特許 7512285 マイクロＲＮＡを用いた胃癌の診断方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-06-28

(45)【発行日】2024-07-08

(54)【発明の名称】マイクロＲＮＡを用いた胃癌の診断方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6886 20180101AFI20240701BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6886 Z

【請求項の数】 12

(21)【出願番号】P 2021535309

(86)(22)【出願日】2019-12-17

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-14

(86)【国際出願番号】 SG2019050621

(87)【国際公開番号】W WO2020130944

(87)【国際公開日】2020-06-25

【審査請求日】2022-12-12

(31)【優先権主張番号】10201811421Q

(32)【優先日】2018-12-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】SG

(73)【特許権者】

【識別番号】504354117

【氏名又は名称】エイジェンシー・フォー・サイエンス，テクノロジー・アンド・リサーチ

(73)【特許権者】

【識別番号】521266642

【氏名又は名称】ミレクサス ラブ ピーティーイー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100206335

【弁理士】

【氏名又は名称】太田 和宏

(74)【代理人】

【識別番号】100120857

【弁理士】

【氏名又は名称】渡邉 聡

(72)【発明者】

【氏名】トゥー ヘン フォン

(72)【発明者】

【氏名】チュン カ ヤン

(72)【発明者】

【氏名】クェク ジア ミン

(72)【発明者】

【氏名】ゾウ ルイ ヤン

【審査官】上條 のぶよ

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１７－５２５３５０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１１－５１６０３２（ＪＰ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０８０４８５７４（ＣＮ，Ａ）

【文献】聖マリアンナ医科大学雑誌，2018年，Vol. 46，p. 111-118

【文献】膜，2015年，Vol.40, No.5，p.235-241

【文献】Drug Delivery System，Vol.26, No.1，2011年，p.10-14

【文献】BMC Medical Genomics，2011年，4:79，p.1-13

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｑ １／６８８６

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

胃癌の検出方法であって、個体からの、又は個体の試料における細胞外小胞（ＥＶ）におけるｍｉＲＮＡの発現レベルを検出する工程を含み、
前記ｍｉＲＮＡがｈｓａ－ｍｉＲ－４８４であり、
胃癌に罹患していないことが知られている個体からの、又は胃癌に罹患していないことが知られている個体の試料における前記ｍｉＲＮＡの発現レベルと比較して変化した前記ｍｉＲＮＡの発現レベルが、前記個体が胃癌に罹患しているか、又は胃癌に罹患している可能性が高いことを示す方法。

【請求項2】

ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４が、ｍｉＲＢａｓｅ受入番号ＭＩＭＡＴ０００２１７４を有するポリヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記変化した前記ｍｉＲＮＡの発現レベルが、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４の上昇した発現レベルを含む請求項１に記載の方法。

【請求項4】

３つのｍｉＲＮＡ、４つのｍｉＲＮＡ、５つのｍｉＲＮＡ、６つのｍｉＲＮＡ及び７つのｍｉＲＮＡよりなる群から選択される２つ以上のｍｉＲＮＡの、試料における発現レベルを検出する工程を含む請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記２つ以上のｍｉＲＮＡが、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ、及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐからなる群から選択され、１つのｍｉＲＮＡがｈｓａ－ｍｉＲ－４８４である、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記試料が、上咽頭分泌物、尿、血清、リンパ液、唾液、肛門及び膣内の分泌物、汗及び精液よりなる群から選択される体液試料を含む請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記細胞外小胞（ＥＶ）が、ポリマーベースの沈殿を用いて前記試料から単離されたものである請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記検出が、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応（多重ＰＣＲ）、ノーザンブロット、リボヌクレアーゼプロテクション、マイクロアレイハイブリダイゼーション及びＲＮＡシークエンシングよりなる群から選択されるポリメラーゼ連鎖反応を含む請求項１に記載の方法。

【請求項9】

胃癌検出のための診断キットであって、
（ａ）細胞外小胞（ＥＶ）における２つ以上のｍｉＲＮＡに結合することができる配列、及び
（ｂ）細胞外小胞を単離する手段を含み、
前記２つ以上のｍｉＲＮＡが、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐからなる群から選択され、１つのｍｉＲＮＡがｈｓａ－ｍｉＲ－４８４である、前記キット。

【請求項10】

前記（ａ）の配列がマイクロアレイ又はＲＮＡシークエンシングに使用されるためのものである、請求項９に記載の診断キット。

【請求項11】

前記（ａ）の配列がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）キットに含まれる、請求項９に記載の診断キット。

【請求項12】

前記ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）キットがマルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）キットである、請求項１１に記載の診断キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、医学、細胞生物学、分子生物学及び遺伝学の分野に関する。

【背景技術】

【0002】

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、タンパク質の発現を制御して、細胞の分化、増殖、アポトーシス等、いくつかの重要な細胞プロセスにおいて生理的意義を発揮する小さな非コードＲＮＡ（約１９～２２ヌクレオチド）である。血清、血漿、全血等の生体液中で容易に検出できる循環ｍｉＲＮＡは、癌を含めた様々な疾患の非侵襲的な検出のための有望なリキッドバイオプシー（液体細胞診）のバイオマーカーである。加えて、ｍｉＲＮＡに影響を与える異常は、癌の発生及び進行に大きく影響することが示されている。

【0003】

ｍｉＲＮＡは血清／血漿中で安定しているため、疾患の循環バイオマーカーとして利用できる可能性が高く、早期発見、予後判定又は治療を目的としたｍｉＲＮＡバイオマーカーの特定が大きく注目され、多大な努力が払われている。

【0004】

しかしながら、ｍｉＲＮＡの変化した発現レベルは、疾患の発症時にはほとんど見られずに、診断が困難になることがある。理想的なリキッドバイオプシーのバイオマーカーは、癌試料と対照試料の間で高い信号対雑音比を有し、臨床現場で容易に検出できるものでなければならない。それゆえ、現在の課題は、疾患の個体と健常な個体とにおけるｍｉＲＮＡの発現レベルのわずかな差を測定することである。バイオマーカーの信号対雑音比が低いことが多いため、罹患した試料と健常な試料との間の循環ｍｉＲＮＡ量の微妙な、しかし意味のある差を検出することは、臨床現場での重要な課題として残っている。

【0005】

異なる研究において特定されたｍｉＲＮＡシグネチャーには大きなばらつきがある。そのようなばらつきの理由の１つは、試料の取り扱いが血液試料の溶血の度合いに影響を与える可能性があり、これが溶解した赤血球（ＲＢＣ）からのｍｉＲＮＡの放出につながり、それゆえｍｉＲＮＡプロファイルを変化させることにある。

【0006】

細胞外小胞（ＥＶ）は、細胞間のコミュニケーションに重要な役割を果たし、腫瘍の発生を促進する。ＥＶにおけるｍｉＲＮＡの発現は頻繁に制御異常になっており、癌細胞はｍｉＲＮＡを含むＥＶを癌の微小環境に活発に分泌する可能性がある。それゆえ、ＥＶからｍｉＲＮＡを単離することで、生体液中に存在する潜在的な混入ｍｉＲＮＡを低減できる可能性があり、それゆえ、癌又は他の疾患の早期診断に有用である。しかしながら、ＥＶの単離には手間と時間がかかる可能性があるため、臨床現場での応用には限界がある。これまで、ＥＶ－ｍｉＲＮＡの単離方法に関する体系的かつ包括的な評価は行われておらず、ＥＶ－ｍｉＲＮＡの単離についての標準的なプロトコルは存在しない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

ｍｉＲＮＡは、胃癌を含む癌の診断に提案されているが、これまでのところ、同一疾患に対する異なる研究で特定されたｍｉＲＮＡシグネチャーには、あまり良い相関性がない。

【0008】

例えば、Ｌｅｉｄｎｅｒら（２０１３）及びＴｉｂｅｒｉｏら（２０１５）は、ｍｉＲＮＡを診断マーカーとして使用する際に直面する問題の例を提示する。
・Ｌｅｉｄｎｅｒ ＲＳ、Ｌｉ Ｌ、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＣＬ． Ｄａｍｐｅｎｉｎｇ ｅｎｔｈｕｓｉａｓｍ ｆｏｒ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２０１３；８（３）：ｅ５７８４１． ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００５７８４１
・Ｔｉｂｅｒｉｏ Ｐ、Ｃａｌｌａｒｉ Ｍ、Ａｎｇｅｌｏｎｉ Ｖ、Ｄａｉｄｏｎｅ ＭＧ、Ａｐｐｉｅｒｔｏ Ｖ． Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｉｎ ｕｓｉｎｇ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｍｉＲＮＡｓ ａｓ ｃａｎｃｅｒ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ． Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ． ２０１５；２０１５：７３１４７９． ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１５／７３１４７９

【0009】

対照的に、請求項に係る発明では、信号対雑音比を向上させることができる改良が可能であり、それゆえ、胃癌で差次的に発現するｍｉＲＮＡをより確実に特定することができ、それゆえ、請求項に係るアッセイの診断性能を当該技術分野のものよりも向上させることができる。

【0010】

さらには、胃癌に関連する症状の多くは胃癌に特異的ではない。それゆえ、症状が重くなって医師が関連する画像検査又は内視鏡検査を行うようになる後期まで、胃癌を特定することは容易ではない。

【0011】

早期に治療を受けた患者の生存率は、進行した癌が見つかった患者に比べてはるかに良好である。それゆえ、胃癌の早期診断に使用されてもよい信頼性の高い検査には価値がある。

【0012】

Ｐａｓｅｃｈｎｉｋｏｖら（２０１４）及びＫｉｍらに示されているように、現在のスクリーニング方法は、通常、侵襲的な方法（生検若しくは内視鏡検査）又はイメージング（撮像）ベースの方法（患者に放射能を浴びせ、かつ／又はコストがかかることが多い）を使用する。
・Ｐａｓｅｃｈｎｉｋｏｖ Ｖ、Ｃｈｕｋｏｖ Ｓ、Ｆｅｄｏｒｏｖ Ｅ、Ｋｉｋｕｓｔｅ Ｉ、Ｌｅｊａ Ｍ． Ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ： ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ， ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｅａｒｌｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ． Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ． ２０１４；２０（３８）：１３８４２－１３８６２． ｄｏｉ：１０．３７４８／ｗｊｇ．ｖ２０．ｉ３８．１３８４２
・Ｋｉｍ ＧＨ、Ｌｉａｎｇ ＰＳ、Ｂａｎｇ ＳＪ、Ｈｗａｎｇ ＪＨ． Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ｆｏｒ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ： Ｉｓ ｉｔ ｎｅｅｄｅｄ？ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ Ｅｎｄｏｓｃ． ２０１６ Ｊｕｌ；８４（１）：１８－２８． ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｇｉｅ．２０１６．０２．０２８． ２０１６年３月３日電子出版

【0013】

ペプシノゲンやピロリ菌検査等の現在利用できる非侵襲的な検査は、必要な特異性と感度を与えない。

【0014】

それゆえ、本発明者らは、現在利用できるものよりも改良されており全体集団における胃癌の診断に有用であると思われる非侵襲的な方法論を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0015】

いくつかの実施形態では、この検査を用いた陽性診断は、内視鏡検査又は生検等のより侵襲的なゴールドスタンダード検査を用いたさらなる確認検査につながる可能性がある。これにより、そのような侵襲的で費用のかかる検査を受ける必要のある患者の数をそもそも減らすことができよう。

【0016】

本発明の第１の態様によれば、胃癌の診断方法が提供される。この方法は、個体からの、又は個体の試料におけるｍｉＲＮＡの発現レベルを検出する工程を含んでもよい。

【0017】

上記ｍｉＲＮＡは、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５からなる群から選択されてもよい。当該方法は、胃癌に罹患していないことが知られている個体からの、又は胃癌に罹患していないことが知られている個体の試料におけるｍｉＲＮＡの発現レベルと比較して変化したｍｉＲＮＡの発現レベルが、その個体が胃癌に罹患しているか、又は胃癌に罹患している可能性が高いことを示すというものであってもよい。

【0018】

上記ｍｉＲＮＡの発現レベルは、個体からの試料又は個体の試料の中の細胞外小胞（ＥＶ）で検出されてもよい。

【0019】

上記ｍｉＲＮＡは、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４を含んでいてもよい。ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４は、ｍｉＲＢａｓｅ受入番号ＭＩＭＡＴ０００２１７４を有するポリヌクレオチド配列を含んでいてもよい。また、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４は、その変異体、相同体、誘導体又は断片（フラグメント）を含んでいてもよい。このその変異体、相同体、誘導体又は断片は、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４に対して７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列を含んでいてもよい。その変異体、相同体、誘導体又は断片は、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４活性を含んでいてもよい。変化した発現レベルは、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４の発現レベルの上昇を含んでいてもよい。

【0020】

上記ｍｉＲＮＡは、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐを含んでいてもよい。ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐは、ｍｉＲＢａｓｅ受入番号ＭＩＭＡＴ００００４５６を有するポリヌクレオチド配列を含んでいてもよい。ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐは、その変異体、相同体、誘導体又は断片を含んでいてもよい。その変異体、相同体、誘導体又は断片は、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐに対して７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列を含んでいてもよい。その変異体、相同体、誘導体又は断片は、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ活性を含んでいてもよい。変化した発現レベルは、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐの発現レベルの上昇を含んでいてもよい。

【0021】

上記ｍｉＲＮＡは、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐを含んでいてもよい。ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐは、ｍｉＲＢａｓｅ受入番号ＭＩＭＡＴ００００４３３を有するポリヌクレオチド配列を含んでいてもよい。また、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐは、その変異体、相同体、誘導体又は断片を含んでいてもよい。その変異体、相同体、誘導体又は断片は、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐに対して７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列を含んでいてもよい。その変異体、相同体、誘導体又は断片は、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ活性を含んでいてもよい。変化した発現レベルは、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐの発現レベルの低下を含んでいてもよい。

【0022】

上記ｍｉＲＮＡは、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄを含んでいてもよい。ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄは、ｍｉＲＢａｓｅ受入番号ＭＩＭＡＴ０００６７６４を有するポリヌクレオチド配列を含んでいてもよい。また、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄは、その変異体、相同体、誘導体又は断片を含んでいてもよい。その変異体、相同体、誘導体又は断片は、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄに対して７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列を含んでいてもよい。その変異体、相同体、誘導体又は断片は、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ活性を含んでいてもよい。変化した発現レベルは、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄの発現レベルの上昇を含んでいてもよい。

【0023】

上記ｍｉＲＮＡは、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａを含んでいてもよい。ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａは、ｍｉＲＢａｓｅ受入番号ＭＩ００００５４２を有するポリヌクレオチド配列を含んでいてもよい。また、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａは、その変異体、相同体、誘導体又は断片を含んでいてもよい。その変異体、相同体、誘導体又は断片は、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａに対して７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列を含んでいてもよい。その変異体、相同体、誘導体又は断片は、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ活性を含んでいてもよい。変化した発現レベルは、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａの発現レベルの上昇を含んでいてもよい。

【0024】

上記ｍｉＲＮＡは、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂを含んでいてもよい。ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂは、ｍｉＲＢａｓｅ受入番号ＭＩＭＡＴ０００５７９２を有するポリヌクレオチド配列を含んでいてもよい。また、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂは、その変異体、相同体、誘導体又は断片を含んでいてもよい。その変異体、相同体、誘導体又は断片は、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂに対して７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列を含んでいてもよい。その変異体、相同体、誘導体又は断片は、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ活性を含んでいてもよい。変化した発現レベルは、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂの発現レベルの上昇を含んでいてもよい。

【0025】

上記ｍｉＲＮＡは、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐを含んでいてもよい。ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐは、ｍｉＲＢａｓｅ受入番号ＭＩＭＡＴ０００００７０を有するポリヌクレオチド配列を含んでいてもよい。また、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐは、その変異体、相同体、誘導体又は断片を含んでいてもよい。その変異体、相同体、誘導体又は断片は、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐに対して７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列を含んでいてもよい。その変異体、相同体、誘導体又は断片は、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ活性を含んでいてもよい。変化した発現レベルは、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐの発現レベルの低下を含んでいてもよい。

【0026】

当該方法は、２つ以上のそのようなｍｉＲＮＡの、試料における、例えば上記試料の中の又は試料の細胞外小胞（ＥＶ）における発現レベルを検出する工程を含んでもよい。当該方法は、３つのそのようなｍｉＲＮＡの、試料における、例えば上記試料の中の又は試料の細胞外小胞（ＥＶ）における発現レベルを検出する工程を含んでもよい。当該方法は、４つのそのようなｍｉＲＮＡの、試料における、例えば上記試料の中の又は試料の細胞外小胞（ＥＶ）における発現レベルを検出する工程を含んでもよい。当該方法は、５つのそのようなｍｉＲＮＡの、試料における、例えば上記試料の中の又は試料の細胞外小胞（ＥＶ）における発現レベルを検出する工程を含んでもよい。当該方法は、６つのそのようなｍｉＲＮＡの、試料における、例えば上記試料の中の又は試料の細胞外小胞（ＥＶ）における発現レベルを検出する工程を含んでもよい。当該方法は、７つのそのようなｍｉＲＮＡの、試料における、例えば上記試料の中の又は試料の細胞外小胞（ＥＶ）における発現レベルを検出する工程を含んでもよい。

【0027】

当該方法は、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐからなる群から選択されるいずれか１つ以上のｍｉＲＮＡと組み合わせてさらなるｍｉＲＮＡの、試料における、例えば上記試料の中の又は試料の細胞外小胞（ＥＶ）における発現レベルを検出する工程をさらに含んでもよい。このさらなるｍｉＲＮＡは、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐ（ｍｉＲＢａｓｅ受入番号ＭＩＭＡＴ０００４７４８）を含んでいてもよい。さらなるｍｉＲＮＡは、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列等、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐの変異体、相同体、誘導体又は断片を含んでいてもよい。このようなｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐの変異体、相同体、誘導体又は断片は、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐ活性を含んでいてもよい。

【0028】

０．３９以上のｈｓａ－ｍｉＲ－４８４の発現レベルが検出された場合、胃癌が示されてもよい。ｌｏｇ_２（個体の発現レベル／対照の発現レベル）として測定されたｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐの発現レベルが０．１５以上である場合に胃癌が示されてもよく、対照は、胃癌に罹患していないことが知られている個体からの、又は胃癌に罹患していないことが知られている個体の試料における、例えば上記試料の中の若しくは上記試料の細胞外小胞（ＥＶ）におけるそのｍｉＲＮＡの発現レベルが検出されていることを示す。

【0029】

ｌｏｇ_２（個体の発現レベル／対照の発現レベル）として測定されたｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐの発現レベルが－０．３５以下である場合に胃癌が示されてもよく、対照は、胃癌に罹患していないことが知られている個体からの、又は胃癌に罹患していないことが知られている個体の試料における、例えば上記試料の中の若しくは上記試料の細胞外小胞（ＥＶ）におけるそのｍｉＲＮＡの発現レベルが検出されていることを示す。

【0030】

ｌｏｇ_２（個体の発現レベル／対照の発現レベル）として測定されたｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄの発現レベルが０．４８以上である場合に胃癌が示されてもよく、対照は、胃癌に罹患していないことが知られている個体からの、又は胃癌に罹患していないことが知られている個体の試料における、例えば上記試料の中の若しくは上記試料の細胞外小胞（ＥＶ）におけるそのｍｉＲＮＡの発現レベルが検出されていることを示す。

【0031】

ｌｏｇ_２（個体の発現レベル／対照の発現レベル）として測定されたｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａの発現レベルが０．４９以上である場合に胃癌が示されてもよく、対照は、胃癌に罹患していないことが知られている個体からの、又は胃癌に罹患していないことが知られている個体の試料における、例えば上記試料の中の若しくは上記試料の細胞外小胞（ＥＶ）におけるそのｍｉＲＮＡの発現レベルが検出されていることを示す。

【0032】

ｌｏｇ_２（個体の発現レベル／対照の発現レベル）として測定されたｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂの発現レベルが０．４以上である場合に胃癌が示されてもよく、対照は、胃癌に罹患していないことが知られている個体からの、又は胃癌に罹患していないことが知られている個体の試料における、例えば上記試料の中の若しくは上記試料の細胞外小胞（ＥＶ）におけるそのｍｉＲＮＡの発現レベルが検出されていることを示す。

【0033】

ｌｏｇ_２（個体の発現レベル／対照の発現レベル）として測定されたｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐの発現レベルが－０．３７以下である場合に胃癌が示されてもよく、対照は、胃癌に罹患していないことが知られている個体からの、又は胃癌に罹患していないことが知られている個体の試料における、例えば上記試料の中の若しくは上記試料の細胞外小胞（ＥＶ）におけるそのｍｉＲＮＡの発現レベルが検出されていることを示す。

【0034】

ｌｏｇ_２（個体の発現レベル／対照の発現レベル）として測定されたｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐの発現レベルが０．５４以上である場合に胃癌が示されてもよく、対照は、胃癌に罹患していないことが知られている個体からの、又は胃癌に罹患していないことが知られている個体の試料における、例えば上記試料の中の若しくは上記試料の細胞外小胞（ＥＶ）におけるそのｍｉＲＮＡの発現レベルが検出されていることを示す。

【0035】

試料は、体液試料を含んでもよい。試料は、個体の上咽頭（鼻咽頭）分泌物、尿、血清、リンパ液、唾液、肛門及び膣内の分泌物、汗、又は精液を含んでもよい。

【0036】

個体中の又は個体の細胞外小胞（ＥＶ）は、個体中の又は個体の試料からのものであってもよい。細胞外小胞（ＥＶ）は、ポリマーベースの沈殿を用いて試料から単離されてもよい。

【0037】

ｍｉＲＮＡの発現は、任意の手段で検出されてもよい。例えば、ｍｉＲＮＡの検出は、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応（多重ＰＣＲ）等のポリメラーゼ連鎖反応の使用を含んでもよい。ｍｉＲＮＡの検出は、ノーザンブロット、リボヌクレアーゼプロテクション（ＲＮＡｓｅプロテクション）、マイクロアレイハイブリダイゼーション、又はＲＮＡシークエンシングを用いてしてもよい。

【0038】

本発明の第２の態様によれば、上記で規定された２つ以上の核酸又はそれに特異的に結合することができるプローブの組み合わせが提供される。これは、基板上に固定化された核酸の組み合わせを含んでいてもよい。この組み合わせは、マイクロアレイの形態であっても、マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）キットとしてであってもよい。

【0039】

当該組み合わせは、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４（ｍｉＲＢａｓｅ受入番号ＭＩＭＡＴ０００２１７４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ（ｍｉＲｂａｓｅ受入番号ＭＩＭＡＴ００００４５６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ（ｍｉＲＢａｓｅ受入番号ＭＩＭＡＴ００００４３３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ（ｍｉＲＢａｓｅ受入番号ＭＩＭＡＴ０００６７６４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ（ｍｉＲＢａｓｅ受入番号ＭＩ００００５４２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ（ｍｉＲＢａｓｅ受入番号ＭＩＭＡＴ０００５７９２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ（ｍｉＲＢａｓｅ受入番号ＭＩＭＡＴ０００００７０）及びｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐ（ｍｉＲＢａｓｅ受入番号ＭＩＭＡＴ０００４７４８）の各々にそれと特異的に結合することができるプローブを含んでいてもよい。

【0040】

本発明の第３の態様によれば、胃癌の検出方法又は胃癌の重症度の決定方法において使用するためのｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐからなる群から選択されるｍｉＲＮＡ、又はその変異体、相同体、誘導体若しくは断片、例えば上記ｍｉＲＮＡに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列が提供される。

【0041】

本発明の第４の態様として、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐからなる群から選択される２つ以上のｍｉＲＮＡ、又はその変異体、相同体、誘導体若しくは断片、例えば上記ｍｉＲＮＡに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列を、薬学的に許容できる賦形剤、担体又は希釈剤とともに含む医薬組成物が提供される。

【0042】

本発明の第５の態様によれば、胃癌の診断キットであって、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐからなる群から選択される２つ以上のｍｉＲＮＡ、又はその変異体、相同体、誘導体若しくは断片、例えば上記ｍｉＲＮＡに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列に結合することができる配列を、使用説明書とともに含むキットが提供される。

【0043】

第６の態様では、本発明は、個体における胃癌の治療方法であって、上述の方法を実行する工程と、その個体が胃癌に罹患しているか又は胃癌に罹患する可能性が高いと判断される場合に、その個体に胃癌用治療剤を投与する工程とを含む方法が提供される。

【0044】

本発明の第７の態様では、個体における胃癌の治療方法であって、（ａ）個体の又は個体からの試料における、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ、並びに任意にｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐからなる群から選択されるｍｉＲＮＡ、又はその変異体、相同体、誘導体若しくは断片、例えば上記ｍｉＲＮＡに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列の発現レベルを測定するアッセイの結果を受け取る工程であって、この結果は上記試料における上記ｍｉＲＮＡの発現レベルを示す工程と、（ｂ）胃癌に罹患していないことが知られている個体の試料における上記ｍｉＲＮＡの発現レベルであるｍｉＲＮＡの基準発現レベルと比較して上記試料における上記ｍｉＲＮＡの発現が変調しており、これにより上記個体における胃癌の徴候を提供又は予測する場合、胃癌用治療剤を投与する工程とを含む方法が提供される。上記ｍｉＲＮＡ又は各ｍｉＲＮＡの発現レベルは、上記試料又は各試料の細胞外小胞（ＥＶ）において測定されてもよい。

【0045】

本発明の第８の態様によれば、個体における胃癌の治療方法であって、（ａ）個体の又は個体からの試料における、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ、並びに任意にｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐからなる群から選択されるｍｉＲＮＡ、又はその変異体、相同体、誘導体若しくは断片、例えば上記ｍｉＲＮＡに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列の発現レベルの分析の結果を得る工程と、（ｂ）胃癌に罹患していないことが知られている個体の試料、又は胃癌に罹患していないことが知られている個体からの試料における上記ｍｉＲＮＡの発現レベルである基準発現レベルと比較して上記ｍｉＲＮＡの発現レベルが変調している場合に、胃癌用治療剤を上記個体に投与する工程とを含む方法が提供される。上記ｍｉＲＮＡ又は各ｍｉＲＮＡの発現レベルは、上記試料又は各試料の細胞外小胞（ＥＶ）において測定されてもよい。

【0046】

本発明の実施には、特に断らない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ及び免疫学の従来の技術が採用され、これらは当業者の能力の範囲内である。そのような技術は、文献で説明されている。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、及びＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、第１－３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（１９９５及び定期的な補遺；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第９、１３、及び１６章、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、ニューヨーク州）；Ｂ．Ｒｏｅ、Ｊ．Ｃｒａｂｔｒｅｅ、及びＡ．Ｋａｈｎ、１９９６、ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ；Ｊ．Ｍ．Ｐｏｌａｋ及びＪａｍｅｓ Ｏ’Ｄ．ＭｃＧｅｅ、１９９０、Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ；Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（編）、１９８４、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｉｒｌ Ｐｒｅｓｓ；Ｄ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ及びＪ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅｒｇ、１９９２、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐａｒｔ Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｅｄｗａｒｄ Ｈａｒｌｏｗ、Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ、Ｅｄ ＨａｒｌｏｗによるＵｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ＮＯ． Ｉ（１９９９、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ ０－８７９６９－５４４－７）；Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ（編）、Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（編）によるＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ ０－８７９６９－３１４－２）、１８５５． Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ Ｓｅｅｔｈａｌａ、Ｐｒａｂｈａｖａｔｈｉ Ｂ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｓによる編集のＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ（２００１、ニューヨーク、ニューヨーク州、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、ＩＳＢＮ ０－８２４７－０５６２－９）；並びにＬａｂ Ｒｅｆ：Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｒｅｃｉｐｅｓ， Ｒｅａｇｅｎｔｓ， ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｕｓｅ ａｔ ｔｈｅ Ｂｅｎｃｈ、Ｊａｎｅ Ｒｏｓｋａｍｓ及びＬｉｎｄａ Ｒｏｄｇｅｒｓ編、２００２、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＩＳＢＮ ０－８７９６９－６３０－３を参照。これらの一般的なテキストの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。

【図面の簡単な説明】

【0047】

【図1A】図１Ａ及び図１Ｂは、ＥＶ画分からのｍｉＲＮＡプロファイルを示す図である。図１Ａ。２００μｌのプールしたヒト血清から、ＵＣ法（黒色）、カラムアフィニティ法（白色）、ペプチドアフィニティ法（薄灰色）、及びイムノビーズアフィニティ法（濃灰色）を用いてＥＶを単離した。次に、これらのＥＶ画分及び２００μｌの血清（全体）からＱＩＡｚｏｌ溶解試薬を用いてＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ｑＰＣＲによって１１種のｍｉＲＮＡを定量した。ＥＶ ｍｉＲＮＡの回収率（％）は、２^{－（ＣＴ全－ＣＴＥＶ）}を用いて算出した。各実験条件は３回実施し、データは平均±ＳＥＭとして提示した。

【図1B】図１Ａ及び図１Ｂは、ＥＶ画分からのｍｉＲＮＡプロファイルを示す図である。図１Ｂ。ＵＣ、カラムアフィニティ及びペプチドアフィニティを用いて単離したＥＶのウエスタンブロット解析。一般的なＥＶマーカーであるフロチリン、ＴＳＧ１０１及びＣＤ９の発現を提示する。

【図2A】図２Ａ及び図２Ｂは、ＥＶ画分からのｍｉＲＮＡプロファイルを示す図である。図２Ａ。２００μｌのプールしたヒト血清から、ＵＣ法（黒色）、Ｉｎｖｔ法（白色）、ＳＢＩ法（薄灰色）、Ｅｘｉ法（濃灰色）及びＨａｎ法（茶色）を用いてＥＶを単離した。次に、これらのＥＶ画分及び２００μｌの血清（全体）からＱＩＡｚｏｌ溶解試薬を用いてＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ｑＰＣＲによって１１種のｍｉＲＮＡを定量した。ＥＶ ｍｉＲＮＡの回収率（％）は、２^{－（ＣＴ全－ＣＴＥＶ）}を用いて算出した。各実験条件は３回実施し、データは平均±ＳＥＭとして提示した。

【図2B】図２Ａ及び図２Ｂは、ＥＶ画分からのｍｉＲＮＡプロファイルを示す図である。図２Ｂ。ＵＣ法及びポリマーベースの沈殿法を用いて単離したＥＶのウエスタンブロット解析。一般的なＥＶマーカーであるフロチリン、ＴＳＧ１０１、ＣＤ９、ＣＤ６３及びＣＤ８１の発現を提示した。

【図3】図３は、４つの異なるポリマーベースの沈殿法を用いたｍｉＲＮＡプロファイリングを示す図である。４つの方法すべてにおいて、胃癌（Ｃａｎ）群及び対照（Ｃｔｒｌ）群で、全体とＥＶ画分との間のｍｉＲＮＡ倍率変化を［ｌｏｇ_２（コピー数_ＥＶ／コピー数_全）］に基づいて算出した。

【図4】図４は、４つの異なるポリマーベースの沈殿法を用いたｍｉＲＮＡプロファイリングを示す図である。各ポリマーベースの沈殿法についての癌と対照との間の倍率変化のｐ値と、全画分でのｐ値との比較。ｐ値＜０．０５かつｐ値＜全画分のＥＶ関連ｍｉＲＮＡは丸で囲った。

【図5】図５は、癌及び対照群において信号対雑音比を高めると特定された８つのｍｉＲＮＡの発現レベルを示す箱ひげ図を示す図である。

【図6】図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃは、ＥＶ画分からのｍｉＲＮＡプロファイルを示す図である。図６Ａ及び図６Ｂは、２００μｌのプールしたヒト血清を用いて、異なる方法でＥＶを単離したことを示す図である。次に、ＱＩＡｚｏｌ溶解試薬を用いて、これらのＥＶ画分及び２００μｌの血清からＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ｑＰＣＲによって１１種のｍｉＲＮＡを定量した。各箱ひげ図は、測定した全１１種のｍｉＲＮＡの回収率（全血清からの回収率）（％）を表す。回収率（％）は２^{－（Ｃｔ全－ＣｔＥＶ）}を用いて算出した。各実験条件は３回実施し、データは平均±ＳＥＭとして提示した。「＋」は外れ値のデータ点を示した。図６Ｃは、ＰＢＰを用いて単離したＥＶのウエスタンブロット解析を示す図である。一般的なＥＶマーカーであるフロチリン、ＴＳＧ１０１、ＣＤ９、ＣＤ６３及びＣＤ８１の発現を提示した。

【図7】図７Ａ、図７Ｂは、４つの異なるＰＢＰ試薬を用いたｍｉＲＮＡプロファイリングを示す図である。図７Ａは、各試薬についての癌と対照との間の倍率変化のｐ値と、全画分でのｐ値との比較を示す図である。ｐ値＜０．０５かつｐ値＜全画分のＥＶ関連ｍｉＲＮＡを丸で囲った。破線はｌｏｇ_１０（０．０５）をカットオフ値として示した。図７Ｂは、Ｉｎｖｔを用いて単離したｍｉＲＮＡ（白棒）のＡＵＣを全血清（黒棒）と比較して示す図である。

【図8】図８Ａ及び図８Ｂは、全血清と比較してＥＶの診断性能が良好なｍｉＲＮＡを示す図である。図８Ａは、胃癌及び対照群におけるｍｉＲＮＡの倍率変化（［ｌｏｇ２（コピー数_ＥＶ－コピー数_全）］に基づいて算出）を、全血清（黒棒）及びＩｎｖｔ（白棒）で示した図である。図８Ｂは、Ｉｎｖｔ（白棒）を用いて単離したｍｉＲＮＡのＡＵＣを、全血清（黒棒）と比較して示した図である。

【図9】図９は、全血清（全）中又は単離された細胞外小胞（ＥＶ）中の胃癌の検出のための個々のｍｉＲＮＡ（１－ｍｉＲＮＡパネル）又は複数のｍｉＲＮＡの組み合わせを使用した場合のＡＵＣ値の中央値を示す図である。８－ｍｉＲＮＡパネルの場合、１つの組み合わせしか可能でないことを考慮して、中央値の代わりにただ１つのＡＵＣ値が提供されている。

【発明を実施するための形態】

【0048】

ＥＶ関連のｍｉＲＮＡは、細胞間のコミュニケーションプロセス及び腫瘍の発生に重要な役割を果たしていることから注目されている。癌の発生／進行の際には、ＥＶ関連のｍｉＲＮＡの発現レベルは頻繁に制御異常になっている。それゆえ、ＥＶ画分を単離することで、癌診断の可能性を高められる可能性がある。

【0049】

細胞外小胞（ＥＶ）は、血清中の循環ｍｉＲＮＡの主要な供給源であることから、本発明者らは、ＥＶを単離することでｍｉＲＮＡバイオマーカーが濃縮され、診断能力の向上及びバイオマーカーの性能向上につながるとの仮説を立てた。

【0050】

本発明者らは、ＥＶ関連のｍｉＲＮＡの迅速な単離のための適切なハイスループット手法を特定し、その画分が血清中のこれらのｍｉＲＮＡの検出を向上させることができるという仮説を検証しようとした。本発明者らはさらに、胃癌（ＧＣ）検出の非侵襲的な診断ツールとなりうるＥＶ関連のｍｉＲＮＡを特定しようとした。

【0051】

本研究では、胃癌（ＧＣ）のバイオマーカーとして、血清中ｍｉＲＮＡに対するＥＶ－ｍｉＲＮＡの性能を評価した。

【0052】

本発明者らは、１５人のＧＣ患者の血清及び１５人のマッチした健常な対照血清からＥＶを単離するために、５つの異なる単離方法を評価し、ポリマーベースの沈殿（ＰＢＰ）アプローチを選択した。パイロット研究として、ＧＣに関連する１３３種類のｍｉＲＮＡのパネル（一団）を、血清画分及びＥＶ画分の両方で測定した。これらのｍｉＲＮＡのうち、１１種類が癌と対照との間で有意に異なっていた。癌と対照血清との独立した２０組を用いた別の検証セットでは、１１の候補のうち８つが、全血清と比較してＥＶ画分中のｍｉＲＮＡの診断能力を高めることが判明した。以上の結果から、ＥＶ中のｍｉＲＮＡを濃縮することで、ＧＣの検出におけるｍｉＲＮＡバイオマーカーの感度を大幅に向上させることができることが明らかになり、ＧＣの診断にＥＶ－ｍｉＲＮＡを利用できる可能性が示唆された。

【0053】

具体的には、本発明者らは、最初に、超遠心分離、カラムアフィニティ、ペプチドアフィニティ、イムノビーズアフィニティによるＥＶ精製と比較して、ポリマーベースの沈殿（ＰＢＰ）が最も高いＥＶ－ｍｉＲＮＡの回収率を与えることを明らかにした。

【0054】

次に、本発明者らは、４種類のＰＢＰ試薬を用いて、１５人のＧＣ患者及び１５人の健常な対照からＥＶ－ｍｉＲＮＡを単離し、ＲＴ－ｑＰＣＲを用いてＥＶ画分及び全血清から１３３種のＧＣ関連ｍｉＲＮＡをプロファイリングした。本発明者らは、最も多くのＥＶ－ｍｉＲＮＡバイオマーカーを生成したＰＢＰ試薬を選択し、それを用いて２０人のＧＣ患者及び２０人の対照の独立のセットで１１種のＥＶ－ｍｉＲＮＡを検証した。

【0055】

これらのＥＶ－ｍｉＲＮＡバイオマーカーのうち８つが、より良好なＧＣの検出精度を与えることが判明した（ＡＵＣ＞０．８）。これらの８つのｍｉＲＮＡを使用することで、ＧＣ診断の感度と特異性が大幅に向上する。これらの８つのｍｉＲＮＡを癌診断に使用することに関する報告は他には刊行されていない。

【0056】

以上のことから、ＥＶのｍｉＲＮＡは血清のｍｉＲＮＡと比較してＧＣの検出性能を向上させることができるということが示され、８種類のＥＶ－ｍｉＲＮＡをＧＣの有望な非侵襲的バイオマーカーとして特定することにつながった。

【0057】

ＥＶを単離して引き続いてｍｉＲＮＡを検出する本発明者らの方法は、臨床現場に容易に適応できる。

【0058】

胃癌の診断におけるｍｉＲＮＡの使用
本発明者らは、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ等のｍｉＲＮＡが癌においてある役割を果たすことを初めて明らかにした。

【0059】

具体的には、本発明者らは、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐの各ｍｉＲＮＡが、胃癌細胞で異なる発現をしていることを示す。

【0060】

例えば、本出願で開示されたデータは、胃癌に罹患している（又は罹患する可能性が高い）患者では、胃癌に罹患していないことが知られている個体と比較して、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈａｓ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ又はｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂの発現が増加していることを示す。

【0061】

さらには、本出願で開示されたデータは、胃癌に罹患している（又は罹患する可能性が高い）患者では、胃癌に罹患していないことが知られている個体と比較して、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐの発現が減少していることを示す。

【0062】

従って、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐのｍｉＲＮＡは、胃癌の検出のためのマーカーとして使用されてもよい。ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐのｍｉＲＮＡ発現のレベルは、癌、特に胃癌の指標として使用されてもよい。

【0063】

ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐのｍｉＲＮＡの発現レベルは、そのような癌の可能性の高さの指標としても使用されてもよい。これらのｍｉＲＮＡのいずれか１つ以上の発現のレベルがそのような目的で検出されてもよい。これは、任意に、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのレベルの検出と組み合わされてもよい。

【0064】

ｍｉＲＮＡ自体の発現レベルが検出されてもよい。あるいは、又は加えて、本明細書中に開示された方法は、関連するｍｉＲＮＡに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列等の、その変異体、相同体、誘導体又は断片の検出を含んでもよい。

【0065】

特に、特定のｍｉＲＮＡの発現レベルが、胃癌に罹患していないことが知られている人と比較して上昇している場合に、胃癌が検出されてもよい。

【0066】

例えば、ｌｏｇ２（個体の発現レベル／対照の発現レベル）として測定された個体におけるｈｓａ－ｍｉＲ－４８４が、胃癌に罹患していないことが知られている個体に比べて、０．３９以上であり、胃癌を示す（「対照」と表記）。

【0067】

別の例として、ｌｏｇ２（個体の発現レベル／対照の発現レベル）として測定された個体におけるｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐの発現レベルが、胃癌に罹患していないことが知られている個体に比べて、０．１５以上である場合にも、胃癌が検出されてもよく、胃癌を示す（「対照」と表記）。

【0068】

さらなる例として、ｌｏｇ２（個体の発現レベル／対照の発現レベル）として測定された個体におけるｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄの発現レベルが、胃癌に罹患していないことが知られている個体に比べて、０．４８以上である場合に、胃癌が検出されてもよく、胃癌を示す（「対照」と表記）。

【0069】

さらに別の例として、ｌｏｇ２（個体の発現レベル／対照の発現レベル）として測定された個体におけるｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａの発現レベルが、胃癌に罹患していないことが知られている個体に比べて、０．４９以上である場合に、胃癌が検出されてもよく、胃癌を示す（「対照」と表記）。

【0070】

さらに別のさらなる例として、ｌｏｇ２（個体の発現レベル／対照の発現レベル）として測定された個体におけるｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂの発現レベルが、胃癌に罹患していないことが知られている個体に比べて、０．４以上である場合に、胃癌が検出されてもよく、胃癌を示す（「対照」と表記）。

【0071】

別の例としては、ｌｏｇ２（個体の発現レベル／対照の発現レベル）として測定された個体におけるｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐの発現レベルが、胃癌に罹患していないことが知られている個体に比べて、０．５４以上である場合に、胃癌が検出されてもよく、胃癌を示す（「対照」と表記）。

【0072】

他のｍｉＲＮＡについては、胃癌に罹患していないことが知られている人と比較して、特定のｍｉＲＮＡの発現レベルが低下している場合に、胃癌が検出されてもよい。

【0073】

例えば、ｌｏｇ２（個体の発現レベル／対照の発現レベル）として測定された個体におけるｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐの発現レベルが、胃癌に罹患していないことが知られている個体に比べて、－０．３５以下の場合に、胃癌が検出されてもよく、胃癌を示す（「対照」と表記）。

【0074】

別の例としては、ｌｏｇ２（個体の発現レベル／対照の発現レベル）として測定された個体におけるｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐの発現レベルが、胃癌に罹患していないことが知られている個体に比べて、－０．３７以下である場合に、胃癌が検出されてもよく、胃癌を示す（「対照」と表記）。

【0075】

それゆえ、本発明者らは、癌、特に胃癌の診断又は検出の方法を提供する。本発明者らはさらに、そのような癌の侵襲性若しくは浸潤性若しくは転移状態、又はこれらの任意の組み合わせの診断及び検出の方法を提供する。当該方法は、ｍｉＲＮＡレベルの分析（例えば、インサイツハイブリダイゼーション又はＲＴ－ＰＣＲによる）を含んでいてもよい。このような診断及び検出の方法については、以下でさらに詳しく説明する。

【0076】

細胞外小胞（ＥＶ）
細胞外小胞（ＥＶ）は、細胞間のコミュニケーションに重要な役割を果たし、腫瘍の発生を促進する^{１３－１６}。ＥＶにおけるｍｉＲＮＡの発現は頻繁に制御異常になっており、癌又は他の疾患の早期診断に有用である可能性がある^{１５、１７－２５}。

【0077】

ＥＶは血清中の循環ｍｉＲＮＡの主要な供給源であることから、本発明者らは、ＥＶを単離することでｍｉＲＮＡバイオマーカーが濃縮され、信号対雑音比が向上し、従って診断性能が向上するとの仮説を立てた。

【0078】

細胞外小胞（ＥＶ）の単離
エクソソーム等の細胞外小胞は、当該技術分野で公知の任意の手段を使用して試料から単離されてもよい。

【0079】

当業者であれば、生体液から細胞外小胞を単離するための様々な方法が開発されていることを知っている。このような方法としては、遠心分離、クロマトグラフィー、濾過、ポリマーベースの沈殿、及び免疫学的単離を挙げてもよい。

【0080】

単離方法を選択する際に考慮すべき１つの点は、単離された細胞外小胞に細胞外小胞以外の粒子が混入することであろう。これは、得られた細胞外小胞の生物学的活性について誤った結論をもたらす可能性があるため、避けるべきである。さらには、当業者なら、異なる検体に由来する細胞外小胞は、異なるタンパク質／脂質及び内腔の含有量を有し、異なる沈降特性を有することを認識している。

【0081】

以下は、Ｋｏｎｓｔａｎｔｉｎ Ｙａｋｉｍｃｈｕｋ（２０１５） Ｅｘｏｓｏｍｅｓ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍａｒｋｅｒｓ． Ｍａｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１５；５：１４５０から改作したものである。

【0082】

分画遠心法
分画遠心法は、細胞、大きな小胞、破片を除去し、エクソソームを沈殿させることを目的とした複数の遠心分離工程から構成される。

【0083】

分画遠心法は、生体液及び培地からエクソソームを単離するために使用される標準的で、非常によく用いられている方法である。しかしながら、血漿及び血清等の粘性の高い生体液を分析に使用すると、この方法の効率は低下する。

【0084】

分画遠心法は、エクソソーム単離の最も一般的な方法のうちの１つであり続けている。

【0085】

詳細には、この方法は、（１）細胞及びアポトーシスの残骸を除去するための低速遠心分離、（２）より大きな小胞を除去するためのより高速の回転、そして最後に（３）エクソソームを沈殿させるための高速遠心分離、を含むいくつかの工程で構成されている。生体液の粘度は、単離されたエクソソームの純度と大きな相関関係がある。さらに、高粘度の生体試料では、超遠心分離工程の時間を長くしたり、遠心速度を上げたりする必要がある。

【0086】

例えば、エクソソームは、無血清培地で培養した細胞から、８００×ｇ及び２０００×ｇの連続遠心分離工程により精製され、最後に１００，０００×ｇの超遠心でペレット化されてもよい。

【0087】

大脳皮質初代ニューロン由来のエクソソームは、上清を４℃で３００×ｇで１０分間、２０００×ｇで１０分間、１０，０００×ｇで３０分間、及び１００，０００×ｇで９０分間、連続的に遠心分離して得てもよく、最後のペレットは再懸濁して１００，０００×ｇで９０分間再度遠心分離された。

【0088】

エクソソームの単離に超遠心分離を用いることを示すプロトコルは、例３として実施例に記載されている。

【0089】

密度勾配遠心分離法
密度勾配遠心分離法は、超遠心分離をショ糖密度勾配法の使用と組み合わせる。より具体的には、密度勾配遠心分離法は、エクソソームを、タンパク質及びタンパク質／ＲＮＡの凝集体等の非小胞性粒子から分離するために用いられる。従って、この方法は、異なる密度の粒子から小胞を単離する。

【0090】

適切な遠心分離時間を用いることが非常に重要である。そうしないと、混入粒子が同じような密度を持つ場合に、その混入粒子がエクソソーム画分の中に残る可能性がある。血液調製物からエクソソームを精製するために、密度勾配浮選（浮動）法が使用されてもよい。最近の研究では、超遠心分離法からのエクソソームのペレットをショ糖勾配に適用してから遠心分離を行うことが示唆されている。

【0091】

最近、クッション密度勾配超遠心法（Ｃｕｓｈｉｏｎｅｄ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）として導入された密度勾配ベースの方法の改良版のプロトコルが記載された。この方法は、単離されたエクソソームの最大限の回収及び高純度を提供し、その構造と機能を維持する。

【0092】

サイズ排除クロマトグラフィー
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、分子量ではなく、サイズに基づいて高分子を分離するために使用される。

【0093】

この技術は、複数の細孔及びトンネルを持つ多孔質ポリマービーズを充填したカラムを適用する。分子は、ビーズの直径に応じてビーズを通過する。小さな半径の分子はカラムの細孔を通過するのに時間がかかり、高分子はカラムから早く溶出する。

【0094】

サイズ排除クロマトグラフィーは、大分子及び小分子を正確に分離することができる。さらに、異なる溶出液をこの方法に適用することができる。クロマトグラフィーで単離したエクソソームは、小胞の構造を変化させる可能性のあるせん断力の影響を受けないため、クロマトグラフィー単離は、遠心分離法と比較してより多くの利点を有することが示されている。現在、ＳＥＣは血液中及び尿中に存在するエクソソームを単離するための手法として広く受け入れられている。

【0095】

加えて、尿由来のエクソソームの単離及び解析には、ＳＥＣ法と限外濾過の組み合わせが用いられている。ＵＶ分析器及び光散乱検出器と組み合わせたフローフィールドフロー分画法も、エクソソームのサイズ及び純度を分析するために応用されている。フローフィールドフロー分画法は、パラボリックフロー及びクロスフローを組み合わせてエクソソームを単離する。得られたエクソソームは、電子顕微鏡や質量分析法によって検出された。加えて、Ｌａｎｅらによる最近の論文（２０１７、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０１７；１６６０：１１１－１３０）は、超遠心分離、ＳＥＣ及び密度勾配遠心分離法のプロトコルを含む、エクソソームの精製のための最新のプロトコルを提示している。

【0096】

エクソソームの単離のためのカラムアフィニティベースの精製の使用を示すプロトコルは、例５として実施例に記載されている。

【0097】

濾過
限外濾過膜も、エクソソームの単離に用いられてよい。マイクロベシクルのサイズにもよるが、この方法ではエクソソームをタンパク質及び他の高分子から分離することができる。エクソソームは、多孔質構造体を用いてエクソソームを捕捉することにより単離されてもよい。

【0098】

多くの一般的な濾過膜は、０．８μｍ、０．４５μｍ、又は０．２２μｍの細孔サイズを有し、８００ｎｍ、４００ｎｍ、又は２００ｎｍよりも大きいエクソソームの回収に使用されてもよい。特に、４０～１００ｎｍのエクソソームを単離するために、マイクロピラー多孔質シリコンの繊毛構造が設計された。最初の工程では、大きい小胞が取り除かれる。次の工程では、エクソソームの集団が濾過膜に濃縮される。単離の工程は比較的短いが、この方法ではシリコン構造体をＰＢＳバッファで事前にインキュベートする必要がある。次の工程では、エクソソームの集団が濾過膜上で濃縮される。

【0099】

この方法は、まだ臨床試料を使っては検証されていない。標準的な濾過手法に加えて、タンジェンシャルフローフィルトレーションはエクソソームの効果的な単離に有望な結果を示しており、基礎研究及び臨床分析の両方に応用できる。この方法は、遊離ペプチド及び他の低分子化合物を除去することにより、サイズが十分に決定されたエクソソームの単離に用いられる。加えて、限外濾過とＳＥＣとの組み合わせは、インビトロの研究において、及び脂肪組織からのエクソソームの単離に非常に効率的であることが示された。

【0100】

ポリマーベースの沈殿
ポリマーベースの沈殿法は、通常、生体液を、ポリマーを含む沈殿液と混合し、４℃でインキュベートした後、低速で遠心分離することを含む。

【0101】

ポリマーベースの沈殿に使用される最も一般的なポリマーの一つはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。このポリマーを用いた沈殿は、単離されたエクソソームへの影響が少なく、中性のｐＨを利用できる等の多くの利点を有する。

【0102】

ＥｘｏＱｕｉｃｋ（商標）（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（システム・バイオサイエンシーズ）、マウンテンビュー（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ）、カリフォルニア州、米国）等、エクソソームの単離にＰＥＧを適用する市販のキットがいくつか利用可能である。このキットは、簡単かつ迅速に行うことができ、追加の設備も必要ない。最近の研究では、最も高いエクソソームの収量が、ＥｘｏＱｕｉｃｋ（商標）法を用いた超遠心分離を用いて得られることが実証された。しかしながら、ポリマーベースの単離方法については、エクソソーム単離物に非エクソソーム物質が混入することが依然として問題となっている。加えて、単離物の中に存在するポリマー物質が、下流の分析に支障をきたす可能性もある。

【0103】

Ｎｉｕらによる最近の研究は、ヒト子宮内膜細胞からエクソソームを単離するために、超遠心、限外濾過、及びポリマーベースの沈殿の適用を比較し、ポリマーベースの方法が最もタンパク質の混入が少ないことを見出した。

【0104】

免疫学的な分離
エクソソームの免疫学的な分離の技術がいくつか開発されている。イムノチップ法は、表面エクソソーム受容体に基づいており、この受容体は、エクソソームをその起源に応じて単離するために使用される。得られたエクソソームは直接分析されるか、又はＤＮＡ若しくは全ＲＮＡの単離に使用される。

【0105】

エクソソームの細胞内タンパク質は、エクソソームの単離のための特異的なマーカーとして使用できる。抗体をコーティングした磁気ビーズが、抗原提示細胞からエクソソームを単離するために有効に使用された。また、腫瘍関連のＨＥＲ２及びＥｐＣＡＭに対する抗体を用いて、腫瘍細胞から腫瘍由来のエクソソームが単離された。単離されたビーズ－エクソソーム複合体は、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット法及び電子顕微鏡によって分析できる。さらに、ウエスタンブロット法は、テトラスパニン、並びにエンドソーム選別輸送複合体（ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｓｏｒｔｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ、ＥＳＣＲＴ）タンパク質であるＡｌｉｘ及びＴＳＧ１０１を含めたエクソソーム特異的なタンパク質を検出するために適用される。しかしながら、抗体をコーティングしたビーズを用いた単離は、大きい体積からエクソソームを得るのに適していない。

【0106】

加えて、ＥＬＩＳＡベースのＥｘｏＴＥＳＴ（商標）がエクソソームの単離に有効であることが実証された。エクソソームの抗体でコーティングしたＥｘｏＴＥＳＴ（商標）プレートを用いて、様々な生体液からエクソソームを単離することができる。この方法は、一般的なエクソソームタンパク質及び細胞種特異的なエクソソームタンパク質の両方の検出、分析並びに定量に適用される。

【0107】

最近の研究は、エクソソームを結合させるために、免疫親和性超常磁性ナノ粒子（ＩＳＰＮ）を応用している。その研究者らは、抗ＣＤ６３抗体とナノ粒子とを結合させてＩＳＰＮを生成し、それを用いて体液からエクソソームを単離した。

【0108】

エクソソームの単離に免疫親和性親和性ベースの精製を使用することを示すプロトコルは、例７として実施例に記載されている。

【0109】

篩い分けによる単離
この手法は、エクソソームを生体液から膜を介してふるいにかけ、加圧濾過又は電気泳動を行うことでエクソソームを単離する。この方法は、分離期間が短くて済むが、単離されたエクソソームの純度が高い。この方法は、エクソソームの特定の種類に関しては非選択的であると考えられている。篩い分けによる分離の唯一の欠点は、単離されたエクソソームの回収率が低いことである。

【0110】

超遠心分離（ＵＣ）
超遠心分離（ＵＣ）は、現在のＥＶ単離のゴールドスタンダードである。しかしながら、この手順は時間がかかり、スループットが低く、操作者によってばらつきが大きいため、超遠心分離は、臨床現場での使用には適していない可能性がある^{２６－２９}。

【0111】

他の単離方法も利用できるが、これらは異なるサブタイプのＥＶを単離するようで、比較が難しい^{２８、３０－３６}。

【0112】

本研究では、本発明者らは、以下の２つの目的で、市販のＥＶ単離キット／試薬のＥＶ関連ｍｉＲＮＡ（ＥＶ－ｍｉＲＮＡ）回収性能を系統的に比較した：（１）臨床現場での血清ＥＶ－ｍｉＲＮＡの回収に適した堅牢なＥＶ単離方法を特定すること、及び（２）胃癌（ＧＣ）の非侵襲的な検出に使用できる血清ＥＶ－ｍｉＲＮＡバイオマーカーを特定すること。

【0113】

エクソソームの単離のための超遠心分離の使用を示すプロトコルは、例３として実施例に記載されている。

【0114】

ポリマーベースの沈殿を用いたエクソソームの単離
本明細書中に開示された方法では、エクソソーム等の細胞外小胞は、ポリマーベースの沈殿を用いて単離されてもよい。この目的のために、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｔｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ｆｒｏｍ ｓｅｒｕｍ）（カタログ番号：４４７８３６０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）、米国）等の市販のキットが使用されてもよい。

【0115】

ポリマーベースの沈殿を用いてエクソソームを単離するために、以下の例示的なプロトコルが使用されてもよい。エクソソームの単離のためのポリマーベースの沈殿の使用を示すさらなるプロトコルは、例４として実施例に記載されている。

【0116】

ポリマーベースの沈殿のプロトコル
試料の調製
１． 血清試料を保管場所から取り出し、氷上に置く。試料が凍結している場合は、２５℃の水浴で完全に液状になるまで試料を解凍し、必要になるまで氷上に置いておく。
２． 血清試料を２０００×ｇで３０分間遠心分離し、細胞や破片を除去する。
３． 清澄化した血清を含む上清を、ペレットを崩さないように新しいチューブに移し、単離を行う準備ができるまで氷上に置いておく。

【0117】

エクソソームの単離
１． 必要量の清澄化した血清を新しいチューブに移し、０．２倍量のＴｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（ｆｒｏｍ ｓｅｒｕｍ）試薬を加える。
２． 血清／試薬の混合物をボルテックスにかけるか又は上下のピペッティング操作により、均一な溶液になるまでよく混合する。
注：溶液は白濁しているはずである。
３． 試料を２℃～８℃で３０分間インキュベートする。
４． インキュベート後、試料を１０，０００×ｇで１０分間、室温で遠心分離する。
５． 上清を吸引し、廃棄する。エクソソームはチューブの底にあるペレットに含まれている。
６． ピペットチップを用いて、ペレットを適量の１×ＰＢＳ又は類似のバッファに完全に懸濁する。
開始血清量が１００μＬの場合、２５～５０μＬの再懸濁量を使用するべきである。開始血清量が１ｍＬの場合、１００～５００μＬの再懸濁量を使用するべきである。
７． ペレットが再懸濁されると、エクソソームは下流の分析又はアフィニティ法によるさらなる精製の準備が整う。
単離したエクソソームは、２℃～８℃で１週間まで、又は２０℃以下で長期保存する。

【0118】

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、タンパク質の発現を制御して、細胞の分化、増殖、アポトーシス等、いくつかの重要な細胞プロセスにおいて生理的な意義を発揮する小さな非コードＲＮＡ（約１９～２２ヌクレオチド）である^１、２。血清、血漿、全血等の生体液中で容易に検出できる循環ｍｉＲＮＡは、癌を含めた様々な疾患の非侵襲的な検出のための有望なリキッドバイオプシーのバイオマーカーである。加えて、ｍｉＲＮＡに影響を与える異常は、癌の発生及び進行に大きく影響することが示されている^３－６。ｍｉＲＮＡは血清／血漿中で安定しているため、早期発見、予後判定又は治療を目的としたｍｉＲＮＡバイオマーカーの特定が大きく注目され、多大な努力が払われている^７－９。しかしながら、ｍｉＲＮＡの発現レベルの変化は、疾患の発症時にはほとんど見られずに、診断が困難になることがある^{１０－１２}。理想的なリキッドバイオプシーのバイオマーカーは、癌試料と対照試料との間で高い信号対雑音比を有し、臨床現場で容易に検出できるものでなければならない。

【0119】

ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡ
本明細書中に記載されている方法及び組成物は、個体における胃癌の診断、感受性の検出、治療、緩和又は予防のために、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ及び任意にｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡ、並びにこれらのいずれかのものの変異体、相同体、誘導体及び断片を利用してもよい。

【0120】

用語「ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐのｍｉＲＮＡ」並びに「ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ核酸」は、互換的に使用されてもよい。同様に、「ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡ」及び「ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐ核酸」という用語は、互換的に使用されてもよい。

【0121】

これらの用語は、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ又はｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐのｍｉＲＮＡ（若しくは、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐが使用される場合にはｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐも）並びに／又はこれの断片、誘導体、相同体若しくは変異体をコードすることができる核酸配列を含むことも意図されている。これらの用語は、本明細書に開示された特定の配列を有するｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ又はｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ（又は、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐが使用される場合にはｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐも）ポリヌクレオチドの断片、誘導体、相同体若しくは変異体である核酸配列を含むことも意図されている。

【0122】

ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐのｍｉＲＮＡ（又は、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐも）核酸への言及がなされる場合、これは、そのようなｍｉＲＮＡをコードすることができる核酸配列への言及とみなされるべきである。そのようなｍｉＲＮＡは、場合によっては、未変性のｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ又はｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐのｍｉＲＮＡ（又は、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐが関連する場合にはｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐも）の１つ以上の生物学的活性を含んでいてもよい。

【0123】

ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐのｍｉＲＮＡ、及び任意にｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐは、本明細書に記載されているように、様々な手段に使用されてもよい。例えば、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐのｍｉＲＮＡ又はｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５のｍｉＲＮＡは、胃癌に罹患しているか、若しくは罹患していると疑われる個体を治療するために、又はそのような状態を予防するために、又はそのような状態の結果として生じる任意の症状を緩和するために使用されてもよい。他の使用は、当業者には明らかであり、本明細書にも包含されている。

【0124】

本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、一般に、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを指し、これらは未修飾のＲＮＡ又はＤＮＡであってもよく、修飾されたＲＮＡ又はＤＮＡであってもよい。「ポリヌクレオチド」には、一本鎖及び二本鎖のＤＮＡ、一本鎖領域及び二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖のＲＮＡ、一本鎖領域及び二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖であってもよく、より典型的には二本鎖であってもよく、一本鎖領域及び二本鎖領域の混合物であってもよいＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子が含まれるが、これらに限定されない。加えて、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ、又はＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。「ポリヌクレオチド」という用語は、１つ以上の修飾塩基を含むＤＮＡ又はＲＮＡ、及び安定性のために若しくは他の理由で骨格が修飾されたＤＮＡ又はＲＮＡも含む。「修飾」塩基には、例えば、トリチル化された塩基や、イノシン等の通常ではない塩基が含まれる。ＤＮＡ及びＲＮＡには様々な修飾が施されているため、「ポリヌクレオチド」は、自然界で典型的に見られるポリヌクレオチドの化学的、酵素的、又は代謝的に修飾された形態、並びにウイルス及び細胞に特徴的なＤＮＡ並びにＲＮＡの化学的な形態を包含する。「ポリヌクレオチド」には、オリゴヌクレオチドと呼ばれることが多い比較的短いポリヌクレオチドも包含する。

【0125】

遺伝コードの縮重の結果として、多数のヌクレオチド配列が同じポリペプチドをコードすることができることは、当業者には理解されるであろう。

【0126】

本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド配列」という用語は、ヌクレオチド配列、オリゴヌクレオチド配列、ポリヌクレオチド配列、及びそれらの変異体、相同体、断片及び誘導体（その一部等）を指す。ヌクレオチド配列は、二本鎖であっても一本鎖であっても、センス鎖を表していてもアンチセンス鎖を表していても、若しくはそれらの組み合わせであってもよい、ゲノム若しくは合成若しくは組換え起源のＤＮＡ又はＲＮＡであってもよい。用語「ヌクレオチド配列」は、組換えＤＮＡ技術（例えば、組換えＤＮＡ）を用いて調製されてもよい。

【0127】

用語「ヌクレオチド配列」はＤＮＡ又はＲＮＡを意味してもよい。

【0128】

他の核酸
本発明者らは、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐのｍｉＲＮＡの断片、相同体、変異体又は誘導体である核酸、並びにｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡが任意に使用される場合にはｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡの断片、相同体、変異体又は誘導体である核酸も提供する。

【0129】

ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡに関連する用語「変異体」、「相同体」、「誘導体」又は「断片（フラグメント）」には、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡの配列からの、若しくはその配列への１つ（以上）の核酸の任意の置換、変形、修飾、置き換え、欠失又は付加が含まれる。文脈上他に認められない限り、「ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐのｍｉＲＮＡ」、並びに「ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ核酸」、「ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐヌクレオチド配列」等への言及は、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ又はｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐのｍｉＲＮＡのそのような変異体、相同体、誘導体及び断片への言及を含む。ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐについても同様である。

【0130】

ヌクレオチド配列は、いずれか１つ以上のｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ又はｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐのｍｉＲＮＡ活性（又は関連する場合にはｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐ活性）を有するポリペプチドをコードしてもよい。「相同体」という用語は、結果として得られるヌクレオチド配列が、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ又はｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐのｍｉＲＮＡ活性（又はｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐ活性）を有するポリペプチドをコードするような、構造及び／又は機能に関する同一性をカバーすることを意図してもよい。例えば、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐのｍｉＲＮＡ又はｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐの相同体等は、胃癌に罹患している個体からの細胞において、正常な細胞と比較して発現レベルが上昇又は低下していてもよい。配列同一性（すなわち類似性）に関して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％又は少なくとも９０％の配列同一性があってもよい。ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ又はｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐのｍｉＲＮＡの任意の核酸配列等の関連配列に対して、少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性があってもよい。これらの用語は、上記配列の対立遺伝子の変異も包含する。

【0131】

変異体、誘導体及び相同体
ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐのｍｉＲＮＡ（並びに任意に使用される場合のｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡ）の核酸変異体、断片、誘導体及び相同体は、ＲＮＡを含んでもよい。それらは一本鎖であってもよい。それらは、合成ヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであってもよい。オリゴヌクレオチドに対する多くの異なるタイプの修飾が当該技術分野で公知である。オリゴヌクレオチドの修飾には、メチルホスホネート骨格及びホスホロチオエート骨格、分子の３’末端や５’末端にアクリジン鎖やポリリジン鎖を付加することを含む。本明細書の目的のためには、ポリヌクレオチドは、当該技術分野で利用可能な任意の方法によって修飾されてもよいことを理解されたい。このような修飾は、目的とするポリヌクレオチドのインビボでの活性又は寿命を高めるために行われてもよい。

【0132】

ポリヌクレオチドが二本鎖である場合、その二本鎖の両鎖は、個別に又は組み合わせて、本明細書に記載の方法及び組成物に包含される。ポリヌクレオチドが一本鎖である場合、そのポリヌクレオチドの相補的配列も含まれることを理解されたい。

【0133】

ヌクレオチド配列に関する「変異体」、「相同体」又は「誘導体」という用語には、その配列から又はその配列への１つ（以上）の核酸の任意の置換、変形、修飾、置き換え、欠失又は付加が含まれる。この変異体、相同体又は誘導体は、生物学的活性を有するポリペプチドをコードしてもよい。ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐのｍｉＲＮＡ又はｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのそのような断片、相同体、変異体及び誘導体は、上述のように、変調した活性を含んでいてもよい。

【0134】

上述のように、配列同一性に関して、「相同体」は、関連配列、例えばｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ又はｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐのｍｉＲＮＡの任意の核酸配列に対する少なくとも５％の同一性、少なくとも１０％の同一性、少なくとも１５％の同一性、少なくとも２０％の同一性、少なくとも２５％の同一性、少なくとも３０％の同一性、少なくとも３５％の同一性、少なくとも４０％の同一性、少なくとも４５％の同一性、少なくとも５０％の同一性、少なくとも５５％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも６５％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、又は少なくとも９５％の同一性を有していてもよい。

【0135】

少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、又は少なくとも９９％の同一性があってもよい。ヌクレオチド同一性の比較は、上述のように実施されてもよい。使用されてもよい配列比較プログラムは、上述のＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムである。デフォルトのスコアリングマトリックスは、各同一のヌクレオチドに対して１０のマッチ値を有し、各ミスマッチに対して－９のマッチ値を有する。デフォルトのギャップ作成ペナルティは－５０であり、デフォルトのギャップ拡張ペナルティは各ヌクレオチドに対して－３である。

【0136】

ハイブリダイゼーション
さらに、本明細書に提示された配列のいずれか、又はその変異体、断片若しくは誘導体、又はいずれかの上記のものの相補体に選択的にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列が記載される。ヌクレオチド配列は、少なくとも５ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、又は１５ヌクレオチドの長さ、例えば少なくとも２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、又は５０ヌクレオチドの長さであってもよい。

【0137】

本明細書で使用される「ハイブリダイゼーション」という用語は、「核酸の鎖が塩基対形成を介して相補的な鎖と結合するプロセス」、及びポリメラーゼ連鎖反応技術で行われるような増幅のプロセスを含むものとする。

【0138】

本明細書に提示されているヌクレオチド配列又はその相補体に選択的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、本明細書中に提示される対応するヌクレオチド配列、例えばｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ又はｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐのｍｉＲＮＡ（又は任意でｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐ）の任意の核酸配列に対して少なくとも４０％相同、少なくとも４５％相同、少なくとも５０％相同、少なくとも５５％相同、少なくとも６０％相同、少なくとも６５％相同、少なくとも７０％相同、少なくとも７５％相同、少なくとも８０％相同、少なくとも８５％相同、少なくとも９０％相同、又は少なくとも９５％相同であってもよい。そのようなポリヌクレオチドは、少なくとも５、１０、１５又は２０、例えば少なくとも２５又は３０、例えば少なくとも４０、６０又は１００以上の連続したヌクレオチドの領域にわたって、対応するヌクレオチド配列に対して一般的に少なくとも７０％、少なくとも８０若しくは９０％又は少なくとも９５％又は９８％相同であってもよい。

【0139】

用語「選択的にハイブリダイズする」は、プローブとして使用されるポリヌクレオチドが、標的ポリヌクレオチドがバックグラウンドを大幅に上回るレベルでそのプローブにハイブリダイズすることが見出される条件下で使用されることを意味する。バックグラウンドでのハイブリダイゼーションは、例えば、スクリーニングされるｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡライブラリ中に存在する他のポリヌクレオチドのために起こる可能性がある。この場合、バックグラウンドとは、プローブとライブラリの非特異的なＤＮＡメンバーとの間の相互作用によって生成されるシグナルのレベルを意味し、それは、標的ＤＮＡとの間で観測される特異的な相互作用の１０分の１未満、例えば１００分の１未満の強度である。相互作用の強さは、例えば、プローブを^３２Ｐ又は^３３Ｐで放射性標識したり、非放射性プローブ（例えば蛍光色素、ビオチン、ジゴキシゲニン）で標識したりして測定されてもよい。

【0140】

ハイブリダイゼーションの条件は、Ｂｅｒｇｅｒ及びＫｉｍｍｅｌ（１９８７、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ、カリフォルニア州）で教示されているように、核酸結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づいており、本明細書の他の箇所で説明されているように、定義された「ストリンジェンシー」を付与する。

【0141】

最大ストリンジェンシーは、典型的には約Ｔｍ－５℃（プローブのＴｍより５℃低い）で発生し、高ストリンジェンシーはＴｍより約５℃～１０℃Ｃ低い温度で発生し、中間ストリンジェンシーはＴｍより約１０℃～２０℃低い温度で発生し、低ストリンジェンシーはＴｍより約２０℃～２５℃低い温度で発生する。当業者であれば理解できるように、最大ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、同一のポリヌクレオチド配列を識別又は検出するために使用することができ、一方、中間（又は低）ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、類似又は関連するポリヌクレオチド配列を識別又は検出するために使用することができる。

【0142】

ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ又はｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐのｍｉＲＮＡ（及び使用される場合のｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡ）の核酸、断片、変異体、相同体、又は誘導体とストリンジェントな条件（例えば、６５℃及び０．１×ＳＳＣ）（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸三ナトリウム、ｐＨ７．０）でハイブリダイズすることができてもよいヌクレオチド配列が提供される。

【0143】

相同体、変異体及び誘導体の生成
関連する配列（ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡ）と１００％同一ではないが、これも含まれるポリヌクレオチド、並びにｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡの相同体、変異体及び誘導体は、いくつかの方法で得ることができる。上記配列の他の変異体は、例えば、様々な個体、例えば、異なる集団からの個体から作られたＲＮＡライブラリをプローブすることによって得られてもよい。例えば、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐのｍｉＲＮＡ及びｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐの相同体は、他の個体、又は他の種から特定されてもよい。さらなる組換えのｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡ核酸及びポリペプチドは、相同体の対応する位置を特定し、本明細書の他の箇所に記載されているように分子を合成又は製造することによって製造されてもよい。

【0144】

加えて、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡの他のウイルス／細菌又は細胞性相同体、特に哺乳類細胞（例えば、ラット、マウス、ウシ、及び霊長類の細胞）で見出される細胞性相同体が得られてもよく、そのような相同体及びその断片は、一般に、ヒトのｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡに選択的にハイブリダイズすることができるであろう。そのような相同体は、非ヒトのｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡ核酸、断片、変異体及び相同体を設計するために使用されてもよい。さらなる多様性を生み出すために、当該技術分野で公知の手段で変異導入が行われてもよい。

【0145】

ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡの相同体の配列は、他の動物種から作製したライブラリをプローブすること、そのようなライブラリを、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡ、並びにｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ又はｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡの断片、変異体及び相同体、又は他の断片のいずれかの全部又は一部を含むプローブで、中～高ストリンジェンシーの条件下でプローブすることによって得てもよい。

【0146】

本明細書中に開示されたポリペプチド配列又はヌクレオチド配列の種の相同体及び対立遺伝子の変異体を得るために、同様の考慮が適用される。

【0147】

変異体及び株／種相同体は、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ又はｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡ核酸の配列内の保存されたアミノ酸配列をコードする変異体及び相同体内の配列を標的とするように設計されたプライマーを使用する縮重ＰＣＲを用いて得てもよい。保存された配列は、例えば、いくつかの変異体／相同体からのアミノ酸配列をアラインメントすることによって予測することができる。配列のアラインメントは、当該技術分野で公知のコンピュータソフトウェアを用いて行うことができる。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＰｉｌｅＵｐプログラムが広く使われている。

【0148】

縮重ＰＣＲに使用されるプライマーは、１つ以上の縮重位置を含み、既知の配列に対する単一配列プライマーを用いた配列のクローニングに使用されるものよりも低いストリンジェンシー条件で使用される。遠縁の生物からの配列間の全体的なヌクレオチドの相同性は非常に低い可能性が高く、従って、このような状況では、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐのｍｉＲＮＡ又はｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐ配列の標識された断片でライブラリをスクリーニングするのではなく、縮重ＰＣＲが選択される可能性があることは当業者には理解されるであろう。

【0149】

加えて、ＢＬＡＳＴプログラムセット等の検索アルゴリズムを使用して、ヌクレオチド及び／又はタンパク質のデータベースを検索することによって、相同配列が特定されてもよい。

【0150】

あるいは、そのようなポリヌクレオチドは、例えば、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ若しくはｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡ核酸、又はその変異体、相同体、誘導体若しくは断片等の特徴的な配列の部位指向性変異誘発によって得られてもよい。これは、例えば、ポリヌクレオチド配列が発現している特定の宿主細胞に対するコドンの優先順位を最適化するために、配列にサイレントコドンの変更が必要な場合に有用であってもよい。制限酵素認識部位を導入するか、又はポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの特性又は機能を変更するために、他の配列変更が望まれてもよい。

【0151】

本明細書中に記載されているポリヌクレオチドは、プライマー、例えばＰＣＲプライマー、代替増幅反応のためのプライマー、プローブ、例えば放射性標識又は非放射性標識を用いた従来の手段により明らかにする標識で標識されたプローブを作成するために使用されてもよいし、又はこのポリヌクレオチドはベクターにクローニングされてもよい。そのようなプライマー、プローブ及び他の断片は、少なくとも８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、又は１５ヌクレオチド、例えば少なくとも２０ヌクレオチド、例えば少なくとも２５ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、又は４０ヌクレオチドの長さを有するであろうし、本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」という用語にも包含される。

【0152】

ＤＮＡポリヌクレオチド及びプローブ等のポリヌクレオチドは、組換え的に、合成的に、又は当業者が利用可能な任意の手段によって製造されてもよい。このポリヌクレオチドは、標準的な技術でクローニングされてもよい。

【0153】

一般に、プライマーは、所望の核酸配列を一度に１ヌクレオチドずつ段階的に製造することを含む合成的手段により製造される。自動化された技術を使用してこれを達成するための技術は、当該技術分野で容易に入手可能である。

【0154】

ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ及び任意にｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐの断片を含むプライマーは、例えば胃癌に関連して、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ又はｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡの発現、例えば、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡ発現の上方制御又は下方制御の検出方法において特に有用である。ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ又はｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡの増幅に好適なプライマーは、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ又はｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡ任意の好適なひとつながり（区間）から生成されてもよい。使用されてもよいプライマーとしては、特異的であるｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ又はｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡの配列を増幅できるものが挙げられる。

【0155】

ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡプライマーは、単独で提供されてもよいが、順方向プライマー及び逆方向プライマーを含むプライマー対として提供されるのが最も有用である。

【0156】

より長いポリヌクレオチドは、一般に、組換え手段を用いて、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術を用いて製造される。これは、一対のプライマー（例えば、約１５～３０ヌクレオチドのもの）を作製し、これらのプライマーを動物又はヒトの細胞から得たｍＲＮＡ又はｃＤＮＡと接触させ、所望の領域を増幅させる条件下でポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅された断片を単離し（例えば、アガロースゲル上で反応混合物を精製することにより）、増幅されたＤＮＡを回収することを含む。プライマーは、増幅されたＤＮＡが適切なクローニングベクターにクローニングされうるように、適切な制限酵素認識部位を含むように設計されていてもよい。

【0157】

ポリヌクレオチド又はプライマーには、明らかにするための標識が付いていてもよい。好適な標識としては、^３２Ｐ又は^３５Ｓ等の放射性同位元素、ジゴキシゲニン、蛍光色素、酵素標識、又はビオチン等のタンパク質標識が挙げられる。このような標識は、ポリヌクレオチド又はプライマーに付加されてもよく、公知の技術を用いて検出されてもよい。ポリヌクレオチド若しくはプライマー、又はそれらの断片は、標識されていても標識されていなくても、当業者によってヒトや動物の体内のポリヌクレオチドを検出又は配列決定するための核酸ベースの検査に使用されてもよい。

【0158】

検出するためのそのような検査は、一般に、ＤＮＡ又はＲＮＡを含む生体試料を、ポリヌクレオチド又はプライマーを含むプローブとハイブリダイズ条件下で接触させ、プローブと試料中の核酸との間に形成されたいずれかの二本鎖を検出することを含む。このような検出は、ＰＣＲ等の手法を用いて、又はプローブを固体支持体上に固定化し、プローブとハイブリダイズしていない試料中の核酸を除去した後、プローブとハイブリダイズした核酸を検出することにより達成されてもよい。あるいは、試料の核酸が固体支持体に固定化されてもよく、そのような支持体に結合したプローブの量を検出することができる。この形式及び他の形式の適切なアッセイ方法は、例えば、国際公開第８９／０３８９１号パンフレット及び国際公開第９０／１３６６７号パンフレットに見出すことができる。

【0159】

ヌクレオチド、例えば、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡ核酸の配列を決定するための試験は、標的のＤＮＡ又はＲＮＡを含む生体試料を、ポリヌクレオチド又はプライマーを含むプローブと、ハイブリダイズ条件下で接触させ、例えばサンガーによるジデオキシ鎖伸長停止法（Ｓａｍｂｒｏｏｋらを参照）によって配列を決定することを含む。

【0160】

このような方法は、一般に、適切な試薬の存在下で、標的のＤＮＡ又はＲＮＡに相補的な鎖の合成によりプライマーを伸長させ、伸長反応をＡ、Ｃ、Ｇ又はＴ／Ｕ残基の１つ以上で選択的に伸長停止させることと、鎖の伸長及び伸長停止反応を起こさせることと、伸長した生成物をサイズに応じて分離し、選択的伸長停止が起こったヌクレオチドの配列を決定することとを含む。適切な試薬としては、ＤＮＡポリメラーゼ酵素、デオキシヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、バッファ、並びにＡＴＰが挙げられる。ジデオキシヌクレオチドは選択的伸長停止に用いられる。

【0161】

ｍｉＲＮＡの単離
ｍｉＲＮＡは、当該技術分野で公知の任意の手段を用いてエクソソームから単離されてもよい。

【0162】

当業者であれば、生体液からｍｉＲＮＡを単離するための様々な方法が開発されていることを知っているであろう。例えば、ｍｉＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ（キアゲン）、カリフォルニア州）、ｍｉＲＶａｎａ ＰＡＲＩＳキット（Ａｍｂｉｏｎ（アンビオン）、テキサス州）、全ＲＮＡ単離キット（Ｎｏｒｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｋ（ノルゲン・バイオテック）、カナダ）の市販のｍｉＲＮＡ単離キットが入手可能である。試料からｍｉＲＮＡを単離するためにこれらのいずれが使用されてもよい。

【0163】

ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（ＱＩＡＧＥＮ、２０１２年２月）から引用した以下のプロトコル例を用いて、ｍｉＲＮｅａｓｙキットを使用してｍｉＲＮＡを単離してもよい。
１． 血清若しくは血漿を調製するか、又は凍結試料を解凍する。
２． ＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔを５倍量加える（ガイドラインとして表２を参照）。ボルテックス又は上下のピペッティングにより混合する。

【表1】

注：血漿又は血清の量が限られていない場合は、本発明者らは、１回のＲＮＡ調製につき１００～２００μｌの使用を推奨する。
注：ＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔを添加した後、可溶化液は－７０℃で数ヶ月間保存できる。
３． 上記可溶化液が入ったチューブを室温（１５～２５℃）で５分間、ベンチトップに置く。
４． ３．５μｌのｍｉＲＮｅａｓｙ Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ Ｓｐｉｋｅ－Ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌ（１．６×１０^８コピー／μｌの作業溶液）を加え、十分に混合する。
ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ Ｓｐｉｋｅ－Ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌの適切なストック及び作業溶液の作製に関する詳細については、付録Ｂの２５頁を参照のこと。
５． 出発試料と同量のクロロホルムを上記可溶化液が入ったチューブに加え、しっかりとキャップする（ガイドラインとして表２を参照）。１５秒間、ボルテックスにかけるか又は激しく振盪する。
十分に混合することが、その後の相単離に重要である。
６． 可溶化液が入ったチューブを室温（１５～２５℃）で２～３分間、ベンチトップに置く。
７． ４℃で１２，０００×ｇの遠心分離を１５分間行う。遠心分離後、同じ遠心分離機を次の遠心分離工程で使用する場合は、遠心分離機を室温（１５～２５℃）に戻す。
遠心分離後、試料は、ＲＮＡを含む上層の無色の水相、白色の中間相、及び下層の赤色の有機相の３相に分離する。水相のおおよその体積については表２を参照。
８． 上層の水相を新しい採取チューブ（付属していない）に移す。中間相の物質を移さないようにすること。１．５倍量の１００％エタノールを加え、上下に数回ピペッティングして十分に混合する。遠心分離はしない。遅滞なく工程９に進む。
エタノールを加えた後に沈殿物ができることがあるが、これは手順に影響を及ぼさない。
９． 沈殿物が生成していたらそれも含めて最大７００μｌの試料を、２ｍｌ採取チューブ（付属している）に入れたＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムにピペッティングする。蓋を静かに閉め、室温（１５～２５℃）で８０００×ｇ以上（１０，０００ｒｐｍ以上）で１５秒間遠心する。フロースルーを捨てる^＊。
上記採取チューブは工程１０で再利用する。
１０． 試料の残りを用いて工程９を繰り返す。フロースルーを廃棄する^＊。
上記採取チューブは工程１１で再利用する。
１１． ７００μｌのＢｕｆｆｅｒ ＲＷＴをＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムに加える。蓋を静かに閉め、８０００×ｇ以上（１０，０００ｒｐｍ以上）で１５秒間遠心し、カラムを洗浄する。フロースルーを捨てる^＊。
上記採取チューブは工程１２で再利用する。
１２． ５００μｌのＢｕｆｆｅｒ ＲＰＥを上記ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムにピペッティングする。蓋を静かに閉め、８０００×ｇ以上（１０，０００ｒｐｍ以上）で１５秒間遠心し、カラムを洗浄する。フロースルーを捨てる。
上記採取チューブを工程１３で再利用する。
１３． ５００μｌの８０％エタノールを上記ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムにピペッティングする。蓋を静かに閉め、８０００×ｇ以上（１０，０００ｒｐｍ以上）で２分間遠心し、スピンカラムのメンブレンを洗浄する。フロースルーが入った採取チューブを捨てる。
注：８０％エタノールは、エタノール（９６～１００％）及びＲＮａｓｅフリーの水で調製する必要がある。
注：遠心後、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムがフロースルーに接触しないように注意深く採取チューブからＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムを取り出す。ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムがフロースルーに接触すると、エタノールの持ち越しが発生することになる。
１４． 上記ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムを新しい２ｍｌ採取チューブ（付属している）に入れる。スピンカラムの蓋を開け、全速力で５分間遠心し、メンブレンを乾燥させる。フロースルーが入った採取チューブを捨てる。
蓋の破損を防ぐため、スピンカラムを、カラム間に少なくとも１本分の空き位置を設けて遠心機に入れること。蓋の向きは、蓋がローターの回転方向と逆になるようにする（例えば、ローターが時計回りに回転する場合は、蓋を反時計回りにする）。
残留エタノールは下流の反応に支障をきたす可能性があるので、スピンカラムのメンブレンを乾燥させることが重要である。蓋を開けた状態で遠心すると、ＲＮＡの溶出時にエタノールが持ち越されないことが確実になる。
１５． 上記ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムを新しい１．５ｍｌ採取チューブ（付属している）に入れる。１４μｌのＲＮａｓｅフリーの水をスピンカラムのメンブレンの中央に直接加える。蓋を静かに閉め、全速力で１分間遠心し、ＲＮＡを溶出させる。
より高いＲＮＡ濃度が必要な場合は、少ない１０μｌのＲＮａｓｅフリーの水を溶出に使用することもできるが、収量は約２０％減少する。１０μｌ未満のＲＮａｓｅフリーの水ではスピンカラムのメンブレンが十分に水和しないため、１０μｌ未満のＲＮａｓｅフリーの水を用いて溶出しないこと。
ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムのデッドボリュームは２μｌであり、１４μｌのＲＮａｓｅフリーの水で溶出すると１２μｌの溶出液が得られる。

【0164】

胃癌
胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）は、ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ（胃癌）としても知られる。

【0165】

胃癌についての情報は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ（米国癌協会）によって発行されており、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｏｒｇ／ｃａｎｃｅｒ／ｓｔｏｍａｃｈ－ｃａｎｃｅｒから入手されてもよい。

【0166】

胃癌は、以下の文書に詳細に記載されている。
Ｌｅｌｌｏら、２００７年、Ｓｈｏｒｔ ａｎｄ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｆｒｏｍ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ． Ａ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ｓｔｕｄｙ ｆｒｏｍ ａ ｃｏｕｎｔｙ ｈｏｓｐｉｔａｌ ｄｕｒｉｎｇ ２５ ｙｅａｒｓ． Ａｃｔａ Ｏｎｃｏｌｏｇｉｃａ ４６：３、３０８－３１５．
Ｓａｎｊｅｅｖａｉａｈ Ａ、Ｃｈｅｅｄｅｌｌａ Ｎ、Ｈｅｓｔｅｒ Ｃ、Ｐｏｒｅｍｂｋａ ＭＲ． Ｇａｓｔｒｉｃ Ｃａｎｃｅｒ：Ｒｅｃｅｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｄｖａｎｃｅｓ， Ｒａｃｉａｌ Ｄｉｓｐａｒｉｔｙ， ａｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｊ Ｏｎｃｏｌ Ｐｒａｃｔ． ２０１８ Ａｐｒ；１４（４）：２１７－２２４． ｄｏｉ：１０．１２００／ＪＯＰ．１７．０００２５．
Ｒａｗｌａ Ｐ、Ｂａｒｓｏｕｋ Ａ． Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ： ｇｌｏｂａｌ ｔｒｅｎｄｓ， ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ． Ｐｒｚ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ． ２０１９；１４（１）：２６－３８． ｄｏｉ：１０．５１１４／ｐｇ．２０１８．８０００１． ２０１８年１１月２８日電子出版．
Ｐａｓｅｃｈｎｉｋｏｖ Ｖ、Ｃｈｕｋｏｖ Ｓ、Ｆｅｄｏｒｏｖ Ｅ、Ｋｉｋｕｓｔｅ Ｉ、Ｌｅｊａ Ｍ． Ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ： ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ， ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｅａｒｌｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ． Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ． ２０１４；２０（３８）：１３８４２－１３８６２． ｄｏｉ：１０．３７４８／ｗｊｇ．ｖ２０．ｉ３８．１３８４２
Ｋｉｍ ＧＨ、Ｌｉａｎｇ ＰＳ、Ｂａｎｇ ＳＪ、Ｈｗａｎｇ ＪＨ． Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ｆｏｒ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ： Ｉｓ ｉｔ ｎｅｅｄｅｄ？ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ Ｅｎｄｏｓｃ． ２０１６ Ｊｕｌ；８４（１）：１８－２８． ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｇｉｅ．２０１６．０２．０２８． ２０１６年３月３日電子出版．

【0167】

胃癌の危険因子
以下は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙからの改作である。

【0168】

胃癌の危険因子には以下のものがある。

【0169】

性別
胃癌は、女性よりも男性に多く見られる。

【0170】

年齢
５０歳を超えた人に胃癌罹患率が急増する。胃癌と診断される人の多くは、６０代後半から８０代である。

【0171】

民族
米国では、胃癌は、非ヒスパニック系白人よりもヒスパニック系アメリカ人、アフリカ系アメリカ人、アメリカ先住民、アジア／太平洋諸島系アメリカ人で多く見られる。

【0172】

地理
世界的に見ると、胃癌は日本、中国、南東ヨーロッパ、及び南・中央アメリカで多く見られる。この疾患は、北西アフリカ、南中央アジア、及び北アメリカではあまり一般的ではない。

【0173】

ヘリコバクター・ピロリ菌感染
ヘリコバクター・ピロリ菌（Ｈ ｐｙｌｏｒｉ）の感染は、胃癌、とりわけ胃の下部（遠位部）の癌の主な原因と考えられている。胃がこの病原菌に長期間感染すると、胃の内壁に炎症（慢性萎縮性胃炎と呼ばれる）や前癌病変が生じることがある。

【0174】

胃癌の人は、この癌を持たない人に比べてピロリ菌の感染率が高い。ピロリ菌の感染は、いくつかのタイプの胃のリンパ腫にも関係している。そうではあっても、この病原菌を胃に持っているほとんどの人は決して癌を発症しない。

【0175】

胃のリンパ腫
粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）リンパ腫として知られるある種の胃のリンパ腫にかかったことのある人は、胃の腺癌になるリスクが高くなる。これは、おそらくは、胃のＭＡＬＴリンパ腫がピロリ菌の感染によって引き起こされるからである。

【0176】

食生活
燻製、塩漬けの魚及び肉、及び漬物を多く摂る食生活をしている人では、胃癌のリスクの上昇が見られる。硝酸及び亜硝酸は、塩漬肉に多く見出される物質である。硝酸及び亜硝酸は、ピロリ菌等の特定の細菌によって、実験動物で胃癌の原因となると示されている化合物に変換されることが可能である。

【0177】

他方で、新鮮な果物や野菜をたくさん食べることは、胃癌のリスクを下げるようである。

【0178】

タバコの使用
喫煙は、胃癌のリスクを高め、特に食道に近い胃の上方部分の癌のリスクを高める。喫煙者では胃癌の発生率が約２倍になる。

【0179】

太りすぎ又は肥満
太りすぎ又は肥満は、噴門（食道に最も近い胃の上方部分）の癌の原因となる可能性があるが、その関連性の強さはまだ明らかになっていない。

【0180】

胃の手術歴
潰瘍等の非癌性疾患の治療のために胃の一部を切除したことのある人では、胃癌がより発生しやすい。これは、胃がより少ない酸しか分泌せず、そのため亜硝酸を生成する細菌がより多く存在することが可能になるためと考えられる。手術後の小腸から胃への胆汁の逆流（うっ滞）も、リスクの増加につながる可能性がある。これらの癌は通常、手術後何年も経ってから発症する。

【0181】

悪性貧血
胃壁にある特定の細胞は、通常、食物からビタミンＢ１２を吸収するために必要な内因子（ＩＦ）と呼ばれる物質を作っている。ＩＦが十分でない人は、ビタミンＢ１２が欠乏してしまう可能性があり、そうなると、身体が新しい赤血球を作る能力に影響が出て、他の問題も引き起こす可能性がある。この状態は悪性貧血と呼ばれている。貧血（赤血球の数が少なすぎる）とともに、この疾患を抱える人は胃癌のリスクが高くなる。

【0182】

メネトリエ病（肥大性胃疾患）
この状態では、胃壁の過剰な増殖により胃壁に大きなひだができ、胃酸の分泌が低下する。この疾患は非常に稀であるため、これが胃癌のリスクがどの程度高めるかは正確にはわかっていない。

【0183】

Ａ型の血液
血液型群は、赤血球及びその他の細胞の表面に通常存在する特定の物質を指す。これらの群は、輸血用の血液を照合するのに重要である。理由は不明だが、Ａ型の血液の人は胃癌になるリスクが高い。

【0184】

遺伝性の癌症候群
いくつかの遺伝性病態は、人の胃癌のリスクを高める可能性がある。

【0185】

遺伝性びまん性胃癌
この遺伝性の症候群は、胃癌の発生リスクを大幅に高める。この病態は稀であるが、罹患者の生涯の胃癌リスクは約７０～８０％である。この症候群を持つ女性は、ある種の乳癌にかかるリスクも高くなる。この病態は、ＣＤＨ１遺伝子の突然変異（欠損）によって引き起こされる。

【0186】

リンチ症候群又は遺伝性非ポリポーシス大腸癌（ＨＮＰＣＣ）
リンチ症候群（旧名：ＨＮＰＣＣ）は、大腸癌（結直腸癌）、胃癌、その他の癌のリスクを高める遺伝性障害である。ほとんどの場合、この障害はＭＬＨ１遺伝子又はＭＳＨ２遺伝子の欠陥によって引き起こされるが、ＭＬＨ３、ＭＳＨ６、ＴＧＦＢＲ２、ＰＭＳ１、及びＰＭＳ２を含む他の遺伝子がリンチ症候群の原因となることもある。

【0187】

家族性腺腫性ポリポーシス（ＦＡＰ）
ＦＡＰでは、大腸（結腸）に多くのポリープが発生し、時には胃や腸にもポリープが発生する。この症候群を抱える人は、大腸癌（結直腸癌）のリスクが非常に高く、胃癌になるリスクもわずかに高い。これはＡＰＣ遺伝子の変異によって引き起こされる。

【0188】

ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２
遺伝性乳癌遺伝子ＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２の変異を持つ人は、胃癌になる率も高くなる可能性がある。

【0189】

リ・フラウメニ症候群
この症候群を抱える人は、比較的若い年齢で胃癌を発症する等、いくつかのタイプの癌のリスクが高い。リ・フラウメニ症候群は、ＴＰ５３遺伝子の突然変異によって引き起こされる。

【0190】

ポイツ・ジェガーズ症候群（ＰＪＳ）
この病態の人は、胃及び腸のほか、鼻、肺の気道、及び膀胱等の他の部位にポリープを発症する。胃及び腸のポリープは、過誤腫と呼ばれる特殊なタイプのものである。それらは、腸の出血又は閉塞等の問題を引き起こす可能性がある。ＰＪＳは唇、頬の内側及び他の部位に黒いそばかすのような斑点を生じることもある。ＰＪＳを抱える人は、乳房、大腸（結腸）、膵臓、胃、及びその他のいくつかの器官の癌のリスクが高くなる。この症候群は、遺伝子ＳＴＫ１の突然変異によって引き起こされる。

【0191】

胃癌の家族歴
第一度近親者（両親、兄弟、子供）が胃癌に罹患したことがある人は、この疾患を発症する可能性が高くなる。

【0192】

胃ポリープのいくつかの種類
ポリープは、胃の内壁にできる非癌性の増殖物である。ほとんどの種類のポリープ（過形成性ポリープ又は炎症性ポリープ等）は、人の胃癌のリスクを上昇させないようであるが、腺腫性ポリープ（腺腫とも呼ばれる）は、時に癌に発展する可能性がある。

【0193】

エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）感染
エプスタインバーウイルスは、伝染性単核球症（モノとも呼ばれる）の原因となる。ほとんどすべての成人は、生涯の何らかの時期に、通常は子供や１０代の頃に、このウイルスに感染した経験がある。

【0194】

ＥＢＶは、いくつかの形態のリンパ腫に関連している。ＥＢＶは、胃癌を患う人のうちの約５～１０％の人の癌細胞にも見出される。これらの人々は、増殖が遅く、侵襲性が低く、転移する傾向が低い癌を持つ傾向にある。ＥＢＶは一部の胃癌細胞で見出されているが、このウイルスが実際に胃癌を引き起こすかどうかはまだ明らかになっていない。

【0195】

特定の職業
石炭産業、金属産業、ゴム産業に従事している人は、胃癌になるリスクが高いようである。

【0196】

分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）
ＣＶＩＤを抱える人は、胃癌のリスクが高い。ＣＶＩＤの人の免疫系は、病原菌に反応して十分な抗体を作ることができない。ＣＶＩＤを抱える人は、頻繁に感染症にかかるほか、萎縮性胃炎及び悪性貧血等の問題も抱えている。そのような人は胃リンパ腫及び胃癌にもなりやすい。

【0197】

胃癌の症状
以下は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ、「Ｓｔｏｍａｃｈ Ｃａｎｃｅｒ Ｅａｒｌｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ， Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ， ａｎｄ Ｓｔａｇｉｎｇ（胃癌の早期発見、診断、及び病期分類）」からの改作である。

【0198】

胃癌の症状には以下のようなものがある。
・食欲不振
・体重減少（努力せずに）
・腹腔（腹部）の痛み
・腹部、通常はへその上あたりの漠然とした不快感
・少量の食事をした後の上腹部の満腹感
・胸焼け又は消化不良
・吐き気
・血が混じった、又は混じらない嘔吐
・腹部の腫れや体液の貯留
・血便
・赤血球数の減少（貧血）

【0199】

早期の胃癌では、症状が出ることはほとんどない。これが、胃癌の早期発見が難しい理由のひとつである。

【0200】

胃癌の症状は、その疾患が進行しないと現れないことが多いため、米国では、身体の他の部位に転移する前の早期に発見されるのは胃癌の５人に１人程度にすぎない。

【0201】

上部内視鏡検査
上部内視鏡検査（食道胃十二指腸内視鏡検査、ＥＧＤとも呼ばれる）は、胃癌を発見するために使用される主な検査である。特定の危険因子がある人の場合、又は兆候及び症状からこの疾患が存在する可能性があると示唆される場合に、この検査は使用されてもよい。

【0202】

この検査の際、医師が内視鏡を個体の咽頭に通す。内視鏡は、先端に小さなビデオカメラが付いた、細くて柔軟な照明付きの管である。これにより、医師が食道、胃、及び小腸の先端部分の内壁を見ることができる。

【0203】

異常な部分が見えると、内視鏡に通した器具で生検（組織試料の採取）を行うことができる。この組織試料は検査室に送られ、そこで組織試料は顕微鏡で癌が存在するかを見るために観察される。

【0204】

内視鏡で見ると、胃癌は、潰瘍、キノコ状の若しくは突出した腫瘤、又は形成性胃炎として知られる粘膜のびまん性の扁平な肥厚した部位のように見える。遺伝性びまん性胃癌症候群の胃癌は、残念ながら内視鏡では確認できないことが多い。

【0205】

内視鏡検査は、後述する超音波内視鏡検査として知られる特殊な画像検査の一部として使用することもできる。

【0206】

この検査は通常、鎮静下で行われる。

【0207】

超音波内視鏡検査
超音波内視鏡検査（ＥＵＳ）では、内視鏡の先端に小さなトランスデューサが装着される。患者が鎮静剤を投与された状態で、内視鏡が咽頭から下へ胃へと通される。これにより、トランスデューサが癌のある胃の壁に直接当たるようになる。その後、胃壁の層、並びに胃のすぐ外側にある近くのリンパ節及び他の構造が検査されてもよい。音波が移動すべき距離が短いため、標準的な超音波検査よりも画質が良い。

【0208】

ＥＵＳは、癌が胃の壁、近くの組織、及び近くのリンパ節にどれだけ広がっているかを確認するのに最も有用である。ＥＵＳは、疑わしい部位に針を刺して組織試料を採取する際（ＥＵＳガイド下針生検）にも使用される。

【0209】

生検
内視鏡検査や画像検査で異常な外観の部位が見られた場合、診断を確定するために生検が行われてもよい。

【0210】

胃癌を確認するための生検は、上部内視鏡検査の際に行われることがほとんどである。医師が内視鏡検査の際に胃壁に異常な部分を見つけると、内視鏡の中に器具を通し、それらを生検として採取することができる。胃癌の中には、胃壁の奥深くに存在するものがあり、それらは、標準的な内視鏡検査では生検が困難な場合がある。胃癌が胃壁の奥深くにあると医師が疑う場合は、超音波内視鏡検査を使って細い中空の針が胃の壁に刺され、生検試料が採取されてもよい。

【0211】

生検は、癌が広がっている可能性のある部位、例えば、近くのリンパ節又は身体の他の部分の疑わしい部位からも採取されてよい。

【0212】

生検試料の検査
生検試料は、顕微鏡で見るために検査室に送られる。その試料は、試料が癌を含むかどうか、含む場合はその種類（例えば、腺癌、カルチノイド、消化管間質性腫瘍、又はリンパ腫）を確認される。

【0213】

試料が特定の種類の癌細胞を含む場合は、さらに多くの検査が行われてもよい。例えば、腫瘍にＨＥＲ２と呼ばれる増殖を促すタンパク質があまりに多く含まれているかどうかを調べるために腫瘍が検査されてもよい。ＨＥＲ２のレベルが上昇している腫瘍は、ＨＥＲ２陽性と呼ばれる。

【0214】

ＨＥＲ２陽性の胃癌は、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））等、ＨＥＲ２タンパク質を標的とする薬剤で治療されてもよい。

【0215】

生検試料は、２つの異なる方法で検査されてもよい。
・免疫組織化学（ＩＨＣ）：この検査では、ＨＥＲ２タンパク質に結合する特殊な抗体が試料に加えられる。これにより、コピーが多数存在する場合には細胞の色が変化する。この色の変化は、顕微鏡で見ることができる。検査結果は、０、１＋、２＋、又は３＋として報告される。
・蛍光インサイツハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ）：この検査は、細胞内のＨＥＲ２遺伝子のコピーに特異的に結合する蛍光性のＤＮＡ片を使用する。これによりＨＥＲ２遺伝子のコピーを特殊な顕微鏡でカウントすることができる。

【0216】

多くの場合、ＩＨＣ検査が最初に使用される。
・検査結果が０又は１＋であれば、その癌はＨＥＲ２陰性である。ＨＥＲ２陰性の腫瘍を抱える人は、ＨＥＲ２を標的とする薬剤（トラスツズマブ等）では治療されない。
・検査の結果が３＋であれば、その癌はＨＥＲ２陽性である。ＨＥＲ２陽性の腫瘍を抱える患者は、トラスツズマブのような薬剤で治療されてもよい。
・検査結果が２＋の場合、腫瘍のＨＥＲ２の状態ははっきりしない。そのため、ＦＩＳＨによる腫瘍の検査を行うことが多い。

【0217】

腫瘍にＰＤ－Ｌ１と呼ばれる免疫チェックポイントのタンパク質が一定量含まれているかどうかを調べるために腫瘍が検査されてもよいということもある。ＰＤ－Ｌ１が検出された場合、腫瘍は、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（キイトルーダ）（登録商標））等の免疫チェックポイント阻害剤で治療されてもよい。この種の治療は、他の治療法が効かなくなった場合に行われてもよい。

【0218】

画像検査
画像検査は、Ｘ線、磁場、音波、又は放射性物質を用いて身体の内部の様子を撮影する。画像検査は、以下のような様々な理由で行われてもよい。
・疑いのある部位が癌性であるかどうかを把握する助けとするため
・癌がどの程度広がっているかを知るため
・治療が効果的であったかどうかを判断する助けとするため

【0219】

上部消化管（ＧＩ）Ｘ線検査
これは、食道、胃、及び小腸の先端部分の内壁を観察するためのＸ線検査である。この検査は異常な部位の一部を見逃す可能性があり、しかも医師が生検試料を採取することができないため、この検査は、胃癌又は他の胃の問題を調べるための内視鏡検査に比べて使用頻度は低い。しかし、内視鏡検査よりも侵襲性が低いため、状況によっては有効であることもあろう。

【0220】

この検査では、患者はバリウムと呼ばれる物質を含む白い石灰質の溶液を飲む。このバリウムは、食道、胃、及び小腸の内壁をコーティングする。その後、数枚のＸ線写真を撮影する。Ｘ線はバリウムのコーティングを通過できないので、これらの器官の内壁の異常があればそれを浮き彫りにすることになる。

【0221】

早期の胃癌を見つけるために、二重造影法が用いられてもよい。この手法では、バリウム溶液が飲み込まれた後に、細い管が胃の中に入れられて空気が送り込まれる。これにより、バリウムのコーティングが非常に薄くなるため、小さな異常でさえも映し出される。

【0222】

コンピュータ断層撮影（ＣＴ又はＣＡＴ）スキャン
ＣＴスキャンは、Ｘ線を用いて身体の詳細な断面画像を作製する。通常のＸ線とは異なり、ＣＴスキャンは身体の軟部組織の詳細な画像を作り出す。

【0223】

ＣＴスキャンは、胃をかなり鮮明に示し、多くの場合、癌の位置を確認することができる。ＣＴスキャンは、胃の近くにある肝臓等の器官、及び癌が転移している可能性のあるリンパ節及び離れた場所にある器官も示すことができる。ＣＴスキャンは、癌の範囲（ステージ）、及び手術が良い治療の選択肢であるかどうかを判断するのを助けることができる。

【0224】

ＣＴガイド下針生検：ＣＴスキャンは、癌の転移が疑われる部位に生検針を誘導するためにも使用できる。患者はＣＴスキャン台に乗ったまま、医師が生検針を皮膚から腫瘤に向けて移動させる。針が腫瘤の中に入るまで、ＣＴスキャンが繰り返される。その後、微細針生検試料（小さな組織の断片）又はコア針生検試料（細い円筒状の組織）が取り出され、顕微鏡下で観察される。

【0225】

磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）スキャン
ＭＲＩスキャンは、ＣＴスキャンと同様に、身体内の軟部組織の詳細な画像を示す。しかし、ＭＲＩはＸ線の代わりに電磁波及び強力な磁石を使用する。

【0226】

ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）スキャン
ＰＥＴスキャンでは、患者は、主に癌細胞に集まるわずかに放射性を帯びた形態の糖を注射される。その後、特殊なカメラを使用して、身体内の放射活性の領域の画像が作成される。この画像は、ＣＴスキャン又はＭＲＩスキャンのような詳細なものではないが、ＰＥＴスキャンでは身体のすべての部位における癌の広がりの可能性のある部位を一度に調べることができる。

【0227】

より最近の一部の機械は、ＰＥＴスキャン及びＣＴスキャンを同時に行うことができる（ＰＥＴ／ＣＴスキャン）。これにより、ＰＥＴスキャンで「光る」部位を医師がより詳しく見ることができる。

【0228】

ＰＥＴは、医師が癌の転移を疑っているが、どこに転移しているかわからない場合に有用であることがある。画像は、ＣＴスキャン又はＭＲＩスキャンのように詳細なものではないが、その画像は体全体についての有用な情報を提供する。ＰＥＴスキャンは、癌の広がり（転移）の部位を見出すためには有用でありうるが、ＰＥＴスキャンは特定の種類の胃癌においては必ずしも役立たない。というのも、その特定の種類の胃癌は、ブドウ糖をあまり吸収しないからである。

【0229】

胸部Ｘ線
この検査は、癌が肺に転移しているかどうかを調べるのに役立つ可能性がある。この検査は、肺又は心臓に重篤な疾患があるかどうかも判定しうる。胸部のＣＴスキャンを行った場合は、この検査は必要ない。

【0230】

腹腔鏡検査
この手順が行われる場合、それは、通常、胃癌がすでに発見された後である。ＣＴスキャン又はＭＲＩスキャンは身体の内部の詳細な画像を作製することができるが、それらは、一部の腫瘍、とりわけ非常に小さな腫瘍を見逃してしまうことがある。医師は、癌がまだ胃の中にしか存在せず、手術で完全に取り除けることを確認することに役立てるために、他の手術の前に腹腔鏡検査を行うことがある。手術の前に化学療法及び／又は放射線療法が計画されている場合は、その前に腹腔鏡検査が行われてもよい。

【0231】

この手順は、患者が全身麻酔をしている（深い眠りにある）状態で、手術室で行われる。腹腔鏡（細くて柔軟な管）が患者の脇腹にある小さな手術用の開口部から挿入される。腹腔鏡は、その先端に小さなビデオカメラを備えており、そのカメラが腹部の内部の画像をテレビ画面に送る。医師は、器官の表面や近くのリンパ節を詳細に観察したり、又は組織の小さな試料を採取したりすることができる。癌が広がっているように見えない場合、医師は生理食塩水（塩水）で腹部を「洗浄」することがある。これは腹膜洗浄と呼ばれている。その後、その流体（腹水）は取り出され、それが癌細胞を含むかどうかが調べられる。癌細胞が含まれていれば、癌の広がりを見ることができなくても、癌はすでに広がっている。

【0232】

腹腔鏡検査を超音波検査と併用することで、癌のより良好な画像が得られることがある。

【0233】

臨床検査
胃癌の兆候を調べる際に、医師は貧血（癌が胃の中に出血することによって引き起こされる可能性がある）を調べるために、全血球計算（ＣＢＣ）と呼ばれる血液検査を指示することがある。肉眼では見えない便（糞便）中の血液を調べるために、便潜血検査が行われてもよい。

【0234】

癌が発見された場合、とりわけ患者が手術を受ける場合、医師は他の検査を勧めることがある。例えば、肝臓及び腎臓の機能が正常であること、並びに血液が正常に凝固することを確認するために、血液検査が行われる。手術が予定されている場合、又は患者が心臓に影響を与える可能性がある薬を服用する予定である場合には、心臓が正常に機能していることを確認するために、患者は心電図（ＥＫＧ）及び心エコー図（心臓の超音波検査）も受けてよい。

【0235】

胃癌の治療
胃癌の診断方法は、その疾患の治療を伴ってもよい。

【0236】

それゆえ、本発明者らは、個体における胃癌の治療方法を開示する。この方法は、本明細書に記載されている方法によって胃癌を診断する工程を含んでいてもよい。個体が胃癌に罹患しているか又は胃癌に罹患する可能性が高いと判断される場合には、当該方法は、その個体に胃癌用治療剤を投与する工程を含んでもよい。

【0237】

胃癌の治療は、一般的に、外科手術、放射線治療、化学療法剤の投与、免疫療法剤の投与、又はトラスツズマブ及びラムシルマブ等の標的療法の使用のうちの１つ以上の介入を含む。

【0238】

胃癌の治療のために投与されるべき有望な治療薬は、低分子、抗体、ワクチン又はペプチドを含んでもよい。

【0239】

胃癌の治療に使用するための化学療法剤としては、５－フルオロウラシル、カペシタビン、カルボプラチン、シスプラチン、ドセタキセル、エピルビシン、イリノテカン、オキサリプラチン、パクリタキセル、トリフルリジン、及びチピラシルが挙げられる。

【0240】

胃癌の治療に使用するための免疫療法剤としては、ペムブロリズマブ等の免疫チェックポイント阻害剤が挙げられる。

【0241】

早期胃癌のために選択される治療法は、通常、外科手術である。早期に特定された癌については、内視鏡的切除術による治療も可能である。

【0242】

早期胃癌が特定された患者の治療成績は、後期胃癌の患者よりも有意に良好であることが一般的に認められている（Ｌｅｌｌｏら、２００７）。

【0243】

検出及び診断の方法
ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ（並びに任意にｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐ）のｍｉＲＮＡの発現の検出
本発明者らは、実施例において、胃癌患者におけるｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐのｍｉＲＮＡ、並びにｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐの発現が、正常な個体と比較して変化している（上方制御されているか又は下方制御されている）ことを示す。

【0244】

従って、本発明者らは、転移性、侵襲性又は浸潤性の胃癌等の胃癌を含む癌の診断方法であって、個体の細胞若しくは組織における、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ、並びに任意にｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐの発現の変調、例えばｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ又はｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡの発現の上方制御又は下方制御を検出することを含む方法を提供する。

【0245】

このような検出は、細胞が浸潤性又は侵襲性になるかどうかを判断するためにも使用されてよい。従って、細胞における、例えばその細胞を含む生物に由来する試料を介する、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ、並びに任意にｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡの発現、量又は活性の変調されたレベルの検出は、その細胞が侵襲性、転移性若しくは浸潤性であるかまたはそのようになる可能性が高いことを示してもよい。

【0246】

ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ、並びに任意にｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡのレベルが腫瘍の侵襲性とともに変化するので、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ、並びに任意にｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡの発現、量、又は活性の検出は、癌を患う個体の生存率を予測するためにも使用されてよいことが理解されるであろう。それゆえ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐのｍｉＲＮＡの発現、量又は活性の検出は、癌を患う個体の予後を予測する方法として使用されてもよい。

【0247】

ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ、並びに任意にｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡの発現、量又はレベルの検出は、癌を患う個体における特定の治療法の成功の可能性を判定するために使用されてもよい。上記検出は、ある個体の腫瘍が浸潤性若しくは転移性の腫瘍であるか、又はその可能性が高いかどうかを判定する方法に使用されてもよい。

【0248】

本明細書に記載された診断方法は、記載された治療方法と組み合わせられてもよい。従って、本発明者らは、個体における癌の治療、予防又は緩和の方法であって、個体におけるｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ、並びに任意にｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡの発現、量又は活性の変調を検出する工程と、適切な治療法をその個体に投与する工程とを含む方法を提供する。

【0249】

ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ、並びに任意にｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡの存在及び量は、以下にさらに詳細に説明するように、試料において検出されてもよい。従って、胃癌は、被験者（対象）由来の試料から、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡの発現、量若しくは活性の異常な減少又は増加、例えば発現、量又は活性の増加を判定する工程を含む方法によって診断することができる。

【0250】

試料は、発現、量若しくは活性のレベル若しくはパターンの空間的又は時間的変化を含めた、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ、並びに任意にｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡの発現、量若しくは活性の増加、減少若しくはその他の異常に関連する疾患に罹患している、若しくは罹患していることが疑われる生物若しくは個体からの細胞又は組織の試料を含んでもよい。このような疾患に罹患しているか、又は罹患していると疑われる生物におけるｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ、並びに任意にｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡの発現、量若しくは活性のレベル又はパターンは、疾患の診断手段として、正常な生物における発現、量若しくは活性のレベル又はパターンと有用に比較されてもよい。

【0251】

試料は、胃癌に罹患しているか、又は罹患していると疑われる個体からの細胞又は組織の試料、例えば血清試料を含んでもよい。

【0252】

いくつかの実施形態では、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ、並びに任意にｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡの発現、量又は活性のレベルの上昇が、試料において検出される。ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ、並びに任意にｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡのレベルは、正常な細胞、又は癌性ではないことが知られている細胞と比較して、有意な程度に上昇又は低下していてもよい。このような細胞は、被検者、又は別の個体、例えば被検者と年齢、体重、生活習慣等が一致する別の個体から得られたものであってもよい。

【0253】

ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈａｓ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ又はｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂの発現の増加
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡの発現、量又は活性のレベルは、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、１５５％、１６０％、１６５％、１７０％、１７５％、１８０％、１８５％、１９０％、１９５％、２００％又はそれ以上上昇している。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡの発現、量又は活性のレベルは、４５％以上、例えば５０％以上上昇している。

【0254】

例えば、胃癌に罹患していないことが知られている個体と比較して、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈａｓ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ又はｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂのうちの１つ以上の発現が増加している場合に、胃癌が診断されてもよい。

【0255】

ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ又はｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐの発現の減少
他の実施形態では、ｍｉＲＮＡの発現、量又は活性のレベルは、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、１５５％、１６０％、１６５％、１７０％、１７５％、１８０％、１８５％、１９０％、１９５％、２００％又はそれ以上低下している。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡの発現、量又は活性のレベルは、４５％以上、例えば５０％以上低下している。

【0256】

それゆえ、胃癌に罹患していないことが知られている個体と比較して、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐのうちの１つ以上の発現が低下している場合、胃癌と診断されてもよい。

【0257】

ｍｉＲＮＡの発現の検出
ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐのｍｉＲＮＡ、並びに任意にｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡの発現、量又は活性は、当該技術分野で公知のように、そして以下にさらに詳細に説明するように、多くの方法で検出されてもよい。典型的には、個体からの組織試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ又はｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐのｍｉＲＮＡ、並びに任意にｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐの量が測定され、罹患していない個体からの試料と比較される。

【0258】

ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐのｍｉＲＮＡ、並びに任意にｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡの量、活性又は発現の検出は、胃癌の悪性度を判定するために使用されてもよい。例えば、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐのｍｉＲＮＡ、並びに任意にｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡの高いレベルの量、活性、又は発現は、侵襲性、浸潤性又は転移性の癌を示してもよい。同様に、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ又はｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐのｍｉＲＮＡの低いレベルの量、活性、又は発現は、非侵襲性、非浸潤性、又は非転移性の癌を示してもよい。

【0259】

ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ、並びに任意にｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡの遺伝子発現のレベルは、多くの異なる技術を用いて決定されてもよい。

【0260】

１つの実施形態では、本発明者らは、試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ、並びに任意にｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡ核酸を含む核酸の存在を検出する方法であって、その試料を、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ又はｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ、並びに任意にｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡに特異的である少なくとも１種の核酸プローブと接触させることと、そのｍｉＲＮＡの存在について試料をモニタリングすることによる方法を開示する。例えば、核酸プローブは、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ若しくはｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ、及び任意にｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡ、又はその一部分に特異的に結合してもよく、両者の結合は検出され、複合体自体の存在も検出されてよい。

【0261】

従って、１つの実施形態では、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ、並びに任意にｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡの量が、試料中で測定されてもよい。ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐのｍｉＲＮＡ、並びにｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐは、インサイツハイブリダイゼーション、ノーザンブロット法又は逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によってアッセイされてもよい。核酸配列は、特定のプライマーを用いてインサイツハイブリダイゼーション、サザンブロット法、一本鎖コンフォメーション多型、ＰＣＲ増幅及びＤＮＡチップ分析によって特定されてもよい（Ｋａｗａｓａｋｉ、１９９０；Ｓａｍｂｒｏｏｋ、１９９２；Ｌｉｃｈｔｅｒら、１９９０；Ｏｒｉｔａら、１９８９；Ｆｏｄｏｒら、１９９３；Ｐｅａｓｅら、１９９４）。

【0262】

ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ、並びに任意にｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡ ＲＮＡは、例えば、酸性フェノール／グアニジンイソチオシアネート抽出（ＲＮＡｚｏｌ Ｂ；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ（バイオジェネシス））又はＲＮｅａｓｙ ＲＮＡ調製キット（Ｑｉａｇｅｎ）等のＲＮＡ抽出技術を用いて、細胞から抽出されてもよい。リボ核酸ハイブリダイゼーションを利用した代表的なアッセイフォーマットとしては、核ランオンアッセイ、ＲＴ－ＰＣＲ、及びＲＮａｓｅ（リボヌクレアーゼ）プロテクションアッセイ（Ｍｅｌｔｏｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２：７０３５）が挙げられる。採用されてもよい検出方法としては、放射性標識、酵素標識、化学発光標識、蛍光標識、及び他の適切な標識が挙げられる。

【0263】

これらの方法はいずれも、定量的な測定を可能にするものであり、当該技術分野で周知である。それゆえ、減少又は増加したｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ又はｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ、及び任意にｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡの発現、量又は活性は、ポリヌクレオチドの定量のために当該技術分野で周知の方法のいずれかを使用して、ＲＮＡレベルで測定することができる。ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐのｍｉＲＮＡ配列からの任意の適切なプローブ、例えば、適切なヒトのｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ又はｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐのｍｉＲＮＡの配列の任意の部分がプローブとして使用されてもよい。ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐのｍｉＲＮＡプローブを設計するための配列は、関連するｍｉＲＢａｓｅ受入番号を有する配列、又はそのような配列の一部に由来してもよい。

【0264】

ＲＮＡ標的の増幅には、通常、ＲＴ－ＰＣＲが用いられる。このプロセスでは、逆転写酵素を用いてＲＮＡを相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換し、その後、この相補的なＤＮＡは、検出を容易にするために増幅することができる。

【0265】

多くのＤＮＡ増幅方法が知られているが、その多くは酵素連鎖反応（ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、若しくは自家持続配列複製法等）、又はＤＮＡがクローニングされたベクターの全部若しくは一部の複製に依っている。

【0266】

多くの標的増幅法やシグナル増幅法が、文献に、例えば、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｕ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：２２９－２３７（１９８８）及びＬｅｗｉｓ，Ｒ．、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎｅｗｓ １０：１、５４－５５（１９９０）にあるこれらの方法の総説に記載されている。

【0267】

例えば、ポリメラーゼ連鎖反応は、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐのｍｉＲＮＡを検出するために採用されてもよい。

【0268】

「ポリメラーゼ連鎖反応」又は「ＰＣＲ」は、とりわけ米国特許第４，６８３，１９５号明細書及び第４，６８３，２０２号明細書に記載されている核酸増幅方法である。ＰＣＲは、診断上、任意の既知の核酸を増幅するために使用することができる（Ｍｏｋら、１９９４、Ｇｙｎａｅｃｏｌｏｇｉｃ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ５２：２４７－２５２）。自家持続配列複製法（３ＳＲ）は、酵素カクテル及び適切なオリゴヌクレオチドプライマーによって媒介される逆転写酵素（ＲＴ）、ポリメラーゼ並びにヌクレアーゼの活性の連続したラウンドを介して核酸テンプレートの等温増幅を含むＴＡＳのバリエーションである（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４）。ライゲーション増幅反応又はライゲーション増幅システムは、ＤＮＡリガーゼ及び４つのオリゴヌクレオチド（標的鎖ごとに２つ）を使用する。この技法は、Ｗｕ，Ｄ．Ｙ．及びＷａｌｌａｃｅ，Ｒ．Ｂ．、１９８９、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０に記載されている。Ｑβレプリカーゼ技術では、Ｌｉｚａｒｄｉら、１９８８、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７に記載されているように、一本鎖のＲＮＡを複製するバクテリオファージＱβに対するＲＮＡレプリカーゼを用いて標的ＤＮＡを増幅する。

【0269】

ＰＣＲの手順は、基本的に、（１）抽出したＤＮＡを処理して一本鎖の相補鎖を形成する工程と、（２）一対のオリゴヌクレオチドプライマーを加える工程であって、その対の一方のプライマーはセンス鎖の配列の一部に実質的に相補的であり、各対の他方のプライマーは相補的なアンチセンス鎖の同じ配列の異なる部分に実質的に相補的である工程と、（３）対合したプライマーを相補的な配列にアニールする工程と、（４）アニールされたプライマーを各プライマーの３’末端から同時に伸長して、各プライマーにアニールされた鎖に相補的な伸長産物を合成する工程であって、相補体から単離した後の上記伸長産物が、各対の他方のプライマーに対する伸長産物を合成するための鋳型となる工程と、（５）上記伸長産物を上記鋳型から分離して、一本鎖分子を生成する工程と、（６）上記アニール、伸長及び分離の工程を少なくとも１回繰り返すことにより、上記一本鎖分子を増幅する工程とを含む。

【0270】

逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を採用してもよい。定量的ＲＴ－ＰＣＲを用いてもよい。このようなＰＣＲ技術は当該技術分野で周知であり、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ又はｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐのｍｉＲＮＡ配列からの任意の適切なプライマーを採用してもよい。

【0271】

代替の増幅技術を利用することもできる。例えば、ローリングサークル増幅（Ｌｉｚａｒｄｉら、１９９８、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ １９：２２５）は、ＤＮＡポリメラーゼによって駆動され、等温条件下で線形又は幾何級数的な動態で環状のオリゴヌクレオチドプローブを複製することができる、市販されている増幅技術である（ＲＣＡＴ（商標））。さらなる技術、鎖置換型増幅（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＳＤＡ；Ｗａｌｋｅｒら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：３９２）は、特定の標的にユニークな特異的に規定された配列を用いて始める。

【0272】

診断キット
本発明者らは、個体における胃癌、又は個体における胃癌への易罹患性（罹患率）を検出するための診断キットも提供する。

【0273】

当該診断キットは、本明細書に記載されている任意の手段により、個体におけるｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ、並びに任意にｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡの発現、量又は活性を検出する手段を含んでいてもよい。それゆえ、当該診断キットは、以下のいずれか１つ以上を含んでいてもよい：ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ及び任意にｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡポリヌクレオチド若しくはその断片、又はｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐのｍｉＲＮＡ、並びに任意にｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのｍｉＲＮＡ、若しくはその断片に相補的なヌクレオチド配列。

【0274】

当該診断キットは、使用説明書、又は他の指標を含んでいてもよい。当該診断キットは、本明細書に記載されている組成物のいずれか、又は胃癌を治療するために当該技術分野で公知のいずれかの手段等、胃癌の治療又は予防のための手段をさらに含んでいてもよい。

【0275】

さらなる態様
本発明のさらなる態様及び実施形態をここで以下の番号のついた項に記載するが、本発明はこれらの態様を包含するものと理解されたい。

【0276】

項１． 胃癌の診断方法であって、個体における又は個体の細胞外小胞（ＥＶ）において、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐからなる群から選択されるｍｉＲＮＡ、又はその変異体、相同体、誘導体若しくは断片、例えば上記ｍｉＲＮＡに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列の発現レベルを、胃癌に罹患していないことが知られている個体における、又はそのような個体のＥＶにおけるｍｉＲＮＡの発現レベルと比較して検出する工程を含み、ｍｉＲＮＡの変化した発現レベル、例えば発現レベルの上昇又は低下、好ましくは発現レベルの上昇が、その個体が胃癌に罹患しているか、又は罹患している可能性が高いことを示す方法。

【0277】

項２． （ａ）ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４が、ｍｉＲＢａｓｅ受入番号ＭＩＭＡＴ０００２１７４を有するポリヌクレオチド配列、若しくはその変異体、相同体、誘導体若しくは断片、例えば、上記ポリヌクレオチド配列に対して７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有しかつｈｓａ－ｍｉＲ－４８４活性を含む配列を含むか、（ｂ）ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐが、ｍｉＲｂａｓｅ受入番号ＭＩＭＡＴ００００４５６を有するポリヌクレオチド配列、若しくはその変異体、相同体、誘導体若しくは断片、例えば、上記ポリヌクレオチド配列に対して７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有しかつｈｓａ－ｍｉＲ－４８４活性を含む配列を含むか、（ｃ）ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐが、ｍｉＲＢａｓｅ受入番号ＭＩＭＡＴ００００４３３を有するポリヌクレオチド配列、若しくはその変異体、相同体、誘導体若しくは断片、例えば、上記ポリヌクレオチド配列に対して７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有しかつｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ活性活性を含む配列を含むか、（ｄ）ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄが、ｍｉＲＢａｓｅ受入番号ＭＩＭＡＴ０００６７６４を有するポリヌクレオチド配列、若しくはその変異体、相同体、誘導体若しくは断片、例えば、上記ポリヌクレオチド配列に対して７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有しかつｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ活性を含む配列を含むか、（ｅ）ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａが、ｍｉＲＢａｓｅ受入番号ＭＩ００００５４２を有するポリヌクレオチド配列、若しくはその変異体、相同体、誘導体若しくは断片、例えば、上記ポリヌクレオチド配列に対して７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有しかつｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ活性を含む配列を含むか、（ｆ）ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂが、ｍｉＲＢａｓｅ受入番号ＭＩＭＡＴ０００５７９２を有するポリヌクレオチド配列、若しくはその変異体、相同体、誘導体若しくは断片、例えば、上記ポリヌクレオチド配列に対して７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有しかつｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ活性を含む配列を含むか、又は（ｇ）ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐが、ｍｉＲＢａｓｅ受入番号ＭＩＭＡＴ０００００７０を有するポリヌクレオチド配列、若しくはその変異体、相同体、誘導体若しくは断片、例えば、上記ポリヌクレオチド配列に対して７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有しかつｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ活性を含む配列を含む項１に記載の方法。

【0278】

項３． 上記群の中の２つ以上のそのようなｍｉＲＮＡ、例えば３つのｍｉＲＮＡ、４つのｍｉＲＮＡ、５つのｍｉＲＮＡ、６つのｍｉＲＮＡ、又は７つのｍｉＲＮＡの細胞外小胞（ＥＶ）における発現レベルを検出する工程を含む項１又は項２に記載の方法。

【0279】

項４． ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐ（ｍｉＲＢａｓｅ受入番号ＭＩＭＡＴ０００４７４８）、又はその変異体、相同体、誘導体若しくは断片、例えばそれに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有しかつｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐ活性を含む配列の細胞外小胞（ＥＶ）における発現レベルを検出する工程をさらに含む項１、項２又は項３に記載の方法。

【0280】

項５． 上記検出が、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応（多重ＰＣＲ）等のポリメラーゼ連鎖反応、ノーザンブロット、リボヌクレアーゼプロテクション、マイクロアレイハイブリダイゼーション、又はＲＮＡシークエンシングを含む項１から項４のいずれかに記載の方法。

【0281】

項６． 上記個体における、又は上記個体の細胞外小胞（ＥＶ）が、個体の上咽頭分泌物、尿、血清、リンパ液、唾液、肛門及び膣内の分泌物、汗、若しくは精液等の体液試料等、上記個体における、又は上記個体の試料から得られたものである、項１から項５のいずれかに記載の方法。

【0282】

項７． 好ましくはマイクロアレイの形態又はマルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）キットとしての基板上に固定化された核酸の組み合わせ等の項１、項２又は項４のいずれかに記載の２つ以上の核酸又はそれに特異的に結合できるプローブの組み合わせ。

【0283】

項８． ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４（ｍｉＲＢａｓｅ受入番号ＭＩＭＡＴ０００２１７４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ（ｍｉＲＢａｓｅ受入番号ＭＩＭＡＴ００００４５６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ（ｍｉＲＢａｓｅ受入番号ＭＩＭＡＴ００００４３３）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ（ｍｉＲＢａｓｅ受入番号ＭＩＭＡＴ０００６７６４）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ（ｍｉＲＢａｓｅ受入番号ＭＩ００００５４２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ（ｍｉＲＢａｓｅ受入番号ＭＩＭＡＴ０００５７９２）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ（ｍｉＲＢａｓｅ受入番号ＭＩＭＡＴ０００００７０）及びｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐ（ｍｉＲＢａｓｅ受入番号ＭＩＭＡＴ０００４７４８）の各々に特異的に結合することができるプローブを含む項７に記載の組み合わせ。

【0284】

項９． 胃癌の検出方法又は胃癌の重症度の決定方法において使用するための、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐからなる群から選択されるｍｉＲＮＡ、又はその変異体、相同体、誘導体若しくは断片、例えば上記ｍｉＲＮＡに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列。

【0285】

項１０． ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ、並びに任意にｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐからなる群から選択される２つ以上のｍｉＲＮＡ、又はその変異体、相同体、誘導体若しくは断片、例えば上記ｍｉＲＮＡに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列を、薬学的に許容できる賦形剤、担体又は希釈剤とともに含む医薬組成物。

【0286】

項１１． 胃癌の診断キットであって、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ、並びに任意にｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐからなる群から選択される２つ以上のｍｉＲＮＡ、又はその変異体、相同体、誘導体若しくは断片、例えば上記ｍｉＲＮＡに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列を、使用説明書とともに含むキット。

【0287】

項１２． 個体における胃癌の治療方法であって、項１から項６のいずれかに記載の方法を実行する工程と、その個体が胃癌に罹患しているか又は胃癌に罹患する可能性が高いと判断される場合に、その個体に胃癌用治療剤を投与する工程とを含む方法。

【0288】

項１３． 個体における胃癌の治療方法であって、（ａ）個体から得られた試料の細胞外小胞（ＥＶ）におけるｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐからなる群から選択されるｍｉＲＮＡ、又はその変異体、相同体、誘導体若しくは断片、例えば上記ｍｉＲＮＡに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列の発現レベルを測定するアッセイの結果を受け取る工程であって、この結果は上記試料のＥＶにおける上記ｍｉＲＮＡの発現レベルを示す工程と、（ｂ）上記試料のＥＶにおける上記ｍｉＲＮＡの発現が、胃癌に罹患していないことが知られている個体のＥＶにおける上記ｍｉＲＮＡの発現レベルであるｍｉＲＮＡの基準発現レベルよりも高く、これにより上記個体における胃癌の徴候を提供又は予測する場合、胃癌用治療剤を投与する工程とを含む方法。

【0289】

項１４． 個体における胃癌の治療方法であって、（ａ）個体の細胞外小胞（ＥＶ）におけるｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ及びｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐからなる群から選択されるｍｉＲＮＡ、又はその変異体、相同体、誘導体若しくは断片、例えば上記ｍｉＲＮＡに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列の発現レベルの分析の結果を得る工程と、（ｂ）上記ｍｉＲＮＡの発現レベルが胃癌に罹患していないことが知られている個体のＥＶにおける上記ｍｉＲＮＡの発現レベルである基準発現レベルを超える場合に、胃癌用治療剤をその個体に投与する工程とを含む方法。

【0290】

項１５． 添付の図面の図１から図５を参照して本明細書に実質的に記載され示されている方法、組み合わせ、ｍｉＲＮＡ、使用、医薬組成物又は診断。

【実施例】

【0291】

例１． 材料及び方法 － 血漿／血清試料
プールされた正常ヒト血清（ＩＰＬＡ－ＳＥＲ）は、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（イノベーティブ・リサーチ）、米国から購入した。胃癌及び健常な対照の血清は、ＢｉｏＩＶＴ（バイオ・アイヴィーティー）、米国から購入した。

【0292】

例２． 材料及び方法 － 血清からのＥＶの単離
血清は、ＥＶ単離の前に、２，０００ｇで２０分間、その後１０，０００ｇで３０分間の遠心分離を行い、前処理（事前の清澄化）工程に供した。

【0293】

次いで、２００μｌの前処理済み血清からＥＶを単離した。

【0294】

例３． 材料及び方法 － 超遠心分離
Ｏｐｔｉｍａ ＭＡＸ－ＸＰ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ（ベックマン・コールター）、米国）を用いて、２００μｌの前処理済み血清を１００，０００ｇで７０分間、４℃で遠心分離した。上清を吸引してペレットを洗浄し、１００，０００ｇで７０分間、４℃で再遠心分離した。ＥＶを含むペレットを、後続のＲＮＡ抽出のために２００μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁した。タンパク質分析のために、このペレットを３０μｌの５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）に溶解した。

【0295】

例４． 材料及び方法 － ポリマーベースの沈殿
Ｔｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（ｆｒｏｍ ｓｅｒｕｍ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（インビトロジェン）、米国）、ＥｘｏＱｕｉｃｋ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）、ｍｉＲＣＵＲＹ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ － Ｓｅｒｕｍ ａｎｄ Ｐｌａｓｍａ（Ｅｘｉｑｏｎ（エキシコン）、デンマーク）、及びＥＸＯ－ｐｒｅｐ（ＨａｎｓａＢｉｏＭｅｄ（ハンサバイオメド）、エストニア）の４種類の市販のポリマーベースの沈殿試薬を製造業者のプロトコルに従って用いて、２００μｌの前処理済み血清からＥＶを単離した。ＥＶペレットを、後続のＲＮＡ抽出のために２００μｌのＰＢＳに再懸濁した。ペレットを、タンパク質分析のために３０μｌの５％ ＳＤＳに溶解した。

【0296】

例５． 材料及び方法 － カラムアフィニティベースの精製
ｅｘｏＲＮｅａｓｙ Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）を用いて、製造業者のプロトコルに従って、２００μｌの前処理済み血清からＥＶを単離した。手短に言えば、血清を結合バッファと混合し、洗浄のためにメンブレンカラムにロードした。その後、ＱＩＡｚｏｌを加えてＥＶを直接溶解し、３０μｌのヌクレアーゼフリーの水でＲＮＡを溶出した。

【0297】

例６． 材料及び方法 － ペプチドアフィニティベースの精製
ＭＥ（商標） Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ（ニュー・イングランド・ペプチド、米国）を用いてＥＶを単離した。２００μｌの前処理済み血清を２０μｌのＶｎ９６ペプチドストックと４℃で一晩、エンドツーエンドで回転させながらインキュベートした。この混合物を１７，０００ｇで１５分間、室温で遠心分離した。その後、上清を除去し、ＥＶ含有ペレットを５００μｌのＰＢＳを用いて１７，０００ｇで１０分間、２回洗浄した。ＥＶを含むペレットを、後続のＲＮＡ抽出のために２００μｌのＰＢＳに再懸濁した。

【0298】

例７． 材料及び方法 － 免疫親和性アフィニティベースの精製
ＥｘｏＣａｐ（商標） Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｋｉｔ ｆｏｒ ｓｅｒｕｍ Ｐｌａｓｍａ（ＪＳＲ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＪＳＲライフサイエンス）、日本）を用いてＥＶを単離した。１００μｌのキャプチャービーズを１ｍｌの処理バッファと混合し、２００μｌの前処理済み血清と４℃で一晩、エンドツーエンドで回転させながらインキュベートした。チューブを磁気チューブスタンドに１分間置くことにより上澄みを除去した。ビーズを５００μｌの洗浄／希釈用バッファで２回洗浄した。洗浄したビーズを２００μｌのＰＢＳに再懸濁し、直ちにＲＮＡ抽出に進んだ。

【0299】

例８． 材料及び方法 － 全血清又はＥＶ調製物からのＲＮＡの単離
２００μｌのＥＶ調製物又は２００μｌの未処理の血清からの全ＲＮＡを、ｍｉＲＮｅａｓｙ ｓｅｒｕｍ／ｐｌａｓｍａ ｍｉＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者のプロトコルに従って用いて抽出した。

【0300】

ＲＮＡ単離時の技術的なばらつきを正規化するために、１ｍｌのＱＩＡｚｏｌ溶解バッファに３つの専売の合成ｍｉＲＮＡ（ＭｉＲＸＥＳ（ミレクサス）、シンガポール）をスパイク（添加）してから試料に添加した。

【0301】

その後、２００μｌのクロロホルムを混合物に加えて十分に混合し、１８，０００ｇで１５分間遠心分離して相単離させた。

【0302】

ＲＮＡの結合、洗浄、溶出を自動で行うために、各試料から得られた水相をＱｉａＣｕｂｅ（Ｑｉａｇｅｎ）に移した。

【0303】

ＲＮＡを３０μｌのヌクレアーゼフリーの水で溶出した。

【0304】

例９． 材料及び方法 － ウエスタンブロット
ＥＶ調製物を５％ＳＤＳ溶解バッファで溶解した。タンパク質濃度は、ＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ（バイオラッド）、米国）を用いて測定した。３０μｇのタンパク質を４×ＳＤＳ－ＰＡＧＥバッファで懸濁し、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）により１２０Ｖで１時間分離した後、Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ（登録商標） Ｔｕｒｂｏ（商標） Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いてニトロセルロース膜（０．２μｍ）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に転写した。この膜を５％のミルクを含むＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）で３０分間、室温でブロックし、その後、フロチリン（フロチリン）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ベクトン・ディッキンソン）、米国）、ＴＳＧ１０１、ＣＤ６３、ＣＤ８１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（サンタクルーズ・バイオテクノロジー）、米国）、ＣＤ９、アルブミン（Ａｂｃａｍ（アブカム）、英国）の一次抗体を用いて一晩ブロット法を行った。セイヨウワサビ ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識の二次抗体（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ（ゼネラル・エレクトリック）、米国）からの化学発光シグナルを、検出試薬を製造業者の説明書（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（サーモ・サイエンティフィック）、米国）に従って用いて検出した。

【0305】

例１０． 材料及び方法 － 逆転写（ＲＴ）
ＩＤ３ＥＡＬ ｃＤＮＡ合成試薬（ＭｉＲＸＥＳ）を、１１種の血清ｍｉＲＮＡ（ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１０３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｍｉＲ－１９１－５ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－２３ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－４５１ａ及びｍｉＲ－９３－５ｐ）と３種の外来性スパイクインコントロールに対する改変されたステム－ループＲＴプライマープール（ＭｉＲＸＥＳ）とともに用いてＲＮＡを逆転写した。５μｌの全ＲＮＡを、ＩＤ３ＥＡＬ ｍｉＲＮＡ ＲＴバッファ、ＩＤ３ＥＡＬ逆転写酵素、及びＲＴプライマープールと混合し、総反応物量を１５μｌとした。Ｃ１０００ Ｔｏｕｃｈ（商標） Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、反応混合物を４２℃で３０分、続いて９５℃で５分インキュベートし、逆転写酵素を失活させた。

【0306】

例１１． 材料及び方法 － リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）
ＩＤ３ＥＡＬ ｍｉＲＮＡ ｑＰＣＲ試薬（ＭｉＲＸＥＳ）を、用いて、上記１１種のｍｉＲＮＡ標的及び３種類の外来性スパイクインコントロールのそれぞれに特異的なプライマー対とともに用いてｑＰＣＲ反応を行った。

【0307】

各ｃＤＮＡ試料は、ヌクレアーゼフリーの水で１０倍に希釈し、３８４ウェルプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ（アプライド・バイオシステズ）、米国）に２連で加えた。

【0308】

５μｌの希釈したｃＤＮＡ、１×ＩＤ３ＥＡＬ ｍｉＲＮＡ ｑＰＣＲマスターミックス、１×ＩＤ３ＥＡＬ ｍｉＲＮＡ ｑＰＣＲプライマー（ＭｉＲＸＥＳ）、ヌクレアーゼフリーの水を加えた１５μｌの総反応量でＰＣＲ増幅を行った。

【0309】

ｑＰＣＲの増幅及び検出は、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ５ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、以下のサイクリング条件で行った：９５℃×１０分、４０℃×５分、続いて９５℃×１０秒及び６０℃×３０秒のサイクルを４０回繰り返す（光学的読み取り）。

【0310】

生の閾値までのサイクル数（Ｃｔ）の値はＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ Ｄｅｓｉｇｎ ＆ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ１．５を用い、自動ベースライン設定及び０．４の閾値を用いて算出した。

【0311】

例１２． 材料及び方法 － ｍｉＲＮＡプロファイリング
ｍｉＲＮＡプロファイリングのために、４つのマルチプレックスＲＴプライマープールに群分けした１３３種のヒトｍｉＲＮＡ（補足表１）を用いてＲＮＡを逆転写した。この４つのマルチプレックスＲＴプライマープールは、ＩＤ３ＥＡＬ ｃＤＮＡ合成試薬を用いて、各群の異なるＲＴプライマー（ＭｉＲＸＥＳ）間の非特異的相互作用が最小限であることを試験した。

【0312】

これらの１３３種のヒトｍｉＲＮＡは、過去のプロファイリング研究のデータ、及び正常な試料とＧＣ試料との間で血清中での発現レベルに差があることを示す他の文献に基づいて選択した。

【0313】

ｍｉＲＮＡコピー数の測定のために、合成ｍｉＲＮＡテンプレートの６つの１０倍連続希釈液を、単離したＲＮＡ試料を用いて逆転写し、同じマイクロプレートから標準曲線を作成した。

【0314】

ｍｉＲＮＡ特異的ｑＰＣＲアッセイ（ＭｉＲＸＥＳ）を用いて、各ｃＤＮＡ試料中で１３３種の候補ｍｉＲＮＡを測定した。

【0315】

各ｍｉＲＮＡの絶対発現コピー数は、Ｃｔ値を合成ｍｉＲＮＡ標準曲線のＣｔ値に補間して決定し、ＲＴ－ｑＰＣＲ効率の変動を調整した。

【0316】

例１３． 材料及び方法 － データ処理
ＲＮＡ単離時の技術的変動を考慮して、試料からのＣｔ値を３つの外来性スパイクインコントロールを用いて正規化した：（１）試料ごとに３つのスパイクインの平均Ｃｔを算出し、（２）３つのスパイクインの平均Ｃｔを全試料から算出し、（３）ΔＣｔを算出し（平均_試料ごと－平均_全試料）、（４）試料で測定した各ｍｉＲＮＡの各Ｃｔ値からΔＣｔを差し引く^３７。未処理の血清からのＥＶ ｍｉＲＮＡの回収率（％）は、２^{－（Ｃｔ全－ＣｔＥＶ）}×１００％を用いて算出した。データは平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として提示し、少なくとも３回の独立した実験の代表値である。グラフはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（グラフパッド・ソフトウェア）、米国）を用いてプロットした。

【0317】

探索セットを用いたプロファイリング研究では、上述のように、まず外来性スパイクインコントロールによりデータを正規化した。グローバルな正規化を行うために、すべてのｍｉＲＮＡに対する平均Ｃｔ値を正規化係数（正規化因子）として使用し、各試料が最終的に同じ平均ｍｉＲＮＡ発現レベルになるように試料ごとに設定した。ｇｅＮｏｒｍ及びＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒを用いて５つの基準ｍｉＲＮＡの１組を特定し（補足表２）、それを用いて、検証セットから導かれたデータを正規化した。各ｍｉＲＮＡのＬｏｇ２コピー数は、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標） ｖＲ２０１９ａ（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ（マスワークス）、米国）を用いたデータ解析に使用した。真陽性率をｙ軸に、偽陽性率をｘ軸にしてＲＯＣ曲線（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ、受信者操作特性）を計算した。選択したｍｉＲＮＡについてのＡＵＣは、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）を用いて台形公式に基づいて推定した。

【0318】

例１４． 結果 － 異なるＥＶ単離方法が対照的なｍｉＲＮＡの回収率を生じる
ＥＶ単離のためのＵＣ及びポリマーベースの沈殿試薬以外にも、近年、いくつかの他の技術が市販されている。つまり、（１）カラムアフィニティベースのＥＶ精製、（２）ペプチドアフィニティベースのＥＶ精製、（３）イムノビーズアフィニティベースのＥＶ精製である。これらの方法を用いた少量試料からのｍｉＲＮＡの回収率を判定するために、２００μｌの血清からＥＶを単離し、ヒト血清中で一般的に発現している１１種のｍｉＲＮＡの発現レベルをリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ｑＰＣＲ）により評価した。カラムアフィニティベース又はペプチドアフィニティベースの方法によるＥＶのｍｉＲＮＡの回収率は、ＵＣと同様（約１０～２０％の回収率）であった（図１Ａ）が、カラムアフィニティベースの方法による７ａ－５ｐ（約３５％の回収率）は例外であった。なお、イムノビーズアフィニティベースのＥＶ精製方法では、最小量のｍｉＲＮＡしか回収できなかった。本発明者らは、次に、一般的なＥＶマーカーの発現をウエスタンブロット法により測定した（図１Ｂ）。ペプチドアフィニティを用いて単離したＥＶは、ＴＳＧ１０１及びＣＤ９を発現していなかった。同様に、ＴＳＧ１０１の発現は、カラムベースの方法を用いて精製したＥＶには見られなかった（図１Ｂ）。これら２つの方法では、アルブミンの混入量もＵＣと比較して少なかった。イムノビーズアフィニティベースの方法からの画分は、分析するには収量が少なすぎたため、ウエスタンブロット法による分析は行わなかった。

【0319】

次に、本発明者らは、ポリマーベースの沈殿法を用いて回収したＥＶ関連のｍｉＲＮＡを評価した。前処理済み血清からＥＶを単離する性能を比較するために、市販の４種の沈殿試薬を試験した：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｉｎｖｔ）、ＳＢＩ、Ｅｘｉｑｏｎ（Ｅｘｉ）、Ｈａｎｓａ（Ｈａｎ）。ＵＣと比較して、試験したほぼすべての試薬でｍｉＲＮＡの回収率が高かった（図２Ａ）。Ｉｎｖｔ及びＳＢＩは同程度のｍｉＲＮＡ回収率を示したが、Ｅｘｉ及びＨａｎはそれぞれ最高と最低のｍｉＲＮＡ回収率を示した。興味深いことに、７ａ－５ｐ及び９３－５ｐのｍｉＲＮＡの回収率は、４つの試薬すべてにおいてＵＣと同程度であった。

【0320】

ウエスタンブロット解析は、ポリマーベースの沈殿及びＵＣを用いて単離した試料にＥＶマーカー（フロチリン、ＴＳＧ１０１、ＣＤ９、ＣＤ６３、及びＣＤ８１）が存在することを明らかにした（図２Ｂ）。同程度のｍｉＲＮＡ回収率を示したＩｎｖｔ及びＳＢＩは、同程度の量のＥＶマーカーを示した。４つの方法すべてで、ＵＣと比較してＥＶマーカーの発現が変化した。同じ量のタンパク質をウエスタンブロットにロードした場合、Ｈａｎ試薬を用いた調製物ではアルブミンの混入が多く見られた。これらは、Ｈａｎ試薬では試料調製後のＥＶの精製度が低いことを示唆していると考えられる。今回の結果は、ポリマーベースの沈殿法の違いにより、単離されるＥＶの種類が異なる可能性を示唆した。

【0321】

例１５． 結果 － ポリマーベースの沈殿法を用いたｍｉＲＮＡプロファイリング
本発明者らは、下流のｍｉＲＮＡプロファイリング分析にポリマーベースの沈殿法を選択した。というのは、ポリマーベースの沈殿法は他の方法に比べていくつかの利点があるからである。これには、使いやすさ、比較的低コスト、高い拡張性、必要な試料量が少ない、迅速なワークフロー等が含まれる。そこで、本発明者らは、全血清中のｍｉＲＮＡを測定するよりも、ＥＶ画分中のｍｉＲＮＡを定量した方が、より高い信号対雑音比が得られるのではないかという仮説の検証を開始した。１５人のＧＣの血清及び１５人の対照から、Ｉｎｖｔ、ＳＢＩ、Ｅｘｉ又はＨａｎの沈殿試薬を用いてＥＶを単離した。

【0322】

全被験者についての臨床情報を表Ｅ１（下記）に示す。

【0323】

【表2】

【0324】

全血清及びＥＶ画分の両方における１３３種のＧＣ関連ｍｉＲＮＡの発現を測定し、比較した。すべてのｍｉＲＮＡが全血清画分で検出可能であった。１３３種のｍｉＲＮＡのうち３０種は、４種のポリマーベースの沈殿法のいずれかで単離した試料では検出されなかった。そのため、これらのｍｉＲＮＡはその後の解析には使用しなかった。

【0325】

本発明者らは、まず、癌群並びに対照群の全血清及びＥＶ分画におけるｍｉＲＮＡの発現の違いを調べた（図３）。０に近い値は、ＥＶ画分中のｍｉＲＮＡのレベルが全血清中のそれと同様であることを示す。Ｈａｎ試薬は、全血清と比較して、ＥＶ画分におけるｍｉＲＮＡの発現レベルの最も大きい差を示した。Ｈａｎ試薬及びＩｎｖｔ試薬は、ＳＢＩ試薬及びＥｘｉ試薬に比べて、癌と対照群との間でｍｉＲＮＡレベルのより良好な識別が可能であった（ｐ値＜０．０５）。

【0326】

次に、本発明者らは、２つの基準を満たすことで、診断的価値が期待できるＥＶ関連のｍｉＲＮＡを特定した：（１）ＥＶ画分における癌と対照との間の倍率変化のｐ値が０．０５未満である、（２）ＥＶ画分のｐ値が全画分よりも小さい（図４）。１７種のｍｉＲＮＡが特定され、全画分と比較したそれらのｐ値、倍率変化、ＡＵＣを表Ｅ２（下記）に示した。

【0327】

【表3】

【0328】

Ｉｎｖｔは、他のポリマーベースの沈殿法と比較して、より有意なｐ値を持つｍｉＲＮＡの数が最も多い。

【0329】

例１６． 結果 － 血清ＥＶはＧＣ診断のためのユニークなｍｉＲＮＡシグネチャーを保有する
上記の結果に基づいて、本発明者らはＩｎｖｔ試薬を選択し、２０人のＧＣ及び２０人の対照からなる別の独立のセットで、これらのＥＶ関連のｍｉＲＮＡバイオマーカーを検証した。

【0330】

全被験者の臨床情報を、表Ｅ３（下記）に示した。

【0331】

【表4】

【0332】

ｍｉＲ－１４０－３ｐ、ｍｉＲ－１４５－５ｐ及びｍｉＲ－１９７－３ｐはＨａｎ試薬で増強されることが判明しただけなので、これらはそれ以上測定しなかった。結果はｇｅＮｏｒｍ及びＮｏｒｍＦｉｎｄｅｒの両方で安定していると判断した５つのｍｉＲＮＡで正規化した（下記の表Ｅ４）。

【0333】

【表5】

【0334】

測定した１４種のｍｉＲＮＡのうち、８種のＥＶ関連ｍｉＲＮＡが癌及び対照の試料で異なる発現をしていることが判明し、探索セットのデータと一致した（図５及び表Ｅ５、下記）。

【0335】

【表6】

【0336】

例１７． 考察
癌細胞により放出された循環ＥＶは、腫瘍微小環境とのコミュニケーション、細胞増殖の促進、及び免疫系の阻害により、癌の生物学においてある役割を果たしていることが広く報告されている［１、１３、２３、３１、３２、３３］。バイオマーカーとしてのＥＶのｍｉＲＮＡの発見を容易にするためには、これらの小胞を迅速に単離し、それらを生体液中で容易に検出する必要がある。面倒で特殊な装置に大きく依存しているＵＣに代わる方法として、いくつかのＥＶ単離法が開発されている。これらの方法には、カラムアフィニティ［３４］、ペプチドアフィニティ［３５］、特定の抗原（例えばＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１又はＥｐＣＡＭ）に対するイムノビーズアフィニティ［３６、３７］、及びポリマーベースの沈殿法［２４、３８、３９、４０］が含まれ、それらは、主に低コスト、ハイスループット、及び必要な試料量の低さ（１００μｌ程度）から、近年、採用されることが増えている。これらの方法は、有望なＥＶのｍｉＲＮＡバイオマーカーの特定に成功裏に使用されている［４、４１、４２、４３、４４、４５、４６］。現在までに、幅広い範囲の方法にわたるＥＶのｍｉＲＮＡの包括的な評価、標準化されたプロセス、及び疾患と対照との間の発現レベルの比較は行われていない［４７］。本研究では、本発明者らは、将来の臨床応用に向けて、ＲＴ－ｑＰＣＲを用いてＥＶ画分中のシグナルが増強されたｍｉＲＮＡを検出するための迅速かつ堅牢なプロセスを開発することを意図して、上記の多くの市販のＥＶ単離法を評価した。

【0337】

まず、ＥＶ画分からＲＮＡを抽出し、一般的に発現している１１種のヒトｍｉＲＮＡの回収率を定量した。今回の結果は、カラムアフィニティベースの方法又はペプチドアフィニティベースの方法によるＥＶ ｍｉＲＮＡの回収率は、ｌｅｔ ７ａ－５ｐを除いてＵＣと同様であることを示した（図１Ａ）。興味深いことに、これらの方法では、タンパク質マーカーのプロファイルが異なるＥＶが生成され、このことは、画分中のＥＶの種類が異なるか、複数の種類のＥＶが集まっていることを示す可能性がある（図１Ｂ）。ＴＳＧ１０１の発現は、カラム－アフィニティ法を用いた場合には存在することが報告されているが［３４］、本発明者らの研究では存在しなかった。この違いの理由は不明である。

【0338】

イムノビーズアフィニティベースの方法を用いても、ｍｉＲＮＡを効率的に定量することができなかった。単離したＥＶに本研究で分析したｍｉＲＮＡが含まれていなかったか、又は単離したＥＶの量が不足していた可能性がある。ＥＶを捕捉するために使用したビーズには、ＣＤ９、ＣＤ６３及びＣＤ８１等のＥＶ表面抗原を認識する抗体が結合されている。これらの抗原は、他の方法を用いて単離したＥＶから容易に検出できるため（図１Ｂ及び図２Ｂ）、今回のプロトコルでは、２００μｌの血清からＥＶを引き出すのにイムノビーズが効率的でなかった可能性が高い。しかしながら、この方法は、細胞培養上清試料及び血漿試料のような他の生体液からＥＶを単離することが示されており、ＲＴ－ｑＰＣＲ分析のためにはるかに多くの入力量を必要とする［３７、４８］。本発明者らは、より大量の血清（最大１０００μｌ）を用いて研究を繰り返したが、検出されたｍｉＲＮＡの量は、アッセイの検出限界に近いか、それ未満であった（データは示していない）。

【0339】

現在、市場には多くのポリマーベースの沈殿試薬があるが、本発明者らは、これらの試薬が同様の性能を持っているかどうか疑問を持った。本発明者らは、４つの沈殿試薬（Ｉｎｖｔ、ＳＢＩ、Ｅｘｉ及びＨａｎ）を比較し、ＥＶのｍｉＲＮＡの回収率及びプロファイルはキットによって異なることを見出した（図２Ａ）。この違いは、使用したポリマー及びバッファの組成の違いに起因する可能性がある。試験した４つの試薬はすべて、ＵＣと比較してｍｉＲＮＡの回収率が高かった。しかしながら、ポリマーベースの沈殿から調製した試料の純度は、より多い量のアルブミン混入の存在から明らかなように、ＵＣには及ばなかった（図２Ｂ）。ウエスタンブロット分析も、４つの沈殿試薬すべてのＥＶ表面マーカーのプロファイルがＵＣとは異なることを明らかにし、これらがＵＣとは異なるＥＶサブタイプを単離した可能性を示唆した。

【0340】

本発明者らは、血清量が少なくても使用できて、ＵＣと同等以上のｍｉＲＮＡ回収率が得られるいくつかのＥＶ単離法を特定した。現在のところ、血清からＥＶを単離するための最良の方法については、一般的な合意はない。本発明者らの目的は、最小限の応答時間で臨床現場に適しており、ハイスループットの目的に容易に組み込むことができる方法を確立し、ＧＣ患者における循環ｍｉＲＮＡの信号対雑音比を改善することであった。これらの基準に基づき、ポリマーベースの沈殿は、ＥＶ関連のｍｉＲＮＡの単離方法として選択した方法であり、この画分が癌と対照の試料間のｍｉＲＮＡの検出を向上させることができるという仮説を検証した。探索セットでは、Ｉｎｖｔ、ＳＢＩ、Ｅｘｉ及びＨａｎの試薬を用いて、１５人のＧＣ及び１５人の対照の血清を単離した。ＥＶ関連画分におけるｍｉＲＮＡの発現レベルを、全血清から単離したｍｉＲＮＡと比較した。プロファイリングした１３３種のｍｉＲＮＡのうち、３０種はＩｎｖｔ、ＳＢＩ、Ｅｘｉ又はＨａｎの試薬を用いて単離した試料の一部で検出できなかった。本発明者らは、Ｈａｎキットで調製した試料のｍｉＲＮＡコピー数が他の試料に比べて非常に少なく、これらの試料では多くのｍｉＲＮＡが検出できないことを見出した。本発明者らは、Ｈａｎで処理した試料からの沈殿したペレットが、Ｉｎｖｔ、ＳＢＩ及びＥｘｉと比較して例外的に小さいことも認めた。本発明者らは、ＨａｎからのＥＶ ｍｉＲＮＡの回収率が低いのは、その試薬が血清からＥＶを単離するのに適していないことによるか、又はＨａｎがＥＶのサブセットを単離するのに有効で、その結果、本研究で検出されたｍｉＲＮＡの濃度が低いのではないかと推測する。このように、Ｈａｎ試薬は、他の３つの試薬と比較して、ＥＶに含まれる明確な一連のｍｉＲＮＡバイオマーカー（ｍｉＲ－１４０－３ｐ、ｍｉＲ－１４５－５ｐ及びｍｉＲ－１９７－３ｐ）を示した。しかし、ＥＶに関連する１７種のｍｉＲＮＡは、４つの沈殿方法のいずれにおいても、全血清と比較して、より有意な倍率変化、ｐ値及びＡＵＣを有することが判明した。

【0341】

本発明者らは、次に、Ｉｎｖｔ試薬を用いて、これら１７種のＥＶ関連ｍｉＲＮＡを、２０個のＧＣ血清及び２０個の対照血清の独立のセットで検証した。今回のデータは、明確な一連の８種類のＥＶ関連ｍｉＲＮＡを明らかにし、これらは全循環ｍｉＲＮＡと比較して、診断の信号対雑音比が大きく向上していることを示した（表Ｅ２）。興味深いことに、ｍｉＲ－４２３－５ｐ、ｍｉＲ－４８４、ｍｉＲ－１４２－５ｐ及びｍｉＲ－１７－５ｐは、胃癌において制御異常になっており［１２、４２、４３、４９］、腫瘍形成／転移に関与している［４１、４４］。

【0342】

要約すれば、今回の結果は、癌と健常な対照との試料の間で発現が異なるｍｉＲＮＡを、全画分でもＥＶ関連画分においても、容易に定量化できることを明らかにした。８つのＥＶ関連のｍｉＲＮＡのパネルは、ＧＣ診断のための現行の循環ｍｉＲＮＡの感度及び特異性を大幅に改善した。ＧＣの腫瘍形成におけるこれらの８種のｍｉＲＮＡの起源、特異的な役割及び機能を解明するためには、さらなる研究が必要である。

【0343】

例１８． 結果：ポリマーベースの沈殿法が最も高いＥＶ－ｍｉＲＮＡ回収率を与えた
全血清からＥＶ－ｍｉＲＮＡを単離するのに適した最良の市販のＥＶ単離方法を特定するために、本発明者らは、ポリマーベースの沈殿法（ＰＢＰ）、カラムアフィニティベースの精製法（ＣＡＰ）、ペプチドアフィニティベースの精製法（ＰＡＰ）、イムノビーズアフィニティベースの精製法（ＩＡＰ）の４つの異なる方法のＥＶ－ｍｉＲＮＡ回収性能を評価した。本発明者らは、臨床現場を想定して、低容量の試料（２００μｌ）を使用した。本発明者らは、ＲＴ－ｑＰＣＲを用いて、全血清とＥＶとに共通して発現している１１種のｍｉＲＮＡの量を測定し、それぞれの方法によるＥＶ－ｍｉＲＮＡの回収率を決定した。

【0344】

対照として、ＵＣは血清中の全ｍｉＲＮＡの４～１５％を回収し、平均回収率は１０％であった（図６Ａ）。このベンチマークと比較すると、ＣＡＰ及びＰＡＰは同等の平均ｍｉＲＮＡを回収したが、ＩＡＰは最小量のｍｉＲＮＡしか回収しなかった（平均回収率は５％未満）。対照的に、ＰＢＰはＵＣと比較して有意に多くのｍｉＲＮＡを回収した。ＰＢＰ試薬はいくつか市販されているので、本発明者らは、これらの試薬を試験して、それらの性能が同等であるかどうかを調べた。本発明者らは、異なる製造業者の４つのＰＢＰ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－Ｉｎｖｔ、Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ－ＳＢＩ、Ｅｘｉｑｏｎ－Ｅｘｉ、及びＨａｎｓａＢｉｏＭｅｄ－Ｈａｎ）を評価し、４つの試薬とも、ＵＣと比較して血清中の全ｍｉＲＮＡの回収率が高い（平均回収率は２０～３０％）（図６Ｂ）ことを見出した。Ｉｎｖｔ及びＳＢＩは同程度のｍｉＲＮＡ回収率を示したが、Ｅｘｉ及びＨａｎはそれぞれ最高及び最低のｍｉＲＮＡ収量を与えた。

【0345】

本発明者らは、次に、いくつかの一般的なＥＶマーカーであるフロチリン、ＴＳＧ１０１、ＣＤ９、ＣＤ６３及びＣＤ８１がＰＢＰで単離した試料の中に存在するかをウエスタンブロット法を用いてアッセイし、すべての試料でこれらのマーカーを検出することができた（図６Ｃ）。これにより、各ＰＢＰ試薬が全血清からＥＶを単離したことが確認された。しかしながら、ＥＶ画分の中に存在する各ＥＶマーカーの量は試薬によって大きく異なり、異なる試薬が異なる量のＥＶ又はＥＶのサブタイプを単離しているがことが示唆された。注目すべきは、Ｈａｎが最もＥＶマーカーの発現量が低く、試験したＰＢＰプロトコルの中でＥＶ－ｍｉＲＮＡの回収量が最も少なかったことと一致していたことである（図６Ｂ、図６Ｃ）。本発明者らは、ＰＢＰで単離したＥＶは、ＵＣと比較してアルブミンの混入が多く、Ｉｎｖｔ及びＳＢＩはアルブミンが最も少ないことも認めた（図６Ｃ）。

【0346】

それゆえ、本発明者らは、ＰＢＰを、全血清からのＥＶ－ｍｉＲＮＡの回収率が最も高い好ましいＥＶ単離法であると特定した。本発明者らはさらに、試験した４種の市販のＰＢＰ試薬はすべて、現在のＥＶ単離のためのゴールドスタンダードであるＵＣと比較して、ＥＶ－ｍｉＲＮＡの回収率性能が高いということを示した。ＰＢＰは、ＥＶ－ｍｉＲＮＡの回収率が高いだけでなく、使いやすさ、比較的低コスト、高い拡張性、必要な試料量の低さ、及び迅速なワークフローを持ち、臨床現場での使用に最も適していることから、本発明者らは、ＰＢＰを後続のＥＶ－ｍｉＲＮＡバイオマーカー探索にも採用した。

【0347】

例１９． 結果：ＧＣ検出用ＥＶ－ｍｉＲＮＡ候補の特定
本発明者らは、次に、４種の市販のＰＢＰ試薬を用いて、１５人のＧＣ及び１５人のマッチした健常な対照から採取した試料の中の血清ＥＶ－ｍｉＲＮＡバイオマーカーを単離し特定した（臨床情報は下記表ＮＳ３に示す）。

【0348】

【表7】

【0349】

これを達成するために、本発明者らは、４つのＰＢＰ試薬を用いて単離した全血清及びＥＶ画分中の１３３種のＧＣ関連ｍｉＲＮＡの量を測定した。３０名の被験者全員の全血清中に１３３種のＧＣ関連ｍｉＲＮＡがすべて検出された。しかしながら、これらのｍｉＲＮＡのうち、４つのＰＢＰ試薬を用いて単離したすべてのＥＶ画分で一貫して検出可能であったのは１０４種だけであった（下記の表ＮＳ４）。それゆえ、本発明者らは、この１０４種のｍｉＲＮＡに着目して後続の解析を行った。

【0350】

【表8】

【0351】

各ＰＢＰ法について、本発明者らは、以下の基準を用いて、血清中の全ｍｉＲＮＡバイオマーカーよりも信号対雑音比が向上した（ＧＣと健常な被験者との間で発現レベルに差がある）有望なＥＶ－ｍｉＲＮＡバイオマーカーを探した：（１）ＧＣ試料と健常な試料との間でＥＶ－ｍｉＲＮＡの有意な発現差があり（潜在的バイオマーカー）、スチューデント（Ｓｔｕｄｅｎｔ）のｔ検定のｐ値が０．０５未満であること、（２）ＥＶ－ｍｉＲＮＡのｐ値が全血清中の同じｍｉＲＮＡのｐ値よりも低いこと（信号対雑音比の向上）（図７Ａ）。これらの基準を用いて、本発明者らは、Ｉｎｖｔ、ＳＢＩ、Ｅｘｉ及びＨａｎを用いて単離したＥＶ－ｍｉＲＮＡのバイオマーカー候補を、それぞれ１１個、５個、５個及び７個特定した（下記表Ｎ１）。

【0352】

【表9】

【0353】

Ｉｎｖｔにより単離された１１個のＥＶ－ｍｉＲＮＡバイオマーカー候補のうち、１０個は血清ｍｉＲＮＡと比較してＧＣ検出精度（ＲＯＣ曲線のＡＵＣ）が高かった（図７Ｂ及び下記表Ｎ２）。

【0354】

【表10】

【0355】

Ｉｎｖｔが最も多くのＥＶ－ｍｉＲＮＡバイオマーカー候補を単離したことから、本発明者らは、この試薬を用いて検証研究を行った。

【0356】

例２０． 結果：血清ＥＶはＧＣ診断のためのユニークなｍｉＲＮＡシグネチャーを保有する
本発明者らは、Ｉｎｖｔ ＰＢＰプロトコルを用いて、２０人のＧＣ及び２０人の健常な対照の別の独立のセットからＥＶ－ｍｉＲＮＡを単離した（臨床情報は下記表ＮＳ５に示す）。

【0357】

【表11】

【0358】

全１１種のＥＶ－ｍｉＲＮＡバイオマーカー候補（表Ｎ１）の発現レベルを、全血清とＥＶ画分とで定量した。ＥＶ－ｍｉＲＮＡバイオマーカーの特定には、同じ基準（ｐ値＜０．０５、ＥＶ ｐ値＜全血清ｐ値）を用いた。本発明者らは、ＥＶの単離によって血清中のｍｉＲＮＡと比較して信号対雑音比が向上した８種類のＥＶ－ｍｉＲＮＡを検証した（図８Ａ及び下記表Ｎ３）。

【0359】

【表12】

【0360】

これらはすべて、血清中のｍｉＲＮＡと比較してＧＣ検出についてのＡＵＣ値が高かった（図８Ｂ及び表Ｎ３）。それゆえ、この８つの検証したＰＢＰで単離したＥＶ－ｍｉＲＮＡバイオマーカーは、血清よりもＥＶ画分で測定した方がＧＣ検出精度が高く、ＡＵＣは０．６２～０．９１であった。

【0361】

例２１． 結果：胃癌の検出のための多変量のｍｉＲＮＡパネル
上記に続いて、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つのｍｉＲＮＡを含む多変量パネルについて、ＧＣ検出のＡＵＣ値を評価した。

【0362】

表Ｎ４は、これらの多変量パネルのＡＵＣ値の中央値（図９のグラフにも示されている）と、各パネルサイズで可能なｍｉＲＮＡの組み合わせで得られた最高から最低までのＡＵＣ値の範囲を示す。

【0363】

８－ｍｉＲＮＡパネルでは、提供した値はＡＵＣ値である（８つのｍｉＲＮＡの組み合わせは１つしか可能ではないため）。

【0364】

【表13】

【0365】

例２２． 考察
癌検出のためのバイオマーカーとしてのＥＶ－ｍｉＲＮＡを発見するためには、ＥＶを迅速に単離し、ＥＶを生体液中で容易に検出することが不可欠である。面倒で特殊な装置に大きく依存しているＵＣに代わる方法として、いくつかのＥＶ単離法が開発されている。これらのＥＶ単離法には、ＣＡＰ^３８、ＰＡＰ^３９、及び特定の抗原（例えばＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１又はＥｐＣＡＭ）を持つＥＶを単離するのに使用されている^{４０、４２}ＩＡＰ^{４０、４１}がある。別のＥＶ単離法であるＰＢＰは、主にその低コスト、ハイスループット能力、及び必要な試料量の低さ（１００μｌ試料程度）^{４３－４５}から、近年、採用されることが増えている。上記のこれらのＥＶ単離法はいずれも、有望なＥＶ－ｍｉＲＮＡバイオマーカーの特定に成功裏に使用されている^{４６－４９}。しかしながら、これまで、ＥＶ－ｍｉＲＮＡの単離方法を系統的かつ包括的に評価した例はなく、ＥＶ－ｍｉＲＮＡ単離の標準化されたプロトコルも存在しない。本研究では、本発明者らは、ＧＣの臨床的検出のために、ＥＶ－ｍｉＲＮＡバイオマーカーを検出するための迅速かつ堅牢なプロセスを開発することを目的として、市販のいくつかのＥＶ単離法を評価した。具体的には、ＥＶ－ｍｉＲＮＡの回収率が高いＥＶ単離法を特定し、この方法を用いてＥＶ－ｍｉＲＮＡを単離することで、循環ｍｉＲＮＡバイオマーカーの信号対雑音比及びＧＣ検出性能が向上するという仮説を検証した。

【0366】

本発明者らは、まず、血清中及び血清から単離したＥＶ画分中に存在する、一般的に発現している１１種のヒトｍｉＲＮＡの量を比較することにより、ＥＶ－ｍｉＲＮＡの回収性能を判定した。本発明者らは、ＣＡＰ及びＰＡＰによるＥＶ－ｍｉＲＮＡの回収率はＵＣと同程度であったのに対し、ＰＢＰは優れた回収性能を有するということを示した。予想外にも、本発明者らは、ＩＡＰを用いると非常に少量のＥＶ－ｍｉＲＮＡしか認めなかった。これは、おそらくはＩＡＰで単離したＥＶに本研究で分析したｍｉＲＮＡが含まれていなかったか、又は本プロトコルで使用した血清が少量（２００μｌ）であったために、単離されるＥＶの量が不十分であったことを示す可能性がある。ＩＡＰはこれまでにも、細胞培養上清試料及び血漿試料等の他の生体液からＥＶを効率的に単離することが示されているが、これらの研究ではＲＴ－ｑＰＣＲ分析のためにはるかに大量の入力量を使用した^{４０、４２}。投入量が少ないためにＩＡＰがＥＶの単離に非効率的であるという可能性を排除するために、より大量の血清（最大１０００μｌ）を用いてＩＡＰ研究を繰り返したところ、ＥＶの回収率は最小限にとどまることが確認された（データは示していない）。そこで、本発明者らは、ＰＢＰに着目した。というのは、ＰＢＰは、試験した方法の中で最良のＥＶ－ｍｉＲＮＡの回収率を示したからである。

【0367】

現在、多くのＰＢＰ試薬が市販されており、本発明者らは、本研究においてそれらの試薬の中から４つの試薬（Ｉｎｖｔ、ＳＢＩ、Ｅｘｉ及びＨａｎ）を評価のために選択した。本発明者らは、ＰＢＰ試薬の違いにより、全血清からのＥＶ－ｍｉＲＮＡの回収率が異なることを見出した。この回収率の違いは、使用したポリマー及びバッファの組成の違いに起因する可能性がある。しかし、試験した４つのＰＢＰプロトコルはすべて、ＵＣと比較してＥＶ－ｍｉＲＮＡの回収率が高かった。しかしながら、Ｅｘｉ及びＨａｎのＰＢＰプロトコルは、より多い量のアルブミン混入の存在から認めることができるように、ＵＣと比較してＥＶの純度が低かった。ウエスタンブロット解析も、４つの沈殿試薬すべてのＥＶ表面マーカーのプロファイルがＵＣとは異なることを明らかにし、これらがＵＣとは異なるＥＶサブタイプを単離した可能性を示唆した。

【0368】

本発明者らは、次に、１５人のＧＣ及び１５人の健常な対照からの血清を用いて、４種のＰＢＰプロトコルを検証した。本発明者らは、合計１３３種のｍｉＲＮＡをプロファイリングし、大部分（１０４種のｍｉＲＮＡ）がすべての４種類のＰＢＰ法で単離したすべてのＥＶで検出されることを見出した。本発明者らは、Ｉｎｖｔ、ＳＢＩ、Ｅｘｉ及びＨａｎを用いて単離したＥＶ－ｍｉＲＮＡバイオマーカー候補を、それぞれ１１個、５個、５個及び７個特定した。Ｉｎｖｔ試薬は、最も多くのＥＶ－ｍｉＲＮＡ候補を与え、これら１１種のうち１０種は、血清中のｍｉＲＮＡと比較して高いＧＣ検出精度（ＡＵＣ）を示した。このように、本発明者らは、ＰＢＰを用いたＥＶの単離はｍｉＲＮＡを濃縮し、ＧＣのｍｉＲＮＡバイオマーカーの性能を向上させることができることを示した。

【0369】

今回のパイロット研究で発見された１１種のＥＶ－ｍｉＲＮＡは、２０個ＧＣ血清及び２０個の対照血清の独立のセットでさらに検証された。これら１１種のＥＶ－ｍｉＲＮＡのうち８種は、全循環ｍｉＲＮＡと比較して診断の信号対雑音比が大きく向上しており、ＰＢＰを用いてＥＶを単離した後のｍｉＲＮＡバイオマーカーの性能が向上することが検証された。これらのｍｉＲＮＡのうち４つ、すなわちｍｉＲ－４２３－５ｐ、ｍｉＲ－４８４、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、及びｍｉＲ－１７－５ｐは、ＧＣにおいて制御異常になっていること、又はＧＣの腫瘍形成／転移に関与していることが示されている^{５０－５５}。

【0370】

要約すれば、本発明者らは、血清中のＥＶ－ｍｉＲＮＡを単離することで、ＧＣのｍｉＲＮＡバイオマーカーの性能が向上することを示した。特に、本発明者らは、Ｉｎｖｔ ＰＢＰプロトコルを、最も多くのＥＶ－ｍｉＲＮＡバイオマーカーを発見するプロトコルとして確立した。この試薬を用いて、本発明者らは、検証セットで有効性が確認された８つのＥＶ－ｍｉＲＮＡ ＧＣバイオマーカーを特定した。今回の研究により、ＥＶ－ｍｉＲＮＡが実際にＧＣの診断マーカーになりうるという概念が証明された。ＧＣの腫瘍形成におけるこれらの８種のｍｉＲＮＡの起源、特異的な役割及び機能を解明するためには、さらなる研究が必要である。

【0371】

参考文献
１． Ｅｓｑｕｅｌａ－Ｋｅｒｓｃｈｅｒ Ａ、Ｓｌａｃｋ ＦＪ． Ｏｎｃｏｍｉｒｓ － ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｗｉｔｈ ａ ｒｏｌｅ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ［Ｒｅｖｉｅｗ Ａｒｔｉｃｌｅ］． Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ． ２００６；６：２５９． ｄｏｉ： １０．１０３８／ｎｒｃ１８４０．
２． Ｌｉｍ ＬＰ、Ｇｌａｓｎｅｒ ＭＥ、Ｙｅｋｔａ Ｓら、Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｇｅｎｅｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２００３；２９９（５６１２）．
３． Ｋｉｓｓ Ｔ． Ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅｏｌａｒ ＲＮＡｓ： ａｎ ａｂｕｎｄａｎｔ ｇｒｏｕｐ ｏｆ ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡｓ ｗｉｔｈ ｄｉｖｅｒｓｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ． Ｃｅｌｌ． ２００２ Ａｐｒ １９；１０９（２）：１４５－８． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： １２００７４００； ｅｎｇ．
４． Ｌｕ Ｍ、Ｚｈａｎｇ Ｑ、Ｄｅｎｇ Ｍら、Ａｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ． ＰＬｏＳ ＯＮＥ． ２００８；３（１０）：ｅ３４２０． ｄｏｉ： １０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００３４２０．
５． Ｇｌｉｎｇｅ Ｃ、Ｃｌａｕｓｓ Ｓ、Ｂｏｄｄｕｍ Ｋら、Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｂｌｏｏｄ－Ｂａｓｅｄ ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ － Ｐｒｅ－Ａｎａｌｙｔｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ． ＰＬｏＳ ＯＮＥ． ２０１７；１２（２）：ｅ０１６７９６９． ｄｏｉ： １０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１６７９６９．
６． Ｊｕｎｇ Ｍ、Ｓｃｈａｅｆｅｒ Ａ、Ｓｔｅｉｎｅｒ Ｉら、Ｒｏｂｕｓｔ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ Ｄｅｇｒａｄｅｄ ＲＮＡ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｓａｍｐｌｅｓ［１０．１３７３／ｃｌｉｎｃｈｅｍ．２００９．１４１５８０］． Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ２０１０；５６（６）：９９８．
７． Ｂｒｅｎｎｅｒ ＡＷ、Ｓｕ ＧＨ、Ｍｏｍｅｎ－Ｈｅｒａｖｉ Ｆ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ． Ｓｕ ＧＨ編． Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｃａｎｃｅｒ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ： Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； ２０１９収録． ２２９－２３７頁．
８． Ｓａｎｚ－Ｒｕｂｉｏ Ｄ、Ｍａｒｔｉｎ－Ｂｕｒｒｉｅｌ Ｉ、Ｇｉｌ Ａら、Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｅｘｏｓｏｍａｌ ｍｉＲＮＡｓ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｓｕｂｊｅｃｔｓ． Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｒｅｐｏｒｔｓ． ２０１８；８（１）：１０３０６－１０３０６． ｄｏｉ： １０．１０３８／ｓ４１５９８－０１８－２８７４８－５． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ２９９８５４６６．
９． Ｚｈｏｕ Ｘ、Ｚｈｕ Ｗ、Ｌｉ Ｈら、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｖａｌｕｅ ｏｆ ａ ｐｌａｓｍａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｉｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ： ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ． ２０１５；５：１１２５１． ｄｏｉ： １０．１０３８／ｓｒｅｐ１１２５１． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ＰＭＣ４４６２０２２．
１０． Ｃｈｅｎ Ｋ－Ｂ、Ｃｈｅｎ Ｊ、Ｊｉｎ Ｘ－Ｌら、Ｅｘｏｓｏｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ． ２０１８；８（６）：５０３－５０９． ｄｏｉ： １０．３８９２／ｂｒ．２０１８．１０８８． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ＰＭＣ５９５４６０３．
１１． Ｔｈｉｎｄ Ａ、Ｗｉｌｓｏｎ Ｃ． Ｅｘｏｓｏｍａｌ ｍｉＲＮＡｓ ａｓ ｃａｎｃｅｒ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ． ２０１６；５：１０．３４０２／ｊｅｖ．ｖ５．３１２９２． ｄｏｉ： １０．３４０２／ｊｅｖ．ｖ５．３１２９２． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ＰＭＣ４９５４８６９．
１２． Ｗａｎｇ Ｍ、Ｇｕ，Ｈ．、Ｗａｎｇ，Ｓ．、Ｑｉａｎ，Ｈ．、Ｚｈｕ，Ｗ．、Ｚｈａｎｇ，Ｌ．、Ｚｈａｏ，Ｃ．、Ｔａｏ，Ｙ．、Ｘｕ，Ｗ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｍｉＲ－１７－５ｐ ａｎｄ ｍｉＲ－２０ａ： Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｒｅｐｏｒｔｓ． ２０１２ ２０１２；５（６）：１５１４－１５２０．
１３． Ｌｉｎ Ｊ、Ｌｉ Ｊ、Ｈｕａｎｇ Ｂら、Ｅｘｏｓｏｍｅｓ： Ｎｏｖｅｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ． Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｗｏｒｌｄ Ｊｏｕｒｎａｌ． ２０１５；２０１５：６５７０８６． ｄｏｉ： １０．１１５５／２０１５／６５７０８６． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ＰＭＣ４３２２８５７．
１４． Ｗｉｌｌｍｓ Ｅ、Ｃａｂａｎａｓ Ｃ、Ｍａｇｅｒ Ｉら、Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅ Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ： Ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ， Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ａｎｄ Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ． Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． ２０１８；９：７３８． ｄｏｉ： １０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１８．００７３８． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ＰＭＣ５９３６７６３．
１５． Ｓｏｈｎ Ｗ、Ｋｉｍ Ｊ、Ｋａｎｇ ＳＨら、Ｓｅｒｕｍ ｅｘｏｓｏｍａｌ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ａｓ ｎｏｖｅｌ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ． ２０１５；４７（９）：ｅ１８４． ｄｏｉ： １０．１０３８／ｅｍｍ．２０１５．６８． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ＰＭＣ４６５０９２８．
１６． Ｃｈｉａｍ Ｋ、Ｗａｎｇ Ｔ、Ｗａｔｓｏｎ ＤＩら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｓｅｒｕｍ Ｅｘｏｓｏｍａｌ ｍｉＲＮＡｓ Ａｓ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｓｕｒｇｅｒｙ． ２０１５ ２０１５／０７／０１；１９（７）：１２０８－１２１５． ｄｏｉ： １０．１００７／ｓ１１６０５－０１５－２８２９－９．
１７． Ｌｉ Ｍ、Ｒａｉ ＡＪ、Ｊｏｅｌ ＤｅＣａｓｔｒｏ Ｇら、Ａｎ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｅｘｏｓｏｍｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｓｅｒｕｍ ｓａｍｐｌｅｓ： Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｃａｎｃｅｒ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ． Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２０１５ ２０１５／１０／０１／；８７（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｃ）：２６－３０． ｄｏｉ： ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｙｍｅｔｈ．２０１５．０３．００９．
１８． Ｏｇａｔａ－Ｋａｗａｔａ Ｈ、Ｉｚｕｍｉｙａ Ｍ、Ｋｕｒｉｏｋａ Ｄら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｅｘｏｓｏｍａｌ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ａｓ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ Ｃｏｌｏｎ Ｃａｎｃｅｒ． ＰＬｏＳ ＯＮＥ． ２０１４；９（４）：ｅ９２９２１． ｄｏｉ： １０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００９２９２１． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ＰＭＣ３９７６２７５．
１９． Ｔａｙｌｏｒ ＤＤ、Ｇｅｒｃｅｌ－Ｔａｙｌｏｒ Ｃ． ＭｉｃｒｏＲＮＡ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ａｓ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ． Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ． ２００８；１１０（１）：１３－２１． ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｙｇｙｎｏ．２００８．０４．０３３．
２０． Ｍａｒｒｕｇｏ－Ｒａｍｉｒｅｚ Ｊ、Ｍｉｒ Ｍ、Ｓａｍｉｔｉｅｒ Ｊ． Ｂｌｏｏｄ－Ｂａｓｅｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｂｉｏｐｓｙ： Ａ Ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ Ｎｏｎ－Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｔｏ Ｔｉｓｓｕｅ Ｂｉｏｐｓｙ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｃｉｅｎｃｅｓ． ２０１８；１９（１０）：２８７７． ｄｏｉ： １０．３３９０／ｉｊｍｓ１９１０２８７７． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ３０２４８９７５．
２１． Ｍｏｍｅｎ－Ｈｅｒａｖｉ Ｆ、Ｇｅｔｔｉｎｇ ＳＪ、Ｍｏｓｃｈｏｓ ＳＡ． Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｆｏｒ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ＆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ． ２０１８ ２０１８／０８／０３／． ｄｏｉ： ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｐｈａｒｍｔｈｅｒａ．２０１８．０８．００２．
２２． Ｆｕｒｉ Ｉ、Ｍｏｍｅｎ－Ｈｅｒａｖｉ Ｆ、Ｓｚａｂｏ Ｇ． Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ： ｐｒｅｓｅｎｔ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ． Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ． ２０１７；５（１２）：２６３． ｄｏｉ： １０．２１０３７／ａｔｍ．２０１７．０３．９５． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ＰＭＣ５４９７１００．
２３． Ｃｏｌｏｍｂｏ Ｍ、Ｒａｐｏｓｏ Ｇ、Ｔｈｅｒｙ Ｃ． Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ， Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ， ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｅｘｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ． Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ． ２０１４ ２０１４／１０／１１；３０（１）：２５５－２８９． ｄｏｉ： １０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ－ｃｅｌｌｂｉｏ－１０１５１２－１２２３２６．
２４． Ｌｉ Ｐ、Ｋａｓｌａｎ Ｍ、Ｌｅｅ ＳＨら、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ． Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ． ２０１７；７（３）：７８９－８０４． ｄｏｉ： １０．７１５０／ｔｈｎｏ．１８１３３． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ２８２５５３６７．
２５． Ｌｉｍ ＬＰ、Ｇｌａｓｎｅｒ ＭＥ、Ｙｅｋｔａ Ｓら、Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ｇｅｎｅｓ［１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１０８０３７２］． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２００３；２９９（５６１２）：１５４０．
２６． Ｃｈｅｎ Ｊ、Ｘｕ Ｙ、Ｌｕ Ｙら、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｖｉｓｉｂｌｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｆｒｏｍ Ｐｌａｓｍａ． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ２０１８ ２０１８／１０／２９． ｄｏｉ： １０．１０２１／ａｃｓ．ａｎａｌｃｈｅｍ．８ｂ０３０３１．
２７． Ｘｕ Ｈ、Ｌｉａｏ Ｃ、Ｚｕｏ Ｐら、Ｍａｇｎｅｔｉｃ－Ｂａｓｅｄ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｄｅｖｉｃｅ ｆｏｒ Ｏｎ－Ｃｈｉｐ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｅｘｏｓｏｍｅｓ． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ２０１８ ２０１８／０９／２０． ｄｏｉ： １０．１０２１／ａｃｓ．ａｎａｌｃｈｅｍ．８ｂ０３２７２．
２８． Ｔｉａｎ Ｙ－Ｆ、Ｎｉｎｇ Ｃ－Ｆ、Ｈｅ Ｆら、Ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｂｙ ＳＥＲＳ ｕｓｉｎｇ ｇｏｌｄ ｎａｎｏｓｔａｒ＠Ｒａｍａｎ ｒｅｐｏｒｔｅｒ＠ｎａｎｏｓｈｅｌｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｂｉｖａｌｅｎｔ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ－ｌａｂｅｌｅｄ ＤＮＡ ａｎｃｈｏｒ［１０．１０３９／Ｃ８ＡＮ０１０４１Ｂ］． Ａｎａｌｙｓｔ． ２０１８；１４３（２０）：４９１５－４９２２． ｄｏｉ： １０．１０３９／Ｃ８ＡＮ０１０４１Ｂ．
２９． Ａｎ Ｍ、Ｗｕ Ｊ、Ｚｈｕ Ｊら、Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ａｎ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｖｅｒｓｕｓ Ｓｉｚｅ－Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｆｏｒ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． ２０１８ ２０１８／１０／０５；１７（１０）：３５９９－３６０５． ｄｏｉ： １０．１０２１／ａｃｓ．ｊｐｒｏｔｅｏｍｅ．８ｂ００４７９．
３０． Ｃｈａｎｇ Ｍ、Ｃｈａｎｇ Ｙ－Ｊ、Ｃｈａｏ ＰＹら、Ｅｘｏｓｏｍｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＰＥＧ－ｃｏａｔｅｄ Ｆｅ３Ｏ４ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ． ＰｌｏＳ ｏｎｅ． ２０１８；１３（６）：ｅ０１９９４３８－ｅ０１９９４３８． ｄｏｉ： １０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１９９４３８． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ２９９３３４０８．
３１． Ｔｈｅｒｙ Ｃ、Ｚｉｔｖｏｇｅｌ Ｌ、Ａｍｉｇｏｒｅｎａ Ｓ． Ｅｘｏｓｏｍｅｓ： ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ， ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ［１０．１０３８／ｎｒｉ８５５］． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００２；２（８）：５６９－５７９．
３２． Ｙｏｓｈｉｋａｗａ Ｍ、Ｉｉｎｕｍａ Ｈ、Ｕｍｅｍｏｔｏ Ｙら、Ｅｘｏｓｏｍｅ－ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｍｉｃｒｏＲＮＡ－２２３－３ｐ ａｓ ａ ｍｉｎｉｍａｌｌｙ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ． Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ． ２０１８；１５（６）：９５８４－９５９２． ｄｏｉ： １０．３８９２／ｏｌ．２０１８．８４５７． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ＰＭＣ５９５８６８９．
３３． Ｘｕ Ｒ、Ｒａｉ Ａ、Ｃｈｅｎ Ｍら、Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ － ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｆｕｔｕｒｅ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｃａｒｅ． Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ． ２０１８ ２０１８／０５／２３． ｄｏｉ： １０．１０３８／ｓ４１５７１－０１８－００３６－９．
３４． Ｅｎｄｅｒｌｅ Ｄ、Ｓｐｉｅｌ Ａ、Ｃｏｔｉｃｃｈｉａ ＣＭら、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ｆｒｏｍ Ｅｘｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ Ｉｓｏｌａｔｅｄ ｂｙ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ－Ｂａｓｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ． ＰＬｏＳ ＯＮＥ． ２０１５；１０（８）：ｅ０１３６１３３． ｄｏｉ： １０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１３６１３３． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ＰＭＣ４５５２７３５．
３５． Ｇｈｏｓｈ Ａ、Ｄａｖｅｙ Ｍ、Ｃｈｕｔｅ ＩＣら、Ｒａｐｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｆｒｏｍ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｆｌｕｉｄｓ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ ｗｉｔｈ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｆｏｒ Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ． ＰＬｏＳ ＯＮＥ． ２０１４；９（１０）：ｅ１１０４４３． ｄｏｉ： １０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１１０４４３． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ＰＭＣ４２０１５５６．
３６． Ｚａｒｏｖｎｉ Ｎ、Ｃｏｒｒａｄｏ Ａ、Ｇｕａｚｚｉ Ｐら、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｘｏｓｏｍｅ ｓｈｕｔｔｌｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｕｓｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｃａｐｔｕｒｅ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２０１５ ２０１５／１０／０１／；８７（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｃ）：４６－５８． ｄｏｉ： ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｙｍｅｔｈ．２０１５．０５．０２８．
３７． Ｔａｕｒｏ ＢＪ、Ｇｒｅｅｎｉｎｇ ＤＷ、Ｍａｔｈｉａｓ ＲＡら、Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ， ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ ｃａｐｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｉｓｏｌａｔｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ＬＩＭ１８６３－ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｘｏｓｏｍｅｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２０１２ ２０１２／０２／０１／；５６（２）：２９３－３０４． ｄｏｉ： ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｙｍｅｔｈ．２０１２．０１．００２．
３８． Ｍａｌｌａ Ｂ、Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ ＤＭ、Ｄａｌ Ｐｒａ Ａ． Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｓｅｒｕｍ ｅｘｏｓｏｍａｌ ｍｉＲＮＡｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ． ２０１８；１６（１）：２２３－２２３． ｄｏｉ： １０．１１８６／ｓ１２９６７－０１８－１５９２－６． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ３０１０３７７１．
３９． Ｎｉｕ Ｚ、Ｐａｎｇ ＲＴＫ、Ｌｉｕ Ｗら、Ｐｏｌｙｍｅｒ－ｂａｓｅｄ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｐｒｅｓｅｒｖｅｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｆｒｏｍ ａｎ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ． ＰＬＯＳ ＯＮＥ． ２０１７；１２（１０）：ｅ０１８６５３４． ｄｏｉ： １０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１８６５３４．
４０． Ｒｉｄｅｒ ＭＡ、Ｈｕｒｗｉｔｚ ＳＮ、Ｍｅｃｋｅｓ Ｊｒ ＤＧ． ＥｘｔｒａＰＥＧ： Ａ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ－Ｂａｓｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ［Ａｒｔｉｃｌｅ］． Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ． ２０１６ ０４／１２／ｏｎｌｉｎｅ；６：２３９７８． ｄｏｉ： １０．１０３８／ｓｒｅｐ２３９７８
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ｓｒｅｐ２３９７８＃ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ－ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．
４１． Ｃｈｅｎ Ｐ、Ｚｈａｏ Ｈ、Ｈｕａｎｇ Ｊら、ＭｉｃｒｏＲＮＡ－１７－５ｐ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ， ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｅａｒｌｙ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ２． Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． ２０１６；６（９）：２０１０－２０２０． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ＰＭＣ５０４３１１０．
４２． Ｚｈａｎｇ Ｘ、Ｙａｎ Ｚ、Ｚｈａｎｇ Ｊら、Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｓａ－ｍｉＲ－３７５ ａｎｄ ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ ａｓ ａ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ ｆｏｒ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ｒｉｓｋ ｉｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ． Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ． ２０１１；２２（１０）：２２５７－２２６６． ｄｏｉ： １０．１０９３／ａｎｎｏｎｃ／ｍｄｑ７５８．
４３． Ｌｉｕ Ｒ、Ｚｈａｎｇ Ｃ、Ｈｕ Ｚら、Ａ ｆｉｖｅ－ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｓｅｒｕｍ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｓｅｒｖｅｓ ａｓ ａ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ ｆｏｒ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ． Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ． ２０１１；４７（５）：７８４－７９１． ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｅｊｃａ．２０１０．１０．０２５．
４４． Ｌｉｕ Ｊ、Ｗａｎｇ Ｘ、Ｙａｎｇ Ｘら、ｍｉＲＮＡ４２３－５ｐ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｒｅｆｏｉｌ ｆａｃｔｏｒ １ ｉｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ． ２０１４；３４７（１）：９８－１０４． ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｃａｎｌｅｔ．２０１４．０１．０２４．
４５． Ｂｕ Ｈ、Ｈｅ Ｄ、Ｈｅ Ｘら、Ｅｘｏｓｏｍｅｓ： ｉｓｏｌａｔｉｏｎ， ａｎａｌｙｓｉｓ， ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｙ． ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ． ２０１８；０（ｊａ）． ｄｏｉ： １０．１００２／ｃｂｉｃ．２０１８００４７０．
４６． Ｋａｌｉｓｈｗａｒａｌａｌ Ｋ、Ｋｗｏｎ ＷＹ、Ｐａｒｋ ＫＳ． Ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｆｏｒ ｎｏｎ－ｉｎｖａｓｉｖｅ ｃａｎｃｅｒ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ． ２０１８；０（ｊａ）：１８００４３０． ｄｏｉ： １０．１００２／ｂｉｏｔ．２０１８００４３０．
４７． Ｋｉｓｓ Ｔ． Ｓｍａｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｌａｒ ＲＮＡｓ． Ｃｅｌｌ． ２００２；１０９（２）：１４５－１４８． ｄｏｉ： １０．１０１６／ｓ００９２－８６７４（０２）００７１８－３．
４８． Ｚａｒｏｖｎｉ Ｎ、Ｃｏｒｒａｄｏ Ａ、Ｇｕａｚｚｉ Ｐら、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｘｏｓｏｍｅ ｓｈｕｔｔｌｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｕｓｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｃａｐｔｕｒｅ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２０１５ Ｏｃｔ １；８７：４６－５８． ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｙｍｅｔｈ．２０１５．０５．０２８． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ２６０４４６４９； ｅｎｇ．
４９． Ｋｉｍ ＣＨ、Ｋｉｍ ＨＫ、Ｒｅｔｔｉｇ ＲＬら、ｍｉＲＮＡ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｏｕｔｃｏｍｅ ｏｆ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ． ＢＭＣ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ． ２０１１；４：７９－７９． ｄｏｉ： １０．１１８６／１７５５－８７９４－４－７９． ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ＰＭＣ３２８７１３９．

【0372】

参考文献（例１８～２１について）
１． Ｈａｙｅｓ Ｊ、Ｐｅｒｕｚｚｉ ＰＰ、Ｌａｗｌｅｒ Ｓ： ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ： ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ， ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１４、２０：４６０－４６９．
２． Ｗａｈｉｄ Ｆ、Ｓｈｅｈｚａｄ Ａ、Ｋｈａｎ Ｔ、Ｋｉｍ ＹＹ： ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ： Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ｍｅｃｈａｎｉｓｍ， ｆｕｎｃｔｉｏｎ， ａｎｄ ｒｅｃｅｎｔ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ． Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ （ＢＢＡ） － Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１０、１８０３：１２３１－１２４３．
３． Ｌｕ Ｍ、Ｚｈａｎｇ Ｑ、Ｄｅｎｇ Ｍ、Ｍｉａｏ Ｊ、Ｇｕｏ Ｙ、Ｇａｏ Ｗ、Ｃｕｉ Ｑ： Ａｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ． ＰＬｏＳ ＯＮＥ ２００８、３：ｅ３４２０．
４． Ｅｓｑｕｅｌａ－Ｋｅｒｓｃｈｅｒ Ａ、Ｓｌａｃｋ ＦＪ： Ｏｎｃｏｍｉｒｓ － ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｗｉｔｈ ａ ｒｏｌｅ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ． Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ ２００６、６：２５９．
５． Ｋｉｓｓ Ｔ： Ｓｍａｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｌａｒ ＲＮＡｓ． Ｃｅｌｌ ２００２、１０９：１４５－１４８．
６． Ｌｉｍ ＬＰ、Ｇｌａｓｎｅｒ ＭＥ、Ｙｅｋｔａ Ｓ、Ｂｕｒｇｅ ＣＢ、Ｂａｒｔｅｌ ＤＰ： Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ｇｅｎｅｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３、２９９：１５４０．
７． Ｊｕｎｇ Ｍ、Ｓｃｈａｅｆｅｒ Ａ、Ｓｔｅｉｎｅｒ Ｉ、Ｋｅｍｐｋｅｎｓｔｅｆｆｅｎ Ｃ、Ｓｔｅｐｈａｎ Ｃ、Ｅｒｂｅｒｓｄｏｂｌｅｒ Ａ、Ｊｕｎｇ Ｋ： Ｒｏｂｕｓｔ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ Ｄｅｇｒａｄｅｄ ＲＮＡ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｓａｍｐｌｅｓ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１０、５６：９９８．
８． Ｇｌｉｎｇｅ Ｃ、Ｃｌａｕｓｓ Ｓ、Ｂｏｄｄｕｍ Ｋ、Ｊａｂｂａｒｉ Ｒ、Ｊａｂｂａｒｉ Ｊ、Ｒｉｓｇａａｒｄ Ｂ、Ｔｏｍｓｉｔｓ Ｐ、Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄ Ｂ、Ｋａａｂ Ｓ、Ｗａｋｉｌｉ Ｒ、Ｊｅｓｐｅｒｓｅｎ Ｔ、Ｔｆｅｌｔ－Ｈａｎｓｅｎ Ｊ： Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｂｌｏｏｄ－Ｂａｓｅｄ ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ － Ｐｒｅ－Ａｎａｌｙｔｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ． ＰＬｏＳ ＯＮＥ ２０１７、１２：ｅ０１６７９６９．
９． Ｓａｎｚ－Ｒｕｂｉｏ Ｄ、Ｍａｒｔｉｎ－Ｂｕｒｒｉｅｌ Ｉ、Ｇｉｌ Ａ、Ｃｕｂｅｒｏ Ｐ、Ｆｏｒｎｅｒ Ｍ、Ｋｈａｌｙｆａ Ａ、Ｍａｒｉｎ ＪＭ： Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｅｘｏｓｏｍａｌ ｍｉＲＮＡｓ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｓｕｂｊｅｃｔｓ． Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１８、８：１０３０６－１０３０６．
１０． Ｕｒａｔａｎｉ Ｒ、Ｔｏｉｙａｍａ Ｙ、Ｋｉｔａｊｉｍａ Ｔ、Ｋａｗａｍｕｒａ Ｍ、Ｈｉｒｏ Ｊ、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｍ、Ｔａｎａｋａ Ｋ、Ｉｎｏｕｅ Ｙ、Ｍｏｈｒｉ Ｙ、Ｍｏｒｉ Ｔ、Ｋａｔｏ Ｔ、Ｇｏｅｌ Ａ、Ｋｕｓｕｎｏｋｉ Ｍ： Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ａｎｄ Ｅｘｏｓｏｍａｌ ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｈｉｇｈ－Ｒｉｓｋ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ａｄｅｎｏｍａｓ． ＰＬｏＳ ＯＮＥ ２０１６、１１：ｅ０１６０７２２．
１１． Ｚｈｏｕ Ｘ、Ｚｈｕ Ｗ、Ｌｉ Ｈ、Ｗｅｎ Ｗ、Ｃｈｅｎｇ Ｗ、Ｗａｎｇ Ｆ、Ｗｕ Ｙ、Ｑｉ Ｌ、Ｆａｎ Ｙ、Ｃｈｅｎ Ｙ、Ｄｉｎｇ Ｙ、Ｘｕ Ｊ、Ｑｉａｎ Ｊ、Ｈｕａｎｇ Ｚ、Ｗａｎｇ Ｔ、Ｚｈｕ Ｄ、Ｓｈｕ Ｙ、Ｌｉｕ Ｐ： Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｖａｌｕｅ ｏｆ ａ ｐｌａｓｍａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｉｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ： ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１５、５：１１２５１．
１２． Ｃｈｅｎ Ｋ－Ｂ、Ｃｈｅｎ Ｊ、Ｊｉｎ Ｘ－Ｌ、Ｈｕａｎｇ Ｙ、Ｓｕ Ｑ－Ｍ、Ｃｈｅｎ Ｌ： Ｅｘｏｓｏｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１８、８：５０３－５０９．
１３． Ｔｈｉｎｄ Ａ、Ｗｉｌｓｏｎ Ｃ： Ｅｘｏｓｏｍａｌ ｍｉＲＮＡｓ ａｓ ｃａｎｃｅｒ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ２０１６、５：１０．３４０２／ｊｅｖ．ｖ３４０５．３１２９２．
１４． Ｔｈｅｒｙ Ｃ、Ｚｉｔｖｏｇｅｌ Ｌ、Ａｍｉｇｏｒｅｎａ Ｓ： Ｅｘｏｓｏｍｅｓ： ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ， ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００２、２：５６９－５７９．
１５． Ｌｉｎ Ｊ、Ｌｉ Ｊ、Ｈｕａｎｇ Ｂ、Ｌｉｕ Ｊ、Ｃｈｅｎ Ｘ、Ｃｈｅｎ Ｘ－Ｍ、Ｘｕ Ｙ－Ｍ、Ｈｕａｎｇ Ｌ－Ｆ、Ｗａｎｇ Ｘ－Ｚ： Ｅｘｏｓｏｍｅｓ： Ｎｏｖｅｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ． Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｗｏｒｌｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ２０１５、２０１５：６５７０８６．
１６． Ｘｕ Ｒ、Ｒａｉ Ａ、Ｃｈｅｎ Ｍ、Ｓｕｗａｋｕｌｓｉｒｉ Ｗ、Ｇｒｅｅｎｉｎｇ ＤＷ、Ｓｉｍｐｓｏｎ ＲＪ： Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ － ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｆｕｔｕｒｅ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｃａｒｅ． Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２０１８．
１７． Ｗｕ Ｈ－Ｈ、Ｌｉｎ Ｗ－ｃ、Ｔｓａｉ Ｋ－Ｗ： Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ： ｍｉＲＮＡｓ ａｓ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｎｏｖｅｌ ｃａｎｃｅｒ ｍａｒｋｅｒｓ． Ｅｘｐｅｒｔ ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１６：ｅ１－ｅ１．
１８． Ｍａｒｒｕｇｏ－Ｒａｍｉｒｅｚ Ｊ、Ｍｉｒ Ｍ、Ｓａｍｉｔｉｅｒ Ｊ： Ｂｌｏｏｄ－Ｂａｓｅｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｂｉｏｐｓｙ： Ａ Ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ Ｎｏｎ－Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｔｏ Ｔｉｓｓｕｅ Ｂｉｏｐｓｙ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１８、１９：２８７７．
１９． Ｏｇａｔａ－Ｋａｗａｔａ Ｈ、Ｉｚｕｍｉｙａ Ｍ、Ｋｕｒｉｏｋａ Ｄ、Ｈｏｎｍａ Ｙ、Ｙａｍａｄａ Ｙ、Ｆｕｒｕｔａ Ｋ、Ｇｕｎｊｉ Ｔ、Ｏｈｔａ Ｈ、Ｏｋａｍｏｔｏ Ｈ、Ｓｏｎｏｄａ Ｈ、Ｗａｔａｎａｂｅ Ｍ、Ｎａｋａｇａｍａ Ｈ、Ｙｏｋｏｔａ Ｊ、Ｋｏｈｎｏ Ｔ、Ｔｓｕｃｈｉｙａ Ｎ： Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｅｘｏｓｏｍａｌ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ａｓ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ Ｃｏｌｏｎ Ｃａｎｃｅｒ． ＰＬｏＳ ＯＮＥ ２０１４、９：ｅ９２９２１．
２０． Ｃｈｉａｍ Ｋ、Ｗａｎｇ Ｔ、Ｗａｔｓｏｎ ＤＩ、Ｍａｙｎｅ ＧＣ、Ｉｒｖｉｎｅ ＴＳ、Ｂｒｉｇｈｔ Ｔ、Ｓｍｉｔｈ Ｌ、Ｗｈｉｔｅ ＩＡ、Ｂｏｗｅｎ ＪＭ、Ｋｅｅｆｅ Ｄ、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＳＫ、Ｊｏｎｅｓ ＭＥ、Ｈｕｓｓｅｙ ＤＪ： Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｓｅｒｕｍ Ｅｘｏｓｏｍａｌ ｍｉＲＮＡｓ Ａｓ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｓｕｒｇｅｒｙ ２０１５、１９：１２０８－１２１５．
２１． Ｍｏｍｅｎ－Ｈｅｒａｖｉ Ｆ、Ｇｅｔｔｉｎｇ ＳＪ、Ｍｏｓｃｈｏｓ ＳＡ： Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｆｏｒ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ＆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２０１８．
２２． Ｔａｙｌｏｒ ＤＤ、Ｇｅｒｃｅｌ－Ｔａｙｌｏｒ Ｃ： ＭｉｃｒｏＲＮＡ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ａｓ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ． Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２００８、１１０：１３－２１．
２３． Ｌｉ Ｍ、Ｒａｉ ＡＪ、Ｊｏｅｌ ＤｅＣａｓｔｒｏ Ｇ、Ｚｅｒｉｎｇｅｒ Ｅ、Ｂａｒｔａ Ｔ、Ｍａｇｄａｌｅｎｏ Ｓ、Ｓｅｔｔｅｒｑｕｉｓｔ Ｒ、Ｖｌａｓｓｏｖ ＡＶ： Ａｎ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｅｘｏｓｏｍｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｓｅｒｕｍ ｓａｍｐｌｅｓ： Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｃａｎｃｅｒ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１５、８７：２６－３０．
２４． Ｓｏｈｎ Ｗ、Ｋｉｍ Ｊ、Ｋａｎｇ ＳＨ、Ｙａｎｇ ＳＲ、Ｃｈｏ Ｊ－Ｙ、Ｃｈｏ ＨＣ、Ｓｈｉｍ ＳＧ、Ｐａｉｋ Ｙ－Ｈ： Ｓｅｒｕｍ ｅｘｏｓｏｍａｌ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ａｓ ｎｏｖｅｌ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１５、４７：ｅ１８４．
２５． Ｂｒｅｎｎｅｒ ＡＷ、Ｓｕ ＧＨ、Ｍｏｍｅｎ－Ｈｅｒａｖｉ Ｆ： Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ． Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｃａｎｃｅｒ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ． Ｓｕ ＧＨ編． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ： Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２０１９． ２２９－２３７頁．
２６． Ｃｏｌｏｍｂｏ Ｍ、Ｒａｐｏｓｏ Ｇ、Ｔｈｅｒｙ Ｃ： Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ， Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ， ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｅｘｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ． Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１４、３０：２５５－２８９．
２７． Ｗｉｌｌｍｓ Ｅ、Ｃａｂａｎａｓ Ｃ、Ｍａｇｅｒ Ｉ、Ｗｏｏｄ ＭＪＡ、Ｖａｄｅｒ Ｐ： Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅ Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ： Ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ， Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ａｎｄ Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ． Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１８、９：７３８．
２８． Ｆｕｒｉ Ｉ、Ｍｏｍｅｎ－Ｈｅｒａｖｉ Ｆ、Ｓｚａｂｏ Ｇ： Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ： ｐｒｅｓｅｎｔ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ． Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１７、５：２６３－２６３．
２９． Ｌｉ Ｐ、Ｋａｓｌａｎ Ｍ、Ｌｅｅ ＳＨ、Ｙａｏ Ｊ、Ｇａｏ Ｚ： Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ． Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ ２０１７、７：７８９－８０４．
３０． Ａｎ Ｍ、Ｗｕ Ｊ、Ｚｈｕ Ｊ、Ｌｕｂｍａｎ ＤＭ： Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ａｎ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｖｅｒｓｕｓ Ｓｉｚｅ－Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｆｏｒ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１８、１７：３５９９－３６０５．
３１． Ｔｉａｎ Ｙ－Ｆ、Ｎｉｎｇ Ｃ－Ｆ、Ｈｅ Ｆ、Ｙｉｎ Ｂ－Ｃ、Ｙｅ Ｂ－Ｃ： Ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｂｙ ＳＥＲＳ ｕｓｉｎｇ ｇｏｌｄ ｎａｎｏｓｔａｒ＠Ｒａｍａｎ ｒｅｐｏｒｔｅｒ＠ｎａｎｏｓｈｅｌｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｂｉｖａｌｅｎｔ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ－ｌａｂｅｌｅｄ ＤＮＡ ａｎｃｈｏｒ． Ａｎａｌｙｓｔ ２０１８、１４３：４９１５－４９２２．
３２． Ｃｈｅｎ Ｊ、Ｘｕ Ｙ、Ｌｕ Ｙ、Ｘｉｎｇ Ｗ： Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｖｉｓｉｂｌｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｆｒｏｍ Ｐｌａｓｍａ． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１８．
３３． Ｘｕ Ｈ、Ｌｉａｏ Ｃ、Ｚｕｏ Ｐ、Ｌｉｕ Ｚ、Ｙｅ Ｂ－Ｃ： Ｍａｇｎｅｔｉｃ－Ｂａｓｅｄ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｄｅｖｉｃｅ ｆｏｒ Ｏｎ－Ｃｈｉｐ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｅｘｏｓｏｍｅｓ． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１８．
３４． Ｃｈａｎｇ Ｍ、Ｃｈａｎｇ Ｙ－Ｊ、Ｃｈａｏ ＰＹ、Ｙｕ Ｑ： Ｅｘｏｓｏｍｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＰＥＧ－ｃｏａｔｅｄ Ｆｅ３Ｏ４ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ． ＰｌｏＳ ｏｎｅ ２０１８、１３：ｅ０１９９４３８－ｅ０１９９４３８．
３５． Ｂａｒａｎｙａｉ Ｔ、Ｈｅｒｃｚｅｇ Ｋ、Ｏｎｏｄｉ Ｚ、Ｖｏｓｚｋａ Ｉ、Ｍｏｄｏｓ Ｋ、Ｍａｒｔｏｎ Ｎ、Ｎａｇｙ Ｇ、Ｍａｇｅｒ Ｉ、Ｗｏｏｄ ＭＪ、Ｅｌ Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ Ｓ、Ｐａｌｉｎｋａｓ Ｚ、Ｋｕｍａｒ Ｖ、Ｎａｇｙ Ｐ、Ｋｉｔｔｅｌ Ａ、Ｂｕｚａｓ ＥＩ、Ｆｅｒｄｉｎａｎｄｙ Ｐ、Ｇｉｒｉｃｚ Ｚ： Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｆｒｏｍ Ｂｌｏｏｄ Ｐｌａｓｍａ： Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ ａｎｄ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｉｚｅ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ＰＬｏＳ ＯＮＥ ２０１５、１０：ｅ０１４５６８６．
３６． Ｇｒｅｅｎｉｎｇ ＤＷ、Ｘｕ Ｒ、Ｊｉ Ｈ、Ｔａｕｒｏ ＢＪ、Ｓｉｍｐｓｏｎ ＲＪ： Ａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ： Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ， Ｄｅｎｓｉｔｙ－Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ， ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ． Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ． Ｐｏｓｃｈ Ａ編． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ： Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２０１５． ｐｐ． １７９－２０９．
３７． Ｗｏｎｇ ＬＬ、Ｚｏｕ Ｒ、Ｚｈｏｕ Ｌ、Ｌｉｍ ＪＹ、Ｐｈｕａ ＤＣＹ、Ｌｉｕ Ｃ、Ｃｈｏｎｇ ＪＰＣ、Ｎｇ ＪＹＸ、Ｌｉｅｗ ＯＷ、Ｃｈａｎ ＳＰ、Ｃｈｅｎ Ｙ－Ｔ、Ｃｈａｎ ＭＭＹ、Ｙｅｏ ＰＳＤ、Ｎｇ ＴＰ、Ｌｉｎｇ ＬＨ、Ｓｉｍ Ｄ、Ｌｅｏｎｇ ＫＴＧ、Ｏｎｇ ＨＹ、Ｊａｕｆｅｅｒａｌｌｙ Ｆ、Ｗｏｎｇ Ｒ、Ｃｈａｉ Ｐ、Ｌｏｗ ＡＦ、Ｌｕｎｄ Ｍ、Ｄｅｖｌｉｎ Ｇ、Ｔｒｏｕｇｈｔｏｎ Ｒ、Ｃａｍｅｒｏｎ ＶＡ、Ｄｏｕｇｈｔｙ ＲＮ、Ｌａｍ ＣＳＰ、Ｔｏｏ ＨＰ、Ｒｉｃｈａｒｄｓ ＡＭ： Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ＭｉｃｒｏＲＮＡ ａｎｄ ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ ｔｏ Ｄｅｔｅｃｔ ａｎｄ Ｃａｔｅｇｏｒｉｚｅ Ｈｅａｒｔ Ｆａｉｌｕｒｅ Ｓｕｂｔｙｐｅｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ ２０１９、７３：１３００－１３１３．
３８． Ｅｎｄｅｒｌｅ Ｄ、Ｓｐｉｅｌ Ａ、Ｃｏｔｉｃｃｈｉａ ＣＭ、Ｂｅｒｇｈｏｆｆ Ｅ、Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｒ、Ｓｃｈｌｕｍｐｂｅｒｇｅｒ Ｍ、Ｓｐｒｅｎｇｅｒ－Ｈａｕｓｓｅｌｓ Ｍ、Ｓｈａｆｆｅｒ ＪＭ、Ｌａｄｅｒ Ｅ、Ｓｋｏｇ Ｊ、Ｎｏｅｒｈｏｌｍ Ｍ： Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ｆｒｏｍ Ｅｘｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ Ｉｓｏｌａｔｅｄ ｂｙ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ－Ｂａｓｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ． ＰＬｏＳ ＯＮＥ ２０１５、１０：ｅ０１３６１３３．
３９． Ｇｈｏｓｈ Ａ、Ｄａｖｅｙ Ｍ、Ｃｈｕｔｅ ＩＣ、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ＳＧ、Ｌｅｗｉｓ Ｓ、Ｃｈａｃｋｏ Ｓ、Ｂａｒｎｅｔｔ Ｄ、Ｃｒａｐｏｕｌｅｔ Ｎ、Ｆｏｕｒｎｉｅｒ Ｓ、Ｊｏｙ Ａ、Ｃａｉｓｓｉｅ ＭＣ、Ｆｅｒｇｕｓｏｎ ＡＤ、Ｄａｉｇｌｅ Ｍ、Ｍｅｌｉ ＭＶ、Ｌｅｗｉｓ ＳＭ、Ｏｕｅｌｌｅｔｔｅ ＲＪ： Ｒａｐｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｆｒｏｍ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｆｌｕｉｄｓ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ ｗｉｔｈ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｆｏｒ Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ． ＰＬｏＳ ＯＮＥ ２０１４、９：ｅ１１０４４３．
４０． Ｚａｒｏｖｎｉ Ｎ、Ｃｏｒｒａｄｏ Ａ、Ｇｕａｚｚｉ Ｐ、Ｚｏｃｃｏ Ｄ、Ｌａｒｉ Ｅ、Ｒａｄａｎｏ Ｇ、Ｍｕｈｈｉｎａ Ｊ、Ｆｏｎｄｅｌｌｉ Ｃ、Ｇａｖｒｉｌｏｖａ Ｊ、Ｃｈｉｅｓｉ Ａ： Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｘｏｓｏｍｅ ｓｈｕｔｔｌｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｕｓｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｃａｐｔｕｒｅ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１５、８７：４６－５８．
４１． Ｓｈａｒｍａ Ｐ、Ｌｕｄｗｉｇ Ｓ、Ｍｕｌｌｅｒ Ｌ、Ｈｏｎｇ ＣＳ、Ｋｉｒｋｗｏｏｄ ＪＭ、Ｆｅｒｒｏｎｅ Ｓ、Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅ ＴＬ： Ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ－ｂａｓｅｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｆｒｏｍ ｐｌａｓｍａ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｌａｎｏｍａ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ２０１８、７：１４３５１３８－１４３５１３８．
４２． Ｔａｕｒｏ ＢＪ、Ｇｒｅｅｎｉｎｇ ＤＷ、Ｍａｔｈｉａｓ ＲＡ、Ｊｉ Ｈ、Ｍａｔｈｉｖａｎａｎ Ｓ、Ｓｃｏｔｔ ＡＭ、Ｓｉｍｐｓｏｎ ＲＪ： Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ， ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ ｃａｐｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｉｓｏｌａｔｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ＬＩＭ１８６３－ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｘｏｓｏｍｅｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１２、５６：２９３－３０４．
４３． Ｒｉｄｅｒ ＭＡ、Ｈｕｒｗｉｔｚ ＳＮ、Ｍｅｃｋｅｓ Ｊｒ ＤＧ： ＥｘｔｒａＰＥＧ： Ａ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ－Ｂａｓｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ． Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１６、６：２３９７８．
４４． Ｎｉｕ Ｚ、Ｐａｎｇ ＲＴＫ、Ｌｉｕ Ｗ、Ｌｉ Ｑ、Ｃｈｅｎｇ Ｒ、Ｙｅｕｎｇ ＷＳＢ： Ｐｏｌｙｍｅｒ－ｂａｓｅｄ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｐｒｅｓｅｒｖｅｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｆｒｏｍ ａｎ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ． ＰＬＯＳ ＯＮＥ ２０１７、１２：ｅ０１８６５３４．
４５． Ｍａｌｌａ Ｂ、Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ ＤＭ、Ｄａｌ Ｐｒａ Ａ： Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｓｅｒｕｍ ｅｘｏｓｏｍａｌ ｍｉＲＮＡｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１８、１６：２２３－２２３．
４６． Ｋａｌｉｓｈｗａｒａｌａｌ Ｋ、Ｋｗｏｎ ＷＹ、Ｐａｒｋ ＫＳ： Ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｆｏｒ ｎｏｎ－ｉｎｖａｓｉｖｅ ｃａｎｃｅｒ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ２０１８、０：１８００４３０．
４７． Ｂｕ Ｈ、Ｈｅ Ｄ、Ｈｅ Ｘ、Ｗａｎｇ Ｋ： Ｅｘｏｓｏｍｅｓ： ｉｓｏｌａｔｉｏｎ， ａｎａｌｙｓｉｓ， ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｙ． ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ２０１８、０．
４８． Ｎｅｄａｅｉｎｉａ Ｒ、Ｍａｎｉａｎ Ｍ、Ｊａｚａｙｅｒｉ ＭＨ、Ｒａｎｊｂａｒ Ｍ、Ｓａｌｅｈｉ Ｒ、Ｓｈａｒｉｆｉ Ｍ、Ｍｏｈａｇｈｅｇｈ Ｆ、Ｇｏｌｉ Ｍ、Ｊａｈｅｄｎｉａ ＳＨ、Ａｖａｎ Ａ、Ｇｈａｙｏｕｒ－Ｍｏｂａｒｈａｎ Ｍ： Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ ｅｘｏｓｏｍａｌ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ａｓ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｃａｎｃｅｒ． Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１６、２４：４８．
４９． Ｘｉｅ ＪＸ、Ｆａｎ Ｘ、Ｄｒｕｍｍｏｎｄ ＣＡ、Ｍａｊｕｍｄｅｒ Ｒ、Ｘｉｅ Ｙ、Ｃｈｅｎ Ｔ、Ｌｉｕ Ｌ、Ｈａｌｌｅｒ ＳＴ、Ｂｒｅｗｓｔｅｒ ＰＳ、Ｄｗｏｒｋｉｎ ＬＤ、Ｃｏｏｐｅｒ ＣＪ、Ｔｉａｎ Ｊ： ＭｉｃｒｏＲＮＡ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｉｎ ｋｉｄｎｅｙ ｄｉｓｅａｓｅ： Ｐｌａｓｍａ ｖｅｒｓｕｓ ｐｌａｓｍａ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｘｏｓｏｍｅｓ． Ｇｅｎｅ ２０１７、６２７：１－８．
５０． Ｗａｎｇ Ｍ、Ｇｕ，Ｈ．、Ｗａｎｇ，Ｓ．、Ｑｉａｎ，Ｈ．、Ｚｈｕ，Ｗ．、Ｚｈａｎｇ，Ｌ．、Ｚｈａｏ，Ｃ．、Ｔａｏ，Ｙ．、Ｘｕ，Ｗ： Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｍｉＲ－１７－５ｐ ａｎｄ ｍｉＲ－２０ａ： Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１２、５：１５１４－１５２０．
５１． Ｚｈａｎｇ Ｘ、Ｙａｎ Ｚ、Ｚｈａｎｇ Ｊ、Ｇｏｎｇ Ｌ、Ｌｉ Ｗ、Ｃｕｉ Ｊ、Ｌｉｕ Ｙ、Ｇａｏ Ｚ、Ｌｉ Ｊ、Ｓｈｅｎ Ｌ、Ｌｕ Ｙ： Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｓａ－ｍｉＲ－３７５ ａｎｄ ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ ａｓ ａ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ ｆｏｒ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ｒｉｓｋ ｉｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ． Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２０１１、２２：２２５７－２２６６．
５２． Ｌｉｕ Ｒ、Ｚｈａｎｇ Ｃ、Ｈｕ Ｚ、Ｌｉ Ｇ、Ｗａｎｇ Ｃ、Ｙａｎｇ Ｃ、Ｈｕａｎｇ Ｄ、Ｃｈｅｎ Ｘ、Ｚｈａｎｇ Ｈ、Ｚｈｕａｎｇ Ｒ、Ｄｅｎｇ Ｔ、Ｌｉｕ Ｈ、Ｙｉｎ Ｊ、Ｗａｎｇ Ｓ、Ｚｅｎ Ｋ、Ｂａ Ｙ、Ｚｈａｎｇ Ｃ－Ｙ： Ａ ｆｉｖｅ－ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｓｅｒｕｍ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｓｅｒｖｅｓ ａｓ ａ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ ｆｏｒ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ． Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ２０１１、４７：７８４－７９１．
５３． Ｌｉｕ Ｊ、Ｗａｎｇ Ｘ、Ｙａｎｇ Ｘ、Ｌｉｕ Ｙ、Ｓｈｉ Ｙ、Ｒｅｎ Ｊ、Ｇｕｌｅｎｇ Ｂ： ｍｉＲＮＡ４２３－５ｐ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｒｅｆｏｉｌ ｆａｃｔｏｒ １ ｉｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２０１４、３４７：９８－１０４．
５４． Ｋｉｍ ＣＨ、Ｋｉｍ ＨＫ、Ｒｅｔｔｉｇ ＲＬ、Ｋｉｍ Ｊ、Ｌｅｅ ＥＴ、Ａｐｒｅｌｉｋｏｖａ Ｏ、Ｃｈｏｉ ＩＪ、Ｍｕｎｒｏｅ ＤＪ、Ｇｒｅｅｎ ＪＥ： ｍｉＲＮＡ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｏｕｔｃｏｍｅ ｏｆ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ． ＢＭＣ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２０１１、４：７９－７９．
５５． Ｃｈｅｎ Ｐ、Ｚｈａｏ Ｈ、Ｈｕａｎｇ Ｊ、Ｙａｎ Ｘ、Ｚｈａｎｇ Ｙ、Ｇａｏ Ｙ： ＭｉｃｒｏＲＮＡ－１７－５ｐ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ， ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｅａｒｌｙ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ２． Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１６、６：２０１０－２０２０．

【0373】

本明細書及び特許請求の範囲において、動詞「ｔｏ ｃｏｍｐｒｉｓｅ（…を含む）」及びその活用形は、その単語に続く項目は含まれるが、特に言及されていない項目は除外されないという意味で、非限定的に使用されている。加えて、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による要素の言及は、文脈上、要素が１つだけであることが明確に要求されない限り、複数の要素が存在する可能性を排除しない。従って、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。

【0374】

本明細書に記載されている各出願及び特許、並びに上記各出願及び特許の手続中を含めて上記各出願及び特許で引用又は参照されている各文書（「出願引用文書」）、並びに各出願及び特許並びに出願引用文書のいずれかで引用若しくは言及されているすべての製品の製造業者の説明書又はカタログは、参照により本明細書に組み込まれる。さらには、本明細書で引用されているすべての文書、本明細書で引用されている文書で引用又は参照されているすべての文書、及び本明細書で引用若しくは言及されているすべての製品の製造業者の説明書又はカタログは、参照により本明細書に組み込まれる。

【0375】

本発明の記載された方法及びシステムの様々な改変例及び変形例は、本発明の範囲及び趣旨から逸脱しない範囲で当業者に明らかになるであろう。本発明を特定の好ましい実施形態に関連して説明してきたが、請求項に係る発明がそのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことを理解すべきである。実際、分子生物学又は関連分野の当業者にとって明らかな、本発明を実施するための記述された態様の様々な改変例が、特許請求の範囲に含まれることが意図されている。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】