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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-06-28
(45)【発行日】2024-07-08
(54)【発明の名称】生化学試験用の干渉センサ
(51)【国際特許分類】
G01N 21/45 20060101AFI20240701BHJP
G01N 33/483 20060101ALI20240701BHJP
【ＦＩ】
G01N21/45 A
G01N33/483 C
【請求項の数】
10
(21)【出願番号】P 2022505387
(86)(22)【出願日】2020-07-24
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-26
(86)【国際出願番号】 US2020043555
(87)【国際公開番号】W WO2021021653
(87)【国際公開日】2021-02-04
【審査請求日】2023-06-21
(31)【優先権主張番号】62/879,086
(32)【優先日】2019-07-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】522033760
【氏名又は名称】アクセス・メディカル・システムズ，リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110003708
【氏名又は名称】弁理士法人鈴榮特許綜合事務所
(74)【代理人】
【識別番号】100108855
【弁理士】
【氏名又は名称】蔵田 昌俊
(74)【代理人】
【識別番号】100179062
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 正
(74)【代理人】
【識別番号】100199565
【弁理士】
【氏名又は名称】飯野 茂
(74)【代理人】
【識別番号】100212705
【弁理士】
【氏名又は名称】矢頭 尚之
(74)【代理人】
【識別番号】100219542
【弁理士】
【氏名又は名称】大宅 郁治
(74)【代理人】
【識別番号】100153051
【弁理士】
【氏名又は名称】河野 直樹
(74)【代理人】
【識別番号】100162570
【弁理士】
【氏名又は名称】金子 早苗
(72)【発明者】
【氏名】ヤオ、ジエンボー
(72)【発明者】
【氏名】タン、ホン
【審査官】嶋田 行志
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１１／０３０５５９９（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特開２００９－００７６３６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開平０２－２４０６０５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００４－３１７３１４（ＪＰ，Ａ）
【文献】実開昭５６－１１０４１０（ＪＰ，Ｕ）
【文献】特表２００７－５１０９０７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表平０５－５００５６７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１４－５０１９３３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００６－０３８７５４（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ２１／００－Ｇ０１Ｎ ２１／６１
Ｇ０１Ｎ ３３／４８－Ｇ０１Ｎ ３３／９８
Ｈ０１Ｌ ２１／００－Ｈ０１Ｌ ２１／９８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＪＳＴＣｈｉｎａ（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＡＣＳ ＰＵＢＬＩＣＡＴＩＯＮＳ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
試料中の分析物を検出するための干渉センサであって、前記干渉センサは、モノリシック基材の反対側の端部で互いに実質的に平行に配設された第１及び第２の表面を有する、ガラスを含む前記モノリシック基材と、
前記モノリシック基材の前記第２の表面上にコーティングされたフッ化マグネシウム（ＭｇＦ２）を含む干渉層と、
前記干渉層上にコーティングされた分析物結合分子の層と、を備え、
前記モノリシック基材と前記干渉層との間の第１の界面が、光が前記干渉センサ上に照射されるときに第１の反射面として機能し、
前記分析物結合分子に結合する試料中の分析物分子によって形成されたバイオ層と、前記試料を含有する溶液との間の第２の界面が、前記光が前記干渉センサ上に照射されるときに第２の反射面として機能する、干渉センサ。
【請求項2】
前記モノリシック基材が、前記第１の表面と前記第２の表面との間に規定される、少なくとも５ミリメートル（ｍｍ）の長さを有し、前記モノリシック基材のアスペクト比が少なくとも５対１である、請求項１に記載の干渉センサ。
【請求項3】
前記干渉層が少なくとも５００ナノメートル（ｎｍ）の厚さを有する、請求項１に記載の干渉センサ。
【請求項4】
前記干渉層と前記分析物結合分子の層との間に位置付けられた二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）を含む接着層をさらに備える、請求項１に記載の干渉センサ。
【請求項5】
前記接着層が１０ｎｍ未満の厚さを有する、請求項４に記載の干渉センサ。
【請求項6】
請求項１に記載の干渉センサを製造するための方法であって、前記方法が、モノリシック基材を取得することと、
前記モノリシック基材の反対側の端部で互いに実質的に平行に配設された前記モノリシック基材の第１及び第２の表面を研磨することと、
フッ化マグネシウム（ＭｇＦ２）を含む第１の透明材料を、前記モノリシック基材の前記第２の表面上に堆積して、干渉層を形成することと、
分析物結合分子を前記干渉層に結合することと、を備える、方法。
【請求項7】
前記モノリシック基材がガラスを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記干渉層が少なくとも９００ｎｍの厚さを有する、請求項６に記載の方法。
【請求項9】
第２の透明材料を前記干渉層上に堆積して、接着層を形成することをさらに備え、前記分析物結合分子の層が前記接着層に結合している、請求項６に記載の方法。
【請求項10】
前記第２の透明材料が、二酸化ケイ素である、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
様々な実施形態は、試料中の分析物分子が生化学試験の過程にわたって結合することができる、干渉センサに関する。
【背景技術】
【0002】
分析物分子と分析物結合分子との間の結合事象に基づく診断試験は、医療、獣医、農業、および研究用途で広く使用されている。これらの診断試験を用いて、分析物分子が試料中に存在するかどうか、試料中の分析物分子の量、または分析物分子が分析物結合分子に結合する速度を検出することができる。共に、分析物結合分子およびその対応する分析物分子は、分析物－抗分析物結合対（または単に「結合対」）を形成する。結合対の実施例としては、核酸の相補鎖、抗原－抗体対、および受容体－受容体結合剤が含まれる。分析物は、結合対のいずれかのメンバーであり得、抗分析物は、結合対の他のメンバーであり得る。
【0003】
歴史的に、診断試験は、その上に固定された分析物結合分子を有する固体の平坦な表面を用いてきた。試料中の分析物分子は、定義された検出ゾーン内で高い親和性でこれらの分析物結合分子に結合する。「固相アッセイ」として知られるこのタイプのアッセイでは、固体表面は、分析物分子の分析物結合分子への結合を促進する条件下で試料に曝露される。一般に、結合事象は、結合事象を示す質量、反射率、厚さ、色、または別の特性の変化を測定することによって直接的に検出される。例えば、分析物分子が発色団、蛍光標識、または放射性標識で標識される場合、結合事象は、（もし存在する場合）検出ゾーン内で検出され得る標識の量に基づいて検出可能である。代替的に、分析物分子は、検出ゾーン内の分析物結合分子に結合した後に標識され得る。
【0004】
米国特許第５，８０４，４５３号は、物質が結合するその遠位端に直接的にコーティングされた試薬（すなわち、捕捉分子）を有する光ファイバを使用して、試料溶液中の物質の濃度を決定する方法を開示している。次いで、遠位端を、分析物を含有する試料中に浸漬する。分析物の試薬層への結合は、干渉パターンを生成し、分光計によって検出される。
【0005】
米国特許第７，３９４，５４７号は、第１の光学的に透明な要素が、それらの間に空隙を有する光ファイバ先端に機械的に取り付けられており、次いで、５０ナノメートル（ｎｍ）を超える厚さを有する干渉層としての第２の光学要素が、第１の要素の遠位端に取り付けられている、バイオセンサを開示している。バイオ層は、第２の光学要素の周辺表面上に形成される。厚さが５～５０ｎｍであり、屈折率が１．８を超える追加の反射面層が、干渉層と第１の要素との間にコーティングされる。スペクトル干渉の変化に基づいて試料中の分析物を検出する原理は、この参照文献に記載されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる。
【0006】
米国特許第７，３１９，５２５号は、光ファイバのセクションが、光ファイバセクションの近位端と先端コネクタとの間の空隙を有する１つ以上の光ファイバからなる先端コネクタに機械的に取り付けられている、異なる構成を開示している。干渉層、次いでバイオ層は、光ファイバセクションの遠位表面上に構築される。
【0007】
従来技術は、薄膜干渉計に基づくバイオセンサの利用における機能性を提供するが、これらの干渉計の性能に改善の必要性が存在する。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1A】光源、検出器、導波路、および光学アセンブリ（「プローブ」とも呼ばれる）を含む、バイオセンサ干渉計を示している。
【図1B】従来のプローブの実施例を示している。
【図2】様々な実施形態によるプローブの実施例を示している。
【図3】様々な実施形態によるプローブの別の実施例を示している。
【図4A】薄膜干渉計における検出の原理を示している。
【図4B】薄膜干渉計における検出の原理を示している。
【図5】様々な実施形態によるスライドの実施例を示している。
【図6】様々な実施形態によるスライドの別の実施例を示している。
【図7】プローブを製造するためのプロセスのフロー図を示している。
【図8A】様々な実施形態による、プローブの側面斜視図を含む。
【図8B】様々な実施形態による、底面斜視図を含む。
【図8C】様々な実施形態による、上面斜視図を含む。
【図9】チャネル（ＣＨ）１～４に割り当てられた従来のプローブ（すなわち、下の４つの曲線）およびＣＨ５～８に割り当てられたＭｇＦ２プローブ（すなわち、上の４つの曲線）を有する、ＡＰＳプローブにおけるタンパク質Ａの結合曲線（ｎｍにおけるシフトを伴う）を示している。
【図10】ＣＨ１～４に割り当てられた従来のプローブ（すなわち、下の４つの曲線）およびＣＨ５～８に割り当てられたＭｇＦ２プローブ（すなわち、下の４つの曲線）を有する、タンパク質ＡプローブにおけるヒトＩｇＧの結合曲線を示している。
【0009】
本技術の様々な特徴は、図面と併せた発明を実施するための形態の研究から、当業者に明らかになるであろう。図面は、例示のみを目的として、発明を実施するための形態全体を通して説明される様々な実施形態を示している。具体的な実施形態が例として示されているが、本技術は、様々な修正および代替形態に適している。その意図は、例示および／または説明されてきた特定の実施形態に技術を限定することではない。
【発明を実施するための形態】
【0010】
いくつかの事業体は、生化学試験を実施するように設計されたシステムを開発した。図１Ａおよび図１Ｂは、そのようなシステムの１つの実施例を示している。特に、図１Ａは、光源１０２、検出器１０４、導波路１０６、および光学アセンブリ１０８（「プローブ」とも呼ばれる）を含む、バイオセンサ干渉計１００（または単に「干渉計」）を示している。プローブ１０８は、結合媒体を介して導波路１０６に接続され得る。
【0011】
光源１０２は、導波路１０６によってプローブ１０８に向かって誘導される光を放出し得る。例えば、光源１０２は、所与のスペクトル（例えば、４００ｎｍ以下～７００ｎｍ以上）内の少なくとも５０ナノメートル（ｎｍ）、１００ｎｍ、または１５０ｎｍの範囲にわたって光を生成するように構成された発光ダイオード（ＬＥＤ）であってもよい。あるいは、干渉計１００は、可視範囲内の異なる波長の光を放出するように設計されたＬＥＤなどの異なる特徴的な波長を有する複数の光源を用いてよい。同じ機能は、異なる波長を有する光をプローブ１０８上に方向付けるための適切なフィルタを備えた単一の光源によって達成され得る。
【0012】
検出器１０４は、好ましくは、プローブ１０８から受信された干渉光のスペクトルを記録することができる、オーシャン光学ＵＳＢ４０００などの分光計である。あるいは、光源１０２が異なる波長をプローブ１０８上に方向付けるように動作する場合、検出器１０４は、各波長で強度を記録することができる単純な光検出器であり得る。別の実施形態では、検出器１０４は、複数の波長の各々で強度の検出を可能にする、複数のフィルタを含み得る。
【0013】
導波路１０６は、光源１０２によって放出された光をプローブ１０８に運び、次いで、プローブ１０８内の表面によって反射された光を検出器１０４に運ぶように構成され得る。一部の実施形態では、導波路１０６は、光ファイバ（例えば、単一モード光ファイバケーブル）の束であり、一方で、他の実施形態では、導波路１０６は、マルチモード光ファイバケーブルである。
【0014】
図１Ｂに示されるように、プローブ１０８は、モノリシック基材１１４、薄膜層（「干渉層」とも呼ばれる）、および分析物結合分子１２０に結合した分析物分子１２２を含む、生体分子層（「バイオ層」とも呼ばれる）を含む。モノリシック基材１１４は、光が通過することができる透明な材料を含む。干渉層はまた、透明な材料を含む。光がプローブ１０８に照射されるとき、干渉層の近位表面は、第１の反射面として作用し得、バイオ層は、第２の反射面として作用し得る。以下にさらに説明するように、第１および第２の反射面によって反射された光は、干渉計１００によって監視され得る干渉パターンを形成し得る。
【0015】
干渉層は、通常、干渉パターンの検出性を改善するために、そのような手法で組み合わされた複数の層を含む。ここで、例えば、干渉層は、五酸化タンタル（Ｔａ２Ｏ５）層１１６および二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）層１１８を含む。五酸化タンタル層１１６は、その主目的が干渉層の近位表面での反射率を改善することであるため、薄くてもよい（例えば、１０～４０ｎｍ程度）。一方、二酸化ケイ素層１１８は、その主目的が第１の反射面と第２の反射面との間の距離を増加させることであるため、比較的厚くてもよい（例えば、６５０～９００ｎｍ程度）。
【0016】
診断試験を実施するために、プローブ１０８は、試料１１２を含むマイクロウェル１１０（または単に「ウェル」）に懸濁され得る。試料１１２内の分析物分子１２２は、診断試験の過程でプローブ１０８の遠位端に沿って分析物結合分子１２０に結合し、これらの結合事象は、検出器１０４によって観察され得る干渉パターンをもたらす。干渉計１００は、干渉パターンの位相特性におけるシフトを検出することによって、プローブ１０８の遠位端に沿って形成されたバイオ層の厚さを監視することができる。
【0017】
しかしながら、このような設計には、いくつかの不利な点がある。１つの欠点は、これらのプローブを伴う生化学試験中に観察される低い信号強度である。別の欠点は、バイオ層が延長された事前の時間にわたって成長するときに生じ得る結合曲線の負のシフト（例えば、２０～４０分にわたって生じる数十サイクル）である。
【0018】
本明細書で紹介するものは、これらの欠点に対処する干渉センサ（「干渉バイオセンサ」または「感知装置」とも呼ばれる）である。具体的には、干渉センサは、モノリシック基材の反対側の端部で互いに実質的に平行に配設された第１および第２の表面を有するモノリシック基材と、モノリシック基材の第２の表面上にコーティングされた干渉層と、干渉層上にコーティングされた分析物結合分子の層と、を含むことができる。干渉層は、フッ化マグネシウム（ＭｇＦ２）を含み得る。モノリシック基材と干渉層との間の第１の界面は、光が干渉センサに照射されるときに、第１の反射面として機能し、一方で、分析物結合分子に結合する試料中の分析物分子によって形成されるバイオ層と、試料を含む溶液との間の第２の界面は、光がプローブに照射されるときに、第２の反射面として機能する。上述したように、バイオ層の厚さは、第１および第２の反射面によって反射される光の干渉パターンに基づいて推定され得る。
【0019】
干渉センサの実施形態は、例示の目的のために試料を含む溶液内に懸濁されるように設計されたプローブのコンテキスト内で説明されてよい。しかしながら、当業者は、これらの特徴が、生化学試験の過程にわたって平面表面上に溶液を流すことによってバイオ層が形成される平面表面（例えば、スライド）などの他の感知表面に等しく適用可能であることを認識するであろう。
【0020】
定義
「約」という用語は、記載の値の±１０％以内を意味する。
「約」という用語は、記載の値の±１０％以内を意味する。
【0021】
「分析物結合分子」という用語は、分析物分子との結合反応に関与することができる任意の分子を指す。分析物結合分子の例としては、（ｉ）抗原分子、（ｉｉ）抗体分子、（ｉｉｉ）タンパク質分子、（ｉｖ）リガンド、および（ｖ）一本鎖核酸分子が含まれるが、これらに限定されない。
【0022】
「干渉センサ」という用語は、干渉パターンを生成するためにバイオ層が形成される任意の感知装置を指す。干渉センサの１つの例は、分析物分子を有する試料を含有する溶液中に懸濁されるように設計されたプローブである。干渉センサの別の例は、生化学試験の過程にわたってバイオ層を形成することができる平面表面を有するスライドである。
【0023】
「プローブ」という用語は、感知側にコーティングされた薄膜層を有する少なくとも２～１のアスペクト比（長さ対幅）を有するモノリシック基材を指す。
【0024】
「モノリシック基材」という用語は、１つの屈折率を有するガラス、石英、またはプラスチックなどの均一な組成を有する固体材料片を指す。
【0025】
「導波路」という用語は、（光としての）電磁波の伝播を制限および方向付けるように設計されたデバイス（例えば、ダクト、同軸ケーブル、または光ファイバ）を指す。導波路の１つの例は、超高周波波をチャネルするための金属チューブである。
【0026】
プローブ概要
図２は、様々な実施形態によるプローブ２００の実施例を示している。プローブ２００は、モノリシック基材２０２の遠位端に沿って固定された干渉層２０４を含む。分析物結合分子２０６は、干渉層２０４の遠位表面に沿って堆積され得る。生化学試験の過程で、バイオ層は、分析物結合分子２０６に結合する試料中の分析物分子２０８として形成されることになる。
図２は、様々な実施形態によるプローブ２００の実施例を示している。プローブ２００は、モノリシック基材２０２の遠位端に沿って固定された干渉層２０４を含む。分析物結合分子２０６は、干渉層２０４の遠位表面に沿って堆積され得る。生化学試験の過程で、バイオ層は、分析物結合分子２０６に結合する試料中の分析物分子２０８として形成されることになる。
【0027】
図２に示されるように、モノリシック基材２０２は、例えば、干渉計の導波路に結合され得る近位表面（「結合側」とも呼ばれる）と、追加の層が堆積される遠位表面（「感知側」とも呼ばれる）とを有する。一般に、モノリシック基材２０２は、少なくとも３ミリメートル（ｍｍ）、５ｍｍ、１０ｍｍ、または１５ｍｍの長さを有する。好ましい実施形態では、モノリシック基材２０２のアスペクト比（長さ対幅）は、少なくとも５対１である。そのような実施形態では、モノリシック基材２０２は、柱状形態を有すると言ってよい。モノリシック基材２０２の断面は、円、楕円、正方形、長方形、三角形、五角形などであり得る。モノリシック基材２０２は、好ましくは、干渉層２０４の屈折率よりも実質的に高い屈折率を有し、その結果、干渉層２０４の近位表面は、プローブ２００上に方向付けられた光を効果的に反射する。モノリシック基材の好ましい屈折率は、１．５、１．８、または２．０より高くてもよい。したがって、モノリシック基材２０２は、ガラス（２．０の屈折率）などの高屈折率材料を含み得るが、モノリシック基材２０２の一部の実施形態は、石英（１．４６の屈折率）またはプラスチック（１．３２～１．４９の屈折率）などの低屈折率材料を含み得る。透明プラスチックの例としては、ポリプロピレン、ポリウレタン、アクリル、ポリカーボネートなどが含まれる。
【0028】
干渉層２０４は、モノリシック基材２０２の遠位表面上にコーティングされた少なくとも１つの透明材料を含む。これらの透明材料は、ナノメートル（例えば、単層）の分率から数マイクロメートルの厚さの範囲の薄膜の形態で、モノリシック基材２０２の遠位表面上に堆積される。干渉層２０４は、少なくとも５００ｎｍ、７００ｎｍ、または９００ｎｍの厚さを有し得る。例示的な厚さは、５００～５，０００ｎｍ（および好ましくは、８００～１，２００ｎｍ）である。本明細書では、例えば、干渉層２０４は、約９００～１，０００ｎｍ、または９４０ｎｍの厚さを有する。
【0029】
従来のプローブとは対照的に、干渉層２０４は、バイオ層と実質的に同様の屈折率を有する。これは、プローブ２００の遠位端からの反射が、干渉層２０４と分析物結合分子２０６との間の界面ではなく、主に分析物分子２０８に起因することを確実にする。一般に、バイオ層は、およそ１．３６の屈折率を有するが、これは、プローブ２００の遠位端に沿った分析物結合分子（およびしたがって分析物分子）のタイプに応じて変化し得る。
【0030】
一部の実施形態では、干渉層２０４は、フッ化マグネシウム（ＭｇＦ２）を含み、一方で、他の実施形態では、干渉層２０４は、１．３６の屈折率を有するフッ化カリウム（ＫＦ）、１．３９の屈折率を有するフッ化リチウム（ＬｉＦ）、１．３２の屈折率を有するフッ化ナトリウム（ＮａＦ）、１．３９の屈折率を有するリチウムカルシウムフッ化アルミニウム（ＬｉＣａＡｌＦ６）、１．３７の屈折率を有するフッ化ストロンチウム（ＳｒＦ２）、１．３８の屈折率を有するフッ化アルミニウム（ＡｌＦ３）、１．３４の屈折率を有する六フッ化アルミニウムナトリウム（Ｎａ３ＡｌＦ６）（「凍結石」とも呼ばれる）、１．３４の屈折率を有するフッ化アルミニウムナトリウム（Ｎａ５Ａｌ３Ｆ１４）（「キオライト」とも呼ばれる）などを含む。追加的または代替的に、干渉層２０４は、ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）（スクロースおよびエピクロロヒドリンのコポリマー）などの１．４未満の屈折率を有するポリマーを含み得る。フッ化マグネシウムは、プローブ２００の遠位端に沿って形成されたバイオ層の屈折率と実質的に同一である、１．３８の屈折率を有する。比較のために、従来のプローブの干渉層は通常、二酸化ケイ素を含み、純粋な二酸化ケイ素の屈折率は、約１．４６である。より純度の低い形態の二酸化ケイ素は、高い屈折率（例えば、可視範囲内で約１．５）を有する。一般に、干渉層２０４の屈折率は、１．３２～１．４２、１．３６～１．４２、または１．３８～１．４０である。干渉層２０４およびバイオ層は、同様の屈折率を有するため、光は、干渉層２０４からバイオ層内に移動し、次いでバイオ層から干渉層２０４内に戻るときに、最小限の散乱を経験するであろう。
【0031】
バイオ層の厚さは、干渉計のハードウェア（例えば、光学構成要素）に基づいて全体的な感度を最適化するように設計される。従来の固定化化学は、分析物結合分子２０６を干渉層２０４の遠位表面に共有結合的に（例えば、化学的に）または非共有結合的に（例えば、吸着によって）付着させるために使用され得る。
【0032】
分析物結合分子２０６の層は、好ましくは、プローブ２００の遠位端が濃密にコーティングされている条件下で形成され、その結果、分析物分子２０８の分析物結合分子２０６への結合は、層を充填するのではなく、バイオ層の厚さの変化をもたらす。分析物結合分子２０６の層は、単層または多層マトリックスであり得る。
【0033】
生化学試験の間、プローブ２００は、試料を含む空洞（例えば、ウェル）内に懸濁され得る。プローブベースの検出技術の例は、「Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｅｎｓｏｒ ｏｆ Ｂｉｏ－Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｕｓｉｎｇ Ｔｈｉｎ－Ｆｉｌｍ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｅｒ」と題する米国特許第８，５９７，５７８号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。生化学試験の過程で、分析物分子２０８が分析物結合分子２０６に結合するにつれて、プローブ２００の遠位端に沿ってバイオ層が形成される。
【0034】
光がプローブ２００上に照射されるとき、干渉層２０４の近位表面は、第１の反射面として作用し得、バイオ層の遠位表面は、第２の反射面として作用し得る。プローブ２００に対する分析物分子２０８の存在、濃度、または結合速度は、これらの２つの反射面によって反射される光ビームの干渉に基づいて推定され得る。分析物分子２０８が分析物結合分子２０６に付着する（またはそこから分離する）のにつれて、第１の反射面と第２の反射面との間の距離は変化する。プローブ２００内のすべての他の構成要素の寸法は同じままであるため、第１および第２の反射面によって反射される光によって形成される干渉パターンは、結合事象によるバイオ層厚の変化に応じて位相がずれている。
【0035】
光ファイバの代わりにモノリシック基材２０２を使用することは、いくつかの利点を提供する。上述したように、モノリシック基材２０２の屈折率は、干渉層２０４の屈折率よりも高いことが好ましい。例えば、モノリシック基材２０２の屈折率は、干渉層２０４の屈折率よりも少なくとも０．１、０．２、０．４、０．５、または０．６高くてもよい。モノリシック基材２０２は、均一な組成を有する固体材料片であるため、干渉層２０４よりも高い屈折率を有する材料を選択することが容易である。逆に、光ファイバは、典型的には、屈折率が低い別の誘電体材料（「クラッディング」とも呼ばれる）によって囲まれ、その屈折率を操作することを困難にする、誘電体材料（「コア材料」とも呼ばれる）を有する円形断面誘電体導波路である。
【0036】
動作中、光源によって放出される入射光信号２１０は、モノリシック基材２０２を通してバイオ層に向かって運ばれる。プローブ２００内で、光は、第１の反射面で反射され、第１の反射光信号２１２をもたらす。光はまた、第２の反射面で反射され、第２の反射光信号２１４をもたらす。第２の反射面は、最初に、分析物結合分子２０６とプローブ２００が浸漬される試料との間の界面に対応する。結合が生化学試験の間に生じると、第２の反射面は、分析物分子２０８と試料との間の界面となる。
【0037】
第１および第２の反射光信号２１２、２１４は、図４Ａに示されるように、スペクトル干渉パターンを形成する。分析物分子２０８が干渉層２０４の遠位表面上の分析物結合分子２０６に結合するとき、第２の反射光信号２１４の光路は長くなる。その結果、図４Ｂに示すように、スペクトル干渉パターンがＴ０からＴ１に移行する。位相シフトをリアルタイムで連続的に測定することにより、シフト量対時間として、運動学的結合曲線をプロットすることができる。干渉層２０４の遠位表面に固定された分析物結合分子に対する分析物分子の関連付け速度は、試料中の分析物濃度を計算するために使用され得る。したがって、位相シフトの尺度は、薄膜干渉計の検出原理である。
【0038】
図４Ａを参照すると、薄膜干渉計の性能は、交流（ＡＣ）成分を最大化し、直流（ＤＣ）オフセットを最小化することによって改善され得る。別の言い方をすれば、ＡＣ成分が対象の信号を表し、ＤＣオフセットがノイズを表すので、ＡＣ対ＤＣ比を増加させることによって、薄膜干渉計の性能を改善することができる。これらの目的を達成するために、（１）入射光信号２１０および反射光信号２１２、２１４がプローブ２００を通って移動する効率を高めることができ、（２）光源とプローブ２００との間の結合効率を高めることができ、および／または（３）分光計とプローブ２００との間の結合効率を高めることができる。
【0039】
干渉層２０４およびバイオ層の屈折率を実質的に一致させることは、すなわち、プローブ２００内の他の表面（例えば、干渉層２０４と分析物結合分子２０６との間の界面）からの反射を可能な限り低減することによって、これらの目標の第１の目的を達成する。干渉層２０４の屈折率がバイオ層の屈折率に近づくに場合（例えば、干渉層２０４については１．３８、バイオ層については１．３６）、バイオ層が構築されるのにつれてスペクトル干渉パターンのシフトが増加する。これは、Ｔ０とＴ１との間のデルタが、干渉層２０４および周囲材料（例えば、試料）の屈折率の差に基づいているためである。しかしながら、干渉層２０４の屈折率が小さくなるにつれて、Ｔ０、Ｔ１の大きさも小さくなる。スペクトル干渉パターンには、マグニチュードとシフトとの間のトレードオフがある。高いレベルでは、目標は、２つのピークをできるだけ分離させながら識別することができるように、十分に大きい大きさを有することである。一実施例として、干渉層２０４の屈折率を低下させると、より多くのシフトがもたらされるが、より小さなＡＣ対ＤＣ比がもたらされる（すなわち、より大きなＤＣ成分および／またはより小さなＡＣ成分により、信号が「ノイズが多い」結果になる）。
【0040】
一部の実施形態では、反射層（図示せず）は、反射層がモノリシック基材２０２と干渉層２０４との間に位置付けられるように、モノリシック基材２０２の遠位端に沿って堆積される。その主な目的が、第１の反射光信号２１２がモノリシック基材２０２と干渉層２０４との間の界面で反射することを確実にすることであるため、反射層は、モノリシック基材２０２または干渉層２０４のいずれかよりも高い屈折率を有する材料を含み得る。例えば、反射層は、２．３～２．４の屈折率を有する硫化亜鉛（ＺｎＳ）、２．３～２．４の屈折率を有する二酸化チタン（ＴｉＯ２）、２．２～２．３の屈折率を有する一酸化チタン（ＴｉＯ）、１．９～２．３の屈折率を有する三酸化チタン（Ｔｉ２Ｏ３）、２．２～２．３の屈折率を有する酸化チタン（Ｔｉ３Ｏ５）、２１６の屈折率を有する酸化タンタル（Ｔａ２Ｏ３）、２．１６の屈折率を有する五酸化タンタル（Ｔｉ３Ｏ５）、１．８～１．９の屈折率を有する一酸化ケイ素（ＳｉＯ）、１．６７の屈折率を有するセスキオキシドアルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）、１．９７～２．０５の屈折率を有する二酸化ジルコニウム（ＺｒＯ２）、２．０１の屈折率を有する一酸化亜鉛（ＺｎＯ）、２．１の屈折率を有する三酸化チタンランタン（ＬａＴｉＯ３）、１．８の屈折率を有する酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）、２．１～２．３の屈折率を有する五酸化ニオブ（Ｎｂ２Ｏ５）、２．５８の屈折率を有するセレン化亜鉛（ＺｎＳｅ）、２．３５の屈折率を有する二酸化セリウム（ＣｅＯ２）、１．８７の屈折率を有する酸化イットリウム（Ｙ２Ｏ３）、１．９５の屈折率を有する酸化ハフニウム（ＨｆＯ２）、または１．８の屈折率を有する酸化ガドリニウム（Ｇｄ２Ｏ３）を含み得る。反射層は、干渉層２０４と比較して非常に薄くてもよい。例えば、反射層は、約３～１０ｎｍの厚さを有し得る。
【0041】
図３は、様々な実施形態によるプローブ３００の別の実施例を示している。図３のプローブ３００は、図２のプローブ２００と実質的に同様であり得る。しかしながら、本明細書では、プローブ３００は、モノリシック基材３０２に固定された干渉層３０４の遠位表面に沿って堆積された接着層３１０を含む。接着層３１０は、分析物結合分子３０６の接着を促進する材料を含み得る。そのような材料の一例は、二酸化ケイ素である。接着層３１０は、一般に、干渉層３０４と比較して非常に薄く、したがって、バイオ層に向かって移動する、またはそこから戻る光に対するその影響は最小限である。例えば、接着層３１０は、約３～１０ｎｍの厚さを有し得、一方で、干渉層３０４は、約８００～１，０００ｎｍの厚さを有し得る。分析物結合分子３０６および分析物分子３０８によって形成されたバイオ層は、通常、数ｎｍの厚さを有する。図２のプローブ２００と非常によく似ているが、図３のプローブ３００はまた、反射層がモノリシック基材３０２と干渉層３０４との間に位置付けられるように、モノリシック基材３０２の遠位端に沿って堆積された反射層（図示せず）を有してもよい。反射層の厚さは、接着層３１０の厚さとほぼ同じであり得る。
【0042】
上述のように、これらの特徴は、他の形態を有する感知表面にも同様に適用可能である。そのような感知表面の一例は、平面表面を有するスライド（「チップ」とも呼ばれる）であり、生化学試験の過程で平面表面上に溶液を流すことによって、その上にバイオ層が形成される。平面表面のいくつかの実施例を、図５および図６を参照して以下で考察する。
【0043】
図５は、様々な実施形態によるスライド５００の実施例を示している。スライド５００は、干渉層５０４が堆積される基材５０２を含む。一部の実施形態では、干渉層５０４は、基材５０２の上面全体に沿って堆積され、一方で、他の実施形態では、干渉層５０４は、基材５０２の上面の一部分に沿って堆積される。例えば、干渉層５０４は、基材５０２の上面内に形成されたチャネルまたはウェル内に堆積されてもよい。上記で考察されたように、図２および図３のモノリシック基材２０２、３０２は、一般に、幅よりもはるかに大きい高さである。ここで、しかしながら、その逆が当てはまる場合がある。実際、基材５０２の幅は、長さよりも、５、７．５、１０、または２０倍大きくてもよい。実施例として、基材は、約１ｍｍの高さ／厚さで、約７５×２６ｍｍであってもよい。
【0044】
診断試験の過程で、分析物分子５０８は、干渉層５０４の上面に沿って固定された分析物結合分子５０６に結合して、バイオ層を形成することができる。バイオ層の厚さを確立するために、図５に示されるように、スライド５００の上面に光を照射することができる。より具体的には、光源によって放出される入射光信号５１０は、スライド５００の上面に沿って形成されたバイオ層で示され得る。これは、入射光信号５１０が周囲媒体５１６を通って移動することを必要とし得、周囲媒体５１６は、真空、空気、または溶液であり得る。入射光信号５１０は、第１の反射面で反射され、第１の反射光信号５１２をもたらす。第１の反射面は、バイオ層と周囲媒体５１６との間の界面を表し得る。入射光信号５１０はまた、第２の反射面で反射され、第２の反射光信号５１４をもたらす。第２の反射面は、干渉層５０４と基材５０２との間の界面を表し得る。上述のように、第１および第２の反射光信号５１２、５１４は、バイオ層の厚さを確立するために分析され得る、スペクトル干渉パターンを形成する。入射光信号５１０は基材５０２を介して運ばれないため、基材５０２は、透明であってもよく、または透明でなくてもよい（例えば、不透明であってもよい）ことに留意されたい。
【0045】
図６は、様々な実施形態によるスライド６００の別の実施例を示している。図６のスライド６００は、図５のスライド５００とほぼ同様であり得る。したがって、スライド６００は、干渉層６０４および分析物結合分子６０６が堆積される基材６０２を含んでもよい。診断試験の過程で、分析物分子６０８は、分析物結合分子６０６に結合して、バイオ層を形成することができる。
【0046】
ここで、しかしながら、入射光信号６１０は、スライド６００の下面に示されている。動作中、入射光信号６１０は、基材６０２を通してバイオ層に向かって運ばれる。スライド６００内で、光は、第１の反射面で反射され、第１の反射光信号６１２をもたらす。第１の反射面は、干渉層６０４と基材６０２との間の界面を表し得る。光はまた、第２の反射面で反射され、第２の反射光信号６１４をもたらす。第２の反射面は、バイオレイヤと周囲媒体６１６との間の界面を表し得る。上述のように、第１および第２の反射光信号６１２、６１４は、バイオ層の厚さを確立するために分析され得る、スペクトル干渉パターンを形成する。
【0047】
図５および図６には示されていないが、スライド５００、６００は、基材５０２、６０２と干渉層５０４、６０４との間に配置され、その界面に沿った反射率を向上させる反射層、および／または分析物結合分子５０６、６０６を固定するために干渉層５０４、６０４の上面に沿って配置された接着層を含むことができる。
【0048】
図７は、干渉センサを製造するためのプロセス７００のフロー図を示している。最初に、製造業者は、モノリシック基材を取得する（ステップ７０１）。例えば、製造業者は、異なる生化学試験、分析物結合分子などのために設計された複数のモノリシック基材の中からモノリシック基材を選択してもよい。モノリシック基材の好ましい屈折率は、１．５、１．８、または２．０よりも高くてもよい。したがって、製造業者によって取得されたモノリシック基材は、ガラス（２．０の屈折率）などの高屈折率材料、または石英（１．４６の屈折率）もしくはプラスチック（１．３２～１．４９の屈折率）などの低屈折率材料を含み得る。上述のように、一部の実施形態では、モノリシック基材は、柱状形態（例えば、図２および図３のモノリシック基材２０２、３０２）を有し、一方で、他の実施形態では、モノリシック基材は、平面形態（例えば、図５および図６のモノリシック基材５０２、６０２）を有する。
【0049】
次いで、製造業者は、モノリシック基材の表面上に透明材料を堆積させて、干渉層を形成することができる（ステップ７０２）。例えば、透明材料は、ナノメートル（例えば、単層）の分率から数マイクロメートルの厚さの範囲の薄膜の形態で、モノリシック基材の遠位表面上に堆積されてもよい。通常、干渉層は、少なくとも５００ｎｍ、７００ｎｍ、または９００ｎｍの厚さを有する。例示的な厚さは、５００～５，０００ｎｍ（および好ましくは、８００～１，２００ｎｍ）である。
【0050】
一部の実施形態では、製造業者は、別の透明材料を干渉層の表面上に堆積させて、接着層を形成する（ステップ７０３）。接着層は、分析物結合分子の接着を促進する材料を含み得る。そのような材料の一例は、二酸化ケイ素である。接着層は、一般に、干渉層と比較して非常に薄いため、干渉センサに沿って移動する光に対するその影響は最小限である。例えば、接着層は、約３～１０ｎｍの厚さを有し得る。
【0051】
その後、製造業者は、分析物結合分子を接着層の表面に固定することができる（ステップ７０４）。上述のように、分析物結合分子の層は、干渉センサの表面（例えば、プローブの遠位端、または平面チップの遠位表面）が濃密にコーティングされている条件下で形成され得る。これにより、生化学試験の過程で分析物分子が分析物結合分子に結合すると、これらの結合事象が、分析物結合分子の層を充填するのではなく、バイオ層の厚さに変化をもたらすことが確実になる。分析物結合分子の層は、単層または多層マトリックスであり得る。
【0052】
物理的可能性に反しない限り、上述のステップは、様々な順序および組み合わせで実施され得ることが想定される。例えば、製造業者は、干渉層の遠位表面に沿って接着層を作成しないことを選択してもよい。そのような実施形態では、分析物結合分子は、干渉層の遠位表面に直接的に固定され得る。
【0053】
追加のステップがまた、実施され得る。例えば、製造業者は、モノリシック基材の表面上に反射層を形成してもよい。上述したように、反射層は、モノリシック基材および干渉層よりも高い屈折率を有する透明材料を含み得る。その位置のため、この透明材料は、干渉層が形成される前（すなわち、ステップ７０２が実施される前）に、モノリシック基材の表面上に堆積され得る。別の実施例として、製造業者は、接着層を形成する前に、（例えば、熱、空気、放射線などを使用して）干渉層を硬化させてもよい。同様に、製造業者は、（ｉ）接着層を反射層に固定する前に反射層を硬化させ得、および／または（ｉｉ）分析物結合分子を接着層に固定する前に接着層を硬化させ得る。別の実施例として、製造業者は、モノリシック基材の反対側の端部で互いに実質的に平行に配設されたモノリシック基材の第１および第２の表面を研磨してもよい。研磨は、モノリシック基材への干渉層の接着性を改善するために実施され得る。
【0054】
図８Ａは、様々な実施形態によるプローブ８００の側面図を含む。図８Ｂは、プローブ８００の底面斜視図を含み、一方で、図８Ｃは、プローブ８００の上面斜視図を含む。プローブ８００は、ロッドセクション８０２（「ロッド構成要素」とも呼ばれる）および可撓性支持構成要素８０４（「可撓性スカート」とも呼ばれる）を含む。可撓性支持構成要素８０４は、ロッドセクション８０２の第１の部分が可撓性支持構成要素８０４の上側から延在し、ロッドセクション８０２の第２の部分が可撓性支持構成要素８０４の下側から延在するように、ロッドセクション８０２の長さに沿って中央に位置され得る。したがって、可撓性支持構成要素８０４は、ロッドセクション８０２の中央部分に位置されてもよい。
【0055】
ロッドセクション８０２は、図２のモノリシック基材２０２などのモノリシック基材であってもよい。ロッドセクション８０２は、少なくとも３ｍｍ、５ｍｍ、１０ｍｍ、または１５ｍｍの長さを有し得る。ロッドセクション８０２の第１および第２の部分は、異なるサイズであってもよいことに留意されたい。例えば、可撓性支持構成要素８０４の上側から延在しているロッドセクション８０２の第１の部分は、２～５ｍｍであってもよく、一方で、可撓性支持構成要素８０４の下側から延在しているロッドセクション８０２の第２の部分は、５～１０ｍｍであってもよい。
【0056】
可撓性支持構成要素８０４は、フランジセクション８０６およびスリーブセクション８０８を含むことができる。一部の実施形態では、フランジセクション８０６およびスリーブセクション８０８は、各構成要素の製造後に互いに連結される。他の実施形態では、フランジセクション８０６およびスリーブセクション８０８は、成形プロセス、押出プロセスなどを介して形成される単一の構成要素の一部である。可撓性支持構成要素８０４は、シリコーンゴム、ニトリルゴム、またはいくつかの他のエラストマーを部分的または全体的に含むことができる。例えば、一部の実施形態では、可撓性支持構成要素８０４全体が、可撓性材料を含み、一方で、他の実施形態では、フランジセクション８０６のみが可撓性材料を含む。
【0057】
図８Ｂに示されるように、可撓性支持構成要素８０４の下側は、内側凹面８１６によって画定される窪み８１０を含むことができる。窪み８１０内に位置する内側延長特徴部８１８は、ロッドセクション８０２の周りに固定されてもよい。内側延長特徴部８１８を含む実施形態では、窪み８１０は、ロッドセクション８０２の周りに半径方向に延在している環状窪みの形態をとることができる。
【0058】
上述したように、ロッドセクション８０２の遠位端８１２（「底端」とも呼ばれる）は、その上に固定された干渉層を有し得、分析物結合分子は、干渉層上にコーティングされ得る。生化学試験の過程で、バイオ層は、分析物結合分子に結合する試料中の分析物分子として形成されることになる。光がプローブ８００の近位端８１４に照射されるとき、干渉層の近位表面は、第１の反射面として作用し得、バイオ層は、第２の反射面として作用し得る。
【0059】
プローブ８００がウェルに装填される場合、圧力が、可撓性支持構成要素８０４のフランジセクション８０６の底面に対してウェルの上面によって加えられる。このような圧力により、ロッドセクション８０２の遠位端８１２がウェル内に懸架される。フランジセクション８０６は、ウェルに装填されたときに、ロッドセクション８０２の遠位端８１２がウェルの内面に接触することを防ぐように設計され得る。ウェルは、直線形式で配設された複数のウェルを含むカートリッジ、またはグリッド形式で配設された複数のウェルを含むマイクロプレートに含まれ得る。
【0060】
備考
本技術の様々な実施形態の前述の説明は、例証および説明の目的で提供されている。包括的であること、または特許請求された主題を開示された正確な形態に限定することは意図されない。
本技術の様々な実施形態の前述の説明は、例証および説明の目的で提供されている。包括的であること、または特許請求された主題を開示された正確な形態に限定することは意図されない。
【0061】
多くの修正および変形は、当業者に明らかであろう。実施形態は、本技術の原理およびその実際の用途を最もよく説明するために選択および説明され、それにより、関連する当業者は、特許請求の範囲の主題、様々な実施形態、および企図される特定の用途に適した様々な修正を理解することができる。
【実施例】
【0062】
本発明は、範囲内で本発明をそれらに記載される特定の手順に限定するものとして解釈されるべきではない以下の実施例によってさらに説明される。
【0063】
実施例１．従来のプローブ（ＳｉＯ２プローブ）の調製
従来のプローブを図１Ｂに示す。長さ２０ｍｍ、直径１ｍｍの石英（屈折率１．４６）ロッドの両端を、光学研磨機を使用して鏡面に研磨した。ロッドを洗浄し、精製水中で洗った後、それらを固定装置内に配列し、次に、イオンビーム補助物理蒸着（ＰＶＤ）機械に装填した。ＰＶＤ機械では、電子ビームを使用して、表面上にコーティングされるターゲット材料に衝撃を与えて、ターゲット材料を気化させ、次いで、イオンビームを適用して、表面上に蒸気を堆積させ、薄膜層を形成する。これらの石英ロッドを最初に２０ｎｍのＴａ２Ｏ５層でコーティングし、続いて７３０ｎｍのＳｉＯ２層でコーティングした。表面をＴａ２Ｏ５／ＳｉＯ２層でコーティングした後、ロッドを化学気相蒸着（ＣＶＤ）機械（例えば、イールドエンジニアリング製のＬａｂ Ｋｏｔｅ）内に配置し、アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）の薄層をコーティングした。ＡＰＳ層は、典型的には、厚さ１～２ｎｍである。ＡＰＳは、タンパク質固定を可能にするために堆積される。ＡＰＳは、疎水性相互作用およびイオン性相互作用の組み合わせによって、タンパク質をプローブの表面に吸着させる。タンパク質はまた、架橋試薬を使用した共有結合によってＡＰＳのアミノ基に結合され得る。ＡＰＳは、単層のみであり、したがって、約７ｎｍ厚であり得る。
従来のプローブを図１Ｂに示す。長さ２０ｍｍ、直径１ｍｍの石英（屈折率１．４６）ロッドの両端を、光学研磨機を使用して鏡面に研磨した。ロッドを洗浄し、精製水中で洗った後、それらを固定装置内に配列し、次に、イオンビーム補助物理蒸着（ＰＶＤ）機械に装填した。ＰＶＤ機械では、電子ビームを使用して、表面上にコーティングされるターゲット材料に衝撃を与えて、ターゲット材料を気化させ、次いで、イオンビームを適用して、表面上に蒸気を堆積させ、薄膜層を形成する。これらの石英ロッドを最初に２０ｎｍのＴａ２Ｏ５層でコーティングし、続いて７３０ｎｍのＳｉＯ２層でコーティングした。表面をＴａ２Ｏ５／ＳｉＯ２層でコーティングした後、ロッドを化学気相蒸着（ＣＶＤ）機械（例えば、イールドエンジニアリング製のＬａｂ Ｋｏｔｅ）内に配置し、アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）の薄層をコーティングした。ＡＰＳ層は、典型的には、厚さ１～２ｎｍである。ＡＰＳは、タンパク質固定を可能にするために堆積される。ＡＰＳは、疎水性相互作用およびイオン性相互作用の組み合わせによって、タンパク質をプローブの表面に吸着させる。タンパク質はまた、架橋試薬を使用した共有結合によってＡＰＳのアミノ基に結合され得る。ＡＰＳは、単層のみであり、したがって、約７ｎｍ厚であり得る。
【0064】
実施例２Ａ．本発明の一実施形態のプローブの調製（図３）
本発明のプローブの実施例を図３に示す。プローブは、「ＭｇＦ２プローブ」または「ＭｇＦ２－ＡＰＳプローブ」と呼ばれてもよい。長さ２０ｍｍ、直径１ｍｍのガラス（屈折率２．０）ロッドの両端を、光学研磨機を使用して鏡面に研磨した。ロッドを洗浄し、精製水中で洗った後、それらを固定装置内に配列し、次に、イオンビーム補助物理蒸着（ＰＶＤ）機械に装填した。ＰＶＤ機械では、電子ビームを使用して、表面上にコーティングされるターゲット材料に衝撃を与えて、ターゲット材料を気化させ、次いで、イオンビームを適用して、表面上に蒸気を堆積させ、薄膜層を形成する。ガラスロッドを最初に９４０ｎｍのＭｇＦ２層でコーティングし、続いて５ｎｍのＳｉＯ２層でコーティングした。表面をＭｇＦ２／ＳｉＯ２層でコーティングした後、ロッドを化学気相蒸着（ＣＶＤ）機械内に配置し、典型的には１～２ｎｍの厚さであるＡＰＳの薄層をコーティングした。
本発明のプローブの実施例を図３に示す。プローブは、「ＭｇＦ２プローブ」または「ＭｇＦ２－ＡＰＳプローブ」と呼ばれてもよい。長さ２０ｍｍ、直径１ｍｍのガラス（屈折率２．０）ロッドの両端を、光学研磨機を使用して鏡面に研磨した。ロッドを洗浄し、精製水中で洗った後、それらを固定装置内に配列し、次に、イオンビーム補助物理蒸着（ＰＶＤ）機械に装填した。ＰＶＤ機械では、電子ビームを使用して、表面上にコーティングされるターゲット材料に衝撃を与えて、ターゲット材料を気化させ、次いで、イオンビームを適用して、表面上に蒸気を堆積させ、薄膜層を形成する。ガラスロッドを最初に９４０ｎｍのＭｇＦ２層でコーティングし、続いて５ｎｍのＳｉＯ２層でコーティングした。表面をＭｇＦ２／ＳｉＯ２層でコーティングした後、ロッドを化学気相蒸着（ＣＶＤ）機械内に配置し、典型的には１～２ｎｍの厚さであるＡＰＳの薄層をコーティングした。
【0065】
実施例２Ｂ．本発明の別の実施形態のプローブの調製（図２）
本発明のプローブの別の実施例を図２に示す。プローブは、「ＭｇＦ２プローブ」または「ＭｇＦ２－ＡＰＳプローブ」と呼ばれてもよい。長さ２０ｍｍ、直径１ｍｍのガラス（屈折率２．０）ロッドの両端を、光学研磨機を使用して鏡面に研磨した。ロッドを洗浄し、精製水中で洗った後、それらを固定装置内に配列し、次に、イオンビーム補助物理蒸着（ＰＶＤ）機械に装填した。ＰＶＤ機械では、電子ビームを使用して、表面上にコーティングされるターゲット材料に衝撃を与えて、ターゲット材料を気化させ、次いで、イオンビームを適用して、表面上に蒸気を堆積させ、薄膜層を形成する。ガラスロッドを、ＳｉＯ２層の薄層なしで、９４０ｎｍのＭｇＦ２の単層でコーティングした。表面をＭｇＦ２層でコーティングした後、ロッドを化学気相蒸着（ＣＶＤ）機械内に配置し、典型的には１～２ｎｍの厚さであるＡＰＳの薄層をコーティングした。
本発明のプローブの別の実施例を図２に示す。プローブは、「ＭｇＦ２プローブ」または「ＭｇＦ２－ＡＰＳプローブ」と呼ばれてもよい。長さ２０ｍｍ、直径１ｍｍのガラス（屈折率２．０）ロッドの両端を、光学研磨機を使用して鏡面に研磨した。ロッドを洗浄し、精製水中で洗った後、それらを固定装置内に配列し、次に、イオンビーム補助物理蒸着（ＰＶＤ）機械に装填した。ＰＶＤ機械では、電子ビームを使用して、表面上にコーティングされるターゲット材料に衝撃を与えて、ターゲット材料を気化させ、次いで、イオンビームを適用して、表面上に蒸気を堆積させ、薄膜層を形成する。ガラスロッドを、ＳｉＯ２層の薄層なしで、９４０ｎｍのＭｇＦ２の単層でコーティングした。表面をＭｇＦ２層でコーティングした後、ロッドを化学気相蒸着（ＣＶＤ）機械内に配置し、典型的には１～２ｎｍの厚さであるＡＰＳの薄層をコーティングした。
【0066】
実施例３．ＭｇＦ２プローブと従来のプローブのタンパク質Ａ結合の比較
並行比較研究のために、従来のＡＰＳプローブ（実施例１）およびＭｇＦ２－ＡＰＳプローブ（実施例２Ａ）を、結合試験のためにタンパク質Ａで固定化した。
並行比較研究のために、従来のＡＰＳプローブ（実施例１）およびＭｇＦ２－ＡＰＳプローブ（実施例２Ａ）を、結合試験のためにタンパク質Ａで固定化した。
【0067】
表１に示すように、２つのタイプのプローブに、９６ウェルプレートにおいて３つのステップを行った。
【表1】
【0068】
実験は、Ｐｒｏｂｅ Ｌｉｆｅ社のＧａｔｏｒ干渉計器具とソフトウェアバージョン１．３を使用して行った。結果を図９に示し、表２に要約する。図９は、チャネル（ＣＨ）１～４に割り当てられた従来のプローブ（すなわち、下の４つの曲線）およびＣＨ５～８に割り当てられたＭｇＦ２プローブ（すなわち、上の４つの曲線）を有する、ＡＰＳプローブにおけるタンパク質Ａの結合曲線（ｎｍにおけるシフトを伴う）を示している。
【表2】
【0069】
結果は、ＭｇＦ２－ＡＰＳプローブが、ｎｍにおける波長シフトの上限によって示されるように、従来のプローブと比較して２．２４倍以上の結合信号（ｎｍシフト）を得たことを示している。
【0070】
実施例４．ＭｇＦ２プローブと従来のプローブのＩｇＧ／タンパク質Ａ結合の比較
タンパク質Ａは、５つのＩｇ結合ドメインを有し、Ｆｃ領域内、およびまたヒトＶＨ３ファミリーの場合、Ｆａｂ領域内の重鎖に結合するため、我々は、プローブ表面上のヒトＩｇＧ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ ＳＬＨ５６）およびタンパク質Ａを繰り返し固定して、ｎｍシフトの上限を試験することができた。
タンパク質Ａは、５つのＩｇ結合ドメインを有し、Ｆｃ領域内、およびまたヒトＶＨ３ファミリーの場合、Ｆａｂ領域内の重鎖に結合するため、我々は、プローブ表面上のヒトＩｇＧ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ ＳＬＨ５６）およびタンパク質Ａを繰り返し固定して、ｎｍシフトの上限を試験することができた。
【0071】
２つのＡＰＳプローブ（従来のプローブ、実施例１、およびＭｇＦ２プローブ、実施例２Ａ）は、９６ウェルプレート中で５０回、工程１～４を周期的に実行した。
１．Ｋ緩衝液（ＰＢＳ、０．０２％ ＢＳＡ、０．００２％ Ｔｗｅｅｎ－２０、２００μＬ）を１０００ｒｐｍ下で１０秒間
２．Ｋ緩衝液（２００μＬ）中の２μｇ／ｍＬのヒト全ＩｇＧを、１０００ｒｐｍ下で６０秒間
３．Ｋ緩衝液（２００μＬ）を１０００ｒｐｍ下で１０秒間
４．Ｋ緩衝液（２００μＬ）中の１０μｇ／ｍＬのタンパク質Ａを、１０００ｒｐｍ下で６０秒間
１．Ｋ緩衝液（ＰＢＳ、０．０２％ ＢＳＡ、０．００２％ Ｔｗｅｅｎ－２０、２００μＬ）を１０００ｒｐｍ下で１０秒間
２．Ｋ緩衝液（２００μＬ）中の２μｇ／ｍＬのヒト全ＩｇＧを、１０００ｒｐｍ下で６０秒間
３．Ｋ緩衝液（２００μＬ）を１０００ｒｐｍ下で１０秒間
４．Ｋ緩衝液（２００μＬ）中の１０μｇ／ｍＬのタンパク質Ａを、１０００ｒｐｍ下で６０秒間
【0072】
実験は、Ｐｒｏｂｅ Ｌｉｆｅ社のＧａｔｏｒ器具およびソフトウェアバージョン１．３を使用して行った。結果を図１０に示す。特に、図１０は、ＣＨ１～４に割り当てられた従来のプローブ（すなわち、下の４つの曲線）およびＣＨ５～８に割り当てられたＭｇＦ２プローブ（すなわち、上の４つの曲線）を有する、タンパク質ＡプローブにおけるヒトＩｇＧの結合曲線を示している。
【0073】
図１０の結果は、ＭｇＦ２プローブが、負のシフトに変わることなく、１２０ｎｍの波長シフトに達したのに対し、従来のプローブが、負のｎｍシフトを示すようになる前に、７ｎｍの波長シフトに達しただけであることを示している。信号（ｎｍシフト）は、ＭｇＦ２プローブでは従来のプローブよりもはるかに高かった。
【0074】
実施例５．ＭｇＦ２プローブと従来のプローブのタンパク質結合および再生の比較
抗マウスＦｃでコーティングしたプローブの調製
２つのＡＰＳプローブ（実施例１および２Ａ）を、１０００ｒｐｍで１０分間、９６ウェルプレートにおけるＰＢＳ緩衝液中の５０μｇ／ｍＬのストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，２１１２２）に浸すことによって、ストレプトアビジンでコーティングしたプローブを作製した。
抗マウスＦｃでコーティングしたプローブの調製
２つのＡＰＳプローブ（実施例１および２Ａ）を、１０００ｒｐｍで１０分間、９６ウェルプレートにおけるＰＢＳ緩衝液中の５０μｇ／ｍＬのストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，２１１２２）に浸すことによって、ストレプトアビジンでコーティングしたプローブを作製した。
【0075】
親和性に精製されたヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ－γ断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ－Ｉｍｍｕｎｏ，１１５－００５－０７１）を実験に使用した。この抗マウスＦｃは、ヒト、ウシおよびウマの血清タンパク質に対する交差反応が最小限である。抗マウスＩｇＧを、ＥＺ－リンクＮＨＳ－ＰＥＧ４－ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ａ３９２５９）で標準プロトコルを用いてビオチン化した。ビオチン化抗体をＫ緩衝液（Ｐｒｏｂｅ Ｌｉｆｅ，１２００１１）に希釈した。ストレプトアビジンでコーティングしたプローブを、０．５ｍｇ／ｍＬのビオチン－抗マウス－Ｆｃ中に１０分間浸漬し、Ｋ緩衝液中で３０秒間洗浄して、プローブの表面上の任意の非特異的な結合相互作用を除去した。
【0076】
アッセイ
抗マウスＦｃでコーティングした乾燥プローブをＱ緩衝液（ＰＢＳ＋０．２％ ＢＳＡ＋０．０２％ Ｔｗｅｅｎ－２０）に浸し、任意のアッセイの前に５分間水和した。
抗マウスＦｃでコーティングした乾燥プローブをＱ緩衝液（ＰＢＳ＋０．２％ ＢＳＡ＋０．０２％ Ｔｗｅｅｎ－２０）に浸し、任意のアッセイの前に５分間水和した。
【0077】
Ｑ緩衝液に溶解したマウスＩｇＧを用いて、０．５～２００μｇ／ｍｌの範囲のマウスＩｇＧ濃度を生成した。この濃度シリーズを使用して、従来のプローブとＭｇＦ２プローブを並行して試験し、結合容量、信号強度、および再生の観点から両方のプローブの性能を比較した。両方のプローブを再生するために、１５０ｍＭのＮａＣｌを有する１０ｍＭのグリシンｐＨ１．７５を再生溶液として使用した。
【0078】
実験は、Ｐｒｏｂｅ Ｌｉｆｅ社のＧａｔｏｒ器具（ＧＡ００７）およびそのソフトウェアバージョン１．３を使用して行った。試料ならびに再生溶液を、Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ（参照番号６５５２０９）からのマイクロプレート中で調製した。
【0079】
反応および再生プロトコルを表３に示す。再生は１０回繰り返される。
【表3】
【0080】
結果
従来のプローブとＭｇＦ２プローブの結合容量の並行比較を行い、結合強度、結合速度、および再生を理解した。結果を、表４および表５に要約する。
従来のプローブとＭｇＦ２プローブの結合容量の並行比較を行い、結合強度、結合速度、および再生を理解した。結果を、表４および表５に要約する。
【0081】
表４は、ＭｇＦ２プローブが、従来のプローブよりもはるかに高い信号（ｎｍ波長シフト）およびより速い結合速度を有することを示している。
【表4】
【0082】
表５は、１０ラウンドの再生後、ＭｇＦ２プローブが元の信号強度の５２％（３０μｇ／ｍＬのｍＩｇＧ）および４１％（３μｇ／ｍＬのｍＩｇＧ）を保持したのに対し、従来のプローブが元の信号強度の２９％（３０μｇ／ｍＬのｍＩｇＧ）および３０％（３μｇ／ｍＬのｍＩｇＧ）しか保持しなかったことを示している。
【表5】
【0083】
実施例６．ＭｇＦ２プローブと従来のプローブの小分子結合の比較
この実施例では、阻害剤の１つであるフロセミドへの酵素、炭酸アンヒドラーゼＩＩ（ＣＡＩＩ）の結合を、実施例２ＢのＭｇＦ２プローブで検出し、ＳｉＯ２光学層を有する従来のバイオ層干渉法（ＢＬＩ）センサと比較した。また、抗体である抗エストラジオールを、その抗原であるエストラジオールへの結合について試験した。フロセミドおよびエストラジオールは、それぞれ３３０および２７２ダルトンの分子量を有するため、小分子標識フリー検出のための優れたモデルである。
この実施例では、阻害剤の１つであるフロセミドへの酵素、炭酸アンヒドラーゼＩＩ（ＣＡＩＩ）の結合を、実施例２ＢのＭｇＦ２プローブで検出し、ＳｉＯ２光学層を有する従来のバイオ層干渉法（ＢＬＩ）センサと比較した。また、抗体である抗エストラジオールを、その抗原であるエストラジオールへの結合について試験した。フロセミドおよびエストラジオールは、それぞれ３３０および２７２ダルトンの分子量を有するため、小分子標識フリー検出のための優れたモデルである。
【0084】
材料の調製
ウシ炭酸アンヒドラーゼＩＩ（ＣＡＩＩ）およびヒト抗エストラジオール抗体のビオチン標識
ビオチン化反応には、ＣＡＩＩ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、抗エストラジオール（ＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ＮＨＳ－ＬＣ－ＬＣ－ビオチン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用した。標識反応の前に、材料のさらなる精製は行わなかった。ＣＡＩＩおよび抗フルオレセイン抗体を、１のモル結合比（ＭＣＲ）で標識化した。無水ＤＭＦを使用して、ＮＨＳ－ＬＣ－ＬＣ－ビオチンを溶解し、直ちにそれぞれのタンパク質に添加し、ボルテックスし、室温で１時間進行させた。標識反応の後、ビオチン化タンパク質をＰＤ－１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製した。
ウシ炭酸アンヒドラーゼＩＩ（ＣＡＩＩ）およびヒト抗エストラジオール抗体のビオチン標識
ビオチン化反応には、ＣＡＩＩ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、抗エストラジオール（ＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ＮＨＳ－ＬＣ－ＬＣ－ビオチン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用した。標識反応の前に、材料のさらなる精製は行わなかった。ＣＡＩＩおよび抗フルオレセイン抗体を、１のモル結合比（ＭＣＲ）で標識化した。無水ＤＭＦを使用して、ＮＨＳ－ＬＣ－ＬＣ－ビオチンを溶解し、直ちにそれぞれのタンパク質に添加し、ボルテックスし、室温で１時間進行させた。標識反応の後、ビオチン化タンパク質をＰＤ－１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製した。
【0085】
架橋ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）の調製
架橋されたＦＩＣＯＬＬ（登録商標）を調製する方法は、米国特許第８，３０９，３６９号に記載されている。２０ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ中に、ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）４００ｋＤ（Ｓｋｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）当たり８８個のアミンを含有するようにアミノ化された２ｍｌのＦＩＣＯＬＬ（登録商標）４００（Ｓｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈ）に、ＤＭＦにおける５０ｍｇ／ｍｌで１０μＬのＳＰＤＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、スクシンイミジル６－［３－［２－ピリジルジチオ］－プロピオナミド］ヘキサノエート）を加えた。ＳＰＤＰ対ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）分子結合比（ＭＣＲ）は、１５であった。混合物を室温で１時間反応させた後、透析を行った。チオールの組み込みは、標準的な方法によって、ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）４００ｋＤ当たり５．５であると推定された。
架橋されたＦＩＣＯＬＬ（登録商標）を調製する方法は、米国特許第８，３０９，３６９号に記載されている。２０ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ中に、ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）４００ｋＤ（Ｓｋｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）当たり８８個のアミンを含有するようにアミノ化された２ｍｌのＦＩＣＯＬＬ（登録商標）４００（Ｓｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈ）に、ＤＭＦにおける５０ｍｇ／ｍｌで１０μＬのＳＰＤＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、スクシンイミジル６－［３－［２－ピリジルジチオ］－プロピオナミド］ヘキサノエート）を加えた。ＳＰＤＰ対ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）分子結合比（ＭＣＲ）は、１５であった。混合物を室温で１時間反応させた後、透析を行った。チオールの組み込みは、標準的な方法によって、ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）４００ｋＤ当たり５．５であると推定された。
【0086】
ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）４００で標識したＳＰＤＰ上のチオールを脱保護するために、３８ｍｇ／ｍＬのＰＢＳで３０μＬのＤＴＴを、１ｍＬのＰＢＳ中で２０ｍｇに添加し、室温で２時間反応させた。ＳＨ－ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）をＰＤ１０カラム上で精製した。
【0087】
ＳＭＣＣを、アミノ化ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）４００（８８アミン／ＦＩＣＯＬＬ（登録商標））に、以下のように２つの調製物でリンクさせた。１．）１ｍｌのＰＢＳ中に１０ｍｇでアミノ化されたＦＩＣＯＬＬ（登録商標）４００を、３０のＳＭＣＣ／ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）ＭＣＲに対して１０ｍｇ／ｍＬのＤＭＦで２５μＬのＳＭＣＣと混合した。混合物を室温で２時間反応させ、続いてＰＤ１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で精製した。２．）１ｍＬのＰＢＳ中に１０ｍｇでアミノ化されたＦＩＣＯＬＬ（登録商標）４００を、１５のＳＭＣＣ／ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）ＭＣＲに対して１０ｍｇ／ｍＬのＤＭＦで１２．５ｕｌのＳＭＣＣと混合した。混合物を室温で２時間反応させ、続いてＰＤ１０カラム上で精製した。
【0088】
ＳＨ－ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）４００とＳＭＣＣ－ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）４００を架橋するために、以下の２つの調製物を作製した。１．）１ｍＬのＰＢＳ ＳＨ－ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）４００中の１０ｍｇを、１ｍＬのＰＢＳ ＳＭＣＣ－ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）４００（３０ＭＣＲ）中の１０ｍｇと混合した。２．）１ｍＬのＰＢＳ ＳＨ－ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）４００中の１０ｍｇを、１ｍＬのＰＢＳ ＳＭＣＣ－ＦＩＣＯＬ（登録商標）４００（１５ＭＣＲ）中の１０ｍｇと混合した。混合物を３０℃で一晩反応させた。
【0089】
ＳＨ－ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）４００とＳＭＣＣ－ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）４００を提供するために、以下の２つの調製物を作製した。１．）１ｍＬのＰＢＳ ＳＨ－ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）４００中の１０ｍｇを、３０ＭＣＲで１ｍＬのＰＢＳ ＳＭＣＣ－ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）４００中の１０ｍｇと混合した。２．）１ｍＬのＰＢＳ ＳＨ－ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）４００中の１０ｍｇを、１ｍＬのＰＢＳ ＳＭＣＣ－ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）４００（１５ＭＣＲ）中の１０ｍｇと混合した。混合物を３０℃で一晩反応させた。
【0090】
ストレプトアビジン架橋ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）コンジュゲートの合成
１ｍｇのＳＰＤＰ標識架橋ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）を、室温で１時間、５９２のＭＣＲで、ＰＢＳに溶解させた３８ｍｇ／ｍＬのＤＴＴ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、２０２９０）で脱保護した。８ｍｇのストレプトアビジン（ＳＡ）（Ｐｒｏｚｙｍｅ、ＳＡ１０）を、無水ＤＭＦに溶解させたスクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）で、室温で１時間、１のＭＣＲで標識化した。ＳＭＣＣ標識またはＤＴＴ脱保護反応の後、ストレプトアビジン（ＳＡ）または架橋ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）を、ＰＤ－１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７０８５１０１）を使用して精製した。精製した架橋ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）およびＳＡを５０ｍＬのチューブ内で混合し、カップリング反応を室温で一晩進行させた。翌日、ＰＢＳに溶解させた１２μＬの１６ｍｇ／ｍＬのＮ－エチルマレイミドを反応混合物に加え、室温で３０分間反応させ、未反応のシステインをキャップした。キャッピング反応の後、反応混合物を４Ｂ－ＣＬカラム上で精製した。
１ｍｇのＳＰＤＰ標識架橋ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）を、室温で１時間、５９２のＭＣＲで、ＰＢＳに溶解させた３８ｍｇ／ｍＬのＤＴＴ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、２０２９０）で脱保護した。８ｍｇのストレプトアビジン（ＳＡ）（Ｐｒｏｚｙｍｅ、ＳＡ１０）を、無水ＤＭＦに溶解させたスクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）で、室温で１時間、１のＭＣＲで標識化した。ＳＭＣＣ標識またはＤＴＴ脱保護反応の後、ストレプトアビジン（ＳＡ）または架橋ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）を、ＰＤ－１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７０８５１０１）を使用して精製した。精製した架橋ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）およびＳＡを５０ｍＬのチューブ内で混合し、カップリング反応を室温で一晩進行させた。翌日、ＰＢＳに溶解させた１２μＬの１６ｍｇ／ｍＬのＮ－エチルマレイミドを反応混合物に加え、室温で３０分間反応させ、未反応のシステインをキャップした。キャッピング反応の後、反応混合物を４Ｂ－ＣＬカラム上で精製した。
【0091】
ストレプトアビジン架橋ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）によるＭｇＦ２プローブのコーティング
すべての揺動速度は１０００ｒｐｍであった。最初に、ＭｇＦ２プローブ（実施例２Ｂ）をエタノールで１２０秒間洗浄した。次に、プローブをＰＢＳで６０秒間洗浄した後、１００μｇ／ｍＬのストレプトアビジン架橋ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）で６００秒間コーティングした。長期保存のための防腐剤として、ＰＢＳ中の１５％のスクロースで６０秒間、プローブをコーティングする前に、各３０秒でさらに２回のＰＢＳ洗浄を行った。次いで、プローブを４０℃のオーブン中で２０分間乾燥させた。
すべての揺動速度は１０００ｒｐｍであった。最初に、ＭｇＦ２プローブ（実施例２Ｂ）をエタノールで１２０秒間洗浄した。次に、プローブをＰＢＳで６０秒間洗浄した後、１００μｇ／ｍＬのストレプトアビジン架橋ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）で６００秒間コーティングした。長期保存のための防腐剤として、ＰＢＳ中の１５％のスクロースで６０秒間、プローブをコーティングする前に、各３０秒でさらに２回のＰＢＳ洗浄を行った。次いで、プローブを４０℃のオーブン中で２０分間乾燥させた。
【0092】
ＭｇＦ２プローブ上のビオチン化ＣＡＩＩおよびビオチン化抗エストラジオールの装填
特に明記しない限り、すべての揺動速度は１０００ｒｐｍであった。最初に、プローブをＱ緩衝液中で１２０秒間平衡化した。次に、ビオチン化ＣＡＩＩまたはビオチン化抗エストラジオールを、１０μｇ／ｍＬで、４００ｒｐｍのオービタルシェーカー上で１８００秒間装填した。１ｍＭのビオシチンを、その後の二重参照実験のために参照プローブ（ＣＡＩＩを含有しないプローブ）上に装填した。６０秒間の最終洗浄を行った。
特に明記しない限り、すべての揺動速度は１０００ｒｐｍであった。最初に、プローブをＱ緩衝液中で１２０秒間平衡化した。次に、ビオチン化ＣＡＩＩまたはビオチン化抗エストラジオールを、１０μｇ／ｍＬで、４００ｒｐｍのオービタルシェーカー上で１８００秒間装填した。１ｍＭのビオシチンを、その後の二重参照実験のために参照プローブ（ＣＡＩＩを含有しないプローブ）上に装填した。６０秒間の最終洗浄を行った。
【0093】
ストレプトアビジンＳｉＯ２プローブ上のビオチン化ＣＡＩＩおよび抗エストラジオール抗体の装填
特に明記しない限り、すべての揺動速度は１０００ｒｐｍであった。最初に、オクテットＳＡプローブ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、１８－５０１９）をＱ緩衝液中で１２０秒間平衡化した。次に、ビオチン化ＣＡＩＩまたは抗エストラジオール抗体を、４００ｒｐｍで１８００秒間、１０ｕｇ／ｍＬで共に装填した。１ｍＭのビオシチンを、参照実験のために参照プローブ上に装填した。６０秒間の最終洗浄を行った。
特に明記しない限り、すべての揺動速度は１０００ｒｐｍであった。最初に、オクテットＳＡプローブ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、１８－５０１９）をＱ緩衝液中で１２０秒間平衡化した。次に、ビオチン化ＣＡＩＩまたは抗エストラジオール抗体を、４００ｒｐｍで１８００秒間、１０ｕｇ／ｍＬで共に装填した。１ｍＭのビオシチンを、参照実験のために参照プローブ上に装填した。６０秒間の最終洗浄を行った。
【0094】
アッセイプロトコルおよびデータ処理
ＭｇＦ２プローブアッセイ
すべての揺動速度は１０００ｒｐｍであった。アッセイおよびデータ収集は、３０℃でＧａｔｏｒＴＭ機器（ＧａｔｏｒＢｉｏ）上で実施された。フロセミド（Ａｃｒｏｓ ４４８９７００１０）を１０μＭで使用し、エストラジオール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、１２５０００８）を６．４ｎＭで使用した。ＣＡＩＩまたは抗エストラジオール抗体を装填したプローブを、結合ステップの開始前に、アッセイ緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％ ＤＭＳＯ）中で６００秒間予め湿潤させた。次に、アッセイ緩衝液中に６０秒のベースラインを確立し、続いて０．０５％のＤＭＳＯを有するＰＢＳ中のフロセミドまたはエストラジオールとの１８０秒の関連付けステップを確立した。参照実験では、次いで、第２のカラム上のビオシチン装填プローブをフロセミドに曝露した。
ＭｇＦ２プローブアッセイ
すべての揺動速度は１０００ｒｐｍであった。アッセイおよびデータ収集は、３０℃でＧａｔｏｒＴＭ機器（ＧａｔｏｒＢｉｏ）上で実施された。フロセミド（Ａｃｒｏｓ ４４８９７００１０）を１０μＭで使用し、エストラジオール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、１２５０００８）を６．４ｎＭで使用した。ＣＡＩＩまたは抗エストラジオール抗体を装填したプローブを、結合ステップの開始前に、アッセイ緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％ ＤＭＳＯ）中で６００秒間予め湿潤させた。次に、アッセイ緩衝液中に６０秒のベースラインを確立し、続いて０．０５％のＤＭＳＯを有するＰＢＳ中のフロセミドまたはエストラジオールとの１８０秒の関連付けステップを確立した。参照実験では、次いで、第２のカラム上のビオシチン装填プローブをフロセミドに曝露した。
【0095】
ＭｇＦ２プローブデータ処理
エストラジオールおよびフロセミド結合データを、参照ウェル減算オプションを使用して、Ｇａｔｏｒデータ分析バージョン１．７．２で処理した。Ｙ軸は、各ベースラインに対して合わせられ、最後の５０秒間平均化される。データから高周波ノイズを除去するために、Ｓａｖｉｔｚｋｙ－Ｇｏｌａｙフィルタリングを適用した。次いで、結合曲線データを計算し、ピコメートル（ｐｍ）で波長シフトとして示した。
エストラジオールおよびフロセミド結合データを、参照ウェル減算オプションを使用して、Ｇａｔｏｒデータ分析バージョン１．７．２で処理した。Ｙ軸は、各ベースラインに対して合わせられ、最後の５０秒間平均化される。データから高周波ノイズを除去するために、Ｓａｖｉｔｚｋｙ－Ｇｏｌａｙフィルタリングを適用した。次いで、結合曲線データを計算し、ピコメートル（ｐｍ）で波長シフトとして示した。
【0096】
従来のプローブ（ＳｉＯ２）アッセイ
すべての揺動速度は１０００ｒｐｍであった。アッセイおよびデータ収集を、３０℃でＯｃｔｅｔＲＥＤ機器（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）で行った。ＭｇＦ２プローブに関して上述されたものと同じアッセイプロトコルを使用した。
すべての揺動速度は１０００ｒｐｍであった。アッセイおよびデータ収集を、３０℃でＯｃｔｅｔＲＥＤ機器（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）で行った。ＭｇＦ２プローブに関して上述されたものと同じアッセイプロトコルを使用した。
【0097】
従来のプローブデータ処理
フロセミドデータを、参照減算オプションを使用して、Ｏｃｔｅｔデータ分析１０．０で処理した。参照オプションでは、フロセミド結合信号が、参照プローブを活性フロセミドプローブから減算することによって得られた。
フロセミドデータを、参照減算オプションを使用して、Ｏｃｔｅｔデータ分析１０．０で処理した。参照オプションでは、フロセミド結合信号が、参照プローブを活性フロセミドプローブから減算することによって得られた。
【0098】
エストラジオール結合データを、参照プローブ減算オプションを使用して処理した。このオプションでは、結合信号が、参照プローブを活性エストラジオールプローブから減算することによって得られた。
【0099】
両方の場合において、ｙ軸は、各ベースラインに対して合わせられ、１～５９秒平均化される。データから高周波ノイズを除去するために、Ｓａｖｉｔｚｋｙ－Ｇｏｌａｙフィルタリングを適用した。次いで、結合曲線データを計算し、ピコメートル（ｐｍ）で波長シフトとして示した。
【0100】
ＭｇＦ２プローブと従来のプローブの比較結果
表６は、ＭｇＦ２および従来のＳｉＯ２プローブとの炭酸アンヒドラーゼ／フロセミド結合の比較結果を示している。ＭｇＦ２プローブ上のＣＡＩＩに対する１０μＭのフロセミドの結合信号は、２１０．７ｐｍ（ピコメートル）であり、従来のＳｉＯ２プローブ上の１１．７ｐｍと比較して１８倍高かった。
表６は、ＭｇＦ２および従来のＳｉＯ２プローブとの炭酸アンヒドラーゼ／フロセミド結合の比較結果を示している。ＭｇＦ２プローブ上のＣＡＩＩに対する１０μＭのフロセミドの結合信号は、２１０．７ｐｍ（ピコメートル）であり、従来のＳｉＯ２プローブ上の１１．７ｐｍと比較して１８倍高かった。
【表6】
【0101】
表７は、ＭｇＦ２プローブおよび従来のＳｉＯ２プローブとの抗エストラジオール／エストラジオール結合の比較結果を示している。従来のＳｉＯ２プローブは、ごくわずかな結合信号（２ｐｍ）を生成し、一方で、ＭｇＦ２プローブは、９０．９ｐｍの有意な結合信号を生成した。
以下に、出願当初の特許請求の範囲に記載の事項を、そのまま、付記しておく。
［１］ 試料中の分析物を検出するための干渉センサであって、前記干渉センサが、
モノリシック基材の反対側の端部で互いに実質的に平行に配設された第１および第２の表面を有する、ガラスを含む、前記モノリシック基材と、
前記モノリシック基材の前記第２の表面上にコーティングされたフッ化マグネシウム（ＭｇＦ ２ ）を含む、干渉層と、
前記干渉層上にコーティングされた分析物結合分子の層と、を含み、
前記モノリシック基材と前記干渉層との間の第１の界面が、光が前記干渉センサ上に照射されるときに第１の反射面として機能し、
前記分析物結合分子に結合する試料中の分析物分子によって形成されたバイオ層と、前記試料を含有する溶液との間の第２の界面が、前記光が前記干渉センサ上に照射されるときに、第２の反射面として機能する、干渉センサ。
［２］ 前記モノリシック基材が、少なくとも５ミリメートル（ｍｍ）の長さを有し、前記モノリシック基材のアスペクト比が、少なくとも５～１である、［１］に記載の干渉センサ。
［３］ 前記干渉層が、少なくとも５００ナノメートル（ｎｍ）の厚さを有する、［１］に記載の干渉センサ。
［４］ 前記干渉層と前記分析物結合分子の層との間に位置付けられた二酸化ケイ素（ＳｉＯ ２ ）を含む、接着層をさらに含む、［１］に記載の干渉センサ。
［５］ 前記接着層が、１０ｎｍ未満の厚さを有する、［４］に記載の干渉センサ。
［６］ 干渉センサであって、
モノリシック基材の反対側の端部で互いに実質的に平行に配設された第１および第２の表面を有する、前記モノリシック基材と、
前記モノリシック基材の屈折率より少なくとも０．１小さい屈折率を有する、干渉層と、
生化学試験中に試料中の分析物分子が結合して、バイオ層を形成する、分析物結合分子の層と、を含み、
前記干渉層の前記屈折率が、前記バイオ層の前記屈折率の０．０５以内である、干渉センサ。
［７］ 前記干渉層の厚さが、５００～５，０００ｎｍである、［６］に記載の干渉センサ。
［８］ 前記干渉層の前記厚さが、８００～１，２００ｎｍである、［７］に記載の干渉センサ。
［９］ 前記モノリシック基材が、ガラスを含む、［６］に記載の干渉センサ。
［１０］ 前記干渉層が、フッ化マグネシウムを含む、［６］に記載の干渉センサ。
［１１］ 前記モノリシック基材の前記屈折率が、少なくとも１．８である、［６］に記載の干渉センサ。
［１２］ 前記分析物結合分子の層を前記干渉層に接続する、接着層をさらに含む、［６］に記載の干渉センサ。
［１３］ 前記接着層が、二酸化ケイ素を含み、前記接着層が、１０ｎｍ未満の厚さを有する、［１２］に記載の干渉センサ。
［１４］ 前記モノリシック基材が、柱状形態を有する、［６］に記載の干渉センサ。
［１５］ 前記モノリシック基材の中央部分に位置する可撓性支持構成要素であって、
前記モノリシック基材の第１の部分が、前記可撓性支持構成要素の上側から延在しており、
前記モノリシック基材の第２の部分が、前記可撓性支持構成要素の下側から延在している、可撓性支持構成要素をさらに含む、［１４］に記載の干渉センサ。
［１６］ 前記可撓性支持構成要素が、フランジおよび前記フランジの下方に位置するスリーブを含む、［１５］に記載の干渉センサ。
［１７］ 前記可撓性支持構成要素が、シリコーンゴムを含む、［１５］に記載の干渉センサ。
［１８］ 前記可撓性支持構成要素が、ウェルに装填されたときに前記干渉センサを支持するように構成されている、［１５］に記載の干渉センサ。
［１９］ 前記モノリシック基材と前記干渉層との間に相互接続された反射層であって、
前記反射層が、前記モノリシック基材の前記屈折率および前記干渉層の前記屈折率よりも高い屈折率を有する、反射層をさらに含む、［６］に記載の干渉センサ。
［２０］ ［１］に記載の干渉センサを製造するための方法であって、前記方法が、
モノリシック基材を取得することと、
前記モノリシック基材の反対側の端部で互いに実質的に平行に配設された前記モノリシック基材の第１および第２の表面を研磨することと、
フッ化マグネシウム（ＭｇＦ ２ ）を含む第１の透明材料を、前記モノリシック基材の前記第２の表面上に堆積して、干渉層を形成することと、
分析物結合分子を前記干渉層に結合することと、を含む、方法。
［２１］ 前記モノリシック基材が、ガラスを含む、［２０］に記載の方法。
［２２］ 前記干渉層が、少なくとも９００ｎｍの厚さを有する、［２０］に記載の方法。
［２３］ 第２の透明材料を前記干渉層上に堆積して、接着層を形成することであって、
前記分析物結合分子の層が、前記接着層に結合している、形成することをさらに含む、［２０］に記載の方法。
［２４］ 前記第２の透明材料が、二酸化ケイ素である、［２３］に記載の方法。
【表7】
［１］ 試料中の分析物を検出するための干渉センサであって、前記干渉センサが、
モノリシック基材の反対側の端部で互いに実質的に平行に配設された第１および第２の表面を有する、ガラスを含む、前記モノリシック基材と、
前記モノリシック基材の前記第２の表面上にコーティングされたフッ化マグネシウム（ＭｇＦ ２ ）を含む、干渉層と、
前記干渉層上にコーティングされた分析物結合分子の層と、を含み、
前記モノリシック基材と前記干渉層との間の第１の界面が、光が前記干渉センサ上に照射されるときに第１の反射面として機能し、
前記分析物結合分子に結合する試料中の分析物分子によって形成されたバイオ層と、前記試料を含有する溶液との間の第２の界面が、前記光が前記干渉センサ上に照射されるときに、第２の反射面として機能する、干渉センサ。
［２］ 前記モノリシック基材が、少なくとも５ミリメートル（ｍｍ）の長さを有し、前記モノリシック基材のアスペクト比が、少なくとも５～１である、［１］に記載の干渉センサ。
［３］ 前記干渉層が、少なくとも５００ナノメートル（ｎｍ）の厚さを有する、［１］に記載の干渉センサ。
［４］ 前記干渉層と前記分析物結合分子の層との間に位置付けられた二酸化ケイ素（ＳｉＯ ２ ）を含む、接着層をさらに含む、［１］に記載の干渉センサ。
［５］ 前記接着層が、１０ｎｍ未満の厚さを有する、［４］に記載の干渉センサ。
［６］ 干渉センサであって、
モノリシック基材の反対側の端部で互いに実質的に平行に配設された第１および第２の表面を有する、前記モノリシック基材と、
前記モノリシック基材の屈折率より少なくとも０．１小さい屈折率を有する、干渉層と、
生化学試験中に試料中の分析物分子が結合して、バイオ層を形成する、分析物結合分子の層と、を含み、
前記干渉層の前記屈折率が、前記バイオ層の前記屈折率の０．０５以内である、干渉センサ。
［７］ 前記干渉層の厚さが、５００～５，０００ｎｍである、［６］に記載の干渉センサ。
［８］ 前記干渉層の前記厚さが、８００～１，２００ｎｍである、［７］に記載の干渉センサ。
［９］ 前記モノリシック基材が、ガラスを含む、［６］に記載の干渉センサ。
［１０］ 前記干渉層が、フッ化マグネシウムを含む、［６］に記載の干渉センサ。
［１１］ 前記モノリシック基材の前記屈折率が、少なくとも１．８である、［６］に記載の干渉センサ。
［１２］ 前記分析物結合分子の層を前記干渉層に接続する、接着層をさらに含む、［６］に記載の干渉センサ。
［１３］ 前記接着層が、二酸化ケイ素を含み、前記接着層が、１０ｎｍ未満の厚さを有する、［１２］に記載の干渉センサ。
［１４］ 前記モノリシック基材が、柱状形態を有する、［６］に記載の干渉センサ。
［１５］ 前記モノリシック基材の中央部分に位置する可撓性支持構成要素であって、
前記モノリシック基材の第１の部分が、前記可撓性支持構成要素の上側から延在しており、
前記モノリシック基材の第２の部分が、前記可撓性支持構成要素の下側から延在している、可撓性支持構成要素をさらに含む、［１４］に記載の干渉センサ。
［１６］ 前記可撓性支持構成要素が、フランジおよび前記フランジの下方に位置するスリーブを含む、［１５］に記載の干渉センサ。
［１７］ 前記可撓性支持構成要素が、シリコーンゴムを含む、［１５］に記載の干渉センサ。
［１８］ 前記可撓性支持構成要素が、ウェルに装填されたときに前記干渉センサを支持するように構成されている、［１５］に記載の干渉センサ。
［１９］ 前記モノリシック基材と前記干渉層との間に相互接続された反射層であって、
前記反射層が、前記モノリシック基材の前記屈折率および前記干渉層の前記屈折率よりも高い屈折率を有する、反射層をさらに含む、［６］に記載の干渉センサ。
［２０］ ［１］に記載の干渉センサを製造するための方法であって、前記方法が、
モノリシック基材を取得することと、
前記モノリシック基材の反対側の端部で互いに実質的に平行に配設された前記モノリシック基材の第１および第２の表面を研磨することと、
フッ化マグネシウム（ＭｇＦ ２ ）を含む第１の透明材料を、前記モノリシック基材の前記第２の表面上に堆積して、干渉層を形成することと、
分析物結合分子を前記干渉層に結合することと、を含む、方法。
［２１］ 前記モノリシック基材が、ガラスを含む、［２０］に記載の方法。
［２２］ 前記干渉層が、少なくとも９００ｎｍの厚さを有する、［２０］に記載の方法。
［２３］ 第２の透明材料を前記干渉層上に堆積して、接着層を形成することであって、
前記分析物結合分子の層が、前記接着層に結合している、形成することをさらに含む、［２０］に記載の方法。
［２４］ 前記第２の透明材料が、二酸化ケイ素である、［２３］に記載の方法。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9】
【図10】