特許7512413抗ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２抗体ならびにその誘導体および用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-06-28
(45)【発行日】2024-07-08
(54)【発明の名称】抗ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２抗体ならびにその誘導体および用途
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20240701BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20240701BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240701BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240701BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20240701BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240701BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240701BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240701BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240701BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240701BHJP
C07K 14/52 20060101ALI20240701BHJP
C07K 14/005 20060101ALI20240701BHJP
C12N 7/00 20060101ALI20240701BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20240701BHJP
C12N 7/04 20060101ALI20240701BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240701BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240701BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240701BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20240701BHJP
A61K 47/55 20170101ALI20240701BHJP
A61K 51/10 20060101ALI20240701BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240701BHJP
G01N 33/531 20060101ALI20240701BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20240701BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28
C07K16/46
C12N15/13 ZNA
C12N15/63 Z
C12P21/08
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C07K19/00
C07K14/52
C07K14/005
C12N7/00
C12N7/01
C12N7/04
A61K39/395 N
A61K45/00
A61K48/00
A61K47/68
A61K47/55
A61K51/10 100
A61P35/00
G01N33/531 A
G01N33/574 A
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2022559528
(86)(22)【出願日】2021-03-30
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-10
(86)【国際出願番号】 CN2021084196
(87)【国際公開番号】W WO2021197358
(87)【国際公開日】2021-10-07
【審査請求日】2022-10-31
(31)【優先権主張番号】202010246560.0
(32)【優先日】2020-03-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】522383078
【氏名又は名称】ビオテウス・インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100137213
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 健司
(74)【代理人】
【識別番号】100143823
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 英彦
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100160749
【弁理士】
【氏名又は名称】飯野 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100160255
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100182132
【弁理士】
【氏名又は名称】河野 隆
(74)【代理人】
【識別番号】100172683
【弁理士】
【氏名又は名称】綾 聡平
(74)【代理人】
【識別番号】100219265
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 崇大
(74)【代理人】
【識別番号】100146318
【弁理士】
【氏名又は名称】岩瀬 吉和
(74)【代理人】
【識別番号】100127812
【弁理士】
【氏名又は名称】城山 康文
(72)【発明者】
【氏名】ミャオ，シャオニウ
(72)【発明者】
【氏名】ウー，ファン
(72)【発明者】
【氏名】チェン，チャン
【審査官】松村 真里
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１５－５２７３４２（ＪＰ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１１０２５６５６４（ＣＮ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０７６８６５２０（ＣＮ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１１０００３３３３（ＣＮ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１９／１４９２１９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】中国特許出願公開第１１０６２７９０６（ＣＮ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０９０９６３９６（ＣＮ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１１０３７２７９３（ＣＮ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０７６３６０１３（ＣＮ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
Ｃ０７Ｋ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディであって、前記ＰＤ－Ｌ２ナノボディのＶＨＨ鎖の各相補性決定領域（ＣＤＲ）は、
アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７に示されるＣＤＲ１、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８に示されるＣＤＲ２、およびアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９に示されるＣＤＲ３、または
アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０に示されるＣＤＲ１、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１に示されるＣＤＲ２、およびアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２に示されるＣＤＲ３で構成されることを特徴とする、前記抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディ。
【請求項2】
抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディであって、前記ＰＤ－Ｌ１ナノボディのＶＨＨ鎖の各相補性決定領域（ＣＤＲ）は、
アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３に示されるＣＤＲ１、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４に示されるＣＤＲ２、およびアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５に示されるＣＤＲ３で構成されることを特徴とする、前記抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディ。
【請求項3】
前記抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディのＶＨＨ鎖のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１６、１７または１８で示され；または前記抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディのＶＨＨ鎖のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２または１５で示される、請求項１に記載の抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディ。
【請求項4】
前記抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディのＶＨＨ鎖のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９または２２で示される、請求項２に記載の抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディ。
【請求項5】
二重特異性抗体であって、前記二重特異性抗体は、請求項２に記載の抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディおよび請求項１に記載の抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディを含むことを特徴とする、前記二重特異性抗体。
【請求項6】
前記二重特異性抗体は、式Ｉまたは式ＩＩに示される構造を有するポリペプチドを含むか、または式ＩＩＩおよび式ＩＶに示される構造を有するポリペプチドを同時に含み、Ａ－Ｌ１－Ｆｃ１－Ｌ２－Ｂ（式Ｉ）
Ａ－Ｌ３－Ｂ－Ｌ４－Ｆｃ１（式ＩＩ）
Ａ－Ｌ５－Ｆｃ２－Ｌ６－Ｆｃ１（式ＩＩＩ）
Ｂ－Ｌ７－Ｆｃ２（式ＩＶ）
ここで、
ＡおよびＢは、それぞれ独立して、請求項２に記載の抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディまたは請求項１に記載の抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディであり、ＡおよびＢは、異なる抗体であり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、それぞれ独立して、ペプチド結合またはリンカー要素であり、
Ｆｃ１、Ｆｃ２は、どちらも抗体のＦｃセグメントであり、ここで、Ｆｃ１は、ヒトＩｇＧドメインであり、Ｆｃ２は、ＣＨ１＋ＣＬドメインであり、
「－」は、ペプチド結合であることを特徴とする
請求項５に記載の二重特異性抗体。
【請求項7】
単離されたポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドは、請求項１に記載の抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディ、請求項２に記載の抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディ、または請求項５に記載の二重特異性抗体をコードすることを特徴とする、前記単離されたポリヌクレオチド。
【請求項8】
ベクターであって、前記ベクターは、請求項７に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、前記ベクター。
【請求項9】
宿主細胞であって、前記宿主細胞は、請求項８に記載のベクターを含むか、
あるいは、前記宿主細胞は、請求項１に記載の抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディ、請求項２に記載の抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディ、または請求項５に記載の二重特異性抗体を発現することを特徴とする、前記宿主細胞。
【請求項10】
二重特異性抗体を生成する方法であって、（ａ）適切な条件下で、請求項９に記載の宿主細胞を培養することにより、前記抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディ、抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディ、または二重特異性抗体を含む培養物を獲得する段階と、および
（ｂ）段階（ａ）で得られた培養物を精製および／または分離して、前記抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディ、抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディ、または二重特異性抗体を獲得する段階とを含むことを特徴とする、前記二重特異性抗体を生成する方法。
【請求項11】
免疫コンジュゲートであって、前記免疫コンジュゲートは、
（ａ）請求項１に記載の抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディ、請求項２に記載の抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディ、または請求項５に記載の二重特異性抗体、および
（ｂ）検出可能な標識、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、または酵素、金ナノ粒子／ナノロッド、ナノ磁性粒子、ウイルスコートタンパク質またはＶＬＰ、またはその組み合わせからなる群から選択されるカップリング部分を含むことを特徴とする、前記免疫コンジュゲート。
【請求項12】
請求項１に記載の抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディ、または請求項５に記載の二重特異性抗体の、薬剤、試薬、検出プレートまたはキットの調製における使用であって、前記試薬、検出プレートまたはキットは、サンプル中のＰＤ－Ｌ２の検出に使用され、前記薬剤は、ＰＤ－Ｌ２を発現する腫瘍の治療または予防に使用されることを特徴とする、前記使用。
【請求項13】
請求項２に記載の抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディ、または請求項５に記載の二重特異性抗体の、薬剤、試薬、検出プレートまたはキットの調製における使用であって、前記試薬、検出プレートまたはキットは、サンプル中のＰＤ－Ｌ１の検出に使用され、前記薬剤は、ＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍の治療または予防に使用されることを特徴とする、前記使用。
【請求項14】
医薬組成物であって、（ｉ）請求項１に記載の抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディ、請求項２に記載の抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディ、または請求項５に記載の二重特異性抗体、または請求項１１に記載の免疫コンジュゲート、ならびに（ｉｉ）薬学的に許容されるベクターを含むことを特徴とする、前記医薬組成物。
【請求項15】
ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２検出試薬であって、前記検出試薬は、請求項１１に記載の免疫コンジュゲートおよび検出学的に許容されるベクターを含むことを特徴とする、前記ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２検出試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生物医学またはバイオ医薬品の技術分野に関し、より具体的には、抗ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２抗体ならびにその誘導体および用途に関する。
【背景技術】
【0002】
ＣＤ２７９とも呼ばれるプログラム細胞死１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ－１、ＰＤ－１）は、ＣＤ２８ファミリーメンバーであり、その細胞質領域は、二つのチロシン残基を含み、Ｎ末端近くの一つは、免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｏｔｉｆ、ＩＴＩＭ）に位置し、Ｃ末端近くの一つは、免疫受容体チロシンベースのスイッチモチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ｓｗｉｔｃｈ ｍｏｔｉｆ、ＩＴＳＭ）に位置する。ＰＤ－１は、主に活性化されたＴリンパ球、Ｂリンパ球およびマクロファージの表面に発現する。通常の状況下で、ＰＤ－１は、Ｔリンパ球の機能を阻害し、Ｔｒｅｇの機能を促進することにより、自己免疫応答を阻害し、自己免疫性疾患の発生を防止することができる。
【0003】
ＣＤ２７４とも呼ばれるプログラム細胞死１リガンド１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ １ ｌｉｇａｎｄ １、ＰＤ－Ｌ１）は、Ｂ７ファミリーメンバーであり、ＰＤ－１のリガンドである。ＰＤ－Ｌ１は、一つのＩｇＶ様ドメイン、一つのＩｇＣ様ドメイン、一つの膜貫通疎水性ドメインおよび３０個のアミノ酸からなる一つの細胞内ドメインを含む、合計２９０個のアミノ酸のＩ型膜貫通タンパク質である。
【0004】
他のＢ７ファミリー分子とは異なり、ＰＤ－Ｌ１は、免疫応答を負に調節する効果を有する。研究によると、ＰＤ－Ｌ１は、主に活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージおよび樹状細胞等で発現し、リンパ球に加えて、ＰＤ－Ｌ１は、胸腺、心臓、胎盤等の様々な他の組織の内皮細胞、ならびに黒色腫、肝臓がん、胃がん、腎細胞がん、卵巣がん、結腸がん、乳がん、食道がん、頭頸部がんのような様々な非リンパ系にも発現することが分かる。ＰＤ－Ｌ１は、自己反応性Ｔ細胞、Ｂ細胞および免疫寛容の調節において幅広く、末梢組織Ｔ細胞およびＢ細胞応答において役割を果たす。腫瘍細胞でのＰＤ－Ｌ１の高発現は、癌患者の予後不良に関連する。
【0005】
しかし、腫瘍の発生時において、腫瘍細胞によって発現されるＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１とが結合した後に、リンパ球に対する阻害性硬化を通じて、腫瘍の免疫逃避を促進することができる。ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との結合は、様々な生物学的変化を引き起こし、免疫調節をもたらす可能性があり、例えば、リンパ球の増殖および活性化を阻害し、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ１およびＴｈ１７細胞への分化を阻害し、炎症性サイトカインの放出等を阻害することができる。
【0006】
ＣＤ２７３またはＢ７－ＤＣとも呼ばれるプログラム細胞死１リガンド２（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ １ ｌｉｇａｎｄ ２、ＰＤ－Ｌ２）は、ＰＤ－１の別の重要なリガンドである。ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ２との相互作用は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化および増殖を阻害し、サイトカインの放出を減少させ、腫瘍の免疫逃避を増加させることができる。同時に、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２との相互作用を遮断することで、ＰＤ－１経路の活性化が免疫系に対する阻害を効果的に解放し、体の自己免疫系を活性化し、腫瘍を殺すことができる。
【0007】
しかしながら、これまでに、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２を同時に標的とする二重特異性単一ドメイン抗体は、市場に公開されず、新世代抗体の診断および治療における新たな力として、単一ドメイン抗体は、高い安定性、良好な水溶性、簡単なヒト化、高い標的性、強力な浸透性等の特徴を有し、免疫実験、診断および治療において、想像を超える巨大な機能を果たしている。
【0008】
従って、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２を同時に標的とすることができる二重特異性単一ドメイン抗体が当技術分野で緊急に必要とされる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明の目的は、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２を同時に標的とする二重特異性抗体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明の第１の態様は、抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディを提供し、前記ＰＤ－Ｌ２ナノボディのＶＨＨ鎖の各相補性決定領域（ＣＤＲ）は、
アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７に示されるようなＣＤＲ１、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８に示されるようなＣＤＲ２、およびアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９に示されるようなＣＤＲ３、または
アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０に示されるようなＣＤＲ１、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１に示されるようなＣＤＲ２、およびアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２に示されるようなＣＤＲ３で構成されるか、
あるいは、前記抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディのＶＨＨ鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１７または１８に示されたとおりである。
アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７に示されるようなＣＤＲ１、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８に示されるようなＣＤＲ２、およびアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９に示されるようなＣＤＲ３、または
アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０に示されるようなＣＤＲ１、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１に示されるようなＣＤＲ２、およびアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２に示されるようなＣＤＲ３で構成されるか、
あるいは、前記抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディのＶＨＨ鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１７または１８に示されたとおりである。
【0011】
別の好ましい例において、前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、ＶＨＨ鎖のフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４によって隔離される。
【0012】
別の好ましい例において、前記抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディのＶＨＨ鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３（即ち、Ｄ－Ｎａ－９６）、１６（即ち、ＨＺ－Ｄ－Ｎａ－９６－１）、１２（即ち、Ｄ－Ｙｅ－２９）または１５（即ち、ＨＺ－Ｄ－Ｙｅ－２９－３）に示されたとおりである。
【0013】
別の好ましい例において、前記抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディは、ヒト化されており、前記抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディのＶＨＨ鎖のアミノ酸配列は、１６（即ち、ＨＺ－Ｄ－Ｎａ－９６－１）または１５（即ち、ＨＺ－Ｄ－Ｙｅ－２９－３）に示されたとおりである。
【0014】
別の好ましい例において、前記ＰＤ－Ｌ２ナノボディは、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ２との相互作用を遮断することができる。
【0015】
本発明の第２の態様は、抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディを提供し、前記ＰＤ－Ｌ１ナノボディのＶＨＨ鎖の各相補性決定領域（ＣＤＲ）は、
アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３に示されるようなＣＤＲ１、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４に示されるようなＣＤＲ２、およびアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５に示されるようなＣＤＲ３等で構成される。
アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３に示されるようなＣＤＲ１、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４に示されるようなＣＤＲ２、およびアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５に示されるようなＣＤＲ３等で構成される。
【0016】
別の好ましい例において、前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、ＶＨＨ鎖のフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４によって隔離される。
【0017】
別の好ましい例において、前記抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディのＶＨＨ鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９（即ち、Ｋ－Ｙｒ－１３＆１４－０２）、２０（即ち、Ｋ－Ｙｒ－１３＆１４－０９）、２１（即ち、Ｋ－Ｙｒ－１３＆１４－１６）または２２（即ち、ＨＺ－Ｋ－Ｙｒ－１３＆１４－０２－３）に示されたとおりである。
【0018】
別の好ましい例において、前記抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディは、ヒト化されており、前記抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディのＶＨＨ鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２（即ち、ＨＺ－Ｋ－Ｙｒ－１３＆１４－０２－３）に示されたとおりである。
【0019】
別の好ましい例において、前記ＰＤ－Ｌ１ナノボディは、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用を遮断することができる。
【0020】
本発明の第３の態様は、二重特異性抗体を提供し、前記二重特異性抗体は、本発明の第２の態様に記載の抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディおよび本発明の第１の態様に記載の抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディを含む。
【0021】
別の好ましい例において、前記二重特異性抗体は、１～３個の抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディを含み、好ましくは、１個または２個の抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディを含む。
【0022】
別の好ましい例において、前記二重特異性抗体は、１～３個の抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディを含み、好ましくは、１個または２個の抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディを含む。
【0023】
別の好ましい例において、前記二重特異性抗体は、Ｆｃセグメントをさらに含む。
【0024】
別の好ましい例において、前記二重特異性抗体のＦｃセグメントは、ヒトＩｇＧドメイン、ＣＨ１＋ＣＬ１ドメイン、またはその組み合わせからなる群から選択される。
【0025】
別の好ましい例において、前記ヒトＩｇＧドメインは、操作された突然変異型ＩｇＧドメイン、好ましくはＬＡＬＡ突然変異型ＩｇＧドメインである。
【0026】
別の好ましい例において、前記二重特異性抗体は、式Ｉまたは式ＩＩに示されるような構造を有するポリペプチドを含むか、または式ＩＩＩおよび式ＩＶに示されるような構造を有するポリペプチドを同時に含み、
Ａ－Ｌ１－Ｆｃ１－Ｌ２－Ｂ（式Ｉ）
Ａ－Ｌ３－Ｂ－Ｌ４－Ｆｃ１（式ＩＩ）
Ａ－Ｌ５－Ｆｃ２－Ｌ６－Ｆｃ１（式ＩＩＩ）
Ｂ－Ｌ７－Ｆｃ２（式ＩＶ）
ここで、
ＡおよびＢは、それぞれ独立して、本発明の第２の態様に記載の抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディまたは本発明の第１の態様に記載の抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディであり、ＡおよびＢは、異なる抗体であり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、それぞれ独立して、ペプチド結合またはリンカー要素であり、
Ｆｃ１、Ｆｃ２は、どちらも抗体のＦｃセグメントであり、ここで、Ｆｃ１は、ヒトＩｇＧドメイン（好ましくは、ＬＡＬＡ突然変異型ＩｇＧドメインである）であり、Ｆｃ２は、ＣＨ１＋ＣＬドメインであり、
「－」は、ペプチド結合である。
Ａ－Ｌ１－Ｆｃ１－Ｌ２－Ｂ（式Ｉ）
Ａ－Ｌ３－Ｂ－Ｌ４－Ｆｃ１（式ＩＩ）
Ａ－Ｌ５－Ｆｃ２－Ｌ６－Ｆｃ１（式ＩＩＩ）
Ｂ－Ｌ７－Ｆｃ２（式ＩＶ）
ここで、
ＡおよびＢは、それぞれ独立して、本発明の第２の態様に記載の抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディまたは本発明の第１の態様に記載の抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディであり、ＡおよびＢは、異なる抗体であり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、それぞれ独立して、ペプチド結合またはリンカー要素であり、
Ｆｃ１、Ｆｃ２は、どちらも抗体のＦｃセグメントであり、ここで、Ｆｃ１は、ヒトＩｇＧドメイン（好ましくは、ＬＡＬＡ突然変異型ＩｇＧドメインである）であり、Ｆｃ２は、ＣＨ１＋ＣＬドメインであり、
「－」は、ペプチド結合である。
【0027】
別の好ましい例において、前記二重特異性抗体は、式ＩＩＩおよび式ＩＶに示されるよう構造を有するポリペプチド配列を有し、前記式ＩＩＩに示される構造を有するポリペプチドと式ＩＶに示される構造を有するポリペプチドとの間は、ジスルフィド結合を介してヘテロ二量体ａを形成する。
【0028】
別の好ましい例において、前記二重特異性抗体は、式Ｉに示される構造を有するポリペプチドを有し、前記ポリペプチドは、Ｆｃ１間のジスルフィド結合の作用を介して相同性二量体ｉを形成する。
【0029】
別の好ましい例において、前記二重特異性抗体は、式ＩＩに示される構造を有するポリペプチドを有し、前記ポリペプチドは、Ｆｃ１間のジスルフィド結合の作用を介して相同性二量体ｉｉを形成する。
【0030】
別の好ましい例において、前記二重特異性抗体は、式ＩＩＩおよび式ＩＶに示されるよう構造を有するポリペプチド配列を有し、前記式ＩＩＩに示される構造を有するポリペプチドと式ＩＶに示される構造を有するポリペプチドの間は、Ｆｃ２間のジスルフィド結合の作用を介してヘテロ二量体ａを形成し、前記ヘテロ二量体ｉｉは、Ｆｃ１間のジスルフィド結合の作用を介して相同性二量体ｉｉｉを形成する。
【0031】
別の好ましい例において、前記ＰＤ－Ｌ１ナノボディのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、２０、２１または２２、好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されたとおりである。
【0032】
別の好ましい例において、前記二重特異性抗体は、他の抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディのＶＨＨ鎖をさらに含み、前記他のＰＤ－Ｌ２ナノボディのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８に示されたとおりである。
【0033】
別の好ましい例において、前記抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディのＶＨＨ鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１６、１２または１５、好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６または１５に示されたとおりである。
【0034】
別の好ましい例において、前記リンカー要素の配列は、（４ＧＳ）ｎであり、ここで、ｎは、正の整数（例えば、１、２、３、４、５または６）、好ましくは、ｎ＝４である。
【0035】
別の好ましい例において、前記リンカー要素の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示されるか、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示される配列と≧８５％（好ましくは９０％、より好ましくは９５％）の配列同一性を有する。
【0036】
別の好ましい例において、前記ＬＡＬＡ突然変異型のヒトＩｇＧドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示されるか、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示される配列と≧８５％（好ましくは９０％、より好ましくは９５％）の配列同一性を有する。
【0037】
別の好ましい例において、前記ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されるか、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示される配列と≧８５％（好ましくは９０％、より好ましくは９５％）の配列同一性を有する。
【0038】
別の好ましい例において、前記ＣＬドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるか、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示される配列と≧８５％（好ましくは９０％、より好ましくは９５％）の配列同一性を有する。
【0039】
別の好ましい例において、前記二重特異性抗体のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３または２４に示されたとおりである。
【0040】
別の好ましい例において、前記二重特異性抗体は、式ＩＩＩおよび式ＩＶに示されるような構造を有するポリペプチドを同時に含み、ここで、前記式ＩＩＩに記載のポリペプチドのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されたとおりであり、前記式ＩＶに記載のポリペプチドのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されたとおりである。
【0041】
本発明の第４の態様は、単離されたポリヌクレオチドを提供し、前記ポリヌクレオチドは、本発明の第１の態様に記載の抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディ、本発明の第２の態様に記載の抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディ、または本発明の第３の態様に記載の二重特異性抗体をコードする。
【0042】
別の好ましい例において、前記ポリヌクレオチドの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７または４８に示されたとおりである。
【0043】
別の好ましい例において、前記ポリヌクレオチドの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３（即ち、Ｄ－Ｎａ－９６）、４６（即ち、ＨＺ－Ｄ－Ｎａ－９６－１）、４２（即ち、Ｄ－Ｙｅ－２９）または４５（即ち、ＨＺ－Ｄ－Ｙｅ－２９）に示されたとおりであり、好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６または４５である。
【0044】
別の好ましい例において、前記ポリヌクレオチドの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９（即ち、Ｋ－Ｙｒ－１３＆１４－０２）、５０（即ち、Ｋ－Ｙｒ－１３＆１４－０９）、５１（即ち、Ｋ－Ｙｒ－１３＆１４－１６）または５２（即ち、ＨＺ－Ｋ－Ｙｒ－１３＆１４－０２－３）に示されたとおりであり、好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２である。
【0045】
別の好ましい例において、前記ポリヌクレオチドの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３または５４に示されたとおりである。
【0046】
別の好ましい例において、前記ポリヌクレオチドは、配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５に示されるような第１のポリヌクレオチドおよび配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６に示されるような第２のポリヌクレオチドを含む。
【0047】
本発明の第５の態様は、ベクターを提供し、前記ベクターは、本発明の第４の態様に記載のポリヌクレオチドを含む。
【0048】
別の好ましい例において、前記ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルスベクター、プラスミド、トランスポゾン、他の遺伝子転移系、またはその組み合わせからなる群から選択され、好ましくは、前記発現ベクターは、レンチウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶウイルス、レトロウイルス、またはその組み合わせ等のウイルスベクターを含む。
【0049】
本発明の第６の態様は、宿主細胞を提供し、前記宿主細胞は、本発明の第５の態様に記載のベクターを含むか、またはそのゲノムには本発明の第４の態様に記載のポリヌクレオチドがが組み込まれているか、
あるいは、前記宿主細胞は、本発明の第１の態様に記載の抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディ、本発明の第２の態様に記載の抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディ、または本発明の第３の態様に記載の二重特異性抗体を発現する。
あるいは、前記宿主細胞は、本発明の第１の態様に記載の抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディ、本発明の第２の態様に記載の抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディ、または本発明の第３の態様に記載の二重特異性抗体を発現する。
【0050】
別の好ましい例において、前記宿主細胞は、原核細胞または真核細胞を含む。
【0051】
別の好ましい例において、前記宿主細胞は、大腸菌、酵母細胞、哺乳動物細胞からなる群から選択される。
【0052】
本発明の第７の態様は、抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディ、抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディ、または二重特異性抗体を生成する方法を提供し、
（ａ）適切な条件下で、本発明の第６の態様に記載の宿主細胞を培養することにより、前記抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディ、抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディ、または二重特異性抗体を含む培養物を獲得する段階と、および
（ｂ）段階（ａ）で得られた培養物を精製および／または分離して、前記抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディ、抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディ、または二重特異性抗体を獲得する段階とを含む。
（ａ）適切な条件下で、本発明の第６の態様に記載の宿主細胞を培養することにより、前記抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディ、抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディ、または二重特異性抗体を含む培養物を獲得する段階と、および
（ｂ）段階（ａ）で得られた培養物を精製および／または分離して、前記抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディ、抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディ、または二重特異性抗体を獲得する段階とを含む。
【0053】
別の好ましい例において、前記精製は、タンパク質Ａアフィニティーカラムによって精製および分離して、目的抗体を獲得することができる。
【0054】
別の好ましい例において、前記精製および分離後の目的抗体の純度は、９５％を超え、９６％を超え、９７％を超え、９８％を超え、９９％を超え、好ましくは１００％である。
【0055】
本発明の第８の態様は、免疫コンジュゲートを提供し、前記免疫コンジュゲートは、
（ａ）本発明の第１の態様に記載の抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディ、本発明の第２の態様に記載の抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディ、または本発明の第３の態様に記載の二重特異性抗体と、および
（ｂ）検出可能な標識、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、または酵素、金ナノ粒子／ナノロッド、ナノ磁性粒子、ウイルスコートタンパク質またはＶＬＰ、またはその組み合わせからなる群から選択されるカップリング部分とを含む。
（ａ）本発明の第１の態様に記載の抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディ、本発明の第２の態様に記載の抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディ、または本発明の第３の態様に記載の二重特異性抗体と、および
（ｂ）検出可能な標識、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、または酵素、金ナノ粒子／ナノロッド、ナノ磁性粒子、ウイルスコートタンパク質またはＶＬＰ、またはその組み合わせからなる群から選択されるカップリング部分とを含む。
【0056】
別の好ましい例において、前記放射性核種は、
（ｉ）Ｔｃ－９９ｍ、Ｇａ－６８、Ｆ－１８、Ｉ－１２３、Ｉ－１２５、Ｉ－１３１、Ｉｎ－１１１、Ｇａ－６７、Ｃｕ－６４、Ｚｒ－８９、Ｃ－１１、Ｌｕ－１７７、Ｒｅ－１８８、またはその組み合わせからなる群から選択される、診断用同位体、および／または
（ｉｉ）Ｌｕ－１７７、Ｙ－９０、Ａｃ－２２５、Ａｓ－２１１、Ｂｉ－２１２、Ｂｉ－２１３、Ｃｓ－１３７、Ｃｒ－５１、Ｃｏ－６０、Ｄｙ－１６５、Ｅｒ－１６９、Ｆｍ－２５５、Ａｕ－１９８、Ｈｏ－１６６、Ｉ－１２５、Ｉ－１３１、Ｉｒ－１９２、Ｆｅ－５９、Ｐｂ－２１２、Ｍｏ－９９、Ｐｄ－１０３、Ｐ－３２、Ｋ－４２、Ｒｅ－１８６、Ｒｅ－１８８、Ｓｍ－１５３、Ｒａ２２３、Ｒｕ－１０６、Ｎａ２４、Ｓｒ８９、Ｔｂ－１４９、Ｔｈ－２２７、Ｘｅ－１３３、Ｙｂ－１６９、Ｙｂ－１７７、またはその組み合わせからなる群から選択される、治療用同位体とを含む。
（ｉ）Ｔｃ－９９ｍ、Ｇａ－６８、Ｆ－１８、Ｉ－１２３、Ｉ－１２５、Ｉ－１３１、Ｉｎ－１１１、Ｇａ－６７、Ｃｕ－６４、Ｚｒ－８９、Ｃ－１１、Ｌｕ－１７７、Ｒｅ－１８８、またはその組み合わせからなる群から選択される、診断用同位体、および／または
（ｉｉ）Ｌｕ－１７７、Ｙ－９０、Ａｃ－２２５、Ａｓ－２１１、Ｂｉ－２１２、Ｂｉ－２１３、Ｃｓ－１３７、Ｃｒ－５１、Ｃｏ－６０、Ｄｙ－１６５、Ｅｒ－１６９、Ｆｍ－２５５、Ａｕ－１９８、Ｈｏ－１６６、Ｉ－１２５、Ｉ－１３１、Ｉｒ－１９２、Ｆｅ－５９、Ｐｂ－２１２、Ｍｏ－９９、Ｐｄ－１０３、Ｐ－３２、Ｋ－４２、Ｒｅ－１８６、Ｒｅ－１８８、Ｓｍ－１５３、Ｒａ２２３、Ｒｕ－１０６、Ｎａ２４、Ｓｒ８９、Ｔｂ－１４９、Ｔｈ－２２７、Ｘｅ－１３３、Ｙｂ－１６９、Ｙｂ－１７７、またはその組み合わせからなる群から選択される、治療用同位体とを含む。
【0057】
別の好ましい例において、前記カップリング部分は、薬物または毒素である。
【0058】
別の好ましい例において、前記薬物は、細胞毒性薬である。
【0059】
別の好ましい例において、前記細胞毒性薬は、抗チューブリン薬、ＤＮＡ副溝結合試薬、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化試薬、抗生物質、葉酸アンタゴニスト、代謝拮抗剤、化学増感剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイド、またはその組み合わせからなる群から選択される。
【0060】
特に有用な細胞毒性薬の例としては、例えば、ＤＮＡ副溝結合試薬、ＤＮＡアルキル化試薬、およびチューブリン阻害剤を含み、典型的な細胞毒性薬は、例えば、アウリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎｓ）、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎｓ）、デュオカルマイシン／デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎｓ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅｓ）、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅｓ）およびメイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ）（例えば、ＤＭ１およびＤＭ４）、タキサン（ｔａｘａｎｅｓ）、ベンゾジアゼピン（ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ）またはベンゾジアゼピン含有薬物（ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｄｒｕｇｓ）（例えば、ピロロ［１，４］ベンゾジアゼピン（ＰＢＤｓ）、インドリノベンゾジアゼピン（ｉｎｄｏｌｉｎｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ）およびオキサゾリジノベンゾジアゼピン（ｏｘａｚｏｌｉｄｉｎｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ））、ビンカアルカロイド（ｖｉｎｃａ ａｌｋａｌｏｉｄｓ）、またはその組み合わせを含む。
【0061】
別の好ましい例において、前記毒素は、
アウリスタチン（例えば、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦ）、クロルテトラサイクリン（ｃｈｌｏｒｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、メイタンシノール（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｌ）、リシン毒素（ｒｉｃｉｎ ｔｏｘｉｎ）、リシン毒素Ａ－鎖、コンブレタスタチン（ｃｏｍｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎ）、ドカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）、ドラスタチン（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ）、アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、ｃｃ１０６５、臭化エチジウム（ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、コルヒチン（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）、ジヒドロキシアンスラキシオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｎｔｈｒａｘｄｉｏｎｅ）、アクチノマイシン（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ジフテリア毒素（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ ｔｏｘｉｎ）、シュードモナス外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン（ａｂｒｉｎ）、アブリンＡ鎖、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、α－サルシナ、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、マイトジェリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レトリトシン（ｒｅｔｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、クリシン（ｃｕｒｉｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、サボンソウ（Ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、グルココルチコイド（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ）、またはその組み合わせからなる群から選択される。
アウリスタチン（例えば、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦ）、クロルテトラサイクリン（ｃｈｌｏｒｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、メイタンシノール（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｌ）、リシン毒素（ｒｉｃｉｎ ｔｏｘｉｎ）、リシン毒素Ａ－鎖、コンブレタスタチン（ｃｏｍｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎ）、ドカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）、ドラスタチン（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ）、アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、ｃｃ１０６５、臭化エチジウム（ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、コルヒチン（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）、ジヒドロキシアンスラキシオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｎｔｈｒａｘｄｉｏｎｅ）、アクチノマイシン（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ジフテリア毒素（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ ｔｏｘｉｎ）、シュードモナス外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン（ａｂｒｉｎ）、アブリンＡ鎖、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、α－サルシナ、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、マイトジェリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レトリトシン（ｒｅｔｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、クリシン（ｃｕｒｉｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、サボンソウ（Ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、グルココルチコイド（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ）、またはその組み合わせからなる群から選択される。
【0062】
別の好ましい例において、前記カップリング部分は、検出可能な標識である。
【0063】
別の好ましい例において、前記コンジュゲートは、蛍光または発光標識、放射性標識、ＭＲＩ（磁気共鳴画像）またはＣＴ（コンピューター断層撮影技術）造影剤、または検出可能な生成物を生成できる酵素、放射性核種、生物学的毒素素、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２）、抗体、抗体Ｆｃ断片、抗体ｓｃＦｖ断片、金ナノ粒子／ナノロッド、ウイルス粒子、リポソーム、ナノ磁性粒子、プロドラッグ活性化酵素（例えば、ＤＴ－ジアホラーゼ（ＤＴＤ）またはビフェニルヒドロラーゼ－様タンパク質（ＢＰＨＬ））、化学療法剤（例えば、シスプラチン）から選択される。
【0064】
別の好ましい例において、前記免疫コンジュゲートは、本発明の第１の態様に記載の多価（例えば、二価）抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディ、本発明の第２の態様に記載の抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディ、または本発明の第３の態様に記載の二重特異性抗体を含む。
【0065】
別の好ましい例において、前記多価は、前記免疫コンジュゲートのアミノ酸配列中に複数の反復を含む、本発明の第１の態様に記載の抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディ、本発明の第２の態様に記載の抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディ、または本発明の第３の態様に記載の二重特異性抗体を指す。
【0066】
本発明の第９の態様は、薬剤、試薬、検出プレートまたはキットの調製に使用される、本発明の第１の態様に記載の抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディ、本発明の第２の態様に記載の抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディ、または本発明の第３の態様に記載の二重特異性抗体、または本発明の第８の態様に記載の免疫コンジュゲートの用途を提供し、ここで、前記試薬、検出プレートまたはキットは、サンプル中のＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２の検出に使用され、ここで、前記薬剤は、ＰＤ－Ｌ１（即ち、ＰＤ－Ｌ１陽性）を発現する腫瘍またはＰＤ－Ｌ２を発現する腫瘍の治療または予防に使用される。
【0067】
別の好ましい例において、前記免疫コンジュゲートのカップリング部分は、診断用同位体である。
【0068】
別の好ましい例において、前記試薬は、同位体トレーサー、造影剤、フロー検出試薬、細胞免疫蛍光検出試薬、ナノ磁性粒子およびイメージング剤からなる群から選択される一つまたは複数の種の試薬である。
【0069】
別の好ましい例において、前記検出サンプル中のＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２の試薬は、ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２分子を（インビボ）検出するための造影剤である。
【0070】
別の好ましい例において、前記検出は、インビボ検出またはインビトロ検出である。
【0071】
別の好ましい例において、前記検出は、フロー検出、細胞免疫蛍光検出を含む。
【0072】
別の好ましい例において、前記薬剤は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を遮断するか、および／またはＰＤ－１とＰＤ－Ｌ２との間の相互作用を遮断するために使用される。
【0073】
別の好ましい例において、前記腫瘍は、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、多発性脊髄症、非ホジキンリンパ腫、結腸直腸がん、乳がん、大腸がん、胃がん、肝臓がん、白血病、腎臓がん、肺がん、小腸がん、骨がん、前立腺がん、前立腺がん、子宮頸がん、リンパ腫、副腎腫瘍、膀胱腫瘍を含むが、これらに限定されない。
【0074】
本発明の第１０の態様は、（ｉ）本発明の第１の態様に記載の抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディ、本発明の第２の態様に記載の抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディ、または本発明の第３の態様に記載の二重特異性抗体、または本発明の第８の態様に記載の免疫コンジュゲート、および（ｉｉ）薬学的に許容されるベクターを含む、医薬組成物を提供する。
【0075】
別の好ましい例において、前記免疫コンジュゲートのカップリング部分は、薬物、毒素、および／または治療用同位体である。
【0076】
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、細胞毒性薬等の腫瘍を治療するための他の薬物をさらに含む。
【0077】
別の好ましい例において、前記腫瘍を治療するための他の薬物は、パクリタキセル、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、アキシチニブ（ａｘｉｔｉｎｉｂ）、レンバチニブ（ｌｅｎｖａｔｉｎｉｂ）、ペムブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）を含む。
【0078】
別の好ましい例において、前記薬物は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を遮断するか、および／またはＰＤ－１とＰＤ－Ｌ２との間の相互作用を遮断するために使用される。
【0079】
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ２シグナル伝達経路を遮断するために使用される。
【0080】
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、ＰＤ－Ｌ１タンパク質（即ち、ＰＤ－Ｌ１陽性）および／またはＰＤ－Ｌ２タンパク質（即ち、ＰＤ－Ｌ２陽性）を発現する腫瘍を治療するために使用される。
【0081】
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、注射剤の形態である。
【0082】
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、腫瘍を予防および治療するための薬物の調製に使用される。
【0083】
本発明の第１１の態様は、
（ｉ）ヒトＰＤ－Ｌ１分子および／またはＰＤ－Ｌ２分子の検出用、（ｉｉ）フロー検出用、（ｉｉｉ）細胞免疫蛍光検出用、（ｉｖ）腫瘍の治療用、（ｖ）腫瘍の診断用、（ｖｉ）ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用の遮断用、および／または（ｖｉｉ）ＰＤ－Ｌ２とＰＤ－１との間の相互作用の遮断用からなる群から選択される本発明の第１の態様に記載の抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディ、本発明の第２の態様に記載の抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディ、または本発明の第３の態様に記載の二重特異性抗体の一つまたは複数の種の用途を提供する。
（ｉ）ヒトＰＤ－Ｌ１分子および／またはＰＤ－Ｌ２分子の検出用、（ｉｉ）フロー検出用、（ｉｉｉ）細胞免疫蛍光検出用、（ｉｖ）腫瘍の治療用、（ｖ）腫瘍の診断用、（ｖｉ）ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用の遮断用、および／または（ｖｉｉ）ＰＤ－Ｌ２とＰＤ－１との間の相互作用の遮断用からなる群から選択される本発明の第１の態様に記載の抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディ、本発明の第２の態様に記載の抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディ、または本発明の第３の態様に記載の二重特異性抗体の一つまたは複数の種の用途を提供する。
【0084】
別の好ましい例において、前記腫瘍は、ＰＤ－Ｌ１タンパク質（即ち、ＰＤ－Ｌ１陽性）および／またはＰＤ－Ｌ２タンパク質（即ち、ＰＤ－Ｌ２陽性）を発現する腫瘍である。
【0085】
別の好ましい例において、前記用途は、非診断的および非治療的である。
【0086】
別の好ましい例において、前記抗体は、抗ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２の抗体である。
【0087】
本発明の第１２の態様は、組換えタンパク質を提供し、前記組換えタンパク質は、（ｉ）本発明の第１の態様に記載の抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディ、本発明の第２の態様に記載の抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディ、または本発明の第３の態様に記載の二重特異性抗体、および（ｉｉ）発現および／または精製を協力する任意選択のタグ配列を有する。
【0088】
別の好ましい例において、前記タグ配列は、６Ｈｉｓタグ、ＨＡタグおよびＦｃタグを含む。
【0089】
別の好ましい例において、前記組換えタンパク質は、ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２に特異的に結合する。
【0090】
本発明の第１３の態様は、サンプル中のＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２を検出するための方法を提供し、前記方法は、（１）サンプルと本発明の第１の態様に記載の抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディ、本発明の第２の態様に記載の抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディ、または本発明の第３の態様に記載の二重特異性抗体とを接触させる段階と、（２）抗原－抗体複合体を形成するかどうかを検出する段階とを含み、ここで、複合体の形成は、サンプル中にＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２が存在することを示す。
【0091】
本発明の第１４の態様は、疾患を治療するための方法を提供し、前記方法は、必要とする対象に本発明の第１の態様に記載の抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディ、本発明の第２の態様に記載の抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディ、または本発明の第３の態様に記載の二重特異性抗体、本発明の第８の態様に記載の免疫コンジュゲート，または本発明の第十態様に記載の医薬組成物を投与する段階を含む。
【0092】
別の好ましい例において、前記対象は、哺乳動物を含み、好ましくはヒトである。
【0093】
本発明の第１５の態様は、ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２検出試薬を提供し、前記検出試薬は、本発明の第８の態様に記載の免疫コンジュゲートおよび検出学的に許容されるベクターを含む。
【0094】
別の好ましい例において、前記免疫コンジュゲートのカップリング部分は、診断用同位体である。
【0095】
別の好ましい例において、前記検出学的に許容されるベクターは、非毒性の非活性水性ベクター媒体である。
【0096】
別の好ましい例において、前記検出試薬は、同位体トレーサー、造影剤、フロー検出試薬、細胞免疫蛍光検出試薬、ナノ磁性粒子およびイメージング剤からなる群から選択される一つまたは複数の種の試薬である。
【0097】
別の好ましい例において、前記検出試薬は、インビボ検出に使用される。
【0098】
別の好ましい例において、前記検出試薬の剤形は、液体または粉末上（例えば、水製剤、注射剤、凍結乾燥粉末、錠剤、バッカル製剤、エアロゾル製剤）である。
【0099】
本発明の第１６の態様は、ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２を検出するためのキットを提供し、前記キットは、本発明の第８の態様に記載の免疫コンジュゲートまたは本発明の第１５の態様に記載の検出試薬、および取扱説明書を含む。
【0100】
別の好ましい例において、前記取扱説明書において、前記キットは、被験対象のＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２発現を非侵襲的に検出するために使用される。
【0101】
別の好ましい例において、前記キットは、ＰＤ－Ｌ１タンパク質（即ち、ＰＤ－Ｌ１陽性）および／またはＰＤ－Ｌ２タンパク質（即ち、ＰＤ－Ｌ２陽性）を発現する腫瘍の検出に使用される。
【発明の効果】
【0102】
本発明の範囲内で、本発明の上記の各技術的特徴と以下（例えば、実施例）に具体的に説明される各技術的特徴との間を、互いに組み合わせることにより、新しいまたは好ましい技術的解決策を構成することができることに理解されたい。スペースに限りがあるため、ここでは繰り返さない。
【図面の簡単な説明】
【0103】
【図1】精製された抗ＰＤ－Ｌ２抗体とＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ２細胞との結合活性を示す。
【図2】ＰＤ－Ｌ２とＰＤ－１との結合に対する精製された抗ＰＤ－Ｌ２抗体遮断効果を示す。
【図3】Ｄ－Ｎａ－９６ヒト化抗体とＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ２細胞との結合活性を示す。
【図4】ＰＤ－Ｌ２とＰＤ－１との結合に対するＤ－Ｎａ－９６ヒト化抗体の遮断効果を示す。
【図5】ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディとＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞との結合活性を示す。
【図6】三つの異なる形態の抗ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２二重特異性抗体の構造の概略図を示す。
【図9】ＰＤＬ１／ＰＤＬ２／ＰＤ１／ｌｕｃシグナル伝達経路に対する抗ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２二重特異性抗体の遮断効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0104】
本発明者らは、広範囲かつ綿密な研究、および大量のスクリーニングの後、抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体および抗ＰＤ－Ｌ２単一ドメイン抗体を抗ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２二重特異性抗体を初めて開発した。実験によると、本発明の二重特異性抗体は、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２分子の両方に対して良好な結合活性を有し、同時にＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用およびＰＤ－１とＰＤ－Ｌ２との相互作用を遮断することができ、インビトロでＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ２／ＰＤ－１のシグナル伝達経路を同時に遮断し、下流レポーター遺伝子の発現を活性化できるため、良好な抗腫瘍活性を有することを示す。これに基づいて、本発明を完成させた。
【0105】
用語
本開示を理解しやすくするために、まず特定の用語を定義する。本発明で使用されるように、本明細書で特に明記されない限り、以下の各用語は、以下に示される意味を有するべきである。発明の全体で他の定義を説明する。
本開示を理解しやすくするために、まず特定の用語を定義する。本発明で使用されるように、本明細書で特に明記されない限り、以下の各用語は、以下に示される意味を有するべきである。発明の全体で他の定義を説明する。
【0106】
二重特異性抗体
本明細書で使用されるように、「本発明の二重特異性抗体」、「本発明の二重抗体」、「抗ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２二重特異性抗体」という用語は、同じ意味を有し、どちらもＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２を特異的に識別および結合する二重特異性抗体を指す。
本明細書で使用されるように、「本発明の二重特異性抗体」、「本発明の二重抗体」、「抗ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２二重特異性抗体」という用語は、同じ意味を有し、どちらもＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２を特異的に識別および結合する二重特異性抗体を指す。
【0107】
本発明は、抗ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２二重特異性抗体を提供し、それは、抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体および抗ＰＤ－Ｌ２単一ドメイン抗体を含む。
【0108】
好ましくは、本発明の二重特異性抗体は、式Ｉまたは式ＩＩに示されるような構造を有するポリペプチドを含むか、または式ＩＩＩおよび式ＩＶに示されるような構造を有するポリペプチドを同時に含み、
Ａ－Ｌ１－Ｆｃ１－Ｌ２－Ｂ（式Ｉ）
Ａ－Ｌ３－Ｂ－Ｌ４－Ｆｃ１（式ＩＩ）
Ａ－Ｌ５－Ｆｃ２－Ｌ６－Ｆｃ１（式ＩＩＩ）
Ｂ－Ｌ７－Ｆｃ２（式ＩＶ）
ここで、
ＡおよびＢは、それぞれ独立して、抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体または抗ＰＤ－Ｌ２単一ドメイン抗体であり、ＡおよびＢは、異なる抗体であり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、それぞれ独立して、ペプチド結合またはリンカー要素であり、
Ｆｃ１、Ｆｃ２は、どちらも抗体のＦｃセグメントであり、ここで、Ｆｃ１は、ヒトＩｇＧドメイン（好ましくは、ＬＡＬＡ突然変異型ＩｇＧドメインである）であり、Ｆｃ２は、ＣＨ１＋ＣＬドメインであり、
「－」は、ペプチド結合である。
Ａ－Ｌ１－Ｆｃ１－Ｌ２－Ｂ（式Ｉ）
Ａ－Ｌ３－Ｂ－Ｌ４－Ｆｃ１（式ＩＩ）
Ａ－Ｌ５－Ｆｃ２－Ｌ６－Ｆｃ１（式ＩＩＩ）
Ｂ－Ｌ７－Ｆｃ２（式ＩＶ）
ここで、
ＡおよびＢは、それぞれ独立して、抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体または抗ＰＤ－Ｌ２単一ドメイン抗体であり、ＡおよびＢは、異なる抗体であり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、それぞれ独立して、ペプチド結合またはリンカー要素であり、
Ｆｃ１、Ｆｃ２は、どちらも抗体のＦｃセグメントであり、ここで、Ｆｃ１は、ヒトＩｇＧドメイン（好ましくは、ＬＡＬＡ突然変異型ＩｇＧドメインである）であり、Ｆｃ２は、ＣＨ１＋ＣＬドメインであり、
「－」は、ペプチド結合である。
【0109】
一実施形態において、前記二重特異性抗体は、式Ｉに示される構造を有するポリペプチドを有し、前記ポリペプチドは、Ｆｃ１間のジスルフィド結合の作用を介して相同性二量体ｉを形成する。
【0110】
一実施形態において、前記二重特異性抗体は、式ＩＩに示される構造を有するポリペプチドを有し、前記ポリペプチドは、Ｆｃ１間のジスルフィド結合の作用を介して相同性二量体ｉｉを形成する。
【0111】
一実施形態において、前記二重特異性抗体は、式ＩＩＩおよび式ＩＶに示されるよう構造を有するポリペプチド配列を有し、前記式ＩＩＩに示される構造を有するポリペプチドと式ＩＶに示される構造を有するポリペプチドの間は、Ｆｃ２間のジスルフィド結合の作用を介してヘテロ二量体ａを形成し、前記ヘテロ二量体ｉｉは、Ｆｃ１間のジスルフィド結合の作用を介して相同性二量体ｉｉｉを形成する。
【0112】
本明細書で使用されるように、「単一ドメイン抗体」、「ナノボディＶＨＨ」、「ナノボディ」という用語は、同じ意味を有し、抗体重鎖の可変領域をクローニングして、一つのみの重鎖可変領域からなるナノボディ（ＶＨＨ）を構築することを指し、それは、完全に機能する最小の抗原結合断片である。通常、軽鎖および重鎖の定常領域１（ＣＨ１）を天然に欠く抗体を得られた後、抗体重鎖の可変領域をクローニングして、一つのみの重鎖可変領域からなるナノボディ（ＶＨＨ）を構築する。
【0113】
本明細書で使用されるように、「可変」という用語は、抗体中の可変領域の一部の配列が異なることを表し、それは、特定の抗原に対する様々な特定の抗体の結合と特異性を形成する。しかしながら、可変性は、抗体可変領域全体に均等に分布されない。それは、軽鎖および重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる三つの断片に集中される。可変領域のより保存的な部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変領域は、それぞれ四つのＦＲ領域を含み、それらは、大まかにβシート構造であり、リンクループを形成する三つのＣＤＲによって接続され、場合によっては部分的にβシート構造を形成することができる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域を介して緊密に詰め込まれ、かつ別の鎖のＣＤＲとともに、抗体の抗原結合部位（Ｋａｂａｔら、ＮＩＨ Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１－３２４２、巻Ｉ、６４７～６６９頁（１９９１））を形成する。定常領域は、抗体と抗原との結合に直接関与しているが、抗体の抗体依存性細胞傷害への関与など、様々なエフェクター機能を示す。
【0114】
本明細書で使用されるように、「フレームワーク領域」（ＦＲ）という用語は、ＣＤＲ間に挿入されたアミノ酸配列、即ち、単一の種の異なる免疫グロブリン間で比較的保存される免疫グロブリンの軽鎖および重鎖可変領域の部分を指す。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖は、それぞれＦＲ１－Ｌ、ＦＲ２－Ｌ、ＦＲ３－Ｌ、ＦＲ４－Ｌ和ＦＲ１－Ｈ、ＦＲ２－Ｈ、ＦＲ３－Ｈ、ＦＲ４－Ｈと呼ばれる四つのＦＲを有する。対応的に、軽鎖可変ドメインは、（ＦＲ１－Ｌ）－（ＣＤＲ１－Ｌ）－（ＦＲ２－Ｌ）－（ＣＤＲ２－Ｌ）－（ＦＲ３－Ｌ）－（ＣＤＲ３－Ｌ）－（ＦＲ４－Ｌ）として表されることができ、重鎖可変ドメインは、（ＦＲ１－Ｈ）－（ＣＤＲ１－Ｈ）－（ＦＲ２－Ｈ）－（ＣＤＲ２－Ｈ）－（ＦＲ３－Ｈ）－（ＣＤＲ３－Ｈ）－（ＦＲ４－Ｈ）として表されることができる。好ましくは、本発明のＦＲは、ヒト抗体ＦＲまたはその誘導体であり、前記ヒト抗体ＦＲの誘導体は、天然に存在するヒト抗体ＦＲと実質的に同じであり、即ち、配列同一性が８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％に達する。
【0115】
ＣＤＲのアミノ酸配列を知っていれば、当業者は、フレームワーク領域ＦＲ１－Ｌ、ＦＲ２－Ｌ、ＦＲ３－Ｌ、ＦＲ４－Ｌおよび／またはＦＲ１－Ｈ、ＦＲ２－Ｈ、ＦＲ３－Ｈ、ＦＲ４－Ｈを容易に決定することができる。
【0116】
本明細書で使用されるように、「ヒトフレームワーク領域」という用語は、天然に存在するヒト抗体のフレームワーク領域と実質的に同一（約８５％またはそれ以上、具体的には、９０％、９５％、９７％、９９％または１００％である）のフレームワーク領域である。
【0117】
本明細書で使用されるように、「親和性」という用語は、無傷の抗体と抗原との間の平衡結合によって理論的に定義される。本発明の二重抗体の親和性は、バイオレイヤー干渉技術（Ｂｉｏ－ｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ、ＢＬＩ）等のＫＤ値（解離定数）（または他の測定方法）によって評価または測定し、ＦｏｒｔｅｂｉｏＲｅｄ９６機器を使用して測定および確認する。
【0118】
本明細書で使用されるように、「リンカー」という用語は、軽鎖および重鎖のドメインが交換二重可変領域免疫グロブリンに折り畳まれるのに十分な可動性を提供するために、免疫グロブリンドメインに一つまたは複数のアミノ酸残基を挿入することを指す。
【0119】
当業者に知られているように、免疫コンジュゲートおよび融合発現生成物は、薬物、毒素、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）、放射性核種、酵素および他の診断または治療分子と本発明の抗体またはその断片と結合することによって形成されたコンジュゲートを含む。本発明は、前記ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２二重特異性抗体またはその断片に結合する細胞表面標識または抗原をさらに含む。
【0120】
本明細書で使用されるように、「可変領域」および「相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）」は、交換可能に使用される。
【0121】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗体の重鎖可変領域は、三つの相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。
【0122】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗体の重鎖は、上記の重鎖可変領域および重鎖定常領域を含む。
【0123】
本発明において、「本発明の抗体」、「本発明のタンパク質」、または「本発明のポリペプチド」という用語は、交換可能に使用され、すべて、重鎖可変領域を有するタンパク質またはポリペプチド等、ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２タンパク質に特異的に結合するポリペプチドを指す。それらは、初期メチオニン（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）を含むか、または含まない場合がある。
【0124】
本発明は、本発明の抗体を有する他のタンパク質または融合発現生成物を提供する。具体的には、当該可変領域が本発明の抗体の重鎖可変領域と同じであるか、または少なくとも９０％相同性、好ましくは少なくとも９５％相同性である限り、本発明は、可変領域含有重鎖を有する任意のタンパク質またはタンパク質コンジュゲートおよび融合発現生成物（即ち、免疫コンジュゲートおよび融合発現生成物）を含む。
【0125】
一般的に、抗体の抗原結合特性は、可変領域（ＣＤＲ）と呼ばれる重鎖の可変領域の三つの特定の領域によって説明されることができ、当該セグメントは、四つのフレームワーク領域（ＦＲ）に分かれ、四つのＦＲのアミノ酸配列は、比較的に保存的である、結合反応に直接関与しない。これらのＣＤＲは、環状構造を形成し、その間のＦＲが形成するβシートは、空間的に接近し、重鎖のＣＤＲト対応する軽鎖のＣＤＲとは、抗体の抗原結合部位を構成する。同じタイプの抗体のアミノ酸配列を比較することによって、ＦＲまたはＣＤＲ領域を構成するアミノ酸を確認することができる。
【0126】
本発明の抗体の重鎖の可変領域は、それらの少なくともいくつかが抗原との結合に関与するため、特に興味深い。従って、ＣＤＲが本明細書で同定されたＣＤＲと９０％以上（好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の相同性である限り、本発明は、ＣＤＲを有する抗体重鎖可変領域を有する分子を含む。
【0127】
本発明は、完全な抗体だけでなく、免疫活性を有する抗体の断片または抗体と他の配列とで形成された融合タンパク質をさらに含む。従って、本発明は、前記抗体の断片、誘導体および類似物をさらに含む。
【0128】
本明細書で使用されるように、「断片」、「誘導体」および「類似体」という用語は、本発明の抗体と基本的に同じ生物学機能または活性を保持するポリペプチドを指す。本発明のポリペプチド断片、誘導体または類似体は、（ｉ）一つのまたは複数の保存的または非保存性的アミノ酸残基（好ましくは、保存的アミノ酸残基）が置換されたポリペプチド（このように置換されたアミノ酸残基は、遺伝暗号によってエンコードされる場合とされない場合であり得る）、または（ｉｉ）一つのまたは複数のアミノ酸残基に置換基を有するポリペプチド、または（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドと別の化合物（例えば、ポリエチレングリコール等のポリペプチドの半減期を延長する化合物）との融合によって形成されるポリペプチドまたは（ｉｖ）追加のアミノ酸配列がポリペプチド配列に融合されることによって形成されたポリペプチド（例えば、リーダー配列または分泌配列またはこのポリペプチドを精製するための配列またはタンパク質配列または６Ｈｉｓタグで形成された融合タンパク質）であり得る。本明細書の教示によると、これらの断片、誘導体および類似体は、当業者の周知の範囲内である。
【0129】
本発明の抗体は、ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２タンパク質結合活性を有する二重抗体を指す。当該用語は、本発明の抗体と同じ機能を有する同じＣＤＲ領域を含むポリペプチドの変異系チアをさらに含む。これらの変異形態（これらに限定されない）は、一つまたは複数（通常は、１～５０個、好ましくは、１～３０個、より好ましくは、１～２０個、最も好ましくは、１～１０である）のアミノ酸の欠失、挿入および／または置換、およびＣ末端および／またはＮ末端での一つまたは複数（通常は、２０個以下、好ましくは、１０個以下、より好ましくは、５個以下である）のアミノ酸の追加を含む。例えば、この分野において、通常、性能が同様または類似のアミノ酸を使用して置換する場合、タンパク質の機能を変更しない。別の例として、Ｃ末端および／またはＮ末端での一つまたは複数のアミノ酸の追加も、通常、タンパク質の機能を変更しない。当該用語は、本発明の抗体の活性断片および活性誘導体をさらに含む。
【0130】
当該ポリペプチドの変異形態は、相同配列、保存的変異体、対立遺伝子変異体、天然突然変異体、誘導突然変異体、高いまたは低いストリンジェンシー条件下で本発明の抗体のコーティングＤＮＡとハイブリダイズすることができるＤＮＡによってコードされるタンパク質、および本発明の抗体に対する抗血清を使用することによって得られるポリペプチドまたはタンパク質を含む。
【0131】
本発明は、単一ドメイン抗体またはその断片を含む融合タンパク質等の他のポリペプチドをさらに提供する。ほぼ全長のポリペプチドに加えて、本発明は、本発明の単一ドメイン抗体の断片をさらに提供する。通常、当該断片は、本発明の抗体の少なくとも約５０個の連続アミノ酸、好ましくは少なくとも約５０個の連続アミノ酸、より好ましくは少なくとも約８０個の連続アミノ酸、最も好ましくは少なくとも約１００个連続アミノ酸を有する。
【0132】
本発明において、「本発明の抗体の保存的変異体」とは、本発明の抗体のアミノ酸配列と比較して、最大で１０個、好ましくは、最大で８個、より好ましくは、最大で５個、最も好ましくは、最大で３個のアミノ酸が同様または類似の性質を有するアミノ酸の置換によって形成されたポリペプチドを指す。これらの保存性変異体ポリペプチドは、表Ａに従って、アミノ酸置換を行うことにより生成されるのが最もよい。
【0133】
【表A】
本発明は、前記抗体またはそのフラグメントまたはその融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子をさらに提供する。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ形態またはＲＮＡ形態であり得る。ＤＮＡ形態は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは、一本鎖または二本鎖であり得る。ＤＮＡは、コード鎖または非コード鎖であり得る。
【0134】
本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドのみをコードするコード配列、成熟ポリペプチドのコード配列および様々な追加のコード配列、成熟ポリペプチドのコード配列（および任意の追加のコード配列）および非コード配列を含む。
【0135】
「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むか、または追加のコード配列および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドをさらに含む。
【0136】
本発明は、前記配列とハイブリダイズし、二つの配列間で少なくとも５０％、好ましくは、少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチドにさらに関する。本発明は、特に、ストリンジェント条件下で本発明の前記ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドに関する。本発明において、「ストリンジェント条件」とは、（１）例えば、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０°C等のより低いイオン強度およびより高い温度でのハイブリダイズおよび溶出、または（２）ハイブリダイズ中に、例えば、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド（ｆｏｒｍａｍｉｄｅ）、０．１％子牛血清／０．１％フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、４２°Ｃ等の変性剤の添加、または（３）二つの配列間の同一性が少なくとも９０％以上、より好ましくは、９５％以上である場合にのみおこるハイブリダイズを指す。さらに、ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、成熟ポリペプチドと同じ生物学的機能および活性を有する。
【0137】
本発明の抗体の全長ヌクレオチド配列またはそのフラグメントは、通常、ＰＣＲ増幅法、組換え法または人工合成法によって得ることができる。特にフラグメントの長さが短い場合、実行可能な方法は、人工合成法を使用して関連する配列を合成することである。一般に、最初に複数の小さなフラグメントを合成した後、接続して非常に長い配列のフラグメントを獲得する。さらに、重鎖のコード配列および発現タグ（例えば、６Ｈｉｓ）を融合させて、融合タンパク質を形成することができる。
【0138】
関連する配列を得られたら、組換え法を使用して、関連する配列を大領に得ることができる。通常、これは、それをベクターにクローニングし、次に細胞に移し、次に従来の方法によって増殖した宿主細胞から関連する配列を単離することによって行われる。本発明に関与する生体分子（核酸、タンパク質等）は、単離された形態で存在する生体分子を含む。
【0139】
現在、完全に科学的合成によって本発明のタンパク質（またはそのフラグメントまたはその誘導体）をコードするＤＮＡ配列を得ることができる。次に、当該ＤＮＡ配列を当技術分野で知られている様々な既存のＤＮＡ分子（またはベクター等）および細胞に導入することができる。さらに、化学的合成によって突然変異を本発明のタンパク質配列に導入することができる。
【0140】
本発明は、前記適切なＤＮＡ配列および適切なプロモーターまたは制御配列を含むベクターにさらに関する。これらのベクターは、タンパク質を発現できるように適切な宿主細胞に形質転換するために使用されることができる。
【0141】
宿主細胞は、例えば、細菌細胞等の原核細胞、または例えば、酵母細胞等の下等真核細胞、または例えば、哺乳動物細胞等の上等真核細胞であり得る。代表的な例としては、大腸菌、ストレプトマイセス、チャイニーズハムスター菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の細菌細胞、酵母などの真菌細胞、ドロソフィラＳ２またはＳｆ９の昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ７および２９３細胞の動物細胞等を含む。
【0142】
組換えＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は、当業者に周知の従来の技術によって実施することができる。宿主が大腸菌などの原核生物である場合、ＤＮＡ吸収することができるコンピテント細胞は、指数増殖期の後にＣａＣｌ２法で処理されることによって獲得され、使用される段階は、当技術分野でよく知られている。別の方法は、ＭｇＣｌ２を使用することである。必要に応じて、エレクトロポレーションの方法によって、形質転換を行うこともできる。宿主が真核生物である場合、リン酸カルシウム共沈法，マイクロインジェクションおよびエレクトロポレーション等の従来の機械的方法、リポソームパッケージ等のようなＤＮＡトランスフェクション方法を選択することができる。
【0143】
得られた形質転換体を従来の方法で培養して、本発明の遺伝子がコードするポリペプチドを発現させることができる。使用される宿主細胞に応じて、培養に使用される培地は、様々な従来の培地から選択することができる。宿主細胞の増殖に適した条件下で培養する。宿主細胞が適切な細胞密度まで増殖した後、適切な方法（例えば、温度変換または化学的誘導）を使用して選択されたプロモーターを誘導し、細胞を一定期間さらに培養する。
【0144】
前記方法における組換えポリペプチドは、細胞内、または細胞膜で発現されるか、または細胞外に分泌されることができる。必要に応じて、物理的、化学的およびその他の特性を使用して、様々な単離方法で組換えされたタンパク質を単離および精製することができる。これらの方法は、当業者によく知られている。これらの方法の例は、従来の再生処理、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧滅菌、超処理、超遠心分離、モレキュラーシーブクロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液相クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および他の様々な液体クロマトグラフィー技術ならびにこれらの方法の組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【0145】
本発明の抗体は、単独で使用することができ、検出可能な標識（診断目的のために）、治療剤、ＰＫ（プロテインキナーゼ）修飾部分または上記のこれらのいずれかの物質の組み合わせと結合またはカップリングすることができる。
【0146】
診断目的の検出可能なマーカーは、蛍光または発光マーカー、放射性マーカー、ＭＲＩ（核磁気共鳴画像法）またはＣＴ（コンピュータ断層撮影技術）造影剤、または検出可能な生成物を生成することができる酵素を含むが、これらに限定されない。
【0147】
本発明の抗体と結合またはカップリングすることができる治療剤は、１．放射性核種、２．生物学的毒素、３．ＩＬ－２等のサイトカイン、４．金ナノ粒子／ナノロッド、５．ウイルス粒子、６．リポソーム、７．ナノ磁性粒子、８．プロドラッグ活性化酵素（例えば、ＤＴ－ジアホラーゼ（ＤＴＤ）またはビフェニルヒドロラーゼ－様タンパク質（ＢＰＨＬ））、９．化学療法剤（例えば、シスプラチン）または任意の形態のナノ粒子等を含むが、これらに限定されない。
【0148】
医薬組成物
本発明は、組成物をさらに提供する。好ましくは、前記組成物は、上記の抗体またはその活性断片またはその融合タンパク質、および薬学的に許容されるベクターを含む、医薬組成物である。一般に、これらの物質を、毒性がなく、不活性で、薬学的に許容される水性ベクター媒体で処方することができ、ここで、ｐＨは、通常、約５～８、好ましくは、約６～８であり、ｐＨ値は、処方される物質の性質および治療される病症によって異なる。処方された医薬組成物は、従来の経路で投与されることができ、ここで、腫瘍内、腹腔内、静脈内、または局所投与等を含む（これらに限定されない）。
本発明は、組成物をさらに提供する。好ましくは、前記組成物は、上記の抗体またはその活性断片またはその融合タンパク質、および薬学的に許容されるベクターを含む、医薬組成物である。一般に、これらの物質を、毒性がなく、不活性で、薬学的に許容される水性ベクター媒体で処方することができ、ここで、ｐＨは、通常、約５～８、好ましくは、約６～８であり、ｐＨ値は、処方される物質の性質および治療される病症によって異なる。処方された医薬組成物は、従来の経路で投与されることができ、ここで、腫瘍内、腹腔内、静脈内、または局所投与等を含む（これらに限定されない）。
【0149】
本発明の医薬組成物は、ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２タンパク質分子に結合するために直接使用することができるため、腫瘍を治療するために使用されることができる。さらに、他の治療剤と同時に使用されることができる。
【0150】
本発明の医薬組成物は、安全かつ有効量（例えば、０．００１～９９ｗｔ％、好ましくは０．０１～９０ｗｔ％、より好ましくは０．１～８０ｗｔ％）の本発明の上記の単一ドメイン抗体（またはそのコンジュゲート）および薬学的に許容されるベクターまたは賦形剤を含む。このようなベクターは、生理食塩水、緩衝液、グルコース、水、グリセリン（glycerine）、エタノール（ｅｔｈａｎｏｌ）、およびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。薬物製剤は、投与方法と一致する必要がある。本発明の医薬組成物は、例えば、生理食塩水またはグルコースと他のアジュバントとを含む水溶液を使用して、従来の方法によって注射の形態で調製することができる。注射剤および溶液等の医薬組成物は、無菌条件下で調製する必要がある。有効成分の投与量は、治療有效量であり、例えば、毎日の約１０μｇ／ｋｇ体重～約５０ｍｇ／ｋｇ体重である。さらに、本発明のポリペプチドは、他の治療剤とともに使用することもできる。
【0151】
医薬組成物を使用する場合、安全かつ有効な量の免疫コンジュゲートが哺乳動物に陽よされ、ここで、当該安全かつ有効な量は、通常、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重であり、ほとんどの場合、約５０ｍｇ／ｋｇ体重を超えなく、好ましくは、当該投与量は、約１０μｇ／ｋｇ体重～約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。もちろん，具体的な投与量は、投与経路および患者の健康状態等の要因を考慮する必要があり、これらは、すべて熟練した医師のスキル範囲内にある。
【0152】
標識された抗体
本発明の好ましい例において、前記抗体は、検出可能な標識を有する。より好ましくは、前記標識は、同位体、コロイド金標識、着色標識または蛍光標識からなる群から選択される。
本発明の好ましい例において、前記抗体は、検出可能な標識を有する。より好ましくは、前記標識は、同位体、コロイド金標識、着色標識または蛍光標識からなる群から選択される。
【0153】
コロイド金標識は、当業者に知られている方法を使用して行うことができる。本発明の好ましい解決策において、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２二重特異性抗体は、コロイド金で標識して、コロイド金標識抗体を得ることができる。
【0154】
検出方法
本発明は、ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２タンパク質を検出するための方法にさらに関する。当該方法の段階は、大まかに次のとおりである：細胞および／または組織サンプルを獲得し、サンプルを媒体に溶解し、前記溶解されたサンプル中のＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２タンパク質のレベルを検出する。
本発明は、ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２タンパク質を検出するための方法にさらに関する。当該方法の段階は、大まかに次のとおりである：細胞および／または組織サンプルを獲得し、サンプルを媒体に溶解し、前記溶解されたサンプル中のＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２タンパク質のレベルを検出する。
【0155】
本発明の検出方法において、使用されるサンプルは、特に限定されず、代表的な例としては、細胞保存液に存在する細胞含有サンプルである。
【0156】
キット
本発明は、本発明の抗体（またはその断片）または検出プレートを含むキットをさらに提供し、本発明の好ましい例において、前記キットは、容器、取扱説明書、緩衝剤等をさらに含む。
本発明は、本発明の抗体（またはその断片）または検出プレートを含むキットをさらに提供し、本発明の好ましい例において、前記キットは、容器、取扱説明書、緩衝剤等をさらに含む。
【0157】
本発明は、ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２レベルを検出するための検出キットをさらに提供し、当該キットは、ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２タンパク質を識別する抗体、サンプルを溶解する溶解媒体、例えば様々な緩衝液、検出標識、検出基質等の検出に必要な一般的な試薬および緩衝液等を含む。当該検出キットは、インビトロ診断装置であり得る。
【0158】
適用
上記のように、本発明の単一ドメイン抗体は、幅広い生物学的適用価値および臨床的適用価値を有し、その適用は、ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２に関連する疾患の診断および治療、基礎医学研究、生物学的研究等の多数の分野に関する。好ましい適用は、腫瘍治療等のＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２に対する臨床診断および標的治療である。
上記のように、本発明の単一ドメイン抗体は、幅広い生物学的適用価値および臨床的適用価値を有し、その適用は、ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２に関連する疾患の診断および治療、基礎医学研究、生物学的研究等の多数の分野に関する。好ましい適用は、腫瘍治療等のＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２に対する臨床診断および標的治療である。
【0159】
本発明の主な利点は、次のとおりである。
【0160】
（１）本発明のナノボディは、正しい空間構造を有するヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に対して高度に特異的である。
【0161】
（２）本発明のナノボディは、正しい空間構造を有するヒトＰＤ－Ｌ２タンパク質に対して高度に特異的である。
【0162】
（３）本発明のナノボディの親和性は、強い。
【0163】
（４）本発明のナノボディの製造が、容易である。
【0164】
（５）本発明は、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ２／ＰＤ－１の相互作用を同時に遮断し、免疫阻害を解除し、体の免疫系を活性化して腫瘍を殺すことができる。
【0165】
以下、本発明は、具体的実施例と併せてされに説明される。これらの実施例は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。以下の実施例において、具体的条件を示さない実験方法は、通常、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験マニュアル（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）に記載される条件等の従来の条件、またはメーカーによって提案された条件に従う。特に明記されない限り、パーセンテージおよび部数は、重量パーセンテージおよび重量部数で計算される。
【0166】
【表B】
実施例１：抗ヒトＰＤ－Ｌ２ナノボディ
１．１．ナノボディライブラリーの構築
動物免疫化
１ｍｇのヒトＰＤ－Ｌ２抗原（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入）を等量のフロイントアジュバントと混合し、２匹のラマ（Ｌｌａｍａ）を週１回、合計４回免疫し、Ｂ細胞を剌激して抗原特異的なナノボディを発現させる。４回免疫後、５０ｍｌのラマ末梢血を抽出し、リンパ球分離液で分離してリンパ球を得る。ＲＮＡ抽出試薬Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を使用して全ＲＮＡを抽出する。ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）によって逆転写して、ラマ全ｃＤＮＡを獲得する。
【0167】
ナノボディ遺伝子増幅
１回目のＰＣＲにおいて、ｃＤＮＡからＩｇＧ２、ＩｇＧ３配列が増幅される。
１回目のＰＣＲにおいて、ｃＤＮＡからＩｇＧ２、ＩｇＧ３配列が増幅される。
【0168】
【表1】
ＰＣＲ生成物をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲルを切断することによって７５０ｂｐでの断片を回収して、２回目のＶＨＨ配列増幅に使用する。２回目のＰＣＲ増幅プライマーは、次のとおりである。
【0169】
【表2】
２回目のＰＣＲ生成物を鋳型として、３回目のＰＣＲを行い、ＶＨＨ遺伝子に相同性アームを加える。３回目のＰＣＲ増幅プライマーは、次のとおりである。
【0170】
【表3】
ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮから購入）を用いて目的断片を回收する。
【0171】
ライブラリー構築
線形化された酵母ディスプレイベクターと３回目のＰＣＲ生成物を混合した後にサッカロマイセスセンビシエ（ＡＴＣＣから購入）に電気形質転換し、２匹の動物から抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディライブラリーを構築し、かつライブラリーの容量を測定し、ライブラリーの用量の大きさは、それぞれ４．４７×１０７および４．１４×１０７である。
線形化された酵母ディスプレイベクターと３回目のＰＣＲ生成物を混合した後にサッカロマイセスセンビシエ（ＡＴＣＣから購入）に電気形質転換し、２匹の動物から抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディライブラリーを構築し、かつライブラリーの容量を測定し、ライブラリーの用量の大きさは、それぞれ４．４７×１０７および４．１４×１０７である。
【0172】
１．２．ＰＤ－Ｌ２ナノボディのスクリーニング
ヒトＰＤ－Ｌ２タンパク質のビオチン化標識
適切な体積の再蒸留水を取り、ヒトＰＤ－Ｌ２タンパク質（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入）を溶解し、ビオチン標識キット（Ｔｈｅｒｍｏから購入）の製品取扱説明書に従う，ビオチンを溶解した後にタンパク質溶液と混合し、４℃下で２時間インキュベートする。脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏから購入）で余分なビオチンを除去し、脱塩カラムの前処理およびサンプル収集操作は、製品取扱説明書の手順を参照する。
ヒトＰＤ－Ｌ２タンパク質のビオチン化標識
適切な体積の再蒸留水を取り、ヒトＰＤ－Ｌ２タンパク質（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入）を溶解し、ビオチン標識キット（Ｔｈｅｒｍｏから購入）の製品取扱説明書に従う，ビオチンを溶解した後にタンパク質溶液と混合し、４℃下で２時間インキュベートする。脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏから購入）で余分なビオチンを除去し、脱塩カラムの前処理およびサンプル収集操作は、製品取扱説明書の手順を参照する。
【0173】
ＰＤ－Ｌ２特異的に結合できる酵母を濃縮するＭＡＣＳ
実施例１．２で構築したＶＨＨライブラリーをＳＤ－ＣＡＡ増幅培地（１Ｌ ＳＤ－ＣＡＡ増幅培地は、６．７ｇのＹＮＢ、５ｇのチロシン、１３．６２ｇのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、７．４４ｇのＮａＨ２ＰＯ４および２％グルコースを含む）に接種し、接種した酵母細胞の数は、＞１０×ライブラリー容量（初期増幅濃度＝０．５ＯＤ６００／ｍｌ）であり、３０℃下で、２２５ｒｐｍで一晩培養する。１０×ライブラリーの容量の酵母細胞を取り、３０００ｒｐｍ×５ｍｉｎで遠心分離して（以下の遠心分離操作も同様）培地を除去し、ＳＤ－ＣＡＡ誘導培地で酵母細胞を再懸濁し、初期濃度を０．５ＯＤ６００／ｍｌに調整し、一晩誘導する。誘導後のライブラリー濃度を測定し、１０×ライブラリーの容量の酵母細胞を取り、遠心分離して培地を除去する。５０ｍｌの洗浄液（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋２ｍＭのＥＤＴＡ）で酵母細胞を再懸濁し、遠心分離して上清を除去する。１０ｍｌの洗浄液で酵母細胞を再懸濁する。
実施例１．２で構築したＶＨＨライブラリーをＳＤ－ＣＡＡ増幅培地（１Ｌ ＳＤ－ＣＡＡ増幅培地は、６．７ｇのＹＮＢ、５ｇのチロシン、１３．６２ｇのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、７．４４ｇのＮａＨ２ＰＯ４および２％グルコースを含む）に接種し、接種した酵母細胞の数は、＞１０×ライブラリー容量（初期増幅濃度＝０．５ＯＤ６００／ｍｌ）であり、３０℃下で、２２５ｒｐｍで一晩培養する。１０×ライブラリーの容量の酵母細胞を取り、３０００ｒｐｍ×５ｍｉｎで遠心分離して（以下の遠心分離操作も同様）培地を除去し、ＳＤ－ＣＡＡ誘導培地で酵母細胞を再懸濁し、初期濃度を０．５ＯＤ６００／ｍｌに調整し、一晩誘導する。誘導後のライブラリー濃度を測定し、１０×ライブラリーの容量の酵母細胞を取り、遠心分離して培地を除去する。５０ｍｌの洗浄液（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋２ｍＭのＥＤＴＡ）で酵母細胞を再懸濁し、遠心分離して上清を除去する。１０ｍｌの洗浄液で酵母細胞を再懸濁する。
【0174】
ビオチン標識ＰＤ－Ｌ２タンパク質（最終濃度１００ｍＭ）を加え、室温下で３０分間インキュベートし、遠心分離して酵母細胞を収集し、５０ｍｌの洗浄液で酵母を３回洗浄する。５ｍｌの洗浄液で酵母細胞を再懸濁し、２００μｌのＳＡ磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉから購入）を加え、転倒して１０分間インキュベートする。洗浄液で酵母および磁気ビーズの混合物を３回洗浄し、混合物をＬＳ精製カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉから購入）に加える。ＬＳ精製カラムを磁気スタンドに置き、洗浄液で洗浄して非特異的に結合した酵母細胞を除去する。精製カラムを磁気スタンドから取り出し、洗浄液を加えて酵母を溶出する。溶出した酵母を遠心分離した後に２００ｍｌのＳＤ－ＣＡＡ増幅培地に移して増幅する。
【0175】
高親和性酵母細胞を獲得するためのフローサイトメトリー
ＭＡＣＳによって濃縮された酵母細胞をＳＤ－ＣＡＡ増幅培地に接種し、初期増幅濃度＝０．５ＯＤ６００／ｍｌである。３０℃下で、２２５ｒｐｍで振とうフラスコを一晩培養する。ＳＤ－ＣＡＡ誘導培地（１ＬのＳＤ－ＣＡＡ誘導培地は、６．７ｇのＹＮＢ、５ｇのチロシン、１３．６２ｇのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、７．４４ｇのＮａＨ２ＰＯ４ならびに２％ガラクトース、２％ラフィノースおよび０．１％グルコースを含む）で酵母細胞を再懸濁し、初期濃度は、０．５ＯＤ６００／ｍｌであり、一晩誘導する。１：２００で希釈した抗－ｃ－Ｍｙｃマウス抗体（Ｔｈｅｒｍｏから購入）および１００ｎＭのビオチン標識ＰＤ－Ｌ２抗原を加え、室温下で１０分間インキュベートする。ＰＢＳを加えて酵母を３回洗浄し、１：５００で希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ Ｐｌｕｓ ４８８蛍光抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）およびストレプトアビジンＡＰＣコンジュゲート蛍光抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を加え、４℃下で暗所で１５分間インキュベートする。２ｍｌのＰＢＳを加えて細胞を再懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ機器を用いてソーティングして、ＰＤ－Ｌ２抗原への結合能の高い酵母を獲得する。
ＭＡＣＳによって濃縮された酵母細胞をＳＤ－ＣＡＡ増幅培地に接種し、初期増幅濃度＝０．５ＯＤ６００／ｍｌである。３０℃下で、２２５ｒｐｍで振とうフラスコを一晩培養する。ＳＤ－ＣＡＡ誘導培地（１ＬのＳＤ－ＣＡＡ誘導培地は、６．７ｇのＹＮＢ、５ｇのチロシン、１３．６２ｇのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、７．４４ｇのＮａＨ２ＰＯ４ならびに２％ガラクトース、２％ラフィノースおよび０．１％グルコースを含む）で酵母細胞を再懸濁し、初期濃度は、０．５ＯＤ６００／ｍｌであり、一晩誘導する。１：２００で希釈した抗－ｃ－Ｍｙｃマウス抗体（Ｔｈｅｒｍｏから購入）および１００ｎＭのビオチン標識ＰＤ－Ｌ２抗原を加え、室温下で１０分間インキュベートする。ＰＢＳを加えて酵母を３回洗浄し、１：５００で希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ Ｐｌｕｓ ４８８蛍光抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）およびストレプトアビジンＡＰＣコンジュゲート蛍光抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を加え、４℃下で暗所で１５分間インキュベートする。２ｍｌのＰＢＳを加えて細胞を再懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ機器を用いてソーティングして、ＰＤ－Ｌ２抗原への結合能の高い酵母を獲得する。
【0176】
ＰＤ－Ｌ２ナノボディ候補分子の抗体遺伝子の抽出
ＭＡＣＳおよびＦＡＣＳ濃縮によって得られたＰＤ－Ｌ２抗原に対する結合能の高い酵母液を、ＳＤ－ＣＡＡ増幅培地で３０℃下で、２２５ｒｐｍで一晩培養し、酵母プラスミド抽出キット（Ｔｉａｎｇｅｎから購入）に従って酵母プラスミドを抽出する。プラスミドをＴｏｐ１０コンピテント細胞（Ｔｉａｎｇｅｎから購入）に電気形質転換し、アンピシリン耐性プレートでコーティングし、３７℃下で一晩培養する。シーケンシング用の単一クローンを選択してＶＨＨ遺伝子配列を獲得する。
ＭＡＣＳおよびＦＡＣＳ濃縮によって得られたＰＤ－Ｌ２抗原に対する結合能の高い酵母液を、ＳＤ－ＣＡＡ増幅培地で３０℃下で、２２５ｒｐｍで一晩培養し、酵母プラスミド抽出キット（Ｔｉａｎｇｅｎから購入）に従って酵母プラスミドを抽出する。プラスミドをＴｏｐ１０コンピテント細胞（Ｔｉａｎｇｅｎから購入）に電気形質転換し、アンピシリン耐性プレートでコーティングし、３７℃下で一晩培養する。シーケンシング用の単一クローンを選択してＶＨＨ遺伝子配列を獲得する。
【0177】
１．３．重鎖抗体の構築、発現および精製
ｐＣＤＮＡ３．１発現ベクターへの抗体遺伝子の構築
ＶＨＨ遺伝子配列は、ヒトＩｇＧ１（ＬＡＬＡ突然変異）Ｆｃセグメントに連結され、相同性リコンビナーゼを使用して、（Ｖａｚｙｍｅから購入）およびＥｃｏＲ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉ二重制限酵素で線形化されたｐＣＤＮＡ３．１ベクターで構築され、プロセスは、製品取扱説明書に従う。相同性組換え生成物をＴｏｐ１０コンピテント細胞に形質転換し、アンピシリン耐性プレートでコーティングし、３７℃下で一晩培養し、シーケンシング用の単一クローンを選択し、プラスミドを抽出する。
ｐＣＤＮＡ３．１発現ベクターへの抗体遺伝子の構築
ＶＨＨ遺伝子配列は、ヒトＩｇＧ１（ＬＡＬＡ突然変異）Ｆｃセグメントに連結され、相同性リコンビナーゼを使用して、（Ｖａｚｙｍｅから購入）およびＥｃｏＲ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉ二重制限酵素で線形化されたｐＣＤＮＡ３．１ベクターで構築され、プロセスは、製品取扱説明書に従う。相同性組換え生成物をＴｏｐ１０コンピテント細胞に形質転換し、アンピシリン耐性プレートでコーティングし、３７℃下で一晩培養し、シーケンシング用の単一クローンを選択し、プラスミドを抽出する。
【0178】
細胞トランスフェクションおよびタンパク質精製
ＥｘｐｉＣＨＯTM発現システムキット（Ｔｈｅｒｍｏから購入）を使用して、抽出したプラスミドをＥｘｐｉ－ＣＨＯ細胞に導入し、トランスフェクション方法は、製品取扱説明書に従い、細胞を５日間培養した後に上清を収集し、タンパク質Ａ磁気ビーズ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔから購入）ソーティング法で目的タンパク質を精製する。磁気ビーズを適切な体積の結合緩衝液（ＰＢＳ＋０．１％トゥイーン２０、ｐＨ７．４）で再懸濁（１～４倍の磁気ビーズの体積）した後に精製するサンプルに加え、室温下で穏やかに振とうしながら１時間インキュベートする。サンプルを磁気スタンド（Ｂｅａｖｅｒから購入）に置き、上清を捨て、磁気ビーズを結合緩衝液で３回洗浄する。磁気ビーズ体積の３～５倍の体積で溶出緩衝液（０．１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．２）を加え、室温下で５～１０分間振とうし、磁気スタンドに戻し、溶出緩衝液を収集し、中和緩衝液（１ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．５４）を加えたコレクションチューブに収集し、均一に混合して、目的タンパク質を獲得する。
ＥｘｐｉＣＨＯTM発現システムキット（Ｔｈｅｒｍｏから購入）を使用して、抽出したプラスミドをＥｘｐｉ－ＣＨＯ細胞に導入し、トランスフェクション方法は、製品取扱説明書に従い、細胞を５日間培養した後に上清を収集し、タンパク質Ａ磁気ビーズ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔから購入）ソーティング法で目的タンパク質を精製する。磁気ビーズを適切な体積の結合緩衝液（ＰＢＳ＋０．１％トゥイーン２０、ｐＨ７．４）で再懸濁（１～４倍の磁気ビーズの体積）した後に精製するサンプルに加え、室温下で穏やかに振とうしながら１時間インキュベートする。サンプルを磁気スタンド（Ｂｅａｖｅｒから購入）に置き、上清を捨て、磁気ビーズを結合緩衝液で３回洗浄する。磁気ビーズ体積の３～５倍の体積で溶出緩衝液（０．１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．２）を加え、室温下で５～１０分間振とうし、磁気スタンドに戻し、溶出緩衝液を収集し、中和緩衝液（１ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．５４）を加えたコレクションチューブに収集し、均一に混合して、目的タンパク質を獲得する。
【0179】
１．４．精製抗ＰＤ－Ｌ２抗体与ヒトＰＤ－Ｌ２結合
ヒトＰＤ－Ｌ２ ｃＤＮＡ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入）をクローニングするｐＣＨＯ１．０ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）をトランスフェクションによって、ヒトＰＤ－Ｌ２を過剰発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ２細胞）を生成する。拡大培養したＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ２細胞を２×１０６細胞／ｍｌの細胞密度に調整し、１００μｌ／ウェルを９６ウェルフロープレートに加え、遠心分離して備蓄する。精製したＰＤ－Ｌ２抗体をＰＢＳで希釈し、１０００ｎＭから初めて３倍で合計１２ポイントを希釈し、上記の希釈したサンプル１００μｌ／ウェルを上記の細胞含有９６ウェルフロープレートに加え、４℃下で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄する。ＰＢＳで１００倍希釈したヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ（ＰＥ）（Ａｂｃａｍから購入）を１００μｌ／ウェル加え、４℃下で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄する。１００μｌ／ウェルをＰＢＳに加えて細胞を再懸濁し、ＣｙｔｏＦｌｅｘ（Ｂｅｃｈｍａｎ）フローサイトメーターで検出し、かつ対応するＭＦＩを計算する。
ヒトＰＤ－Ｌ２ ｃＤＮＡ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入）をクローニングするｐＣＨＯ１．０ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）をトランスフェクションによって、ヒトＰＤ－Ｌ２を過剰発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ２細胞）を生成する。拡大培養したＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ２細胞を２×１０６細胞／ｍｌの細胞密度に調整し、１００μｌ／ウェルを９６ウェルフロープレートに加え、遠心分離して備蓄する。精製したＰＤ－Ｌ２抗体をＰＢＳで希釈し、１０００ｎＭから初めて３倍で合計１２ポイントを希釈し、上記の希釈したサンプル１００μｌ／ウェルを上記の細胞含有９６ウェルフロープレートに加え、４℃下で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄する。ＰＢＳで１００倍希釈したヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ（ＰＥ）（Ａｂｃａｍから購入）を１００μｌ／ウェル加え、４℃下で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄する。１００μｌ／ウェルをＰＢＳに加えて細胞を再懸濁し、ＣｙｔｏＦｌｅｘ（Ｂｅｃｈｍａｎ）フローサイトメーターで検出し、かつ対応するＭＦＩを計算する。
【0180】
上記の方法の測定実験において、実験結果は、図１に示されたとおりであり、本発明のすべての精製サンプルおよびＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ２細胞は、結合活性を有する。
【0181】
１．５．ＰＤ－Ｌ２抗体親和性の測定
ＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定は、既存の方法（Ｅｓｔｅｐ、Ｐら、ハイスループット法に基づく抗体－抗原親和性とエピトープとの結合の測定．ＭＡｂｓ、２０１３．５（２）：ｐ．２７０－８）に従って実行される。簡単に言えば、センサーは、分析緩衝液で３０分間オフラインで平衡化し、次に６０秒間オンラインで検出してベースラインを構築し、上記で得られた精製抗体をＡＨＱセンサーにオンラインでロードされる。センサーを１００ｎＭのＰＤ－Ｌ２抗原に５分間入れ、その後センサーをＰＢＳに移して５分間解離させる。１：１結合モデルを使用して動態学的分析を実行する。
ＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定は、既存の方法（Ｅｓｔｅｐ、Ｐら、ハイスループット法に基づく抗体－抗原親和性とエピトープとの結合の測定．ＭＡｂｓ、２０１３．５（２）：ｐ．２７０－８）に従って実行される。簡単に言えば、センサーは、分析緩衝液で３０分間オフラインで平衡化し、次に６０秒間オンラインで検出してベースラインを構築し、上記で得られた精製抗体をＡＨＱセンサーにオンラインでロードされる。センサーを１００ｎＭのＰＤ－Ｌ２抗原に５分間入れ、その後センサーをＰＢＳに移して５分間解離させる。１：１結合モデルを使用して動態学的分析を実行する。
【0182】
【表4】
１．６．ＰＤ－Ｌ２とＰＤ－１との結合を遮断する精製抗ＰＤ－Ｌ２抗体
ヒトＰＤ－１ ｃＤＮＡ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入）をクローニングしたｐＣＨＯ１．０ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）トランスフェクションによって、ヒトＰＤ－１を過剰発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ｈＰＤ－１細胞）を生成する。拡大培養したＣＨＯ－ｈＰＤ－１細胞を２×１０６細胞／ｍｌの細胞密度に調整し、１００μｌ／ウェルを９６ウェルフロープレートに加え、遠心分離して備蓄する。精製した突然変異サンプルをＰＢＳで希釈し、１０００ｎＭから３倍で合計１２ポイントを希釈し、９６ウェルサンプル希釈プレートに上記の希釈サンプル６０μｌ／ウェルを加え、同時に６０μｌ／ウェルにビオチン化ヒトＰＤ－Ｌ２タンパク質（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入）を加え、最終濃度は、１μｇ／ｍｌであり、４℃下で精製サンプルを３０分間インキュベートする。１００μｌ／ウェルの共培養サンプルを、細胞含有上記の９６ウェルフロープレートに加え、４℃下で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄する。ＰＢＳで１００倍希釈した１００μｌ／ウェルのＡＰＣヤギ抗マウスＩｇＧ（最小×反応性）抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから購入）を加え、４℃下で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄する。１００μｌ／ウェルをＰＢＳに加えて細胞を再懸濁し、ＣｙｔｏＦｌｅｘ（Ｂｅｃｈｍａｎ）フローサイトメーターで検出し、かつ対応するＭＦＩを計算する。
【0183】
上記の方法の測定実験において、実験結果如図２に示されたとおりであり、本発明のすべての精製サンプルは、ＰＤ－Ｌ２とＰＤ－１との結合を遮断することができる。
【0184】
１．７．ＰＤ－Ｌ２抗体ヒト化の構築
ヒトインビボにおけるモノクローナル抗体の免疫原性の生成を減少させるために、Ｄ－ＮＡ－９６およびＤ－Ｙｅ－２９抗体をヒト化する。ヒト化方法は、ＶＨＨヒト化一般フレームワーク移植法を使用し、同時に文献（Ｖｉｎｃｋｅ、Ｃ．ら、ヒト化ラクダ単一ドメイン抗体および一般的なヒト化ナノボディ足場を同定する一般的戦略、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８４（５）：３２７３－３２８４）で報告された方法に従って、抗体フレームワーク２（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ２）の部分アミノ酸を完全に突然変異させる。
ヒトインビボにおけるモノクローナル抗体の免疫原性の生成を減少させるために、Ｄ－ＮＡ－９６およびＤ－Ｙｅ－２９抗体をヒト化する。ヒト化方法は、ＶＨＨヒト化一般フレームワーク移植法を使用し、同時に文献（Ｖｉｎｃｋｅ、Ｃ．ら、ヒト化ラクダ単一ドメイン抗体および一般的なヒト化ナノボディ足場を同定する一般的戦略、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８４（５）：３２７３－３２８４）で報告された方法に従って、抗体フレームワーク２（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ２）の部分アミノ酸を完全に突然変異させる。
【0185】
この研究では、ＩＭＧＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）によって、Ｄ－ＮＡ－９６、Ｄ－Ｙｅ－２９およびヒト化配列のヒト化レベルを評価し、結果は、表５に示されたとおりであり、ヒト化後のすべてのサンプルヒト化レベルは、すべて８０％を超え、後期の薬物開発の要件を満たす。
【0186】
【表5】
タンパク質の構築、発現および精製方法は、実施例１．３と同じであり、ＨＰＬＣを使用して得られたタンパク質の純度を検出する。ＨＰＬＣ方法は、次のとおりである。移動相：１５０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、ｐＨ７．０。クロマトグラフィー条件：検出波長：２８０ｎｍ、カラム温度：２５℃、流速：０．３５ｍｌ／ｍｉｎ、検出時間：２０分間、Ｚｅｎｉｘ－Ｃ ＳＥＣ－３００クロマトグラフィーカラム（ＳＥＰＡＸ ４．６×３００ｍｍ、３μｍ）。
【0187】
【表6】
１．８．Ｄ－Ｎａ－９６ヒト化サンプルとヒトＰＤ－Ｌ２との結合
この実験では、精製されたＤ－Ｎａ－９６ヒト化サンプルとＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ２細胞との結合活性を検出し、実験方法は、実施例１．４と同じであり、実験結果は、図３に示されたとおりであり、Ｄ－Ｎａ－９６ヒト化サンプルは、ＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ２細胞に対して良好な結合活性を有し、レベルは、Ｄ－Ｎａ－９６に匹敵する。
【0188】
１．９．Ｄ－Ｎａ－９６／Ｄ－Ｙｅ－２９ヒト化サンプルの親和性測定
この実験は、精製されたＤ－Ｎａ－９６／Ｄ－Ｙｅ－２９ヒト化サンプルとヒトＰＤ－Ｌ２との結合親和性を検出し、実験方法は、実施例１．５と同じであり、実験結果は、表７に示されたとおりであり、Ｄ－Ｎａ－９６／Ｄ－Ｙｅ－２９ヒト化サンプルは、ヒトＰＤ－Ｌ２タンパク質に対して良好な結合活性を有する。
この実験は、精製されたＤ－Ｎａ－９６／Ｄ－Ｙｅ－２９ヒト化サンプルとヒトＰＤ－Ｌ２との結合親和性を検出し、実験方法は、実施例１．５と同じであり、実験結果は、表７に示されたとおりであり、Ｄ－Ｎａ－９６／Ｄ－Ｙｅ－２９ヒト化サンプルは、ヒトＰＤ－Ｌ２タンパク質に対して良好な結合活性を有する。
【0189】
【表7】
１．１０．ＰＤ－Ｌ２とＰＤ－１との結合を遮断するＤ－Ｎａ－９６ヒト化サンプル
この実験では、ＰＤ－Ｌ２とＰＤ－１との結合を遮断する精製されたＤ－Ｎａ－９６ヒト化サンプルを検出し、実験方法は、実施例１．６と同じであり、実験結果は、図４に示されたとおりであり、本発明のすべてのヒト化サンプルは、ＰＤ－Ｌ２とＰＤ－１との結合を遮断することができ、遮断レベルは、Ｄ－Ｎａ－９６に匹敵する。
【0190】
実施例２：抗ヒトＰＤ－Ｌ１ナノボディの開発
２．１．ナノボディライブラリーの構築
動物免疫化
ｌｍｇのヒトＰＤ－Ｌ１抗原（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入）を等量の与フロイントアジュバントと混合し、２匹のラマ（ＬｌａｍａおよびＡｌｐａｃａは、それぞれ１匹）を免疫氏、それぞれ１、２、３、５、７週目に動物を免疫し、Ｂ細胞を剌激して抗原特異的なナノボディを発現させる。５回免疫後、３００ｍｌのラマ末梢血を抽出し、リンパ球分離液で分離してリンパ球を得る。ＲＮＡ抽出試薬Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を使用して全ＲＮＡを抽出する。ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）によって逆転写して、ラマ全ｃＤＮＡを獲得する。
２．１．ナノボディライブラリーの構築
動物免疫化
ｌｍｇのヒトＰＤ－Ｌ１抗原（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入）を等量の与フロイントアジュバントと混合し、２匹のラマ（ＬｌａｍａおよびＡｌｐａｃａは、それぞれ１匹）を免疫氏、それぞれ１、２、３、５、７週目に動物を免疫し、Ｂ細胞を剌激して抗原特異的なナノボディを発現させる。５回免疫後、３００ｍｌのラマ末梢血を抽出し、リンパ球分離液で分離してリンパ球を得る。ＲＮＡ抽出試薬Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を使用して全ＲＮＡを抽出する。ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）によって逆転写して、ラマ全ｃＤＮＡを獲得する。
【0191】
他のナノライブラリー構築方法は、実施例１．１と同じである。
【0192】
２．２．ＰＤ－Ｌ１ナノボディのスクリーニングならびに重鎖抗体の構築、発現および精製
この研究では、実施例２．１で構築された酵母ディスプレイライブラリーから、ヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合できるナノボディ配列をスクリーニングし、具体的なスクリーニング方法は、実施例１．２と同じである。ＶＨＨ遺伝子配列とヒトＩｇＧ１（ＬＡＬＡ突然変異）Ｆｃセグメントとを連結し、真核発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１に構築した。ＥｘｐｉＣＨＯ発現システムおよび磁気ビーズ親和性精製システムによって、高純度の重鎖抗体タンパク質を調製する。重鎖抗体対の構築、発現および精製方法は、実施例１．３と同じである。
この研究では、実施例２．１で構築された酵母ディスプレイライブラリーから、ヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合できるナノボディ配列をスクリーニングし、具体的なスクリーニング方法は、実施例１．２と同じである。ＶＨＨ遺伝子配列とヒトＩｇＧ１（ＬＡＬＡ突然変異）Ｆｃセグメントとを連結し、真核発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１に構築した。ＥｘｐｉＣＨＯ発現システムおよび磁気ビーズ親和性精製システムによって、高純度の重鎖抗体タンパク質を調製する。重鎖抗体対の構築、発現および精製方法は、実施例１．３と同じである。
【0193】
２．３．ＰＤ－Ｌ１抗体親和性の測定
この研究では、ＦｏｒｔｅＢｉｏ機器を使用して、得られた抗ＰＤ－Ｌ１抗体とヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質との結合活性を検出し、検出方法は、実施例１．５と同じである。検出結果は、表８に示されたとおりであり、この研究で得られた３個の候補分子およびヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質は、すべて良好な結合活性を有する。
この研究では、ＦｏｒｔｅＢｉｏ機器を使用して、得られた抗ＰＤ－Ｌ１抗体とヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質との結合活性を検出し、検出方法は、実施例１．５と同じである。検出結果は、表８に示されたとおりであり、この研究で得られた３個の候補分子およびヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質は、すべて良好な結合活性を有する。
【0194】
【表8】
２．４．ＰＤ－Ｌ１抗体ヒト化の構築
ヒトインビボにおけるモノクローナル抗体の免疫原性の生成を減少させるために、Ｋ－Ｙｒ－１３＆１４－０２抗体をヒト化する。ヒト化方法は、実施例１．７と同じである。
【0195】
この研究では、ＩＭＧＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）によって、Ｋ－Ｙｒ－１３＆１４－０２およびヒト化配列のヒト化レベルを評価し、結果は、表９に示されたとおりであり、ヒト化レベルは、すべて８０％を超え、後期の薬物開発の要件を満たす。
【0196】
【表9】
タンパク質の構築、発現、精製およびＨＰＬＣ純度検出の方法は、実施例１．３と同じである。結果は、表１０に示されたとおりであり、ワンステップ精製後に高純度のヒト化抗ＰＤ－Ｌ１重鎖抗体タンパク質を獲得する。
【0197】
【表10】
２．５．ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディとヒトＰＤ－Ｌ１との結合
この実験では、精製されたヒト化サンプルＨＺ－Ｋ－Ｙｒ－１３＆１４－０２－３とＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞との結合活性を検出し、実験方法は、実施例１．４と同じであり、実験結果は、図５に示されたとおりであり、ＨＺ－Ｋ－Ｙｒ－１３＆１４－０２－３およびＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞は、良好な結合活性を有し、レベルは、Ｋ－Ｙｒ－１３＆１４－０２および対照抗体ＡＴＥに匹敵する。
【0198】
２．６．ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１ナノボディの親和性測定
この実験では、精製されたＨＺ－Ｋ－Ｙｒ－１３＆１４－０２－３とヒトＰＤ－Ｌ１との結合親和性を検出し、実験方法は、実施例１．５と同じであり、実験結果は、表１１に示されたとおりであり、ＨＺ－Ｋ－Ｙｒ－１３＆１４－０２－３およびヒトＰＤ－Ｌ２タンパク質は、良好な結合活性を有する。
この実験では、精製されたＨＺ－Ｋ－Ｙｒ－１３＆１４－０２－３とヒトＰＤ－Ｌ１との結合親和性を検出し、実験方法は、実施例１．５と同じであり、実験結果は、表１１に示されたとおりであり、ＨＺ－Ｋ－Ｙｒ－１３＆１４－０２－３およびヒトＰＤ－Ｌ２タンパク質は、良好な結合活性を有する。
【0199】
【表11】
実施例３．抗ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２二重特異性抗体
３．１．抗ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２二重特異性抗体の分子構築
この研究では、三つの異なる形態の抗ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２二重特異性抗体を構築し、その構造概略図は、図６に示されたとおりである。
【0200】
Ｂｉ－２０１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示されるアミノ酸配列を有するペプチド鎖を含み、それは、抗ＰＤ－Ｌ１のナノボディＨＺ－Ｋ－Ｙｒ－１３＆１４－０２－３を含み、前記ナノボディアミノ酸配列のＣ末端は、ヒトＩｇＧ１（ＬＡＬＡ突然変異型）ドメインに直接連結される。抗ＰＤ－Ｌ２のナノボディＨＺ－Ｄ－ＮＡ－９６－１は、柔軟なペプチド鎖（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）を介してＦｃのＣ末端に連結される。
【0201】
Ｂｉ－２０２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示されるアミノ酸配列を有するペプチド鎖を含み、抗ＰＤ－Ｌ１のナノボディＨＺ－Ｋ－１３＆１４－０２－０３アミノ酸配列のＣ末端および抗ＰＤ－Ｌ２のナノボディＨＺ－Ｄ－ＮＡ－９６－１は、柔軟なペプチド鎖（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）によって連結される。ＨＺ－Ｄ－ＮＡ－９６－１のＣ末端は、ヒトＩｇＧ１（ＬＡＬＡ突然変異型）ドメインに直接連結される。
【0202】
Ｂｉ－２０３－２０４は、二つのペプチド鎖を含む。ペプチド鎖＃１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されるアミノ酸配列を有し、抗ＰＤ－Ｌ１のナノボディＨＺ－Ｋ－Ｙｒ－１３＆１４－０２－３アミノ酸配列のＣ末端は、ヒトＩｇＧ１由来のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されるＣＨ１アミノ酸配列に直接連結され、ヒトＩｇＧ１（ＬＡＬＡ突然変異型）Ｆｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）ドメインをＣＨ１領域のＣ末端に直接連結することにより、ペプチド鎖＃１を獲得する。ペプチド鎖＃２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示されるアミノ酸配列を有し、それは、抗ＰＤ－Ｌ２ナノボディＨＺ－Ｄ－ＮＡ－９６－０１アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６を含み、前記ナノボディアミノ酸配列のＣ末端は、ヒトκ軽鎖定常領域（ＣＬ）アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に直接連結されることにより、ペプチド鎖＃２を獲得する。
【0203】
３．２．抗ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２二重特異性抗体の発現および精製
本実施例において、実施例３．１で構築された抗ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２二重特異性抗体Ｂｉ－２０１、Ｂｉ－２０２、Ｂｉ－２０３－２０４をコードするヌクレオチド配列は、すべてマルチクローニング部位を介して市販の真核発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１（＋）に連結される。ＥｘｐｉＣＨＯ発現システムおよび磁気ビーズ親和性精製システムを使用して、高純度の重鎖抗体タンパク質を調製する。タンパク質の構築、発現、精製およびＨＰＬＣ純度の検出方法は、実施例１．３と同じである。結果は、表１２に示されたとおりであり、ワンステップ精製後に高純度の二重特異性抗体タンパク質を獲得する。
本実施例において、実施例３．１で構築された抗ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２二重特異性抗体Ｂｉ－２０１、Ｂｉ－２０２、Ｂｉ－２０３－２０４をコードするヌクレオチド配列は、すべてマルチクローニング部位を介して市販の真核発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１（＋）に連結される。ＥｘｐｉＣＨＯ発現システムおよび磁気ビーズ親和性精製システムを使用して、高純度の重鎖抗体タンパク質を調製する。タンパク質の構築、発現、精製およびＨＰＬＣ純度の検出方法は、実施例１．３と同じである。結果は、表１２に示されたとおりであり、ワンステップ精製後に高純度の二重特異性抗体タンパク質を獲得する。
【0204】
【表12】
３．３．抗ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２二重特異性抗体親和性の測定
この研究では、ＦｏｒｔｅＢｉｏ機器を使用して、獲得した抗ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２二重特異性抗体およびヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質またはヒトＰＤ－Ｌ２の結合活性を検出し、検出方法は、実施例１．５と同じである。検出結果は、表１３、表１４に示されたとおりであり、この研究で得られた３個の候補分子およびヒトＰＤ－Ｌ１ならびにヒトＰＤ－Ｌ２タンパク質は、すべて良好な結合活性を有する。
【0205】
【表13】
【0206】
【表14】
３．４．抗ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２二重特異性抗体と細胞表面ヒトＰＤ－Ｌ１またはヒトＰＤ－Ｌ２との結合
この実験では、精製された抗ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２二重特異性抗体とＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞またはＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ２との結合活性を検出し、実験方法は、実施例１．４と同じであり、実験結果は、図７Ａおよび７Ｂに示されたとおりであり、Ｂｉ－２０１、Ｂｉ－２０２、Ｂｉ－２０３－２０４ならびにＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞およびＣＨＯ－ｈＰＤ－Ｌ２細胞は、すべて良好な結合活性を有する。
【0207】
３．５．ＰＤ－Ｌ２／ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との結合を遮断する抗ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２二重特異性抗体
拡大培養したＣＨＯ－ｈＰＤ－１細胞を２×１０６細胞／ｍｌの細胞密度に調整し、１００μｌ／ウェルを９６ウェルフロープレートに加え、遠心分離して備蓄する。精製した突然変異サンプルをＰＢＳで希釈し、１０００ｎＭから３倍で合計１２ポイントを希釈し、希釈した上記のサンプル６０μｌ／ウェルを９６ウェルサンプル希釈プレートに加え、同時に６０μｌ／ウェルにビオチン化ヒトＰＤ－Ｌ２タンパク質またはビオチン化ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入）を加え、最終濃度は、１μｇ／ｍｌであり、４℃下で精製サンプルとともに３０不安感インキュベートする。１００μｌ／ウェルの共培養サンプルを、上記の細胞含有９６ウェルフロープレートに加え、４℃下で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄する。ＰＢＳで１００倍した１００μｌ／ウェルのＡＰＣヤギ抗マウスＩｇＧ（最小値×反応性）抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから購入）を加え、４℃下で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄する。１００μｌ／ウェルをＰＢＳに加えて細胞を再懸濁し、ＣｙｔｏＦｌｅｘ（Ｂｅｃｈｍａｎ）フローサイトメーターで検出し、かつ対応するＭＦＩを計算する。
拡大培養したＣＨＯ－ｈＰＤ－１細胞を２×１０６細胞／ｍｌの細胞密度に調整し、１００μｌ／ウェルを９６ウェルフロープレートに加え、遠心分離して備蓄する。精製した突然変異サンプルをＰＢＳで希釈し、１０００ｎＭから３倍で合計１２ポイントを希釈し、希釈した上記のサンプル６０μｌ／ウェルを９６ウェルサンプル希釈プレートに加え、同時に６０μｌ／ウェルにビオチン化ヒトＰＤ－Ｌ２タンパク質またはビオチン化ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入）を加え、最終濃度は、１μｇ／ｍｌであり、４℃下で精製サンプルとともに３０不安感インキュベートする。１００μｌ／ウェルの共培養サンプルを、上記の細胞含有９６ウェルフロープレートに加え、４℃下で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄する。ＰＢＳで１００倍した１００μｌ／ウェルのＡＰＣヤギ抗マウスＩｇＧ（最小値×反応性）抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから購入）を加え、４℃下で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄する。１００μｌ／ウェルをＰＢＳに加えて細胞を再懸濁し、ＣｙｔｏＦｌｅｘ（Ｂｅｃｈｍａｎ）フローサイトメーターで検出し、かつ対応するＭＦＩを計算する。
【0208】
上記の方法の測定実験において、実験結果は、図８Ａおよび８Ｂに示されたとおりであり、本発明のすべての精製二重特異性抗体サンプルは、すべてＰＤ－Ｌ２およびＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との結合を遮断することができる。
【0209】
３．６．抗ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２二重特異性抗体がＰＤＬ１／ＰＤＬ２／ＰＤ１／ｌｕｃシグナル伝達経路を遮断する実験
ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２は、腫瘍細胞または免疫細胞に共発現させることができ、この実施例は、ヒトＰＤ－Ｌ１およびヒトＰＤ－Ｌ２を共発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２）、ならびにヒトＰＤ－１を過剰発現し、かつＮＦＡＴ－ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含むＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴ）を共培養する方法を使用して、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１経路およびＰＤ－Ｌ２／ＰＤ－１経路に対する精製抗体Ｂｉ－２０１、Ｂｉ－２０２、Ｂｉ－２０３－２０４の同時遮断効果を検出し、具体的な方法は、次のとおりである。
ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２は、腫瘍細胞または免疫細胞に共発現させることができ、この実施例は、ヒトＰＤ－Ｌ１およびヒトＰＤ－Ｌ２を共発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２）、ならびにヒトＰＤ－１を過剰発現し、かつＮＦＡＴ－ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含むＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴ）を共培養する方法を使用して、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１経路およびＰＤ－Ｌ２／ＰＤ－１経路に対する精製抗体Ｂｉ－２０１、Ｂｉ－２０２、Ｂｉ－２０３－２０４の同時遮断効果を検出し、具体的な方法は、次のとおりである。
【0210】
ＣＨＯ－Ｋ１－ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２細胞を５×１０５細胞／ｍｌの密度に調整し、１００μｌ／ウェルを９６ウェル細胞培養用白底プレートに接種し、３７℃下、５％ＣＯ２インキュベーターに置いて一晩培養する。精製抗体および対照抗体１６４０完全培地を段階希釈した後、備蓄する。Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴ細胞を１６４０完全培地で２．５×１０５細胞／ｍｌの細胞密度に調整し、備蓄する。白底プレートを取り出し、培養上清を吸引し、上記のサンプルを対応する濃度に希釈し、４０μｌ／ウェルを取って白底プレートに加え、同時に４０μｌ／ウェルのＪｕｒｋａｔ－ＰＤ－１－ＮＦＡＴエフェクター細胞懸濁液を加え、３７℃下、５％ＣＯ２インキュベーターに置いて６時間接着培養する。各ウェルにＢｉｏ－Ｇｌｏ ＴＭ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、マルチプレートリーダーを用いて蛍光シグナル値を読み取る。
【0211】
実験結果は、図９に示されたとおりである。本発明の抗ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２二重特異性抗体は、インビトロでＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ２／ＰＤ－１シグナル伝達経路を同時に遮断し、下流レポーター遺伝子の発現を活性化することができる。抗ＰＤ－Ｌ１または抗ＰＤ－Ｌ２のモノクローナル抗体は、すべて当該経路を完全に遮断しかつ下流レポーター遺伝子の発現を活性化することはできない。
【0212】
本発明で言及されたすべての文書は、あたかも各文書が個別に参照として引用されたかのように、本出願における参照として引用される。さらに、本発明の上記の教示内容を読んだ後、当業者は本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの同等の形態も、本出願の添付の請求範囲によって定義される範囲に含まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【配列表】