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特許7513287角層細胞間の接着タンパク質の増減に影響を与える成分のスクリーニング方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-07-01
(45)【発行日】2024-07-09
(54)【発明の名称】角層細胞間の接着タンパク質の増減に影響を与える成分のスクリーニング方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20240702BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20240702BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20240702BHJP
G01N 1/04 20060101ALI20240702BHJP
G01N 1/28 20060101ALI20240702BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 Y
G01N33/50 Q
G01N33/50 Z
G01N33/15 Z
G01N1/04 V
G01N1/04 H
G01N1/28 J
【請求項の数】
6
(21)【出願番号】P 2021520870
(86)(22)【出願日】2020-05-22
(86)【国際出願番号】 JP2020020229
(87)【国際公開番号】W WO2020235668
(87)【国際公開日】2020-11-26
【審査請求日】2023-05-08
(31)【優先権主張番号】P 2019096940
(32)【優先日】2019-05-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000113470
【氏名又は名称】ポーラ化成工業株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100137338
【弁理士】
【氏名又は名称】辻田 朋子
(74)【代理人】
【識別番号】100196313
【弁理士】
【氏名又は名称】村松 大輔
(72)【発明者】
【氏名】多田 明弘
(72)【発明者】
【氏名】武重 史佳
【審査官】倉持 俊輔
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１７－１１９６６５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００９－１１５８１３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１４－１３９５４０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００１－０９７８１５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１６－０３７５０１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開平０８－０６８７９１（ＪＰ，Ａ）
【文献】新道弘規，免疫組織化学染色に使用されるコートスライドガラスの組織切片接着メカニズム，THE CHEMICAL TIMES，2010年，2010 No.1 (通巻21号)，9-13
【文献】橿淵暢夫，外１名，角層細胞による肌評価法の開発，J.Soc.Cosmet.Chem.Japan，1989年，Vol.23，No.1，55-57
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／５３
Ａ６１Ｋ ８／００
Ｇ０２Ｂ ２１／３４
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
角層細胞間の接着タンパク質の増減に影響を与える成分のスクリーニング方法であって、テープストリッピング法を用いて、角層細胞を採取する採取工程と、
表面が正電荷に帯電したスライドガラス上に、角層細胞を転写する転写工程と、
前記スライドガラスを洗浄する洗浄工程と、
前記スライドガラスに探索対象成分を添加し、免疫組織染色法により、接着タンパク質を染色し、スクリーニング試料を調製する調製工程と、
前記スクリーニング試料の任意の箇所を撮影し、解析用画像を得る画像取得工程と、
前記解析用画像における染色部分の面積を指標として、前記探索対象成分の接着タンパク質の増減への影響を評価する評価工程を備え
前記調製工程において、前記探索対象成分の種類が同一であって、濃度が異なる複数のスクリーニング試料を調製し、
前記評価工程が、複数の前記スクリーニング試料の染色部分の面積を比較して、接着タンパク質の量を減少する作用における最適濃度を評価する工程である、スクリーニング方法。
【請求項2】
前記転写工程は、ＮＨ
３
＋
を表面に配置したスライドガラスに角層細胞を転写し、ＮＨ
３
＋
が角層細胞中のリン脂質のカルボキシル基とイオン結合を形成し、角層細胞をスライドガラスからはがれにくくする、転写工程である、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項3】
前記調製工程において、前記探索対象成分を添加せずにスクリーニング対照試料を調製し、前記評価工程が、前記スクリーニング試料の染色部分の面積と、前記スクリーニング対照試料の染色部分の面積とを比較して、前記スクリーニング試料の染色部分の面積が小さい場合、前記探索対象成分は接着タンパク質の量を減少する作用を有すると評価する工程である、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項4】
前記接着タンパク質が、デスモグレイン１（ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ１）である、請求項１～３の何れか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項5】
前記スライドガラスが、表面にＮＨ３
＋が配列されたスライドガラスである、請求項１～４の何れか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項6】
前記洗浄工程が、前記スライドガラスをキシレンに浸漬する工程である、請求項１～５の何れか一項に記載のスクリーニング方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、角層細胞間の接着タンパク質の増減に影響を与える成分のスクリーニング方法、及び当該スクリーニング方法に適した角層細胞試料の調製方法に関する。
【背景技術】
【0002】
角化細胞（ケラチノサイト）の接着装置として代表的なものにデスモソームがある。デスモソームは、表皮細胞間及び角層細胞間の接着に関与している構造物であり、デスモソームを介する表皮細胞同士の接着はケラチン線維からなる細胞骨格と連携し、上皮組織における強固な構築が維持されるものであることが知られている。
【0003】
肌荒れ、日焼けや乾燥により生じる角層の落屑等の肌状態の悪化に関し、デスモゾームタンパク質の増加が原因の一つとして知られている。
デスモゾームタンパク質の量をコントロールする方法として、角層に蓄積したデスモゾームタンパク質のプロテアーゼにより分解し、ニキビ、フケ、落屑を改善する方法がこれまでに報告されている（特許文献１）。
デスモゾームタンパク質の量をコントロールする方法として、角層に蓄積したデスモゾームタンパク質のプロテアーゼにより分解し、ニキビ、フケ、落屑を改善する方法がこれまでに報告されている（特許文献１）。
【0004】
このデスモソームの構成タンパク質は、デスモグレイン１、２、３、４、デスモコリン１、２、３、及びデスモプラキン１、２等が知られている。
このデスモソームの構成タンパクの中でも、特に接着タンパク質のデスモグレイン１が、デスモソーム成分のタンパク分解と細胞剥離との間に密接な相関関係がある。このため、角層のデスモグレインの存在状態を確認することは、デスモソーム機能を評価することでもあり、皮膚の状態を評価する上で極めて重要である。
このデスモソームの構成タンパクの中でも、特に接着タンパク質のデスモグレイン１が、デスモソーム成分のタンパク分解と細胞剥離との間に密接な相関関係がある。このため、角層のデスモグレインの存在状態を確認することは、デスモソーム機能を評価することでもあり、皮膚の状態を評価する上で極めて重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】特表平７－５０５３８３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
上述したことから、デスモソーム、又はデスモソームを構成する接着タンパク質の量を減少する成分の探索が求められている。
このような成分のスクリーニング方法として、テープストリッピング法を用いた角層細胞の採取、及びスライドガラスへの転写により、角層細胞試料を調製し、免疫組織染色法により接着タンパク質を染色し、任意の顕微鏡で観察する手法が存在する。
このような成分のスクリーニング方法として、テープストリッピング法を用いた角層細胞の採取、及びスライドガラスへの転写により、角層細胞試料を調製し、免疫組織染色法により接着タンパク質を染色し、任意の顕微鏡で観察する手法が存在する。
【0007】
ところで、テープストリッピング法を用いた角層細胞の転写は、スライドガラスに粘着テープの成分が残り、これが染色されることで接着タンパク質と区別できなくなる恐れがあるため、スライドガラスを洗浄する必要がある。
しかし、スライドガラスを洗浄すると、転写した角層細胞まで剥離してしまい、角層細胞中に存在する接着タンパク質の存在量を指標とした評価が困難であり、十分なスクリーニング方法であるといえなかった。
しかし、スライドガラスを洗浄すると、転写した角層細胞まで剥離してしまい、角層細胞中に存在する接着タンパク質の存在量を指標とした評価が困難であり、十分なスクリーニング方法であるといえなかった。
【0008】
本発明の課題は、従来の方法と比して正確な、デスモグレインをはじめとする角層細胞間に存在する接着タンパク質の増減に影響を与える成分のスクリーニング方法を提供することにある。
また、本発明のさらなる課題は、上述したスクリーニング方法において、より正確に接着タンパク質の存在量を評価するための角層細胞試料の調製方法を提供することにある。
また、本発明のさらなる課題は、上述したスクリーニング方法において、より正確に接着タンパク質の存在量を評価するための角層細胞試料の調製方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0009】
前記課題を解決する本発明は、
角層細胞間の接着タンパク質の増減に影響を与える成分のスクリーニング方法であって、
テープストリッピング法を用いて、角層細胞を採取する採取工程と、
表面が正電荷に帯電したスライドガラス上に、角層を転写する転写工程と、
前記スライドガラスを洗浄する洗浄工程と、
前記スライドガラスに探索対象成分を添加し、免疫組織染色法により、接着タンパク質を染色し、スクリーニング試料を調製する調製工程と、
前記スクリーニング試料の任意の箇所を撮影し、解析用画像を得る画像取得工程と、
前記解析用画像における染色部分の面積を指標として、前記探索対象成分のコンパクト角層の形成阻害作用を評価する評価工程を備える。
角層細胞間の接着タンパク質の増減に影響を与える成分のスクリーニング方法であって、
テープストリッピング法を用いて、角層細胞を採取する採取工程と、
表面が正電荷に帯電したスライドガラス上に、角層を転写する転写工程と、
前記スライドガラスを洗浄する洗浄工程と、
前記スライドガラスに探索対象成分を添加し、免疫組織染色法により、接着タンパク質を染色し、スクリーニング試料を調製する調製工程と、
前記スクリーニング試料の任意の箇所を撮影し、解析用画像を得る画像取得工程と、
前記解析用画像における染色部分の面積を指標として、前記探索対象成分のコンパクト角層の形成阻害作用を評価する評価工程を備える。
【0010】
細胞表面は、リン脂質のカルボキシ基により、負電荷（ＣＯＯ－）を有することが知られている。
本発明のスクリーニング方法によれば、表面が正電荷に帯電したスライドガラス上に、角層細胞を転写することで、洗浄による角層細胞の剥離を防止することができ、より正確に角層細胞中の接着タンパク質の存在量を評価することができる。
本発明のスクリーニング方法によれば、表面が正電荷に帯電したスライドガラス上に、角層細胞を転写することで、洗浄による角層細胞の剥離を防止することができ、より正確に角層細胞中の接着タンパク質の存在量を評価することができる。
【0011】
本発明の好ましい形態では、
前記調製工程において、前記探索対象成分を添加しないスクリーニング対照試料を試料し、
前記評価工程が、前記スクリーニング試料の染色部分の面積と、前記スクリーニング対照試料の染色部分の面積とを比較して、前記スクリーニング試料の染色部分の面積が小さい場合、前記探索対象成分は接着タンパク質の量を減少する作用を有すると評価する工程である。
このような形態とすることで、より正確に接着タンパク質の増減に影響を与える成分をスクリーニングすることができる。
前記調製工程において、前記探索対象成分を添加しないスクリーニング対照試料を試料し、
前記評価工程が、前記スクリーニング試料の染色部分の面積と、前記スクリーニング対照試料の染色部分の面積とを比較して、前記スクリーニング試料の染色部分の面積が小さい場合、前記探索対象成分は接着タンパク質の量を減少する作用を有すると評価する工程である。
このような形態とすることで、より正確に接着タンパク質の増減に影響を与える成分をスクリーニングすることができる。
【0012】
本発明の好ましい形態では、
前記調製工程において、前記探索対象成分の種類が同一であって、濃度が異なる複数のスクリーニング試料を調製し、
前記評価工程が、複数の前記スクリーニング試料の染色部分の面積を比較して、接着タンパク質の量を減少する作用における最適濃度を評価する工程である。
このような形態とすることで、接着タンパク質の量を減少する作用を有する成分のスクリーニングのみならず、その最適な濃度を評価することができる。
前記調製工程において、前記探索対象成分の種類が同一であって、濃度が異なる複数のスクリーニング試料を調製し、
前記評価工程が、複数の前記スクリーニング試料の染色部分の面積を比較して、接着タンパク質の量を減少する作用における最適濃度を評価する工程である。
このような形態とすることで、接着タンパク質の量を減少する作用を有する成分のスクリーニングのみならず、その最適な濃度を評価することができる。
【0013】
本発明の好ましい形態では、前記接着タンパク質が、デスモグレイン１（ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ１）である。
【0014】
本発明の好ましい形態では、前記スライドガラスが、表面にＮＨ３
＋が配列されたスライドガラスである。
ＮＨ３ ＋は、細胞表面のＣＯＯ－とイオン結合を形成するため、角層細胞のスライドガラスへの接着性を向上させることができる。
ＮＨ３ ＋は、細胞表面のＣＯＯ－とイオン結合を形成するため、角層細胞のスライドガラスへの接着性を向上させることができる。
【0015】
本発明の好ましい形態では、前記洗浄工程が、前記スライドガラスをキシレンに浸漬する工程である。
スライドガラスをキシレンに浸漬することにより洗浄することで、角層細胞の剥離をより抑制することができる。
スライドガラスをキシレンに浸漬することにより洗浄することで、角層細胞の剥離をより抑制することができる。
【0016】
また、前記課題を解決する本発明は、
テープストリッピング法を用いた角層細胞試料の調製方法であって、
表面が正電荷に帯電したスライドガラス上に、角層を転写する転写工程と、
前記スライドガラスを洗浄する洗浄工程と、を備える。
表面が正電荷に帯電したスライドガラス上に、角層を転写することで、その後の洗浄工程における、スライドガラスからの角層細胞の剥離を抑制することができる。
テープストリッピング法を用いた角層細胞試料の調製方法であって、
表面が正電荷に帯電したスライドガラス上に、角層を転写する転写工程と、
前記スライドガラスを洗浄する洗浄工程と、を備える。
表面が正電荷に帯電したスライドガラス上に、角層を転写することで、その後の洗浄工程における、スライドガラスからの角層細胞の剥離を抑制することができる。
【0017】
本発明の好ましい形態では、前記スライドガラスが表面にＮＨ３
＋が配列されたスライドガラスである。
【発明の効果】
【0018】
本発明のスクリーニング方法によれば、従来の方法と比してより正確に、接着タンパク質の増減に影響を与える成分をスクリーニングすることができる。
また、本発明の角層細胞の調製方法によれば、スライドガラス上の角層細胞の剥離を抑制することができる。
また、本発明の角層細胞の調製方法によれば、スライドガラス上の角層細胞の剥離を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】本実施形態のスクリーニング方法を示すフローチャートである。
【図2】本実施形態における角層細胞試料の調製工程を示すフローチャートである。
【図3】本実施形態における評価工程を示すフローチャートである。
【図4】角層細胞試料にワイルドタイム抽出物、トゲナシ抽出物を探索対象成分として添加したスクリーニング試料、及びスクリーニング対照試料の顕微鏡画像である。
【図5】スクリーニング対照試料の染色部分の面積を１００％とした場合における、スクリーニング試料の染色部分の面積比を表わすグラフである。
【図6】実施例２における、デスモグレイン１量の測定結果を示す図面（代表）である。
【図7】実施例２における、デスモグレイン１量の測定結果を示すグラフである。
【図8】実施例３における、L＊値の測定結果を示すグラフである。
【図9】実施例３における、a＊値の測定結果を示すグラフである。
【図10】実施例３における、b＊値の測定結果を示すグラフである。
【図11】実施例３における、硬度の測定結果を示すグラフである。
【図12】実施例３における、デスモグレイン１量の測定結果を示すグラフである。
【図13】実施例３における、デスモグレイン１量の測定結果を示す図（代表）である。
【図14】実施例４における、デスモグレイン１量の測定結果を示す図（代表）である。
【図15】実施例４における、デスモグレイン１量の測定結果を示すグラフである。
【図16】実施例４における、角層細胞の剥離の様子を観察した光学顕微鏡像である。
【図17】実施例５における、デスモグレイン１量の測定結果を示す図（代表）である。
【図18】実施例５における、デスモグレイン１量の測定結果を示すグラフ（６週間）である。
【図19】実施例５における、デスモグレイン１量の測定結果を示すグラフ（１２週間）である。
【0020】
以下、図１～３のフローチャートを参考にして、本発明のスクリーニング方法について詳述する。
【0021】
本発明のスクリーニング方法は、角層細胞試料調製ステップＳ１０、スクリーニング試料調製ステップＳ２０、画像取得ステップＳ３０、及び評価ステップＳ４０を備える。
【0022】
（１）角層細胞試料調製工程
図２に、ステップＳ１０を詳細に表したフローチャートを示す。
ステップＳ１０は、テープストリッピング法により角層細胞を採取する採取ステップＳ１１を行う。
テープストリッピング法とは、粘着テープに代表される感圧接着剤を肌に貼り付け、剥がすことで肌の細胞を剥離する方法の総称である。
使用する感圧接着剤は特に限定されないが、簡便性の観点からセロハンテープを用いることが好ましい。
図２に、ステップＳ１０を詳細に表したフローチャートを示す。
ステップＳ１０は、テープストリッピング法により角層細胞を採取する採取ステップＳ１１を行う。
テープストリッピング法とは、粘着テープに代表される感圧接着剤を肌に貼り付け、剥がすことで肌の細胞を剥離する方法の総称である。
使用する感圧接着剤は特に限定されないが、簡便性の観点からセロハンテープを用いることが好ましい。
【0023】
次いで、ステップＳ１１で採取した角層細胞を、表面が正電荷に帯電したスライドガラスに転写する転写ステップＳ１２を行う。
【0024】
角層細胞等のヒト細胞の表面は、脂質二重膜を形成するリン脂質のカルボキシ基（ＣＯＯ－）の影響で、負電荷を帯びている。
ステップＳ１２において、表面が正電荷に帯電したスライドガラスに角層細胞を転写することによって、静電的相互作用により角層細胞がスライドガラスから剥離し難くなる。
ステップＳ１２において、表面が正電荷に帯電したスライドガラスに角層細胞を転写することによって、静電的相互作用により角層細胞がスライドガラスから剥離し難くなる。
【0025】
表面が正電荷に帯電したスライドガラスとしては、スライドガラス表面をポリリジン、ポリアルキルアミン、及びアミノ変性シリコーン等で修飾したスライドガラスが例示できる。
本発明においては、スライドガラスの表面がＮＨ３ ＋が配列したスライドガラスを用いることが好ましい。
ＮＨ３ ＋は、リン脂質のカルボキシ基とイオン結合を形成するため、角層細胞がスライドガラスからより剥離し難くなる、
本発明においては、スライドガラスの表面がＮＨ３ ＋が配列したスライドガラスを用いることが好ましい。
ＮＨ３ ＋は、リン脂質のカルボキシ基とイオン結合を形成するため、角層細胞がスライドガラスからより剥離し難くなる、
【0026】
スライドガラスの表面にＮＨ３
＋が配列したスライドガラスとしては、市販の物を用いることができ、例えば、「ＰＬＬコートスライドグラス」（松浪硝子工業株式会社製）、「ＡＰＳコートスライドグラス」（松浪硝子工業株式会社製）、及び「ＭＡＳコートスライドグラス」（松浪硝子工業株式会社製）等が例示できる。
【0027】
次いで、角層細胞を転写したスライドガラスを洗浄する洗浄ステップＳ１３を行う。
スライドガラスの洗浄方法は、特に限定されず、振とう式、及び超音波式の洗浄機を用いて洗浄することができる。
本発明においては、有機化合物を含む洗浄剤にスライドガラスを浸漬することで洗浄することが好ましい。
このような形態とすることで、より角層細胞の剥離を抑制することができる。
スライドガラスの洗浄方法は、特に限定されず、振とう式、及び超音波式の洗浄機を用いて洗浄することができる。
本発明においては、有機化合物を含む洗浄剤にスライドガラスを浸漬することで洗浄することが好ましい。
このような形態とすることで、より角層細胞の剥離を抑制することができる。
【0028】
洗浄剤としては、キシレン、クロロホルム、酢酸エチル等の有機溶剤が例示できるが、角層細胞の接着タンパク質の量に影響を及ぼさないキシレンを用いることが好ましい。
【0029】
浸漬による洗浄を行う場合、その浸漬時間は、室温であれば、好ましくは３時間以上であり、より好ましくは６時間以上であり、さらに好ましくは１２時間以上であり、特に好ましくは２４時間以上である。
【0030】
上述したステップを得て、角層細胞試料を調製したら、次いでスクリーニング試料調製ステップＳ２０を行う。
ステップＳ２０は、探索対象となる成分（以下、探索対象成分という）を、角層細胞試料に添加する。
ステップＳ２０は、探索対象となる成分（以下、探索対象成分という）を、角層細胞試料に添加する。
【0031】
探索対象成分は特に限定されないが、接着タンパク質の量を減少する作用を有する成分をヒトに適用することに鑑みれば、例えば、化粧品に適用可能な成分、及び食品に適用可能な成分を探索対象成分とすることができる。
このような成分として、例えば植物抽出物が例示できる。
このような成分として、例えば植物抽出物が例示できる。
【0032】
探索対象成分は、スクリーニングを行う濃度に応じて、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈することが好ましい。
【0033】
本発明の一実施形態においては、探索対象成分を添加しない、スクリーニング対照試料を調製してもよい。
このような実施形態は、接着タンパク質の量を減少する作用を有する成分の種類のスクリーニングに適している。
このような実施形態は、接着タンパク質の量を減少する作用を有する成分の種類のスクリーニングに適している。
【0034】
本発明の一実施形態においては、探索対象成分の種類が同一であって、濃度が異なる複数のスクリーニング試料を調製してもよい。
このような実施形態は、接着タンパク質の量を減少する作用を奏する、最適な濃度のスクリーニングに適している。
このような実施形態は、接着タンパク質の量を減少する作用を奏する、最適な濃度のスクリーニングに適している。
【0035】
また、ステップＳ２０において、探索対象成分を添加した角層細胞を、免疫組織染色法により染色する。
免疫組織染色法による染色は、常法により行うことができ、接着タンパク質の種類に応じて、直接法、間接法及び増感法を任意に選択することができる。
また、必要に応じて、任意のブロッキング剤を用いることができる。
免疫組織染色法による染色は、常法により行うことができ、接着タンパク質の種類に応じて、直接法、間接法及び増感法を任意に選択することができる。
また、必要に応じて、任意のブロッキング剤を用いることができる。
【0036】
染色する対象となる接着タンパク質は、角層細胞に含まれるものであれば特に限定されないが、好ましくはデスモグレイン１である。
デスモグレイン１は、デスモソーム成分のタンパク分解と細胞剥離との間に密接な相関関係があり、その量の増減に影響を与える成分のスクリーニングは、非常に有用である。
デスモグレイン１は、デスモソーム成分のタンパク分解と細胞剥離との間に密接な相関関係があり、その量の増減に影響を与える成分のスクリーニングは、非常に有用である。
【0037】
次いで、接着タンパク質を染色した角層細胞の画像を撮影する画像取得ステップＳ３０を行う。
画像の撮影は、顕微鏡を用いて行われる。顕微鏡の種類は特に限定されず、ステップＳ２０で行った免疫組織染色法に応じて、適当な顕微鏡を用いることができる。
顕微鏡としては、光学顕微鏡、共焦点レーザー顕微鏡、光学顕微鏡、電子顕微鏡等が挙げられる。
画像の撮影は、顕微鏡を用いて行われる。顕微鏡の種類は特に限定されず、ステップＳ２０で行った免疫組織染色法に応じて、適当な顕微鏡を用いることができる。
顕微鏡としては、光学顕微鏡、共焦点レーザー顕微鏡、光学顕微鏡、電子顕微鏡等が挙げられる。
【0038】
本発明においては、共焦点レーザー顕微鏡を用いることが好ましい。
共焦点レーザー顕微鏡を用いることで、染色部分（接着タンパク質）と非染色部分（接着タンパク質以外の部分、スライドガラス等）との境界がぼけずに、ピントがあった画像を撮影することができるため、染色部分を指標とした本発明のスクリーニング方法の精度を上げることができる。
なお、共焦点レーザー顕微鏡を用いる場合には、前記免疫組織染色法として、蛍光抗体法を採用することが好ましい。
共焦点レーザー顕微鏡を用いることで、染色部分（接着タンパク質）と非染色部分（接着タンパク質以外の部分、スライドガラス等）との境界がぼけずに、ピントがあった画像を撮影することができるため、染色部分を指標とした本発明のスクリーニング方法の精度を上げることができる。
なお、共焦点レーザー顕微鏡を用いる場合には、前記免疫組織染色法として、蛍光抗体法を採用することが好ましい。
【0039】
次いで、撮影した画像から、角層細胞が転写された部分内において、無作為に選択した範囲を拡大し、白黒画像（二値画像）に変換する。
得られた画像から、染色部分、及び／又は非染色部分の面積値、あるいは染色部分及び／又は非染色部分の面積の割合（％）を算出する（以下、単に面積というときは、面積値、及び面積の割合の両方を含む）。
得られた画像から、染色部分、及び／又は非染色部分の面積値、あるいは染色部分及び／又は非染色部分の面積の割合（％）を算出する（以下、単に面積というときは、面積値、及び面積の割合の両方を含む）。
【0040】
上述した画像処理、及び面積の算出については、画像解析ソフトを用いて行うことができる。
画像解析ソフトとしては、「Ｉｍａｇｅ Ｊ（アメリカ国立衛生研究所、ＮＩＨ）」等が例示できる。
画像解析ソフトとしては、「Ｉｍａｇｅ Ｊ（アメリカ国立衛生研究所、ＮＩＨ）」等が例示できる。
【0041】
染色部分の面積は、複数の無作為に選択した範囲から算出した面積の平均値とすることが好ましい。
複数箇所の面積の平均値を指標とすることで、より正確なスクリーニングを行うことができる。
複数箇所の面積の平均値を指標とすることで、より正確なスクリーニングを行うことができる。
【0042】
次いで、ステップＳ３０にて得られた面積を指標として、探索対象成分の接着タンパク質の増減への影響を評価する評価ステップＳ４０を行う。
【0043】
図３に、ステップＳ４０を詳細に表したフローチャートを示す。図３を参照して、前記スクリーニング試料の染色部分の面積と、前記スクリーニング対照試料の染色部分の面積とを比較する一実施形態における、評価工程について説明する。
【0044】
ステップＳ４１において、スクリーニング試料の染色部分の面積Ａｔと、スクリーニング対照試料の染色部分の面積Ａｃとを比較する。
面積の比較は、面積の絶対値の比較であっても良く、スクリーニング対照試料の面積を１００％とした場合における面積の割合の比較であってもよい。
複数のスクリーニング試料について評価を行う場合には、スクリーニング対照試料の面積を１００％とした比較を行うのが好ましい。
面積の比較は、面積の絶対値の比較であっても良く、スクリーニング対照試料の面積を１００％とした場合における面積の割合の比較であってもよい。
複数のスクリーニング試料について評価を行う場合には、スクリーニング対照試料の面積を１００％とした比較を行うのが好ましい。
【0045】
面積Ａｔが面積Ａｃより小さい場合（面積Ａｔ ＜ 面積Ａｃ）、ステップＳ４２に移行し、当該スクリーニング試料に添加した探索対象成分は、接着タンパク質の量を減少する作用を有する成分であると評価する。
【0046】
一方で、面積Ａｔが面積Ａｃと同一、又は面積Ａｔが面積Ａｃより大きい高い場合（面積Ａｔ ≧ 面積Ａｃ）にはステップＳ４３に移行し、当該スクリーニング試料に添加した探索対象成分は、接着タンパク質の量を減少する作用を有さない成分であると評価する。
【0047】
図３を参照して、一実施形態に係る評価工程について説明したが、本発明のスクリーニング方法における評価工程は、スクリーニング試料の染色部分の面積を指標とした、接着タンパク質の増減への影響の評価であれば、特に限定されない。
【0048】
例えば、接着タンパク質の量を増加する成分をスクリーニングしたい場合においては、ステップＳ４１にて、「面積Ａｔ ＞ 面積Ａｃ」であるかを判定し、結果が「ｙｅｓ」であれば、ステップＳ４２にて、「接着タンパク質の量を増加する作用を有する成分である」と評価してもよい。
また、ステップＳ４２において、「接着タンパク質の量を減少する作用を有する成分である」と評価し、ステップＳ４３において、「接着タンパク質の量を増加する作用を有する成分である」と評価してもよい。
また、ステップＳ４２において、「接着タンパク質の量を減少する作用を有する成分である」と評価し、ステップＳ４３において、「接着タンパク質の量を増加する作用を有する成分である」と評価してもよい。
【0049】
また、別の実施形態においては、ステップＳ２０で説明した通り、探索対象成分の濃度が異なる複数のスクリーニング試料を調製し、これらを評価する工程であってもよい。
当該実施形態においては、複数のスクリーニング試料における面積を比較し、接着タンパク質の量が減少する作用、又は増加する作用において、顕著な効果が発現するしきい値となる特定の濃度が存する場合には、「当該探索対象成分は、特定の濃度以上で顕著な接着タンパク質の量が減少する作用、又は増加する作用を有する。」と評価することができる。
また、特定の濃度以上としないと上記作用が発現しない成分については、「当該探索対象成分は、特定の濃度以上で接着タンパク質の量が減少する作用、又は増加する作用を発現する」と評価することができる。
当該実施形態においては、複数のスクリーニング試料における面積を比較し、接着タンパク質の量が減少する作用、又は増加する作用において、顕著な効果が発現するしきい値となる特定の濃度が存する場合には、「当該探索対象成分は、特定の濃度以上で顕著な接着タンパク質の量が減少する作用、又は増加する作用を有する。」と評価することができる。
また、特定の濃度以上としないと上記作用が発現しない成分については、「当該探索対象成分は、特定の濃度以上で接着タンパク質の量が減少する作用、又は増加する作用を発現する」と評価することができる。
【0050】
本発明のスクリーニング方法は、敏感肌の改善及び／又は予防のために用いられる成分のスクリーニングに用いることが好ましい。
ここで、本明細書における「敏感肌」は、外部刺激（乾燥、紫外線、化合物の塗布）抵抗性が低下（皮膚刺激値が低下）した肌質をいう。
ここで、本明細書における「敏感肌」は、外部刺激（乾燥、紫外線、化合物の塗布）抵抗性が低下（皮膚刺激値が低下）した肌質をいう。
【0051】
より具体的には、本明細書における「敏感肌」は、（１）及び／又は（２）で提起される肌質をいう。
【0052】
（１）「医薬品外用剤、化粧品、植物、紫外線、金属などの物質に反応し、皮膚トラブルを起こしやすい肌。また、アレルギー性物質（花粉、香料など）や刺激性物質（アルコールなど）に過敏な肌」
（２）「睡眠不足、過労、生理、季節の変わり目、精神的なストレスなどの状況下で、刺激物に対して一時的に皮膚トラブルを起こしやすくなる肌。」
（２）「睡眠不足、過労、生理、季節の変わり目、精神的なストレスなどの状況下で、刺激物に対して一時的に皮膚トラブルを起こしやすくなる肌。」
【0053】
また、本明細書における「敏感肌の改善及び／又は予防のため」は、外部刺激抵抗性が低下（皮膚刺激閾値が低下）した肌質の改善、及び／又は、肌質における外部刺激抵抗性の低下（皮膚刺激閾値の低下）の予防を指す。
【0054】
また、本発明のスクリーニング方法は、ヒト表皮角化細胞の細胞間接着抑制作用を有する成分のスクリーニングに用いることが好ましい。
なお、本明細書において、「細胞間接着」の語は、デスモゾーム蛋白質（デスモグレインを含むたんぱく質群）の増加による角層接着機能異常（細胞接着性の亢進により角層の重層化が進むこと）をいう（要すれば、特許４１９７１９４号、特許第４００２６３５号 参照）。
また、本明細書において、「細胞間接着抑制」の概念は、細胞間接着の予防又は改善の何れも含む。
なお、本明細書において、「細胞間接着」の語は、デスモゾーム蛋白質（デスモグレインを含むたんぱく質群）の増加による角層接着機能異常（細胞接着性の亢進により角層の重層化が進むこと）をいう（要すれば、特許４１９７１９４号、特許第４００２６３５号 参照）。
また、本明細書において、「細胞間接着抑制」の概念は、細胞間接着の予防又は改善の何れも含む。
【0055】
ここで、ヒト表皮角化細胞の細胞間接着が抑制されることで、角層の重層化が抑制され、角層重層剥離を抑制する作用を得ることができる。
すなわち、本願発明のスクリーニング方法は、角層重層剥離の予防、又は改善作用を有する成分のスクリーニングに用いることができる。
なお、本明細書において、「角層重層剥離」とは、角層が複数枚重なった状態で皮膚表面から剥がれ落ちることをいう。皮膚が角層重層剥離する状態か否かは、テープストリッピング法により角層を採取し、採取した角層を染色して観察することで確認することができる。
すなわち、本願発明のスクリーニング方法は、角層重層剥離の予防、又は改善作用を有する成分のスクリーニングに用いることができる。
なお、本明細書において、「角層重層剥離」とは、角層が複数枚重なった状態で皮膚表面から剥がれ落ちることをいう。皮膚が角層重層剥離する状態か否かは、テープストリッピング法により角層を採取し、採取した角層を染色して観察することで確認することができる。
【0056】
また、後述する実施例に示すように、肌の明度の低い箇所では、デスモグレイン１が多く存在し、肌の明度の低下は、角層の重層化によるものと考えられる。
上記知見に鑑みると、デスモグレインを減少させる作用を有する成分は、肌の明度改善作用を有する成分であるということができる。
すなわち、本発明のスクリーニング方法は、肌の明度改善作用を有する成分のスクリーニングに使用することができる。
ここで、本明細書において、「肌の明度改善」は、正常状態の肌とデスモグレインの過剰存在により明度の低下した肌との間における、明度の差が少なくなることを指す。
上記知見に鑑みると、デスモグレインを減少させる作用を有する成分は、肌の明度改善作用を有する成分であるということができる。
すなわち、本発明のスクリーニング方法は、肌の明度改善作用を有する成分のスクリーニングに使用することができる。
ここで、本明細書において、「肌の明度改善」は、正常状態の肌とデスモグレインの過剰存在により明度の低下した肌との間における、明度の差が少なくなることを指す。
【0057】
また、後述する実施例に示すように、デスモグレイン減少作用を有する成分は、より透明感のある肌状態に改善する作用を有する。すなわち、本発明のスクリーニング方法は、肌の透明感向上作用を有する成分のスクリーニングに使用できる。
【0058】
また、後述する実施例に示すように、肌の硬度が高い箇所では、デスモグレイン１が多く存在し、肌の硬さの要因は、角層の重層化によるものと考えられる。
上記知見に基づくと、デスモグレインを減少させることで、肌が柔らかくなる効果を得られる。すなわち、本発明のスクリーニング方法は、肌の軟化作用を有する成分のスクリーニングに使用できる。
上記知見に基づくと、デスモグレインを減少させることで、肌が柔らかくなる効果を得られる。すなわち、本発明のスクリーニング方法は、肌の軟化作用を有する成分のスクリーニングに使用できる。
【0059】
ここで、肌が柔らかくなることにより、他の薬剤成分の浸透をより効率的に行うことができる。そのため、本発明のスクリーニング方法は、美白剤等の薬効成分をより効率良く肌に浸透させる作用を有する成分のスクリーニングに使用することができる。
【実施例】
【0060】
［実施例１］
＜角層細胞試料の調製工程＞
ヒト前腕外側より、セロハンテープで採取した角層を、スライドガラス（「ＭＡＳコート」、松浪硝子工業株式会社製）に転写し、当該スライドガラスをキシレンに一晩浸漬した。
次いで、当該スライドガラスをキシレンで１０分間、２回洗浄した後、ＰＢＳで洗浄した。
＜角層細胞試料の調製工程＞
ヒト前腕外側より、セロハンテープで採取した角層を、スライドガラス（「ＭＡＳコート」、松浪硝子工業株式会社製）に転写し、当該スライドガラスをキシレンに一晩浸漬した。
次いで、当該スライドガラスをキシレンで１０分間、２回洗浄した後、ＰＢＳで洗浄した。
【0061】
＜探索対象成分の調製＞
ワイルドタイム抽出液（一丸ファルコス社 製、ヨウシュイブキジャコウソウ（Ｗｉｌｄ Ｔｈｙｍｅ，Ｔ．ｓｅｒｐｙｌｌｕｍ）の地上部抽出物）、及びトゲナシ抽出液（丸善製薬社 製、トゲナシ（ＲＯＳＡ ｒｏｘｂｕｒｇｈｉｉ）の果実抽出物）を、それぞれ濃度が０．１質量％、０．０５質量％、０．０２５質量％、０．０１２５質量％となるようにＰＢＳで希釈し、探索対象成分を得た。
＜スクリーニング用試料の調製＞
探索対象成分に、角層細胞を一晩浸漬し、試料を得た。また、対照試料として、探索対象成分に浸漬させない角層細胞を用意した。
ワイルドタイム抽出液（一丸ファルコス社 製、ヨウシュイブキジャコウソウ（Ｗｉｌｄ Ｔｈｙｍｅ，Ｔ．ｓｅｒｐｙｌｌｕｍ）の地上部抽出物）、及びトゲナシ抽出液（丸善製薬社 製、トゲナシ（ＲＯＳＡ ｒｏｘｂｕｒｇｈｉｉ）の果実抽出物）を、それぞれ濃度が０．１質量％、０．０５質量％、０．０２５質量％、０．０１２５質量％となるようにＰＢＳで希釈し、探索対象成分を得た。
＜スクリーニング用試料の調製＞
探索対象成分に、角層細胞を一晩浸漬し、試料を得た。また、対照試料として、探索対象成分に浸漬させない角層細胞を用意した。
【0062】
＜免疫染色試験＞
それぞれの試料をＰＢＳで洗浄後、４％ＰＦＡ・リン酸緩衝液中、室温で１５分間インキュベートした。
次いで、それぞれの試料をＰＢＳで洗浄後、２０％ブロックエース（ＤＳバイオファーマメディカル社製）水溶液中、室温で１時間インキュベートした。
それぞれの試料に、一次抗体（Ａｎｔｉ－Ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ １，Ｍｏｕｓｅ－Ｍｏｎｏ）を加え、湿潤箱中、室温で２時間インキュベートした。
それぞれの試料をＰＢＳで５分間、３回洗浄した後、二次抗体（Ａｌｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ＠４８８ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－ｍｏｕｃｅ ＩｇＧ）、を加え、湿潤箱中、室温で１時間インキュベートした。
それぞれの試料をＰＢＳで５分間、３回洗浄し、蒸留水で２回洗浄した後、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｔ－Ｇ（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて封入し、複数のスクリーニング試料、及びスクリーニング対照試料を得た。
それぞれの試料をＰＢＳで洗浄後、４％ＰＦＡ・リン酸緩衝液中、室温で１５分間インキュベートした。
次いで、それぞれの試料をＰＢＳで洗浄後、２０％ブロックエース（ＤＳバイオファーマメディカル社製）水溶液中、室温で１時間インキュベートした。
それぞれの試料に、一次抗体（Ａｎｔｉ－Ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ １，Ｍｏｕｓｅ－Ｍｏｎｏ）を加え、湿潤箱中、室温で２時間インキュベートした。
それぞれの試料をＰＢＳで５分間、３回洗浄した後、二次抗体（Ａｌｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ＠４８８ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－ｍｏｕｃｅ ＩｇＧ）、を加え、湿潤箱中、室温で１時間インキュベートした。
それぞれの試料をＰＢＳで５分間、３回洗浄し、蒸留水で２回洗浄した後、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｔ－Ｇ（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて封入し、複数のスクリーニング試料、及びスクリーニング対照試料を得た。
【0063】
＜画像解析＞
スクリーニング試料、及びスクリーニング対照試料を、共焦点レーザー顕微鏡を用いて、それぞれ解析用画像を撮影した（図４）。
画像解析ソフト（Ｉｍａｇｅ Ｊ）を用いて、解析用画像における、４か所の任意の範囲を拡大、白黒画像化し、染色部分、及び非染色部分の面積を算出し、平均値を算出した。
スクリーニング対照試料の染色部分の面積を１００％として、スクリーニング試料の染色部分の面積の割合（４か所の平均値）を算出した。結果を表１、図５に示す。
スクリーニング試料、及びスクリーニング対照試料を、共焦点レーザー顕微鏡を用いて、それぞれ解析用画像を撮影した（図４）。
画像解析ソフト（Ｉｍａｇｅ Ｊ）を用いて、解析用画像における、４か所の任意の範囲を拡大、白黒画像化し、染色部分、及び非染色部分の面積を算出し、平均値を算出した。
スクリーニング対照試料の染色部分の面積を１００％として、スクリーニング試料の染色部分の面積の割合（４か所の平均値）を算出した。結果を表１、図５に示す。
【0064】
【表1】
【0065】
図４及び図５に示す通り、ワイルドタイム抽出物、及びトゲナシ抽出物を添加したスクリーニング試料は、スクリーニング対照試料と比して、デスモグレイン１の発現量が減少していることがわかる。
この結果から、ワイルドタイム抽出物、及びトゲナシ抽出物は、デスモグレイン１の量を減少する作用を有する成分であると評価することができる。
この結果から、ワイルドタイム抽出物、及びトゲナシ抽出物は、デスモグレイン１の量を減少する作用を有する成分であると評価することができる。
【0066】
また、添加したワイルドタイム抽出物の濃度が０．１質量％であるスクリーニング試料は、濃度が０．０５、０．０２５、及び０．０１２５質量％であるスクリーニング試料と比して、染色部分の面積が約２．５倍～２．８倍減少していることがわかる。
【0067】
同様に、添加したトゲナシ抽出物の濃度が０．１質量％であるスクリーニング試料は、濃度が０．０５、０．０２５、及び０．０１２５質量％であるスクリーニング試料と比して、染色部分の面積が、７．６～８．０倍減少していることがわかる。
【0068】
このことから、ワイルドタイム抽出物、及びトゲナシ抽出物は、その濃度が０．１質量％以上で、デスモグレイン１の量を減少する顕著な作用を有すると評価することができる。
【0069】
［実施例２］
＜角層細胞試料の調製工程＞
実施例１と同一の手法により、角層細胞試料を調製した。
＜角層細胞試料の調製工程＞
実施例１と同一の手法により、角層細胞試料を調製した。
【0070】
＜探索対象成分の調製＞
ウスベニタチアオイ抽出液（ｊｕｒｌｉｑｕｅ社製、ウスベニタチアオイ（Ａｌｔｈａｅａ Ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）の根の抽出物）を、濃度が０．２５質量％となるようにＰＢＳで希釈し、探索対象成分を得た。
ウスベニタチアオイ抽出液（ｊｕｒｌｉｑｕｅ社製、ウスベニタチアオイ（Ａｌｔｈａｅａ Ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）の根の抽出物）を、濃度が０．２５質量％となるようにＰＢＳで希釈し、探索対象成分を得た。
【0071】
＜スクリーニング用試料の調製＞
探索対象成分に、角層細胞を一晩浸漬し、試料を得た。また、対照試料として、探索対象成分に浸漬させない角層細胞を用意した。
探索対象成分に、角層細胞を一晩浸漬し、試料を得た。また、対照試料として、探索対象成分に浸漬させない角層細胞を用意した。
【0072】
＜免疫染色試験＞
実施例１と同一の手法により、スクリーニング用試料、及びスクリーニング対照試料を得た。
実施例１と同一の手法により、スクリーニング用試料、及びスクリーニング対照試料を得た。
【0073】
＜画像解析＞
実施例１と同一の手法により、スクリーニング用試料及びスクリーニング対照試料の解析用画像を撮影し、スクリーニング対照試料の染色部分の面積を１００％として、スクリーニング試料の染色部分の面積の割合）を算出した。結果を表２、図６、及び図７に示す。
実施例１と同一の手法により、スクリーニング用試料及びスクリーニング対照試料の解析用画像を撮影し、スクリーニング対照試料の染色部分の面積を１００％として、スクリーニング試料の染色部分の面積の割合）を算出した。結果を表２、図６、及び図７に示す。
【0074】
【表2】
【0075】
図６及び図７に示す通り、ウスベニタチアオイ抽出物を添加したスクリーニング試料は、スクリーニング対照試料と比して、デスモグレイン１の発現量が減少していることがわかる。
この結果から、ウスベニタチアオイ抽出物は、デスモグレイン１の量を減少する作用を有する成分であると評価することができる。
この結果から、ウスベニタチアオイ抽出物は、デスモグレイン１の量を減少する作用を有する成分であると評価することができる。
【0076】
［実施例３］
以下、肌の明度の相違とデスモグレイン１の存在量の関係性及び、デスモグレイン１の存在量と肌の硬度の関係性を裏付ける試験結果を示す。
以下、肌の明度の相違とデスモグレイン１の存在量の関係性及び、デスモグレイン１の存在量と肌の硬度の関係性を裏付ける試験結果を示す。
【0077】
（１）被験者及び測定部位
本実施例では、４０歳から５２歳の女性２０名を被験者とした。
そして、本実施例では、被験者顔面における、目視により明度の低下していることが確認できた部位（黒みがかった部分、図１３中部位Ａ 参照）と正常状態の部位（図１３中部位Ｂ 参照）を測定部位として選定した。
本実施例では、４０歳から５２歳の女性２０名を被験者とした。
そして、本実施例では、被験者顔面における、目視により明度の低下していることが確認できた部位（黒みがかった部分、図１３中部位Ａ 参照）と正常状態の部位（図１３中部位Ｂ 参照）を測定部位として選定した。
【0078】
【0079】
L＊値に関し、目視により明度の低下していることが確認できた部位（黒みがかった部分、図１３中部位Ａ 参照）は、正常状態の部位（図１３中部位Ｂ 参照）に比して、有意に低い値を示した。すなわち、目視により明度の低下していることが確認できた部位（黒みがかった部分、図１３中部位Ａ 参照）は、正常状態の部位（図１３中部位Ｂ 参照）に比して、暗いことが確認できた。
【0080】
a＊値に関し、目視により明度の低下していることが確認できた部位（黒みがかった部分、図１３中部位Ａ 参照）は、正常状態の部位（図１３中部位Ｂ 参照）に比して、有意に高い値を示した。すなわち、目視により明度の低下していることが確認できた部位（黒みがかった部分、図１３中部位Ａ 参照）は、正常状態の部位（図１３中部位Ｂ 参照）に比して、赤みが強いことが確認できた。
【0081】
b＊値に関し、目視により明度の低下していることが確認できた部位（黒みがかった部分、図１３中部位Ａ 参照）は、正常状態の部位（図１３中部位Ｂ 参照）に比して、有意に高い値を示した。すなわち、目視により明度の低下していることが確認できた部位（黒みがかった部分、図１３中部位Ａ 参照）は、正常状態の部位（図１３中部位Ｂ 参照）に比して、黄みが強いことが確認できた。
【0082】
【0083】
硬度に関し、目視により明度の低下していることが確認できた部位（黒みがかった部分、図１３中部位Ａ 参照）は、正常状態の部位（図１３中部位Ｂ 参照）に比して、有意に低い値を示した。すなわち、目視により明度の低下していることが確認できた部位（黒みがかった部分、図１３中部位Ａ 参照）は、正常状態の部位（図１３中部位Ｂ 参照）に比して、硬いことが確認できた。
【0084】
（２－３）デスモグレイン１（Ｄｓｇ１）染色
上記（２－１）、（２－２）の試験に供した各測定部位の角層細胞をテープストリッピング法で採取し、スライドガラスに貼付した。
上記（２－１）、（２－２）の試験に供した各測定部位の角層細胞をテープストリッピング法で採取し、スライドガラスに貼付した。
【0085】
角層細胞を貼付したスライドガラスを、キシレンに一晩浸漬させた。
浸漬後、洗浄、風乾させたのち、４％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液中で室温、条件下、１５分間静置した。
浸漬後、洗浄、風乾させたのち、４％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液中で室温、条件下、１５分間静置した。
【0086】
１５分後、角層細胞をＰＢＳで洗浄し、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ（ナカライテスク社製）／ＰＢＳ溶液に、室温条件下、５分間浸漬させた。
【0087】
浸漬後、洗浄し、ブロックエース水溶液中（ＤＳバイオファーマメディカル ＵＫ－Ｂ８０）、室温条件下、１時間静置した。
【0088】
静置後、リキッドブロッカー（大道産業社 製）で枠付けし、一次抗体を加え、湿潤箱中、室温条件下、２時間静置した。
一次抗体として、Ａｎｔｉ Ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ １，Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｎｏ(Ｄｓｇ１ Ｐ２３) Ｐｒｏｇｅｎ，６５１１１０ 原液（ＩｇＧ 濃度：１０－１５ｇ／ｍＬ）を使用した。
一次抗体として、Ａｎｔｉ Ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ １，Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｎｏ(Ｄｓｇ１ Ｐ２３) Ｐｒｏｇｅｎ，６５１１１０ 原液（ＩｇＧ 濃度：１０－１５ｇ／ｍＬ）を使用した。
【0089】
静置後、ＰＢＳを用い洗浄し、二次抗体を加え、湿潤箱中、室温条件下、１時間静置した。
二次抗体として、Ａｌｌｅ ｘａ Ｆｌｕｏｒ＠４８８ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ａ １１００１ ＰＢＳ２００倍希釈溶液を使用した。
二次抗体として、Ａｌｌｅ ｘａ Ｆｌｕｏｒ＠４８８ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ａ １１００１ ＰＢＳ２００倍希釈溶液を使用した。
【0090】
静置後洗浄し、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｔ－Ｇ（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｉｏｔｅｃｈ 社製）で封入し、室温で３０分乾燥させた。
【0091】
乾燥後、マニキュアでカバーガラスを固定し、乾燥させたのち、（撮影）共焦点レーザー顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ａ１）、×２０での観察に供した。
結果を、図１２に示す。
結果を、図１２に示す。
【0092】
デスモグレイン１（Ｄｓｇ１）量に関し、目視により明度の低下していることが確認できた部位（黒みがかった部分、図１３中部位Ａ 参照）は、正常状態の部位（図１３中部位Ｂ 参照）に比して、有意に高い値を示した。すなわち、目視により明度の低下していることが確認できた部位（黒みがかった部分、図１３中部位Ａ 参照）は、正常状態の部位（図１３中部位Ｂ 参照）に比して、デスモグレイン１（Ｄｓｇ１）量が多いことが確認できた。
【0093】
（３）考察
図８～図１０、及び図１２に示すように、肌の明度の低い箇所では、デスモグレイン１が多く存在することが分かった。ここで、肌の明度の低下は、肌のｐＨが低くデスモグレイン１を分解するセリンプロテアーゼの活性が低いために、角層の重なりが密になったこと（角層の重層化）によるものと考えられる。
図８～図１０、及び図１２に示すように、肌の明度の低い箇所では、デスモグレイン１が多く存在することが分かった。ここで、肌の明度の低下は、肌のｐＨが低くデスモグレイン１を分解するセリンプロテアーゼの活性が低いために、角層の重なりが密になったこと（角層の重層化）によるものと考えられる。
【0094】
そして、前述の通り、本願発明の有効成分はデスモグレイン減少作用を奏する。
上記知見に鑑みると、本発明の有効成分は、デスモグレイン１を減少させることによる肌の明度改善作用を奏することがわかった。
上記知見に鑑みると、本発明の有効成分は、デスモグレイン１を減少させることによる肌の明度改善作用を奏することがわかった。
【0095】
図１１～図１２に示すように、肌の硬度が高い箇所では、デスモグレイン１が多く存在するが分かった。ここで、肌の硬さの要因は、肌のｐＨが低くデスモグレイン１を分解するセリンプロテアーゼの活性が低いために、角層の重なりが密になったこと（角層の重層化）によるものと考えられる。
【0096】
上記知見に基づくと、デスモグレイン１を減少させることにより、肌が柔らかくなることがわかった。
そして、前述の通り、本願発明の有効成分はデスモグレイン減少作用を奏する。
つまり、本発明の有効成分は、デスモグレイン１を減少させることによる肌の軟化作用を奏することがわかった。
そして、前述の通り、本願発明の有効成分はデスモグレイン減少作用を奏する。
つまり、本発明の有効成分は、デスモグレイン１を減少させることによる肌の軟化作用を奏することがわかった。
【0097】
［実施例４］
以下、デスモグレイン減少作用を有する成分を含む組成物の重層剥離抑制作用の検証結果を示す。
（１）製剤の調製
表３に記載の組成に従い、トゲナシ抽出物を含む製造例１の化粧料を調製した。
以下、デスモグレイン減少作用を有する成分を含む組成物の重層剥離抑制作用の検証結果を示す。
（１）製剤の調製
表３に記載の組成に従い、トゲナシ抽出物を含む製造例１の化粧料を調製した。
【0098】
【表3】
【0099】
（２）被験者及び対象部位
本実施例では、女性５名を被験者とし、被験者の左右前腕内側部（ｎ＝１０）に、製造例１の化粧品を１日２回（朝と晩）塗布し、これを１０日間続けた。
本実施例では、女性５名を被験者とし、被験者の左右前腕内側部（ｎ＝１０）に、製造例１の化粧品を１日２回（朝と晩）塗布し、これを１０日間続けた。
【0100】
（３）デスモグレイン減少作用の検証
製造例１の化粧品の使用前、使用後（１０日間継続後）のそれぞれの段階で、実施例１の「＜角層細胞試料の調製工程＞」に記載の方法に準拠して、各被験死者の左右前腕内側部の角層を採取し、角層細胞試料を調製した。次いで、実施例１の「＜免疫染色試験＞」に記載の方法に準拠し、角層細胞試料中のデスモグレイン１を染色し、共焦点レーザー顕微鏡を用いて、製造例１の使用前後の解析用画像を撮影し、蛍光（染色）の確認を行った。
製造例１の化粧品の使用前、使用後（１０日間継続後）のそれぞれの段階で、実施例１の「＜角層細胞試料の調製工程＞」に記載の方法に準拠して、各被験死者の左右前腕内側部の角層を採取し、角層細胞試料を調製した。次いで、実施例１の「＜免疫染色試験＞」に記載の方法に準拠し、角層細胞試料中のデスモグレイン１を染色し、共焦点レーザー顕微鏡を用いて、製造例１の使用前後の解析用画像を撮影し、蛍光（染色）の確認を行った。
【0101】
【0102】
【0103】
（４）重層剥離抑制作用の検証
製造例１の化粧品の使用前後において、実施例１の「＜角層細胞試料の調製工程＞」に記載の方法に準拠して、各被験死者の左右前腕内側部の角層を採取し、角層細胞試料を調製した。次いで、それぞれの角層細胞試料を、ゲンチアナバイオレットとブリリアントグリーンを用いて常法により染色し、光学顕微鏡により観察した。
結果の代表図を図１６に示す。
製造例１の化粧品の使用前後において、実施例１の「＜角層細胞試料の調製工程＞」に記載の方法に準拠して、各被験死者の左右前腕内側部の角層を採取し、角層細胞試料を調製した。次いで、それぞれの角層細胞試料を、ゲンチアナバイオレットとブリリアントグリーンを用いて常法により染色し、光学顕微鏡により観察した。
結果の代表図を図１６に示す。
【0104】
図１６に示す通り、製造例１の使用前における角層細胞の光学顕微鏡像には、色が濃い部分が複数存在している。この色濃い部分は、テープストリッピング法により、角層細胞が重層剥離した部分である。
一方で、製造例１を１０日間使用し続けた後に採取した角層細胞試料では、使用前に採取した角層細胞試料と比して、大部分が淡く染色している。この淡い部分は、角層細胞が一層のみ剥がされた部分であり、すなわち、重層剥離が生じていないことを意味している。
以上の通り、デスモグレイン減少作用を有する成分を含む製造例１の化粧品を使用することで、重層剥離が改善されることが確認できた。
一方で、製造例１を１０日間使用し続けた後に採取した角層細胞試料では、使用前に採取した角層細胞試料と比して、大部分が淡く染色している。この淡い部分は、角層細胞が一層のみ剥がされた部分であり、すなわち、重層剥離が生じていないことを意味している。
以上の通り、デスモグレイン減少作用を有する成分を含む製造例１の化粧品を使用することで、重層剥離が改善されることが確認できた。
【0105】
［実施例５］
以下、デスモグレイン減少作用を有する成分を含む組成物のデスモグレイン減少能を調べた。
以下、デスモグレイン減少作用を有する成分を含む組成物のデスモグレイン減少能を調べた。
【0106】
（１）組成物の調製
下記表４に示す処方に従って、ワイルドタイム抽出物を含む化粧料（乳液）を調製した。即ち、（イ）、（ロ）、（ハ）の成分をそれぞれ７０℃に加熱し、（ロ）に（ハ）を加えて中和し、これを撹拌しながら（イ）を徐々に加えて乳化し、ホモジナイザーを用いて均質化した後、撹拌しながら冷却し、製造例２の乳液を得た。
下記表４に示す処方に従って、ワイルドタイム抽出物を含む化粧料（乳液）を調製した。即ち、（イ）、（ロ）、（ハ）の成分をそれぞれ７０℃に加熱し、（ロ）に（ハ）を加えて中和し、これを撹拌しながら（イ）を徐々に加えて乳化し、ホモジナイザーを用いて均質化した後、撹拌しながら冷却し、製造例２の乳液を得た。
【0107】
【表4】
【0108】
（２）被験者及び測定部位
本実施例では、４０歳から５２歳の女性２０名を被験者とした。
そして、本実施例では、被験者顔面における、シミが存在する部位（９２箇所）を測定部位として選定した。
各被験者のシミが存在する部位に、製造例２の乳液を１日２回塗布し、これを１２週間続けた。
本実施例では、４０歳から５２歳の女性２０名を被験者とした。
そして、本実施例では、被験者顔面における、シミが存在する部位（９２箇所）を測定部位として選定した。
各被験者のシミが存在する部位に、製造例２の乳液を１日２回塗布し、これを１２週間続けた。
【0109】
（３）測定
製造例の乳液の使用前、使用継続６週間経過時点、及び１２週間経過時点において、実施例１の「＜角層細胞試料の調製工程＞」に記載の方法に準拠して、被験者のシミが存在する部位の角層細胞を採取し、角層細胞試料を調製した。次いで、実施例１の「＜免疫染色試験＞」に記載の方法により準拠して、それぞれの角層細胞試料におけるデスモグレイン１を染色し、共焦点レーザー顕微鏡を用いて、製造例２の使用前後の解析用画像を撮影し、蛍光（染色）の確認行った。
製造例の乳液の使用前、使用継続６週間経過時点、及び１２週間経過時点において、実施例１の「＜角層細胞試料の調製工程＞」に記載の方法に準拠して、被験者のシミが存在する部位の角層細胞を採取し、角層細胞試料を調製した。次いで、実施例１の「＜免疫染色試験＞」に記載の方法により準拠して、それぞれの角層細胞試料におけるデスモグレイン１を染色し、共焦点レーザー顕微鏡を用いて、製造例２の使用前後の解析用画像を撮影し、蛍光（染色）の確認行った。
【0110】
解析用画像全体の面積を１００％として、蛍光部分の面積を算出した。結果を表５、表６、及び図１７（代表）、図１８、１９に示す。なお、乳液使用１２週間経過後のデータは、シミ部位９２箇所のうち、８０箇所のデータを集計し、同箇所における乳液使用前のデータと比較した。また、図１８において、＊＊はｐ＜０．０１であり、図１９において、＊＊＊はｐ＜０．００１である。
【0111】
【表5】
【0112】
【表6】
【0113】
表５～６、及び図１７～１９に示す通り、ワイルドタイム抽出物を含む乳液を継続的に使用することで、シミ部位におけるデスモグレイン１量が有意に減少することが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【0114】
本発明は、接着タンパク質の量に関連する解析手法に応用できる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
