(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-06-28
(45)【発行日】2024-07-08
(54)【発明の名称】ｍＲＮＡ送達用キャリアおよびこれを含む組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 31/7105 20060101AFI20240701BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240701BHJP
A61K 9/10 20060101ALI20240701BHJP
A61K 47/34 20170101ALI20240701BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240701BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20240701BHJP
【ＦＩ】
A61K31/7105
A61K48/00
A61K9/10
A61K47/34
A61P43/00 111
C12N15/11 Z ZNA
【請求項の数】
6
(21)【出願番号】P 2020538474
(86)(22)【出願日】2019-08-23
(86)【国際出願番号】 JP2019032943
(87)【国際公開番号】W WO2020040272
(87)【国際公開日】2020-02-27
【審査請求日】2022-08-02
(31)【優先権主張番号】P 2018156804
(32)【優先日】2018-08-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成３０年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、研究成果展開事業センター・オブ・イノベーション（ＣＯＩ）プログラム、ＣＯＩ拠点「スマートライフケア社会への変革を先導するものづくりオープンイノベーション拠点」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(73)【特許権者】
【識別番号】514299594
【氏名又は名称】公益財団法人川崎市産業振興財団
(74)【代理人】
【識別番号】100149076
【弁理士】
【氏名又は名称】梅田 慎介
(74)【代理人】
【識別番号】100173185
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 裕
(72)【発明者】
【氏名】片岡 一則
(72)【発明者】
【氏名】ディリサラ アンジャネユル
(72)【発明者】
【氏名】内田 智士
【審査官】六笠 紀子
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１８－０３０９３２（ＪＰ，Ａ）
【文献】Biomaterials，2014年，Vol.35, No.27，pp.7887-7895
【文献】Drug Delivery System，2016年，Vol.31,No.4，pp.283-292
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３１／３３－３３／４４
Ａ６１Ｋ ９／００－９／７２
Ａ６１Ｋ ４７／００－４７／６９
Ａ６１Ｋ ４８／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
非電荷親水性ポリマーブロックと、－（ＣＨ2）n－ＮＨ2｛ｎは、２～５の自然数｝を側鎖に有するアミノ酸を単量体単位として含む重合体とのブロック共重合体とｍＲＮＡとのポリプレックスミセルであって、非電荷親水性ポリマーブロックは、ポリオキサゾリンブロックもしくはポリエチレングリコールブロックを含むか、またはポリエチレングリコールブロックとポリオキサゾリンブロックを含み、
前記－（ＣＨ2）n－ＮＨ2｛ｎは、２～５の自然数｝の一部または全部が１－アミジン－３－メルカプトプロリル基となるよう修飾され、
前記１－アミジン－３－メルカプトプロリル基がブロック共重合体分子間でジスルフィド結合による架橋を形成してポリプレックスミセルを安定化しており、
前記ブロック共重合体が側鎖に有する－（ＣＨ2）n－ＮＨ2｛ｎは、２～５の自然数｝とｍＲＮＡとは複合体を形成している、
ポリプレックスミセル。
【請求項2】
－（ＣＨ2）n－ＮＨ2｛ｎは、２～５の自然数｝を側鎖に有するアミノ酸が、オルニチン若しくはリジンまたはその両方である、請求項１に記載のｍＲＮＡとのポリプレックスミセル。
【請求項3】
共重合体が、側鎖のアミノ基の１０～４０％が１－アミジン－３－メルカプトプロリル基となるよう修飾された共重合体である、請求項１または２に記載のポリプレックスミセル。
【請求項4】
共重合体が、側鎖のアミノ基の２０～３０％が１－アミジン－３－メルカプトプロリル基となるよう修飾された共重合体である、請求項１～３のいずれか一項に記載のポリプレックスミセル。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか一項に記載のポリプレックスミセルと薬学上許容可能な賦形剤を含む、組成物。
【請求項6】
請求項１～４のいずれか一項に記載のポリプレックスミセルを調製することに用いるための、非電荷親水性ポリマーブロックとリジンおよび／またはオルニチン側鎖のアミノ基の一部または全部が１－アミジン－３－メルカプトプロリル基となるように修飾されたポリリジンおよび／またはポリオルニチンとのブロック共重合体を含み、非電荷親水性ポリマーブロックは、ポリオキサゾリンブロックもしくはポリエチレングリコールブロックを含むか、またはポリエチレングリコールブロックとポリオキサゾリンブロックを含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ｍＲＮＡ送達用キャリアおよびこれを含む組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
核酸の体内への送達技術は、不足したタンパク質の補充等を目的として盛んに研究開発が行われている。中でも、ポリエチレングリコールとポリカチオンとの共重合体とＤＮＡまたはｓｉＲＮＡとでミセルを形成させると、ミセル内でこれらの核酸が安定化することが明らかにされている。
【0003】
非特許文献１では、プラスミドＤＮＡ（環状ＤＮＡ）の体内への送達において、ポリエチレングリコールとポリカチオンとの共重合体とＤＮＡとのポリプレックスミセルが、ＤＮＡの安定化に寄与するところ、前記ポリカチオンの側鎖にチオール基を導入してミセルを架橋する場合に、側鎖のポリカチオンの電荷を消失させたときと電荷を残したときとで比較し、側鎖のポリカチオンの電荷を消失させた方が、細胞内でプラスミドＤＮＡを放出しやすく、結果としてプラスミドＤＮＡからの遺伝子発現が向上することを明らかにした。
【0004】
また、非特許文献２では、ｓｉＲＮＡの体内への送達において、ポリカチオンの側鎖にチオール基を導入してミセルを架橋する場合に、側鎖のポリカチオンの電荷を消失させたときと電荷を残したときとで比較し、側鎖のポリカチオンの電荷を消失させたときに、血中滞留性が高いことを明らかにした。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【文献】Ｋａｎｊｉｒｏ Ｍｉｙａｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． ＡＭ． ＣＨＥＭ． ＳＯＣ． ２０１４， １２６， ２３５５－２３６１
【文献】Ｃｈｒｉｓｔｉｅ Ｒ． Ｊａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１１， １２， ３１７４－３１８５
【発明の簡単な説明】
【0006】
本発明は、ｍＲＮＡ送達用キャリアおよびこれを含む組成物を提供する。
【0007】
本発明者らは、非電荷親水性ポリマーブロック（例えば、ポリエチレングリコールおよびポリオキサゾリン）とアミノ基の一部または全部が１－アミジン－３－メルカプトプロリル基となるように修飾された－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ２｛ｎは、２～５の自然数｝を側鎖に有するアミノ酸を単量体単位として含む重合体（カチオン性重合体である）とのブロック共重合体とｍＲＮＡとのポリプレックスミセルが、高いヌクレアーゼ耐性を有し、かつ細胞内に取り込まれると高いｍＲＮＡの放出能を発揮すること、および、細胞内でｍＲＮＡがコードするタンパク質を高発現させることができることを見出した。本発明は、このような知見に基づくものである。
【0008】
本発明によれば、例えば、以下の発明が提供され得る。
（１）非電荷親水性ポリマーブロック（例えば、ポリエチレングリコールおよびポリオキサゾリン、例えば、ポリエチレングリコール）とアミノ基の一部または全部が１－アミジン－３－メルカプトプロリル基となるよう修飾された－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ２｛ｎは、２～５の自然数｝を側鎖に有するアミノ酸を単量体単位として含む重合体とのブロック共重合体とｍＲＮＡとのポリプレックスミセル。
（２）－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ２｛ｎは、２～５の自然数｝を側鎖に有するアミノ酸が、オルニチン若しくはリジンまたはその両方である、上記（１）に記載のｍＲＮＡとのポリプレックスミセル。
（３）共重合体が、側鎖のアミノ基の１０～４０％が１－アミジン－３－メルカプトプロリル基となるよう修飾された共重合体である、上記（１）または（２）に記載のポリプレックスミセル。
（４）共重合体が、側鎖のアミノ基の２０～３０％が１－アミジン－３－メルカプトプロリル基となるよう修飾された共重合体である、上記（１）～（３）のいずれかに記載のポリプレックスミセル。
（５）前記メルカプトプロリル基同士が共重合体間でジスルフィド結合によって架橋されている、上記（１）～（４）のいずれかに記載のポリプレックスミセル。
（６）上記（１）～（５）のいずれかに記載のポリプレックスミセルと薬学上許容可能な賦形剤を含む、組成物。
（７）ｍＲＮＡの体内への送達用ポリプレックスミセルを調製することに用いるための、ポリエチレングリコールとリジンおよび／またはオルニチン側鎖のアミノ基の一部または全部が１－アミジン－３－メルカプトプロリル基となるように修飾されたポリリジンおよび／またはポリオルニチンとの共重合体を含む、組成物。
（１）非電荷親水性ポリマーブロック（例えば、ポリエチレングリコールおよびポリオキサゾリン、例えば、ポリエチレングリコール）とアミノ基の一部または全部が１－アミジン－３－メルカプトプロリル基となるよう修飾された－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ２｛ｎは、２～５の自然数｝を側鎖に有するアミノ酸を単量体単位として含む重合体とのブロック共重合体とｍＲＮＡとのポリプレックスミセル。
（２）－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ２｛ｎは、２～５の自然数｝を側鎖に有するアミノ酸が、オルニチン若しくはリジンまたはその両方である、上記（１）に記載のｍＲＮＡとのポリプレックスミセル。
（３）共重合体が、側鎖のアミノ基の１０～４０％が１－アミジン－３－メルカプトプロリル基となるよう修飾された共重合体である、上記（１）または（２）に記載のポリプレックスミセル。
（４）共重合体が、側鎖のアミノ基の２０～３０％が１－アミジン－３－メルカプトプロリル基となるよう修飾された共重合体である、上記（１）～（３）のいずれかに記載のポリプレックスミセル。
（５）前記メルカプトプロリル基同士が共重合体間でジスルフィド結合によって架橋されている、上記（１）～（４）のいずれかに記載のポリプレックスミセル。
（６）上記（１）～（５）のいずれかに記載のポリプレックスミセルと薬学上許容可能な賦形剤を含む、組成物。
（７）ｍＲＮＡの体内への送達用ポリプレックスミセルを調製することに用いるための、ポリエチレングリコールとリジンおよび／またはオルニチン側鎖のアミノ基の一部または全部が１－アミジン－３－メルカプトプロリル基となるように修飾されたポリリジンおよび／またはポリオルニチンとの共重合体を含む、組成物。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】図１は、ｍＲＮＡと各種共重合体を用いて作製したポリプレックスミセルにおけるｍＲＮＡの凝集の度合いを示す図である。ｍＲＮＡには、Ｃｙ３またはＣｙ５の標識がなされており、凝集するほど蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）効率が高まる。
【図2】図２は、ｍＲＮＡと各種共重合体を用いて作製したポリプレックスミセルの、ポリアニオンの置換反応に対する耐性を示す図である。図中の四角の枠内にバンドが検出された場合、ポリアニオン置換反応に対してｍＲＮＡを放出してしまったことを示し、ポリアニオンの置換反応に対して感受性であることを意味する。図中の四角の枠内にバンドが検出されない場合には、ポリアニオンの置換反応に対して耐性であることを意味する。
【図4】図４は、ｍＲＮＡと各種共重合体を用いて作製したポリプレックスミセルを細胞内に取り込ませた後のｍＲＮＡからのガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）の発現の相対蛍光量の経時変化を示す図である。図４の下パネルは、４８時間後の相対蛍光量を棒グラフで示す図である。
【発明の具体的な説明】
【0010】
本明細書では、「対象」とは、哺乳動物、特にヒトであり得る。
【0011】
本明細書では、「キャリア」とは、薬物を体内の組織に送達することに用いるための材料を意味する。キャリアは、例えば、ミセルである。
【0012】
本明細書では、「ポリプレックスミセル」は、カチオン性ポリマーおよびアニオン性ポリマー（例えば、核酸）を含むポリマー複合体によるミセルを意味する。特に非電荷親水性ポリマーブロック（例えば、ポリエチレングリコールおよびポリオキサゾリン、例えば、ポリエチレングリコール）とカチオン性ポリマーブロックとの共重合体と核酸とのポリマー複合体によって形成されたミセルは、表面が非電荷親水性ポリマーブロック（例えば、ポリエチレングリコールおよびポリオキサゾリン、例えば、ポリエチレングリコール）で被覆されたミセルの形態であると考えられる。「非電荷親水性ポリマーブロック」とは、室温の生理食塩水中で、および体内の血中で、非電荷であり、かつ親水性であるポリマーブロックを意味する。非電荷とは、非イオン性を意味する。
【0013】
本明細書では、「ｍＲＮＡ」とは、メッセンジャーＲＮＡを意味する。ｍＲＮＡは、タンパク質をコードする核酸として知られ、翻訳されることにより、迅速なタンパク質合成の鋳型となり得る。しかし、ｍＲＮＡは、生体中で不安定であることで知られ、血中では裸の状態では、安定的に存在し得ない。
【0014】
本明細書では、「裸のｍＲＮＡ」とは、ポリプレックスミセルを形成したｍＲＮＡ（ポリプレックスミセルに内包されたｍＲＮＡとも表現する）との対比において、ポリプレックスミセルを形成していないという意味で遊離形態のｍＲＮＡをいう。ｍＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡであり、細胞質でリボソームと結合し、ｍＲＮＡがコードする遺伝情報に対応するアミノ酸配列を有するタンパク質が合成される。ｍＲＮＡとしては、単一のタンパク質をコードするモノシストロニックなｍＲＮＡと複数のタンパク質をコードするポリシストロニックなｍＲＮＡが挙げられる。ｍＲＮＡは、一般的に、５’末端のキャップ構造と３’末端のポリ（Ａ）鎖を有する。本明細書では、「成熟ｍＲＮＡ」とは、スプライシングや修飾などのプロセッシングを受けてタンパク質合成に適した形態となったｍＲＮＡを意味するが、人工的に合成したｍＲＮＡ（例えば、ｃＤＮＡから合成されたｍＲＮＡ）を含む意味で用いられる。
【0015】
本明細書では、１－アミジン－３－メルカプトプロリル基となるよう修飾された－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ２｛ｎは、２～５の自然数｝とは、下記化学式：
｛式中、ｎは、２～５の自然数｝により示される基を意味する。本明細書では、１－アミジン－３－メルカプトプロリル基となるように修飾されたポリリジンおよびポリオルニチンとは、側鎖が上記化学式により表される側鎖を有する｛式中、ｎがそれぞれ３および４である｝。
【化1】
【0016】
本発明者らは、非電荷親水性ポリマーブロック（例えば、ポリエチレングリコールおよびポリオキサゾリン、例えば、ポリエチレングリコール）とアミノ基の一部または全部が１－アミジン－３－メルカプトプロリル基となるよう修飾された－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ２｛ｎは、２～５の自然数｝を側鎖に有するアミノ酸を単量体単位として含む重合体（カチオン性重合体、特にペプチドである）とのブロック共重合体とｍＲＮＡとのポリプレックスミセルが、高いヌクレアーゼ耐性を有することを見出した。
【0017】
従って、本発明では、非電荷親水性ポリマーブロック（例えば、ポリエチレングリコールおよびポリオキサゾリン、例えば、ポリエチレングリコール）とアミノ基の一部または全部が１－アミジン－３－メルカプトプロリル基となるよう修飾された－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ２｛ｎは、２～５の自然数｝を側鎖に有するアミノ酸を単量体単位として含む重合体とのブロック共重合体とｍＲＮＡとのポリプレックスミセルが提供される。ここで、１－アミジン－３－メルカプトプロリル基となるよう修飾された－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ２｛ｎは、２～５の自然数｝基は、－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ－Ｃ（ＮＨ）－ＣＨ２－ＣＨ２－ＳＨ｛ｎは、２～５の自然数｝で表される基である。
【0018】
ある態様では、修飾または非修飾の－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ２｛ｎは、２～５の自然数｝を側鎖に有するアミノ酸を単量体単位として含む重合体は、リジン若しくはオルニチンまたはその両方を単量体単位として含む重合体であり得る。この態様において、上記ペプチドの単量体単位の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上が、リジン若しくはオルニチンまたはその両方からなる。ある好ましい態様では、上記ペプチドの単量体単位は、リジン若しくはオルニチンまたはその両方からなる。
【0019】
本発明のある好ましい態様では、非電荷親水性ポリマーブロック（例えば、ポリエチレングリコールおよびポリオキサゾリン、例えば、ポリエチレングリコール）とリジン側鎖のアミノ基の一部または全部が１－アミジン－３－メルカプトプロリル基となるよう修飾されたペプチドとの共重合体（以下、「ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ）」ということがある）と、ｍＲＮＡとのポリプレックスミセルが提供される。
【0020】
本発明の好ましい態様では、本発明のポリプレックスミセルでは、共重合体が有するメルカプト基同士がジスルフィド結合によって架橋されている（すなわち、本発明のポリプレックスミセルは、共重合体間で形成されるジスルフィド結合を含む）。このような架橋は本発明のポリプレックスミセルと還元剤とを接触させることによって達成され得る。本明細書では、メルカプト基同士がジスルフィド結合によって架橋されたポリプレックスミセルを「架橋型ポリプレックスミセル」ということがある。
【0021】
１－アミジン－３－メルカプトプロリル基修飾は、前記ブロック共重合体の側鎖のアミノ基の一部または全部が有し得る。
【0022】
ある態様では、非電荷親水性ポリマーブロックは、エチレングリコール、エチルオキサゾリン、およびプロピルオキサゾリンからなる群から選択される１種以上の単量体単位を含むポリマーのブロックであり得る。ある態様では、非電荷親水性ポリマーブロックは、ポリエチレングリコールである。ある態様では、非電荷親水性ポリマーブロックは、ポリオキサゾリンブロックである。ある態様では、非電荷親水性ポリマーブロックは、ポリエチレングリコールブロックとポリオキサゾリンブロックを含む。
ある態様では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ブロックは、重量平均分子量（Ｍｗ）において、例えば、１ｋＤａ～２０ｋＤａ、例えば、１．５ｋＤａ～１５ｋＤａのＰＥＧであり得る。ある態様では、ポリオキサゾリンブロックは、オキサゾリン、例えば、エチルオキサゾリンおよびプロピルオキサゾリンからなる群から選択される１種以上のオキサゾリンを単量体単位として含む重合体であり得る。この態様では、ポリオキサゾリンブロックは、重量平均分子量（Ｍｗ）において、例えば、１ｋＤａ～５０ｋＤａ、例えば、５ｋＤａ～４０ｋＤａ、例えば、１０ｋＤａ～３０ｋＤａであり得る。ある態様では、ポリオキサゾリンブロックは、ポリエチルオキサゾリンブロックを含む。ある態様では、ポリオキサゾリンブロックは、ポリプロピルオキサゾリンブロックを含む。ある態様では、ポリオキサゾリンブロックは、ポリエチルオキサゾリンブロックとポリプロピルオキサゾリンブロックとを含む。
ある態様では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ブロックは、重量平均分子量（Ｍｗ）において、例えば、１ｋＤａ～２０ｋＤａ、例えば、１．５ｋＤａ～１５ｋＤａのＰＥＧであり得る。ある態様では、ポリオキサゾリンブロックは、オキサゾリン、例えば、エチルオキサゾリンおよびプロピルオキサゾリンからなる群から選択される１種以上のオキサゾリンを単量体単位として含む重合体であり得る。この態様では、ポリオキサゾリンブロックは、重量平均分子量（Ｍｗ）において、例えば、１ｋＤａ～５０ｋＤａ、例えば、５ｋＤａ～４０ｋＤａ、例えば、１０ｋＤａ～３０ｋＤａであり得る。ある態様では、ポリオキサゾリンブロックは、ポリエチルオキサゾリンブロックを含む。ある態様では、ポリオキサゾリンブロックは、ポリプロピルオキサゾリンブロックを含む。ある態様では、ポリオキサゾリンブロックは、ポリエチルオキサゾリンブロックとポリプロピルオキサゾリンブロックとを含む。
【0023】
ある態様では、修飾または非修飾の－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ２｛ｎは、２～５の自然数｝を側鎖に有するアミノ酸を単量体単位として含む重合体は、例えば、重合度１０～１００であり得、例えば、重合度５０～１００であり得、例えば、６０～９０であり得る。
【0024】
ある態様では、側鎖のアミノ基の一部または全部が１－アミジン－３－メルカプトプロリル基となるように修飾された－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ２｛ｎは、２～５の自然数｝を側鎖に有するアミノ酸を単量体単位として含む重合体は、例えば、アミノ基の１％～１００％、１０％～５０％、１５％～４５％、２０％～４０％、１５％～３０％、１０％～４０％、または２０％～３０％が１－アミジン－３－メルカプトプロリル基となるよう修飾されている。
【0025】
ある態様では、ｎは３または４であり得る。すなわち、ある態様では、ポリプレックスミセルは、非電荷親水性ポリマーブロック（例えば、ポリエチレングリコールおよびポリオキサゾリン、例えば、ポリエチレングリコール）と、リジン若しくはオルニチンまたはその両方を単量体単位とするペプチドであって、アミノ基の一部または全部が１－アミジン－３－メルカプトプロリル基となるように修飾されたペプチドとの共重合体とｍＲＮＡとを含む、ポリプレックスミセルであり得る。ある態様では、ポリプレックスミセルは、非電荷親水性ポリマーブロック（例えば、ポリエチレングリコールおよびポリオキサゾリン、例えば、ポリエチレングリコール）と、アミノ基の一部または全部が１－アミジン－３－メルカプトプロリル基となるように修飾されたポリリジンまたはポリオルニチンとの共重合体とｍＲＮＡとを含む、ポリプレックスミセルであり得る。ポリプレックスミセルは、非電荷親水性ポリマーブロック（例えば、ポリエチレングリコールおよびポリオキサゾリン、例えば、ポリエチレングリコール）と、アミノ基の一部または全部が１－アミジン－３－メルカプトプロリル基となるよう修飾されたポリリジンとの共重合体とｍＲＮＡとを含む、ポリプレックスミセルであり得る。
【0026】
ある態様では、ポリプレックスミセルは、非電荷親水性ポリマーブロック（例えば、ポリエチレングリコールおよびポリオキサゾリン、例えば、ポリエチレングリコール）と、リジン若しくはオルニチンまたはその両方を単量体単位とするペプチドであって、アミノ基の一部または全部が１－アミジン－３－メルカプトプロリル基となるよう修飾されたペプチドとの共重合体とｍＲＮＡとを含む、ポリプレックスミセルであり、かつ、
ＰＥＧは、１ｋＤａ～２０ｋＤａの重量平均分子量を有し、
ペプチドは、例えば、６０～９０の重合度を有し、
単量体単位の１０％～４０％が、１－アミジン－３－メルカプトプロリル基により置換されている、
ポリプレックスミセルであり得る。
ＰＥＧは、１ｋＤａ～２０ｋＤａの重量平均分子量を有し、
ペプチドは、例えば、６０～９０の重合度を有し、
単量体単位の１０％～４０％が、１－アミジン－３－メルカプトプロリル基により置換されている、
ポリプレックスミセルであり得る。
【0027】
単量体単位の１－アミジン－３－メルカプトプロリル基の保有率は、例えば、ＰＥＧ－ＰＬｙｓのアミノ基の数に対して添加する３，３’－ジチオビスプロピオンイミダート（ＤＴＢＰ）の量を調整すること等によって当業者であれば適宜調整することができる。
【0028】
本発明のある態様では、ポリエチレングリコールとアミノ基の一部または全部が１－アミジン－３－メルカプトプロリル基となるように修飾された－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ２｛ｎは、２～５の自然数｝を側鎖に有するアミノ酸を単量体単位として含む重合体とのブロック共重合体は、以下式（Ｉ）：
｛式中、
ｍは、５～２０，０００のいずれかの自然数であり得、
ｐは、１０～１００のいずれかの自然数であり得、５０～１００のいずれかの自然数であり得、または６０～９０のいずれかの自然数であり得、
ｎは、２～５のいずれかの自然数であり得、
ｙ／（ｘ＋ｙ）は、０．０１～１、０．１～０．５、０．１５～０．４５、０．２～０．４、０．１５～０．３、０．１～０．４、または０．２～０．３であり得、ｘ＋ｙは、ｐである。｝で示される化合物であり得る。本発明では、このような化合物も提供される。本発明では、このような化合物とｍＲＮＡとを含むポリプレックスミセル、およびこれを含む組成物が提供される。
【化2】
ｍは、５～２０，０００のいずれかの自然数であり得、
ｐは、１０～１００のいずれかの自然数であり得、５０～１００のいずれかの自然数であり得、または６０～９０のいずれかの自然数であり得、
ｎは、２～５のいずれかの自然数であり得、
ｙ／（ｘ＋ｙ）は、０．０１～１、０．１～０．５、０．１５～０．４５、０．２～０．４、０．１５～０．３、０．１～０．４、または０．２～０．３であり得、ｘ＋ｙは、ｐである。｝で示される化合物であり得る。本発明では、このような化合物も提供される。本発明では、このような化合物とｍＲＮＡとを含むポリプレックスミセル、およびこれを含む組成物が提供される。
【0029】
本発明のある態様では、ポリオキサゾリンとアミノ基の一部または全部が１－アミジン－３－メルカプトプロリル基となるように修飾された－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ２｛ｎは、２～５の自然数｝を側鎖に有するアミノ酸を単量体単位として含む重合体とのブロック共重合体が提供され得る。本発明では、このような化合物とｍＲＮＡとを含むポリプレックスミセル、およびこれを含む組成物が提供される。
【0030】
本発明の組成物は、本発明のポリプレックスミセルを含む。本発明の組成物は、本発明のポリプレックスミセルと薬学上許容可能な賦形剤とを含んでいてもよい。賦形剤としては、例えば、等張剤、および緩衝剤が挙げられる。本発明の組成物は、注射剤の形態であり得る。本発明の組成物は、静脈内投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、心室内投与、または脳室内投与のために製剤化され得る。
【0031】
本発明によれば、非電荷親水性ポリマーブロック（例えば、ポリエチレングリコールおよびポリオキサゾリン、例えば、ポリエチレングリコール）とアミノ基の一部または全部が１－アミジン－３－メルカプトプロリル基となるよう修飾された－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ２｛ｎは、２～５の自然数｝を側鎖に有するアミノ酸を単量体単位として含む重合体とのブロック共重合体の、ｍＲＮＡを含むポリプレックスミセルの調製における使用が提供される。
本発明によれば、非電荷親水性ポリマーブロック（例えば、ポリエチレングリコールおよびポリオキサゾリン、例えば、ポリエチレングリコール）とアミノ基の一部または全部が１－アミジン－３－メルカプトプロリル基となるよう修飾された－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ２｛ｎは、２～５の自然数｝を側鎖に有するアミノ酸を単量体単位として含む重合体とのブロック共重合体の、ｍＲＮＡを含むポリプレックスミセルを含む組成物の調製における使用が提供される。
本発明によれば、非電荷親水性ポリマーブロック（例えば、ポリエチレングリコールおよびポリオキサゾリン、例えば、ポリエチレングリコール）とアミノ基の一部または全部が１－アミジン－３－メルカプトプロリル基となるよう修飾された－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ２｛ｎは、２～５の自然数｝を側鎖に有するアミノ酸を単量体単位として含む重合体とのブロック共重合体の、ｍＲＮＡを含むポリプレックスミセルを含む組成物の調製における使用が提供される。
【0032】
本発明によれば、タンパク質をコードするｍＲＮＡを細胞内に送達する方法であって、
ポリエチレングリコールとアミノ基の一部または全部が１－アミジン－３－メルカプトプロリル基となるよう修飾された－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ２｛ｎは、２～５の自然数｝を側鎖に有するアミノ酸を単量体単位として含む重合体とのブロック共重合体と、前記ｍＲＮＡとのポリプレックスミセルを、細胞と接触させることを含む、方法が提供される。
ポリエチレングリコールとアミノ基の一部または全部が１－アミジン－３－メルカプトプロリル基となるよう修飾された－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ２｛ｎは、２～５の自然数｝を側鎖に有するアミノ酸を単量体単位として含む重合体とのブロック共重合体と、前記ｍＲＮＡとのポリプレックスミセルを、細胞と接触させることを含む、方法が提供される。
【0033】
本発明によれば、タンパク質をコードするｍＲＮＡを細胞内で発現させる方法であって、
非電荷親水性ポリマーブロック（例えば、ポリエチレングリコールおよびポリオキサゾリン、例えば、ポリエチレングリコール）とアミノ基の一部または全部が１－アミジン－３－メルカプトプロリル基となるよう修飾された－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ２｛ｎは、２～５の自然数｝を側鎖に有するアミノ酸を単量体単位として含む重合体とのブロック共重合体と、前記ｍＲＮＡとのポリプレックスミセルを、細胞と接触させることを含む、方法が提供される。
非電荷親水性ポリマーブロック（例えば、ポリエチレングリコールおよびポリオキサゾリン、例えば、ポリエチレングリコール）とアミノ基の一部または全部が１－アミジン－３－メルカプトプロリル基となるよう修飾された－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ２｛ｎは、２～５の自然数｝を側鎖に有するアミノ酸を単量体単位として含む重合体とのブロック共重合体と、前記ｍＲＮＡとのポリプレックスミセルを、細胞と接触させることを含む、方法が提供される。
【0034】
本発明によれば、タンパク質をコードするｍＲＮＡをそれを必要とする対象に投与する方法であって、
非電荷親水性ポリマーブロック（例えば、ポリエチレングリコールおよびポリオキサゾリン、例えば、ポリエチレングリコール）とアミノ基の一部または全部が１－アミジン－３－メルカプトプロリル基となるよう修飾された－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ２｛ｎは、２～５の自然数｝を側鎖に有するアミノ酸を単量体単位として含む重合体とのブロック共重合体と、前記ｍＲＮＡとのポリプレックスミセルを、当該対象に投与することを含む、方法が提供される。
非電荷親水性ポリマーブロック（例えば、ポリエチレングリコールおよびポリオキサゾリン、例えば、ポリエチレングリコール）とアミノ基の一部または全部が１－アミジン－３－メルカプトプロリル基となるよう修飾された－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ２｛ｎは、２～５の自然数｝を側鎖に有するアミノ酸を単量体単位として含む重合体とのブロック共重合体と、前記ｍＲＮＡとのポリプレックスミセルを、当該対象に投与することを含む、方法が提供される。
【0035】
本発明によれば、タンパク質をそれを必要とする対象の体内で発現させる方法であって、
ポリエチレングリコールとアミノ基の一部または全部が１－アミジン－３－メルカプトプロリル基となるよう修飾された－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ２｛ｎは、２～５の自然数｝を側鎖に有するアミノ酸を単量体単位として含む重合体とのブロック共重合体と、当該タンパク質をコードするｍＲＮＡとのポリプレックスミセルを、当該対象に投与することを含む、方法が提供される。
ポリエチレングリコールとアミノ基の一部または全部が１－アミジン－３－メルカプトプロリル基となるよう修飾された－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ２｛ｎは、２～５の自然数｝を側鎖に有するアミノ酸を単量体単位として含む重合体とのブロック共重合体と、当該タンパク質をコードするｍＲＮＡとのポリプレックスミセルを、当該対象に投与することを含む、方法が提供される。
【0036】
本発明では、これらの方法に用いるための組成物が提供される。
【0037】
ある態様では、ｍＲＮＡは、有用なタンパク質（例えば、酵素）をコードするｍＲＮＡであり得る。例えば、ｍＲＮＡは、タンパク質補充療法で補充されるタンパク質（例えば、酵素）とすることができる。本発明で用いられ得る有用なタンパク質をコードするｍＲＮＡとしては、レポーター遺伝子、成長因子遺伝子、細胞増殖因子遺伝子、細胞増殖抑制因子遺伝子、細胞死促進因子遺伝子、細胞死抑制因子遺伝子、癌抑制遺伝子、転写因子遺伝子、及びゲノム編集遺伝子又はワクチン抗原遺伝子のｍＲＮＡが挙げられる。レポーター遺伝子としては、例えば、発光タンパク質、及び蛍光タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。成長因子をコードするｍＲＮＡとしては、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ又はＦＧＦ－２）及び肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）をコードするｍＲＮＡが挙げられる。細胞増殖抑制因子をコードするｍＲＮＡとしては、例えば、ｐ２１、ｐ１７、ｐ１６及びｐ５３をコードするｍＲＮＡが挙げられる。細胞死促進因子をコードするｍＲＮＡとしては、例えば、Ｓｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏ、アポトーシス誘導因子（ＡＩＦ）、ＨｔｒＡ２、Ｂａｄ、Ｂｉｍ、Ｂａｘ、ｐ５３、カスパーゼ１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０（例えば、カスパーゼ２、３、６、７、８、９及び１０、好ましくはカスパーゼ３、６及び７）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）並びにＦｏｘＯ１をコードするｍＲＮＡが挙げられる。細胞死抑制因子をコードするｍＲＮＡとしては、例えば、抗アポトーシス因子（例えば、ＦＬＩＰ、Ｍｃｌ－１、Ｘｉａｐ、ｃｒｍＡ、Ｂｃｌ－２及びＢｃｌ－ｘＬ）をコードするｍＲＮＡが挙げられる。癌抑制遺伝子をコードするｍＲＮＡとしては、例えば、ｐ５３、網膜芽細胞腫遺伝子（Ｒｂ）、大腸腺腫症遺伝子（ＡＰＣ）、神経線維腫症１型遺伝子（ＮＦ１）、神経線維腫症２型遺伝子（ＮＦ２）、ＷＴ１、ＶＨＬ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＨＥＫ２、マスピン、ｐ７３、Ｓｍａｄ４、ＭＳＨ２、ＭＬＨ１、ＰＭＳ２、ＤＣＣ、ホスファターゼテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）、ＳＤＨＤ、ｐ１６、ｐ５７Ｋｉｐ２、ＰＴＣ、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＥＸＴ１及びＥＸＴ２をコードするｍＲＮＡが挙げられる。転写因子をコードするｍＲＮＡとしては、例えば、Ｒｕｎｔ関連転写因子１（Ｒｕｎｘ１）、ｐ５３、ｃ－ｆｏｓ、ｃ－Ｊｕｎ、ＣＲＥＢ、Ｃ／ＥＢＰ、ＭｙｏＤ、ｃ－Ｍｙｃ、ｃ－Ｍｙｂ、Ｏｃｔ３／４、ＮＦ－κＢ、ＮＦ－ＡＴ、Ｍｅｆ－２及び細胞外シグナル応答因子（ＳＲＦ）をコードするｍＲＮＡが挙げられる。ゲノム編集遺伝子のｍＲＮＡとしては、例えば、ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＺＮＦ）、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＴＡＬＥＮ）及びｃｌｕｓｔｅｒｅｄ，ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ，ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（Ｃａｓ）９遺伝子のｍＲＮＡが挙げられる。ワクチン抗原遺伝子のｍＲＮＡとしては、例えば、病原体抗原及び腫瘍特異的抗原をコードするｍＲＮＡが挙げられる。また、例えば、ｍＲＮＡは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡとすることができ、これにより、ｍＲＮＡを体内または対外の細胞に送達する効率が高まり、細胞内でのＣａｓ９エンドヌクレアーゼを高発現させ得る。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、２つあるヌクレアーゼドメインの１つが不活性化されたニッカーゼであってもよい。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、２つあるヌクレアーゼドメインの両方共が不活性化されており、かつ、転写活性化ドメインや転写不活性化ドメイン、メチル転移酵素、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）等の他のタンパク質（またはそのドメイン）と連結したものであってもよい。Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを内包するポリプレックスミセルには、標的ＤＮＡに対するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡともいう）（または、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡ）が含まれていてもよい。ｍＲＮＡは、哺乳動物細胞（特にヒト細胞）に適した修飾がなされ、かつ、哺乳動物細胞（特にヒト細胞）に適したコドンを使用したものとすることができる。
【実施例】
【0038】
実施例１：ｍＲＮＡを送達することに用いるためのブロックコポリマーの合成
本実施例では、以下式（Ｉ）で表される化合物：
および
以下式（ＩＩ）で表される化合物：
をそれぞれ合成した（例えば、Ｃｈｒｉｓｔｉｅ Ｒ． Ｊａｍｅｓ ｅｌ ａｔ．， Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１１， １２， ３１７４－３１８５参照）。本実施例では、式（Ｉ）で表される化合物をＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ）ということがあり、式（ＩＩ）で表される化合物をＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＭＰ）ということがある。また、特にリジン残基のアミノ基に対するＡＭＰまたはＭＰの導入比率（％）がｐ％である場合、式（Ｉ）の化合物は、「ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ－ｐ）」または単に「ＡＭＰｐ」と表し、式（ＩＩ）の化合物は、「ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＭＰ－ｐ）」または単に「ＭＰｐ」と表すことがある。
本実施例では、以下式（Ｉ）で表される化合物：
【化3】
以下式（ＩＩ）で表される化合物：
【化4】
【0039】
まず、ＰＥＧ－ＰＬｙｓブロック共重合体のリジン残基に対して、Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）または３，３’－ジチオビスプロピオンイミダート（ＤＴＢＰ）を用いて、様々なチオール化度を有するチオール基を導入した（表１参照）。
【0040】
【表1】
【0041】
ＳＰＤＰの導入に関して、３－（２－ピリジルジチオ）プロピオニル（ＰＤＰ）基をアミド結合を介して共重合体のリジン残基（リジンの側鎖ε－ＮＨ２基と主鎖ω－ＮＨ２基）に導入し、次いで、過剰量のジチオスレイトール（ＤＴＴ）存在下で処理してリジン残基に３－メルカプトプロピオニル（ＭＰ）基を有する共重合体であるＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＭＰ）を調製した。ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＭＰ）の合成スキームはスキームａの通りであった。
【0042】
【化5】
【0043】
ＭＰの導入によって、共重合体のＰＬｙｓ部分のカチオンチャージが減少している。これに対して、カチオンチャージを変化させない方法として、リジンの側鎖ε－ＮＨ２基と主鎖ω－ＮＨ２基のアミド化をＤＴＢＰを用いて行い、チオール基と共にカチオン性アミジン官能基を導入した。得られた共重合体をＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ）と称し、その合成スキームは、スキームｂの通りであった。
【0044】
【化6】
【0045】
実施例２：ｍＲＮＡ内包型ポリプレックスミセルの調製と特性評価
ポリプレックスミセル（ＰＭ）は、各共重合体とｍＲＮＡとを混合して調製した。混合は、Ｎ／Ｐ比が２となるように行った｛ここで、Ｎは、共重合体中のアミノ基およびアミジン基の数の合計であり、Ｐは、ｍＲＮＡ中のリン酸基の数である｝。これにより、内包されるｍＲＮＡと共重合体のチャージ比を異なる共重合体を用いたＰＭ間で一定とした。
ポリプレックスミセル（ＰＭ）は、各共重合体とｍＲＮＡとを混合して調製した。混合は、Ｎ／Ｐ比が２となるように行った｛ここで、Ｎは、共重合体中のアミノ基およびアミジン基の数の合計であり、Ｐは、ｍＲＮＡ中のリン酸基の数である｝。これにより、内包されるｍＲＮＡと共重合体のチャージ比を異なる共重合体を用いたＰＭ間で一定とした。
【0046】
ＰＭの物理化学的な特性評価を水力学的直径（ＤＨ）、多分散度（ＰＤＩ）、およびゼータポテンシャルを測定した（表２参照）。
【0047】
【表2】
【0048】
全てのＰＭは、５０～６５ｎｍのＤＨを有し、０．１０～０．１５の低いＰＤＩを有していた。全てのＰＭはまた、ほぼ中性の表面電荷を示したが、このことは、調製されたＰＭがＰＥＧで覆われていることを示すものである。興味深いことに、ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ）によるＰＭではいずれのＰＭでもチオール化度が上昇するにつれてＤＨが減少した。このことは、ジスルフィド結合による架橋によってＰＭのコア部分へのｍＲＮＡのパッケージングがより強固になることを示唆する。これに対して、ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＭＰ）では、ＤＨの減少は認められず、ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＭＰ－４６）のＤＨは、非架橋ＰＭよりもむしろ大きかった。
【0049】
次に、ｍＲＮＡの濃縮状況を調べるために、蛍光共鳴エネルギー移動法（ＦＲＥＴ）測定をドナー蛍光色素とアクセプター蛍光色素で標識されたｍＲＮＡを用いて確認した。ｍＲＮＡをＣｙ３またはＣｙ５で標識して、ＰＭに搭載してＦＲＥＴ解析を行った。ｍＲＮＡがより強固にパッケージングされると、Ｃｙ３とＣｙ５との距離が近くなるためＦＲＥＴ効率が増加するはずである。ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ）のＰＭでは、非架橋ＰＭと比較してＦＲＥＴ効率の増強が認められたが、ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＭＰ）のＰＭでは、架橋の増加に伴うＦＲＥＴ効率の増強が観察されなかった（図１参照）。これらの結果はＤＬＳ測定と一貫しており、ＳＨ基の導入後にカチオン性チャージが減少していない共重合体によるＰＭでは、架橋によって強固なｍＲＮＡのパッケージングが引き起こされることが示された。
【0050】
次に、架橋によるｍＲＮＡの安定化効果を確認するために、ポリイオン交換反応に対するＰＭの耐性を評価した。デキストラン硫酸（ＤＳ）の添加後のＰＭからのｍＲＮＡの放出をゲル電気泳動で観察した。ＤＳは、Ｓ／Ｐ比１において非架橋ＰＭからのｍＲＮＡの放出を引き起こした｛ここで、Ｓは、ＤＳ中の硫酸基の個数を示し、Ｐは、ｍＲＮＡ中のリン酸基の個数を示す｝。これに対して、ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＭＰ）やＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ）のＰＭではいずれでもＳ／Ｐ比１０においてさえｍＲＮＡの放出に関して耐性であった。Ｓ／Ｐ比１０では、ＰＭは、高密度のアニオン性チャージを有する大量のアニオン性分子に露出していたはずである。これらの結果は、ＰＬｙｓ部分においてカチオン性チャージと引き換えにＳＨ基を導入したＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＭＰ）でさえ、架橋がポリイオン交換反応に対して耐性であるＰＭを提供しうることを示す。すなわち、これらの結果は、大量のアニオン性高分子を含む厳しい生理的環境下においても架橋がＰＭの乖離を防ぐための実用的手段となり得ることを実証した。
【0051】
さらに、得られたＰＭのヌクレアーゼ耐性を確認するために、ｍＲＮＡを含むＰＭをウシ胎児血清（ＦＢＳ）中でインキュベートした後に、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）で評価した。この方法では、プライマーペア間が保護されたｍＲＮＡのみが検出されるため、ヌクレアーゼ等によるｍＲＮＡの分解の程度を検証することができる。結果は図３に示される通りであった。図３に示されるように、非架橋ＰＭにｍＲＮＡを内包させると、裸のｍＲＮＡ（ミセルに内包させていないｍＲＮＡ）と比較して、残存ｍＲＮＡ量を１０，０００倍以上増加させた。このことは、ヌクレアーゼ耐性を改善するＰＭの能力を実証するものである。注目すべきことに、ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ）のＰＭにおいては、わずか１３％のチオール化度の場合でさえ、非架橋ＰＭと比較して４．９倍の残存ｍＲＮＡ量の増加を引き起こした。また、ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ－４７）が非架橋ＰＭと比較して残存ｍＲＮＡ量を９．４倍増加させたことから分かるように、ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ）のＰＭにおけるチオール化度を向上させるとヌクレアーゼ耐性がさらに改善した。これに対して、ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＭＰ）のＰＭにおいては、対応する架橋率のＰＭと比較すると、残存ｍＲＮＡ量は、ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ）よりも有意に少なく、ほどほどのｍＲＮＡの保護効果を示した。これらの結果から、ＰＭにおける共重合体間の架橋は、ｍＲＮＡのヌクレアーゼに対する保護効果を高めるが、共重合体のカチオン性残基を減少させないことでｍＲＮＡのヌクレアーゼに対する保護効果を一層高めることができることが明らかとなった。
【0052】
図２に示されるように本実施例で調製した架橋ＰＭは、いずれもＤＳに対してＳ／Ｐ比１０のときでさえｍＲＮＡを放出することはなかった。一方で、ＦＢＳにはＤＳのような高密度アニオン性チャージを有するアニオン性分子は含まれていない。また、ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＭＰ）では、非架橋ＰＭに対してほどほどのｍＲＮＡ保護効果しか示さなかったが、ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ）では大きなｍＲＮＡ保護効果が示された。このことから、ｍＲＮＡの保護効果は、ｍＲＮＡが強固にパッケージングされていることに起因するものであると考えられ、すなわち、ｍＲＮＡの保護には、ｍＲＮＡのパッケージング状態が重要であると考えられた。図１に示されるように、ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ）のＰＭでは、ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＭＰ）のＰＭや非架橋ＰＭよりも強固なｍＲＮＡのパッケージングが引き起こされていると評価されている。
【0053】
実施例３：培養細胞へのＰＭの導入
培養細胞におけるタンパク質発現の誘導機能についてＰＭを評価した。ＰＭに内包させるｍＲＮＡとしては、分泌型ルシフェラーゼであるガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするｍＲＮＡを用いた。また、培養細胞としては、ヒト肝細胞がん細胞株（ＨｕＨ－７）を用いた。培養細胞へのＰＭの導入では、ＨｕＨ－７細胞を１２ ｗｅｌｌプレートに５０，０００個／ｗｅｌｌ蒔き、１０％ ＦＢＳ， １％ペニシリン／ストレプトマイシンを含む培地で２４時間培養した。その後、培地を新しいものに交換し、ＧＬｕｃ ｍＲＮＡを０．５ μｇ／ｗｅｌｌ含むミセルを添加した。その後、培地を１０ μＬずつ採取し、ＧｌｏＭａｘ（商標） ９６ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ （Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ） とｔｈｅ Ｒｅｎｉｌｌａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を用い、培地に含まれるＧＬｕｃの量を測定した。
培養細胞におけるタンパク質発現の誘導機能についてＰＭを評価した。ＰＭに内包させるｍＲＮＡとしては、分泌型ルシフェラーゼであるガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするｍＲＮＡを用いた。また、培養細胞としては、ヒト肝細胞がん細胞株（ＨｕＨ－７）を用いた。培養細胞へのＰＭの導入では、ＨｕＨ－７細胞を１２ ｗｅｌｌプレートに５０，０００個／ｗｅｌｌ蒔き、１０％ ＦＢＳ， １％ペニシリン／ストレプトマイシンを含む培地で２４時間培養した。その後、培地を新しいものに交換し、ＧＬｕｃ ｍＲＮＡを０．５ μｇ／ｗｅｌｌ含むミセルを添加した。その後、培地を１０ μＬずつ採取し、ＧｌｏＭａｘ（商標） ９６ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ （Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ） とｔｈｅ Ｒｅｎｉｌｌａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を用い、培地に含まれるＧＬｕｃの量を測定した。
【0054】
結果は、図４に示される通りであった。図４に示されるように、ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＭＰ）のＰＭでは、非架橋ＰＭと比較してタンパク質発現向上効果は限定的なものであり、顕著なタンパク質発現向上効果を示すことはなかった。これに対して、ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ）のＰＭでは、ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＭＰ）に対してより高いタンパク質発現向上効果を示したが、特にＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ－２６）において非架橋ＰＭに対して５倍のタンパク質発現向上効果を示した。
【0055】
これらの結果は、非架橋ＰＭおよびＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＭＰ）と比較してＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ）がヌクレアーゼ耐性を増強させていること（図３参照）と一致する結果である。ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ）によってｍＲＮＡをＰＭに内包することにより、ＨｕＨ－７細胞の培地に添加された後に培地中に存在するヌクレアーゼによる分解からｍＲＮＡが効果的に保護され、これにより、効果的なＧＬｕｃ発現を可能としたものと考えられる。また、ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ－４７）においてＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ－２６）で観察された劇的なＧＬｕｃ発現の増強効果が観察されなかったことも重要である。ジスルフィド結合による架橋は、還元環境である細胞内で還元され、これにより細胞内ではＰＭが崩壊してｍＲＮＡが放出されると考えられる。これに対して、ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ－２６）では高いＧＬｕｃ発現が観察され、ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ－４７）ではその発現増強が顕著ではなかったことから、過剰な架橋は、細胞内環境におけるＰＭからのｍＲＮＡの放出を妨げる可能性が示唆された。
【0056】
次に、細胞内環境を模擬する環境下でＰＭからのｍＲＮＡの放出を評価した。細胞内環境は還元的であり、ジスルフィド結合の開裂を引き起こすが、高密度のアニオン性チャージを有するＲＮＡを高濃度で含んでおり、ＰＭを崩壊させてｍＲＮＡの放出を誘発する。細胞内環境を模擬するため、大量の非標識ＲＮＡを含む溶液中で、ＤＴＴ存在下または非存在下でＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ－２６）およびＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ－４７）からのＣｙ５標識ｍＲＮＡの放出量を評価した。結果は、図６に示される通りであった。図６に示されるように、ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ－２６）のＰＭでは、還元環境下でｍＲＮＡの放出が観察されたのに対して、ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ－４７）では、還元環境下でのｍＲＮＡの放出量は少なかった。この結果は、架橋は、細胞内環境でのｍＲＮＡの放出を阻害する効果を有することを示唆するものであり、図４の結果と一貫するものであった。また、ＰＭによる細胞毒性を観察したところ、いずれのＰＭにおいても細胞毒性は観察されなかった（図７参照）。
【0057】
細胞内でのｍＲＮＡの安定性が、ＧＬｕｃ発現におけるＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＭＰ）とＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ）との相違の原因となった可能性が考え得る。そのため、細胞内取込み後のｍＲＮＡの安定性をｑＲＴ－ＰＣＲで評価した。ＨｕＨ－７細胞に非架橋ＰＭ、ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＭＰ－２１）、およびＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ－２６）それぞれを無血清条件下で接触させ、ＨｕＨ－７細胞の細胞内にＰＭを導入し、その後、細胞を洗浄してＰＭを含まない培地に培地を変更することによって細胞内へのＰＭの取込みを停止させた。様々な時点でのｍＲＮＡの残存量をｑＲＴ－ＰＣＲによって定量した。ＰＭの取込みを停止させた直後のｍＲＮＡ量に対する相対的な細胞内のｍＲＮＡの残存量を求め、図５に示した。図５に示されるように、ＰＭの取込みを停止させた１時間後では、非架橋ＰＭ中のｍＲＮＡと比較してＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＭＰ－２１）ＰＭにより細胞内に導入したｍＲＮＡの残存量は２４倍高く、ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ－２６）ではそれよりもさらに３．１倍ｍＲＮＡの残存量が高かった。その後の時点でも同様の傾向が認められた（図５参照）。
【0058】
ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＭＰ－２１）では、ほどほどのｍＲＮＡ保護効果しか示さなかったのに対して（図３参照）、細胞内でのｍＲＮＡの安定性においては顕著な改善が認められた（図５参照）。このため、ポリイオン交換反応に対する高い耐性（図２参照）が、ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＭＰ－２１）による細胞内でのｍＲＮＡを部分的に説明すると考えられた。
【0059】
実施例４：類似する構造を有する共重合体ＰＭとの比較
本実施例では、類似する構造を有する異なる共重合体によるＰＭに内包されたｍＲＮＡの安定性を評価した。具体的には、Ｃｈｒｉｓｔｉｅ Ｒ． Ｊａｍｅｓ ｅｌ ａｔ．， Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１１， １２， ３１７４－３１８５において、ｓｉＲＮＡの安定化に適するとされたＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＩＭ）のＰＭに内包されたｍＲＮＡの安定性を、実施例１～３で試験したＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ）のＰＭと比較した。
本実施例では、類似する構造を有する異なる共重合体によるＰＭに内包されたｍＲＮＡの安定性を評価した。具体的には、Ｃｈｒｉｓｔｉｅ Ｒ． Ｊａｍｅｓ ｅｌ ａｔ．， Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１１， １２， ３１７４－３１８５において、ｓｉＲＮＡの安定化に適するとされたＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＩＭ）のＰＭに内包されたｍＲＮＡの安定性を、実施例１～３で試験したＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ）のＰＭと比較した。
【0060】
ＭｅＯ－ＰＥＧ－ＰＬｙｓのポリリジン部分の側鎖ε－ＮＨ２基と主鎖ω－ＮＨ２基とにＴｒａｕｔ’ｓ試薬（イミノチオラン）を用いて１－アミジン－４－メルカプトブチル（ＡＭＢ）基をコンジュゲートした。ここで、ＭｅＯは、メトキシ基を表し、ＰＥＧは、ポリエチレングリコールを表し、ＰＬｙｓは、ポリリジンを表す。簡単には、ＭｅＯ－ＰＥＧ－ＰＬｙｓブロック共重合体（５０ｍｇ， ２．６μｍｏｌ）を５重量％のＬｉＣｌを含むＮ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）中に溶解させた。Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を重合体溶液（１９４μｌ、ＮＨ２基に対して１０ｍｏｌ過剰）に添加した。次に、ＩＭ（７．１６ ｍｇ， ７１．５ μｍｏｌ）をＮＭＰに溶解させ、ＩＭ溶液を室温で連続的攪拌下で重合体溶液に添加した。４時間後、反応した重合体溶液をジエチルエーテル内で沈殿させ、粉末状の粗生成物を得た。さらに、粗生成物は、ジエチルエーテルを用いて２回洗浄した。沈殿した重合体を０．０１ ＮのＨＣｌ中に溶解させ、０．０１ ＮのＨＣｌに対して１日間透析し、蒸留水に対して更にもう１日透析した。透析した重合体溶液を０．２２μｍのフィルターでろ過し、粉末形態のＭｅＯ－ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＡＭＢ）を得た。ＡＭＢコンジュゲートの程度は、ＩＭの１－アミジン－４－メルカプトブチルプロトン［ＨＳ－（ＣＨ２）３－ＣＮＨ２
＋， δ＝ ２．１－３．４３ ｐｐｍ］に対するβ－、γ－、およびδ－メチレンプロトン［（ＣＨ２）３， δ ＝ １．３－１．９ ｐｐｍ］のピーク強度比によって１Ｈ ＮＭＲスペクトルから決定した。同様の方法を用いて、様々な程度でＡＭＢで置換されたＭｅＯ－ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（すなわち、「ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＩＭ）」）を調製した。
【0061】
非架橋ポリプレックスミセル（非架橋ＰＭ）は、ＰＥＧ（Ｍｗ：１２ｋＤａ）とＰＬｙｓ数７６および２０の重合度を有するＰＥＧ－ＰＬｙｓブロック共重合体から調製した。架橋ポリプレックスミセル（ＣＰＭ）は、様々なチオール化の程度を有するＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＭＰ）、ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＩＭ）、およびＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ）ポリマーから調製した。複合体形成していない裸のガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするｍＲＮＡ、非架橋ＰＭ、ＧＬｕｃ ｍＲＮＡをｍＲＮＡ濃度３３．３μｇ／ｍｌを含むＣＰＭを５０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（大日本住友製薬、大阪、日本）で３７℃で１５分間インキュベートした。ＦＢＳ中に存在するリボヌクレアーゼに対してＰＭ中で保護されたｍＲＮＡをＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ， Ｈｉｌｄｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてその製造者プロトコルに従って抽出した。ＣＰＭにおけるポリリジン間で形成されたジスルフィド架橋を還元してＣＰＭからのｍＲＮＡの放出を促進するために、ＦＢＳ中でインキュベート後のＣＰＭを１００ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含むＲＬＴ緩衝液中で３７℃で１５分間インキュベートした。次に、得られたサンプルに１００μｌのＲＮａｓｅフリーの水を加え、２５０μｌのエタノールを添加してｍＲＮＡを沈殿させた。次いでｍＲＮＡを製造者プロトコルにしたがって抽出した。抽出したｍＲＮＡをＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（商標） ｑＰＣＲ ＲＴ Ｋｉｔ （Ｔｏｙｏｂｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｊａｐａｎ）を用いて逆転写してｃＤＮＡを得た。ｃＤＮＡをＧＬｕｃ特異的プライマーでＰＣＲにより増幅させて、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７５００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いた定量的ＲＴ－ＰＣＲで定量した。用いたプライマー配列は以下の通りであった：
【化7】
【0062】
比較のため、ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＭＰ）、ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＩＭ）、およびＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ）ブロック共重合体から得られたＰＭ試料それぞれに対して、ＦＢＳと接触させ、上記３７℃でのインキュベーションをせずに、ｍＲＮＡの定量を行った。
【0063】
結果は、図８に示される通りであった。図８に示されるように、重合度７６のＰＬｙｓブロックを有するポリマーでは、ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＩＭ）によるｍＲＮＡの保護効果は限定的であり、特にチオール化率２４％では、却ってｍＲＮＡの保護能力を失った。これに対して、ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ－２６）では、ｍＲＮＡの保護能力が顕著に高かった。
また、図９には、重合度２０のＰＬｙｓブロックを有するポリマーで同様の実験を行った場合においても、ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＩＭ）（単に「ＩＭ」と表記することがある）では、ｍＲＮＡの保護能力を消失させたのに対して、ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ）では、ｍＲＮＡの高い保護能力を獲得した。
また、図９には、重合度２０のＰＬｙｓブロックを有するポリマーで同様の実験を行った場合においても、ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＩＭ）（単に「ＩＭ」と表記することがある）では、ｍＲＮＡの保護能力を消失させたのに対して、ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ）では、ｍＲＮＡの高い保護能力を獲得した。
【0064】
本実施例では、ポリオキサゾリン－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ）ブロック共重合体を用いて同様の実験を行った。具体的には、トリブロック共重合体は、非電荷親水性連鎖ポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）（ＰＥｔＯｘ）と温度応答性連鎖ポリ（２－ｎ－プロピル－２－オキサゾリン）からなるブロックセグメントと、カチオン性連鎖ポリリジン（ＰＬｙｓ）を合成し、これらを結合することで作成した。トリブロック共重合体の合成スキームは以下スキーム１～３に示される通りであった。
【0065】
【化8】
【化9】
【化10】
【0066】
より具体的には、トリブロック共重合体の合成では、まずアルキン末端を持つ重合開始剤ｐ－トルエンスルホン酸プロパルギル（６１ ｍｇ， ０．２９ ｍｍｏｌ）をアセトニトリル９ ｍＬとクロロベンゼン９ ｍＬに溶解させ、２－ｎ－プロピル－２－オキサゾリン（ ２．３ ｇ， ２０ ｍｍｏｌ）を加えた。反応溶液を４２℃で６日間反応させた後、２－エチル－２－オキサゾリン（４．３ ｇ， ４４ ｍｍｏｌ）を加えてさらに６日間反応を行った。ここで用いたｐ－トルエンスルホン酸プロパルギルは東京化成より購入し、Ｗａｋｏ社より購入した五酸化ニリンを脱水剤として用いて蒸留精製して使用した。オキサゾリンモノマーは東京化成より購入し、シグマアルドリッチ社より購入したカルシウムハイドライドを脱水材として用いて蒸留精製して使用した。反応溶媒のアセトニトリル、クロロベンゼンはｗａｋｏ社より購入し、それぞれカルシウムハイドライド、五酸化二リンを脱水剤として用いて蒸留精製して使用した。重合反応後、反応溶液を水に対して５回透析し、凍結乾燥することでアルキン末端を持つジブロック共重合体、Ａｌｋｙｎｅ－ＰｎＰｒＯｘ－ＰＥｔＯｘを得た。得られたポリマーは、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ（ＵｌｔｒａＦｌｅｘｔｒｅｍｅ， Ｂｒｕｋｅｒ社）と１Ｈ－ＮＭＲ（ＥＳＣ４００， ＪＥＯＬ）による解析から、ＰｎＰｒＯｘの分子量が７．３ｋ、ＰＥｔＯｘの分子量が１３．７ｋであることが分かった。
【0067】
別途、アジド末端を持つポリリジン（ＰＬｙｓ－Ｎ３）を合成した。これは、シグマアルドリッチ社より購入した１１－アジド－３，６，９－トリオキサウンデカン－１－アミンを開始剤として用い、非特許文献（Ｊ． Ｐｏｌｙｍ． Ｓｃｉ． Ｐａｒｔ Ａ Ｐｏｌｙｍ． Ｃｈｅｍ． ２００３， ４１ １１６７－１１８７）に則りＦｕｃｈｓ－Ｆａｒｔｈｉｎｇ法により合成したＮ－トリフルオロアセチル－Ｌ－リジン Ｎ－カルボキシアンヒドリド（以下、「Ｌｙｓ（ＴＦＡ）－ＮＣＡ」という）を重合させ、その後塩基で処理することで得られる。開始剤（２２ ｍｇ， ０．１０ ｍｍｏｌ）を１Ｍの濃度のチオウレア（以下、「ＴＵ」という）を溶かしたＤＭＦ（以下、「ＤＭＦ（１Ｍ ＴＵ）」という）２ ｍＬに溶解させた。別途Ａｒバック中でＬｙｓ（ＴＦＡ）－ＮＣＡ（１．３５ ｇ， ５．０ ｍｍｏｌ）をフラスコに測りとり、１５ ｍＬのＤＭＦ（１Ｍ ＴＵ）に溶解させた。調製したＬｙｓ（ＴＦＡ）－ＮＣＡ溶液を、Ａｒ雰囲気下で開始剤溶液に加え、２５℃で２日間撹拌して重合反応を行った。反応溶液を水に対して５回透析したのち、凍結乾燥することでＰｏｌｙ（Ｌ－リジン）（ＴＦＡ）（以下、「ＰＬｙｓ（ＴＦＡ）という）を得た。得られたＰＬｙｓ（ＴＦＡ）を５００ ｍｇ測りとり、２５ ｍＬのメタノールに溶解させた。反応後は、０．０１Ｍ ＨＣｌに対して３回透析を行った後、水に対して３回透析を行い、凍結乾燥によりアジド末端を持つポリリジン、ＰＬｙｓ－Ｎ３を回収した。得られたポリマーは、１Ｈ－ＮＭＲ（ＥＳＣ４００， ＪＥＯＬ）による解析から、重合度が５１であることが分かった。
【0068】
続いて、Ａｌｋｙｎｅ－ＰｎＰｒＯｘ－ＰＥｔＯｘとＰＬｙｓ－Ｎ３をクリックケミストリーによりカップリングした。Ａｌｋｙｎｅ－ＰｎＰｒＯｘ－ＰＥｔＯｘ （２１０ ｍｇ， ０．０１ ｍｍｏｌ）を水２ ｍＬに溶解し、１Ｍ のＣｕＳＯ４溶液と１Ｍのアスコルビン酸ナトリウム溶液を２０ μＬずつ加え、撹拌した。別途、ＰＬｙｓ－Ｎ３（３５ ｍｇ， ０．００４４ ｍｍｏｌ）を水１ ｍＬに溶解し、Ａｌｋｙｎｅ－ＰｎＰｒＯｘ－ＰＥｔＯｘ溶液に加え、－２０℃で一晩静置し、４℃で２時間かけて融解させた。生成物は、反応溶液を水に対して５回透析し、凍結乾燥することで回収した。ここでの回収物はトリブロック共重合体の他に、ＰＬｙｓ－Ｎ３を全て反応させるために過剰に加えたＡｌｋｙｎｅ－ＰｎＰｒＯｘ－ＰＥｔＯｘも含まれている。これら二つのジオキサンへの溶解性の違いに着目し、精製作業を行った。回収物をｗａｋｏ社より購入した脱水ジオキサンに分散させて遠心分離により上澄みを取り除く工程を３回行い、ジオキサンへの溶解性が高いＡｌｋｙｎｅ－ＰｎＰｒＯｘ－ＰＥｔＯｘのみを取り除き、溶解性の低いトリブロック共重合体のみを沈殿物として回収した。
【0069】
カップリングの進行や、精製作業後の回収物はＧＥヘルスケア社のカラムＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００を用いたＳＥＣ（ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ， ＧＥ Ｈｅｌｔｈｃｅｒｅ）によって分析した。
【0070】
本トリブロック共重合体の下限臨界共溶温度（ＬＣＳＴ）は約３０℃であった。
【0071】
ＰＥｔＯｘ－ＰｎＰｒＯｘ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ－Ｘ）の合成
これまでに報告した方法［Ｊ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ． ２０１９；２７（５－６）：６７０－６８０］に従い、チオール化の程度が異なる一連のＰＥｔＯｘ－ＰｎＰｒＯｘ－ＰＬｙ（ＡＭＰ－Ｘ）ポリマーを、ホモ二官能性イミドエステル系のチオール化試薬であるＤＴＢＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）を用いてＰＬｙｓセグメントの側鎖ω－ＮＨ２基および主鎖ω－ＮＨ２基に１－アミジン－３－メルカプトプロピル（ＡＭＰ）を導入して合成した。簡単に述べると、ＰＥｔＯｘ－ＰｎＰｒＯｘ－ＰＬｙｓ（１０ｍｇ、０．３５μｍｏｌ）を、室温で１０分間撹拌しながら、１００ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解した。その後、１００ ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ９．０）に新たに溶解したＤＴＢＰ（３．１ ｍｇ、１０．０ μｍｏｌ）を、室温で１時間恒常的に攪拌しながらＰＥｔＯｘ－ＰｎＰｒＯｘ－ＰＬｙｓ溶液に滴下した。その後、ポリマー溶液をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に対して２時間以内に４回透析し、未反応のＤＴＢＰを除去した。透析溶液中のポリマーを室温で１時間ＤＴＴ（１００ｍＭ）処理して、ポリマー内および／またはポリマー間の予め形成されたジスルフィド架橋を切断し、隣接するＡＭＰ基にチオールを含むポリマーを生じた（以下、「ＰＥｔＯｘ－ＰｎＰｒＯｘ－ＰＬｙ（ＡＭＰ）」という）。ＰＥｔＯｘ－ＰｎＰｒＯｘ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ）をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に対して３時間以内に４回透析してＤＴＴを除去し、最後に脱イオン水に対して３時間以内に６回透析してＰＢＳを除去した。ポリマー溶液を濾過し（０．２２μｍフィルター）、凍結乾燥して粉末として得た。１Ｈ ＮＭＲスペクトルから、ＡＭＰ基のメルカプトエチルプロトン［ＨＳ－（ＣＨ２）２、＝ ２．７～２．９ｐｐｍ］に対するリジン単位［（ＣＨ２）３、＝ １．３～１．９ｐｐｍ］のβ－、γ－、およびδ－メチレンプロトンのピーク強度比を計算して、ＡＭＰ導入の程度を２０％と決定した。反応中のＰＬｙｓの－ＮＨ２基に対するＤＴＢＰの供給比の様々な化学量論を変えることにより、様々な段階的な程度のＡＭＰ導入が生じた。ＰＥｔＯｘ－ＰｎＰｒＯｘ－ＰＬｙｓのＰＬｙｓセグメントの総－ＮＨ２基にＡＭＰ導入度がＸ％のＰＥｔＯｘ－ＰｎＰｒＯｘ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ－Ｘ）ポリマーは、ＰＥｔＯｘ－ＰｎＰｒＯｘ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ－Ｘ）と略記された。
これまでに報告した方法［Ｊ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ． ２０１９；２７（５－６）：６７０－６８０］に従い、チオール化の程度が異なる一連のＰＥｔＯｘ－ＰｎＰｒＯｘ－ＰＬｙ（ＡＭＰ－Ｘ）ポリマーを、ホモ二官能性イミドエステル系のチオール化試薬であるＤＴＢＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）を用いてＰＬｙｓセグメントの側鎖ω－ＮＨ２基および主鎖ω－ＮＨ２基に１－アミジン－３－メルカプトプロピル（ＡＭＰ）を導入して合成した。簡単に述べると、ＰＥｔＯｘ－ＰｎＰｒＯｘ－ＰＬｙｓ（１０ｍｇ、０．３５μｍｏｌ）を、室温で１０分間撹拌しながら、１００ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解した。その後、１００ ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ９．０）に新たに溶解したＤＴＢＰ（３．１ ｍｇ、１０．０ μｍｏｌ）を、室温で１時間恒常的に攪拌しながらＰＥｔＯｘ－ＰｎＰｒＯｘ－ＰＬｙｓ溶液に滴下した。その後、ポリマー溶液をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に対して２時間以内に４回透析し、未反応のＤＴＢＰを除去した。透析溶液中のポリマーを室温で１時間ＤＴＴ（１００ｍＭ）処理して、ポリマー内および／またはポリマー間の予め形成されたジスルフィド架橋を切断し、隣接するＡＭＰ基にチオールを含むポリマーを生じた（以下、「ＰＥｔＯｘ－ＰｎＰｒＯｘ－ＰＬｙ（ＡＭＰ）」という）。ＰＥｔＯｘ－ＰｎＰｒＯｘ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ）をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に対して３時間以内に４回透析してＤＴＴを除去し、最後に脱イオン水に対して３時間以内に６回透析してＰＢＳを除去した。ポリマー溶液を濾過し（０．２２μｍフィルター）、凍結乾燥して粉末として得た。１Ｈ ＮＭＲスペクトルから、ＡＭＰ基のメルカプトエチルプロトン［ＨＳ－（ＣＨ２）２、＝ ２．７～２．９ｐｐｍ］に対するリジン単位［（ＣＨ２）３、＝ １．３～１．９ｐｐｍ］のβ－、γ－、およびδ－メチレンプロトンのピーク強度比を計算して、ＡＭＰ導入の程度を２０％と決定した。反応中のＰＬｙｓの－ＮＨ２基に対するＤＴＢＰの供給比の様々な化学量論を変えることにより、様々な段階的な程度のＡＭＰ導入が生じた。ＰＥｔＯｘ－ＰｎＰｒＯｘ－ＰＬｙｓのＰＬｙｓセグメントの総－ＮＨ２基にＡＭＰ導入度がＸ％のＰＥｔＯｘ－ＰｎＰｒＯｘ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ－Ｘ）ポリマーは、ＰＥｔＯｘ－ＰｎＰｒＯｘ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ－Ｘ）と略記された。
【0072】
ポリプレックスミセル（ＰＭ）の調製
ＰＥｔＯｘ－ＰｎＰｒＯｘ－ＰＬｙｓおよびＰＥｔＯｘ－ＰｎＰｒＯｘ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ－Ｘ）ポリマーを１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３）に別々に溶解した。ｍＲＮＡも１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３）に別々に溶解した。
非架橋ＰＭ（非ＣＰＭ）は、１単位体積のＰＥｔＯｘ－ＰｎＰｒＯｘ－Ｐｌｙｓ溶液を２単位体積のｍＲＮＡ溶液に高速ボルテックス混合することにより、ブロック共重合体（Ｎ）の［ｍＲＮＡ（Ｐ）のリン酸基］（Ｎ／Ｐ）に対する［アミノ基およびアミジン基］の残留モル比を２として調製した。
架橋ＰＭは、ＰＥｔＯｘ－ＰｎＰｒＯｘ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ－Ｘ）ポリマーから調製した。簡潔に述べると、ＰＥｔＯｘ－ＰｎＰｒＯｘ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ－Ｘ）ポリマーを１０ｍＭ ＤＴＴを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３）で処理し、ポリマー内の望ましくないジスルフィド架橋を切断してｍＲＮＡとの複合体形成前にチオール基を誘導化するために、少なくとも３０分間室温でインキュベートした。ＰＭは、Ｎ／Ｐ比２でＤＴＴなしで１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３）中のｍＲＮＡ溶液中へのＤＴＴ前処理ＡＭＰ－Ｘポリマー溶液の高速ボルテックス混合により調製した。この条件では、チオール基はポリマー間のジスルフィド架橋を形成していない。ＰＭを４℃で４時間インキュベートし、続いてＤＭＳＯ（５％ｖ／ｖ）で４℃で１日間インキュベートした。添加されたＤＭＳＯはチオール基の穏和な酸化剤であり、ＰＥｔＯｘ－ＰｎＰｒＯｘ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ－Ｘ）ポリマーのリジン残基間のジスルフィド架橋の形成を促進する。
ＰＥｔＯｘ－ＰｎＰｒＯｘ－ＰＬｙｓおよびＰＥｔＯｘ－ＰｎＰｒＯｘ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ－Ｘ）ポリマーを１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３）に別々に溶解した。ｍＲＮＡも１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３）に別々に溶解した。
非架橋ＰＭ（非ＣＰＭ）は、１単位体積のＰＥｔＯｘ－ＰｎＰｒＯｘ－Ｐｌｙｓ溶液を２単位体積のｍＲＮＡ溶液に高速ボルテックス混合することにより、ブロック共重合体（Ｎ）の［ｍＲＮＡ（Ｐ）のリン酸基］（Ｎ／Ｐ）に対する［アミノ基およびアミジン基］の残留モル比を２として調製した。
架橋ＰＭは、ＰＥｔＯｘ－ＰｎＰｒＯｘ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ－Ｘ）ポリマーから調製した。簡潔に述べると、ＰＥｔＯｘ－ＰｎＰｒＯｘ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ－Ｘ）ポリマーを１０ｍＭ ＤＴＴを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３）で処理し、ポリマー内の望ましくないジスルフィド架橋を切断してｍＲＮＡとの複合体形成前にチオール基を誘導化するために、少なくとも３０分間室温でインキュベートした。ＰＭは、Ｎ／Ｐ比２でＤＴＴなしで１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３）中のｍＲＮＡ溶液中へのＤＴＴ前処理ＡＭＰ－Ｘポリマー溶液の高速ボルテックス混合により調製した。この条件では、チオール基はポリマー間のジスルフィド架橋を形成していない。ＰＭを４℃で４時間インキュベートし、続いてＤＭＳＯ（５％ｖ／ｖ）で４℃で１日間インキュベートした。添加されたＤＭＳＯはチオール基の穏和な酸化剤であり、ＰＥｔＯｘ－ＰｎＰｒＯｘ－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ－Ｘ）ポリマーのリジン残基間のジスルフィド架橋の形成を促進する。
【0073】
ポリプレックスミセル（ＰＭ）の血液循環の評価
ＧＬｕｃ ｍＲＮＡを積載したＡＭＰ－Ｘの非ＣＰＭおよびＣＰＭを、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液２００μＬ中の４０μｇのｍＲＮＡの用量で、マウスに別々に尾静脈を介して静脈内注射した。血流内のＰＭの保護ｍＲＮＡの量は、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて製造のガイドラインに従って抽出した。要するに、注射後の測定時点（２．５、５および１０分）で、尾静脈切断から２μＬの血液を取り出し、直ちに、１００ｍＭ ＤＴＴおよびβ―メルカプトエタノール（最終濃度１％）、ＲＬＴ溶液（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔから）（３５０μＬ）を補充した緩衝液に移し、直ちに液体窒素で凍結した。凍結したサンプルを３７℃で１時間インキュベートした。この間に、ＤＴＴは、ｍＲＮＡを効果的に抽出するために、ＣＰＭのコア内のジスルフィド架橋の減少を促進すると予想される。非ＣＰＭもＣＰＭと同様にＤＴＴおよびＲＬＴ混合物による処理を受けた。インキュベーション後、ｍＲＮＡを、製造業者のプロトコルに記載されたさらなる工程に従うことにより抽出した。抽出したｍＲＮＡを逆転写し、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（商標）ｑＰＣＲＲＴキット（Ｔｏｙｏｂｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、大阪、日本）を用いて相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を形成した。ｃＤＮＡを、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７５００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）およびＧＬｕｃ ｍＲＮＡの２０４ｂｐ配列を増幅するＧＬｕｃ特異的プライマー対（フォワードプライマー：ＧＧＡＧＧＴＧＣＴＣＡＡＡＧＡＧＡＴＧＧ、及びリバースプライマー：ＴＴＧＡＡＣＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＣＡＧＧ）を用いた定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ）のために使用した。
ＧＬｕｃ ｍＲＮＡを積載したＡＭＰ－Ｘの非ＣＰＭおよびＣＰＭを、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液２００μＬ中の４０μｇのｍＲＮＡの用量で、マウスに別々に尾静脈を介して静脈内注射した。血流内のＰＭの保護ｍＲＮＡの量は、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて製造のガイドラインに従って抽出した。要するに、注射後の測定時点（２．５、５および１０分）で、尾静脈切断から２μＬの血液を取り出し、直ちに、１００ｍＭ ＤＴＴおよびβ―メルカプトエタノール（最終濃度１％）、ＲＬＴ溶液（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔから）（３５０μＬ）を補充した緩衝液に移し、直ちに液体窒素で凍結した。凍結したサンプルを３７℃で１時間インキュベートした。この間に、ＤＴＴは、ｍＲＮＡを効果的に抽出するために、ＣＰＭのコア内のジスルフィド架橋の減少を促進すると予想される。非ＣＰＭもＣＰＭと同様にＤＴＴおよびＲＬＴ混合物による処理を受けた。インキュベーション後、ｍＲＮＡを、製造業者のプロトコルに記載されたさらなる工程に従うことにより抽出した。抽出したｍＲＮＡを逆転写し、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（商標）ｑＰＣＲＲＴキット（Ｔｏｙｏｂｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、大阪、日本）を用いて相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を形成した。ｃＤＮＡを、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７５００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）およびＧＬｕｃ ｍＲＮＡの２０４ｂｐ配列を増幅するＧＬｕｃ特異的プライマー対（フォワードプライマー：ＧＧＡＧＧＴＧＣＴＣＡＡＡＧＡＧＡＴＧＧ、及びリバースプライマー：ＴＴＧＡＡＣＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＣＡＧＧ）を用いた定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ）のために使用した。
【0074】
非ＣＰＭ、ＡＭＰ－Ｘ ＰＭ製剤および裸のｍＲＮＡのｑＲＴ－ＰＣＲの各々について、公知の標準濃度のＧＬｕｃ ｍＲＮＡを、３７℃でインキュベートすることなく血液とｍＲＮＡの混合物を用いることによって、血流中でＰＭ中に保護されたｍＲＮＡの濃度を外挿するために調製した。標準試料の調製において、血液のＲＮａｓｅを、各ＰＭ製剤の血液および標準ｍＲＮＡ濃度を混合した直後にｍＲＮＡ分解を避けるために、１０ｍＭ ＤＴＴおよびＲＬＴ溶液を含む緩衝液に血液を添加することによって、最初に不活性化した。ＤＴＴは、タンパク質のジスルフィド架橋を分解することにより、ＲＮａｓｅを不活性化すると予想される。得られた溶液を、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて同様の抽出プロトコールに付し、その後、逆転写および前述のようにｑＲＴＰＣＲ測定を行った。
【0075】
結果は、図１０に示される通りであった。図１０に示されるように、裸のｍＲＮＡは血中で即座に分解されるのに対して、非ＣＰＭ中のｍＲＮＡとインビボフェクタミン中のｍＲＮＡは安定化効果を示したが、ポリオキサゾリン－ＰＬｙｓ（ＡＭＰ）ブロック共重合体は、積載したｍＲＮＡを更に顕著に安定化させることが明らかとなった。このように、非電荷親水性ポリマーブロックとしてポリオキサゾリンを用いたＰＬｙｓ（ＡＭＰ）ブロック共重合体も、血中においてｍＲＮＡの滞留性を向上させた。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】