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特許7513299エラスターゼの阻害用経口組成物及びその利用、エラスターゼ阻害剤、エラスターゼ阻害剤を経口摂取するエラスターゼ活性阻害方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-07-01
(45)【発行日】2024-07-09
(54)【発明の名称】エラスターゼの阻害用経口組成物及びその利用、エラスターゼ阻害剤、エラスターゼ阻害剤を経口摂取するエラスターゼ活性阻害方法
(51)【国際特許分類】
A23L 19/00 20160101AFI20240702BHJP
A23L 33/105 20160101ALI20240702BHJP
A23L 33/18 20160101ALI20240702BHJP
A61K 36/185 20060101ALI20240702BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240702BHJP
A61K 38/06 20060101ALI20240702BHJP
C07K 5/12 20060101ALN20240702BHJP
C07K 5/087 20060101ALN20240702BHJP
【ＦＩ】
A23L19/00 Z
A23L33/105
A23L33/18
A61K36/185
A61P43/00 107
A61K38/06
C07K5/12
C07K5/087
【請求項の数】
11
(21)【出願番号】P 2022504931
(86)(22)【出願日】2020-03-06
(86)【国際出願番号】 JP2020009785
(87)【国際公開番号】W WO2021176707
(87)【国際公開日】2021-09-10
【審査請求日】2022-12-23
(73)【特許権者】
【識別番号】500081990
【氏名又は名称】ビーエイチエヌ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110002583
【氏名又は名称】弁理士法人平田国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】田中 郁郎
(72)【発明者】
【氏名】木村 昌代
(72)【発明者】
【氏名】野崎 勉
(72)【発明者】
【氏名】石原 健夫
【審査官】厚田 一拓
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１８－１１５１４３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開昭５９－１１８０８８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開平０１－１６８６９８（ＪＰ，Ａ）
【文献】韓国登録特許第０１５４４９９（ＫＲ，Ｂ１）
【文献】ARAPITSAS, Panagiotis，Identification and quantification of polyphenolic compounds from okra seeds and skins，Food Chemistry，2008年，Vol.110，p.1041-1045
【文献】CARINI, Marina et al.，Procyanidins from Vitis vinifera seeds inhibit the respiratory burst of activated human neutrophils，Planta Med.，2001年，Vol.67，p.714-717
【文献】SANO, Susumu et al.，OF4949, NEW INHIBITORS OF AMINOPEPTIDASE B IV. EFFECTS OF OF4949 AND ITS DERIVATIVES ON ENZYME SYSTE，THE JOURNAL OF ANTIBIOTICS，1987年，VOL.XL, NO.4，p.512-518
【文献】HOMSY, Rania et al.，Characterization of Human Skin Fibroblasts Elastase Activity，J. Invest. Dermatol.，1988年11月，VOL.91, NO.5，p.472-477
【文献】UMEZAWA, Hamao et al.，BESTATIN, AN INHIBITOR OF AMINOPEPTIDASE B, PRODUCED BY ACTINOMYCETES，THE JOURNAL OF ANTIBIOTICS，1976年01月，VOL.XXIX, NO.1，p.97-99
【文献】TSUKAHARA, Kazue et al.，Selective Inhibition of Skin Fibroblast Elastase Elicits a Concentration-Dependent Prevention of Ult，THE JOURNAL OF INVESTIGATIVE DERMATOLOGY，2001年，VOL.117, NO.3，p.671-677
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ２３Ｌ ２／００ － ３５／００
Ａ６１Ｋ ６／００ －１３５／００
Ａ６１Ｐ １／００ － ４３／００
Ｃ０７Ｋ ５／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＦＳＴＡ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
オクラ（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ）の種子の加工物又はオクラの種子由来の特定化合物である環状ペプチド「ＯＦ４９４９－ＩＩ」を有効成分として含有することを特徴とする皮膚の線維芽細胞由来のエラスターゼの阻害用組成物。【化1】
【請求項2】
前記種子が完熟種子である請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記加工物がオクラ種子の抽出物、抽出残渣、酵素分解物又はスプラウトである請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項4】
前記抽出物が熱水抽出物である請求項３に記載の組成物。
【請求項5】
前記酵素分解物がアルカリ性プロテアーゼ及び／又は中性プロテアーゼによる加水分解物である請求項３又は４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項6】
前記組成物を摂取又は投与することにより、エラスターゼの活性を阻害することを特徴とする請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物の利用（但し、ヒトに対する医療行為を除く）。
【請求項7】
請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物を配合してなることを特徴とするエラスターゼ阻害剤。
【請求項8】
請求項７記載のエラスターゼ阻害剤を経口摂取することを特徴とするエラスターゼ活性阻害方法（但し、ヒトに対する医療行為を除く）。
【請求項9】
ヒト皮膚繊維芽細胞由来エラスターゼの活性を阻害することを特徴とする環状ペプチド「ＯＦ４９４９－ＩＩ」の利用（但し、ヒトに対する医療行為を除く）。
【請求項10】
皮膚組織のエラスターゼ阻害作用に基づくエラスチン増加のためのものである請求項９に記載の環状ペプチド「ＯＦ４９４９－ＩＩ」の利用（但し、ヒトに対する医療行為を除く）。
【請求項11】
皮膚組織の老化症状改善用のものである請求項９に記載の環状ペプチド「ＯＦ４９４９－ＩＩ」の利用（但し、ヒトに対する医療行為を除く）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、オクラ（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ）の種子の加工物を含有することを特徴とするエラスターゼ阻害用の経口組成物及びその利用、エラスターゼ阻害剤、並びにエラスターゼ阻害剤を経口摂取するエラスターゼ活性阻害方法に関する。
特に、本発明は、環状ペプチド「ＯＦ４９４９－II」を有効成分として含有するエラスターゼ阻害用の経口組成物及びその利用、エラスターゼ阻害剤、並びにエラスターゼ阻害剤を経口摂取するエラスターゼ活性阻害方法に関する。
特に、本発明は、環状ペプチド「ＯＦ４９４９－II」を有効成分として含有するエラスターゼ阻害用の経口組成物及びその利用、エラスターゼ阻害剤、並びにエラスターゼ阻害剤を経口摂取するエラスターゼ活性阻害方法に関する。
【背景技術】
【0002】
動物や魚類の生体組織は、一般的に、皮膚の表皮や臓器の表面等の上皮組織、主に筋肉を構成する筋組織、全身に張り巡らされた神経の神経組織、及び、身体構造を保持し支えている結合組織に大別される。結合組織は支持組織とも呼ばれ、広義には骨や軟骨、血液、脂肪等も結合組織に分類されることがある。
【0003】
このうち、上皮組織や支持組織については、皮膚、骨、脂肪等において古くから研究及び開発の取り組みがなされ、近年では、例えば、皮膚の老化症状の一環として肌の張りや弾力の低下（シワ・たるみ等）の発生メカニズムが解明されつつあり、肌のシワやたるみにはエラスチン（弾性線維）が大きく関与しているといわれている。
【0004】
エラスチンは、結合組織に存在する線維状の高分子蛋白質の一種であり、高分子の蛋白質であるコラーゲン同士を格子状に結合させ、その隙間にヒアルロン酸やコンドロイチン硫酸等のムコ多糖類をはじめとする種々の細胞外成分が存在する細胞外マトリックス構造を形成している。この細胞外マトリックス構造は、細胞及び皮膚組織の支持、細胞間隙における保水、皮膚の潤滑性と柔軟性の保持、紫外線、乾燥環境、機械的刺激や損傷、微生物感染等の外的因子から皮膚組織を保護する等の役割を担っている。これらの蛋白質や細胞外成分は生体内において線維芽細胞により産生されることが知られている（非特許文献１）。
【0005】
生体組織中のエラスチン含有量は、一般に、項靱帯で約７８～８０％、動脈で約５０％、肺で約２０％、真皮で約２～５％程度と認識されている。また、エラスチンの特徴の１つとして、コラーゲンやヒアルロン酸とは異なり、ヒトの誕生時にはほぼ０％で成長とともに量が増え、２０歳代半ばごろにピークを迎える。その後減少に転じ、４０歳代を過ぎると５０％以下になるといわれている。これは、加齢にともなう代謝変化や紫外線やその他の要因によって生体組織中のエラスチンが分解あるいは変性される可能性を示唆し、その一因としてエラスチンを分解する酵素であるエラスターゼの活性亢進や過剰誘導等が推察される。
【0006】
このような観点から、線維芽細胞の増殖を促進する有効成分としてオクラの種子から得た水性成分を利用することが開示されている（特許文献１）。また、真皮中のエラスチンやコラーゲン等の含量の低減を防止するために様々な検討がなされ種々の報告や提案があり、一例として、皮膚の老化（シワや弾力）を改善する化粧料の有効成分としてレチノール配糖体が開示されている（特許文献２）。しかし、レチノール誘導体には過剰投与による副作用も知られており、安全性の点で十分ではない。
【0007】
また、エラスターゼの活性を阻害する物質を探索する試みも多く、これまでに植物由来成分や抽出物として、セイヨウトウキの抽出物（特許文献３）、フェニルエタノイド配糖体（エキナコサイド及びアクテオサイド）を含むハマウツボ科植物の抽出物（特許文献４）、ブドウの芽及び蔓から抽出したレスベラトロール類（特許文献５）、ザクロの花の粉末及び／又は抽出物（特許文献６）、マンネンタケの抽出物（特許文献７）、大豆タンパク加水分解物（特許文献８）、等が提案されている。
【0008】
上記の先行技術文献には、これらの成分や抽出物を化粧料や皮膚外用剤に配合して皮膚に塗布して利用する旨が記載されている。しかしながら、これらの成分や抽出物を化粧料や皮膚外用剤へ利用する場合は、成分の経皮吸収性や容易な洗浄性等の点で疑問や難点があり、皮膚の老化症状対策として望ましい効果が持続せず、皮膚組織の生理的機能を本質的に改善するものではなかった。また、ペプチド類を経口摂取する場合には、胃腸内で変質や分解を受けるリスクがあり、実用面において有効性を発現し得るものは数少なかった。したがって、前述した肌の老化症状を改善し得る、実効性のある素材が求められていた。
【0009】
なお、オクラ（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ）はアオイ科トロロアオイ属に属する植物であり、世界の熱帯～温帯地域で生育し、野菜として栽培され食用に供されてきた長い歴史がある。通常、白色ないし黄白色の未熟な種子を内包する果実（莢）を生鮮野菜として摂食する。
【0010】
オクラを加工して得られるエキスや成分を産業的に利用する試みとして、前記の特許文献１、オクラ抽出物を含むヒアルロン酸合成促進剤及び該剤を配合する化粧料や飲食品（特許文献９）、オクラ種子由来のオリゴペプチド及び特定植物抽出物を含有する老化防止用皮膚外用剤（特許文献１０）等が提案されている。しかしながら、オクラの種子や加工処理物とエラスチンやエラスターゼとの関連に言及するものは見当たらない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0011】
【文献】服部道広、「スキンケアの科学」、第６頁～第１４頁及び第１５頁～第８３頁、（株）裳華房、１９９７年２月２５日発行
【特許文献】
【0012】
【文献】特開２０１８－１１５１４３号公報
【文献】特開平１０－１５８２９０号公報（請求項１等）
【文献】特開２０１２－２０１６１５号公報、
【文献】特開２００９－２６３２７９号公報
【文献】特開２００８－２３９５７６号公報
【文献】特開２００５－５３８７３号公報
【文献】特開２００５－２３０２１号公報
【文献】特開２００４－１８２６８７号公報
【文献】特開２００４－５１５３３号公報
【文献】特開２００８－７４７５７号公報
【文献】特開平０２－２８８８９０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0013】
かかる現状に鑑み、本発明は、紫外線や活性酸素等の外的要因、生体の代謝機能の低下等によって生じる生体組織中のエラスチンの低減を回復させ、皮膚の老化症状等を改善するための、エラスターゼ阻害用の経口組成物及びその利用、エラスターゼ阻害剤、並びにエラスターゼ阻害剤を経口摂取するエラスターゼ活性阻害方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0014】
前記課題を解決するために、本発明者らは、線維芽細胞由来のエラスターゼの活性を阻害する素材とその加工方法について鋭意検討を重ねた結果、オクラの種子の加工物が有効であることを見出した。
さらに、本発明者らは、線維芽細胞由来のエラスターゼの活性を阻害する成分とその精製方法について研究開発を続けた結果、オクラの完熟種子から得た環状ペプチド「ＯＦ４９４９－II」が有効成分であることを見出し、本発明を完成するに至った。
さらに、本発明者らは、線維芽細胞由来のエラスターゼの活性を阻害する成分とその精製方法について研究開発を続けた結果、オクラの完熟種子から得た環状ペプチド「ＯＦ４９４９－II」が有効成分であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0015】
すなわち、本発明の主たる特徴は概ね次の点にある。
（１）オクラ（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ）の種子の加工物を含有することを特徴とする皮膚の線維芽細胞由来のエラスターゼの阻害用組成物。
ここで、前記種子は完熟種子であることが望ましく、前記加工物はオクラ種子の抽出物、該抽出残渣、酵素分解物又はスプラウトのいずれかであることが望ましく、前記抽出の処理は熱水抽出であることが望ましく、前記酵素分解の処理はアルカリ性プロテアーゼ及び／又は中性プロテアーゼを用いる加水分解であることが望ましい。また、前記組成物は経口的に摂取又は投与することが望ましい。
（１）オクラ（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ）の種子の加工物を含有することを特徴とする皮膚の線維芽細胞由来のエラスターゼの阻害用組成物。
ここで、前記種子は完熟種子であることが望ましく、前記加工物はオクラ種子の抽出物、該抽出残渣、酵素分解物又はスプラウトのいずれかであることが望ましく、前記抽出の処理は熱水抽出であることが望ましく、前記酵素分解の処理はアルカリ性プロテアーゼ及び／又は中性プロテアーゼを用いる加水分解であることが望ましい。また、前記組成物は経口的に摂取又は投与することが望ましい。
【0016】
（２）オクラの種子由来の特定化合物を有効成分として含有することを皮膚の線維芽細胞由来の特徴とするエラスターゼの阻害用組成物。
ここで、前記種子は完熟種子であることが望ましい。また、前記特定化合物は環状ペプチド「ＯＦ４９４９－ＩＩ」であることが望ましく、前記ペプチドは下記式Ｉであることが望ましい。
ここで、前記種子は完熟種子であることが望ましい。また、前記特定化合物は環状ペプチド「ＯＦ４９４９－ＩＩ」であることが望ましく、前記ペプチドは下記式Ｉであることが望ましい。
【化1】
【0017】
（３）前記組成物を摂取又は投与することにより、エラスターゼの活性を阻害することを特徴とする組成物の利用。
ここで、前記組成物は経口的に摂取又は投与して利用することが望ましく、前記経口用組成物は飲食品の態様であることが望ましい。また、前記組成物の利用は、皮膚組織のエラスターゼ活性阻害作用に基づくエラスチン増加のためのものであることが望ましく、更には、皮膚組織の老化症状改善用のものであることが望ましい。
ここで、前記組成物は経口的に摂取又は投与して利用することが望ましく、前記経口用組成物は飲食品の態様であることが望ましい。また、前記組成物の利用は、皮膚組織のエラスターゼ活性阻害作用に基づくエラスチン増加のためのものであることが望ましく、更には、皮膚組織の老化症状改善用のものであることが望ましい。
【0018】
（４）エラスターゼの活性を阻害することを特徴とする環状ペプチド「ＯＦ４９４９－II」の利用。
ここで、前記ペプチドを含有する組成物を経口的に摂取又は投与して利用することが望ましく、前記ペプチドを含有する経口用組成物は飲食品の態様であることが望ましい。また、前記組成物の利用は、皮膚組織のエラスターゼ活性阻害作用に基づくエラスチン増加のためのものであることが望ましく、更には、皮膚組織の老化症状改善用のものであることが望ましい。
ここで、前記ペプチドを含有する組成物を経口的に摂取又は投与して利用することが望ましく、前記ペプチドを含有する経口用組成物は飲食品の態様であることが望ましい。また、前記組成物の利用は、皮膚組織のエラスターゼ活性阻害作用に基づくエラスチン増加のためのものであることが望ましく、更には、皮膚組織の老化症状改善用のものであることが望ましい。
【0019】
（５）前記エラスターゼの阻害用組成物を配合してなることを特徴とするエラスターゼ阻害剤。
【0020】
（６）前記のエラスターゼ阻害剤を経口摂取することを特徴とするエラスターゼ活性阻害方法。
【発明の効果】
【0021】
本発明に係る、オクラの完熟種子から得た加工物である熱水抽出物、その残渣、蛋白質加水分解物及びスプラウトは、オクラの種子由来の特定化合物である環状ペプチド「ＯＦ４９４９－II」を有効成分として、皮膚の線維芽細胞由来のエラスターゼに対して微量でも強力な阻害効果を奏する。
このため、前記ペプチドを含む本発明のエラスターゼの阻害用組成物及びエラスターゼ阻害剤は、皮膚のターンオーバーを促して皮膚トラブルや老化症状（シワ、シミ、くすみ、ソバカス、たるみ等）を改善し、美肌促進に寄与することが可能となる。また、皮膚組織中のエラスチンを増強させ、例えば、皮膚の損傷部位の再生を促進する等、肌の健康維持に役立つことが期待できる。
かかる効果は、本発明のエラスターゼの阻害用組成物を経口的に摂取又は投与することによって顕著に発現される。したがって、本発明のエラスターゼの阻害用組成物及び組成物を配合してなる阻害剤は、とりわけ飲食品、医薬品、動物飼料等の分野において、前記剤の態様のままで又は前記分野の従来の各種製品に配合した形態で、皮膚改善のために有効利用することが可能となる。
このため、前記ペプチドを含む本発明のエラスターゼの阻害用組成物及びエラスターゼ阻害剤は、皮膚のターンオーバーを促して皮膚トラブルや老化症状（シワ、シミ、くすみ、ソバカス、たるみ等）を改善し、美肌促進に寄与することが可能となる。また、皮膚組織中のエラスチンを増強させ、例えば、皮膚の損傷部位の再生を促進する等、肌の健康維持に役立つことが期待できる。
かかる効果は、本発明のエラスターゼの阻害用組成物を経口的に摂取又は投与することによって顕著に発現される。したがって、本発明のエラスターゼの阻害用組成物及び組成物を配合してなる阻害剤は、とりわけ飲食品、医薬品、動物飼料等の分野において、前記剤の態様のままで又は前記分野の従来の各種製品に配合した形態で、皮膚改善のために有効利用することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図1】オクラ完熟種子の抽出物の溶液からエラスターゼ阻害活性画分を得る工程を示すフローチャートである。
【図2】画分Ｆの濃度を４ｍｇ／ｍＬで分画した場合のクロマトグラムである。
【図3】画分Ｆの濃度を４ｍｇ／ｍＬで分画した場合のクロマトグラムである。
【図4】画分（５）－１を１０ｍｇ／ｍＬ程度の濃度で分取した場合の精製物のクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【0023】
以下に本発明を詳細に説明する。まず、本発明のエラスターゼの阻害用組成物は、生体組織とりわけ皮膚の真皮組織中に存在するエラスチンを分解する酵素であるエラスターゼを阻害する作用を有するものであり、オクラの種子の加工物を含有することを特徴とする。
また、本発明のエラスターゼの阻害用組成物は、オクラの種子由来の特定化合物である環状ペプチド「ＯＦ４９４９－II」を有効成分とする。
また、本発明のエラスターゼの阻害用組成物は、オクラの種子由来の特定化合物である環状ペプチド「ＯＦ４９４９－II」を有効成分とする。
【0024】
オクラは、一般に、莢の形状が五角形、八角形、丸形等の品種があり、色が緑色、紫紅色、白色等の品種がある。本発明に係るオクラは、これらの種類に制限はなく、任意のものを使用することができる。
【0025】
本発明では、前記オクラの完熟した種子を原料とすることが望ましい。完熟した種子とは、植物体が成長した果実（莢）から収穫した種子又は自然発生的に飛散する種子を指し、濃緑色～黒褐色で、直径５ｍｍ前後のサイズのものであり、播種すれば発芽する能力を有する。
一方、未熟な種子は、成長途上にある莢の中に包含されており、白色～黄白色の約２～４ｍｍ径のものであり、通常は、莢とともに食用に供せられる。オクラの完熟種子は、オクラを栽培するために種苗会社から市販されており、これを用いるのが簡便である。
一方、未熟な種子は、成長途上にある莢の中に包含されており、白色～黄白色の約２～４ｍｍ径のものであり、通常は、莢とともに食用に供せられる。オクラの完熟種子は、オクラを栽培するために種苗会社から市販されており、これを用いるのが簡便である。
【0026】
前記オクラ種子は以下に述べる加工物、すなわち、オクラ種子の抽出物、該抽出残渣、酵素加水分解物又はスプラウトとして採取することが望ましい。
【0027】
オクラ種子の抽出物は、例えば、次のような加工処理により製造することができる。脱皮若しくは非脱皮の種子を粗粉砕ないしは微粉砕し、水を加えて分散液とした後、常温あるいは加熱下、静置又は適宜に撹拌しながら、抽出処理を行なう。次いで、この抽出液を遠心分離、濾過等の常法で処理して不溶物を除去し、より望ましくは常温ないしはそれ以下の低温で濃縮及び乾燥処理あるいは凍結乾燥処理することにより、本発明に係る抽出物を製造することができる。
【0028】
なお、前述の抽出工程において、熱水抽出物を製造する場合は、水分散液を約３０～約９０℃、より好ましくは約４０～約６０℃に設定し、約１０分～数日間、より好ましくは約３０分～数時間抽出処理し、低温抽出物を製造する場合は、約１０～約３０℃、より好ましくは約１５～約２５℃に設定し、約３０分～数日間、より好ましくは数時間～１日浸漬して抽出処理すればよい。
【0029】
オクラ種子の抽出残渣は、前記抽出工程で除去した不溶物を常法により濃縮乾燥あるいは凍結乾燥処理して製造することができる。この場合、乾燥の程度は、カビ等の発生による汚染を防止するために、水分含量を５質量％以下にすることが好ましい。なお、本発明の前記残渣は、本発明の所望の効果との関連において、前述の低温抽出物を製造する際に分離される残渣（低温抽出残渣）であることが望ましい。
【0030】
オクラ種子の酵素分解物は、次のように加工処理して製造することができる。すなわち、オクラ種子を粉砕して水分散液とし、これに対種子当たり約０．１～約５質量％、より好ましくは約０．５～約２質量％の蛋白質加水分解酵素を添加して、常温ないしは加温（約３０～約９０℃、より好ましくは約４０～約６０℃）下、静置又は適宜に撹拌して、約１０分～数日間、より好ましくは３０分～数時間、加水分解処理を行わせる。該処理後、常法により酵素を加熱失活、次いで遠心分離又は濾過処理して不溶物を分離し、望ましくは常温ないしはそれ以下の低温で濃縮、乾燥処理あるいは凍結乾燥処理することによって製造することができる。なお、本発明では、前記水分散液に代えて、前述のように処理して得られるオクラ種子の抽出物又は抽出残渣を水で溶解ないしは分散させたものを用いて、同様に酵素処理してもよい。
【0031】
前記蛋白質加水分解酵素は、いかなる種類やタイプのものでも使用することが可能であるが、本発明においては、アルカリ性プロテアーゼ及び／又は中性プロテアーゼが好ましく、アルカリ性プロテアーゼがより一層望ましい。ここで、アルカリ性プロテアーゼは、基質のｐＨが概ね６．５～１２で作用を示すものであれば使用することができ、中性プロテアーゼは、基質のｐＨが概ね５～８で作用を示すものであれば差し支えない。また、各プロテアーゼは、１種のみならず２種以上を組み合わせて使用してもよく、後述するような市販品を用いるのが簡便である。
【0032】
アルカリ性プロテアーゼとして以下の具体例を挙げることができる。但し、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
「プロチンＳＤ－ＡＹ１０」、「プロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤ」、「プロレザー（登録商標）ＦＧ－Ｆ」（以上、天野エンザイム（株）製）、「アルカラーゼ（登録商標）２．４ＬＦＧ」（ノボザイムズ社製）、「オリエンターゼ（登録商標）２２ＢＦ」（エイチビィアイ（株）製）、「アロアーゼ（登録商標）ＸＡ－１０」（ヤクルト薬品工業（株）製）、「スミチーム（登録商標）ＭＰ」（新日本化学工業（株）製）、「ビオプラーゼＯＰ、ＳＰ－２０ＦＧ、ＡＬ－１５ＦＧ、３０Ｇ、ＡＰＬ－３０及び３０Ｌ」（ナガセケムテックス（株）製）、「ＯＰＴＩＭＡＳＥ（登録商標）ＰＲ８９Ｌ」、「ＭＡＬＴＩＦＥ ＣＴ（登録商標）ＰＲ６Ｌ」（以上、ダニスコＵＳ社製）、「プロティナーゼＫ」、「キモトリプシン」（以上、ロシュ社製）等。
「プロチンＳＤ－ＡＹ１０」、「プロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤ」、「プロレザー（登録商標）ＦＧ－Ｆ」（以上、天野エンザイム（株）製）、「アルカラーゼ（登録商標）２．４ＬＦＧ」（ノボザイムズ社製）、「オリエンターゼ（登録商標）２２ＢＦ」（エイチビィアイ（株）製）、「アロアーゼ（登録商標）ＸＡ－１０」（ヤクルト薬品工業（株）製）、「スミチーム（登録商標）ＭＰ」（新日本化学工業（株）製）、「ビオプラーゼＯＰ、ＳＰ－２０ＦＧ、ＡＬ－１５ＦＧ、３０Ｇ、ＡＰＬ－３０及び３０Ｌ」（ナガセケムテックス（株）製）、「ＯＰＴＩＭＡＳＥ（登録商標）ＰＲ８９Ｌ」、「ＭＡＬＴＩＦＥ ＣＴ（登録商標）ＰＲ６Ｌ」（以上、ダニスコＵＳ社製）、「プロティナーゼＫ」、「キモトリプシン」（以上、ロシュ社製）等。
【0033】
中性プロテアーゼとして次のものを例示することができるが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
「Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ（登録商標）」、「ＰＲＯＴＡＭＥＸ（登録商標）ＭＧ」、「Ｎｅｕｔｒａｓｅ」（以上、ノボザイムズ社製）、「パンチダーゼ（登録商標）Ｐ及びＭＰ」、「アロアーゼ（登録商標）ＡＰ－１０、ＮＰ－１０及びＮＳ」（以上、ヤクルト薬品工業（株）製）、「ヌクレイシン（登録商標）」、「オリエンターゼ（登録商標）１０ＮＬ及び９０Ｎ」（以上、エイチビィアイ（株）製）、「プロチンＰ」（大和化成（株）製）、「プロテアーゼＡ「アマノ」Ｇ」、「パパインＷ４０」、「ブロメラインＦ」（以上、天野エンザイム（株）製）、「スミチーム（登録商標）ＬＰ及びＬＰＬ」（新日本化学工業（株）製）、「食品用精製パパイン」、「デナチームＡＰ」（以上、ナガセケムテックス（株）製）、「トリプシン」（ロシュ社製）等。
「Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ（登録商標）」、「ＰＲＯＴＡＭＥＸ（登録商標）ＭＧ」、「Ｎｅｕｔｒａｓｅ」（以上、ノボザイムズ社製）、「パンチダーゼ（登録商標）Ｐ及びＭＰ」、「アロアーゼ（登録商標）ＡＰ－１０、ＮＰ－１０及びＮＳ」（以上、ヤクルト薬品工業（株）製）、「ヌクレイシン（登録商標）」、「オリエンターゼ（登録商標）１０ＮＬ及び９０Ｎ」（以上、エイチビィアイ（株）製）、「プロチンＰ」（大和化成（株）製）、「プロテアーゼＡ「アマノ」Ｇ」、「パパインＷ４０」、「ブロメラインＦ」（以上、天野エンザイム（株）製）、「スミチーム（登録商標）ＬＰ及びＬＰＬ」（新日本化学工業（株）製）、「食品用精製パパイン」、「デナチームＡＰ」（以上、ナガセケムテックス（株）製）、「トリプシン」（ロシュ社製）等。
【0034】
オクラ種子のスプラウトは、公知の方法により種子を発芽、かいわれ型に生育させ、緑葉が生じて茎丈が約５～１５ｃｍになるまで栽培したものを収穫し、水洗後、乾燥処理あるいは凍結乾燥処理することによって製造することができる。
【0035】
前述のように処理して得られる前記加工物は、オクラ種子に含まれる蛋白質、多糖蛋白複合体、多糖等及び／又はこれらが加水分解されたペプチド類、アミノ酸類、オリゴ糖類、単糖ないしはオリゴ糖類とペプチド又はアミノ酸との結合体等のさまざまな成分を含有する極めて複雑な組成物である。
【0036】
前記のオクラ種子の加工物を構成する複雑な組成物について鋭意研究した結果、発明者らは、環状ペプチド「ＯＦ４９４９－II」が有効成分として含有されていることを発見した。環状ペプチド「ＯＦ４９４９－II」は、アミノペプチダーゼＢの活性を強力に阻害すること、及びペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属する微生物が生産することが知られているが（特許文献１１）、オクラ完熟種子に含まれているという報告はない。
【0037】
環状ペプチド「ＯＦ４９４９－II」は、例えば、次のような精製処理により製造することができる。オクラの完熟種子を加熱下、静置又は適宜に撹拌しながら、抽出処理を行なう。次いで、この抽出液を遠心分離、濾過等の常法で処理して不溶物を除去し、より望ましくは常温ないしはそれ以下の低温で濃縮及び乾燥処理あるいは凍結乾燥処理することにより抽出物を得る。得られた抽出物をフラッシュクロマトグラフィー又は高速液体クロマトグラフィーを使用し目的の画分を濃縮し精製を繰り返す。
【0038】
なお、前述の精製工程において、最終的に質量分析や核磁気共鳴装置により同定を行い環状ペプチド「ＯＦ４９４９－II」であることを確認する。
【0039】
本発明においては、かかるオクラ種子由来の環状ペプチド「ＯＦ４９４９－II」のみならず、前述のような微生物等から得られる環状ペプチド「ＯＦ４９４９－II」であっても、本願発明のエラスターゼ阻害作用を有する有効成分として利用することが可能であり、同様の効果を期待することができる。
【0040】
本発明では、前記のオクラ種子の加工物をそのまま、又は、デキストリン、セルロ－ス、ゼラチン、精製水等の公知の賦形剤を併用して、本発明のエラスターゼの阻害用組成物を含有する、液体状、粉末状、顆粒状、カプセル状の阻害剤を調製することができる。この剤におけるオクラ種子の加工物の含量は概ね２０質量％以上であり、これを下回ると本発明の所望の効果を発現し難くなるから、オクラ種子の加工物／賦形剤（質量割合）は１００～約２０／０～約８０が望ましく、１００～約５０／０～約５０がより一層望ましい。
【0041】
本発明のエラスターゼの阻害用組成物及びこれを含有するエラスターゼ阻害剤は、これを経口で摂取又は投与することにより、皮膚組織中のエラスターゼ作用を抑制してエラスチンの低減を防止するため、皮膚の前記トラブルを改善し、老化症状を回復し、美肌を促進するための美容手段として利用することができる。
【0042】
この好適な態様として、本発明のエラスターゼ阻害剤を固体状（粉末や顆粒）、ゲル状（ゼリー）、ペ－スト状又は液体状（飲料やドリンク）に成形した飲食品、医薬品、動物飼料等の製品とすることが可能である。また、これらの製品を製造するために使用される公知の添加物（界面活性剤、増粘剤、酸化防止剤、着色剤、香料等）や本発明の趣旨に反しない公知の素材（線維芽細胞増殖促進作用、コラーゲンやヒアルロン酸等の細胞外成分産生促進作用、皮膚老化防止作用、美肌促進作用等が公知の動植物由来の素材等）を適宜に併用して常法により前記各種製品とすることが可能である。
【実施例】
【0043】
次に、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれによって限定されるものではない。なお、以下において、特記しない限り部や％は質量基準である。
【実施例1】
【0044】
〔オクラ種子加工物の製造例〕
製造例１
鹿児島県指宿産オクラの完熟種子をミルで粗粉砕し、この１００ｇに蒸留水３００ｍＬを加えて撹拌しながら５８℃に加熱して分散液（ｐＨ７．５）を調製し、これに蛋白質分解酵素（エイチビィアイ（株）製、商品名：「オリエンターゼ２２ＢＦ」、アルカリ性プロテアーゼ）１部を添加して５時間ゆるやかに撹拌を続けた。この後、酵素を失活させ（８０℃で３０分間）、不溶物を遠心分離で除去し、凍結乾燥して酵素分解物（試料１）を得た。
製造例１
鹿児島県指宿産オクラの完熟種子をミルで粗粉砕し、この１００ｇに蒸留水３００ｍＬを加えて撹拌しながら５８℃に加熱して分散液（ｐＨ７．５）を調製し、これに蛋白質分解酵素（エイチビィアイ（株）製、商品名：「オリエンターゼ２２ＢＦ」、アルカリ性プロテアーゼ）１部を添加して５時間ゆるやかに撹拌を続けた。この後、酵素を失活させ（８０℃で３０分間）、不溶物を遠心分離で除去し、凍結乾燥して酵素分解物（試料１）を得た。
【0045】
比較試料１
比較試料１として、エラスターゼ阻害作用を有することが公知の素材であるライチ種子由来の市販品（オリザ油化（株）製、商品名：「ライチ種子エキス－ＷＳＰ」）を用いた。
比較試料１として、エラスターゼ阻害作用を有することが公知の素材であるライチ種子由来の市販品（オリザ油化（株）製、商品名：「ライチ種子エキス－ＷＳＰ」）を用いた。
【0046】
比較試料２
比較試料２として、エラスターゼ阻害作用を有することが公知の素材であるレスベラトロール含有組成物の市販品（ビーエイチエヌ（株）製、商品名：「レスベラトロールε」）を用いた。
比較試料２として、エラスターゼ阻害作用を有することが公知の素材であるレスベラトロール含有組成物の市販品（ビーエイチエヌ（株）製、商品名：「レスベラトロールε」）を用いた。
【0047】
比較試料３
比較試料３として、植物由来の公知素材であるボタンボウフウ葉粉末の市販品（ビーエイチエヌ（株）製、商品名：「ボタンボウフウ葉粉末」）を用いた。
比較試料３として、植物由来の公知素材であるボタンボウフウ葉粉末の市販品（ビーエイチエヌ（株）製、商品名：「ボタンボウフウ葉粉末」）を用いた。
【0048】
比較試料４
比較試料４として、植物由来の公知素材であるゴマ葉粉末の市販品（ビーエイチエヌ（株）製、商品名：「ゴマ葉粉末」）を用いた。
比較試料４として、植物由来の公知素材であるゴマ葉粉末の市販品（ビーエイチエヌ（株）製、商品名：「ゴマ葉粉末」）を用いた。
【0049】
比較試料５
比較試料５として、オクラ由来の公知素材であるオクラ種子粉末の市販品（販売者：(株)松本交商、商品名：「マイオキシノール ＬＳ ９７３６」）を用いた。
比較試料５として、オクラ由来の公知素材であるオクラ種子粉末の市販品（販売者：(株)松本交商、商品名：「マイオキシノール ＬＳ ９７３６」）を用いた。
【0050】
製造例２
製造例１で使用した完熟種子を粗粉砕し、１００ｇに水８００ｍＬを加え、８０～９０℃で６０分間加熱した後、室温まで冷却し、精密濾過（濾紙）して濾液を採取した。この濾過残渣に再度水６００ｍＬを加えて同様に処理して濾液を採取した。両濾液を合わせて減圧下に濃縮し、凍結乾燥及び粉砕して抽出物（試料２）を製造した。
製造例１で使用した完熟種子を粗粉砕し、１００ｇに水８００ｍＬを加え、８０～９０℃で６０分間加熱した後、室温まで冷却し、精密濾過（濾紙）して濾液を採取した。この濾過残渣に再度水６００ｍＬを加えて同様に処理して濾液を採取した。両濾液を合わせて減圧下に濃縮し、凍結乾燥及び粉砕して抽出物（試料２）を製造した。
【0051】
製造例３
製造例１で使用した完熟種子を粗粉砕し、１００ｇに水８００ｍＬを加え、１５～２５℃で一晩浸漬後、精密濾過（濾紙）して濾液を採取し、減圧下に濃縮し、凍結乾燥及び粉砕して抽出物（試料３）を製造した。
製造例１で使用した完熟種子を粗粉砕し、１００ｇに水８００ｍＬを加え、１５～２５℃で一晩浸漬後、精密濾過（濾紙）して濾液を採取し、減圧下に濃縮し、凍結乾燥及び粉砕して抽出物（試料３）を製造した。
【0052】
製造例４
製造例３に記載した濾過後の残渣を凍結乾燥及び粉砕して抽出残渣（試料４）を製造した。
製造例３に記載した濾過後の残渣を凍結乾燥及び粉砕して抽出残渣（試料４）を製造した。
【0053】
製造例５
製造例１と同じ完熟種子を０℃～室温の水に８～２０時間浸漬して水を除いた後、栽培容器に播種し、室温～３０℃、湿度７５～９０％の暗室に保存し、適宜に水を散布することで発芽させた。発芽後ハウスに移して太陽光下、室温２５～３０℃、適宜に水を散布しながら、５～７日後にカイワレ型のスプラウトを得た。これを水洗し、凍結乾燥及び粉砕してスプラウト粉砕物（試料５）を製造した。
製造例１と同じ完熟種子を０℃～室温の水に８～２０時間浸漬して水を除いた後、栽培容器に播種し、室温～３０℃、湿度７５～９０％の暗室に保存し、適宜に水を散布することで発芽させた。発芽後ハウスに移して太陽光下、室温２５～３０℃、適宜に水を散布しながら、５～７日後にカイワレ型のスプラウトを得た。これを水洗し、凍結乾燥及び粉砕してスプラウト粉砕物（試料５）を製造した。
【0054】
比較製造例１
製造例１において、完熟種子を未熟種子に代えたことを除き同様に処理して酵素分解物（比較試料６）を得た。
製造例１において、完熟種子を未熟種子に代えたことを除き同様に処理して酵素分解物（比較試料６）を得た。
【0055】
比較製造例２
製造例１において、完熟種子をオクラ可食部（未熟種子を内包する莢。以下同じ。）由来の市販品（（有）エール製、商品名：「オクラパウダー」）に代えたことを除き同様に処理して酵素分解物（比較試料７）を得た。
製造例１において、完熟種子をオクラ可食部（未熟種子を内包する莢。以下同じ。）由来の市販品（（有）エール製、商品名：「オクラパウダー」）に代えたことを除き同様に処理して酵素分解物（比較試料７）を得た。
【0056】
比較製造例３
製造例２において、完熟種子をオクラ可食部由来の市販品（（有）エール製、商品名：「オクラパウダー」）に代えたことを除き同様に処理して抽出物（比較試料８）を得た。
製造例２において、完熟種子をオクラ可食部由来の市販品（（有）エール製、商品名：「オクラパウダー」）に代えたことを除き同様に処理して抽出物（比較試料８）を得た。
【0057】
試験例
前記の各試料がエラスターゼ活性に及ぼす影響を以下に述べる方法で調べた。
前記の各試料がエラスターゼ活性に及ぼす影響を以下に述べる方法で調べた。
【0058】
試験例１：エラスターゼ阻害作用（その１）
エラスターゼ活性を測定する試験試料として前記の試料１、比較試料１～３を用いた。各試験試料を１００ｍＭトリス・塩酸バッファー（ｐＨ８．０）に溶解し、終濃度４０.０～１０００．０μｇ／ｍｌの試験溶液を調製した。この際、溶解し難い場合には、１０％以内でＤＭＳＯを添加した。
９６マイクロプレートにこの試験溶液２５μｌとヒト皮膚線維芽細胞由来エラスターゼ溶液（ここで、前記エラスターゼ溶液は、ヒト皮膚線維芽細胞（クラボウ(株)社製）をコンフルエントになるように前培養し、２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で２４時間培養したのちＰＢＳ（－）で２回洗浄後、０．１％ ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を加え、超音波処理にて溶解させた。この溶解液を１２０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を回収し、凍結乾燥した粉末を粗酵素粉末とし、各試験において都度、緩衝液にて溶解させた。）２５μｌを混合し、３７℃で５分間予加温した。
尚、対照として、当該エラスターゼ溶液に１００ｍＭトリス・塩酸バッファー及びＤＭＳＯのみを加えた混合液も、同様に処理した。
次に、基質としてＮ－サクシニル－トリアラニル－Ｐ－ニトロアニリドを含む溶液（基質を最小量のＤＭＳＯに溶解し、１００ｍＭトリス・塩酸バッファー（ｐＨ８．０）を加えて５ｍＭとしたもの）５０μｌを加え、反応を開始させた。２時間経過後に、エラスターゼの作用によって遊離してくるニトロアニリンを、分光光度計（コロナ電気(株)製、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ ＳＨ９０００ Ｌａｂ）を用いて４０５ｎｍ波長光として測定し、試験試料を添加しない対照の吸光度に対する検体の吸光度からエラスターゼ阻害率を算出した。エラスターゼ阻害率は次の計算式から求めた。
エラスターゼ阻害率（％）＝｛１－（対照－試料）／（対照－ブランク）｝×１００
エラスターゼ活性を測定する試験試料として前記の試料１、比較試料１～３を用いた。各試験試料を１００ｍＭトリス・塩酸バッファー（ｐＨ８．０）に溶解し、終濃度４０.０～１０００．０μｇ／ｍｌの試験溶液を調製した。この際、溶解し難い場合には、１０％以内でＤＭＳＯを添加した。
９６マイクロプレートにこの試験溶液２５μｌとヒト皮膚線維芽細胞由来エラスターゼ溶液（ここで、前記エラスターゼ溶液は、ヒト皮膚線維芽細胞（クラボウ(株)社製）をコンフルエントになるように前培養し、２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で２４時間培養したのちＰＢＳ（－）で２回洗浄後、０．１％ ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を加え、超音波処理にて溶解させた。この溶解液を１２０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を回収し、凍結乾燥した粉末を粗酵素粉末とし、各試験において都度、緩衝液にて溶解させた。）２５μｌを混合し、３７℃で５分間予加温した。
尚、対照として、当該エラスターゼ溶液に１００ｍＭトリス・塩酸バッファー及びＤＭＳＯのみを加えた混合液も、同様に処理した。
次に、基質としてＮ－サクシニル－トリアラニル－Ｐ－ニトロアニリドを含む溶液（基質を最小量のＤＭＳＯに溶解し、１００ｍＭトリス・塩酸バッファー（ｐＨ８．０）を加えて５ｍＭとしたもの）５０μｌを加え、反応を開始させた。２時間経過後に、エラスターゼの作用によって遊離してくるニトロアニリンを、分光光度計（コロナ電気(株)製、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ ＳＨ９０００ Ｌａｂ）を用いて４０５ｎｍ波長光として測定し、試験試料を添加しない対照の吸光度に対する検体の吸光度からエラスターゼ阻害率を算出した。エラスターゼ阻害率は次の計算式から求めた。
エラスターゼ阻害率（％）＝｛１－（対照－試料）／（対照－ブランク）｝×１００
【0059】
この結果を表１に示す。同表において、線維芽細胞由来のエラスターゼ阻害率の度合は、同時に実施した対照試験の値を０としたときの相対値で表した。
同表のデ－タから、完熟種子を酵素処理した場合（試料１）は試験試料のいずれの濃度においても極めて高いエラスターゼ阻害作用を示した。これに対して、エラスターゼ阻害作用が既に知られているライチ種子エキス（比較試料１）やレスベラトロール含有組成物（比較試料２）は、高濃度の場合に阻害作用が高まるが低濃度では阻害作用が小さいこと、また、植物由来のボタンボウフウ葉粉末（比較試料３）及びゴマ葉粉末（比較試料４）では、いずれの濃度においても阻害作用が弱いことを確認した。
同表のデ－タから、完熟種子を酵素処理した場合（試料１）は試験試料のいずれの濃度においても極めて高いエラスターゼ阻害作用を示した。これに対して、エラスターゼ阻害作用が既に知られているライチ種子エキス（比較試料１）やレスベラトロール含有組成物（比較試料２）は、高濃度の場合に阻害作用が高まるが低濃度では阻害作用が小さいこと、また、植物由来のボタンボウフウ葉粉末（比較試料３）及びゴマ葉粉末（比較試料４）では、いずれの濃度においても阻害作用が弱いことを確認した。
【0060】
【表1】
【0061】
試験例２：エラスターゼ阻害作用（その２）
本試験例では、オクラ種子の酵素分解物以外の加工物及び完熟種子以外の加工物がエラスターゼ阻害作用に及ぼす影響を調べた。ここで、エラスターゼ阻害活性の測定や該阻害作用の度合いの評価は試験例１と同じ方法で実施したが、試験溶液の終濃度は０.４～１０．０μｇ／ｍｌに設定した。また、試験試料は前記の試料１、試料２～５、比較試料５～８を用いた。
本試験例では、オクラ種子の酵素分解物以外の加工物及び完熟種子以外の加工物がエラスターゼ阻害作用に及ぼす影響を調べた。ここで、エラスターゼ阻害活性の測定や該阻害作用の度合いの評価は試験例１と同じ方法で実施したが、試験溶液の終濃度は０.４～１０．０μｇ／ｍｌに設定した。また、試験試料は前記の試料１、試料２～５、比較試料５～８を用いた。
【0062】
この結果を表２に示す。同表において、エラスターゼ阻害作用の度合（阻害率）は、同時に実施した対照試験の値を０としたときの相対値で表した。
同表のデ－タから、オクラの完熟種子の加工物である抽出物（試料２、３）、抽出残渣（試料４）及びスプラウト（試料５）は酵素分解物（試料１）と同程度の強力なエラスターゼ阻害作用を示すこと、一方、オクラの種子由来粉末の場合（比較試料５）はエラスターゼ阻害作用が劣り、未熟種子を酵素分解した場合（比較試料６）、可食部（未熟種子を含む莢）を酵素処理した場合（比較試料７）及び熱水抽出した場合（比較試料８）は、エラスターゼ阻害作用がほとんど認められないことを確認した。
同表のデ－タから、オクラの完熟種子の加工物である抽出物（試料２、３）、抽出残渣（試料４）及びスプラウト（試料５）は酵素分解物（試料１）と同程度の強力なエラスターゼ阻害作用を示すこと、一方、オクラの種子由来粉末の場合（比較試料５）はエラスターゼ阻害作用が劣り、未熟種子を酵素分解した場合（比較試料６）、可食部（未熟種子を含む莢）を酵素処理した場合（比較試料７）及び熱水抽出した場合（比較試料８）は、エラスターゼ阻害作用がほとんど認められないことを確認した。
【0063】
【表2】
【0064】
試験例３：ヒトモニター試験
以下の試験に同意を得たボランティアの成人女性４０名（３０歳～５５歳、平均年齢： ４４．５歳）を対象とし、１群２０名に分かれてもらい、１群は試料１（１００ｍｇ）もう１群はプラセボ（デキストリン１００ｍｇ）、を１日２回経口摂取してもらい、これを４週間続けた。摂取する前後の肌の変化について、肌の乾燥・シミ・シワ・はり・すくみ・たるみ・ほうれい線・化粧のり・毛穴の開き等の項目を用い、改善の有無についてアンケ－ト調査を行ない、評価した。
以下の試験に同意を得たボランティアの成人女性４０名（３０歳～５５歳、平均年齢： ４４．５歳）を対象とし、１群２０名に分かれてもらい、１群は試料１（１００ｍｇ）もう１群はプラセボ（デキストリン１００ｍｇ）、を１日２回経口摂取してもらい、これを４週間続けた。摂取する前後の肌の変化について、肌の乾燥・シミ・シワ・はり・すくみ・たるみ・ほうれい線・化粧のり・毛穴の開き等の項目を用い、改善の有無についてアンケ－ト調査を行ない、評価した。
【0065】
この結果、試料１群においては、摂取前と比べ肌が改善した：１７名、変化しなかった：２名、改悪した１名、プラセボ群においては肌が改善した：２名、変化しなかった：１４名、改悪した４名、であった。肌の変化した１７名は、特にシワ・はり・たるみ・ほうれい線の項目について２つ以上の改善の選択があった。また、プラセボ群には見られなかった、肌の乾燥や毛穴の開きの改善についても選択されていた。
結果は、本発明に係るオクラ完熟種子の加工物がエラスターゼの活性を阻害することによる肌の改善に有用であることを示唆する。
結果は、本発明に係るオクラ完熟種子の加工物がエラスターゼの活性を阻害することによる肌の改善に有用であることを示唆する。
【実施例2】
【0066】
〔環状ペプチド「ＯＦ４９４９－II」の製造例〕
オクラの完熟種子から得た抽出物５ｇに蒸留水１０ｍＬを加え、よく撹拌し、超音波処理を行い、遠心又は静置後、上清を回収し、分画サンプルとした。この分画サンプル１ｍＬを、分取用充填剤ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ-４０Ｆ（東ソー）が詰められたクロマトグラフ管に供し、一定量の２０％メタノールを流した。
図１に示すフローチャートのように、順次溶出する溶液を、ガラス試験管に３ｍＬ毎に分画した。
オクラの完熟種子から得た抽出物５ｇに蒸留水１０ｍＬを加え、よく撹拌し、超音波処理を行い、遠心又は静置後、上清を回収し、分画サンプルとした。この分画サンプル１ｍＬを、分取用充填剤ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ-４０Ｆ（東ソー）が詰められたクロマトグラフ管に供し、一定量の２０％メタノールを流した。
図１に示すフローチャートのように、順次溶出する溶液を、ガラス試験管に３ｍＬ毎に分画した。
【0067】
試験例
前記の各画分がエラスターゼ活性に及ぼす影響を以下に述べる方法で調べた。
前記の各画分がエラスターゼ活性に及ぼす影響を以下に述べる方法で調べた。
【0068】
試験例：エラスターゼ阻害作用
エラスターゼ活性を測定する試験試料として前記の各画分を用いた。
試験方法は、前記の試験例２と同様の方法において、試験溶液の終濃度を０.４～１０．０μｇ／ｍｌに設定して実施した。
エラスターゼ活性を測定する試験試料として前記の各画分を用いた。
試験方法は、前記の試験例２と同様の方法において、試験溶液の終濃度を０.４～１０．０μｇ／ｍｌに設定して実施した。
【0069】
この結果を表３に示す。同表において、各画分のエラスターゼ阻害率の度合は、同時に実施した対照試験の値を０としたときの相対値で表した。
同表のデータから、画分Ｆは他の画分のいずれの濃度においても極めて高いエラスターゼ阻害作用（％）を示した。
同表のデータから、画分Ｆは他の画分のいずれの濃度においても極めて高いエラスターゼ阻害作用（％）を示した。
【0070】
【表3】
【0071】
次に、前記の画分Ｆを以下のように処理して精製した。前記画分Ｆを濃縮・乾固し１～５ｍｇ／ｍＬ程度の濃度になるように蒸留水に溶解した。溶解後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて流速０．７ｍＬ／ｍｉｎでＣ１８カラムである５Ｃ１８－ＭＳ－II（ナカライテスク）を使用しグラジエント分析を行い５種類の画分（溶出順に（１）～（５））を得て、各画分のエラスターゼ阻害活性を同様に測定した結果、画分（５）に最も高い阻害活性が認められた。
なお、グラジエント分析において、ＨＰＬＣの移動相には０．１％のギ酸を含有した水（移動相Ａ）とアセトニトリル（移動相Ｂ）をグラジエントで使用し、移動相Ｂの割合は０－５（ｍｉｎ）：０％、１５（ｍｉｎ）：５０％、１５－２５（ｍｉｎ）：８０％である。
さらに、同様の条件で画分（５）を３種類の画分（（５）－１～３）に分けて分画したところ実質的に（５）－１にのみ高い阻害活性が確認された。結果を表４に示す。
画分Ｆの濃度を４ｍｇ／ｍＬで分画した場合のクロマトグラムを図２、図３に示す。図２、３において縦軸は紫外線吸収強度（ｍＶ／ｃｍ）、横軸は保持時間（ｍｉｎ／ｃｍ）である。
なお、グラジエント分析において、ＨＰＬＣの移動相には０．１％のギ酸を含有した水（移動相Ａ）とアセトニトリル（移動相Ｂ）をグラジエントで使用し、移動相Ｂの割合は０－５（ｍｉｎ）：０％、１５（ｍｉｎ）：５０％、１５－２５（ｍｉｎ）：８０％である。
さらに、同様の条件で画分（５）を３種類の画分（（５）－１～３）に分けて分画したところ実質的に（５）－１にのみ高い阻害活性が確認された。結果を表４に示す。
画分Ｆの濃度を４ｍｇ／ｍＬで分画した場合のクロマトグラムを図２、図３に示す。図２、３において縦軸は紫外線吸収強度（ｍＶ／ｃｍ）、横軸は保持時間（ｍｉｎ／ｃｍ）である。
【0072】
【表4】
【0073】
阻害活性が高かった画分（５）－１を同様に繰り返し十分な量を得たのち、ＨＰＬＣを用いて流速０．６ｍＬ／ｍｉｎでアミノカラムであるＩｎｔｒａｄａ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ（Ｉｍｔａｋｔ）を使用しグラジエント分析を行い１０．５分頃のピークを回収し精製した。
なお、グラジエント分析において、ＨＰＬＣの移動相には０．１％のギ酸を含有した水（移動相Ａ）とアセトニトリル（移動相Ｂ）をグラジエントで使用し、移動相Ｂの割合は０－３（ｍｉｎ）：９０％、１０（ｍｉｎ）：０％、１０－１５（ｍｉｎ）：０％である。
例えば、画分（５）－１を１０ｍｇ／ｍＬ程度の濃度で分取した場合の精製物のクロマトグラムを図４に示す。図４において縦軸は紫外線吸収強度（ｍＶ）、横軸は保持時間（ｍｉｎ）である。
なお、グラジエント分析において、ＨＰＬＣの移動相には０．１％のギ酸を含有した水（移動相Ａ）とアセトニトリル（移動相Ｂ）をグラジエントで使用し、移動相Ｂの割合は０－３（ｍｉｎ）：９０％、１０（ｍｉｎ）：０％、１０－１５（ｍｉｎ）：０％である。
例えば、画分（５）－１を１０ｍｇ／ｍＬ程度の濃度で分取した場合の精製物のクロマトグラムを図４に示す。図４において縦軸は紫外線吸収強度（ｍＶ）、横軸は保持時間（ｍｉｎ）である。
【0074】
前述の処理で得た精製物を、直接導入／質量分析（ＤＩ／ＭＳ）および核磁気共鳴分析（ＮＭＲ）に供して、分子量：４７２、分子式：Ｃ２２Ｈ２４Ｎ４Ｏ８を推定し、前記式Ｉで示される環状ペプチドの「ＯＦ４９４９－II」（ＣＡＳ番号：９３３７５－５０－９）であることを確認した。
【0075】
試作例１：ハードカプセル製剤
前記の試料１をカプセル充填機に供して、常法により１粒あたり内容量が１００ｍｇのゼラチン被覆ハードカプセル製剤を試作した。ハードカプセル製剤（製造例１の完熟オクラ種子を配合したもの）をモニター試験で経口摂取してもらったところ、肌の改善に有用である知見を得た。したがって、本錠剤は肌の改善のための経口摂取可能な栄養補助食品、医薬品又は動物用飼料として利用することができる。
前記の試料１をカプセル充填機に供して、常法により１粒あたり内容量が１００ｍｇのゼラチン被覆ハードカプセル製剤を試作した。ハードカプセル製剤（製造例１の完熟オクラ種子を配合したもの）をモニター試験で経口摂取してもらったところ、肌の改善に有用である知見を得た。したがって、本錠剤は肌の改善のための経口摂取可能な栄養補助食品、医薬品又は動物用飼料として利用することができる。
【0076】
試作例２：錠剤
以下に示す原料を常法により打錠して錠剤を試作した。ここで、完熟オクラ種子としては、前記の試料１～５のいずれか１種を使用した。これらの錠剤はいずれも安定で服用し易いものであり、栄養補助食品や医薬品として利用することができる。
（配合原料） （１錠当たりの質量（ｍｇ））
１．オクラ完熟種子 １００
２．デキストリン １００
３．バレイショデンプン ４９
４．微結晶セルロ－ス ２０
５．合成ケイ酸アルミニウム ３０
６．ステアリン酸カルシウム １
以下に示す原料を常法により打錠して錠剤を試作した。ここで、完熟オクラ種子としては、前記の試料１～５のいずれか１種を使用した。これらの錠剤はいずれも安定で服用し易いものであり、栄養補助食品や医薬品として利用することができる。
（配合原料） （１錠当たりの質量（ｍｇ））
１．オクラ完熟種子 １００
２．デキストリン １００
３．バレイショデンプン ４９
４．微結晶セルロ－ス ２０
５．合成ケイ酸アルミニウム ３０
６．ステアリン酸カルシウム １
【0077】
試作例３：栄養補助食品
前記試料１を１００ｍｇ、ロイシンを４００ｍｇ、イソロイシンを２５０ｍｇ、バリンを２００ｍｇ、アルギニンを３００ｍｇとし、これらの混合、篩過した粉末を包装充填し、栄養補助食品を試作した。この栄養補助食品はヒトのみならずペットフ－ドにも利用することができる。
前記試料１を１００ｍｇ、ロイシンを４００ｍｇ、イソロイシンを２５０ｍｇ、バリンを２００ｍｇ、アルギニンを３００ｍｇとし、これらの混合、篩過した粉末を包装充填し、栄養補助食品を試作した。この栄養補助食品はヒトのみならずペットフ－ドにも利用することができる。
【0078】
試作例４：食品（麺類）
前記の試料１を１０ｇ、そば粉を３５０ｇ、強力粉を１５０ｇとし、これらを混ぜ合わせながら、篩にかけ、水を１５０ｍｌ混合して、そばを試作した。これは市販品と比べて風味や食感に違和感のないものであった。
前記の試料１を１０ｇ、そば粉を３５０ｇ、強力粉を１５０ｇとし、これらを混ぜ合わせながら、篩にかけ、水を１５０ｍｌ混合して、そばを試作した。これは市販品と比べて風味や食感に違和感のないものであった。
【0079】
試作例５：清涼飲料水、ドリンク剤
市販の清涼飲料水及びドリンク剤１００ｍＬに前記試料１又は試料２を５００ｍｇ又は１００ｍｇ加えて十分に混合し飲料を試作した。この飲料は元の清涼飲料水及びドリンク剤と比較して風味及び保存安定性で何ら■色のないものであった。これは清涼飲料又はドリンク剤として利用することが可能である。
市販の清涼飲料水及びドリンク剤１００ｍＬに前記試料１又は試料２を５００ｍｇ又は１００ｍｇ加えて十分に混合し飲料を試作した。この飲料は元の清涼飲料水及びドリンク剤と比較して風味及び保存安定性で何ら■色のないものであった。これは清涼飲料又はドリンク剤として利用することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【0080】
オクラの完熟種子から得られる加工物、特に、オクラの完熟種子から得られる環状ペプチド「ＯＦ４９４９－II」は、線維芽細由来のエラスターゼ活性を阻害する作用を有するため、これを経口的に摂取又は投与することにより、皮膚の本来の生理機能を回復させ、皮膚トラブルの改善、美肌の促進、皮膚損傷の早期回復等に役立つ飲食品、医薬品、動物飼料等として有効利用が可能となる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】