５５もしくはＤＲｍＱ（図７Ｂ）（０．１ｍｌ中に１００μｇ）を５日間にわたって毎日、ｓ．ｃ．注射し、それらのマウスをＥＡＥの臨床的徴候についてスコア付けした（上のパネル）。マウス群に対する平均ＥＡＥスコアおよびＳＤを免疫後の８日目から２７日目までの各日について計算し、実験全体にわたるＥＡＥスコア曲線を数値的に積分することによって、各マウスに対して合計した（ＣＤＩ、総疾患負荷（ｔｏｔａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｌｏａｄ）を表す；下のパネル）。

【図7B】図７Ａおよび７Ｂは、ＥＡＥマウスにおける構築物の効果を示しているグラフである。８～１２週齢のＣ５７ＢＬ／６ＷＴ雄マウスを、材料および方法に記載されているように免疫した。≧２．０のＥＡＥスコアから開始して、ＤＲｈＱもしくはＤＲα１－ｈＭＯＧ－３５－５５タンパク質（図７Ａ）またはＤＲα１－ｍＭＯＧ－３５－５５もしくはＤＲｍＱ（図７Ｂ）（０．１ｍｌ中に１００μｇ）を５日間にわたって毎日、ｓ．ｃ．注射し、それらのマウスをＥＡＥの臨床的徴候についてスコア付けした（上のパネル）。マウス群に対する平均ＥＡＥスコアおよびＳＤを免疫後の８日目から２７日目までの各日について計算し、実験全体にわたるＥＡＥスコア曲線を数値的に積分することによって、各マウスに対して合計した（ＣＤＩ、総疾患負荷（ｔｏｔａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｌｏａｄ）を表す；下のパネル）。

【図8】図８は、ＥＲＫ１／２リン酸化アッセイを示しているパネルである。ＥＡＥマウスからの２００万個の脾細胞を、ビヒクル、ＤＲｈＱまたはＤＲα１－ｈＭＯＧ－３５－５５で３０分間処置し、次いで、細胞をプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤の存在下において溶解した。上清を電気泳動およびウエスタンブロットによって解析して、Ｐ－ＥＲＫ１／２および全ＥＲＫ１／２（Ｔ－ＥＲＫ１／２）を評価した。ＤＲα１－ｈＭＯＧ（図示せず）およびＤＲｈＱは、インビトロにおいてＥＲＫ１／２リン酸化をダウンレギュレートすることができた。

【図9】図９Ａは、模式図で描写されたＤＲｈＱの構造モデルであり、ＤＲα１－ｈＭＯＧ－３５－５５構築物における関連性のあるアミノ酸残基であってドッキングモデルによってＣＤ７４と接触すると示されたアミノ酸残基の位置を示している。１４位におけるＱ残基の側鎖が強調されている。抗原性ＭＯＧペプチドが薄灰色で示されており、ＭＯＧペプチドにおけるＷ３に対する側鎖が示されている。図９Ｂは、図１に記載された分子（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋからの分子）からのいくつかのα１ドメインを示しており、それらのβ１ストランド－ループ－βストランド領域を、ＰｙＭＯＬ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ ＯＲ）を用いてアラインメントした。１４位がスティックとして強調されている。なお、図１におけるアミノ酸残基のナンバリングは、結晶構造におけるナンバリングと異なる：図１におけるＱ１８は、結晶構造のほとんどにおいてアミノ酸残基１４に対応し、そのドメインのβストランド１の末端に位置する。

【発明を実施するための形態】

【0014】

配列表
本明細書中または添付の配列表に列挙されるいずれの核酸配列およびアミノ酸配列も、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に定義されているように、ヌクレオチド塩基およびアミノ酸に対する標準的な一文字省略形を用いて示される。少なくともいくつかの場合では、各核酸配列の一方の鎖しか示されないが、相補鎖は、示された鎖の任意の参照によって含められると理解される。

【0015】

配列番号１は、Ｌ１４Ｑ置換（下線部）を有する例示的なヒトＤＲα１ポリペプチドのアミノ酸配列である：

【化1】

【0016】

配列番号２は、例示的なＤＲｈＱポリペプチドのアミノ酸配列である。ＤＲｈＱは、抗原ペプチドであるヒトＭＯＧ－３５－５５（下線部）、スペーサー（太字部）、その２つのスペーサー間のトロンビン切断部位（大文字の斜体部）、および改変されたＤＲα１ドメイン（黒色の大文字）を含む。ＤＲα１部分におけるＬ１４Ｑ（Ｌ５０Ｑ）変異には、下線が引かれている：

【化2】

【0017】

配列番号３は、例示的なＤＲｍＱポリペプチドのアミノ酸配列である。ＤＲｍＱは、抗原ペプチドであるマウスＭＯＧ－３５－５５（下線部）、スペーサー（太字部）、その２つのスペーサー間のトロンビン切断部位（大文字の斜体部）、および改変されたＤＲα１ドメイン（黒色の大文字）を含む。ＤＲα１部分におけるＬ１４Ｑ（Ｌ５０Ｑ）変異には、下線が引かれている：

【化3】

【0018】

配列番号４は、ヒトＬ１４Ｑ ＤＲα１をコードする例示的な核酸である。その変異をコードするコドンには、下線が引かれている：

【化4】

【0019】

配列番号５は、ＤＲｈＱをコードする例示的な核酸である。ＤＲα１部分におけるＬ１４Ｑ（Ｌ５０Ｑ）変異をコードするコドンには、下線が引かれている：

【化5】

【0020】

配列番号６は、ＤＲｍＱをコードする例示的な核酸である。ＤＲα１部分におけるＬ１４Ｑ（Ｌ５０Ｑ）変異をコードするコドンには、下線が引かれている：

【化6】

【0021】

配列番号７～１９は、ヒトおよびマウスのクラスＩＩα１ドメインである。

【0022】

配列番号２０～２３は、ヒトおよびマウスのＤＲα１－ＭＯＧ－３５－５５構築物である。

【0023】

配列番号２４～３１は、ＤＲα１の完全長ペプチドおよびＰ１～Ｐ７ペプチドである。

【0024】

配列番号３２～６４は、例示的な抗原ペプチドである。

【0025】

詳細な説明
ＭＳの動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）とＭＳ被験体の両方において、複数の一連のエビデンスが、その自己免疫疾患のプロセスにおける自己反応性のミエリン特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞の役割を裏付けている（Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｃｅｌｌ ８５：２９９－３０２，１９９６；Ｚａｍｖｉｌら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：５７９－６２１，１９９０；Ｃｈｉｔｎｉｓ，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．７９：４３－７２，２００７）。ＭＳの初期の炎症段階を慢性的な進行性段階に押し進めると考えられている重要なサイトカインは、最初に報告されたサイトカインであるマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）およびその祖先型機能ホモログであるＤ－ドーパクロムトートメラーゼ（Ｄ－ＤＴ）である（Ｃｈｉｔｎｉｓ，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．７９：４３－７２，２００７）。ＭＩＦおよびＤ－ＤＴのレベルは、ＭＳでは上昇し、ＭＳの臨床上の悪化のマーカーとして、およびＥＡＥでは疾患進行の必要条件として、意味づけられている（Ｂｅｎｅｄｅｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１４：Ｅ８４２１－Ｅ８４２９，２０１７；Ｎｉｉｎｏら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１７９（Ｓ１－２）：１２７－１３１，２０００；Ｐｏｗｅｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５：５６１１－５６１４，２００５；Ｍｅｚａ－Ｒｏｍｅｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９２：４１６４－４１７３，２０１４）。

【0026】

ＭＩＦ／Ｄ－ＤＴレセプターであるＣＤ７４に強く結合し、ＭＩＦ／Ｄ－ＤＴ結合を競合的に阻害し、かつリン酸化された細胞外シグナル関連キナーゼ（ｐ）ＥＲＫ１／２を介した下流のシグナル伝達を競合的に阻害する、ＲＴＬ１０００と呼ばれる強力な生物学的治療薬および第二世代誘導体であるＤＲα１－ヒト（ｈ）ＭＯＧ－３５－５５が、すでに開発されている（Ｖａｎｄｅｎｂａｒｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：１２７－１３３，２００３；Ｂｅｎｅｄｅｋら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ １２：１２３，２０１５）。ＲＴＬ１０００およびＤＲα１－ｈＭＯＧ－３－５５は、ＥＡＥを有するマウスを臨床的徴候の発生後に処置することができ、Ｔ細胞およびマクロファージの活性化および中枢神経系への遊走を阻害し、疾患重症度を低下させる（Ｖａｎｄｅｎｂａｒｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：１２７－１３３，２００３；Ｂｅｎｅｄｅｋら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：１３０９－１３２１，２０１３；Ｍｅｚａ－Ｒｏｍｅｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９２：４１６４－４１７３，２０１４）。ＲＴＬによる処置は、抗炎症性マクロファージ／小膠細胞の数を増大させ、再ミエリン化を促進し、急性および慢性ＥＡＥの重症度を低下させることも見出された（Ｍｅｚａ－Ｒｏｍｅｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９２：４１６４－４１７３，２０１４）。

【0027】

本開示において、本発明者らは、ＣＤ７４に対するＤＲα１－ｈＭＯＧ－３５－５５構築物の親和性を変化させる（結合能を８～１０倍増加させる）、その構築物の５０位におけるロイシンからグルタミンへのアミノ酸置換（Ｌ５０Ｑ）（ＤＲｈＱと呼ばれる）を特定した。この置換は、円偏光二色性および抗体プロービングによって評価したとき、その分子の構造に影響せず、増大した結合親和性は、ＤＲｈＱが同族のＣＤ７４レセプターへのＭＩＦ結合を競合的に阻害する相応の能力に変換された。ＤＲｈＱでＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６マウスを処置すると、脾細胞におけるｐＥＲＫ１／２リン酸化がインビトロにおいてバックグラウンドレベルにまで低下した。最後に、Ｌ５０Ｑ置換によって、その構築物が重篤なＥＡＥの継続中の臨床的徴候を処置する能力が有意に高まった。

【0028】

Ｉ．用語
別段述べられない限り、専門用語は、従来の使用法に従って使用される。分子生物学における一般的な用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ Ｖ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓから出版，１９９４（ＩＳＢＮ ０－１９－８５４２８７－９）；Ｋｅｎｄｒｅｗら（編），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．から出版，１９９４（ＩＳＢＮ ０－６３２－０２１８２－９）；およびＲｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（編），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．から出版，１９９５（ＩＳＢＮ １－５６０８１－５６９－８）に見られ得る。

【0029】

別段説明されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者が通常理解する意味と同じ意味を有する。単数形の用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が他のことを明確に示さない限り、複数の指示対象を含む。同様に、語「または」は、文脈が他のことを明確に示さない限り、「および」を含むことを意図している。ゆえに、「ＡまたはＢを含む」は、Ａ、またはＢ、またはＡおよびＢを含むことを意味する。核酸またはポリペプチドに対して与えられるすべての塩基サイズまたはアミノ酸サイズおよびすべての分子量または分子質量の値は、近似値であり、説明のために提供されることがさらに理解される。本明細書中に記載される方法および材料と類似のまたは等価な方法および材料を本開示の実施または試験において用いることができるが、好適な方法および材料を下記に記載する。

【0030】

本明細書中で述べられるすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が参照により援用される。本明細書中で述べられるすべてのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は、２０１８年１０月５日にＧｅｎＢａｎｋに存在するものとしてその全体が参照により援用される。矛盾する場合は、用語の説明を含む本明細書が支配する。さらに、材料、方法および例は、単に例証的なものであって、限定することを意図したものではない。

【0031】

本開示の様々な実施形態の精査を容易にするために、特定の用語の以下の説明が提供される。

【0032】

抗原：動物に注射または吸収される組成物を含む、動物において抗体産生またはＴ細胞応答を刺激することができる化合物、組成物または物質。抗原は、異種免疫原によって誘導されるものを含む特定の体液性免疫または細胞性免疫の生成物と反応する。用語「抗原」には、すべての関連する抗原エピトープが含まれる。「エピトープ」または「抗原決定基」または「抗原ペプチド」は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が応答する、抗原上の部位のことを指す。１つの実施形態において、Ｔ細胞は、エピトープがＭＨＣ分子とともに提示されているとき、そのエピトープに応答する。エピトープは、連続したアミノ酸と、タンパク質の３次フォールディングによって並置される連続していないアミノ酸との両方から形成され得る。連続したアミノ酸から形成されるエピトープは、通常、変性溶媒に曝露されたときも保持されるのに対して、３次フォールディングによって形成されるエピトープは、通常、変性溶媒で処理されると失われる。エピトープは、通常、ユニークな空間的立体配座に少なくとも３アミノ酸、およびより通常は少なくとも８アミノ酸（例えば、約８～５０または８～２３アミノ酸）を含む。エピトープの空間的立体配座を測定する方法としては、例えば、Ｘ線結晶構造解析および２次元核磁気共鳴法が挙げられる。

【0033】

抗原は、組織特異的抗原または疾患特異的抗原であり得る。組織特異的抗原は、疾患特異的抗原でもあり得るので、これらの用語は、排他的ではない。組織特異的抗原は、限られた数の組織、例えば、単一の組織において発現される。組織特異的抗原は、１つより多い組織によって発現され得る（例えば、中枢神経系または末梢神経系において発現される抗原であるがこれに限定されない）。

【0034】

ＣＤ７４：ＣＤ７４分子、主要組織適合遺伝子複合体、クラスＩＩインバリアント鎖またはＩｉとしても知られる。ＣＤ７４は、抗原提示を制御するシャペロンである。ＣＤ７４は、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）に対する細胞表面レセプターでもある。ＣＤ７４の核酸配列およびタンパク質配列は、公的に入手可能である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１０２５１５８、ＮＭ＿００４３５５およびＮＭ＿００１０２５１５９は、例示的なヒトＣＤ７４核酸配列を開示しており、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１０２０３２９、ＮＰ＿００４３４６およびＮＰ＿００１０２０３３０は、例示的なヒトＣＤ７４アミノ酸配列を開示している。同様に、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１０４２６０５およびＮＭ＿０１０５４５は、例示的なマウスＣＤ７４核酸配列を開示しており、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１０３６０７０およびＮＰ＿０３４６７５は、例示的なマウスＣＤ７４アミノ酸配列を開示している。これらの各配列は、２０１８年１０月５日にＧｅｎＢａｎｋに存在するものとして参照により本明細書中に援用される。

【0035】

コントロール：「コントロール」とは、実験サンプルと比較するために用いられるサンプルまたは標準物質のことを指す。いくつかの実施形態において、コントロールは、健康な被験体または健康な被験体の集団から得られたサンプルである。他の実施形態において、コントロールは、ヒストリカルコントロールまたは標準的な参照値もしくは参照値の範囲（例えば、以前に試験されたコントロールサンプル、例えば、健康な被験体におけるＣＤ７４の発現または活性のレベルなどのベースラインまたは正常値を表すサンプル群）である。さらなる例において、コントロールは、処置前の被験体からのものである（例えば、ＭＨＣクラスＩＩβ１α１ポリペプチドまたはＭＨＣクラスＩＩα１ドメインポリペプチドによる処置前のＣＤ７４の発現または活性のレベル）。

【0036】

ドメイン：特定の機能と同一視できる、ポリペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列の不連続の部分。例えば、ＭＨＣクラスＩＩ分子を構成するαおよびβポリペプチドの各々は、それぞれ２つのドメインα１、α２およびβ１、β２を有すると認識されている。それらの様々なドメインは、通常、連結アミノ酸配列によってつなげられている。１つの実施形態において、ドメイン配列全体が、その配列を、リンカーまたは隣接ドメインの全部または一部を含むように伸長することによって、組換え分子に含められる。例えば、ＭＨＣクラスＩＩ分子のα１ドメインを選択するとき、選択された配列は、α鎖のアミノ酸残基番号１から、α１ドメインのカルボキシ末端におけるアミノ酸８４までのα１ドメイン全体に及び得る。様々なＭＨＣ分子ドメインにおけるアミノ酸の正確な数は、哺乳動物の種に応じて、ならびに１つの種の中の遺伝子クラスの間で、変動する。組換え分子において使用するための配列の選択には、アミノ酸の数に基づいた正確な構造の定義ではなく、ドメイン機能の維持が必要とされる。当業者は、選択されたドメインのアミノ酸配列全体にいくらか満たない配列が使用されたとしても、ドメイン機能が維持され得ることを認識するだろう。例えば、α１ドメインのアミノ末端またはカルボキシ末端におけるいくつかのアミノ酸が、ドメイン機能に影響することなく取り除かれ得る。選択された特定のドメインの機能活性は、本開示によって提供されるＭＨＣクラスＩＩポリペプチド（例えば、α１ポリペプチド）の状況において、例えば、Ｔ細胞増殖アッセイおよび／またはＣＤ７４結合アッセイにおいて、評価され得る。

【0037】

有効量：進行を阻害するまたは疾患もしくは症状を後退させるのに十分な、あるいはその疾患または症状によって引き起こされる症候を軽減することができる、特定の化合物の用量または量。例えば、これは、炎症性障害および／または自己免疫障害などの障害を処置または阻害するために必要な、開示されるＭＨＣ分子の量または用量であり得る。１つの実施形態において、有効量は、被験体において所望の応答（例えば、炎症性障害もしくは自己免疫障害または他の疾患もしくは障害を処置または阻害すること）を、単独でまたは１つもしくはそれを超えるさらなる治療剤と合わせて、誘導する量である。

【0038】

炎症：炎症性の作用物質を隔絶するように働く組織に対する損傷によって誘発される局所的な防御応答。炎症は、病原体、損傷細胞または刺激物質などの有害な刺激に対する血管組織の複雑な生物学的応答によって取り仕切られている。炎症は、傷害性の刺激を除去するための、ならびに組織に対する治癒プロセスを惹起するための、生物による防御的な試みである。炎症反応は、全身的な、または炎症部位における局所的な、白血球の蓄積を特徴とする。炎症反応は、多くの方法、例えば、白血球の数、多形核好中球（ＰＭＮ）の数、ＰＭＮ活性化の程度の測度（例えば、ルミナール高感度化学発光）または存在するサイトカインの量の測度によって計測され得る。

【0039】

一次性の炎症障害は、炎症自体によって引き起こされる障害である。二次性の炎症障害は、別の障害の結果である炎症である。炎症は、多くの炎症性疾患をもたらし得、それらの炎症性疾患としては、関節リウマチ、変形性関節症、炎症性肺疾患（慢性閉塞性肺疾患を含む）、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎およびクローン病を含む）、歯周病、リウマチ性多発筋痛症、アテローム性動脈硬化症、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、シェーグレン症候群、喘息、アレルギー性鼻炎および皮膚障害（皮膚筋炎および乾癬を含む）などが挙げられるがこれらに限定されない。炎症性の構成要素（多発性硬化症を含むがこれに限定されない）を含む自己免疫障害も、炎症性障害であると見なされる。

【0040】

疾患を阻害または処置する：疾患を「阻害する」とは、例えば、炎症性障害または自己免疫障害などの疾患の素因を有すると判明している人において、疾患の完全な発症を阻害することを指す。疾患の阻害は、例えば、ある疾患もしくは障害を有するかまたはある疾患もしくは障害を発症するリスクがある被験体における、その疾患の部分的な阻害から実質的に完全な阻害の範囲に及び得る。いくつかの例において、用語「阻害する」とは、疾患の発生または進行を低減するまたは遅延させることを指す。疾患を「処置する」とは、疾患または病理学的症状の徴候または症候（例えば、炎症性障害または自己免疫障害の徴候または症候）を回復させる治療的介入のことを指す。その疾患または障害を阻害または処置するために有効量の薬学的化合物を投与される被験体は、そのような障害に対する標準的な診断法、例えば、症候、家族歴という根拠またはその疾患もしくは障害を発症する危険因子によって特定され得る。

【0041】

リンカー：２つの分子（例えば、２つのポリペプチド）を共有結合で連結する分子。リンカー（例えば、ペプチドリンカーまたは化学リンカー）は、本開示の組換えＭＨＣポリペプチドに、例えばα１ドメインと抗原ペプチドとの間に、含められ得る。ペプチドリンカー配列は、一般に２～２５アミノ酸長（例えば、５～１０、１０～１５、１５～２０または２０～２５アミノ酸）であり、それらとしては、Ｃｈａｕｄｈａｒｙら（Ｎａｔｕｒｅ ３３９：３９４－３９７，１９８９）が報告したグリシン（４）－セリンスペーサーが挙げられるが、これに限定されない。同様に、化学リンカー（例えば、チオール結合または架橋剤）も使用できる。

【0042】

ＭＨＣクラスＩＩ：ＭＨＣクラスＩＩ分子は、共有結合によらずに会合した２つのタンパク質であるα鎖およびβ鎖から形成される。α鎖は、α１およびα２ドメインを含み、β鎖は、β１およびβ２ドメインを含む。抗原が適合する間隙は、α１ドメインとβ１ドメインとの相互作用によって形成される。α２およびβ２ドメインは、α鎖およびβ鎖をＡＰＣの細胞膜に繋ぎ留める膜貫通型Ｉｇフォールド様ドメインである。ＭＨＣクラスＩＩ複合体は、（適切な共刺激シグナルの存在下において）抗原と会合したとき、ＣＤ４ Ｔ細胞を刺激する。ＣＤ４ Ｔ細胞の基本的な機能は、炎症反応を惹起すること、免疫系の他の細胞を制御すること、および抗体合成のためにＢ細胞を助けることである。

【0043】

薬学的に許容され得るキャリア：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｅｄｉｔｏｒ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，２１ｓｔ ３０ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００５）には、本明細書中に開示されるタンパク質の薬学的送達に適した組成物および製剤が記載されている。

【0044】

組換え：組換え核酸または組換えポリペプチドは、天然に存在しない配列を有するか、または他の方法で分断された２つもしくはそれを超える配列セグメントの人工的な組み合わせによって作製された配列を有する、核酸またはポリペプチドである。この人工的な組み合わせは、化学合成によって、または単離された核酸セグメントの人工的操作、例えば、遺伝子操作手法によって、達成されることが多い。

【0045】

配列同一性：２つの核酸配列間または２つのアミノ酸配列間の類似性は、それらの配列間の類似性に関して表現され、別の方法では配列同一性と称される。配列同一性は、パーセンテージ同一性（または類似性または相同性）に関して計測されることが多く、そのパーセンテージが高いほど、２つの配列は、より類似している。互いと同じまたは類似の、かなりの量の配列同一性および機能を有するポリペプチドまたはそのドメイン（例えば、異なる種において同じタンパク質）は、「ホモログ」と呼ぶことができる。

【0046】

比較のために配列をアラインメントする方法は、当該分野で周知である。様々なプログラムおよびアラインメントアルゴリズムが、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ ＆ Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ，７３：２３７－２４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ ＆ Ｓｈａｒｐ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．５：１５１－１５３，１９８９；Ｃｏｒｐｅｔら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６，１０８８１－９０，１９８８；Ｈｕａｎｇら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８，１５５－６５，１９９２；およびＰｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７－３３１，１９９４に記載されている。Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０，１９９０）には、配列のアラインメント方法および相同性の計算の詳細な考慮すべき事柄が示されている。ＮＣＢＩベーシックローカルアラインメントサーチツール（ＢＬＡＳＴ）は、配列解析プログラムであるｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘと関連して使用するために、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）をはじめとしたいくつかの提供元から、およびインターネットにおいて、利用可能である。

【0047】

高度の配列同一性を示さない核酸配列であっても、遺伝暗号の縮重に起因して、類似のアミノ酸配列をコードすることがある。この縮重を用いて核酸配列を変化させることにより、すべてが実質的に同じタンパク質をコードする複数の核酸分子を作製することができると理解される。

【0048】

被験体：ヒトと非ヒト哺乳動物の両方を含むカテゴリーである、生存している多細胞脊椎動物。

【0049】

ＩＩ．ＤＲαドメイン
ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲα１ドメインまたはそのフラグメントを含むがＭＨＣクラスＩＩα２、β１またはβ２ドメインを含まず、かつ配列番号１のアミノ酸１４に対応するアミノ酸位置に存在するロイシン（Ｌ）からグルタミン（Ｑ）への置換を含む、単離された組換えポリペプチドが本明細書中に開示される。哺乳動物のＭＨＣクラスＩＩ ＤＲα鎖タンパク質のアミノ酸配列、ならびにこれらのタンパク質をコードする核酸は、当該分野で周知であり、ＧｅｎＢａｎｋをはじめとした数多くの提供元から入手可能である。例示的な配列は、参照により本明細書中に援用されるＤａｓら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：３５４３－３５４７，１９８３）に提供されている（ヒトＨＬＡ ＤＲα）。例示的なヒトＤＲαポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０６１９８４（２０１８年１０月５日にＧｅｎＢａｎｋに存在したものとして参照により本明細書中に援用される）である。さらなるＭＨＣクラスＩＩ ＤＲαポリペプチドは、例えば、ＩＭＧＴ／ＨＬＡデータベース（ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｇｔ／ｈｌａ／のワールドワイドウェブにおいて利用可能）などの公的データベースから、当業者によって特定され得る。

【0050】

特定の実施形態において、ＭＨＣクラスＩＩα１ドメインは、ヒトＨＬＡ－ＤＲＡポリペプチドである。このα１ドメインは、哺乳動物のＭＨＣクラスＩＩα鎖タンパク質において十分に定義されている。いくつかの例において、ＭＨＣクラスＩＩα鎖は、成熟αポリペプチドを生成するためにタンパク分解性に除去される、ポリペプチドの輸送に関わるリーダー配列を含む。

【0051】

α１ドメインは、成熟α鎖のアミノ酸残基約１～９０を含み得るが、当業者は、このドメインのＣ末端カットオフが、必ずしも正確に定義されないこと、および例えば、成熟α鎖のアミノ酸残基７０～１００の任意の点に存在し得ることを認識するだろう。いくつかの例において、α１ドメインは、成熟ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲαドメインのアミノ酸１～７０、１～７１、１～７２、１～７３、１～７４、１～７５、１～７６、１～７７、１～７８、１～７９、１～８０、１～８１、１～８２、１～８３、１～８４、１～８５、１～８６、１～８７、１～８８、１～８９、１～９０、１～９１、１～９２、１～９３、１～９４、１～９５、１～９６、１～９７、１～９８、１～９９または１～１００を含む。他の例において、α１ドメインは、完全長ＤＲα１ポリペプチドの残基約２０～１２０（例えば、残基約２０～１１０、２４～１１０、２４～１０９、２５～１００、２５～１０９、２６～１１０、２６～１０９、３０～１２０、３２～１２０、３２～１１５、２６～９０、２６～８５、２６～８４または他の重複領域）を含む。いくつかの例において、ＤＲα１ドメインは、Ｎ末端メチオニンを含まないが、しかしながら、Ｎ末端メチオニンは、例えば、細菌系、酵母系または哺乳動物系における発現の結果として、存在し得る。

【0052】

さらなる例において、ＤＲα１ドメインは、５’および／または３’末端に数アミノ酸の欠失または付加（例えば、約１～２５アミノ酸の付加または欠失、例えば、５’または３’末端からの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５アミノ酸の付加または欠失、またはそれらの組み合わせ（例えば、一方の末端からの欠失および他方の末端への付加））を含み得る。α１ドメインの組成は、これらのパラメータのほかに、哺乳動物の種および対象となっている特定のα鎖に応じても変動し得る。当業者は、アミノ酸配列の正確な数値パラメータが、ドメイン機能（例えば、ＣＤ７４の結合またはダウンレギュレーション）の維持より重要ではないことを認識するだろう。

【0053】

いくつかの実施形態において、配列番号１のアミノ酸位置１４に対応する位置にグルタミン残基を含むＤＲα１ドメインを含む組換えポリペプチドが開示される。その組換えポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩα２、β１またはβ２ドメインを含まない。いくつかの例において、組換えＤＲα１ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。さらなる実施形態において、組換えポリペプチドは、配列番号１またはそのフラグメントと少なくとも７５％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の配列を有する。例えば、ＤＲα１ポリペプチドは、配列番号１またはそのフラグメントと少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を有する配列番号１のホモログまたはオルソログであり得る。例示的な配列は、ワールドワイドウェブにおいて容易に利用可能なコンピュータプログラムおよび本明細書中に示されるアミノ酸配列を用いて得ることができる。いくつかの例において、そのホモログは、配列番号１のポリペプチドの機能（例えば、変更された二次構造、ＣＤ７４への結合および／またはマウスにおけるＥＡＥの阻害）を保持している。

【0054】

他の実施形態において、配列番号１のアミノ酸位置１４に対応する位置にグルタミン残基を含むＤＲα１ドメインまたはそのフラグメントおよび抗原ペプチドを含む組換えポリペプチドが開示される。その組換えポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩα２、β１またはβ２ドメインを含まない。いくつかの例において、その組換えポリペプチドは、リンカー（例えば、ＤＲα１ポリペプチドと抗原ペプチドとの間のリンカー）をさらに含む。そのリンカーは、ペプチドリンカーまたは化学リンカー（例えば、化学架橋剤）であり得る。

【0055】

いくつかの実施形態において、抗原ペプチドは、ヒトまたはマウスのミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）３５－５５である。したがって、いくつかの実施形態において、上記組換えポリペプチドは、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。さらなる実施形態において、上記組換えポリペプチドは、配列番号２もしくは配列番号３またはそのフラグメントと少なくとも７５％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の配列を有する。例えば、上記ポリペプチドのＤＲα１部分は、配列番号１またはそのフラグメントと少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を有する配列番号１のホモログまたはオルソログであり得る。例示的な配列は、ワールドワイドウェブにおいて容易に利用可能なコンピュータプログラムおよび本明細書中に示されるアミノ酸配列を用いて得ることができる。いくつかの例において、上記ポリペプチドは、配列番号２または配列番号３のポリペプチドの機能（例えば、変更された二次構造、ＣＤ７４への結合および／またはマウスにおけるＥＡＥの阻害）を保持している。上記ポリペプチドに含められ得るさらなる抗原ペプチドを下記で論じる。

【0056】

組換えポリペプチド（例えば、配列番号１～３）の軽微な改変は、実質的に等価な活性（例えば、配列番号１～３と比べて）を有するポリペプチドをもたらし得る。そのような改変は、部位特異的突然変異誘発によるような意図的なものであってもよいし、自然発生的なものであってもよい。これらの改変によって生成されるポリペプチドのすべてが、本明細書中に含められる。したがって、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲα１ポリペプチドの非限定的な具体例は、配列番号１～３のいずれか１つの保存的バリアント（例えば、保存的アミノ酸置換、例えば、１つまたはそれを超える保存的アミノ酸置換、例えば、１～１０個の保存的置換、２～５個の保存的置換、４～９個の保存的置換、例えば、１、２、５または１０個の保存的置換）である。

【0057】

開示される組換えＤＲα１ポリペプチドをコードする（例えば、配列番号１～３のいずれか１つをコードする）核酸分子および／またはその任意のホモログもしくはバリアントは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅などの標準的なアプローチによって作製され得る。いくつかの例において、組換えポリペプチドは、配列番号４～６のいずれか１つの核酸配列を含むかまたはそれからなる核酸によってコードされる。さらなる実施形態において、その核酸は、配列番号４～６のいずれか１つまたはそのフラグメントと少なくとも７５％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の配列を有する。

【0058】

いくつかの実施形態において、上記組換えポリペプチド（例えば、配列番号１～３）は、その組換えポリペプチドをコードする核酸構築物（例えば、配列番号４～６のいずれか１つを含む核酸構築物）から原核細胞または真核細胞において発現され得る。組換えポリペプチドをコードする核酸構築物（例えば、発現構築物）は、プロモーター、エンハンサーおよび／または３’調節領域などの調節エレメントも含むことがあり、それらのエレメントの選択は、タンパク質が発現される細胞のタイプに基づいて決定される。それらの構築物は、選択された細胞型における組換えポリペプチドの発現に適したベクターに導入される。

【0059】

ポリペプチドを発現および精製するための数多くの原核生物系および真核生物系が知られている。例えば、制御された強力なプロモーターおよび効率的なリボソーム結合部位を、ポリペプチドをコードする構築物の上流に配置することによって、原核細胞において異種ポリペプチドを生成することができる。好適なプロモーター配列としては、ベータ－ラクタマーゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）、ファージＴ７およびラムダＰ_Ｌプロモーターが挙げられる。細菌細胞または哺乳動物細胞において異種タンパク質を生成するための方法およびプラスミドベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，２００１；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，１９９２（および２０００年までの補遺）；ならびにＡｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９９に記載されている。

【0060】

大量のタンパク質の発現に適した好適な原核細胞としては、大腸菌および枯草菌が挙げられる。多くの場合、高レベルで発現されたタンパク質は、不溶性の封入体内に見られる。これらの凝集物からタンパク質を抽出するための方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１，ｃｈａｐｔｅｒ １５を参照のこと）によって報告されている。あるいは、原核細胞における組換えポリペプチドの組換え発現は、融合タンパク質の最適な発現および精製のためにデザインされた市販のシステムを用いて都合よく得てもよい。そのような融合タンパク質は、通常、精製を容易にするタグを含む。そのようなシステムの例としては、ｐＭＡＬタンパク質融合および精製システム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）；ＧＳＴ遺伝子融合システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）；およびｐＴｒｃＨｉｓ発現ベクターシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が挙げられる。さらなるシステムとしては、Ｈｉｓ６－タグ（例えば、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）またはストレプトアビジン結合ペプチド（例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）が挙げられる。例えば、ｐＭＡＬ発現系は、発現されるタンパク質にマルトース結合タンパク質を付加するベクターを利用する。その融合タンパク質は、大腸菌において発現され、融合タンパク質は、アミロースカラムを用いて粗細胞抽出物から精製される。必要であれば、Ｘａ因子などの好適なプロテアーゼで処理することによって、融合タンパク質からマルトース結合タンパク質ドメインを切断することができる。次いで、第２のアミロースカラムに通すことによって、その調製物からマルトース結合フラグメントを除去することができる。

【0061】

上記組換えポリペプチドは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって作製された、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、バキュロウイルスおよび／またはシンドビス発現系を含む真核生物発現系においても発現され得る。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、サル腎臓（ＣＯＳ）、ＨｅＬａ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの真核細胞も、組換えポリペプチドを発現するために使用され得る。これらの細胞での使用に適した調節領域としては、哺乳動物細胞の場合は、ウイルスプロモーター（例えば、ＣＭＶ、アデノウイルスまたはＳＶ４０由来のプロモーター）および酵母細胞の場合は、３－ホスホグリセリン酸キナーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼに対するプロモーターが挙げられる。

【0062】

上記ベクターは、純粋なＤＮＡとして（トランスフェクション）、例えば、リン酸カルシウムもしくはリン酸ストロンチウムを用いた沈殿、エレクトロポレーション、リポフェクション、ＤＥＡＥデキストラン、マイクロインジェクション、プロトプラスト融合または微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｇｕｎｓ）によって、レシピエント細胞（例えば、真核細胞）に導入され得る。あるいは、上記核酸分子は、ウイルスベクターを用いた感染によって導入され得る。例えば、レトロウイルス、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスを使用するシステムが開発されている。

【0063】

哺乳動物細胞において生成されたＤＲα１ポリペプチド（例えば、本明細書中に記載されるもの）は、そのタンパク質が上清中に放出された後に抽出され得、抗ＭＨＣ抗体または他の抗体を用いて調製されたイムノアフィニティーカラムを用いて精製され得る。あるいは、そのポリペプチドは、例えばβ－グロビンとの、キメラタンパク質として発現され得る。その後、β－グロビンに対する抗体を用いて、そのキメラタンパク質が精製される。次いで、β－グロビン遺伝子と組換えポリペプチドをコードする核酸配列との間に存在する操作された対応するプロテアーゼ切断部位を用いることにより、翻訳後にそれら２つのポリペプチドフラグメントが互いから分離される。β－グロビンキメラタンパク質を生成するための１つの有用な発現ベクターは、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）である。

【0064】

原核細胞における組換えポリペプチドの発現により、グリコシル化されていないポリペプチドが生じ得る。天然に存在するグリコシル化標的部位におけるポリペプチドのグリコシル化は、ポリペプチドを哺乳動物細胞などの好適な真核生物発現系において発現させることによって達成され得る。他の例では、所望の翻訳後修飾部位（例えば、Ｎ結合型グリコシル化、リン酸化または他の修飾のための１つまたはそれを超える部位）を含むように（例えば、部位特異的突然変異誘発によって）組換えポリペプチドを改変することができる。

【0065】

発現されたタンパク質の精製は、一般に、６Ｍ尿素を含む塩基性溶液（通常、ｐＨ１０付近）中で行われる。次いで、中性ｐＨの緩衝液（通常、ｐＨ７．４付近のリン酸緩衝食塩水）に対する透析によって、精製されたタンパク質のフォールディングが達成される。他のタンパク質精製方法も知られており、それらは、本明細書中に開示される組換えポリペプチドとともに用いることができる。

【0066】

ＩＩＩ．抗原ペプチド
いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される組換えポリペプチドは、ＤＲα１ドメインに直接またはペプチドリンカーもしくは化学リンカーを介して共有結合により連結された抗原ペプチドを含む。ＡＰＣの表面上でのＭＨＣ複合体における抗原の提示は、一般に、抗原ペプチド全体が関わらない（例えば、米国特許第５，４６８，４８１号を参照のこと）。むしろ、ＭＨＣ ＩＩの場合はβ１ドメインとα１ドメインとの間の溝またはＭＨＣ Ｉの場合はα１ドメインとα２ドメインとの間の溝に位置するペプチドが、通常、ポリペプチド抗原全体の小さい直鎖状フラグメントとなる。Ｊａｎｅｗａｙ ＆ Ｔｒａｖｅｒｓ（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，１９９７）に論じられているように、ＭＨＣクラスＩ分子のペプチド溝に位置するペプチドは、結合ポケットのサイズによって限定され、通常、８～１５アミノ酸長（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸）、より通常は８～１０アミノ酸長である（が、考えられる例外についてはＣｏｌｌｉｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３７１：６２６－６２９，１９９４を参照のこと）。対照的に、ＭＨＣクラスＩＩ分子のペプチド溝に位置するペプチドは、このように限定されず、それより大きいことが多く、通常、少なくとも３～５０アミノ酸長（例えば、８～３０、１０～２５または１５～２３アミノ酸長）である。いくつかの例において、ＭＨＣクラスＩＩ分子のペプチド溝に位置するペプチドは、約１５～２３アミノ酸長である。ペプチドフラグメントは、合成ペプチド合成機を使用することなどの標準的なアプローチによって調製され得るか、または組換えポリペプチドの一部として発現され得る。

【0067】

いくつかの例において、抗原ペプチドは、ミエリンタンパク質（例えば、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）またはプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ））などの神経タンパク質または中枢神経系タンパク質からのペプチドを含む。具体例において、抗原ペプチドは、それぞれ配列番号２のアミノ酸１～２１または配列番号３の１～２１によって例証される、ヒトまたはマウスのＭＯＧ－３５－５５ペプチドを含む。他の例では、抗原ペプチドは、光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）、アレスチン、ホスデューシンまたはリカバリンなどの網膜タンパク質からのペプチドである。さらなる抗原ペプチドとしては、ＩＩ型コラーゲン（コラーゲンＩＩ）、フィブリノゲン－α、ビメンチン、α－エノラーゼ、ヒト軟骨糖タンパク質－３９、α２グリアジンまたはインスリンからのペプチドが挙げられる。いくつかの例において、抗原ペプチドは、リン酸化、グリコシル化またはシトルリン化などの翻訳後修飾を含む。例示的な抗原ペプチドの配列は、表１ならびに国際特許出願公開第ＷＯ２０１２／１０３３６５および米国特許出願公開第２０１２／０２７６１２７号（この両方の全体が参照により本明細書中に援用される）に提供されている。当業者は、特定の疾患または障害と関連性があるさらなる抗原ペプチドを特定できる。

【表1-1】

【表1-2】

【0068】

いくつかの例において、上記抗原ペプチドは、発現されたペプチドにおいてその抗原ペプチドがＤＲα１ドメインのアミノ末端に連結されるように、選択された抗原ペプチドをコードする核酸配列を、ＤＲα１ポリペプチドをコードする構築物の５’末端に作動可能に連結することによって、ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲα１ポリペプチドに共有結合により連結される。他の例では、上記抗原ペプチドは、発現されたペプチドにおいてその抗原ペプチドがＤＲα１ドメインのカルボキシ末端に連結されるように、選択された抗原をコードする核酸配列を、ＤＲα１ポリペプチドをコードする構築物の３’末端に作動可能に連結することによって、ＤＲα１ポリペプチドに共有結合により連結される。この結果を得る１つの好都合な方法は、抗原ペプチドをコードする配列を、ＤＲα１ドメインコード領域を増幅するために用いられるＰＣＲプライマーに組み込むことである。いくつかの例において、リンカーペプチド配列をコードする配列が、抗原ペプチドとＤＲα１ポリペプチドとの間に含められる。しかしながら、抗原ペプチドは、厳密にＭＨＣクラスＩＩα１ドメインコード領域の５’末端（または３’末端）にライゲートされる必要はない。例えば、抗原ペプチドコード領域は、ＤＲα１ドメインコード配列の５’または３’末端の最初の数コドン以内（通常、最初の１０個のコドン以内）のα１ドメインに挿入され得る。

【0069】

いくつかの実施形態において、抗原ペプチドをＤＲα１ドメインに連結するための遺伝子系は、異なる抗原ペプチドを有するいくつかのＤＲα１ドメインを生成する場合に特に有用である。記載される系は、ユニークな制限酵素認識部位がＤＲα１ドメインに（例えば、α１ドメインの５’または３’末端に）含められた発現ベクターの構築を可能にする。そのような構築物とともに、抗原ペプチドをコードする配列のライブラリーが作製され、ここで、各抗原コード領域は、選択された制限酵素に対する部位に隣接している。次いで、特定の抗原をＤＲα１ドメインに含めることは、（ａ）選択された制限酵素を用いて抗原コード領域を放出し、（ｂ）同じ制限酵素でＤＲα１ドメイン構築物を切断し、（ｃ）抗原コード領域をＤＲα１ドメイン構築物にライゲートすることによって、簡潔に行われる。このように、多数のＤＲα１ドメイン－ペプチド抗原構築物が、短時間で作製および発現され得る。

【0070】

いくつかの例において、上記抗原は、ペプチドリンカーによってＤＲα１ドメインポリペプチドに共有結合により連結される。いくつかの例において、そのリンカーは、１つまたはそれを超える（例えば、１、２、３、４つまたはそれを超える）グリシン－セリンスペーサー、例えばＧＧＧＧＳ（配列番号５２）を含む。いくつかの例において、そのリンカーは、２つのグリシン－セリンスペーサーを含む。非限定的な例において、上記組換えポリペプチドは、抗原ペプチドとＤＲα１ポリペプチドとの間に第１のグリシン－セリンスペーサー、トロンビン切断部位および第２のグリシン－セリンスペーサーを含み得る。

【0071】

いくつかの例において、上記抗原は、ジスルフィド結合によってＤＲα１ドメインポリペプチドに共有結合により連結される。いくつかの例において、そのジスルフィド結合は、ＤＲα１ドメインポリペプチド内の天然に存在するシステイン残基（例えば、ＤＲα１ドメイン内のシステイン残基）を使用している。当業者は、ＤＲα１ドメインポリペプチド内の好適なシステイン残基を特定できる。他の例では、そのジスルフィド結合は、ＤＲα１ドメインポリペプチド内の天然に存在しないシステイン残基（例えば、突然変異誘発によってＤＲα１ドメインポリペプチドに導入されたシステイン残基）を使用して形成される。さらなる例において、そのジスルフィド結合は、ペプチド抗原内の天然に存在するシステイン残基を使用して形成される。なおもさらなる例において、そのジスルフィド結合は、ペプチド抗原内の天然に存在しないシステイン残基（例えば、突然変異誘発によってペプチド抗原に導入されたシステイン残基）を使用して形成される。

【0072】

ＩＶ．障害を処置または阻害する方法
炎症性障害および／または自己免疫障害を含むがこれらに限定されない被験体における障害を処置または阻害する方法が本明細書中に開示される。開示される方法は、配列番号１のアミノ酸位置１４に対応する位置にグルタミン残基を有するＭＨＣクラスＩＩ ＤＲα１ドメインポリペプチドを含む組換えポリペプチド（配列番号１によって例証される）、または抗原ペプチドに共有結合により連結された、配列番号１のアミノ酸位置１４に対応する位置にグルタミン残基を有するＭＨＣクラスＩＩ ＤＲα１ドメインポリペプチドを含む組換えポリペプチド（配列番号２および３によって例証される）、またはその組換えポリペプチドをコードする核酸を被験体に投与する工程を含む。１つの非限定的な例において、その被験体は、多発性硬化症を有し、ＭＯＧ－３５－５５ペプチドに連結された、配列番号１のアミノ酸位置１４に対応する位置にグルタミン残基を有するＭＨＣクラスＩＩ ＤＲα１ドメインポリペプチド（例えば、配列番号２または配列番号３）を投与される。

【0073】

いくつかの実施形態において、上記方法は、処置するための障害を有する被験体を選択する工程、および有効量の本明細書中に記載される組換えポリペプチド、本明細書中に記載される組換えポリペプチドをコードする核酸、または開示される組換えポリペプチドもしくは核酸を含む医薬組成物をその被験体に投与する工程を含む。

【0074】

いくつかの実施形態において、被験体は、炎症性疾患もしくは炎症性障害および／または自己免疫疾患もしくは自己免疫障害を有し、それらとしては、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、ウェゲナー肉芽腫症、炎症性腸疾患、多発性筋炎、皮膚筋炎、多内分泌不全、シュミット症候群、自己免疫性ブドウ膜炎、セリアック病（ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ）、アジソン病、副腎炎、グレーヴズ病、甲状腺炎、橋本甲状腺炎、自己免疫性甲状腺疾患、悪性貧血、胃の萎縮症、慢性肝炎、ルポイド肝炎、アテローム性動脈硬化症、初老期認知症、脱髄性疾患、多発性硬化症、亜急性皮膚エリテマトーデス、副甲状腺機能低下症、ドレスラー症候群、重症筋無力症、自己免疫性血小板減少症、特発性血小板減少性紫斑病、溶血性貧血、尋常性天疱瘡、天疱瘡、疱疹状皮膚炎、円形脱毛症（ａｌｏｐｅｃｉａ ａｒｃａｔａ）、類天疱瘡、強皮症、全身性進行性硬化症、ＣＲＥＳＴ症候群（石灰沈着症、レイノー現象、食道運動障害、手指硬化症および毛細血管拡張症）、成人発症型真性糖尿病（ＩＩ型糖尿病）、男性および女性の自己免疫性不妊症、強直性脊椎炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、混合結合組織病、結節性多発動脈炎（ｐｏｌｙａｒｔｅｒｉｔｉｓ ｎｅｄｏｓａ）、全身性壊死性血管炎、若年発症型関節リウマチ、糸球体腎炎、アトピー性皮膚炎、アトピー性鼻炎、グッドパスチャー症候群、シャーガス病、サルコイドーシス、リウマチ熱、喘息、反復流産、抗リン脂質症候群、農夫肺、多形性紅斑、心術後症候群、クッシング症候群、自己免疫性慢性活動性肝炎、愛鳥家肺、アレルギー性疾患、アレルギー性脳脊髄炎、中毒性表皮壊死症、脱毛症、アルポート症候群、肺胞炎、アレルギー性肺胞炎、線維化肺胞炎、間質性肺疾患、結節性紅斑、壊疽性膿皮症、輸血反応、ハンセン病、マラリア、リーシュマニア症、トリパノソーマ症、高安動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、側頭動脈炎、住血吸虫症、巨細胞性動脈炎、回虫症、アスペルギルス症、サムター症候群（Ｓａｍｐｔｅｒ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、湿疹、リンパ腫様肉芽腫症、ベーチェット病、カプラン症候群、川崎病、デング熱、脳脊髄炎、心内膜炎、心内膜心筋線維症、眼内炎、持久性隆起性紅斑（ｅｒｙｔｈｅｍａ ｅｌｅｖａｔｕｍ ｅｔ ｄｉｕｔｉｎｕｍ）、乾癬、胎児赤芽球症、好酸球性筋膜炎（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ ｆａｃｉｉｔｉｓ）、シャルマン症候群、フェルティ症候群、フィラリア症、毛様体炎、慢性毛様体炎、異虹彩色性毛様体炎（ｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｎｉｃ ｃｙｃｌｉｔｉｓ）、フックス毛様体炎、ＩｇＡ腎症、ヘノッホシェーンライン紫斑病、糸球体腎炎、移植片対宿主病、移植拒絶反応、ヒト免疫不全ウイルス感染症、エコーウイルス感染症、心筋症、アルツハイマー病、パルボウイルス感染症、風疹ウイルス感染症、予防接種後症候群、先天性風疹感染症、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫、腎細胞癌、多発性骨髄腫、イートン・ランバート症候群、再発性多発性軟骨炎、悪性黒色腫、クリオグロブリン血症、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症（Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍ’ｓ ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｅｍｉａ）、エプスタイン・バーウイルス感染症、ルブラウイルスならびにエヴァンズ症候群が挙げられるが、これらに限定されない。

【0075】

さらなる炎症性疾患としては、変形性関節症、炎症性肺疾患（慢性閉塞性肺疾患を含む）、歯周病、リウマチ性多発筋痛症、アテローム性動脈硬化症、全身性硬化症、アレルギー性鼻炎および皮膚障害（皮膚筋炎および乾癬を含む）などが挙げられる。

【0076】

他の実施形態において、被験体は、網膜障害、例えば、網膜変性症、例えば、網膜色素変性症、錐体杆体ジストロフィー、レーバー先天黒内障または黄斑症（例えば、加齢黄斑変性症、シュタルガルト様黄斑変性症、卵黄様黄斑ジストロフィー（ベスト病）、常染色体優性放射状ドルーゼン（Ｍａｌａｔｔｉａ Ｌｅｖｅｎｔｉｎｅｓｅ）（ドインの蜂巣状網膜ジストロフィー）、糖尿病黄斑症、潜在性黄斑ジストロフィーおよびセロファン黄斑症）を有する。他の例では、網膜障害には、自己免疫性網膜症、糖尿病性網膜症または血管性網膜症などの網膜症が含まれる。なおもさらなる例では、網膜障害には、網膜剥離または緑内障が含まれる。網膜障害は、進行性（例えば、網膜変性症または緑内障）または急性（例えば、網膜剥離）であり得る。さらなる例において、被験体は、ブドウ膜炎または視神経炎を有する被験体である。他の実施形態において、被験体は、脳卒中（例えば、虚血性脳卒中または出血性脳卒中）を有していたことがある。なおもさらなる例において、被験体は、物質嗜癖を有する被験体、例えば、メタンフェタミン乱用およびアルコール乱用を含む物質嗜癖によって誘導される認知機能障害または精神神経機能障害を有する被験体である。

【0077】

いくつかの実施形態において、配列番号１のアミノ酸位置１４に対応する位置にロイシンからグルタミンの置換を含むＤＲα１ドメインまたはその一部（例えば、ＣＤ７４に結合することができるかまたはＣＤ７４の発現および／もしくは活性を低下させることができるα１ドメインの一部）を含む有効量の組成物が被験体に投与される。１つの例において、その組成物は、改変されたＤＲα１－ＭＯＧ－３５－５５（例えば、配列番号２または配列番号３）を含む。

【0078】

本明細書中に開示される組換えポリペプチドまたは核酸（例えば、有効量の開示される組換えポリペプチドまたは核酸）を含む医薬組成物は、選択される特定の投与様式に応じて、適切な固形キャリアまたは液体キャリアとともに製剤化され得る。本開示において有用な薬学的に許容され得るキャリアおよび賦形剤には、当業者に公知のものが含まれる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｅｄｉｔｏｒ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００５）を参照のこと。例えば、非経口製剤は、通常、水、生理食塩水、他の平衡塩類溶液、デキストロース水溶液、グリセロールなどのような薬学的かつ生理的に許容され得る流体ビヒクルである注射可能な流体を含む。固形組成物（例えば、散剤、丸剤、錠剤またはカプセル剤の形態）の場合、従来の無毒性固形キャリアとしては、例えば、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプンまたはステアリン酸マグネシウムが挙げられ得る。

【0079】

投与される医薬組成物は、生物学的に中性のキャリアに加えて、微量の無毒性補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、保存剤、ｐＨ緩衝剤など、例えば酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレート）を含み得る。含められ得る賦形剤は、例えば、ヒト血清アルブミンまたは血漿調製物などの他のタンパク質である。医薬組成物の剤形は、選択される投与様式によって決定され得る。例えば、注射可能な流体に加えて、局部製剤、吸入製剤、経口製剤および坐剤製剤が使用され得る。局部調製物には、点眼剤、軟膏、スプレー、パッチなどが含まれ得る。吸入調製物は、液体（例えば、液剤または懸濁剤）であり得、それらには、ミスト、スプレーなどが含まれ得る。経口製剤は、液体（例えば、シロップ剤、水剤または懸濁剤）または固体（例えば、散剤、丸剤、錠剤またはカプセル剤）であり得る。坐剤調製物は、固体、ゲル、または懸濁液の形態でもあり得る。固形組成物の場合、従来の無毒性固形キャリアとしては、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプンまたはステアリン酸マグネシウムが挙げられ得る。そのような剤形を調製する実際の方法は、当業者に公知であるか、または当業者に明らかであり得る。

【0080】

いくつかの例において、医薬組成物は、その意図された目的を達成する任意の様式によって投与され得る。組換えポリペプチドまたはその一部（またはそのようなポリペプチドをコードする核酸）を投与するための量およびレジメンは、担当臨床医によって決定され得る。治療的な適用のための有効な用量は、処置される症状の性質および重症度、特定のＤＲα１ドメインもしくはその一部ならびに／または選択された抗原ペプチド、患者の年齢および症状、ならびに他の臨床因子に応じて変動し得る。通常、用量範囲は、約０．１μｇ／ｋｇ体重～約１００ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。他の好適な範囲としては、約１００μｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５００μｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重または約１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇまたは約５ｍｇ／ｋｇの用量が挙げられる。投薬スケジュールは、そのタンパク質に対する被験体の感度などのいくつかの臨床因子に応じて、１ヶ月に１回から毎日まで様々であり得る。投薬スケジュールの例は、１ヶ月に１回、隔週で、１週間に１回、１週間に２回、１週間に３回または毎日投与される約１ｍｇ／ｋｇ；１週間に１回、１週間に２回、１週間に３回または毎日の約２．５ｍｇ／ｋｇの用量；１週間に１回、１週間に２回、１週間に３回または毎日の約５ｍｇ／ｋｇの用量；１週間に１回、１週間に２回、１週間に３回または毎日の約１０ｍｇ／ｋｇの用量；または１週間に１回、１週間に２回、１週間に３回または毎日の約３０ｍｇ／ｋｇの用量である。

【0081】

１つまたはそれを超える開示される組換えポリペプチドを含む医薬組成物は、正確な投与量の個々の投与に適した単位剤形に製剤化され得る。１つの非限定的な具体例において、単位投与量は、約１ｎｇ～約５ｇの組換えポリペプチド（例えば、約１０μｇ～１ｇ、約１００ｍｇ～５００ｍｇまたは約１０ｍｇ～１００ｍｇ）を含み得る。投与される活性な化合物の量は、処置される被験体、苦痛の重症度および投与の様式に依存し得る。これらの範囲内において、投与される製剤は、ある量の活性な構成要素を、処置される被験体において所望の効果を達成するのに有効な量で含み得る。

【0082】

上記組換えポリペプチドは、それらの組換えポリペプチドが有効であるヒトまたは他の動物の組織に、様々な様式で（例えば、局部的に、経口的に、静脈内に、筋肉内に、腹腔内に、鼻腔内に、皮内に、髄腔内に、皮下に、眼内に、吸入を介して、または坐剤を介して）投与され得る。１つの例において、それらの化合物は、被験体の皮下に投与される。別の例では、それらの化合物は、被験体の静脈内に投与される。

【0083】

いくつかの実施形態において、上記組換えポリペプチドは、局部適用または局所適用のための不活性なマトリックスに含められ得る。いくつかの例において、その製剤は、例えば硝子体内注射で、眼に注射され得る。不活性なマトリックスの一例として、卵ホスファチジルコリン（ＰＣ）などのジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）からリポソームが調製され得る。カチオン性およびアニオン性リポソームを含むリポソームが、当業者に公知であるような標準的な手順を用いて作製され得る。１つまたはそれを超える組換えポリペプチドを含むリポソームは、液滴の形態でもしくは水性ベースのクリームとして局部適用され得るか、または眼内に注射され得る。局部適用のための製剤では、組換えポリペプチドは、リポソームカプセルが眼表面からの摩耗および破損に起因して分解するにつれて長い時間をかけてゆっくり放出される。眼内注射用の製剤では、リポソームカプセルは、細胞消化に起因して分解する。これらの製剤の両方が、緩効性薬物送達系の利点を提供し、それにより、被験体が実質的に一定濃度の組換えポリペプチドに長い時間にわたって曝露される。１つの例では、ＤＲα１ポリペプチドが、ＤＭＳＯまたはアルコールなどの有機溶媒に溶解され得、ポリ無水物、ポリ（グリコール）酸、ポリ（乳）酸またはポリカプロラクトンポリマーを含み得る。組換えポリペプチドは、植込錠のサイズ、形状および処方ならびに移植手順のタイプに応じて、眼における様々な部位に植え込むことができる送達系に含められ得る。好適な部位としては、前眼房、前眼部、後眼房、後眼部、硝子体腔、脈絡膜上腔、結膜下、上強膜、角膜内、角膜上（ｅｐｉｃｏｒｎｅａｌ）および強膜が挙げられるがこれらに限定されない。

【0084】

いくつかの例において、開示される組換えポリペプチドの有効量（例えば、治療有効量）は、被験体における障害（例えば、炎症性障害および／または自己免疫障害）を処置または阻害するのに必要な組換えポリペプチドの量であり得る。他の例では、開示される組換えポリペプチドの治療有効量は、網膜障害、脳卒中、外傷性脳損傷、または物質嗜癖に関連する障害（例えば、物質嗜癖に起因する認知機能障害または精神神経機能障害）を処置または阻害するのに必要な組換えポリペプチドの量であり得る。

【0085】

本開示は、１つまたはそれを超える開示される組換えポリペプチドと、障害の処置において有用な１つまたはそれを超える他の作用物質との併用も含む。いくつかの例において、それらの組換えポリペプチドは、有効な用量の、炎症性障害または自己免疫障害に対する１つまたはそれを超える治療薬（非ステロイド性抗炎症薬、コルチコステロイド、メトトレキサート、抗ＴＮＦ化合物、ミコフェノール酸、アミノサリチル酸、抗生物質、インターフェロン、酢酸グラチラマー、抗体治療薬（例えば、リツキシマブまたはミラツズマブ）または免疫抑制化合物もしくは免疫調節化合物を含むがこれらに限定されない）とともに投与され得る。別の例では、それらの組換えポリペプチドは、有効な用量の、網膜障害に対する１つまたはそれを超える治療薬（遺伝子治療薬、ビタミン補給剤またはミネラル補給剤（例えば、ビタミンＡ、Ｃおよび／もしくはＥまたは亜鉛および／もしくは銅）、抗血管新生治療（例えば、ラニビズマブまたはベバシズマブ）、光凝固術、光線力学的療法、ルテインもしくはゼアキサンチン、コルチコステロイドまたは免疫抑制剤を含むがこれらに限定されない）と併用して投与され得る。特定の疾患に対する適切な併用療法は、当業者によって選択され得る。用語「併用投与」または「同時投与」とは、活性な作用物質の同時の投与と連続した投与との両方のことを指す。

【実施例】

【0086】

以下の実施例は、ある特定の特徴および／または実施形態を例証するために提供される。これらの実施例は、記載される特定の特徴または実施形態に本開示を限定すると解釈されるべきでない。

【0087】

実施例１
材料および方法
Ｆａｂ、抗体および他の試薬。Ｇ４は、ヒトＩｇＧライブラリーに由来するＤＲα１ドメインに反応性のヒトＦａｂであり、Ｄｒ．Ｙｏｒａｍ Ｒｅｉｔｅｒ，Ｔｅｃｈｎｉｏｎ Ｉｓｒａｅｌからの厚意により供与された。抗ヒトＭＯＧ抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。ＣＨＡＰＳ、Ｔ２０およびウシ血清アルブミンは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。抗ＣＤ７４抗体は、Ｅｖｅｒｅｓｔ Ｂｉｏｔｅｃｈから購入した。ＵｌｔｒａＰｕｒｅ（商標）ＴＲＩＳは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。ベクターｐＥＴ２１ｄ（＋）は、Ｎｏｖａｇｅｎから購入した。ＢＬ２１（ＤＥ３）は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから購入した。ＩＰＴＧは、Ｉｎａｌｃｏから購入した。

【0088】

ＤＲα１構築物のクローニング、発現および精製。ＤＲα１構築物の精製は、報告されている（Ｖａｎｄｅｎｂａｒｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：１２７－１３３，２００３）。簡潔には、ヒトＭＯＧ－３５－５５ペプチド、可動性リンカー、およびアミノ酸残基１５から９７までのＭＨＣクラスＩＩ ＤＲα１ドメインをコードする配列を含む合成ＤＮＡフラグメント、ならびにＤＲα１ドメイン内に変異Ｌ５０Ｑを含む類似の合成ＤＮＡフラグメントを、高レベル発現ベクターｐＥＴ２１ｄ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングした。これらのクローンを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）に形質転換し、５０μｇ／ｍｌの抗生物質カルベニシリンを含むＬＢ寒天プレートにプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、各クローンからの３つの個々のコロニーを選択し、上記抗生物質が補充されたＬＢブロス中で生育して、ＩＰＴＧによって誘導される、目的のタンパク質の産生を試験した。確認後、１００ｍｌの一晩培養物を調製し、それを用いて、上記抗生物質が補充されたＬＢを含む４Ｘ１Ｌフラスコに接種した。対数増殖の時点においてＩＰＴＧを２ｍＭという最終濃度まで加えて、標的タンパク質合成を誘導した。培養物を３７℃でさらに４時間インキュベートし、遠心分離によって収集し、その細菌ペーストを、使用するまで－８０℃で凍結した。

【0089】

ペレットを超音波処理緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）に再懸濁し、超音波処理して、細胞を破壊し、封入体を放出させた。これらの封入体に含まれるタンパク質を、２０ｍＭエタノールアミン、６Ｍ尿素，ｐＨ１０緩衝液中、４℃で一晩、静かに撹拌しながら可溶化した。その可溶化タンパク質を陰イオン交換カラムに通し、そのタンパク質を可溶化緩衝液中のＮａＣｌ勾配で溶出することによって、精製を行った。画分を回収し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって解析した。目的のタンパク質を含む画分をプールし、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．５に対して透析し、５ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、急速冷凍し、次いで、使用するまで１ｍｌアリコートとして－８０℃で保存した。

【0090】

アミノ酸配列のアラインメント。目的の種々のクラスＩＩα１ドメイン配列は、すべてＮＣＢＩから検索し、ＢＬＡＳＴウェブサイト（ＮＩＨ）からのＢＬＡＳＴの２つまたはそれを超える配列を用いてアラインメントし、次いで、関連性のある領域を示すように手作業で最適化した。

【0091】

円偏光二色性によるタンパク質の構造解析。タンパク質を解凍し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって解析した（データ示さず）後、ＡＶＩＶ分光計を用いて遠紫外光（１８０～２６０ｎｍ）の吸光度によってそれらの二次構造含有量について試験した。タンパク質は、９５％超純粋だった。１００マイクロリットルの各ポリペプチドを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．５中に１ｍｇ／ｍｌの濃度で調製し、ＣＤキュベットに入れた。０．５ｎｍ間隔で計測する０．１ｍｍ光路長で１８０ｎｍ～２６０ｎｍの遠紫外スペクトルにおける吸光度についてタンパク質をスキャンした。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液だけを含むサンプルもスキャンし、そのシグナルをタンパク質の計測結果から減算した。各タンパク質について少なくとも３回のスキャンを平均し、モル楕円率としてプロットした。

【0092】

ＣＤ７４へのＤＲα１構築物の結合および競合アッセイ。これらの実験を、以下のとおり、Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）を用いるＥＬＩＳＡによって行った。結合実験および競合実験の前に、タンパク質を、リジン側鎖の第一級アミンを標的化するＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で標識した。結合体化されなかったＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８またはビオチンを、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いるサイズ排除クロマトグラフィーによって除去した。結合実験の場合は、組換えヒトＣＤ７４（ｒｈＣＤ７４）構築物を作製した（データ示さず）。そのデザイン、作製および精製は、すでに記載されている（Ｂｅｎｅｄｅｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１４：Ｅ８４２１－Ｅ８４２９，２０１７）。プレートを、ＲＴで２時間または４℃で一晩、０．１μｇ／ｍｌの濃度の、ｒｈＣＤ７４（Ｃ２７Ｓ）のＴＢＳ溶液でコーティングした。５％ＢＳＡのＴＢＳ溶液および０．０１２５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（Ｔ２０）でブロッキングした後、０．０１２５％Ｔ２０を含むブロッキング緩衝液中に調製されたＤＲα１－ＭＯＧ構築物を室温で３時間捕捉した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合体化されたストレプトアビジンで検出した。データをＰｒｉｓｍソフトウェアにロードし、相対親和性を測定するために１または２結合部位方程式にあてはめた。

【0093】

競合実験の場合は、ＥＬＩＳＡプレートを、ＴＢＳ中、０．５μｇ／ｍｌの濃度のＭＩＦで室温においてコーティングした。次いで、プレートを５％ＢＳＡのＴＢＳ溶液および０．０１２５％Ｔ２０で一晩ブロッキングした後、５％ＢＳＡ／ＴＢＳ＋０．０１２５％Ｔ２０中に調製され、段階希釈したＤＲα１構築物とともにｒｈＣＤ７４を含む競合ミックスを２５℃で１．５時間加えた。結合したｒｈＣＤ７４を、推定ＭＩＦ／Ｄ－ＤＴ結合部位から離れた領域においてヒトＣＤ７４に特異的に認識するモノクローナル抗体で検出した。４５０ｎｍの吸光度を測定し、データをＰｒｉｓｍで解析し、パラメータをそのソフトウェアに含まれる競合方程式を用いて計算した。ＤＲα１－ｈＭＯＧ－３５－５５とＰ２ペプチド（次の項を参照のこと）との競合の場合は、マウスＣＤ７４をＤＲ^＊１５０１Ｔｇマウス脾細胞から免疫沈降し、競合実験を設定した。２．５μｌのＰ２ペプチドを、ＤＲα１－ｈＭＯＧ－３５－５５タンパク質の濃度を上げながら使用した。結合したペプチドを、２％ＳＤＳを用いて免疫沈降物から溶出し、１６．５％ＰＡＧ Ｔｒｉｓ／トリシン中で解析した。ゲルをＦＩＴＣについてスキャンし、蛍光をデンシトメトリーによって定量化した。Ｐ２蛍光 対 ＤＲα１競合物をプロットし、データをＰｒｉｓｍで解析した。相対密度の値を１結合部位方程式にあてはめた。

【0094】

ＤＲα１－ｈＭＯＧ－３５－５５上のＣＤ７４結合エピトープのマッピング。ＤＲα１－ＭＯＧタンパク質およびそれらの親分子であるＲＴＬ１０００に高親和性で結合することができるＦａｂは、以前に記載されている（Ｍｅｚａ－Ｒｏｍｅｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９２：４１６４－４１７３，２０１４）。しかしながら、ＤＲα１ドメイン上のその結合領域は、まだ明らかになっていない。Ｇ４Ｆａｂに対するエピトープをマッピングするために、完全長のＤＲα１ドメインを網羅する一連の７つの重複ペプチドであってＮ末端がＦＩＴＣで標識されたペプチドを合成した。これらのペプチドを、脾細胞からのＩｎ１免疫沈降マウスＣＤ７４およびプロテインＬビーズに免疫吸着されたＧ４に結合する能力について試験した。

【0095】

免疫沈降およびウエスタンブロット実験。免疫沈降の後、個々のペプチドを、０．１％ＣＨＡＰＳ／ＴＥＮ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）中での１４～１６時間の結合実験において解析した。免疫複合体を５０μｌの２％ＳＤＳ／ＥＳＢ（電気泳動サンプル緩衝液）で２０分間溶出し、次いで、非還元条件下の１０～２０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおける電気泳動によって解析した。電気泳動の後、ゲルをＦＩＴＣ標識ペプチドについてスキャンした。平行した実験では、免疫沈降したマウスＨ２Ｍを用いて、ペプチドセットの結合を試験した。Ｈ２Ｍ分子は、クラスＩＩα１ドメインに結合するが、異なる領域に結合するので、Ｈ２Ｍ分子は、結合中にα１ドメイン合成ペプチドに対して異なる選択性を示すはずである。Ｇ４は、ｒｈＣＤ７４へのＤＲα１構築物の結合を阻止するので、本発明者らは、Ｇ４およびＣＤ７４が同じペプチドセットを認識する可能性も試験した。その点について、Ｇ４ＦａｂをプロテインＬビーズに結合させ、次いで、その免疫複合体にＰ２またはＰ７ペプチドを適用した。結合した材料を、上に記載したように溶出し、電気泳動によって解析し、ゲルをＦＩＴＣ標識材料についてスキャンした。タンパク質をＰＶＤＦ（ポアサイズ０．１μｍ）に転写した後、５％ＢＳＡのＴＢＳ溶液および０．０５％Ｔ２０でブロッキングする標準的な手法を用いて、ウエスタンブロット実験を行った。

【0096】

ＥＲＫ１／２リン酸化の遮断。ＥＡＥマウス由来の２００万個の脾細胞を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５、２５μｇのＤＲｈＱまたはＤＲα１－ｈＭＯＧ－３５－５５で３７℃において３０分間、インビトロで処置した。次いで、細胞を遠沈し、プロテアーゼおよびホスフェート阻害剤が補充されたＲＩＰＡ緩衝液で溶解した。細胞溶解を氷上で３０分間進め、核およびオルガネラを含む残屑を、４℃における１０分間の１４，０００ｒｐｍでの遠心分離によって除去した。上清を回収し、還元条件下の１０～２０％の勾配ゲルにおけるＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。電気泳動の後、タンパク質をＰＶＤＦに転写し、膜をまずはｐ－ＥＲＫ１／２についてプロービングし、取り除き、次いで、抗全ＥＲＫ１／２抗体でプロービングした。

【0097】

ＥＡＥの誘導。８～１２週齢のＣ５７ＢＬ／６ ＷＴ雄マウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。すべての手技が、承認されたものであり、連邦、州および施設のガイドラインに従って行われた。０．２ｍｌの、２００μｇのマウスＭＯＧ－３５－５５ペプチドのエマルジョンおよび４００μｇの熱殺菌した結核菌Ｈ３７ＲＡ（Ｄｉｆｃｏ）を含むフロイント完全アジュバントを分配するために、マウスの側腹部の皮下の４部位に免疫した（Ｍｅｚａ－Ｒｏｍｅｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９２：４１６４－４１８３，２０１４）。さらに、免疫後の０および２日目に、Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た百日咳毒素（Ｐｔｘ）をマウスの腹腔内に注射した（マウス１匹あたりそれぞれ７５および２００ｎｇ）。≧２．０のＥＡＥスコアから開始して、ＤＲα１－ｈＭＯＧ－３５－５５、ＤＲｈＱ、ＤＲα１－ｍＭＯＧ－３５－５５およびＤＲｍＱタンパク質（０．１ｍｌ中に１００μｇ）を５日間にわたって毎日、ｓ．ｃ．注射し、それらのマウスを、以前に記載されているように（Ｍｅｚａ－Ｒｏｍｅｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９２：４１６４－４１８３，２０１４）、後肢と前肢の合計麻痺スコアの６点スケールで段階分けするＥＡＥの臨床的徴候についてスコア付けした。マウス群に対する平均ＥＡＥスコアおよびＳＤを免疫後の８日目から２７日目までの各日について計算し、実験全体にわたるＥＡＥスコア曲線を数値的に積分することによって、各マウスに対して合計した（ＣＤＩ、総疾患負荷を表す）。

【0098】

データ解析。ＥＡＥ重症度データを比較する統計解析ならびに結合および競合の結果に対するデータをあてはめる方程式を、Ｐｒｉｓｍソフトウェアパッケージ（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて計算した。

【0099】

実施例２
改変されたＤＲα１ポリペプチドの作製および解析
ＤＲα１－ｈＭＯＧ－３５－５５、ＤＲα１－ｍＭＯＧ－３５－５５、ＤＲｈＱおよびＤＲｍＱタンパク質の生成量は似ていたことから、Ｌ５０Ｑ置換は、転写および発現率に影響しないことが示唆された。タンパク質の収率は、一貫して約９０～１００ｍｇ／リットルＬＢブロスだった。Ｆａｂ Ｇ４を用いて、精製タンパク質を検出した。以前の研究では、Ｆａｂ Ｇ４が、種々の状況におけるＤＲα１ドメイン（独立型のドメインとして、より大きな構築物の一部として（本明細書中に記載されるものと同様）または２ドメイン組換えタンパク質の一部として（ＲＴＬ１０００と同様）を含む）を検出したことが示された。

【0100】

いくつかのヒトクラスＩＩα１ドメインのアラインメントの解析（図１）によって、他のヒトまたはマウスクラスＩＩと共有しないこのＤＲα１ドメインのユニークな特性が明らかになった。このユニークな特徴は、アラインメントに用いられた配列のほとんどにおいて１８位にグルタミン（Ｑ）残基を示す（Ｑ１８、図１における矢印；配列番号１におけるアミノ酸位置１４）。しかしながら、ＤＲα１ドメインは、１８位にロイシン（Ｌ）を有する。その他のペプチド提示クラスＩＩドメインとともに、このＱ１８残基は、非抗原提示タンパク質ＤＭα１およびＤＯα１の間でも保存されていた。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂｌａｎｋ（ＰＤＢ）に保存されている解析されたすべてのクラスＩＩα１ドメインの１次配列および結晶構造において、この領域は、分子本体の外側に向かっているポリペプチドのＮ末端におけるβストランド１とβストランド２との間のループに局在している。

【0101】

Ｌ１８とＱ１８の機能的役割を探索するために、ＥＬＩＳＡ実験における結合アッセイを、マウスおよびヒト起源の以前に構築されたいくつかのＲＴＬを用いて行った。図２Ａは、Ｑ１８を有するポリペプチド（ＤＰ２、ＤＰ４およびマウス由来ＲＴＬ５５１（ＩＡｂ））が、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてｒｈＣＤ７４に対して、Ｌ１８を有する構築物よりも高い結合活性を示したことを示している。Ｌ１８とＱ１８（ＤＲα１－ＭＯＧ－３５－５５構築物における５０位）とが、ＣＤ７４レセプターに対して異なる結合親和性を有し得るかを調べるために、変異ポリペプチドを作製した（図２Ｂに示されている配列）。

【0102】

ヒトＦａｂ Ｇ４（ＤＲα１ドメインを認識する）を、Ｌ５０Ｑ置換がＤＲα１構築物の免疫学的認識に影響するかを判定するためのツールとして使用した。このＦａｂ Ｇ４は、それがＤＲα１－ｈＭＯＧ－３５－５５ならびにＤＲα１－ｍＭＯＧ－３５－５５と交差反応するのと同じ様式でＤＲｈＱ変異体と交差反応した（図３Ａ）。ＤＲｈＱおよびＤＲα１－ＭＯＧ－３５－５５タンパク質の二次構造含有量を対照比較するために、円偏光二色性分光計においてタンパク質の遠紫外スキャンを行った（図３Ｂ）。以前の研究では、ＤＲα１－ｈＭＯＧ－３５－５５が、かなりの量のアルファヘリックス二次構造およびベータシート二次構造を含むことが示された（Ｍｅｚａ－Ｒｏｍｅｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９２：４１６４－４１８３，２０１４）。上記分子のすべてが、１９０ｎｍの吸光度が高い正の値を示し（これは、α－ヘリックスエレメントを示す主な特徴である）、２１５ｎｍの吸光度が負の値を示した（これは、βシート二次構造の存在を示唆する）。全体として、これらの結果は、これら３つのタンパク質が構造的に類似していることを示すことから、それらの構築物のβシートプラットフォームにおけるグルタミン（Ｑ）からロイシン（Ｌ）への置換は、アルファ－ヘリックス含有量を最小限にしか変化させず、分子の底部におけるベータシート構造の量を変化させなかったことが示唆される。

【0103】

ＤＲα１タンパク質の全長にわたって７つの重複ペプチドをデザインした（図４Ａ）。これらのペプチドは、蛍光スキャンによって検出されるために、アミノ酸配列のＮ末端にＦＩＴＣ部分を含んだ。これらのうち、Ｐ１は、完全長ペプチドの溶解度の問題に起因して改変されなければならず、第２のペプチド（Ｐ６）は、合成できなかった。それらのペプチドを個々におよびプールとして使用することにより、マウス脾細胞由来の免疫沈降ＣＤ７４に結合させた。第１のアプローチとして、全ペプチドのカクテルを、ｌｎ１免疫沈降ＣＤ７４を含むプロテインＡ／Ｇビーズに同時に加えた。図４Ｂに示されているように、２つのペプチドＰ２およびＰ５だけしか、免疫沈降マウスＣＤ７４に結合せず、Ｐ５の結合の程度は低かった。これを確かめるために、個々のペプチドを、同じ条件下でプロテインＡ／Ｇ－ｌｎ１－ＣＤ７４複合体に加えた。図４Ｂに示されているように、Ｐ２およびＰ５ペプチドだけしか、明確にマウスＣＤ７４に結合しなかった。Ｐ２は、より強い結合を示した一方で、Ｐ５は、より低い親和性を有した。

【0104】

このストラテジーの有用性を試験するために、上記実験を免疫沈降Ｈ２Ｍでも行った。異なるペプチド（またはペプチドのセット）が、Ｈ２Ｍに結合するだろうと仮定した。図４Ｃに見られるように、異なるセットの重複ペプチドが、このタンパク質に結合したことから、前の実験の結果が確証された。この後の実験は、Ｐ７ペプチドが、免疫沈降Ｈ２Ｍに強く結合し、それより低い程度でＰ４が結合したことを示した（図４Ｃ）。この結果は、ＤＲ／ＤＭ複合体の公開されている結晶構造（Ｐｏｓら、Ｃｅｌｌ １５１：１５５７－１５６８，２０１２）と一致した。これらの２つの分子の境界面は、ＤＭおよびＤＲのアルファ鎖によって支配されている。ＤＭは、ＤＲα１領域のＮ末端から離れていてペプチド結合溝に近いＤＲα１ドメインの側方表面に、ＤＲβ１ドメインに接触することなく結合する。

【0105】

以前の刊行物において、Ｇ４Ｆａｂが、ＣＤ７４へのＤＲα１構築物の結合を阻止するのに有効であることが実証された（Ｍｅｚａ－Ｒｏｍｅｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９２：４１６４－４１７３，２０１４）。ゆえに、実験は、Ｐ２が、プロテインＬに結合したＧ４Ｆａｂとも相互作用するかを判定すること、免疫沈降ＣＤ７４への結合を比較することを目指し、行われた。潜在的には、Ｐ７ペプチドは、Ｇ４またはＣＤ７４に結合しない可能性がある。予想通り、Ｐ２ペプチドだけしかＧ４に結合することができなかったことから、Ｇ４とＣＤ７４は、ＤＲα１ポリペプチド上に同じ結合部位を有することが実証された（図５Ａ）。図５Ｂは、Ｐ２ペプチドの位置を伴うＤＲα１ドメインの概略図を示している。Ｐ２ペプチドが、ＣＤ７４に結合する境界面と会合したことを確かめるために、競合実験を行って、ＤＲα１－ｈＭＯＧ－３５－５５とＰ２ペプチドとが、ｍＣＤ７４への結合について互いに競合するかを判定した。それらの結果から、ＤＲα１－ｈＭＯＧ－３５－５５が、７５０ｎＭという相対親和性（Ｋ_Ｄ）で、免疫沈降ＣＤ７４へのＦＩＴＣ標識Ｐ２ペプチドの結合に打ち勝つことができることが示された（図５Ｃ）。

【0106】

ＤＲα１－ｈＭＯＧ－３５－５５、ＤＲｈＱ、ＤＲα１－ｍＭＯＧ－３５－５５およびＤＲｍＱを含むＤＲα１－ＭＯＧを、それらのレセプターへの結合について評価した。組換えヒトＣＤ７４（Ｃ２７Ｓ）をＥＬＩＳＡプレート上にコーティングし、次いで、ブロッキングの後、ＤＲα１構築物をＲＴで１～１．５時間捕捉し、抗ＭＯＧ抗体で検出した。それらの結果をＰｒｉｓｍソフトウェアに入力し、曲線を１部位特異的結合方程式にあてはめて、Ｋ_Ｄを計算した。図６Ａおよび表２に示されているように、これらの結果から、ＤＲα１構築物の５０位（または上記アラインメントにおける１８位または配列番号１における１４位）のロイシンからグルタミンへの置換が、変異タンパク質の結合能を高めたことが示唆される。

【表2】

【0107】

ＤＲｈＱ変異体は、対応物である野生型バージョンの構築物と比較して、レセプターに対して８～１０倍高い親和性で結合した（Ｋ_Ｄを含む表２を参照のこと）。このことから、ＤＲα／ＣＤ７４相互作用のドッキングモデル（Ｍｅｚａ－Ｒｏｍｅｒｏら、Ｍｅｔａｂ．Ｂｒａｉｎ Ｄｉｓ．３１：２４９－２５５，２０１６；Ｗｉｎｇｅｒｃｈｕｋら、Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．８９：２２５－２４０，２０１４）および上で論じられたＰ２ペプチドを用いた実験によって示唆されるように、Ｌ５０を含む領域が、ＣＤ７４へのＤＲα構築物の結合部位の一部である可能性があることが確認された。競合アッセイは、直接結合の結果と一致した（図６Ｂ）。競合実験では、ＤＲｈＱは、ＣＤ７４への結合について、ＤＲα１－ｈＭＯＧ－３５－５５より８～１０倍高い、ＭＩＦに打ち勝つ能力を示した（ＤＲｈＱ ＩＣ_５０＝０．２８μＭ 対 ＤＲα１－ｈＭＯＧ－３５－５５ ＩＣ_５０＝１．６μＭ）ことから、この領域がその結合相互作用に寄与するというより直接的な役割を支持することが立証される。他方で、ＤＲα１－ｍＭＯＧ－３５－５５およびその誘導体ＤＲｍＱは、それらの間で有意差を示さず、基本的には、ＤＲｈＱと比較して中間の競合活性を示した。

【0108】

図７Ａに示されているように、ＤＲｈＱ構築物によるＣ５７ＢＬ／６雄マウスの処置は、天然のＬ５０含有ＤＲα１－ｈＭＯＧ－３５－５５構築物と比較して、継続中のＥＡＥの重症度を有意に低下させた。対照的に、ＣＤ７４へのＭＩＦの結合を阻止する能力が異ならない（上記を参照のこと）ＤＲｍＱ構築物による処置は、Ｌ５０含有ＤＲα１－ｍＭＯＧ－３５－５５構築物と比較して、ＥＡＥに対して処置の効果が異ならなかった（図７Ｂ）。

【0109】

研究から、ＭＩＦは、細胞表面上のＣＤ７４／ＣＤ４４との相互作用によってＥＲＫ１／２リン酸化を駆動する主要な炎症促進性サイトカインであることが示されている（Ｌｅｎｇら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９７：１４６７－１４７６，２００３）。ＥＡＥマウスから収集された脾細胞は、アップレギュレートされたレベルのｐ－ＥＲＫ１／２を示したことから、炎症過程と関連する継続中の活性なシグナル伝達カスケードが示唆された。ＤＲα１－ＭＯＧ構築物で処置すると、このリン酸化は、３０分間のインキュベーションの後、インビトロにおいてダウンレギュレートされた。このことは、継続中の炎症反応を有する動物由来の脾細胞をそれらの構築物で処置することにより、ＥＲＫ１／２リン酸化のダウンレギュレーションがもたらされたことを示唆する（図８）。

【0110】

Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋに寄託されているいくつかのヒトおよびマウスのクラスＩＩ分子の結晶構造では、Ｑアミノ酸残基は、そのドメインのＮ末端におけるβストランド１とβストランド２との間のループにおけるβストランド１の末端に位置する（図９Ａおよび９Ｂ）。実際に、このループは、ＴＳＳＴ－１トキシンとクラスＩＩのａ１ドメインとの結合と関連付けられており（Ｋａｒｐら、Ｎａｔｕｒｅ ３４６：４７４－４７６，１９９０；Ｋｉｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：１８７０－１８７４，１９９４）、クラスＩＩとインバリアント鎖（Ｉｉ、ＣＤ７４）との間の会合は、ＴＳＳＴとクラスＩＩとの結合を妨げる（Ｋａｒｐら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：９６５７－９６６１，１９９２）ことから、潜在的な共有エピトープまたは重複エピトープが示唆される。本発明者らは、タンパク質－タンパク質ドッキングアルゴリズムを使用して、ＣＤ７４とＤＲα１－ｈＭＯＧ－３５－５５との間の境界面の存在を予測し（Ｍｅｚａ－Ｒｏｍｅｒｏら、Ｍｅｔａｂ．Ｂｒａｉｎ Ｄｉｓ．３１：２４９－２５５，２０１６；Ｗｉｎｇｅｒｃｈｕｋら、Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．８９：２２５－２４０，２０１４）、その構築物におけるアミノ酸残基Ｆ４８、Ｌ５０、Ｐ５２、Ｄ５３およびＳ５５（図９ＡにおけるＦ１２、Ｌ１４、Ｐ１６、Ｄ１７およびＳ１９）をこの境界面の重要な構成要素と定義した。ゆえに、本発明者らは、ＤＲα１－ｈＭＯＧ－３５－５５およびＤＲα１－ｍＭＯＧ－３５－５５にＱ変異を導入して、それぞれＤＲｈＱおよびＤＲｍＱバリアントを作製した。免疫学的観点および生物物理学的観点からは、これらの新規変異体は、それらの親分子と区別がつかない。両方のタンパク質が、Ｆａｂ Ｇ４に対して同じレベルおよび同じ質の交差反応を示すことから、そのエピトープが、構造的に改変されていないことが示唆される（図３Ａ）。同様に、両方の構築物が、円偏光二色性分光法による同一のプロファイルを示すことから、その二次構造が、変異体ＤＲｈＱ（図３Ｂ）およびＤＲｍＱ（図示せず）において保存されていることが示唆される。

【0111】

先の実験的研究は、ＤＲα１－ＭＯＧ－３５－５５（Ｂｅｎｅｄｅｋら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：１３０９－１３２１，２０１３）に加えて、ＲＴＬ１０００も、ＣＤ７４に結合することおよびＣＤ７４へのＭＩＦの結合を阻止することができることを示唆した（Ｂｅｎｅｄｅｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１４：Ｅ８４２１－Ｅ８４２９，２０１７）。ＤＲα１ドメインアミノ酸配列にわたる重複ペプチドのセットを使用することによって、ドッキングアルゴリズムによって予測されたように（Ｍｅｚａ－Ｒｏｍｅｒｏら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ８８：６２－７０，２０１６；Ｍｅｚａ－Ｒｏｍｅｒｏら、Ｍｅｔａｂ．Ｂｒａｉｎ Ｄｉｓ．３１：２４９－２５５，２０１６）、主要な結合部位が、ＤＲα１ドメインのＮ末端に絞り込まれた（図４Ａおよび４Ｂ）。これらすべてのアミノ酸残基が、免疫沈降マウスＣＤ７４およびＦａｂ Ｇ４に結合すると示されたＰ２ペプチドのコアを構成する（図５Ａ）。さらに、ＤＲα１－ｈＭＯＧ－３５－５５は、免疫精製されたマウスＣＤ７４への結合についてＰ２ペプチドに打ち勝った（図５Ｃ）ことから、両方のリガンドが、同じ領域においてレセプターに結合することが示唆される。いくつかのマウスおよびヒトＭＨＣクラスＩＩ分子の結晶構造の綿密な調査は、これらの残基が、α１ドメインのＮ末端におけるβ１ストランドとβ２ストランドとの間のループに位置することを示した。本発明者らのドッキングモデルによると、このループ内の残基が、ＣＤ７４上の残基と近接して接触する（図９Ａ）。

【0112】

本発明者らはまた、組換えバージョンのヒトＣＤ７４へのこの新規バリアントの結合についてこのバリアントを試験し、また、ＭＩＦがレセプターに結合するのを防ぐ活性またはレセプターに結合することについてＭＩＦに打ち勝つ活性を試験した。本発明者らの結果は、Ｑを有するバリアントが、親分子とはかなり異なって、直接結合ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＣＤ７４に対して８～１０倍高い親和性のＫ_Ｄを示したことを示唆することから、この位置のＱが、その相互作用に良い影響を与えたことが示唆される（図６Ａ、表２）。したがって、ＤＲｈＱは、ＣＤ７４レセプターへの結合についてＭＩＦより高い競合活性を示し、ＩＣ_５０が８～１０倍高かった（図６Ｂ、表２）。直接結合および競合実験によって評価されたこのより高い親和性は、実験動物におけるＥＡＥを処置する薬物の効力に反映された。図７Ａおよび７Ｂに示されているように、このレベルの疾患重症度の場合はＤＲα１－ｈＭＯＧ－３５－５５による処置効果がなかったことに比べて、これらの構築物は、マウスの疾患スコアを有意に低下させることができた。これらの実験から、ＥＡＥマウスから収集された脾細胞が、炎症過程に関連する継続中の活性なシグナル伝達カスケードを示唆するアップレギュレートされたレベルのｐ－ＥＲＫ１／２を示したこと、およびこのＥＲＫ１／２のリン酸化が、インビトロにおけるＤＲｈＱ処置によってダウンレギュレートされ得ることが実証された（図８）。

【0113】

本開示の原理が適用され得る多くの考えられる実施形態を考慮すると、例証された実施形態は、単なる例であって本発明の範囲を限定すると解釈されるべきでないと認識されるべきである。むしろ、本発明の範囲は、以下の請求項によって定義される。ゆえに、本発明者らは、これらの請求項の範囲および趣旨の範囲内に入るすべてを本発明者らの発明であると主張する。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
配列番号１のアミノ酸位置１４に対応する位置にグルタミン残基を含むＤＲα１ドメインを含む、組換えポリペプチド。
（項目２）
前記ＤＲα１ドメインが、ヒトＤＲα１ドメインである、項目２に記載の組換えポリペプチド。
（項目３）
配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目１または項目２に記載の組換えポリペプチド。
（項目４）
配列番号１のアミノ酸配列を含む、項目３に記載の組換えポリペプチド。
（項目５）
配列番号１のアミノ酸配列からなる、項目４に記載の組換えポリペプチド。
（項目６）
抗原ペプチドをさらに含む、項目１に記載の組換えポリペプチド。
（項目７）
リンカーをさらに含む、項目６に記載の組換えポリペプチド。
（項目８）
前記リンカーが、ペプチドリンカーまたは化学架橋剤を含む、項目７に記載の組換えポリペプチド。
（項目９）
前記リンカーが、第１のグリシン－セリンスペーサー、トロンビン切断部位および第２のグリシン－セリンスペーサーを含む、項目７に記載の組換えポリペプチド。
（項目１０）
前記抗原ペプチドが、ＭＯＧ－３５－５５である、項目６～９のいずれか１項に記載の組換えポリペプチド。
（項目１１）
前記ＭＯＧ－３５－５５が、ヒトＭＯＧ－３５－５５またはマウスＭＯＧ－３５－５５である、項目１０に記載の組換えポリペプチド。
（項目１２）
前記組換えポリペプチドが、配列番号２もしくは配列番号３を含むか、または配列番号２もしくは配列番号３からなる、項目１０に記載の組換えポリペプチド。
（項目１３）
項目１～１２のいずれか１項に記載の組換えポリペプチドをコードする、核酸分子。
（項目１４）
項目１３に記載の核酸を含む、発現構築物。
（項目１５）
項目１４に記載の発現構築物を含む、細胞株。
（項目１６）
有効量の項目１～１２のいずれか１項に記載の組換えポリペプチドまたは項目１３に記載の核酸分子；および
薬学的に許容され得るキャリア
を含む、医薬組成物。
（項目１７）
前記組成物が、少なくとも５ｍｇ／ｋｇの前記組換えポリペプチドを含む、項目１６に記載の医薬組成物。
（項目１８）
炎症性障害を処置する方法であって、有効量の項目１６または項目１７に記載の医薬組成物を、前記炎症性障害を有する被験体に投与する工程を含む、方法。
（項目１９）
前記炎症性障害が、多発性硬化症または実験的自己免疫性脳症（ＥＡＥ）である、項目１８に記載の方法。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図9】

【配列表】

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