特許 7512290 抗ＴＩＧＩＴ抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-06-28

(45)【発行日】2024-07-08

(54)【発明の名称】抗ＴＩＧＩＴ抗体

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20240701BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240701BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240701BHJP

【ＦＩ】

A61K39/395 N ZNA

A61P35/00

A61K39/395 U

A61P43/00 121

【請求項の数】 4

(21)【出願番号】P 2021539418

(86)(22)【出願日】2020-01-07

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-25

(86)【国際出願番号】 EP2020050203

(87)【国際公開番号】W WO2020144178

(87)【国際公開日】2020-07-16

【審査請求日】2023-01-06

(31)【優先権主張番号】62/789,466

(32)【優先日】2019-01-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】520029974

【氏名又は名称】アイテオス ベルジャム エスエイ

(74)【代理人】

【識別番号】100120031

【弁理士】

【氏名又は名称】宮嶋 学

(74)【代理人】

【識別番号】100120617

【弁理士】

【氏名又は名称】浅野 真理

(74)【代理人】

【識別番号】100126099

【弁理士】

【氏名又は名称】反町 洋

(72)【発明者】

【氏名】フーフド キャスリーン

(72)【発明者】

【氏名】ドリーセン グレゴリー

(72)【発明者】

【氏名】クエンド ジュリア

【審査官】柴原 直司

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１６／１０６３０２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１７／０５３７４８（ＷＯ，Ａ２）

【文献】国際公開第２０１６／１９１６４３（ＷＯ，Ａ２）

【文献】国際公開第２０１７／０３０８２３（ＷＯ，Ａ２）

【文献】Cancer Cell，2014年，26, [6]，p.923-937

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ｃ０７Ｋ １６／００－１６／４６

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

がんの治療のための、ヒトＴＩＧＩＴに結合する抗体またはその抗原結合断片を含んでなる医薬組成物であって、
前記がんが肝細胞癌腫、膵臓癌腫、肺癌腫、及びセザリー症候群から選択され、
前記抗体または抗原結合断片が、
配列番号１６を含む重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、配列番号１７を含む重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、配列番号１８を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む重鎖可変ドメイン、ならびに
配列番号６１を含む軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、配列番号６２を含む軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、及び配列番号６３を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む軽鎖可変ドメイン
を含む、医薬組成物。

【請求項2】

前記抗体またはその抗原結合断片が、
配列番号２２１のアミノ酸配列、またはこれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列を有する、重鎖可変ドメイン
を含み、且つ任意で、
配列番号２２２のアミノ酸配列、またはこれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列を有する、軽鎖可変ドメイン
を含む、
請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

前記抗体またはその抗原結合断片が、
配列番号２１９のアミノ酸配列、またはこれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列を有する、重鎖可変ドメイン
を含み、且つ任意で、
配列番号２２０のアミノ酸配列、またはこれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列を有する、軽鎖可変ドメイン
を含む、
請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項4】

抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗４１ＢＢ抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、及び抗ＩＣＯＳ抗体のうちの１つ以上と組み合わせて使用される、請求項１～３のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

背景
がん免疫療法は腫瘍に対する認識及び応答を高める免疫系の調節に依存する。そのような調節は、免疫細胞上に存在する共刺激分子の活性化を含む、または共抑制性受容体の阻害を介した複数のメカニズムによって達成することができる。免疫応答の活性化は、抗原特異的応答の開始に重要な抗原提示細胞及び腫瘍細胞の破壊に関与するエフェクター細胞のような多数の細胞集団が関与する複雑なメカニズムである。細胞傷害性Ｔ細胞のようなエフェクター細胞の活性化を調節するメカニズムは多数であり、がん免疫療法の文脈では選択の標的を表す。

【0002】

ＴＩＧＩＴ（ＩｇドメインとＩＴＩＭドメインを持つＴ細胞免疫受容体）は、ＷＵＣＡＭ、ＶＳＩＧ９またはＶｓｔｍ３とも呼ばれ、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞と同様に抑制性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞または単に「Ｔｒｅｇ」）にて優先的に発現される共抑制性受容体である。ＴＩＧＩＴは、その細胞内部分における既知のＩＴＩＭドメインと膜貫通ドメインと受容体の細胞外部における免疫グロブリン可変ドメインとを含有する膜貫通タンパク質である。いくつかのリガンドがＴＩＧＩＴ受容体に結合すると記載されており、ＣＤ１５５／ＰＶＲが最良の親和性を示し、ＣＤ１１３／ＰＶＲＬ３及びＣＤ１１２／ＰＶＲＬ２がその後に続く（Ｙｕ，ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：４８（非特許文献１））。ＮＫ細胞及びＴ細胞にて発現される既知の共刺激受容体であるＤＮＡＭ／ＣＤ２２６はＣＤ１５５及びＣＤ１１２の結合についてＴＩＧＩＴと競合するが、親和性が低く、それはＣＤ１５５リガンドを発現している正常細胞に対する制御されない細胞傷害を回避するためのこれらエフェクター細胞の活性化の厳しい制御を示唆している。

【0003】

ＴＩＧＩＴの発現は腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）及びＨＩＶ感染症のような疾患状況で高められる。ＴＩＧＩＴの発現は、ＴＩＧＩＴ陰性の対応する細胞と比べて低いエフェクター機能を有する疲弊Ｔ細胞を特徴付ける（Ｋｕｒｔｕｌｕｓ，ｅｔ ａｌ．（２０１５），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２７６：１１２（非特許文献２）；Ｃｈｅｗ，ｅｔ ａｌ．（２０１６），Ｐｌｏｓ．Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ．１２（非特許文献３））。逆に、ＴＩＧＩＴを発現しているＴｒｅｇ細胞はＴＩＧＩＴ陰性のＴｒｅｇ集団に比べて増強された免疫抑制活性を示す（Ｊｏｌｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２０１４），Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．４０：５６９（非特許文献４））。

【0004】

免疫療法について関連する標的であることが判明している、且つそれについてアンタゴニスト抗体がヒトのがんの治療のために認可されている、Ｔ細胞上で発現される他の共抑制性受容体（ＰＤ１またはＣＴＬＡ４）のように、アンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴ抗体の開発は免疫系のスイッチを入れ、がん細胞と良好に戦うのに役立ってもよい。単剤療法または抗ＰＤ１抗体との組み合わせにおけるアンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴ抗体は前臨床モデルにて強力な抗腫瘍有効性を達成し得ることが示唆されている（そのすべてが参照によって本明細書に組み入れられるＪｏｈｎｓｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１４），Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，２６：１（非特許文献５）；ＷＯ２０１６／０２８６５６（特許文献１）；ＵＳ２０１６／０１７６９６３（特許文献２）；ＵＳ２０１６／０３７６３６５（特許文献３））。

【0005】

従って、ＴＩＧＩＴ受容体活性を阻害し得るＴＩＧＩＴに特異的なアンタゴニスト抗体は腫瘍微細環境に関連する免疫抑制効果を低下させる機会となり、それによって腫瘍細胞に対する抗腫瘍免疫応答を高める。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【文献】ＷＯ２０１６／０２８６５６

【文献】ＵＳ２０１６／０１７６９６３

【文献】ＵＳ２０１６／０３７６３６５

【非特許文献】

【0007】

【文献】Ｙｕ，ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：４８

【文献】Ｋｕｒｔｕｌｕｓ，ｅｔ ａｌ．（２０１５），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２７６：１１２

【文献】Ｃｈｅｗ，ｅｔ ａｌ．（２０１６），Ｐｌｏｓ．Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ．１２

【文献】Ｊｏｌｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２０１４），Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．４０：５６９

【文献】Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１４），Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，２６：１

【発明の概要】

【0008】

本発明は、ＴＩＧＩＴが介在するシグナル伝達の免疫抑制効果を低下させることができる抗ＴＩＧＩＴ抗体を提供する。特に、本発明の抗体または抗原結合断片は、Ｔ細胞（従来型のαβＴ細胞及び非従来型のγδＴ細胞）及びＮＫ細胞におけるリガンド結合の阻止及び／またはＴＩＧＩＴ陽性Ｔｒｅｇ細胞の枯渇を介して、及び／またはＴＩＧＩＴ受容体の内部移行を誘導することによって、ＴＩＧＩＴが介在する免疫抑制を阻害することができる。

【0009】

態様の１つでは、本発明は、ヒトＴＩＧＩＴに結合し、図１に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３の配列から選択される重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）と重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）と重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）とを含む重鎖可変ドメインを含み、さらに図２に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３の配列から選択される軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）と軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）と軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）とを含む軽鎖可変ドメインを含む単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。

【0010】

特定の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３の組み合わせを含み、その際、組み合わせは、図１における各抗体に由来するＬＣＤＲと一緒に図２における対応する抗体に由来するＨＣＤＲによって形成される組み合わせの群から選択される。

【0011】

特定の実施形態では、本発明に係る抗体または抗原結合断片は、配列番号２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、３２７、３２９、及び３３１、ならびにそれらに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインを含んでもよく；且つ任意で、配列番号２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、３２８、３３０、及び３３２のアミノ酸配列、ならびにそれらに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含んでもよい。

【0012】

特定の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとの組み合わせを含み、その際、組み合わせは、図５における各抗体に由来するＶＨまたはそれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列と一緒に、図５における同じ抗体に由来するＶＬまたはそれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列によって形成される組み合わせの群から選択される。

【0013】

本明細書で提供されている最も好ましい抗体及び抗原結合断片は本明細書で提供されている抗体３１２８２のＣＤＲまたは完全な可変ドメインに基づくものである。

【0014】

本明細書で実証されるように、抗体３１２８２に基づくこれらの好ましい抗ＴＩＧＩＴ抗体及び抗原結合断片は特に驚くべき且つ有利な特性を有する。これらの特性には、それぞれ以前記載され、調べた抗ＴＩＧＩＴ抗体と比べてＣＤ８Ｔ細胞（健常ドナーまたはがん患者に由来する）上で発現されるＴＩＧＩＴに対する高い親和性；それぞれ以前記載され、調べた抗ＴＩＧＩＴ抗体と比べてＣＤ１５５／ＰＶＲとの競合についてのさらに良好なＩＣ_５０；それぞれ以前記載され、調べた抗ＴＩＧＩＴ抗体と比べてＴ細胞活性化アッセイにおけるさらに良好なＥＣ_５０；ならびに患者の末梢血に由来する、及び重要なことに腫瘍浸潤リンパ球に由来するＴ細胞にて活性を強く高めることが挙げられる。さらに、本発明に係る抗体及び抗原結合断片、特に抗体３１２８２に基づくものはＴｒｅｇ細胞を優先的に枯渇させることが驚くべきことに本明細書で示されている。すなわち、提供されている抗ＴＩＧＩＴ抗体に曝されたＴＩＧＩＴを発現しているＴｒｅｇ細胞は従来のＣＤ４及びＣＤ８のＴ細胞と比べて大きな割合まで溶解を受ける。従来のＣＤ４及びＣＤ８のＴ細胞もＴＩＧＩＴを発現しているが、抗体と接触して同じ程度には細胞溶解を受けないので、これは驚くべくことである。本発明に係る抗体及び抗原結合断片、特に抗体３１２８２に基づくものは従来のＴ細胞の炎症誘発活性を促進するだけでなく、非従来型のγδＴ細胞の活性も高めることがさらに驚くべきことに示されている。

【0015】

従って、特定の好ましい実施形態では、本明細書で提供されるのはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む抗体または抗原結合断片であり、その際、
ＨＣＤＲ１は配列番号１６（ＹＴＦＴＳＹＹＭＨ）を含み、またはそれから成り、
ＨＣＤＲ２は

を含み、またはそれから成り、
ＨＣＤＲ３は

を含み、またはそれから成り、
ＬＣＤＲ１は配列番号６１（ＲＡＳＱＳＶＲＳＳＹＬＡ）を含み、またはそれから成り、
ＬＣＤＲ２は配列番号６２（ＧＡＳＳＲＡＴ）を含み、またはそれから成り、及び
ＬＣＤＲ３は配列番号６３（ＱＱＹＦＳＰＰＷＴ）を含み、またはそれから成る。

【0016】

特定のそのような実施形態では、重鎖可変ドメインは配列番号２２１に係るアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含み、またはそれから成り、且つ軽鎖可変ドメインは配列番号２２２に係るアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含み、またはそれから成る。

【0017】

特定の好ましい実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体は本明細書に記載されている抗体３１２８２である。

【0018】

さらなる態様では、本発明は、ヒトＴＩＧＩＴへの結合について本発明の第１の態様に係る抗体、たとえば、本明細書で例示されている抗体と交差競合する単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。

【0019】

さらなる態様では、本発明は、本発明の第１の態様に係る抗体、たとえば、本明細書で例示されている抗体と同じエピトープに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。

【0020】

さらなる態様では、本発明は、ＴＩＧＩＴ残基Ｑ５６及びＩ１０９を含み、任意で残基Ｑ５６、Ｎ５８及びＩ１０９を含むヒトＴＩＧＩＴのエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片を提供する。好ましい実施形態では、提供されるのはＴＩＧＩＴ残基Ｑ５６、Ｎ５８、Ｅ６０、Ｉ６８、Ｌ７３、Ｈ７６及びＩ１０９を含むヒトＴＩＧＩＴのエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片である。

【0021】

特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片はＴＩＧＩＴ残基Ｑ５６、Ｎ５８、Ｅ６０、Ｉ６８、Ｌ７３、Ｈ７６及びＩ１０９から成るヒトＴＩＧＩＴのエピトープに結合する。

【0022】

さらなる態様では、本発明は、ヒトＴＩＧＩＴに結合し、且つＴＩＧＩＴの結合についてＣＤ１５５と競合しない単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。

【0023】

特定の実施形態では、ヒトＴＩＧＩＴに結合し、且つＴＩＧＩＴの結合についてＣＤ１５５と競合しない抗体または抗原結合断片は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、その際、ＨＣＤＲ１は配列番号２８０を含み、またはそれから成り、ＨＣＤＲ２は配列番号２８１を含み、またはそれから成り、ＨＣＤＲ３は配列番号２８２を含み、またはそれから成り、ＬＣＤＲ１は配列番号２９２を含み、またはそれから成り、ＬＣＤＲ２は配列番号２９３を含み、またはそれから成り、及びＬＣＤＲ３は配列番号２９４を含み、またはそれから成る。

【0024】

特定のそのような実施形態では、重鎖可変ドメインは配列番号３３３として示されるアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含み、またはそれから成り、且つ軽鎖可変ドメインは配列番号３３４として示されるアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含み、またはそれから成る。

【0025】

特定の好ましい実施形態では、ヒトＴＩＧＩＴに結合し、且つＴＩＧＩＴの結合についてＣＤ１５５と競合しない抗体は重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとを含み、その際、ＨＣＤＲ１は配列番号３５３を含み、ＨＣＤＲ２は配列番号３５４を含み、ＨＣＤＲ３は配列番号３５５を含み、ＬＣＤＲ１は配列番号３５６を含み、ＬＣＤＲ２は配列番号３５７を含み、且つＬＣＤＲ３は配列番号３５８を含む。

【0026】

特定のそのような実施形態では、重鎖可変ドメインは配列番号３６７として示されるアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含んでもよく、且つ軽鎖可変ドメインは配列番号３６８として示されるアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含んでもよい。

【0027】

さらなる態様では、本発明は、ＴＩＧＩＴを発現しているＴｒｅｇ細胞を優先的に枯渇させる単離された抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片を提供し、任意でその際、抗体または抗原結合断片は本発明の第１の態様に係る抗体または抗原結合断片、たとえば、本明細書で例示されている抗体である。

【0028】

さらなる態様では、本発明は本発明の他の態様に係る抗体、たとえば、本明細書で例示されている抗体の親和性変異体を提供する。

【0029】

さらなる態様では、本発明は、本発明の他の態様に係る抗体または抗原結合断片、たとえば、本明細書で例示されている抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドまたは単離されたポリヌクレオチドの組み合わせを提供する。

【0030】

さらなる態様では、本発明は抗ＴＩＧＩＴ抗体のＶＨ及び／またはＶＬのドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供し、その際、ポリヌクレオチドは配列番号２４１～２７０、３３５～３４２及び３６９～３７０から成る群から選択される１つ以上の配列を含む。

【0031】

さらなる態様では、本発明は、宿主細胞または無細胞発現システムにおける抗原結合ポリペプチドの発現を可能にする調節性配列に動作可能に連結された本発明に係るポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組み合わせを含む発現ベクターを提供する。

【0032】

さらなる態様では、本発明は、本発明に係る発現ベクターを含有する宿主細胞または無細胞発現システムを提供する。

【0033】

さらなる態様では、本発明は、抗体または抗原結合断片の発現を可能にする条件下で本発明に係る宿主細胞または無細胞発現システムを培養することと、発現された抗体または抗原結合断片を回収することとを含む、組換え抗体またはその抗原結合断片を作製する方法を提供する。

【0034】

さらなる態様では、本発明は、本発明に係る抗体または抗原結合断片、たとえば、本明細書で例示されている抗体と、少なくとも１つの薬学上許容できるキャリアまたは賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。

【0035】

さらなる態様では、本発明は、治療法で使用するための本発明に係る抗体または抗原結合断片または本発明に係る医薬組成物を提供する。

【0036】

さらなる態様では、本発明は、がんを治療する方法で使用するための本発明に係る抗体または抗原結合断片（たとえば、本明細書で例示されている抗体）または本発明に係る医薬組成物を提供する。

【0037】

さらなる態様では、本発明は、有効量の本発明に係る抗体または抗原結合断片（たとえば、本明細書で例示されている抗体）または本発明に係る医薬組成物を対象に投与し、それによってがんを治療することを含む、対象にてがんを治療する方法を提供する。

【0038】

特定の好ましい実施形態では、方法は肺癌、膵臓癌、及びＴ細胞リンパ腫から選択されるがんを治療する方法である。特定の好ましい実施形態では、がんは肝細胞癌腫である。特定の好ましい実施形態では、がんは膵臓腺癌である。特定の好ましい実施形態では、がんは肺癌腫である。特定の好ましい実施形態では、がんはセザリー症候群である。

【0039】

さらなる態様では、本発明は、ウイルス感染症、任意でＣＭＶ感染症を治療する方法で使用するための本発明に係る抗体または抗原結合断片（たとえば、本明細書で例示されている抗体）または本発明に係る医薬組成物を提供する。

【0040】

さらなる態様では、提供されるのは、有効量の本発明に係る抗体または抗原結合断片または本発明に係る医薬組成物を対象に投与し、それによってウイルス感染症を治療することを含む、対象にてウイルス感染症を治療する方法である。好ましい実施形態では、ウイルス感染症はＣＭＶ感染症である。

【0041】

さらなる態様では、提供されるのは、Ｔ細胞の集団を、本発明に係る抗体または抗原結合断片に接触させることを含む、Ｔ細胞の活性を促進する方法である。特定の実施形態では、方法はαβＴ細胞の活性を促進する。特定の実施形態では、方法はγδＴ細胞の活性を促進する。特定の実施形態では、方法はインビトロで実施される。特定の実施形態では、方法はインビボで、たとえば、ヒト対象にて実施される。

【0042】

特定の実施形態では、提供されるのは、本発明に係る方法、または本発明に係る方法で使用するための抗体または抗原結合断片または医薬組成物であり、その際、方法はさらに、１つ以上の追加の治療剤の投与を含む。特定の好ましい実施形態では、１つ以上の追加の作用物質は、化学療法剤、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗４１ＢＢ抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、及び抗ＩＣＯＳ抗体から選択される。

【0043】

さらなる態様では、提供されるのは、抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片と、化学療法剤、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗４１ＢＢ抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、及び抗ＩＣＯＳ抗体のうちの１つ以上とを含む組み合わせである。さらなる態様では、提供されるのは、治療法で使用するための本発明に係る組み合わせである。さらなる態様では、提供されるのは、がんを治療する方法で使用するための、またはウイルス感染症を治療する方法で使用するための、本発明に係る組み合わせである。さらなる態様では、提供されるのは、本発明に係る方法で使用するための本発明に係る組み合わせである。好ましい実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片は本発明の抗体またはその抗原結合断片である。

【0044】

さらなる態様では、提供されるのは腫瘍体積を減らす組成物または組み合わせである。いくつかの実施形態では、組み合わせはさらに、１つ以上の追加の治療剤の投与を含む。特定の好ましい実施形態では、１つ以上の追加の治療剤は化学療法剤、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗４１ＢＢ抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、及び抗ＩＣＯＳ抗体から選択される。

【0045】

さらなる態様では、提供されるのは本発明に係る抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片と化学療法剤とを含む組み合わせである。好ましい実施形態では、化学療法剤はドキソルビシンである。好ましい実施形態では、組み合わせはさらに、アデノシンＡ２Ａ受容体（Ａ２ＡＲ）アンタゴニストを含む。さらなる態様では、組み合わせは治療法で使用するために提供される。さらなる態様では、組み合わせはがんを治療するのに使用するために提供される。好ましい実施形態では、組み合わせは結腸癌を治療するのに使用するためのものである。

【0046】

さらなる態様では、提供されるのはがんを治療する方法で使用するための本発明に係る抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片であり、その際、方法は、化学療法剤と組み合わせて抗体を投与することを含む。好ましい実施形態では、方法はさらに、Ａ２ＡＲアンタゴニストを投与することを含み、抗体または抗原結合断片と化学療法剤とＡ２ＡＲアンタゴニストとが、組み合わせで投与される。好ましい実施形態では、がんは結腸癌である。好ましい実施形態では、化学療法剤はドキソルビシンである。関連する態様すべてにおいて、治療される対象はヒト対象であることが好ましい。関連する態様すべてにおいて、本発明に係る抗体と接触する細胞（たとえば、Ｔ細胞）はヒト細胞（たとえば、ヒトＴ細胞）であることが好ましい。

【0047】

技術的に不適合でない限り、または反対に指示されない限り、記載されている好ましい実施形態は任意で、他の好ましいすべての実施形態のうちの１つ以上と組み合わせて使用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0048】

【図1】本発明の抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列を提供する表である。

【図2】本発明の抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のＣＤＲ配列を提供する表である。

【図3-1】本発明の抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のフレームワーク（ＦＲ）配列を提供する表である。

【図3-2】図３－１の説明を参照のこと。

【図4-1】本発明の抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のフレームワーク（ＦＲ）配列を提供する表である。

【図4-2】図４－１の説明を参照のこと。

【図5-1】本発明の抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のアミノ酸配列を提供する表である。

【図5-2】図５－１の説明を参照のこと。

【図5-3】図５－１の説明を参照のこと。

【図6-1】本発明に係る抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインをコードするポリヌクレオチドの配列を提供する表である。

【図6-2】図６－１の説明を参照のこと。

【図6-3】図６－１の説明を参照のこと。

【図6-4】図６－１の説明を参照のこと。

【図6-5】図６－１の説明を参照のこと。

【図7】Ｊｕｒｋａｔ－ｈＴＩＧＩＴへの結合についてのｈＣＤ１５５と抗ＴＩＧＩＴ抗体との間での競合アッセイの結果を示すグラフである。

【図8】（Ａ）７人の健常ヒトドナーに由来するＰＢＭＣの特異的Ｔ細胞集団内におけるＴＩＧＩＴ陽性細胞の比率を示すグラフである。（Ｂ）７人の健常ヒトドナーに由来するＰＢＭＣの様々な免疫集団内でのＴＩＧＩＴ陽性細胞の比率を示すグラフである。

【図9】Ｊｕｒｋａｔ－ｈＴＩＧＩＴにおける抗ＴＩＧＩＴ抗体の結合アッセイの結果を示すグラフである。

【図10-1】（Ａ及びＢ）ヒト健常ＰＢＭＣに由来する初代ＣＤ８^＋Ｔ細胞における抗ＴＩＧＩＴ抗体の結合アッセイの結果を示すグラフである。（Ｃ）ヒト健常ＰＢＭＣに由来する初代メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＴｒｅｇにおける抗ＴＩＧＩＴ抗体の結合アッセイの結果を示すグラフである。

【図10-2】図１０－１の説明を参照のこと。

【図11】カニクイザル健常ＰＢＭＣに由来する初代ＣＤ８^＋Ｔ細胞における抗ＴＩＧＩＴ抗体の結合アッセイの結果を示すグラフである。

【図12-1】ＣＨＯ－ＴＣＲ－ＣＤ１５５及びＪｕｒｋａｔ－ｈＴＩＧＩＴのバイオアッセイにおける抗ＴＩＧＩＴ抗体の効果を示すグラフである。

【図12-2】図１２－１の説明を参照のこと。

【図13-1】ＣＨＯ－ＴＣＲ－ＣＤ１５５細胞で活性化した健常ドナーに由来するヒト初代ＣＤ８Ｔ細胞における機能的アッセイにてＩＦＮｇの分泌を高める抗ＴＩＧＩＴ抗体の効果を示すグラフである。

【図13-2】図１３－１の説明を参照のこと。

【図13-3】図１３－１の説明を参照のこと。

【図14】ＣＨＯ－ＴＣＲ－ＣＤ１５５細胞で活性化した卵巣腹水に由来するヒト初代ＣＤ８^＋ＴＩＬにおける機能的アッセイにてＩＦＮｇの分泌を高める抗ＴＩＧＩＴ抗体の効果を示す柱状グラフのプロットである。

【図15】（Ａ）Ｊｕｒｋａｔ－ｍＴＩＧＩＴへの結合についてのマウスＣＤ１５５と抗ＴＩＧＩＴ抗体との間での競合アッセイの結果を示すグラフである。（Ｂ）マウスＯＴ－１Ｔ細胞における機能的アッセイにてＩＦＮｇの分泌を高める抗ＴＩＧＩＴ抗体の効果を示すグラフである。（Ｃ）マウスＯＴ－１Ｔ細胞における機能的アッセイにて細胞傷害性を高める抗ＴＩＧＩＴ抗体の効果を示すグラフである。

【図16】（Ａ）ＣＴ２６腫瘍モデルにおける単剤療法にて抗ＴＩＧＩＴ抗体の抗腫瘍有効性を示すグラフである。（Ｂ及びＣ）ＣＴ２６腫瘍モデルにて抗ＰＤ１との併用での抗ＴＩＧＩＴ抗体の抗腫瘍有効性を示すグラフである。

【図17-1】（Ａ）ＣＴ２６腫瘍モデルにおける単剤療法にて抗ＴＩＧＩＴ抗体のアイソタイプ依存性の抗腫瘍有効性を示すグラフである。（Ｂ）ＣＴ２６腫瘍モデルにて抗ＰＤ１との併用での抗ＴＩＧＩＴ抗体のアイソタイプ依存性の抗腫瘍有効性を示すグラフである。

【図17-2】図１７－１の説明を参照のこと。

【図18-1】（Ａ及びＧ）単剤療法または抗ＰＤ１との併用にて抗ＴＩＧＩＴ抗体で処理したＣＴ２６腫瘍におけるＣＤ４^＋Ｔ細胞集団全体内でのＴｒｅｇ細胞の比率の調節を示すグラフである。（Ｂ及びＨ）単剤療法または抗ＰＤ１との併用にて抗ＴＩＧＩＴ抗体で処理したＣＴ２６腫瘍におけるＣＤ４５^＋細胞集団全体内でのＣＤ８^＋Ｔ細胞の比率の調節を示すグラフである。（Ｃ及びＩ）単剤療法または抗ＰＤ１との併用にて抗ＴＩＧＩＴ抗体で処理したＣＴ２６腫瘍におけるＣＤ８^＋／ＴｒｅｇＴ細胞の比の調節を示すグラフである。（Ｄ及びＪ）単剤療法または抗ＰＤ１との併用にて抗ＴＩＧＩＴ抗体で処理したＣＴ２６腫瘍におけるＩＦＮｇを分泌するＣＤ４^＋Ｔ細胞の調節を示すグラフである。（Ｅ）抗ＴＩＧＩＴ抗体で処理したＣＴ２６腫瘍におけるＩＦＮｇを分泌するＣＤ８^＋Ｔ細胞の調節を示すグラフである。（Ｌ及びＦ）単剤療法または抗ＰＤ１との併用にて抗ＴＩＧＩＴ抗体で処理したＣＴ２６腫瘍におけるＩＦＮｇ／ＩＬ－１０を分泌するＣＤ４^＋Ｔ細胞の比を示すグラフである。（Ｋ）抗ＰＤ１抗体との併用で抗ＴＩＧＩＴ抗体によって処理したＣＴ２６腫瘍におけるＩＬ－１０を分泌するＣＤ４^＋Ｔ細胞の調節を示すグラフである。

【図18-2】図１８－１の説明を参照のこと。

【図18-3】図１８－１の説明を参照のこと。

【図18-4】図１８－１の説明を参照のこと。

【図19】（Ａ）ＣＴ２６腫瘍にて遺伝子発現を調節する、及びＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ解析によって測定した抗ＴＩＧＩＴ抗体処理の効果を示す火山プロットである。（Ｂ）単剤療法または抗ＰＤ１との併用にて抗ＴＩＧＩＴ抗体で処理したＣＴ２６腫瘍における細胞傷害性スコアの調節を示す箱ひげ図である。（Ｃ）単剤療法または抗ＰＤ１との併用にて抗ＴＩＧＩＴ抗体で処理したＣＴ２６腫瘍におけるＣＤ８^＋Ｔ細胞のスコアの調節を示す箱ひげ図である。

【図20】（Ａ）ヒト健常ボランティアに由来するＰＢＭＣにおけるＴＩＧＩＴ^＋、ＣＤ４^＋、ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＴｒｅｇの集団の比率を示す柱状グラフのプロットである。（Ｂ）ヒト健常ボランティアに由来するＰＢＭＣにおける従来型のＣＤ４^＋、ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＴｒｅｇの集団に対する抗ＴＩＧＩＴ抗体のインビトロ細胞傷害性効果を示すグラフである。

【図21】ＣＴ２６腫瘍における従来型のＣＤ４^＋、ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＴｒｅｇの集団に対する抗ＴＩＧＩＴ抗体のエクスビボ細胞傷害性効果を示すグラフである。

【図22】（Ａ）Ｊｕｒｋａｔ－ｈＴＩＧＩＴ細胞における抗ＴＩＧＩＴ抗体クローンの結合アッセイの結果を示すグラフである。（Ｂ）健常ヒトＰＢＭＣに由来する初代ＣＤ８^＋Ｔ細胞における抗ＴＩＧＩＴ抗体クローンの結合アッセイの結果を示すグラフである。（Ｃ）がん患者のＰＢＭＣに由来する初代ＣＤ８^＋Ｔ細胞における抗ＴＩＧＩＴ抗体クローンの結合アッセイの結果を示すグラフである。

【図23】Ｊｕｒｋａｔ－ｈＴＩＧＩＴへの結合についてのヒトＣＤ１５５と抗ＴＩＧＩＴ抗体クローンとの間での競合アッセイの結果を示すグラフである。

【図24-1】アンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴクローンの機能的特性評価を示すグラフである。（Ａ）Ｊｕｒｋａｔ－ｈＴＩＧＩＴエフェクター細胞を用いた機能的アッセイ（ルシフェラーゼレポーターアッセイ）における抗ＴＩＧＩＴ抗体の効果を示すグラフである。（Ｂ）健常ボランティアに由来するヒト初代ＣＤ８^＋Ｔ細胞によるＩＦＮｇ分泌を測定する機能的アッセイにおける抗ＴＩＧＩＴ抗体の効果を示すグラフである。（Ｃ）ＰＢＭＣに由来するがん患者のＣＤ３^＋Ｔ細胞によるＩＦＮｇ分泌を測定する機能的アッセイにおける抗ＴＩＧＩＴ抗体クローン３１２８２の効果を示すグラフである。（Ｄ）がん患者のＴＩＬまたはＰＢＭＣにて細胞内サイトカイン染色を測定する機能的アッセイにおける抗ＴＩＧＩＴ抗体クローン３１２８２の効果を示すグラフである。

【図24-2】図２４－１の説明を参照のこと。

【図25】がん患者に由来するＰＢＭＣにおけるＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋のメモリーＴ細胞全体及びＴｒｅｇの集団に対する抗ＴＩＧＩＴクローン３１２８２の細胞傷害活性を示すグラフである。

【図26】がん患者に由来する免疫集団におけるＴＩＧＩＴ発現の特性評価を示すグラフである。（Ａ）がん患者のＰＢＭＣ及びＴＩＬに由来する免疫集団におけるＴＩＧＩＴ発現の頻度を示すグラフである。（Ｂ）がん患者のＰＢＭＣ及びＴＩＬに由来する免疫集団におけるＴＩＧＩＴ発現の絶対的定量を示すグラフである。

【図27A】Ｆａｂの構造：リボン図として示されるＴＩＧＩＴ複合体を示す図である。

【図27B】クローン３１２８２とＴＩＧＩＴの間の完全な結合界面を示す図である。

【図27C】接触した残基を示すクローン３１２８２とＴＩＧＩＴの間の結合界面を示す図である。

【図28】抗ＴＩＧＩＴクローンの３１２８２と３２９５９との間での競合アッセイを示すグラフである。

【図29】カニクイザルにて０．１ｍｇ／ｋｇ（上の列）、１ｍｇ／ｋｇ（中の列）または１０ｍｇ／ｋｇ（下の列）の単回用量をｉ．ｖ．注射した後の抗ＴＩＧＩＴクローン３１２８２の血漿濃度の測定を示すグラフである。左の欄：３１２８２ ＩｇＧ１；右の欄：３１２８２ ＩｇＧ４。

【図30】セザリー症候群患者に由来する悪性及び正常のＣＤ４^＋Ｔ細胞集団におけるＴＩＧＩＴ発現の特性評価を示すグラフである。（Ａ）悪性及び正常のＣＤ４^＋Ｔ細胞を分離するゲート戦略。（Ｂ）２つの異なる集団におけるＴＩＧＩＴ染色についてのＭＦＩ。

【図31】ＣＬＬ患者に由来する悪性及び正常のＢ細胞集団におけるＴＩＧＩＴ発現の特性評価を示すグラフである。（Ａ）悪性及び正常のＢ細胞を分離するゲート戦略。（Ｂ）２つの異なる集団におけるＴＩＧＩＴ染色についてのＭＦＩ。

【図32】（Ａ～Ｃ）ＥＬ４－ｍＴＩＧＩＴ腫瘍を接種したマウスにおける腫瘍増殖曲線を示すグラフである。（Ａ）中央値腫瘍増殖曲線。（Ｂ）ｈＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体で処理したマウスにおける個々の腫瘍増殖曲線。（Ｃ）マウス代替アンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴ抗体（ｈＩｇＧ１）で処理したマウスにおける個々の腫瘍増殖曲線。（Ｄ～Ｆ）ＥＬ４－ＧＦＰ腫瘍を接種したマウスにおける腫瘍増殖曲線を示すグラフである。（Ｄ）中央値腫瘍増殖曲線。（Ｅ）ｈＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体で処理したマウスにおける個々の腫瘍増殖曲線。（Ｆ）代替アンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴ（ｈＩｇＧ１）で処理したマウスにおける個々の腫瘍増殖曲線。

【図33A】ＣＴ２６腫瘍を接種したマウスにおける腫瘍増殖曲線を示すグラフである。（Ａ）抗ＴＩＧＩＴ抗体及び抗４－１ＢＢ抗体で処理したマウスについての中央値及び個々の腫瘍増殖曲線。

【図33B】ＣＴ２６腫瘍を接種したマウスにおける腫瘍増殖曲線を示すグラフである。（Ｂ）抗ＴＩＧＩＴ抗体及び抗ＯＸ－４０抗体で処理したマウスについての中央値及び個々の腫瘍増殖曲線。

【図33C】ＣＴ２６腫瘍を接種したマウスにおける腫瘍増殖曲線を示すグラフである。（Ｃ）抗ＴＩＧＩＴ抗体及び抗ＧＩＴＲ抗体で処理したマウスについての中央値及び個々の腫瘍増殖曲線。

【図33D】ＣＴ２６腫瘍を接種したマウスにおける腫瘍増殖曲線を示すグラフである。（Ｄ）抗ＴＩＧＩＴ抗体及び抗ＩＣＯＳ抗体で処理したマウスについての中央値及び個々の腫瘍増殖曲線。

【図34】γδＴ細胞に対する抗ＴＩＧＩＴ抗体の効果を示すグラフである。（Ａ）ＣＭＶ陽性及び陰性のヒトドナーに由来するＰＢＭＣのＶδ２^－γδＴ細胞集団内でのＴＩＧＩＴ陽性細胞の中央値比率及びＴＩＧＩＴのＭＦＩシグナル。（Ｂ）単離されたヒト初代Ｖδ１^＋γδＴ細胞における機能的アッセイにてＩＦＮｇ分泌を高める抗ＴＩＧＩＴ抗体の活性を示すグラフである。（Ｃ）ＰＢＭＣ全体における機能的アッセイにてＩＦＮｇ分泌を高める抗ＴＩＧＩＴ抗体の活性を示すグラフである。

【図35】肝細胞癌腫マウスのモデルにおける単剤療法での抗ＴＩＧＩＴｍＡｂの抗腫瘍有効性を示すグラフである。データは（Ａ）中央値腫瘍増殖及び（Ｂ）個々の曲線として表されている。

【図36】皮下膵臓腺癌のマウスモデルにおける単剤療法及び抗４－１ＢＢ ｍＡｂとの併用での抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂの抗腫瘍有効性を示すグラフである。データは（Ａ）中央値腫瘍増殖及び（Ｂ）個々の曲線として表されている。

【図37】皮下膵臓腺癌のマウスモデルにおける単剤療法及び抗ＯＸ４０ ｍＡｂとの併用での抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂの抗腫瘍有効性を示すグラフである。データは（Ａ）中央値腫瘍増殖及び（Ｂ）個々の曲線として表されている。

【図38】皮下膵臓腺癌のマウスモデルにおける単剤療法及び抗ＧＩＴＲ ｍＡｂとの併用での抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂの抗腫瘍有効性を示すグラフである。データは（Ａ）中央値腫瘍増殖及び（Ｂ）個々の曲線として表されている。

【図39-1】同所性膵臓腺癌のマウスモデルにおける単剤療法及び抗４－１ＢＢ ｍＡｂとの併用での抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂの抗腫瘍有効性を示すグラフである。データは（Ａ）中央値生物発光シグナル、（Ｂ）個々の曲線及び（Ｃ）生存曲線として表されている。

【図39-2】図３９－１の説明を参照のこと。

【図40】ヒト化肺腫瘍モデルにおける単剤療法での抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂの抗腫瘍有効性を示すグラフである。（Ａ）ヒトＡ５４９肺腫瘍細胞株によるＣＤ１５５、ＣＤ１１２及びＣＤ１１３の発現を示す柱状グラフのプロットである。腫瘍増殖に対する抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂの効果は（Ａ）中央値腫瘍増殖及び（Ｂ）個々の曲線として示されている。

【図41】全ＰＢＭＣで実施した機能的アッセイにてγδＴ細胞によるＩＦＮγの分泌を高める抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂの活性を示すグラフである。

【図42A】セザリー症候群患者における抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂのインビトロ細胞傷害性活性を示すグラフである。（Ａ）悪性ＣＤ４^＋Ｔ細胞及び正常なＣＤ４^＋Ｔ細胞を分離するゲートかけ戦略。

【図42B】セザリー症候群患者における抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂのインビトロ細胞傷害性活性を示すグラフである。（Ｂ）セザリー症候群患者のＰＢＭＣにおける悪性ＣＤ４^＋、非悪性ＣＤ４^＋、及びＮＫの集団に対する抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂのインビトロ細胞傷害性活性。

【図43】ＣＴ２６腫瘍を接種したマウスにおける腫瘍増殖曲線を示すグラフである。（Ａ）抗ＴＩＧＩＴ、Ａ_２ＡＲアンタゴニスト及び／またはドキソルビシンで処理したマウスについての中央値腫瘍増殖曲線。（Ｂ）各処理群についての個々の腫瘍増殖曲線。

【図44】抗ＴＩＧＩＴクローン３１２８２と共に予めインキュベートした細胞にてクローン３１２８２－ＰＥまたは３２９５９－ＡＦ６４７を用いたＴＩＧＩＴ^＋集団の検出。（Ａ）抗ＴＩＧＩＴクローン３１２８２とのインキュベート及びクローン３１２８２－ＰＥによる検出の後のＴＩＧＩＴ^＋細胞の正規化した頻度を示すグラフである。（Ｂ）抗ＴＩＧＩＴクローン３１２８２とのインキュベート及びクローン３２９５９－ＡＦ６４７による検出の後のＴＩＧＩＴ^＋細胞の正規化した頻度を示すグラフである。

【図45】グラフは様々な希釈のクローン３１２８２を添加し、抗イディオタイプ抗体３２８６９で展開したＭＳＤ ＥＬＩＳＡを用いて調べたヒト血清試料を表す。放たれた光シグナルは血清試料におけるクローン３１２８２の濃度に比例する。

【発明を実施するための形態】

【0049】

発明の詳細な説明
本明細書で使用されるとき、用語「免疫グロブリン」には、それが関連する特異的な免疫反応性を持っていようと持っていまいと、２本の重鎖と２本の軽鎖の組み合わせを有するポリペプチドが含まれる。「抗体」は、対象とする抗原（たとえば、ＴＩＧＩＴ）に対する有意な既知の特異的な免疫反応性活性を有するそのような集合体を指す。用語「ＴＩＧＩＴ抗体」または「抗ＴＩＧＩＴ抗体」はＴＩＧＩＴタンパク質に対する免疫的な特異性を示す抗体を指すのに本明細書で使用される。抗体及び免疫グロブリンは、それらの間での鎖間共有結合の有無にかかわらず、軽鎖及び重鎖を含む。脊椎動物系における基本的な免疫グロブリンの構造は相対的によく理解されている。

【0050】

総称「免疫グロブリン」は生化学的に区別することができる抗体の５つの異なるクラスを含む。抗体の５つのクラスはすべて本発明の範囲内にあるが、以下の議論は一般に免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスに向けられるであろう。ＩｇＧに関して、免疫グロブリンは分子量およそ２３，０００ダルトンの２本の同一軽鎖ポリペプチドと、分子量５３，０００～７０，０００の２本の同一重鎖とを含む。４本の鎖は「Ｙ」構造にてジスルフィド結合によって連結され、その際、軽鎖は「Ｙ」の口元で開始し、重鎖を囲み、可変領域に至るまで続く。

【0051】

抗体の軽鎖はカッパまたはラムダ（κ、λ）にいずれかとして分類される。各クラスの重鎖はカッパ軽鎖またはラムダ軽鎖のいずれかに結合されてもよい。一般に、軽鎖及び重鎖は互いに共有結合し、２本の重鎖の「尾」部は、免疫グロブリンがＢ細胞または遺伝子操作された宿主細胞によって生成される場合、共有ジスルフィド結合または非共有結合によって互いに結合される。重鎖では、アミノ酸配列はＹ構造の分岐端でのＮ末端から各鎖の底でのＣ末端まで伸びる。当業者は、重鎖がそれらの間での一部のサブクラス（たとえば、γ１～γ４）を伴ってガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）として分類されることを十分に理解するであろう。それはそれぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥとして抗体の「クラス」を決定するこの鎖の性質である。免疫グロブリンのサブクラス（アイソタイプ）、たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、等はよく特徴付けられており、機能的な特殊化を付与することが知られている。これらのクラス及びアイソタイプのそれぞれの修飾された型は本開示を考えれば技量のある熟練者が容易に認識できるので本発明の範囲内にある。

【0052】

上記で示されているように、抗体の可変領域は、抗体が抗原上のエピトープを選択的に認識し、特異的に結合できるようにする。すなわち、抗体のＶＬドメイン及びＶＨドメインは結合して三次元の抗原結合部位を定義する可変領域を形成する。この抗体の四元構造がＹの各アームの末端に存在する抗原結合部位を形成する。さらに具体的には、抗原結合部位はＶＨ鎖及びＶＬ鎖のそれぞれにおける３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって定義される。

【0053】

本明細書で使用されるとき、用語「ＴＩＧＩＴタンパク質」または「ＴＩＧＩＴ抗原」または「ＴＩＧＩＴ」は相互交換可能に使用され、ポリオウイルス受容体（ＰＶＲ－ＣＤ１５５としても知られる）を結合するヒトＴ細胞免疫受容体（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＭ＿１７３７９９）を指す。ＴＩＧＩＴはまたＶＳＩＧ９、ＶＳＴＭ３またはＷＵＣＡＭとしても知られる。ＴＩＧＩＴに対する言及には、ヒト宿主にて及び／またはヒト培養細胞株の表面にて天然に発現されるネイティブのヒトＴＩＧＩＴタンパク質、と同様にその組換え形態及び断片及び天然にも存在する突然変異体形態が含まれる。

【0054】

本明細書で使用されるとき、用語「結合部位」は対象とする標的抗原（たとえば、ＴＩＧＩＴ）に選択的に結合することに関与するポリペプチドの領域を含む。結合ドメインは少なくとも１つの結合部位を含む。例となる結合ドメインには抗体の可変ドメインが挙げられる。本発明の抗体分子は単一の結合部位または複数（たとえば、２、３または４）の結合部位を含んでもよい。

【0055】

本明細書で使用されるとき、指定されたタンパク質（たとえば、ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片）、用語「に由来する」はポリペプチドの起源を指す。一実施形態では、特定の出発ポリペプチドに由来するポリペプチドまたはアミノ酸の配列はＣＤＲ配列またはそれに関連する配列である。一実施形態では、特定の出発ポリペプチドに由来するアミノ酸配列は隣接しない。たとえば、一実施形態では、１、２、３、４、５または６つのＣＤＲが１つの出発抗体に由来する。一実施形態では、特定の出発ポリペプチドまたはアミノ酸の配列に由来するポリペプチドまたはアミノ酸の配列は出発配列のものまたはその一部と本質的に同一であるアミノ酸配列を有し、その際、その一部は少なくとも３～５のアミノ酸、少なくとも５～１０のアミノ酸、少なくとも１０～２０のアミノ酸、少なくとも２０～３０のアミノ酸、もしくは少なくとも３０～５０のアミノ酸から成り、またはさもなければ出発配列にその起源を有すると当業者が認識できる。一実施形態では、出発抗体に由来する１つ以上のＣＤＲ配列を変化させて変異体ＣＤＲ、たとえば、親和性変異体を生じ、その際、変異体ＣＤＲの配列はＴＩＧＩＴ結合活性を維持する。

【0056】

本明細書で使用されるとき、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。塩基性側鎖（たとえば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（たとえば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（たとえば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（たとえば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（たとえば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（たとえば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該技術で定義されている。従って、免疫グロブリンポリペプチドにおける必須ではないアミノ酸残基は同じ側鎖ファミリーに由来する別のアミノ酸残基で置き換えられてもよい。別の実施形態では、１列のアミノ酸は側鎖ファミリーメンバーの系列及び／または組成で異なる構造的に類似する１列で置き換えることができる。

【0057】

本明細書で使用されるとき、用語「重鎖部分」には、免疫グロブリン重鎖の定常ドメインに由来するアミノ酸配列が含まれる。重鎖部分を含むポリペプチドは、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（たとえば、上部、中部及び／または下部のヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはそれらの変異体または断片の少なくとも１つを含む。一実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片は、免疫グロブリン重鎖のＦｃ部分（たとえば、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン）を含んでもよい。別の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片は、定常ドメインの少なくとも一部（たとえば、ＣＨ２ドメインの全部または一部）を欠いてもよい。特定の実施形態では、定常ドメインの少なくとも１つ及び好ましくはすべてがヒト免疫グロブリン重鎖に由来する。たとえば、好ましい一実施形態では、重鎖部分は完全にヒトのヒンジドメインを含む。他の好ましい実施形態では、重鎖部分は完全にヒトのＦｃ部分（たとえば、ヒト免疫グロブリンに由来するヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３のドメインの配列）を含む。

【0058】

特定の実施形態では、重鎖部分の構成要素である定常ドメインは異なる免疫グロブリン分子に由来する。たとえば、ポリペプチドの重鎖部分はＩｇＧ１分子に由来するＣＨ２ドメインとＩｇＧ３またはＩｇＧ４の分子に由来するヒンジ領域とを含んでもよい。他の実施形態では、定常ドメインは異なる免疫グロブリン分子の一部を含むキメラドメインである。たとえば、ヒンジはＩｇＧ１分子に由来する第１の部分とＩｇＧ３またはＩｇＧ４の分子に由来する第２の部分とを含んでもよい。上記で述べられているように、重鎖部分の定常ドメインは、それらが天然に存在する（野生型の）免疫グロブリン分子とはアミノ酸配列で異なるように修飾されてもよい。すなわち、本明細書で開示されている本発明のポリペプチドは重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２またはＣＨ３）及び／または軽鎖定常領域ドメイン（ＣＬ）の１つ以上に対する変化または修飾を含んでもよい。例となる修飾には、１つ以上のドメインにおける１つ以上のアミノ酸の付加、欠失または置換が挙げられる。

【0059】

本明細書で使用されるとき、用語「可変領域」及び「可変ドメイン」は相互交換可能に使用され、同等の意味を有するように意図される。用語「可変」は、可変ドメインＶＨ及びＶＬの特定の部分が抗体間で配列にて広範に異なり、その標的抗原に対する各特定の抗体の結合及び特異性で使用されるという事実を指す。しかしながら、変異性は抗体の可変ドメイン全体にわたって均一に分布するわけではない。それは、抗原結合部位の一部を形成するＶＬドメイン及びＶＨドメインのそれぞれにおける「超可変ループ」と呼ばれる３つのセグメントに集中している。Ｖ_ラムダ軽鎖ドメインの第１、第２及び第３の超可変ループは本明細書ではＬ１（λ）、Ｌ２（λ）及びＬ３（λ）と呼ばれ、ＶＬドメインにて残基２４～３３（９、１０または１１のアミノ酸残基から成るＬ１（λ））、残基４９～５３（３つの残基から成るＬ２（λ））及び残基９０～９６（５つの残基から成るＬ３（λ））を含むと定義されてもよい（Ｍｏｒｅａ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０，２６７－２７９，２０００）。Ｖ_カッパ軽鎖ドメインの第１、第２及び第３の超可変ループは本明細書ではＬ１（κ）、Ｌ２（κ）及びＬ３（κ）と呼ばれ、ＶＬドメインにて残基２５～３３（６、７、８、１１、１２、１３の残基から成るＬ１（κ））、残基４９～５３（３つの残基から成るＬ２（κ））及び残基９０～９７（６つの残基から成るＬ３（κ））を含むと定義されてもよい（Ｍｏｒｅａ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０，２６７－２７９，２０００）。ＶＨドメインの第１、第２及び第３の超可変ループは本明細書ではＨ１、Ｈ２及びＨ３と呼ばれ、ＶＨドメインにて残基２５～３３（７、８、または９の残基から成るＨ１）、残基５２～５６（３または４の残基から成るＨ２）及び残基９１～１０５（長さで高度に可変のＨ３）を含むと定義されてもよい（Ｍｏｒｅａ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０，２６７－２７９，２０００）。

【0060】

指示されない限り、用語Ｌ１、Ｌ２及びＬ３はそれぞれＶＬドメインの第１、第２及び第３の超可変ループを指し、Ｖ_カッパ及びＶ_ラムダのアイソタイプ双方から得られる超可変ループを包含する。用語Ｈ１、Ｈ２及びＨ３はそれぞれＶＨドメインの第１、第２及び第３の超可変ループを指し、γ、ε、δ、αまたはμを含む既知の重鎖アイソタイプのいずれかから得られる超可変ループを包含する。

【0061】

超可変ループＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２及びＨ３はそれぞれ、以下で定義されるような「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」の部分を含んでもよい。用語「超可変ループ」及び「相補性決定領域」は、超可変ループが（ＨＶ）が構造に基づいて定義されているのに対して相補性決定領域（ＣＤＲ）は配列変異性に基づいて定義され（Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１）、ＨＶ及びＣＤＲの端は一部のＶＨ及びＶＬのドメインで異なってもよいので、厳密には同義ではない。

【0062】

ＶＬドメイン及びＶＨドメインのＣＤＲは通常、以下のアミノ酸：軽鎖可変ドメインにおける残基２４～３４（ＬＣＤＲ１）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）及び８９～９７（ＬＣＤＲ３）ならびに重鎖可変ドメインにおける残基３１～３５または３１～３５ｂ（ＨＣＤＲ１）、５０～６５（ＨＣＤＲ２）及び９５～１０２（ＨＣＤＲ３）を含むと定義することができる（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１）。従って、ＨＶは、ＶＨの「超可変ループ」に相当するＣＤＲ及び本明細書でのそれへの参照の範囲内で構成されてもよく、ＶＬドメインは相当するＣＤＲも包含すると解釈されるべきであり、指示されない限り、逆もまた同様である。

【0063】

可変ドメインのさらに高度に保存された部分は以下で定義されるようにフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。ネイティブの重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ３つの超可変ループによって接続される大部分βシート構造を導入する４つのＦＲ（それぞれＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）を含む。各鎖における超可変ループは、ＦＲによって非常に近接して他の鎖の超可変ループと結び付けられて抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。抗体の構造的解析は、相補性決定領域によって形成される結合部位の配列と形状の間の関係性を明らかにした（Ｃｈｏｔｈｉａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７，７９９－８１７，１９９２；Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２１５，１７５－１８２，１９９０）。その高度な配列変異性にもかかわらず、６つのループのうち５つは「正準構造」と呼ばれる主鎖構造の単に小さなレパトアを採用する。これらの構造は、先ず第１にループの長さによって決定され、第２にそのパッキング、水素結合または普通ではない主鎖構造を想定する能力を介して構造を決定するループ及びフレームワークの領域における特定な位置での重要な残基の存在によって決定される。

【0064】

本明細書で使用されるとき、用語「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」は重鎖及び軽鎖のポリペプチド双方の可変領域内で見いだされる不連続の抗原結合部位を意味する。これらの特定の領域はＫａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２，６６０９－６６１６，１９７７によって、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１によって、Ｃｈｏｔｈｉａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９０１－９１７，１９８７によって、及びＭａｃＣａｌｌｕｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２，７３２－７４５，１９９６によって記載されており、その際、互いに対して比べると、定義にはアミノ酸残基の重複またはサブセットが含まれている。上記の引用文献のそれぞれによって定義されるようなＣＤＲを包含するアミノ酸残基が比較のために示される。好ましくは、用語「ＣＤＲ」は配列比較に基づいてＫａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲである。

【0065】

（表１）ＣＤＲの定義

^１残基の番号付けはＫａｂａｔ，ｅｔ ａｌ，上記の命名法に従う。
^２残基の番号付けはＣｈｏｔｈｉａ，ｅｔ ａｌ，上記の命名法に従う。
^３残基の番号付けはＭａｃＣａｌｌｕｍ，ｅｔ ａｌ，上記の命名法に従う。

【0066】

本明細書で使用されるとき、用語「フレームワーク領域」または「ＦＲ領域」には、可変領域の一部であるが、ＣＤＲの一部ではない（たとえば、ＣＤＲのＫａｂａｔ定義を用いて）アミノ酸残基が含まれる。従って、可変領域フレームワークは長さ約１００～１２０の間のアミノ酸であるが、ＣＤＲの外側のアミノ酸のみを含む。重鎖可変ドメインの具体例については及びＫａｂａｔ，ｅｔ ａｌによって定義されるようなＣＤＲについては、フレームワーク１はアミノ酸１～３０を包含する可変領域のドメインに相当し；フレームワーク２はアミノ酸３６～４９を包含する可変領域のドメインに相当し；フレームワーク３はアミノ酸６６～９４を包含する可変領域のドメインに相当し；フレームワーク４はアミノ酸１０３から可変領域の末端までの可変領域のドメインに相当する。軽鎖についてのフレームワーク領域は軽鎖可変領域ＣＤＲのそれぞれによって同様に分離される。同様に、Ｃｈｏｔｈｉａ，ｅｔ ａｌまたはＭａＣａｌｌｕｍ，ｅｔ ａｌによるＣＤＲの定義を用いて、フレームワーク領域の境界は上記に記載されているようにそれぞれのＣＤＲ末端によって分離される。好ましい実施形態では、ＣＤＲはＫａｂａｔによって定義される。

【0067】

天然に存在する抗体では、抗体は水性環境にてその三次元構造を前提とするので、各単量体抗体に存在する６つのＣＤＲは、特異的に位置づけられて抗原結合部位を形成するアミノ酸の短い、不連続の配列である。重鎖及び軽鎖の可変ドメインの残りの部分はアミノ酸配列で分子間変異性が少なく、フレームワーク領域と呼ばれる。フレームワーク領域は大部分βシート構造を採用し、ＣＤＲは接続するループを形成し、場合によってはβシート構造の一部を形成する。従って、これらのフレームワーク領域は、鎖間の非共有結合の相互作用によって正しい方向性で６つのＣＤＲを位置づけることを提供する足場を形成するように作用する。位置づけられたＣＤＲによって形成される抗原結合部位は免疫反応性の抗原上でのエピトープに対する表面相補性を定義する。この相補性の表面が抗体の免疫反応性抗原エピトープへの非共有結合を促進する。ＣＤＲの位置は当業者によって容易に定義され得る。

【0068】

本明細書で使用されるとき、用語「断片」はインタクトのまたは完全な抗体または抗体鎖よりも少ないアミノ酸残基を含む抗体または抗体鎖の一部または部分を指す。用語「抗原結合断片」は抗原を結合するまたは抗原結合（すなわち、ＴＩＧＩＴへの特異的な結合）についてインタクトの抗体（すなわち、それらが由来したインタクトの抗体）と競合する免疫グロブリンまたは抗体のポリペプチド断片を指す。本明細書で使用されるとき、抗体分子の、用語「断片」には、抗体の抗原結合断片、たとえば、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、及び単一ドメイン抗体断片（ＤＡｂ）が挙げられる。断片は、たとえば、インタクトのまたは完全な抗体または抗体鎖の化学処理もしくは酵素処理を介して、または組換え手段によって得ることができる。

【0069】

本明細書で使用されるとき、用語「価数」はポリペプチドにおける潜在的な標的結合部位の数を指す。各標的結合部位は１つの標的分子または標的分子の特異的な部位に特異的に結合する。ポリペプチドが１を超える標的結合部位を含む場合、各標的結合部位は同一のまたは異なる分子を特異的に結合してもよい（たとえば、異なるリガンドまたは異なる抗原、または同じ抗原の異なるエピトープに結合してもよい）。主題の結合分子はＴＩＧＩＴに特異的な少なくとも１つの結合部位を有する。

【0070】

本明細書で使用されるとき、用語「特異性」は所与の標的、たとえば、ＴＩＧＩＴを結合する（たとえば、それと免疫反応性の）能力を指す。ポリペプチドは単一特異性であってもよく、標的を特異的に結合する１つ以上の結合部位を含有してもよく、またはポリペプチドは多重特異性であってもよく、同一のまたは異なる標的を特異的に結合する２以上の結合部位を含有してもよい。一実施形態では、本発明の抗体は１を超える標的に特異的である。たとえば、一実施形態では、本発明の多重特異性結合分子はＴＩＧＩＴ及び第２の標的分子を結合する。この文脈で、第２の標的分子はＴＩＧＩＴ以外の分子である。

【0071】

本明細書で使用されるとき、ポリペプチドに関して、用語「合成の」には、天然に存在しないアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれる。たとえば、天然に存在するポリペプチドの修飾された形態である（たとえば、付加、置換または欠失のような突然変異を含む）、または自然界ではそれが天然に連結しない第２のアミノ酸配列（天然に存在してもよいし、しなくてもよい）にアミノ酸の直鎖配列で連結される第１のアミノ酸配列（天然に存在してもよいし、しなくてもよい）を含む天然に存在しないポリペプチド。

【0072】

本明細書で使用されるとき、用語「操作された」には、合成手段による（たとえば、組換え法、インビトロペプチド合成による、ペプチドの酵素的もしくは化学的なカップリング、またはこれらの技法の一部の組み合わせによる）核酸分子またはポリペプチド分子の操作を指す。好ましくは、本発明の抗体は、１つ以上の特性、たとえば、抗原結合、安定性／半減期またはエフェクター機能を改善するように操作されている。

【0073】

本明細書で使用されるとき、用語「修飾された抗体」には、天然に存在しないように変化させている抗体、たとえば、２つの完全な重鎖ではない少なくとも２つの重鎖部分を含む抗体（たとえば、ドメインを欠失させた抗体またはミニボディ）の合成形態；２以上の異なる抗原または単一抗原の異なるエピトープに結合するように変化させた抗体の多重特異性（たとえば、二重特異性、三重特異性、等）形態；ｓｃＦｖ分子等に連結された重鎖分子が含まれる。ｓｃＦｖ分子は当該技術で既知であり、たとえば、米国特許第５，８９２，０１９号に記載されている。加えて、用語「修飾された抗体」には、抗体の多価形態（たとえば、三価、四価、等、同じ抗原の３以上のコピーに結合する抗体）が含まれる。別の実施形態では、本発明の修飾された抗体はＣＨ２ドメインを欠く少なくとも１つの重鎖部分を含み、且つ受容体リガンド対の一方のメンバーの結合部分を含むポリペプチドの結合ドメインを含む融合タンパク質である。

【0074】

用語「修飾された抗体」は本発明のＴＩＧＩＴ抗体のアミノ酸配列変異体を指すのに本明細書で使用されてもよい。本発明のＴＩＧＩＴ抗体を修飾して、それが由来したＴＩＧＩＴ抗体と比べてアミノ酸配列で異なる変異体ＴＩＧＩＴ抗体を作り出してもよい。たとえば、「必須ではない」アミノ酸残基にて保存的な置換または変化につながるヌクレオチドまたはアミノ酸の置換を行ってもよい（たとえば、ＣＤＲ及び／またはフレームワークの残基にて）。アミノ酸置換は天然に存在するまたは天然に存在しないアミノ酸による１つ以上のアミノ酸の置き換えを含むことができる。

【0075】

「抗体断片」は完全長の抗体の一部、一般に、その抗原結合ドメインまたは可変ドメインを含む。抗原結合抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、二重特異性Ｆａｂ’、及びＦｖ断片、ジアボディ、直鎖抗体、単鎖抗体分子、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる（その内容が参照によって本明細書に組み入れられるＨｏｌｌｉｇｅｒ及びＨｕｄｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１１２６－１１３６，２００５を参照のこと）。

【0076】

本明細書で使用されるとき、用語「親和性変異体」は本発明の参照ＴＩＧＩＴ抗体と比べてアミノ酸配列で１つ以上の変化を示す変異体抗体を指し、その際、親和性変異体は参照抗体と比べてＴＩＧＩＴに対して変化した親和性を示す。好ましくは、親和性変異体は、参照ＴＩＧＩＴ抗体と比べてＴＩＧＩＴに対して改善された親和性を示す。改善は、ＴＩＧＩＴに対して低いＫＤまたはＴＩＧＩＴに対して遅いオフ速度として明らかであってもよい。親和性変異体は通常、参照ＴＩＧＩＴ抗体と比べてＣＤＲにおけるアミノ酸配列で１つ以上の変化を示す。そのような置換は、天然に存在するアミノ酸残基または天然に存在しないアミノ酸残基であってもよい異なるアミノ酸残基による、ＣＤＲにおける所与の位置に存在する元々のアミノ酸の置き換えを生じてもよい。アミノ酸置換は保存的であってもよいし、または非保存的であってもよい。

【0077】

本明細書で使用されるとき、用語「親和性」または「結合親和性」は抗体結合の文脈で当該技術における普通の意味に基づいて理解されるべきであり、抗原と抗体またはその抗原結合断片における結合部位との間での結合の強度及び／または安定性を反映する。本明細書で提供されている抗ＴＩＧＩＴ抗体はヒトＴＩＧＩＴへの高親和性の結合を特徴とする。ＴＩＧＩＴに対する結合親和性は当業者に既知の標準の技法を用いて評価されてもよい。

【0078】

結合親和性は特定の抗体についての解離定数またはＫ_Ｄとしても表現されてもよい。Ｋ_Ｄ値が小さければ小さいほど、抗体とその標的抗原の間の結合相互作用は強い。一実施形態では、定義されたＶＨ／ＶＬの対合を含むＦａｂクローンの結合親和性は、当該技術で既知の方法を用いて、たとえば、添付の実施例に記載されているように、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（商標）システムによって、ＭＳＤ溶液均衡滴定（ＳＥＴ）によって、または表面プラスモン共鳴によって、たとえば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）システムを用いて評価されてもよい。本発明に係る抗体のＦａｂ断片は通常、１×１０^－１０～５×１０^－８Ｍ、任意で７×１０^－１０～４×１０^－８Ｍの範囲でのＦｏｒｔｅＢｉｏ（商標）によって測定されるＴＩＧＩＴに対するＫ_Ｄを示す。この範囲内のＫ_ＤはＦａｂ及び相当する二価のｍＡｂがｈＴＩＧＩＴに対する高親和性結合を示す指標として解釈されてもよい。述べられた範囲内でｈＴＩＧＩＴに対するＫ_Ｄを（個々に）示す２つのＦａｂを含む二価のｍＡｂもまたｈＴＩＧＩＴに対して高親和性結合を示すと解釈される。１×１０^－１１～５×１０^－９、任意で２×１０^－１１～１×１０^－９の範囲でのＭＳＤのＫ_ＤはｈＴＩＧＩＴに対する高親和性結合を示す指標として解釈されてもよい。本発明に係る抗体のＦａｂ断片は通常、１×１０^－１０～１×１０^－９Ｍ、任意で１×１０^－１０～７×１０^－１０Ｍ、任意で２×１０^－１０～７×１０^－１０Ｍの範囲でのＢｉａｃｏｒｅ（商標）によって測定されるＴＩＧＩＴに対するＫ_Ｄを示す。この範囲内でのＫ_ＤはＦａｂ及び相当する二価のｍＡｂがｈＴＩＧＩＴに対する高親和性結合を示す指標として解釈されてもよい。

【0079】

ヒトＴＩＧＩＴに対する結合親和性は添付の実施例に記載されているように細胞に基づく系を用いても評価することもでき、その際、ｍＡｂは、たとえば、ＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリーを用いて哺乳類細胞（ＴＩＧＩＴを発現している細胞株またはエクスビボ細胞）への結合について調べられる。ＴＩＧＩＴに対する高親和性は、たとえば、実施例１０に記載されているもののようなフローサイトメトリー（たとえば、ＦＡＣＳ）解析により０．５ｎＭを超えるＥＣ_５０によって示されてもよい。特定の実施形態では、本発明の抗体は０．５ｎＭを超える、任意で０．２ｎＭを超える細胞結合ＥＣ_５０を示す。ＥＣ_５０として表現される親和性の細胞に基づく測定は好ましくは、ｈＴＩＧＩＴを発現しているＪｕｒｋａｔ細胞またはヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来する初代ＣＤ８Ｔ細胞を用いて測定される。

【0080】

本明細書で使用されるとき、「Ｔｒｅｇ細胞」または単に「Ｔｒｅｇ」は抑制性ＣＤ４＋Ｔ細胞―すなわち、従来のＴ細胞（ＣＤ８またはＣＤ４のＴ細胞）のエフェクター機能（複数可）を低下させるＴ細胞を指す。Ｔｒｅｇは当該技術で既知の方法に従って、たとえば、高レベルのＣＤ２５及び低レベルのＣＤ１２７またはＣＤ１２７の非存在を発現するＣＤ４細胞を特定するフローサイトメトリーを用いて特定することができる。

【0081】

上記でまとめられているように、本発明は少なくともある程度、ＴＩＧＩＴに結合する抗体及びその抗原結合断片に関する。本発明に係るＴＩＧＩＴ抗体及び抗体断片の特性及び特徴が今やさら詳細に記載されるであろう。

【0082】

抗ＴＩＧＩＴ抗体
態様の１つでは、本発明は、ヒトＴＩＧＩＴに結合し、且つ図１に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３の配列から選択される重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）と重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）と重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）とを含む重鎖可変ドメインを含み、さらに図２に示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３の配列から選択される軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）と軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）と軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）とを含む軽鎖可変ドメインを含む単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。すなわち、本発明は、ヒトＴＩＧＩＴに結合し、且つ重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）と重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）と重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）とを含む重鎖可変ドメインを含み、その際、
（ｉ）ＨＣＤＲ１は配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、２７１、２７４、及び２７７から成る群から選択され；
（ｉｉ）ＨＣＤＲ２は配列番号２、５、８、１１、１４、１７、２０、２３、２６、２９、３２、３５、３８、４１、４４、２７２、２７５、及び２７８から成る群から選択され；
（ｉｉｉ）ＨＣＤＲ３は配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、２７３、２７６、及び２７９から成る群から選択され；
且つさらに軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）と軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）と軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）とを含む軽鎖可変ドメインを含み、その際、
（ｉｖ）ＬＣＤＲ１は配列番号４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７３、７６、７９、８２、８５、８８、２８３、２８６、及び２８９から成る群から選択され；
（ｖ）ＬＣＤＲ２は配列番号４７、５０、５３、５６、５９、６２、６５、６８、７１、７４、７７、８０、８３、８６、８９、２８４、２８７、及び２９０から成る群から選択され；
（ｖｉ）ＬＣＤＲ３は配列番号４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１、８４、８７、９０、２８５、２８８、及び２９１から成る群から選択される、
単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。

【0083】

ＶＬドメインと対合して抗原（ヒトＴＩＧＩＴ）のための結合部位を形成するＶＨドメインを含む所与の抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片は、６つのＣＤＲ：可変重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）、可変重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、可変重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、可変軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）、可変軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、及び可変軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）の組み合わせを含むであろう。上記でリストにされたＣＤＲの配列群から選択される６つのＣＤＲの多数の異なる組み合わせが許容され、本発明の範囲内であるが、６つのＣＤＲの特定の組み合わせが特に好ましく；それらはヒトＴＩＧＩＴに対して高親和性結合を示す単一ｍＡｂ内での「ネイティブ」の組み合わせである。特定の実施形態では、抗体または抗原結合断片はＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３の組み合わせを含み、その際、組み合わせは、図２における相当する抗体に由来するＬＣＤＲと一緒に図１における各抗体に由来するＨＣＤＲによって形成される組み合わせの群から選択される。

【0084】

すなわち、特定の実施形態では、抗体または抗原結合断片はＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３の組み合わせを含み、その際、組み合わせは、
（ｉ）配列番号１を含むＨＣＤＲ１、配列番号２を含むＨＣＤＲ２、配列番号３を含むＨＣＤＲ３、配列番号４６を含むＬＣＤＲ１、配列番号４７を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号４８を含むＬＣＤＲ３；
（ｉｉ）配列番号４を含むＨＣＤＲ１、配列番号５を含むＨＣＤＲ２、配列番号６を含むＨＣＤＲ３、配列番号４９を含むＬＣＤＲ１、配列番号５０を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号５１を含むＬＣＤＲ３；
（ｉｉｉ）配列番号７を含むＨＣＤＲ１、配列番号８を含むＨＣＤＲ２、配列番号９を含むＨＣＤＲ３、配列番号５２を含むＬＣＤＲ１、配列番号５３を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号５４を含むＬＣＤＲ３；
（ｉｖ）配列番号１０を含むＨＣＤＲ１、配列番号１１を含むＨＣＤＲ２、配列番号１２を含むＨＣＤＲ３、配列番号５５を含むＬＣＤＲ１、配列番号５６を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号５７を含むＬＣＤＲ３；
（ｖ）配列番号１３を含むＨＣＤＲ１、配列番号１４を含むＨＣＤＲ２、配列番号１５を含むＨＣＤＲ３、配列番号５８を含むＬＣＤＲ１、配列番号５９を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号６０を含むＬＣＤＲ３；
（ｖｉ）配列番号１６を含むＨＣＤＲ１、配列番号１７を含むＨＣＤＲ２、配列番号１８を含むＨＣＤＲ３、配列番号６１を含むＬＣＤＲ１、配列番号６２を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号６３を含むＬＣＤＲ３；
（ｖｉｉ）配列番号１９を含むＨＣＤＲ１、配列番号２０を含むＨＣＤＲ２、配列番号２１を含むＨＣＤＲ３、配列番号６４を含むＬＣＤＲ１、配列番号６５を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号６６を含むＬＣＤＲ３；
（ｖｉｉｉ）配列番号２２を含むＨＣＤＲ１、配列番号２３を含むＨＣＤＲ２、配列番号２４を含むＨＣＤＲ３、配列番号６７を含むＬＣＤＲ１、配列番号６８を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号６９を含むＬＣＤＲ３；
（ｉｘ）配列番号２５を含むＨＣＤＲ１、配列番号２６を含むＨＣＤＲ２、配列番号２７を含むＨＣＤＲ３、配列番号７０を含むＬＣＤＲ１、配列番号７１を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号７２を含むＬＣＤＲ３；
（ｘ）配列番号２８を含むＨＣＤＲ１、配列番号２９を含むＨＣＤＲ２、配列番号３０を含むＨＣＤＲ３、配列番号７３を含むＬＣＤＲ１、配列番号７４を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号７５を含むＬＣＤＲ３；
（ｘｉ）配列番号３１を含むＨＣＤＲ１、配列番号３２を含むＨＣＤＲ２、配列番号３３を含むＨＣＤＲ３、配列番号７６を含むＬＣＤＲ１、配列番号７７を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号７８を含むＬＣＤＲ３；
（ｘｉｉ）配列番号３４を含むＨＣＤＲ１、配列番号３５を含むＨＣＤＲ２、配列番号３６を含むＨＣＤＲ３、配列番号７９を含むＬＣＤＲ１、配列番号８０を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号８１を含むＬＣＤＲ３；
（ｘｉｉｉ）配列番号３７を含むＨＣＤＲ１、配列番号３８を含むＨＣＤＲ２、配列番号３９を含むＨＣＤＲ３、配列番号８２を含むＬＣＤＲ１、配列番号８３を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号８４を含むＬＣＤＲ３；
（ｘｉｖ）配列番号４０を含むＨＣＤＲ１、配列番号４１を含むＨＣＤＲ２、配列番号４２を含むＨＣＤＲ３、配列番号８５を含むＬＣＤＲ１、配列番号８６を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号８７を含むＬＣＤＲ３；
（ｘｖ）配列番号４３を含むＨＣＤＲ１、配列番号４４を含むＨＣＤＲ２、配列番号４５を含むＨＣＤＲ３、配列番号８８を含むＬＣＤＲ１、配列番号８９を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号９０を含むＬＣＤＲ３；
（ｘｖｉ）配列番号２７１を含むＨＣＤＲ１、配列番号２７２を含むＨＣＤＲ２、配列番号２７３を含むＨＣＤＲ３、配列番号２８３を含むＬＣＤＲ１、配列番号２８４を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号２８５を含むＬＣＤＲ３；
（ｘｖｉｉ）配列番号２７４を含むＨＣＤＲ１、配列番号２７５を含むＨＣＤＲ２、配列番号２７６を含むＨＣＤＲ３、配列番号２８６を含むＬＣＤＲ１、配列番号２８７を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号２８８を含むＬＣＤＲ３；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号２７７を含むＨＣＤＲ１、配列番号２７８を含むＨＣＤＲ２、配列番号２７９を含むＨＣＤＲ３、配列番号２８９を含むＬＣＤＲ１、配列番号２９０を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号２９１を含むＬＣＤＲ３
から成る群から選択される。

【0085】

特定の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、３２７、３２９、及び３３１、ならびにそれらに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインを含み；任意で配列番号２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、３２８、３３０、及び３３２のアミノ酸配列、ならびにそれらに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む。

【0086】

上記でリストにされたＶＨドメイン及びＶＬドメインの配列群から選択されるＶＨドメイン及びＶＬドメインの考えられる対合すべてが許容でき、本発明の範囲内にあるが、特定の組み合わせのＶＨ及びＶＬが特に好ましく；それらはヒトＴＩＧＩＴに対する高親和性結合を示す単一ｍＡｂ内の「ネイティブの」組み合わせである。

【0087】

特定の実施形態では、抗体または抗原結合断片は重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとの組み合わせを含み、その際、組み合わせは図５における各抗体に由来するＶＬまたはそれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列と一緒に、図５における同じ抗体に由来するＶＨまたはそれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列によって形成される組み合わせの群から選択される。特定の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとの組み合わせを含み、その際、組み合わせは、
（ｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号２１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号２１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｉｉｉ）配列番号２１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号２１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｉｖ）配列番号２１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号２１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｖ）配列番号２１９のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号２２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｖｉ）配列番号２２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号２２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｖｉｉ）配列番号２２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号２２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｖｉｉｉ）配列番号２２５のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号２２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｉｘ）配列番号２２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号２２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｘ）配列番号２２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号２３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｘｉ）配列番号２３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号２３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｘｉｉ）配列番号２３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号２３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｘｉｉｉ）配列番号２３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号２３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｘｉｖ）配列番号２３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号２３８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｘｖ）配列番号２３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号２４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｘｖｉ）配列番号３２７のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号３２８のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
（ｘｖｉｉ）配列番号３２９のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号３３０のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；ならびに
（ｘｖｉｉｉ）配列番号３３１のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号３３２のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン
から成る群から選択される。

【0088】

上記でリストにした特定のＶＨ／ＶＬの組み合わせのそれぞれについては、引用されているＶＨドメイン配列に対して少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有するＶＨドメインを引用されているＶＬドメイン配列に対して少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有するＶＬドメインと組み合わせることも許容でき、本発明の範囲内である。ＶＨドメインのアミノ酸配列が所与の参照ＶＨ配列と１００％未満の配列同一性を示す実施形態は、それにもかかわらず、参照配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と同一である重鎖ＣＤＲを含んでもよい一方で、フレームワーク領域内でアミノ酸配列の変異を示す。同様に、ＶＬドメインのアミノ酸配列が所与の参照配列と１００％未満の配列同一性を示す実施形態はそれにもかかわらず、参照配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３と同一である軽鎖ＣＤＲを含んでもよい一方で、フレームワーク領域の範囲内でアミノ酸配列の変異を示す。

【0089】

先行する段落では、及び本明細書のどこか他では、抗体／抗原結合断片の構造は引用された参照配列との（所与の配列番号との）％配列同一性に基づいて定義される。この文脈で、２つのアミノ酸配列の間での％配列同一性は最適な方法で並べたこれら２つの配列を比較することによって決定されてもよく、その際、比較されるアミノ酸配列はこれら２つの配列間の最適な配列比較のために参照配列に関して付加または欠失を含むことができる。同一性の比率は、２つの配列間でアミノ酸残基が同一である同一の位置の数を決定し、同一の位置のこの数を比較ウインドウにおける位置の総数で割り、これら２つの配列間の同一性の比率を得るために、得られた結果に１００を乗じることによって算出される。通常、比較ウインドウは比較される配列の完全長に相当する。たとえば、サイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｂｌ２．ｈｔｍｌで利用できるＢＬＡＳＴプログラムである「ＢＬＡＳＴ２配列」（Ｔａｔｕｓｏｖａ，ｅｔ ａｌ，“Ｂｌａｓｔ ２ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ－ａ ｎｅｗ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”，ＦＥＭＳ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１７４：２４７－２５０）を使用することが可能であり、使用されるパラメーターは初期設定により与えられるもの（特にパラメーターについては、「開放ギャップペナルティ」が５及び「伸長ギャップペナルティ」が２；選択されるマトリクスは、たとえば、プログラムによって提案されるマトリクス「ＢＬＯＳＵＭ６２」）であり、比較される２つの配列間の同一性の比率はプログラムによって直接算出される。参照配列に対するクエリ配列の配列同一性を決定することは、当業者の能力の範囲内であり、ＢＬＡＳＴ（商標）のような市販の解析ソフトウェアを用いて実施することができる。

【0090】

本発明の態様すべての特定の好ましい実施形態では、抗体または抗原結合断片は、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとを含んでもよく、その際、ＨＣＤＲ１は配列番号１６を含み、ＨＣＤＲ２は配列番号１７を含み、ＨＣＤＲ３は配列番号１８を含み、ＬＣＤＲ１は配列番号６１を含み、ＬＣＤＲ２は配列番号６２を含み、ＬＣＤＲ３は配列番号６３を含む。

【0091】

特定のそのような実施形態では、重鎖可変ドメインは配列番号２２１として示されるアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含んでもよく、且つ軽鎖可変ドメインは配列番号２２２として示されるアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含んでもよい。特定のそのような実施形態では、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは本明細書で提供されている抗体３１２８２のＶＨドメイン及びＶＬドメインである。

【0092】

本明細書で提供されている抗体３１２８２は抗体２９４８９に由来する。抗体３１２８２はＶＨのＦＲ４領域におけるアミノ酸１１６でのＭ－Ｔ置換によって抗体２９４８９から作出された。この置換は、抗体の潜在的な酸化部位を取り除き、それによって機能に影響を及ぼすことなく安定性を改善すると理解されている。従って、抗体３１２８２及び２９４８９は、同一のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３の配列を共有し、フレームワークでのみで異なる。

【0093】

従って、本発明の抗体または抗原結合断片の特定の実施形態では、重鎖可変ドメインは配列番号２１９として示されるアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含んでもよく、且つ軽鎖可変ドメインは配列番号２２０として示されるアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含んでもよい。特定のそのような実施形態では、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは本明細書で提供されている抗体２９４８９のＶＨドメイン及びＶＬドメインである。

【0094】

ＶＨドメインのアミノ酸配列が配列番号２２１または２１９として示される配列と１００％未満の配列同一性を示す実施形態は、それにもかかわらず、配列番号２２１及び２１９のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３（それぞれ配列番号１６、１７及び１８）と同一である重鎖ＣＤＲを含んでもよい一方で、フレームワーク領域内でアミノ酸配列の変異を示す。同様に、ＶＬドメインのアミノ酸配列が配列番号２２２または２２０として示される配列と１００％未満の配列同一性を示す実施形態は、それにもかかわらず、配列番号２２２及び２２０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３（それぞれ配列番号６１、６２及び６３）と同一である軽鎖ＣＤＲを含んでもよい一方で、フレームワーク領域内でアミノ酸配列の変異を示す。

【0095】

（表２）

【0096】

本明細書に記載されている及び図１～５にて示された配列を有する例となるＴＩＧＩＴ抗体は５つの親型抗体クローンから発現させた。表２は本明細書に記載されている抗体の系列をまとめている。ナイーブな親型ヒト抗ＴＩＧＩＴ抗体は酵母で発現させ、ＴＩＧＩＴに対する高い機能的活性を示すものを選択し（灰色の列、２６．．．と名付けた）、親和性成熟を受けさせた。選択した親和性成熟した抗体を次いで哺乳類細胞で発現させた（各親型の下の白色の列、２９．．．または３．．．．と名付けた）。加えて、抗体３１２８２はＶＨのＦＲ４領域におけるアミノ酸１１６でのＭ－Ｔ置換によって抗体２９４８９から作出された。この置換は、抗体の潜在的な酸化部位を取り除き、それによって機能に影響を及ぼすことなく安定性を改善すると理解されている。加えて、抗体３１２８８はＶＨのＦＲ１領域におけるアミノ酸２でのＶ－Ｌ置換及びＶＨのＦＲ４領域におけるアミノ酸１２０でのＭ－Ｔ置換によって抗体２９４９４から作出された。Ｖ－Ｌ置換はＶＨ４－３９の生殖系列の配列を復元すると理解され、Ｍ－Ｔ置換は抗体の潜在的な酸化部位を取り除き、それによって機能に影響を及ぼすことなく安定性を改善すると理解されている。

【0097】

第２世代の抗体は各親型抗体よりも高い親和性を示す。

【0098】

特定の実施形態では、本発明は、ＶＨドメインがＶＨ３－０７、ＶＨ３－３０、ＶＨ１－４６、ＶＨ４－０Ｂ、ＶＨ４－３９、ＶＨ１－６９、ＶＨ３－０９、ＶＨ３－３３、ＶＨ３－３０から選択されるヒトＶ領域生殖系列の配列に由来する抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片を提供する。特定の好ましい実施形態では、抗体またはその抗原結合断片はヒトＶ領域生殖系列ＶＨ１－４６に由来するＶＨドメインを含む。

【0099】

重鎖可変領域の配列がその他よりも所与の生殖系列に由来する可能性が高いのであれば、ＶＨドメインは特定のＶ領域生殖系列の配列に「由来する」。

【0100】

ＴＩＧＩＴエピトープ
本発明はまた、残基Ｑ５６及びＩ１０９を含むエピトープにてヒトＴＩＧＩＴに結合する抗体またはその抗原結合断片も提供する。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は少なくとも残基Ｑ５６、Ｎ５８及びＩ１０９にてヒトＴＩＧＩＴを結合する。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は残基Ｑ５６、Ｎ５８及びＩ１０９及び任意でＥ６０、Ｉ６８、Ｌ７３及びＨ７６の１つ以上を含むエピトープにてヒトＴＩＧＩＴを結合する。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は残基Ｑ５６、Ｎ５８、Ｅ６０、Ｉ６８、Ｌ７３、Ｈ７６、及びＩ１０９を含むエピトープにてヒトＴＩＧＩＴを結合する。

【0101】

特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片はＴＩＧＩＴの残基Ｑ５６、Ｎ５８、Ｅ６０、Ｉ６８、Ｌ７３、Ｈ７６、及びＩ１０９から成るエピトープにてヒトＴＩＧＩＴを結合する。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は抗体３１２８２と同じエピトープを結合する。

【0102】

抗体または抗原結合断片が示されたＴＩＧＩＴ残基を含むヒトＴＩＧＩＴのエピトープを結合する場合、抗体はこれらの残基及び任意でＴＩＧＩＴの他の残基のそれぞれを結合する。抗体または抗原結合断片がＴＩＧＩＴの残基Ｑ５６、Ｎ５８、Ｅ６０、Ｉ６８、Ｌ７３、Ｈ７６、及びＩ１０９から成るヒトＴＩＧＩＴのエピトープを結合する場合、抗体はこれらの残基のそれぞれを結合し、ＴＩＧＩＴの他の残基を結合しない。

【0103】

ＴＩＧＩＴに結合する際、示されたＴＩＧＩＴのアミノ酸残基（複数可）に接触すれば、抗体または抗原結合断片は所与のエピトープにてヒトＴＩＧＩＴに結合する。本明細書で使用されるとき、抗体・ＴＩＧＩＴ結合によって形成されるタンパク質複合体にて、残基が以下の基準：（ｉ）０．３キロカロリー／モルを超える算出された結合自由エネルギーの寄与を有する、（ｉｉ）Ｘ線構造にてすべての残基の平均Ｂ因子よりも低い実験的な平均Ｂ因子を有する、（ｉｉｉ）４．０オングストローム以下の距離で少なくとも３対の重原子を抗体原子と原子間接触させる、（ｉｖ）溶媒に曝されただけの水素結合またはイオン相互作用を行わない、（ｖ）それが非芳香族の極性残基（Ａｓｎ、Ｇｉｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、またはＡｒｇ）であれば、抗体との少なくとも１つの水素結合またはイオン相互作用を行う、のそれぞれを満たせば、抗体はＴＩＧＩＴの残基に接触する。結合自由エネルギーの算出は当業者の能力の範囲内である。好ましくは、結合自由エネルギーは経験的力場、好ましくはＦｏｌｄＸを用いて算出される。ＦｏｌｄＸは当業者によく知られており、ｈｔｔｐ：／／ｆｏｌｄｘｓｕｉｔｅ．ｃｒｇ．ｅｕ／にて公的に利用できる。ＦｏｌｄＸを用いた結合自由エネルギーの算出は、参照によって本明細書に組み入れられるＧｕｅｒｏｉｓ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００２；３２０（２）：３６９－８７にも記載されている。当業者によく知られているように、重原子はすべての非水素原子（Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓを含む）である。

【0104】

従って、本発明はまた、少なくとも残基Ｑ５６及びＩ１０９にてヒトＴＩＧＩＴに接触する抗体またはその抗原結合断片も提供する。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は少なくとも残基Ｑ５６、Ｎ５８、及びＩ１０９にてヒトＴＩＧＩＴに接触する。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、少なくとも残基Ｑ５６、Ｎ５８及びＩ１０９及び任意で残基Ｅ６０、Ｉ６８、Ｌ７３及びＨ７６の１つ以上にてヒトＴＩＧＩＴに接触する。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、少なくとも残基Ｑ５６、Ｎ５８、Ｅ６０、Ｉ６８、Ｌ７３、Ｈ７６、及びＩ１０９にてヒトＴＩＧＩＴに接触する。

【0105】

特定のそのような実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は残基Ｑ５６、Ｎ５８、Ｅ６０、Ｉ６８、Ｌ７３、Ｈ７６、及びＩ１０９でのみヒトＴＩＧＩＴに接触する。

【0106】

たとえば、実施例２３に記載されているもののようなＸ線結晶学を含む、抗体またはその抗原結合断片がＴＩＧＩＴのどの残基に接触するのかを決定する手段は当業者によく知られている。

【0107】

提供されるのはまた、本明細書に記載されている抗体または抗原結合断片と同じエピトープに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片である。

【0108】

抗体のサブタイプ
ＴＩＧＩＴ抗体はＶＨドメイン及びＶＬドメインの双方が存在する種々の異なる実施形態を取ることができる。用語「抗体」は本明細書では最も広い意味で使用され、それらがヒトＴＩＧＩＴタンパク質に対する適正な免疫的特異性を示す限り、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（たとえば、二重特異性抗体）を包含するが、これらに限定されない。用語「モノクローナル抗体」は本明細書で使用されるとき、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、軽微な量で存在してもよい天然に存在する考えられる突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原性部位に向けられる。さらに、抗原上の異なる決定基（エピトープ）に向けられた異なる抗体を通常含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基またはエピトープに向けられる。

【0109】

非限定の実施形態では、本明細書で提供されているＴＩＧＩＴ抗体は、そのアミノ酸配列は完全にまたは実質的にヒトであるＣＨ１ドメイン及び／またはＣＬドメインを含んでもよい。ＴＩＧＩＴ抗体がヒトでの治療用途を対象とするのであれば、抗体の定常領域全体または少なくともその一部は完全にまたは実質的にヒトのアミノ酸配列を有することが典型的である。従って、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＬドメイン（及び存在すればＣＨ４ドメイン）の１つ以上またはその組み合わせはそのアミノ酸配列に関して完全にまたは実質的にヒトであってもよい。そのような抗体はヒトアイソタイプのものであってもよく、ヒトＩｇＧ４及びＩｇＧ１が特に好ましい。

【0110】

有利なことに、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、及びＣＬドメイン（及び存在するならばＣＨ４ドメイン）はすべて完全にまたは実質的にヒトのアミノ酸配列を有してもよい。ヒト化抗体またはキメラ抗体または抗体断片の定常領域の文脈では、用語「実質的にヒト」はヒト定常領域との少なくとも９０％、または少なくとも９２％、または少なくとも９５％、または少なくとも９７％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を指す。この文脈での用語「ヒトアミノ酸配列」は、生殖系列の遺伝子、再構成された遺伝子及び体細胞変異した遺伝子を含むヒト免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を指す。そのような抗体は任意のヒトアイソタイプのものであってもよく、ヒトのＩｇＧ４及びＩｇＧ１が特に好ましい。

【0111】

提供されるのはまた、ヒト配列に関して１つ以上のアミノ酸の付加、欠失または置換によって変えられている「ヒト」配列の定常ドメインを含むＴＩＧＩＴ抗体である。

【0112】

本明細書で提供されているＴＩＧＩＴ抗体は任意のアイソタイプのものであってもよい。ヒトでの治療用途を対象とする抗体は通常、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭの型のものであり、ＩｇＧ型のものが多く、その場合、それらは４つのサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びｂ、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のいずれかに属することができる。これらのサブクラスのそれぞれの範囲内で、Ｆｃ部分内で１つ以上のアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失を行うこと、または、たとえば、Ｆｃ依存性の機能性を高めるまたは低下させるために他の構造的修飾を行うことが許される。

【0113】

特定の好ましい実施形態では、本明細書で提供されているＴＩＧＩＴ抗体はＩｇＧ抗体である。特定の実施形態では、本発明に係る抗体はＩｇＧ１抗体である。特定の代替の実施形態では、本発明に係る抗体はＩｇＧ４抗体である。

【0114】

ＩｇＧ４抗体はＦａｂアームの交換（ＦＡＥ）を受けることが知られており、ＩｇＧ４抗体の予測できない薬物動態特性を生じることができる。ＦＡＥはヒンジ領域におけるＳ２２８Ｐ突然変異によって阻止されることが示されている（Ｓｉｌｖａ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１５，Ｆｅｂ．２７；２９０（９）：５４６２－５４６９）。従って、本発明に係る抗体がＩｇＧ４抗体である特定のそのような実施形態では、抗体は突然変異Ｓ２２８Ｐ―すなわち、２２８位（ＥＵ番号付けに従って）におけるセリンからプロリンへの突然変異を含む。

【0115】

非限定の実施形態では、１つ以上のアミノ酸の置換、挿入または欠失が重鎖及び／または軽鎖の定常領域内、特にＦｃ領域内で行われてもよいことが熟考される。アミノ酸置換は、異なる天然に存在するアミノ酸または天然に存在しないまたは修飾されたアミノ酸によって置換されたアミノ酸の置き換えを生じてもよい。他の構造的修飾、たとえば、グリコシル化パターンの変化（たとえば、Ｎ連結またはＯ連結のグリコシル化部位の付加または欠失による）も許される。ＴＩＧＩＴ抗体の目的とする用途に応じて、Ｆｃ受容体への結合特性に関して本発明の抗体を修飾して、たとえば、エフェクター機能を調節することが望ましくてもよい。

【0116】

特定の実施形態では、ＴＩＧＩＴ抗体は所与の抗体アイソタイプ、たとえば、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を含んでもよく、それはその抗体アイソタイプに自然に関連する１つ以上の抗体のエフェクター機能を低下させるまたは実質的に排除するために修飾される。

【0117】

本明細書で実証されているように、細胞溶解のエフェクター機能を持つ抗体はＴｒｅｇ細胞集団を減らすことで有効であり得るが、驚くべきことに従来のエフェクターＴ細胞集団に有害効果を及ぼさない。この選択性は抗腫瘍エフェクターＴ細胞を保持しながら、Ｔｒｅｇの抑制性効果のさらに強力な阻害を可能にすることができる。

【0118】

従って、特定の代替の実施形態では、ＴＩＧＩＴ抗体はその抗体アイソタイプに自然に関連する抗体のエフェクター機能の１つ以上を保持する。たとえば、本発明のＴＩＧＩＴ抗体はＡＤＣＣ機能性を保持するＩｇＧ１抗体であってもよい。さらなる実施形態では、ＴＩＧＩＴ抗体は所与の抗体アイソタイプ、たとえば、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を含んでもよく、それはその抗体アイソタイプに自然に関連する１つ以上の抗体エフェクター機能を高めるために修飾される。この文脈で、「抗体のエフェクター機能」には、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び抗体依存性細胞性貪食（ＡＤＣＰ）の１つ以上またはすべてが含まれる。

【0119】

特定の実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体は修飾された抗体である。

【0120】

特定の実施形態では、提供されるのは、ＴＩＧＩＴに特異的な第１のアームと第２の標的に特異的な第２のアームとを含む二重特異性抗体である。好ましい実施形態では、第２の標的は免疫チェックポイント分子である。特定の実施形態では、第２の標的はＯＸ４０である。特定の実施形態では、第２の標的はＩＣＯＳである。特定の実施形態では、第２の標的はＧＩＴＲである。特定の実施形態では、第２の標的は４－１ＢＢである。特定の実施形態では、第２の標的はＰＤ－１である。特定の実施形態では、第２の標的はＰＤ－Ｌ１である。特定の実施形態では、ＴＩＧＩＴに特異的な第１のアームは本発明に係る抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３の配列の組み合わせを含む。特定の実施形態では、第１のアームは重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み、その際、ＨＣＤＲ１は配列番号１６を含み、ＨＣＤＲ２は配列番号１７を含み、ＨＣＤＲ３は配列番号１８を含み、ＬＣＤＲ１は配列番号６１を含み、ＬＣＤＲ２は配列番号６２を含み、ＬＣＤＲ３は配列番号６３を含む。

【0121】

本明細書で開示されているＴＩＧＩＴ抗体と「交差競合する」モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、本ＴＩＧＩＴ抗体が結合する部位（複数可）と同一であるまたは重複する部位（複数可）にてヒトＴＩＧＩＴを結合するものである。競合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、たとえば、抗体競合アッセイを介して特定することができる。たとえば、精製したまたは部分精製したヒトＴＩＧＩＴの試料を固形支持体に結合することができる。次いで、本発明の抗体化合物またはその抗原結合断片及びそのような本発明の抗体化合物と競合することができると疑われるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を加える。２つの分子の一方が標識される。標識した化合物及び未標識の化合物がＴＩＧＩＴ上の別々の異なる部位に結合するのであれば、疑われる競合化合物が存在しようと存在すまいと、標識した化合物は同じレベルに結合するであろう。しかしながら、相互作用の部位が同一であるならば、または重複するならば、未標識の化合物は競合するであろうし、抗原に結合する標識した化合物の量は低下するであろう。たとえあったとしても未標識の化合物が非常にわずかに過剰に存在するならば、標識した化合物は結合するであろう。

【0122】

本発明の目的で、競合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、本抗体化合物のＴＩＧＩＴへの結合を約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％低下させるものである。そのような競合アッセイを実施する手順の詳細は当該技術で周知であり、たとえば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８，５６７－５６９，１９８８，ＩＳＢＮ ０－８７９６９－３１４－２に見いだすことができる。そのようなアッセイは精製抗体を用いて定量的に行うことができる。標準曲線はそれ自体に対して１つの抗体を滴定することによって確立され、すなわち、同じ抗体を標識及び競合相手の双方に使用する。プレートへの標識分子の結合を阻害する未標識の競合モノクローナル抗体またはその抗原結合断片の能力が滴定される。結果をプロットし、結合阻害の所望の程度を達成するのに必要な濃度を比較する。

【0123】

本発明の抗体はＴＩＧＩＴに対して高親和性を示し、ＣＤ１５５と競合する
特定の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片はヒトＴＩＧＩＴに対して高親和性を示す。特定の実施形態では、本発明に係る抗体のＦａｂ断片は１×１０^－１０～５×１０^－８Ｍ、任意で７×１０^－１０～４×１０^－８Ｍの範囲のＦｏｒｔｅＢｉｏ（商標）によって測定されるＴＩＧＩＴに対するＫ_Ｄを示す。特定の実施形態では、本発明に係る抗体は１×１０^－１１～５×１０^－９Ｍ、任意で２×１０^－１１～１×１０^－９Ｍの範囲のＭＳＤのＫ_Ｄを示す。特定の実施形態では、本発明に係る抗体のＦａｂ断片は１×１０^－１０～１×１０^－９Ｍ、任意で１×１０^－１０～７×１０^－１０Ｍ、任意で２×１０^－１０～７×１０^－１０Ｍの範囲でＢｉａｃｏｒｅ（商標）によって測定されるＴＩＧＩＴに対するＫ_Ｄを示す。

【0124】

（表３）

【0125】

実施例で実証されているように、抗体３１２８２は驚くべきことに、トランスジェニック細胞にて発現されたＴＩＧＩＴに対して高親和性を示す。従って、特定の実施形態では、本明細書で提供されている抗ＴＩＧＩＴ抗体または抗原結合断片は０．５ｎＭ未満のヒトＴＩＧＩＴに対する結合ＥＣ_５０を示す。好ましいそのような実施形態では、抗体または抗原結合断片は、約０．０５～約０．４ｎＭ、好ましくは約０．０５～約０．３ｎＭ、好ましくは約０．０５～約０．２ｎＭ、好ましくは約０．０５～０．１５ｎＭの結合ＥＣ_５０を示す。特定の好ましい実施形態では、抗体または抗原結合断片は約０．１ｎＭのヒトＴＩＧＩＴに対する結合ＥＣ_５０を示す。好ましい実施形態では、抗体は抗体３１２８２のＣＤＲを含む。好ましくは、ＥＣ_５０は実施例１８に記載されているようにヒトＴＩＧＩＴを発現しているＪｕｒｋａｔ細胞を用いて決定される。特定の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片は、マウスＴＩＧＩＴ及び／またはカニクイザルＴＩＧＩＴと交差反応する。

【0126】

「２９．．．」第２世代の抗体は高度に機能的な親型抗体の親和性成熟した子孫なので、それらは親型抗体と少なくとも類似のまたは同等の機能的特性を示すことが期待され、逆もまた同様である。

【0127】

本明細書に記載されているように、特定の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片は、ＣＤ８Ｔ細胞によって発現されるＴＩＧＩＴ及びＴｒｅｇ細胞によって発現されるＴＩＧＩＴに対して同等の親和性を有する。本明細書で使用されるとき、ＣＤ８Ｔ細胞に対する親和性がＴｒｅｇ細胞に対する親和性の０．５～１．５倍の範囲にあれば、抗体または抗原結合断片は、ＣＤ８Ｔ細胞及びＴｒｅｇ細胞に対して「同等の親和性」を有する。たとえば、０．０３ｎＭのＴｒｅｇ細胞に対する親和性を示す、ＣＤ８Ｔ細胞及びＴｒｅｇ細胞に対して同等の親和性を有する抗体は０．０１５～０．０４５ｎＭの範囲でのＣＤ８Ｔ細胞に対する親和性を示すことになる。

【0128】

表３は本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体の親和性特性のまとめを提供し、灰色のマス目は親型抗体のクローンを示し、各系列の第２世代及び第３世代の抗体は各親型抗体のすぐ下に示されている（表２も参照のこと）。

【0129】

実施例で実証されているように、抗体３１２８２は驚くべきことに、ヒト初代ＣＤ８＋Ｔ細胞上に発現されるＴＩＧＩＴに対する高い親和性を示す。従って、特定の実施形態では、本明細書で提供されている抗ＴＩＧＩＴ抗体または抗原結合断片は、０．５ｎＭ未満のヒトＴＩＧＩＴに対する結合ＥＣ_５０を示す。好ましいそのような実施形態では、抗体または抗原結合断片は、約０．０５～約０．４ｎＭ、好ましくは約０．１～約０．３ｎＭの結合ＥＣ_５０を示す。特定の好ましい実施形態では、抗体または抗原結合断片は、約０．２ｎＭのヒトＴＩＧＩＴに対する結合ＥＣ_５０を示す。好ましい実施形態では、抗体または抗原結合断片は、抗体３１２８２のＣＤＲを含む。好ましくは、ＥＣ_５０は、実施例１８に記載されているようにヒトＰＢＭＣ、好ましくは健常個体に由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を用いて決定される。

【0130】

付随する実施例にて実証されているように、特定の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片は、ＴＩＧＩＴを発現しているＣＤ８Ｔ細胞に対する高い親和性及びＴＩＧＩＴを発現しているＴｒｅｇ細胞に対する高い親和性を示す。特定の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片は、０．５ｎＭ未満、好ましくは０．３ｎＭ未満、好ましくは０．２ｎＭ未満のＥＣ_５０を特徴とする、ＴＩＧＩＴを発現しているＣＤ８Ｔ細胞及びＴＩＧＩＴを発現しているＴｒｅｇ細胞に対する親和性を示す。特定の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片は、ＴＩＧＩＴを発現しているＣＤ８Ｔ細胞及びＴＩＧＩＴを発現しているＴｒｅｇ細胞に対して同等の親和性を示す。

【0131】

本発明に係る抗体（たとえば、抗体３１２８２）は驚くべきことに、がん患者に由来するＣＤ８＋Ｔ細胞に対する高い親和性を示す。ＴＩＧＩＴのシグナル伝達の阻害によって、がん患者に由来するＴ細胞のエフェクター活性を高めることはさらに効果的な腫瘍制御につながり得るので、このことは特に有利である。従って、特定の実施形態では、本明細書で提供されている抗ＴＩＧＩＴ抗体または抗原結合断片は、がん患者に由来するヒトＣＤ８＋Ｔ細胞上のヒトＴＩＧＩＴに対する０．５ｎＭ未満の結合ＥＣ_５０を示す。好ましいそのような実施形態では、抗体または抗原結合断片は、約０．０５～約０．４ｎＭ、好ましくは約０．１～約０．３ｎＭの結合ＥＣ_５０を示す。特定の好ましい実施形態では、抗体または抗原結合断片は、約０．１～約０．２ｎＭのヒトＴＩＧＩＴに対するＥＣ_５０を示す。好ましい実施形態では、抗体または抗原結合断片は抗体３１２８２のＣＤＲを含む。好ましくは、ＥＣ_５０は実施例１８に記載されているようにがんの患者から採取したＰＢＭＣに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を用いて決定される。

【0132】

付随する実施例で実証されているように、特定の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片は、ＴＩＧＩＴの結合についてＣＤ１５５／ＰＶＲと競合する。特定の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片は、０．２ｎＭ以下、好ましくは０．１ｎＭ以下のＩＣ_５０を特徴とするＣＤ１５５との競合を示す。特定の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、約０．０５ｎＭ以下のＩＣ_５０を特徴とするＣＤ１５５との競合を示す。特定の好ましい実施形態では、示されるＩＣ_５０は約０．０５ｎＭである。理論によって束縛されることを望まないで、ＴＩＧＩＴ結合についてのＣＤ１５５との抗体の競合は、ＣＤ１５５が誘導しＴＩＧＩＴが介在するシグナル伝達のレベルを低下させ、それによってエフェクターＴ細胞の活性化のレベルを高めると予想される。

【0133】

本発明はさらに、本明細書に記載されている抗体の「親和性変異体」を提供する。

【0134】

本発明はまた、ヒトＴＩＧＩＴへの結合について本明細書に記載されている抗体または抗原結合断片と交差競合する単離された抗体またはその抗原結合断片も提供する。

【0135】

本発明の抗体は炎症誘発性のＴ細胞活性を促進する
本発明に係る抗体（たとえば、抗体３１２８２）は驚くべきことに、ＣＤ８＋Ｔ細胞の炎症誘発性活性を促進することにて効果的である。実施例で実証されているように、本発明の抗体または抗原結合断片（特に３１２８２）は、比較基準である抗ＴＩＧＩＴ抗体よりも炎症誘発性ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性を促進すること（ＩＦＮｇの放出によって示される）にてさらに効果的である（図２４を参照のこと）。比較基準抗体に対するこの改善された有効性はＴＩＧＩＴを発現しているトランスジェニックＪｕｒｋａｔレポーター細胞及び初代ＣＤ８Ｔ細胞において実証された。従って、特定の実施形態では、本明細書で提供されている抗ＴＩＧＩＴ抗体または抗原結合断片は、実施例１９に記載されているようにＪｕｒｋａｔレポーター細胞によって発現させたヒトＴＩＧＩＴに対する５ｎＭ未満の活性化ＥＣ_５０を示す。好ましいそのような実施形態では、抗体または抗原結合断片は、約１ｎＭ～約４ｎＭ、好ましくは約２ｎＭ～約４ｎＭのＥＣ_５０を示す。

【0136】

特定の実施形態では、本明細書で提供されている抗ＴＩＧＩＴ抗体または抗原結合断片は、実施例１９に記載されているように健常な個体に由来するＣＤ８Ｔ細胞に対して０．４ｎＭ未満の活性化ＥＣ_５０を示す。ＣＤ８Ｔ細胞の活性（すなわち、炎症誘発性活性）は炎症性サイトカイン（たとえば、ＩＦＮｇ）の産生によって測定されてもよい。好ましいそのような実施形態では、抗体または抗原結合断片は、約０．０５ｎＭ～約０．４ｎＭ、好ましくは約０．１ｎＭ～約０．２ｎＭのＥＣ_５０を示す。好ましくは、ＥＣ_５０は実施例１９に記載されているように健常な個体から採取したＰＢＭＣに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を用いて決定される。

【0137】

提供されている抗ＴＩＧＩＴ抗体はガンマ・デルタ（γδまたはｇ／ｄ）Ｔ細胞（すなわち、従来のαβＴＣＲサブユニットに対比するものとしてγδＴＣＲサブユニットを発現しているＴ細胞）の活性を高めることにて効果的であることが付随する実施例においてさらに且つ驚くべきことに実証されている。そのようなγδＴ細胞は免疫系の異なる且つ重要な成分を形成し、これらの細胞の活性を促進する本明細書で提供されている抗体の能力は抗体の有用性を強調している。

【0138】

従って、本明細書で提供されるのはまた、γδＴ細胞の集団を抗ＴＩＧＩＴ抗体に接触させることを含むγδＴ細胞の活性を促進する方法である。特定の実施形態では、方法はインビトロで実施される。特定の実施形態では、方法はヒト対象にてインビボで実施される。特定のそのような実施形態では、ヒト対象はがんを有する。特定の実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体または抗原結合断片は、本発明に係る抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３の配列の組み合わせを含む。特定の実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体は重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとを含み、その際、ＨＣＤＲ１は配列番号１６を含み、ＨＣＤＲ２は配列番号１７を含み、ＨＣＤＲ３は配列番号１８を含み、ＬＣＤＲ１は配列番号６１を含み、ＬＣＤＲ２は配列番号６２を含み、ＬＣＤＲ３は配列番号６３を含む。

【0139】

Ｔｒｅｇ細胞の選択的枯渇
本明細書で実証されているように、抗ＴＩＧＩＴ抗体はＴＩＧＩＴを発現しているＴｒｅｇ細胞を選択的に枯渇させることができる。すなわち、抗ＴＩＧＩＴ抗体はそれらがエフェクターまたはメモリーのＣＤ４またはＣＤ８のＴ細胞の比率を減らすよりも大きな程度にＴ細胞の集団全体に対するＴＩＧＩＴを発現しているＴｒｅｇ細胞の比率を減らす。

【0140】

特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＴＩＧＩＴを発現しているＴｒｅｇ細胞を選択的に枯渇させる。

【0141】

ＴＩＧＩＴを発現しているＴｒｅｇ細胞のこの選択的枯渇にはＴＩＧＩＴを発現しているＴｒｅｇ細胞の選択的溶解が介在することができる（たとえば、ＡＤＣＣまたはＣＤＣによる（図２０、２１及び２５を参照のこと））。ＴＩＧＩＴを発現しているＴｒｅｇ細胞はＴＩＧＩＴを発現していないＴｒｅｇよりもさらに強力な抑制性細胞であると理解されている。理論によって束縛されることを望まないで、ＴＩＧＩＴを発現しているＴｒｅｇ細胞の溶解による選択的枯渇は、Ｔｒｅｇの全体数を枯渇させるが、さらに強力な抑制性機能を示すＴｒｅｇ細胞も枯渇させることによってＴ細胞のエフェクター機能（たとえば、Ｔ細胞が介在する細胞傷害、炎症誘発性サイトカインの放出）を高めると予想される。この高められたＴ細胞のエフェクター機能は図２４にて実証されている。

【0142】

従って、特定の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片はＴＩＧＩＴを発現しているＴｒｅｇ細胞を選択的に溶解する。

【0143】

ＴＩＧＩＴを発現しているＴｒｅｇ細胞の選択的枯渇には、それがもはや細胞膜で発現されないようにＴＩＧＩＴ受容体の内部移行を誘導することも介在することができる。理論によって束縛されることを望まないで、ＴＩＧＩＴ^＋Ｔｒｅｇ細胞がＴＩＧＩＴ^－Ｔｒｅｇ細胞になるようにＴＩＧＩＴの内部移行を誘導することによって、これらの細胞の抑制性機能はあまり強力ではなくなると予想される（ＴＩＧＩＴ^＋Ｔｒｅｇがさらに強力な抑制性細胞なので）。受容体の内部移行及びこれらＴｒｅｇの抑制性効力のその後の低下の結果、Ｔ細胞のエフェクター機能は高まると予想される。従って、特定の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片は、好ましくはＴＩＧＩＴを発現しているＴｒｅｇ細胞によるＴＩＧＩＴの内部移行を誘導することによってＴＩＧＩＴを発現しているＴｒｅｇ細胞の抑制活性を阻害する。

【0144】

ＣＤ８Ｔ細胞及びＴｒｅｇ細胞に対して高親和性を示し、Ｔｒｅｇ細胞の選択的枯渇も示し、それによって２つのメカニズムを介してＴ細胞のエフェクター機能を促進することは、本発明に係る抗ＴＩＧＩＴ抗体にとって特に有利である。抗体エフェクター機能（たとえば、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ）の保持はＴｒｅｇの効果的な枯渇を生じ、選択性は抗体エフェクター機能がエフェクターＴ細胞の望まれていない枯渇を生じないことを意味する。抗ＴＩＧＩＴ抗体を作り出す以前の試みはＴＩＧＩＴを発現しているエフェクターＴ細胞の溶解を回避するために抗体のエフェクター機能を排除しようとしていたので、選択性は特に驚くべきことである。さらに、本発明のＴＩＧＩＴ抗体はエフェクターＴ細胞（たとえば、ＣＤ８Ｔ細胞）に対する親和性を示すので、これらの細胞におけるＴＩＧＩＴが介在するシグナル伝達はＣＤ１５５結合についての競合によって、及び／またはエフェクターＴ細胞上のＴＩＧＩＴの内部移行を誘発することによって阻害することができる。組み合わせて、本発明の抗体のこれらの効果はＴ細胞エフェクター機能の有意な上方調節を生じることができる。

【0145】

さらなる態様では、提供されるのはＴ細胞の集団を抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片と接触させ、それによって抗ＴＩＧＩＴ抗体がＴｒｅｇ細胞の集団を選択的に枯渇させることを含む、Ｔ細胞の集団からＴｒｅｇ細胞を選択的に枯渇させる方法である。特定の実施形態では、方法はインビトロで実施される。特定の実施形態では、方法はヒト対象にてインビボで実施される。特定のそのような実施形態では、ヒト対象はがんを有する。特定の実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体または抗原結合断片は本発明に係る抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３の配列の組み合わせを含む。特定の実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＨＣＤＲ１が配列番号１６を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号１７を含み、ＨＣＤＲ３が配列番号１８を含み、ＬＣＤＲ１が配列番号６１を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号６２を含み、且つＬＣＤＲ３が配列番号６３を含む重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとを含む。

【0146】

さらに有利な特性
本発明に係る抗体または抗原結合断片によって示されたさらに驚くべき有利な特性には、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）のＴ細胞エフェクター機能（たとえば、炎症誘発性サイトカインの放出）を高めることが挙げられる。腫瘍微小環境への曝露は、たぶん抗原過剰曝露及び／または免疫抑制性腫瘍微小環境のせいで、反応不顕性のまたはいわゆる「疲弊した」表現型を示すＴＩＬをもたらすことができる。腫瘍自体に浸潤しているので腫瘍のサイズまたは増殖を減らすのに最良に適する場所に位置する細胞なので、ＴＩＬのエフェクター機能を高めることは望ましい；しかしながら、多数のＴＩＬの反応不顕性のまたは疲弊した表現型のせいでそのエフェクター機能を強化するのは難しいと予想される。従って、本発明の抗体への曝露に続くＴＩＬの炎症誘発性反応における上昇は驚くべきことであり、抗体が特に有効な治療剤であってもよいことを示している。

【0147】

抗体または抗原結合断片によって示されたその上さらに驚くべき有利な特性には、ガンマ・デルタ（γδ）Ｔ細胞の炎症誘発性活性を高める能力が挙げられる。たとえば、γδＴ細胞のような非従来型のＴ細胞の活性を促進する能力は抗ＴＩＧＩＴ抗体については以前報告されておらず、γδＴ細胞が重要であることが知られているがん以外の疾患を治療する潜在力を提供している。たとえば、γδＴ細胞は、病原性感染（細菌、ウイルス（たとえば、ＣＭＶ）、真菌）に対する応答に関与するとともに、自己免疫疾患から保護することにおいて役割を有することが報告されている。加えて、非従来型のＴ細胞の活性を促進する驚くべき能力は抗体の抗腫瘍効果にさらなる効力を提供する。

【0148】

抗体及び抗原結合断片によって示されたその上さらに驚くべき有利な特性には悪性Ｔ細胞を選択的に枯渇させる一方で正常Ｔ細胞を容認する能力が挙げられる。本発明の抗体（たとえば、３１２８２）は十中八九ＡＤＣＣを介して悪性Ｔ細胞（たとえば、ＣＤ４^＋T細胞）を選択的に枯渇させることができる。しかしながら、健常なＴ細胞に対して限定的な影響がある。このことは、たとえば、Ｔ細胞リンパ腫（たとえば、セザリー症候群）のようなＴ細胞疾患の治療に特に有用である本発明の抗体を指摘する。

【0149】

ＣＤ１５５と競合しないＴＩＧＩＴ抗体
付随する実施例で実証されているように、本発明はまた、ＴＩＧＩＴの結合についてＣＤ１５５／ＰＶＲと競合しない抗ＴＩＧＩＴ抗体も提供する。従って、さらなる態様では、本発明はヒトＴＩＧＩＴの結合についてＣＤ１５５／ＰＶＲと競合しないヒトＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片を提供する。特定のそのような実施形態では、本発明に係るＣＤ１５５と競合しない抗ＴＩＧＩＴ抗体のＦａｂ断片は５×１０^－９～５×１０^－８Ｍ、任意で１×１０^－８～３×１０^－８Ｍの範囲でのＦｏｒｔｅＢｉｏ（商標）によって測定されるＴＩＧＩＴに対するＫ_Ｄを示す。

【0150】

特定の好ましい実施形態では、抗体は重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとを含んでもよく、その際、ＨＣＤＲ１は配列番号２８０を含み、ＨＣＤＲ２は配列番号２８１を含み、ＨＣＤＲ３は配列番号２８２を含み、ＬＣＤＲ１は配列番号２９２を含み、ＬＣＤＲ２は配列番号２９３を含み、ＬＣＤＲ３は配列番号２９４を含む。特定のそのような実施形態では、重鎖可変ドメインは配列番号３３３として示されるアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含んでもよく、且つ軽鎖可変ドメインは配列番号３３４として示されるアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含んでもよい。

【0151】

ＶＨドメインのアミノ酸配列が配列番号３３３として示される配列と１００％未満の配列同一性を示す実施形態はそれにもかかわらず、配列番号３３３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３（それぞれ配列番号２８０、２８１、２８２）と同一である重鎖ＣＤＲを含んでもよい一方で、フレームワーク領域内でアミノ酸配列の変異を示す。同様に、ＶＬドメインのアミノ酸配列が配列番号３３４として示される配列と１００％未満の配列同一性を示す実施形態はそれにもかかわらず、配列番号３３４のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３（それぞれ配列番号２９２、２９３、２９４）と同一である軽鎖ＣＤＲを含んでもよい一方で、フレームワーク領域内でアミノ酸配列の変異を示す。

【0152】

特定の好ましい実施形態では、抗体は重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとを含んでもよく、その際、ＨＣＤＲ１は配列番号３５３を含み、ＨＣＤＲ２は配列番号３５４を含み、ＨＣＤＲ３は配列番号３５５を含み、ＬＣＤＲ１は配列番号３５６を含み、ＬＣＤＲ２は配列番号３５７を含み、ＬＣＤＲ３は配列番号３５８を含む。特定のそのような実施形態では、重鎖可変ドメインは配列番号３６７として示されるアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含んでもよく、且つ軽鎖可変ドメインは配列番号３６８として示されるアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含んでもよい。

【0153】

ＶＨドメインのアミノ酸配列が配列番号３６７として示される配列と１００％未満の配列同一性を示す実施形態はそれにもかかわらず、配列番号３６７のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３（それぞれ配列番号３５３、３５４、３５５）と同一である重鎖ＣＤＲを含んでもよい一方で、フレームワーク領域内でアミノ酸配列の変異を示す。同様に、ＶＬドメインのアミノ酸配列が配列番号３６８として示される配列と１００％未満の配列同一性を示す実施形態はそれにもかかわらず、配列番号３６８のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３（それぞれ配列番号３５６、３５７、３５８）と同一である軽鎖ＣＤＲを含んでもよい一方で、フレームワーク領域内でアミノ酸配列の変異を示す。

【0154】

ポリヌクレオチド、ベクター、及び発現システム
本発明はまた、本発明のＴＩＧＩＴ抗体をコードするポリヌクレオチド分子と、宿主細胞または無細胞発現システムにおける抗原結合ポリペプチドの発現を可能にする調節配列に動作可能に連結された本発明のＴＩＧＩＴ抗体をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターと、この発現ベクターを含有する宿主細胞または無細胞発現システムとを提供する。

【0155】

本発明のＴＩＧＩＴ抗体をコードするポリヌクレオチド分子には、たとえば、組換えＤＮＡ分子が挙げられる。用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド分子」は本明細書では相互交換可能に使用され、一本鎖または二本鎖の任意のＤＮＡまたはＲＮＡの分子、及び一本鎖であれば、その相補性配列の分子を指す。核酸分子を議論することにおいて、特定の核酸分子の配列または構造は、５’から３’の方向での配列を提供する普通の慣例に従って本明細書で記載されてもよい。本発明の一部の実施形態では、核酸またはポリヌクレオチドは「単離される」。この用語は、核酸分子に適用される場合、それが由来した生物の天然に存在するゲノムにてそれが直接隣接する配列から分離されている核酸分子を指す。たとえば、「単離された核酸」は、たとえば、プラスミドもしくはウイルスベクターのようなベクターに挿入された、または原核細胞もしくは真核細胞もしくは非ヒト宿主生物のゲノムＤＮＡに組み込まれたＤＮＡ分子を含んでもよい。ＲＮＡに適用される場合、用語「単離されたポリヌクレオチド」は主として、上記で定義されたような単離されたＤＮＡ分子によってコードされたＲＮＡ分子を指す。あるいは、その用語は天然の状態（すなわち、細胞または組織にて）でそれが会合している他の核酸から精製されている／分離されているＲＮＡ分子を指してもよい。単離されたポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）はさらに、生物学的手段または合成手段によって直接作出され、作出の間に存在する他の成分から分離された分子を表してもよい。

【0156】

本発明に係るＴＩＧＩＴ抗体の組換え生産については、それをコードする組換えポリヌクレオチドを調製し（標準の分子生物学的技法を用いて）、選択した宿主細胞または無細胞発現システムでの発現のために複製可能なベクターに挿入してもよい。好適な宿主細胞は、原核細胞、酵母細胞、または高等真核細胞、具体的には哺乳類細胞であってもよい。有用な哺乳類宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換したサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）；ヒト胚性腎臓株（２９３細胞または浮遊培養での増殖のためにサブクローン化した２９３細胞；Ｇｒａｈａｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９－７４，１９７７）；幼若ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６，１９８０；またはＣＨＯ－Ｋ１、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－６１のようなＣＨＯに由来するクローン、Ｋａｏ及びＰｕｃｋ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ，ＶＩＩ． Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ ｍｕｔａｎｔｓ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｃｅｌｌｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６０：１２７５－１２８１，１９６８）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４；Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５２，１９８０）；マウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０－ＡＧ１４（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８１；ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８２８７）またはＮＳ０（ＨＰＡ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ 番号８５１１０５０３）；サル腎臓細胞（ＣＶ１，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８，１９８２）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株（Ｈｅｐ Ｇ２）、と同様にＤＳＭのＰＥＲＣ－６細胞株である。これら宿主細胞のそれぞれでの使用に好適な発現ベクターも一般に当該技術で既知である。

【0157】

用語「宿主細胞」は一般に培養された細胞株を指すことが言及されるべきである。本発明に係る抗原結合ポリペプチドをコードする発現ベクターが導入されている人間丸ごとは「宿主細胞」の定義から明白に除外される。

【0158】

重要な態様では、本発明はまた、ＴＩＧＩＴ抗体の発現を可能する条件下でＴＩＧＩＴ抗体をコードするポリヌクレオチド（たとえば、発現ベクター）を含有する宿主細胞（または無細胞発現システム）を培養し、発現されたＴＩＧＩＴ抗体を回収することを含む、本発明のＴＩＧＩＴ抗体を生産する方法も提供する。ヒトの治療用途を対象とするモノクローナル抗体を含む本発明に係るＴＩＧＩＴ抗体の大規模生産にはこの組換え発現プロセスを使用することができる。インビボでの治療用途に好適な組換え抗体の大規模製造に好適なベクター、細胞株及び生産プロセスは一般に当該技術で利用可能であり、当業者に周知であろう。

【0159】

従って、本発明によれば、提供されるのは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３の組み合わせを含む抗体または抗原結合断片をコードする単離されたポリヌクレオチドまたは単離されたポリヌクレオチドの組み合わせであり、その際、組み合わせは、
（ｉ）配列番号１６を含むＨＣＤＲ１、配列番号１７を含むＨＣＤＲ２、配列番号１８を含むＨＣＤＲ３、配列番号６１を含むＬＣＤＲ１、配列番号６２を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号６３を含むＬＣＤＲ３；
（ｉｉ）配列番号４を含むＨＣＤＲ１、配列番号５を含むＨＣＤＲ２、配列番号６を含むＨＣＤＲ３、配列番号４９を含むＬＣＤＲ１、配列番号５０を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号５１を含むＬＣＤＲ３；
（ｉｉｉ）配列番号７を含むＨＣＤＲ１、配列番号８を含むＨＣＤＲ２、配列番号９を含むＨＣＤＲ３、配列番号５２を含むＬＣＤＲ１、配列番号５３を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号５４を含むＬＣＤＲ３；
（ｉｖ）配列番号１０を含むＨＣＤＲ１、配列番号１１を含むＨＣＤＲ２、配列番号１２を含むＨＣＤＲ３、配列番号５５を含むＬＣＤＲ１、配列番号５６を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号５７を含むＬＣＤＲ３；
（ｖ）配列番号１３を含むＨＣＤＲ１、配列番号１４を含むＨＣＤＲ２、配列番号１５を含むＨＣＤＲ３、配列番号５８を含むＬＣＤＲ１、配列番号５９を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号６０を含むＬＣＤＲ３；
（ｖｉ）配列番号１を含むＨＣＤＲ１、配列番号２を含むＨＣＤＲ２、配列番号３を含むＨＣＤＲ３、配列番号４６を含むＬＣＤＲ１、配列番号４７を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号４８を含むＬＣＤＲ３；
（ｖｉｉ）配列番号１９を含むＨＣＤＲ１、配列番号２０を含むＨＣＤＲ２、配列番号２１を含むＨＣＤＲ３、配列番号６４を含むＬＣＤＲ１、配列番号６５を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号６６を含むＬＣＤＲ３；
（ｖｉｉｉ）配列番号２２を含むＨＣＤＲ１、配列番号２３を含むＨＣＤＲ２、配列番号２４を含むＨＣＤＲ３、配列番号６７を含むＬＣＤＲ１、配列番号６８を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号６９を含むＬＣＤＲ３；
（ｉｘ）配列番号２５を含むＨＣＤＲ１、配列番号２６を含むＨＣＤＲ２、配列番号２７を含むＨＣＤＲ３、配列番号７０を含むＬＣＤＲ１、配列番号７１を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号７２を含むＬＣＤＲ３；
（ｘ）配列番号２８を含むＨＣＤＲ１、配列番号２９を含むＨＣＤＲ２、配列番号３０を含むＨＣＤＲ３、配列番号７３を含むＬＣＤＲ１、配列番号７４を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号７５を含むＬＣＤＲ３；
（ｘｉ）配列番号３１を含むＨＣＤＲ１、配列番号３２を含むＨＣＤＲ２、配列番号３３を含むＨＣＤＲ３、配列番号７６を含むＬＣＤＲ１、配列番号７７を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号７８を含むＬＣＤＲ３；
（ｘｉｉ）配列番号３４を含むＨＣＤＲ１、配列番号３５を含むＨＣＤＲ２、配列番号３６を含むＨＣＤＲ３、配列番号７９を含むＬＣＤＲ１、配列番号８０を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号８１を含むＬＣＤＲ３；
（ｘｉｉｉ）配列番号３７を含むＨＣＤＲ１、配列番号３８を含むＨＣＤＲ２、配列番号３９を含むＨＣＤＲ３、配列番号８２を含むＬＣＤＲ１、配列番号８３を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号８４を含むＬＣＤＲ３；
（ｘｉｖ）配列番号４０を含むＨＣＤＲ１、配列番号４１を含むＨＣＤＲ２、配列番号４２を含むＨＣＤＲ３、配列番号８５を含むＬＣＤＲ１、配列番号８６を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号８７を含むＬＣＤＲ３；
（ｘｖ）配列番号４３を含むＨＣＤＲ１、配列番号４４を含むＨＣＤＲ２、配列番号４５を含むＨＣＤＲ３、配列番号８８を含むＬＣＤＲ１、配列番号８９を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号９０を含むＬＣＤＲ３；
（ｘｖｉ）配列番号２７１を含むＨＣＤＲ１、配列番号２７２を含むＨＣＤＲ２、配列番号２７３を含むＨＣＤＲ３、配列番号２８３を含むＬＣＤＲ１、配列番号２８４を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号２８５を含むＬＣＤＲ３；
（ｘｖｉｉ）配列番号２７４を含むＨＣＤＲ１、配列番号２７５を含むＨＣＤＲ２、配列番号２７６を含むＨＣＤＲ３、配列番号２８６を含むＬＣＤＲ１、配列番号２８７を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号２８８を含むＬＣＤＲ３；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号２７７を含むＨＣＤＲ１、配列番号２７８を含むＨＣＤＲ２、配列番号２７９を含むＨＣＤＲ３、配列番号２８９を含むＬＣＤＲ１、配列番号２９０を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号２９１を含むＬＣＤＲ３
から成る群から選択される。

【0160】

特定の実施形態では、提供されるのは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３の組み合わせを含む抗体または抗原結合断片をコードする単離されたポリヌクレオチドまたは単離されたポリヌクレオチドの組み合わせであり、その際、
（ｉ）ＨＣＤＲ１は配列番号１６を含むまたはそれから成り、ＨＣＤＲ２は配列番号１７を含むまたはそれから成り、ＨＣＤＲ３は配列番号１８を含むまたはそれから成り、ＬＣＤＲ１は配列番号６１を含むまたはそれから成り、ＬＣＤＲ２は配列番号６２を含むまたはそれから成り、且つＬＣＤＲ３は配列番号６３を含むまたはそれから成る。

【0161】

また本発明によれば、本明細書に記載されている抗体または抗原結合断片をコードする単離されたポリヌクレオチドまたは単離されたポリヌクレオチドの組み合わせが提供される。特定の実施形態では、提供されるのは、本明細書で提供されている抗体３１２８２またはその抗原結合断片をコードする単離されたポリヌクレオチドである。

【0162】

また本発明によれば、抗ＴＩＧＩＴ抗体のＶＨドメイン及び／またはＶＬドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドが提供され、その際、ポリヌクレオチドは配列番号２４１～２７０、３３５～３４２及び３６９～３７０から成る群から選択される１つ以上の配列を含む。特定の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは配列番号２５１に係る配列及び／または配列番号２５２に係る配列を含む。ポリヌクレオチドが配列番号２５１に係る配列及び配列番号２５２に係る配列を含む特定の実施形態では、配列は隣接する。ポリヌクレオチドが配列番号２５１に係る配列及び配列番号２５２に係る配列を含む特定の実施形態では、配列は隣接しない。

【0163】

また本発明によれば、宿主細胞または無細胞発現システムにおける抗原結合ポリペプチドの発現を可能にする調節配列に動作可能に連結された本発明に係るポリヌクレオチドを含む発現ベクターが提供される。

【0164】

また本発明によれば、本発明に係る発現ベクターを含有する宿主細胞または無細胞発現システムが提供される。

【0165】

また、本発明によれば、抗体または抗原結合断片の発現を可能にする条件下で本発明に係る宿主細胞または無細胞発現システムを培養し、発現された抗体または抗原結合断片を回収することを含む、組換え抗体またはその抗原結合断片を生産する方法が提供される。

【0166】

医薬組成物
本明細書で提供されるのはまた、１つ以上の薬学上許容できるキャリアまたは賦形剤と共に製剤化される本発明に係る抗体または抗原結合断片を含む医薬組成物である。そのような組成物は、（たとえば、２以上の異なる）ＴＩＧＩＴ抗体を１つまたはその組み合わせを含んでもよい。ヒトでの治療用途のために抗体を製剤化する技法は当該技術で周知であり、たとえば、Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．９６，ｐｐ１－２６，２００７にて概説されている。

【0167】

本明細書で提供されているＴＩＧＩＴ抗体及び医薬組成物は、疾患、特にＴＩＧＩＴの機能の阻害から利益が得られる状態の治療法、特に疾患の治療処置で有用性を有する。

【0168】

組み合わせ製品
本明細書で実証されているように、本発明の抗体またはその抗原結合断片は追加の治療剤と組み合わせて投与されると特に効果的である。たとえば、本発明の抗体またはその抗原結合断片は免疫チェックポイント阻害剤―具体的に抗ＩＣＯＳアンタゴニスト抗体または抗ＰＤ－１抗体（すなわち、ヒト免疫調節分子ＰＤ－１に特異的なアンタゴニスト抗体）と組み合わせて投与されると特に効果的である。抗ＩＣＯＳ抗体または抗ＰＤ－１抗体と組み合わせた抗ＴＩＧＩＴ抗体の投与は、いずれかの抗体単独と比べて腫瘍増殖にて相乗的な減少を生じる。本発明に係る抗ＴＩＧＩＴ抗体と抗ＰＤ－Ｌ１抗体との組み合わせを用いて類似の効果が観察されると予想される。

【0169】

本発明の抗体またはその抗原結合断片は、免疫チェックポイント共刺激分子に特異的なアゴニスト抗体―具体的に抗４－１ＢＢ抗体、抗ＯＸ４０抗体または抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体と組み合わせて投与されると特に効果的であることが本明細書でさらに実証される。抗４－１ＢＢアゴニスト抗体、抗ＯＸ４０アゴニスト抗体または抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体と組み合わせた抗ＴＩＧＩＴ抗体の投与は、いずれかの抗体単独と比べて腫瘍増殖にて相乗的な減少を生じる。

【0170】

さらなる態様では、提供されるのは、抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片と、化学療法剤、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗４１ＢＢ抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、及び抗ＩＣＯＳ抗体のうちの１つ以上とを含む組み合わせ製品である。

【0171】

本発明に係る抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片（たとえば、３１２８２）と化学療法剤（たとえば、ドキソルビシン）との組み合わせはがんを治療することで特に効果的なので、この組み合わせで減った腫瘍体積はいずれかの治療法だけよりも有意に大きいことも本明細書で実証されており、相乗効果の可能性を示している（実施例３５）。

【0172】

さらに、本発明に係る抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片（たとえば、３１２８２）と化学療法剤（たとえば、ドキソルビシン）とＡ２Ａ受容体（Ａ２ＡＲ）アンタゴニストとの組み合わせは、症例の大半で完全寛解を誘導した程度に有意に効果的な治療を生じることも本明細書で実証されている。特に、抗ＴＩＧＩＴ抗体とＡ２ＡＲアンタゴニストとの組み合わせだけでは単剤療法を超えて有効性を改善することはなかった。従って本発明の組み合わせの有効性は特に予想外である。

【0173】

従って、さらなる態様では、提供されるのは本発明に係る抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片と化学療法剤とを含む組み合わせである。好ましい実施形態では、化学療法剤はドキソルビシンを含む。

【0174】

好ましい実施形態では、組み合わせはさらにアデノシンＡ２Ａ受容体（Ａ２ＡＲ）アンタゴニストを含む。例となるＡ２ＡＲアンタゴニストは、参照によって本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＥＰ２０１９／０７４２０８に提供されている。

【0175】

特定の好ましい実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体または抗原結合断片は、本発明に従って提供されている抗体または抗原結合断片である。最も好ましい実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体または抗原結合断片は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３の組み合わせを含み、その際、
ＨＣＤＲ１は配列番号１６（ＹＴＦＴＳＹＹＭＨ）を含み、
ＨＣＤＲ２は

を含み、
ＨＣＤＲ３は

を含み、
ＬＣＤＲ１は配列番号６１（ＲＡＳＱＳＶＲＳＳＹＬＡ）を含み、
ＬＣＤＲ２は配列番号６２（ＧＡＳＳＲＡＴ）を含み、且つ
ＬＣＤＲ３は配列番号６３（ＱＱＹＦＳＰＰＷＴ）を含む。

【0176】

提供されるのはまた、がんまたはウイルス感染症を治療する方法で使用するための本明細書で提供されているような組み合わせであり、任意でその際、ウイルス感染症はＣＭＶ感染症である。提供されるのはさらに、本明細書で提供されている方法で使用するための本明細書で提供されているような組み合わせである。

【0177】

本明細書で使用されるとき、２以上の活性剤が「組み合わせ」、「治療上の組み合わせ」または「併用療法」（用語は相互交換可能に使用される）として提供される場合、これは活性剤が単一組成物に製剤化されることを必要としない、またはそれを除外しない。併用療法には、患者が各活性剤からの利益を引き出すことができるように投与される２以上の活性剤の従来の解釈が与えられる。「併用療法」は、同時製剤化、共投与、同時投与または固定用量製剤を必要としない。

【0178】

治療法
本明細書で提供されているＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片、医薬組成物及び組み合わせを用いてインビボでがん性腫瘍細胞の増殖を阻害することができるので、腫瘍の治療に有用である。

【0179】

従って、本発明のさらなる態様は、それを必要とする患者に有効量の本明細書に記載されているようなＴＩＧＩＴ抗体または抗原結合断片、本明細書に記載されているような医薬組成物、または本明細書に記載されているような組み合わせを投与することを含む、ヒト患者にて腫瘍細胞の増殖を阻害する方法、及びがんを治療するまたは予防する方法に関する。

【0180】

本発明の別の態様は、ヒト患者にて腫瘍細胞の増殖を阻害するのに使用するための本明細書に記載されているようなＴＩＧＩＴ抗体または抗原結合断片を提供する。本発明のその上さらなる態様は、ヒト患者にてがんを治療するまたは予防するのに使用するための本明細書に記載されているようなＴＩＧＩＴ抗体または抗原結合断片を提供する。

【0181】

本発明の別の態様は、がん患者にてＴｒｅｇ細胞を選択的に枯渇させる方法を提供し、該方法は抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片を患者に投与することを含む。特定の実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、残基Ｑ５６、Ｎ５８、Ｅ６０、Ｉ６８、Ｌ７３、Ｈ７６及びＩ１０９を含む、好ましくは残基Ｑ５６、Ｎ５８、Ｅ６０、Ｉ６８、Ｌ７３、Ｈ７６及びＩ１０９から成るヒトＴＩＧＩＴ上のエピトープで結合する。特定の実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体は本明細書で提供されている抗ＴＩＧＩＴ抗体である。

【0182】

特定の実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３の組み合わせを含み、その際、ＨＣＤＲ１は配列番号１６（ＹＴＦＴＳＹＹＭＨ）を含むまたはそれから成り、ＨＣＤＲ２は

を含むまたはそれから成り、ＨＣＤＲ３は

を含むまたはそれから成り、ＬＣＤＲ１は配列番号６１（ＲＡＳＱＳＶＲＳＳＹＬＡ）を含むまたはそれから成り、ＬＣＤＲ２は配列番号６２（ＧＡＳＳＲＡＴ）を含むまたはそれから成り、且つＬＣＤＲ３は配列番号６３（ＱＱＹＦＳＰＰＷＴ）を含むまたはそれから成る。

【0183】

特定の好ましい実施形態では、治療される患者は、腎臓癌（たとえば、腎細胞癌腫）、乳癌、脳腫瘍、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病を含む慢性または急性の白血病、リンパ腫（たとえば、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫、リンパ性リンパ腫、原発ＣＮＳリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫（たとえば、ＣＬＬ）、Ｔ細胞リンパ腫（たとえば、セザリー症候群））、鼻咽頭癌腫、黒色腫（たとえば、転移性悪性黒色腫）、前立腺癌、結腸癌、肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頚部のがん（たとえば、頭頚部の有棘細胞癌腫（ＨＮＳＣＣ））、皮膚癌腫、皮膚または眼内の悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域のがん、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頚部の癌腫、膣の癌腫、外陰部の癌腫、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、小児期の固形腫瘍、膀胱のがん、腎臓または尿管のがん、腎盂の癌腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍、腫瘍血管新生、脊髄軸の腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、中皮腫から選択されるがんを有する。特定の実施形態では、抑制されるがんは、肺癌、膀胱癌、乳癌、腎臓癌（たとえば、腎臓癌腫）、頭頚部癌（たとえば、ＨＮＳＣＣ）、または結腸癌（たとえば、結腸腺腫）である。特定の実施形態では、がんは結腸癌（たとえば、結腸腺腫）または肺癌である。特定の実施形態では、がんは血液癌である。特定のそのような実施形態では、がんはリンパ腫である。特定の実施形態では、がんはＴ細胞リンパ腫またはＢ細胞リンパ腫である。

【0184】

特定の実施形態では、治療されるがんは結腸腺癌、肝臓癌腫、膵臓癌腫、肺癌、及びＴ細胞リンパ腫（たとえば、セザリー症候群）から選択される。特定の実施形態では、治療されるがんは結腸腺癌である。特定の実施形態では、治療されるがんは肝臓癌腫である。特定の実施形態では、治療されるがんは膵臓癌腫である。特定の実施形態では、治療されるがんは肺癌、たとえば、肺癌腫である。特定の実施形態では、治療されるがんはＴ細胞リンパ腫、たとえば、セザリー症候群である。

【0185】

特定の実施形態では、がんを治療する方法はさらに、追加の治療剤、たとえば、化学療法剤の投与を含む。

【0186】

特定の好ましい実施形態では、がんを治療する方法は抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片と、化学療法剤と、任意でＡ２ＡＲアンタゴニストとを含む本発明に係る組み合わせの投与を含む。

【0187】

提供されるのはまた、治療法で使用するための、任意でがんを治療するのに使用するための抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片と、化学療法剤と、任意でＡ２ＡＲアンタゴニストとを含む本発明に係る組み合わせである。好ましくは、がんは結腸腺癌である。

【0188】

提供されるのはまた、がんを治療する方法で使用するための本発明に係る抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片であり、その際、方法は、化学療法剤と組み合わせて抗体を投与することを含む。好ましくは、化学療法剤はドキソルビシンである。

【0189】

特定の好ましい実施形態では、方法はさらに、Ａ２ＡＲアンタゴニストを投与することを含み、その際、抗体または抗原結合断片と化学療法剤とＡ２ＡＲアンタゴニストとは組み合わせとして投与される。

【0190】

本明細書で実証されているように、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、免疫チェックポイント阻害剤―具体的に抗ＩＣＯＳアンタゴニスト抗体または抗ＰＤ－１抗体（すなわち、ヒト免疫調節分子ＰＤ－１に特異的なアンタゴニスト抗体）と組み合わせて投与されると特に効果的である。抗ＩＣＯＳ抗体または抗ＰＤ－１抗体と組み合わせた抗ＴＩＧＩＴ抗体の投与は、いずれかの抗体単独と比べて腫瘍増殖にて相乗的な減少を生じる。本発明に係る抗ＴＩＧＩＴ抗体と抗ＰＤ－１抗体との組み合わせを用いて類似の効果が観察されると予想される。

【0191】

本発明の抗体またはその抗原結合断片は、免疫チェックポイント共刺激分子に特異的なアゴニスト抗体―具体的に抗４－１ＢＢアゴニスト抗体、抗ＯＸ４０アゴニスト抗体または抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体と組み合わせて投与されると特に効果的であることが本明細書でさらに実証される。抗４－１ＢＢアゴニスト抗体、抗ＯＸ４０アゴニスト抗体または抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体と組み合わせた抗ＴＩＧＩＴ抗体の投与は、いずれかの抗体単独と比べて腫瘍増殖にて相乗的な減少を生じる。

【0192】

従って、本明細書で提供されるのはまた、有効量の本発明に係る抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片を対象に投与し、且つ有効量の抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗４－１ＢＢ抗体、抗ＯＸ４０抗体、及び抗ＧＩＴＲ抗体、または抗ＩＣＯＳ抗体も投与することを含む、対象にてがんを治療する方法である。

【0193】

加えて、抗ＴＩＧＩＴ抗体が従来型のＴ細胞と同様にγδ細胞の活性を高めることができることを実証している本明細書で提供されているデータは抗ＴＩＧＩＴ抗体を用いてがん以外の状態を治療することができることを示している。特に、γδＴ細胞は感染、たとえば、細菌、真菌またはウイルスの感染に対する応答で重要であることが知られている。実施例２９にて示すように、抗ＴＩＧＩＴ抗体に接触させると、ＣＭＶ血清反応陽性の対象に由来するγδＴ細胞はＩＦＮｇ分泌の上昇を特徴とする顕著に上昇した活性化を示す。このようにＣＭＶ患者にてγδＴ細胞の活性化を促進する能力は抗ＴＩＧＩＴ抗体の投与がγδＴ細胞の抗ウイルス活性を促進するであろうことを示している。

【0194】

従って、本明細書で提供されるのは、有効量の抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、対象にてウイルス感染症を治療する方法である。提供されるのはまた、有効量の本明細書で提供されている抗ＴＩＧＩＴ抗体または抗原結合断片または医薬組成物を対象に投与し、それによってウイルス感染症を治療することを含む、対象にてウイルス感染症を治療する方法である。好ましい実施形態では、ウイルス感染症はＣＭＶ感染症である。

【0195】

特定の実施形態では、方法はさらに１つ以上の追加の治療剤の投与を含む。特定の実施形態では、１つ以上の治療剤は、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗４１ＢＢ抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、及び抗ＩＣＯＳ抗体から選択される。

【0196】

実施例で実証されているように、本明細書で開示されている抗ＴＩＧＩＴ抗体はＴ細胞の活性、特に炎症誘発性のＴ細胞の活性を促進することにて効果的である。Ｔ細胞の活性は、当業者によく知られている方法によって、たとえば、実施例に記載されているようにＩＦＮｇの産生を測定することによって測定することができる。

【0197】

従って、提供されるのはまた、Ｔ細胞の集団を、本明細書に記載されているような抗体または抗原結合断片に接触させることを含む、Ｔ細胞の活性を促進する方法である。

【0198】

特定の実施形態では、Ｔ細胞の活性を促進する方法はインビトロで実施される。特定の実施形態では、Ｔ細胞の活性を促進する方法はヒト対象にてインビボで実施される。特定のそのような実施形態では、ヒト対象はがんを有する。特定の実施形態では、ヒト対象はウイルス感染症、たとえば、ＣＭＶ感染症を有する。

【0199】

特定の実施形態では、方法は従来型のαβＴ細胞の活性を促進する。特定の実施形態では、方法はＣＤ４Ｔ細胞の活性を促進する。特定の実施形態では、方法はＣＤ８Ｔ細胞の活性を促進する。特定の実施形態では、方法はγδ（ガンマ・デルタ）Ｔ細胞の活性を促進する。

【0200】

本明細書で開示されている抗ＴＩＧＩＴ抗体は、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗４１ＢＢ抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、または抗ＩＣＯＳ抗体と組み合わせて使用されるとＴ細胞の活性を促進することにおいて特に効果的であろうことが実施例でさらに実証される。重要なことに、組み合わせは、Ｔ細胞の活性において相乗的な（すなわち、相加的よりも大きい）上昇を提供する。

【0201】

従って、特定の実施形態では、Ｔ細胞の活性を促進する方法はさらに、Ｔ細胞の集団を、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗４１ＢＢ抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、及び抗ＩＣＯＳ抗体のうちの１つ以上に接触させることを含む。

【0202】

本明細書に記載されているが、本発明の精神及び範囲から逸脱しない本発明の実施形態の変異体及び同等物は当業者によく知られるであろう。本発明は以下の非限定の実施例を参照してさらに理解されるであろう。

【実施例】

【0203】

実施例１：ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質の選択
ＴＩＧＩＴのＡＢＰは、たとえば、ＷＯ２００９０３６３７９；ＷＯ２０１０１０５２５６；ＷＯ２０１２００９５６８；及びＸｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．，Ｖｏｌ．２６（１０），ｐｐ．６６３－６７０（２０１３））に記載されているように一般的に及び以下で提供されているようにさらに具体的にＩｇＧ形式にて酵母細胞の表面上に発現され、提示されるヒト抗体の合成ライブラリから選択した。組換えライブラリから単離されたＡＢＰの配列及び特徴は図１～６に提供されている。

【0204】

それぞれ約１０^９の多様性の８つのナイーブなヒト合成酵母ライブラリを以前記載された（たとえば、Ｘｕ，ｅｔ ａｌ，２０１３；ＷＯ２００９０３６３７９；ＷＯ２０１０１０５２５６；及びＷＯ２０１２００９５６８を参照のこと）ように増殖させた。選択の最初の２回については、記載されている（Ｓｉｅｇｅｌ，ｅｔ ａｌ．，２００４を参照のこと）ようにＭｉｌｔｅｎｙｉのＭＡＣＳシステムを利用する磁気ビーズ選別法を実施した。手短には、ＦＡＣＳ洗浄緩衝液（リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）／０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））にて酵母細胞（約１０^１０個／ライブラリ）をビオチン化ＴＩＧＩＴ－Ｆｃ抗原（Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍａｒｔ）と共にインキュベートした。５０ｍＬの氷冷洗浄緩衝液で１回洗浄した後、細胞ペレットを４０ｍＬの洗浄緩衝液に再浮遊させ、ストレプトアビジンマイクロビーズ（５００μＬ）を酵母に加え、４℃で１５分間インキュベートした。次に、酵母をペレットにし、５ｍＬの洗浄緩衝液に再浮遊させ、ＭｉｌｔｅｎｙｉのＬＳカラムにかけた。５ｍＬを負荷した後、３ｍＬのＦＡＣＳ洗浄緩衝液でカラムを３回洗浄した。次いでカラムを磁場から取り出し、５ｍＬの増殖培地で酵母を溶出し、次いで、一晩増殖させた。フローサイトメトリーを用いて後に続く回の選別を行った。およそ１×１０^８個の酵母をペレットにし、洗浄緩衝液で３回洗浄し、室温にて平衡条件下でビオチン化ＴＩＧＩＴ－Ｆｃ融合抗原（１０ｎＭ）と共にインキュベートした。次いで酵母を２回洗浄し、ＬＣ－ＦＩＴＣ（１：１００希釈）及びＳＡ－６３３（１：５００希釈）またはＥＡ－ＰＥ（１：５０希釈）二次試薬のいずれかによって４℃にて１５分間染色した。氷冷洗浄緩衝液で２回洗浄した後、細胞ペレットを０．４ｍＬの洗浄緩衝液に再浮遊させ、濾過器でフタをした選別チューブに移した。ＦＡＣＳ ＡＲＩＡソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて選別を行い、バックグラウンド対照に比べて特異的な結合物を選択するように選別ゲートを割り当てた。ＣＨＯ細胞に由来する可溶性膜タンパク質（たとえば、ＷＯ２０１４１７９３６３及びＸｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ，Ｖｏｌ．２６（１０），ｐｐ．６６３－６７０（２０１３）を参照のこと）を利用して非特異的な結合物の数を減らし、ＴＩＧＩＴ－Ｆｃ抗原を用いてＴＩＧＩＴに対する改善された親和性を持つ結合物を特定するために、その後の回の選択を採用した。最終回の選別の後、酵母をプレートに播き、親和性成熟についてのクローンの特徴付け及び指名のために個々のクローンを採取した。機能的活性について６３のクローンをスクリーニングした。スクリーニングからクローン２６５１８、２６４５２、２６４８６、２６５２１及び２６４９３が最良の機能的活性を有し、さらなる最適化のために選択された。

【0205】

実施例２：抗体の最適化
３つの成熟戦略：軽鎖の多様化、ＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２の多様化、及び選択されたＨＣＤＲ１とＨＣＤＲ２の多様性プールの範囲内でのＨＣＤＲ３の多様化を利用してナイーブなクローンの最適化を行った。

【0206】

軽鎖の多様化：ナイーブなアウトプット（上記に記載されている）から重鎖可変領域を抽出し、１×１０^６の多様性を持つ軽鎖ライブラリに変換した。１回のＭＡＣＳ選別及び１０ｎＭまたは１ｎＭのビオチン化ＴＩＧＩＴ－ＨＩＳ抗原（Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍａｒｔ）を各回に用いた３回のＦＡＣＳ選別によって上記に記載されているように選択を行った。

【0207】

ＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２の選択：軽鎖の多様化手順から選択されたクローンに由来するＨＣＤＲ３を１×１０^８の多様性のＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２の変異体により予め作製したライブラリに組み換え、単量体ＨＩＳ－ＴＩＧＩＴ抗原を用いて選択を行った。室温にて平衡条件下で漸減する濃度のビオチン化ＨＩＳ－ＴＩＧＩＴ抗原（１００～１ｎＭ）を用いて親和性の圧力を適用した。

【0208】

ＨＣＤＲ３／ＨＣＤＲ１／ＨＣＤＲ２の選択：ＨＣＤＲ３のいずれかの側の相同隣接領域と同様にＨＣＤＲ３を含むオリゴがＩＤＴからオーダーされた。ＨＣＤＲ３の全体にわたってオリゴ当たり２つの位置でのＮＮＫ多様性を介してＨＣＤＲ３におけるアミノ酸の位置を多様化した。ＨＣＤＲ３オリゴはＨＣＤＲ３の隣接領域にアニーリングしたプライマーを用いた二本鎖だった。重鎖可変領域の残りのＦＷＲ１～ＦＷＲ３は上記で選択されたＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２の多様性から単離された改善された親和性を持つ抗体のプールから増幅した。次いで元々のナイーブな親型の軽鎖をすでに含有している酵母に対して二本鎖ＨＣＤＲ３オリゴ、ＦＷＲ１～ＦＷＲ３のプールした断片及び重鎖発現ベクターで形質転換することによってライブラリを作り出した。４回のＦＡＣＳ選別を用いた前のサイクルの間に選択を行った。各回のＦＡＣＳについて、ＰＳＲ結合、種交差反応性、及び親和性圧力に関してライブラリを評価し、選別を行って所望の特徴を持つ集団を得た。これらの選択のための親和性圧力はＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２の選択にて上記に記載されているように実行した。

【0209】

実施例３：抗体の産生及び精製
Ａ．酵母における産生
さらなる特性評価のために十分量の最適化した及び最適化していない選択した抗体を産生させるために、酵母クローンを飽和まで増殖させ、次いで振盪しながら３０℃で４８時間誘導した。誘導の後、酵母細胞をペレットにし、精製のために上清を回収した。プロテインＡカラムを用いてＩｇＧを精製し、酢酸ｐＨ２．０で溶出した。パパイン消化によってＦａｂ断片を生成し、プロテインＡ（ＧＥ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）及びＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）によって２段階プロセスで精製した。

【0210】

Ｂ．哺乳類細胞における産生
さらなる特性評価のために十分量の最適化した及び最適化していない選択した抗体を産生させるために、特異的抗体クローンをコードするＤＮＡベクターを生成し、ＨＥＫ細胞に形質導入した。抗体可変ドメインについてヒトのコドンで最適化した合成ＤＮＡ断片はＧｅｎｅａｒｔでオーダーした。マウスのＩｇカッパのシグナル配列及び各抗体クラスの定常領域を含有しているｐＵＰＥ発現ベクターに可変ドメインの配列を途切れなくライゲーションした。発現ベクターは制限解析及びＤＮＡ配列決定によって検証した。一時的な形質移入にために、確立されたプロトコールに従ってエンドトキシンを含まないＤＮＡｍａｘｉｐｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ）を作製し、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にて重鎖及び軽鎖のベクターでＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ１細胞に同時形質移入した。形質移入の２４時間後、プリマトン（最終容量０．５５％）を加えた。形質移入の６日後、馴化培地を回収した。Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ ｓｕｒｅＬＸ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）アフィニティクロマトグラフィーによって抗体をバッチごとに精製した。１ＭのＮａＣｌを含有するＰＢＳ及びＰＢＳによって２段階で結合した抗体を洗浄した。抗体を２０ｍＭのクエン酸塩、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ３で溶出し、１／６容量の１ＭのＫ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ８でおよそｐＨ７に中和した。

【0211】

次に、ＰＢＳで平衡化したＳｅｐｅｒｄｅｘ２００カラムを用いたゲル濾過によって抗体をさらに精製した。ＮｕＰＡＧＥによって分画を分析し、抗体を含有する分画をプールした。最終生成物を０．２２μｍのシリンジフィルターで無菌化した。生成物をＮｕＰＡＧＥによって分析し、エンドトキシンのレベルをＬＡＬアッセイによって測定した。

【0212】

実施例４：組換えヒトＴＩＧＩＴタンパク質への抗ＴＩＧＩＴ抗体の結合についての親和性の決定
Ａ．ＦｏｒｔｅＢｉｏによるＫ_Ｄの測定
選択した抗体のＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定は以前記載された（たとえば、Ｅｓｔｅｐ，ｅｔ ａｌ．，Ｍａｂｓ，Ｖｏｌ．５（２），ｐｐ．２７０－２７８（２０１３）を参照のこと）ように一般に実施した。手短には、ＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定はＡＨＱセンサーにオンラインでＩｇＧを負荷することによって実施される。センサーをオフラインにてアッセイ緩衝液で３０分間平衡化し、次いでベースラインの確立のためにオンラインで６０秒間モニターした。負荷したＩｇＧを伴うセンサーを１００ｎＭの抗原（ヒトＴＩＧＩＴ－Ｆｃ、ヒトＴＩＧＩＴ－ＨｉｓまたはカニクイザルＴＩＧＩＴ－Ｆｃ）に５分間曝し、その後、オフ速度の測定のためにそれらをアッセイ緩衝液に５分間移した。１：１の結合モデルを用いて動態を解析した。ＦｏｒｔｅＢｉｏによって９０を超える抗体を親和性について調べ、表３は組換えＴＩＧＩＴタンパク質への強い結合を示す１５の選択された抗ＴＩＧＩＴ抗体についてのデータを提供する。

【0213】

Ｂ．ＭＳＤ－ＳＥＴによるＫ_Ｄの測定
選択した抗体の平衡親和性測定は、以前記載された（Ｅｓｔｅｐ，ｅｔ ａｌ．，Ｍａｂｓ，Ｖｏｌ．５（２），ｐｐ．２７０－２７８（２０１３））ように一般に実施した。手短には、ＰＢＳ＋０．１％のＩｇＧを含まないＢＳＡ（ＰＢＳＡ）にて１０～１００ｐＭにて一定を保持し、１０ｐＭ～１０ｎＭで開始して３～５倍の連続希釈したＦａｂまたはｍＡｂと共にインキュベートした抗原（ＴＩＧＩＴ－Ｈｉｓ単量体）によって溶液平衡滴定（ＳＥＴ）を行った。抗体（ＰＢＡ中２０ｎＭ）を標準結合のＭＳＤ－ＥＣＬプレートに４℃で一晩または室温で３０分間コーティングした。次いで７００ｒｐｍで振盪しながらＢＳＡによって３０分間プレートをブロックし、その後洗浄緩衝液（ＰＢＳＦ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。ＳＥＴ試料をプレートに入れ、７００ｒｐｍで振盪しながら１５０秒間インキュベートし、その後１回洗浄した。プレート上で捕捉された抗原をプレート上で３分間インキュベートすることによってＰＢＳＦ中２５０ｎｇ／ｍＬスルホタグで標識したストレプトアビジンによって検出した。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、次いで界面活性剤を伴った１×Ｒｅａｄ緩衝液Ｔを用いてＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ２４００機器にて読み取った。Ｐｒｉｓｍにて遊離の抗原の百分率を滴定した抗体の関数としてプロットし、Ｋ_Ｄを抽出する四元方程式に適合させた。処理能力を改善するために、ＳＥＴ試料の調製を含めてＭＳＤ－ＳＥＴ実験全体を通して液体を取り扱うロボットを使用した。選択した抗体をＭＳＤによって親和性について調べたが、表４は組換えＴＩＧＩＴタンパク質への強力な結合を示す７つの抗ＴＩＧＩＴクローンについてのデータを提供する。

【0214】

（表４）選択した抗ＴＩＧＩＴ抗体についての親和性のＭＳＤ解析

【0215】

Ｃ．Ｂｉａｃｏｒｅによる測定
ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｍａｒｌｂｏｒｏ，ＭＡ）を接続したＢｉａｃｏｒｅの８Ｋ光学バイオセンサーを用いてＨＢＳ－ＥＰ緩衝液系（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％の界面活性剤Ｐ２０）にて２５℃でバイオセンサー分析を実施した。サンプルホテルを８℃で維持した。標準のアミンカップリング化学反応を用いて、センサーチップの双方のフローセルにヤギ抗ヒトＩｇＧ捕捉抗体（Ｆｃγ断片に特異的な、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ；１０９－００５－０９８）を不動化した（１１７００±２００ＲＵ）。この表面型は各再生工程の後、新しい分析抗体を再生可能に捕捉するための定型を提供した。フローセル２を用いて捕捉抗体を分析した（６０～９０ＲＵ）一方でフローセル１は参照フローセルとして使用した。３０から０．１２３ｎＭに及ぶ（３倍希釈）抗原濃度をランニング緩衝液で調製した。抗原試料濃度のそれぞれを単回反復として実行した。２つのブランク（緩衝液）注入も実行し、システムの作為を評価し、差し引くのに使用した。抗原濃度すべてについて会合相（３００ｓ）及び解離相（６００ｓ）を３０ｕＬ／分の流速で実施した。１０ｍＭのグリシン、ｐＨ１．５の３回の連続注入（１５ｓ、１５ｓ及び６０ｓ）によって３０ｕＬ／分の流速で表面を再生した。データを並べ、二重参照し、Ｂｉａｃｏｒｅ８Ｋ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア、バージョン１．０を用いて１：１結合モデルに当て嵌めた。選択した抗体をＢｉａｃｏｒｅによって親和性について調べたが、表５は組換えＴＩＧＩＴタンパク質への強い結合を示す５つの抗ＴＩＧＩＴクローンについてのデータを提供する。

【0216】

（表５）選択した抗ＴＩＧＩＴ抗体についての親和性のＢｉａｃｏｒｅ分析

【0217】

実施例５：抗ＴＩＧＩＴアンタゴニスト抗体とＴＩＧＩＴ天然リガンドとの間での競合アッセイ
Ａ．Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ３８４エピトープビニング／リガンドブロッキング
標準のサンドイッチ形式の交差遮断アッセイを用いて、選択した抗体のエピトープビニング／リガンドブロッキングを実施した。対照の抗標的ＩｇＧをＡＨＱセンサー上に負荷し、センサー上の占有されていないＦｃ結合部位を無関係なヒトＩｇＧ１抗体でブロックした。次いでセンサーを１００ｎＭの標的抗原（ｈＴＩＧＩＴ、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍａｒｔ）に曝し、その後、二次抗標的抗体またはリガンド（抗ＴＩＧＩＴ抗体及びＣＤ１５５またはＣＤ１１３またはＣＤ１１２）に曝した。ＦｏｒｔｅＢｉｏのデータ解析ソフトウェア７．０を用いてデータを処理した。抗原会合の後の二次抗体またはリガンドによる追加の結合は占有されていないエピトープ（非競合物）を示す一方で、結合がないことはエピトープブロッキング（競合物またはリガンドのブロッキング）を示す。天然のリガンドとの競合について親型抗体（最適化の前の）を調べたが、表６はＣＤ１５５、ＣＤ１１２及びＣＤ１１３に対する競合について得られたデータをまとめている。親型クローン２６４３２はＴＩＧＩＴとの結合についてＣＤ１５５と競合しないことが見いだされた。他の選択した抗ＴＩＧＩＴ抗体はすべて組換えヒトＴＩＧＩＴタンパク質への結合について天然のリガンドと競合する。

【0218】

（表６）最適化されていない抗ＴＩＧＩＴ抗体についてのＴＩＧＩＴ天然リガンドに対するビニング解析

【0219】

Ｂ．抗ＴＩＧＩＴアンタゴニスト抗体のＪｕｒｋａｔ－ｈＴＩＧＩＴ上のＣＤ１５５との競合
ヒトＴＩＧＩＴを過剰発現しているＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ－ｈＴＩＧＩＴ）を回収し、１０^５個／ウェルで分配し、完全培地にて以下の濃度：１６６．６；５３．２４；１７．０１；５．４３；１．７３；０．５５；０．１７；０．０５；０．０１；５．７８×１０^－３；１．８５×１０^－３；５．９×１０^－３ｎＭでの抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体と共に３７℃で４５分間インキュベートした。過剰な抗体を洗い流し、次いで細胞を５μｇ／ｍＬでのＣＤ１５５－Ｈｉｓ（Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍａｒｔ、ＰＶＲ－３１４１Ｈ）と共に３７℃で４５分間インキュベートした。次いで、抗Ｈｉｓタグ－ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，３６２６０３，試験当たり２μＬ）を用いて結合したＣＤ１５５－Ｈｉｓを検出し、４℃で３０分間インキュベートした。ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａを用いたＦＡＣＳによって細胞を解析し、ＣＤ１５５の結合を阻止する半分の濃度（ＩＣ_５０）は幾何平均蛍光に基づいて算出した。

【0220】

結果は、図７で説明する結果について以下のとおりだった：クローン２９４８９については０．１０１ｎＭ；クローン２９４９４については０．０７ｎＭ；クローン２９５２０については０．１０２ｎＭ及びクローン２９５２７については０．０７８ｎＭだった。他の調べた抗体の値は以下の表７にてまとめている。全体として、結果は膜で発現したＴＩＧＩＴへの結合について調べたアンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴ抗体によるＣＤ１５５との強い競合を実証している。

【0221】

（表７）ヒトＴＩＧＩＴにおけるＣＤ１５５との競合についてのＩＣ_５０のデータ

【0222】

実施例６：疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＭＡｂｓ．２０１５，Ｍａｙ－Ｊｕｎ；７（３）：５５３－５６１．）の特性評価
Ｚｅｂａ ４０ｋＤａ ０．５ｍＬのスピンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｉｅｒｃｅ，カタログ＃８７７６６）を用いて抗ＴＩＧＩＴのＩｇＧ１抗体試料をｐＨ６．５での１Ｍの硫酸アンモニウム及び０．１Ｍのリン酸ナトリウムに緩衝液交換した。Ｄｉｏｎｅｘ ＰｒｏＰａｃ ＨＩＣ－１０カラムにてｐＨ６．５での１．８Ｍの硫酸アンモニウム及び０．１Ｍのリン酸ナトリウムから硫酸アンモニウムがない同じ条件まで塩勾配を確立した。勾配を０．７５ｍＬ／分の流速で１７分間流した。流入の最後にアセトニトリル洗浄工程を加え、残りのタンパク質を取り除き、次の注入サイクルの前に７カラム容量にわたってカラムを再平衡化した。Ａ２８０の吸光度でピーク保持時間をモニターし、溶出での硫酸アンモニウムの濃度を勾配及び流速に基づいて算出した。表８は１５の選択した抗ＴＩＧＩＴ抗体について得られた結果をまとめている。

【0223】

（表８）選択した抗ＴＩＧＩＴ抗体についての疎水性相互作用クロマトグラフィーの分析

【0224】

実施例７：ＰＳＲ製剤多特異性試薬の特性評価
Ａ．多特異性試薬の調製
Ｘｕ，ｅｔ．ａｌ，ｍＡｂｓ，２０１３に従って多特異性試薬（ＰＳＲ）を調製した。手短には、２．５リットルのＣＨＯ－Ｓ細胞を出発物質として使用した。４００ｍＬに満たした５００ｍＬの遠心ビンにて２，４００×ｇで５分間、細胞をペレットにした。細胞ペレットを合わせ、次いで２５ｍＬの緩衝液Ｂに再浮遊させ、２，４００×ｇで３分間、ペレットにした。緩衝液を捨て、洗浄を１回繰り返した。細胞を氷上で維持しながらポリトロンホモジナイザーを用いて１×プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ，ｃＯｍｐｌｅｔｅ，ＥＤＴＡを含まない）を含有するペレット容量の３倍の緩衝液Ｂに細胞ペレットを再浮遊させた。次いでホモジネートを２，４００×ｇで５分間遠心分離し、上清を保持し、もう１回ペレットにして（２，４００×ｇ／５分）、壊れていない細胞、細胞残渣及び核を確実に除いた；得られた上清が総タンパク質調製物である。次いで上清を２本のＮａｌｇｅｎｅ Ｏａｋ Ｒｉｄｇｅの４５ｍＬの遠心管に移し、４℃にて４０，０００×ｇで４０分間ペレットにした。分離した細胞質タンパク質（ＳＣＰ）を含有する上清を次いできれいなＯａｋ Ｒｉｄｇｅ試験管に移し、４０，０００×ｇでもう１回遠心分離した。並行して、膜分画（ＥＭＦ）を含有するペレットを保持し、４０，０００で２０分間遠心分離して残留上清を取り除いた。次いでＥＭＦペレットを緩衝液Ｂですすいだ。次いで８ｍＬの緩衝液Ｂを膜ペレットに加え、ペレットを移動させ、ダウンスホモジナイザーに移した。ペレットをホモジネートした後、それらを５０ｍＬの円錐管に移し、最終的なＥＭＦ調製物を表した。

【0225】

１０億個の哺乳類細胞（たとえば、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、Ｓｆ９）を約１０^６～１０^７個／ｍＬで組織培養環境から４本の２５０ｍＬの円錐管に移し、５５０×ｇで３分間ペレットにした。後に続く工程はすべて氷冷した緩衝液と共に４℃または氷上で行った。細胞を１００ｍＬのＰＢＳＦ（１×ＰＢＳ＋１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ）で洗浄し、１本の円錐管に合わせた。上清を取り除いた後、細胞ペレットを３０ｍＬの緩衝液Ｂ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０％のグリセロール、ｐＨ７．２）に再浮遊させ、５５０×ｇで３分間ペレットにした。緩衝液Ｂ上清を捨て、細胞をペレットの３倍容量の緩衝液Ｂ＋２．５×プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ，ｃＯｍｐｌｅｔｅ、ＥＤＴＡを含まない）に再浮遊させた。緩衝液Ｂ中のプロテアーゼ阻害剤はここから先で含めた。細胞を３０秒パルスで４回ホモジネートし（ポリトロンホモジナイザー、ＰＴ１２００Ｅ）、膜分画を４℃にて４０，０００×ｇで１時間ペレットにした。ペレットを１ｍＬの緩衝液Ｂですすぎ、上清を保持し、ｓを表す。ペレットを３ｍＬの緩衝液Ｂと共にダウンスホモジナイザーに移し、すりこぎをゆっくり３０～３５回上下に動かすことによって再浮遊させる。濃縮した膜分画（ＥＭＦ）を新しい回収チューブに移し、すりこぎをすすぎ、潜在的なタンパク質すべてを回収する。Ｄｃタンパク質アッセイキット（ＢｉｏＲａｄ）を用いて精製したＥＭＦのタンパク質濃度を決定する。ＥＭＦを可溶化するために、１ｍｇ／ｍＬの最終濃度までＥＭＦを可溶化緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１％のｎ－ドデシル－ｂ－Ｄ－マルトピラノシド（ＤＤＭ）、１×プロテアーゼ阻害剤、ｐＨ７．２））に移す。混合物を一晩４℃の回転で回転し、その後、５０ｍＬのＯａｋ Ｒｉｄｇｅ管（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，０５０５２９－ＩＤ）にて４０，０００×ｇで１時間遠心分離する。可溶性膜タンパク質（ＳＭＰ）を表す上清を回収し、タンパク質収量を上記に記載されているように定量した。

【0226】

ビオチン化のために、製造元のプロトコール（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に従ってＨＮＳ－ＬＣ・ビオチンストック溶液を調製する。手短には、２０ｕＬのビオチン試薬を１ｍｇのＥＭＦ試料ごとに加え、穏やかに撹拌しながら４℃で３時間インキュベートする。緩衝液Ｂで容量を２５ｍＬに合わせ、Ｏａｋ Ｒｉｄｇｅ遠心管に移す。ビオチン化ＥＭＦ（ｂ－ＥＭＦ）を４０，０００×ｇで１時間ペレットにし、ペレットを壊さずに３ｍＬの緩衝液Ｃ（緩衝液Ｂからグリセロールを除く）で２回すすぐ。残留溶液を取り除く。以前記載されたように３ｍＬの緩衝液Ｃにてペレットをダウンスホモジナイザーで再浮遊させた。再浮遊させたペレットは今やビオチン化ＥＭＦ（ｂ－ＥＭＦ）を表し、上記に記載されているように可溶化されてｂ－ＳＭＰを調製する。

【0227】

Ｂ．ＰＳＲの結合解析
一般にＷＯ２０１４／１７９３６３に記載されているようにＰＳＲ解析を行った。手短には、酵母にて提示されるモノクローナル抗体のＰＳＲプロファイルを特徴付けるために、２００万個のＩｇＧを提示している酵母を９６穴アッセイプレートに移し、３０００×ｇで３分間ペレットにして上清を除いた。５０ｕＬの新しく調製した１：１０希釈のストックｂ－ＰＳＲにてペレットを再浮遊させ、氷上で２０分間インキュベートする。２００ｕＬの冷ＰＢＳＦで細胞を２回洗浄し、５０ｕＬの二次標識ミックス（Ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ－Ｒ－ＰＥ、抗ヒトＬＣ－ＦＩＴＣ、及びヨウ化プロピジウム）にペレットを再浮遊させる。氷上でミックスを２０分間インキュベートし、その後、２００ｕＬの氷冷ＰＢＳＦで２回洗浄する。１００ｕＬの氷冷ＰＢＳＦに細胞を再浮遊させ、ＨＴＳ試料注入器を用いてＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にてプレートを実行させる。Ｒ－ＰＥチャネルにおける平均蛍光強度についてフローサイトメトリーのデータを解析し、非特異的な結合を評価するために適正な対照に対して正規化した。表９は、クローンのほとんどについて低いスコアを確認している１５の選択した抗ＴＩＧＩＴ抗体について得られた多特異性試薬結合の結果をまとめている。

【0228】

（表９）多特異性試薬の解析

【0229】

実施例８：健常ヒトＰＢＭＣに由来する免疫集団におけるＴＩＧＩＴ発現の特性評価
Ａ．Ｔ細胞サブセットにおけるＴＩＧＩＴ発現のプロファイル
健常個体から新しく単離されたＰＢＭＣにおける免疫細胞サブセットでのＴＩＧＩＴの発現を評価するためにフローサイトメトリー解析を行った。コンジュゲートした抗体をＥｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄまたはＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。濾過したＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２ｍＭのＥＤＴＡ＋０．１％ＢＳＡ）及びＢｒｉｌｌｉａｎｔ染色緩衝液（ＢＤ＃５６３７９４）を用いて製造元の指示によって細胞を染色した。染色に先立って適当なヒトＦｃＢｌｏｃｋ（ＢＤ ＃５６４２２０）で細胞をブロックし、データ取得に先立ってＩＣ固定緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃００－８２２２－４９）を用いて固定した。データ取得はＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行い、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ）で解析した。生細胞は前方散乱と側方散乱にゲートをかけた。種々の免疫細胞サブセットは以下のようにゲートをかけた：ＣＤ１９^＋（Ｂ細胞）、ＣＤ３^－ＣＤ１９^－ＣＤ１４^＋（単球）、ＣＤ３^＋ＴＣＲａｂ^－（ＴＣＲｇｄ Ｔ細胞）、ＣＤ３^＋ＴＣＲａｂ^＋（ＴＣＲａｂ Ｔ細胞）、ＣＤ３^－ＣＤ１９^－ＣＤ１４^－ＨＬＡ－ＤＲ^－ＣＤ５６^低／高（ＮＫ細胞）、ＣＤ３^－ＣＤ１９^－ＣＤ１４^－ＨＬＡ－ＤＲ^＋（樹状細胞）、ＣＤ３^＋ＴＣＲａｂ^＋ＣＤ４^＋ＣＤ１２７^低ＣＤ２５^＋（抑制性Ｔ細胞）、ＣＤ３^＋ＴＣＲａｂ^＋ＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＯ^－ＣＣＲ７^＋（ＣＤ４またはＣＤ８ナイーブＴ細胞）、ＣＤ３^＋ＴＣＲａｂ^＋ＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＯ^＋（メモリーＴ細胞）及びＣＤ４５ＲＯ^－ＣＤ６２Ｌ^－（エフェクターＴ細胞）。

【0230】

図８Ａ及び８Ｂに示すように、ＴＩＧＩＴはＮＫ細胞、抑制性Ｔ細胞及びＣＤ８メモリーＴ細胞で優先的に発現される。それは他のＴ細胞サブセットではさらに少ない程度に存在し、低い比率のナイーブＴ細胞がＴＩＧＩＴ発現を示す。加えて、ＴＩＧＩＴは単球、樹状細胞及びＢ細胞では発現されない（図８Ｂ）。このセットのデータは公開されたデータ（Ｙｕ，ｅｔ ａｌ．Ｎｌ，２００８及びＷａｎｇ，ｅｔ ａｌ．ＥＪＩ，２０１５）と一致する。

【0231】

実施例９：抗ＴＩＧＩＴアンタゴニスト抗体の細胞への結合
Ａ．Ｊｕｒｋａｔ－ｈＴＩＧＩＴ及びＪｕｒｋａｔ－ｍＴＩＧＩＴへの抗ＴＩＧＩＴ抗体の結合
ヒトＴＩＧＩＴで形質導入した（Ｊｕｒｋａｔ－ｈＴＩＧＩＴ）またはマウスＴＩＧＩＴで形質導入した（Ｊｕｒｋａｔ－ｍＴＩＧＩＴ）ＪｕｒｋａｔＥ６．１細胞を用いてヒト抗ＴＩＧＩＴ抗体の親和性を測定している。ｈＴＩＧＩＴまたはｍＴＩＧＩＴに対する選択した抗体の親和性を分析するために、ウェル当たり１０^５個の細胞を分配し、１００ｎＭの単一用量での抗ＴＩＧＩＴ抗体（表３）または漸減濃度（１６６．６；５３．２４；１７．０１；５．４３；１．７３；０．５５；０．１７；０．０５；０．０１；５．７８×１０^－３；１．８５×１０^－３；５．９×１０^－３ｎＭ）の選択した抗体（図９）と共にインキュベートした。抗体はＦＡＣＳ緩衝液にて細胞と共に４℃で２０分間インキュベートした。洗浄の後、氷上で細胞を抗ヒトＩｇ（Ｆｃガンマ特異的な）－ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，１２－４９９８－８２，２．５μｇ／ｍＬで）と共に２０分間インキュベートし、２回洗浄した。ＬＳＲ ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａを用いて幾何平均蛍光強度を解析した。細胞結合は、各抗体について形質移入していない株と比べて形質移入した株におけるＰＥの中央値蛍光強度として記録した（表３）。ＥＣ_５０結合の算出については、Ｐｒｉｓｍにて４変数曲線適合方程式を用いてｈＴＩＧＩＴ－Ｊｕｒｋａｔへの結合の半分最大濃度（ＥＣ_５０）を算出し、得られた値は図９で説明したデータについて以下のもの；クローン２９４８９については０．０８２ｎＭ；クローン２９４９４については０．０７ｎＭ；クローン２９５２０については０．１１９ｎＭ及びクローン２９５２７については０．０５ｎＭであった。結果は調べた抗ＴＩＧＩＴ抗体について膜発現したヒトＴＩＧＩＴに対する強い結合を実証している。

【0232】

Ｂ．ヒト初代Ｔ細胞への抗ＴＩＧＩＴアンタゴニスト抗体の結合
アンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴ抗体による結合について健常ボランティアから単離されたヒトＰＢＭＣを分析した。ウェル当たり５×１０^５個で細胞を分配した。細胞を抗ＣＤ１６（クローン３Ｇ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ３０２００２）、ＣＤ３２（クローンＦＬＩ８．２６，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ５５７３３３）及びＣＤ６４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ５５５５２５）と共に室温で１０分間インキュベートし、示した抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体をＦＡＣＳ緩衝液にて１２．６５；４；１．２６；０．４０；０．１２６；０．０４０；０．１２及び４×１０^－３ｎＭの最終濃度で直接加え、４℃で２０分間インキュベートした。洗浄の後、細胞を抗ヒトＩｇ（Ｆｃガンマ特異的な）－ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，１２－４９９８－８２，２．５μｇ／ｍＬで）と共に４℃で２０分間インキュベートした。次いで細胞を洗浄し、図１０Ａ及び１０Ｂの結果のための以下の抗体及びＬＶＤミックス：抗ＣＤ４－ＰｅｒｃＰ－Ｃｙ５．５（クローＡ１６１Ａ１，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ３５７４１４）；抗ＣＤ８－ＢＶ５１０（クローンＳＫ１，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ５６３９１９）及びＬＶＤ ｅＦｌｕｏｒ ５２０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ６５－０８６７－１４）と共にインキュベートした。図１０Ｃについては、細胞を洗浄し、以下の抗体及びＬＶＤミックス：ＬＶＤ ｅＦｌｕｏｒ５２０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ６５－０８６７－１４）、抗ＴＣＲａｂ－ＰｅｒｃＰ－Ｃｙ５．５（クローンＩＰ２６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３０６７２３）、抗ＣＤ４－ＢＶ５１０（クローンＳＫ３、ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ ５６２９７０）、抗ＣＤ８－ＡＰＣ－Ｃｙ７（クローンＳＫ１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３４４７１４）、抗ＣＤ２５－ＢＶ６０５（クローン２Ａ３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ５６２６６０）、抗ＣＤ１２７－ＡＰＣ（Ａ０１９Ｄ５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３５１３１６）、抗ＣＣＲ７－ＢＶ４２１（クローンＧ０４３Ｈ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３５３２０７）及び抗ＣＤ４５ＲＯ－ＰＥ－Ｃｙ７（クローンＵＣＨＬ１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３０４２２９）と共にインキュベートした。

【0233】

ＣＤ８^＋ヒト初代Ｔ細胞への結合についてのＥＣ_５０値はゲートをかけたＬＶＤ^－ＣＤ８^＋Ｔ細胞における陽性ＴＩＧＩＴ染色された細胞の％を用いて算出した（図１０Ａ及び１０Ｂ）。ヒトメモリーＣＤ８^＋初代Ｔ細胞またはＴｒｅｇ初代Ｔ細胞への結合についてのＥＣ_５０値は、ゲートをかけたＬＶＤ^－ＴＣＲａｂ^＋ＣＤ４５ＲＯ^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞（メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞について）またはゲートをかけたＬＶＤ^－ＴＣＲａｂ^＋ＣＤ１２７^低ＣＤ２５^高ＣＤ４^＋Ｔ細胞（Ｔｒｅｇについて）における陽性のＴＩＧＩＴ染色された細胞の％を用いて算出したが、図１０Ｃで説明する。

【0234】

図１０Ａに示すように、ヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞全体への結合についてのＥＣ_５０値は、クローン２９４８９については０．１２３ｎＭ；クローン２９５２０については０．１８１ｎＭ、及びクローン２９５２７については０．２５３ｎＭである。２９４８９と３１２８２（残基１１６におけるＭからＴへの突然変異がある２９４８９の変異体）との直接の比較を行い、ＥＣ_５０値がそれぞれ０．０５７ｎＭ及び０．０８６ｎＭだったということは、２つのクローンについてヒト初代ＣＤ８^＋Ｔ細胞への強力で類似する結合有効性を実証している（図１０Ｂ）。メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＴｒｅｇへの結合について得られたＥＣ_５０値はそれぞれ０．０３９ｎＭ及び０．０３ｎＭだったということは、双方の集団に対する強力で類似する親和性を実証している（図１０Ｃ）。

【0235】

Ｃ．カニクイザル初代Ｔ細胞への抗ＴＩＧＩＴアンタゴニスト抗体の結合
Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓから単離されたＰＢＭＣはＢｉｏＰＲＩＭから入手した。細胞を解凍し、製造元の仕様書に従って１：２（ビーズ：細胞の比）にて非ヒト霊長類用のＴ細胞活性化／増殖キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて刺激した。翌日、細胞を回収し、数え、ウェル当たり５×１０^４個で分配した。室温にて細胞を抗ＣＤ１６（クローン３Ｇ８，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ３０２００２）、ＣＤ３２（クローンＦＬＩ８．２６，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ５５７３３３）及びＣＤ６４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ５５５５２５）と共に１０分間インキュベートし、選択した抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体をＦＡＣＳ緩衝液における１２．６５；４；１．２６；０．４０；０．１２６；０．０４０；０．１２及び４×１０^－３ｎＭの最終濃度で直接加え、４℃にて２０分間インキュベートした。洗浄の後、細胞を抗ヒトＩｇ（Ｆｃガンマ特異的な）－ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，１２－４９９８－８２，２．５μｇ／ｍＬで）と共に４℃で２０分間インキュベートした。次いで細胞を洗浄し、図１１Ａ及び１１Ｂで説明されているデータのために以下の抗体及びＬＶＤミックス：抗ＣＤ４－ＰｅｒｃＰ－Ｃｙ５．５（クローンＡ１６１Ａ１，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ３５７４１４）；抗ＣＤ８－ＢＶ５１０（クローンＳＫ１，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ５６３９１９）、ＣＤ６９－ＡＰＣ－Ｃｙ７（クローンＦＮ５０，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，３１０９１４）及びＬＶＤ ｅＦｌｕｏｒ ５２０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ６５－０８６７－１４）と共にインキュベートした。染色した細胞をＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａを用いてＦＡＣＳによって解析した。結合のＥＣ_５０値はＬＶＤ^－ＣＤ６９^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞にゲートをかけた陽性ＴＩＧＩＴ染色された細胞の％を用いて算出した。図１１に示すように、カニクイザルＣＤ８^＋Ｔ細胞への結合についてのＥＣ_５０値は、クローン２９４８９については０．４８７ｎＭ、クローン２９５２０については１．７３ｎＭ及びクローン２９５２７については０．３７８ｎＭだった。クローン２９４８９及び３１２８２（残基１１６におけるＭからＴへの置換がある２９４８９の変異体）を同様に比較し、ＥＣ_５０値が、図１１Ｂに示す例についてそれぞれ０．２５ｎＭ及び０．２６ｎＭだったということは、２つのクローンについてのカニクイザル初代ＣＤ８^＋Ｔ細胞に対する類似の且つ強力な親和性を実証している。

【0236】

実施例１０：アンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴ活性のインビトロでの機能的特性評価
Ａ．ＣＨＯ－ＴＣＲ－ＣＤ１５５及びＪｕｒｋａｔ－ｈＴＩＧＩＴの共培養におけるＴＩＧＩＴのバイオアッセイ
ヒトＴＩＧＩＴ受容体を遮断することの機能的帰結を特徴付けるために、我々は、ｈＴＩＧＩＴとＴＣＲ連結の際に活性化されるルシフェラーゼレポーターを発現するＪｕｒｋａｔ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａの、解凍してそのまま使用（Ｔｈａｗ－ａｎｄ－Ｕｓｅ）のＴＩＧＩＴエフェクター細胞）をヒトＣＤ１５５及びＴＣＲ活性化因子を発現するように操作したＣＨＯ－Ｋ１細胞株（Ｐｒｏｍｅｇａの、解凍してそのまま使用のＣＤ１５５ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１）と共に共培養した。ＴＩＧＩＴを過剰発現しているＪｕｒｋａｔ細胞の活性化はＪｕｒｋａｔ細胞上のＴＣＲの連結の際のＣＤ１５５を発現しているＣＨＯ－Ｋ１細胞との接触によって誘導することができ、アンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴ抗体の存在下で増大させることができる。Ｊｕｒｋａｔ細胞の活性化を増大させる異なる抗体の能力を比較するために、漸増濃度の抗体の存在下で実験を実施し、ＥＣ_５０値を算出した。

【0237】

解凍してそのまま使用のＣＤ１５５ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＣＳ１９８８１１）細胞を製造元の推奨に従って播き、５％ＣＯ２インキュベーターＯ／Ｎにて３７℃でインキュベートした。その翌日、製造元の推奨に従って、解凍してそのまま使用のＴＩＧＩＴエフェクター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＣＳ１９８８１１）を、１３３ｎＭでの抗ＴＩＧＩＴ抗体（図１２Ａ）または漸増濃度（０．２２；０．５４；１．３６；３．４１；８．５３；２１．３；５３．３；１３３．３３；及び３３３ｎＭ）の抗ＴＩＧＩＴ抗体（図１２Ｂ）と共に新鮮な完全培地を含有するＣＤ１５５ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞のプレートに加え、３７℃、５％ＣＯ２にて６時間インキュベートした。

【0238】

６時間のインキュベートの後、Ｂｉｏ－ＧｌｏＴＭルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｇ７９４１）を使用することによりルシフェラーゼ活性を測定することによってＴＩＧＩＴエフェクター細胞の活性化を評価した。

【0239】

図１２Ａはアイソタイプ対照と比べてルシフェラーゼのシグナルに対する選択したクローンの添加の効果を示す。データは、Ｊｕｒｋａｔ－ｈＴＩＧＩＴ細胞のさらに強い活性化を生じたそれら抗体のアンタゴニスト活性を実証している。表１０は、アイソタイプ対照クローン（０３８４７）と比べた様々な抗ＴＩＧＩＴ抗体について得られたルシフェラーゼ発現の誘導の変化倍率をまとめている。

【0240】

（表１０）アイソタイプ対照と比べた誘導の変化倍率

【0241】

図１２Ｂに示すように、Ｊｕｒｋａｔ－ｈＴＩＧＩＴ細胞の活性化は０．２２ｎＭ～３３３ｎＭの間の抗ＴＩＧＩＴ抗体で評価され、クローン２９４８９については３．０ｎＭ；クローン２９４９４については４．４ｎＭ；クローン２９５２０については２．３ｎＭ及びクローン２９５２７については３２ｎＭ；クローン３２９１９については２．７ｎＭ及びクローン３２９３１については３．２ｎＭのＥＣ_５０を与えたということは、ＴＩＧＩＴの抑制性シグナル伝達の遮断に連続した強い機能的な活性を実証している。クローン２９４８９及び３１２８２（残基１１６におけるＭからＴへの突然変異がある２９４８９の変異体）を同様に比較し、ＥＣ_５０値が、図１２Ｃに示す例についてそれぞれ４．３ｎＭ及び８．１ｎＭだったということは、２つのクローンについて類似の機能的活性を実証している。

【0242】

Ｂ．ヒト初代ＣＤ８^＋Ｔ細胞に基づく機能的アッセイ
ヒトＴＩＧＩＴ受容体を遮断することの機能的帰結を特徴付けるために、我々は、健常ヒトドナーのＰＢＭＣに由来するヒト初代ＣＤ８^＋Ｔ細胞を、ヒトＣＤ１５５を発現し、ヒトＴ細胞を活性化するように操作されたＣＨＯ－Ｋ１細胞株と共に共培養した。我々は、操作されたＣＤ１５５を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞の存在下でのＣＤ８^＋Ｔ細胞によるＩＦＮｇの放出を抗ＴＩＧＩＴアンタゴニスト抗体によるｈＴＩＧＩＴの遮断によって高めることができることを観察した。ＩＦＮｇの放出を高めるこれら抗体の能力を比較するために、漸増濃度の抗体の存在下で実験を実施し、ＥＣ_５０値を算出した。

【0243】

製造元の推奨に従って、解凍してそのまま使用のＣＤ１５５ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＣＳ１９８８１１）細胞をＵ底９６穴プレートに播き、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターＯ／Ｎでインキュベートした。翌日、健常ドナーの全血から単離した凍結ヒト末梢血単核細胞（Ｉｍｍｕｎｅｈｅａｌｔｈ）から陰性選択キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１７９５３）を使用することによって製造元の推奨に従ってＣＤ８^＋Ｔ細胞を精製した。次いで、精製したＣＤ８Ｔ細胞を漸増濃度（０．１１ｎＭ、０．３３ｎＭ、１．０６ｎＭ、３．３ｎＭ、１０．６ｎＭ、３３．３ｎＭ、１０５．５ｎＭ及び３３３ｎＭ）の抗体（１００，０００個のＣＤ８Ｔ細胞／抗体を含有する１００ｕＬの完全培地）と共に１時間インキュベートした。その後、５０μＬの新鮮な完全培地を含有するＣＤ１５５ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞のプレートに抗体・ＣＤ８のミックスを加え、３７℃、５％ＣＯ２で５日間インキュベートした。最終的に、製造元の推奨に従って実行したＥＬＩＳＡアッセイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，８８－７３１６－８６）を用いて細胞上清にてＩＦＮｇの濃度を評価した。

【0244】

図１３Ａに示すように、抗ＴＩＧＩＴ抗体はすべてアイソタイプ対照と比べてＩＦＮｇの分泌を増やした。最も高い増加はクローン２９４８９（６．４倍）で見られ、その後に２９４９４（５．８倍）、２９５２０（５．４倍）、２９４９９（５．２倍）、２９５２７（４．５倍）及び２９５１３（３．２倍）が続いた。

【0245】

用量範囲試験（０．２２ｎＭ～３３３ｎＭの間での抗ＴＩＧＩＴ抗体）も行ってヒト初代ＣＤ８Ｔ細胞によるＩＦＮｇ分泌の増加についてのＥＣ_５０値を評価した。図１３Ｂに示すように、抗ＴＩＧＩＴ抗体２９４８９は３．５ｎＭのＥＣ_５０によって最良の活性を示し、クローン２９５２７（ＥＣ_５０＝５．１ｎＭ）、クローン２９４９４（ＥＣ_５０＝６．１ｎＭ）及びクローン２９５２０（ＥＣ_５０＝１１．１ｎＭ）がその後に続いた。最終的に、クローン２９４８９及びその変異体３１２８２を並行して調べ、それぞれ０．４９ｎＭ及び０．５０ｎＭのＥＣ_５０値で類似の活性を示した（図１３Ｃ）。要するに、これらのデータはＣＤ８^＋ヒトＴ細胞におけるＴＩＧＩＴ抑制性シグナルを遮断し、且つＩＦＮｇの産生での強い増加を特徴とするようなエフェクター機能を高めるアンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴ抗体の強い機能的な活性を実証している。

【0246】

Ｃ．ヒトＴＩＬの機能的アッセイ
がん患者に由来する腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）におけるヒトＴＩＧＩＴ受容体を遮断することの機能的帰結を特徴付けるために、我々は、卵巣腹水患者のＴＩＬに由来するヒト初代ＣＤ８^＋Ｔ細胞を、ヒトＣＤ１５５を発現し、ヒトＴ細胞を活性化するように操作されたＣＨＯ－Ｋ１細胞株と共に共培養した。我々は、操作されたＣＤ１５５を発現しているＣＨＯ－Ｋ１細胞の存在下でのＣＤ８^＋Ｔ細胞によるＩＦＮｇの放出が抗ＴＩＧＩＴアンタゴニスト抗体によるｈＴＩＧＩＴの遮断によって高められ得ることを観察した。

【0247】

解凍してそのまま使用のＣＤ１５５ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＣＳ１９８８１１）を製造元の推奨に従ってＵ底９６穴プレートに播き、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターＯ／Ｎにてインキュベートした。翌日、卵巣腹水から単離した凍結ヒトＴＩＬ（Ｉｍｍｕｎｅｈｅａｌｔｈ）から陰性選択キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１７９５３）を使用することによって製造元の推奨に従ってＣＤ８Ｔ細胞を精製した。次いで、精製したＣＤ８^＋Ｔ細胞を抗ＴＩＧＩＴ抗体クローン２９４８９の最適化していない親型であるクローン２６４５２、及び３１２８２（１００，０００個のＣＤ８^＋Ｔ細胞／１００μＬの抗体を含有する完全培地）と共に１時間インキュベートした。その後、５０ｕＬの新鮮な完全培地を含有するＣＤ１５５ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞のプレートに抗体・ＣＤ８ミックスを加え、３７℃、５％ＣＯ２で５日間インキュベートした。

【0248】

最終的に、製造元の推奨に従って実行されるＥＬＩＳＡアッセイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，８８－７３１６－８６）を用いて細胞上清にてＩＦＮｇの濃度を評価した。図１４に見られるように、抗ＴＩＧＩＴ抗体を共培養に加えるとＩＦＮｇの分泌はほぼ２倍増えた。これらのデータは、ＣＤ８^＋ヒトＴＩＬにおけるＴＩＧＩＴの抑制性シグナルを遮断し、且つ腫瘍の状況でのＴ細胞のエフェクター機能を高めるアンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴ抗体の強い機能的な活性を実証している。

【0249】

実施例１１：マウスにて機能的な活性を持つ抗ＴＩＧＩＴアンタゴニスト抗体の特性評価
Ａ．代替抗ＴＩＧＩＴアンタゴニスト抗体に対するマウスＣＤ１５５の競合アッセイ
このアッセイのために、マウスＴＩＧＩＴを過剰発現するように操作したＪｕｒｋａｔ細胞（クローンＥ６－１、ＡＴＣＣ ＴＩＢ－１５２）（Ｊｕｒｋａｔ－ｍＴＩＧＩＴ）を使用した。この抗体がヒトＴＩＧＩＴへの結合と同様にマウスＴＩＧＩＴに対して交差反応性を示したので抗ＴＩＧＩＴ抗体２６４９３を代替として使用した。２５μＬの完全培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）にて様々な濃度の抗ＴＩＧＩＴ抗体クローン２６４９３（０．０３～１０μｇ／ｍＬ）と共に細胞を３７℃で４５分間予め培養した。細胞を１回洗浄し、５０μＬの完全培地にて４μｇ／ｍＬのマウスＣＤ１５５－Ｈｉｓ－Ｆｃタグタンパク質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，５０２５９Ｍ０３Ｈ５０）と共にインキュベーターで４５分間インキュベートした。細胞を１回洗浄し、ＰＥ－抗Ｈｉｓ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，３６２６０３）で４℃にて３０分間染色した。ＦＡＣＳによって測定した中央値蛍光強度（ＭＦＩ）をＪｕｒｋａｔ－ｍＴＩＧＩＴへのＣＤ１５５の結合の測定単位として使用した。図１５Ａは、ＩＣ_５０として２．３ｎＭを特定しているＣＤ１５５の競合についての抗ＴＩＧＩＴクローン２６４９３の用量反応曲線を示す（上の点線はアイソタイプに由来するシグナルを表し、下の点線はＣＤ１５５なしでの細胞からのシグナルを表す）。これらの結果はマウスＴＩＧＩＴについてＣＤ１５５リガンドと競合する抗ＴＩＧＩＴ抗体の機能的有効性を実証している。

【0250】

Ｂ．マウスの機能的なインビトロアッセイ：抗原特異的な細胞傷害性（ＯＴ－Ｉ）
このアッセイではＯＶＡをパルスした標的細胞に向けたＯＴ－ＩＣＤ８^＋Ｔ細胞の抗原特異的な細胞傷害活性及び抗ＴＩＧＩＴ抗体の効果を評価するために、機械的な解離とその後のＥａｓｙＳｅｐ（商標）マウスＴ細胞単離キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ，カタログ＃１９８５１）を用いたマウスＴ細胞の陰性選択によってＣ５７ＢＬ／６－Ｔｇ^{（ＴｃｒａＴｃｒｂ）}１１００Ｍｊｂ／Ｃｒｌマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）の脾臓からＯＴ１細胞を単離した。抗原提示細胞として天然にＣＤ１５５を発現しているＰａｎＯ２がん細胞をマイトマイシンＣ（２５μｇ／ｍＬ）で処理し、その後ＯＶＡペプチド（Ｓ７９５１－１ＭＧ，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，１μｇ／ｍｌ，３７℃で１時間）でパルスした。１３３ｎＭでの抗ＴＩＧＩＴ抗体クローン２６４９３またはアイソタイプ対照の存在下でＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＰａｎＯ２を３日間共培養した。３日目に、ＥＬＩＳＡによるＩＦＮｇの検出（図１５Ｂ）のために上清を回収し、細胞傷害性アッセイ（図１５Ｃ）のためにＴ細胞を回収した。標的細胞としてＯＶＡをパルスしたＰａｎＯ２を使用した。製造元の指示書に従って、標的細胞及びパルスしていないＰａｎＯ２細胞（非標的内部対照）をそれぞれ１×１０^６個にてＣＦＳＥ（Ｃ１１５７，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）及びＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｆａｒ Ｒｅｄ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎキット（Ｃ３４５６４，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によって標識した。これらの細胞を混合し（１：１の比）、ウェル当たり２×１０^４個でプレートに播いた。１３３ｎＭでの抗ＴＩＧＩＴ抗体クローン２６４９３またはアイソタイプ対照の存在下で１０：１のエフェクター対標的の比を生じる１×１０^５個／ウェル（エフェクター細胞）にて刺激したＯＴ－１ＣＤ８^＋Ｔ細胞を加えた。２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理によって浮かせた。次いで細胞を生／死定着性バイオレット死細胞染色キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｌ３４９５５）によって染色した。次いで標的細胞の細胞傷害性殺傷をフローサイトメトリーによる生存標的細胞の非標的細胞に対する比における変化をモニターすることによって測定した。

【0251】

図１５Ｂは、抗ＴＩＧＩＴ抗体がＩＦＮｇの産生をほぼ２倍増やすことを示す一方で、図１５Ｃは６０％前後のマウスＯＴ－ＩＣＤ８^＋Ｔ細胞の細胞傷害活性の上昇を示している。要するに、これらの結果は、マウスのＣＤ８^＋Ｔ細胞のエフェクター機能を高める抗ＴＩＧＩＴ抗体の機能的な活性を裏付けている。

【0252】

実施例１２：マウスモデルにおける単剤療法及び抗ＰＤ－１抗体との併用における抗ＴＩＧＩＴアンタゴニスト抗体の抗腫瘍活性
Ａ．単剤療法における抗ＴＩＧＩＴアンタゴニスト抗体のインビボ抗腫瘍活性
この実験については、抗ＴＩＧＩＴ抗体クローン２６４９３はマウスＩｇＧ２ａアイソタイプで哺乳類細胞にて産生された。８週齢のメスＢａｌｂ／ｃマウスに５００，０００個のＣＴ２６結腸癌細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２６３８（商標））を皮下に接種した。接種後９日目に、腫瘍体積が平均４５ｍｍ^３前後であれば、マウスを同等の腫瘍体積を持つ処理群に無作為化した（群当たりｎ＝８）。９日目、１２日目及び１５日目の腹腔内注射によって、マウスを２００μｇの抗ＴＩＧＩＴまたはアイソタイプ対照（ｍｌｇＧ２ａ、ＢｉｏＸｃｅｌｌ）または２００μｇの抗ＰＤ－１（ＲＭＰ１－１４、ＢｉｏＸｃｅｌｌ）及び２００μｇのアイソタイプ対照（ｍｌｇＧ２ａ、ＢｉｏＸｃｅｌｌ）または２００μｇの抗ＰＤ－１（ＲＭＰ１－１４、ＢｉｏＸｃｅｌｌ）及び種々の濃度の抗ＴＩＧＩＴ（２００μｇ、６０μｇ、２０μｇ）で処理した。腫瘍増殖をモニターし、腫瘍体積は９日目から３６日目まで週３回、電子キャリパーによって測定した。腫瘍体積が２０００ｍｍ^３を超えるとマウスを屠殺した。線形混合モデルによって腫瘍増殖曲線を統計的に解析した。処理群間の差異は時間^＊処理群の相互作用を調べることによって評価した。抗ＴＩＧＩＴと抗ＰＤ－１の間での相乗効果を調べるために、抗ＴＩＧＩＴと抗ＰＤ－１の間での相乗効果を調べるために、２つの変数：抗ＴＩＧＩＴ（あり／なし）及び抗ＰＤ－１（あり／なし）の組み合わせによって処理群を記録した。各処理の相加効果（抗ＴＩＧＩＴ^＊時間及び抗ＰＤ－１^＊時間）の上の相乗効果は相互作用期間抗ＴＩＧＩＴ^＊抗ＰＤ－１^＊時間を調べることによって評価した。

【0253】

図１６Ａは、単剤療法にて抗ＴＩＧＩＴ抗体で処理したマウスについての個々の増殖曲線と同様に群当たりの中央値腫瘍増殖曲線を示す。対照群ではマウスは腫瘍の退縮を有さなかったのに対して、抗ＴＩＧＩＴで処理した２／８のマウスは完全奏効を有した。残りのマウスでは、明瞭な腫瘍増殖の遅延が存在した。対照群では、３０日を超えて生存したマウスはいなかったのに対して、処理群では、７／８のマウスが３０日を超えて生存した。

【0254】

図１６Ｂは、単剤療法または抗ＴＩＧＩＴとの併用にて抗ＰＤ－１によって処理したマウスについての個々の増殖曲線と同様に群当たりの中央値腫瘍増殖曲線を示す。抗ＰＤ－１単剤療法と比べて抗ＴＩＧＩＴ＋抗ＰＤ－１で処理したマウスでは腫瘍増殖の有意な抑制があった（ｐ＜０．０００１）。抗ＴＩＧＩＴ＋抗ＰＤ－１の併用は、双方の単剤療法処理の相加効果よりも大きい相乗的な抗腫瘍有効性を達成した（ｐ＝０．０２）。抗ＴＩＧＩＴ抗体（２００μｇ）と抗ＰＤ－１抗体の併用は完全奏効を示す７／８のマウスを生じた。抗腫瘍有効性は、抗ＰＤ－１と、抗ＴＩＧＩＴ抗体を６０μｇに減らした際８／８のマウスで及び抗ＴＩＧＩＴ抗体を２０μｇにさらに減らした際５／８のマウスで完全奏効を達成する低用量の抗ＴＩＧＩＴとの併用で維持された（図１６Ｃ）。これらのデータは、予め確立された腫瘍の治療について、単剤療法（ｐ＜０．０００１）または抗ＰＤ－１抗体との併用（ｐ＜０．０００１）における抗ＴＩＧＩＴ治療の有意な抗腫瘍有効性を実証している。

【0255】

実施例１３：マウスモデルにおける単剤療法及び抗ＰＤ－１抗体との併用での抗ＴＩＧＩＴアンタゴニスト抗体のアイソタイプ依存性の抗腫瘍活性
この実験のために、抗ＴＩＧＩＴクローン２６４９３をマウスＩｇＧ２ａ及びマウスＩｇＧ１のアイソタイプで哺乳類細胞にて産生させた。８週齢のメスＢａｌｂ／ｃマウスに５００，０００個のＣＴ２６結腸癌細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２６３８（商標））を皮下に接種した。接種後１０日目に、腫瘍体積が平均１００ｍｍ^３前後であれば、マウスを同等の腫瘍体積の処理群に無作為化した（群当たりｎ＝１０）。単剤療法の評価については、１０日目、１３日目及び１６日目での腹腔内注射によって２００μｇの抗ＴＩＧＩＴまたはアイソタイプ対照（ｍＩｇＧ２ａ、ＢｉｏＸｃｅｌｌ）でマウスを処理した。抗ＰＤ－１との併用の評価については、１０日目、１３日目及び１６日目での腹腔内注射によって２００μｇの抗ＰＤ－１（ＲＭＰ１－１４，ＢｉｏＸｃｅｌｌ）及び２００μｇのアイソタイプ対照（ｍｌｇＧ２ａ，ＢｉｏＸｃｅｌｌ）または２００μｇの抗ＰＤ－１（ＲＭＰ１－１４，ＢｉｏＸｃｅｌｌ）と２００μｇの抗ＴＩＧＩＴとの併用によりマウスを処理した。腫瘍増殖をモニターし、腫瘍体積は１０日目から３３日目まで週３回、電子キャリパーによって測定した。腫瘍体積が２０００ｍｍ^３を超えるとマウスを屠殺した。

【0256】

図１７Ａは、抗ＴＩＧＩＴ抗体による単剤療法についての個々の増殖曲線と同様に群当たりの中央値腫瘍増殖曲線を示し、図１７Ｂは抗ＴＩＧＩＴ抗体と抗ＰＤ－１抗体による併用療法について示す。単剤療法及び抗ＰＤ－１との併用の双方において、抗ＴＩＧＩＴ抗体による処理はマウスＩｇＧ２ａアイソタイプとして投与された場合、有意な抗腫瘍有効性を生じた（それぞれｐ＝０．０００１及びｐ＝０．００９）。しかしながら、マウスＩｇＧ１アイソタイプとしての抗ＴＩＧＩＴでは抗腫瘍有効性が観察できなかったということは、マウスＣＴ２６モデルではＦｃ受容体のｍＩｇＧ２ａとの相互作用が抗ＴＩＧＩＴアンタゴニスト抗体の抗腫瘍活性に重要であることを示唆している。これらのデータは、予め確立された腫瘍の治療について単剤療法または併用における抗ＴＩＧＩＴ療法のアイソタイプ依存性の抗腫瘍有効性を実証している。

【0257】

実施例１４：抗ＴＩＧＩＴアンタゴニスト抗体のインビボ抗腫瘍活性の作用のメカニズムの特性評価
Ａ．脾臓及び腫瘍のフローサイトメトリー解析
アンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴ抗体の作用のインビボモードを検討するために、単剤療法及び抗ＰＤ－１との併用にて抗ＴＩＧＩＴ抗体２６４９３（ＩｇＧ２ａ）による処理に続く免疫細胞の浸潤についてフローサイトメトリーによって腫瘍を解析した。実施例１２に記載されているようにマウスに接種し、それを処理した。２回目の処理の２日後、マウス（群当たり８匹）を屠殺し、腫瘍を採取した。腫瘍解離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によって腫瘍を解離させた。直接のエクスビボ染色のために、生存性色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｌ３４９５５）による染色及びＦｃブロックの後、細胞を抗ＣＤ４５、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８及び抗ＦｏｘＰ３（すべてｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色した。エクスビボ刺激については、細胞を細胞刺激カクテル（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びタンパク質輸送阻害剤（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と共に３時間インキュベートした。この後に抗ＣＤ４抗体及び抗ＣＤ８抗体による染色及びＦｃブロックが続いた。市販の緩衝液（ＩＣ固定緩衝液及び透過化緩衝液）による固定及び透過化の後、細胞を抗ＩＬ－１０及び抗ＩＦＮｇ（すべてｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色した。すべての図において、関連する対照群（単剤療法についてはアイソタイプ対照、併用については抗ＰＤ－１）と比べた比率変化は、対照群と比べて低下を表す負の値及び増加を表す正の値で示される。

【0258】

図１８Ａは、抗ＴＩＧＩＴ ｍＩｇＧ２ａ抗体による腫瘍のインビボ処理が対照群と比べてＣＤ４^＋ＴＩＬ集団内での抑制性Ｔ細胞の比率で２８％の低下を生じ、それは抗ＴＩＧＩＴ ｍＩｇＧ１による処理の後では観察されないことを示す。これはＴＩＧＩＴ^＋Ｔｒｅｇ細胞の枯渇があることを示しており、たぶん、実施例１４で議論されているような２つのアイソタイプの差別的有効性を説明する。図１８Ｂは、ＣＤ８^＋ＴＩＬの枯渇はないが、代わりに、２つのアイソタイプについて少しの増加が観察される（ｍＩｇＧ１については対照と比べて１７％の増加及びｍＩｇＧ２ａについては１６％の増加）ことを示している。これらの知見は一緒に、抗ＴＩＧＩＴ ｍＩｇＧ２ａで処理した腫瘍ではＣＤ８／Ｔｒｅｇの比の５０％を超える上昇を生じる（図１８Ｃ）。腫瘍内Ｔ細胞の機能性も抗ＴＩＧＩＴ ｍＩｇＧ２ａ抗体で処理した群について改善され、ＣＤ４^＋（図１８Ｄ）及びＣＤ８^＋のＴＩＬ（図１８Ｅ）双方のＩＦＮｇ産生の強い増加がある。これは、ＣＤ４^＋ＴＩＬ／ＣＤ８^＋集団におけるエクスビボ刺激の後、ＩＦＮ－ｇ産生細胞／ＩＬ－１０産生細胞の比の強い上昇を生じた（図１８Ｆ）。

【0259】

図１８Ｇは、抗ＴＩＧＩＴ ｍＩｇＧ２ａを抗ＰＤ－１と併用することが抗ＰＤ－１の単剤療法と比べて抑制性Ｔ細胞の３３％の減少を生じることを示している。再び、ＣＤ８^＋Ｔ細胞については逆が真実であり、抗ＰＤ－１の単剤療法と比べてｍＩｇＧ１及びｍＩｇＧ２ａのアイソタイプそれぞれについてＣＤ８^＋Ｔ細胞の浸潤で２２％及び２８％増加する（図１８Ｈ）。合わせて、これは、抗ＴＩＧＩＴ ｍＩｇＧ２ａとの併用での腫瘍にてＣＤ８^＋ＴＩＬのＴｒｅｇに対する比で２倍を超える上昇を生じる（図１８Ｉ）。さらに、抗ＰＤ－１と併用した抗ＴＩＧＩＴ抗体ｍＩｇＧ２ａによる処理は、腫瘍内ＣＤ４^＋Ｔ細胞についてＴｈ１対Ｔｈ２の表現型でのシフトを実証しており、ＩＦＮｇ産生ＣＤ４細胞の顕著な増加（図１８Ｊ）及びＩＬ－１０産生ＣＤ４細胞の減少（図１８Ｋ）がある。これは、単剤療法にて抗ＰＤ－１で処理したマウスと比べて、ＣＤ４^＋ＴＩＬ集団におけるエクスビボ刺激の後、ＩＦＮｇ産生細胞／ＩＬ－１０産生細胞の強い上昇を生じた（図１８Ｌ）。

【0260】

（表１１）抗ＴＩＧＩＴ ｍＩｇＧ２ａで処理したマウスとビヒクルで処理したマウスの間で差別的に発現された遺伝子

【0261】

（表１２）抗ＴＩＧＩＴ ｍＩｇＧ２ａ＋抗ＰＤ－１で処理したマウスと抗ＰＤ－１で処理したマウスの間で差別的に発現された遺伝子

【0262】

Ｂ．ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇによる腫瘍のトランスクリプトミクス解析
抗ＴＩＧＩＴ抗体の作用のインビボモードを検討するために、単剤療法及び抗ＰＤ－１との併用にて抗ＴＩＧＩＴで処理した腫瘍の免疫細胞の浸潤をトランスクリプトミクス解析（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ）によって解析した。実施例１２に記載されているようにマウスに接種し、それを処理した。抗ＴＩＧＩＴ抗体及び／または抗ＰＤ－１抗体による３回目の処理の２日後、マウスを屠殺し、腫瘍を採取した。ＲＮＡを抽出し、癌免疫学に関与する７７０の遺伝子の選択の発現をｎＣｏｕｎｔｅｒ技術（ＰａｎＣａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｐａｎｅｌ，Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ；ＶＩＢ Ｎｕｃｌｅｏｍｉｃｓ Ｃｏｒｅによって実施された）によって直接定量した。データはｎＳｏｌｖｅｒソフトウェア（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ）で解析した。

【0263】

図１９Ａは、ビヒクルで処理したマウスと抗ＴＩＧＩＴ ｍＩｇＧ２ａで処理したマウスとの間で差別的に調節される遺伝子の火山プロットを示す。高度に統計的に有意な遺伝子はプロットの頂点に収まり、高度に差別的に発現される遺伝子はいずれかの側（左：抗ＴＩＧＩＴで処理されたマウスでは下方調節される；右：抗ＴＩＧＩＴで処理されたマウスでは上方調節される）に収まる。高度に上方調節される遺伝子の例には、パーフォリン、グランザイムＢ及びＣＴＬＡ－４が挙げられる。実線は補正されていない０．０１のｐ値を表し、点線は補正された０．０５のｐ値を表す（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ補正）。表１１及び表１２はそれぞれ、ビヒクルと比べた抗ＴＩＧＩＴ ｍＩｇＧ２ａについて及び抗ＰＤ－１に対して抗ＰＤ－１＋抗ＴＩＧＩＴ ｍＩｇＧ２ａについて有意に差別的に発現された遺伝子を示す。複数の遺伝子が免疫細胞の機能的サブセットについてスコアで要約された場合、最も目立つ知見は細胞傷害性細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞のスコアの上昇だった（図１９Ｂ）。同じ変化は抗ＰＤ－１単独と比べた抗ＰＤ－１＋抗ＴＩＧＩＴ ｍＩｇＧ２ａで処理したマウスに存在した。単剤療法または抗ＰＤ－１との併用にて抗ＴＩＧＩＴ ｍＩｇＧ１で処理したマウスでは変化は観察されなかった。

【0264】

要するに、これらの結果は、抗ＴＩＧＩＴ抗体によるインビボ処理の後に観察された抗腫瘍有効性には腫瘍におけるＴｒｅｇ浸潤の減少が介在する一方でＣＤ８^＋エフェクターＴ細胞の集団は増えることを実証している。加えて、ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋のＴＩＬのエフェクター機能は、高い比率のＩＦＮｇ産生細胞、Ｔｈ１応答へのシフト及びＴ細胞の細胞傷害性機能に重要な遺伝子の発現の増加によって示されたように高められる。

【0265】

実施例１５：抗ＴＩＧＩＴアンタゴニスト抗体によって誘導される抗体依存性細胞性毒性（ＡＤＣＣ）活性
Ａ．健常ドナーに由来するヒトＰＢＭＣにおけるインビトロＡＤＣＣ
健常ドナーから単離したＰＢＭＣを完全ＲＰＭＩ培地（１０％熱非働化ＦＢＳ＋５０Ｕのペニシリン＋５０Ｕのストレプトマイシンで補完され、且つ２００ＩＵのＩＬ－２／ｍＬで補完された）に再浮遊させた。２．５×１０^５個のヒトＰＢＭＣを９６ウェルプレートＵ底にてウェル当たりで分配した。哺乳類細胞にて産生させた抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体クローン２６４５２またはＩｇＧ１アイソタイプ対照（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，４０３１０２）を６６．６、０．６６及び０．００６ｎＭの最終濃度で各相当するウェルに加えた。細胞を５％ＣＯ２と共に３７℃で２０時間インキュベートした。次いで細胞を回収し、以下の抗体パネル：ＬＶＤ ｅＦｌｕｏｒ５２０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ６５－０８６７－１４）、抗ＴＣＲａｂ－ＰｅｒｃＰ－Ｃｙ５．５（クローンＩＰ２６，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３０６７２３）、抗ＣＤ４－ＢＶ５１０（クローンＳＫ３，ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ ５６２９７０）、抗ＣＤ８－ＡＰＣ－Ｃｙ７（クローＳＫ１，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３４４７１４）、抗ＣＤ２５－ＢＶ６０５（クローン２Ａ３，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ５６２６６０）、抗ＣＤ１２７－ＡＰＣ（Ａ０１９Ｄ５，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３５１３１６）、抗ＣＣＲ７－ＢＶ４２１（クローンＧ０４３Ｈ７，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３５３２０７）及び抗ＣＤ４５ＲＯ－ＰＥ－Ｃｙ７（クローンＵＣＨＬ１，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３０４２２９）で染色した。結果はゲートをかけた生細胞にて提示する。ＣＤ４５^＋ＣＤ４^＋またはＣＤ４５^＋ＣＤ８^＋はＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋のＴ細胞全体を表す。ＣＤ４５^＋ＲＯ^＋ＣＤ４^＋またはＣＤ４５^＋ＲＯ^＋ＣＤ８^＋細胞はメモリーＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋Ｔ細胞を表す一方でＣＤ２５^高ＣＤ１２７^低ＣＤ４^＋はＴｒｅｇ細胞を表す。図２０Ａに示すように、ゲートをかけたＴｒｅｇにおけるＴＩＧＩＴ^＋細胞の比率はゲートをかけたメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＣＤ４^＋Ｔ細胞におけるよりも高い。

【0266】

製造元の仕様書に従ってＡｃｃｕＣｈｅｃｋ Ｃｏｕｎｔｉｎｇビーズ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて絶対的定量を行う。μＬ当たりの絶対細胞数の算出の後、特異的溶解の％は以下の式＝（１－（２６４５２ＴＩＧＩＴ抗体で処理した試料でのμＬ当たりの細胞の絶対数／抗体処理なしの３つ組の平均））×１００を用いて算出する。図２０Ｂに示すように、抗ＴＩＧＩＴ２６４５２ｈＩｇＧ１抗体はＣＤ８^＋Ｔ細胞全体（１２．２％）またはＣＤ４^＋Ｔ細胞全体（１６．３６％）よりもＴｒｅｇ（６２．２２％）にて高い特異的溶解を引き起こす。

【0267】

Ｂ．マウスの腫瘍におけるエクスビボＡＤＣＣ
抗ＴＩＧＩＴマウスＩｇＧ２ａ抗体がＴＩＧＩＴ^＋抑制性Ｔ細胞を枯渇させることができることを確認するために、エクスビボＡＤＣＣアッセイを設定した。８週齢のメスＢａｌｂ／ｃマウスに５００，０００個のＣＴ２６結腸癌細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２６３８（商標））を皮下に接種した。接種の３週後、腫瘍を採取し、腫瘍解離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で解離させた。単個細胞浮遊液を１３３ｎＭの抗ＴＩＧＩＴ抗体２６４９３（ｍＩｇＧ１またはｍＩｇＧ２ａのアイソタイプ）と共に２０時間インキュベートした（１００万個の細胞／２００μＬのＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）。２０時間後、生存性色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｌ３４９５５）で染色し、且つＦｃをブロックした後、細胞を抗ＣＤ４、抗ＴＩＧＩＴ、抗ＣＤ８及び抗ＦｏｘＰ３の抗体（すべてｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色した。

【0268】

図２１は、様々なＴＩＧＩＴ^＋免疫サブセットについてのアイソタイプ対照による処理と比べたＴＩＧＩＴ^＋細胞の絶対カウントでの％低下を示す。抗ＴＩＧＩＴ ｍＩｇＧ２ａ抗体処理後の最強の低下が抑制性Ｔ細胞で明らかである（約４０％の低下）ということは、これらの細胞が従来型のＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋のＴ細胞よりもＡＤＣＣの影響を受け易いことを示唆している。

【0269】

全体として、これらの結果は、Ｔｒｅｇ集団で実証された強い活性によりＴＩＧＩＴ^＋免疫細胞を枯渇させる抗ＴＩＧＩＴ ｈＩｇＧ１または抗ＴＩＧＩＴ ｍＩｇＧ２ａの有効性を実証している。

【0270】

実施例１６：コンピューターによる解析を用いた免疫原性の予測
ＥｐｉＭａｔｒｉｘタンパク質スコア（Ｄｅ Ｇｒｏｏｔ，ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｃｌｉｎｉｃａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１：１８９）を用いたコンピューター予測によってクローン２９４９４及び２９４８９と同様にその変異体３１２８２の免疫原性の潜在性を評価した。解析を完了するために、インプット配列を重複する９量体のフレームに分け、各フレームを８つの共通するクラスＩＩＨＬＡ対立遺伝子のパネルに関して評価した。これらの対立遺伝子は「スーパータイプ」である。各１つは多数の追加の「ファミリーメンバー」の対立遺伝子と機能的に同等またはほぼ同等である。まとめて見れば、これら８つのスーパータイプの対立遺伝子はそのそれぞれのファミリーメンバーと共にヒト集団の９５％余りを上手く「カバーする」（Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄ，ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３３６３）。対立遺伝子によるフレームの各「評価」はそれぞれ予測されたＨＬＡ結合親和性についての言及である。ＥｐｉＭａｔｒｉｘ評価のスコアはおよそ－３から＋３までに及び、正規分布する。１．６４を上回るＥｐｉＭａｔｒｉｘ評価のスコアは「ヒット」として定義され、すなわち、潜在的に免疫原性であり、さらなる考慮に値する。

【0271】

他の因子はすべて同等であり、所与のタンパク質に含有されるＨＬＡリガンド（すなわち、ＥｐｉＭａｔｒｉｘのヒット）が多ければ多いほど、そのタンパク質が免疫応答を誘導することになる可能性が高い。ＥｐｉＭａｔｒｉｘタンパク質スコアは、所与のサイズのタンパク質で見いだされると予想される予測されたＴ細胞エピトープの数とＥｐｉＭａｔｒｉｘシステムによって予測された推定上のエピトープの数の間での差異である。ＥｐｉＭａｔｒｉｘタンパク質スコアは観察される免疫原性と相関する。ＥｐｉＭａｔｒｉｘタンパク質スコアは「正規化され」、標準化尺度でプロットすることができる。「平均」タンパク質のＥｐｉＭａｔｒｉｘタンパク質スコアはゼロである。ゼロを上回るＥｐｉＭａｔｒｉｘタンパク質スコアは過剰なＭＨＣリガンドの存在を示し、免疫原性の高い潜在性を意味する一方で、ゼロを下回るスコアは予想よりも少ない潜在的なＭＨＣリガンドの存在及び免疫原性について低い潜在性を示す。＋２０を上回るスコアを持つタンパク質は有意な免疫原性の潜在性を有すると見なされる。

【0272】

抑制性Ｔ細胞エピトープの存在を調整すること
抗体は、その可変ドメイン、特に相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列が桁外れな程度に変化することができるという点で独特のタンパク質である。それは、抗体が多種多様な抗原を認識できるようにするこの変異性である。しかしながら、抗体の成熟を制御する組換え及び突然変異の事象は新しいＴ細胞エピトープまたは新Ｔ細胞エピトープも生じることができる。これらの新エピトープは循環しているＴ細胞にとって「異物」であると思われ得る。抗体配列における新エピトープの存在は、ＨＡＨＡ反応またはＡＤＡ（抗薬剤抗体）としても知られるヒト抗ヒト抗体反応の形成をもたらすことができる。

【0273】

抑制性Ｔ細胞は、変異した配列及び／または高度に可変の配列、たとえば、抗体のＣＤＲを含有するものを含む末梢における完全にヒトのタンパク質に対する免疫応答を抑制することで重要な役割を担う。抑制性Ｔ細胞は抑制性Ｔ細胞エピトープによって連結され、活性化される。抗体配列における新エピトープの存在に関連する遺伝的リスクは天然に存在する抑制性Ｔ細胞エピトープの存在によってバランスが保たれていると思われる。

【0274】

多数のヒト抗体の単離物の配列をスクリーニングすることによって、ＥｐｉＶａｘは抑制性の潜在力を有すると考えられるいくつかの高度に保存されたＨＬＡリガンドを同定している。実験的な証拠は、これらペプチドの多くが実際、ほとんどの対象にて積極的に寛容原性であることを示唆している。これらの高度に保存された抑制性で乱雑なＴ細胞エピトープは今やＴレギトープ（Ｔｒｅｇｉｔｏｐｅ）として知られている（Ｄｅ Ｇｒｏｏｔ，ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｂｌｏｏｄ，１１２：３３０３）。

【0275】

多くの場合、ヒト化抗体に含有される新エピトープの免疫原性の潜在力は有意な数のＴレギトープの存在下で効果的に制御することができる。抗体の免疫原性解析の目的で、ＥｐｉＶａｘはＴレギトープ調整後のＥｐｉＭａｔｒｉｘスコア及び抗治療用抗体反応の対応する予測を開発している。Ｔレギトープ調整後のＥｐｉＭａｔｒｉｘスコアを算出するために、ＴレギトープのスコアをＥｐｉＭａｔｒｉｘタンパク質スコアから差し引く。Ｔレギトープ調整後のスコアは、２３の市販の抗体のセットについて観察された臨床免疫応答とよく相関することが示されている（Ｄｅ Ｇｒｏｏｔ，ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１：１８９）。

【0276】

クローン２９４８９、２９４９４及び３１２８２の抗体配列は、免疫原性について限定された潜在性を示す、ＥｐｉＭａｔｒｉｘスコアの下端にて得点する。ライセンス供与されているモノクローナル抗体の回帰分析は抗体クローン２９４８９及び３１２８２について曝露された患者の約０％でＡＤＡ反応を予測する。クローン２９４９４については、分析はベースラインＶＨ配列について曝露された患者の２．７８％でＡＤＡ反応を予測し、可変ＶＨ配列については２．８８％で予測する。データは以下の表１３にてまとめている。

【0277】

（表１３）ＥｐｉＭａｔｒｉｘスコア及びＴレギトープ調整後のＥｐｉＭａｔｒｉｘスコア

【0278】

実施例１７：組換えヒトＴＩＧＩＴタンパク質への抗ＴＩＧＩＴクローンの結合についての親和性の決定
抗体３１２８２を他の特許出願に記載されている抗ＴＩＧＩＴ抗体クローンに対して比較した。具体的には、３１２８２を４．１Ｄ３．Ｑ１Ｅ（４．１Ｄ３とも呼ばれる、ＷＯ２０１７／０５３７４８から）；２２Ｇ２（ＷＯ２０１６１０６３０２から）；３１Ｃ６（ＷＯ２０１６／０２８６５６から）；３１３Ｍ２（ＷＯ２０１６／１９１６４３から）；及びＴＩＧ１（ＷＯ２０１７／１５２０８８から）と比較した。比較した抗体クローンの参照及び配列を以下の表１４に示す。

【0279】

（表１４）比較しての抗ＴＩＧＩＴ抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインの配列

【0280】

Ａ．哺乳類細胞における産生
さらなる特性評価のために十分な量の選択された抗ＴＩＧＩＴクローンを産生させるために、特異的な抗体クローン（クローン３１２８２＿ｕｐ、４．１Ｄ３、２２Ｇ２、３１Ｃ６、３１３Ｍ３２及びＴＩＧ１）をコードするＤＮＡベクターを生成し、ヒトＩｇＧ１アイソタイプの産生のためにＨＥＫ細胞に形質導入した。抗体可変ドメインのためのヒトコドンで最適化した合成ＤＮＡ断片をＧｅｎｅａｒｔでオーダーした。各抗体クラスのマウスＩｇカッパシグナル配列と定常領域とを含有するｐＵＰＥ発現ベクターに可変ドメインの配列を継ぎ目なくライゲーションした。発現ベクターは制限解析及びＤＮＡ配列決定によって検証した。一時的な形質移入のために、エンドトキシンを含まないＤＮＡｍａｘｉｐｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ）を作製し、確立されたプロトコールに従って、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にて重鎖及び軽鎖のベクターをＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ１細胞に同時形質移入した。形質移入の２４時間後にプリマトン（最終容量０．５５％）を加えた。形質移入の６日後、馴化培地を回収した。Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ ｓｕｒｅＬＸ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）アフィニティクロマトグラフィーによって抗体をバッチごとに精製した。結合した抗体を、１ＭのＮａＣｌを含有するＰＢＳ及びＰＢＳによる２工程で洗浄した。抗体を２０ｍＭのクエン酸塩、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ３で溶出し、１／６容量の１ＭのＫ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ８によっておよそｐＨ７に中和した。

【0281】

次に、ＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムを用いたゲル濾過によって抗体をさらに精製した。ＮｕＰＡＧＥによって分画を分析し、抗体を含有する分画をプールした。０．２２μｍのシリンジフィルターにて最終生成物を無菌化した。生成物をＮｕＰＡＧＥによって分析し、エンドトキシンのレベルはＬＡＬアッセイによって測定した。

【0282】

さらに、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４のアイソタイプで以下のように（クローン３１２８２＿ｗｕ）ＣＨＯ－Ｋ１細胞にてクローン３１２８２も産生させた。抗体をコードしているＤＮＡベクターを構築し、ＣＨＯ－Ｋ１細胞に形質移入した。抗体可変ドメインのためのＣＨＯコドンで最適化したＤＮＡ断片を合成し、各抗体クラスのシグナル配列及び定常領域を含有する発現ベクターにライゲーションした。発現ベクターは制限解析及びＤＮＡ配列決定によって検証した。確立されたプロトコールに従ってエレクトロポレーション（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によって重鎖及び軽鎖のベクターをＣＨＯ－Ｋ１細胞に同時形質移入した。形質移入した培養物を規模拡大し、流加培養に接種した。流加培養の１４日後、馴化培地を回収した。

【0283】

回収した細胞培養物を先ず、連続して接続したＤ０ＨＣ及びＡ１ＨＣ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）による深層濾過の２段階によって清澄化した。次いで、清澄化した回収物を先ず、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によるアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。結合した抗体を、１ＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭのＮａＡｃ－ＨＡｃ（ｐＨ５．５）及び５０ｍＭのＮａＡｃ－ＨＡｃ（ｐＨ５．５）による２工程で洗浄した。次いで抗体を５０ｍＭのＮａＡｃ－ＨＡｃ（ｐＨ３．５）によって溶出し、１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）によっておよそｐＨ５．５に中和した。

【0284】

次に、中和した中間体をさらに素通り画分モードでのＰＯＲＯＳ ＨＱ５０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ）を用いたアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）によって精製した。負荷の前にカラムを５０ｍＭのＮａＡｃ－ＨＡｃ（ｐＨ５．５）で平衡化した。負荷工程及び回収工程の間に回収されたＡＥＸの素通り画分をＰＯＲＯＳ ＸＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ）を用いた結合・溶出モードでのカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）によってさらに精製した。ＣＥＸカラムを５０ｍＭのＮａＡｃ－ＨＡｃ（ｐＨ５．５）で平衡化し、１０ＣＶで０．５ＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭのＮａＡｃ－ＨＡｃ（ｐＨ５．５）に達するまでの線形勾配溶出（ＬＧＥ）によって抗体を溶出した。Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ３，ｕｌｔｒａｃｅｌ ３０ｋＤ，タイプＡ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いた最終的な限外濾過及び透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）を行ってＣＥＸ溶出液を濃縮し、緩衝液を２０ｍＭのＨｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ５．５）に交換した。その後、ポリソルベート８０（ＰＳ８０）及びスクロースを透析濾過した試料に加え、２０ｍＭのＨｉｓ－ＨＣｌ、０．０１％（ｗ／ｗ）のＰＳ８０、及び９％（ｗ／ｖ）のスクロース（ｐＨ５．５）の緩衝液におけるその濃度が２０ｇ／Ｌに近い最終生成物を得た。生成物はＰＱＡ試験すべてを完了した。ＳＥＣ純度、エンドトキシンのレベル及び他の基準はすべて要件を満たした。

【0285】

Ｂ．Ｂｉａｃｏｒｅ測定
ＢｉａｃｏｒｅＴ２００の技術であるＣＭ５センサーチップ（ＦｒａｎｃｅのＮｏｖａｌｉｘで実行）を用いてＨＢＳ－ＥＰ緩衝液系（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）にて２５℃でバイオセンサー解析を行った。サンプルホテルは８℃で維持した。標準のアミンカップリング化学反応を用いて、ヤギ抗ヒトＩｇＧ捕捉抗体（Ｆｃγ断片に特異的、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をセンサーチップの双方のフローセルに不動化した（１００００ＲＵ）。この表面型は、各再生工程の後、新しい解析抗体を再生可能な方法で捕捉するための構成を提供した。フローセル２を用いて捕捉抗体を解析する一方でフローセル１は参照フローセルとして使用した。３０から０．１２３ｎＭに及ぶ６つの異なる抗原濃度をランニング緩衝液で調製した。抗原試料濃度のそれぞれは、３．３３ｎＭの２つ組での実行を除いて単回の繰り返しとして実行した。２つのブランク（緩衝液）注入も実行し、系の人為的結果を評価し、差し引くのに使用した。抗原濃度すべてについて会合相（３００ｓ）及び解離相（６００ｓ）を３０ｕＬ／分の流速で実施した。１０ｍＭのグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ１．５の３回の連続注入（１５ｓ、１５ｓ及び６０ｓ）によって表面を再生した。得られたセンサーグラムを１：１モデル（適用した濃度すべてについて同じ動的値を想定する）に大域的に適合させた。１：１動的モデルの適合が信頼できなかったので、親和性はクローン３１３Ｍ３２については定常状態からも決定したということは、会合時間の終了時でのヒトＴＩＧＩＴとの平衡を示している。様々な抗ＴＩＧＩＴクローンについて得られた結果を表１５で報告する。

【0286】

（表１５）動態及び親和性の評価

【0287】

実施例１８：抗ＴＩＧＩＴアンタゴニスト抗体の細胞結合
Ａ．Ｊｕｒｋａｔ－ｈＴＩＧＩＴへの抗ＴＩＧＩＴクローンの結合
ヒトＴＩＧＩＴで形質導入したＪｕｒｋａｔＥ６．１細胞（Ｊｕｒｋａｔ ｈＴＩＧＩＴ）を用いてヒト抗ＴＩＧＩＴ抗体の親和性が測定されている。ｈＴＩＧＩＴに対する選択した抗体の親和性を分析するために、１０^５個の細胞をウェル当たりで分配し、漸減濃度（８；４；２；１；０．５；０．２５；０．１２５；０．０６２；０．０３１；０．０１６；８×１０^－３及び４×１０^－３ｎＭ）の種々の抗ＴＩＧＩＴアンタゴニスト抗体クローンと共にインキュベートした（図２）。抗体をＦＡＣＳ緩衝液にて細胞と共に４℃で２０分間インキュベートした。洗浄の後、細胞を抗ヒトＩｇ（Ｆｃガンマ特異的な）－ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，１２－４９９８－８２，２．５μｇ／ｍｌで）と共に氷上で２０分間インキュベートし、２回洗浄した。ＬＳＲ ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａを用いて蛍光強度を解析し、その表面にＴＩＧＩＴを発現している細胞にてＰＥの中央値蛍光強度として細胞結合を記録した。

【0288】

Ｊｕｒｋａｔ－ｈＴＩＧＩＴへの結合の半最大濃度（ＥＣ_５０）はＰｒｉｓｍにおける４変数曲線・適合方程式を用いて算出した。結果は図２２Ａにて説明し、値は以下の表１６にてまとめる。Ｊｕｒｋａｔ－ｈＴＩＧＩＴを結合するＥＣ_５０値はクローン３１２８２については非常に近接しており、ＨＥＫ細胞（３１２８２＿ｕｐ、０．１３ｎＭ）またはＣＨＯ－Ｋ１細胞（３１２８２＿ｗｕ、０．１０ｎＭ）にて産生された抗体の間で顕著な差異はなかった。クローン３１Ｃ６及びＴＩＧ１も０．２ｎＭを下回るＥＣ_５０値を示す一方で、他のクローン（４．１Ｄ３、２２Ｇ２及び３１３Ｍ３２）についての親和性は低く、結果は０．２６７から０．４４５ｎＭに及ぶＥＣ_５０値を示している。結果は、抗ＴＩＧＩＴクローン３１２８２、３１Ｃ６及びＴＩＧ１について操作された系における膜で発現されたヒトＴＩＧＩＴへの強い結合を実証している一方で、他のクローンは低い親和性を有する。

【0289】

（表１６）Ｊｕｒｋａｔ－ｈＴＩＧＩＴへの結合についての様々な抗ＴＩＧＩＴクローンのＥＣ_５０のデータ及び比較

【0290】

Ｂ．健常ヒトＰＢＭＣに由来する初代ＣＤ８^＋Ｔ細胞への抗ＴＩＧＩＴクローンの結合
健常ボランティアから単離されたヒトＰＢＭＣをアンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴ抗体による結合について分析した。細胞をウェル当たり１×１０^５個で分配した。細胞を抗ＣＤ１６（クローン３Ｇ８，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ３０２００２）、ＣＤ３２（クローンＦＬＩ８．２６，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ５５７３３３）及びＣＤ６４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ５５５５２５）と共に室温で１０分間インキュベートし、示した抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体のクローンをＦＡＣＳ緩衝液における８；４；２；１；０．５；０．２５；０．１２５；０．０６２；０．０３１；０．０１６；８×１０^－３及び４×１０^－３ｎＭの最終濃度にて直接加え、４℃で２０分間インキュベートした。洗浄の後、細胞を抗ヒトＩｇ（Ｆｃガンマ特異的な）－ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，１２－４９９８－８２，２．５μｇ／ｍｌで）と共に４℃で２０分間インキュベートした。次いで細胞を洗浄し、以下の抗体及びＬＶＤミックス：抗ＣＤ４－ＰｅｒｃＰ－Ｃｙ５．５（クローンＡ１６１Ａ１，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ３５７４１４）；抗ＣＤ８－ＢＶ５１０（クローンＳＫ１，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ５６３９１９）及びＬＶＤ ｅＦｌｕｏｒ６６０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ６５－０８６４－１８）と共にインキュベートした。

【0291】

生存ＴＩＧＩＴ^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるＭＦＩシグナルを用いてＣＤ８^＋ヒト初代Ｔ細胞への結合についてのＥＣ_５０値を算出した。結果を図２２Ｂで説明し、ＥＣ_５０の濃度を以下の表１７でまとめる。ヒト初代ＣＤ８^＋Ｔ細胞を結合することについてのＥＣ_５０値は、クローン３１２８２については非常に近接しており、ＨＥＫ細胞（３１２８２＿ｕｐ、０．２１ｎＭ）またはＣＨＯ－Ｋ１細胞（３１２８２＿ｗｕ、０．１９ｎＭ）にて産生された抗体の間で顕著な差異はなかった。アンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴ抗体の様々なクローン間での比較は、クローン３１２８２＿ｗｕ（０．１９ｎＭ）及びクローン３１２８２＿ｕｐ（０．２１ｎＭ）についてヒト初代ＣＤ８^＋Ｔ細胞における結合で最良のＥＣ_５０値を示している。クローン３１Ｃ６及びＴＩＧ１はＥＣ_５０で２倍の差を示す一方で、クローン２２Ｇ２、３１３Ｍ３２及び４．１Ｄ３は６．１～９．７倍の倍数で異なる。全体として、３１２８２＿ｗｕ及び３１２８２＿ｕｐはヒト初代ＣＤ８^＋Ｔ細胞上で膜に発現されたＴＩＧＩＴに対する最良の結合を示す。

【0292】

（表１７）ヒト初代ＣＤ８^＋Ｔ細胞への結合についての様々な抗ＴＩＧＩＴクローンのＥＣ_５０のデータ及び比較

【0293】

Ｃ．がん患者のＰＢＭＣに由来する初代ＣＤ８^＋Ｔ細胞への抗ＴＩＧＩＴクローンの結合
様々なアンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴ抗体のクローンによる結合についてがん患者から単離されたヒトＰＢＭＣを分析した。細胞をウェル当たり１×１０^５個で分配した。細胞を抗ＣＤ１６（クローン３Ｇ８，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ３０２００２）、ＣＤ３２（クローンＦＬＩ８．２６，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ５５７３３３）及びＣＤ６４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ５５５５２５）と共に室温で１０分間インキュベートし、示した抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体をＦＡＣＳ緩衝液にて８、４、２、１、０．５、０．２５、０．１２５、０．０６２及び０．０３１ｎＭの最終濃度で直接加え、４℃で２０分間インキュベートした。洗浄した後、細胞を抗ヒトＩｇ（Ｆｃガンマ特異的な）－ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，１２－４９９８－８２，２．５μｇ／ｍｌで）と共に４℃で２０分間インキュベートした。次いで細胞を洗浄し、以下の抗体及び生存性色素（ＬＶＤ）ミックス：抗ＣＤ４－ＰｅｒｃＰ－Ｃｙ５．５（クローンＡ１６１Ａ１，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ３５７４１４）；抗ＣＤ８－ＢＶ５１０（クローンＳＫ１，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ５６３９１９）及びＬＶＤ ｅＦｌｕｏｒ５２０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ６５－０８６７－１４）と共にインキュベートした。細胞を洗浄し、固定し、ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａを用いて表面染色を定量した。ＦｌｏｗＪｏ Ｖ１０．１を用いてフローサイトメトリーのデータを解析した。ゲートをかけたＬＶＤ^－ＴＩＧＩＴ^＋ＣＤ８^＋細胞におけるＴＩＧＩＴのＭＦＩを用いてＥＣ_５０値を算出した。非線形の回帰曲線を図２２Ｃに示し、値を以下の表１８でまとめる。

【0294】

クローン３１２８２＿ｗｕ及びクローン３１２８２＿ｕｐは、それぞれ０．１４ｎＭ及び０．１２ｎＭの濃度でがん患者に由来するＣＤ８^＋Ｔ細胞上に結合する非常に近接したＥＣ_５０値を示す。クローンの残りは低い親和性を示し、クローン３１Ｃ６、ＴＩＧ１及び２２Ｇ２はそれぞれ１．５、２．７及び３．１倍低い親和性を示す。クローン３１３Ｍ３２について測定されたＥＣ_５０値はクローン３１２８２＿ｕｐと比べて８．３倍低い。クローン４．１Ｄ３は最低の親和性を示し、調べた最良のクローンに対して９．５倍の差で結合する。

【0295】

（表１８）がん患者に由来するヒト初代ＣＤ８^＋Ｔ細胞への結合についての様々な抗ＴＩＧＩＴクローンのＥＣ_５０のデータ及び比較

【0296】

実施例１９：抗ＴＩＧＩＴアンタゴニスト抗体クローンとＴＩＧＩＴ天然リガンド（ＣＤ１５５）との間の競合アッセイ
ヒトＴＩＧＩＴを過剰発現しているＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ－ｈＴＩＧＩＴ）を回収し、５．１０^４個／ウェルで分配し、完全培地にて以下の濃度：１３３．３３；４２．２０；１３．３３；４．２２；１．３３；０．４２２；０．１３３；０．０４２；０．０１３３；４．２×１０^－３；１．３×１０^－３；４．２×１０^－４；１．３×１０^－４；４．２×１０^－５ｎＭでの抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体と共に３７℃で４５分間インキュベートした。過剰な抗体を洗い流し、次いで細胞を１５μｇ／ｍＬでのＣＤ１５５－Ｈｉｓ（Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍａｒｔ，ＰＶＲ－３１４１Ｈ）と共に３７℃で４５分間インキュベートした。次いで、抗Ｈｉｓタグ－ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，３６２６０３，試験当たり２μＬ）を用いて、結合したＣＤ１５５－Ｈｉｓを検出し、４℃で３０分間インキュベートした。ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａを用いたＦＡＣＳによって細胞を解析し、細胞全体におけるＰＥの中央値蛍光強度に基づいて、ＣＤ１５５の結合を阻止する濃度の半分（ＩＣ_５０）を算出した。

【0297】

結果を図２３で説明し、値を以下の表１９でまとめる。抗ＴＩＧＩＴクローン３１２８２＿ｗｕ及び３１２８２＿ｕｐは、ｈＴＩＧＩＴを発現するように操作したＪｕｒｋａｔ細胞にてＣＤ１５５との競合についてそれぞれ０．０５ｎＭ及び０．０４ｎＭの濃度による最良のＩＣ_５０値を示す。他のクローン（４．１Ｄ３、２２Ｇ２、３１Ｃ６、ＴＩＧ１）は０．０７～０．０９ｎＭの間のＩＣ_５０値を有する一方で、クローン３１３Ｍ３２ははるかに低い有効性（０．６５ｎＭ）でＴＩＧＩＴへの結合についてＣＤ１５５と競合する。

【0298】

（表１９）ヒトＴＩＧＩＴにおけるＣＤ１５５との競合についての様々な抗ＴＩＧＩＴクローンのＩＣ_５０のデータ及び比較

【0299】

実施例２０：アンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴクローンの機能的特性評価
Ａ．Ｊｕｒｋａｔ－ｈＴＩＧＩＴ細胞によるＴＩＧＩＴの機能的アッセイ
ヒトＴＩＧＩＴ受容体を遮断することの機能的帰結を特徴付けるために、我々は、ｈＴＩＧＩＴとＴＣＲ連結の際に活性化されるルシフェラーゼレポーターとを発現しているＪｕｒｋａｔ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａの、解凍してそのまま使用のＴＩＧＩＴエフェクター細胞）を、ヒトＰＶＲ／ＣＤ１５５とＴＣＲ活性化因子とを発現するように操作したＣＨＯ－Ｋ１細胞株（Ｐｒｏｍｅｇａの、解凍してそのまま使用のＣＤ１５５ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１）と共に共培養した。ＴＩＧＩＴを過剰発現しているＪｕｒｋａｔ細胞の活性化はＪｕｒｋａｔ細胞上でのＴＣＲの連結の際にＣＤ１５５を発現しているＣＨＯ－Ｋ１細胞との接触によって誘導することができ、アンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴ抗体の存在下で高めることができる。Ｊｕｒｋａｔ細胞の活性化を高める様々な抗ＴＩＧＩＴクローンの能力を比較するために、漸増濃度の抗体の存在下で実験を行い、ＥＣ_５０値を算出した。

【0300】

製造元の推奨に従ってＣＤ１５５ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＣＳ１９８８１１）細胞を播き、３７℃、５％のＣＯ２のインキュベーターＯ／Ｎにてインキュベートした。翌日、漸増濃度（０．０３；０．１１；０．３３；１．０６；３．３４；１０．５６；３３．３８；１０５．４９；及び３３３ｎＭ）の抗ＴＩＧＩＴ抗体と共に新しい完全培地を含有するＣＤ１５５ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞のプレートに、製造元の推奨に従って、ＴＩＧＩＴエフェクター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＣＳ１９８８１１）を加え、３７℃、５％ＣＯ２にて６時間インキュベートした。６時間のインキュベートの後、Ｂｉｏ－ＧｌｏＴＭルシフェラーゼアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｇ７９４１）を用いてルシフェラーゼ活性を測定することによってＴＩＧＩＴエフェクター細胞の活性化を評価した。

【0301】

図２４Ａに示し、表２０でまとめるように、抗ＴＩＧＩＴ抗体３１２８２はアッセイにおけるＥＣ_５０値及びルシフェラーゼシグナルの最大誘導という点で最良の有効性を有する。ＨＥＫ細胞（３１２８２＿ｕｐ）またはＣＨＯ－Ｋ１細胞（３１２８２＿ｗｕ）にて産生されたクローンについて観察された活性はアイソタイプ対照（Ｂｉｏｅｘｃｅｌｌ，ＢＥ０２９７）よりも８倍高い最大のルシフェラーゼシグナルに匹敵し、ＥＣ_５０濃度はそれぞれ３．３ｎＭ及び３．５ｎＭにて測定された。比較の目的で、クローン４．１Ｄ３、２２Ｇ２及び３１Ｃ６は５～１０ｎＭの間のＥＣ_５０に関連してアイソタイプ対照に比べて５．３～６．７倍の間の最大活性を有する。クローン３１３Ｍ３２及びＴＩＧ１についてのＥＣ_５０値は調べた濃度での低い活性及び曲線の不十分な適合のために決定することができなかった（図２４Ａ）。

【0302】

（表２０）Ｊｕｒｋａｔ－ｈＴＩＧＩＴ細胞における機能的活性についての様々な抗ＴＩＧＩＴクローンのＥＣ_５０のデータ及び比較

Ｐ．Ｆ．：不十分な適合

【0303】

Ｂ．健常ボランティアに由来するヒト初代ＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるＴＩＧＩＴの機能的アッセイ
ヒトＴＩＧＩＴ受容体を遮断することの機能的帰結を特徴付けるために、我々は、健常ヒトドナーのＰＢＭＣに由来するヒト初代ＣＤ８^＋Ｔ細胞を、ヒトＰＶＲ／ＣＤ１５５を発現し、且つヒトＴ細胞を活性化するように操作したＣＨＯ－Ｋ１細胞株と共に共培養した。我々は、操作されたＣＤ１５５を発現しているＣＨＯ－Ｋ１細胞の存在下でのＣＤ８^＋Ｔ細胞によるＩＦＮｇの放出が抗ＴＩＧＩＴアンタゴニスト抗体によりｈＴＩＧＩＴを遮断することによって高められ得ることを観察した。これら抗体のＩＦＮｇの放出を高める能力を比較するために、漸増濃度の抗体の存在下で実験を行い、ＥＣ_５０値を算出した。

【0304】

製造元の推奨に従って、ＣＤ１５５ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＣＳ１９８８１１）細胞をＵ底９６穴プレートに播き、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターＯ／Ｎにてインキュベートした。翌日、健常ドナーの全血から単離した凍結ヒト末梢血単核細胞（Ｉｍｍｕｎｅｈｅａｌｔｈ）から陰性選択キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１７９５３）を用いて製造元の推奨に従ってＣＤ８^＋Ｔ細胞を精製した。次いで、精製したＣＤ８Ｔ細胞と漸増濃度（０．０１１ｎＭ、０．０３３ｎＭ、０．１１ｎＭ、０．３３ｎＭ、１．０６ｎＭ、３．３ｎＭ、１０．６ｎＭ、３３．３ｎＭ及び１０５．５ｎＭ））の抗体とをＣＤ１５５ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１（１００，０００個のＣＤ８Ｔ細胞／抗体を含有する完全培地１００ｕＬ）に加え、３７℃、５％ＣＯ２にて５日間インキュベートした。最終的に、製造元の推奨に従って実行したＥＬＩＳＡアッセイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，８８－７３１６－８６）を用いて細胞上清にてＩＦＮｇの濃度を評価した。

【0305】

図２４Ｂに示し、表２１にまとめるように、抗ＴＩＧＩＴクローン３１２８２及び４．１Ｄ３はＩＦＮｇ分泌の最良の誘導を示し、アイソタイプ対照抗体に比べてそれぞれ２．７倍及び２．９倍上昇する。クローン３１２８２は０．１３ｎＭで測定されたＥＣ_５０濃度という点でＩＦＮｇ産生の誘導について最良の有効性を有する。クローン３１Ｃ６は２．３倍異なるＥＣ_５０値を示す一方で、クローン２２Ｇ２及び４．１Ｄ３はクローン３１２８２よりも３．１倍及び１０．８倍効き目が弱い。調べた濃度での低い活性及び曲線の不十分な適合のためにクローン３１３Ｍ３２については値を決定することができなかった（図２４Ｂ）。

【0306】

（表２１）ヒト初代ＣＤ８^＋Ｔ細胞における機能的活性についての様々な抗ＴＩＧＩＴクローンのＥＣ_５０のデータ及び比較

【0307】

Ｃ．がん患者に由来するヒト初代ＣＤ３^＋Ｔ細胞におけるＴＩＧＩＴの機能的アッセイ
がん患者に由来するＴ細胞上のヒトＴＩＧＩＴ受容体を遮断することの機能的帰結を特徴付けるために、がん性患者のＰＢＭＣに由来するヒト初代ＣＤ３^＋Ｔ細胞を、ヒトＰＶＲ／ＣＤ１５５を発現し、且つヒトＴ細胞を活性化するように操作したＣＨＯ－Ｋ１細胞株（ＣＨＯ－ＴＣＲ－ＣＤ１５５）と共に共培養した。我々は、操作したＣＤ１５５を発現しているＣＨＯ－Ｋ１細胞の存在下でのＣＤ３^＋Ｔ細胞によるＩＦＮｇの放出が抗ＴＩＧＩＴアンタゴニスト抗体３１２８２によりｈＴＩＧＩＴを遮断することによって高められ得ることを観察した。

【0308】

製造元の推奨に従って、ＣＤ１５５ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＣＳ１９８８１１）細胞をＵ底９６穴プレートに播き、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターＯ／Ｎにてインキュベートした。翌日、２４時間早く採取したがん性患者（ＨＮＳＣＣ）の全血から単離した新鮮なヒト末梢血単核細胞（Ｂｉｏｐａｒｔｎｅｒｓ）から陰性選択キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１７９５１）を使用することによって製造元の推奨に従ってＣＤ３^＋Ｔ細胞を精製した。精製したＣＤ３^＋Ｔ細胞と６６．７ｎＭの抗体を次いでＣＤ１５５ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１（１００，０００個のＣＤ３Ｔ細胞／抗体を含有する完全培地１００ｕＬ）に加え、３７℃、５％ＣＯ２にて５日間インキュベートした。最終的に、製造元の推奨に従って実行されるＥＬＩＳＡアッセイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，８８－７３１６－８６）を用いて細胞上清にてＩＦＮｇの濃度を評価した。

【0309】

図２４Ｃに示すように、抗体３１２８２がＩＦＮｇの分泌を増やす強い機能的な活性を誘導したということは、がん患者に由来するＰＢＭＣのＴ細胞を再活性化するこの抗ＴＩＧＩＴ抗体の潜在力を実証している。

【0310】

Ｄ．抗ＴＩＧＩＴクローン３１２８２はがん患者のＰＢＭＣ及び解離させた腫瘍細胞（ＤＴＣ）に由来するＴ細胞にて細胞内サイトカインの産生を増やす
この実施例では、新しく単離した対応したＰＢＭＣと、腎臓癌のがん患者に由来する解離させた腫瘍細胞（ＤＴＣ）内の腫瘍浸潤リンパ球とからのＴ細胞サイトカインの産生を評価するために細胞内フローサイトメトリー染色を行った。ＤＴＣについては、特定の腫瘍型についての製造元の指示書に従って、腫瘍を機械的に細かく刻み、次いで、穏やかなＭＡＣＳ解離装置にて回転のもとで腫瘍解離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＃１３０ ０９５ ９２９）と共にインキュベートした。細胞内染色を行う前に、Ｔ細胞刺激ビーズカクテル（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で１６時間細胞を刺激した。刺激の最後の３時間の間に、タンパク質輸送阻害カクテル（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及び細胞刺激カクテル（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を細胞に加えた。コンジュゲートした抗体はＥｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄまたはＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。表面染色は、濾過したＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２ｍＭのＥＤＴＡ＋０．１％ＢＳＡ）及びブリリアント染色緩衝液（ＢＤ ＃５６３７９４）を用いて製造元の指示によって行った。表面染色に先立って、細胞を適当なヒトＦｃＢｌｏｃｋ（ＢＤ ＃５６４２２０）でブロックした。細胞内染色については、ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／ｃｙｔｏｐｅｒｍ溶液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて細胞を固定し、透過化した。細胞は以下の抗体パネル：抗ＣＤ４５－ＢＢ５１５（クローンＨＩ３０、ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ ５６４５８５）、抗ＣＤ７３－ＢＶ４２１（クローンＡＤ２、ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ ５６２４３０）、抗ＣＤ８ａ－ＢＶ５１０（クローンＳＫ１、ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ ５６３９１９）、抗ＣＤ３－ＢＶ６５０（クローンＳＫ７、ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ ５６３９９９）、抗ＩＦＮγ－ＢＶ７１１（クローン４Ｓ．Ｂ３、ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ ５６４７９３）、抗ＩＬ－２－ＡＰＣ（ＭＱ１－１７Ｈ１２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ １７－７０２９－８２）、抗ＣＤ４－ＡＰＣ－Ｒ７００（クローンＲＰＡ－Ｔ４、ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ ５６４９７５）、ＬＶＤ ｅＦｌｕｏｒ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ６５－０８６５－１４）、抗ＴＩＧＩＴ－ＰＥ（クローンＭＢＳＡ４３、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｅ１３４５６－１０８）、抗ＣＤ３９－ＰＥ－Ｄａｚｚｌｅ５９４（クローンＡ１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３２８２２４）及びＴＮＦα－ＰＥ－ｃｙ７（クローンＭａｂ１１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ２５－７３４９－８２）で染色した。データ取得はＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行い、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ）によって解析した。生細胞は前方散乱及び側方散乱にゲートをかけた。Ｔ細胞サブセットは以下のようにゲートをかけた：ＰＢＭＣについてはＤ４５^＋ＣＤ３^＋及びＤＴＣについてはＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋とＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋。サイトカインを分泌しているＴ細胞は未染色及び未刺激の対照を用いてゲートをかけた。

【0311】

図２４Ｄは、ＩＬ－２、ＩＦＮｇ及びＴＮＦａの細胞内含量がすべて、抗ＴＩＧＩＴクローン３１２８２の存在下での活性化の際に上昇したことを示す。この上昇は図２４Ｃで説明しているデータに従ってＰＢＭＣ由来のＣＤ３^＋Ｔ細胞で観察されたが、解離させた腫瘍細胞由来のＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋双方のＴＩＬでも観察された。このことは、ＰＢＭＣ集団及びがん患者のＴ細胞に由来するＴＩＬ集団の活性化を高める抗ＴＩＧＩＴクローン３１２８２の潜在力を実証している。

【0312】

実施例２１：抗ＴＩＧＩＴクローン３１２８２はがん患者に由来するＰＢＭＣにてＴｒｅｇの優先的な細胞傷害を誘導する
この実施例では、肺癌患者から単離されたＰＢＭＣを完全ＲＰＭＩ培地（１０％熱非働化ＦＢＳ＋５０Ｕのペニシリン＋５０Ｕのストレプトマイシンで補完された）に再浮遊させた。２．５×１０^５個のヒトＰＢＭＣを９６ウェルプレートＵ底にてウェル当たりで分配した。抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体クローン３１２８２、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（ＢｉｏＸｃｅｌｌ ＢＥ０２９７）またはリツキシマブ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ ｈｃｄ２０－ｍａｂ１）を６．６ｎＭの最終濃度で相当する各ウェルに加えた。細胞を５％ＣＯ２と共に３７℃で２０時間インキュベートした。次いで細胞を回収し、以下の抗体パネル：ＬＶＤ ｅＦｌｕｏｒ５２０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ６５－０８６７－１４）、抗ＴＣＲａｂ－ＰｅｒｃＰ－Ｃｙ５．５（クローンＩＰ２６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３０６７２３）、抗ＣＤ４－ＢＶ５１０（クローンＳＫ３、ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ ５６２９７０）、抗ＣＤ８－ＡＰＣ－Ｃｙ７（クローンＳＫ１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３４４７１４）、抗ＣＤ２５－ＢＶ６０５（クローン２Ａ３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ５６２６６０）、抗ＣＤ１２７－ＡＰＣ（Ａ０１９Ｄ５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３５１３１６）、抗ＣＣＲ７－ＢＶ４２１（クローンＧ０４３Ｈ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３５３２０７）及び抗ＣＤ４５ＲＯ－ＰＥ－Ｃｙ７（クローンＵＣＨＬ１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３０４２２９）で染色した。結果はゲートをかけた生細胞で提示する。製造元の仕様書に従ってＡｃｃｕＣｈｅｃｋ計数ビーズ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて絶対的な定量を行った。μＬ当たりの細胞の絶対数の計算の後、特異的溶解の％は以下の式＝（１－（３１２８２ＴＩＧＩＴ抗体で処理した試料におけるμＬ当たりの細胞の絶対数／対照アイソタイプで処理した試料の３つ組の平均））×１００を用いて算出される。結果は３つ組での特異的溶解の平均％±ＳＤとして提示される。ＡＤＣＣ／ＡＤＣＰのエフェクター細胞の細胞傷害活性は、リツキシマブとのインキュベートの際、ゲートをかけたＣＤ１９^＋細胞における特異的細胞溶解の％を測定することによって評価した。

【0313】

図２５に示すように、抗ＴＩＧＩＴクローン３１２８２はＣＤ４５ＲＯ^＋ＣＣＲ７^＋／－ＣＤ８^＋Ｔ細胞（メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞全体）（－１．４８±６％）またはＣＤ４５ＲＯ^＋ＣＣＲ７^＋／－ＣＤ４^＋Ｔ（メモリーＣＤ４^＋Ｔ細胞全体）（０．６４±３％）よりもＴｒｅｇ細胞（３０．１±３％）にて高い特異的溶解を引き起こす。リツキシマブ陽性対照はゲートをかけたＣＤ１９^＋細胞にて７７．９％（±６．８％）の特異的溶解を引き起こす。全体のデータは、メモリーＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋のＴ細胞集団全体に比べてがん患者のＰＢＭＣに由来するＴｒｅｇ細胞の優先的な枯渇を実証している。結腸腺癌の患者に由来する細胞を用いてＴｒｅｇ細胞の類似する優先的な枯渇が観察された。

【0314】

実施例２２：がん患者のＰＢＭＣ及び解離させた腫瘍細胞に由来する免疫集団におけるＴＩＧＩＴ発現の特性評価
フローサイトメトリー解析を行って、がん患者に由来する新しく単離した対応するＰＢＭＣと解離させた腫瘍細胞（ＤＴＣ）内の腫瘍浸潤リンパ球とに由来する免疫細胞サブセットにおけるＴＩＧＩＴの発現を評価した。様々な適応症：卵巣癌、腎臓癌、ＨＮＳＣＣ、皮膚癌、黒色腫、及び肺癌に由来する試料を取得した。ＤＴＣについては、特定の腫瘍型についての製造元の指示書に従って、腫瘍を機械的に細かく刻み、次いで、穏やかなＭＡＣＳ解離装置にて回転のもとで腫瘍解離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＃１３０ ０９５ ９２９）と共にインキュベートした。ＰＢＭＣは密度勾配培地（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ Ａｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ ＃１１１５７５８）にて全血から単離した。表現型データを健常個体（ｎ＝１０）から単離した凍結ＰＢＭＣと比較した。

【0315】

濾過したＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２ｍＭのＥＤＴＡ＋０．１％ＢＳＡ）及びブリリアント染色緩衝液（ＢＤ ＃５６３７９４）を用い、製造元の指示によって細胞を染色した。染色に先立って適当なヒトＦｃＢｌｏｃｋ（ＢＤ ＃５６４２２０）で細胞をブロックし、データ取得に先立ってＩＣ固定緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃００－８２２２－４９）を用いて固定した。ＤＴＣは以下の抗体パネル：抗ＣＤ４５－ＢＢ５１５（クローンＨＩ３０、ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ ５６４５８５）、抗ＣＤ７３－ＢＶ４２１（クローンＡＤ２、ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ ５６２４３０）、抗ＣＤ８ａ－ＢＶ５１０（クローンＳＫ１、ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ ５６３９１９）、抗ＣＤ３－ＢＶ６５０（クローンＳＫ７、ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ ５６３９９９）、抗ＣＤ５６－ＢＶ７１１（クローン５．１Ｈ１１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３６２５４２）、抗ＣＤ２７９－ＢＶ７８５（クローンＥＨ１２．２Ｈ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３２９９３０）、抗ＣＤ１２７－ＡＰＣ（クローンＡ０１９Ｄ５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３５１３１６）、抗ＣＤ４－ＡＰＣ－Ｒ７００（クローンＲＰＡ－Ｔ４、ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ ５６４９７５）、ＬＶＤ ｅＦｌｕｏｒ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ６５－０８６５－１４）、抗ＴＩＧＩＴ－ＰＥ（クローンＭＢＳＡ４３、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｅ１３４５６－１０８）、抗ＣＤ３９－ＰＥ－Ｄａｚｚｌｅ５９４（クローンＡ１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３２８２２４）及びＣＤ２５－ＰＥ－ｃｙ７（クローンＢＣ９６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３０２６１２）で染色した。ＰＢＭＣは以下の抗体パネル：抗ＣＤ４５ＲＯ－ＢＢ５１５（クローンＵＣＨＬ１、ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ ５６４５２９）、抗ＣＤ７３－ＢＶ４２１（クローンＡＤ２、ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ ５６２４３０）、抗ＣＤ８ａ－ＢＶ５１０（クローンＳＫ１、ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ ５６３９１９）、抗ＣＤ３－ＢＶ６５０（クローンＳＫ７、ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ ５６３９９９）、抗ＣＤ５６－ＢＶ７１１（クローン５．１Ｈ１１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３６２５４２）、抗ＣＤ１９７－ＢＶ７８６（クローン３Ｄ１２、ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ ５６３７１０）、抗ＣＤ１２７－ＡＰＣ（クローンＡ０１９Ｄ５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３５１３１６）、抗ＣＤ４－ＡＰＣ－Ｒ７００（クローンＲＰＡ－Ｔ４、ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ ５６４９７５）、ＬＶＤ ｅＦｌｕｏｒ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ６５－０８６５－１４）、抗ＴＩＧＩＴ－ＰＥ（クローンＭＢＳＡ４３、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｅ１３４５６－１０８）、抗ＣＤ３９－ＰＥ－Ｄａｚｚｌｅ５９４（クローンＡ１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３２８２２４）及びＣＤ２５－ＰＥ－ｃｙ７（Ｃｌ ｂｏｎｅ ＢＣ９６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３０２６１２）で染色した。データ取得はＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行い、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ）で解析した。生細胞は前方散乱及び側方散乱にゲートをかけた。種々の免疫細胞サブセットは以下のようにゲートをかけた：ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ１２７^＋ＣＤ２５^－（ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋非Ｔｒｅｇ細胞）、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ１２７^低ＣＤ２５^＋（抑制性Ｔ細胞）、ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋（ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞）、ＣＤ３^－ＣＤ５６^＋（ＮＫ細胞）、ＣＤ３^＋ＣＤ５６^＋（ＮＫＴ細胞）、ＣＤ３^－ＣＤ５６^－（非Ｔ／ＮＫ細胞）。Ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ ＰＥビーズ（ＢＤ ＃３４０４９５）を同じ機器設定で実行し、蛍光データを細胞当たりで結合した抗体の数に変換するのに使用した。

【0316】

百分位数を計算するＴｕｋｅｙ法を用いた箱ひげ図の表現を用いて、様々な免疫集団におけるＴＩＧＩＴ発現の頻度を図２６Ａに表し、各サブセットのＴＩＧＩＴ密度を図２６Ｂに表す。

【0317】

データは、健常ドナーのＰＢＭＣと比べてがん患者のＰＢＭＣの方がＴ細胞サブセットにおけるＴＩＧＩＴの頻度が高いことを示している。この頻度はさらにＤＴＣのＴＩＬで上昇する（図２６Ａ）。ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋非Ｔｒｅｇ細胞及びＣＤ４^＋Ｔｒｅｇ細胞の表面上でＴＩＧＩＴの密度で同じ観察が見られる一方で、ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞については細胞当たりのＴＩＧＩＴ分子の数はＤＴＣ ＴＩＬでは低下する（図２６Ｂ）。

【0318】

実施例２３：ＴＩＧＩＴの構造的な及び機能的なエピトープマッピングとクローン３１２８２
抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂであるクローン３１２８２とＴＩＧＩＴ組換えタンパク質との間の相互作用をさらに特性評価し、理解するために、ＴＩＧＩＴとの複合体における３１２８２の結晶構造をＸ線回折によって決定した。

【0319】

Ａ．ＴＩＧＩＴ及びＦａｂの発現、精製及び結晶化
ヒトＴＩＧＩＴ残基２３～１２８はＰｒｏｔｅｒｏｓ Ｂｉｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ＧｍｂＨが作製した。Ｎ末端ＨＩＳタグを持つ（トロンビンで切断可能）ＴＩＧＩＴ（２３～１２８）をｐＥＴ１５ｂにクローニングし、３７℃で封入体でのＢＩ２１（ＤＥ３）にてＬＢ培地において発現させた。封入体（ＩＢ）をＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．４及びＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．０５％のＢｒｉｊ－３５を含有する緩衝液で洗浄した。ＩＢを６ＭのＧｄｍ／ＨＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．５及び１０ｍＭのＤＴＴで変性させた。５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８、１ｍＭのＧＳＨ、０．５ｍＭのＧＳＳＧ、１５０ｍＭのＮａＣｌにて折り畳み直しを行った。折り畳み直したタンパク質をＨＩＳ－トラップで精製した。トロンビン切断を介してＮ末端のＨＩＳタグを取り外し、５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２００ｍＭのＮａＣｌにて平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ－７５にてさらに精製した。

【0320】

Ｆａｂ断片の発現については、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を１％のペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭのＬ－グルタミン及び０．１％のプルロニックを伴ったＦｒｅｅｓｔｙｌｅＦ１７にて増殖させた。形質移入用に増殖させた培養物を３ＬのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，２Ｌの細胞培養作業容量、３７℃、８％ｖ／ｖのＣＯ_２、８０～１２０ｒｐｍ、５０ｍｍの振幅）にて培養した。形質移入の前日に培養物を希釈し、細胞数を１×１０^６個／ｍＬに調整した。発現培養物の容量は６Ｌだった。Ｆａｂの軽鎖及び重鎖についてのプラスミドで一時的な形質移入を行った。ＤＮＡ／ＦｅｃｔｏＰｒｏ（ＦｅｃｔｏＰｒｏ，ＰｏｌｙＰｌｕｓ）のＭａｓｔｅｒＭｉｘを純粋なＦ１７培地で調製し、１０分間インキュベートした（ＰｏｌｙＰｌｕｓのプロトコールに従って）。この形質移入ミックスを一滴ずつ細胞浮遊液に加え、直ちにブースターを加えた。形質移入の１８時間後、培養物に３ｇ／Ｌのグルコースを与えた。

【0321】

Ｆａｂ断片の精製については、形質移入の６日後、ＨＥＫ２９３細胞培養物の６Ｌの上清を遠心分離によって回収し、３０ｍＬのＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔカラムにかけた。ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔをＰＢＳ、ｐＨ７．４で洗浄し、クエン酸ナトリウム、ｐＨ３で溶出し、Ｆａｂを含有する分画をＴｒｉｓ緩衝液で中和した。２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、１００ｍＭのＮａＣｌで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘＳ－２００カラムにてＦａｂをさらに精製し、さらなる使用まで－８０℃で保存した。

【0322】

Ｆａｂ－ＴＩＧＩＴ複合体の形成については、精製したＴＩＧＩＴを精製したＦａｂと１．５：１の比で混合し、複合体を２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、１００ｍＭのＮａＣｌで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘＳ－２００にて精製した。Ｆａｂ－ＴＩＧＩＴ複合体を結晶化のために３５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。０．１μｇのタンパク質溶液（２０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ８、０；１００ｍＭのＮａＣｌにおける３５．３ｍｇ／ｍｌ）を１：１の比でリザーバ溶液（０．１０Ｍのカコジル酸ナトリウム、ｐＨ６．００；１５％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ４０００）と混合することによって蒸気拡散法を用いて２７７ＫにてＦａｂ－ＴＩＧＩＴ複合体を結晶化した。２５％のグリセロールを加えたリザーバ溶液にそれらを浸すことによって結晶を凍結防止した。

【0323】

Ｂ．データの収集及び処理
Ｐｒｏｔｅｒｏｓ Ｂｉｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ＧｍｂＨの標準プロトコールを用いて低温プロトコールを確立した。結晶を瞬間凍結し、１００Ｋの温度で測定した。極低温状態を用いてＳＷＩＳＳ ＬＩＧＨＴ ＳＯＵＲＣＥ（ＳＬＳ，Ｖｉｌｌｉｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）にてＦａｂ：ＴＩＧＩＴ複合体の結晶からＸ線回折データを収集した。結晶は空間群Ｐ１に属する。プログラムＸＤＳ及びＸＳＣＡＬＥを用いてデータを処理した。データの収集及び処理の統計は表２２にて見いだすことができる。

【0324】

（表２２）データの収集及び処理の統計

^１ＳＷＩＳＳ ＬＩＧＨＴ ＳＯＵＲＣＥ （ＳＬＳ， Ｖｉｌｌｉｇｅｎ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）
^２括弧内の値は最高分解能のビンを指す。
^３独立した反射から算出した。

【0325】

Ｃ．構造のモデル化及び緻密化
構造を決定し、解析するのに必要な位相情報は分子置換によって得た。Ｆａｂの以前解決した構造を検索モデルとして使用した。ソフトウェアパッケージＣＣＰ４及びＣＯＯＴと共に標準のプロトコールに従ってその後のモデルの構築及び緻密化を行った。自由Ｒ因子の計算については、最終モデルの正確性を相互検証する評価基準、測定された反射の約２．５％を緻密化手順から除外した（表２３を参照のこと）。

【0326】

ＴＬＳの緻密化（ＲＥＦＭＡＣ５，ＣＣＰ４を用いて）を行い、その結果、低いＲ因子及び高品質の電子密度マップを生じた。自動的に生成される局所のＮＣＳの拘束が適用されている（さらに新しいＲＥＦＭＡＣ５のバージョンのキーワード「ｎｃｓｒ局所」）。リガンドのパラメーター化及び対応するライブラリファイルの生成はそれぞれＣＨＥＭＳＫＥＴＣＨ及びＬＩＢＣＨＥＣＫ（ＣＣＰ４）で行った。

【0327】

３．０で合わせたＦ_０－Ｆ_Ｃマップのピークに水分子を入れ、その後ＲＥＦＭＡＣ５で緻密化し、ＣＯＯＴの検証ツールで水すべてをチェックすることによりＣＯＯＴの「Ｆｉｎｄ ｗａｔｅｒｓ」のアルゴリズムによって水モデルを構築した。疑われる水のリストについての基準は：８０Å２より大きいＢ因子、１．２σ未満の２Ｆ_０－Ｆ_Ｃマップ、２．３Å未満または３．５Åを超える最も近い接触への距離だった。疑われる水分子及びリガンド結合部位（１０Å未満のリガンドまでの距離）におけるそれらを手動でチェックした。最終的な複合体の構造をＰＨＥＮＩＸで緻密化した。我々は、ＸＹＺ座標、リアル空間、個々のＢ因子及び群Ｂ因子を含む緻密化パラメーターを選択した。Ｘ線／立体化学の加重を最適化し、ＮＣＳ拘束も緻密化のために選択した。最終モデルのＲａｍａｃｈａｎｄｒａｎプロットは好ましい領域にて残基すべての９５．３９％を示し、許される領域では３．９５％を示す。最終構造の統計及び緻密化の過程を表２３でリストにする。

【0328】

（表２３）緻密化の統計^１

^１ＰＨＥＮＩＸにて定義されるような値
^２ＣＯＯＴで算出された

【0329】

Ｄ．全体的な構造
ヒトＦａｂ抗体断片の重鎖及び軽鎖はヒト抗体の典型的な折り畳みを示す（図２７Ａ）。基本的には同じ全体的な構造を持つ非対称単位にて２つのヘテロ三量体がある。モデルはＴＩＧＩＴの残基２３～１２８、クローン３１２８２の重鎖の残基１～２２４及びクローン３１２８２の軽鎖の残基１～２１４を含む。重鎖の一方のショートループ領域は電子密度によって完全に定義されるわけではないので、モデルに含まれていない。

【0330】

ＦｏｌｄＸプログラムを用いて回折画像を解析し、残基のエネルギー寄与を推定し、相互作用のホットスポットを定義した。結合界面を形成するアミノ酸残基は電子密度マップで十分に定義されている。解釈されたＸ線回折データはＦａｂとＴＩＧＩＴの間での相互作用を明瞭に示している（図２７Ｂ及び２７Ｃ）。クローン３１２８２の軽鎖ＣＤＲはＴＩＧＩＴの２つの領域と相互作用しており、ＣＤＲ Ｌ１のＡｒｇ３０とＴｙｒ３３はＴＩＧＩＴの残基Ａｓｎ５８及びＧｌｕ６０に接触し；ＣＤＲ Ｌ１のＡｒｇ３０とＣＤＲ Ｌ３のＰｈｅ９３はＴＩＧＩＴ残基のＩｌｅ１０９に接触する。ＣＤＲ Ｌ２はＴＩＧＩＴに接触していない（表２４）。クローン３１２８２の重鎖はＴＩＧＩＴの様々な領域と相互作用し、ＣＤＲ Ｈ１のＴｙｒ３３は残基Ｌｅｕ７３でＴＩＧＩＴに接触し、ＣＤＲ Ｈ２のＶａｌ５０、Ｓｅｒ５４及びＳｅｒ５７は残基Ｌｅｕ７３でＴＩＧＩＴに接触し、ＣＤＲ Ｈ３のＡｓｐ１０２、Ｔｙｒ１０３及びＴｒｐ１０４は残基Ｇｌｎ５６、Ｉｌｅ６８、Ｌｅｕ７３及びＨｉｓ７６でＴＩＧＩＴに接触する。

【0331】

抗ＴＩＧＩＴクローン３１２８２／ＴＩＧＩＴ複合体のこの結晶構造に基づいて、クローン３１２８２によって接触されるＴＩＧＩＴの残基（クローン３１２８２によって結合されるＴＩＧＩＴについてのエピトープ残基）及びＴＩＧＩＴによって接触されるクローン３１２８２の残基（ＴＩＧＩＴによって結合されるクローン３１２８２についてのパラトープ残基）が決定された。表２４及び２５及び図２７Ｃはクローン３１２８２の軽鎖（表２４）または重鎖（表２５）の残基と接触したＴＩＧＩＴの残基を示す。接触残基は以下の基準：（ｉ）それが０．３ｋｃａｌ／モルより大きい計算された結合自由エネルギーの寄与を有する、（ｉｉ）それがＸ線構造における残基すべての平均Ｂ因子より低い実験的な平均されたＢ因子を有する、（ｉｉｉ）それが４．０オングストローム以下の距離で抗体原子との少なくとも３対の重原子の原子間接触を作る、（ｉｖ）それが溶媒に曝露された水素結合またはイオン相互作用のみを作らない、（ｖ）それが非芳香族極性残基（Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、またはＡｒｇ）であれば、それは抗体との少なくとも１つの水素結合またはイオン相互作用を作る；のそれぞれを満たす各アミノ酸として定義された。

【0332】

（表２４）ＴＩＧＩＴのエピトープ残基及びクローン３１２８２の軽鎖における対応するパラトープ残基のまとめ

【0333】

（表２５）ＴＩＧＩＴのエピトープ残基及びクローン３１２８２の重鎖における対応するパラトープ残基のまとめ

【0334】

実施例２４：抗ＴＩＧＩＴクローン３１２８２と３２９５９との間での競合アッセイ
ヒトＩｇＧ１アイソタイプの抗ＴＩＧＩＴ抗体クローン３２９５９はＨＥＫ細胞で産生させ、上記の実施例１７に記載されているように精製した。

【0335】

ヒトＴＩＧＩＴを過剰発現しているＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ－ｈＴＩＧＩＴ）を回収し、５．１０^４個／ウェルで分配し、このクローンのＫｄの０～１００倍の濃度の範囲を表す以下の濃度：０ｎＭ（Ａｂなし）、０．０８ｎＭ、０．１６ｎＭ、０．８ｎＭ及び８ｎＭでのアンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴクローン３１２８２と共にインキュベートした。過剰の抗体を洗い流し、細胞を漸減濃度（８；４；２；１；０．５；０．２５；０．１２５；０．０６２；０．０３１；０．０１６；０．００８及び０．００４ｎＭ）の直接カップリングした（ＡＦ６４７）抗ＴＩＧＩＴクローン３２９５９と共に４℃で３０分間インキュベートした。ＬＳＲ ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａを用いて幾何平均の蛍光強度を解析した。細胞の結合をＡＦ６４７の中央値蛍光強度として記録した。クローン３２９５９のＥＣ_５０結合の算出については、Ｐｒｉｓｍにおける４変数曲線適合方程式を用いてｈＴＩＧＩＴ－Ｊｕｒｋａｔへの結合の半最大濃度（ＥＣ_５０）を算出し、得られた値を表２６に示し、図２８で説明する。結果はクローン３１２８２の濃度とは無関係に抗ＴＩＧＩＴクローン３２９５９の強い結合を示すということは、アンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴ抗体との競合の非存在を実証している。

【0336】

（表２６）漸増濃度のアンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴクローン３１２８２の存在下での抗ＴＩＧＩＴクローン３２９５９のＪｕｒｋａｔ－ｈＴＩＧＩＴへの結合についてのＥＣ_５０濃度

【0337】

実施例２５：カニクイザルにおける単回ｉ．ｖ．注射後のクローン３１２８２の薬物動態プロファイルの測定
カニクイザルにｉ．ｖ．ボーラス注射を介して抗ＴＩＧＩＴクローン３１２８２のＩｇＧ１またはＩｇＧ４を与えた。抗体は２匹（オス１及びメス１）の動物に３つの異なる濃度（０．１ｍｇ／ｋｇ；１ｍｇ／ｋｇ；１０ｍｇ／ｋｇ）で投与した。１日目の投与後５０４時間に至るまで血液を採取した。血液試料を血漿に処理し、ＥＬＩＳＡ法を用いて抗ＴＩＧＩＴクローン３１２８２のＩｇＧ１またはＩｇＧ４の濃度について分析した。個々の動物の血漿濃度・時間データを用い、Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（バージョン６．３，Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ，ａ Ｃｅｒｔａｒａ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）の血管内モデルを用いてＩＶ投与後の抗ＴＩＧＩＴクローン３１２８２のＩｇＧ１及びＩｇＧ４についての毒物動態パラメーター値を算出した。

【0338】

０．１、１及び１０ｍｇ／ｋｇでの抗ＴＩＧＩＴクローン３１２８２のＩｇＧ１及びＩｇＧ４のＩＶボーラス投与に続いて、ＩｇＧ１濃度は投与後それぞれ２４０時間、３３６時間、及び５０４時間に至るまでオス及びメスのサルの血漿にて定量でき、ＩｇＧ４はそれぞれ１６８時間、２４０時間及び５０４時間に至るまで定量できた（図２９及び表２７）。抗ＴＩＧＩＴクローン３１２８２のＩｇＧ１及びＩｇＧ４のｉ．ｖ．ボーラス投与の後、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４への全身性曝露において明らかな性別関連の差異（Ｃｍａｘ及びＡＵＣｌａｓｔ）はなかったが、０．８５５から１．１６に及ぶ比（オス／メス）があった。

【0339】

オス及びメスのサルへの抗ＴＩＧＩＴクローン３１２８２のＩｇＧ１のｉ．ｖ．ボーラス投与に続いて、血漿ＩｇＧ１濃度はすべての用量レベルで二相性に低下したが、平均終末相半減期（ｔ１／２）は８４．７～１７４時間に及んだ（図２９）。全身性クリアランス（ＣＬ）は検討した用量にわたって一貫しており、０．２８０から０．３９２ｍＬ／時間／ｋｇに及んだ。定常状態での分布のみかけの体積（Ｖｓｓ）は調べた用量レベルの間で一貫しており、値は５３．７から６６．５ｍＬ／ｋｇに及んだ。０．１から１ｍｇ／ｋｇまで及び１から１０ｍｇ／ｋｇまでの範囲における抗ＴＩＧＩＴクローン３１２８２のＩｇＧ１用量の１０倍の増加は曝露にてほぼ比例した増加を生じた（９．５７～１４．５倍の増加）。

【0340】

オス及びメスのサルへの抗ＴＩＧＩＴクローン３１２８２のＩｇＧ４のｉ．ｖ．投与に続いて、血漿ＩｇＧ４濃度は調べた用量レベルすべてで二相性に低下し、ｔ１／２は１４８～３３４時間だった（図２９及び表２８）。ＣＬは調べた用量レベルの間で一貫しており、０．１６０から０．２１９ｍＬ／時間／ｋｇに及んだ。平均Ｖｓｓは４１．２から７０．７ｍＬ／ｋｇに及んだ。０．１から１ｍｇ／ｋｇまで及び１から１０ｍｇ／ｋｇまでの範囲における抗ＴＩＧＩＴクローン３１２８２のＩｇＧ４用量の１０倍の増加はＩｇＧ４への曝露にてほぼ比例した増加を生じた（９．３２～１２．５倍の増加）。

【0341】

（表２７）カニクイザルにおけるｉ．ｖ．ボーラス後の抗ＴＩＧＩＴクローン３１２８２ヒトＩｇＧ１についての平均毒物動態パラメーターのまとめ

【0342】

（表２８）カニクイザルにおけるｉ．ｖ．ボーラス後の抗ＴＩＧＩＴクローン３１２８２ヒトＩｇＧ４についての平均毒物動態パラメーターのまとめ

【0343】

実施例２６：ヒト腫瘍細胞集団におけるＴＩＧＩＴ発現の特性評価
フローサイトメトリー解析を行って、血液癌の異なる適応症のがん患者に由来する血液試料における正常及び腫瘍のＴ細胞またはＢ細胞でのＴＩＧＩＴの発現を評価した。

【0344】

セザリー症候群患者の試料を調べて、悪性の及び正常のＣＤ４^＋Ｔ細胞集団におけるＴＩＧＩＴの発現を比較した。これらの集団を分離するために、Ｂｅｃｋｍａｎ ＣｏｕｌｔｅｒのＴＣＲ－Ｖｂレパトアキット（＃ＩＭ３４９７）を用いて、悪性クローンのＴＣＲ－Ｖｂの再構成の事前決定を行った。悪性クローンがいったん特定されると、以下の市販試薬：抗ＣＤ３ Ｋｒｏｍｅ Ｏｒａｎｇｅ（＃Ｂ０００６８）、抗ＣＤ４－ＰＥ（＃Ａ０７７５１）、抗ＣＤ８－ＰＣ７（＃７３７６６１）、抗ＣＤ５６－ＰＣ５（＃Ａ０７７８９）、抗ＣＤ４５－Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（＃Ａ７４７６３）、抗ＣＤ１９－ＡＦ７５０（＃Ａ９４６８１）及び抗Ｖｂ８－ＦＩＴＣ（＃ＩＭ１２３３）（すべてＢｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ由来）及び抗ＴＩＧＩＴ－ＡＰＣ（クローンＭＢＳＡ４３、ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃１７－９５００－４２）を用いてセザリー症候群患者の免疫細胞にてＴＩＧＩＴ発現の特性を明らかにした。ＣｙｔｏＦｌｅｘ装置（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ）にてセザリー症候群患者の試料のフローサイトメトリー解析を行った。データはＦｌｏＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ）によって解析した。

【0345】

代表的な例を図３０Ａに示す。悪性のＴＣＲ－Ｖｂ８クローンを有するこのドナーのためにゲーティング戦略を図３０Ａに示すが、悪性細胞はＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｖｂ８^＋であり、正常ＣＤ４^＋Ｔ細胞はＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｖｂ８^－だった。ＴＩＧＩＴの強い発現は正常ＣＤ４^＋Ｔ細胞に比べて悪性ＣＤ４^＋Ｔ細胞で観察される（４９８７及び９９９の各ＭＦＩ）（図３０Ｂ）。

【0346】

同様に、フローサイトメトリー解析を行ってＣＬＬの患者に由来する骨髄試料における正常の及び悪性のＢ細胞でのＴＩＧＩＴの発現を評価した。試料を以下の抗体パネル：ＬＶＤ ｅＦｌｕｏｒ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ６５－０８６５－１４）、抗ＣＤ４５－ＢＢ５１５（クローンＨＩ３０、ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ ５６４５８５）、抗ＣＤ５－ＢＶ５１０（クローンＵＣＨＴ２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３６３３８１）、抗ＣＤ１９－ＢＶ７１１（クローンＳＪ２５Ｃ１、ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ ５６３０３６）及び抗ＴＩＧＩＴ－ＰＥ（クローンＭＢＳＡ４３、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｅ１３４５６－１０８）で染色した。データの取得はＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行い、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ）で解析した。生細胞は前方散乱及び側方散乱にゲートをかけた。種々の細胞サブセットは以下のようにゲートをかけた：ＣＤ４５^＋ＣＤ１９^＋ＣＤ５^－（正常Ｂ細胞）及びＣＤ４５^＋ＣＤ１９^＋ＣＤ５^＋（悪性Ｂ－ＣＬＬ）。

【0347】

代表的な例を図３１Ａで説明しているゲーティング戦略と共に図３１に示す。正常Ｂ細胞（１％）とは対照的に高い比率の悪性Ｂ－ＣＬＬ細胞がＴＩＧＩＴ陽性（７５％）である（ＭＦＩはそれぞれ１４４０及び８１０）（図３１Ｂ）。

【0348】

全体的に、得られたデータは特定の血液癌の適応症で腫瘍細胞がＴＩＧＩＴを発現していることを実証している。

【0349】

実施例２７：マウスＴ細胞リンパ腫モデルにおける単剤療法での抗ＴＩＧＩＴアンタゴニスト抗体の抗腫瘍活性
この実験のために、ＥＬ４Ｔ細胞リンパ腫細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）、ＴＩＢ－３９（商標））を、マウスＴＩＧＩＴを安定して発現するように操作した（ＥＬ４－ｍＴＩＧＩＴ）。ＧＦＰをコードする類似のベクターで形質導入したＥＬ４細胞を対照として使用した（ＥＬ４－ＧＦＰ）。細胞のプールをサブクローニングしてＥＬ４－ｍＴＩＧＩＴ及びＥＬ４－ＧＦＰのクローンを得た。使用した抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＶＨ ＦＲ３の残基２７をＬからＶに変異させ、ＶＨ ＦＲ４の残基６をＭからＴに変異させるように修飾した、抗体２９５２７の修飾された型（マウスＴＩＧＩＴと交差反応する）であり、ヒトＩｇＧ１アイソタイプで作製した。修飾した２９５２７抗体（２９５２７ｍ）のＶＨドメインの配列を以下に示す。抗体２９５２７ｍのＶＬ配列は２９５２７のＶＬ（配列番号２４０）に相当する。

【0350】

８週齢のメスＢａｌｂ／ｃマウスに１×１０^６個のＥＬ４－ｍＴＩＧＩＴ細胞または２×１０^５個のＥＬ４－ＧＦＰ細胞を皮下に接種した。接種後７日目に腫瘍体積が平均１１０ｍｍ^３前後であれば、マウスを同等の腫瘍体積で処理群に無作為化した（ＥＬ４－ｍＴＩＧＩＴについての群当たりｎ＝１５及びＥＬ４－ＧＦＰについての群当たりｎ＝１０）。腫瘍の接種後、７日目、１０日目、１３日目及び１６日目に腹腔内注射によってマウスを２００μｇの抗ＴＩＧＩＴ抗体またはアイソタイプ対照抗体（ｈＩｇＧ１、ＢｉｏＸｃｅｌｌ）で処理した。７日目から２６日目まで腫瘍増殖をモニターし、腫瘍体積を週３回電子キャリパーで測定した。腫瘍体積が２０００ｍｍ^３を超えたら、マウスを屠殺した。腫瘍増殖曲線は線形混合モデルによって統計的に解析した。時間^＊処理群の相互作用を調べることによって処理群間の差異を評価した。

【0351】

図３２は、ＥＬ４－ｍＴＩＧＩＴ（Ａ～Ｃ）またはＥＬ４－ＧＦＰ（Ｄ～Ｆ）を接種したマウスにおける腫瘍増殖曲線を説明している。ｈＩｇＧ１アイソタイプ対照（Ｂ及びＥ）またはアンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴ抗体（Ｃ及びＦ）で処理したマウスについての中央値腫瘍増殖曲線（Ａ及びＤ）と同様に個々の腫瘍増殖曲線を示す。ＥＬ４－ｍＴＩＧＩＴ細胞を接種したマウスでは、アイソタイプ対照で処理した群と比べて抗ＴＩＧＩＴ抗体で処理した場合、腫瘍増殖の有意な抑制があった（ｐ＜０．００１）。アイソタイプ対照で処理した群では、１５匹のマウスのうち３匹がモデルの終了時７００ｍｍ^３を下回る体積で腫瘍増殖の制御を示したのに対して、アンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴ抗体で処理した群ではこの数は１５匹のマウスのうち８匹に増えた。アイソタイプ対照抗体とアンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴ抗体の処理を比べると、ＥＬ４－ＧＦＰ担癌マウスでは抗腫瘍有効性または完全奏効を観察することができなかった。総合して、これらの結果はアンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴ抗体（ｈＩｇＧ１）がＴＩＧＩＴを発現している腫瘍細胞によるモデルにて有意な抗腫瘍有効性を有することを実証している。

【0352】

実施例２８：ＣＴ２６結腸癌マウスモデルにおける免疫チェックポイント抗体との併用での抗ＴＩＧＩＴアンタゴニスト抗体の抗腫瘍活性
抗ＴＩＧＩＴ抗体の抗ＰＤ－１抗体との併用（実施例１２、１３及び１４）に加えて、共刺激分子である４－１ＢＢ、ＯＸ４０及びＧＩＴＲに特異的なアゴニスト抗体、と同様にチェックポイント阻害分子ＩＣＯＳに特異的なアンタゴニスト抗体との併用で抗ＴＩＧＩＴ抗体の抗腫瘍有効性も評価した。

【0353】

ＣＴ２６腫瘍細胞株はＡＴＣＣ（登録商標）から購入した（ＣＲＬ－２６３８（商標））。８週齢のメスＢａｌｂ／ｃマウスに右脇腹にて５００，０００個の細胞を皮下に接種した。接種後９日目に腫瘍体積が平均で７５ｍｍ^３前後であれば、同等の腫瘍体積でマウスを処理群に無作為化した（群当たりｎ＝１０匹のマウス）。抗体はすべて無作為化の日から開始して３日ごとに合計３回の注射で腹腔内に与えた。使用した抗ＴＩＧＩＴ抗体は、抗体の修飾された型（ＶＨ ＦＲ３の残基２７をＬからＶに変異させ、ＶＨ ＦＲ４の残基６をＭからＴに変異させるように修飾した）２９５２７ｍ（マウスＴＩＧＩＴと交差反応する）であり、マウスＩｇＧ２ａアイソタイプで作製し、それを２０μｇ／マウスで与えた。抗４－１ＢＢ（クローン３Ｈ３、ＢｉｏＸＣｅｌｌ、ＢＥ０２３９）は５μｇ／マウスで与え、抗ＯＸ－４０（クローンＯＸ－８６、ＢｉｏＸＣｅｌｌ、ＢＥ００３１）は２０μｇ／マウスで与え、抗ＧＩＴＲ（クローンＤＴＡ－１、ＢｉｏＸＣｅｌｌ、ＢＥ００６３）は１０μｇ／マウスで与え；及び抗ＩＣＯＳ（クローン７Ｅ．１７Ｇ９、ＢｉｏＸＣｅｌｌ、ＢＥ００５９）は２００μｇ／マウスで与えた。７日目から３５日目まで腫瘍増殖をモニターし、週３回、腫瘍体積を電子キャリパーで測定した。腫瘍体積が２０００ｍｍ^３を超えるとマウスを屠殺した。対数変換した腫瘍体積における線形混合モデルによって腫瘍増殖曲線を統計的に解析した。時間^＊処理群の相互作用を調べることによって処理群間の差異を評価した。これは、非常に小さな腫瘍体積（１０ｍｍ^３を下回る）を除いてデータの大部分にとって良好なモデル適合を生じた。従って、これらの小さな腫瘍体積は欠測値として処理した。抗ＴＩＧＩＴ抗体を対応する免疫チェックポイント抗体（ＩＣ―すなわち、抗４１ＢＢ、抗ＯＸ４０、抗ＧＩＴＲ及び抗ＩＣＯＳ）と併用することから生じる相乗効果について調べるために、処理群を２つの変数；抗ＴＩＧＩＴ（あり／なし）及びＩＣ（あり／なし）の組み合わせによって再コード化した。抗ＴＩＧＩＴ^＊ＩＣ^＊時間の相互作用期間を調べることによって各処理（抗ＴＩＧＩＴ^＊時間及びＩＣ^＊時間）の相加効果の上にある相乗効果を評価した。

【0354】

図３３Ａは、単剤療法で、または抗４－１ＢＢとの併用で抗ＴＩＧＩＴによって処理したマウスについての群当たりの中央値腫瘍増殖曲線と同様に個々の増殖曲線を示す。抗ＴＩＧＩＴまたは抗４－１ＢＢの単剤療法と比べて抗ＴＩＧＩＴ＋抗４－１ＢＢで処理したマウスでは腫瘍増殖の有意な抑制があった（それぞれｐ＝０．０００５及びｐ＜０．０００１）。抗ＴＩＧＩＴ抗体と抗４－１ＢＢ抗体の併用は、それぞれ単剤としての抗ＴＩＧＩＴまたは抗４－１ＢＢで処理した群における１／１０匹または０／１０匹の完全奏効（腫瘍が＜３０ｍｍ^３である及び測定不能と見なされる場合）と比べて完全奏効を示す６／１０匹のマウスを生じた。これらのデータは予め定着した腫瘍の治療に対する抗４－１ＢＢとの併用での抗ＴＩＧＩＴ療法の有意な抗腫瘍有効性を実証している。

【0355】

図３３Ｂは、単剤療法で、または抗ＯＸ－４０との併用で抗ＴＩＧＩＴによって処理したマウスについての群当たりの中央値腫瘍増殖曲線と同様に個々の増殖曲線を示す。抗ＴＩＧＩＴまたは抗ＯＸ－４０の単剤療法と比べて抗ＴＩＧＩＴ＋抗ＯＸ－４０で処理したマウスでは腫瘍増殖の有意な抑制があった（それぞれｐ＝０．０００２及びｐ＜０．０００１）。抗ＴＩＧＩＴ＋抗ＯＸ－４０の併用は双方の単剤療法の治療の相加効果よりも大きい相乗的な抗腫瘍有効性を達成した（ｐ＝０．０２）。抗ＴＩＧＩＴ抗体と抗ＯＸ－４０抗体の併用は、それぞれ単剤としての抗ＴＩＧＩＴまたは抗ＯＸ－４０で処理した群における１／１０匹または０／１０匹の完全奏効と比べて完全奏効を示す７／１０匹のマウスを生じた。これらのデータは予め定着した腫瘍の治療に対する抗ＯＸ－４０との併用での抗ＴＩＧＩＴ療法の有意で且つ相乗的な抗腫瘍有効性を実証している。

【0356】

図３３Ｃは、単剤療法で、または抗ＧＩＴＲとの併用で抗ＴＩＧＩＴによって処理したマウスについての群当たりの中央値腫瘍増殖曲線と同様に個々の増殖曲線を示す。抗ＴＩＧＩＴまたは抗ＧＩＴＲの単剤療法（ｐ＜０．０００１）と比べて抗ＴＩＧＩＴ＋抗ＧＩＴＲで処理したマウスでは腫瘍増殖の有意な抑制があった。抗ＴＩＧＩＴ＋抗ＧＩＴＲの併用は双方の単剤療法の治療の相加効果よりも大きい相乗的な抗腫瘍有効性を達成した（ｐ＝０．０１）。抗ＴＩＧＩＴ抗体と抗ＧＩＴＲ抗体の併用は、それぞれ単剤としての抗ＴＩＧＩＴまたは抗ＧＩＴＲで処理した群における１／１０匹または０／１０匹と比べて完全奏効を示す６／１０匹のマウスを生じた。これらのデータは予め定着した腫瘍の治療に対する抗ＧＩＴＲとの併用での抗ＴＩＧＩＴ療法の有意で且つ相乗的な抗腫瘍有効性を実証している。

【0357】

図３３Ｄは、単剤療法で、または抗ＩＣＯＳとの併用で抗ＴＩＧＩＴによって処理したマウスについての群当たりの中央値腫瘍増殖曲線と同様に個々の増殖曲線を示す。抗ＴＩＧＩＴまたは抗ＩＣＯＳの単剤療法と比べて抗ＴＩＧＩＴ＋抗ＩＣＯＳで処理したマウスでは腫瘍増殖の有意な抑制があった（それぞれｐ＝０．００３及びｐ＝０．０００１）。抗ＴＩＧＩＴ抗体と抗ＩＣＯＳ抗体の併用は、それぞれ単剤としての抗ＴＩＧＩＴ抗体または抗ＩＣＯＳ抗体で処理した群における１／１０匹または０／１０匹と比べて完全奏効（腫瘍が＜３０ｍｍ^３である及び測定不能と見なされる場合）を示す１／１０匹のマウスを生じた。これらのデータは予め定着した腫瘍の治療に対する抗ＩＣＯＳとの併用での抗ＴＩＧＩＴ療法の有意で且つ相乗的な抗腫瘍有効性を実証している。

【0358】

実施例２９：γδＴ細胞に対する抗ＴＩＧＩＴアンタゴニスト抗体の活性
γδ（ガンマ・デルタまたはｇ／ｄ）Ｔ細胞は、記載された抗腫瘍活性（Ｚｈａｏ，ｅｔ ａｌ．２０１８．Ｊ．Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．１６：１２２）及び抗ウイルス活性（たとえば、ＣＭＶ感染）を持つ非従来型のＴ細胞の集団であり、自己免疫疾患にも関与している（Ｍａｌｉｋ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．２０１６．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：１４）。

【0359】

フローサイトメトリー解析を行って、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）について血清反応陰性と血清反応陽性の状態での健常個体から新しく単離されたＰＢＭＣのγδＴ細胞におけるＴＩＧＩＴの発現を評価した（ＣＭＶの状態はＥＦＳ Ｎｏｕｖｅｌｌｅ Ａｑｕｉｔａｉｎｅ，Ｂｏｒｄｅａｕｘ，Ｆｒａｎｃｅが評価した）。濾過したＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２ｍＭのＥＤＴＡ＋０．１％ＢＳＡ）を用いて製造元の指示によって細胞を染色した。データ取得はＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行い、ＢＤ ＦＡＣＳ ＤＩＶＡソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で解析した。細胞は、前方散乱及び側方散乱及び生存性にゲートをかけた。γδＴ細胞は、以下の抗体：抗ＴＣＲγδＡＰＣ、ＭｉｌｔｅｎｙｉのクローンＲＥＡ５９１＃１３０－１０９－２８０；抗ＴＣＲ Ｖδ２－ＰＥ－Ｖｉｏ７７０、ＭｉｌｔｅｎｙｉのクローンＲＥＡ７７１、＃１３０－１１１－０１２；ＢＶ４２１マウス抗ヒトＣＤ３、ＢＤ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのクローンＵＣＨＴ１、＃５６０３６５；ＢｉｏｌｅｇｅｎｄのＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ Ｆｉｘａｂｌｅ生存性キット、＃４２３１０１を用いて以下：ＣＤ３^＋ＴＣＲγδ^＋Ｖδ２^－（Ｖδ２^－γδＴ細胞）のようにゲートをかけた。

【0360】

従来型のαβＴ細胞と同様に、非従来型のＶδ２^－γδＴ細胞はＣＭＶ陰性及び陽性双方のヒト集団にてＴＩＧＩＴを発現する（抗ＴＩＧＩＴ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのクローンＭＢＳＡ４３，＃１２－９８５００－４２）（図３４Ａ）。この細胞集団にてＴＩＧＩＴ受容体を遮断することの機能的帰結を特徴付けるために、ＣＭＶ陽性ドナーから磁気的に単離されたＶδ１^＋γδＴ細胞（双方ともＭｉｌｔｅｎｙｉの抗ＴＣＲ Ｖｄ１－ＦＩＴＣ、クローンＲＥＡ１７３ ＃１３０－１００－５３２及び抗ＦＩＴＣマイクロビーズ ＃１３０－０４８－７０１）または全ＰＢＭＣを抗Ｖδ１（１０μｇ／ｍ）（Ｂｅｃｋｍａｎ ＣｏｕｌｔｅｒのクローンＲ９．１，＃ＩＭ１７６１）及びＩＬ－１５（２０ｎｇ／ｍｌ），Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈの＃２００－１５－５０ＵＧ）によって活性化し、ＴＩＧＩＴ－リガンドＣＤ１５５（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓの＃９１７４－ＣＤ－０５０）の存在下または非存在下でＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ，＃２００－０２－１ＭＧ Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を単離されたＶδ１^＋γδＴ細胞にさらに加えた。図３４Ｂは、ＴＩＧＩＴ－リガンドＣＤ１５５（０、０．１、１及び１０μｇ／ｍＬ）の添加が介在するＩＦＮγ分泌の用量依存性の低下（ＥＬＩＳＡキット，Ｍａｂｔｅｃｈの＃３４２０－１ｈ－２０）を示し、１μｇ／ｍＬのＣＤ１５５で最大阻害に達した。抗ＴＩＧＩＴ抗体クローン３１２８２（１０μｇ／ｍＬ）の添加はＣＤ１５５リガンドが存在しない条件以上のレベルまでＩＦＮγの産生を完全に回復させる一方で、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照は非常に限定された効果を有する。図３４Ｃは、全ＰＢＭＣの抗Ｖδ１による活性化の後のＣＤ１５５（１０μｇ／ｍＬ）が介在する類似の阻害効果及び抗ＴＩＧＩＴクローン３１２８２を混合に加えた場合のＩＦＮγ分泌の全面回復を実証している。これらのデータは、αβＴ細胞に類似して、γδＴ細胞の活性はＣＤ１５５のＴＩＧＩＴへのライゲーションによって損傷することができ、抗ＴＩＧＩＴ抗体はこの阻害を完全に阻止することを実証している。

【0361】

実施例３０：肝細胞癌腫マウスモデルにおける単剤としての抗ＴＩＧＩＴアンタゴニスト抗体の抗腫瘍活性
この実験のために、メスＣ５７Ｂｌ／６マウスの右脇腹にて５００万個のＨｅｐａ１－６肝細胞癌腫細胞（Ｃｒｏｗｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．）を皮下に接種した。使用した抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＶＨ ＦＲ３の残基２７をＬからＶに変異させ、ＶＨ ＦＲ４の残基６をＭからＴに変異させるように修飾した、抗体２９５２７の修飾された型（マウスＴＩＧＩＴと交差反応する）２９５２７ｍであり、マウスＩｇＧ２ａアイソタイプで作製した。接種後３日目に腫瘍体積が平均６５ｍｍ^３前後であれば、等しい腫瘍体積を持つ処理群にマウスを無作為化した（群あたりｎ＝１０）。腫瘍の接種後３日目、６日目及び９日目に腹腔内注射によって２００μｇの抗ＴＩＧＩＴ抗体またはアイソタイプ対照抗体（ｍＩｇＧ２ａ，ＢｉｏＸｃｅｌｌ ＢＥ００８５）でマウスを処理した。３日目から２０日目まで週２回、腫瘍増殖をモニターし、腫瘍体積を電子ノギスで測定した。腫瘍体積が２０００ｍ^３を超えるとマウスを屠殺した。線形混合モデルによって腫瘍増殖曲線を統計的に分析した。時間^＊処理群の相互作用を検定することによって処理群間の差異を評価した。

【0362】

図３５はＨｅｐａ１－６細胞を接種したマウスにおける腫瘍増殖曲線を説明している。中央値腫瘍増殖曲線（Ａ）ならびにｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（Ｂ）またはアンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ（Ｃ）で処理したマウスについての個々の腫瘍増殖曲線を示す。アイソタイプ対照で処理した群と比べて抗ＴＩＧＩＴ Ａｂで処理すると腫瘍増殖の有意な抑制があった（ｐ＜０．０００１）。これらのデータは、マウス肝細胞癌腫のモデルにて単剤として使用されるとアンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴ抗体は有意な抗腫瘍有効性を有することを実証している。

【0363】

実施例３１：膵臓腺癌のマウスモデルにおける単剤としてのまたは免疫チェックポイント抗体との併用での抗ＴＩＧＩＴアンタゴニスト抗体の抗腫瘍活性
免疫療法に応答性であると記載されているモデルで観察された抗ＴＩＧＩＴアンタゴニストｍＡｂの有効性（実施例１２～１４、２７、２８及び３０）に加えて、単剤としてのまたは併用での抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂの有効性も膵臓腺癌モデルの免疫原性がより低いモデル（ＰａｎｃＯ２）で調べた。

【0364】

ＰａｎＯ２腫瘍細胞株は米国国立がん研究所（ＮＣＩ ０５０７４０６ ｐ３）から購入した。８週齢のメスＣ５７Ｂｌ／６マウスに５００万個の細胞を右脇腹にて皮下に接種した。接種後７日目に腫瘍体積が平均５５ｍｍ^３前後であれば、等しい腫瘍体積を持つ処理群にマウスを無作為化した（群あたりｎ＝１０）。抗体はすべて無作為化の日に開始して３日ごとに合計３回腹腔内に注射した。使用した抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂはＶＨ ＦＲ３の残基２７をＬからＶに変異させ、ＶＨ ＦＲ４の残基６をＭからＴに変異させるように修飾した、抗体２９５２７の修飾された型（マウスＴＩＧＩＴと交差反応する）２９５２７ｍであり、マウスＩｇＧ２ａアイソタイプで作製し、それを２００μｇ／マウスで与えた。抗４－１ＢＢ（クローン３Ｈ３、ＢｉｏＸＣｅｌｌ、ＢＥ０２３９）を２００ｕｇ／マウスで与え、抗ＯＸ－４０（クローンＯＸ－８６、ＢｉｏＸＣｅｌｌ、ＢＥ００３１）を２００ｕｇ／マウスで与え、抗ＧＩＴＲ（クローンＤＴＡ－１、ＢｉｏＸＣｅｌｌ、ＢＥ００６３）を１０ｕｇ／マウスで与えた。７日目から４２日目まで週に３回、腫瘍増殖をモニターし、腫瘍体積を電子ノギスで測定した。腫瘍体積が２０００ｍ^３を超えるとマウスを屠殺した。対数変換した腫瘍体積での線形混合モデルによって腫瘍増殖曲線を統計的に分析した。時間^＊処理群の相互作用を検定することによって処理群間の差異を評価した。抗ＴＩＧＩＴ抗体を対応する免疫チェックポイント抗体（ＩＣ－すなわち、抗４１ＢＢ、抗ＯＸ４０及び抗ＧＩＴＲ）と組み合わせることで生じる相乗効果について検定するために、２つの変数：抗ＴＩＧＩＴ（あり／なし）とＩＣ（あり／なし）の組み合わせによって処理群を再コード化した。相互作用項、抗ＴＩＧＩＴ^＊ＩＣ^＊時間を検定することによって、各処理の相加効果（抗ＴＩＧＩＴ^＊時間及びＩＣ^＊時間）に加えて相乗効果を評価した。

【0365】

図３６Ａは群ごとの中央値腫瘍増殖曲線を示し、図３６Ｂは単剤としてまたは抗４－１ＢＢとの併用で抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂによって処理したマウスについての個々の増殖曲線を示す。アイソタイプで処理したマウスと比べて抗ＴＩＧＩＴで処理したマウスでは有意な腫瘍抑制はなかった（ｐ＝０．９１）。抗ＴＩＧＩＴまたは抗４－１ＢＢの単剤療法と比べて抗ＴＩＧＩＴ＋抗４－１ＢＢで処理したマウスでは腫瘍増殖の有意な抑制があった（それぞれｐ＜０．０００１及びｐ＜０．０００１）。抗ＴＩＧＩＴ抗体と抗４－１ＢＢ抗体の併用は完全な応答を示す２／１０のマウスを生じた一方で、単剤としての抗ＴＩＧＩＴまたは抗４－１ＢＢで処理した群では完全な応答は起きなかった。これらのデータは、予め確立された腫瘍の治療について抗４－１ＢＢと併用した抗ＴＩＧＩＴ療法の有意な抗腫瘍有効性を実証している。

【0366】

図３７Ａは群ごとの中央値腫瘍増殖曲線を示し、図３７Ｂは単剤としてまたは抗ＯＸ４０との併用で抗ＴＩＧＩＴによって処理したマウスについての個々の増殖曲線を示す。抗ＴＩＧＩＴまたは抗ＯＸ－４０の単剤療法と比べて抗ＴＩＧＩＴ＋抗ＯＸ－４０で処理したマウスでは腫瘍増殖の有意な抑制があった（それぞれｐ＜０．０００１及びｐ＜０．０００１）。これらのデータは、予め確立された腫瘍の治療について抗ＯＸ－４０と併用した抗ＴＩＧＩＴ療法の有意な且つ相乗的な抗腫瘍有効性を実証している。

【0367】

図３８Ａは群ごとの中央値腫瘍増殖曲線を示し、図３８Ｂは単剤としてまたは抗ＧＩＴＲとの併用で抗ＴＩＧＩＴによって処理したマウスについての増殖曲線を示す。抗ＴＩＧＩＴまたは抗ＧＩＴＲの単剤療法と比べて抗ＴＩＧＩＴ＋抗ＧＩＴＲで処理したマウスでは腫瘍増殖の有意な抑制があった（双方の比較についてｐ＜０．０００１）。これらのデータは、予め確立された腫瘍の治療について抗ＧＩＴＲと併用した抗ＴＩＧＩＴ療法の有意な且つ相乗的な抗腫瘍有効性を実証している。

【0368】

さらに臨床的に代表する設定における抗腫瘍有効性を明確にするために、単剤としてのまたは抗４－１ＢＢとの併用での抗ＴＩＧＩＴ療法の効果を膵臓腺癌の同所性モデル（ＰａｎｃＯ２）でも調べた。ルシフェラーゼを発現するように操作した２×１０^６個の同系ＰａｎｃＯ２腫瘍細胞を８週齢のメスＣ５７Ｂｌ／６マウスに膵臓で同所性に接種した。接種後６日目に生物発光シグナルを測定し、等しい生物発光シグナルを持つ処理群にマウスを無作為化した（群あたりｎ＝１０のマウス）。無作為化の日に開始して３日ごとに合計４回、ｍＡｂによる処理を腹腔内に与えた。使用した抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂはＶＨ ＦＲ３の残基２７をＬからＶに変異させ、ＶＨ ＦＲ４の残基６をＭからＴに変異させるように修飾した、抗体２９５２７の修飾された型（マウスＴＩＧＩＴと交差反応する）２９５２７ｍであり、マウスＩｇＧ２ａアイソタイプで作製し、それを２００μｇ／マウスで与えた。抗４－１ＢＢ ｍＡｂ（クローン３Ｈ３、ＢｉｏＸＣｅｌｌ、ＢＥ０２３９）を２００ｕｇ／マウスで与えた。腫瘍細胞の移植後６、１４、１８及び２２日目に測定した生物発光シグナルに基づいて腫瘍の進行をモニターした。対数変換したシグナルでの線形混合モデルによって、生物発光シグナルに基づく腫瘍進行の曲線を統計的に分析した。時間^＊処理群の相互作用を検定することによって処理群間の差異を評価した。マウスを毎日モニターし、スコア化評価項目についてのスコアシートに基づいて屠殺した。生存曲線を描き、ログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定を用いて統計的に分析した。

【0369】

図３９Ａは経時的な中央値生物発光シグナルを示し、図３９Ｂは処理群ごとの個々の曲線を示す。図３９Ａ及び図３９Ｂはアイソタイプで処理したマウスと比べて単剤としての抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂで処理したマウスにて有意な腫瘍増殖抑制を示している（ｐ＝０．００８）。抗ＴＩＧＩＴまたは抗４－１ＢＢの単剤療法と比べて抗ＴＩＧＩＴ＋抗４－１ＢＢの併用で処理したマウスにて腫瘍増殖の有意な抑制があった（それぞれｐ＝０．０００１及びｐ＝０．００４）一方で、抗４－１ＢＢのみでは効果を有さなかった。図３９Ｃは処理群ごとの生存曲線を示す。結果は、抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂが単剤として（ｐ＝０．０４）または抗４－１ＢＢとの併用で（ｐ＝０．００７）使用されるとマウスの生存に対して有意な効果を有したことを示している。これらのデータは、同所性膵臓腺癌の治療について単剤としての及び抗４－１ＢＢとの併用での抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ療法の有意な抗腫瘍有効性を実証している。

【0370】

実施例３２：ヒト化肺癌腫Ａ５４９モデルにおける単剤としての抗ＴＩＧＩＴアンタゴニスト抗体の抗腫瘍活性
ヒト腫瘍を接種し、ヒトＰＢＭＣ細胞を養子導入したＮＳＧマウスのヒト化システムにて、マウスＴＩＧＩＴと交差反応しない抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ ３１２８２の抗腫瘍有効性（表３）を評価した。

【0371】

この目的で、異なるＴＩＧＩＴリガンド（ＣＤ１５５、ＣＤ１１２及びＣＤ１１３）の発現についていくつかのヒト腫瘍細胞株を特徴付けた。図４０Ａにおけるフローサイトメトリーのデータで例示されているように、ヒトＡ５４９肺癌腫細胞株は異なるリガンドについて陽性だった。

【0372】

－２０日目にＡ５４９肺癌腫細胞を２×１０^６個／マウスの濃度でＮＯＤ ＳＣＩＤガンママウスの右脇腹にて皮下に移植した。０日目に群あたり等しい平均腫瘍体積を持つ処理群にマウスを無作為化し、３×１０^６個のヒトＰＢＭＣを静脈内注射でマウスに与えた。抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ ３１２８２またはヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照は２００ｕｇ／マウスでＰＢＭＣ導入の１日後に開始して３日ごとに合計３回腹腔内に注射した。ＰＢＭＣ導入の１日後に開始して週に２回、腫瘍増殖をモニターし、腫瘍体積を電子ノギスで測定した。腫瘍体積が２０００ｍｍ^３を超えるとマウスを屠殺した。対数変換した腫瘍体積での線形混合モデルによって腫瘍増殖曲線を統計的に分析した。時間^＊処理群の相互作用を検定することによって処理群間の差異を評価した。さらに、マウスごとの腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）は、以下の式：Ｘ日における％ＴＧＩ＝１－（Ｔ_Ｘ－Ｔ_０／Ｃ_Ｘ－Ｃ_０）^＊１００を用いて算出したが、式中、Ｔは処理したマウス１匹の腫瘍体積（ＰＢＭＣ移植後０日目及びＸ日目）であり、Ｃは参照群におけるマウスの中央値腫瘍体積である。次いで、抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ処理群について平均ＴＧＩを算出した。

【0373】

図４０Ｂは群ごとの中央値腫瘍増殖曲線を示し、図４０Ｃはアイソタイプ対照（左）または抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ（右）によって処理されたマウスについての個々の増殖曲線を示す。線形混合モデル解析は、アイソタイプと比べて抗ＴＩＧＩＴで処理したマウスでは腫瘍増殖の有意な抑制があった（ｐ＜０．０００１）ことを示している。有意な腫瘍増殖阻害はＰＢＭＣの移植後７日目（７５％ＴＧＩ、ｐ＝０．０１）、１１日目（５４％ＴＧＩ、ｐ＝０．０１）、１３日目（５９％ＴＧＩ ｐ＜０．０１）、及び１５日目（４１％ＴＧＩ、ｐ＜０．０１）に観察された。これらのデータは、ヒト化Ａ５４９肺腫瘍モデルにおける抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ ３１２８２の有意な抗腫瘍有効性を実証している。

【0374】

実施例３３：γδＴ細胞に対する抗ＴＩＧＩＴアンタゴニスト抗体の活性
γδ（ガンマ／デルタ）Ｔ細胞は記載されている抗腫瘍活性（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．２０１８．Ｊ．Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．１６：１２２）及び抗ウイルス活性（たとえば、ＣＭＶ感染）を持つ従来型ではないＴ細胞の集団であり、自己免疫疾患にも関与している（Ｍａｌｉｋ Ｓ ｅｔ ａｌ．２０１６．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：１４）。

【0375】

従来のαβＴ細胞と同様に、非従来型のＶδ２^－γδＴ細胞はＣＭＶ陰性及びＣＭＶ陽性双方のヒト集団にてＴＩＧＩＴを発現している（実施例８及び２９）。この細胞集団でのＴＩＧＩＴ受容体をブロックする機能的結果を特徴付けるために、ＣＭＶ陽性ドナー由来のＰＢＭＣ全体を１０００００個／ウェルで９６ウェルプレートに入れ、抗Ｖδ１（１０ｕｇ／ｍｌ）（クローンＲ９．１、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒの＃ＩＭ１７６１）とＩＬ－１５（２０ｎｇ／ｍｌ）によって活性化した。組換えＣＤ１５５（ＰＶＲ－６２１Ｈ Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍａｒｔ）を１０μｇ／ｍｌでウェルに加えた。抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ ３１２８２は１μｇ／ｍｌで開始して６ポイント、３．１６倍の希釈曲線で加えた。ｈＩｇＧ１アイソタイプは最高濃度で対照として使用した。４８時間の培養後、上清を回収し、ＥＬＩＳＡによってＩＦＮγの分泌を測定した。

【0376】

図４１は、抗ＴＩＧＩＴクローン３１２８２を混合物に加えたときのＰＢＭＣ全体の抗Ｖδ１による活性化の後のＣＤ１５５（１０μｇ／ｍｌ）が介在する阻害効果及びＩＦＮγ分泌の用量依存性の回復を実証している一方で、アイソタイプ対照は効果を有さない。興味深いことに、結果は、γδＴ細胞を刺激する抗ＴＩＧＩＴのＣＤ１５５が介在する効果及びそれと無関係な効果をＣＤ１５５が示さないで抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ ３１２８２による処理は対照条件より優れたレベルでＩＦＮγの分泌を高めることを示している。

【0377】

これらのデータは、αβＴ細胞と同様に、γδＴ細胞の活性はＩＦＮγ分泌の上昇によって示されるようにこの集団の活性を高める抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ ３１２８２によって積極的に調節され得ることを実証している。

【0378】

実施例３４：セザリー症候群患者に由来する悪性細胞に対する抗ＴＩＧＩＴアンタゴニスト抗体３１２８２が誘導する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性
ＴＩＧＩＴは免疫細胞で発現されることが知られている標的である。加えて、ＴＩＧＩＴの発現は特定の血液癌の徴候におけるＣＤ４^＋腫瘍細胞でも観察されている（Ｊａｒｉｗａｌａ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１３７：１；実施例２６）。抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ ３１２８２が抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導し、ＴＩＧＩＴを発現している悪性細胞を枯渇させることができることを評価するためにフローサイトメトリー解析を行った。

【0379】

先ず、患者の試料を調べて悪性の及び正常なＣＤ４^＋Ｔ細胞集団におけるＴＩＧＩＴの発現をモニターした。これらの集団を分離するためにＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＴＣＲ－Ｖｂレパトアキット（＃ＩＭ３４９７）を用いて悪性クローンのＴＣＲ－Ｖｂ再構成の事前の決定を行った。いったん悪性クローンが同定されると、以下の市販試薬：抗ＣＤ３ Ｋｒｏｍｅ Ｏｒａｎｇｅ（＃Ｂ０００６８）、抗ＣＤ４－ＰＥ（＃Ａ０７７５１）、抗ＣＤ８－ＰＣ７（＃７３７６６１）、抗ＣＤ５６－ＰＣ５（＃Ａ０７７８９）、抗ＣＤ４５－Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（＃Ａ７４７６３）、抗ＣＤ１９－ＡＦ７５０（＃Ａ９４６８１）及び抗Ｖｂ２０－ＦＩＴＣ（＃ＩＭ１５６２）（すべてＢｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ由来）ならびに抗ＴＩＧＩＴ－ＡＰＣ（クローンＭＢＳＡ４３、ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃１７－９５００－４２）を用いてセザリー症候群患者の免疫細胞でＴＩＧＩＴの発現の特性を明らかにした。セザリー症候群患者試料のフローサイトメトリー解析はＣｙｔｏＦｌｅｘ装置（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ）で実施した。データはＦｌｏＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ）で分析した。

【0380】

代表的な例を図４２に示す。悪性ＴＣＲ－Ｖｂ２０を有するこのドナーのゲートかけ戦略を図４２Ａに示すが、悪性細胞はＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｖｂ２０^＋であり、正常ＣＤ４^＋Ｔ細胞はＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｖｂ２０^－である。正常ＣＤ４^＋Ｔ細胞（２８．９％）とは対照的に悪性ＣＤ４^＋Ｔ細胞はすべてＴＩＧＩＴについて陽性である（９９．６％）。

【0381】

ＡＤＣＣアッセイについては、セザリー患者（ＳＳ）のヘパリン化静脈血から密度勾配によってＰＢＭＣを調製した。ＮＫ細胞及びＣＤ４^＋Ｔ細胞は製造元の推奨（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ）に従ってＭＡＣＳ（陰性選択）によって精製した。選別したＣＤ４^＋Ｔ細胞はすべて１０μｇ／ｍｌでのアイソタイプ対照、抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ（３１２８２）または陽性対照としての抗ＣＤ５２ ｍＡｂ（アレムツズマブと同様の配列を共有する）と共に室温にて３０分間、予備インキュベートし、次いで０／１、１／５、１／１及び５／１のＥ／Ｔ比で自己ＮＫリンパ球と混合した。３７℃にて４時間３０分インキュベートを行った。７－ＡＡＤの取り込みを介して非悪性及び悪性のＣＤ４^＋Ｔ細胞ならびにＮＫの細胞死をフローサイトメトリーによってモニターした。

【0382】

代表的な例を図４２Ｂに示し、アイソタイプの存在下での無視できるレベルのＮＫ介在性の細胞傷害があったが、Ｅ／Ｔ比と共に上昇する抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂによる腫瘍細胞のＮＫ細胞依存性の細胞傷害活性が得られた。非悪性のＣＤ４^＋Ｔ細胞に向かう細胞傷害は限定され、ＮＫ細胞は維持された。

【0383】

本明細書の本文の範囲内で引用されている参考文献、取得された特許及び特許出願はすべてあらゆる目的でその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。さらに、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／４３９６８はあらゆる目的でその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

【0384】

実施例３５：ＣＴ２６結腸癌マウスモデルにおける化学療法及びＡ_２ＡＲアンタゴニストとの併用での抗ＴＩＧＩＴアンタゴニスト抗体の抗腫瘍活性
抗ＴＩＧＩＴ抗体の免疫チェックポイント抗体との併用（実施例１２、１３、１４及び２８）に加えて、化学療法剤ドキソルビシンまたはＡ_２ＡＲアンタゴニストとの併用、及びＡ_２ＡＲアンタゴニストとドキソルビシンとの抗ＴＩＧＩＴ抗体の三重併用にて抗ＴＩＧＩＴ抗体の抗腫瘍有効性を評価した。使用したＡ_２ＡＲアンタゴニストは参照によって本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＥＰ２０１９／０７４２０８における化合物８ｂに相当する。

【0385】

ＡＴＣＣ（登録商標）から購入したＣＴ２６腫瘍細胞株（ＣＲＬ－２６３８（商標））を５００，０００個で８週齢のメスＢａｌｂ／ｃマウスの右脇腹にて皮下に接種した。接種後９日目に腫瘍体積が平均９０ｍｍ^３前後であれば、マウスを等しい腫瘍体積を持つ処理群に無作為化した（群あたりｎ＝８のマウス）。無作為化の日に開始して３日ごとに合計３回２０μｇ／マウスの用量で抗ＴＩＧＩＴ抗体（２９５２７ｍ）またはｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照を腹腔内に注射した。同じ日に開始してＱＤで３２日間、０．６ｍｇ／ｋｇ用量のＡ_２ＡＲアンタゴニストまたはビヒクルによってｐ．ｏ．でマウスを処理した。無作為化の１日後に開始して、６ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンまたは対照ＰＢＳをｉ．ｖ．でマウスに投与し、投与は４日離して２回だった。

【0386】

９日目から５０日目まで週に３回、腫瘍増殖をモニターし、腫瘍体積を電子ノギスで測定した。腫瘍体積が２０００ｍｍ^３を超えるとマウスを屠殺した。対数変換した腫瘍体積での線形混合モデルによって腫瘍増殖曲線を統計的に分析した。時間^＊処理群の相互作用を検定することによって処理群間の差異を評価した。

【0387】

図４３は群ごとの中央値腫瘍増殖曲線（Ａ）、ならびに単剤療法または指定された併用で処理したマウスについての個々の増殖曲線（Ｂ）を示す。腫瘍細胞移植後９、１２及び１５日目での１ｍｇ／ｋｇの抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ ２９５２７ｍの腹腔内注射は、実施例１２で前に報告されているように対照アイソタイプで処理したマウスと比べて腫瘍増殖を有意に抑制した（ｐ＝０．０００９）。

【0388】

６ｍｇ／ｋｇの用量でのドキソルビシンの２回投与は腫瘍増殖に対して効果を有さなかった（ｐ＝０．１４）一方で、抗ＴＩＧＩＴとの併用は抗腫瘍有効性を改善した（抗ＴＩＧＩＴまたはドキソルビシンの単剤療法と比べてそれぞれｐ＝０．００８及びｐ＝０．０００２）。

【0389】

０．６ｍｇ／ｋｇのＡ_２ＡＲ阻害剤の抗ＴＩＧＩＴ ２９５２７ｍを伴った投与は抗ＴＩＧＩＴ単剤療法と比べて抗腫瘍効果を改善しなかった。

【0390】

６ｍｇ／ｋｇでのドキソルビシンと共に０．６ｍｇ／ｋｇで投与されたＡ_２ＡＲ阻害剤はドキソルビシンの単独投与と比べて有意な抗腫瘍効果を達成した（ｐ＝０．０００３）。

【0391】

抗ＴＩＧＩＴとＡ_２ＡＲ阻害剤とドキソルビシンとの併用で処理したマウスにおける腫瘍増殖の抑制は、それぞれの二重併用（抗ＴＩＧＩＴ＋Ａ_２ＡＲ阻害剤と比べてまたはドキソルビシン＋Ａ_２ＡＲ阻害剤と比べてｐ＜０．０００１、抗ＴＩＧＩＴ＋ドキソルビシンと比べてｐ＝０．００３）で達成された腫瘍増殖の抑制よりも有意に高く、８匹のマウスのこの群で５匹が完全な応答者だった。

【0392】

実施例３６：アンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴ抗体の存在下でのＴＩＧＩＴ発現の定量
ＴＩＧＩＴ受容体への結合について互いに競合する及びＴＩＧＩＴの天然のリガンド（ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３）と競合するアンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴ抗体の存在下でのＴＩＧＩＴの発現の測定を可能にするために、我々はアンタゴニスト抗体と競合しない抗ＴＩＧＩＴ抗体についてスクリーニングした。クローン３２９５９はアンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴクローン３１２８２の存在下でＴＩＧＩＴに結合することができる抗体であると選択された。この能力を実証するために、ＥＤＴＡで採血した健常ヒトドナーに由来する静脈血を５０μＬのアリコートに分配し、漸減濃度の未標識クローン３１２８２と共にインキュベートし、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベートに続いて試料を洗浄し、上清を捨てた。その後、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ由来の抗ＣＤ４５－ＰｅｒｃＰ（クローンＨＩ３０）及びＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ由来のＣＤ４－ＢＶ４２１（クローンＬ２００）、ＣＤ８ａ－ＢＶ５１０（クローンＳＫ１）、ＣＤ４５ＲＯ－ＢＢ５１５（クローンＵＣＨＬ１）、ＣＤ２５－ＢＶ６０５（クローン２Ａ３）、ＣＤ１２７－ＢＶ７８６（クローンＨＩＬ－７Ｒ－Ｍ２１）、ＣＤ５６－ＢＶ６５０（クローンＮＣＡＭ１６．２）及びＰＥ標識した３１２８２またはＡＦ６４７に結合した３２９５９のいずれかを用いたＴＩＧＩＴによって試験試料を染色した。各血液試料は４℃で３０分間インキュベートした。ＢＤ溶解緩衝液で赤血球を溶解し、白血球をペレットにし、洗浄し、最終的に、ＰＢＳで希釈したＩＣ固定緩衝液に再浮遊させた。ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でデータ取得を行い、フローサイトメトリーのデータはＦｌｏｗＪｏ Ｖ１０．５．３を用いて分析した。

【0393】

遊離のＴＩＧＩＴの正規化した頻度は、以下の式：Ｙ＝（Ａ／Ｂ）^＊１００に従って算出した。その際、このクローンでの検出についてＡ＝３１２８２－ＰＥ％_{濃度Ｘでの３１２８２}及びＢ＝３１２８２－ＰＥ％_{未処理の３１２８２}である一方で、クローン３２９５９－ＡＦ６４７での検出については、Ａ＝３２９５９－ＡＦ６４７^＋％_{濃度Ｘでの３１２８２}及びＢ＝３２９５９－ＡＦ６４７％_{未処理の３１２８２}である。

【0394】

様々な濃度の未結合の３１２８２と共にインキュベートし、その後、その条件で同時に３１２８２－ＰＥ（Ａ）または抗ＴＩＧＩＴ３２９５９－ＡＦ６４７（Ｂ）によるＦＡＣＳ染色によって検出した後のＣＤ３^＋ＣＤ８^＋細胞集団における遊離のＴＩＧＩＴ^＋の正規化した頻度を図４４に示す。３１２８２とのインキュベート後の３２９５９によるＴＩＧＩＴ^＋細胞の検出は、各抗ＴＩＧＩＴ抗体クローンによる重複しないエピトープの認識にたぶん起因する、競合の非存在を裏付けている。

【0395】

実施例３７：ヒト血清試料におけるクローン３１２８２の濃度を測定するアッセイ（ＰＫアッセイ）でのクローン３１２８２に対する抗イディオタイプ抗体３２８６９の使用
ヒトＩｇＧ１である抗イディオタイプ抗体クローン３２８６９はアンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴクローン３１２８２への特異的な結合の実証の後、ＨｕＣＡＬ（登録商標）ライブラリから選択された。

【0396】

ヒトＩｇＧ１アイソタイプでＨＥＫ２９３細胞にて産生された抗イディオタイプ抗体クローン３２８６９を用いて、臨床試験の間にクローンの薬物動態（ＰＫ）を追跡するためにヒト血清試料でのクローン３１２８２の定量用のＥＬＩＳＡアッセイを開発した。

【0397】

ＥＬＩＳＡアッセイは電気化学発光検出技術を用いたＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）構築基盤に基づく。抗イディオタイプ抗体クローン３２８６９（０．５μｇ／ｍＬ）を高結合のＭＳＤプレートにコーティングする。次いで、血清試料の希釈物を１時間インキュベートし、プレートを洗浄し、コーティングした抗イディオタイプ抗体へのクローン３１２８２の結合を、読み取り緩衝液の存在下でスルホ－ＴＡＧｈＩｇＧ１ ３２８６９（０．５μｇ／ｍＬ）によって検出する。プレートの電極に電圧を印加し、結合したスルホ－ＴＡＧを電気化学的刺激を介して発光させる。発光の強度は血清試料におけるクローン３１２８２の濃度に比例する（図４５）。

【図1】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4-1】

【図4-2】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図6-4】

【図6-5】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10-1】

【図10-2】

【図11】

【図12-1】

【図12-2】

【図13-1】

【図13-2】

【図13-3】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17-1】

【図17-2】

【図18-1】

【図18-2】

【図18-3】

【図18-4】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24-1】

【図24-2】

【図25】

【図26】

【図27A】

【図27B】

【図27C】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33A】

【図33B】

【図33C】

【図33D】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39-1】

【図39-2】

【図40】

【図41】

【図42A】

【図42B】

【図43】

【図44】

【図45】

【配列表】

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