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▶ イノベント バイオロジックス （スウツォウ） カンパニー，リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-06-28
(45)【発行日】2024-07-08
(54)【発明の名称】新規インターロイキン２およびその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 14/55 20060101AFI20240701BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240701BHJP
C07K 16/00 20060101ALI20240701BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240701BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240701BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240701BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20240701BHJP
A61K 38/20 20060101ALI20240701BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240701BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240701BHJP
C12N 15/26 20060101ALI20240701BHJP
【ＦＩ】
C07K14/55 ZNA
C07K19/00
C07K16/00
C12N15/63 Z
C12N5/10
C12P21/02 K
A61K47/68
A61K38/20
A61P35/00
A61P37/04
C12N15/26
【請求項の数】
20
(21)【出願番号】P 2020571641
(86)(22)【出願日】2019-09-20
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-04
(86)【国際出願番号】 CN2019107055
(87)【国際公開番号】W WO2020057646
(87)【国際公開日】2020-03-26
【審査請求日】2022-05-09
(31)【優先権主張番号】201811108649.X
(32)【優先日】2018-09-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】518049935
【氏名又は名称】イノベント バイオロジックス （スウツォウ） カンパニー，リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100091487
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 行孝
(74)【代理人】
【識別番号】100105153
【弁理士】
【氏名又は名称】朝倉 悟
(74)【代理人】
【識別番号】100120617
【弁理士】
【氏名又は名称】浅野 真理
(74)【代理人】
【識別番号】100126099
【弁理士】
【氏名又は名称】反町 洋
(72)【発明者】
【氏名】カン、リーシャン
(72)【発明者】
【氏名】クー、チュンイン
(72)【発明者】
【氏名】フー、フォンケン
(72)【発明者】
【氏名】チョウ、ショアイシアン
(72)【発明者】
【氏名】シー、シンチェン
(72)【発明者】
【氏名】リウ、ジュンジャン
【審査官】西村 亜希子
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１０４２３１０６８（ＣＮ，Ａ）
【文献】特表２０１４－５０６７９３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１７－５１８３６１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０２０－５２９９７７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０２１－５３１０１３（ＪＰ，Ａ）
【文献】Nature Communications，2017年，Vol.8，15373
【文献】Nature，2012年，Vol.484, No.7395，pp.529-533
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／
Ｃ０７Ｋ
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
野生型ＩＬ－２と比較して、（１）Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｅ／Ｆ４２Ａ／Ｔ３７Ｅ、
（２）Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｋ／Ｅ６８Ｒ、
（３）Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｗ／Ｅ６８Ｒ、
（４）Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｒ／Ｅ６８Ｒ、
（５）Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｋ／Ｅ６８Ｒ／Ｔ３７Ｄ、
（６）Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｋ／Ｅ６８Ｒ／Ｔ３７Ｄ、
（７）Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｗ／Ｅ６８Ｒ／Ｔ３７Ｄ、
（８）Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｒ／Ｅ６８Ｒ／Ｔ３７Ｄ、
（９）Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｒ／Ｅ６８Ｒ／Ｔ３７Ｄ、
（１０）Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｒ／Ｅ６８Ｒ／Ｔ３７Ｅ、
（１１）Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｋ／Ｅ６８Ｒ／Ｔ３７Ｅ、
（１２）Ｋ３５Ｄ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｅ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｒ／Ｅ６８Ｙ／Ｋ４３Ｙ／Ｌ７２Ｋ
（１３）Ｋ３５Ｄ／Ｔ３７Ｅ／Ｒ３８Ｄ／Ｔ４１Ｅ／Ｋ４３Ｅ／Ｌ７２Ｆ、
（１４）Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｅ／Ｔ４１Ｅ／Ｋ４３Ｙ／Ｙ４５Ｋ／Ｌ７２Ｆ、
（１５）Ｋ３５Ｄ／Ｔ３７Ｅ／Ｒ３８Ｄ／Ｋ４３Ｅ／Ｌ７２Ｆ、
（１６）Ｋ３５Ｅ／Ｔ３７Ｄ／Ｒ３８Ｄ／Ｋ４３Ｅ／Ｌ７２Ｆ、
（１７）Ｋ３５Ｄ／Ｔ３７Ｅ／Ｒ３８Ｄ／Ｋ４３Ｙ／Ｙ４５Ｋ／Ｌ７２Ｆ、および
（１８）Ｋ３５Ｄ／Ｒ３８Ｅ／Ｔ４１Ｅ／Ｋ４３Ｅ
からなる群から選択される変異の組み合わせを含み、
前記野生型ＩＬ－２がヒトＩＬ－２であるか、または配列番号１で表される配列もしくはそれに対して少なくとも９６％、９７％、９８％、もしくは９９％を有する配列を含み、かつ
野生型ＩＬ－２と比較して、排除または低減されたＩＬ－２Ｒα受容体への結合親和性、増強されたＩＬ－２Ｒβ受容体への結合親和性、ならびに哺乳動物細胞においてＦｃ融合タンパク質の形態で発現されるとき、改善された発現量および／または純度を有し、
配列番号１で表される配列と９０％以上の同一性を有するものである、
ＩＬ－２変異タンパク質。
【請求項2】
１２５位にアミノ酸残基Ｓ有する、請求項１に記載のＩＬ－２変異タンパク質。
【請求項3】
Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｅ／Ｆ４２Ａ／Ｔ３７Ｅの変異の組み合わせを含む、請求項１に記載のＩＬ－２変異タンパク質。
【請求項4】
野生型ＩＬ－２と比較して、（１）Ｋ３５Ｄ／Ｔ３７Ｅ／Ｒ３８Ｅ／Ｔ４１Ｅ／Ｋ４３Ｅ／Ｙ４５Ｋ／Ｌ７２Ｆ／Ｈ７９Ｅ／Ｒ８１Ｄ／Ｐ８２Ｉ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｄ、
（２）Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｄ／Ｔ４１Ｅ／Ｋ４３Ｅ／Ｌ７２Ｆ／Ｒ８１Ｄ／Ｐ８２Ａ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｅ／Ｉ９２Ｍ、
（３）Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｌ／Ｅ６８Ｒ／Ｒ８１Ｄ／Ｐ８２Ａ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｅ／Ｉ９２Ｌ、
（４）Ｋ３５Ｄ／Ｔ３７Ｋ／Ｒ３８Ｅ／Ｔ４１Ｋ／Ｆ４２Ｑ／Ｋ４３Ｄ／Ｅ６８Ｙ／Ｈ７９Ｅ／Ｒ８１Ｄ／Ｐ８２Ｔ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｅ／Ｖ９１Ｌ、
（５）Ｋ３５Ｄ／Ｔ３７Ｅ／Ｒ３８Ｄ／Ｋ４３Ｙ／Ｙ４５Ｋ／Ｌ７２Ｆ／Ｒ８１Ｄ／Ｐ８２Ｔ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｄ／Ｉ９２Ｌ、
（６）Ｋ３５Ｅ／Ｔ３７Ｙ／Ｒ３８Ｗ／Ｔ４１Ｙ／Ｆ４２Ｅ／Ｋ４３Ｅ／Ｙ４５Ｋ／Ｌ７２Ｋ／Ｈ７９Ｑ／Ｒ８１Ｄ／Ｐ８２Ａ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｅ、
（７）Ｋ３５Ｄ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｅ／Ｋ４３Ｅ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６８Ｋ／Ｒ８１Ｄ／Ｐ８２Ｔ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｅ／Ｉ９２Ｍ、
（８）Ｋ３５Ｅ／Ｔ４１Ｑ／Ｆ４２Ｒ／Ｋ４３Ｄ／Ｅ６８Ｙ／Ｈ７９Ｄ／Ｒ８１Ｄ／Ｓ８７Ｄ／Ｉ９２Ｌ、
（９）Ｋ３５Ｄ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｅ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｒ／Ｅ６８Ｙ／Ｋ４３Ｙ／Ｈ７９Ｅ／Ｒ８１Ｎ／Ｐ８２Ａ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｄ／Ｉ９２Ｌ、
（１０）Ｋ３５Ｄ／Ｒ３８Ｆ／Ｔ４１Ｅ／Ｆ４２Ｅ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６８Ｙ／Ｒ８１Ｄ／Ｐ８２Ｔ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｄ／Ｖ９１Ｌ／Ｉ９２Ｌ、および
（１１）Ｋ３５Ｅ／Ｔ３７Ｋ／Ｒ３８Ｅ／Ｔ４１Ｅ／Ｋ４３Ｅ／Ｌ７２Ｆ／Ｈ７９Ｅ／Ｒ８１Ｄ／Ｐ８２Ａ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｅ／Ｉ９２Ｍ
からなる群から選択される変異の組み合わせを含み、
前記野生型ＩＬ－２がヒトＩＬ－２であるか、または配列番号１で表される配列もしくはそれに対して少なくとも９６％、９７％、９８％、もしくは９９％を有する配列を含み、かつ
野生型ＩＬ－２と比較して、排除または低減されたＩＬ－２Ｒα受容体への結合親和性、増強されたＩＬ－２Ｒβ受容体への結合親和性、ならびに哺乳動物細胞においてＦｃ融合タンパク質の形態で発現されるとき、改善された発現量および／または純度を有し、
配列番号１で表される配列と９０％以上の同一性を有するものである、
ＩＬ－２変異タンパク質。
【請求項5】
１２５位にアミノ酸残基Ｓ有する、請求項４に記載のＩＬ－２変異タンパク質。
【請求項6】
野生型ＩＬ－２と比較して、以下の特性：－低減された高親和性ＩＬ－２Ｒ受容体（ＩＬ－２Ｒαβγ）への結合親和性、
－増加された中程度の親和性ＩＬ－２Ｒ受容体（ＩＬ－２Ｒβγ）への結合親和性、
－低下されたＣＤ２５＋細胞に対する活性化、
－低減されたＣＤ２５＋ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＬ－２が介在するシグナル伝達への刺激、
－除去または低減されたＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞の活性化に対する偏向性、
－低下されたＩＬ－２誘導性Ｔｒｅｇ細胞による免疫反応のダウンレギュレート作用、
－維持または増強されたＣＤ２５－細胞に対する活性化作用、
－増加されたエフェクターＴ細胞とＮＫ細胞のＩＬ－２が介在する増殖と活性化の刺激、ならびに
－向上された抗腫瘍効果
の１つ以上を有する、請求項１～５のいずれか１項に記載のＩＬ－２変異タンパク質。
【請求項7】
哺乳動物細胞においてＦｃ抗体断片に融合した形態で発現されるとき、ワンステップタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー精製後、ＳＥＣ－ＨＰＬＣによって検出される純度が７０％以上、８０％以上、または９０％以上に達する、請求項１～６のいずれか一項に記載のＩＬ－２変異タンパク質。
【請求項8】
哺乳動物細胞においてＦｃ抗体断片に融合した形態で発現されるとき、野生型ＩＬ－２タンパク質よりも優れた発現量を有し、以下：－Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｋ／Ｅ６８Ｒ／Ｔ３７Ｄ、
－Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｅ／Ｆ４２Ａ／Ｔ３７Ｅ、および
－Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｋ／Ｅ６８Ｒ／Ｔ３７Ｅ、
からなる群から選択される変異の組み合わせを含む、または
野生型ＩＬ－２と比較して、低減されたＣＤ２５＋Ｔ細胞におけるシグナル伝達を刺激する能力を有し、かつ、以下：
Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｅ／Ｆ４２Ａ／Ｔ３７Ｅ、
Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｋ／Ｅ６８Ｒ、
Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｗ／Ｅ６８Ｒ、
Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｒ／Ｅ６８Ｒ、
Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｋ／Ｅ６８Ｒ／Ｔ３７Ｄ、
Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｋ／Ｅ６８Ｒ／Ｔ３７Ｄ、
Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｗ／Ｅ６８Ｒ／Ｔ３７Ｄ、
Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｒ／Ｅ６８Ｒ／Ｔ３７Ｄ、
Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｒ／Ｅ６８Ｒ／Ｔ３７Ｄ、
Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｒ／Ｅ６８Ｒ／Ｔ３７Ｅ、
Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｋ／Ｅ６８Ｒ／Ｔ３７Ｅ、および
Ｋ３５Ｄ／Ｒ３８Ｅ／Ｔ４１Ｅ／Ｋ４３Ｅ
からなる群から選択される変異の組み合わせを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のＩＬ－２変異タンパク質。
【請求項9】
野生型ＩＬ－２と比較して、ＣＤ２５＋Ｔ細胞におけるシグナル伝達を刺激する能力が低減されており、かつ、ＣＤ２５－Ｔ細胞におけるシグナル伝達を刺激する能力が増強されており、以下：Ｋ３５Ｄ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｅ／Ｋ４３Ｅ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６８Ｋ／Ｒ８１Ｄ／Ｐ８２Ｔ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｅ／Ｉ９２Ｍ、および
Ｋ３５Ｄ／Ｒ３８Ｆ／Ｔ４１Ｅ／Ｆ４２Ｅ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６８Ｙ／Ｒ８１Ｄ／Ｐ８２Ｔ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｄ／Ｖ９１Ｌ／Ｉ９２Ｌ
から選択される変異の組み合わせを含む、請求項４または５に記載のＩＬ－２変異タンパク質。
【請求項10】
請求項１～９のいずれか１項に記載のＩＬ－２変異タンパク質を含む、融合タンパク質。
【請求項11】
Ｆｃ抗体断片と融合している、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項12】
請求項１～９のいずれか１項に記載のＩＬ－２変異タンパク質および抗原結合分子を含む、免疫複合体。
【請求項13】
請求項１～９のいずれか１項に記載のＩＬ－２変異タンパク質、請求項１０または１１に記載の融合タンパク質、または請求項１２に記載の免疫複合体をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項14】
請求項１３に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項15】
請求項１３に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項16】
ＩＬ－２変異タンパク質またはその融合タンパク質もしくは免疫複合体を製造する方法であって、請求項１５に記載の宿主細胞を、ＩＬ－２変異タンパク質または融合タンパク質または免疫複合体の発現に適した条件下で培養することを含む、方法。
【請求項17】
請求項１～９のいずれか１項に記載のＩＬ－２変異タンパク質、請求項１０または１１に記載の融合タンパク質、または請求項１２に記載の免疫複合体、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項18】
癌の治療のための医薬の製造における、請求項１～９のいずれか１項に記載のＩＬ－２変異タンパク質、請求項１０または１１に記載の融合タンパク質、請求項１２に記載の免疫複合体、または請求項１７に記載の医薬組成物の使用。
【請求項19】
対象における免疫系を刺激するための医薬の製造における、請求項１～９のいずれか１項に記載のＩＬ－２変異タンパク質、請求項１０または１１に記載の融合タンパク質、または請求項１２に記載の免疫複合体の使用。
【請求項20】
（ｉ）ＩＬ－２Ｒα受容体への野生型ＩＬ－２タンパク質の結合親和性を排除または低減するか、および／またはＩＬ－２Ｒβ受容体への結合親和性を増強し、かつ（ｉｉ）哺乳動物細胞においてＦｃ融合タンパク質の形態で発現されるとき、野生型ＩＬ－２タンパク質の発現量および／または純度が改善される方法であって、前記方法が請求項１～５のいずれか１項に記載の変異の組み合わせを野生型ＩＬ－２タンパク質に導入し、ＩＬ－２変異タンパク質を生成することを含み、前記野生型ＩＬ－２タンパク質が配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有し、前記ＩＬ－２変異タンパク質が配列番号１で表される配列と９０％以上の同一性を有するものである、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規インターロイキン２（ＩＬ－２）変異タンパク質およびその使用に関する。特に、本発明は、野生型ＩＬ－２ ２と比較して、ＩＬ－２Ｒα受容体結合能が低減され、および／またはＩＬ－２Ｒβ受容体結合能が増加されたＩＬ－２変異タンパク質に関する。本発明はまた、当該ＩＬ－２変異タンパク質を含む融合タンパク質、免疫複合体、および当該ＩＬ－２変異タンパク質をコードする核酸、当該核酸を含むベクターおよび宿主細胞を提供する。本発明はさらに、当該ＩＬ－２変異タンパク質を調製する方法、当該ＩＬ－２変異タンパク質を含む医薬組成物、および当該変異タンパク質の治療的使用を提供する。
【背景技術】
【0002】
Ｔ細胞成長因子（ＴＣＧＦ）とも呼ばれるインターロイキン2（ＩＬ－２）は、活性化Ｔ細胞、特にCD4+ Tヘルパー細胞によって主に産生される多能性サイトカインである。真核細胞において、ヒトＩＬ－２（ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ６０５６８）は１５３アミノ酸の前駆体ポリペプチドとして合成され、Ｎ末端２０アミノ酸を除去した後、成熟した分泌性ＩＬ－２を産生する。他の種のＩＬ－２の配列も開示されており、ＮＣＢＩ Ｒｅｆ Ｓｅｑ Ｎｏ． ＮＰ０３２３９２（マウス）、ＮＰ４４６２８８（ラット）またはＮＰ５１７４２５（チンパンジー）を参照されたい。
【0003】
インターロイキン２は、その機能に不可欠な４次構造を形成する４つの反平行両親媒性 αヘリックスを有する（Ｓｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０，１１６９－７６（１９８８）；Ｂａｚａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７，４１０－４１３（１９９２））。ほとんどの場合、ＩＬ－２は、インターロイキン２受容体α（ＩＬ－２Ｒα；ＣＤ２５）、インターロイキン２受容体β（ＩＬ－２Ｒβ；ＣＤ１２２）およびインターロイキン２受容体γ（ＩＬ－２Ｒγ；ＣＤ１３２）の３つの異なる受容体によって機能する。ＩＬ－２ＲβおよびＩＬ－２ＲγはＩＬ－２のシグナル伝達に重要であるが、ＩＬ－２Ｒα（ＣＤ２５）はシグナル伝達に必要ではないが、ＩＬ－２の受容体への高い親和力結合を与えることができる（Ｋｒｉｅｇ ｅｔａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １０７，１１９０６－１１（２０１０））。ＩＬ－２Ｒ α、β、およびγの組み合わせから形成される三量体受容体（ＩＬ－２αβγ）は、ＩＬ－２高親和力受容体（ＫＤは約１０ｐＭ）であり、βおよびγからなる二量体受容体（ＩＬ－２βγ）は、中間親和力受容体（ＫＤは約１ｎＭ）であり、αサブユニットのみから形成されるＩＬ－２受容体は、低親和力受容体である。
【0004】
免疫細胞は二量体または三量体ＩＬ－２受容体を発現する。二量体受容体は細胞傷害性ＣＤ８＋ Ｔ細胞とナチュラルキラー細胞（ＮＫ）で発現し、三量体受容体は主に活性化リンパ球とＣＤ４＋ ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋抑制的制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）で発現する（Ｂｙｍａｎ， Ｏ．およびＳｐｒｅｎｔ． Ｊ． Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２， １８０－１９０（２０１２））。静止状態のエフェクターＴ細胞およびＮＫ細胞は、細胞表面上にＣＤ２５を有さないので、ＩＬ－２に対して比較的非感受性である。一方、Ｔｒｅｇ細胞は体内で常に最高レベルのＣＤ２５を発現しているため、通常ＩＬ－２はＴｒｅｇ細胞の増殖を優先的に刺激する。
【0005】
ＩＬ－２は、異なる細胞上のＩＬ－２受容体との結合を介して、免疫反応における多重作用を介在する。一方、ＩＬ－２は免疫系刺激剤として、Ｔ細胞の増殖と分化を刺激し、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の生成を誘導し、Ｂ細胞の増殖と分化と免疫グロブリンの合成を促進し、そしてナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の生産、増殖、活性化を刺激することから、免疫治療剤としてがんやレンチウイルス感染の治療に使用されることが承認されている。一方、ＩＬ－２は、免疫抑制性ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞（すなわち、Ｔｒｅｇ細胞）の活性化および増殖を促進でき（Ｆｏｎｔｅｎｏｔ ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６，１１４２－５１（２００５）；Ｄ’ＣｒｕｚおよびＫｌｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６，１１５２－５９（２００５）；ＭａｌｏｙおよびＰｏｗｒｉｅ，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ６，１１７１－７２（２００５））、免疫抑制をもたらす。さらに、高用量ＩＬ－２は、患者において血管漏出症候群（ＶＬＳ）を引き起こす可能性がある。ＩＬ－２は、肺内皮細胞上のＩＬ－２三量体受容体（ＩＬ－２αβγ）と直接結合することによって肺浮腫を誘導することが示されている（Ｋｒｉｅｇ ｅｔａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ１０７，１１９０６－１１（２０１０））。
【0006】
ＩＬ－２免疫療法に関連する上述の問題を克服するために、ＩＬ－２の様々な受容体に対する選択性または選好性を変化させることにより、ＩＬ－２療法の毒性を低下させ、および／またはその有効性を増大させることが提案されている。例えば、ＩＬ－２モノクローナル抗体とＩＬ－２との複合物を用いて、ＣＤ２５ではなくＣＤ１２２を発現する細胞をＩＬ－２に標的化することにより、ＣＤ１２２ｈｉｇｈ集団の優先的増幅を誘導し、インビボＩＬ－２治療効果を増強することが提案されている （Ｂｏｙｍａｎ ｅｔａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１１， １９２４－１９２７（２００６））。Ｏｌｉｖｅｒ ＡＳＴ ｅｔａｌ．（ＵＳ２０１８／０１４２０３７）は、ＩＬ－２Ｒα受容体に対する親和性を低下させるために、ＩＬ－２のアミノ酸残基位置４２、４５および７２に三重変異Ｆ４２Ａ／Ｙ４５Ａ／Ｌ７２Ｇを導入することを提案している。Ａｒｏｎ Ｍ． Ｌｅｖｉｎ ｅｔａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ， Ｖｏｌ ４８４， ｐ５２９－５３３， ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１０９７５）は、「ｓｕｐｅｒｋｉｎｅ」と呼ばれるＩＬ－２変異体ＩＬ－２Ｈ９を提案し、当該変異体は、ＩＬ－２Ｒβ結合の増強を伴う五重変異Ｌ８０Ｆ／Ｒ８１Ｄ／Ｌ８５Ｖ／Ｉ８６Ｖ／Ｉ９２Ｆを含み、これによりＣＤ２５－細胞に対する刺激効果を増強した。Ｒｏｄｒｉｇｏ Ｖａｚｑｕｅｚ－Ｌｏｍｂａｒｄｉ ｅｔａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， ８：１５３７３， ＤＯＩ： １０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１５３７３）は、アミノ酸残基位置３８、４３および６１にそれぞれ残基変異Ｒ３８Ｄ／Ｋ４３Ｅ／Ｅ６１Ｒを有する三重変異ヒトＩＬ－２変異タンパク質ＩＬ－２３Ｘを提案し、これによりＩＬ－２Ｒαに対する当該変異タンパク質の非結合がもたらされ、ＣＤ２５＋細胞に対するＩＬ－２の活性化偏向性の排除を達成する。しかし、ＣＤ２５＋細胞に対するＩＬ－２３Ｘの活性化偏向性は依然として存在し、かつ当該変異タンパク質の発現量は比較的低く、その後の薬物としての大量生産には不利である。
【0007】
免疫調節および疾患におけるＩＬ－２の役割を考慮すると、改善された特性を有する新規ＩＬ－２分子を開発する必要性が本分野において依然として存在する。
【発明の内容】
【0008】
本発明は、野生型ＩＬ－２と比較して改善されたＩＬ－２受容体選択性／偏向性を有する新規ＩＬ－２変異タンパク質を提供することによって、上記の要件を満たす。
【0009】
したがって、１つの態様において、本発明は、新規ＩＬ－２変異タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、以下の１つ以上の特性を有する。
【0010】
（ｉ）野生型ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－２Ｒα受容体への結合親和性が低下すること、
（ｉｉ）野生型ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－２Ｒβ受容体への結合親和性が増強すること、
（ｉｉｉ）ＣＤ２５＋細胞に対するＩＬ－２の活性化偏向性を効果的に低下させること、
（ｉｖ）ＣＤ２５－細胞を効果的に活性化すること。
（ｉｉ）野生型ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－２Ｒβ受容体への結合親和性が増強すること、
（ｉｉｉ）ＣＤ２５＋細胞に対するＩＬ－２の活性化偏向性を効果的に低下させること、
（ｉｖ）ＣＤ２５－細胞を効果的に活性化すること。
【0011】
いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、高い発現量の特性を有する。
【0012】
いくつかの実施形態において、本発明は、ＩＬ－２のアミノ酸残基領域３５－７２に少なくとも１つの変異を含むＩＬ－２変異タンパク質を提供する。他の実施形態において、本発明は、ＩＬ－２のアミノ酸残基領域７９－９２に少なくとも１つの変異を含むＩＬ－２変異タンパク質を提供する。さらに他の実施形態において、本発明は、アミノ酸領域３５－７２および７９－９２に２つ以上、好ましくは３つ以上の変異を含むＩＬ－２変異タンパク質を提供する。
【0013】
さらに、本発明は、ＩＬ－２変異タンパク質を含む融合タンパク質および免疫複合体、医薬組成物および組み合わせ製品、ＩＬ－２変異タンパク質をコードする核酸、前記核酸を含むベクターおよび宿主細胞、ならびに本発明のＩＬ－変異タンパク質、融合タンパク質および免疫複合体を産生する方法を提供する。
【0014】
さらに、本発明は、本発明のＩＬ－２変異タンパク質を用いて疾患を治療する方法、および対象の免疫系を刺激する方法および使用を提供する。
【0015】
以下、本発明を、図面および実施形態を参照してさらに説明する。しかし、これらの図面および実施形態は、本発明の範囲を限定するものと考えられるべきではなく、当業者が容易に思いつく変更は、本発明の精神および添付の特許請求の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【発明を実施するための形態】
【0017】
別に定義しない限り、本出願に用いられる全ての技術と科学用語はいずれも、当業者が通常に理解する意味と同じ意味を有する。本発明の目的のために、下記の用語を定義する。
【0018】
用語「約」は数値と共に使用されるとき、下限として記載数値より５％小さく上限として記載数値より５％大きい範囲における数値を含むことを意味する。
【0019】
用語「および／または」は選択可能オプションのうちのいずれか１項または選択可能オプションのいずれか２項または複数項の組み合わせを指すと理解すべきである。
【0020】
本出願に使用される場合、用語「包含する」または「含む」とは、前記要素、整数またはステップを含むが、他の要素、整数またはステップを排除しないことを意味する。本出願において、用語「包含する」または「含む」を用いる場合、特記しない限り、述べられた要素、整数またはステップからなる場合を含む必要がある。例えば、ある変異または変異の組み合わせを「包含する」または「含む」ＩＬ－２変異タンパク質に言及する場合、その変異または変異の組み合わせのみを有するＩＬ－２変異タンパク質を包含することも意図される。
【0021】
本明細書において、野生型「インターロイキン－２」または「ＩＬ－２」とは、本発明の変異または変異の組み合わせを導入するテンプレートである親ＩＬ－２タンパク質、好ましくは天然に存在するＩＬ－２タンパク質、例えば、未処理（例えば、シグナルペプチドの除去なし）の形態および処理済み（例えば、シグナルペプチドの除去あり）の形態を含む、ヒト、マウス、ラット、非ヒト霊長類由来の天然ＩＬ－２タンパク質を指す。さらに、この表現には、天然に存在するＩＬ－２対立遺伝子変異体およびスプライシング変異体、アイソタイプ、相同体、および種相同体も含まれる。この表現には、天然ＩＬ－２の変異体も含まれ、例えば、前記変異体は、天然ＩＬ－２と少なくとも９５％－９９％またはそれ以上の同一性を有してもよく、または１－１０個以下または１－５個以下のアミノ酸変異（特に保存的アミノ酸置換）を有してもよく、天然ＩＬ－２タンパク質と実質的に同じＩＬ－２Ｒα結合親和性および／またはＩＬ２Ｒβ結合親和性を有する。したがって、いくつかの実施形態において、野生型ＩＬ－２は、天然ＩＬ－２タンパク質と比較して、ＩＬ－２受容体へのその結合に影響を及ぼさないアミノ酸変異、例えば、変異Ｃ１２５Ｓを１２５位に導入した天然ヒトＩＬ－２タンパク質（ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ６０５６８）は、本発明の野生型ＩＬ－２に属する。野生型ヒトＩＬ－２タンパク質の例を配列番号１に示す。いくつかの実施形態において、野生型ヒトＩＬ－２配列は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、さらには少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％またはさらに高いアミノ酸配列同一性を有する。
【0022】
本明細書において、アミノ酸変異は、アミノ酸置換、欠失、挿入、および付加であってもよい。置換、欠失、挿入および付加の任意の組み合わせを行って、所望の特性（例えば、ＩＬ－２Ｒα結合親和性の低下）を有する最終変異タンパク質構築物を得ることができる。アミノ酸の欠失および挿入は、ポリペプチド配列のアミノおよび／またはカルボキシ基末端における欠失および挿入を含む。例えば、アラニン残基は、全長ヒトＩＬ－２位置１で欠失することができる。好ましいアミノ酸変異はアミノ酸置換である。いくつかの実施形態において、本発明に記載の特定の変異アミノ酸位置に変異を導入することによって、変化した受容体結合特性を有するＩＬ－２変異タンパク質を得ることが意図される場合、位置的に非保存的アミノ酸置換を行うことが好ましい。いくつかの実施形態において、好ましい非保存的アミノ酸置換は、疎水性アミノ酸を親水性アミノ酸で置換すること、または異なる極性または反対電荷のアミノ酸で置換することを含む。
【0023】
本発明において、アミノ酸位置を言及する場合、配列番号１の野生型ヒトＩＬ－２タンパク質（ＩＬ－２ＷＴとも呼ばれる）アミノ酸配列（図６に示す）を参照することにより決定される。アミノ酸配列アラインメントを実施することによって（例えば、ＢＬＡＳＴを使用して、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＲＯＧＲＡＭ＝ｂｌａｓｔｐ＆ ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ＆ＬＩＮＫ＿ＬＯＣ＝ｂｌａｓｔｈｏｍｅから取得可能なＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ、デフォルトパラメータを使用して、アラインメントを実施する）、他のＩＬ－２タンパク質またはポリペプチド（全長配列または切断断片を含む）上の対応するアミノ酸位置を同定する。したがって、本発明において、例えば、「Ｆ４２」を言及する場合、配列番号１の４２位のフェニルアラニン残基Ｆ、または他のＩＬ－２配列上の対応する位置にアラインメントしたアミノ酸残基を指す。複数の位置の組み合わせを言及する場合、例えばＦ４２位、Ｒ８１位およびＳ８７位をＦ４２／Ｒ８１／Ｓ８７と表すことができる。
【0024】
本明細書において、ＩＬ－２変異タンパク質に言及するとき、変異は以下のように記載される。アミノ酸置換は、［元のアミノ酸残基／位置／置換されたアミノ酸残基］として表される。例えば、位置９２のイソロイシンはロイシンに置換され、Ｉ９２Ｌと表すことができる。所与の位置（例えば、Ｈ７９位）に複数の代替アミノ酸置換方式（例えばＤ、Ｅ、Ｑ）が存在し得る場合、置換は、（１）Ｈ７９Ｄ、Ｅ、Ｑ、または（２）Ｈ７９Ｄ／Ｅ／Ｑと表すことができる。相応して、複数の所与の位置（例えばＲ８１、Ｒ８３およびＳ８７）における組み合わせ変異は、１）Ｒ８１Ｄ／Ｎ、Ｒ８３Ｅ、Ｉ９２Ｌ／Ｆ／Ｙ、または（２）Ｒ８１Ｄ／Ｓ８７Ｄ／Ｉ９２Ｌと表すことができる。
【0025】
本明細書では、「配列同一性パーセント」は、比較ウィンドウ内で２つの最適アラインメント配列を比較することによって決定することができる。好ましくは、配列同一性は、参照配列（例えば、配列番号1）の全長にわたって決定される。比較のための配列アラインメント方法は、本分野において周知である。配列同一性パーセントを決定するのに適したアルゴリズムは、例えば、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムを含む（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔａｌ．，Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５： ３３８９－４０２，１９７７およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔａｌ． Ｊ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５： ４０３－１０， １９９０参照）。ＢＬＡＳＴ分析のためのソフトウェアは、アメリカ国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）から公的に入手可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。本出願の目的のために、同一性パーセントは、通常、デフォルトパラメータとして設定されたＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムを用いて決定される。
【0026】
本明細書で使用するとき、用語「保存的置換」は、アミノ酸配列を含むタンパク質／ポリペプチドの生物学的機能に悪影響を及ぼさない、または変化させないアミノ酸置換を意味する。例えば、保存的置換は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ介在性変異誘発などの本分野で公知の標準的な技術によって導入することができる。典型的な保存的アミノ酸置換は、１つのアミノ酸を、類似の化学的性質（例えば、電荷または疎水性）を有する別のアミノ酸に置換することを意味する。以下の６組はそれぞれ、互いに典型的な保存的置換が可能なアミノ酸を含む。１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。例えば、野生型ＩＬ－２タンパク質は、配列番号１に対して保存的アミノ酸置換を有してもよく、または保存的アミノ酸置換のみを有してもよい。さらに例えば、本発明の変異ＩＬ－２タンパク質は、野生型ＩＬ－２タンパク質と比較して、本発明の特徴的な変異に加えて保存的アミノ酸置換を有してもよく、または保存的アミノ酸置換のみを有してもよい。
【0027】
「親和性」または「結合親和性」は、結合組のメンバー間の相互作用の固有結合能を反映する。分子Xのその結合配偶子Yに対する親和性は、平衡解離定数（KＤ）によって示され、平衡解離定数は、解離速度定数と結合速度定数（それぞれｋｄｉｓとｋｏｎである）との比値である。結合親和性は本分野の既知の常用方法で測定される。親和性を測定するための具体的な方法は、本明細書におけるバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）技術によって測定されることである。さらに、ＩＬ－２変異タンパク質の異なる受容体に対する親和性の変化は、本明細書に記載のフローサイトメトリーによって予備的に評価することもできる。例えば、酵母細胞上に提示された野生型ＩＬ－２および変異ＩＬ－２タンパク質をビオチン化したＩＬ－２ＲβまたはＩＬ－２Ｒα受容体で染色分析することにより、野生型ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－２Ｒ受容体ＩＬ－２ＲβまたはＩＬ－２Ｒαとの結合親和性が変化するＩＬ－２変異タンパク質を同定する。
【0028】
本明細書において、抗体結合分子は、抗原と特異的に結合し得るポリペプチド分子、例えば免疫グロブリン分子、抗体または抗体断片、例えばＦａｂ断片およびｓｃＦｖ断片である。
【0029】
本明細書において、抗体Ｆｃ断片とは、定常領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖のＣ－末端領域を意味し、天然配列Ｆｃ断片および変異体Ｆｃ断片を含むことができる。１つの実施形態において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ断片は重鎖のＣｙｓ２２６からまたはＰｒｏ２３０からカルボキシル基末端に延伸する。他の実施形態において、Ｆｃ－断片のＣ－末端リジン（Ｌｙｓ４４７）が存在してもよく、存在しなくてもよい。他の実施形態において、Ｆｃ断片は、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異などの変異を含んでもよい。本出願では特記しない限り、Fｃ断片におけるアミノ酸残基の番号付けは、ＥU番号付けシステムによるものであり、ＥU索引とも呼ばれる。例えば、Kａｂａｔ、Ｅ．Ａ． ｅｔ ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Bｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２に記載される。
【0030】
本発明の種々の態様は、以下の各セクションにおいてさらに詳細に説明される。
【0031】
１．本発明のＩＬ－２変異タンパク質
本発明は、１つの態様において、ＩＬ－２受容体選択性／偏向性が改善され、より具体的には、ＩＬ－２Ｒα受容体への結合親和性が低減または排除され、および／またはＩＬ－２Ｒβ受容体への結合親和性が増強された新規ＩＬ－２変異タンパク質を提供する。
本発明は、１つの態様において、ＩＬ－２受容体選択性／偏向性が改善され、より具体的には、ＩＬ－２Ｒα受容体への結合親和性が低減または排除され、および／またはＩＬ－２Ｒβ受容体への結合親和性が増強された新規ＩＬ－２変異タンパク質を提供する。
【0032】
本発明のＩＬ－２変異タンパク質の有利な生物学的性質
ＩＬ－２タンパク質は、ＩＬ－２受容体と相互作用することによってシグナル伝達を誘発し、機能する。野生型ＩＬ－２は、異なるＩＬ－２受容体に対して異なる親和性を示す。野生型ＩＬ－２との親和性が低いＩＬ－２βおよびＩＬ－２γ受容体を、静止エフェクター細胞（ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含む）上で発現した。野生型ＩＬ－２との親和性が高いＩＬ－２Ｒαを、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）細胞および活性化エフェクター細胞上で発現した。高い親和性のために、野生型ＩＬ－２は、細胞表面のＩＬ－２Ｒαと優先的に結合し、ＩＬ－２Ｒβγを動員し、ＩＬ－２Ｒβγを介して下流のｐ－ＳＴＡＴ５シグナルを放出し、Ｔｒｅｇ細胞および活性化エフェクター細胞を刺激する。したがって、理論に束縛されるものではないが、ＩＬ－２Ｒα受容体に対するＩＬ－２の親和性を低減または排除することは、ＩＬ－２がＣＤ２５＋細胞を優先的に活性化する偏向を低減し、ＩＬ－２介在性Ｔｒｅｇ細胞の免疫ダウンレギュレート作用を低減するであろう。理論に束縛されるものではないが、ＩＬ－２β受容体に対する親和性の維持または増強は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞などのエフェクター細胞に対するＩＬ－２の活性化作用を維持または増強し、それによって免疫刺激作用を達成する。
ＩＬ－２タンパク質は、ＩＬ－２受容体と相互作用することによってシグナル伝達を誘発し、機能する。野生型ＩＬ－２は、異なるＩＬ－２受容体に対して異なる親和性を示す。野生型ＩＬ－２との親和性が低いＩＬ－２βおよびＩＬ－２γ受容体を、静止エフェクター細胞（ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含む）上で発現した。野生型ＩＬ－２との親和性が高いＩＬ－２Ｒαを、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）細胞および活性化エフェクター細胞上で発現した。高い親和性のために、野生型ＩＬ－２は、細胞表面のＩＬ－２Ｒαと優先的に結合し、ＩＬ－２Ｒβγを動員し、ＩＬ－２Ｒβγを介して下流のｐ－ＳＴＡＴ５シグナルを放出し、Ｔｒｅｇ細胞および活性化エフェクター細胞を刺激する。したがって、理論に束縛されるものではないが、ＩＬ－２Ｒα受容体に対するＩＬ－２の親和性を低減または排除することは、ＩＬ－２がＣＤ２５＋細胞を優先的に活性化する偏向を低減し、ＩＬ－２介在性Ｔｒｅｇ細胞の免疫ダウンレギュレート作用を低減するであろう。理論に束縛されるものではないが、ＩＬ－２β受容体に対する親和性の維持または増強は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞などのエフェクター細胞に対するＩＬ－２の活性化作用を維持または増強し、それによって免疫刺激作用を達成する。
【0033】
本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、ＩＬ－２がＩＬ－２Ｒαと相互作用する領域（アミノ酸残基３５－７２位）および／またはＩＬ－２がＩＬ－２Ｒβと相互作用する領域（アミノ酸残基７９－９２位）に１つ以上の変異、特に３つ以上の変異を導入することによって、ＩＬ－２変異タンパク質のＩＬ－２Ｒαへの結合を減少または非結合にし、および／またはＩＬ－２Ｒβへの結合を不変または増強させる。これにより、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して改善された性質を有し、例えば、以下の１つ以上を含む。
【0034】
（１）IL-2Rα受容体への結合親和性の低減または排除、
（２）ＩＬ－２Ｒβ受容体への結合親和性の増強、
（３）高親和性ＩＬ－２Ｒ受容体（ＩＬ－２Ｒαβγ）への結合親和性の低減、
（４）中程度の親和性ＩＬ－２Ｒ受容体（ＩＬ－２Ｒβγ）への結合親和性の増加、
（５）ＣＤ２５＋細胞（特に活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇ細胞）におけるＩＬ－２シグナル伝達の活性化、特にＳＴＡＴ５リン酸化シグナルの活性化能の低下、
（６）ＩＬ－２介在性ＣＤ２５＋細胞（特に、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇ細胞）の活性化および増殖の減少、
（７）Ｔｒｅｇ細胞の増殖を優先的に刺激するＩＬ－２の偏向の低減または解消、
（８）ＩＬ－２誘導下でのＴｒｅｇ細胞の免疫ダウンレギュレート作用の低減、
（９）特に、ＣＤ２５－細胞（特にＣＤ２５－Ｔエフェクター細胞およびＮＫ細胞）に対する活性化作用の保持または増強、
（１０）ＩＬ－２介在性エフェクターＴ細胞およびＮＫ細胞の活性化および増殖の増加、
（１１）免疫刺激作用の向上、
（１２）抗腫瘍効果の向上。
（２）ＩＬ－２Ｒβ受容体への結合親和性の増強、
（３）高親和性ＩＬ－２Ｒ受容体（ＩＬ－２Ｒαβγ）への結合親和性の低減、
（４）中程度の親和性ＩＬ－２Ｒ受容体（ＩＬ－２Ｒβγ）への結合親和性の増加、
（５）ＣＤ２５＋細胞（特に活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇ細胞）におけるＩＬ－２シグナル伝達の活性化、特にＳＴＡＴ５リン酸化シグナルの活性化能の低下、
（６）ＩＬ－２介在性ＣＤ２５＋細胞（特に、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＴｒｅｇ細胞）の活性化および増殖の減少、
（７）Ｔｒｅｇ細胞の増殖を優先的に刺激するＩＬ－２の偏向の低減または解消、
（８）ＩＬ－２誘導下でのＴｒｅｇ細胞の免疫ダウンレギュレート作用の低減、
（９）特に、ＣＤ２５－細胞（特にＣＤ２５－Ｔエフェクター細胞およびＮＫ細胞）に対する活性化作用の保持または増強、
（１０）ＩＬ－２介在性エフェクターＴ細胞およびＮＫ細胞の活性化および増殖の増加、
（１１）免疫刺激作用の向上、
（１２）抗腫瘍効果の向上。
【0035】
いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、上記（１）の特性を有し、好ましくは、（３）および（５）－（８）からなる群から選択される１つ以上、特に全ての特性をさらに有し、より好ましくは（２）および（９）－（１２）からなる群から選択される１つ以上、特に全ての特性をさらに有する。いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、上記（２）の特性を有し、好ましくは、（９）－（１２）から選択される１つ以上、特に全ての特性をさらに有し、より好ましくは（１）、（３）および（５）－（８）からなる群から選択される１つ以上、特に全ての特性をさらに有する。
【0036】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質はまた、高親和性受容体ＩＬ－２αβγへのＩＬ－２の結合が介在するインビボ毒性の減少という特性を野生型ＩＬ－２に対して有する。
【0037】
いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、改善された薬物形成特性を有し、例えば、哺乳動物細胞、例えばＨ２９３Ｔ細胞において発現される場合、（ｉ）野生型ＩＬ－２タンパク質よりも優れた発現量、（ｉｉ）野生型ＩＬ－２タンパク質よりも優れた均質性、および（ｉｉｉ）より高いタンパク質純度まで精製しやすいこと、から選択される１つ以上の特性を有する。
【0038】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して発現レベルの増加を示す。本発明のいくつかの実施形態において、発現の増加は哺乳動物細胞発現系で起こる。発現レベルは、細胞培養上清（好ましくはワンステップアフィニティークロマトグラフィー精製後の上清）中の組換えＩＬ－２タンパク質の量を定量的または半定量的に分析することを可能にする任意の適切な方法によって決定することができる。いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、哺乳動物細胞において発現量を少なくとも１．１倍、または少なくとも１．５倍、または少なくとも２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、または４倍以上増加させる。
【0039】
いくつかの好ましい実施形態において、一次タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー精製後、本発明のＩＬ－２変異タンパク質産物の純度は、７０％以上、または８０％以上、または９０％以上に達することができる。いくつかの実施形態において、タンパク質純度は、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ技術によって検出される。
【0040】
いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２（例えば、配列番号１に示されるＩＬ－２ＷＴ）と比較して、ＩＬ－２Ｒα受容体に対する親和性を少なくとも５倍、少なくとも１０倍、または少なくとも２５倍、特に少なくとも３０倍、５０倍、または１００倍以上低下させる。好ましい実施形態において、本発明の変異タンパク質はＩＬ－２Ｒα受容体と結合しない。結合親和性は、本発明のＩＬ－２変異タンパク質、例えばＦｃ断片と融合した本発明のＩＬ－２変異タンパク質と受容体ＩＬ－２Ｒα受容体との平衡解離定数（ＫＤ）をバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）技術によって測定することによって決定することができる。
【0041】
いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質（例えば配列番号１に示されるＩＬ－２ＷＴ）は、野生型ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－２Ｒβ受容体に対する親和性を少なくとも５倍、少なくとも１０倍、または少なくとも２５倍、特に少なくとも３０倍、５０倍、または１００倍、より好ましくは少なくとも１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、または５００倍、または５５０倍以上増強させる。結合親和性は、本発明のＩＬ－２変異タンパク質、例えばＦｃ断片と融合した本発明のＩＬ－２変異タンパク質と受容体ＩＬ－２Ｒβ受容体との平衡解離定数（ＫＤ）をバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）技術によって測定することによって決定することができる。１つの実施形態において、受容体ＩＬ－２Ｒβ受容体に対する本発明のＩＬ－２変異タンパク質の結合親和性ＫＤ値は、ＩＬ－２－Ｆｃ融合タンパク質の形態でＢＬＩ測定において１０．０Ｅ－０９Ｍ未満、例えば６．０Ｅ－０９Ｍ、３．０Ｅ－０９Ｍ、２．０Ｅ－０９Ｍ、１．０Ｅ－０９Ｍ未満であり、さらに好ましくは９．０Ｅ－１０Ｍ未満であり、例えば６．０Ｅ－１０Ｍ、５．０Ｅ－１０Ｍ、４．０Ｅ－１０Ｍ、３．０Ｅ－１０Ｍ、２．０Ｅ－１０Ｍ、１．０Ｅ－１０Ｍ未満であり、さらに好ましくは９．０Ｅ－１１Ｍ、８．０Ｅ－１１Ｍ、または７．０Ｅ－１１Ｍ未満である。
【0042】
１つの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－２介在性ＣＤ２５＋細胞活性化および増殖の減少をもたらす。１つの実施形態において、ＣＤ２５＋細胞はＣＤ２５＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞である。別の実施形態において、ＣＤ２５＋細胞はＴｒｅｇ細胞である。１つの実施形態において、ＳＴＡＴ５リン酸化測定試験において、ＩＬ－２変異タンパク質がＣＤ２５＋細胞中でＳＴＡＴ５リン酸化シグナルを活性化することを検出することにより、ＩＬ－２変異タンパク質がＣＤ２５＋細胞を活性化する能力を同定する。例えば、半最大有効濃度（ＥＣ５０）は、本出願の実施例に記載されるように、フローサイトメトリーによって細胞中のＳＴＡＴ５リン酸化を分析することによって決定することができる。１つの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、例えばＦＣ融合タンパク質の形態で、ＳＴＡＴ５リン酸化測定試験において測定されるように、野生型ＩＬ－２タンパク質（例えば、配列番号１のヒトＩＬ－２）と比較して、ＣＤ２５＋細胞を活性化する能力を少なくとも１０倍、５０倍、１００倍、３００倍、１０００倍、３０００倍またはそれ以上低下させる。
【0043】
１つの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－２介在性ＣＤ２５－エフェクター細胞の維持されたかまたは増強された活性化および増殖をもたらす。１つの実施形態において、ＣＤ２５－細胞はＣＤ８＋エフェクターＴ細胞またはＮＫ細胞である。１つの実施形態において、ＳＴＡＴ５リン酸化測定試験において、ＣＤ２５－細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化シグナルを活性化するＩＬ－２変異タンパク質のＥＣ５０値を検出することによって、ＣＤ２５－細胞を活性化するＩＬ－２変異タンパク質の能力を同定する。１つの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、ＳＴＡＴ５リン酸化測定試験において測定されるように、野生型ＩＬ－２タンパク質（例えば、配列番号１のヒトＩＬ－２）と比較して、ＣＤ２５＋細胞を活性化する能力が少なくとも１倍、例えば２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、または１５０倍増加する。
【0044】
１つの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較してＩＬ－２がＣＤ２５＋細胞に対して優先的に活性化する偏向性を除去または減少させる。１つの実施形態において、ＣＤ２５＋細胞はＣＤ２５＋ＣＤ８＋Ｔ細胞である。別の実施形態において、ＣＤ２５＋細胞はＴｒｅｇ細胞である。１つの実施形態において、ＩＬ－２変異体がＣＤ２５－細胞を活性化する能力は、ＳＴＡＴ５リン酸化測定試験において、それぞれＣＤ２５－細胞およびＣＤ２５＋細胞においてＳＴＡＴ５リン酸化シグナルを活性化するＩＬ－２変異タンパク質のＥＣ５０値を検出することによって同定される。例えば、ＣＤ２５＋細胞に対するＩＬ－２変異タンパク質の活性化偏向は、ＣＤ２５－およびＣＤ２５＋Ｔ細胞上のＳＴＡＴ５リン酸化シグナルを活性化するＥＣ５０値の比を計算することによって決定される。好ましくは、変異タンパク質のＣＤ２５＋に対する偏向性は、野生型タンパク質と比較して少なくとも１００倍、好ましくは少なくとも１０００倍、２０００倍、３０００倍減少する。
【0045】
本発明の変異タンパク質
ＩＬ－２タンパク質は、４つのαヘリックス（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）構造を有する短鎖Ｉ型サイトカインファミリーのメンバーである。結晶構造（ＰＤＢ：１Ｚ９２）の分析によれば、ＩＬ－２は、アミノ酸残基領域３５－７２において、ＣＤ２５と相互作用する以下のアミノ酸部位３５、３７、３８、４１、４２、４３、４５、６１、６２、６８、７２を有する。結晶構造（ＰＤＢ：２ＥＲＪ）の分析によれば、ＩＬ－２は、アミノ酸残基領域１２－２３およびアミノ酸領域７９－９２においてＣＤ１２２と相互作用する以下の部位１２、１３、１５、１６、１９、２０、２３、７９、８１、８２、８３、８４、８７、８８、９１、９２を有する。
ＩＬ－２タンパク質は、４つのαヘリックス（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）構造を有する短鎖Ｉ型サイトカインファミリーのメンバーである。結晶構造（ＰＤＢ：１Ｚ９２）の分析によれば、ＩＬ－２は、アミノ酸残基領域３５－７２において、ＣＤ２５と相互作用する以下のアミノ酸部位３５、３７、３８、４１、４２、４３、４５、６１、６２、６８、７２を有する。結晶構造（ＰＤＢ：２ＥＲＪ）の分析によれば、ＩＬ－２は、アミノ酸残基領域１２－２３およびアミノ酸領域７９－９２においてＣＤ１２２と相互作用する以下の部位１２、１３、１５、１６、１９、２０、２３、７９、８１、８２、８３、８４、８７、８８、９１、９２を有する。
【0046】
本発明者らは、ＩＬ－２のアミノ酸残基領域３５－７２（以下、「ＣＤ２５結合領域」と略称する）のＣＤ２５相互作用部位（すなわち、部位３５、３７、３８、４１、４２、４３、４５、６１、６２、６８、７２）に特定の変異を導入することにより、ＩＬ－２Ｒβへの結合を維持または増強しながら、ＩＬ－２ＲαへのＩＬ－２の結合を低減または排除できることを見出した。本発明者らはまた、ＩＬ－２のアミノ酸残基領域７９－９２（以下、「ＣＤ１２２結合領域」と略称する）のＣＤ１２２相互作用部位（すなわち、部位７９、８１、８２、８３、８４、８７、８８、９１、９２）に特定の変異を導入することによって、ＩＬ－２βへのＩＬ－２の結合を増強することができることを見出した。さらに、本発明者らは、２つの領域の変異を組み合わせて、ＩＬ－２Ｒα結合の低減または排除とＩＬ－２β結合の増強の両方を有するＩＬ－２変異体を提供できることも見出した。
【0047】
これにより、本発明は、野生型ＩＬ－２（好ましくはヒトＩＬ－２、より好ましくは配列番号１で表される配列を含むＩＬ－２）と比較して、ＩＬ－２Ｒα受容体への結合親和性を排除または低減し、および／またはＩＬ－２Ｒβ受容体への結合親和性を増強する少なくとも１つの変異を含むＩＬ－２変異タンパク質を提供する。
【0048】
ＣＤ２５結合領域の変異
１つの態様において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－２がＩＬ－２Ｒα受容体（ＣＤ２５）と相互作用する部位、好ましくは配列番号１の３５、３７、３８、４１、４２、４３、４５、６１、６２、６８および７２に対応する位置に、ＩＬ－２Ｒα受容体への結合親和性を排除または低減し、好ましくはＩＬ－２Ｒβ結合親和性の増強をもたらす１つ以上の変異（好ましくは少なくとも３つ）を含む。好ましくは、上述したこれらの位置における変異はアミノ酸置換である。より好ましくは、これらの位置における変異は、それぞれ、３５位：Ｋ３５Ｄ，Ｅ、３７位：Ｔ３７Ｄ，Ｅ，Ｒ，Ｋ，Ｆ，Ｙ，Ｗ、３８位：Ｒ３８Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｙ，Ｗ，Ａ，Ｖ、４１位：Ｔ４１Ｋ，Ｒ，Ｍ，Ｆ，Ｙ，Ｗ，Ｑ，Ｅ、４２位：Ｆ４２Ｋ，Ｒ，Ａ，Ｅ，Ｑ、４３位：Ｋ４３Ｅ，Ｄ，Ｆ，Ｙ，Ｗ、４５位：Ｙ４５Ｒ，Ｋ、６１位：Ｅ６１Ｒ，Ｋ，Ｗ，Ｙ，Ｌ、６２位：Ｅ６２Ｒ，Ｋ，Ｗ，Ｙ，Ｌ、６８位：Ｅ６８Ｒ，Ｋ，Ｗ，Ｙ、７２位：Ｌ７２Ｒ，Ｋ，Ｆ，Ｙ，Ｗから選択される置換残基である。より好ましくは、これらの位置における置換残基は、それぞれ、Ｋ３５Ｄ，Ｅ、Ｔ３７Ｅ，Ｄ，Ｋ，Ｗ，Ｙ、Ｒ３８Ｗ，Ｅ，Ｄ，Ｖ，Ｆ，Ｋ、Ｔ４１Ｅ，Ｙ，Ｒ，Ｋ，Ｑ、Ｆ４２Ｅ，Ｒ，Ｋ，Ｑ，Ａ、Ｋ４３Ｅ，Ｙ，Ｄ，Ｗ、Ｙ４５Ｋ，Ｒ、Ｅ６１Ｋ，Ｒ，Ｌ，Ｗ、Ｅ６８Ｒ，Ｙ，Ｗ，Ｋ、Ｌ７２Ｋ，Ｆから選択される。さらに好ましくは、これらの位置における置換残基は、それぞれ、Ｋ３５Ｄ，Ｅ、Ｔ３７Ｄ，Ｅ、Ｒ３８Ｄ，Ｅ，Ｆ、Ｔ４１Ｅ、Ｆ４２Ａ，Ｅ，Ｑ、Ｋ４３Ｅ，Ｄ，Ｙ、Ｙ４５Ｒ，Ｋ、Ｅ６１Ｒ，Ｋ，Ｗ，Ｙ，Ｌ、Ｅ６２Ｒ，Ｗ、Ｅ６８Ｒ，Ｋ，Ｗ，Ｙ、Ｌ７２Ｋ，Ｆから選択される。最も好ましくは、前記変異タンパク質は、Ｋ３５Ｄ，Ｅ、Ｔ３７Ｅ、Ｒ３８Ｆ，Ｅ、Ｔ４１Ｅ、Ｆ４２Ａ，Ｅ、Ｙ４５Ｋ、Ｅ６８Ｙから選択される１つ以上の変異を含む。さらなる実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質において、ＩＬ－２Ｒα受容体への結合親和性を低減または排除する変異は、配列番号１の以下の位置に対応する位置における変異から選択される変異を含む。
１つの態様において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－２がＩＬ－２Ｒα受容体（ＣＤ２５）と相互作用する部位、好ましくは配列番号１の３５、３７、３８、４１、４２、４３、４５、６１、６２、６８および７２に対応する位置に、ＩＬ－２Ｒα受容体への結合親和性を排除または低減し、好ましくはＩＬ－２Ｒβ結合親和性の増強をもたらす１つ以上の変異（好ましくは少なくとも３つ）を含む。好ましくは、上述したこれらの位置における変異はアミノ酸置換である。より好ましくは、これらの位置における変異は、それぞれ、３５位：Ｋ３５Ｄ，Ｅ、３７位：Ｔ３７Ｄ，Ｅ，Ｒ，Ｋ，Ｆ，Ｙ，Ｗ、３８位：Ｒ３８Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｙ，Ｗ，Ａ，Ｖ、４１位：Ｔ４１Ｋ，Ｒ，Ｍ，Ｆ，Ｙ，Ｗ，Ｑ，Ｅ、４２位：Ｆ４２Ｋ，Ｒ，Ａ，Ｅ，Ｑ、４３位：Ｋ４３Ｅ，Ｄ，Ｆ，Ｙ，Ｗ、４５位：Ｙ４５Ｒ，Ｋ、６１位：Ｅ６１Ｒ，Ｋ，Ｗ，Ｙ，Ｌ、６２位：Ｅ６２Ｒ，Ｋ，Ｗ，Ｙ，Ｌ、６８位：Ｅ６８Ｒ，Ｋ，Ｗ，Ｙ、７２位：Ｌ７２Ｒ，Ｋ，Ｆ，Ｙ，Ｗから選択される置換残基である。より好ましくは、これらの位置における置換残基は、それぞれ、Ｋ３５Ｄ，Ｅ、Ｔ３７Ｅ，Ｄ，Ｋ，Ｗ，Ｙ、Ｒ３８Ｗ，Ｅ，Ｄ，Ｖ，Ｆ，Ｋ、Ｔ４１Ｅ，Ｙ，Ｒ，Ｋ，Ｑ、Ｆ４２Ｅ，Ｒ，Ｋ，Ｑ，Ａ、Ｋ４３Ｅ，Ｙ，Ｄ，Ｗ、Ｙ４５Ｋ，Ｒ、Ｅ６１Ｋ，Ｒ，Ｌ，Ｗ、Ｅ６８Ｒ，Ｙ，Ｗ，Ｋ、Ｌ７２Ｋ，Ｆから選択される。さらに好ましくは、これらの位置における置換残基は、それぞれ、Ｋ３５Ｄ，Ｅ、Ｔ３７Ｄ，Ｅ、Ｒ３８Ｄ，Ｅ，Ｆ、Ｔ４１Ｅ、Ｆ４２Ａ，Ｅ，Ｑ、Ｋ４３Ｅ，Ｄ，Ｙ、Ｙ４５Ｒ，Ｋ、Ｅ６１Ｒ，Ｋ，Ｗ，Ｙ，Ｌ、Ｅ６２Ｒ，Ｗ、Ｅ６８Ｒ，Ｋ，Ｗ，Ｙ、Ｌ７２Ｋ，Ｆから選択される。最も好ましくは、前記変異タンパク質は、Ｋ３５Ｄ，Ｅ、Ｔ３７Ｅ、Ｒ３８Ｆ，Ｅ、Ｔ４１Ｅ、Ｆ４２Ａ，Ｅ、Ｙ４５Ｋ、Ｅ６８Ｙから選択される１つ以上の変異を含む。さらなる実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質において、ＩＬ－２Ｒα受容体への結合親和性を低減または排除する変異は、配列番号１の以下の位置に対応する位置における変異から選択される変異を含む。
【0049】
Ｋ３５／Ｔ３７／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｋ４３、
Ｋ３５／Ｔ３７／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｋ４３／Ｌ７２、
Ｋ３５／Ｔ３７／Ｒ３８／Ｋ４３／Ｙ４５／Ｌ７２、
Ｋ３５／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｋ４３、
Ｋ３５／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｋ４３／Ｌ７２、
Ｋ３５／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｋ４３／Ｅ６１／Ｌ７２、
Ｋ３５／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｋ４３／Ｙ４５／Ｌ７２、
Ｋ３５／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｋ４３／Ｙ４５／Ｅ６１／Ｌ７２、
Ｋ３５／Ｒ３８／Ｆ４２／Ｙ４５、
Ｋ３５／Ｒ３８／Ｆ４２／Ｙ４５／Ｅ６１／Ｅ６８、
Ｋ３５／Ｒ３８／Ｆ４２／Ｅ６８／Ｌ７２、
Ｋ３５／Ｒ３８／Ｆ４２／Ｋ４３／Ｙ４５／Ｅ６８、
Ｋ３５／Ｒ３８／Ｆ４２／Ｋ４３／Ｙ４５／Ｅ６１／Ｅ６８、
Ｋ３５／Ｒ３８／Ｆ４２／Ｋ４３／Ｙ４５／Ｅ６１／Ｅ６８／Ｌ７２、
Ｋ３５／Ｔ３７／Ｒ３８／Ｆ４２、
Ｋ３５／Ｔ３７／Ｒ３８／Ｆ４２／Ｙ４５／Ｅ６１／Ｅ６８、
Ｋ３５／Ｔ３７／Ｒ３８／Ｆ４２／Ｋ４３／Ｙ４５／Ｅ６１／Ｅ６８、
Ｋ３５／Ｔ３７／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｆ４２／Ｋ４３／Ｙ４５／Ｅ６１／Ｅ６８、
Ｋ３５／Ｔ３７／Ｒ３８／Ｆ４２／Ｙ４５／Ｅ６１／Ｅ６２／Ｅ６８／Ｌ７２。
Ｋ３５／Ｔ３７／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｋ４３／Ｌ７２、
Ｋ３５／Ｔ３７／Ｒ３８／Ｋ４３／Ｙ４５／Ｌ７２、
Ｋ３５／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｋ４３、
Ｋ３５／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｋ４３／Ｌ７２、
Ｋ３５／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｋ４３／Ｅ６１／Ｌ７２、
Ｋ３５／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｋ４３／Ｙ４５／Ｌ７２、
Ｋ３５／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｋ４３／Ｙ４５／Ｅ６１／Ｌ７２、
Ｋ３５／Ｒ３８／Ｆ４２／Ｙ４５、
Ｋ３５／Ｒ３８／Ｆ４２／Ｙ４５／Ｅ６１／Ｅ６８、
Ｋ３５／Ｒ３８／Ｆ４２／Ｅ６８／Ｌ７２、
Ｋ３５／Ｒ３８／Ｆ４２／Ｋ４３／Ｙ４５／Ｅ６８、
Ｋ３５／Ｒ３８／Ｆ４２／Ｋ４３／Ｙ４５／Ｅ６１／Ｅ６８、
Ｋ３５／Ｒ３８／Ｆ４２／Ｋ４３／Ｙ４５／Ｅ６１／Ｅ６８／Ｌ７２、
Ｋ３５／Ｔ３７／Ｒ３８／Ｆ４２、
Ｋ３５／Ｔ３７／Ｒ３８／Ｆ４２／Ｙ４５／Ｅ６１／Ｅ６８、
Ｋ３５／Ｔ３７／Ｒ３８／Ｆ４２／Ｋ４３／Ｙ４５／Ｅ６１／Ｅ６８、
Ｋ３５／Ｔ３７／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｆ４２／Ｋ４３／Ｙ４５／Ｅ６１／Ｅ６８、
Ｋ３５／Ｔ３７／Ｒ３８／Ｆ４２／Ｙ４５／Ｅ６１／Ｅ６２／Ｅ６８／Ｌ７２。
【0050】
Ｋ３５／Ｔ３７／Ｒ３８／Ｆ４２／Ｙ４５／Ｅ６２／Ｅ６８、
Ｋ３５／Ｔ３７／Ｒ３８／Ｆ４２／Ｋ４３／Ｅ６８、
Ｋ３５／Ｔ３７／Ｆ４２／Ｋ４３、
Ｋ３５／Ｔ３７／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｌ７２、
Ｋ３５／Ｔ３７／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｆ４２、
Ｋ３５／Ｔ３７／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｆ４２／Ｋ４３／Ｅ６８、
Ｋ３５／Ｔ３７／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｆ４２／Ｋ４３／Ｙ４５、
Ｋ３５／Ｔ３７／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｆ４２／Ｋ４３／Ｙ４５／Ｌ７２、
Ｔ３７／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｆ４２／Ｋ４３／Ｙ４５、
Ｋ３５／Ｔ３７／Ｔ４１／Ｆ４２／Ｋ４３／Ｙ４５、
Ｋ３５／Ｔ３７／Ｔ４１／Ｆ４２／Ｋ４３／Ｅ６１／Ｅ６８／Ｌ７２、
Ｋ３５／Ｔ４１／Ｆ４２／Ｋ４３／Ｅ６８、
Ｋ３５／Ｔ３７／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｋ４３／Ｙ４５、
Ｋ３５／Ｔ３７／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｋ４３／Ｙ４５／Ｌ７２、
Ｋ３５／Ｔ３７／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｋ４３／Ｙ４５／Ｅ６１／Ｌ７２、
Ｋ３５／Ｔ３７／Ｒ３８／Ｋ４３／Ｌ７２、
Ｋ３５／Ｒ３８／Ｋ４３／Ｌ７２、
Ｋ３５／Ｔ３７／Ｅ６１／Ｌ７２、
Ｋ３５／Ｙ４５／Ｅ６１／Ｅ６８、
Ｋ３５／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｆ４２、
Ｋ３５／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｆ４２／Ｙ４５、
Ｋ３５／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｆ４２／Ｙ４５／Ｅ６８、
Ｋ３５／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｅ６８、
Ｋ３５／Ｒ３８／Ｙ４５／Ｅ６８／Ｌ７２、
Ｔ３７／Ｋ４３／Ｅ６８／Ｌ７２、
Ｔ３７／Ｋ４３／Ｙ４５／Ｅ６８／Ｌ７２、
Ｔ３７／Ｋ４３／Ｙ４５／Ｅ６１／Ｅ６８／Ｌ７２、
Ｔ３７／Ｆ４２／Ｙ４５／Ｅ６１／Ｅ６８／Ｌ７２、
Ｔ３７／Ｔ４１／Ｙ４５／Ｅ６１／Ｅ６８／Ｌ７２、
Ｒ３８／Ｔ４１／Ｆ４２／Ｙ４５／Ｅ６１／Ｅ６８、
Ｔ４１／Ｋ４３／Ｙ４５／Ｅ６１／Ｅ６８／Ｌ７２。
Ｋ３５／Ｔ３７／Ｒ３８／Ｆ４２／Ｋ４３／Ｅ６８、
Ｋ３５／Ｔ３７／Ｆ４２／Ｋ４３、
Ｋ３５／Ｔ３７／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｌ７２、
Ｋ３５／Ｔ３７／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｆ４２、
Ｋ３５／Ｔ３７／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｆ４２／Ｋ４３／Ｅ６８、
Ｋ３５／Ｔ３７／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｆ４２／Ｋ４３／Ｙ４５、
Ｋ３５／Ｔ３７／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｆ４２／Ｋ４３／Ｙ４５／Ｌ７２、
Ｔ３７／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｆ４２／Ｋ４３／Ｙ４５、
Ｋ３５／Ｔ３７／Ｔ４１／Ｆ４２／Ｋ４３／Ｙ４５、
Ｋ３５／Ｔ３７／Ｔ４１／Ｆ４２／Ｋ４３／Ｅ６１／Ｅ６８／Ｌ７２、
Ｋ３５／Ｔ４１／Ｆ４２／Ｋ４３／Ｅ６８、
Ｋ３５／Ｔ３７／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｋ４３／Ｙ４５、
Ｋ３５／Ｔ３７／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｋ４３／Ｙ４５／Ｌ７２、
Ｋ３５／Ｔ３７／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｋ４３／Ｙ４５／Ｅ６１／Ｌ７２、
Ｋ３５／Ｔ３７／Ｒ３８／Ｋ４３／Ｌ７２、
Ｋ３５／Ｒ３８／Ｋ４３／Ｌ７２、
Ｋ３５／Ｔ３７／Ｅ６１／Ｌ７２、
Ｋ３５／Ｙ４５／Ｅ６１／Ｅ６８、
Ｋ３５／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｆ４２、
Ｋ３５／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｆ４２／Ｙ４５、
Ｋ３５／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｆ４２／Ｙ４５／Ｅ６８、
Ｋ３５／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｅ６８、
Ｋ３５／Ｒ３８／Ｙ４５／Ｅ６８／Ｌ７２、
Ｔ３７／Ｋ４３／Ｅ６８／Ｌ７２、
Ｔ３７／Ｋ４３／Ｙ４５／Ｅ６８／Ｌ７２、
Ｔ３７／Ｋ４３／Ｙ４５／Ｅ６１／Ｅ６８／Ｌ７２、
Ｔ３７／Ｆ４２／Ｙ４５／Ｅ６１／Ｅ６８／Ｌ７２、
Ｔ３７／Ｔ４１／Ｙ４５／Ｅ６１／Ｅ６８／Ｌ７２、
Ｒ３８／Ｔ４１／Ｆ４２／Ｙ４５／Ｅ６１／Ｅ６８、
Ｔ４１／Ｋ４３／Ｙ４５／Ｅ６１／Ｅ６８／Ｌ７２。
【0051】
いくつかの好ましい実施形態において、ＩＬ－２Ｒα受容体への結合親和性を低減または排除する変異は、以下から選択される変異の組み合わせを含む。
【0052】
Ｋ３５Ｄ／Ｔ３７Ｋ／Ｒ３８Ｅ／Ｔ４１Ｋ／Ｆ４２Ｑ／Ｋ４３Ｄ／Ｅ６８Ｙ、Ｋ３５Ｄ／Ｔ３７Ｄ／Ｔ４１Ｆ／Ｆ４２Ｅ／Ｋ４３Ｄ／Ｙ４５Ｋ、Ｋ３５Ｄ／Ｔ３７Ｋ／Ｒ３８Ｄ／Ｔ４１Ｅ／Ｋ４３Ｅ、Ｋ３５Ｄ／Ｒ３８Ｅ／Ｔ４１Ｅ／Ｋ４３Ｅ、Ｋ３５Ｄ／Ｒ３８Ｆ／Ｆ４２Ｅ／Ｙ４５Ｋ、Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｄ／Ｔ４１Ｅ／Ｋ４３Ｅ／Ｌ７２Ｆ、Ｋ３５Ｄ／Ｔ３７Ｅ／Ｒ３８Ｄ／Ｋ４３Ｅ／Ｌ７２Ｆ、Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｄ／Ｔ４１Ｅ／Ｋ４３Ｅ／Ｅ６１Ｋ／Ｌ７２Ｆ、Ｋ３５Ｅ／Ｔ３７Ｄ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｋ／Ｅ６８Ｒ、Ｔ３７Ｅ／Ｋ４３Ｅ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６８Ｋ／Ｌ７２Ｋ、Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｅ／Ｔ４１Ｍ／Ｆ４２Ｅ／Ｙ４５Ｋ、Ｋ３５Ｄ／Ｔ３７Ｅ／Ｒ３８Ｄ／Ｔ４１Ｅ／Ｋ４３Ｅ、Ｋ３５Ｄ／Ｔ３７Ｄ／Ｒ３８Ｅ／Ｋ４３Ｅ／Ｌ７２Ｆ、Ｋ３５Ｅ／Ｔ３７Ｄ／Ｒ３８Ｄ／Ｋ４３Ｅ／Ｌ７２Ｆ、Ｋ３５Ｄ／Ｒ３８Ｄ／Ｔ４１Ｅ／Ｋ４３Ｅ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｗ／Ｌ７２Ｆ、Ｋ３５Ｄ／Ｔ３７Ｅ／Ｒ３８Ｄ／Ｔ４１Ｅ／Ｋ４３Ｅ／Ｌ７２Ｆ、Ｋ３５Ｄ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｅ／Ｅ６８Ｒ／Ｌ７２Ｆ、Ｋ３５Ｄ／Ｔ３７Ｅ／Ｒ３８Ｄ／Ｋ４３Ｙ／Ｙ４５Ｋ／Ｌ７２Ｆ、Ｋ３５Ｅ／Ｔ３７Ｄ／Ｒ３８Ｗ／Ｔ４１Ｅ／Ｆ４２Ａ／Ｋ４３Ｆ／Ｙ４５Ｋ、Ｋ３５Ｄ／Ｔ３７Ｅ／Ｒ３８Ｄ／Ｔ４１Ｒ／Ｆ４２Ｑ、Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｄ／Ｔ４１Ｅ／Ｋ４３Ｄ／Ｌ７２Ｆ、Ｋ３５Ｅ／Ｔ４１Ｑ／Ｆ４２Ｒ／Ｋ４３Ｄ／Ｅ６８Ｙ、Ｋ３５Ｅ／Ｔ３７Ｙ／Ｒ３８Ｗ／Ｔ４１Ｙ／Ｆ４２Ｅ／Ｋ４３Ｅ／Ｙ４５Ｋ／Ｌ７２Ｋ、Ｋ３５Ｄ／Ｔ３７Ｅ／Ｒ３８Ｄ／Ｋ４３Ｙ／Ｙ４５Ｒ／Ｌ７２Ｆ、Ｋ３５Ｅ／Ｔ３７Ｅ／Ｒ３８Ｄ／Ｔ４１Ｅ／Ｋ４３Ｙ、Ｔ３７Ｅ／Ｔ４１Ｋ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｌ／Ｅ６８Ｋ／Ｌ７２Ｋ、Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｗ／Ｅ６８Ｒ、Ｋ３５Ｄ／Ｔ３７Ｅ／Ｒ３８Ｅ／Ｔ４１Ｅ／Ｌ７２Ｆ、Ｋ３５Ｄ／Ｔ３７Ｄ／Ｒ３８Ｄ／Ｔ４１Ｅ／Ｌ７２Ｆ、Ｋ３５Ｄ／Ｒ３８Ｅ／Ｔ４１Ｅ／Ｋ４３Ｅ／Ｌ７２Ｆ、Ｋ３５Ｅ／Ｔ３７Ｄ／Ｒ３８Ｄ／Ｔ４１Ｅ／Ｋ４３Ｙ／Ｙ４５Ｋ、Ｋ３５Ｄ／Ｔ３７Ｄ／Ｆ４２Ａ／Ｋ４３Ｅ、Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｅ／Ｔ４１Ｅ／Ｋ４３Ｙ／Ｙ４５Ｋ／Ｌ７２Ｆ、Ｋ３５Ｄ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｅ／Ｋ４３Ｙ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｒ／Ｅ６８Ｙ、Ｒ３８Ｋ／Ｔ４１Ｒ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｙ／Ｅ６８Ｗ、Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｌ／Ｅ６８Ｒ、Ｋ３５Ｄ／Ｔ３７Ｅ／Ｒ３８Ｅ／Ｔ４１Ｅ／Ｋ４３Ｅ／Ｙ４５Ｋ／Ｌ７２Ｆ、Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｄ／Ｋ４３Ｅ／Ｌ７２Ｆ、Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｅ／Ｋ４３Ｅ／Ｌ７２Ｆ、Ｋ３５Ｄ／Ｔ３７Ｅ／Ｒ３８Ｄ／Ｌ７２Ｆ、Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｅ／Ｔ４１Ｅ／Ｋ４３Ｅ／Ｌ７２Ｆ、Ｋ３５Ｅ／Ｔ３７Ｅ／Ｒ３８Ｅ／Ｆ４２Ａ、Ｋ３５Ｄ／Ｒ３８Ｆ／Ｔ４１Ｅ／Ｆ４２Ｅ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６８Ｙ、Ｋ３５Ｅ／Ｔ３７Ｋ／Ｒ３８Ｅ／Ｔ４１Ｅ／Ｋ４３Ｅ／Ｌ７２Ｆ、Ｋ３５Ｄ／Ｒ３８Ｄ／Ｋ４３Ｅ／Ｌ７２Ｆ、Ｋ３５Ｄ／Ｒ３８Ａ／Ｔ４１Ｑ／Ｆ４２Ｒ、Ｋ３５Ｄ／Ｔ３７Ｅ／Ｒ３８Ｆ／Ｆ４２Ｅ／Ｋ４３Ｅ／Ｅ６８Ｒ、Ｋ３５Ｄ／Ｔ３７Ｅ／Ｒ３８Ｄ／Ｔ４１Ｅ／Ｋ４３Ｅ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｗ／Ｌ７２Ｆ、Ｔ３７Ｄ／Ｒ３８Ｆ／Ｔ４１Ｆ／Ｆ４２Ｅ／Ｋ４３Ｅ／Ｙ４５Ｒ、Ｋ３５Ｄ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｅ／Ｋ４３Ｅ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６８Ｋ、Ｋ３５Ｅ／Ｔ３７Ｄ／Ｒ３８Ｅ／Ｔ４１Ｅ／Ｋ４３Ｙ、Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｅ／Ｙ４５Ｋ、Ｋ３５Ｅ／Ｔ３７Ｄ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｅ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６８Ｙ／Ｌ７２Ｒ、Ｋ３５Ｅ／Ｔ３７Ｄ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６２Ｒ／Ｅ６８Ｒ、Ｋ３５Ｅ／Ｔ３７Ｄ／Ｔ４１Ｆ／Ｆ４２Ａ／Ｋ４３Ｅ／Ｅ６１Ｗ／Ｅ６８Ｋ／Ｌ７２Ｗ、Ｔ４１Ｋ／Ｋ４３Ｄ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｌ／Ｅ６８Ｋ／Ｌ７２Ｋ、Ｋ３５Ｅ／Ｔ３７Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｒ／Ｅ６８Ｒ、Ｋ３５Ｅ／Ｔ３７Ｄ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｋ／Ｅ６８Ｒ、Ｋ３５Ｅ／Ｔ３７Ｄ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｗ／Ｅ６８Ｒ、Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｋ／Ｅ６８Ｒ、Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｗ／Ｅ６８Ｒ、Ｋ３５Ｅ／Ｔ３７Ｄ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｒ／Ｅ６８Ｒ、Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｄ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６８Ｒ／Ｌ７２Ｋ、Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｒ／Ｅ６８Ｒ、Ｔ３７Ｅ／Ｋ４３Ｄ／Ｅ６８Ｙ／Ｌ７２Ｒ、Ｋ３５Ｅ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｌ／Ｅ６８Ｗ、Ｋ３５Ｅ／Ｔ３７Ｄ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｒ／Ｅ６８Ｒ、Ｋ３５Ｅ／Ｔ３７Ｄ／Ｒ３８Ｖ／Ｆ４２Ｅ／Ｋ４３Ｗ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｌ／Ｅ６８Ｗ、Ｋ３５Ｅ／Ｔ３７Ａ／ Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｒ／Ｅ６８Ｒ、Ｋ３５Ｅ／Ｔ３７Ｗ／Ｒ３８Ｅ／Ｔ４１Ｙ／Ｆ４２Ｒ／Ｋ４３Ｄ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｋ／Ｅ６８Ｗ、Ｋ３５Ｄ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｋ／Ｋ４３Ｙ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｒ／Ｅ６８Ｗ／Ｌ７２Ｋ、Ｋ３５Ｅ／Ｔ３７Ｅ／Ｅ６１Ｗ／Ｌ７２Ｋ、Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｙ／Ｔ４１Ｅ／Ｅ６８Ｙ、Ｋ３５Ｅ／Ｔ３７Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｋ／Ｅ６８Ｒ、Ｔ３７Ｄ／Ｋ４３Ｄ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｙ／Ｅ６８Ｋ／Ｌ７２Ｒ、Ｋ３５Ｄ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｅ／Ｋ４３Ｙ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｒ／Ｅ６８Ｙ／Ｌ７２Ｋ、Ｔ３７Ｅ／Ｆ４２Ｒ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｙ／Ｅ６８Ｋ／Ｌ７２Ｋ、Ｋ３５Ｅ／Ｔ３７Ｄ／Ｒ３８Ｖ／Ｆ４２Ａ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｒ／Ｅ６２Ｗ／Ｅ６８Ｙ／Ｌ７２Ｒ。
【0053】
いくつかの好ましい実施形態において、ＩＬ－２Ｒα受容体への結合親和性を低減または排除する変異は、Ｋ３５／Ｒ３８／Ｆ４２／Ｔ３７、Ｋ３５／Ｒ３８／Ｆ４２／Ｙ４５／Ｅ６１／Ｅ６８、Ｋ３５／Ｒ３８／Ｆ４２／Ｙ４５／Ｅ６１／Ｅ６８／Ｔ３７から選択される位置における変異を含む。好ましくは、前記変異は、Ｋ３５Ｅ，Ｒ３８Ｅ，Ｆ４２Ａ，Ｔ３７Ｅ、またはＫ３５Ｅ，Ｒ３８Ｗ，Ｆ４２Ｑ，Ｙ４５Ｒ／Ｋ，Ｅ６１Ｋ／Ｗ／Ｒ，Ｅ６８Ｒ、および場合によりＴ３７Ｄ／Ｅを含む。最も好ましくは、前記変異は、以下から選択される変異の組み合わせである。
【0054】
Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｅ／Ｆ４２Ａ／Ｔ３７Ｅ、Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｋ／Ｅ６８Ｒ、Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｗ／Ｅ６８Ｒ、Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｒ／Ｅ６８Ｒ、Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｋ／Ｅ６８Ｒ／Ｔ３７Ｄ、Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｋ／Ｅ６８Ｒ／Ｔ３７Ｄ、Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｗ／Ｅ６８Ｒ／Ｔ３７Ｄ、Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｒ／Ｅ６８Ｒ／Ｔ３７Ｄ、Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｒ／Ｅ６８Ｒ／Ｔ３７Ｄ、Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｒ／Ｅ６８Ｒ／Ｔ３７Ｅ、Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｋ／Ｅ６８Ｒ／Ｔ３７Ｅ。好ましくは、これらの変異の組み合わせを含む本発明のＩＬ－２タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較してＩＬ－２Ｒβ結合親和性を増加させ、より好ましくは、ＣＤ２５＋細胞の活性化偏向性を減少させる。
【0055】
いくつかの好ましい実施形態において、ＩＬ－２Ｒα受容体への結合親和性を低減または排除する変異は、Ｋ３５／Ｒ３８／Ｆ４２／Ｙ４５／Ｅ６１／Ｅ６８／Ｋ４３、Ｋ３５／Ｒ３８／Ｆ４２／Ｙ４５／Ｅ６１／Ｅ６８／Ｋ４３／Ｌ７２、Ｋ３５／Ｒ３８／Ｆ４２／Ｙ４５／Ｅ６１／Ｅ６８／Ｋ４３／Ｔ３７、Ｋ３５／Ｒ３８／Ｆ４２／Ｙ４５／Ｅ６１／Ｅ６８／Ｋ４３／Ｔ３７／Ｔ４１から選択される位置における変異を含む。好ましくは、前記変異は、Ｋ３５Ｄ／Ｅ，Ｒ３８Ｗ／Ｖ／Ｅ，Ｆ４２Ｅ／Ｋ／Ｒ，Ｙ４５Ｒ／Ｋ，Ｅ６１Ｒ／Ｌ／Ｋ，Ｅ６８Ｙ／Ｗ，Ｋ４３Ｙ／Ｗ／Ｄを含み、場合によりＴ３７Ｄ／Ｗ，Ｔ４１Ｙ、Ｌ７２Ｋのうちの１つ以上をさらに含む。より好ましくは、前記変異は、以下から選択される変異の組み合わせである。
【0056】
Ｋ３５Ｄ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｅ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｒ／Ｅ６８Ｙ／Ｋ４３Ｙ、Ｋ３５Ｄ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｅ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｒ／Ｅ６８Ｙ／Ｋ４３Ｙ／Ｌ７２Ｋ、Ｋ３５Ｄ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｋ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｒ／Ｅ６８Ｗ／Ｋ４３Ｙ／Ｌ７２Ｋ、Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｖ／Ｆ４２Ｅ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｌ／Ｅ６８Ｗ／Ｔ３７Ｄ／Ｋ４３Ｗ、Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｅ／Ｆ４２Ｒ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｋ／Ｅ６８Ｗ／Ｔ３７Ｗ／Ｋ４３Ｄ／Ｔ４１Ｙ。より好ましくは、前記変異は、
Ｋ３５Ｄ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｅ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｒ／Ｅ６８Ｙ／Ｋ４３Ｙ／Ｌ７２Ｋである。好ましくは、これらの変異の組み合わせを含む本発明のＩＬ－２タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較してＩＬ－２Ｒα受容体結合親和性が低減または排除され、ＩＬ－２Ｒβ結合親和性が向上する。
Ｋ３５Ｄ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｅ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｒ／Ｅ６８Ｙ／Ｋ４３Ｙ／Ｌ７２Ｋである。好ましくは、これらの変異の組み合わせを含む本発明のＩＬ－２タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較してＩＬ－２Ｒα受容体結合親和性が低減または排除され、ＩＬ－２Ｒβ結合親和性が向上する。
【0057】
いくつかの実施形態において、ＩＬ－２Ｒα受容体への結合親和性を低減または排除する変異は、Ｋ３５／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｋ４３、Ｋ３５／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｋ４３／Ｔ３７、Ｋ３５／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｋ４３／Ｌ７２、Ｋ３５／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｋ４３／Ｔ３７／Ｌ７２、Ｋ３５／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｋ４３／Ｅ６１／Ｌ７２、Ｋ３５／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｋ４３／Ｙ４５／Ｌ７２、Ｋ３５／Ｒ３８／Ｋ４３／Ｔ３７／Ｌ７２、Ｋ３５／Ｒ３８／Ｋ４３／Ｔ３７／Ｌ７２／Ｙ４５から選択される位置における変異を含む。好ましくは、前記変異は、Ｋ３５Ｄ／Ｅ，Ｒ３８Ｄ／Ｅ，Ｔ４１Ｅ，Ｋ４３Ｅ／Ｙを含み、場合によりＴ３７Ｋ／Ｅ，Ｙ４５Ｋ，Ｅ６１Ｋ，Ｌ７２Ｆから選択される１つまたは２つをさらに含む。または、好ましくは、前記変異は、Ｋ３５Ｄ／Ｅ，Ｒ３８Ｄ，Ｋ４３Ｅ／Ｙ，Ｔ３７Ｄ／Ｅ，Ｌ７２Ｆを含み、場合によりＹ４５Ｋをさらに含む。より好ましくは、前記変異は、以下から選択される変異の組み合わせである。
【0058】
Ｋ３５Ｄ／Ｒ３８Ｅ／Ｔ４１Ｅ／Ｋ４３Ｅ、Ｋ３５Ｄ／Ｔ３７Ｋ／Ｒ３８Ｄ／Ｔ４１Ｅ／Ｋ４３Ｅ、Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｅ／Ｔ４１Ｅ／Ｋ４３Ｅ／Ｌ７２Ｆ、Ｋ３５Ｄ／Ｔ３７Ｅ／Ｒ３８Ｄ／Ｔ４１Ｅ／Ｋ４３Ｅ／Ｌ７２Ｆ、Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｄ／Ｔ４１Ｅ／Ｋ４３Ｅ／Ｅ６１Ｋ／Ｌ７２Ｆ、Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｅ／Ｔ４１Ｅ／Ｋ４３Ｙ／Ｙ４５Ｋ／Ｌ７２Ｆ、Ｋ３５Ｄ／Ｔ３７Ｅ／Ｒ３８Ｄ／Ｋ４３Ｅ／Ｌ７２Ｆ、Ｋ３５Ｅ／Ｔ３７Ｄ／Ｒ３８Ｄ／Ｋ４３Ｅ／Ｌ７２Ｆ、Ｋ３５Ｄ／Ｔ３７Ｅ／Ｒ３８Ｄ／Ｋ４３Ｙ／Ｙ４５Ｋ／Ｌ７２Ｆ。
より好ましくは、前記変異は、以下から選択される変異の組み合わせである。
より好ましくは、前記変異は、以下から選択される変異の組み合わせである。
【0059】
Ｋ３５Ｄ／Ｔ３７Ｅ／Ｒ３８Ｄ／Ｔ４１Ｅ／Ｋ４３Ｅ／Ｌ７２Ｆ、Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｄ／Ｔ４１Ｅ／Ｋ４３Ｅ／Ｅ６１Ｋ／Ｌ７２Ｆ、Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｅ／Ｔ４１Ｅ／Ｋ４３Ｙ／Ｙ４５Ｋ／Ｌ７２Ｆ、Ｋ３５Ｄ／Ｔ３７Ｅ／Ｒ３８Ｄ／Ｋ４３Ｅ／Ｌ７２Ｆ、Ｋ３５Ｅ／Ｔ３７Ｄ／Ｒ３８Ｄ／Ｋ４３Ｅ／Ｌ７２Ｆ、Ｋ３５Ｄ／Ｔ３７Ｅ／Ｒ３８Ｄ／Ｋ４３Ｙ／Ｙ４５Ｋ／Ｌ７２Ｆ。最も好ましくは、前記変異は、Ｋ３５Ｄ／Ｒ３８Ｅ／Ｔ４１Ｅ／Ｋ４３Ｅである。これらの変異の組み合わせを含む本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較してＩＬ－２Ｒα受容体結合親和性が低減または排除され、ＩＬ－２Ｒβ結合親和性が向上することが好ましく、ＣＤ２５＋細胞に対する活性化偏向性が低減することがより好ましい。
【0060】
いくつかの好ましい実施形態において、ＩＬ－２Ｒα受容体に対する結合親和性を低減または排除する変異は、Ｋ３５／Ｒ３８／Ｆ４２／Ｙ４５／Ｅ６１／Ｅ６８、Ｋ３５／Ｒ３８／Ｆ４２／Ｙ４５／Ｅ６１／Ｅ６８／Ｔ３７、Ｋ３５／Ｒ３８／Ｆ４２／Ｔ３７、Ｋ３５／Ｒ３８／Ｔ４１／Ｋ４３から選択される位置における変異を含む。
【0061】
いくつかの好ましい実施形態において、ＩＬ－２Ｒα受容体への結合親和性を低減または排除する変異は、Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｅ／Ｆ４２Ａ／Ｔ３７Ｅ、Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｋ／Ｅ６８Ｒ、Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｗ／Ｅ６８Ｒ、Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｒ／Ｅ６８Ｒ、Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｋ／Ｅ６８Ｒ／Ｔ３７Ｄ、Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｋ／Ｅ６８Ｒ／Ｔ３７Ｄ、Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｗ／Ｅ６８Ｒ／Ｔ３７Ｄ、Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｒ／Ｅ６８Ｒ／Ｔ３７Ｄ、Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｒ／Ｅ６８Ｒ／Ｔ３７Ｄ、Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｒ／Ｅ６８Ｒ／Ｔ３７Ｅ、Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｋ／Ｅ６８Ｒ／Ｔ３７Ｅ、Ｋ３５Ｄ／Ｒ３８Ｅ／Ｔ４１Ｅ／Ｋ４３Ｅから選択される変異の組み合わせを含む。これらの変異の組み合わせは、本発明のＩＬ－２変異タンパク質が野生型ＩＬ－２と比較してＩＬ－２Ｒα受容体結合親和性を低減または排除し、ＩＬ－２Ｒβ結合親和性を増加させることを可能にし、ＣＤ２５＋細胞の活性化偏向性を減少させる一方で、ＣＤ２５－エフェクター細胞の活性化および／または増殖を維持または増強する。
【0062】
さらに好ましい実施形態において、ＩＬ－２Ｒα受容体への結合親和性を低減または排除する変異は、Ｋ３５Ｄ／Ｔ３７Ｅ／Ｒ３８Ｅ／Ｔ４１Ｅ／Ｋ４３Ｅ／Ｙ４５Ｋ／Ｌ７２Ｆ、Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｄ／Ｔ４１Ｅ／Ｋ４３Ｅ／Ｌ７２Ｆ、Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｌ／Ｅ６８Ｒ、Ｋ３５Ｄ／Ｔ３７Ｋ／Ｒ３８Ｅ／Ｔ４１Ｋ／Ｆ４２Ｑ／Ｋ４３Ｄ／Ｅ６８Ｙ、Ｋ３５Ｄ／Ｔ３７Ｅ／Ｒ３８Ｄ／Ｋ４３Ｙ／Ｙ４５Ｋ／Ｌ７２Ｆ、Ｋ３５Ｅ／Ｔ３７Ｙ／Ｒ３８Ｗ／Ｔ４１Ｙ／Ｆ４２Ｅ／Ｋ４３Ｅ／Ｙ４５Ｋ／Ｌ７２Ｋ、Ｋ３５Ｄ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｅ／Ｋ４３Ｅ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６８Ｋ、Ｋ３５Ｅ／Ｔ４１Ｑ／Ｆ４２Ｒ／Ｋ４３Ｄ／Ｅ６８Ｙ、Ｋ３５Ｄ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｅ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｒ／Ｅ６８Ｙ／Ｋ４３Ｙ、Ｋ３５Ｄ／Ｒ３８Ｆ／Ｔ４１Ｅ／Ｆ４２Ｅ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６８Ｙ、Ｋ３５Ｅ／Ｔ３７Ｋ／Ｒ３８Ｅ／Ｔ４１Ｅ／Ｋ４３Ｅ／Ｌ７２Ｆ、Ｒ３８Ｋ／Ｔ４１Ｒ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｙ／Ｅ６８Ｗから選択される変異の組み合わせを含む。有利には、これらの変異の組み合わせは、ＩＬ－２Ｒβ結合を増加させる本発明の７９－９２領域の変異と組み合わせて、ＩＬ－２Ｒαと結合せずにＩＬ－２Ｒβとの結合を増強するＩＬ－２変異タンパク質を提供することができる。
【0063】
ＣＤ１２２結合領域の変異
さらに別の態様において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、ＩＬ－２がそのβ受容体ＣＤ１２２（すなわちＩＬ－２Ｒβ）と相互作用する部位、好ましくは配列番号１の位置７９、８１、８２、８３、８４、８７、８８、９１、９２に対応する位置に、ＩＬ－２Ｒβへの結合親和性を増強する１つ以上の変異を含むことができる。好ましくは、上述したこれらの位置における変異はアミノ酸置換である。より好ましくは、これらの位置における変異は、それぞれ、Ｈ７９Ｒ，Ｋ，Ｙ，Ｗ，Ｄ，Ｅ，Ｑ、Ｒ８１Ｄ，Ｅ，Ｎ，Ｑ，Ｔ，Ｈ，Ｙ，Ｗ、Ｐ８２Ｉ，Ｔ，Ａ、Ｒ８３Ｅ、Ｄ８４Ｅ，Ｎ，Ｑ，Ｈ，Ｔ，Ｖ、Ｓ８７Ｔ，Ｄ，Ｎ，Ｅ，Ｑ，Ｋ，Ｒ，Ｙ，Ｗ、Ｎ８８Ｄ，Ｅ，Ｑ，Ｈ，Ｙ，Ｗ、Ｖ９１Ｔ，Ｌ，Ｉ，Ｍ，Ｄ，Ｎ，Ｅ，Ｑ，Ｈ、Ｉ９２Ｖ，Ｌ，Ｍ，Ｆ，Ｙ，Ｗ，Ｎ，Ｄ，Ｅ，Ｑから選択される置換残基である。
１つの好ましい実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、配列番号１の位置７９、８１、８２、８３、８７、９１、９２に対応する位置に１つ以上の変異、好ましくはアミノ酸置換、特にＨ７９Ｄ，Ｅ，Ｑ、Ｒ８１Ｄ，Ｎ、Ｐ８２Ｉ，Ｔ，Ａ、Ｒ８３Ｅ、Ｓ８７Ｄ，Ｅ、Ｖ９１Ｌ，Ｉ、Ｉ９２Ｌ，Ｍ，Ｆ，Ｙから選択される１つ以上の置換を含む。１つの実施形態において、本発明の変異タンパク質は、配列番号１の位置１２、１３、１５、１６、１９、２０、２３に対応する位置で、野生型ＩＬ－２タンパク質と比較して不変のままである。
さらに別の態様において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、ＩＬ－２がそのβ受容体ＣＤ１２２（すなわちＩＬ－２Ｒβ）と相互作用する部位、好ましくは配列番号１の位置７９、８１、８２、８３、８４、８７、８８、９１、９２に対応する位置に、ＩＬ－２Ｒβへの結合親和性を増強する１つ以上の変異を含むことができる。好ましくは、上述したこれらの位置における変異はアミノ酸置換である。より好ましくは、これらの位置における変異は、それぞれ、Ｈ７９Ｒ，Ｋ，Ｙ，Ｗ，Ｄ，Ｅ，Ｑ、Ｒ８１Ｄ，Ｅ，Ｎ，Ｑ，Ｔ，Ｈ，Ｙ，Ｗ、Ｐ８２Ｉ，Ｔ，Ａ、Ｒ８３Ｅ、Ｄ８４Ｅ，Ｎ，Ｑ，Ｈ，Ｔ，Ｖ、Ｓ８７Ｔ，Ｄ，Ｎ，Ｅ，Ｑ，Ｋ，Ｒ，Ｙ，Ｗ、Ｎ８８Ｄ，Ｅ，Ｑ，Ｈ，Ｙ，Ｗ、Ｖ９１Ｔ，Ｌ，Ｉ，Ｍ，Ｄ，Ｎ，Ｅ，Ｑ，Ｈ、Ｉ９２Ｖ，Ｌ，Ｍ，Ｆ，Ｙ，Ｗ，Ｎ，Ｄ，Ｅ，Ｑから選択される置換残基である。
１つの好ましい実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、配列番号１の位置７９、８１、８２、８３、８７、９１、９２に対応する位置に１つ以上の変異、好ましくはアミノ酸置換、特にＨ７９Ｄ，Ｅ，Ｑ、Ｒ８１Ｄ，Ｎ、Ｐ８２Ｉ，Ｔ，Ａ、Ｒ８３Ｅ、Ｓ８７Ｄ，Ｅ、Ｖ９１Ｌ，Ｉ、Ｉ９２Ｌ，Ｍ，Ｆ，Ｙから選択される１つ以上の置換を含む。１つの実施形態において、本発明の変異タンパク質は、配列番号１の位置１２、１３、１５、１６、１９、２０、２３に対応する位置で、野生型ＩＬ－２タンパク質と比較して不変のままである。
【0064】
いくつかの好ましい実施形態において、ＩＬ－２Ｒβへの結合親和性を増強する前記変異は、Ｈ７９／Ｒ８１／Ｓ８７／Ｉ９２、Ｈ７９／Ｒ８１／Ｓ８７／Ｉ９２／Ｐ８２から選択される位置における変異を含む。好ましくは、前記変異は、Ｈ７９Ｄ／Ｅ、Ｒ８１Ｄ、Ｓ８７Ｄ／Ｅ、Ｉ９２Ｌ／Ｆを含み、場合によりＰ８２Ｔをさらに含む。より好ましくは、前記変異は、Ｈ７９Ｄ／Ｒ８１Ｄ／Ｓ８７Ｄ／Ｉ９２Ｌ、およびＨ７９Ｄ／Ｒ８１Ｄ／Ｐ８２Ｔ／Ｓ８７Ｄ／Ｉ９２Ｌから選択される組み合わせ変異を含む。好ましくは、前記変異の組み合わせは、野生型ＩＬ－２と比較して本発明のＩＬ－２変異タンパク質のＩＬ－２Ｒβ結合親和性の有意な増加を可能にし、より好ましくは、ＣＤ２５－エフェクター細胞の活性化および／または増殖の増強をもたらす。
【0065】
いくつかの好ましい実施形態において、ＩＬ－２Ｒβへの結合親和性を増強する前記変異は、Ｒ８１／Ｒ８３／Ｓ８７、Ｒ８１／Ｒ８３／Ｓ８７／Ｉ９２、Ｒ８１／Ｐ８２／Ｒ８３／Ｓ８７、またはＲ８１／Ｐ８２／Ｒ８３／Ｓ８７／Ｉ９２から選択される位置における変異を含み、好ましくは、Ｈ７９およびＶ９１の一方または両方の位置における変異をさらに含む。好ましくは、前記変異は、Ｒ８１Ｄ， Ｐ８２Ｔ／Ｉ／Ａ，Ｒ８３Ｅ，Ｓ８７Ｅ／Ｄ、Ｒ８１Ｄ／Ｎ，Ｐ８２Ｔ／Ｉ／Ａ，Ｒ８３Ｅ，Ｓ８７Ｅ／Ｄ，Ｉ９２／Ｌ／Ｍ／Ｆ／Ｙ、Ｒ８１Ｄ，Ｒ８３Ｅ，Ｓ８７Ｅ／Ｄ、Ｒ８１Ｄ，Ｒ８３Ｅ，Ｓ８７Ｅ／Ｄ，Ｉ９２Ｌから選択される組み合わせ変異を含み、より好ましくは、Ｈ７９Ｄ／Ｅ／ＱおよびＶ９１Ｌ／Ｉの一方または両方をさらに含む。より好ましくは、前記変異は、Ｈ７９Ｄ／Ｒ８１Ｄ／Ｓ８７Ｄ／Ｉ９２Ｌ、Ｈ７９Ｄ／Ｒ８１Ｄ／Ｐ８２Ｔ／Ｓ８７Ｄ／Ｉ９２Ｌ、Ｒ８１Ｄ／Ｐ８２Ｔ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｅ、Ｒ８１Ｄ／Ｐ８２Ｔ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｅ／Ｖ９１Ｌ、Ｒ８１Ｄ／Ｐ８２Ａ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｅ／Ｖ９１Ｌ、Ｈ７９Ｅ／Ｒ８１Ｄ／Ｐ８２Ｔ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｅ／Ｖ９１Ｌ、Ｈ７９Ｅ／Ｒ８１Ｄ／Ｐ８２Ｉ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｄ、Ｈ７９Ｑ／Ｒ８１Ｄ／Ｐ８２Ａ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｅ、Ｒ８１Ｎ／Ｐ８２Ｔ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｅ／Ｖ９１Ｌ／Ｉ９２Ｆ、Ｈ７９Ｄ／Ｒ８１Ｎ／Ｐ８２Ｔ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｅ／Ｖ９１Ｌ／Ｉ９２Ｆ、Ｒ８１Ｄ／Ｐ８２Ｔ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｄ／Ｉ９２Ｍ、Ｈ７９Ｅ／Ｒ８１Ｄ／Ｐ８２Ｉ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｅ／Ｉ９２Ｍ、Ｈ７９Ｑ／Ｒ８１Ｄ／Ｐ８２Ｔ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｄ／Ｖ９１Ｌ／Ｉ９２Ｙ、Ｒ８１Ｄ／Ｐ８２Ｉ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｄ／Ｖ９１Ｉ／Ｉ９２Ｙ、Ｒ８１Ｄ／Ｐ８２Ｔ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｄ／Ｉ９２Ｌ、Ｒ８１Ｄ／Ｐ８２Ｔ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｄ／Ｖ９１Ｌ／Ｉ９２Ｌ、Ｒ８１Ｄ／Ｐ８２Ａ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｅ／Ｉ９２Ｌ、Ｈ７９Ｅ／Ｒ８１Ｎ／Ｐ８２Ａ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｄ／Ｉ９２Ｌ、Ｒ８１Ｄ／Ｐ８２Ｔ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｅ／Ｉ９２Ｍ、Ｒ８１Ｄ／Ｐ８２Ａ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｅ／Ｉ９２Ｍ、Ｈ７９Ｅ／Ｒ８１Ｄ／Ｐ８２Ａ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｅ／Ｉ９２Ｍ、Ｒ８１Ｄ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｄ／Ｉ９２Ｌ、Ｒ８１Ｄ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｅ／Ｉ９２Ｌ、Ｈ７９Ｄ／Ｒ８１Ｄ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｄ、Ｈ７９Ｄ／Ｒ８１Ｄ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｅ／Ｖ９１Ｉ／Ｉ９２Ｌから選択される変異の組み合わせである。好ましくは、前記変異の組み合わせは、野生型ＩＬ－２と比較して本発明のＩＬ－２変異タンパク質のＩＬ－２Ｒβ結合親和性の有意な増加を可能にし、より好ましくは、ＣＤ２５－エフェクター細胞の活性化および／または増殖の増強をもたらす。
【0066】
いくつかの実施形態において、ＩＬ－２Ｒβへの結合親和性を増強する変異は、以下から選択される組み合わせ変異である。
【0067】
Ｈ７９Ｄ／Ｒ８１Ｄ／Ｓ８７Ｄ／Ｉ９２Ｌ、Ｈ７９Ｅ／Ｒ８１Ｄ／Ｐ８２Ｔ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｅ／Ｖ９１Ｌ、Ｈ７９Ｅ／Ｒ８１Ｄ／Ｐ８２Ｉ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｄ、Ｈ７９Ｑ／Ｒ８１Ｄ／Ｐ８２Ａ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｅ、Ｒ８１Ｄ／Ｐ８２Ｔ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｄ／Ｉ９２Ｌ、Ｒ８１Ｄ／Ｐ８２Ｔ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｄ／Ｖ９１Ｌ／Ｉ９２Ｌ、Ｒ８１Ｄ／Ｐ８２Ａ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｅ／Ｉ９２Ｌ、Ｈ７９Ｅ／Ｒ８１Ｎ／Ｐ８２Ａ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｄ／Ｉ９２Ｌ、Ｒ８１Ｄ／Ｐ８２Ｔ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｅ／Ｉ９２Ｍ、Ｒ８１Ｄ／Ｐ８２Ａ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｅ／Ｉ９２Ｍ、Ｈ７９Ｅ／Ｒ８１Ｄ／Ｐ８２Ａ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｅ／Ｉ９２Ｍ、Ｈ７９Ｄ／Ｒ８１Ｄ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｅ／Ｖ９１Ｉ／Ｉ９２Ｌ。有利には、これらの変異の組み合わせは、ＩＬ－２Ｒα結合親和性を低減する本発明の３５－７２位置領域の変異と組み合わせて、ＩＬ－２Ｒαと結合せず、ＩＬ－２Ｒβとの結合を増強するＩＬ－２変異タンパク質を提供することができる。
【0068】
ＣＤ２５結合領域の変異とＣＤ１２２結合領域の変異の組み合わせ
さらに別の態様において、本発明は、ＣＤ２５結合領域の変異およびＣＤ１２２結合領域の変異を含むＩＬ－２変異タンパク質を提供し、好ましくは、前記変異タンパク質は、ＩＬ－２Ｒα結合を低減（または排除）し、ＩＬ－２Ｒβ結合を増強し、より好ましくは、より高い発現量および製品純度などの改善された薬物形成性能をさらに有する。
さらに別の態様において、本発明は、ＣＤ２５結合領域の変異およびＣＤ１２２結合領域の変異を含むＩＬ－２変異タンパク質を提供し、好ましくは、前記変異タンパク質は、ＩＬ－２Ｒα結合を低減（または排除）し、ＩＬ－２Ｒβ結合を増強し、より好ましくは、より高い発現量および製品純度などの改善された薬物形成性能をさらに有する。
【0069】
いくつかの好ましい態様において、本発明は、以下の変異の組み合わせから選択される組み合わせを含むＩＬ－２変異タンパク質を提供する。
【表1】
【0070】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明は、野生型ＩＬ－２と比較してＣＤ２５＋Ｔ細胞におけるシグナル伝達を刺激する能力が低下しているＩＬ－２変異タンパク質を提供し、好ましくは、前記変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２タンパク質（例えば、配列番号１のヒトＩＬ－２タンパク質）と比較して、以下から選択される変異の組み合わせ（のみ）を含む。
【0071】
Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｅ／Ｆ４２Ａ／Ｔ３７Ｅ、
Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｋ／Ｅ６８Ｒ、
Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｗ／Ｅ６８Ｒ、
Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｒ／Ｅ６８Ｒ、
Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｋ／Ｅ６８Ｒ／Ｔ３７Ｄ、
Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｋ／Ｅ６８Ｒ／Ｔ３７Ｄ、
Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｗ／Ｅ６８Ｒ／Ｔ３７Ｄ、
Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｒ／Ｅ６８Ｒ／Ｔ３７Ｄ、
Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｒ／Ｅ６８Ｒ／Ｔ３７Ｄ、
Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｒ／Ｅ６８Ｒ／Ｔ３７Ｅ、
Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｋ／Ｅ６８Ｒ／Ｔ３７Ｅ。
Ｋ３５Ｄ／Ｒ３８Ｅ／Ｔ４１Ｅ／Ｋ４３Ｅ。
Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｋ／Ｅ６８Ｒ、
Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｗ／Ｅ６８Ｒ、
Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｒ／Ｅ６８Ｒ、
Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｋ／Ｅ６８Ｒ／Ｔ３７Ｄ、
Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｋ／Ｅ６８Ｒ／Ｔ３７Ｄ、
Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｗ／Ｅ６８Ｒ／Ｔ３７Ｄ、
Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６１Ｒ／Ｅ６８Ｒ／Ｔ３７Ｄ、
Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｒ／Ｅ６８Ｒ／Ｔ３７Ｄ、
Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｒ／Ｅ６８Ｒ／Ｔ３７Ｅ、
Ｋ３５Ｅ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｑ／Ｙ４５Ｒ／Ｅ６１Ｋ／Ｅ６８Ｒ／Ｔ３７Ｅ。
Ｋ３５Ｄ／Ｒ３８Ｅ／Ｔ４１Ｅ／Ｋ４３Ｅ。
【0072】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明は、野生型ＩＬ－２と比較してＣＤ２５＋Ｔ細胞におけるシグナル伝達を刺激する能力が低下し、ＣＤ２５－Ｔ細胞におけるシグナル伝達を刺激する能力が増強するＩＬ－２変異タンパク質を提供し、好ましくは、前記変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２タンパク質（例えば、配列番号１のヒトＩＬ－２タンパク質）と比較して、以下から選択される変異の組み合わせ（のみ）を含む。
【0073】
Ｋ３５Ｄ／Ｒ３８Ｗ／Ｆ４２Ｅ／Ｋ４３Ｅ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６８Ｋ／Ｒ８１Ｄ／Ｐ８２Ｔ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｅ／Ｉ９２Ｍ、
Ｋ３５Ｄ／Ｒ３８Ｆ／Ｔ４１Ｅ／Ｆ４２Ｅ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６８Ｙ／Ｒ８１Ｄ／Ｐ８２Ｔ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｄ／Ｖ９１Ｌ／Ｉ９２Ｌ。
Ｋ３５Ｄ／Ｒ３８Ｆ／Ｔ４１Ｅ／Ｆ４２Ｅ／Ｙ４５Ｋ／Ｅ６８Ｙ／Ｒ８１Ｄ／Ｐ８２Ｔ／Ｒ８３Ｅ／Ｓ８７Ｄ／Ｖ９１Ｌ／Ｉ９２Ｌ。
【0074】
その他の変異
上記の領域および位置における変異に加えて、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、それが本発明のＩＬ－２変異タンパク質の上記の１つ以上の有益な特性を保持する限り、他の領域または位置に１つ以上の変異を有してもよい。例えば、本発明のＩＬ－２変異タンパク質はまた、Ｃ１２５Ｓ．Ｃ１２５Ａ、Ｃ１２５Ｔ、またはＣ１２５Ｖなどの位置１２５における置換を含むことができ、改善された発現または均質性または安定性などのさらなる利点を提供する（例えば、米国特許第４，５１８，５８４号を参照）。当業者は、本発明のＩＬ－２変異タンパク質に組み込むことができる追加の変異を決定する方法を知っている。
上記の領域および位置における変異に加えて、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、それが本発明のＩＬ－２変異タンパク質の上記の１つ以上の有益な特性を保持する限り、他の領域または位置に１つ以上の変異を有してもよい。例えば、本発明のＩＬ－２変異タンパク質はまた、Ｃ１２５Ｓ．Ｃ１２５Ａ、Ｃ１２５Ｔ、またはＣ１２５Ｖなどの位置１２５における置換を含むことができ、改善された発現または均質性または安定性などのさらなる利点を提供する（例えば、米国特許第４，５１８，５８４号を参照）。当業者は、本発明のＩＬ－２変異タンパク質に組み込むことができる追加の変異を決定する方法を知っている。
【0075】
ＩＬ－２変異タンパク質と野生型タンパク質との間の配列の相違は、配列同一性によって、または両者の間の異なるアミノ酸の数によって表すことができる。１つの実施形態において、ＩＬ－２変異タンパク質と野生型タンパク質との間に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％の同一性、好ましくは９０％以上の同一性、好ましくは９５％であるが、好ましくは９７％以下、より好ましくは９６％以下の同一性を有する。別の実施形態において、ＩＬ－２変異タンパク質と野生型タンパク質との間には、上述の本発明のＣＤ２５結合領域の変異またはＣＤ１２２結合領域の変異、またはそれらの組み合わせ変異に加えて、１５個以下、例えば１－１０個、または１－５個の変異が存在し得る。１つの実施形態において、前記他の変異は保存的置換であり得る。１つの実施形態において、前記他の変異はＩＬ－２の他の改善された性質を付与する変異であり得る。
【0076】
２.融合タンパク質および免疫複合体
本発明はまた、本発明のＩＬ－２変異タンパク質を含む融合タンパク質を提供する。１つの好ましい実施形態において、本発明のＩＬ－変異タンパク質は、改善された薬物動態特性を付与することができる別のポリペプチド、例えばアルブミン、より好ましくは抗体Ｆｃ断片と融合される。好ましくは、Ｆｃ断片は、Ｆｃγ受容体への結合を低減するＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異またはＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａなどのエフェクター機能を減少または除去する変異を含む。好ましくは、Ｆｃを含む融合タンパク質は、増加した血清半減期を有する。１つの好ましい実施形態において、Ｆｃを含む融合タンパク質は、同時に、Ｆｃ領域が介在するエフェクター機能、例えば、ＡＤＣＣまたはＡＤＣＰまたはＣＤＣを減少させる。
本発明はまた、本発明のＩＬ－２変異タンパク質を含む融合タンパク質を提供する。１つの好ましい実施形態において、本発明のＩＬ－変異タンパク質は、改善された薬物動態特性を付与することができる別のポリペプチド、例えばアルブミン、より好ましくは抗体Ｆｃ断片と融合される。好ましくは、Ｆｃ断片は、Ｆｃγ受容体への結合を低減するＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異またはＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａなどのエフェクター機能を減少または除去する変異を含む。好ましくは、Ｆｃを含む融合タンパク質は、増加した血清半減期を有する。１つの好ましい実施形態において、Ｆｃを含む融合タンパク質は、同時に、Ｆｃ領域が介在するエフェクター機能、例えば、ＡＤＣＣまたはＡＤＣＰまたはＣＤＣを減少させる。
【0077】
本発明はまた、本発明のＩＬ－２変異タンパク質および抗原結合分子を含む免疫複合体を提供する。好ましくは、抗原結合分子は、免疫グロブリン分子、特にＩｇＧ分子、または抗体もしくは抗体断片、特にＦａｂ分子およびｓｃＦｖ分子である。いくつかの実施形態において、前記抗原結合分子は、腫瘍細胞上または腫瘍環境中に存在する抗原、例えば、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、テネイシンＣのＡ１ドメイン（ＴＮＣ Ａ１）、テネイシンＣのＡ２ドメイン（ＴＮＣ Ａ２）、フィブロネクチンの外部ドメインＢ（Ｅｘｔｒａ Ｄｏｍａｉｎ Ｂ、ＥＤＢ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）からなる群から選択される抗原と特異的に結合する。したがって、本発明の免疫複合体は、対象への投与後に腫瘍細胞または腫瘍環境を標的とすることができ、さらなる治療上の利点、例えば、より低い用量での治療の可能性およびそれによる副作用の低減、抗腫瘍効果の増強などを提供する。
【0078】
本発明の融合タンパク質および免疫複合体において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、別の分子または抗原結合分子に直接またはリンカーを介して結合することができ、いくつかの実施形態において、タンパク質加水分解切断部位が両者の間に含まれる。
【0079】
３．ポリヌクレオチド、ベクターと宿主
本発明は、上記ＩＬ－２変異タンパク質または融合体または複合体のいずれかをコードする核酸を提供する。本発明の変異タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、当該技術分野において周知の方法を用いて、新規固相ＤＮＡ合成、または野生型ＩＬ－２をコードする既存の配列のＰＣＲ変異誘発によって生成することができる。さらに、本発明のポリヌクレオチドおよび核酸は、分泌シグナルペプチドをコードするセグメントを含み、本発明の変異タンパク質をコードするセグメントに作動可能に連結されて、本発明の変異タンパク質の分泌発現を誘導することができる。
本発明は、上記ＩＬ－２変異タンパク質または融合体または複合体のいずれかをコードする核酸を提供する。本発明の変異タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、当該技術分野において周知の方法を用いて、新規固相ＤＮＡ合成、または野生型ＩＬ－２をコードする既存の配列のＰＣＲ変異誘発によって生成することができる。さらに、本発明のポリヌクレオチドおよび核酸は、分泌シグナルペプチドをコードするセグメントを含み、本発明の変異タンパク質をコードするセグメントに作動可能に連結されて、本発明の変異タンパク質の分泌発現を誘導することができる。
【0080】
本発明はまた、本発明の核酸を含むベクターを提供する。１つの実施形態において、ベクターは発現ベクターで、例えば、真核発現ベクターである。ベクターの非限定的な例は、ウイルス、プラスミド、コスミド、λファージまたは酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含む。好ましい実施形態において、本発明の発現ベクターはｐＹＤＯ＿０１７発現ベクター（配列番号１３）である。
【0081】
本発明はまた、前記核酸または前記ベクターを含む宿主細胞を提供する。変異ＩＬ－２タンパク質または融合体または免疫複合体の発現を複製および支持するのに適した宿主細胞は、当該技術分野において周知である。このような細胞は、特定の発現ベクターでトランスフェクションまたは形質導入することができ、しかもベクターを含む多くの細胞を培養して大型の発酵槽に接種して、臨床用として十分な量のＩＬ－２変異体または融合体または免疫複合体が得られる。１つの実施形態において、宿主細胞は真核細胞である。別の実施形態において、宿主細胞は、酵母細胞、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞もしくは２９３細胞）から選択される。例えば、ポリペプチドは、特にグリコシル化を必要としない場合、細菌中で生成することができる。発現後、可溶性画分においてポリペプチドを細菌細胞のペースト状物から分離して、さらに精製することができる。原核生物の他、糸状菌または酵母などのような真核微生物は、ポリペプチドコーディングベクターのための適切なクローンまたは発現の宿主であり、グリコシル化経路が既に「ヒト化」される真菌と酵母菌株を含み、これは、一部または完全のヒトグリコシル化モードを有するポリペプチドの生成を引き起こす。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈ２２，１４０９－１４１４（２００４）およびＬｉ ｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈ２４，２１０－２１５（２００６）が参照される。有用の哺乳動物宿主細胞系の実例は、ＳＶ４０形質転換のサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ－７）、ヒト胎児腎臓系（例えばＧｒａｈａｍ ｅｔａｌ．，ＪＧｅｎＶｉｒｏｌ３６，５９（１９７７）に説明した２９３または２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ（ｓｅｒｔｏｌｉ）細胞（例えばＭａｔｈｅｒ，ＢｉｏｌＲｅｐｒｏｄ２３，２４３－２５１（１９８０）に説明したＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ）、犬腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、ｂｕｆｆａｌｏラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えばＭａｔｈｅｒ ｅｔａｌ．，ＡｎｎａｌｓＮ．Ｙ．ＡｃａｄＳｃｉ３８３，４４－６８（１９８２）に説明）、ＭＲＣ ５細胞、およびＦＳ４細胞である。使用可能な他の哺乳動物宿主細胞株は、ｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ７７，４２１６（１９８０））などのチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３およびＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。１つの実施形態において、宿主細胞は真核生物細胞、好ましくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚腎（ＨＥＫ）細胞、またはリンパ球（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）などの哺乳動物細胞である。
【0082】
４．調製方法
さらに別の態様において、本発明は、本発明のＩＬ－２変異タンパク質または融合体または複合体を調製する方法を提供し、前記方法は、ＩＬ－２変異タンパク質または融合体または複合体の発現に適した条件下で、前記タンパク質または融合体または複合体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することと、場合により宿主細胞（または宿主細胞培地）から前記タンパク質または融合体または複合体を回収することとを含む。
さらに別の態様において、本発明は、本発明のＩＬ－２変異タンパク質または融合体または複合体を調製する方法を提供し、前記方法は、ＩＬ－２変異タンパク質または融合体または複合体の発現に適した条件下で、前記タンパク質または融合体または複合体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することと、場合により宿主細胞（または宿主細胞培地）から前記タンパク質または融合体または複合体を回収することとを含む。
【0083】
５．測定手法
本分野において既知の様々な測定手法を利用して、本発明のＩＬ－２変異タンパク質に対して同定、スクリーニング、またはその物理的／化学的特性および／または生物学的活性の特性評価を行うことができる。
本分野において既知の様々な測定手法を利用して、本発明のＩＬ－２変異タンパク質に対して同定、スクリーニング、またはその物理的／化学的特性および／または生物学的活性の特性評価を行うことができる。
【0084】
１つの態様において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質に対してＩＬ－２受容体への結合活性を測定することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ、Ｗｅｓｔｅｒｎブロットなどのような本分野において既知の方法、または本出願の実施例に開示されている例示的な方法を利用して、ヒトＩＬ－２Ｒαまたはβタンパク質との結合を測定することができる。例えば、細胞表面上で変異タンパク質を発現するようにトランスフェクトされた細胞、例えば酵母ディスプレイ細胞を、標識された（例えばビオチン標識された）ＩＬ－２Ｒαまたはβタンパク質と反応させるフローサイトメトリーを用いて測定することができる。あるいは、結合動力学（例えば、ＫＤ値）を含む変異タンパク質の受容体への結合は、組換え変異タンパク質－Ｆｃ融合体を使用してバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）測定手法において測定することができる。いくつかの実施形態において、例えば実施例に記載のＢＬＩ測定手法を使用する。
【0085】
さらに別の態様において、受容体結合の下流で起こるシグナル伝達および／または免疫賦活効果を測定することによって、ＩＬ－２変異タンパク質がＩＬ－２受容体と結合する能力を間接的に測定することができる。
【0086】
したがって、いくつかの実施形態において、生物学的活性を有する変異ＩＬ－２タンパク質を同定するための測定手法をさらに提供する。生物学的活性には、例えば、ＩＬ－２受容体を有するＴおよび／またはＮＫ細胞の増殖を誘導する能力、ＩＬ－２受容体を有するＴおよび／またはＮＫ細胞におけるＩＬ－２シグナル伝達を誘導する能力、二次サイトカインとしてＮＫ細胞を介してインターフェロン（ＩＦＮ）－γを産生する能力、Ｔ細胞におけるアポトーシスを誘導する能力の低下、腫瘍の退縮および／または生存の改善を誘導する能力、並びに血管透過性の低下などのインビボ毒性特性の低下が含まれ得る。本発明は、インビボおよび／またはインビトロにおいて、かかる生物学的活性を有する変異ＩＬ－２タンパク質も提供する。
【0087】
ＩＬ－２の生物学的活性を決定するために、当技術分野で公知の様な方法を使用することができる。例えば、本発明のＩＬ－２変異タンパク質がＮＫ細胞のＩＦＮ－γ産生を刺激する能力を試験するための適切な測定手法は、培養されたＮＫ細胞を本発明の変異ＩＬ－２タンパク質または融合または免疫複合体とインキュベートし、その後、培地中のＩＦＮ－γ濃度をＥＬＩＳＡにより測定することを含む。ＩＬ－２シグナル伝達は、いくつかのシグナル伝達経路を誘導し、ＪＡＫ（Ｊａｎｕｓキナーゼ）およびＳＴＡＴ（シグナル伝達物質および転写活性化因子）シグナル伝達分子に関与する。
【0088】
ＩＬ－２と受容体βおよびγサブユニットとの相互作用は、受容体ならびにＪＡＫ１およびＪＡＫ３（βおよびγサブユニットとそれぞれ結合する）のリン酸化をもたらす。次に、ＳＴＡＴ５はリン酸化受容体と結合し、それ自体が非常に重要なチロシン残基上でリン酸化される。これは、標的遺伝子の転写を促進する、受容体解離、ＳＴＡＴ５二量体化、およびＳＴＡＴ５二量体から核へのＳＴＡＴ５のシフトをもたらす。したがって、変異体ＩＬ－２ポリペプチドがＩＬ－２受容体を介してシグナル伝達を誘導する能力は、例えばＳＴＡＴ５のリン酸化を測定することによって評価することができる。この方法の詳細は、実施例に開示されている。例えば、ＰＢＭＣを本発明の変異体ＩＬ－２ポリペプチドまたは融合体または免疫複合体で処理し、リン酸化ＳＴＡＴ５のレベルをフローサイトメトリーによって決定することができる。
【0089】
さらに、Ｔ細胞またはＮＫ細胞応答ＩＬ－２の増殖は、血液から単離されたＴ細胞またはＮＫ細胞を本発明の変異体ＩＬ－２ポリペプチドまたは免疫複合体とインキュベートし、次いで処理細胞の溶解物中のＡＴＰ含量を測定することによって測定することができる。処理前に、Ｔ細胞を植物レクチン（ＰＨＡ－Ｍ）で予備刺激することができる。この測定手法は、生存細胞数の高感度定量を可能にし、多数の適切な代替測定手法（例えば、［３Ｈ］－チミジン取り込み測定手法、細胞滴定ＧｌｏＡＴＰ測定手法、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ測定手法、ＷＳＴ－１測定手法、ＭＴＴ測定手法）も当技術分野で知られている。
【0090】
さらに、腫瘍成長および生存に対する変異ＩＬ－２の効果は、当技術分野で公知の様々な動物腫瘍モデルにおいて評価することができる。例えば、ヒト癌細胞株の異種移植片を免疫不全マウスに移植し、本発明の変異体ＩＬ－２ポリペプチドまたは融合体または免疫複合体で処理することができる。死亡率、生命期観察（行動、体重、体温などの有害作用の可視症状）、ならびに臨床病理学および解剖病理学（血液化学測定および／または組織病理学分析など）に基づいて、本発明の変異体ＩＬ－２ポリペプチド、融合および免疫複合体のインビボでの毒性を測定することができる。例えば、ＩＬ－２処理によって誘発された血管透過性は、血管透過性前処理動物モデルにおいて、血管滲出レポータ分子を用いて検査することができる。好ましくは、血管滲出レポータ分子は、前処理のためのＩＬ－２野生型形態の透過性を明らかにするのに十分な大きさである。
【0091】
６．スクリーニング方法
さらに別の態様において、本発明は、ＩＬ－２Ｒα受容体に対するＩＬ－２タンパク質の結合親和性を排除または低減し、および／またはＩＬ－２Ｒβ受容体に対する結合親和性を増強する方法であって、野生型ＩＬ－２タンパク質に、本明細書に記載される変異または変異の組み合わせを導入することと、野生型ＩＬ－２タンパク質と比較して、ＩＬＲαまたはβに対して変化している結合親和性、および／または改善されている生物学的活性、例えば前述のとおり本発明のＩＬ－２変異タンパク質に関して説明した特性のうちの１つ以上を有する変異タンパク質を（例えば、前述の測定方法を用いて）同定することとを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、変異テンプレートとして使用される親野生型ＩＬ－２タンパク質は、好ましくは配列番号１と少なくとも８０％、または少なくとも９５％または９９％またはそれ以上の同一性を有し、より好ましくはヒト由来ＩＬ－２タンパク質である。
さらに別の態様において、本発明は、ＩＬ－２Ｒα受容体に対するＩＬ－２タンパク質の結合親和性を排除または低減し、および／またはＩＬ－２Ｒβ受容体に対する結合親和性を増強する方法であって、野生型ＩＬ－２タンパク質に、本明細書に記載される変異または変異の組み合わせを導入することと、野生型ＩＬ－２タンパク質と比較して、ＩＬＲαまたはβに対して変化している結合親和性、および／または改善されている生物学的活性、例えば前述のとおり本発明のＩＬ－２変異タンパク質に関して説明した特性のうちの１つ以上を有する変異タンパク質を（例えば、前述の測定方法を用いて）同定することとを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、変異テンプレートとして使用される親野生型ＩＬ－２タンパク質は、好ましくは配列番号１と少なくとも８０％、または少なくとも９５％または９９％またはそれ以上の同一性を有し、より好ましくはヒト由来ＩＬ－２タンパク質である。
【0092】
７．医薬組成物と薬物製剤
本発明はまた、ＩＬ－２変異タンパク質またはその融合体または免疫複合体を含む組成物（医薬組成物または薬物製剤を含む）、およびＩＬ－２変異タンパク質またはその融合体または免疫複合体をコードするポリヌクレオチドを含む組成物を含む。これらの組成物はまた、本分野で既知の薬学的に許容可能な担体、緩衝剤を含む薬用賦形剤などの適切な医薬品添加物を必要に応じて含んでもよい。
本発明はまた、ＩＬ－２変異タンパク質またはその融合体または免疫複合体を含む組成物（医薬組成物または薬物製剤を含む）、およびＩＬ－２変異タンパク質またはその融合体または免疫複合体をコードするポリヌクレオチドを含む組成物を含む。これらの組成物はまた、本分野で既知の薬学的に許容可能な担体、緩衝剤を含む薬用賦形剤などの適切な医薬品添加物を必要に応じて含んでもよい。
【0093】
本発明に適する薬学的に許容可能な担体は、石油、動物もしくは植物に由来するまたは合成された、ピーナッツオイル、大豆油、鉱油、ごま油など、水、油などの滅菌液体であってもよい。医薬組成物を静脉内に投与する場合、水はベクターとして好ましい。さらに、生理塩水溶液、水性デキストロースとグリセリン溶液を液体ベクターとして、特に注射溶液に用いることができる。適切な薬用賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセリン、プロピレン、ジオール、水、エタノールなどを含む。賦形剤の使用およびその用途に関しては、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」，５ｔｈ ｅｄｉｔｏｎ，Ｒ．Ｃ．Ｒｏｗｅ，Ｐ．Ｊ．Ｓｅｓｋｅｙ、Ｓ．Ｃ．Ｏｗｅｎ，ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＰｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｃｈｉｃａｇｏが参照される。必要があれば、前記組成物は湿潤剤、乳化剤、またはｐＨ緩衝剤をさらに少量に含有してもよい。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末、持続性放出製剤などの形態を採用できる。経口製剤は、薬用マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンなどの標準的なベクターを含んでもよい。
【0094】
所望の純度を有する本発明のＩＬ－２変異タンパク質、融合体または免疫複合体を任意の１つまたは複数の医薬品添加物（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｏｓｏｌ，Ａ．（１９８０））と混合することによって、本発明を含む薬物製剤を調製し、好ましくは凍結乾燥製剤または水溶液の形式で調製する。例示的な凍結乾燥抗体製剤に関する説明は、米国特許第６，２６７，９５８号が参照される。水性抗体製剤に関しては、米国特許第６，１７１，５８６号、世界特許ＷＯ２００６／０４４９０８が参照され、後者の製剤はヒスチジン－アセテート緩衝剤を含む。また、持続性放出製剤を調製できる。持続性放出製剤の適切な例は、タンパク質を含有する疎水性固体ポリマーによる半透性マトリックスを含み、前記マトリックスは、フィルムまたはマイクロカプセルなどのように一定の形態を有する。
【0095】
本発明の医薬組成物または製剤は、１種以上の他の活性成分をさらに含んでもよく、前記活性成分は、特定の適応症の治療に必要であり、好ましくは互いにマイナスの影響を与えない活性的に相補な活性成分を含む。例えば、好ましくは、化学療法剤、ＰＤ－１軸結合拮抗剤（例えば、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗ＰＤ－Ｌ２抗体）などの他の抗がん活性成分をさらに提供する。前記活性成分は、目的用途において有効な量で適切に組み合わせた形で存在する。
【0096】
したがって、１つの実施形態において、組成物は、第２の治療剤をさらに含む。例えば、第２の治療剤は免疫チェックポイント阻害剤であってもよい。例えば、第２の治療剤は、例えば、抗－ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＣＤ４７抗体、抗－ＰＤ－１抗体、抗－ＰＤ－Ｌ１抗体、抗－ＣＤ４０抗体、抗－ＯＸ４０ （ＣＤ１３４、ＴＮＦＲＳＦ４、ＡＣＴ３５および／またはＴＸＧＰ１Ｌとも呼ばれる）抗体、抗－ＬＡＧ－３抗体、抗－ＣＤ７３抗体、抗－ＣＤ１３７抗体、抗－ＣＤ２７抗体、抗－ＣＳＦ－１Ｒ抗体、ＴＬＲアゴニストまたはＩＤＯまたはＴＧＦβの小分子アンタゴニストを含むが、これらに限定されない１つ以上から選択することができる。好ましくは、第２の治療剤は、ＰＤ－１拮抗剤であり、特に抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ－３、抗ＣＤ４７である。免疫治療薬物に加えて、第２の治療剤は、他の放射線療法または化学療法薬物であってもよい。
【0097】
８．組み合わせ製品
１つの態様において、本発明は、本発明の変異タンパク質またはその融合体または免疫複合体、および１種以上の他の治療剤（例えば、化学療法剤、他の抗体、細胞傷害剤、ワクチン、抗感染症剤など）を含む組み合わせ製品をさらに提供する。本発明の組み合わせ製品は、本発明の治療方法において使用できる。
１つの態様において、本発明は、本発明の変異タンパク質またはその融合体または免疫複合体、および１種以上の他の治療剤（例えば、化学療法剤、他の抗体、細胞傷害剤、ワクチン、抗感染症剤など）を含む組み合わせ製品をさらに提供する。本発明の組み合わせ製品は、本発明の治療方法において使用できる。
【0098】
いくつかの実施形態において、本発明は、組み合わせ製品を提供し、ここで、前記他の治療剤が、例えば、免疫応答を刺激して対象の免疫応答をさらに増強、刺激または上方制御するのに有効な、抗体などの治療剤である。いくつかの実施形態において、他の抗体は、例えば、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗ＰＤ－Ｌ２抗体または抗－ＬＡＧ－３抗体または抗－ＣＴＬＡ－４抗体または抗ＴＩＭ－３抗体である。
【0099】
いくつかの実施形態において、前記組み合わせ製品は、腫瘍の予防または治療に用いられる。いくつかの実施形態において、腫瘍は、がん、例えば、胃がん、直腸がん、結腸がん、結腸直腸がんなどの胃腸管がん、または悪性黒色腫などの皮膚がん、または腎細胞癌、膀胱癌、非小細胞肺癌などである。いくつかの実施形態において、前記組み合わせ製品は、例えば細菌感染、ウイルス感染、真菌感染、原生動物感染などの感染の予防または治療に用いられる。
【0100】
９．治療方法と使用
本出願では、用語「個体」または「対象」は、互いに切り替えて用いることができ、哺乳動物を指す。哺乳動物は、家畜（例えば、ウシ、ヤギ、ネコ、イヌとウマ）、霊長類（例えば、ヒトとサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウスとラット）を含むが、これらに限定されない。特に、対象はヒトである。
本出願では、用語「個体」または「対象」は、互いに切り替えて用いることができ、哺乳動物を指す。哺乳動物は、家畜（例えば、ウシ、ヤギ、ネコ、イヌとウマ）、霊長類（例えば、ヒトとサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウスとラット）を含むが、これらに限定されない。特に、対象はヒトである。
【0101】
本明細書では、用語「治療」は、治療を受けている個体における疾病の天然過程を変化させようとする臨床介入を指す。所望の治療效果は、疾病の出現または再発を防止すること、症状を軽減すること、疾病の如何なる直接的または間接的病理学結果を減少すること、転移を防止すること、病状進展速度を低減すること、疾病の状態を改善または緩和させること、および、予後を緩和または改善させることを含むが、これらに限定されない。
【0102】
１つの態様において、本発明は、対象の免疫系を刺激する方法であって、本発明のＩＬ－２変異タンパク質または融合体または免疫複合体を含む医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む方法を提供する。本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、ＣＤ２５－ＣＤ１２２＋エフェクター細胞（細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞）に対して高い活性および選択性を有し、ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞に対する刺激作用を低減および除去する。したがって、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、対象の免疫系を刺激するために低用量で使用することができる。
【0103】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、対象における身体の免疫応答を増強する方法に関し、前記方法は、本明細書に記載の任意のＩＬ－２変異タンパク質、またはその融合体または免疫複合体の有効量を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質またはその融合体または免疫複合体を、抗腫瘍免疫応答を刺激するように、腫瘍を携帯する対象に投与する。別の一部の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合部分を、抗感染免疫応答を刺激するように、感染を携帯する対象に投与する。１つの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、Ｔｒｅｇによる免疫抑制をさらに低減するために、Ｔｒｅｇ枯渇抗体（例えば、ＦｃγＲ介在性Ｔｒｅｇ枯渇）と組み合わせて使用することができる。１つの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて、例えば、抗ＰＤ－１および抗ＣＴＬＡ－４と組み合わせて、癌免疫治療効果を増強するために投与することができる。
【0104】
別の態様において、本発明は、腫瘍および癌および感染症などの対象の疾患を治療する方法に関し、前記方法は、本明細書に記載の任意のＩＬ－２変異タンパク質、またはその融合体または免疫複合体の有効量を前記対象に投与することを含む。
【0105】
がんは、早期、中期または末期にあるがんまたは転移性がんであってもよい。いくつかの実施形態において、腫瘍または腫瘍細胞は、結腸直腸腫瘍、卵巣腫瘍、膵臓腫瘍、肺腫瘍、肺腫瘍、肝腫瘍、乳房腫瘍、腎臓腫瘍、前立腺腫瘍、胃腸腫瘍、黒色腫、子宮頸部腫瘍、膀胱腫瘍、神経膠芽腫および頭頸部腫瘍から選択され得る。いくつかの実施形態において、がんは、結腸直腸がん、卵巣がん、膵臓がん、肺がん、肝臓がん、乳がん、腎臓がん、前立腺がん、胃腸がん、黒色腫、子宮頸がん、膀胱がん、神経膠芽腫および頭頸部がんから選択され得る。いくつかの実施形態において、腫瘍はメラノーマ、腎細胞癌、結腸直腸癌、膀胱癌、非小細胞肺癌である。
【0106】
別の態様において、本発明は、対象における感染性疾患、例えば慢性感染の治療方法に関し、前記方法は、本明細書に係る任意のＩＬ－２変異タンパク質またはその断片、または前記抗体もしくは断片を含む免疫複合体、多重特異性抗体、または医薬組成物の有効量を前記対象に投与することを含む。１つの実施形態において、前記感染はウイルス感染である。
【0107】
いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質またはその融合体または複合体の他、本発明の方法は、前記対象に１種以上の療法（例えば、治療法および／または他の治療剤）を組み合わせて適用することをさらに含む。いくつかの実施形態において、治療法は、手術治療および／または放射線治療を含む。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、少なくとも１種の他の免疫刺激性抗体、例えば、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗－ＬＡＧ－３抗体、抗ＣＤ４３抗体、および／または抗ＣＴＬＡ－４抗体を投与することをさらに含み、これらの抗体は、例えば、完全ヒト化抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体であり得る。
【0108】
いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－１抗体は、ＩＢＩ３０８（シンディリマブ、ＷＯ２０１７／０２５０１６Ａ１）、ＭＤＸ－１１０６（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、ＯＰＤＩＶＯ）、Ｍｅｒｃｋ ３４７５（ＭＫ－３４７５、ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、ＫＥＹＴＲＵＤＡ）、ＣＴ－０１１（Ｐｉｄｉｌｉｚｕｍａｂ）から選択される。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－１抗体はＭＤＸ－１１０６である。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－１抗体は、ｎｉｖｏｌｕｍａｂ（ＣＡＳ登録番号：９４６４１４－９４－４）である。さらに、いくつかの実施形態において、ＩＬ－２変異タンパク質またはその断片は、単独でまたはＰＤ－１拮抗剤との組み合わせとして、１種以上の他の療法、例えば、治療方式および／または他の治療剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、治療法は、外科的手術（例えば、腫瘍切除）、放射線治療（例えば、照射領域が設定された三次元原体放射線療法などの外部粒子ビーム療法）、局所照射（例えば、所定の標的もしくは器官に対する照射）または集中的照射などを含む。
【0109】
いくつかの実施形態において、本明細書は、本発明の変異タンパク質およびＣＴＬＡ－４拮抗性抗体を対象に投与することを含む、疾患（例えば、腫瘍）を治療する方法を提供する。抗－ＣＴＬＡ－４抗体は、例えば、ＹＥＲＶＯＹ(R)（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂまたは抗体１０Ｄ１、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ０１／１４４２４に記載されている）、ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ（旧称ｔｉｃｉｌｉｍｕｍａｂ，ＣＰ－６７５，２０６）、およびＷＯ ９８／４２７５２、ＷＯ ００／３７５０４、米国特許第６，２０７，１５６号、Ｈｕｒｗｉｔｚｅｔａｌ．（１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５（１７）：１００６７－１００７１、Ｃａｍａｃｈｏ ｅｔａｌ．（２００４） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２２（１４５）： Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ． ２５０５ （抗体ＣＰ－６７５２０６）、およびＭｏｋｙｒ ｅｔａｌ．（１９９８） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５８：５３０１－５３０４に記載されている抗－ＣＴＬＡ－４抗体からなる群から選択される抗体であり得る。
【0110】
いくつかの実施形態において、本明細書は、本発明の抗－変異タンパク質および抗－ＬＡＧ－３拮抗剤抗体を対象に投与することを含む、疾患（例えば、腫瘍）を治療する方法を提供する。抗－ＬＡＧ３抗体は、例えば、米国特許出願番号ＵＳ２０１１／０１５０８９２およびＷＯ２０１４／００８２１８に記載されている抗体２５Ｆ７、２６Ｈ１０、２５Ｅ３、８Ｂ７、１１Ｆ２、または１７Ｅ５、またはこれらの抗体のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体、ＢＭＳ－９８６０１６、ＵＳ２０１１／００７０２３に記載されているＩＭＰ７３１から選択され得る。
【0111】
いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、化学療法または化学療法剤と併用して投与されてもよい。いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、放射線療法または放射線療法剤と併用して投与されてもよい。いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、標的療法または標的治療剤と併用して投与されてもよい。いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、免疫療法または免疫治療剤、例えばモノクローナル抗体と併用して投与されてもよい。
【0112】
本発明の変異（およびそれを含む医薬組成物またはその融合体または免疫複合体、任意の他の治療剤）は、非経口投与、肺内投与、鼻腔内投与を含む任意の適切な方法により投与されてもよく、かつ、局所治療の場合は、病巣内に投与されてもよい。非経口注入は、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与または皮下投与を含む。なお、投与期間の長さによって、例えば、静脈内注射投与または皮下注射投与などの注射を含む任意の適切な経路にすることができる。本発明において、非限定的であるが、単回投与または複数の時刻での複数回投与、ボーラス投与、パルス療法などの様々な頻度の投与が含まれる。
【0113】
本発明の変異タンパク質は、疾患の予防または治療に用いられる場合、その適切な投与量（単独で投与される場合または１種以上の他の治療剤と組み合わせて投与される場合）が、治療対象疾患の種類、抗体のタイプ、疾患の重症度とその経過、予防目的であるか治療目的であるか、これまでの治療歴、患者の臨床病歴、前記抗体に対する応答、主治医の判断によって決定される。前記抗体は、単回の治療として、または一連の治療において患者に適切に投与される。
【0114】
さらに別の態様において、本発明は、上述の方法（例えば治療のため）の医薬の調製における、本発明のＩＬ－２変異タンパク質、組成物、免疫複合体、融合体の使用を提供する。
【0115】
以下の実施例を本発明の理解を補助するように説明する。如何なる形式で実施例を、本発明の保護範囲を制限するものと解釈すべきではない。
【0116】
実施例
実施例１：インターロイキン２変異ライブラリーの設計と構築
インターロイキン２変異ライブラリーの設計
インターロイキン２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２、ＩＬ－２と略称）とそのα受容体ＣＤ２５（ＩＬ－２Ｒαと略称）複合物の結晶構造（ＰＤＢ：１Ｚ９２）（図１に示す）に基づき、相互作用部位のＩＬ－２残基を表１に示されるように変異した。各部位のオリジナルアミノ酸は５０％の割合を占め、残りの５０％の割合は表１の「変異アミノ酸」で等分した。ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒαの相互結合部位に対して設計されたライブラリーの理論的多様性は、３×８×８×９×６×６×３×６×６×５×６≒２．０×１０８であり、ライブラリーはＩＢＹＤＬ０２９（Ｉｎｎｏｖｅｎｔｂｉｏ Ｙｅａｓｔ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｌｉｂｒａｒｙ）と命名された。
実施例１：インターロイキン２変異ライブラリーの設計と構築
インターロイキン２変異ライブラリーの設計
インターロイキン２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２、ＩＬ－２と略称）とそのα受容体ＣＤ２５（ＩＬ－２Ｒαと略称）複合物の結晶構造（ＰＤＢ：１Ｚ９２）（図１に示す）に基づき、相互作用部位のＩＬ－２残基を表１に示されるように変異した。各部位のオリジナルアミノ酸は５０％の割合を占め、残りの５０％の割合は表１の「変異アミノ酸」で等分した。ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒαの相互結合部位に対して設計されたライブラリーの理論的多様性は、３×８×８×９×６×６×３×６×６×５×６≒２．０×１０８であり、ライブラリーはＩＢＹＤＬ０２９（Ｉｎｎｏｖｅｎｔｂｉｏ Ｙｅａｓｔ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｌｉｂｒａｒｙ）と命名された。
【表2】
【0117】
ＩＬ－２とそのβ受容体ＣＤ１２２（ＩＬ－２Ｒβと略称）複合物の結晶構造（ＰＤＢ：２ＥＲＪ）（図２に示す）に基づいて、相互作用部位のＩＬ－２残基を表２に示されるように変異した。各部位のオリジナルアミノ酸は５０％の割合を占め、残りの５０％の割合は表2の「変異アミノ酸」で等分した。ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒβの相互結合部位が多いため、ライブラリーの理論的多様性が大きすぎ、ライブラリーを２つの小さいライブラリーに分け、部位１２－２３の変異ライブラリーはＩＢＹＤＬ０３０で、理論的多様性は１２×８×９×１２×１３×７×１２≒１．１×１０７であり、部位７９－９２の変異ライブラリーはＩＢＹＤＬ０３１であり、理論的多様性は８×９×４×２×７×１０×７×１０×１１≒３．１×１０７である。
【表3】
【0118】
インターロイキン２変異ライブラリーの構築
野生型ＩＬ－２（ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ６０５６８，ａａ２１－１５３，Ｃ１２５Ｓ、ＩＬ－２ＷＴと略称）を、酵母ディスプレイプラスミドｐＹＤＣ０１１の２つのＢａｍＨ Ｉ酵素切断部位の間に置いた。ＩＬ－２ＷＴの配列は、ジスルフィド架橋ＩＬ－２二量体形成を回避するために１２５位にＣ１２５Ｓ変異が導入された配列番号１で本出願に示されている。プラスミド構築の具体的な手順は以下のとおりである。
野生型ＩＬ－２（ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ６０５６８，ａａ２１－１５３，Ｃ１２５Ｓ、ＩＬ－２ＷＴと略称）を、酵母ディスプレイプラスミドｐＹＤＣ０１１の２つのＢａｍＨ Ｉ酵素切断部位の間に置いた。ＩＬ－２ＷＴの配列は、ジスルフィド架橋ＩＬ－２二量体形成を回避するために１２５位にＣ１２５Ｓ変異が導入された配列番号１で本出願に示されている。プラスミド構築の具体的な手順は以下のとおりである。
【0119】
１．ＩＬ－２ＷＴ遺伝子をテンプレートとしてプライマーＡＭＰ０２１０およびＡＭＰ０２１１で増幅したこと、
２．プラスミドｐＹＤＣ０１１をＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ、製品番号：Ｒ３１３６Ｖ）で酵素切断した後、ゲルで回収したこと（ＱＩＡＧＥＮ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｃａｔ．２８７０４）、
３．１％アガロースゲルで増幅産物および酵素切断産物を回収したこと、
４．回収した後、Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｖａｚｙｍｅ製品番号：Ｃ１１３－０２）でインビトロ相同組換えを行ったこと、
５．組換え後産物を大腸菌Ｔｏｐ１０受容性細胞（天根、製品番号：ＣＢ１０４－０２）に移し、アンモニアリブ耐性ＬＢプレートにコーティングし、３７℃で一晩培養したこと、
６．成長したモノクローナルコロニーを配列決定した後、正しいプラスミドをｐＹＤＣ０３５と命名したこと。
２．プラスミドｐＹＤＣ０１１をＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ、製品番号：Ｒ３１３６Ｖ）で酵素切断した後、ゲルで回収したこと（ＱＩＡＧＥＮ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｃａｔ．２８７０４）、
３．１％アガロースゲルで増幅産物および酵素切断産物を回収したこと、
４．回収した後、Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｖａｚｙｍｅ製品番号：Ｃ１１３－０２）でインビトロ相同組換えを行ったこと、
５．組換え後産物を大腸菌Ｔｏｐ１０受容性細胞（天根、製品番号：ＣＢ１０４－０２）に移し、アンモニアリブ耐性ＬＢプレートにコーティングし、３７℃で一晩培養したこと、
６．成長したモノクローナルコロニーを配列決定した後、正しいプラスミドをｐＹＤＣ０３５と命名したこと。
【0120】
既存の文献によれば、ＩＬ－２変異体ＩＬ－２３ＸはＩＬ－２Ｒαと結合せず、ＩＬ－２Ｒβとの結合力を維持したままである（Ｒｏｄｒｉｇｏ Ｖａｚｑｕｅｚ－Ｌｏｍｂａｒｄｉ ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， ８：１５３７３， ＤＯＩ： １０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１５３７３）。ＩＬ－２変異体ＩＬ－２Ｈ９はＩＬ－２Ｒβとの結合が増強され、ＩＬ－２Ｒαとの結合を維持したままである（Ａｒｏｎ Ｍ． Ｌｅｖｉｎ ｅｔａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， Ｖｏｌ ４８４， ｐ５２９－５３３， ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１０９７５）。ＩＬ－２３ＸとＩＬ－２Ｈ９を酵母表面に示し、対照として使用した。ＩＬ－２３ＸとＩＬ－２Ｈ９の配列は、それぞれ配列番号２および３に示され、２つのタンパク質は、ＩＬ－２ＷＴと同様にＣ１２５Ｓ変異も含む。
【0121】
表１および表２のライブラリー構築プロトコルに従って、所望のプライマー（図３に示す）を設計し、蘇州金唯智生物科技有限公司によって合成した。
【0122】
ＩＢＹＤＬ０２９ライブラリーＤＮＡ増幅：１．ｐＹＤＣ０３５をテンプレートとし、プライマーＡＭＰ０１９１、ＡＭＰ０２００を用いて断片０２９－Ｆを増幅し、２．ｐＹＤＣ０３５をテンプレートとし、プライマーＡＭＰ０２０１、ＡＭＰ０１９９を用いて断片０２９－Ｒを増幅し、３．断片０２９－Ｆ、０２９－Ｒをゲルで回収してＰＣＲ増幅テンプレートとし、プライマーＡＭＰ０１９１とＡＭＰ０１９９を用いて全長断片０２９を増幅した。
【0123】
ＩＢＹＤＬ０３０ライブラリーＤＮＡ増幅：１．ｐＹＤＣ０３５をテンプレートとし、プライマーＡＭＰ０１９１、ＡＭＰ０２２４を用いて断片０３０－Ｆを増幅し、２．ｐＹＤＣ０３５をテンプレートとし、プライマーＡＭＰ０２２２、ＡＭＰ０１９９を用いて断片０３０－Ｒを増幅し、３．断片０３０－Ｆ、０３０－Ｒをゲルで回収してＰＣＲ増幅テンプレートとし、プライマーＡＭＰ０１９１とＡＭＰ０１９９を用いて全長断片０３０を増幅した。
【0124】
ＩＢＹＤＬ０３１ライブラリーＤＮＡ増幅：１．ｐＹＤＣ０３５をテンプレートとし、プライマーＡＭＰ０１９１、ＡＭＰ０２２５を用いて断片０３１－Ｆを増幅し、２．ｐＹＤＣ０３５をテンプレートとし、プライマーＡＭＰ０２２３、ＡＭＰ０１９９を用いて断片０３１－Ｒを増幅し、３．断片０３１－Ｆ、０３１－Ｒをゲルで回収してＰＣＲ増幅テンプレートとし、プライマーＡＭＰ０１９１とＡＭＰ０１９９を用いて全長断片０３１を増幅した。
【0125】
１００μｇのプラスミドｐＹＤＣ０１１をＢａｍＨＩで酵素切断し、酵素切断後にＰＣＲ産物回収キット（ＱＩＡＧＥＮ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｃａｔ．２８１０４）で回収し、十分な量の線状化プラスミドを得た。線状化プラスミドとライブラリーＤＮＡを４μｇ：１２μｇで混合し、既存の方法（Ｌｏｒｅｎｚｏ Ｂｅｎａｔｕｉｌ ｅｔａｌ．，Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｙｅａｓｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｅｒｙ ｌａｒｇｅ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｄｅｓｉｇｎ ＆ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｖｏｌ． ２３ ｎｏ． ４ ｐｐ． １５５－１５９， ２０１０）で各ライブラリーと線状化プラスミドとの混合物をＥＢＹ１００酵母株に電気的に導入した。電気的導入後のライブラリーを勾配希釈してＳＤ－Ｔｒｐ（ＴＡＫＡＲＡ、製品番号：６３０３０９）のプレートにコーディングし、成長したコロニー数をカウントしたところ、得られたライブラリーの実際の多様性はＩＢＹＤＬ０２９：４．２×１０８、ＩＢＹＤＬ０３０：４．５×１０８、ＩＢＹＤＬ０３１：３．８×１０８であり、いずれもライブラリーの理論的多様性より大きい。
【0126】
実施例２：ＩＬ－２ＷＴ－ＦＣ、ＩＬ－２３Ｘ－ＦＣ、ＩＬ－２Ｒα、ＩＬ－２Ｒβタンパク質製造およびビオチン標識
発現プラスミドの構築
ＩＬ－２ＷＴ－ＦＣとＩＬ－２３Ｘ－ＦＣ融合タンパク質を発現するために、ＩＬ－２ＷＴ、ＩＬ－２３Ｘ遺伝子配列をベクターｐＹＤＯ＿０１７の２つのＢａｍＨＩ酵素切断部位の間に置き、本発明で使用されるＦｃは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、ＦｃＬＡＬＡと略称）を指す。ＩＬ－２Ｒα（Ｕｉｐｒｏｔ：Ｐ０１５８９，ａａ２２－２１７）とＩＬ－２Ｒβ（Ｕｉｐｒｏｔ：Ｐ１４７８４，ａａ２７－２４０）に対して配列のＣ末端にａｖｉタグおよび６つのヒスチジンタグ（配列は配列番号１１および１２に示す）を取り付け、ｐＴＴ５ベクター上にそれぞれ構築して、ＩＬ－２ＲαおよびＩＬ－２Ｒβタンパク質を発現する。
発現プラスミドの構築
ＩＬ－２ＷＴ－ＦＣとＩＬ－２３Ｘ－ＦＣ融合タンパク質を発現するために、ＩＬ－２ＷＴ、ＩＬ－２３Ｘ遺伝子配列をベクターｐＹＤＯ＿０１７の２つのＢａｍＨＩ酵素切断部位の間に置き、本発明で使用されるＦｃは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、ＦｃＬＡＬＡと略称）を指す。ＩＬ－２Ｒα（Ｕｉｐｒｏｔ：Ｐ０１５８９，ａａ２２－２１７）とＩＬ－２Ｒβ（Ｕｉｐｒｏｔ：Ｐ１４７８４，ａａ２７－２４０）に対して配列のＣ末端にａｖｉタグおよび６つのヒスチジンタグ（配列は配列番号１１および１２に示す）を取り付け、ｐＴＴ５ベクター上にそれぞれ構築して、ＩＬ－２ＲαおよびＩＬ－２Ｒβタンパク質を発現する。
【0127】
タンパク質の発現および精製
上記で構築した発現プラスミドベクターを、化学トランスフェクション法を用いてＨＥＫ２９３－Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、製品番号：Ｒ７９００７）細胞に導入した。化学トランスフェクション試薬ポリエチレンイミン（ＰＥＩと略称、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、製品番号：２３９６６）を用いて、培養されたＨＥＫ２９３－Ｆ細胞を、製造業者によって提供されたプロトコルに従って一過性トランスフェクションした。最終体積の１／１０（ｖ／ｖ）のＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ製品番号：３１９８５－０７０）をトランスフェクション緩衝液として使用し、プラスミドを加えて、均一に混合し、０．２２μｍのフィルターヘッドで濾過して準備した。前の手順のプラスミドにポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、２３９６６）を加え（２９３Ｆ細胞におけるプラスミドとＰＥＩの質量比率は１：３）、均一に混合してから室温で１０ｍｉｎインキュベートすることによって、ＤＮＡ／ＰＥＩ混合物を得た。ＤＮＡ／ＰＥＩ混合物をＨＥＫ２９３細胞に穏やかに注ぎ、均一に混合し、３７℃、８％ ＣＯ２の条件下で２４ｈ培養した後、ＶＰＡＶＰＡ（Ｓｉｇｍａ、製品番号：Ｐ４５４３－１００Ｇ）を追加し、最終濃度を２ ｍＭおよび２％（ｖ／ｖ）Ｆｅｅｄ（１ｇ／Ｌ Ｐｈｙｔｏｎｅ Ｐｅｐｔｏｎｅ ＋ １ｇ／Ｌ Ｄｉｆｃｏ Ｓｅｌｅｃｔ Ｐｈｙｔｏｎｅ）にし、６ｄ培養を継続した。
ＩＬ－２ＷＴ－ＦＣとＩＬ－２３Ｘ－ＦＣとの融合タンパク質を発現する細胞培養液を、１３０００ｒｐｍで２０ｍｉｎ遠心分離し、上清を収集し、前カラムＨｉｔｒａｐ Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ（ＧＥ，１１－００３４－９５）を用いて上清を精製した。操作は以下のとおりである。精製前に５倍カラム体積の平衡液（０．２ Ｍ Ｔｒｉｓ， １．５ Ｍ ＮａＣｌ， ｐＨ７．２）で充填カラムを平衡化し、収集した上清をカラムに通し、さらに１０倍カラム体積の平衡液で充填カラムを洗浄し、非特異的結合タンパク質を除去し、５倍カラム体積の溶離緩衝液（１Ｍ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ，ｐＨ３．５）で充填剤を洗浄し、溶離液を収集した。溶離液１ｍｌあたり８０μＬのＴｒｉｓ（２Ｍ Ｔｒｉｓ）を加え、限外濾過濃縮管（上海拓開生物科技有限公司、ＭＣＰＭ０２Ｃ６７）を用いてＰＢＳ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ、７００１１－０４４）に交換し、濃度を測定した。精製後のタンパク質１００μｇに対して、濃度を１ｍｇ／ｍＬに調整し、ゲル濾過カラム（ＴＯＳＯＨ製品番号：１８６７５）を用いてタンパク質純度を測定した。
上記で構築した発現プラスミドベクターを、化学トランスフェクション法を用いてＨＥＫ２９３－Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、製品番号：Ｒ７９００７）細胞に導入した。化学トランスフェクション試薬ポリエチレンイミン（ＰＥＩと略称、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、製品番号：２３９６６）を用いて、培養されたＨＥＫ２９３－Ｆ細胞を、製造業者によって提供されたプロトコルに従って一過性トランスフェクションした。最終体積の１／１０（ｖ／ｖ）のＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ製品番号：３１９８５－０７０）をトランスフェクション緩衝液として使用し、プラスミドを加えて、均一に混合し、０．２２μｍのフィルターヘッドで濾過して準備した。前の手順のプラスミドにポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、２３９６６）を加え（２９３Ｆ細胞におけるプラスミドとＰＥＩの質量比率は１：３）、均一に混合してから室温で１０ｍｉｎインキュベートすることによって、ＤＮＡ／ＰＥＩ混合物を得た。ＤＮＡ／ＰＥＩ混合物をＨＥＫ２９３細胞に穏やかに注ぎ、均一に混合し、３７℃、８％ ＣＯ２の条件下で２４ｈ培養した後、ＶＰＡＶＰＡ（Ｓｉｇｍａ、製品番号：Ｐ４５４３－１００Ｇ）を追加し、最終濃度を２ ｍＭおよび２％（ｖ／ｖ）Ｆｅｅｄ（１ｇ／Ｌ Ｐｈｙｔｏｎｅ Ｐｅｐｔｏｎｅ ＋ １ｇ／Ｌ Ｄｉｆｃｏ Ｓｅｌｅｃｔ Ｐｈｙｔｏｎｅ）にし、６ｄ培養を継続した。
ＩＬ－２ＷＴ－ＦＣとＩＬ－２３Ｘ－ＦＣとの融合タンパク質を発現する細胞培養液を、１３０００ｒｐｍで２０ｍｉｎ遠心分離し、上清を収集し、前カラムＨｉｔｒａｐ Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ（ＧＥ，１１－００３４－９５）を用いて上清を精製した。操作は以下のとおりである。精製前に５倍カラム体積の平衡液（０．２ Ｍ Ｔｒｉｓ， １．５ Ｍ ＮａＣｌ， ｐＨ７．２）で充填カラムを平衡化し、収集した上清をカラムに通し、さらに１０倍カラム体積の平衡液で充填カラムを洗浄し、非特異的結合タンパク質を除去し、５倍カラム体積の溶離緩衝液（１Ｍ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ，ｐＨ３．５）で充填剤を洗浄し、溶離液を収集した。溶離液１ｍｌあたり８０μＬのＴｒｉｓ（２Ｍ Ｔｒｉｓ）を加え、限外濾過濃縮管（上海拓開生物科技有限公司、ＭＣＰＭ０２Ｃ６７）を用いてＰＢＳ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ、７００１１－０４４）に交換し、濃度を測定した。精製後のタンパク質１００μｇに対して、濃度を１ｍｇ／ｍＬに調整し、ゲル濾過カラム（ＴＯＳＯＨ製品番号：１８６７５）を用いてタンパク質純度を測定した。
【0128】
ＩＬ－２ＲαおよびＩＬ－２Ｒβタンパク質を発現する細胞培養液を、１３０００ｒｐｍで２０ｍｉｎ遠心分離し、上清を収集し、０．２２μｍのフィルターで濾過し、ニッケルカラム（５ｍＬ Ｈｉｓｔｒａｐ ｅｘｃｅｌ， ＧＥ， １７－３７１２－０６）を０．１Ｍ ＮａＯＨに２ｈ浸漬した後、１０倍カラム体積の超純水で洗浄し、アルカリ液を除去し、さらに５倍カラム体積の結合緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ， ３００ｍＭ ＮａＣｌ， ｐＨ７．４）で精製カラムを平衡化し、細胞上清をカラムに通し、さらに１０倍カラム体積の洗浄緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ， ３００ｍＭ ＮａＣｌ， １０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ， ｐＨ７．４）でカラムを洗浄し、非特異的結合ヘテロタンパク質を除去し、最後に５倍カラム体積の溶離液（２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ， ３００ｍＭ ＮａＣｌ， １００ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ， ｐＨ７．４）で目的タンパク質を溶離し、タンパク質限外濾過濃縮によりＰＢＳに交換し、精製してタンパク質の発現量および純度を測定した（表３参照）。
【表4】
【0129】
ＩＬ－２ＲαとＩＬ－２Ｒβ ＩＨタンパク質のビオチン化標識
酵素触媒法によりＩＬ－２ＲαとＩＬ－２Ｒβタンパク質をビオチン標識する方法は、以下のとおりである。適量のＩＬ－２ＲαとＩＬ－２Ｒβ ＩＨタンパク質溶液に、１／１０（ｍ／ｍ）質量のＨｉｓ－ＢｉｒＡタンパク質（ｕｎｉｐｒｏｔ： Ｐ０６７０９）を加え、同時に最終濃度２ｍＭ ＡＴＰ（ｓｉｇｍａ製品番号：Ａ２３８３－１０Ｇ）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ Ｄ－ビオチン （ＡＶＩＤＩＴＹ製品番号：Ｋ０７１７）を加え、３０℃で１ｈインキュベートし、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ｉｎｃｒｅａｓｅ（ＧＥ，１０／３００ＧＬ，１０２４５６０５）により精製し、余分なビオチンとＨｉｓ－ＢｉｒＡを除去し、精製後の試料をＦｏｒｔｅｂｉｏのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＳＡ）センサ（ＰＡＬＬ、１８－５０１９）により検証し、ビオチン標識の成功を確認した。本実施例で得られたビオチン標識されたＩＬ－２Ｒα、ＩＬ－２Ｒβ ＩHタンパク質は、それぞれＩＬ－２Ｒα－ＢｉｏｔｉｎおよびＩＬ－２Ｒβ ＩＨ－Ｂｉｏｔｉｎと略称される。
酵素触媒法によりＩＬ－２ＲαとＩＬ－２Ｒβタンパク質をビオチン標識する方法は、以下のとおりである。適量のＩＬ－２ＲαとＩＬ－２Ｒβ ＩＨタンパク質溶液に、１／１０（ｍ／ｍ）質量のＨｉｓ－ＢｉｒＡタンパク質（ｕｎｉｐｒｏｔ： Ｐ０６７０９）を加え、同時に最終濃度２ｍＭ ＡＴＰ（ｓｉｇｍａ製品番号：Ａ２３８３－１０Ｇ）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ Ｄ－ビオチン （ＡＶＩＤＩＴＹ製品番号：Ｋ０７１７）を加え、３０℃で１ｈインキュベートし、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ｉｎｃｒｅａｓｅ（ＧＥ，１０／３００ＧＬ，１０２４５６０５）により精製し、余分なビオチンとＨｉｓ－ＢｉｒＡを除去し、精製後の試料をＦｏｒｔｅｂｉｏのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＳＡ）センサ（ＰＡＬＬ、１８－５０１９）により検証し、ビオチン標識の成功を確認した。本実施例で得られたビオチン標識されたＩＬ－２Ｒα、ＩＬ－２Ｒβ ＩHタンパク質は、それぞれＩＬ－２Ｒα－ＢｉｏｔｉｎおよびＩＬ－２Ｒβ ＩＨ－Ｂｉｏｔｉｎと略称される。
【0130】
実施例３：ＩＬ－２変異ライブラリーのスクリーニングによるＩＬ－２ｍｕｔａｎｔの取得および染色鑑定
ＩＬ－２Ｒβと親和力の高いＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ のスクリーニング
酵母ベースのＩＬ－２ｍｕｔａｎｔディスプレイライブラリーＩＢＹＤＬ０２９、ＩＢＹＤＬ０３０、ＩＢＹＤＬ０３１は、いずれも２．０×１０９の酵母細胞を培養および誘導し、ここで、ライブラリーの多様性は、それぞれ２．０×１０８、１．１×１０７、３．１×１０７であった。ＩＢＹＤＬ０２９ライブラリーの多様性が比較的大きいため、１回目のスクリーニングにおいて、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社のＭＡＣＳシステムを利用して磁気ビーズ細胞選別を行う。まず、ＦＡＣＳ洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ、１％ウシ血清アルブミン含有）において、２×１０９酵母細胞を室温で３０ｍｉｎインキュベートし、緩衝液に５００ｎＭのビオチン標識された市販のＩＬ－２Ｒβ（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎビオチン標識、ＩＬ－２Ｒβ－Ｂｉｏｔｉｎと略称）を含有する。予め冷却されたＦＡＣＳ洗浄緩衝液５０ｍｌで洗浄し、次に同洗浄緩衝液１０ｍｌで細胞を再懸濁し、ストレプトアビジンマイシンビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ、製品番号：１３０－０９０－４８５）４０μｌを加えて４℃で１５ｍｉｎインキュベートした。３０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離して上清を捨て、ＦＡＣＳ洗浄緩衝液１０ｍｌで細胞を再懸濁し、細胞溶液をＭｉｌｔｅｎｙｉ ＬＳカラムに加える。試料をロードした後、カラムを３回洗浄し、各回にＦＡＣＳ洗浄緩衝液３ｍｌを使用した。磁気領域からＭｉｌｔｅｎｙｉ ＬＳカラムを取り外し、成長培地５ｍｌで溶出し、溶出された酵母細胞を回収し、30 ℃で一晩成長させた。ＩＢＹＤＬ０３０、ＩＢＹＤＬ０３１ライブラリーの多様性が比較的小さいため、フローサイトメトリーを直接用いて１回目の選別を行うことができる。各１×１０８、２．５×１０８の酵母細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、１００ｎＭ ＩＬ－２Ｒβ－Ｂｉｏｔｉｎ、Ａｎｔｉ Ｆｌａｇ抗体（Ｓｉｇｍａ製品番号：Ｆ１８０４１、１：１０００希釈）を含有するＦＡＣＳ緩衝液で室温で３０ｍｉｎインキュベートし、細胞をＦＡＣＳ洗浄緩衝液で２回洗浄した後、細胞をＳＡ－ＰＥ（ストレプトアビジン－ＰＥ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ製品番号：Ｓ２１３８８、１：２００希釈）、ヤギ抗マウス結合Ａｌｅｘ Ｆｌｏｕｒ－６４７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ製品番号：Ａ２１２３５、１：２００希釈）を含有するＦＡＣＳ洗浄緩衝液と混合し、４℃で１５ｍｉｎ遮光インキュベートした。予め冷却されたＦＡＣＳ洗浄緩衝液で２回洗浄し、緩衝液１ｍｌに再懸濁し、フィルターを備える単離管に細胞を移した。細胞をＦＡＣＳ ＭｏＦｌｏ＿ＸＤＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ）で選別し、選別した酵母細胞を３０℃で一晩増殖させた。
ＩＬ－２Ｒβと親和力の高いＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ のスクリーニング
酵母ベースのＩＬ－２ｍｕｔａｎｔディスプレイライブラリーＩＢＹＤＬ０２９、ＩＢＹＤＬ０３０、ＩＢＹＤＬ０３１は、いずれも２．０×１０９の酵母細胞を培養および誘導し、ここで、ライブラリーの多様性は、それぞれ２．０×１０８、１．１×１０７、３．１×１０７であった。ＩＢＹＤＬ０２９ライブラリーの多様性が比較的大きいため、１回目のスクリーニングにおいて、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社のＭＡＣＳシステムを利用して磁気ビーズ細胞選別を行う。まず、ＦＡＣＳ洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ、１％ウシ血清アルブミン含有）において、２×１０９酵母細胞を室温で３０ｍｉｎインキュベートし、緩衝液に５００ｎＭのビオチン標識された市販のＩＬ－２Ｒβ（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎビオチン標識、ＩＬ－２Ｒβ－Ｂｉｏｔｉｎと略称）を含有する。予め冷却されたＦＡＣＳ洗浄緩衝液５０ｍｌで洗浄し、次に同洗浄緩衝液１０ｍｌで細胞を再懸濁し、ストレプトアビジンマイシンビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ、製品番号：１３０－０９０－４８５）４０μｌを加えて４℃で１５ｍｉｎインキュベートした。３０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離して上清を捨て、ＦＡＣＳ洗浄緩衝液１０ｍｌで細胞を再懸濁し、細胞溶液をＭｉｌｔｅｎｙｉ ＬＳカラムに加える。試料をロードした後、カラムを３回洗浄し、各回にＦＡＣＳ洗浄緩衝液３ｍｌを使用した。磁気領域からＭｉｌｔｅｎｙｉ ＬＳカラムを取り外し、成長培地５ｍｌで溶出し、溶出された酵母細胞を回収し、30 ℃で一晩成長させた。ＩＢＹＤＬ０３０、ＩＢＹＤＬ０３１ライブラリーの多様性が比較的小さいため、フローサイトメトリーを直接用いて１回目の選別を行うことができる。各１×１０８、２．５×１０８の酵母細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、１００ｎＭ ＩＬ－２Ｒβ－Ｂｉｏｔｉｎ、Ａｎｔｉ Ｆｌａｇ抗体（Ｓｉｇｍａ製品番号：Ｆ１８０４１、１：１０００希釈）を含有するＦＡＣＳ緩衝液で室温で３０ｍｉｎインキュベートし、細胞をＦＡＣＳ洗浄緩衝液で２回洗浄した後、細胞をＳＡ－ＰＥ（ストレプトアビジン－ＰＥ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ製品番号：Ｓ２１３８８、１：２００希釈）、ヤギ抗マウス結合Ａｌｅｘ Ｆｌｏｕｒ－６４７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ製品番号：Ａ２１２３５、１：２００希釈）を含有するＦＡＣＳ洗浄緩衝液と混合し、４℃で１５ｍｉｎ遮光インキュベートした。予め冷却されたＦＡＣＳ洗浄緩衝液で２回洗浄し、緩衝液１ｍｌに再懸濁し、フィルターを備える単離管に細胞を移した。細胞をＦＡＣＳ ＭｏＦｌｏ＿ＸＤＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ）で選別し、選別した酵母細胞を３０℃で一晩増殖させた。
【0131】
１回目のスクリーニングで得られた各ライブラリー細胞を２０℃で２４ｈ振とう誘導してＩＬ－２ｍｕｔａｎｔを示し、フローサイトメトリーを用いて２回目の選別を行った。各ライブラリーから３×１０７酵母細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、異なる濃度のＩＬ－２Ｒβ－Ｂｉｏｔｉｎ（０２９：３００ｎＭ，０３０／０３１：１００ｎＭ）、Ａｎｔｉ Ｆｌａｇ抗体を含有するＦＡＣＳ緩衝液を加え、室温で３０ｍｉｎインキュベートし、細胞をＦＡＣＳ洗浄緩衝液で２回洗浄した後、細胞をＳＡ－ＰＥ、ヤギ抗マウス結合Ａｌｅｘ Ｆｌｏｕｒ－６４７を含有するＦＡＣＳ洗浄緩衝液と混合し、４℃で１５ｍｉｎ遮光インキュベートし、予め冷却されたＦＡＣＳ洗浄緩衝液で２回洗浄し、１ｍＬの緩衝液に再懸濁し、細胞を、フィルターを備える単離管に移した。細胞をＭｏＦｌｏ＿ＸＤＰで選別し、選別した酵母細胞を３０℃で一晩増殖させた。３回目の選別プロトコルは２回目と同じで、３回の選別を経た後、モノクロナールを選んで配列決定した。
【0132】
ＩＬ－２Ｒβ－Ｂｉｏｔｉｎを用いた３回のスクリーニングにより、ＩＢＹＤＬ０２９は５３個の変異配列を獲得し、ＩＢＹＤＬ０３０は変異配列を獲得せず、ＩＢＹＤＬ０３１は７１個の変異配列を獲得した。
【0133】
酵母ベースのＩＬ－２変異体ディスプレイライブラリーＩＢＹＤＬ０２９、ＩＢＹＤＬ０３０、ＩＢＹＤＬ０３１に対して、実施例２で得られた自家製ＩＬ－２Ｒβ ＩＨ－Ｂｉｏｔｉｎを用いて第２バッチのスクリーニングを行った。１回目のスクリーニングにおいて、ＭＡＣＳシステムを利用して磁気ビーズ細胞選別を行った。まず、各ライブラリーから２×１０９酵母細胞を異なる濃度のＩＬ－２Ｒβ ＩＨ－Ｂｉｏｔｉｎ（ＩＢＹＤＬ０２９：５００ｎＭ，ＩＢＹＤＬ０３０／０３１：２００ｎＭ）を含有するＦＡＣＳ洗浄緩衝液で室温で３０ｍｉｎインキュベートし、次の手順で第１バッチの磁気ビーズ選別と同様にして、磁気ビーズ選別後に得られた酵母細胞を３０℃で一晩増殖させた。フローサイトメトリーを用いて２回目、３回目の選別を行い、２回のスクリーニングにおいてＩＬ－２Ｒβ ＩＨ－Ｂｉｏｔｉｎ濃度はいずれもＩＢＹＤＬ ０２９：５００ｎＭ、ＩＢＹＤＬ ０３０／０３１：１００ｎＭを選び、残りの手順は第１バッチの２、３回目のスクリーニングと同じである。
【0134】
ＩＬ－２Ｒβ ＩＨ－Ｂｉｏｔｉｎを用いた３回のスクリーニングにより、モノクロナールを選んで配列決定し、ＩＢＹＤＬ０２９は２５個の変異配列を追加し、ＩＢＹＤＬ０３０も同様に変異配列を獲得せず、ＩＢＹＤＬ０３１は４１個の変異配列を追加した。
【0135】
ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ染色鑑定
配列決定後の単一変異配列を含む酵母細胞を２０℃で２４ｈ振とう誘導してＩＬ－２ｍｕｔａｎｔを示し、その受容体ＩＬ－２Ｒα－Ｂｉｏｔｉｎ、ＩＬ－２Ｒβ ＩＨ－Ｂｉｏｔｉｎとそれぞれ染色し、具体的な手順は以下のとおりである。
配列決定後の単一変異配列を含む酵母細胞を２０℃で２４ｈ振とう誘導してＩＬ－２ｍｕｔａｎｔを示し、その受容体ＩＬ－２Ｒα－Ｂｉｏｔｉｎ、ＩＬ－２Ｒβ ＩＨ－Ｂｉｏｔｉｎとそれぞれ染色し、具体的な手順は以下のとおりである。
【0136】
一、 ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔにより示された酵母細胞とＩＬ－２Ｒα－Ｂｉｏｔｉｎ染色分析：
1. 各試料からの１×１０６細胞を遠心分離により上清を捨ててＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した後に使用した。
2. ５０ｎＭ ＩＬ－２Ｒα－ＢｉｏｔｉｎとＡｎｔｉ Ｆｌａｇ抗体を含むＦＡＣＳ緩衝液１００μＬに加えて室温で３０ｍｉｎインキュベートした。
3. 予め冷却されたＦＡＣＳ緩衝液を用いて３０００ｒｐｍ、４℃で３ｍｉｎ遠心分離して２回洗浄した。
4. ＳＡ－ＰＥ、ヤギ抗マウス結合Ａｌｅｘ Ｆｌｏｕｒ－６４７を含むＦＡＣＳ緩衝液１００μＬを加え、氷上で２０ｍｉｎ遮光インキュベートした。
5. 予め冷却されたＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、細胞を１００μＬの緩衝液で再懸濁し、フローアナライザー（ＢＤ，ＡＣＣＵＲＩ Ｃ６）でＩＬ－２ｍｕｔａｎｔとＩＬ－２Ｒαの結合レベルを分析した。
1. 各試料からの１×１０６細胞を遠心分離により上清を捨ててＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した後に使用した。
2. ５０ｎＭ ＩＬ－２Ｒα－ＢｉｏｔｉｎとＡｎｔｉ Ｆｌａｇ抗体を含むＦＡＣＳ緩衝液１００μＬに加えて室温で３０ｍｉｎインキュベートした。
3. 予め冷却されたＦＡＣＳ緩衝液を用いて３０００ｒｐｍ、４℃で３ｍｉｎ遠心分離して２回洗浄した。
4. ＳＡ－ＰＥ、ヤギ抗マウス結合Ａｌｅｘ Ｆｌｏｕｒ－６４７を含むＦＡＣＳ緩衝液１００μＬを加え、氷上で２０ｍｉｎ遮光インキュベートした。
5. 予め冷却されたＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、細胞を１００μＬの緩衝液で再懸濁し、フローアナライザー（ＢＤ，ＡＣＣＵＲＩ Ｃ６）でＩＬ－２ｍｕｔａｎｔとＩＬ－２Ｒαの結合レベルを分析した。
【0137】
二、 ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔにより示された酵母細胞とＩＬ－２Ｒβ ＩＨ－Ｂｉｏｔｉｎ染色分析：
1. 各試料からの１×１０６細胞を遠心分離により上清を捨ててＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した後に使用した。
2. ＩＬ－２Ｒβ ＩＨ－Ｂｉｏｔｉｎ（３０ｎＭ－１００ｎＭ）とＡｎｔｉ Ｆｌａｇ抗体を含むＦＡＣＳ緩衝液１００μＬに加えて室温で３０ｍｉｎインキュベートした。
3. ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔとＩＬ－２Ｒβとの結合レベルを、手順３～５と同様にして分析した。
1. 各試料からの１×１０６細胞を遠心分離により上清を捨ててＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した後に使用した。
2. ＩＬ－２Ｒβ ＩＨ－Ｂｉｏｔｉｎ（３０ｎＭ－１００ｎＭ）とＡｎｔｉ Ｆｌａｇ抗体を含むＦＡＣＳ緩衝液１００μＬに加えて室温で３０ｍｉｎインキュベートした。
3. ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔとＩＬ－２Ｒβとの結合レベルを、手順３～５と同様にして分析した。
【0138】
フロー染色の結果から、ＩＢＹＤＬ０２９の１回目のスクリーニングで得られた５３個のＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ（具体的な配列は図４Ａを参照）がＩＬ－２Ｒαと結合した平均蛍光シグナル強度はＩＬ－２３Ｘに近く、いずれも結合せず、ＩＬ－２Ｒβと結合した平均蛍光シグナル強度はＩＬ－２３Ｘより強かったがＩＬ－２Ｈ９より弱く、ＩＬ－２Ｒβ結合シグナルが最も高かった１２個の変異を以下の表３－１に示す。第２バッチのスクリーニングで得られた２５個のＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ（具体的な配列は図４Ｂを参照）はＩＬ－２Ｒαと結合せず、ＩＬ－２３Ｘと比較して、ＩＬ－２Ｒβとの結合が異なる程度で向上し、ＩＬ－２Ｒβ結合シグナルが最も高い１４個の変異を以下の表３－１に示す。ＩＢＹＤＬ０３１の２バッチのスクリーニングで得られた１１２個のＩＬ－２ｍｕｔａｎｔはIL-2Rα、IL-2Rβの両方とも結合し、ＩＬ－２Ｒβ結合シグナルが比較的高い２５個の変異（具体的な配列は図４Ｃを参照）を下の表３－１に示し、当該２５個の変異がＩＬ－２Ｒβと結合した平均蛍光シグナル強度はＩＬ－２３Ｘより著しく強く、ＩＬ－２Ｈ９と同等またはわずかに弱い。
【表5】
【0139】
さらに、ＩＢＹＤＬ０２９由来の変異をＩＢＹＤＬ０３１由来の変異と組み合わせ（具体的な配列は図４Ｄを参照）、ＩＬ－２Ｒαと結合せずにＩＬ－２Ｒβとの結合を増強する新規変異体を得て、表３－２に示されるとおりである。
【表6】
【0140】
実施例４：ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ－ＦＣ融合の発現および受容体との親和性（ａｖｉｄｉｔｙ）測定
発現プラスミドの構築
ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ配列をベクターｐＹＤＯ＿０１７の２つのＢａｍＨＩ酵素切断部位の間に置き、ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ－ＦＣ融合タンパク質を発現するために用いられる。ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔの遺伝子を含む酵母ディスプレイプラスミドを等比率で混合してテンプレートとし、両端プライマーを用いて断片を増幅し、増幅後に１％アガロースゲルを用いてＤＮＡ断片を回収し、ｐＹＤＯ＿０１７ ＢａｍＨＩ酵素切断ベクターは回収した断片と相同組換え、組換え後の産物は大腸菌受容性細胞を転化し、得られたＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ－ＦＣの発現プラスミドを配列決定により確認した。
発現プラスミドの構築
ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ配列をベクターｐＹＤＯ＿０１７の２つのＢａｍＨＩ酵素切断部位の間に置き、ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ－ＦＣ融合タンパク質を発現するために用いられる。ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔの遺伝子を含む酵母ディスプレイプラスミドを等比率で混合してテンプレートとし、両端プライマーを用いて断片を増幅し、増幅後に１％アガロースゲルを用いてＤＮＡ断片を回収し、ｐＹＤＯ＿０１７ ＢａｍＨＩ酵素切断ベクターは回収した断片と相同組換え、組換え後の産物は大腸菌受容性細胞を転化し、得られたＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ－ＦＣの発現プラスミドを配列決定により確認した。
【0141】
ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔとＦＣ融合タンパク質の発現および精製
融合タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを、化学トランスフェクション法を用いてＨＥＫ２９３細胞に導入した。使用した化学トランスフェクション試薬はＰＥＩであり、培養されたＨＥＫ２９３細胞を、製造業者によって提供されたプロトコルに従って一過性トランスフェクションした。まずクリーンベンチでプラスミドＤＮＡとトランスフェクション試薬を準備し、３ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ製品番号：３１９８５－０７０）を５０ｍＬの遠心管に入れ、３０μｇの対応プラスミドのＤＮＡを加え、プラスミドを含むＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を０．２２μｍのフィルターヘッドで濾過し、続いて９０μｇのＰＥＩ（１ｇ／Ｌ）を加え、２０ｍｉｎ静置した。ＤＮＡ／ＰＥＩ混合物を２７ｍＬのＨＥＫ２９３細胞に穏やかに注ぎ、均一に混合し、３７℃、８％ＣＯ２で２０ｈ培養した後、ＶＰＡを加えて最終濃度を２ｍＭおよび２％（ｖ／ｖ）Ｆｅｅｄにし、６日間培養を続けた。
融合タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを、化学トランスフェクション法を用いてＨＥＫ２９３細胞に導入した。使用した化学トランスフェクション試薬はＰＥＩであり、培養されたＨＥＫ２９３細胞を、製造業者によって提供されたプロトコルに従って一過性トランスフェクションした。まずクリーンベンチでプラスミドＤＮＡとトランスフェクション試薬を準備し、３ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ製品番号：３１９８５－０７０）を５０ｍＬの遠心管に入れ、３０μｇの対応プラスミドのＤＮＡを加え、プラスミドを含むＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を０．２２μｍのフィルターヘッドで濾過し、続いて９０μｇのＰＥＩ（１ｇ／Ｌ）を加え、２０ｍｉｎ静置した。ＤＮＡ／ＰＥＩ混合物を２７ｍＬのＨＥＫ２９３細胞に穏やかに注ぎ、均一に混合し、３７℃、８％ＣＯ２で２０ｈ培養した後、ＶＰＡを加えて最終濃度を２ｍＭおよび２％（ｖ／ｖ）Ｆｅｅｄにし、６日間培養を続けた。
【0142】
細胞培養後、１３０００ｒｐｍで２０ｍｉｎ遠心分離し、上清を収集し、前カラムＨｉｔｒａｐ Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅを用いて上清を精製した。操作は以下のとおりである。精製前に５倍カラム体積の平衡液（０．２Ｍ Ｔｒｉｓ， １．５Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ７．２）充填カラムを平衡化し、収集した上清をカラムに通し、さらに１０倍カラム体積の平衡液で充填カラムを洗浄し、非特異的結合タンパク質を除去し、５倍カラム体積の溶離緩衝液（１Ｍ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ，ｐＨ３．５）で充填剤を洗浄して溶離液を収集し、溶離液１ｍｌあたり８０μＬのＴｒｉｓ（２Ｍ Ｔｒｉｓ）を加え、限外濾過濃縮管を用いてＰＢＳ緩衝液に交換し、濃度を測定した。精製後のタンパク質１００μｇに対して、濃度を１ｍｇ／ｍＬに調整し、ゲル濾過カラムを用いてタンパク質純度を測定した。４７個の本発明のＩＬ－２ｍｕｔａｎｔの発現および精製結果を表４に示す。
【表7】
【0143】
ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ－ＦＣとその受容体との親和性測定
バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）技術を用いて本発明の３４個のＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ－ＦＣとその受容体の平衡解離定数（ＫＤ）を測定した。
バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）技術を用いて本発明の３４個のＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ－ＦＣとその受容体の平衡解離定数（ＫＤ）を測定した。
【0144】
ＢＬＩ法による親和力測定は従来の方法（Ｅｓｔｅｐ，Ｐ ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｂａｓｅｄ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａｎｔｉｇｅｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｂｉｎｎｉｎｇ．ＭＡｂｓ，２０１３．５（２）：ｐ．２７０－８）で行った。センサを分析緩衝液中で２０ｍｉｎ予備湿潤させた後、確立された方法に従って、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６で候補ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ－ＦＣとＩＬ－２Ｒα、ＩＬ－２Ｒβのそれぞれとの親和性を測定する。まず基線を１２０ｓ平衡化し、次いでＩＬ－２Ｒα－ＢｉｏｔｉｎまたはＩＬ－２Ｒβ ＩＨ－ＢｉｏｔｉｎをＳＡセンサ（ＰＡＬＬ，１８－５０１９）に固定化し、固定化したＩＬ－２Ｒα－ＢｉｏｔｉｎまたはＩＬ－２Ｒβ ＩＨ－Ｂｉｏｔｉｎのセンサを、１００ｎＭ ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ－ＦＣを含む溶液にプラトー期間（１００秒）まで置いた後、センサを分析緩衝液に移して少なくとも２ｍｉｎ解離させ、結合および解離をそれぞれ測定した。実験結果に対して１：１結合モデルを利用して動力学的分析を行った。
【0145】
上記の測定手法に従って行った実験において、３６個のＨＥＫ２９３－Ｆによって発現されたＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ－ＦＣとその受容体の親和性ＫＤ値を表５に示す。
【表8】
【0146】
上の表の結果から、（１）ライブラリーのスクリーニングによって得られた各ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ－ＦＣとＩＬ－２Ｒβの親和性はＩＬ－２ＷＴとＩＬ－２３Ｘと比較して有意に強くなった。（２）Ｙ２７Ｄ２、Ｙ２７Ｆ６、Ｙ２８Ａ２、Ｙ２８Ａ５のほか、各ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ－ＦＣのＩＬ－２Ｒαへの親和性はＩＬ－２ＷＴと比較して有意に低下または非結合であり、ＩＬ－２３Ｘに近い。表４、５の結果を総合し、Ｙ２９Ａ２、Ｙ２９Ｂ２、Ｙ３０Ｅ１、Ｙ０７、Ｙ１０、Ｙ３３Ａ４、Ｙ３３Ａ５、Ｙ３３Ａ６、Ｙ３３Ｂ１、Ｙ３３Ｂ４、Ｙ３３Ｂ５、Ｙ３３Ｃ５、Ｙ３３Ｆ４、Ｙ３４Ｆ４を選んでインビトロ機能実験を行った。
【0147】
実施例5：ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ－ＦＣインビトロ機能試験
ＩＬ－２ＷＴとＩＬ－２Ｒαの親和力はＩＬ－２Ｒβ、ＩＬ－２Ｒγより高く、細胞表面のＩＬ－２Ｒαと優先的に結合し、さらにＩＬ－２Ｒβγを動員し、ＩＬ－２Ｒβγを介して下流のｐ－ＳＴＡＴ５シグナルを放出し、Ｔ細胞とＮＫ細胞の増殖を刺激する。Ｔｒｅｇ細胞表面にＩＬ－２Ｒαがあり、エフェクターＴ細胞とＮＫ細胞表面にＩＬ－２Ｒαがないため、正常時にＩＬ－２ＷＴはＴｒｅｇ細胞増殖を優先的に刺激し、免疫反応をダウンレギュレートさせる。ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔはＩＬ－２Ｒαと結合せず、Ｔｒｅｇ細胞の増殖を優先的に刺激する選好を解消し、同時にＴ細胞とＮＫ細胞の増殖を刺激し、エフェクターＴ細胞とＮＫ細胞の数を効果的に増加させ、抗腫瘍効果を高める。
ＩＬ－２ＷＴとＩＬ－２Ｒαの親和力はＩＬ－２Ｒβ、ＩＬ－２Ｒγより高く、細胞表面のＩＬ－２Ｒαと優先的に結合し、さらにＩＬ－２Ｒβγを動員し、ＩＬ－２Ｒβγを介して下流のｐ－ＳＴＡＴ５シグナルを放出し、Ｔ細胞とＮＫ細胞の増殖を刺激する。Ｔｒｅｇ細胞表面にＩＬ－２Ｒαがあり、エフェクターＴ細胞とＮＫ細胞表面にＩＬ－２Ｒαがないため、正常時にＩＬ－２ＷＴはＴｒｅｇ細胞増殖を優先的に刺激し、免疫反応をダウンレギュレートさせる。ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔはＩＬ－２Ｒαと結合せず、Ｔｒｅｇ細胞の増殖を優先的に刺激する選好を解消し、同時にＴ細胞とＮＫ細胞の増殖を刺激し、エフェクターＴ細胞とＮＫ細胞の数を効果的に増加させ、抗腫瘍効果を高める。
【0148】
本実施例は各ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ－ＦＣの初代ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞ｐ－ＳＴＡＴ５シグナルに対する活性化を検出することにより、各変異体のＣＤ２５＋細胞の活性化偏向性の除去を検証し、ＣＤ２５－細胞の活性化作用が強い変異体をスクリーニングした。具体的な工程は以下のとおりである。
【0149】
1. ＰＢＭＣ細胞の蘇生
a) 液体窒素からＰＢＭＣ細胞（Ａｌｌｃｅｌｌｓ製品番号：ＰＢ００５Ｆ、１００Ｍ入り）を取り出し、３７℃の水浴鍋に迅速に入れ、ＰＢＭＣ細胞を蘇生した。
b) 細胞を予熱した５％ヒトＡＢ血清（ＧｅｍＣｅｌｌ製品番号：１００－５１２）と１‰ ＤＮＡ酵素（ＳＴＲＭＣＥＬＬ製品番号：０７９００）を含むＸ－ＶＩＶＯ１５（Ｌｏｎｚａ製品番号：０４－４１８Ｑ）培地１０ｍＬに添加し、４００Ｇ、２５℃で１０ｍｉｎ遠心分離し（後続遠心分離はすべてこの条件）洗浄した。
c) ２０ｍＬの培地を加えて細胞を再懸濁し、３７℃の二酸化炭素インキュベーターで一晩培養した。
a) 液体窒素からＰＢＭＣ細胞（Ａｌｌｃｅｌｌｓ製品番号：ＰＢ００５Ｆ、１００Ｍ入り）を取り出し、３７℃の水浴鍋に迅速に入れ、ＰＢＭＣ細胞を蘇生した。
b) 細胞を予熱した５％ヒトＡＢ血清（ＧｅｍＣｅｌｌ製品番号：１００－５１２）と１‰ ＤＮＡ酵素（ＳＴＲＭＣＥＬＬ製品番号：０７９００）を含むＸ－ＶＩＶＯ１５（Ｌｏｎｚａ製品番号：０４－４１８Ｑ）培地１０ｍＬに添加し、４００Ｇ、２５℃で１０ｍｉｎ遠心分離し（後続遠心分離はすべてこの条件）洗浄した。
c) ２０ｍＬの培地を加えて細胞を再懸濁し、３７℃の二酸化炭素インキュベーターで一晩培養した。
【0150】
2. ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞の精製：
a) 工程１で懸濁した細胞液を吸引し、遠心分離して上清を捨てた。
b) Ｒｏｂｏｓｅｐ緩衝液（ＳＴＥＭＣＥＬＬ 製品番号：２０１０４）１ｍＬとヒトＡＢ血清１００μＬおよびヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞精製キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 製品番号：１１３４８Ｄ）１００μＬに抗体混合液を陰性スクリーニングして細胞を再懸濁した。
c) 均一に混合した後、４℃で２０ｍｉｎインキュベートし、５ｍｉｎごとに振とうした。
d) インキュベートした後、１０ｍＬのＲｏｂｏｓｅｐ緩衝液を加え、遠心分離して２回洗浄した。
e) 同時に、１ｍＬの磁性微小球（ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞精製キット）を用意し、７ｍＬのＲｏｂｏｓｅｐ緩衝液を加えて磁気スタンドに入れて１ｍｉｎ上清を捨て、磁性微小球を予備洗浄した。
f) 各１ｍＬ Ｒｏｂｏｓｅｐ緩衝液を加えてそれぞれ微小球と細胞を再懸濁し、均一に混合した後に室温で３０ｍｉｎ回転インキュベートした。
g) インキュベートした後、 ６ｍＬのＲｏｂｏｓｅｐ緩衝液を加え、磁気スタンドに１ｍｉｎ置き、上清を収集した。
h) 収集液を再び磁気スタンドに１ｍｉｎ置き、上清を収集した。
i) 遠心分離して上清を捨て、予熱したＴ培地で再懸濁し、密度を１×１０６／ｍＬに調整した。
j) １／３の細胞を用意してＣＤ２５の発現を刺激し、残りの細胞は３７℃の二酸化炭素インキュベーターで一晩培養した。
a) 工程１で懸濁した細胞液を吸引し、遠心分離して上清を捨てた。
b) Ｒｏｂｏｓｅｐ緩衝液（ＳＴＥＭＣＥＬＬ 製品番号：２０１０４）１ｍＬとヒトＡＢ血清１００μＬおよびヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞精製キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 製品番号：１１３４８Ｄ）１００μＬに抗体混合液を陰性スクリーニングして細胞を再懸濁した。
c) 均一に混合した後、４℃で２０ｍｉｎインキュベートし、５ｍｉｎごとに振とうした。
d) インキュベートした後、１０ｍＬのＲｏｂｏｓｅｐ緩衝液を加え、遠心分離して２回洗浄した。
e) 同時に、１ｍＬの磁性微小球（ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞精製キット）を用意し、７ｍＬのＲｏｂｏｓｅｐ緩衝液を加えて磁気スタンドに入れて１ｍｉｎ上清を捨て、磁性微小球を予備洗浄した。
f) 各１ｍＬ Ｒｏｂｏｓｅｐ緩衝液を加えてそれぞれ微小球と細胞を再懸濁し、均一に混合した後に室温で３０ｍｉｎ回転インキュベートした。
g) インキュベートした後、 ６ｍＬのＲｏｂｏｓｅｐ緩衝液を加え、磁気スタンドに１ｍｉｎ置き、上清を収集した。
h) 収集液を再び磁気スタンドに１ｍｉｎ置き、上清を収集した。
i) 遠心分離して上清を捨て、予熱したＴ培地で再懸濁し、密度を１×１０６／ｍＬに調整した。
j) １／３の細胞を用意してＣＤ２５の発現を刺激し、残りの細胞は３７℃の二酸化炭素インキュベーターで一晩培養した。
【0151】
3. ＣＤ８＋ Ｔ細胞を、ＣＤ２５を発現するように刺激した：
a) １／３工程２で精製したＣＤ８＋ Ｔ細胞を用意し、抗ヒトＣＤ３／ＣＤ２８抗体の磁性微小球（ＧＩＢＣＯ製品番号：１１１３１Ｄ）を加え、細胞と微小球の割合は３：１であった。
b) ３７ ℃の二酸化炭素インキュベーターに３ｍｉｎ静置した。
c) 培地１０ｍＬを加えて２回洗浄した。
d) 培地を加えて細胞密度を１×１０６／ｍＬに調整し、 ３７℃の炭酸ガスインキュベーターで２ｄ静置培養した。
a) １／３工程２で精製したＣＤ８＋ Ｔ細胞を用意し、抗ヒトＣＤ３／ＣＤ２８抗体の磁性微小球（ＧＩＢＣＯ製品番号：１１１３１Ｄ）を加え、細胞と微小球の割合は３：１であった。
b) ３７ ℃の二酸化炭素インキュベーターに３ｍｉｎ静置した。
c) 培地１０ｍＬを加えて２回洗浄した。
d) 培地を加えて細胞密度を１×１０６／ｍＬに調整し、 ３７℃の炭酸ガスインキュベーターで２ｄ静置培養した。
【0152】
4. 細胞純度と発現レベルの測定：
a) 抗ヒトＣＤ８－ＰＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製品番号：１２－００８６－４２）、抗ヒトＣＤ２５－ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製品番号：１２－０２５９－４２）、同型対照抗体（ＢＤ製品番号：５５６６５３）を用いて細胞のＣＤ８とＣＤ２５を検出した。
b) 工程２において細胞はＣＤ８＋ ＣＤ２５－Ｔ細胞であり、工程３において細胞はＣＤ８＋ ＣＤ２５＋ Ｔ細胞であった。
a) 抗ヒトＣＤ８－ＰＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製品番号：１２－００８６－４２）、抗ヒトＣＤ２５－ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製品番号：１２－０２５９－４２）、同型対照抗体（ＢＤ製品番号：５５６６５３）を用いて細胞のＣＤ８とＣＤ２５を検出した。
b) 工程２において細胞はＣＤ８＋ ＣＤ２５－Ｔ細胞であり、工程３において細胞はＣＤ８＋ ＣＤ２５＋ Ｔ細胞であった。
【0153】
5. 各ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ－ＦＣによるＣＤ８＋ ＣＤ２５－Ｔ細胞に対するｐ－ＳＴＡＴ５シグナル活性化のＥＣ５０の検出：
a) ＣＤ８＋ ＣＤ２５－Ｔ細胞を用意し、１ウェルあたり１×１０５細胞で９６ウェルＵ底培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ製品番号：ＣＬＳ３７９９－５０ＥＡ）を敷いた。
b) １００μＬの各ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ－ＦＣ、市販ＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ製品番号：２０２－ＩＬ－５００）、ＩＬ－２ＷＴ－ＦＣ、ＩＬ－２３Ｘ－ＦＣを添加し、最高濃度２６６．７ｎＭから始めて合計１２段階の４倍の濃度勾配で希釈し、３７℃のインキュベーター中で２０ｍｉｎインキュベートした。
c) ４．２％ ホルムアルデヒド溶液５５．５μＬを加え、室温で１０ｍｉｎ固定した。
d) 上清を遠心分離し、２００μＬの氷メタノール（Fisher製品番号：Ａ４５２－４）を加えて細胞を再懸濁し、４℃の冷蔵庫で３０ｍｉｎインキュベートした。
e) 上清を遠心分離し、２００μＬ染色緩衝液（ＢＤ製品番号：５５４６５７）で３回洗浄した。
f) 抗ｐ－ＳＴＡＴ５－ＡｌｅｘＦｌｏｕｒ６４７（ＢＤ製品番号：５６２０７６、１：２００希釈）を含む破膜・固定緩衝液（ＢＤ製品番号：５１－２０９１ＫＺ）２００μＬを加え、室温で遮光して３ｈインキュベートした。
g) 染色緩衝液を用いて３回洗浄し、１００μＬの染色緩衝液で細胞を再懸濁し、フローサイトメトリー検出を行った。
h) 抗体濃度を横軸、ＡｌｅｘＦｌｏｕｒ６４７中間蛍光度値を縦軸として、ｐ－ＳＴＡＴ５シグナルのＥＣ５０値および曲線を作成した結果を図５．Ａ、Ｃに示す。
a) ＣＤ８＋ ＣＤ２５－Ｔ細胞を用意し、１ウェルあたり１×１０５細胞で９６ウェルＵ底培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ製品番号：ＣＬＳ３７９９－５０ＥＡ）を敷いた。
b) １００μＬの各ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ－ＦＣ、市販ＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ製品番号：２０２－ＩＬ－５００）、ＩＬ－２ＷＴ－ＦＣ、ＩＬ－２３Ｘ－ＦＣを添加し、最高濃度２６６．７ｎＭから始めて合計１２段階の４倍の濃度勾配で希釈し、３７℃のインキュベーター中で２０ｍｉｎインキュベートした。
c) ４．２％ ホルムアルデヒド溶液５５．５μＬを加え、室温で１０ｍｉｎ固定した。
d) 上清を遠心分離し、２００μＬの氷メタノール（Fisher製品番号：Ａ４５２－４）を加えて細胞を再懸濁し、４℃の冷蔵庫で３０ｍｉｎインキュベートした。
e) 上清を遠心分離し、２００μＬ染色緩衝液（ＢＤ製品番号：５５４６５７）で３回洗浄した。
f) 抗ｐ－ＳＴＡＴ５－ＡｌｅｘＦｌｏｕｒ６４７（ＢＤ製品番号：５６２０７６、１：２００希釈）を含む破膜・固定緩衝液（ＢＤ製品番号：５１－２０９１ＫＺ）２００μＬを加え、室温で遮光して３ｈインキュベートした。
g) 染色緩衝液を用いて３回洗浄し、１００μＬの染色緩衝液で細胞を再懸濁し、フローサイトメトリー検出を行った。
h) 抗体濃度を横軸、ＡｌｅｘＦｌｏｕｒ６４７中間蛍光度値を縦軸として、ｐ－ＳＴＡＴ５シグナルのＥＣ５０値および曲線を作成した結果を図５．Ａ、Ｃに示す。
【0154】
6. 各ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ－ＦＣによるＣＤ８＋ ＣＤ２５＋Ｔ細胞に対するｐ－ＳＴＡＴ５シグナル活性化のＥＣ５０の検出：
a) ＣＤ８＋ ＣＤ２５＋Ｔ細胞を用意し、１ウェルあたり１×１０５細胞で９６ウェルＵ底培養プレートを敷いた。
b) 手順５におけるｂ）－ｈ）と同様にして、ｐ－ＳＴＡＴ５シグナルのＥＣ５０値および曲線を作成した結果を図５．Ｂ、Ｄに示す。
a) ＣＤ８＋ ＣＤ２５＋Ｔ細胞を用意し、１ウェルあたり１×１０５細胞で９６ウェルＵ底培養プレートを敷いた。
b) 手順５におけるｂ）－ｈ）と同様にして、ｐ－ＳＴＡＴ５シグナルのＥＣ５０値および曲線を作成した結果を図５．Ｂ、Ｄに示す。
【0155】
実験結果に基づき、ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ－ＦＣのＣＤ８＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞に対する活性化効果とＣＤ８＋ＣＤ２５－Ｔ細胞に対する活性化効果との比を比較したところ（表６．１、６．２）、１）本発明の各ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ－ＦＣのＣＤ８＋ＣＤ２５－Ｔ細胞に対する活性化効果はＩＬ－２３Ｘ－ＦＣよりも優れており、ＩＬ－２ＷＴ－ＦＣと比較的近く、ここで、Ｙ０７およびＹ１０効果は市販のＩＬ－２よりも強い。２）ＣＤ２５発現を刺激した後、本発明の各ＩＬ－２ｍｕｔａｎｔ－ＦＣのＣＤ８＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞に対する活性化効果は、ＣＤ２５－時よりもわずかに増加したが、市販のＩＬ－２、ＩＬ－２ＷＴ－ＦＣの大きな幅と比較して有意差があったことがわかった。まとめると、ＣＤ２５＋ ＥＣ５０／ＣＤ２５－ ＥＣ５０の倍数から明らかなように、本発明の各ＩＬ－２の変異体は、ＣＤ２５＋細胞活性化への偏向性を効果的に排除し、Ｙ０７、Ｙ１０がＣＤ２５－細胞を活性化する効果は、残りの変異より優れている。
【表9】
【表10】
【0156】
配列表
ＩＬ－２ＷＴ（配列番号１）、変異（Ｃ１２５Ｓ）を有する
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT
ＩＬ－２３Ｘ（配列番号２）、変異（Ｃ１２５Ｓ，Ｒ３８Ｄ，Ｋ４３Ｅ，Ｅ６１Ｒ）を有する
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTDMLTFEFYMPKKATELKHLQCLERELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT
ＩＬ－２Ｈ９（配列番号３）、変異（Ｃ１２５Ｓ，Ｌ８０Ｆ，Ｒ８１Ｄ，Ｌ８５Ｖ，Ｉ８６Ｖ，Ｉ９２Ｆ）を有する
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHFDPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT
酵母ディスプレイプラスミドｐＹＤＣ０１１（配列番号４）
ACGGATTAGAAGCCGCCGAGCGGGTGACAGCCCTCCGAAGGAAGACTCTCCTCCGTGCGTCCTCGTCTTCACCGGTCGCGTTCCTGAAACGCAGATGTGCCTCGCGCCGCACTGCTCCGAACAATAAAGATTCTACAATACTAGCTTTTATGGTTATGAAGAGGAAAAATTGGCAGTAACCTGGCCCCACAAACCTTCAAATGAACGAATCAAATTAACAACCATAGGATGATAATGCGATTAGTTTTTTAGCCTTATTTCTGGGGTAATTAATCAGCGAAGCGATGATTTTTGATCTATTAACAGATATATAAATGCAAAAACTGCATAACCACTTTAACTAATACTTTCAACATTTTCGGTTTGTATTACTTCTTATTCAAATGTAATAAAAGTATCAACAAAAAATTGTTAATATACCTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACCCCGGATCGGACTACTAGCAGCTGTAATACGACTCACTATAGGGAATATTAAGCTAATTCCCTACTTCATACATTTTCAATTAAGATGCAGTTACTTCGCTGTTTTTCAATATTTTCTGTTATTGCTTCAGTTTTAGCAGGaTCctgacatagtagggattataaGGaGGcGGtGGaTCcGATTACAAGGATGACGATGACAAGGGCGGAGGAGGCTCcCAGGAACTGACAACTATATGCGAGCAAATCCCCTCACCAACTTTAGAATCGACGCCGTACTCTTTGTCAACGACTACTATTTTGGCCAACGGGAAGGCAATGCAAGGAGTTTTTGAATATTACAAATCAGTAACGTTTGTCAGTAATTGCGGTTCTCACCCCTCAACgACTAGCAAAGGCAGCCCCATAAACACACAGTATGTTTTTtaaTGAGTTTAAACCCGCTGATCTGATAACAACAGTGTAGATGTAACAAAATCGACTTTGTTCCCACTGTACTTTTAGCTCGTACAAAATACAATATACTTTTCATTTCTCCGTAAACAACATGTTTTCCCATGTAATATCCTTTTCTATTTTTCGTTCCGTTACCAACTTTACACATACTTTATATAGCTATTCACTTCTATACACTAAAAAACTAAGACAATTTTAATTTTGCTGCCTGCCATATTTCAATTTGTTATAAATTCCTATAATTTATCCTATTAGTAGCTAAAAAAAGATGAATGTGAATCGAATCCTAAGAGAATTGGGCAAGTGCACAAACAATACTTAAATAAATACTACTCAGTAATAACCTATTTCTTAGCATTTTTGACGAAATTTGCTATTTTGTTAGAGTCTTTTACACCATTTGTCTCCACACCTCCGCTTACATCAACACCAATAACGCCATTTAATCTAAGCGCATCACCAACATTTTCTGGCGTCAGTCCACCAGCTAACATAAAATGTAAGCTCTCGGGGCTCTCTTGCCTTCCAACCCAGTCAGAAATCGAGTTCCAATCCAAAAGTTCACCTGTCCCACCTGCTTCTGAATCAAACAAGGGAATAAACGAATGAGGTTTCTGTGAAGCTGCACTGAGTAGTATGTTGCAGTCTTTTGGAAATACGAGTCTTTTAATAACTGGCAAACCGAGGAACTCTTGGTATTCTTGCCACGACTCATCTCCGTGCAGTTGGACGATATCAATGCCGTAATCATTGACCAGAGCCAAAACATCCTCCTTAGGTTGATTACGAAACACGCCAACCAAGTATTTCGGAGTGCCTGAACTATTTTTATATGCTTTTACAAGACTTGAAATTTTCCTTGCAATAACCGGGTCAATTGTTCTCTTTCTATTGGGCACACATATAATACCCAGCAAGTCAGCATCGGAATCTAGAGCACATTCTGCGGCCTCTGTGCTCTGCAAGCCGCAAACTTTCACCAATGGACCAGAACTACCTGTGAAATTAATAACAGACATACTCCAAGCTGCCTTTGTGTGCTTAATCACGTATACTCACGTGCTCAATAGTCACCAATGCCCTCCCTCTTGGCCCTCTCCTTTTCTTTTTTCGACCGAATTTCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGGACGGATCGCTTGCCTGTAACTTACACGCGCCTCGTATCTTTTAATGATGGAATAATTTGGGAATTTACTCTGTGTTTATTTATTTTTATGTTTTGTATTTGGATTTTAGAAAGTAAATAAAGAAGGTAGAAGAGTTACGGAATGAAGAAAAAAAAATAAACAAAGGTTTAAAAAATTTCAACAAAAAGCGTACTTTACATATATATTTATTAGACAAGAAAAGCAGATTAAATAGATATACATTCGATTAACGATAAGTAAAATGTAAAATCACAGGATTTTCGTGTGTGGTCTTCTACACAGACAAGATGAAACAATTCGGCATTAATACCTGAGAGCAGGAAGAGCAAGATAAAAGGTAGTATTTGTTGGCGATCCCCCTAGAGTCTTTTACATCTTCGGAAAACAAAAACTATTTTTTCTTTAATTTCTTTTTTTACTTTCTATTTTTAATTTATATATTTATATTAAAAAATTTAAATTATAATTATTTTTATAGCACGTGATGAAAAGGACCCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGCAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGGAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCCGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTACCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCCTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCGGAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGCTAGT
ＩＬ－２受容体配列：
ＩＬ－２Ｒα受容体（配列番号１１）、Ｃ末端にａｖｉタグおよびＨｉｓ６タグを付ける
ELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGEMETSQFPGEEKPQASPEGRPESETSCLVTTGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH
ＩＬ－２Ｒβ受容体（配列番号１２）、Ｃ末端にａｖｉタグおよびＨｉｓ６タグを付ける
AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPISLQVVHVETHRCNISWEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTWEEAPLLTLKQKQEWICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDTGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH
ベクターｐＹＤＯ＿０１７：（配列番号１３）
gacggatcgggagatctcccgatcccctatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagctggatggagaccgacaccctcttactgtgggtgctgctgctgtgggttcccggttccactggATCctgacatagtagggattataaGGaGGcGGtGGaTCcggcggcggaggctccgacaaaacccatacatgtcctccttgccccgcccctgaggctgctggaggccccagcgtgttcctgtttccccccaagcccaaagataccctcatgatctccaggacccccgaagtgacctgcgtcgtggtcgacgtgagccacgaggaccctgaagtcaagttcaactggtacgtcgatggcgtggaggtgcacaacgctaagaccaaaccccgggaagagcagtacaattccacctacagggtggtgtccgtcctgacagtgctgcaccaagactggctgaatggaaaggagtacaagtgcaaagtgagcaataaggccctccctgctcccattgagaagaccatttccaaggccaaaggccagcctcgggaaccccaggtgtacacactgcccccttccagggaggagatgaccaagaaccaggtgagcctcacctgcctggtgaagggcttctaccctagcgacattgctgtggagtgggagagcaacggccagcccgaaaacaactataagacaacccctcccgtgctggacagcgacggctccttctttctgtactccaagctcaccgtggacaagtccaggtggcaacagggaaacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggccctccacaaccactacacccagaagagcctgagcctgtcccctggcaagtgatgaagcggccgctcgagtctagagggcccgtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaaccagctggggctctagggggtatccccacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctctgcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagctcccgggagcttgtatatccattttcggatctgatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccaccccaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctgtataccgtcgacctctagctagagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttc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ＩＬ－２ＷＴ（配列番号１）、変異（Ｃ１２５Ｓ）を有する
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT
ＩＬ－２３Ｘ（配列番号２）、変異（Ｃ１２５Ｓ，Ｒ３８Ｄ，Ｋ４３Ｅ，Ｅ６１Ｒ）を有する
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTDMLTFEFYMPKKATELKHLQCLERELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT
ＩＬ－２Ｈ９（配列番号３）、変異（Ｃ１２５Ｓ，Ｌ８０Ｆ，Ｒ８１Ｄ，Ｌ８５Ｖ，Ｉ８６Ｖ，Ｉ９２Ｆ）を有する
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHFDPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT
酵母ディスプレイプラスミドｐＹＤＣ０１１（配列番号４）
ACGGATTAGAAGCCGCCGAGCGGGTGACAGCCCTCCGAAGGAAGACTCTCCTCCGTGCGTCCTCGTCTTCACCGGTCGCGTTCCTGAAACGCAGATGTGCCTCGCGCCGCACTGCTCCGAACAATAAAGATTCTACAATACTAGCTTTTATGGTTATGAAGAGGAAAAATTGGCAGTAACCTGGCCCCACAAACCTTCAAATGAACGAATCAAATTAACAACCATAGGATGATAATGCGATTAGTTTTTTAGCCTTATTTCTGGGGTAATTAATCAGCGAAGCGATGATTTTTGATCTATTAACAGATATATAAATGCAAAAACTGCATAACCACTTTAACTAATACTTTCAACATTTTCGGTTTGTATTACTTCTTATTCAAATGTAATAAAAGTATCAACAAAAAATTGTTAATATACCTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACCCCGGATCGGACTACTAGCAGCTGTAATACGACTCACTATAGGGAATATTAAGCTAATTCCCTACTTCATACATTTTCAATTAAGATGCAGTTACTTCGCTGTTTTTCAATATTTTCTGTTATTGCTTCAGTTTTAGCAGGaTCctgacatagtagggattataaGGaGGcGGtGGaTCcGATTACAAGGATGACGATGACAAGGGCGGAGGAGGCTCcCAGGAACTGACAACTATATGCGAGCAAATCCCCTCACCAACTTTAGAATCGACGCCGTACTCTTTGTCAACGACTACTATTTTGGCCAACGGGAAGGCAATGCAAGGAGTTTTTGAATATTACAAATCAGTAACGTTTGTCAGTAATTGCGGTTCTCACCCCTCAACgACTAGCAAAGGCAGCCCCATAAACACACAGTATGTTTTTtaaTGAGTTTAAACCCGCTGATCTGATAACAACAGTGTAGATGTAACAAAATCGACTTTGTTCCCACTGTACTTTTAGCTCGTACAAAATACAATATACTTTTCATTTCTCCGTAAACAACATGTTTTCCCATGTAATATCCTTTTCTATTTTTCGTTCCGTTACCAACTTTACACATACTTTATATAGCTATTCACTTCTATACACTAAAAAACTAAGACAATTTTAATTTTGCTGCCTGCCATATTTCAATTTGTTATAAATTCCTATAATTTATCCTATTAGTAGCTAAAAAAAGATGAATGTGAATCGAATCCTAAGAGAATTGGGCAAGTGCACAAACAATACTTAAATAAATACTACTCAGTAATAACCTATTTCTTAGCATTTTTGACGAAATTTGCTATTTTGTTAGAGTCTTTTACACCATTTGTCTCCACACCTCCGCTTACATCAACACCAATAACGCCATTTAATCTAAGCGCATCACCAACATTTTCTGGCGTCAGTCCACCAGCTAACATAAAATGTAAGCTCTCGGGGCTCTCTTGCCTTCCAACCCAGTCAGAAATCGAGTTCCAATCCAAAAGTTCACCTGTCCCACCTGCTTCTGAATCAAACAAGGGAATAAACGAATGAGGTTTCTGTGAAGCTGCACTGAGTAGTATGTTGCAGTCTTTTGGAAATACGAGTCTTTTAATAACTGGCAAACCGAGGAACTCTTGGTATTCTTGCCACGACTCATCTCCGTGCAGTTGGACGATATCAATGCCGTAATCATTGACCAGAGCCAAAACATCCTCCTTAGGTTGATTACGAAACACGCCAACCAAGTATTTCGGAGTGCCTGAACTATTTTTATATGCTTTTACAAGACTTGAAATTTTCCTTGCAATAACCGGGTCAATTGTTCTCTTTCTATTGGGCACACATATAATACCCAGCAAGTCAGCATCGGAATCTAGAGCACATTCTGCGGCCTCTGTGCTCTGCAAGCCGCAAACTTTCACCAATGGACCAGAACTACCTGTGAAATTAATAACAGACATACTCCAAGCTGCCTTTGTGTGCTTAATCACGTATACTCACGTGCTCAATAGTCACCAATGCCCTCCCTCTTGGCCCTCTCCTTTTCTTTTTTCGACCGAATTTCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGGACGGATCGCTTGCCTGTAACTTACACGCGCCTCGTATCTTTTAATGATGGAATAATTTGGGAATTTACTCTGTGTTTATTTATTTTTATGTTTTGTATTTGGATTTTAGAAAGTAAATAAAGAAGGTAGAAGAGTTACGGAATGAAGAAAAAAAAATAAACAAAGGTTTAAAAAATTTCAACAAAAAGCGTACTTTACATATATATTTATTAGACAAGAAAAGCAGATTAAATAGATATACATTCGATTAACGATAAGTAAAATGTAAAATCACAGGATTTTCGTGTGTGGTCTTCTACACAGACAAGATGAAACAATTCGGCATTAATACCTGAGAGCAGGAAGAGCAAGATAAAAGGTAGTATTTGTTGGCGATCCCCCTAGAGTCTTTTACATCTTCGGAAAACAAAAACTATTTTTTCTTTAATTTCTTTTTTTACTTTCTATTTTTAATTTATATATTTATATTAAAAAATTTAAATTATAATTATTTTTATAGCACGTGATGAAAAGGACCCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGCAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGGAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCCGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTACCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCCTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCGGAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGCTAGT
【表11】
ＩＬ－２Ｒα受容体（配列番号１１）、Ｃ末端にａｖｉタグおよびＨｉｓ６タグを付ける
ELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLCTGNSSHSSWDNQCQCTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCREPPPWENEATERIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICTGEMETSQFPGEEKPQASPEGRPESETSCLVTTGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH
ＩＬ－２Ｒβ受容体（配列番号１２）、Ｃ末端にａｖｉタグおよびＨｉｓ６タグを付ける
AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPISLQVVHVETHRCNISWEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTWEEAPLLTLKQKQEWICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDTGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH
ベクターｐＹＤＯ＿０１７：（配列番号１３）
gacggatcgggagatctcccgatcccctatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagctggatggagaccgacaccctcttactgtgggtgctgctgctgtgggttcccggttccactggATCctgacatagtagggattataaGGaGGcGGtGGaTCcggcggcggaggctccgacaaaacccatacatgtcctccttgccccgcccctgaggctgctggaggccccagcgtgttcctgtttccccccaagcccaaagataccctcatgatctccaggacccccgaagtgacctgcgtcgtggtcgacgtgagccacgaggaccctgaagtcaagttcaactggtacgtcgatggcgtggaggtgcacaacgctaagaccaaaccccgggaagagcagtacaattccacctacagggtggtgtccgtcctgacagtgctgcaccaagactggctgaatggaaaggagtacaagtgcaaagtgagcaataaggccctccctgctcccattgagaagaccatttccaaggccaaaggccagcctcgggaaccccaggtgtacacactgcccccttccagggaggagatgaccaagaaccaggtgagcctcacctgcctggtgaagggcttctaccctagcgacattgctgtggagtgggagagcaacggccagcccgaaaacaactataagacaacccctcccgtgctggacagcgacggctccttctttctgtactccaagctcaccgtggacaagtccaggtggcaacagggaaacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggccctccacaaccactacacccagaagagcctgagcctgtcccctggcaagtgatgaagcggccgctcgagtctagagggcccgtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaaccagctggggctctagggggtatccccacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctctgcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagctcccgggagcttgtatatccattttcggatctgatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccaccccaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctgtataccgtcgacctctagctagagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttc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【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図4C-D】
【図5A-B】
【図5C-D】
【図6】
【配列表】