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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-07-01
(45)【発行日】2024-07-09
(54)【発明の名称】新規な抗体ならびにそれを調製および使用するための方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20240702BHJP
C07K 16/30 20060101ALI20240702BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20240702BHJP
C07K 14/765 20060101ALI20240702BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240702BHJP
C07K 14/55 20060101ALI20240702BHJP
C07K 14/54 20060101ALI20240702BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20240702BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240702BHJP
C12N 15/26 20060101ALI20240702BHJP
C12N 15/24 20060101ALI20240702BHJP
C12N 15/14 20060101ALI20240702BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240702BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/30 ZNA
C07K16/46
C07K14/765
C07K19/00
C07K14/55
C07K14/54
C07K16/28
C12N15/62 Z
C12N15/26
C12N15/24
C12N15/14
A61K39/395 T
【請求項の数】
12
(21)【出願番号】P 2021526401
(86)(22)【出願日】2019-07-18
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-11-11
(86)【国際出願番号】 US2019042493
(87)【国際公開番号】W WO2020018852
(87)【国際公開日】2020-01-23
【審査請求日】2022-07-19
(31)【優先権主張番号】62/700,174
(32)【優先日】2018-07-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/792,798
(32)【優先日】2019-01-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】520347328
【氏名又は名称】アスクジーン・ファーマ・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＡｓｋＧｅｎｅ Ｐｈａｒｍａ， Ｉｎｃ．
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】ル，ユエフォン
(72)【発明者】
【氏名】ル，ジェン－フォン
(72)【発明者】
【氏名】シャネベック，カート
(72)【発明者】
【氏名】リ，ルー
(72)【発明者】
【氏名】リュウ，レイ
(72)【発明者】
【氏名】チョウ，シーウェン
(72)【発明者】
【氏名】ラン，ヤン
【審査官】大久保 智之
(56)【参考文献】
【文献】特表２００９－５１７３５４（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１８／００５５９４４（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２０１５－５１７４７６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１８－５１３１４６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１９－５３５２３４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１６－５１７４４７（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１５／０３７４７８９（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１５／０１５７７１１（ＵＳ，Ａ１）
【文献】Cancer Research，2011年，Vol.71, No.2，pp.516-527，https://aacrjournals.org/cancerres/article/71/2/516/568756/Highly-Specific-Auto-Antibodies-against-Claudin-18参照
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－９０
Ｃ０７Ｋ １４／００－１９／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒトＣＬＤＮ１８．２タンパク質に結合するヒト化抗体であって、配列番号２５７のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインと、
配列番号２６０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインと、
を含む、抗体。
【請求項2】
単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ抗体、Ｆａｂ’抗体、および（Ｆａｂ’）２抗体から選択される形態を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項3】
前記抗体は、ヒトＣＬＤＮ１８．１への結合よりも強い親和性でヒトＣＬＤＮ１８．２に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項4】
前記抗体は、ヒトＣＬＤＮ１８．１への結合よりも少なくとも１００倍高い親和性でヒトＣＬＤＮ１８．２に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項5】
前記抗体は、ヒトＣＬＤＮ１８．２に結合するがヒトＣＬＤＮ１８．１に結合しない、請求項１に記載の抗体。
【請求項6】
前記抗体は１種以上の細胞毒性薬に結合されている、請求項１に記載の抗体。
【請求項7】
前記抗体の重鎖および／または軽鎖はヒトアルブミンに融合されており、前記アルブミンドメインは１種以上の細胞毒性薬に結合されている、請求項１に記載の抗体。
【請求項8】
ＩＬ－２またはＩＬ－１５の１種以上の拮抗薬をさらに含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項9】
前記抗体の重鎖および／または軽鎖は抗原結合ドメインに融合されており、前記抗原結合ドメインはヒトＣＤ３に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項10】
前記抗体の重鎖および／または軽鎖は１つ以上の抗原結合ドメインに融合されており、前記抗原結合ドメインはヒトＰＤ－Ｌ１、ＣＤ４７またはシグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項11】
請求項１に記載の抗体を含む、医薬組成物。
【請求項12】
前記抗体の重鎖および／または軽鎖は、１種以上のＩＬ－２ポリペプチド、１種以上のＩＬ－２類似体、１種以上のＩＬ－１５ポリペプチド、または１種以上のＩＬ－１５類似体に融合されている、請求項１に記載の抗体。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１８年７月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／７００，１７４号および２０１９年１月１５日に出願された同第６２／７９２，７９８号の優先権を主張するものであり、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１８年７月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／７００，１７４号および２０１９年１月１５日に出願された同第６２／７９２，７９８号の優先権を主張するものであり、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
以下は本発明を理解するのに有用であり得る情報を含む。それらの情報は、本明細書において提供されている情報のいずれかがここに記載もしくは特許請求されている発明の先行技術または関連技術であること、あるいは具体的または暗黙的に参照されているいずれかの刊行物または文献が先行技術であることを認めるものではない。
【0003】
毎年世界的に１００万件に近い胃癌の新しい症例が確認されていることが最近分かった。胃癌の世界的な死亡率は２０１２年には７００，０００件超であった（ｈｔｔｐ：／／ｇｌｏｂｏｃａｎ．ｉａｒｃ．ｆｒ／ｏｌｄ／ＦａｃｔＳｈｅｅｔｓ／ｃａｎｃｅｒｓ／ｓｔｏｍａｃｈ－ｎｅｗ．ａｓｐ）。米国癌協会によれば２０１８年には、米国で約２６，４００人の人々が胃癌であると診断され、その予測死亡者数は約１０，８００人であった。人口全体の割合としての胃癌の発生率はアジアではより高く、それは２０１２年に世界的に報告された全ての胃癌症例の約４０％であり、すなわちおよそ４００，０００件の症例が中国において発生したものであることが分かった。２０１２年には中国で３２５，０００人の人々が胃癌で死亡した。これらの人口統計データにより、胃癌は限られた治療選択肢しかなく既存の治療法が十分でないために未だ対処されていない深刻な疾患であり、新しい治療用化合物および治療法が緊急に必要とされていることは明らかである。
【0004】
胃癌を治療するために、５－Ｆｕとシスプラチンとの組み合わせは多くの国々で第一選択治療であることが多い。しかし中国ではパクリタキセルとシスプラチンとの組み合わせを使用して胃癌患者を治療することが多く、これはより良好な治療効果を有すると言われている。
【0005】
抗体は様々な癌のために現在広く使用されている比較的新しいクラスの標的治療用化合物である。抗体ベースの治療薬は多くの従来の非抗体型癌治療薬と比較して、より高い特異性およびより低い副作用を有する可能性がある。一般に抗体ベースの治療薬の潜在的標的は正常細胞と新生細胞とを識別することを必要とする。驚くことではないが、細胞表面タンパク質は腫瘍細胞上で露出されている可能性がある抗体ベースの標的化の開発の潜在的領域である。クローディン（Ｃｌａｕｄｉｎ）１８．２は、胃および食道癌のための抗体療法のための標的であることが最近発見された（Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ．２０１７（１）：１０５）。それは膵臓癌のための抗体薬物を開発するための標的でもあった。クローディン１８．２は、少なくとも２４種の密接に関連する膜貫通タンパク質を有するタンパク質のクローディンファミリーに属する（概説のために、Ｏｕｂａｎ Ａ，Ａｈｍｅｄ ＡＡ．：「Ｃｌａｕｄｉｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ：ａ ｒｅｖｉｅｗ（ヒトの癌におけるクローディン：概説）」，Ｈｉｓｔｏｌ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．２０１０ Ｊａｎ；２５（１）：８３－９０を参照）。
【0006】
クローディンは傍細胞イオン輸送を調節する密着結合タンパク質である。特定のクローディンタンパク質メンバーは悪性腫瘍において差次的に発現される。クローディン１８．２の場合、それは短命の分化した胃上皮細胞上で排他的に発現される高度に選択的な胃系統抗原であり、それは抗体薬物に対して限られた到達性しか有しない（Ｓａｈｉｎ Ｕら「Ｃｌａｕｄｉｎ １８ ｓｐｌｉｃｅ ｖａｒｉａｎｔ ２ ｉｓ ａ ｐａｎ－ｃａｎｃｅｒ ｔａｒｇｅｔ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（クローディン１８スプライスバリアント２は治療的抗体の開発に適した膵臓癌標的である）」．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００８，１４：７６２４－３４、およびＴｕｒｅｃｉ Ｏら「Ｃｌａｕｄｉｎ－１８ ｇｅｎｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｓ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｍａｍｍａｌ（クローディン１８遺伝子の構造、調節および発現は哺乳類において進化的に保存されている）」．Ｇｅｎｅ ２０１１，４８１：８３－９２）。クローディン１８．２は悪性転換の過程で維持され、従ってヒト胃癌細胞の表面で頻繁に提示される（Ｗｏｌｌら：「Ｃｌａｕｄｉｎ １８．２ ｉｓ ａ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ＩＭＡＢ３６２ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｎｅｏｐｌａｓｍｓ（クローディン１８．２は膵臓腫瘍においてＩＭＡＢ３６２抗体の標的である）」．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ：１３４，７３１－７３９，２０１４）。
【0007】
ＩＭＡＢ３６２と命名されたクローディン１８．２に対する抗体が米国特許第８，１６８，４２７号において最近開示された。２０１６年に公表された第２相研究（ｈｔｔｐｓ：／／ｍｅｅｔｉｎｇｌｉｂｒａｒｙ．ａｓｃｏ．ｏｒｇ／ｒｅｃｏｒｄ／１２２６５１／ａｂｓｔｒａｃｔ）では、標準的な化学療法に追加されたＩＭＡＢ３６２で治療した進行型もしくは再発性胃癌および胃食道接合部癌腫を有する患者は、標準的なＥＯＸ（エピルビシン、オキサリプラチンおよびカペシタビン）のみを摂取した患者と比較して進行のリスクの５３％の低下および死亡のリスクの４９％の低下を実証した。しかし、標的クローディン１８．２への特定の抗体ＩＭＡＢ３６２の結合親和性は比較的中程度であるように思われ、必要とされる投与量は比較的高いように思われた。さらに臨床開発中の抗体は、反復投与後に免疫原性リスクを潜在的に有する可能性があるキメラ分子であった。
【0008】
より高い有効性、より低い投与量／コストおよび／またはより低い免疫原性リスクを有するクローディン１８．２に対する新しい抗体が必要とされている。
【発明の概要】
【0009】
本明細書に記載および特許請求されている発明は、限定されるものではないが、この簡単な概要に記載または説明または言及されているものを含む多くの属性および実施形態を有する。本明細書に記載および特許請求されている発明は、本概要に特定されている特徴または実施形態に（よって）限定されず、これは限定のためではなく例示のためにのみ含められている。
【0010】
本明細書に記載および提供されているものはクローディン１８．２のための新規な抗体である。本明細書においてさらに詳細に記載されているように、本発明に係る抗体は、限定されるものではないが、以下の特性：ｉ）クローディン１８．２への高い相対的結合親和性、ｉｉ）ヒト抗体もしくはヒト化抗体、ｉｉｉ）向上した抗体－薬物コンジュゲート能力、ｉｖ）免疫療法との向上した併用、ｖ）向上したＡＤＣＣ機能、およびｖｉ）向上した治療効果を含む。
【0011】
一態様では、本発明は、以下からなる群から選択されるヒトクローディン（ＣＬＤＮ）１８．２タンパク質に結合する抗体を提供する。
（１）配列番号４７に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号４８に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号４９に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号５０に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５１に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号５２に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（２）配列番号５３に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５４に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号５５に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号５６に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５７に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号５８に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（３）配列番号５９に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号６０に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号６１に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号６２に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６３に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号６４に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（４）配列番号６５に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号６６に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号６７に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号６８に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６９に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号７０に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（５）配列番号７１に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号７２に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号７３に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号７４に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７５に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号７６に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（６）配列番号７７に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号７８に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号７９に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号８０に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号８１に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号８２に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（７）配列番号８３に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号８４に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号８５に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号８６に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号８７に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号８８に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（８）配列番号８９に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号９０に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号９１に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号９２に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９３に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号９４に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（９）配列番号９５に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号９６に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号９７に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号９８に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９９に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１００に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（１０）配列番号１０１に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０２に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号１０３に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１０４に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０５に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１０６に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（１１）配列番号１０７に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０８に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号１０９に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１１０に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１１に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１１２に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（１２）配列番号１１３に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１１４に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号１１５に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１１６に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１７に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１１８に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（１３）配列番号１１９に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１２０に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号１２１に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１２２に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１２３に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１２４に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（１４）配列番号１２５に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１２６に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号１２７に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１２８に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１２９に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１３０に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（１５）配列番号１３１に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１３２に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号１３３に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１３４に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１３５に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１３６に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（１６）配列番号１３７に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１３８に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号１３９に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１４０に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４１に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１４２に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（１７）配列番号１４３に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４４に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号１４５に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１４６に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４７に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１４８に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（１８）配列番号１４９に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１５０に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号１５１に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１５２に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５３に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１５４に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（１９）配列番号１５５に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１５６に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号１５７に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１５８に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５９に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１６０に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（２０）配列番号１６１に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１６２に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号１６３に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１６４に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１６５に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１６６に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（２１）配列番号１６７に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１６８に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号１６９に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１７０に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７１に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１７２に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（２２）配列番号１７３に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１７４に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号１７５に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１７６に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７７に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１７８に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（２３）配列番号１７９に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１８０に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号１８１に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１８２に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１８３に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１８４に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（２４）配列番号２０７に示されているアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０８に示されているアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２および配列番号２０９に示されているアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２１０に示されているアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２１１に示されているアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２および配列番号２１２に示されているアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（２５）配列番号２１３に示されているアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２１４に示されているアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２および配列番号２１５に示されているアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２１６に示されているアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２１７に示されているアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２および配列番号２１８に示されているアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（２６）配列番号２１３に示されているアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２１４に示されているアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２および配列番号２４７に示されているアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２１６に示されているアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２１７に示されているアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２および配列番号２１８に示されているアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（２７）配列番号２１９に示されているアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２２０に示されているアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２および配列番号２２１に示されているアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２２２に示されているアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２２３に示されているアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２および配列番号２２４に示されているアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（２８）配列番号２２５に示されているアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２２６に示されているアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２および配列番号２２７に示されているアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２２８に示されているアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２２９に示されているアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２および配列番号２３０に示されているアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（２９）配列番号２３１に示されているアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２３２に示されているアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２および配列番号２３３に示されているアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２３４に示されているアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３５に示されているアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２および配列番号２３６に示されているアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体。
（１）配列番号４７に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号４８に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号４９に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号５０に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５１に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号５２に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（２）配列番号５３に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５４に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号５５に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号５６に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５７に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号５８に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（３）配列番号５９に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号６０に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号６１に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号６２に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６３に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号６４に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（４）配列番号６５に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号６６に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号６７に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号６８に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６９に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号７０に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（５）配列番号７１に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号７２に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号７３に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号７４に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７５に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号７６に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（６）配列番号７７に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号７８に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号７９に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号８０に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号８１に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号８２に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（７）配列番号８３に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号８４に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号８５に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号８６に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号８７に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号８８に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（８）配列番号８９に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号９０に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号９１に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号９２に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９３に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号９４に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（９）配列番号９５に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号９６に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号９７に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号９８に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９９に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１００に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（１０）配列番号１０１に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０２に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号１０３に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１０４に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１０５に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１０６に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（１１）配列番号１０７に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０８に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号１０９に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１１０に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１１に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１１２に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（１２）配列番号１１３に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１１４に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号１１５に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１１６に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１７に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１１８に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（１３）配列番号１１９に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１２０に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号１２１に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１２２に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１２３に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１２４に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（１４）配列番号１２５に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１２６に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号１２７に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１２８に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１２９に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１３０に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（１５）配列番号１３１に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１３２に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号１３３に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１３４に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１３５に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１３６に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（１６）配列番号１３７に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１３８に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号１３９に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１４０に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４１に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１４２に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（１７）配列番号１４３に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４４に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号１４５に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１４６に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４７に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１４８に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（１８）配列番号１４９に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１５０に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号１５１に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１５２に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５３に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１５４に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（１９）配列番号１５５に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１５６に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号１５７に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１５８に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５９に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１６０に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（２０）配列番号１６１に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１６２に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号１６３に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１６４に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１６５に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１６６に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（２１）配列番号１６７に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１６８に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号１６９に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１７０に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７１に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１７２に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（２２）配列番号１７３に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１７４に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号１７５に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１７６に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７７に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１７８に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（２３）配列番号１７９に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１８０に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２および配列番号１８１に示されているアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１８２に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１８３に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１８４に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（２４）配列番号２０７に示されているアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０８に示されているアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２および配列番号２０９に示されているアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２１０に示されているアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２１１に示されているアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２および配列番号２１２に示されているアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（２５）配列番号２１３に示されているアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２１４に示されているアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２および配列番号２１５に示されているアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２１６に示されているアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２１７に示されているアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２および配列番号２１８に示されているアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（２６）配列番号２１３に示されているアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２１４に示されているアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２および配列番号２４７に示されているアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２１６に示されているアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２１７に示されているアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２および配列番号２１８に示されているアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（２７）配列番号２１９に示されているアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２２０に示されているアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２および配列番号２２１に示されているアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２２２に示されているアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２２３に示されているアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２および配列番号２２４に示されているアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（２８）配列番号２２５に示されているアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２２６に示されているアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２および配列番号２２７に示されているアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２２８に示されているアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２２９に示されているアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２および配列番号２３０に示されているアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、
（２９）配列番号２３１に示されているアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２３２に示されているアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２および配列番号２３３に示されているアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２３４に示されているアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３５に示されているアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２および配列番号２３６に示されているアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体。
【0012】
一態様では、本発明は配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１および２４８からなる群から選択される重鎖可変領域を含むヒトＣＬＤＮ１８．２タンパク質に結合する抗体を提供し、別の態様では、本発明は配列番号２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、２４２、２４３、２４４、２４５および２４６からなる群から選択される軽鎖可変領域を含むヒトＣＬＤＮ１８．２タンパク質に結合する抗体を提供する。
【0013】
一実施形態では、本抗体はヒト化されている。別の実施形態では、本抗体のＣＤＲ領域は置換、突然変異、欠失または付加された１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのアミノ酸を有する。
【0014】
一実施形態では、本抗体はヒト化されており、これは配列番号１９３～１９７、２０５および２０６から選択されるものと少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖と、配列番号１８７～１９１、１９９～２０３および２０４から選択されるものと少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖とを含む。
【0015】
一実施形態では、本抗体はヒト化されており、これは配列番号２５２および２５３から選択されるものと少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖と、配列番号２４９、２５０および２５１から選択されるものと少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖とを含む。
【0016】
一実施形態では、本抗体はヒト化されており、これは配列番号２５４～２５８および２５９から選択されるものと少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号２６０、２６１および２６２から選択されるものと少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む。
【0017】
一実施形態では、本抗体はヒト化されており、これは配列番号２６３、２６４および２６５からなる群から選択されるものと少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号２６６、２６７、２６８および２６９からなる群から選択されるものと少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む。
【0018】
一実施形態では、本抗体は、単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ抗体、Ｆａｂ’抗体、（Ｆａｂ’）２抗体、ドメイン抗体、ナノボディ、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、マキシボディ（ｍａｘｉｂｏｄｙ）およびダイアボディから選択される。
【0019】
一態様では、上の前記抗体は１種以上の細胞毒性薬に結合されている。一実施形態では、前記抗体の重鎖および／または軽鎖はヒトアルブミンに融合されており、かつ前記アルブミンドメインは１種以上の細胞毒性薬に結合されている。
【0020】
一態様では、本抗体は免疫賦活剤に融合されている。いくつかの実施形態では、前記抗体の重鎖および／または軽鎖は１種以上のＩＬ－２ポリペプチド、１種以上のＩＬ－２類似体、１種以上のＩＬ－１５ポリペプチドまたは１種以上のＩＬ－１５類似体に融合されている。いくつかの実施形態では、前記抗体は、ＩＬ－２またはＩＬ－１５の１種以上の拮抗薬をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記抗体の重鎖および／または軽鎖は抗原結合ドメインに融合されており、前記抗原結合ドメインはヒトＣＤ３に結合する。いくつかの実施形態では、前記抗体の重鎖および／または軽鎖は１つ以上の抗原結合ドメインに融合されており、前記抗原結合ドメインはヒトＰＤ－Ｌ１、ＣＤ４７またはシグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）に結合する。
【0021】
別の態様では、本発明は上に記載されている抗体を含む医薬組成物を提供する。
【0022】
別の態様では、本発明は、上に記載されている医薬組成物をそれを必要とする対象に投与する工程を含む、膵臓、胃、食道および肝臓癌からなる群から選択される癌を治療する方法を提供する。
【0023】
別の態様では、本発明は、上の前記医薬組成物を胃、食道、膵臓および肝臓癌からなる群から選択される癌に適した化学療法レジメンと組み合わせてそれを必要とする患者に投与する工程を含む、癌を治療する方法をさらに提供する。
【0024】
いくつかの実施形態では、前記化学療法レジメンは、ヌクレオシド類似体、白金化合物、カンプトテシン類似体、タキサン、それらのプロドラッグ、それらの塩およびそれらの組み合わせから選択される。
【0025】
いくつかの実施形態では、前記化学療法レジメンは、ゲムシタビン、５－フルオロウラシル、オキサリプラチン、イリノテカン、パクリタキセル、それらのプロドラッグ、それらの塩およびそれらの組み合わせからなる。
【0026】
いくつかの実施形態では、前記化学療法レジメンは、オキサリプラチンとパクリタキセルとの組み合わせあるいはそれらのプロドラッグまたは塩からなる。
【0027】
添付の図面は本発明の態様を示す。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図2】図２：Ｂ細胞クローンのＦＡＣＳベースのスクリーニング。各クローンからの上澄みを、ＣＬＤＮ１８．２（左、青色）およびＣＬＤＮ１８．１（右、橙黄色）を発現している安定な細胞株に結合するそれらの能力についてＦＡＣＳを用いて試験した。
【図4】図４：腫瘍細胞株ＮＵＧＣ４を用いた抗体のＡＤＣＣ分析。細胞傷害の誘導倍数がＹ軸に示され、かつ試験した異なるモノクローナル抗体の量がＸ軸にプロットされており、試験したクローンは４６Ｈ２Ｌ５（●）、４８Ｈ１Ｌ６（■）、２７２Ｈ１Ｌ５（▲）、４２Ｈ１Ｌ１１（緑色の▽）、３２Ｈ１Ｌ１（◆）、２１５Ｈ５Ｌ３（〇）および対照（青色の▼）である。この図に示されている実験では、ＦＡＣＳ分析の７２時間前にＨＥＫ２９３細胞をヒトおよびマウスのクローディン１８．２およびクローディン１８．１でトランスフェクトした。
【図8】図８：培養した陽性ハイブリドーマのサブクローンからの上澄みのＦＡＣＳ分析。図８Ａは、ＨＥＫ２９３細胞上で発現されているＣＬＤＮ１８．２へのハイブリドーマの上澄みの結合の滴定曲線を示す。図８Ｂは、１８．１に対してＣＬＤＮ１８．２を発現しているＨＥＫ２９３細胞への上澄みの結合の特異性を示す。図８Ｃは、ＨＥＫ２９３細胞上で発現されているＣＬＤＮ１８．１に対してＣＬＤＮ１８．２への上澄みの結合のＦＡＣＳ強度を示す。
【図9】図９：陽性のサブクローンからクローニングした遺伝子で一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の上澄みのＦＡＣＳ分析。図９Ａは、ＨＥＫ２９３細胞上で発現されているＣＬＤＮ１８．２へのクローンの上澄みの結合の滴定曲線を示す。図９Ｂは、１８．１に対してＣＬＤＮ１８．２を発現しているＨＥＫ２９３細胞への上澄みの結合の特異性を示す。図９Ｃは、ＨＥＫ２９３細胞上で発現されているＣＬＤＮ１８．１に対してＣＬＤＮ１８．２への上澄みの結合のＦＡＣＳ強度を示す。
【図12】図１２：ＣＬＤＮ１８．２を発現している標的細胞ＨＥＫ２９３（図１２Ａ）、胃癌細胞ＮＵＧＣ４（図１２Ｂ）および胃癌細胞ＤＡＮ－Ｇ（図１２Ｃ）を用いたヒト化抗体Ｍ５およびＢについてのＡＤＣＣレポーターアッセイの結果。
【図13】図１３：ヒト化分子Ｂ、Ｍ１およびＭ５のＣＤＣの結果。図１３ＡはＣＬＤＮ１８．２を発現している標的ＨＥＫ２９３細胞に対する参照に対してＢおよびＭ１を用いた場合の結果を示し、図１３ＢはＣＬＤＮ１８．２を発現している標的ＨＥＫ２９３細胞に対する参照に対してＭ５を用いた場合の結果を示し、図１３Ｃは標的ＮＵＧＣ４細胞に対する参照に対してＢおよびＭ１を用いた場合の結果を示す。
【0029】
上に説明されている図面はその例示的な実施形態の少なくとも１つにおける本発明の態様を示し、それらはさらに以下の発明を実施するための形態において詳細に定められている。異なる図の中で同じ符号によって参照されている本発明の特徴、要素および態様は、１つ以上の実施形態に係る同じ、同等もしくは同様の特徴、要素または態様を表す。
【発明を実施するための形態】
【0030】
本発明は、癌などの疾患に罹患している対象の治療のための組成物および方法に関し、この方法は、内因性免疫応答を増強し、すなわち内因性応答の活性化を刺激するか内因性応答の抑制を阻害する治療的有効量の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその一部を含む組成物を対象に投与することを含む。一実施形態では、抗体は、４９Ｅ０５、４９Ｅ１２、５０Ｈ０８、５２Ｅ０７、５２Ｇ０２、５４Ｂ０８、５４Ｃ０２、５９Ａ０８、５９Ｅ０７、５９Ｆ１０、５９Ｇ０３、７７Ｂ０６、８０Ｄ０８、８０Ｇ０８、８１Ｅ１１、８２Ｃ０８、８２Ｆ０２、９９Ａ０９、ＳＤ２１５、ＳＤ２３２、ＳＤ２７２、ＳＤ３１２、ＳＤ３３１、７９Ｃ４、１１Ｅ１２、８３Ｇ３、３０Ｂ５または８５Ｈ１２と命名されている。これらの抗体は、以下の表４～表２６、表２９～表３２および表３３に列挙されているそれぞれのＣＤＲを有する。別の実施形態では、抗体４９Ｅ０５、４９Ｅ１２、５０Ｈ０８、５２Ｅ０７、５２Ｇ０２、５４Ｂ０８、５４Ｃ０２、５９Ａ０８、５９Ｅ０７、５９Ｆ１０、５９Ｇ０３、７７Ｂ０６、８０Ｄ０８、８０Ｇ０８、８１Ｅ１１、８２Ｃ０８、８２Ｆ０２、９９Ａ０９、ＳＤ２１５、ＳＤ２３２、ＳＤ２７２、ＳＤ３１２、ＳＤ３３１、７９Ｃ４、１１Ｅ１２、８３Ｇ３、３０Ｂ５および８５Ｈ１２は、以下の表２、表３、表３４および表３５に列挙されているそれぞれの軽鎖および重鎖可変領域を有する。
【0031】
抗ＣＬＤＮ１８．２抗体を発現するハイブリドーマ系統１１Ｅ１２は、特許寄託番号ＰＴＡ－１２５９５０で２０１９年６月１２日にアメリカ培養細胞系統保存機関［ＡＴＣＣ；１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．、バージニア州マナッサス ２０１１０－２２０９（米国）］に寄託された。
【0032】
特定の他の実施形態では、当該対象は、癌を有する患者から得られた試験組織試料においてＣＬＤＮ１８．２の表面発現を測定すること、例えば細胞表面でＣＬＤＮ１８．２を発現する試験組織試料中の細胞の割合を決定し、かつＣＬＤＮ１８．２が試験組織試料中の細胞の表面で発現されているという評価に基づいて治療のための患者を選択することを含む方法において治療に適したものとして選択される。
【0033】
クローディン１８（ＣＬＤ１８）分子（ジェンバンク受入番号：スプライスバリアント１（ＣＬＤ１８Ａ１）：ＮＰ＿０５７４５３、ＮＭ＿０１６３６９およびスプライスバリアント２（ＣＬＤ１８Ａ２）：ＮＭ＿００１００２０２６、ＮＰ＿００１００２０２６）は、およそ２７．９／２７．７ＫＤの分子量を有する内在性膜貫通タンパク質である。クローディンは上皮および内皮の密着結合内に位置する内在性膜タンパク質である。
【0034】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すように本明細書では同義で使用される。この用語は、その１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に生じるアミノ酸の人工の化学的模倣体であるアミノ酸ポリマーならびに天然に生じるアミノ酸ポリマーおよび天然に生じないアミノ酸ポリマーにも適用される。ポリペプチドを得る（例えば、産生する、単離する、精製する、合成する、および組換えで製造する）ための方法は当業者によく知られている。
【0035】
「アミノ酸」という用語は、天然に生じるアミノ酸および合成のアミノ酸ならびに天然に生じるアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然に生じるアミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるものならびに後で修飾されるアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタミン酸およびＯ－ホスホセリンである。アミノ酸類似体とは、天然に生じるアミノ酸と同じ基本的な化学構造、すなわち水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基に結合した炭素を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は、修飾されたＲ基（例えばノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが天然に生じるアミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持している。アミノ酸模倣体とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが天然に生じるアミノ酸と同様に機能する化合物を指す。
【0036】
アミノ酸は本明細書では、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）によって推奨されているそれらの一般に公知の３文字記号または１文字記号のいずれかによって言及されている場合がある。ヌクレオチドは同様にそれらの一般に受け入れられている１文字コードによって言及されている場合がある。
【0037】
本組成物は一般に、タンパク質およびペプチド中にタンパク質またはペプチドの活性を変えないアミノ酸置換を含む（Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク，１９７９）。一実施形態では、これらの置換は「保存的」アミノ酸置換である。最も一般に生じる置換は、両方向でのＡｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／ＧｌｕおよびＡｓｐ／Ｇｌｙである。
【0038】
アミノ酸配列の「保存的に修飾されたバリアント」については、当業者であれば、コードされる配列中の単一のアミノ酸または少ない割合のアミノ酸を変化、付加または欠失させる核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失または付加が「保存的に修飾されたバリアント」であり、ここではその変化により化学的に類似したアミノ酸によるアミノ酸の置換が生じることが分かるであろう。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表が当該技術分野でよく知られている。そのような保存的に修飾されたバリアントは本発明の多型バリアント、種間相同体および対立遺伝子に追加されるものであり、それらを排除するものではない。
【0039】
以下の８つの群：１）アラニン（Ａ）とグリシン（Ｇ）、２）アスパラギン酸（Ｄ）とグルタミン酸（Ｅ）、３）アスパラギン（Ｎ）とグルタミン（Ｑ）、４）アルギニン（Ｒ）とリジン（Ｋ）、５）イソロイシン（Ｉ）とロイシン（Ｌ）とメチオニン（Ｍ）とバリン（Ｖ）、６）フェニルアラニン（Ｆ）とチロシン（Ｙ）とトリプトファン（Ｗ）、７）セリン（Ｓ）とトレオニン（Ｔ）、ならびに８）システイン（Ｃ）とメチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照）はそれぞれ、互いに対して保存的置換であるアミノ酸を含む。
【0040】
本明細書で使用される類似体は、参照ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列とは異なるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列を示す。そのような差異はアミノ酸の付加、欠失または置換、リン酸化、硫酸化、アクリル化（ａｃｒｙｌａｔｉｏｎ）、グリコシル化、メチル化、ファルネシル化、アセチル化およびアミド化などであってもよく、非天然アミノ酸構造の使用または他のそのような修飾は当該技術分野で知られている。
【0041】
一実施形態では、本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、４９Ｅ０５、４９Ｅ１２、５０Ｈ０８、５２Ｅ０７、５４Ｂ０８、５４Ｃ０２、５９Ａ０８、５９Ｅ０７、５９Ｆ１０、５９Ｇ０３、７７Ｂ０６、８０Ｄ０８、８０Ｇ０８、８１Ｅ１１、８２Ｃ０８、８２Ｆ０２、９９Ａ０９、ＳＤ２１５、ＳＤ２３２、ＳＤ２７２、ＳＤ３１２、ＳＤ３３１、７９Ｃ４、１１Ｅ１２、８３Ｇ３、３０Ｂ５または８５Ｈ１２のいずれかで命名されており、かつそれぞれが重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲを含み、ここでは重鎖ＣＤＲは、以下の表４～表２６に列挙されているそれぞれのＣＤＲと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含み、かつ軽鎖ＣＤＲは、以下の表４～表２６に列挙されているそれぞれのＣＤＲと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含む。
【0042】
別の実施形態では、本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、４９Ｅ０５、４９Ｅ１２、５０Ｈ０８、５２Ｅ０７、５４Ｂ０８、５４Ｃ０２、５９Ａ０８、５９Ｅ０７、５９Ｆ１０、５９Ｇ０３、７７Ｂ０６、８０Ｄ０８、８０Ｇ０８、８１Ｅ１１、８２Ｃ０８、８２Ｆ０２、９９Ａ０９、ＳＤ２１５、ＳＤ２３２、ＳＤ２７２、ＳＤ３１２、ＳＤ３３１、７９Ｃ４、１１Ｅ１２、８３Ｇ３、３０Ｂ５または８５Ｈ１２のいずれかで命名されており、かつそれぞれが重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、ここでは重鎖可変領域は、以下の表２に列挙されているそれぞれの重鎖可変領域と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含み、かつ軽鎖可変領域は、以下の表３に列挙されているものから選択されるそれぞれの軽鎖可変領域と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含む。
【0043】
さらなる実施形態では、ヒト化抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は重鎖および軽鎖を含み、ここでは重鎖は、以下の表２７に列挙されている配列番号１８７～１９１、１９９～２０３、２０４、２４９、２５０および２５１から選択されるそれぞれの重鎖可変領域と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含み、かつ軽鎖は、以下の表２８に列挙されている配列番号１９３～１９７、２０５、２０６、２５２および２５３から選択されるそれぞれの軽鎖可変領域と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含む。
【0044】
「抗体」は、抗原に特異的に結合してそれを認識する免疫グロブリン遺伝子またはその断片からのフレームワーク領域を含むポリペプチドを指す。認識される免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμ定常領域遺伝子ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖はκまたはλのいずれかとして分類される。重鎖はγ、μ、α、δまたはεとして分類され、次いでこれらはそれぞれ免疫グロブリンクラスすなわちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを定める。典型的には、抗体の抗原結合領域は結合の特異性および親和性において最も重要である。
【0045】
例示的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は四量体を含む。各四量体はポリペプチド鎖の２つの同一の対からなり、各対は１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）および１つの「重」鎖（約５０～７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は主に抗原認識に寄与する約１００～１１０個またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を定める。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）という用語はこれらの軽鎖および重鎖をそれぞれ指す。
【0046】
抗体は例えば、インタクトな免疫グロブリンまたは各種ペプチダーゼによる消化によって生成される多くの十分に特性評価されている断片として存在する。従って、例えばペプシンはヒンジ領域におけるジスルフィド結合の下で抗体を消化してＦ（ａｂ）’２、すなわちそれ自体がジスルフィド結合によってＶＨ－－ＣＨ１に結合された軽鎖であるＦａｂの二量体を生成する。Ｆ（ａｂ）’２を穏やかな条件下で還元してヒンジ領域におけるジスルフィド結合を破壊し、それによりＦ（ａｂ）’２二量体をＦａｂ’モノマーに変換してもよい。Ｆａｂ’モノマーは本質的にヒンジ領域の一部を有するＦａｂである（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（基礎免疫学），Ｐａｕｌ編，第３版 １９９３を参照）。各種抗体断片はインタクトな抗体の消化に関して定められているが、当業者であればそのような断片を化学的に合成するか、あるいは組換えＤＮＡ法を用いて新たに合成することができることが分かるであろう。従って本明細書で使用される抗体という用語は、全抗体の修飾によって生成された抗体断片または組換えＤＮＡ法を用いて新たに合成されたもの（例えば一本鎖Ｆｖ）またはファージディスプレイライブラリーを用いて同定されたものも含む（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４（１９９０）を参照）。
【0047】
従って本発明のいずれかの態様において、抗体という用語は、ミニボディ、ダイアボディおよびトリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）なども包含する。ダイアボディは高い結合活性および特異性を有する小さい二価の生体特異性抗体断片である。それらの高い信号雑音比は典型的には、特異的抗原の診断および治療標的化のためのそれらの可能性を高めるより良好な特異性および速い血液クリアランスのおかげでより良好である（Ｓｕｎｄａｒｅｓａｎら．，Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ ４４：１９６２－９（２００３））。さらにこれらの抗体は、小さい一本鎖Ｆｖから様々なイソ型を有するインタクトなＩｇＧにまで及ぶ異なる種類の抗体断片として必要であれば操作することができるので有利である（Ｗｕ＆Ｓｅｎｔｅｒ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１１３７－１１４６（２００５））。いくつかの実施形態では、抗体断片はダイアボディの一部である。いくつかの実施形態におけるいずれかの態様では、本発明は本発明に従って使用するために高い結合活性抗体を提供する。
【0048】
本発明によって提供されるＣＤＲ領域は、限定されるものではないが、抗体、ｓｃＦｖ、トリアボディ、ダイアボディおよびミニボディなどの抗ＣＬＤＮ１８．２結合タンパク質を構築するために使用してもよい。特定の実施形態では、本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２タンパク質は、以下に列挙されている表４～表２６からの少なくとも１つのＣＤＲ領域あるいは表４～表２６に列挙されているＣＤＲ領域と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含む。抗ＣＬＤＮ１８．２結合タンパク質は、本明細書において提供されている抗体からの例えばＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３またはそれらの組み合わせを含んでいてもよい。本発明の特定の実施形態では、抗ＣＬＤＮ１８．２結合タンパク質は、本明細書において提供されている抗体の３種類全てのＣＤＲ－Ｈ配列、本明細書において提供されている抗体の３種類全てのＣＤＲ－Ｌ配列または両方を含んでいてもよい。抗ＣＬＤＮ１８．２のＣＤＲ配列は抗体骨格またはその断片に使用してもよく、同様にヒト化抗体すなわちヒト化配列を含む抗体を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ領域はＫａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、ＡｂＭ定義、接触定義または任意の他の好適なＣＤＲ番号付システムを用いて定めてもよい。
【0049】
いくつかの実施形態では、本発明は、表４～表２６のＣＤＲまたは表４～表２６のＣＤＲと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列を有する抗体（例えばダイアボディ、ミニボディ、トリアボディ）またはそれらの断片を提供する。他の実施形態では、ダイアボディは、表２および表３の軽鎖および重鎖または表２および表３の配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列を有する。
【0050】
最初にＨｏｌｌｉｎｇｅｒら，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９０（１４）：６４４４－６４４８（１９９３）によって記載されたダイアボディは、本明細書に開示されている重鎖および軽鎖を用い、かつ本明細書に開示されている個々のＣＤＲ領域を用いて構築してもよい。典型的にはダイアボディ断片は、短すぎて同じ鎖上の２つのドメイン間で対形成することができないリンカーによって軽鎖可変領域（ＶＬ）に結合された重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。従って１つの断片のＶＨおよびＶＬ領域は別の断片の相補的なＶＨおよびＶＬ領域と対形成することを強いられ、それにより２つの抗原結合部位が形成される。トリアボディは同様に３つの抗原結合部位と共に構築することができる。Ｆｖ断片は、非共有結合性相互作用によって互いに保持されたＶＬ領域およびＶＨ領域を含む完全な抗原結合部位を含む。本発明によって包含されるＦｖ断片はＶＨおよびＶＬ領域がグルタルアルデヒド、分子間ジスルフィドまたは他のリンカーにより架橋されている構築物も含む。重鎖および軽鎖の可変領域を互いに融合させて親免疫グロブリンの元の特異性を保持する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を形成することができる。Ｇｒｕｂｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２（１２）：５３６８－７４（１９９４）によって最初に記載された一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）二量体は、本明細書に開示されている重鎖および軽鎖を用い、かつ本明細書に開示されている個々のＣＤＲ領域を用いて構築してもよい。当該技術分野で知られている多くの技術を使用して本発明の特異的結合構築物を調製することができる（米国特許出願公開第２００７０１９６２７４号および米国特許出願公開第２００５０１６３７８２号を参照、それらの内容全体が全ての目的のために、特にミニボディおよびダイアボディ設計に関して参照により本明細書に組み込まれる）。
【0051】
ダイアボディは化学的架橋結合またはハイブリッドハイブリドーマ技術によって作製することができる。あるいはダイアボディ分子は組換え技術によって産生することができる。ＶＨおよびＶＬ領域を結合するリンカーの長さをｓｃＦｖ断片を産生するために日常的に使用される約１５個のアミノ酸から約５個のアミノ酸まで減少させることにより二量体化を促進することができる。これらのリンカーはＶＨおよびＶＬ領域の鎖内組み立てに有利である。あらゆる好適な短いリンカーを使用することができる。このようにして２つの断片が集合して二量体分子になる。リンカー長さを０～２個のアミノ酸までさらなる減少させることにより三量体（トリアボディ）または四量体（四重特異性抗体）分子を作製することができる。
【0052】
抗体（例えば組換えモノクローナルもしくはポリクローナル抗体）の調製のために、当該技術分野で知られている多くの技術を使用することができる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－４９７（１９７５）；Ｋｏｚｂｏｒら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２（１９８３）；Ｃｏｌｅら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（モノクローナル抗体および癌療法），Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７－９６（１９８５）；Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（免疫学における現在のプロトコル）（１９９１）；Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（抗体の使用：研究室マニュアル）（１９８８）、ならびにＧｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（モノクローナル抗体：原理および実践）（第２版 １９８６）を参照）。目的の抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子は細胞からクローニングすることができ、例えばモノクローナル抗体をコードする遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、組換えモノクローナル抗体を産生するために使用することができる。モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子ライブラリーもハイブリドーマまたは血漿細胞から作製することができる。重鎖および軽鎖遺伝子産物のランダムな組み合わせにより、異なる抗原特異性を有する抗体の大きなプールを生成する（例えば、Ｋｕｂｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第３版 １９９７）を参照）。一本鎖抗体または組換え抗体の産生のための技術（米国特許第４，９４６，７７８号、米国特許第４，８１６，５６７号）を改変して本発明のポリペプチドに対する抗体を産生することができる。また遺伝子導入マウスまたは他の哺乳類などの他の生物を使用してヒト化もしくはヒト抗体を発現させてもよい（例えば、米国特許第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，６６１，０１６号；Ｍａｒｋｓら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９－７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇら，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６－８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８１２－１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５－５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８２６（１９９６）；およびＬｏｎｂｅｒｇ＆Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５－９３（１９９５を参照））。あるいは、ファージディスプレイ技術を使用して選択された抗原に特異的に結合する抗体およびヘテロメリックＦａｂ断片を同定することができる（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４（１９９０）；Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９－７８３（１９９２）を参照）。抗体を二重特異性にする、すなわち２つの異なる抗原を認識することができるようにすることもできる（例えば、国際公開第９３／０８８２９号；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：３６５５－３６５９（１９９１）；およびＳｕｒｅｓｈら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（酵素学における方法）１２１：２１０（１９８６）を参照）。抗体は異種結合体、例えば２つの共有結合された抗体または免疫毒素であってもよい（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、国際公開第９１／００３６０号および国際公開第９２／２００３７３号を参照）。
【0053】
非ヒト抗体をヒト化または霊長類化するための方法は当該技術分野でよく知られている。一般にヒト化抗体は非ヒトである供給源からそこに導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、典型的には移入可変領域にちなんで移入残基（ｉｍｐｏｒｔ ｒｅｓｉｄｕｅ）と呼ばれることが多い。ヒト化は、齧歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列の代わりに使用することにより、本質的にＷｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法に従って行うことができる（例えば、Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４－１５３６（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３－５９６（１９９２）を参照）。従って、そのようなヒト化抗体はキメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号）、ここではインタクトなヒト可変領域よりも実質的に少ないアミノ酸残基が非ヒト生物種からの対応する配列によって置換されている。実際にはヒト化抗体は典型的には、いくつかのＣＤＲ残基および場合によりいくつかのＦＲ残基が齧歯類抗体内の類似した部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
【0054】
「キメラ抗体」は、「（ａ）抗原結合部位（可変領域）を異なるまたは変化させたクラス、エフェクター機能および／または生物種の定常領域あるいはキメラ抗体に新しい特性を与える完全に異なる分子、例えば酵素、毒素、ホルモン、増殖因子、薬物などに結合させるように、定常領域またはその一部が変化、置換または交換されている」、あるいは「（ｂ）可変領域またはその一部が異なるまたは変化させた抗原特異性を有する可変領域により変化、置換または交換されている」抗体分子である。
【0055】
抗体に「特異的に（または選択的に）結合するまたは「～と特異的に（または選択的に）免疫反応性である」という語句は、タンパク質またはペプチドについて言及している場合には、異種タンパク質集団および他の生物学的製剤中のタンパク質の存在の決定因となる結合反応を指す。従って指定された免疫学的検定条件下では、特定の抗体はバックグラウンドの少なくとも２倍、より典型的にはバックグラウンドの１０～１００倍超で特定のタンパク質に結合する。そのような条件下での抗体への特異的結合は、特定のタンパク質へのその特異性のために選択される抗体を必要とする。例えばポリクローナル抗体は、選択された抗原と特異的に免疫反応性であり、かつ他のタンパク質とはそうではないポリクローナル抗体のみを得るために選択することができる。この選択は他の分子と交差反応する抗体を除去することにより達成してもよい。様々な免疫学的検定方式を使用して特定のタンパク質と特異的に免疫反応性の抗体を選択してもよい。例えば、タンパク質と特異的に免疫反応性の抗体を選択するために固相ＥＬＩＳＡ免疫学的検定が日常的に使用されている（例えば、特異的免疫反応性を決定するために使用することができる免疫学的検定方式および条件の説明については、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（抗体の使用：研究室マニュアル）（１９９８）を参照）。
【0056】
「免疫応答」は、侵入病原体、病原体に感染した細胞または組織、癌性もしくは他の異常細胞、あるいは自己免疫、神経変性または病的炎症の場合は正常なヒト細胞または組織の選択的標的化、そこへの結合、損傷、その破壊および／または脊椎動物の体からの除去をもたらす免疫系の細胞（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、樹状細胞および好中球）ならびにこれらの細胞のいずれかまたは肝臓によって産生される可溶性巨大分子（Ａｂ、サイトカインおよび補体を含む）の作用を指す。
【0057】
「免疫調節剤」は、免疫応答を調節する物質、薬剤、シグナル伝達経路またはその成分を指す。免疫応答を「調節する」「変更する」または「調整する」は、免疫系の細胞またはそのような細胞の活性におけるあらゆる変化を指す。そのような調節としては、各種細胞型の数の増加または減少、これらの細胞の活性の増加または減少、あるいは免疫系の中で生じ得るあらゆる他の変化によって明らかにすることができる免疫系の刺激または抑制が挙げられる。阻害性および刺激性免疫調節剤の両方が同定されており、そのうちのいくつかは癌、感染症または神経変性微小環境において向上した機能を有し得る。
【0058】
「免疫療法」という用語は、免疫応答を誘導、向上、抑制またはそれ以外の方法で変更することを含む方法によって、疾患に罹患しているか、疾患に罹患するリスクがあるか、あるいは疾患が再発するリスクがある対象の治療を指す。対象の「治療」または「治療法」は、疾患に関連する症状、合併症、病状または生化学的徴候の発症、進行、発生、重症度または再発を、回復、軽減、寛解、阻害、減速または予防する目的で当該対象に対して行われる任意の種類の介入またはプロセスあるいは当該対象への活性薬剤の投与を指す。
【0059】
「内因性免疫応答を増強させる」は、対象における既存の免疫応答の有効性または効力の増加を意味する。この有効性および効力における増加は、例えば内因性宿主免疫応答を抑制する機序を克服することにより、あるいは内因性宿主免疫応答を高める機序を刺激することにより達成してもよい。
【0060】
細胞表面ＣＬＤＮ１８．２発現に関する「所定の閾値」は、その上で試料が細胞表面ＣＬＤＮ１８．２発現について陽性であるとスコア化される腫瘍細胞および腫瘍浸潤性炎症細胞を含む試験組織試料中の細胞の割合を指す。細胞表面発現について、細胞表面でＣＬＤＮ１８．２を発現している細胞の所定の閾値は、細胞の総数の少なくとも約０．０１％から少なくとも約２０％の範囲である。好ましい実施形態では、細胞表面でＣＬＤＮ１８．２を発現している細胞の所定の閾値は細胞の総数の少なくとも約０．１％から少なくとも約１０％の範囲である。より好ましくは、所定の閾値は少なくとも約５％である。さらにより好ましくは、所定の閾値は少なくとも約１％である。
【0061】
所望の配列および対照配列を含む好適なベクターの構築は、当該技術分野において良く理解されている標準的なライゲーションおよび制限技術を用いる（Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（分子クローニング：研究室マニュアル），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク（１９８２）を参照）。単離したプラスミド、ＤＮＡ配列または合成のオリゴヌクレオチドを所望の形態で切断、調整および再連結させる。
【0062】
核酸は別の核酸配列と機能的関係で配置されている場合には「操作可能に連結」されている。例えばプレ配列または分泌リーダー（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｌｅａｄｅｒ）のためのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合にはポリペプチドのためのＤＮＡと操作可能に連結されており、プロモーターまたはエンハンサーはコード配列の転写に影響を与える場合にはその配列に操作可能に連結されており、あるいはリボソーム結合部位はコード配列が翻訳を容易にするように位置している場合にはそこに操作可能に連結されている。一般に「操作可能に連結されている」は、連結されているＤＮＡ配列が互いに近く、かつ分泌リーダーの場合は隣接し、かつ読み取り相（ｒｅａｄｉｎｇ ｐｈａｓｅ）の中にあることを意味する。但しエンハンサーは隣接している必要はない。連結は好都合な制限部位におけるライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合には、従来の実践に従って合成のオリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが使用される。
【0063】
「保存的に修飾されたバリアント」はアミノ酸および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関しては、保存的に修飾されたバリアントは同一もしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指し、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には本質的に同一の配列を指す。遺伝暗号の縮重が原因で多数の機能的に同一の核酸があらゆる所与のタンパク質をコードする。例えばコドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは全てアミノ酸アラニンをコードする。従ってアラニンがコドンによって指定されている全ての位置において、コードされるポリペプチドを変えることなくそのコドンを記載されている対応するコドンのいずれかに変えることができる。そのような核酸の変化は「サイレント変化」であり、これは保存的に修飾された変化の１種である。ポリペプチドをコードする本明細書中の全ての核酸配列は核酸の全ての可能なサイレント変化も記述する。当業者であれば、核酸中の各コドン（通常はメチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常はトリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を修飾して機能的に同一の分子を得ることができることが分かるであろう。従ってポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変化は、発現産物に関しては各記述されている配列において暗示されているが実際のプローブ配列に関してはそうではない。
【0064】
「同一の」または「同一性」パーセントという用語は、２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈では、以下に記載されているデフォルトパラメータと共にＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを用いるか、手動アライメントおよび目視検査によって測定した場合に同じであるか、同じ指定された割合（すなわち、比較ウィンドウまたは指定された領域にわたって最大一致のために比較およびアライメントした場合に、指定された領域にわたって約６０％の同一性、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い同一性）のアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する２つ以上の配列または部分配列を指す。その際、そのような配列を「実質的に同一」であると言う。この定義は、試験配列の相補体を指したりそれに適用したりしてもよい。この定義は欠失および／または付加を有する配列ならびに置換を有する配列も含む。以下に記載するように、好ましいアルゴリズムはギャップなども考慮することができる。好ましくは、同一性は少なくとも約２５個のアミノ酸もしくはヌクレオチド長である領域にわたって、あるいはより好ましくは５０～１００個のアミノ酸もしくはヌクレオチド長である領域にわたって存在する。
【0065】
配列比較のために、典型的には１つの配列は試験配列と比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列をコンピュータに入力し、部分配列座標を指定し、かつ必要であれば配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。好ましくはデフォルトプログラムパラメータを使用することができ、あるいは他のパラメータを指定することができる。次いで配列比較アルゴリズムにより、プログラムパラメータに基づいて参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。
【0066】
本明細書で使用される「比較ウィンドウ」は、２０から参照配列の全長まで、通常は約２５～１００または５０～約１５０、より通常は約１００～約１５０からなる群から選択される連続位置の数のいずれか１つのセグメントの参照を含み、ここでは２つの配列を最適にアライメントした後に、配列を同じ数の連続位置の参照配列と比較することができる。比較のための配列のアライメント方法は当該技術分野でよく知られている。比較のために配列の最適なアライメントは、例えばＳｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータ化実装（ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、あるいは手動アライメントおよび目視検査（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学における現在のプロトコル）（Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９５年補遺）を参照）によって行うことができる。
【0067】
配列同一性パーセントおよび配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの好ましい例はＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらはＡｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２（１９７７）およびＡｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）にそれぞれ記載されている。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０を本明細書に記載されているパラメータと共に使用して本発明の核酸およびタンパク質の配列同一性パーセントを決定する。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアはアメリカ国立生物工学情報センターを通して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードとアライメントした場合にいくつかの正の値の閾値スコアＴに一致するかそれを満たすクエリー配列中の長さＷの短いワードを特定することにより最初に高スコア配列対（ＨＳＰ：ｈｉｇｈ ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐａｉｒ）を特定することを含む。Ｔを隣接ワード（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ ｗｏｒｄ）スコア閾値と呼ぶ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，上記）。これらの最初の隣接ワードのヒットはそれらを含むより長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するためのシードとして機能する。このワードのヒットは累積アライメントスコアを増加させることができる限り各配列に沿って両方向に拡張させる。累積スコアは、ヌクレオチド配列のためにパラメータＭ（一対の一致している残基のための報酬スコア；常に＞０）およびＮ（一致していない残基のためのペナルティスコア；常に＜０）を用いて計算する。アミノ酸配列の場合、スコア行列を使用して累積スコアを計算する。累積アライメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ低下した場合、１つ以上の負のスコアの残基アライメントの蓄積により累積スコアがゼロ以下になった場合、あるいはいずれか一方の配列の終端に達した場合に、各方向へのワードヒットの拡張を停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸはアライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列のため）はデフォルトとして、１１のワード長さ（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝－４および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムはデフォルトとして、３のワード長さおよび１０の期待値（Ｅ）ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９）を参照）の５０のアライメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝－４および両鎖の比較を使用する。
【0068】
「核酸」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよび単鎖もしくは二本鎖の形態のそれらのポリマーならびにその補体を指す。その用語は、合成、天然および非天然の公知のヌクレオチド類似体あるいは修飾された骨格残基または結合を含む核酸を包含し、これらは参照核酸と同様の結合特性を有し、かつ参照ヌクレオチドと同様の方法で代謝される。そのような類似体の例としては、限定されるものではないが、ホスホロチオエート、ホスホロアミダイト、メチルホスホネート、キラル－メチルホスホネート、２－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、ペプチド－核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。
【0069】
特に記載がない限り、特定の核酸配列はその保存的に修飾されたバリアント（例えば縮重コドン置換）および相補的配列ならびに明示的に示されている配列も暗黙的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は１つ以上の選択された（または全ての）コドンの第３の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を作製することにより達成してもよい（Ｂａｔｚｅｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５－２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１－９８（１９９４））。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドと同義で使用される。
【0070】
特定の核酸配列は「スプライスバリアント」も暗黙的に包含する。同様に、核酸によってコードされる特定のタンパク質は核酸のスプライスバリアントによってコードされるあらゆるタンパク質を暗黙的に包含する。「スプライスバリアント」はその名前が示唆するように遺伝子の選択的スプライシングの産物である。転写後に、異なる（他の）核酸が異なるポリペプチドをコードする産物をスプライスするように、最初の核酸転写物をスプライスしてもよい。スプライスバリアントの産生の機序は様々であるが、エクソンの選択的スプライシングが挙げられる。読み過し転写による同じ核酸に由来する代替のポリペプチドもこの定義によって包含される。スプライス産物の組換え型を含むスプライシング反応のあらゆる産物がこの定義に含まれる。カリウムチャネルスプライスバリアントの例は、Ｌｅｉｃｈｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（５２）：３５０９５－３５１０１（１９９８）において考察されている。
【0071】
「異種」という用語は、核酸の一部を参照して使用される場合、核酸が本質的に互いに対して同じ関係で見い出されない２つ以上の部分配列を含むことを示す。例えば核酸は典型的には、新しい機能性核酸（例えば１つの供給源からのプロモーターおよび別の供給源からのコード領域）を作るように配置された無関係の遺伝子からの２つ以上の配列を有して組換えで産生される。同様に異種タンパク質は、タンパク質が本質的に互いに対して同じ関係で見い出されない２つ以上の部分配列を含むことを示す（例えば融合タンパク質）。
【0072】
「癌」は、限定されるものではないが、固形腫瘍、肛門、腎臓、乳房、心臓、頸部、卵巣、原発性腹膜、結腸直腸、肺、子宮、子宮内膜、食道、眼、卵管、胆嚢、胃、精巣、腎臓、膀胱、胆管、骨、黒色腫、カポジ肉腫、尿路、尿道、陰茎、外陰、膣、頸部、副甲状腺、陰茎、下垂体、結腸、喉、甲状腺、卵巣、前立腺、中皮腫、膵臓、直腸、胃、脳、頭頸部、小腸、皮膚、子宮、精巣、食道および肝臓の癌などのヒトの癌および癌腫、肉腫、腺癌などを指す。癌はバーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、有毛細胞白血病および急性骨髄性白血病などのリンパ腫および白血病も含むことができる。肺癌は小細胞肺癌および非小細胞肺癌を含むことができる。
【0073】
上記実施形態のいずれかにおいて、１つ以上の癌療法、例えば化学療法、放射線療法、免疫療法、外科手術またはホルモン療法を本発明の抗体と共に同時投与することができる。
【0074】
一実施形態では、化学療法剤はアルキル化剤、すなわちナイトロジェンマスタード、ニトロソ尿素、テトラジン、アジリジン、シスプラチンおよび誘導体ならびに非古典的アルキル化剤である。ナイトロジェンマスタードとしては、メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、イホスファミドおよびブスルファンが挙げられる。ニトロソ尿素としては、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－メチル尿素（ＭＮＵ）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）およびセムスチン（ＭｅＣＣＮＵ）、フォテムスチンおよびストレプトゾシンが挙げられる。テトラジンとしては、ダカルバジン、ミトゾロミドおよびテモゾロミドが挙げられる。アジリジンとしては、チオテパ、マイトマイシンおよびジアジコン（ＡＺＱ）が挙げられる。シスプラチンおよび誘導体としては、シスプラチン、カルボプラチンおよびオキサリプラチンが挙げられる。一実施形態では、化学療法剤は代謝拮抗剤、すなわち抗葉酸剤（例えばメトトレキサート）、フルオロピリミジン（例えばフルオロウラシルおよびカペシタビン）、デオキシヌクレオシド類似体およびチオプリンである。別の実施形態では、化学療法剤はビンカアルカロイド（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）ならびにタキサン（例えばパクリタキセルおよびドセタキセル）などの微小管阻害薬である。別の実施形態では、化学療法剤はドキソルビシン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、アクチノマイシンおよびマイトマイシンなどのトポイソメラーゼ阻害剤または抗悪性腫瘍性抗生物質である。
【0075】
患者に本抗体または抗体断片を接触させることは、本抗体を患者に静脈内、腹膜内、筋肉内、腫瘍内または皮内投与することによって行うことができる。いくつかの実施形態では本抗体を癌治療薬と同時投与する。
【0076】
本明細書で使用される「再折り畳み」という用語は、タンパク質構造がその機能的形状すなわち立体構造をとるプロセスを指す。それはポリペプチドが折り重なってランダムコイルからその特徴的かつ機能的３次元構造になる物理的プロセスである。それは塩基性ｐＨ（典型的にはｐＨ８．０～１０．０、ｐＨ８．５～１０またはｐＨ８．５～９．６）、低い温度（典型的には０．０℃～１０．０℃または２．０℃～８．０℃）で、好ましくは好適な濃度の酸化還元対の存在および／または酸素の存在、および／または好適な濃度の銅イオンなどの触媒の存在により生じる。
【0077】
本明細書で使用される「組換え体」という用語は、哺乳類発現系、昆虫細胞発現系、酵母発現系および細菌発現系から選択される生物学的宿主により産生されるポリペプチドを指す。
【0078】
本明細書で使用される「製剤」という用語は、投与することができ、対応する受容体に結合し、かつ所望の活性を生じさせるシグナル伝達経路を開始するための能力を有する互いに組み合わせられた本明細書に開示されている抗体および賦形剤を指す。本製剤は任意に他の薬剤を含むことができる。
【0079】
本明細書は対象に投与するための医薬組成物も提供する。本明細書に開示されている医薬組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈液もさらに含んでいてもよい。本明細書で使用される「薬学的に許容される」という用語は、本組成物が有害な副作用を生じることなく治療効果を達成するのに十分であり、かつ疾患の種類、患者の年齢、体重、健康状態、性別、および薬物感受性、投与経路、投与様式、投与頻度、治療持続期間、本明細書に開示されている組成物と併用または同時使用される薬物ならびに医学において公知の他の因子に応じて容易に決定できることを意味する。
【0080】
本明細書に開示されている抗体を含む医薬組成物は薬学的に許容される担体をさらに含んでいてもよい。経口投与のための担体としては、限定されるものではないが、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、着色料および着香料が挙げられる。注射可能な製剤のための担体としては、緩衝剤、保存料、鎮痛薬、可溶化剤、等張剤および安定化剤が挙げられる。局所投与用製剤のための担体としては基剤、賦形剤、滑沢剤および保存料が挙げられる。
【0081】
開示されている組成物は、上記薬学的に許容される担体と組み合わせて様々な剤形に製剤化されていてもよい。例えば経口投与のために、本医薬組成物は錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップまたはカシェ剤に製剤化されていてもよい。注射可能な製剤のために、本医薬組成物は単回投与剤形としてアンプルに、あるいは複数回投与容器の中に製剤化されていてもよい。また本医薬組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセルおよび長時間作用性製剤に製剤化されていてもよい。
【0082】
他方で、本医薬製剤のために適した担体、賦形剤および希釈液の例としては、限定されるものではないが、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱油が挙げられる。さらに本医薬製剤は、充填剤、抗凝固剤、滑沢剤、湿潤剤、着香料および消毒薬をさらに含んでいてもよい。
【0083】
さらに本明細書に開示されている医薬組成物は、錠剤、丸剤、粉末、顆粒、カプセル、懸濁液、内服のための液体、乳濁液、シロップ、無菌水溶液、非水性溶媒、凍結乾燥製剤および坐薬からなる群から選択されるあらゆる製剤を有していてもよい。
【0084】
本組成物は患者の体に適した単回投与剤形に製剤化されていてもよく、好ましくは限定されるものではないが、皮膚、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、心室内、肺内、経皮、皮下、腹膜内、鼻腔内、結腸内、局所、舌下、膣内または直腸内投与などによる経口もしくは非経口経路によって投与されるように、製薬分野における典型的な方法に従ってペプチド薬物にとって有用な製剤に製剤化されている。
【0085】
本組成物は生理食塩水または有機溶媒などの様々な薬学的に許容される担体と混合することにより使用してもよい。安定性または吸収率を高めるために、グルコース、スクロースまたはデキストランなどの炭水化物、アスコルビン酸またはグルタチオンなどの抗酸化剤、キレート剤、低分子量タンパク質または他の安定化剤を使用してもよい。
【0086】
本明細書に開示されている医薬組成物の投与用量および頻度は、治療される疾患、投与経路、患者の年齢、性別および体重ならびに疾患重症度などの各種因子と共に有効成分の種類によって決定される。
【0087】
本明細書に開示されている組成物の総有効用量は単回投与で患者に投与してもよく、あるいは分割治療プロトコルに従って長期間にわたって複数回投与で投与してもよい。本明細書に開示されている医薬組成物では、有効成分の含有量は疾患重症度によって異なってもよい。好ましくは、本明細書に開示されているペプチドの総１日用量は患者の体重の１ｋｇ当たりおよそ０．０００１μｇ～５００ｍｇであってもよい。但し、本ペプチドの有効用量は本医薬組成物の投与経路および治療頻度に加えて患者の年齢、体重、健康状態、性別、疾患重症度、食事および分泌率などの各種因子を考慮して決定される。これを考慮すれば、当業者は本明細書に開示されている医薬組成物の特定の使用に適した有効用量を容易に決定することができる。本明細書に開示されている医薬組成物はそれが好適な効果を示す限り、特に製剤および投与経路および投与様式において限定されない。
【0088】
さらに本医薬組成物は単独で投与してもよく、あるいは予防もしくは治療効果を示す他の医薬製剤と併用または同時投与してもよい。
【0089】
さらに別の態様では、本明細書は、キメラタンパク質またはそれを含む本医薬組成物を対象に投与する工程を含む、癌、感染性疾患または神経変性疾患を予防または治療するための方法を提供する。
【0090】
本明細書で使用される「予防」という用語は、当該疾患の発生を抑制または遅延させる全ての行為を意味する。
【0091】
本明細書で使用される「治療」という用語」は、それにより当該疾患の症状が軽減、改善または寛解されたことのある全ての行為を意味する。本明細書における「治療」は、癌、神経変性疾患または感染症の症状が本明細書に開示されている抗体の投与によって軽減、改善または寛解されることを意味する。
【0092】
本明細書で使用される「投与」という用語は、特定の好適な方法による所定の量の物質の患者の体内への導入を意味する。本明細書に開示されている組成物はそれが所望の組織に到達することができる限り、一般的な経路、例えば限定されるものではないが、腹膜内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、経口、局所、鼻腔内、肺内または直腸内投与のいずれかにより投与することができる。但しペプチドは経口投与すると消化されるため、経口投与のための組成物の有効成分は胃の中での分解に対して保護されるようにコーティングまたは製剤化されていなければならない。
【0093】
本明細書における「対象」という用語は、癌、神経変性疾患または感染症を有していると疑われるかそうであると診断されたものである。但し、本明細書に開示されている医薬組成物で治療されるあらゆる対象が限定されることなく含まれる。本明細書に開示されている抗ＣＬＤＮ１８．２抗体を含む医薬組成物は、癌、神経変性疾患または感染症を有していると疑われる対象に投与される。
【0094】
本明細書の治療方法は、本抗体を含む組成物を薬学的に有効な量で投与する工程を含んでもよい。総１日用量は医師による適切な医学的判断により決定し、かつ１回または数回投与すべきである。任意の特定の患者のための具体的な治療的に有効な用量レベルは、達成される応答の種類および程度、他の薬剤がそれと共に使用されるか否かに従う具体的な組成、患者の年齢、体重、健康条件、性別および食事、投与の時間および経路、本組成物の分泌率、治療法の期間、本明細書に開示されている組成物と併用または同時使用される他の薬物ならびに医学分野で周知の同様の因子などの医学分野において周知の各種因子よって異なってもよい。
【0095】
さらに別の態様では、本明細書は、癌、神経変性疾患または感染症の予防または治療のための薬物の調製における本治療用タンパク質またはそれを含む医薬組成物の使用を提供する。
【0096】
一実施形態では、本組成物の用量は毎日、週２回、週１回、隔週または月１回で投与してもよい。治療の期間は１週間、２週間、１ヶ月、２ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、８ヶ月、１年またはそれ以上の長さであってもよい。最初の用量は維持用量よりも多くてもよい。一実施形態では、当該用量は少なくとも０．０１ｍｇ、少なくとも０．２５ｍｇ、少なくとも０．３ｍｇ、少なくとも０．５ｍｇ、少なくとも０．７５ｍｇ、少なくとも１ｍｇ、少なくとも１．２５ｍｇ、少なくとも１．５ｍｇ、少なくとも２ｍｇ、少なくとも２．５ｍｇ、少なくとも３ｍｇ、少なくとも４ｍｇ、少なくとも５ｍｇ、少なくとも６ｍｇ、少なくとも７ｍｇ、少なくとも８ｍｇ、少なくとも９ｍｇ、少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも２０ｍｇ、少なくとも２５ｍｇ、少なくとも３０ｍｇ、少なくとも３５ｍｇ、少なくとも４０ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、少なくとも５５ｍｇ、少なくとも６０ｍｇ、少なくとも６５ｍｇまたは少なくとも７０ｍｇの週用量である。一実施形態では、週用量は最大で０．５ｍｇ、最大で０．７５ｍｇ、最大で１ｍｇ、最大で１．２５ｍｇ、最大で１．５ｍｇ、最大で２ｍｇ、最大で２．５ｍｇ、最大で３ｍｇ、最大で４ｍｇ、最大で５ｍｇ、最大で６ｍｇ、最大で７ｍｇ、最大で８ｍｇ、最大で９ｍｇ、最大で１０ｍｇ、最大で１５ｍｇ、最大で２０ｍｇ、最大で２５ｍｇ、最大で３０ｍｇ、最大で３５ｍｇ、最大で４０ｍｇ、最大で５０ｍｇ、最大で５５ｍｇ、最大で６０ｍｇ、最大で６５ｍｇまたは最大で７０ｍｇであってもよい。特定の態様では、週用量は０．２５ｍｇ～２．０ｍｇ、０．５ｍｇ～１．７５ｍｇの範囲であってもよい。他の態様では、週用量は１０ｍｇ～７０ｍｇの範囲であってもよい。
【0097】
本実施形態の他の態様では、本明細書における抗体は、癌の重症度を例えば少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％低下させる。本実施形態のさらに他の態様では、本明細書における抗体は、癌の重症度を例えば約５％～約１００％、約１０％～約１００％、約２０％～約１００％、約３０％～約１００％、約４０％～約１００％、約５０％～約１００％、約６０％～約１００％、約７０％～約１００％、約８０％～約１００％、約１０％～約９０％、約２０％～約９０％、約３０％～約９０％、約４０％～約９０％、約５０％～約９０％、約６０％～約９０％、約７０％～約９０％、約１０％～約８０％、約２０％～約８０％、約３０％～約８０％、約４０％～約８０％、約５０％～約８０％、約６０％～約８０％、約１０％～約７０％、約２０％～約７０％、約３０％～約７０％、約４０％～約７０％または約５０％～約７０％低下させる。
【0098】
本明細書に開示されている抗体は、ヒト、ネコ、イヌ、ウマ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタまたは他の動物などのヒトもしくは非ヒト哺乳類への通例の投与を可能にするのに十分な量で治療用化合物を含んでいてもよい。
【0099】
本明細書の態様は部分的に、癌などの疾患に罹患しているヒトもしくは非ヒト哺乳類の個体を治療することを開示している。本明細書で使用される「治療する」という用語は、ヒトもしくは非ヒト哺乳類において癌の臨床的症状を減少または排除すること、あるいはヒトもしくは非ヒト哺乳類において癌の臨床的症状の発症を遅延または防止することを指す。例えば「治療する」という用語は、癌によって特徴づけられる病気の症状を減少させること、限定されるものではないが、当該疾患の重症度の例えば少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％の減少を意味することができる。癌に関連する実際の症状はよく知られており、限定されるものではないが、当該疾患の位置、当該疾患の原因、当該疾患の重症度および／または当該疾患によって冒されている組織もしくは臓器などの因子を考慮に入れることにより当業者によって決定することができる。当業者であれば特定の種類の疾患に関連する適当な症状または指標を知っており、個体が本明細書に開示されている治療の候補であるかを決定する方法を知っているであろう。
【0100】
本実施形態の態様では、本明細書における本発明の抗体の治療的有効量は、癌の重症度を例えば少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％低下させる。本実施形態の他の態様では、本明細書における本発明の抗体の治療的有効量は、癌の重症度を例えば最大で１０％、最大で１５％、最大で２０％、最大で２５％、最大で３０％、最大で３５％、最大で４０％、最大で４５％、最大で５０％、最大で５５％、最大で６０％、最大で６５％、最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％、最大で９５％または最大で１００％低下させる。本実施形態のさらに他の態様では、本明細書における本発明の抗体の治療的有効量は、癌の重症度を例えば約１０％～約１００％、約１０％～約９０％、約１０％～約８０％、約１０％～約７０％、約１０％～約６０％、約１０％～約５０％、約１０％～約４０％、約２０％～約１００％、約２０％～約９０％、約２０％～約８０％、約２０％～約２０％、約２０％～約６０％、約２０％～約５０％、約２０％～約４０％、約３０％～約１００％、約３０％～約９０％、約３０％～約８０％、約３０％～約７０％、約３０％～約６０％または約３０％～約５０％低下させる。
【0101】
本実施形態のさらに他の態様では、本明細書に開示されている抗体は一般に、約０．００１ｍｇ／ｋｇ／日～約１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にある。本実施形態の態様では、本明細書に開示されている治療用化合物の有効量は、例えば少なくとも０．００１ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも０．１ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも１．０ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも５．０ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも１５ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも２０ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも２５ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも３０ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも３５ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも４０ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも４５ｍｇ／ｋｇ／日または少なくとも５０ｍｇ／ｋｇ／日であってもよい。本実施形態の他の態様では、本明細書に開示されている抗体の有効量は、例えば約０．００１ｍｇ／ｋｇ／日～約１０ｍｇ／ｋｇ／日、約０．００１ｍｇ／ｋｇ／日～約１５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．００１ｍｇ／ｋｇ／日～約２０ｍｇ／ｋｇ／日、約０．００１ｍｇ／ｋｇ／日～約２５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．００１ｍｇ／ｋｇ／日～約３０ｍｇ／ｋｇ／日、約０．００１ｍｇ／ｋｇ／日～約３５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．００１ｍｇ／ｋｇ／日～約４０ｍｇ／ｋｇ／日、約０．００１ｍｇ／ｋｇ／日～約４５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．００１ｍｇ／ｋｇ／日～約５０ｍｇ／ｋｇ／日、約０．００１ｍｇ／ｋｇ／日～約７５ｍｇ／ｋｇ／日または約０．００１ｍｇ／ｋｇ／日～約１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であってもよい。本実施形態のさらに他の態様では、本明細書に開示されている治療用化合物の有効量は、例えば約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日～約１０ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日～約１５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日～約２０ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日～約２５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日～約３０ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日～約３５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日～約４０ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日～約４５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日～約５０ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日～約７５ｍｇ／ｋｇ／日または約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日～約１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であってもよい。本実施形態のさらに他の態様では、本明細書に開示されている抗体は、例えば約０．１ｍｇ／ｋｇ／日～約１０ｍｇ／ｋｇ／日、約０．１ｍｇ／ｋｇ／日～約１５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．１ｍｇ／ｋｇ／日～約２０ｍｇ／ｋｇ／日、約０．１ｍｇ／ｋｇ／日～約２５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．１ｍｇ／ｋｇ／日～約３０ｍｇ／ｋｇ／日、約０．１ｍｇ／ｋｇ／日～約３５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．１ｍｇ／ｋｇ／日～約４０ｍｇ／ｋｇ／日、約０．１ｍｇ／ｋｇ／日～約４５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．１ｍｇ／ｋｇ／日～約５０ｍｇ／ｋｇ／日、約０．１ｍｇ／ｋｇ／日～約７５ｍｇ／ｋｇ／日または約０．１ｍｇ／ｋｇ／日～約１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であってもよい。
【0102】
本実施形態の他の態様では、本明細書に開示されている抗体の有効量は、例えば約１ｍｇ／ｋｇ／日～約１０ｍｇ／ｋｇ／日、約１ｍｇ／ｋｇ／日～約１５ｍｇ／ｋｇ／日、約１ｍｇ／ｋｇ／日～約２０ｍｇ／ｋｇ／日、約１ｍｇ／ｋｇ／日～約２５ｍｇ／ｋｇ／日、約１ｍｇ／ｋｇ／日～約３０ｍｇ／ｋｇ／日、約１ｍｇ／ｋｇ／日～約３５ｍｇ／ｋｇ／日、約１ｍｇ／ｋｇ／日～約４０ｍｇ／ｋｇ／日、約１ｍｇ／ｋｇ／日～約４５ｍｇ／ｋｇ／日、約１ｍｇ／ｋｇ／日～約５０ｍｇ／ｋｇ／日、約１ｍｇ／ｋｇ／日～約７５ｍｇ／ｋｇ／日または約１ｍｇ／ｋｇ／日～約１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であってもよい。本実施形態のさらに他の態様では、本明細書に開示されている抗体の有効量は、例えば約５ｍｇ／ｋｇ／日～約１０ｍｇ／ｋｇ／日、約５ｍｇ／ｋｇ／日～約１５ｍｇ／ｋｇ／日、約５ｍｇ／ｋｇ／日～約２０ｍｇ／ｋｇ／日、約５ｍｇ／ｋｇ／日～約２５ｍｇ／ｋｇ／日、約５ｍｇ／ｋｇ／日～約３０ｍｇ／ｋｇ／日、約５ｍｇ／ｋｇ／日～約３５ｍｇ／ｋｇ／日、約５ｍｇ／ｋｇ／日～約４０ｍｇ／ｋｇ／日、約５ｍｇ／ｋｇ／日～約４５ｍｇ／ｋｇ／日、約５ｍｇ／ｋｇ／日～約５０ｍｇ／ｋｇ／日、約５ｍｇ／ｋｇ／日～約７５ｍｇ／ｋｇ／日または約５ｍｇ／ｋｇ／日～約１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であってもよい。
【0103】
液体および半固体製剤では、本明細書に開示されている抗体の濃度は典型的には約５０ｍｇ／ｍＬ～約１，０００ｍｇ／ｍＬであってもよい。本実施形態の態様では、本明細書に開示されている抗体の治療的有効量は、例えば約５０ｍｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ～約２００ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ～約３００ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ～約４００ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ～約５００ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ～約６００ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ～約７００ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ～約８００ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ～約９００ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ～約１，０００ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ～約２００ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ～約３００ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ～約４００ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ～約５００ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ～約６００ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ～約７００ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ～約８００ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ～約９００ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ～約１，０００ｍｇ／ｍＬ、約２００ｍｇ／ｍＬ～約３００ｍｇ／ｍＬ、約２００ｍｇ／ｍＬ～約４００ｍｇ／ｍＬ、約２００ｍｇ／ｍＬ～約５００ｍｇ／ｍＬ、約２００ｍｇ／ｍＬ～約６００ｍｇ／ｍＬ、約２００ｍｇ／ｍＬ～約７００ｍｇ／ｍＬ、約２００ｍｇ／ｍＬ～約８００ｍｇ／ｍＬ、約２００ｍｇ／ｍＬ～約９００ｍｇ／ｍＬ、約２００ｍｇ／ｍＬ～約１，０００ｍｇ／ｍＬ、約３００ｍｇ／ｍＬ～約４００ｍｇ／ｍＬ、約３００ｍｇ／ｍＬ～約５００ｍｇ／ｍＬ、約３００ｍｇ／ｍＬ～約６００ｍｇ／ｍＬ、約３００ｍｇ／ｍＬ～約７００ｍｇ／ｍＬ、約３００ｍｇ／ｍＬ～約８００ｍｇ／ｍＬ、約３００ｍｇ／ｍＬ～約９００ｍｇ／ｍＬ、約３００ｍｇ／ｍＬ～約１，０００ｍｇ／ｍＬ、約４００ｍｇ／ｍＬ～約５００ｍｇ／ｍＬ、約４００ｍｇ／ｍＬ～約６００ｍｇ／ｍＬ、約４００ｍｇ／ｍＬ～約７００ｍｇ／ｍＬ、約４００ｍｇ／ｍＬ～約８００ｍｇ／ｍＬ、約４００ｍｇ／ｍＬ～約９００ｍｇ／ｍＬ、約４００ｍｇ／ｍＬ～約１，０００ｍｇ／ｍＬ、約５００ｍｇ／ｍＬ～約６００ｍｇ／ｍＬ、約５００ｍｇ／ｍＬ～約７００ｍｇ／ｍＬ、約５００ｍｇ／ｍＬ～約８００ｍｇ／ｍＬ、約５００ｍｇ／ｍＬ～約９００ｍｇ／ｍＬ、約５００ｍｇ／ｍＬ～約１，０００ｍｇ／ｍＬ、約６００ｍｇ／ｍＬ～約７００ｍｇ／ｍＬ、約６００ｍｇ／ｍＬ～約８００ｍｇ／ｍＬ、約６００ｍｇ／ｍＬ～約９００ｍｇ／ｍＬまたは約６００ｍｇ／ｍＬ～約１，０００ｍｇ／ｍＬであってもよい。
【0104】
投与は単回投与または累積（連続投与）であってもよく、当業者によって容易に決定することができる。例えば癌の治療は、本明細書に開示されている治療用化合物または医薬組成物の有効用量の１回投与を含んでもよい。あるいは癌の治療は、例えば１日１回、１日２回、１日３回、数日に１回または週１回などのある範囲の期間にわたって行われる医薬組成物の有効用量の複数回投与を含んでもよい。投与のタイミングは個体の症状の重症度などの因子によって個体間で異なってもよい。例えば、本明細書に開示されている抗体の有効用量は不確定期間にわたって、あるいは個体がもはや治療法を必要としなくなるまで個体に１日１回投与することができる。当業者であれば治療過程にわたって個体の状態を監視することができること、および投与される本明細書に開示されている抗体の有効量をそれに応じて調整することができることを理解しているであろう。
【0105】
一実施形態では、本明細書に開示されている抗体は、癌に罹患している個体における癌細胞の数または腫瘍サイズを同じ治療を受けていない患者と比較して例えば少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％減少させることができる。本実施形態の他の態様では、抗体は、癌に罹患している個体において癌細胞の数または腫瘍サイズを同じ治療を受けていない患者と比較して例えば約１０％～約１００％、約２０％～約１００％、約３０％～約１００％、約４０％～約１００％、約５０％～約１００％、約６０％～約１００％、約７０％～約１００％、約８０％～約１００％、約１０％～約９０％、約２０％～約９０％、約３０％～約９０％、約４０％～約９０％、約５０％～約９０％、約６０％～約９０％、約７０％～約９０％、約１０％～約８０％、約２０％～約８０％、約３０％～約８０％、約４０％～約８０％、約５０％～約８０％または約６０％～約８０％、約１０％～約７０％、約２０％～約７０％、約３０％～約７０％、約４０％～約７０％または約５０％～約７０％減少させることができる。
【0106】
さらなる実施形態では、抗体およびその誘導体は２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月またはそれ以上の半減期を有する。
【0107】
一実施形態では、抗体の投与期間は１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月またはそれ以上である。さらなる実施形態では、投与を停止する期間は１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月またはそれ以上である。
【0108】
本実施形態の態様では、本明細書に開示されている抗体は個体における癌細胞集団および／または腫瘍細胞サイズを例えば少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％減少または維持する。本実施形態の他の態様では、本明細書に開示されている抗体は個体における疾患または癌細胞集団および／または腫瘍細胞サイズを例えば最大で１０％、最大で１５％、最大で２０％、最大で２５％、最大で３０％、最大で３５％、最大で４０％、最大で４５％、最大で５０％、最大で５５％、最大で６０％、最大で６５％、最大で７０％、最大で７５％、最大で８０％、最大で８５％、最大で９０％、最大で９５％または最大で１００％減少または維持する。本実施形態のさらに他の態様では、本明細書に開示されている抗体は個体における癌細胞集団および／または腫瘍細胞サイズを例えば約１０％～約１００％、約１０％～約９０％、約１０％～約８０％、約１０％～約７０％、約１０％～約６０％、約１０％～約５０％、約１０％～約４０％、約２０％～約１００％、約２０％～約９０％、約２０％～約８０％、約２０％～約２０％、約２０％～約６０％、約２０％～約５０％、約２０％～約４０％、約３０％～約１００％、約３０％～約９０％、約３０％～約８０％、約３０％～約７０％、約３０％～約６０％または約３０％～約５０％減少または維持する。
【0109】
典型的には治療の候補である任意の個体は、いくつかの形態の癌（癌が良性であるか悪性あるかを問わない）、腫瘍（固体またはそれ以外）、腫瘍またはいくつかの他の形態の癌に位置しない癌細胞を有する候補である。術前評価は典型的には、当該処置の全ての関連するリスクおよび利点を開示する徹底的なインフォームドコンセントに加えて日常的な病歴および身体検査を含む。
【実施例】
【0110】
以下の非限定的な実施例は、現在企図されている代表的な実施形態のより完全な理解を容易にするために例示のみを目的として提供されている。これらの実施例は単なる例示のためのものであって本発明の範囲の限定するものではない。
【0111】
従って、これらの実施例は本明細書に記載されている実施形態を決して限定するように解釈されるべきではない。
【0112】
ＣＬＤ１８．２に対するウサギ抗体の作製
実施例１：ＣＬＤＮ１８．１およびＣＬＤＮ１８．２の発現および精製
ＣＬＤＮ１８．２および１８．１をＰｅｔ２８ベクター（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ社）を用いて大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３において過剰発現させた。２５ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）中の細胞溶解物を２０００×ｇで２０分間遠心分離した。上澄みを１００，０００×ｇで１時間の超遠心分離によってさらに分離して膜粒子を得た。溶解物緩衝液中に１％のｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトピラノシド（ＤＤＭ）を使用して膜を４℃で一晩可溶化した。非可溶化膜を１００，０００×ｇで１時間の超遠心分離により除去した。上澄みを１５ｍＭのイミダゾールの存在下でＨｉｓＰｕｒ Ｃｏｂａｌｔ樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）カラムに充填した。そのカラムを０．１％ＤＤＭ、ＰＢＳ中に１５ｍＭのイミダゾールで洗浄した。クローディンタンパク質を０．０５％ＤＤＭ、０．００２％ヘミコハク酸コレステリルトリス塩（ＣＨＳ）、２００ｍＭのイミダゾールを含むＰＢＳを用いて溶出した。精製したタンパク質は短期間での使用のために２～８℃またはより長い期間の貯蔵のために－８０℃で保存した。
実施例１：ＣＬＤＮ１８．１およびＣＬＤＮ１８．２の発現および精製
ＣＬＤＮ１８．２および１８．１をＰｅｔ２８ベクター（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ社）を用いて大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３において過剰発現させた。２５ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）中の細胞溶解物を２０００×ｇで２０分間遠心分離した。上澄みを１００，０００×ｇで１時間の超遠心分離によってさらに分離して膜粒子を得た。溶解物緩衝液中に１％のｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトピラノシド（ＤＤＭ）を使用して膜を４℃で一晩可溶化した。非可溶化膜を１００，０００×ｇで１時間の超遠心分離により除去した。上澄みを１５ｍＭのイミダゾールの存在下でＨｉｓＰｕｒ Ｃｏｂａｌｔ樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）カラムに充填した。そのカラムを０．１％ＤＤＭ、ＰＢＳ中に１５ｍＭのイミダゾールで洗浄した。クローディンタンパク質を０．０５％ＤＤＭ、０．００２％ヘミコハク酸コレステリルトリス塩（ＣＨＳ）、２００ｍＭのイミダゾールを含むＰＢＳを用いて溶出した。精製したタンパク質は短期間での使用のために２～８℃またはより長い期間の貯蔵のために－８０℃で保存した。
【0113】
実施例２：免疫化
ニュージーランド白ウサギをヒトＣＬＤ１８．２をコードする真核生物発現ベクターまたはその断片で免疫した。ウサギ血清中のヒトＣＬＤ１８．２に対する抗体の存在をＦＡＣＳ分析によって監視した。ヒトＣＬＤ１８．２を含む構築物をコードする核酸で一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を用いて免疫蛍光を決定した。精製したＣＬＤＮ１８．２タンパク質および／または代わりとしてヒトＣＬＤ１８．２をコードする核酸で一過性にトランスフェクトした１×１０８個のＨＥＫ２９３細胞の腹膜内注射により、検出可能な免疫応答を有するウサギを追加免疫した。
ニュージーランド白ウサギをヒトＣＬＤ１８．２をコードする真核生物発現ベクターまたはその断片で免疫した。ウサギ血清中のヒトＣＬＤ１８．２に対する抗体の存在をＦＡＣＳ分析によって監視した。ヒトＣＬＤ１８．２を含む構築物をコードする核酸で一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を用いて免疫蛍光を決定した。精製したＣＬＤＮ１８．２タンパク質および／または代わりとしてヒトＣＬＤ１８．２をコードする核酸で一過性にトランスフェクトした１×１０８個のＨＥＫ２９３細胞の腹膜内注射により、検出可能な免疫応答を有するウサギを追加免疫した。
【0114】
実施例３：Ｂ細胞のクローニング
完全培地は、ＲＰＭＩ１６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ｃａｔ．＃１１８７５－１１９）、１０％ウシ胎児血清（Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ社、ｃａｔ．＃０５００）、非必須アミノ酸（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ｃａｔ．＃１１１４０－０５０）、ピルビン酸ナトリウム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ｃａｔ．＃１１３６０－０７０）、２－メルカプトエタノール（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ｃａｔ．＃２１－９８５－０２３）およびゲンタマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ｃａｔ．＃１５７１０－０７２）を含む。１０ｎｇ／ｍＬのＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、ｃａｔ．＃Ｐ１５８５）および０．５％ＰＨＡ－ｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、ｃａｔ．＃１０５７６－０１５）を含む完全培地において、２×１０６／ｍＬのウサギ胸腺細胞（Ｓｐｒｉｎｇ Ｖａｌｌｅｙ Ｌａｂｓ、メリーランド州ウッドバイン）を２×１０６／ｍＬウサギ脾細胞（Ｓｐｒｉｎｇ Ｖａｌｌｅｙ Ｌａｂｓ、メリーランド州ウッドバイン）と共に４８時間培養した。上澄みを０．２ｕＭで濾過し、－２０℃で貯蔵した。
完全培地は、ＲＰＭＩ１６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ｃａｔ．＃１１８７５－１１９）、１０％ウシ胎児血清（Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ社、ｃａｔ．＃０５００）、非必須アミノ酸（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ｃａｔ．＃１１１４０－０５０）、ピルビン酸ナトリウム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ｃａｔ．＃１１３６０－０７０）、２－メルカプトエタノール（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ｃａｔ．＃２１－９８５－０２３）およびゲンタマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ｃａｔ．＃１５７１０－０７２）を含む。１０ｎｇ／ｍＬのＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、ｃａｔ．＃Ｐ１５８５）および０．５％ＰＨＡ－ｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、ｃａｔ．＃１０５７６－０１５）を含む完全培地において、２×１０６／ｍＬのウサギ胸腺細胞（Ｓｐｒｉｎｇ Ｖａｌｌｅｙ Ｌａｂｓ、メリーランド州ウッドバイン）を２×１０６／ｍＬウサギ脾細胞（Ｓｐｒｉｎｇ Ｖａｌｌｅｙ Ｌａｂｓ、メリーランド州ウッドバイン）と共に４８時間培養した。上澄みを０．２ｕＭで濾過し、－２０℃で貯蔵した。
【0115】
６０ｍｍのペトリ皿を３ｍＬのヒトＣＬＤＮ１８．２－ｈｉｓ（ＰＢＳ中に２ｕｇ／ｍＬ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。コーティング溶液を除去し、３ｍＬのＰＢＳ／５％ＢＳＡを添加して室温で１～２時間ブロッキングした。ブロッキング溶液を除去し、プレートをＰＢＳで４回洗浄した。免疫したウサギからの脾臓リンパ球の単細胞懸濁液をプレート中の３ｍＬのＰＢＳ／２．５％ＢＳＡに添加し、４℃で４５分間インキュベートした。次いでこの皿をＰＢＳ／ＢＳＡで５回洗浄して非接着細胞を除去し、次いで細胞スクレーパを用いるスクレイピングにより接着細胞を細胞完全培地の中に回収した。
【0116】
あるいは、脾臓リンパ球をＣＬＤＮ１８．１およびＣＬＤＮ１８．２タンパク質を用いてパニングした。Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のＥＺ－Ｌｉｎｋ（商標）ＮＨＳ－ＰＥＧ４ビオチン化キットを用いてこれらのクローディンタンパク質をビオチン化した。ネガティブパニングのために、免疫したウサギからの脾臓リンパ球の単細胞懸濁液をビオチン化ＣＬＤＮ１８．１を含有するＭＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／２ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁し、４℃で１５分間インキュベートした。細胞をＭＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ＭＡＣＳ緩衝液＋Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製ストレプトアビジンマイクロビーズに再懸濁した。１５分間のインキュベーション後に細胞を洗浄し、磁気カラム（ＬＳカラム、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）に通した。ポジティブ選択で使用するために未結合細胞を回収した。細胞をビオチン化したＣＬＤＮ１８．２を含有するＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、１５分間インキュベートした。細胞をＭＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ＭＡＣＳ緩衝液＋ストレプトアビジンマイクロビーズに再懸濁し、１５分間インキュベートした。細胞を１回洗浄し、次いで磁気カラム（ＭＳカラム、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）に通した。ポジティブ選択された結合細胞を溶出し、Ｂ細胞クローニングのために使用した。
【0117】
次いで、９６ウェル丸底プレートの中の２％ウサギ脾臓／胸腺順化培地、５～１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－２（Ｐｒｏｓｐｅｃ、ｃａｔ．＃ｃｙｔ－０９５）、１：２０，０００のＰａｎｓｏｒｂｉｎ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ｃａｔ．＃５０７８５８）、および５×１０４個のマイトマイシン－ｃ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、ｃａｔ．＃Ｍ４２８４）処理した（５０ｕｇ／ｍＬ、４５分間）ＥＬ４－Ｂ５細胞／ウェルを含む完全培地に細胞を１０～５０細胞／ウェルで播種した。プレートをＣＯ２インキュベータ中３７℃で７日間インキュベートし、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ分析のために上澄みを除去し、その後の抗体ｖ領域レスキューのために細胞を含むプレートを－８０℃で凍結させた。ＥＬＩＳＡベースのスクリーニングの例は図１に示されている。ＦＡＣＳベースのスクリーニングの例は図２に示されている。
【0118】
実施例４：一過性のトランスフェクション
ｖ領域レスキューの成功の確認は、キメラ抗体の重鎖および軽鎖をＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、かつＣＬＤＮ１８．２結合活性の回復についてその上澄みを試験することにより行った。ＨＥＫ２９３細胞を２４ウェル組織培養プレート中の１ｍＬの完全培地に１．５×１０５細胞／ウェルで播種して一晩培養した。トランスフェクションは製造業者の説明書に従ってリポフェクタミン３０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ｃａｔ．＃Ｌ３００００１５）と共に５００ｎｇの重鎖ＤＮＡおよび５００ｎｇの軽鎖ＤＮＡを用いて行った。３～５日後に上澄みを回収し、ＥＬＩＳＡによって結合活性についてアッセイした。
ｖ領域レスキューの成功の確認は、キメラ抗体の重鎖および軽鎖をＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、かつＣＬＤＮ１８．２結合活性の回復についてその上澄みを試験することにより行った。ＨＥＫ２９３細胞を２４ウェル組織培養プレート中の１ｍＬの完全培地に１．５×１０５細胞／ウェルで播種して一晩培養した。トランスフェクションは製造業者の説明書に従ってリポフェクタミン３０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ｃａｔ．＃Ｌ３００００１５）と共に５００ｎｇの重鎖ＤＮＡおよび５００ｎｇの軽鎖ＤＮＡを用いて行った。３～５日後に上澄みを回収し、ＥＬＩＳＡによって結合活性についてアッセイした。
【0119】
精製のために材料を作製するためのより大規模なトランスフェクションは、製造業者の説明書に従い、リポフェクタミン３０００を用いて５％極低（ｕｌｔｒａ－ｌｏｗ）ＩｇＧウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ｃａｔ．＃１６２５０－０７８）中で培養したＨＥＫ２９３細胞を用いて行った。
【0120】
実施例５：ＣＬＤＮ１８．２結合ＥＬＩＳＡ
Ｂ細胞クローニング上澄みをＥＬＩＳＡによってＣＬＤＮ１８．２への結合について試験した。ＥＬＩＳＡプレートを、１００ｕＬの抗原（ＰＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ｃａｔ．＃１４１９０－２５０）中に０．５もしくは１ｕｇ／ｍＬ）を用いて４℃で一晩または３７℃で１時間コーティングした。ＣＬＤＮ１８．２および１８．１の両方を大腸菌およびＳＦ９細胞中で発現させ、Ｓｕｚｕｋｉら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４４，３０４（２０１４））によって記載されている方法と同様の方法を用いて部分的に精製した。次いでプレートをＰＢＳ＋１０％ヤギ血清で１時間ブロッキングした。脱イオン水で洗浄した後、試料をＰＢＳ／１０％ヤギ血清に添加し、１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、かつ１００ｕＬのヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｆｃ－ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社、ｃａｔ．＃１１１－０３５－０４６）を１：５０００希釈でＰＢＳ／１０％ヤギ血清の中に１時間添加した。次いでプレートを脱イオン水で洗浄し、１００ｕＬのＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ｃａｔ．＃ＰＩ１３４０２１）を各ウェルに添加した。１００ｕＬの１Ｎ Ｈ２ＳＯ４で発色を停止し、マイクロプレート分光光度計を用いてＯＤ４５０を測定した。
Ｂ細胞クローニング上澄みをＥＬＩＳＡによってＣＬＤＮ１８．２への結合について試験した。ＥＬＩＳＡプレートを、１００ｕＬの抗原（ＰＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ｃａｔ．＃１４１９０－２５０）中に０．５もしくは１ｕｇ／ｍＬ）を用いて４℃で一晩または３７℃で１時間コーティングした。ＣＬＤＮ１８．２および１８．１の両方を大腸菌およびＳＦ９細胞中で発現させ、Ｓｕｚｕｋｉら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４４，３０４（２０１４））によって記載されている方法と同様の方法を用いて部分的に精製した。次いでプレートをＰＢＳ＋１０％ヤギ血清で１時間ブロッキングした。脱イオン水で洗浄した後、試料をＰＢＳ／１０％ヤギ血清に添加し、１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、かつ１００ｕＬのヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｆｃ－ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社、ｃａｔ．＃１１１－０３５－０４６）を１：５０００希釈でＰＢＳ／１０％ヤギ血清の中に１時間添加した。次いでプレートを脱イオン水で洗浄し、１００ｕＬのＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ｃａｔ．＃ＰＩ１３４０２１）を各ウェルに添加した。１００ｕＬの１Ｎ Ｈ２ＳＯ４で発色を停止し、マイクロプレート分光光度計を用いてＯＤ４５０を測定した。
【0121】
精製したキメラおよびヒト化抗体をＥＬＩＳＡによってＣＬＤＮ１８．２への結合について試験した。プロトコルはＢ細胞クローニング上澄みを試験する場合と同じであった。
【0122】
実施例６：ＦＡＣＳによって試験した場合のＣＬＤＮ１８．２結合
ＣＬＤＮ１８．１またはＣＬＤＮ１８．２を発現している安定なＨＥＫ２９３細胞株を培養した。細胞を非酵素的細胞解離溶液で剥離した。細胞を計数し、細胞密度をＦＡＣＳ洗浄緩衝液を用いておよそ３百万個の細胞／ｍｌになるように調整し、これはＰＢＳ中に３％ＦＢＳを含んでいた。５０ｕＬの細胞（１５００００個の細胞／ウェル）を９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。一次抗体または目的の抗体を発現している上澄みを事前に指定された濃度で細胞に添加した。プレートを氷の上で１時間インキュベートした。プレートをＦＡＣＳ洗浄緩衝液で３回洗浄した。蛍光結合された二次抗体をこれらの細胞に添加した（製造業者の説明書に応じた濃度）。プレートを氷の上で１時間インキュベートした。プレートを再度洗浄した。ＰＩ染色溶液を０．１ｕｇ／ｍＬで添加し、プレートを氷の上で１０分間インキュベートした。フローサイトメトリー機器を用いて細胞蛍光を測定した。
ＣＬＤＮ１８．１またはＣＬＤＮ１８．２を発現している安定なＨＥＫ２９３細胞株を培養した。細胞を非酵素的細胞解離溶液で剥離した。細胞を計数し、細胞密度をＦＡＣＳ洗浄緩衝液を用いておよそ３百万個の細胞／ｍｌになるように調整し、これはＰＢＳ中に３％ＦＢＳを含んでいた。５０ｕＬの細胞（１５００００個の細胞／ウェル）を９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。一次抗体または目的の抗体を発現している上澄みを事前に指定された濃度で細胞に添加した。プレートを氷の上で１時間インキュベートした。プレートをＦＡＣＳ洗浄緩衝液で３回洗浄した。蛍光結合された二次抗体をこれらの細胞に添加した（製造業者の説明書に応じた濃度）。プレートを氷の上で１時間インキュベートした。プレートを再度洗浄した。ＰＩ染色溶液を０．１ｕｇ／ｍＬで添加し、プレートを氷の上で１０分間インキュベートした。フローサイトメトリー機器を用いて細胞蛍光を測定した。
【0123】
実施例７：親和性の測定
親和性の測定は、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ ９６（ＦｏｒｔｅＢｉｏ社）機器を用いて３０℃で行った。簡単に言うと、抗ヒトＩｇＧ捕捉センサ（ＡＨＣ、ＦｏｒｔｅＢｉｏ社、ｃａｔ＃１８－５０６０）をアッセイ緩衝液（１０×Ｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｂｕｆｆｅｒ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ社、ｃａｔ＃１８－５０３２）の１×希釈物）で校正した。試験抗体試料を２μｇ／ｍＬまで希釈し、センサに５分間結合させた。次いでセンサをアッセイ緩衝液で３分間洗浄し、異なる濃度で希釈したＣＬＤＮ１８．２リガンドをセンサ表面にコーティングされたｍＡｂに５分間結合させた。その後にアッセイ緩衝液中で解離を１０分間行った。センサはグリシン緩衝液およびアッセイ緩衝液で３回洗浄することにより再生させることができた。得られたデータをＦｏｒｔｅＢｉｏソフトウェアを用いて１：１結合モデルでフィッティングした。親和性の測定の例は図３に示されている（本抗体と抗原ＣＬＤＮ１８．２との間の結合親和性の測定）。クローン５の例示的結合動態がここに示されている。選択したクローンの結合動態のパラメータは図３の表に示されている。
親和性の測定は、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ ９６（ＦｏｒｔｅＢｉｏ社）機器を用いて３０℃で行った。簡単に言うと、抗ヒトＩｇＧ捕捉センサ（ＡＨＣ、ＦｏｒｔｅＢｉｏ社、ｃａｔ＃１８－５０６０）をアッセイ緩衝液（１０×Ｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｂｕｆｆｅｒ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ社、ｃａｔ＃１８－５０３２）の１×希釈物）で校正した。試験抗体試料を２μｇ／ｍＬまで希釈し、センサに５分間結合させた。次いでセンサをアッセイ緩衝液で３分間洗浄し、異なる濃度で希釈したＣＬＤＮ１８．２リガンドをセンサ表面にコーティングされたｍＡｂに５分間結合させた。その後にアッセイ緩衝液中で解離を１０分間行った。センサはグリシン緩衝液およびアッセイ緩衝液で３回洗浄することにより再生させることができた。得られたデータをＦｏｒｔｅＢｉｏソフトウェアを用いて１：１結合モデルでフィッティングした。親和性の測定の例は図３に示されている（本抗体と抗原ＣＬＤＮ１８．２との間の結合親和性の測定）。クローン５の例示的結合動態がここに示されている。選択したクローンの結合動態のパラメータは図３の表に示されている。
【0124】
実施例８：抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）
以下に記載されているプロトコルに従ってＡＤＣＣレポーターアッセイを行った。
以下に記載されているプロトコルに従ってＡＤＣＣレポーターアッセイを行った。
【0125】
材料：
１．培養培地－ＲＰＭＩ１６４０、１０％ウシ胎児血清、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、５０ｕＭのβ－メルカプトエタノール、ペニシリン／ストレプトマイシン
２．アッセイ培地－低（ｌｏｗ）ＩｇＧウシ胎児血清を使用すること以外は培養培地と同じ
３．エフェクター細胞株－ＡＤＣＣバイオアッセイエフェクター細胞株Ｖバリアント（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社＃６０５４１）
４．標的細胞株－ＨＥＫ２９３／１８．２（標的抗原でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞）
５．標的細胞株－ＮＵＧＣ４（標的抗原を発現する胃癌細胞株）
６．Ｐｉｅｒｃｅ Ｆｉｒｅｆｌｙ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ Ｇｌｏｗアッセイキット＃１６１９６
１．培養培地－ＲＰＭＩ１６４０、１０％ウシ胎児血清、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、５０ｕＭのβ－メルカプトエタノール、ペニシリン／ストレプトマイシン
２．アッセイ培地－低（ｌｏｗ）ＩｇＧウシ胎児血清を使用すること以外は培養培地と同じ
３．エフェクター細胞株－ＡＤＣＣバイオアッセイエフェクター細胞株Ｖバリアント（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社＃６０５４１）
４．標的細胞株－ＨＥＫ２９３／１８．２（標的抗原でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞）
５．標的細胞株－ＮＵＧＣ４（標的抗原を発現する胃癌細胞株）
６．Ｐｉｅｒｃｅ Ｆｉｒｅｆｌｙ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ Ｇｌｏｗアッセイキット＃１６１９６
【0126】
アッセイプロトコル：
１．標的細胞株を回収する。１５，０００細胞／ウェルを白色の９６ウェルアッセイプレート中の５０ｕＬアッセイ培地に播種する。エフェクター細胞を沈降させ、かつアッセイ培地中に懸濁させる。一晩培養する。
２．アッセイ培地において４×濃度で被験物質の段階希釈物を調製する（典型的には希釈系列は１６ｕｇ／ｍＬ（４×）、抗体価３×希釈９ウェルで開始する）。
３．２５ｕＬの４×試料を標的細胞を含むアッセイプレートに移す。１５分間インキュベートする。
４．エフェクター細胞を回収および計数する。７０，０００エフェクター細胞／ウェル／２５ｕＬを分注する。５．５～６時間インキュベートする。
５．プレートを５分間放置して室温まで冷却する。
６．１００ｕＬ／ウェルのＯｎｅ－Ｓｔｅｐホタルルシフェラーゼ試薬を添加する。発光を測定する。
ＡＤＣＣ結果の例は図４Ａに示されており、ここでは腫瘍細胞株ＮＵＧＣ４を用いてＡＤＣＣ分析を行った。図４Ｂは、５Ｈ１Ｌ３、６Ｈ１Ｌ２、２６Ｈ３Ｌ３、４２Ｈ１Ｌ１１、４６Ｈ２Ｌ５、４８Ｈ１Ｌ６、２１５Ｈ５Ｌ３、２７２Ｈ１Ｌ５、３２Ｈ１Ｌ１および１００Ｆと命名された個々のクローンのＭＦＩを示し、マウス１８．２（水色）、ヒト１８．２（濃橙黄色）、マウス１８．１（灰色）、ヒト１８．１（薄橙黄色）およびＨＥＫ２９３（濃青色）についても示されている。定量化した結果も図４Ｂに示されている表に示されている。
１．標的細胞株を回収する。１５，０００細胞／ウェルを白色の９６ウェルアッセイプレート中の５０ｕＬアッセイ培地に播種する。エフェクター細胞を沈降させ、かつアッセイ培地中に懸濁させる。一晩培養する。
２．アッセイ培地において４×濃度で被験物質の段階希釈物を調製する（典型的には希釈系列は１６ｕｇ／ｍＬ（４×）、抗体価３×希釈９ウェルで開始する）。
３．２５ｕＬの４×試料を標的細胞を含むアッセイプレートに移す。１５分間インキュベートする。
４．エフェクター細胞を回収および計数する。７０，０００エフェクター細胞／ウェル／２５ｕＬを分注する。５．５～６時間インキュベートする。
５．プレートを５分間放置して室温まで冷却する。
６．１００ｕＬ／ウェルのＯｎｅ－Ｓｔｅｐホタルルシフェラーゼ試薬を添加する。発光を測定する。
ＡＤＣＣ結果の例は図４Ａに示されており、ここでは腫瘍細胞株ＮＵＧＣ４を用いてＡＤＣＣ分析を行った。図４Ｂは、５Ｈ１Ｌ３、６Ｈ１Ｌ２、２６Ｈ３Ｌ３、４２Ｈ１Ｌ１１、４６Ｈ２Ｌ５、４８Ｈ１Ｌ６、２１５Ｈ５Ｌ３、２７２Ｈ１Ｌ５、３２Ｈ１Ｌ１および１００Ｆと命名された個々のクローンのＭＦＩを示し、マウス１８．２（水色）、ヒト１８．２（濃橙黄色）、マウス１８．１（灰色）、ヒト１８．１（薄橙黄色）およびＨＥＫ２９３（濃青色）についても示されている。定量化した結果も図４Ｂに示されている表に示されている。
【0127】
実施例９：ウサギＢ細胞からのＶ領域レスキューおよびキメラ抗体のスクリーニング
ＣＬＤＮ１８．２結合が陽性であった被験ウサギＢ細胞をレスキューするために、重鎖および軽鎖の両方のＩｇＧ可変領域を陽性のＢ細胞から単離したｍＲＮＡからの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を用いる増幅によって捕捉した。このようにして得られたＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡを、最終ｃＤＮＡ構築物がキメラウサギヒトＩｇＧをコードするようにクローニングし、かつヒト定常領域構築物に連結させた。
ＣＬＤＮ１８．２結合が陽性であった被験ウサギＢ細胞をレスキューするために、重鎖および軽鎖の両方のＩｇＧ可変領域を陽性のＢ細胞から単離したｍＲＮＡからの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を用いる増幅によって捕捉した。このようにして得られたＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡを、最終ｃＤＮＡ構築物がキメラウサギヒトＩｇＧをコードするようにクローニングし、かつヒト定常領域構築物に連結させた。
【0128】
選択した陽性のＢ細胞を溶解し、かつ製造業者の説明書に従い、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＤｙｎａｂｅａｄｓ ｍＲＮＡ ＤＩＲＥＣＴ Ｍｉｃｒｏキットを用いてｍＲＮＡを調製した。ｖ領域を回復させるために、単一抗原陽性ウェルから作製したｍＲＮＡを製造業者の説明書に従って重鎖および軽鎖の両方のためのＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）反応において使用する。その反応のために、ウサギＩｇＧ分子の重鎖および軽鎖の定常領域に位置している遺伝子特異的プライマーを使用して単鎖ｃＤＮＡを生成し、次いでＰＣＲおよびネステッドＰＣＲを行ってＰＣＲ産物の末端に特異的制限部位が付加されている可変領域を増幅させた。サブクローニングのために特異的制限部位を有するヒトγ－１重鎖定常領域およびヒトκ軽鎖定常領域を含む自社ベクターを使用した。制限部位の付加後に、ＰＣＲ産物を関連する制限酵素による消化に供し、ゲル精製し、かつ適当なベクターの中に連結させた。
【0129】
サブクローニング後に、連結させたＤＮＡをコンピテント大腸菌ＤＨ５－α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に形質転換した。形質転換プール全体を適当な抗生物質耐性を含む培地で一晩培養した。培養した細菌を、一方の部分はキメラ抗体の一過性のＨＥＫ２９３発現に使用するためのプラスミドＤＮＡプレップ（Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット）を調製するためのものであり、もう一方の部分はＤＮＡシーケンシングのために単一のコロニーを播種するために保存するためのものである２つの部分に分けた。
【0130】
キメラ抗体を作製するために、ＨＥＫ２９３細胞を選択したウェルからの重鎖および軽鎖の両方のＤＮＡで同時トランスフェクトした。３～５日間の細胞培養後に上澄みを回収し、かつＥＬＩＳＡによってＩｇＧおよび抗原結合についてアッセイした。トランスフェクション上澄み中のＩｇＧの存在を検出するために、ＥＬＩＳＡプレートにコーティングした抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ捕捉抗体、その後に上澄みおよびヒトＩｇＧ標準を利用するＥＬＩＳＡ免疫学的検定を行う。Ｆｃ捕捉抗体の検出は、抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）－ＨＲＰ試薬およびＴＭＢ基質を用いて得る。
【0131】
陽性のキメラ抗体発現および抗原結合機能を与える単離したＤＮＡプレップをＤＮＡシーケンシングのために処理した。選択したウェルが１種以上の異なるＢ細胞クローンを含んでいる場合があるため、単離したＤＮＡプラスミドはこの段階で１つの特異的Ｖ領域について均質な場合もあれば均質でない場合もあることに留意されたい。当該プールを単一のクローンに分けるために、ＤＮＡを以前にそこから単離した大腸菌ＤＨ５α培養プールを適当な抗生物質を含む寒天プレート上の単一のコロニーに播種した。複数のコロニーを選択し、製造業者の説明書に従ってローリングサークルＤＮＡ増幅キット（Ｔｅｍｐｌｉｐｈｙ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いてＤＮＡ生成のために処理した。Ｔｅｍｐｌｉｐｈｙ反応から生成されたＤＮＡを配列決定し、その後に分析して各ウェルについてＶ領域の複雑性を決定する。ＤＮＡを調製することに加えて、Ｔｅｍｐｌｉｐｈｙ反応のために使用した細菌の各クローンを将来のＤＮＡ単離のために保存した。
【0132】
ＤＮＡ配列分析に基づいて、固有のＩｇＧ重鎖もしくは軽鎖配列を含む対応する単一クローン大腸菌培養物からプラスミドＤＮＡプレップを調製した。次いでこれらのプラスミドを使用してＨＥＫ２９３を再度形質転換してキメラモノクローナル抗体についてスクリーニングした。同じＢ細胞のウェル（クローナルでないウェル）から得られた複数の重鎖および軽鎖配列が存在する場合、固有の重鎖および軽鎖対の全ての可能な組み合わせをトランスフェクトした。３～５日後に上澄みを回収し、ＥＬＩＳＡによってＩｇＧおよび抗原結合についてアッセイした。このデコンボリューション工程後に、さらなる機能解析および次いでヒト化のために所望の結合活性を保持していた重鎖および軽鎖の組み合わせを選択した。
【0133】
上位抗体候補の特性および配列情報
精製したキメラタンパク質を用いて固有のＤＮＡ配列を有する上位１３種の抗体を特性評価した。その結果は表１に要約されている。
精製したキメラタンパク質を用いて固有のＤＮＡ配列を有する上位１３種の抗体を特性評価した。その結果は表１に要約されている。
【0134】
以下の使用した内部参照または参照抗体は、ｈｔｔｐ：／／ａｐｐｓ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｍｅｄｉｃｉｎｅｄｏｃｓ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ｓ２３２５６ｅｎ／ｓ２３２５６ｅｎ．ｐｄｆに示されているゾルベツキシマブのものと同じ重鎖および軽鎖配列を含む。参照抗体をＨＥＫ２９３細胞において一過性に発現させ、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィカラムおよびその後にイオン交換クロマトグラフィ工程を用いて精製した。
【0135】
【表1】
【0136】
ＣＬＤ１８．２に対するマウス抗体の作製
実施例１０：ヒトクローディン１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）に対するマウス抗体の作製
ＤＮＡ免疫法を用いてＣＬＤＮ１８．２特異的モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を作製した。簡単に言うと、ＣＬＤＮ１８．２遺伝子インサートを修飾したＤＮＡワクチンベクターｐＪＷ４３０３にクローニングした。次いで、Ｍｅｇａ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォルニア州バレンシア）を用いてＤＮＡプラスミドを大腸菌（ＨＢ１０１株）から作製した。２０匹の６～８週齢の雌のＣ５７／Ｂ６マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ社）のそれぞれを、遺伝子銃（Ｂｉｏ－ｒａｄ社）システムまたはＩＤ注射のいずれかおよびその後の電気穿孔法（ＢＴＸ－Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ社）によって送達されるプラスミドをコードするＣＬＤＮ１８．２により複数回免疫した。ＣＬＤＮ１８．２特異的抗体応答の研究のために、最初の免疫の前および最後の免疫から２週間後に血清試料を採取した。高い特異的抗体価を有するマウスはＣＬＤＮ１８．２を発現しているＨＥＫ２９３細胞の最終ブーストを与え、４日後に安楽死させて脾臓を無菌的に単離した。脾臓から単細胞懸濁液を調製し、次いで電気融合（ＢＴＸ－Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ社）によってＳＰ２／０骨髄腫細胞に融合させた。それぞれに最大１０匹のマウスを用いて２回の融合を行った。培養物上澄みを分析してＣＬＤＮ１８．２を発現しているがＣＬＤＮ１８．１を発現していないＨＥＫ２９３細胞との結合を有するハイブリドーマをスクリーニングした。陽性のクローンを増殖させ、単細胞クローニングを行い、かつ複数のアッセイによって確認した。
実施例１０：ヒトクローディン１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）に対するマウス抗体の作製
ＤＮＡ免疫法を用いてＣＬＤＮ１８．２特異的モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を作製した。簡単に言うと、ＣＬＤＮ１８．２遺伝子インサートを修飾したＤＮＡワクチンベクターｐＪＷ４３０３にクローニングした。次いで、Ｍｅｇａ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォルニア州バレンシア）を用いてＤＮＡプラスミドを大腸菌（ＨＢ１０１株）から作製した。２０匹の６～８週齢の雌のＣ５７／Ｂ６マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ社）のそれぞれを、遺伝子銃（Ｂｉｏ－ｒａｄ社）システムまたはＩＤ注射のいずれかおよびその後の電気穿孔法（ＢＴＸ－Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ社）によって送達されるプラスミドをコードするＣＬＤＮ１８．２により複数回免疫した。ＣＬＤＮ１８．２特異的抗体応答の研究のために、最初の免疫の前および最後の免疫から２週間後に血清試料を採取した。高い特異的抗体価を有するマウスはＣＬＤＮ１８．２を発現しているＨＥＫ２９３細胞の最終ブーストを与え、４日後に安楽死させて脾臓を無菌的に単離した。脾臓から単細胞懸濁液を調製し、次いで電気融合（ＢＴＸ－Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ社）によってＳＰ２／０骨髄腫細胞に融合させた。それぞれに最大１０匹のマウスを用いて２回の融合を行った。培養物上澄みを分析してＣＬＤＮ１８．２を発現しているがＣＬＤＮ１８．１を発現していないＨＥＫ２９３細胞との結合を有するハイブリドーマをスクリーニングした。陽性のクローンを増殖させ、単細胞クローニングを行い、かつ複数のアッセイによって確認した。
【0137】
図５は、ＦＡＣＳにより検出した際の、最初の免疫前および最後の免疫から２週間後に採取した血清試料のＣＬＤＮ１８．２特異的抗体応答の結果を示す。
【0138】
図６は、ＦＡＣＳ分析によって同定した最初の融合からの陽性ハイブリドーマの結果を示す。ハイブリドーマは、ＣＬＤＮ１８．２を発現しているＨＥＫ２９３細胞への結合を示すが、ＣＬＤＮ１８．１を発現しているＨＥＫ２９３細胞またはＨＥＫ２９３細胞への結合を示さないか最小の結合を示す場合に陽性であると同定した。
【0139】
２回の融合からの陽性ハイブリドーマをサブクローニングし、サブクローンをＣＬＤＮ１８．１に対してＣＬＤＮ１８．２へのそれらの選択的結合についてさらにスクリーニングした。１２種の陽性サブクローンを同定した（図７）。ハイブリドーマ細胞を増殖させてバイアルに入れた。これらのバイアルをさらなる試験およびその後のクローニングのために凍結させた。
【0140】
ハイブリドーマのバイアルを解凍して培養した。次いでそれらの上澄みをＦＡＣＳによりさらに分析した。図８ＡはＨＥＫ２９３細胞上で発現されているＣＬＤＮ１８．２へのハイブリドーマの上澄みの結合の滴定曲線を示し、図８Ｂは１８．１に対してＣＬＤＮ１８．２を発現しているＨＥＫ２９３細胞への上澄みの結合の特異性を示し、図８Ｃは、ＨＥＫ２９３細胞上で発現されているＣＬＤＮ１８．１に対してＣＬＤＮ１８．２への上澄みの結合のＦＡＣＳ強度を示す。
【0141】
実施例１１：選択したクローンのクローニング
７９Ｃ４、１１Ｅ１２、８３Ｇ３、３０Ｂ５および８５Ｈ１２を含む陽性のサブクローンを選択してクローニングした。選択したクローンの抗体可変領域をクローニングした。選択したクローンの重鎖可変領域配列は表３４に、軽鎖可変領域は表３５に示されており、各上位候補のためのＣＤＲは表２９～表３３に提供されている。
７９Ｃ４、１１Ｅ１２、８３Ｇ３、３０Ｂ５および８５Ｈ１２を含む陽性のサブクローンを選択してクローニングした。選択したクローンの抗体可変領域をクローニングした。選択したクローンの重鎖可変領域配列は表３４に、軽鎖可変領域は表３５に示されており、各上位候補のためのＣＤＲは表２９～表３３に提供されている。
【0142】
以下に記載されている手順を用いて、Ｖ遺伝子クローニングを行った。
【0143】
ＲＮＡ抽出：１×１０６個のマウスハイブリドーマ細胞を９００ｇで５分間の遠心機によって回収した。製造業者のプロトコルに従い、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ）を用いて総ＲＮＡを抽出した。ＮａｎｏＤｒｏｐ １０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）によりＲＮＡを定量化した。
【0144】
ｃＤＮＡ合成：ｃＤＮＡ合成のためにｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キット（カタログ１７０８８９１、Ｂｉｏ－ｒａｄ社）を使用した。簡単に言うと、２０ｕＬの反応体積中で、１ｕｇの総ＲＮＡ、ランダムプライマーを含む４ｕＬの反応緩衝液、１ｕＬのｉＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素およびヌクレアーゼ非含有水（変数）を混合した。製造業者のプロトコルに記載されているように、反応混合物をサーマルサイクラー（Ｂｉｏ－ｒａｄ社）において２５℃で１０分間、４６℃で３０分間および９５℃で１分間インキュベートした。あるいは、ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ５’／３’キット（カタログ６３４８５８、Ｔａｋａｒａ社）を使用して製造業者のマニュアルに記載されているようにｃＤＮＡを合成した。
【0145】
Ｖ遺伝子の増幅：ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｎｏｖａｇｅｎ マウスＩｇ－プライマーセット（カタログ６９８３１３、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）およびＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（カタログ１１３０４０１１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して重鎖および軽鎖可変領域を増幅させる。簡単に言うと、５０ｕＬの反応体積中で、５ｕＬの１０×反応緩衝液、１ｕＬの１０ｍＭのｄＮＴＰ混合物、１ｕＬの順方向／逆方向プライマー、１ｕＬのｃＤＮＡ産物、０．２ｕＬのＤＮＡポリメラーゼおよびヌクレアーゼ非含有水（５０ｕＬまで充填）を混合した。反応混合物をサーマルサイクラー（Ｂｉｏ－ｒａｄ社）において３０サイクルのために９５℃で１５秒間、５５℃で１５秒間および７２℃で３０秒間インキュベートし、次いで７２℃でさらに５分間延長した。製造業者のマニュアルに記載されているように、ＰＣＲ産物をＴＯＰＯ ＴＡクローニングベクター（カタログＫ４５７５０１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングし、かつ大腸菌の上位１０種のコンピテント細胞に形質転換した。ＧｅｎｅＷｉｚ（ニュージャージー州サウスプレインフィールド、０７０８０）によるシークエンシングのために単一のコロニーを選択した。
【0146】
サブクローンの配列を確認するためにキメラ抗体を作製した。完全な抗体発現のために、重鎖および軽鎖可変遺伝子をそれぞれｐＦＵＳＥｈＩＧ１およびｐＦＵＳＥｈＩＧＫ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社、サンディエゴ）にクローニングした。選択したサブクローンのそれぞれからの重鎖および軽鎖の両方のＤＮＡでＨＥＫ２９３細胞を同時トランスフェクトした。ＣＬＤＮ１８．１を発現しているＨＥＫ２９３細胞に対してＣＬＤＮ１８．２を発現しているＨＥＫ２９３細胞へのＦＡＣＳ結合により上澄みを試験した。ＦＡＣＳ分析の例は図９に示されている。図９Ａは、ＨＥＫ２９３細胞上で発現されているＣＬＤＮ１８．２へのクローンの上澄みの結合の滴定曲線を示す。図９Ｂは、ＣＬＤＮ１８．１に対してＣＬＤＮ１８．２を発現しているＨＥＫ２９３細胞への上澄みの結合の特異性を示す。図９Ｃは、ＨＥＫ２９３細胞上で発現されているＣＬＤＮ１８．１に対してＣＬＤＮ１８．２への上澄みの結合のＦＡＣＳ強度を示す。
【0147】
さらに、実施例８に記載されているプロトコルに従ってＡＤＣＣレポーターアッセイによる機能分析も行った。ＡＤＣＣレポーターアッセイの結果の例は図１０に示されている。
【0148】
選択したＣＬＤ１８．２に対する抗体のヒト化
実施例１２：ウサギ抗体クローン４６のヒト化
ヒト化のためにクローン４６を選択した。抗体構造に対する最近の研究に関連する標準的なＣＤＲ移植技術および成熟ヒトＩｇＧ配列の最新のデータベースを用いてヒト化を行った。クローン４６のＣＤＲ配列のための「アクセプター」フレームワークとして使用されたことのある多くのヒトフレームワーク配列を同定した。これらのアクセプター配列は全てヒト供給源からの成熟したヒトＩｇＧに由来しており、ファージディスプレイまたは他の技術から得られたものではなかった。故に、ヒト化配列は非免疫原性であることが期待され、かつＣＤＲループの標準構造を保持していた。ＶＨ／ＶＬ界面および標準ループ構造のための重要な残基は、ＣＤＲｘプラットフォームを用いてヒト化バリアントにおいて可能な限り維持されていた。
実施例１２：ウサギ抗体クローン４６のヒト化
ヒト化のためにクローン４６を選択した。抗体構造に対する最近の研究に関連する標準的なＣＤＲ移植技術および成熟ヒトＩｇＧ配列の最新のデータベースを用いてヒト化を行った。クローン４６のＣＤＲ配列のための「アクセプター」フレームワークとして使用されたことのある多くのヒトフレームワーク配列を同定した。これらのアクセプター配列は全てヒト供給源からの成熟したヒトＩｇＧに由来しており、ファージディスプレイまたは他の技術から得られたものではなかった。故に、ヒト化配列は非免疫原性であることが期待され、かつＣＤＲループの標準構造を保持していた。ＶＨ／ＶＬ界面および標準ループ構造のための重要な残基は、ＣＤＲｘプラットフォームを用いてヒト化バリアントにおいて可能な限り維持されていた。
【0149】
５対のヒト化重鎖（配列番号１８７～１９１、表２７）および軽鎖（配列番号１９３～１９７、表２８）を作製した。全ての可能な対をＨＥＫ２９３細胞を用いて一過性に発現させ、一過性の発現の上澄みを結合およびＡＤＣＣ活性について試験した。最初の結果（データは示さず）に基づいて、ＨＣ５／ＬＣ５、ＨＣ４／ＬＣ５、ＨＣ３／ＬＣ１、ＨＣ５／ＬＣ１、ＨＣ４／ＬＣ１の対は最も高い結合親和性およびＡＤＣＣ活性を有していた。最適化されたＨＣ４のために配列番号１９９～２０１を作製し、かつ最適化されたＨＣ５のために配列番号２０２～２０４を作製するために、ＨＣ４（配列番号１９０）およびＨＣ５（配列番号１９１）をさらに最適化した。最適化されたＬＣ１のために配列番号２０５を作製し、かつ最適化されたＬＣ５のために配列番号２０６を作製するために、ＬＣ鎖ＬＣ１（配列番号１９３）およびＬＣ５（配列番号１９７）も最適化した。さらなるスクリーニング後に、２種類のリード分子ＡＳＫ５８９－Ｂ（すなわちＢ）およびＡＳＫ５８９－Ｃ（すなわちＣ）をヒト化ウサギ抗体からのリード分子として同定した。分子Ｂは、配列番号２０２に示されているアミノ酸配列を有する重鎖と配列番号２０５に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む。分子Ｃは、配列番号２０４に示されているアミノ酸配列を有する重鎖と配列番号２０５に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む。
【0150】
実施例１３：マウス抗体クローン１１Ｅ１２および８３Ｇ３のヒト化
ヒト化のためにマウスハイブリドーマクローン１１Ｅ１２および８３Ｇ３を選択した。モデル構造としてｐｄｂ ４ＯＺ４を用いて１１Ｅ１２ Ｆｖ相同性モデルを構築し、ｐｄｂ １ＨＩＬおよびｐｄｂ ３ＴＴ１で構築された別の異種モデルによりヒト化設計を二重確認した。モデル構造としてｐｄｂ ２Ｉ９Ｌを用いて８３Ｇ３ Ｆｖ相同性モデルを構築し、ｐｄｂ １ＭＣＰおよびｐｄｂ ２Ｉ９Ｌで構築された別の異種モデルによりヒト化設計を二重確認した。ヒト化プロセス中に、マウスＣＤＲをヒトフレームワークアクセプターの中に移植し、マウスフレームワーク内のものと異なるヒトフレームワーク内の残基を調査した。以下の規則：「ａ．新しい接触（イオン間相互作用、水素結合、疎水性相互作用）がこのヒト残基とマウスＦｖ ＣＤＲ残基、標準残基、界面残基またはｖｅｒｎｉｅｒ残基との間に作り出された場合、このヒト残基をマウス残基に逆突然変異させる必要がある」、「ｂ．ヒト残基がマウス残基を置換している場合にマウス残基と標準残基、界面残基またはｖｅｒｎｉｅｒ残基との間の古い接触（イオン間相互作用、水素結合、疎水性相互作用）が失われた場合、このヒト残基をマウス残基に逆突然変異させる必要がある」、および「ｃ．マウス標準残基、界面残基またはｖｅｒｎｉｅｒ残基のヒト残基による置換を慎重に調査し、通常は回避しなければならない」に基づいて、ヒト残基からマウス残基への逆突然変異を設計した。
ヒト化のためにマウスハイブリドーマクローン１１Ｅ１２および８３Ｇ３を選択した。モデル構造としてｐｄｂ ４ＯＺ４を用いて１１Ｅ１２ Ｆｖ相同性モデルを構築し、ｐｄｂ １ＨＩＬおよびｐｄｂ ３ＴＴ１で構築された別の異種モデルによりヒト化設計を二重確認した。モデル構造としてｐｄｂ ２Ｉ９Ｌを用いて８３Ｇ３ Ｆｖ相同性モデルを構築し、ｐｄｂ １ＭＣＰおよびｐｄｂ ２Ｉ９Ｌで構築された別の異種モデルによりヒト化設計を二重確認した。ヒト化プロセス中に、マウスＣＤＲをヒトフレームワークアクセプターの中に移植し、マウスフレームワーク内のものと異なるヒトフレームワーク内の残基を調査した。以下の規則：「ａ．新しい接触（イオン間相互作用、水素結合、疎水性相互作用）がこのヒト残基とマウスＦｖ ＣＤＲ残基、標準残基、界面残基またはｖｅｒｎｉｅｒ残基との間に作り出された場合、このヒト残基をマウス残基に逆突然変異させる必要がある」、「ｂ．ヒト残基がマウス残基を置換している場合にマウス残基と標準残基、界面残基またはｖｅｒｎｉｅｒ残基との間の古い接触（イオン間相互作用、水素結合、疎水性相互作用）が失われた場合、このヒト残基をマウス残基に逆突然変異させる必要がある」、および「ｃ．マウス標準残基、界面残基またはｖｅｒｎｉｅｒ残基のヒト残基による置換を慎重に調査し、通常は回避しなければならない」に基づいて、ヒト残基からマウス残基への逆突然変異を設計した。
【0151】
各抗体およびｈｕＶＨｖ１ＶＬｖ１（最も高いヒト化割合を有するヒト化型からのデータ）のシュレーディンガー表面分析およびシュレーディンガー翻訳後修飾も行った。さらに、逆突然変異を含んでいた最も高いヒト化型ＶＨｖ１ＶＬｖ１のフレームワークにおけるＰｒｏｔｅａｎ ３Ｄによって予測される全ての可能な細胞エピトープ、Ｂ細胞エピトープ、ＭＨＣ ＩＩエピトープおよび抗原性エピトープをコールアウトした。
【0152】
ヒト化１１Ｅ１２の可変領域配列が表３６に列挙されている。ヒト化８３Ｇ３の可変領域配列が表３７に列挙されている。
【0153】
上に記載されているのように、ＨＥＫ２９３細胞においてヒト化抗体を一過性に発現させて精製した。本抗体をＣＬＤＮ１８．２に対するそれらの機能性および特異性についてさらに試験した。さらなる特性評価のためにＡＳＫ５８９－Ｍ１（すなわちＭ１）を選択した。分子Ｍ１は、配列番号２５４に示されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と配列番号２６０に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む。Ｍ５は、配列番号２５７に示されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と配列番号２６０に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含むＭ１の突然変異型である。
【0154】
ＣＬＤ１８．２に対するヒト化抗体の機能性分析
実施例１４：結合アッセイ
ＨＥＫ２９３細胞およびＮＵＧＣ４細胞上で発現されている標的ＣＬＤＮ１８．２タンパク質へのヒト化抗体の結合をＦＡＣＳにより分析した。その結果は図１１に示されている。図１１Ａは、ＣＬＤＮ１８．２でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞への結合を示す。その結果から、Ｍ５は参照分子と比較するとより高い結合およびより高い結合親和性を有することが分かった。図１１Ｂは、ＣＬＤＮ１８．２を天然に発現するＮＵＧＣ４細胞への結合を示す。その結果から、Ｍ５およびＢは参照分子と比較すると有意により高い結合および非常により高い結合親和性を有することが分かった。
実施例１４：結合アッセイ
ＨＥＫ２９３細胞およびＮＵＧＣ４細胞上で発現されている標的ＣＬＤＮ１８．２タンパク質へのヒト化抗体の結合をＦＡＣＳにより分析した。その結果は図１１に示されている。図１１Ａは、ＣＬＤＮ１８．２でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞への結合を示す。その結果から、Ｍ５は参照分子と比較するとより高い結合およびより高い結合親和性を有することが分かった。図１１Ｂは、ＣＬＤＮ１８．２を天然に発現するＮＵＧＣ４細胞への結合を示す。その結果から、Ｍ５およびＢは参照分子と比較すると有意により高い結合および非常により高い結合親和性を有することが分かった。
【0155】
実施例１５：ＡＤＣＣレポーターアッセイ
実施例１１に記載されているＡＤＣＣレポーターアッセイを用いてヒト化抗体を試験した。その結果は図１２に示されている。図１２Ａは、ＣＬＤＮ１８．２で安定にトランスフェクトした標的細胞ＨＥＫ２９３を用いたヒト化抗体Ｍ５およびＢについてのＡＤＣＣレポーターアッセイの結果を示す。それらの結果から、Ｍ５およびＢは高レベルのＣＬＤＮ１８．２がそれらの表面に発現されているＨＥＫ２９３細胞に対して参照抗体の活性よりも僅かに良好またはそれと同様の活性を有することが分かった。図１２Ｂおよび図１２Ｃは胃癌細胞ＮＵＧＣ４（図１２Ｂ）およびＤＡＮ－Ｇ（図１２Ｃ）を用いた場合の結果を示し、これらはＣＬＤＮ１８．２を天然に発現するが、ＣＬＤＮ１８．２で安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞と比較すると有意により低いレベルで発現している。それらの結果から、分子Ｍ５およびＢが胃癌細胞を死滅させるのに参照抗体よりも有意に高いＡＤＣＣ活性を有することが分かった。
実施例１１に記載されているＡＤＣＣレポーターアッセイを用いてヒト化抗体を試験した。その結果は図１２に示されている。図１２Ａは、ＣＬＤＮ１８．２で安定にトランスフェクトした標的細胞ＨＥＫ２９３を用いたヒト化抗体Ｍ５およびＢについてのＡＤＣＣレポーターアッセイの結果を示す。それらの結果から、Ｍ５およびＢは高レベルのＣＬＤＮ１８．２がそれらの表面に発現されているＨＥＫ２９３細胞に対して参照抗体の活性よりも僅かに良好またはそれと同様の活性を有することが分かった。図１２Ｂおよび図１２Ｃは胃癌細胞ＮＵＧＣ４（図１２Ｂ）およびＤＡＮ－Ｇ（図１２Ｃ）を用いた場合の結果を示し、これらはＣＬＤＮ１８．２を天然に発現するが、ＣＬＤＮ１８．２で安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞と比較すると有意により低いレベルで発現している。それらの結果から、分子Ｍ５およびＢが胃癌細胞を死滅させるのに参照抗体よりも有意に高いＡＤＣＣ活性を有することが分かった。
【0156】
実施例１６：ＣＤＣアッセイ
アッセイ培地としてＲＰＭＩ１６４０＋１％低ＩｇＧウシ胎児血清を用いてＣＤＣアッセイを行った。５０ｕＬ／ウェルのアッセイ培地において試験抗体を２×濃度で滴定する。標的細胞を２５ｕＬ中に２０，０００細胞／ウェルで添加する。３７℃で１５分間インキュベートする。２５ｕＬ／ウェルの４０％ヒト補体（１０％最終濃度）を添加する。自然発生的な細胞死のために培地のみを含む標的を使用する。最大細胞死のために標的＋１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を使用する。３７℃で１時間インキュベートする。１００ｕＬ／ウェルのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ社ｃａｔ．＃Ｇ７５７１）を添加する。発光を測定する。以下の方程式：特異的放出＝（実験値－自然発生値）／（最大値－自然発生値）×１００を用いてＣＤＣ活性を計算する。
アッセイ培地としてＲＰＭＩ１６４０＋１％低ＩｇＧウシ胎児血清を用いてＣＤＣアッセイを行った。５０ｕＬ／ウェルのアッセイ培地において試験抗体を２×濃度で滴定する。標的細胞を２５ｕＬ中に２０，０００細胞／ウェルで添加する。３７℃で１５分間インキュベートする。２５ｕＬ／ウェルの４０％ヒト補体（１０％最終濃度）を添加する。自然発生的な細胞死のために培地のみを含む標的を使用する。最大細胞死のために標的＋１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を使用する。３７℃で１時間インキュベートする。１００ｕＬ／ウェルのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ社ｃａｔ．＃Ｇ７５７１）を添加する。発光を測定する。以下の方程式：特異的放出＝（実験値－自然発生値）／（最大値－自然発生値）×１００を用いてＣＤＣ活性を計算する。
【0157】
図１３は、参照抗体と比較した場合のヒト化分子Ｂ、Ｍ１およびＭ５のＣＤＣ結果を示す。図１３ＡはＣＬＤＮ１８．２を発現しているＨＥＫ２９３細胞に対する参照に対してＢおよびＭ１を用いた場合の結果を示し、図１３ＢはＣＬＤＮ１８．２を発現している標的ＨＥＫ２９３細胞に対する参照に対してＭ５を用いた場合の結果を示し、図１３Ｃは標的ＮＵＧＣ４細胞に対する参照に対してＢおよびＭ１を用いた場合の結果を示す。全ての結果から、抗体Ｍ１、Ｍ５およびＢが参照抗体よりも高いＣＤＣ活性を有することが分かった。
【0158】
ヒト化抗体Ｍ１、ＢおよびＭ５の特異性
実施例１７：他のクローディンファミリーメンバーへの結合
多くのクローディンファミリーメンバーを発現している遺伝子をＨＥＫ２９３細胞に一過性にトランスフェクトした。またＣＬＤＮ７およびＣＬＤＮ１８．２以外のクローディンは全てＣ末端でＦＬＡＧに融合されていた。ＨＥＫ２９３細胞上で発現されているクローディンへの抗体Ｍ１、Ｍ５およびＢならびに参照抗体の結合を上に記載されているのようにＦＡＣＳを用いて試験した。その結果から、本明細書において試験した全ての抗体はＣＬＤＮ１８．２に選択的に結合するが本明細書に示されている他のクローディンファミリーメンバーのいずれにも結合しないことが分かった（図１４Ａ）。それらの結果から、ＦＬＡＧ抗体の結合によって実証されているようにＦＬＡＧを有する全てのクローディンが発現されることも分かった（図１４Ｂ）。
実施例１７：他のクローディンファミリーメンバーへの結合
多くのクローディンファミリーメンバーを発現している遺伝子をＨＥＫ２９３細胞に一過性にトランスフェクトした。またＣＬＤＮ７およびＣＬＤＮ１８．２以外のクローディンは全てＣ末端でＦＬＡＧに融合されていた。ＨＥＫ２９３細胞上で発現されているクローディンへの抗体Ｍ１、Ｍ５およびＢならびに参照抗体の結合を上に記載されているのようにＦＡＣＳを用いて試験した。その結果から、本明細書において試験した全ての抗体はＣＬＤＮ１８．２に選択的に結合するが本明細書に示されている他のクローディンファミリーメンバーのいずれにも結合しないことが分かった（図１４Ａ）。それらの結果から、ＦＬＡＧ抗体の結合によって実証されているようにＦＬＡＧを有する全てのクローディンが発現されることも分かった（図１４Ｂ）。
【0159】
実施例１８：タンパク質チップを用いた特異性分析
ヒト化抗体がＣＬＤＮ１８．２に特異的であるかを試験するために、ヒト膜タンパク質ＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体の特異性をプロファイリングするための膜プロテオームアレイ（ＭＰＡ：Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ａｒｒａｙ）アッセイを行った。ＭＰＡを使用して抗体標的特異性を決定し、オーファン抗体標的の畳み込みを解き、かつバイオシミラー候補の標的プロファイルを特性評価することができる。膜プロテオームアレイ（ＭＰＡ）アッセイは以前に記載されている方法と同様に行った（Ｔｕｃｋｅｒら ＰＮＡＳ ２０１８年５月２９日，１１５（２２）Ｅ４９９０－Ｅ４９９９）。フローサイトメトリーを使用して、ヒトＨＥＫ－２９３Ｔ細胞において発現されている膜タンパク質への抗体結合を直接検出した。全てのＭＰＡ標的を自然の立体構造および適当な翻訳後修飾を有するように設計した。本抗体をＧＰＣＲ、イオンチャネルおよびトランスポーターを含む５，３００種超のヒト膜タンパク質のＭＰＡライブラリーに対する反応性について試験した。同定した標的を２次スクリーニングにおいて検査して反応性を確認した。これらのデータ（図示せず）から、Ｍ５がＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合し、当該試験においてバックグラウンドを超えるレベルで膜タンパク質のいずれにも予想外に結合しないことが分かった。
ヒト化抗体がＣＬＤＮ１８．２に特異的であるかを試験するために、ヒト膜タンパク質ＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗体の特異性をプロファイリングするための膜プロテオームアレイ（ＭＰＡ：Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ａｒｒａｙ）アッセイを行った。ＭＰＡを使用して抗体標的特異性を決定し、オーファン抗体標的の畳み込みを解き、かつバイオシミラー候補の標的プロファイルを特性評価することができる。膜プロテオームアレイ（ＭＰＡ）アッセイは以前に記載されている方法と同様に行った（Ｔｕｃｋｅｒら ＰＮＡＳ ２０１８年５月２９日，１１５（２２）Ｅ４９９０－Ｅ４９９９）。フローサイトメトリーを使用して、ヒトＨＥＫ－２９３Ｔ細胞において発現されている膜タンパク質への抗体結合を直接検出した。全てのＭＰＡ標的を自然の立体構造および適当な翻訳後修飾を有するように設計した。本抗体をＧＰＣＲ、イオンチャネルおよびトランスポーターを含む５，３００種超のヒト膜タンパク質のＭＰＡライブラリーに対する反応性について試験した。同定した標的を２次スクリーニングにおいて検査して反応性を確認した。これらのデータ（図示せず）から、Ｍ５がＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合し、当該試験においてバックグラウンドを超えるレベルで膜タンパク質のいずれにも予想外に結合しないことが分かった。
【0160】
ＰＫ研究
実施例１９：カニクイザルにおける薬物動態学的研究
実験動物を用い、関連する政府規制に従ってカニクイザル（３～４ｋｇ体重の１０匹の雄および１０匹の雌の動物）ＰＫ研究においてヒト化抗体Ｍ１、Ｍ５、ＢおよびＣを試験した。投与量は計４回の投与のために毎週５ｍｇ／ｋｇであった。この研究は以下の表に示されている５つの群に対して設計した。
実施例１９：カニクイザルにおける薬物動態学的研究
実験動物を用い、関連する政府規制に従ってカニクイザル（３～４ｋｇ体重の１０匹の雄および１０匹の雌の動物）ＰＫ研究においてヒト化抗体Ｍ１、Ｍ５、ＢおよびＣを試験した。投与量は計４回の投与のために毎週５ｍｇ／ｋｇであった。この研究は以下の表に示されている５つの群に対して設計した。
【表2】
【0161】
試料は以下の表に記載されているように採取した。
【表3】
【0162】
以下の表に示されているスケジュールに従ってＰＫ試料を採取した。
【表4】
【0163】
精製した抗原を用いるＥＬＩＳＡアッセイを使用して血清中の薬物濃度を試験した。ＰＫデータは図１５に示されている。これらの結果から抗体Ｍ１およびＭ５は５ｍｇ／ｋｇにおいて明らかな免疫原性を有しない線形のＰＫを有することが分かった。
【0164】
動物モデルの有効性研究
実施例２０：動物モデルの有効性研究
この実験のために使用したマウスは６週齢の雌のＢａｌｂ／Ｃマウスであった。マウスを実験の開始前の１週間で輸送から回復させた。ＣＴ２６／１８．２細胞を１００ｕＬのＰＢＳ中に１×１０６細胞で皮下に移植した。７日後に腫瘍は平均して約７０ｍｍ３に達した。各群が同じ平均腫瘍サイズを有するようにマウスを１０匹のマウスからなる６つの群に無作為化した。７日目に治療を開始した。
実施例２０：動物モデルの有効性研究
この実験のために使用したマウスは６週齢の雌のＢａｌｂ／Ｃマウスであった。マウスを実験の開始前の１週間で輸送から回復させた。ＣＴ２６／１８．２細胞を１００ｕＬのＰＢＳ中に１×１０６細胞で皮下に移植した。７日後に腫瘍は平均して約７０ｍｍ３に達した。各群が同じ平均腫瘍サイズを有するようにマウスを１０匹のマウスからなる６つの群に無作為化した。７日目に治療を開始した。
【0165】
研究群を以下に列挙する。
１．プラセボ
２．マウス抗体参照（１０ｍｇ／Ｋｇ）
３．マウス抗体Ｍ５（１０ｍｇ／Ｋｇ）
４．マウス抗体Ｍ５（１ｍｇ／Ｋｇ）
５．５－フルオロウラシル（４０ｍｇ／Ｋｇ）
６．５－フルオロウラシル＋Ｍ５（３ｍｇ／Ｋｇ）
１．プラセボ
２．マウス抗体参照（１０ｍｇ／Ｋｇ）
３．マウス抗体Ｍ５（１０ｍｇ／Ｋｇ）
４．マウス抗体Ｍ５（１ｍｇ／Ｋｇ）
５．５－フルオロウラシル（４０ｍｇ／Ｋｇ）
６．５－フルオロウラシル＋Ｍ５（３ｍｇ／Ｋｇ）
【0166】
マウスＩｇＧ２ａの形態の抗体を発現させて精製した。それらを３日ごとに腹腔内投与した。計３回の治療のために５－ＦＵを２日ごとに腹腔内投与した。３日ごとに腫瘍サイズを測定した。
【0167】
インビボ有効性データは図１６に示されている。このデータからマウス抗体Ｍ５は１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇにおいて腫瘍増殖を抑制するのに有効であることが分かった。参照抗体は本研究においてあらゆる活性を示した。
【0168】
【表5】
【0169】
【表6】
【0170】
【表7】
【0171】
【表8】
【0172】
【表9】
【0173】
【表10】
【0174】
【表11】
【0175】
【表12】
【0176】
【表13】
【0177】
【表14】
【0178】
【表15】
【0179】
【表16】
【0180】
【表17】
【0181】
【表18】
【0182】
【表19】
【0183】
【表20】
【0184】
【表21】
【0185】
【表22】
【0186】
【表23】
【0187】
【表24】
【0188】
【表25】
【0189】
【表26】
【0190】
【表27】
【0191】
【表28】
【0192】
【表29】
【0193】
【表30】
【0194】
【表31】
【0195】
【表32】
【0196】
【表33】
【0197】
【表34】
【0198】
【表35】
【0199】
【表36】
【0200】
【表37】
【0201】
【表38】
【0202】
【表39】
【0203】
【表40】
【0204】
上記非限定的な例は、開示されている主題のより完全な理解を容易にするために単に例示のために提供されている。これらの実施例は、癌、神経変性疾患または感染症を治療するための抗体、医薬組成物または方法および使用に関するものを含む本明細書に記載されている実施形態を決して限定するものとして解釈されるべきではない。
【0205】
最後になるが、当然のことながら、本明細書の態様は具体的な実施形態を参照することにより強調されているが、当業者であればこれらの開示されている実施形態は本明細書に開示されている主題の原理の単なる例示であることを容易に理解するであろう。従って、開示されている主題はそのようなものとして明示的に記載されていない限り、本明細書に記載されている特定の化合物、組成物、物品、装置、方法論、プロトコルおよび／または試薬などに決して限定されないことを理解すべきである。さらに当業者であれば、本明細書の趣旨から逸脱することなく本明細書中の教示に従って特定の変化、修正、交換、変更、追加、削除およびそれらのサブコンビネーションが可能であることが分かるであろう。従って、以下の添付の特許請求の範囲および今後導入される請求項は、それらの真の趣旨および範囲内にあるものとして、そのような変化、修正、交換、変更、追加、削除およびサブコンビネーションを含むように解釈されることが意図されている。
【0206】
本発明者らに知られている本発明を実施するための最良の形態を含む本発明の特定の実施形態が本明細書に記載されている。当然のことながら、これらの記載されている実施形態に対する変形は上記説明を読めば当業者には明らかになるであろう。本発明者は、当業者がそのような変形を適宜用いることを想定しており、本発明者らは、本明細書に具体的に記載されているものとは異なる方法で本発明が実施されることを意図している。従って本発明は、本明細書に添付されている特許請求の範囲に列挙されている主題の全ての修正形態および均等物を適用法により認められるものとして含む。さらに、本明細書に特に記載がない限り、あるいは文脈に明らかに矛盾しない限り、その全ての可能な変形における上に記載されている実施形態のあらゆる組み合わせが本発明によって包含される。
【0207】
本発明の他の実施形態、要素または工程のグループ化は、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。各グループの構成要素は個々に、あるいは本明細書に開示されている他のグループの構成要素との任意の組み合わせで言及および特許請求することができる。グループの１つ以上の構成要素は利便性および／または特許性を理由に、グループに含めたりそこから削除したりすることができるものと想定される。任意のそのような包含または削除が生じた場合、本明細書は、そのグループを修正されたものとして含み、従って添付の特許請求の範囲に使用されている全てのマーカッシュ群の記載を満たしているものとみなされる。
【0208】
特に記載がない限り、本明細書および特許請求の範囲に使用されている特性、項目、量、パラメータ、性質および用語などを表わす全ての数は、「約」という用語により全ての場合に修飾されるものとして理解されるべきである。本明細書で使用される「約」という用語は、そのように修飾された特性、項目、量、パラメータ、性質または用語が、その指定された特性、項目、量、パラメータ、性質または用語の値の上下±１０％の範囲を包含することを意味する。従って特に矛盾した記載がない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲に記載されている数値のパラメータは変動し得る近似値である。例えば、質量分析機器は所与の分析物の質量を決定する際に僅かにばらつく可能性があるため、イオンの質量またはイオンの質量／電荷比の文脈における「約」という用語は±０．５０原子質量単位を指す。少なくとも各数値の表示は特許請求の範囲に対する均等論の適用を制限しようとするものではなく、少なくとも報告されている有効数字の数を考慮し、かつ通常の丸め技術を適用して解釈されるべきである。
【0209】
一実施形態または一実施形態の態様を言及する際の「～してもよい」または「～することができる」という用語の使用は、それにより「～しなくてもよい」または「～することができない」という他の意味も有する。従って本明細書が一実施形態または一実施形態の態様を本発明の主題の一部として含めてもよいこと、または含めることができることを開示している場合、一実施形態または一実施形態の態様を本発明の主題の一部として含めなくてもよいこと、または含めることができないことを意味するその否定的な限定または排他的な提供も明示的に意図されている。同様の方法で、一実施形態または一実施形態の態様を参照する際の「任意に」という用語の使用は、そのような実施形態または当該実施形態の態様を本発明の主題の一部として含めてもよいこと、または本発明の主題の一部として含めなくてもよいことを意味する。そのような否定的な限定または排他的な提供が適用されるか否かは、その否定的な限定または排他的な提供が特許請求されている主題に列挙されているか否かに基づくであろう。
【0210】
本発明の広い範囲を記載している数値範囲および値が近似値であっても、具体的な例に記載されている数値範囲および値は可能な限り正確に報告されている。但し、どの数値範囲または値もそれらの各試験測定値に認められる標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を本質的に含む。本明細書における値の数値範囲の列挙は単に、その範囲に含まれる各個別の数値を個々に述べるのを省略する方法としての役割を担うためのものである。本明細書に明記しない限り、数値範囲の各個々の値はあたかも本明細書に個々に列挙されているかのように本明細書に組み込まれている。
【0211】
本発明を説明する文脈（特に以下の特許請求の範囲の文脈）に使用される「１つの（ａ）」「１つの（ａｎ）」「その（前記）（ｔｈｅ）」という用語および同様の言及は、本明細書に特に記載がない限り、あるいは文脈に明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を包含するように解釈されるべきである。さらに、特定される要素のための「第１の」「第２の」「第３の」などの序数標識は、要素を区別するために使用されており、特に別段の定めのない限り、そのような要素の必要数または限定数を示したり暗示したりしておらず、そのような要素の特定の位置または順序を示してはいない。本明細書に記載されている全ての方法は、本明細書に特に記載がない限り、あるいは文脈に明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施することができる。本明細書に提供されているありとあらゆる例または例を表わす言葉（例えば「など」）の使用は、単に本発明をより良く理解するためのものであり、特許請求の範囲に別段の定めがない限り本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中の言葉はいずれも本発明の実施に必須なあらゆる特許請求されていない要素を示すものとして解釈されるべきではない。
【0212】
特許請求の範囲で使用されている場合、出願であるか補正による追加であるかに関わらず、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」というオープンエンドの移行句（および「～を含む（備える）（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「～を含む（含有する）（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」および「～を有する（ｈａｖｉｎｇ）」のようなその同等のオープンエンドの移行句）は、単独または列挙されていない主題と組み合わせて明示的に列挙されている要素、限定、工程および／または特徴を全て包含し、列挙されていない要素、限定および／または特徴は必須ではないが、他の列挙されていない要素、限定および／または特徴を追加することができ、なお特許範囲の範囲内の構成をなしている。本明細書に開示されている具体的な実施形態は、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の代わりまたは補正としてクローズドエンドの移行句である「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」または「本質的に～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」を用いて特許請求の範囲においてさらに限定されている場合がある。特許請求の範囲で使用されている場合、出願であるか補正による追加であるかに関わらず、「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」というクローズドエンドの移行句は、特許請求の範囲に明示的に列挙されていないあらゆる要素、限定、工程または特徴を排除する。「本質的に～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」というクローズドエンドの移行句は、請求項の範囲を明示的に列挙されている要素、限定、工程および／または特徴ならびに特許請求されている主題の基本的および新規な特性に実質的に影響を与えないあらゆる他の要素、限定、工程および／または特徴に限定する。従って、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」というオープンエンドの移行句の意味は、具体的に列挙されている要素、限定、工程および／または特徴ならびにあらゆる任意のさらなる明記されていないものを全て包含するものとして定義される。「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」というクローズドエンドの移行句の意味は、請求項に具体的に列挙されている要素、限定、工程および／または特徴のみを含むものとして定義されており、「本質的に～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」というクローズドエンドの移行句の意味は、請求項に具体的に列挙されている要素、限定、工程および／または特徴ならびに特許請求されている主題の基本的および新規な特性に実質的に影響を与えない要素、限定、工程および／または特徴のみを含むものとして定義される。従って、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」というオープンエンドの移行句（およびその同等のオープンエンドの移行句）は、その意味の範囲内で限定的事例として、「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」または「本質的に～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」というクローズドエンドの移行句によって指定されている特許請求されている主題を含む。従って、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語句と共に本明細書に記載されているかそのように特許請求されているそのような実施形態は、「本質的に～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」および「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という語句に対して本明細書において明示的または本質的に疑う余地なく記載され、可能であり、かつ支持されている。
【0213】
本明細書で参照および特定されている全ての特許、特許公開公報および他の刊行物の内容全体が、例えば本発明に関連して使用することができるそのような刊行物に記載されている組成物および方法論を記載および開示するために個々に、かつ明確に参照により本明細書に組み込まれる。これらの刊行物は単に本出願の出願日より前のそれらの開示のために提供されている。この点に関してはいずれも、本発明者らが先願発明を理由に、あるいはあらゆる他の理由のために、そのような開示に先行する権利がないということを認めるものとして解釈されるべきではない。これらの文献の日付に関する全ての記載または内容に関する表現は本出願人に利用可能な情報に基づくものであり、これらの文献の日付または内容の正確性に関するいかなる承認も構成するものではない。
【0214】
最後に、本明細書で使用される用語は単に特定の実施形態について記述するためものであり、本発明の範囲を限定するものためのものではなく、本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ定められている。従って本発明は詳細に図示および説明されるものに限定されない。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【配列表】