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▶ インターベット インターナショナル ベー． フェー．の特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-07-01
(45)【発行日】2024-07-09
(54)【発明の名称】プライム－ブーストワクチン接種レジメン
(51)【国際特許分類】
A61K 39/215 20060101AFI20240702BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20240702BHJP
A61K 39/12 20060101ALI20240702BHJP
【ＦＩ】
A61K39/215
A61P31/12 171
A61K39/12
【請求項の数】
11
(21)【出願番号】P 2021535069
(86)(22)【出願日】2019-12-19
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-10
(86)【国際出願番号】 EP2019086305
(87)【国際公開番号】W WO2020127730
(87)【国際公開日】2020-06-25
【審査請求日】2022-06-29
(31)【優先権主張番号】62/782,508
(32)【優先日】2018-12-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】510000976
【氏名又は名称】インターベット インターナショナル ベー． フェー．
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100137213
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 健司
(74)【代理人】
【識別番号】100143823
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 英彦
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100160749
【弁理士】
【氏名又は名称】飯野 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100160255
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100202267
【弁理士】
【氏名又は名称】森山 正浩
(74)【代理人】
【識別番号】100182132
【弁理士】
【氏名又は名称】河野 隆
(74)【代理人】
【識別番号】100146318
【弁理士】
【氏名又は名称】岩瀬 吉和
(74)【代理人】
【識別番号】100127812
【弁理士】
【氏名又は名称】城山 康文
(72)【発明者】
【氏名】ストレート，エリン
(72)【発明者】
【氏名】モグラー，マーク・エー
(72)【発明者】
【氏名】キティクーン，プラビナ
(72)【発明者】
【氏名】セガーズ，ルード・フィリップ・アントン・マリア
(72)【発明者】
【氏名】ファン・デン・ボーン，エルヴィン
【審査官】佐々木 大輔
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２００５／０４６６２１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Archives of Virology，2018年10月26日，Vol.164，pp.359-370
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３９／００－３９／４４
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
標的非ヒト動物をウイルスによる感染または疾患から保護するためのワクチン接種の方法であって、該ウイルスの生弱毒化形態を含むワクチンの該標的非ヒト動物への投与、およびそれに続く
該ウイルス由来の１または複数の抗原をコードするレプリコン粒子（ＲＰ）を含むワクチンの該標的非ヒト動物への投与
を含み、
該ウイルスがニドウイルス目に属する、前記方法。
【請求項2】
標的非ヒト動物がブタである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ウイルスが、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）および豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
ＲＰを含むワクチンが、前記ウイルス由来の１または複数の抗原をコードする少なくとも１つのさらなるＲＰを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
ＲＰによってコードされる少なくとも１つのウイルス抗原が、前記生弱毒化ウイルスの種内の変異体であるウイルス由来である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
ワクチンの１つまたは両方がアジュバントを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
ウイルスによる感染または疾患から標的動物を保護するためのプライム－ブーストワクチン接種レジメンにおいて使用するための該ウイルスの生弱毒化形態を含むワクチンであって、該レジメンが、生弱毒化形態の該ウイルスを含むワクチンによるワクチン接種、およびそれに続く
前記ウイルス由来の１または複数の抗原をコードするＲＰを含むワクチンによるワクチン接種
を含むことを特徴とし、
該ウイルスがニドウイルス目に属する、前記ワクチン。
【請求項8】
ニドウイルス目のウイルスによる感染または疾患から標的動物を保護するためのプライム－ブーストワクチン接種レジメンにおいて使用するための該ウイルス由来の１または複数の抗原をコードするＲＰを含むワクチンであって、該レジメンが、生弱毒化形態の該ウイルスを含むワクチンによるワクチン接種、およびそれに続く
ＲＰを含むワクチンによるワクチン接種
を含むことを特徴とする、前記ワクチン。
【請求項9】
ウイルスによる感染または疾患から標的動物を保護するためのワクチンの製造における該ウイルスの生弱毒化形態の使用であって、該ワクチンがプライム－ブーストワクチン接種レジメンにおいて投与され、かつ前記レジメンが、該ウイルスの生弱毒化形態を含むワクチンの投与、およびそれに続く
前記ウイルス由来の１または複数の抗原をコードするＲＰのワクチンの投与
を含むことを特徴とし、
該ウイルスがニドウイルス目に属する、前記使用。
【請求項10】
ウイルスによる感染または疾患から標的動物を保護するためのワクチンの製造における該ウイルス由来の１または複数の抗原をコードするＲＰの使用であって、該ワクチンがプライム－ブーストワクチン接種レジメンにおいて投与され、かつ前記レジメンが、
該ウイルスの生弱毒化形態を含むワクチンの投与、およびそれに続く
該ＲＰを含むワクチンの投与
を含むことを特徴とし、
該ウイルスがニドウイルス目に属する、前記使用。
【請求項11】
請求項１から６のいずれか１項に記載の標的非ヒト動物をウイルスによる感染または疾患から保護するためのワクチン接種の方法のための、少なくとも２つの容器を備える部品のキットであって、少なくとも１つの容器が請求項１乃至６のいずれか一項において定義された前記ウイルスの生弱毒化形態を含むワクチンを含み、少なくとも１つの容器が請求項１乃至６のいずれか一項において定義された前記ウイルスのウイルス抗原をコードするＲＰを含むワクチンを含み、該ウイルスがニドウイルス目に属する、前記部品のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ワクチン接種の分野に関するものであり、より具体的には、本発明は、ウイルスによって引き起こされる感染または疾患から標的動物を保護するためのワクチン接種の方法に関するものである。
【0002】
病原性ウイルスによる感染症とその結果生じる疾患は文明の始まりから知られており、ヒトと動物の両方に影響を及ぼし、健康と福利にしばしば重大な影響を及ぼす。１８００年代以来、ウイルス感染は能動免疫によって対抗されてきた。このようなワクチン接種は、弱毒化または死滅形態のウイルス病原体の標的動物への投与を含む。弱毒化ウイルスワクチン（別名修飾生ワクチン）は、複製するが比較的無害なウイルスを含み、それによって標的動物におけるその複製によって、対応する病原型のウイルスに対する防御免疫応答を誘導する。
【0003】
ほとんどのウイルスは比較的単純な構造であるため、その抗原プロファイルから単一の抗原を使用すれば、防御免疫応答を生み出すのに十分であることがある。このようなサブユニットワクチンは、ウイルスまたはその培養物からの抽出、または特異的抗原の組換え発現によって製造することができる。あるいは、ベクターとして機能する生きた組換え担体微生物によって、ウイルス抗原を標的動物に送達し、その体内で発現させることもできる。ウイルスベクターの例は、ヒトに使用するためのアデノウイルス、およびニワトリのためのシチメンチョウのヘルペスウイルスである。
【0004】
ウイルスベクターワクチンの使用に関する変動は、レプリコン粒子（ＲＰ）のワクチンの使用である（Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ， ２０１４， Ｖａｃｃｉｎｅｓ， ｖｏｌ． ６， ｐ． ２３９２－２４１５参照）。これらはウイルス様粒子であるが、欠陥ウイルスゲノム、および典型的には異種遺伝子を含む。これらのレプリコン粒子は、標的動物宿主細胞に入り、新しい粒子を形成する能力なしに１ラウンドのウイルスゲノム増幅を行うことができるように、粒子中にパッケージされたＲＮＡ （すなわち、それらはカプシド形成されている）を含む。レプリコン粒子は、必要な構造タンパク質コード配列を欠いているので、感染細胞からは増殖しない。そのため、裸のＲＮＡワクチン等の他のレプリコンワクチン、又はＤＮＡプラスミドからのＲＮＡを含むワクチンよりも、野生型ウイルスにより類似している（Ｈｉｋｋｅ， ２０１７、Ａｎｕ． Ｒｅｖ． Ａｎｉｍ． Ｂｉｏｓｃｉ． ２０１７， ５； １０．１－１０．２１）。ＲＰのゲノムは、典型的には、免疫防御抗原をコードする異種遺伝子を発現する。ＲＰの製造には、プラス鎖フラビウイルス科、ピコルナウイルス科およびアルテリウイルス科のメンバーのような複数のＲＮＡウイルス、またはブニヤウイルス、パラミクソウイルスおよびラブドウイルスのようなマイナス鎖ＲＮＡウイルスが使用されている。最も広く使用され、最も広く研究されているのは、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子（Ｖａｎｄｅｒ Ｖｅｅｎら、２０１２、Ａｎｉｍ． Ｈｅａｌｔｈ． Ｒｅｓ． Ｒｅｖ．、ｖｏｌ． １３、ｐ． １－９；および： Ｋａｍｒｕｄら、２０１０、Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．、ｖｏｌ． ９１、ｐ． １７２３－１７２７）であり、また、アルファウイルスＲＰは、ブニヤウイルスのような他のウイルスに基づく当該技術分野で知られている他のＲＰワクチンよりも幾分強力な免疫増強体であると考えられている。いくつかのアルファウイルス種、例えば、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ） （Ｐｕｓｈｋｏら、１９９７、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ． ２３９、ｐ． ３８９－４０１）、シンドビスウイルス（Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら、１９９３、Ｊ． ｏｆ Ｖｉｒｏｌ． ｖｏｌ． ６７、ｐ． ６４３９－６４４６）、およびセムリキ森林ウイルス（Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ ＆ Ｇａｒｏｆｆ， １９
９１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （ＮＹ）、ｖｏｌ．９， ｐ． ｐ． １３５６１３６１）がＲＰワクチンの開発に使用されている。
９１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （ＮＹ）、ｖｏｌ．９， ｐ． ｐ． １３５６１３６１）がＲＰワクチンの開発に使用されている。
【0005】
ＲＰワクチンは、標的動物の免疫化後に粘膜および全身の免疫応答を誘発することができる（Ｄａｖｉｓら、２００２、ＩＵＢＭＢ Ｌｉｆｅ、ｖｏｌ．５３、ｐ．２０９－２１１）。ＲＰワクチン（ＶＥＥベース）は、いくつかのＵＳＤＡライセンスワクチンの基礎でもある。このワクチンには以下が含まれる：ポルシンエピデミックジアレアワクチン、ＲＮＡ （製品コード１９Ｕ５．Ｐ１）、ブタインフルエンザワクチン、ＲＮＡ（製品コード１９Ａ５．Ｄ０）、トリインフルエンザワクチン、ＲＮＡ （製品コード１９Ｏ５．Ｄ０）、および処方製品、ＲＮＡ粒子（製品コード９ＰＰ０．００）。また： Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１８， Ｖａｃｃｉｎｅ， ｖｏｌ．３６， ｐ． ｐ． ６８３－６９０。
【0006】
不活化ワクチンおよびサブユニットワクチンでは、最適な効果を得るために免疫賦活剤を用いることが一般的である。賦形剤として、このようなアジュバントは、薬学的に許容可能であり、費用効果的である必要がある。周知のアジュバントはアルミニウム塩および油である。油性アジュバントは、鉱物または非鉱物起源であり得るが、鉱物油は、一般的に獣医学的使用のためにのみ許可される。
【0007】
獣医学診療において、ワクチン接種は、生きた家畜またはコンパニオン動物に日常的に行われる。畜産部門では、手術の経済性が重要な懸念事項である。なぜなら、一般的に、手術件数の多い低マージン手術であるからである。したがって、家畜飼育のためのワクチン接種は効果的であり、手頃な価格である必要がある。したがって、強力な免疫防御を達成するために接種する必要のあるワクチン接種の回数、および得られる防御の幅に関してその効果が認められる。この最後の側面は、ウイルスが迅速に突然変異し、新たな変異体として出現する可能性があるため、ウイルスワクチンにとって特に重要である。その結果、確立されたウイルスワクチン製品は、時間とともに有効性を失う可能性がある。
【0008】
したがって、動物ワクチン接種の分野では、有効性と防御の幅の観点からウイルスワクチン接種の最適化が常に重要視される。
【0009】
ワクチン接種の有効性を向上させるための周知の実践は、ワクチンを複数回投与することである。このような反復接種の場合、通常、初回接種は、プライムワクチン接種と呼ばれ、その後の接種は、ブースターワクチン接種と呼ばれる。このようなプライム－ブーストワクチン接種レジメンでは、同一のワクチン製剤を用いて２回以上の接種が可能であり、この場合、同種のプライム－ブーストワクチン接種レジメンと呼ばれる。例えば、ウイルスの生弱毒化形態を含むワクチン、または不活化ウイルスを含むワクチンの２回以上の投与である。あるいは、ワクチン接種は、同じ病原体または疾患に対して防御するために意図された異なるワクチン製品を用いて行うことができる。その場合、これは異種プライム－ブーストワクチン接種レジメンである。総説は： Ｋａｒｄａｎｉら、２０１６年（Ｖａｃｃｉｎｅ、ｖｏｌ．３４、ｐ．４１３－４２３）であり、これは、異種プライム－ブーストワクチン接種レジメンの大部分が、プライミングワクチンとウイルスの生弱毒化形態を含むワクチンの組合せを適用し、しばらく後に、不活化ウイルスを含むワクチンによる１回以上のブースターを適用することを記載している。
【0010】
コロナウイルスであるブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）は、１９７１年に英国の給餌ブタおよび肥育ブタの間で最初に観察された；これらはＣＶ７７７のような「古典的」株である。その後、２０１０年にアジアで高病原性ＰＥＤＶ株の集団発生が出現し、高い死亡率を引き起こしており、現在、ＰＥＤＶはアジアの養豚業に大きな経済的損失を与える主な病原体の１つである。アジア様ＰＥＤＶ株は２０１３年４月にアメリカ合衆国で検出され、カナダと南アメリカに広がっている。
【0011】
ブタでは、疾患の重症度は様々で、群れの疫学的状態に依存する。特に哺乳ブタは非常に感受性が高く、典型的には水様性下痢、脱水、および高い死亡率を伴う代謝性アシドーシスを呈する。一方、飼養豚と育成ブタは、下痢、食欲不振、うつ状態を呈し、罹患率は高いが、死亡率は低い。
【0012】
ＰＥＤＶに対するワクチンは、生＋不活化ワクチンの異種プライム－ブーストワクチン接種レジメンへの適用についても記載されている。ＷＯ ２０１６／００７５７６、およびＷＯ ２０１６／００７９５５を参照のこと。しかし、２ｘ不活化ＰＥＤＶワクチンの同種プライム－ブーストレジメンは非常に効果的であると記述された： Ｐａｕｄｅｌ ｅｔ ａｌ．， ２０１４（Ｖｅｔ． Ｑｕａｒｔ．， ｖｏｌ． ３４， ｐ． １９４－２００）。
【0013】
アルテリウイルスである豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）は１９８７年に初めて報告され、１９９０年代初頭にはパンデミックとなった。このウイルスは繁殖障害および発育遅延により養豚業に重大な損失を引き起こす。ＰＲＲＳＶは多因子性ブタ呼吸器疾患の発生に重要な役割を果たしている。臨床症状は、流産および死産またはミイラ変性胎児、ならびに耳および外陰部のチアノーゼである。新生ブタおよび離乳ブタでは、このウイルスは呼吸窮迫を引き起こし、二次呼吸器感染に対する感受性が増大する。しかし、不顕性感染もよくみられる。また、このウイルスは非常に多様である：記載された種の２つの異なる変異体：遺伝子型１（以前はヨーロッパ型として知られていた）と遺伝子型２（以前は北アメリカ型として知られていた）があり、これら２つの遺伝子型内の株の分岐は大きい。
【0014】
不活化ウイルスに基づくＰＲＲＳＶに対するワクチンが記載されており、市販されている。しかし、生弱毒化ウイルスに基づくワクチンの方が有効であると考えられている。例えば： Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（商標） ＰＲＲＳ （ＭＳＤ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ社）、Ｉｎｇｅｌｖａｃ ＰＲＲＳ（商標） ＭＬＶ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ社）、Ｆｏｓｔｅｒａ（商標） ＰＲＲＳ （Ｚｏｅｔｉｓ社）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0015】
【文献】ＷＯ ２０１６／００７５７６
【文献】ＷＯ ２０１６／００７９５５
【非特許文献】
【0016】
【文献】Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ， ２０１４， Ｖａｃｃｉｎｅｓ， ｖｏｌ． ６， ｐ． ２３９２－２４１５
【文献】Ｈｉｋｋｅ， ２０１７、Ａｎｕ． Ｒｅｖ． Ａｎｉｍ． Ｂｉｏｓｃｉ． ２０１７， ５； １０．１－１０．２１
【文献】Ｖａｎｄｅｒ Ｖｅｅｎら、２０１２、Ａｎｉｍ． Ｈｅａｌｔｈ． Ｒｅｓ． Ｒｅｖ．、ｖｏｌ． １３、ｐ． １－９
【文献】Ｋａｍｒｕｄら、２０１０、Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．、ｖｏｌ． ９１、ｐ． １７２３－１７２７
【文献】Ｐｕｓｈｋｏら、１９９７、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ． ２３９、ｐ． ３８９－４０１
【文献】Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら、１９９３、Ｊ． ｏｆ Ｖｉｒｏｌ． ｖｏｌ． ６７、ｐ． ６４３９－６４４６
【文献】Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ ＆ Ｇａｒｏｆｆ， １９９１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （ＮＹ）、ｖｏｌ．９， ｐ． ｐ． １３５６１３６１
【文献】Ｄａｖｉｓら、２００２、ＩＵＢＭＢ Ｌｉｆｅ、ｖｏｌ．５３、ｐ．２０９－２１１
【文献】Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１８， Ｖａｃｃｉｎｅ， ｖｏｌ．３６， ｐ． ｐ． ６８３－６９０
【文献】Ｋａｒｄａｎｉら、２０１６年（Ｖａｃｃｉｎｅ、ｖｏｌ．３４、ｐ．４１３－４２３
【文献】Ｐａｕｄｅｌ ｅｔ ａｌ．， ２０１４（Ｖｅｔ． Ｑｕａｒｔ．， ｖｏｌ． ３４， ｐ． １９４－２００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0017】
先行技術における不利益を克服し、ウイルス性病原体によって引き起こされる感染または疾患に対するワクチンの免疫防御を向上させることができるワクチン接種レジメンを提供することにより、現場のニーズに対応することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【0018】
驚くべきことに、ウイルスの生弱毒化形態を含むワクチンおよび異種ウイルス抗原をコードするＲＰを含むワクチンを用いる異種プライム－ブーストワクチン接種レジメンを適用することによって、この目的を達することができ、結果的に、従来技術の１つ以上の欠点を克服することができることが分かった。これらの２つのワクチンを特定の順序で標的動物に投与した場合、標的動物における結果としての免疫応答は、個々のワクチンのいずれかからの応答と比較して、改善された強度および／または幅を有することが見出された。
【0019】
注目すべきことに、これらのワクチンを逆順に投与した場合、または２種類のワクチンのいずれかを同種プライム－ブーストレジメンで反復投与した場合では、この改善は観察されなかった。
【0020】
どのようにして、また、いかなる理由によって、このようなワクチンタイプの選択、およびこの併用レジメンでのそれらの投与、およびこの特定の順番で、この改善を引き起こすことができるのかは正確にはわかっていない。発明者らは、これらの知見を説明し得るいかなる理論またはモデルによっても拘束されたくないが、免疫応答の高さおよび／または幅の増加の形態の観察された改善は、生弱毒化ウイルスによるプライムワクチン接種が、例えば先天性免疫応答を含む完全なまたは少なくとも精巧な免疫応答の一式を開始することができ、そのために、ＲＰによるブースターワクチン接種が、（適切にプライミングされた免疫系）に対してより良く応答し、生ワクチンにおいては無効な遺伝子に基づいて、このワクチン接種を安全なものにすることさえも可能であると推測している。ＲＰワクチンによるプライミングは、ＲＰの感染性が低い／免疫増強性が低い性質のため、しばしば中等度の免疫応答しか与えない。このように、本スキームは、比較的安全な（しかし、それほど有効ではないかもしれない）生ワクチンで良好な免疫応答を適切に開始し、一方、安全性の理由から生ワクチン中には存在しない遺伝子（すなわち、対応するタンパク質）および／または他の遺伝子に対する良好な免疫応答を可能にするという利点を提供する。このことは、現在の計画は、免疫系を十分に刺激するために生ワクチンを必要としているが、それ自体に（安全な）生ワクチンを使用すること（ワンショット、又はマルチショットワクチンのいずれかとして）によって、その病原体に対する最良の可能な程度の防御をもたらさない病原体に対して特に有利であると考えられる。このような病原体の例としては、例えば、ブタ病原体ＰＲＲＳｖ、ＰＥＤＶ、ＡＳＦ （アフリカブタコレラ）などが考えられる。
【0021】
免疫応答に対するこの改善の発見は、いくつかの方法で有利に使用することができ、例えば、生弱毒化型ウイルスを含むワクチンによるワクチン接種から免疫応答の強さまたは開始を増加させることができる。あるいは、例えばアルファウイルスＲＮＡベースのレプリコン粒子のような、ＲＰを含むワクチンの免疫応答の幅を増加させることができる。いずれの場合も、単一ワクチンのいずれかを反復投与した場合にも適用される。
【0022】
また、プライミングワクチン接種で使用されるウイルス種の変種由来の１つ以上の抗原をコードするＲＰをブースター接種として投与することにより、ウイルスの生弱毒化形態を含むワクチン、またはＲＰを含むワクチンのいずれかによるワクチン接種からの免疫応答を広げることに適用することができる。また、ブースター接種では、複数の種類のＲＰを使用することができる。これは、ウイルスの変異体に対しても、より広い範囲の免疫防御を提供するのに役立つ。さらに、このことは、現在野外にいる病原性ウイルスが、生弱毒化ウイルスを含むワクチンからの免疫応答を逃れるようにさせるであろう突然変異を受けた場合であっても、生弱毒化ウイルスを含む認可ワクチンからの防御を保持するのに役立つ。
【0023】
さらなる利点は、ＲＰワクチンがかなり迅速に生成され得ることであり、これは、本発明に係るワクチン接種方法の設計に柔軟性を付加する。
【0024】
これらはすべて、本発明によって可能にされたワクチン接種の分野に大きな利益をもたらす有利な使用である。
【0025】
ＲＰを含むワクチンはかなり最近になって記述されただけであり、本発明のワクチン接種スキームを使用する異種プライム－ブーストワクチン接種レジメンはまだ開示されていないので、これは先行技術におけるいかなる開示からも自明なものではない。そのため、本発明のワクチン接種方法を適用することにより、このような免疫応答の改善が起こり得ることを期待する表示はなかった。したがって、発明者らにより、これらの特定のワクチンタイプを選択すること；またはこれらのワクチンタイプをプライム－ブーストワクチン接種レジメンに適用すること；またはこれらのワクチンタイプをこのような特定の順序でワクチン接種レジメンに適用することは提案されてこなかった。
【0026】
したがって、一態様では、本発明は、ウイルスによって引き起こされる感染または疾患から標的動物を保護するためのワクチン接種の方法に関するものであって、ここでの方法は、以下を含む
該ウイルスの生弱毒化形態を含むワクチンの前記標的動物への投与、次いで
前記ウイルス由来の１以上の抗原をコードするレプリコン粒子（ＲＰ）を含むワクチンの前記標的動物への投与。
該ウイルスの生弱毒化形態を含むワクチンの前記標的動物への投与、次いで
前記ウイルス由来の１以上の抗原をコードするレプリコン粒子（ＲＰ）を含むワクチンの前記標的動物への投与。
【0027】
「ワクチン接種の方法」とは、特定の病原体、ここではある種のウイルスに対するプライム－ブーストワクチン接種計画のような、予定されたワクチン接種を伴う手順を意味する。
【0028】
したがって、「プライミング（priming）」および「ブースター(booster)」または「ブースティング(boosting)」としても知られる用語「プライム(prime)」および「ブースト(boost)」は、本発明によるワクチン接種の方法において適用されるワクチン接種を指すために使用され得、ここで、プライム、またはプライミングは、そのウイルスに対する標的動物のより早期のワクチン接種であり、ブースト、ブースター、またはブースティングが、その後に適用されるそのウイルスに対するワクチン接種である。プライム接種とブースター接種のいずれかを１回以上行うことができる。
【0029】
本発明によるワクチン接種方法の複数回のワクチン接種は、標的動物の免疫系がプライミングワクチン接種に対する応答を開始するのに十分な期間によって時間的に分離される。この期間は、例えば、約１週間から長年まで、非常に多様であり得る。これは、ワクチン接種を受けているウイルスおよび／またはその疾患の特性によって決定される。また、この間隔は、対象動物の寿命など、対象動物の特性によって決まる。
【0030】
本発明の「標的動物」は、ヒトまたは非ヒト動物である。標的動物は、ワクチン接種の方法が防御しようとするウイルスによって引き起こされる感染または疾患に対するワクチン接種を必要とするか、またはその恩恵を受けることができる。
【0031】
健康な対象動物にワクチンを接種すること、および、生後できるだけ早くワクチン接種することが明らかに有利であるが、ワクチン接種対象動物の年齢、体重、性別、免疫学的状態その他のパラメータは、重要ではない。
【0032】
本発明のワクチン接種方法により、標的動物はそのライフサイクルの１または複数のステージにおいて防御が可能であり、例えば、保護的初乳を介した哺乳新生児として、生後初期の乳児として、屠殺のために飼育または肥育されている成長中の動物として、授乳中の仔に初乳を提供できる妊娠中の母親として、免疫系の強度が低下している高齢の標的動物として、防御が可能である。
【0033】
ここで使用される用語「含む（comprises）」（および、その派生語、含む（comprise）、含んでいる（comprising）および含まれた（comprised））は、この用語が使用される文章、パラグラフ、クレーム等にカバーされるか、または含まれる全ての要素に言及するものであり、仮にこれらの要素または組合せが明示的に記載されていなくとも全ての要素に言及するものであり、また、これらの要素または組合せの排除に言及するものではない。したがって、本文セクション、クレーム等は、用語が「から成る（consist of）」、「から成る(consisting of)」、又は「本質的に構成される」等の用語に置き換えられる、１つ以上の実施形態にも関連することができる。
【0034】
標的動物への本発明によるワクチン接種方法のワクチンの「投与」は、任意の実行可能な方法および経路を用いて行うことができる。典型的には、最適な投与方法は、適用されるワクチンの種類、およびそれが防御することを意図している標的動物およびウイルス性疾患の特徴によって決定されるであろう。例えば、生弱毒化ウイルスを含むワクチンは複製抗原を含むので、飲料水又はスプレー適用のような大量適用の方法を用いて投与することができる。代わりに、ウイルスの生弱毒化形態を含むワクチン、および非経口、粘膜、局所または経腸投与のいくつかの経路を含むワクチンの両方が可能である。これはすべて当技術分野でよく知られており、「獣医学ワクシノロジー」（Ｐ． Ｐａｓｔｏｒｅｔ ａｌ． ｅｄ．， １９９７， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， ＩＳＢＮ ０４４４８１９６８１）などを参照されたい。
【0035】
「ワクチン」は、医学的効果を有し、免疫学的に活性な成分および医薬的に許容可能な担体を含む周知の組成物である。担体は、液体または（粒状）固体であり得る。それぞれのワクチンにおける本発明の「免疫学的に活性な成分」は、生きた弱毒化形態のウイルス、またはウイルス抗原をコードするＲＰである。ワクチンは標的動物の免疫系を刺激し、免疫学的応答を誘導する。反応は、標的動物の先天性および／または獲得免疫系に由来し得、細胞型および／または体液型であり得る。
【0036】
本発明によるワクチン接種方法におけるワクチンは、ワクチン接種された動物において、本発明に係るウイルスによるその後の感染の重症度を減少させることにより、「防御」を提供するか、または、「感染または疾患から防御する」。例えば、標的動物におけるウイルス複製の数または期間を減少させること、または感染によって引き起こされる病変の数、強度、または重症度を短縮または減少させることによる。また、またはその結果として、ワクチン接種の方法は、そのような感染もしくは複製によって、またはその感染もしくは複製に対する標的動物の応答によって引き起こされ得る疾患の（臨床的）症状を減少もしくは改善するのに有効である。同様に、ワクチン接種の方法は、初乳の摂取、または卵黄の吸収からのような、母体由来の抗体によって提供される受動免疫によって、ワクチン接種された標的動物の子孫に対する防御を提供する。
【0037】
ワクチンの効力は、例えば、ワクチン接種およびチャレンジ感染後の免疫学的応答をモニタリングすることによって、例えば、標的動物の疾患の徴候、臨床スコアをモニタリングすることによって、またはウイルス病原体の再単離によって、およびこれらの結果を、模擬ワクチン接種された標的動物に見られるワクチン接種－チャレンジ応答と比較することによって決定することができる。
【0038】
本発明によるワクチン接種方法におけるワクチンについては、免疫学的に活性な成分の用量または量をよく知られた方法で決定することができ、例えば、動物、受精卵、または培養中の適当な宿主細胞において、生弱毒化ウイルスまたはＲＰを力価測定することができる。その結果は、例えば、プラーク形成単位（ｐｆｕ）、ワクチン１ｍＬ当たりのＴＣＩＤ５０またはＥＩＤ５０、またはＲＰ／ｍｌの数で表される。代わりに、抗原は、ＥＬＩＳＡまたはＡｌｐｈａＬｉｓａ（商標）のような血清学的または生化学的試験によって定量化され、適切な参照標準と比較して、相対単位で表すことができる。これらはいずれも当技術分野ではよく知られている。
【0039】
本発明によるワクチン接種の方法は、予防的、メタフィラキシー的、または治療的処置として用いることができる。
【0040】
本発明の「ウイルス」とは、本発明のためのある種のウイルス種を意味する。一般的に、ウイルス種は決定され、分類学的には、形態、核酸型、複製様式、宿主生物、ならびにウイルスが引き起こす可能性のある疾患の種類などの表現型の特徴の組み合わせによって分類学的に特徴づけられる。
【0041】
ウイルスの生弱毒化形態を含むワクチン、および本発明に係るワクチン接種方法で使用されるＲＰを含むワクチンは、生ワクチンがそのウイルス種の弱毒化形態を含み、ＲＰがそのウイルス種由来の少なくとも１つの抗原タンパク質をコードするという点で、いずれも本発明に対するウイルスに関するものである。
【0042】
当業者が理解するように、ここで使用する分類学的名称、例えばウイルスの種名は、現在微生物が割り当てられている分類学的グループを意味する。しかし、新しい洞察が新しい分類群または異なる分類群への再分類につながる可能性があるため、分類学的分類が時間的に変化する可能性がある。しかし、これは微生物そのもの、又はその抗原レパートリーを変化させるものではなく、その科学名又は分類を変化させるのみであるため、そのように再分類された微生物は、発明の範囲内に留まる。
【0043】
本発明に対するウイルス種への言及には、例えば、その種内の血清型、生物型、病原型、又は遺伝子型の変異に関して、そのウイルス種内の任意のウイルスを含む。ウイルスや病気に関する情報は、例えば、Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ６ｔｈ ｅｄ．， ＩＳＢＮ： ９７８１４５１１０５６３６、および”Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｍａｎｕａｌ”， １０ｔｈ ｅｄ．， ２０１０， Ｃ．Ｍ． Ｋａｈｎ ｅｄｔ．， ＩＳＢＮ： ０９１１９１０９３Ｘといったハンドブックから入手できる。
【0044】
ある種のウイルス種の生弱毒化ウイルスは、いくつかの方法で得ることができ、多くのヒトまたは動物のウイルス性疾患については、そのようなウイルスの生弱毒化ウイルスがすでに入手可能である。生弱毒化ウイルスの認可ワクチンの例は、ヒトの医学分野でも獣医学分野でも言及するには数が多すぎる。これらは、本発明によるワクチン接種の方法に適用することができる。当業者は、ウイルスの生弱毒化形態を含むワクチンを本願発明のワクチン接種方法に組み込むことができるか、また、どのように組み込むことができるかを十分に評価することが可能であり、さらに、適宜、慣例の改変や最適化を行うことができる。前出のＰ． Ｐａｓｔｏｒｅｔ ａｌ．参照。
【0045】
あるいは、ある種のウイルス種の病原性または弱毒化形態は、様々な起源、例えば、野生または農場の生物からの野外分離株として、または様々な研究所、（寄託）機関、または（獣医）大学から得ることができる。弱毒型のウイルスが入手できない場合には、その病原性型のウイルスを、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで継代するか、化学的または物理的突然変異誘発などのｉｎ ｖｉｔｒｏ技術、あるいは組換えＤＮＡ技術を用いるなどにより、その弱毒化の方法に供することができる。その後、減弱のレベルをｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで評価することができる。これはすべてこの分野でよく知られている。
【0046】
「アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子（ＲＰ）」は、単一サイクルの感染性アルファウイルス構造としてよく知られている。これは、そのゲノムに構造タンパク質遺伝子が存在しないために複製が欠損している。ゲノムは、その２６Ｓサブゲノムプロモーターからの異種遺伝子をコードすることができる。ＲＰは１回の複製を行うことができ、このようにして異種抗原を標的動物の免疫系に運び、発現させる。
【0047】
本発明については、ＲＰがコードする遺伝子は、典型的には、レプリコン構造が由来した親ウイルスの種に対して異種性（すなわち、天然ではない）である遺伝子である。
【0048】
市販のアルファウイルス ＲＮＡ ＲＰワクチンのように、ある種のウイルス種の異種ウイルス遺伝子をコードするＲＰがすでに入手できる可能性がある。あるいは、例えばＴＣ－８３ ＶＥＥ アルファウイルス由来のようなウイルスレプリコン骨格に免疫防御抗原をコードする異種核酸を組み込むことにより、周知の技術を用いて作製することができる。次いで、ウイルス抗原遺伝子を（２６Ｓアルファウイルス）サブゲノムプロモーターから発現させることができ、転写されたレプリコンＲＮＡを、パッケージング細胞系によって、またはレプリコンＲＮＡの適当な宿主細胞への共トランスフェクションによって、および構造タンパク質をコードする１つ以上の「ヘルパー」ＲＮＡの発現によって、ＲＰにパッケージすることができる。ＶＥＥ ＴＣ－８３ ＲＮＡレプリコン粒子の生成は、例えばＵＳ ９，４４１，２４７およびＵＳ ８，４６０，９１３に記載されている。クローニング、トランスフェクション、組換え、選択、および増幅を含む一般的な分子生物学的技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ： ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ” （２００１， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ； ＩＳＢＮ： ０８７９６９５７７３）； Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ： Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｊ． Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．， ＮＹ， ２００３， ＩＳＢＮ： ０４７１５０３３８Ｘ）； Ｃ． Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ ＆ Ｇ． Ｄｖｅｋｓｌｅｒ： ”ＰＣＲｐｒｉｍｅｒｓ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ”（ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ， ＩＳＢＮ ０８７９６５４０）； ａｎｄ “ＰＣＲ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”， ｂｙ ： Ｊ． Ｂａｒｔｌｅｔｔ ａｎｄ Ｄ． Ｓｔｉｒｌｉｎｇ （Ｈｕｍａｎａ ｐｒｅｓｓ， ＩＳＢＮ： ０８９６０３６４２１）などの標準的なテキストに詳細に説明されている。
【0049】
ＲＰを含むワクチンは、選択されたウイルス種に対する既存のワクチンであり得る。代わりに、このようなＲＰワクチンは、周知の技術を用いて、既存のまたは新たに製造されたＲＰから開発することができる。
【0050】
本発明のＲＰは、本発明のウイルス種由来の「１つ以上の抗原をコードする」ものである。これはいくつかの方法で達成できる。例えば、そのようなＲＰは、ポリシストロン性リーディングフレームをコードすることができ、または、サブゲノムプロモーターの１つ以上の追加コピーを使用して別々の遺伝子をコードすることで別々のタンパク質の発現が可能となる。
【0051】
代替的に、または追加的に、本発明のＲＰを含むワクチンは、１種類以上のＲＰ、例えば、それぞれをコードする１種類以上の異種抗原を含むことができる。
【0052】
本発明のＲＰによってコードされる異種抗原は、本発明のためのウイルス種由来であり、それにより、「由来」という用語は、その抗原をコードする核酸が、その種からのウイルスを起源とすることを示す。核酸は、ウイルス試料またはその一部から得られたものであってもよく、またはそのウイルス由来の配列情報に基づいて合成されたものであってもよい。続いて、コードされている核酸配列が、発現されたタンパク質抗原のアミノ酸配列の改変、切断、および／または延長をもたらすように遺伝的に操作されたものであってもよい。
【図面の簡単な説明】
【0053】
【発明を実施するための形態】
【0054】
本発明の実施形態およびさらなる局面の詳細を以下に記載する。
【0055】
本発明によるワクチン接種の方法は、その構成要素の比較的低い価格、その使用の容易さ、およびそれが誘導し得る増加および／または広範な免疫応答のために、獣医診療において特に有用である。
【0056】
したがって、本発明によるワクチン接種方法の実施形態において、標的動物は、獣医学的関連性のある（ヒト以外の）動物である。好ましくは、獣医学的関連性のある動物は、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマおよびトリから選択される動物である。より好ましくは、動物は、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、およびトリから選択される。さらに好ましくは、動物は、ブタ、イヌ、ネコ、およびトリから選択される。さらに好ましくは、動物はブタおよびトリから選択される。最も好ましい動物はブタである。
【0057】
本発明によるワクチン接種方法の一実施形態において、ウイルスは獣医学的慣行に関連するウイルスである。好ましくは、ウイルスは動物病原体である。より好ましくは、ウイルスは、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、およびトリから選択される動物の病原体である。より好ましくは、ウイルスは、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、およびトリから選択される動物の病原体である。さらに好ましくは、ウイルスは、ブタ、イヌ、ネコ、およびトリから選択される動物の病原体である。さらに好ましくは、ウイルスは、ブタおよびトリから選択された動物の病原体である。最も好ましいウイルスはブタの病原体である。
【0058】
本発明では、「ブタ」は、イノシシ科の動物を指し、好ましくはイノシシ属の動物、例えば、野生または家畜ブタ、イノシシ、バビルサ、またはワルトを指す。これには、雌ブタ、イノシシ、ブタ、離乳ブタ、仕上げブタ（finisher pig）、肥育ブタ、給餌ブタ、または（哺乳）子ブタのような、性別、年齢、または大きさを指す任意の名称によって示されるブタも含まれる。
【0059】
標的動物がブタである本発明によるワクチン接種方法の実施形態において、ブタは、好ましくは、雌ブタ、哺乳子ブタ、仕上げブタ、給餌ブタ、および肥育ブタから選択される。
【0060】
ウイルスがブタの病原体である本発明によるワクチン接種方法の一実施形態において、ウイルスは、ブタ流行性下痢ウイルス、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ブタサーコウイルス、ブタパルボウイルス、ブタコレラウイルス、アフリカブタコレラウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタ呼吸器コロナウイルス、口蹄疫ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ブタサイトメガロウイルス、ブタロタウイルス、ブタポックスウイルス、および水疱性口内炎ウイルスから選択されることが好ましい。
【0061】
ウイルスがブタの病原体である本発明によるワクチン接種方法の実施形態において、ウイルスは、好ましくはニドウイルス目内の種のものである。より好ましくは、このウイルスは、アルテリウイルス科またはコロナウイルス科内の種のものである。さらに好ましくは、ウイルスはＰＥＤＶまたはＰＲＲＳＶ種のものである。
【0062】
本発明によるワクチン接種方法の実施形態において、ウイルスはＰＥＤＶであり、ＲＰはＰＥＤＶスパイク蛋白質をコードする。
【0063】
本発明によるワクチン接種方法の実施形態において、ウイルスはＰＲＲＳＶであり、ＲＰはＰＲＲＳＶ ＧＰ５タンパク質（糖タンパク質５、別称、主要エンベロープタンパク質、またはＯＲＦ ５タンパク質）をコードする。
【0064】
ウイルスがＰＥＤＶである本発明によるワクチン接種方法の一実施形態では、標的動物は妊娠ブタである。
【0065】
ウイルスがＰＲＲＳＶである本発明によるワクチン接種方法の実施形態では、標的動物はブタである。ブタは出生日以降、任意の年齢のものでよい。そのブタは妊娠中の雌ブタであり得る。
【0066】
本発明によるワクチン接種の方法については、ワクチンおよび標的動物の特性に適合する方法でワクチン接種を適用する。
【0067】
したがって、本発明によるワクチン接種方法の実施形態において、ウイルスの生弱毒化形態を含むワクチンは、粘膜経路によって投与される。好ましくは、粘膜投与は、飲水、スプレー、点眼剤、鼻腔内、または経口経路による。
【0068】
本発明によるワクチン接種方法の実施形態において、ウイルスがＰＲＲＳＶである場合、ＰＲＲＳＶの生弱毒化形態を含むワクチンは、非経口経路、より好ましくは、筋肉内、皮内または皮下経路によって投与される。
【0069】
本発明によるワクチン接種方法の一実施形態において、ＲＰを含むワクチンは、非経口経路により、皮膚への注射または経皮的に投与される。好ましくは、非経口投与は、筋肉内、静脈内、腹腔内、皮内、粘膜下、または皮下である。より好ましい非経口投与経路は、筋肉内、皮内、または皮下経路による。
【0070】
本発明によるワクチン接種方法のスケジュールは、標的動物に対するストレスを減少させ、そして労働コストを減少させるために、標的動物が必要とし得る他のワクチンの既存のワクチン接種スケジュールに統合されることが好ましい。これらの他のワクチンは、それらの登録された使用と適合する方法で、同時、同時または連続的に投与することができる。
【0071】
本発明に係るワクチン接種方法のためのプライム及びブーストワクチン接種は、免疫学的に有効であり、かつ対象動物に受け入れ可能な用量及び容量で投与される。
【0072】
標的動物投与当たりの生弱毒化ウイルスの用量は、１０～１ｘ１０８感染性ウイルスの間であることが好ましく、これは、ｐｆｕ、ＴＣＩＤ５０又はＥＩＤ５０で測定され得る。
【0073】
標的動物投与当たりのＲＰの用量は、好ましくは１×１０２～１×１０１２ＲＰの間である。これらはＴＣＩＤ５０またはＲＰ／ｍｌで測定できる。
【0074】
投与されるワクチン接種量は、標的動物投与当たり０．０１～１０ｍｌの間である。
これはすべて当技術分野でよく知られている。
これはすべて当技術分野でよく知られている。
【0075】
本発明については、引用されている範囲には、記載されているエンドポイントも含まれている。
【0076】
示されるように、本発明によるワクチン接種の方法は、ＲＰによるブースターワクチン接種が、プライミングワクチン接種に使用される生弱毒化ウイルスの種内の変異体であるウイルス由来の抗原をコードする場合、これが標的動物の免疫応答を広げるので、特に有利である。
【0077】
したがって、本発明によるワクチン接種方法の実施形態において、ＲＰによってコードされる少なくとも１つのウイルス抗原は、生弱毒化ウイルスの種内の変異体であるウイルス由来である。
【0078】
本発明について、用語「変異体」は、本発明によるワクチン接種の方法が保護を目的とするウイルスの種に対して使用される。このような変異体は、プライミングワクチン接種のために弱毒化された形態で使用されるウイルスと同じ種のウイルスであるが、同一のウイルスではないウイルスである。この文脈において、「同じではない」は、例えば、変異体ウイルスが異なる株または分離株由来である場合、または、その血清型、生物型、病原型、および／または遺伝子型に関して変異体ウイルスが異なる場合など、より顕著な差異を参照することができる。この差異はまた、ＲＰによってコードされる異種遺伝子の１つまたはそれ以上の遺伝子操作に起因する可能性がある。
【0079】
記載のように、この点で非常に有利なのは、ＲＰブースターワクチンにおける、ＲＰの異なるタイプの使用、例えば、本発明のためのウイルス種の複数の抗原をコードするＲＰの使用、または、２以上のタイプのRP、例えば、それぞれが本発明のためのウイルスの異なる抗原をコードするタイプ、それぞれが同じ抗原であるが異なったウイルスの変異体由来の抗原をコードするタイプ、もしくは、それぞれが複数の異種抗原をコードするタイプの使用である。
【0080】
したがって、本発明によるワクチン接種方法の実施形態において、ＲＰを含むワクチンは、本発明のウイルス種の２以上の抗原をコードするＲＰを含む。
【0081】
本発明によるワクチン接種方法の実施形態において、ＲＰを含むワクチンは、本発明のためのウイルス種由来の１以上の抗原をコードする少なくとも１つのさらなるＲＰを含む。好ましくは、異なるＲＰは、本発明のためのウイルス種の異なる抗原をコードする。代わりに、又は追加的に、ＲＰは、本発明のためのウイルス種内の変異体由来であるが、同一の抗原をコードする。
【0082】
本発明によるワクチン接種方法の実施形態において、ワクチンの１つまたは両方は、さらなる免疫刺激性化合物を含む。
【0083】
好ましくは、さらなる免疫刺激化合物は、サイトカイン、非メチル化ＣｐＧを含む免疫刺激核酸、およびアジュバントから選択される。
【0084】
このような免疫刺激分子は、当該技術分野において周知である。
【0085】
本発明によるワクチン接種方法の実施形態において、非メチル化ＣｐＧを含む免疫刺激性核酸は、ＷＯ ２０１２／０８９．８００（Ｘ４ファミリー）、ＷＯ ２０１２／１６０．１８３（Ｘ４３ファミリー）、およびＷＯ ２０１２／１６０．１８４（Ｘ２３ファミリー）から選択される１以上である。
【0086】
本発明によるワクチン接種方法の一実施形態において、ワクチンの１つまたは両方はアジュバントを含む。好ましくは、アジュバントはオイルアジュバントである。
【0087】
好ましい実施態様において、ワクチンの１つまたは両方は、鉱油アジュバントを含む。
別の好ましい実施態様において、ワクチンの１つまたは両方は、非鉱油アジュバントを含む。
本発明について、「鉱油」は、それぞれの油が、典型的には石油に由来する鉱物源に由来することを示し、「非鉱油」は、合成、半合成、動物－または植物－由来である。
別の好ましい実施態様において、ワクチンの１つまたは両方は、非鉱油アジュバントを含む。
本発明について、「鉱油」は、それぞれの油が、典型的には石油に由来する鉱物源に由来することを示し、「非鉱油」は、合成、半合成、動物－または植物－由来である。
【0088】
本発明によるワクチン接種方法の実施形態において、ＲＰを含むワクチンは、油アジュバントを含み、この油アジュバントは、鉱油および１つ以上の非鉱油を含む。より好ましくは、ＲＰブースターワクチンのオイルアジュバントは、流動パラフィン油およびビタミンＥ－アセテートを含む。さらに好ましくは、ＲＰを含むワクチンは、Ｘｓｏｌｖｅ（商標）アジュバントを含む。
【0089】
本発明によるワクチン接種方法の実施形態において、ＲＰを含むワクチンは、油アジュバントを含み、この油アジュバントは、２つ以上の非鉱油を含む。より好ましくは、ＲＰブースターワクチンのオイルアジュバントは、スクワランおよびビタミンＥ－アセテートを含む。さらに好ましくは、ＲＰを含むワクチンは、ＳＶＥＡ（商標）アジュバントを含む。
【0090】
本発明の場合、流動パラフィン油はＣＡＳ番号： ８０４２－４７－５であり、スクワランはＣＡＳ番号１１１－０１－３であり、ビタミンＥ酢酸エステルはＣＡＳ番号： ５８－９５－７である。実施形態において、ビタミンＥアセテートはｄｌ－α－トコフェロール－アセテートである。
【0091】
本発明によるワクチン接種方法の実施形態において、油性アジュバントは、水および油のエマルションとしてワクチンの一方または両方を配合する。好ましくは、エマルションは水中油型エマルションである。別の好ましい実施形態では、エマルションは油中水型エマルションである。
【0092】
ＲＰを含むワクチンが油性アジュバントを含む本発明のワクチン方法の実施形態では、アジュバントは、投与直前、例えば投与前１日以内、６時間以内、４時間以内、または投与前２時間以内に、この優先順にＲＰと組み合わせることが好ましい。
【0093】
本発明によるワクチン接種方法では、ワクチンの１つまたは両方が、例えば、製剤、安定化、またはそのワクチンの送達を補助する１つまたは複数のさらなる賦形剤を含むことができる。例として、安定剤、保存剤、粘度調整剤がある。
【0094】
本発明によるワクチン接種方法の一実施形態において、ワクチンの１つまたは両方は、安定剤、保存剤、および粘度調整剤から選択されるさらなる賦形剤を含む。
【0095】
好ましい安定剤は、デキストラン、グリセロール、ゼラチン、アミノ酸、抗酸化剤、および緩衝剤から選択される１または複数である。
【0096】
好ましい防腐剤は、チオメルサール、フェノキシエタノール、ホルムアルデヒド、および抗生物質から選択される１または複数である。
【0097】
好ましい粘度調整剤は、ポリビニルピロリドンおよびＧａｎｔｒｅｚ（商標）から選択される１または複数である。
【0098】
本発明によるワクチン接種方法の実施形態において、ウイルスの生弱毒化形態を含むワクチンは、ポリビニルピロリドンおよびＧａｎｔｒｅｚ（商標）から選択される粘度調整剤を含む。
【0099】
本発明のために、Ｇａｎｔｒｅｚ（商標）（Ａｓｈｌａｎｄ、Covington、ＫＹ、米国）は、ビニルエーテルのポリマーおよびコポリマーのファミリーである。
【0100】
本発明によるワクチン接種の方法の実施形態では、生弱毒化形態のウイルスを含むワクチンによるワクチン接種に続いて、１週間から８０年の間の期間内にＲＰを含むワクチンによるワクチン接種を行う。
【0101】
好ましくは、この期間は、１週間と３年との間、１週間と２年との間、１週間と１年との間、１週間と６か月との間、１週間と３か月との間、１週間と２か月との間、１週間と１か月との間、１週間と４週間との間、１週間と３週間との間、さらには１週間と２週間との間である。
【0102】
好ましくは、期間は、２年、１年、６ヵ月、４ヵ月、３ヵ月、２ヵ月、１ヵ月、４週間、３週間、２週間および１週間から選択される。
【0103】
本発明によるワクチン接種方法の好ましい実施形態において、ウイルスの生弱毒化形態を含むワクチンによるワクチン接種の後に、少なくとも１週間の期間内にＲＰを含むワクチンによるワクチン接種を行う。より好ましいのは、以下から選択される期間内である：少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１ヵ月、少なくとも２ヵ月、少なくとも３ヵ月、少なくとも６ヵ月、少なくとも１年、および少なくとも２年。
【0104】
本発明によるワクチン接種方法の一実施形態において、ＲＰワクチンの基となるウイルスはアルファウイルスであり、好ましくはその種がＶＥＥＶである。
【0105】
好ましくは、ＶＥＥＶはＴＣ－８３株由来である。
【0106】
本発明によるワクチン接種方法の一実施形態において、以下からなる群より選択される、１つ以上の条件が適用される。
- 対象動物は獣医学的に妥当な動物である。好ましくは、獣医学的関連性のある動物は、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、シカ、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、およびトリから選択される動物である。より好ましくは、動物は、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、およびトリから選択される。さらに好ましくは、動物は、ブタ、イヌ、ネコ、およびトリから選択される。さらに好ましくは、動物はブタおよびトリから選択される。最も好ましい動物はブタである。
- ウイルスは獣医学診療に関連するウイルスである。好ましくは、ウイルスは動物病原体である。より好ましくは、ウイルスは、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、シカ、イヌ、ネコ、ウマ、およびトリから選択される動物の病原体である。より好ましくは、ウイルスは、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、およびトリから選択される動物の病原体である。さらに好ましくは、ウイルスは、ブタ、イヌ、ネコ、およびトリから選択される動物の病原体である。さらに好ましくは、ウイルスは、ブタおよびトリから選択された動物の病原体である。最も好ましいウイルスはブタの病原体である；
- 対象動物はブタであり、ブタは雌ブタ、哺乳子ブタ、仕上げブタ、給餌ブタ、肥育ブタから選択することが望ましい；
- 本ウイルスはブタの病原体であり、ブタ流行性下痢ウイルス、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ブタサーコウイルス、ブタパルボウイルス、ブタコレラウイルス、アフリカブタコレラウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタ呼吸器コロナウイルス、口蹄疫ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ブタサイトメガロウイルス、ブタロタウイルス、ブタポックスウイルス、水疱性口内炎ウイルスから選択されることが望ましい；
- ウイルスはニドウイルス目内の種であることが望ましい。より好ましくは、このウイルスは、アルテリウイルス科またはコロナウイルス科内の種のものである。さらに好ましくは、ウイルスはＰＥＤＶまたはＰＲＲＳＶ種のものである；
- ウイルスはＰＥＤＶであり、ＲＰはＰＥＤＶスパイク蛋白質をコードする；
- ウイルスはＰＲＲＳＶであり、ＲＰは例えばＧＰ５蛋白質のような１つ以上のＰＲＲＳＶ糖蛋白質をコードする；
- ウイルスはＰＥＤＶ、対象動物は妊娠ブタである；
- ウイルスはＰＲＲＳＶであり、対象動物はブタである。ブタは出生日以降、どの日齢でもよい。ブタは妊娠ブタであり得る；
- 粘膜投与は飲水、スプレー、点眼、鼻腔内、または経口による；
- ウイルスはＰＲＲＳＶであり、ＰＲＲＳＶの生弱毒化形態を含むワクチンは、非経口経路で投与することが好ましく、より好ましくは、筋肉内、皮内または皮下経路で投与する；
- ＲＰを含むワクチンは、非経口経路によって、皮膚内または皮膚を通して注射によって投与される。好ましくは、非経口投与は、筋肉内、静脈内、腹腔内、皮内、粘膜下、または皮下である。より好ましい非経口投与経路は、筋肉内、皮内、または皮下経路による；
- ＲＰによってコードされる少なくとも１つのウイルス抗原は、生弱毒化ウイルスの種内の変異体であるウイルス由来である；
- ＲＰを含むワクチンは、本発明のウイルス種の複数の抗原をコードするＲＰを含む；
- ＲＰを含むワクチンは、本発明のウイルス種由来の１以上の抗原をコードする少なくとも１つのさらなるＲＰを含む。好ましくは、異なるウイルスＲＮＡ ＲＰは、本発明のためのウイルス種の異なる抗原をコードする。代わりに、または追加的に、ＲＰは、本発明のためのウイルス種内の変異体由来であるが、同一の抗原をコードする；
- ワクチンの一方または両方は、さらなる免疫刺激性化合物を含む。好ましくは、さらなる免疫刺激化合物は、サイトカイン、非メチル化ＣｐＧを含む免疫刺激核酸、およびアジュバントから選択される。好ましくは、非メチル化ＣｐＧを含む免疫刺激性核酸は、ＷＯ ２０１２／０８９．８００（Ｘ４ファミリー）、ＷＯ ２０１２／１６０．１８３（Ｘ４３ファミリー）、およびＷＯ ２０１２／１６０．１８４（Ｘ２３ファミリー）から選択される１つ以上である；
- ワクチンの一方または両方がアジュバントを含む。好ましくはアジュバントはオイルアジュバントである；
- ワクチンの一方または両方は、鉱油アジュバントを含む。別の好ましい実施態様において、ワクチンの１つまたは両方は、非鉱油アジュバントを含む；
- ＲＰを含むワクチンは、油性アジュバントを含み、油性アジュバントは、鉱油および１以上の非鉱油を含む。より好ましくは、ＲＰを含むワクチンの油性アジュバントは、流動パラフィン油およびビタミンＥ－アセテートを含む。さらに好ましくは、ＲＰを含むワクチンはＸｓｏｌｖｅ（商標）アジュバントを含む；
- ＲＰを含むワクチンは、油性アジュバントを含み、油性アジュバントは、１以上の非鉱油を含む。より好ましくは、ＲＰを含むワクチンのオイルアジュバントは、スクワランおよびビタミンＥ－アセテートを含む。さらに好ましくは、ＲＰを含むワクチンはＳＶＥＡ（登録商標）アジュバントを含む；
- ビタミンＥ酢酸エステルはｄｌ－α－トコフェロール酢酸エステルである；
- 油性アジュバントは、水および油のエマルジョンとしてワクチンの一方または両方を配合する。好ましくは、エマルションは水中油型エマルションである。別の好ましい実施形態では、エマルションは油中水型エマルションである；
- 投与直前、例えば投与１日以内、６時間前、４時間前または２時間前にアジュバントをＲＰと組み合わせる；
ワクチンの一方または両方は、安定剤、保存剤、および粘度改良剤から選択されるさらなる賦形剤を含む。好ましい安定剤は、デキストラン、グリセロール、ゼラチン、アミノ酸、抗酸化剤、および緩衝剤から１つ以上選択される。好ましい防腐剤は、チオメルサール、フェノキシエタノール、ホルムアルデヒド、および抗生物質から１つ以上選択される。好ましい粘度調整剤は、ポリビニルピロリドンおよびＧａｎｔｒｅｚ（商標）から選択される１つ以上である；
- ウイルスの生弱毒化形態を含むワクチンは、ポリビニルピロリドンおよびＧａｎｔｒｅｚ（商標）から選択される粘度改質剤を含む；
- 生弱毒化ウイルスを含むワクチンによるワクチン接種の後、１週間から８０年の間の期間内にＲＰを含むワクチンによるワクチン接種を行う。好ましくは、この期間は、１週間と３年との間、１週間と２年との間、１週間と１年との間、１週間と６か月との間、１週間と３か月との間、１週間と２か月との間、１週間と１か月との間、１週間と４週間との間、１週間と３週間との間、さらには１週間と２週間との間である。好ましくは、期間の期間は、２年、１年、６ヵ月、４ヵ月、３ヵ月、２ヵ月、１ヵ月、４週間、３週間、２週間および１週間から選択される；
- ウイルスの生弱毒化形態を含むワクチンでのワクチン接種に続いて、少なくとも１週間の期間内にＲＰを含むワクチンでのワクチン接種を行う。より好ましくは、以下から選択される期間内である：少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１ヵ月、少なくとも２ヵ月、少なくとも３ヵ月、少なくとも６ヵ月、少なくとも１年、および少なくとも２年；
- アルファウイルスＲＮＡ ＲＰを含むワクチンのウイルス種はＶＥＥＶである。好ましくは、ＶＥＥＶはＴＣ－８３株由来である。
- 対象動物は獣医学的に妥当な動物である。好ましくは、獣医学的関連性のある動物は、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、シカ、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、およびトリから選択される動物である。より好ましくは、動物は、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、およびトリから選択される。さらに好ましくは、動物は、ブタ、イヌ、ネコ、およびトリから選択される。さらに好ましくは、動物はブタおよびトリから選択される。最も好ましい動物はブタである。
- ウイルスは獣医学診療に関連するウイルスである。好ましくは、ウイルスは動物病原体である。より好ましくは、ウイルスは、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、シカ、イヌ、ネコ、ウマ、およびトリから選択される動物の病原体である。より好ましくは、ウイルスは、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、およびトリから選択される動物の病原体である。さらに好ましくは、ウイルスは、ブタ、イヌ、ネコ、およびトリから選択される動物の病原体である。さらに好ましくは、ウイルスは、ブタおよびトリから選択された動物の病原体である。最も好ましいウイルスはブタの病原体である；
- 対象動物はブタであり、ブタは雌ブタ、哺乳子ブタ、仕上げブタ、給餌ブタ、肥育ブタから選択することが望ましい；
- 本ウイルスはブタの病原体であり、ブタ流行性下痢ウイルス、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ブタサーコウイルス、ブタパルボウイルス、ブタコレラウイルス、アフリカブタコレラウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタ呼吸器コロナウイルス、口蹄疫ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ブタサイトメガロウイルス、ブタロタウイルス、ブタポックスウイルス、水疱性口内炎ウイルスから選択されることが望ましい；
- ウイルスはニドウイルス目内の種であることが望ましい。より好ましくは、このウイルスは、アルテリウイルス科またはコロナウイルス科内の種のものである。さらに好ましくは、ウイルスはＰＥＤＶまたはＰＲＲＳＶ種のものである；
- ウイルスはＰＥＤＶであり、ＲＰはＰＥＤＶスパイク蛋白質をコードする；
- ウイルスはＰＲＲＳＶであり、ＲＰは例えばＧＰ５蛋白質のような１つ以上のＰＲＲＳＶ糖蛋白質をコードする；
- ウイルスはＰＥＤＶ、対象動物は妊娠ブタである；
- ウイルスはＰＲＲＳＶであり、対象動物はブタである。ブタは出生日以降、どの日齢でもよい。ブタは妊娠ブタであり得る；
- 粘膜投与は飲水、スプレー、点眼、鼻腔内、または経口による；
- ウイルスはＰＲＲＳＶであり、ＰＲＲＳＶの生弱毒化形態を含むワクチンは、非経口経路で投与することが好ましく、より好ましくは、筋肉内、皮内または皮下経路で投与する；
- ＲＰを含むワクチンは、非経口経路によって、皮膚内または皮膚を通して注射によって投与される。好ましくは、非経口投与は、筋肉内、静脈内、腹腔内、皮内、粘膜下、または皮下である。より好ましい非経口投与経路は、筋肉内、皮内、または皮下経路による；
- ＲＰによってコードされる少なくとも１つのウイルス抗原は、生弱毒化ウイルスの種内の変異体であるウイルス由来である；
- ＲＰを含むワクチンは、本発明のウイルス種の複数の抗原をコードするＲＰを含む；
- ＲＰを含むワクチンは、本発明のウイルス種由来の１以上の抗原をコードする少なくとも１つのさらなるＲＰを含む。好ましくは、異なるウイルスＲＮＡ ＲＰは、本発明のためのウイルス種の異なる抗原をコードする。代わりに、または追加的に、ＲＰは、本発明のためのウイルス種内の変異体由来であるが、同一の抗原をコードする；
- ワクチンの一方または両方は、さらなる免疫刺激性化合物を含む。好ましくは、さらなる免疫刺激化合物は、サイトカイン、非メチル化ＣｐＧを含む免疫刺激核酸、およびアジュバントから選択される。好ましくは、非メチル化ＣｐＧを含む免疫刺激性核酸は、ＷＯ ２０１２／０８９．８００（Ｘ４ファミリー）、ＷＯ ２０１２／１６０．１８３（Ｘ４３ファミリー）、およびＷＯ ２０１２／１６０．１８４（Ｘ２３ファミリー）から選択される１つ以上である；
- ワクチンの一方または両方がアジュバントを含む。好ましくはアジュバントはオイルアジュバントである；
- ワクチンの一方または両方は、鉱油アジュバントを含む。別の好ましい実施態様において、ワクチンの１つまたは両方は、非鉱油アジュバントを含む；
- ＲＰを含むワクチンは、油性アジュバントを含み、油性アジュバントは、鉱油および１以上の非鉱油を含む。より好ましくは、ＲＰを含むワクチンの油性アジュバントは、流動パラフィン油およびビタミンＥ－アセテートを含む。さらに好ましくは、ＲＰを含むワクチンはＸｓｏｌｖｅ（商標）アジュバントを含む；
- ＲＰを含むワクチンは、油性アジュバントを含み、油性アジュバントは、１以上の非鉱油を含む。より好ましくは、ＲＰを含むワクチンのオイルアジュバントは、スクワランおよびビタミンＥ－アセテートを含む。さらに好ましくは、ＲＰを含むワクチンはＳＶＥＡ（登録商標）アジュバントを含む；
- ビタミンＥ酢酸エステルはｄｌ－α－トコフェロール酢酸エステルである；
- 油性アジュバントは、水および油のエマルジョンとしてワクチンの一方または両方を配合する。好ましくは、エマルションは水中油型エマルションである。別の好ましい実施形態では、エマルションは油中水型エマルションである；
- 投与直前、例えば投与１日以内、６時間前、４時間前または２時間前にアジュバントをＲＰと組み合わせる；
ワクチンの一方または両方は、安定剤、保存剤、および粘度改良剤から選択されるさらなる賦形剤を含む。好ましい安定剤は、デキストラン、グリセロール、ゼラチン、アミノ酸、抗酸化剤、および緩衝剤から１つ以上選択される。好ましい防腐剤は、チオメルサール、フェノキシエタノール、ホルムアルデヒド、および抗生物質から１つ以上選択される。好ましい粘度調整剤は、ポリビニルピロリドンおよびＧａｎｔｒｅｚ（商標）から選択される１つ以上である；
- ウイルスの生弱毒化形態を含むワクチンは、ポリビニルピロリドンおよびＧａｎｔｒｅｚ（商標）から選択される粘度改質剤を含む；
- 生弱毒化ウイルスを含むワクチンによるワクチン接種の後、１週間から８０年の間の期間内にＲＰを含むワクチンによるワクチン接種を行う。好ましくは、この期間は、１週間と３年との間、１週間と２年との間、１週間と１年との間、１週間と６か月との間、１週間と３か月との間、１週間と２か月との間、１週間と１か月との間、１週間と４週間との間、１週間と３週間との間、さらには１週間と２週間との間である。好ましくは、期間の期間は、２年、１年、６ヵ月、４ヵ月、３ヵ月、２ヵ月、１ヵ月、４週間、３週間、２週間および１週間から選択される；
- ウイルスの生弱毒化形態を含むワクチンでのワクチン接種に続いて、少なくとも１週間の期間内にＲＰを含むワクチンでのワクチン接種を行う。より好ましくは、以下から選択される期間内である：少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１ヵ月、少なくとも２ヵ月、少なくとも３ヵ月、少なくとも６ヵ月、少なくとも１年、および少なくとも２年；
- アルファウイルスＲＮＡ ＲＰを含むワクチンのウイルス種はＶＥＥＶである。好ましくは、ＶＥＥＶはＴＣ－８３株由来である。
【0107】
本発明によるワクチン接種方法の一実施形態において、標的動物はブタであり、ウイルスはＰＥＤＶであり、ブタは妊娠ブタであり、ウイルスの生弱毒化形態を含むワクチンは粘度修飾因子を含み、そしてアルファウイルスＲＮＡ ＲＰを含むワクチンのウイルスはＶＥＥＶである。
【0108】
本発明によるワクチン接種方法の一実施形態では、標的動物はブタであり、ウイルスはＰＲＲＳＶであり、アルファウイルスＲＮＡ ＲＰを含むワクチンのウイルスはＶＥＥＶであり、ＲＰを含むワクチンはオイルアジュバントを含む。
【0109】
本発明によるワクチン接種方法は、例えば、それが具体化するワクチン接種計画の方法によって、またはこの方法で使用されるワクチンの各々の医学的使用によって、異なる様式でコード化することもできる。
【0110】
従って、さらなる局面において、本発明は、ウイルスによって引き起こされる感染または疾患から標的動物を保護するためのプライム－ブーストワクチン接種レジメンに関するものであり、ここで、ワクチン接種レジメンは、該ウイルスの生弱毒化形態を含むワクチンの標的動物への投与、続いて前記ウイルスからの１以上の抗原をコードするＲＰを含むワクチンの標的動物への投与を含む。
【0111】
さらなる局面において、本発明は、ウイルスによって引き起こされる感染または疾患から標的動物を保護するためのプライム－ブーストワクチン接種レジメンにおいて使用するためのウイルスの生弱毒化形態を含むワクチンに関するものであり、該レジメンは、
生弱毒化された形態のウイルスを含むワクチンによるワクチン接種、次いで
前記ウイルス由来の１以上の抗原をコードするＲＰを含むワクチンによるワクチン接種、
を含む。
生弱毒化された形態のウイルスを含むワクチンによるワクチン接種、次いで
前記ウイルス由来の１以上の抗原をコードするＲＰを含むワクチンによるワクチン接種、
を含む。
【0112】
さらなる局面において、本発明は、ウイルス由来の１以上の抗原をコードするＲＰを含むワクチンに関するものであり、プライム－ブーストワクチン接種レジメンにおいて、前記ウイルスによって引き起こされる感染または疾患から標的動物を保護するために使用され、該レジメンは、
該ウイルスの生弱毒化形態を含むワクチンによるワクチン接種、次いで
ＲＰを含むワクチンの接種
を含む。
該ウイルスの生弱毒化形態を含むワクチンによるワクチン接種、次いで
ＲＰを含むワクチンの接種
を含む。
【0113】
さらなる局面において、本発明は、ウイルスによって引き起こされる感染または疾患に対する標的動物の保護のためのワクチンの製造のための生弱毒化形態のウイルスの使用に関するものであり、それによって、該ワクチンは、
生弱毒化ウイルスを含むワクチンの投与、次いで
前記ウイルス由来の１以上の抗原をコードするＲＰを含むワクチンの投与
を含むプライム－ブーストワクチン接種レジメンで投与される。
生弱毒化ウイルスを含むワクチンの投与、次いで
前記ウイルス由来の１以上の抗原をコードするＲＰを含むワクチンの投与
を含むプライム－ブーストワクチン接種レジメンで投与される。
【0114】
そしてさらなる局面において、本発明は、ウイルス由来の１つ以上の抗原をコードするＲＰを用いて、標的動物を、前記ウイルスによって引き起こされる感染または疾患から保護するためにワクチンを製造することに関するものであり、該ワクチンは、
該ウイルスの生弱毒化形態を含むワクチンの投与、次いで
ＲＰを含むワクチンの投与
を含むプライム－ブーストワクチン接種レジメンにおいて投与される。
該ウイルスの生弱毒化形態を含むワクチンの投与、次いで
ＲＰを含むワクチンの投与
を含むプライム－ブーストワクチン接種レジメンにおいて投与される。
【0115】
プライム－ブーストワクチン投与計画、ウイルス、生弱毒化ウイルスを含むワクチン、ＲＰを含むワクチン、プライムとブーストワクチン接種の間の時間間隔、防御、標的動物、感染、疾患、および投与のようなこれらのさらなる局面のこれらの特徴の１つまたは複数の好ましい態様において、全てが本明細書に記載される実施形態のいずれか１つまたは複数において定義される。
【0116】
本発明については、製造されるワクチンの医学的使用を可能にする方法で、本発明の製造のためのウイルスの生弱毒化形態の使用、またはＲＰの使用が行われる。一般的には、医薬品として許容される装置および成分を使用し、医薬品の製造管理および品質管理基準などの品質規制を遵守することである。このことは、製造工程の様々な段階が、例えば抗原の品質及び量に関する免疫学的試験、無菌性に関する微生物学的試験及び外来性因子の非存在による適切な試験、並びに最終的にはワクチンの有効性及び安全性を確認するための動物を用いた試験によってモニターされることを意味する。これらの試験終了後、ワクチン製品を発売することができる。
【0117】
これらはすべて当業者に周知されており、ワクチンの製造に適用される一般的な技術および考慮事項は、例えば、欧州薬局方、９および２１ ＣＦＲなどの政府規則、ならびにＰ． Ｐａｓｔｏｒｅｔら（上出）および「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： ｔｈｅ ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｙ」（２０００， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔ， ＵＳＡ， ＩＳＢＮ： ６８３３０６４７２）などのハンドブックに記載されている。
【0118】
本発明によるワクチン接種方法に使用するワクチン、ウイルスの生弱毒化形態を含むワクチンおよびＲＰを含むワクチンは、別々に市場に供給することができ、次いで、本発明によるワクチン接種方法に使用することができる。または、本発明によるワクチン接種方法におけるそれらの使用を容易にする組み合わせでワクチンを供給することができる。
【0119】
したがって、さらなる局面において、本発明は、少なくとも２つの容器を含む部分のキットに関するものであり、少なくとも１つの容器は、本発明のために定義されるようにウイルスの生弱毒化形態を含むワクチンを含み、少なくとも１つの容器は、本発明のために定義されるようにウイルス抗原をコードするＲＰを含むワクチンを含む。
【0120】
本発明の部分のキットの好ましい実施形態において、部分のキットの１つ以上または全ての特徴は、本明細書に記載される実施形態のいずれか１つまたは複数において定義される。
【0121】
好ましい実施態様では、ウイルスの生弱毒化形態を含むワクチンを含む少なくとも１つの容器は、投与直前に希釈剤で希釈できる凍結乾燥剤として前記ワクチンを含む。
【0122】
好ましい実施態様において、ＲＰを含むワクチンを含む少なくとも１つの容器は、投与直前に希釈剤で希釈できる凍結乾燥剤として前記ワクチンを含む。
【0123】
別の実施態様において、ＲＰを含むワクチンを含む少なくとも１つの容器は、ワクチンを水溶液中で含み、水溶液は、好ましくは緩衝剤を含み、そして該ワクチンを含む水溶液は、使用するまで冷却または凍結されることが好ましい。一実施形態では、前記ワクチンとの水溶液は、ＲＰ凍結乾燥物および適切な水性希釈剤の混合から生成される、再構成されたＲＰの溶液である。
【0124】
少なくとも１つの容器が凍結乾燥物としてＲＰを含むワクチンを含む実施形態において、本発明によるパーツのキットは、さらなる容器を含むことができ、さらなる容器は、ＲＰを含む凍結乾燥ワクチンを再構成するための適切な希釈剤を含むことができる。好ましい実施形態において、希釈剤は水溶液であり、好ましくは、薬学的に許容可能な品質の緩衝剤および／または安定剤および水を含む。
【0125】
別の好ましい実施形態では、希釈剤は、ＲＰを含むワクチンを再構成およびアジュバント化するための水中油型エマルションである。
【0126】
本発明による部品のキットの実施形態において、キットは、キットおよび／またはその構成部品の使用説明書を含む。好ましい実施態様において、使用のための指示書は、キットの構成要素の１つまたはそれ以上の部分で提供されるか、またはそれとともに提供されるれ、または、例えば、製造業者、またはキットの流通業者からインターネットウェブサイト上で閲覧可能な情報、またはインターネットウェブサイトからソフトウェア可能な情報など、電子形態の指示書への参照によって提供される。
【0127】
一実施態様では、部品のキットは、少なくとも２つの容器を含むボックスであり、ボックスとともに、またはボックス内に含まれる情報担体（例えば、カード、またはリーフレット）上に表示される使用説明書を含む。
【0128】
部品のキットの一実施形態において、キットはまた、例えばインターネットウェブサイト上での、本発明によるワクチン接種の方法において使用するための（商業的販売に関する）部品の提供であってもよい。
【0129】
本発明の方法、ワクチン、使用、レジメンおよびキットをさらに最適化することは、当業者の手の届く範囲内で十分である。一般に、これには、ワクチンの有効性の微調整および適用可能な特定の状態に適応するためのそれらの投与が含まれる。これは、ワクチンの用量、容積、抗原含量またはアジュバントを適応させることによって、または投与の経路または方法を適応させることによって行うことができる。このような微調整はすべて、この分野で知られている日常的な方法と材料を用いて行うことができる。
【0130】
本発明の上記実施形態のいずれにおいても、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子の使用が好ましい。
【0131】
本発明は、ここで、以下の、非限定的な例によってさらに記述される。
実施例
実施例
【実施例1】
【0132】
実施例１：同種プライム－ブーストＰＲＲＳＶワクチン接種
既存のＰＲＲＳＶ生ワクチンＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標） ＰＲＲＳは、ＰＲＲＳＶのヨーロッパ分離株であるＤＶ株、遺伝子型１のＰＲＲＳＶに基づいている。このことは、生弱毒化ＰＲＲＳＶの全ワクチンに共通する問題である異種チャレンジ株に対して検査した場合、時に有効性に欠けることがわかった。このワクチン接種効果を向上させるために、同種プライム－ブーストワクチン接種法など、様々な方法が検討された。
既存のＰＲＲＳＶ生ワクチンＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標） ＰＲＲＳは、ＰＲＲＳＶのヨーロッパ分離株であるＤＶ株、遺伝子型１のＰＲＲＳＶに基づいている。このことは、生弱毒化ＰＲＲＳＶの全ワクチンに共通する問題である異種チャレンジ株に対して検査した場合、時に有効性に欠けることがわかった。このワクチン接種効果を向上させるために、同種プライム－ブーストワクチン接種法など、様々な方法が検討された。
【0133】
ワクチン接種－チャレンジ実験では、ワクチン接種の当日にＰＲＲＳＶ抗体陰性であった約５週齢の１６頭から成る３群を用いた。２群には生弱毒化ウイルスＰｏｒｃｉｌｉｓ ＰＲＲＳのワクチン接種を１回または２回、２週間間隔で行った。１群はワクチン未接種のままであった。すべてのブタに、最近のドイツ遺伝子型１分離株のＰＲＲＳＶによるチャレンジ感染を、初回ワクチン接種からそれぞれ４．５週後に行った。投与量は、１匹当たり２ｍＬ（各鼻孔で１ｍＬ）のウイルス ５．３Ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０であった。ワクチン接種日およびチャレンジ後０、４、７、１０、１４および２０日目に血液サンプルを採取した。ＰＲＲＳＶウイルス血症は、以下に記載のとおり、ＰＡＭ細胞上でｃｐｅとして判定した。
【0134】
図１に３群のウイルス血症の結果を示す。明らかに分かるように、生弱毒化ＰＲＲＳＶワクチンを１回または２回接種した場合の効果に有意差は認められなかった。
【0135】
したがって、ＰＲＲＳＶについては、同種プライム－ブーストワクチン接種レジメンを用いることで、単回ワクチン接種の免疫防御能を改善することはできない。
【実施例2】
【0136】
実施例２： ＰＲＲＳＶ － プライム－ブーストワクチン接種、初期実験
２．１序文
この実験では、ブースターワクチン接種に変更を伴う本発明のワクチン接種法を適用した。ここで、使用した生弱毒化ウイルスのワクチンは、ＰＲＲＳＶ１型、ＤＶ株であるＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標） ＰＲＲＳであり、アルファウイルスＲＮＡ ＲＰを含むワクチンおよび使用したチャレンジウイルスは、ＰＲＲＳＶ１型Ｓｃ３株に基づくものであった。
２．１序文
この実験では、ブースターワクチン接種に変更を伴う本発明のワクチン接種法を適用した。ここで、使用した生弱毒化ウイルスのワクチンは、ＰＲＲＳＶ１型、ＤＶ株であるＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標） ＰＲＲＳであり、アルファウイルスＲＮＡ ＲＰを含むワクチンおよび使用したチャレンジウイルスは、ＰＲＲＳＶ１型Ｓｃ３株に基づくものであった。
【0137】
使用したアルファウイルスＲＮＡ ＲＰはＶＥＥＶ株ＴＣ－８３に基づいており、複数のウイルス抗原を発現した。１種類のＲＰ （ここではＲＰ１）はＰＲＲＳＶ株Ｓｃ３遺伝子である、Ｅ、ＧＰ２、ＧＰ３およびＧＰ４をコードし、天然のＥ－ＧＰ２－ＧＰ３－ＧＰ４四量体の発現につながった。別のタイプのＲＰ （ここではＲＰ２）はＰＲＲＳＶ株Ｓｃ３遺伝子である、ＧＰ５およびＭをコードし、天然のＧＰ５－Ｍ二量体の発現につながった。それぞれの場合（ＲＰ１およびＲＰ２）、異種遺伝子はそれぞれ独自のサブゲノムプロモーター配列の転写制御下にあった。ＲＰ１では、４つの別々のサブゲノムプロモーター配列が存在し、ＲＰ２では、２つのサブゲノムプロモーター配列が存在した。
【0138】
２．２ 試験デザイン
抗ＰＲＲＳＶ抗体血清陰性の子ブタ４０頭を１０頭ずつ４群に分けた。第１群～第３群の子ブタに約５週齢時に、生弱毒化ウイルスワクチンＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標） ＰＲＲＳＶを筋肉内（ＩＭ）経路でプライミングワクチン接種し、第４群の子ブタを非接種対照動物とした。プライミングワクチン接種の３週間後に、２群および３群は、２タイプのアルファウイルスＲＮＡ ＲＰを含むワクチンによるブースターワクチン接種を受けた。プライミングワクチン接種から約４．５週間後、すなわちブースターワクチン接種から１１日後に、すべての動物に最新の毒性遺伝子型１株Ｓｃ－３を鼻腔内経路でチャレンジ接種した。血液サンプルは、プライミングワクチン接種日およびその後７、１５、２３日、ならびにチャレンジ接種日（＝３２日ｄｐｖ）およびその後４、７、１１、１７、２１日に採取した。これらの検体から血清を分離し、チャレンジ感染後に得られた検体を用いて、チャレンジ株のウイルス血症を測定することにより、異なるワクチン接種のワクチン効果を判定した。
抗ＰＲＲＳＶ抗体血清陰性の子ブタ４０頭を１０頭ずつ４群に分けた。第１群～第３群の子ブタに約５週齢時に、生弱毒化ウイルスワクチンＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標） ＰＲＲＳＶを筋肉内（ＩＭ）経路でプライミングワクチン接種し、第４群の子ブタを非接種対照動物とした。プライミングワクチン接種の３週間後に、２群および３群は、２タイプのアルファウイルスＲＮＡ ＲＰを含むワクチンによるブースターワクチン接種を受けた。プライミングワクチン接種から約４．５週間後、すなわちブースターワクチン接種から１１日後に、すべての動物に最新の毒性遺伝子型１株Ｓｃ－３を鼻腔内経路でチャレンジ接種した。血液サンプルは、プライミングワクチン接種日およびその後７、１５、２３日、ならびにチャレンジ接種日（＝３２日ｄｐｖ）およびその後４、７、１１、１７、２１日に採取した。これらの検体から血清を分離し、チャレンジ感染後に得られた検体を用いて、チャレンジ株のウイルス血症を測定することにより、異なるワクチン接種のワクチン効果を判定した。
【0139】
２．３材料および方法
治療：
Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標） ＰＲＲＳの推奨接種経路、すなわち筋肉内投与が、アルファウイルスＲＮＡ ＲＰを含むワクチンにも用いられた。チャレンジ接種には、自然感染経路、経鼻経路を用いた。血液サンプルを採取し、ＰＲＲＳＶ感染の関連パラメータ：ウイルス血症および血清学的検査をモニタリングした。
治療：
Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標） ＰＲＲＳの推奨接種経路、すなわち筋肉内投与が、アルファウイルスＲＮＡ ＲＰを含むワクチンにも用いられた。チャレンジ接種には、自然感染経路、経鼻経路を用いた。血液サンプルを採取し、ＰＲＲＳＶ感染の関連パラメータ：ウイルス血症および血清学的検査をモニタリングした。
【0140】
被験物質：
チャレンジウイルスはＰＲＲＳＶ株Ｓｃ－３で、０．５ ｘ １０＾５．０ ＴＣＩＤ５０／ｍｌに希釈した。
凍結乾燥Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標） ＰＲＲＳワクチンの希釈液は１０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液とした。これを使用直前に適用して、０．５ ｘ １０＾５．０ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価を得た。
初代ブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）について、５－７日後にｃｐｅを読み取って滴定を行った。
ＲＰ用の希釈剤は、アルファウイルスＲＮＡ ＲＰ１またはＲＰ２を含むワクチンのそれぞれについて０．５ ｘ １０＾８．０ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価に到達するために、使用直前に適用されるＸｓｏｌｖｅ（登録商標）５０油水中エマルションであった。
チャレンジウイルスはＰＲＲＳＶ株Ｓｃ－３で、０．５ ｘ １０＾５．０ ＴＣＩＤ５０／ｍｌに希釈した。
凍結乾燥Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標） ＰＲＲＳワクチンの希釈液は１０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液とした。これを使用直前に適用して、０．５ ｘ １０＾５．０ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価を得た。
初代ブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）について、５－７日後にｃｐｅを読み取って滴定を行った。
ＲＰ用の希釈剤は、アルファウイルスＲＮＡ ＲＰ１またはＲＰ２を含むワクチンのそれぞれについて０．５ ｘ １０＾８．０ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価に到達するために、使用直前に適用されるＸｓｏｌｖｅ（登録商標）５０油水中エマルションであった。
【0141】
ＲＰが遺伝子組み換え作物に分類される場合、全ての材料、試料、動物は、適切なレベルの生物学的封じ込めの施設で取り扱われ、保管される必要がある。
【0142】
試験動物：
標準子ブタ、ワクチン接種当日５週齢前後、混合性、ワクチン接種までＰＲＲＳＶ抗体陰性。子ブタは、試験施設への輸送からワクチン接種日までの間に５日間の馴化を行った。臨床的に健康なブタのみを用いた。番号付き耳標を用いてブタを同定した。実験期間中、全動物の全身状態を毎日観察した。すべての観察結果を記録し、必要に応じて担当獣医師に相談した。
標準子ブタ、ワクチン接種当日５週齢前後、混合性、ワクチン接種までＰＲＲＳＶ抗体陰性。子ブタは、試験施設への輸送からワクチン接種日までの間に５日間の馴化を行った。臨床的に健康なブタのみを用いた。番号付き耳標を用いてブタを同定した。実験期間中、全動物の全身状態を毎日観察した。すべての観察結果を記録し、必要に応じて担当獣医師に相談した。
【0143】
ワクチン接種はすべて２ｍｌ／匹を筋肉内（IM）投与し、チャレンジは２ｍｌ／匹の動物に鼻腔内（ＩＮ）投与した。
【0144】
【0145】
サンプリング
血液サンプルは、プライミングワクチン接種後（ｄｐｖ）０、７、１５、２３日、そしてチャレンジ後（ｄｐｃ）０（＝３２ｄｐｖ）、４、７、１１、１７、２１日に頸静脈から採取した。最後の血液サンプルは実験終了時に安楽死中に採取した。血液は、抗凝固剤を用いずにバキュテーナーで採取した。血液検体は常温で１時間凝固した後、３０００ｘ ｇで１０分間遠心分離し、使用まで－２０℃未満で保存した。
血液サンプルは、プライミングワクチン接種後（ｄｐｖ）０、７、１５、２３日、そしてチャレンジ後（ｄｐｃ）０（＝３２ｄｐｖ）、４、７、１１、１７、２１日に頸静脈から採取した。最後の血液サンプルは実験終了時に安楽死中に採取した。血液は、抗凝固剤を用いずにバキュテーナーで採取した。血液検体は常温で１時間凝固した後、３０００ｘ ｇで１０分間遠心分離し、使用まで－２０℃未満で保存した。
【0146】
ウイルス血症検出
ＰＲＲＳＶのウイルス血症（ウイルスの生弱毒化ウイルスとチャレンジウイルスの両方）は、ＰＲＲＳＶ遺伝子型１に特異的なプライマーセットを用いたｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ｑＰＣＲ法による血清中のＰＲＲＳＶ ＲＮＡの定量化、およびｉＴａｑ（商標） Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ Ｋｉｔ （ＢｉｏＲａｄ）により検出した。
ＰＲＲＳＶのウイルス血症（ウイルスの生弱毒化ウイルスとチャレンジウイルスの両方）は、ＰＲＲＳＶ遺伝子型１に特異的なプライマーセットを用いたｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ｑＰＣＲ法による血清中のＰＲＲＳＶ ＲＮＡの定量化、およびｉＴａｑ（商標） Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ Ｋｉｔ （ＢｉｏＲａｄ）により検出した。
【0147】
血清学的検査
市販のＥＬＩＳＡキット： ＩＤＥＸＸ（商標） ＰＲＲＳ Ｘ３（ＩＤＥＸＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ， ＭＥ， ＵＳＡ）を用いて、ＰＲＲＳＶに対する抗体について血清を検査した。組換えＰＲＲＳＶ抗原でコーティングしたマイクロ滴定ウェルで血清をインキュベートした。次に、ワサビペルオキシダーゼ結合抗ブタ抗体と発色原を用いて、結合したＰＲＲＳＶ特異抗体を検出した。結果はサンプル対陽性（Ｓ／Ｐ）比として計算した。Ｓ／Ｐ比≧０．４のサンプルを陽性と分類し、Ｓ／Ｐ比＜０．４のサンプルをＰＲＲＳＶ特異抗体陰性と分類した。
市販のＥＬＩＳＡキット： ＩＤＥＸＸ（商標） ＰＲＲＳ Ｘ３（ＩＤＥＸＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ， ＭＥ， ＵＳＡ）を用いて、ＰＲＲＳＶに対する抗体について血清を検査した。組換えＰＲＲＳＶ抗原でコーティングしたマイクロ滴定ウェルで血清をインキュベートした。次に、ワサビペルオキシダーゼ結合抗ブタ抗体と発色原を用いて、結合したＰＲＲＳＶ特異抗体を検出した。結果はサンプル対陽性（Ｓ／Ｐ）比として計算した。Ｓ／Ｐ比≧０．４のサンプルを陽性と分類し、Ｓ／Ｐ比＜０．４のサンプルをＰＲＲＳＶ特異抗体陰性と分類した。
【0148】
結果および結論
ワクチン接種前の血清サンプルはすべてＰＲＲＳＶ－Ａｂ陰性であり、第４群の血清サンプルはチャレンジまでＰＲＲＳＶ－Ａｂ陰性であったため、この実験は妥当であると考えられた。
ワクチン接種前の血清サンプルはすべてＰＲＲＳＶ－Ａｂ陰性であり、第４群の血清サンプルはチャレンジまでＰＲＲＳＶ－Ａｂ陰性であったため、この実験は妥当であると考えられた。
【0149】
ウイルス血症の判定結果を、各群毎に集めたｑＰＣＲスコアを表す図２に示す。
【0150】
非ワクチン接種ブタ（第４群）では、血清中のＰＲＲＳウイルスのレベルが最も高く、これは予想通りであった。また、予想通り、２１ ｄｐｖに２種類のアルファウイルスＲＮＡ ＲＰをプライムブースターワクチン接種しても、血清中のＰＲＲＳＶウイルス血症濃度は検出されなかった（例えば、第３群、図２参照）。
【0151】
アルファウイルスＲＮＡ ＲＰ１およびＲＰ２を含むワクチンによるプライミングおよびブースターワクチン接種の両方を受けた動物（第３群）では、観察されたウイルス血症レベルは、非ワクチン接種動物で認められたレベルとほぼ同等に高かった。
【0152】
明らかに、アルファウイルス ＲＮＡ ＲＰを含むワクチンによる同種プライム－ブーストレジメンでは、これらがチャレンジウイルスの複数の抗原をコードしている場合でも、ＰＲＲＳＶに対する十分な防御は得られなかった。
【0153】
生弱毒化ウイルスにより、ウイルス血症の良好な減少が得られた（１群）。しかしながら、本発明の異種プライム－ブーストワクチン接種レジメンに従ってワクチン接種を受けた群（第２群）は、すべてのチャレンジ感染に対して最良の防御を示した。すなわち、チャレンジ後の血清サンプル中の検出可能なＰＲＲＳＶのレベルが常に最低であった。
【実施例3】
【0154】
実施例３： ＰＲＲＳＶ － プライム－ブーストワクチン接種、拡大実験
３．１序文
実施例２に記載した実験で認められた顕著な結果を繰り返し、拡大するために、さらなる実験を設定した。この設定では、ブースターワクチン接種としてアルファウイルスＲＮＡ ＲＰ１またはＲＰ２を含む別個のワクチンの効果を試験するために、群を追加した。さらに、本発明に従ったワクチン接種の方法において、ワクチン接種の逆順を試験するために１群を加えた。
３．１序文
実施例２に記載した実験で認められた顕著な結果を繰り返し、拡大するために、さらなる実験を設定した。この設定では、ブースターワクチン接種としてアルファウイルスＲＮＡ ＲＰ１またはＲＰ２を含む別個のワクチンの効果を試験するために、群を追加した。さらに、本発明に従ったワクチン接種の方法において、ワクチン接種の逆順を試験するために１群を加えた。
【0155】
試験デザイン
この例における試験デザインは、余分な試験群を除いて、実施例２と本質的に同じであった。実施例３の実験概要を表２に要約する。すべての群に、プライミングワクチン接種の５週間後、すなわちブースターワクチン接種の２週間後にＰＲＲＳＶ株Ｓｃ－３によるチャレンジ感染を行った。
この例における試験デザインは、余分な試験群を除いて、実施例２と本質的に同じであった。実施例３の実験概要を表２に要約する。すべての群に、プライミングワクチン接種の５週間後、すなわちブースターワクチン接種の２週間後にＰＲＲＳＶ株Ｓｃ－３によるチャレンジ感染を行った。
【0156】
【0157】
３．３ 材料および方法
ワクチン接種およびチャレンジは、実施例２で適用したものとほぼ同じであった。抗原投与のタイミングに関しては、実施例２の４．５週目ではなく、プライミングワクチン接種後５週目であった。２群、３群および４群を追加し、ブースターワクチン接種としてアルファウイルスＲＮＡ ＲＰ１またはＲＰ２を含む単一ワクチンを接種した。
ワクチン接種およびチャレンジは、実施例２で適用したものとほぼ同じであった。抗原投与のタイミングに関しては、実施例２の４．５週目ではなく、プライミングワクチン接種後５週目であった。２群、３群および４群を追加し、ブースターワクチン接種としてアルファウイルスＲＮＡ ＲＰ１またはＲＰ２を含む単一ワクチンを接種した。
【0158】
３．４ 結果および結論
結果を図３に示す。結果を比較する最良の時点は、チャレンジ４日後のウイルス血症（Ｃｔ値における）である。
結果を図３に示す。結果を比較する最良の時点は、チャレンジ４日後のウイルス血症（Ｃｔ値における）である。
【0159】
この試験も、ワクチン接種前の抗ＰＲＲＳＶ抗体に対する血清陰性に基づいて、有効であった。また、ワクチン未接種群６は、抗原投与後、予想通りに反応した。生弱毒化ウイルスの単回接種群（ＭＬＶ：改良生ワクチン；１群）とＲＰ１（Ｅ－ＧＰ２－３－４）ワクチンのブースター接種を受けた４群では、６群と同様のウイルス血症が検出された。ワクチン未接種群よりやや良好であったのは第５群であり、本発明に従った接種方法のワクチン接種を受けたが、逆の順序であった。
【0160】
しかしながら、すべてのグループの中で最良のものは、アルファウイルスＲＮＡ ＲＰ２単独またはＲＰ１との組合せを含むワクチンをブースターとして接種されたグループであった。ワクチンとしてアルファウイルスＲＮＡ ＲＰ１およびＲＰ２を含むワクチンでブースター接種した第２群は、チャレンジ後のウイルス血症が大幅に減少したが、弱毒生ＰＲＲＳＶを含むワクチンの後にブースター接種としてアルファウイルスＲＮＡ ＲＰ２を含むワクチンを接種した第３群は、全体的にウイルス血症が最も低かった。
【0161】
３群（本発明によるワクチン接種方法、ＲＰ２投与）と５群（逆順）のチャレンジ４日後のウイルス血症の差は約５ Ｃｑ点であり、これは２５のウイルス量の差に相当する。このように、本発明に従った正しいワクチン接種方法を適用すると、チャレンジウイルス血症を３２倍の係数で減少させることができた。
【0162】
同様に、生弱毒化ウイルスの単一ワクチン（１群）と３群（本発明に従った接種方法）との間のワクチン防御の向上を考えると、検出されるウイルス血症の差は、８ Ｃｑ点、即ち２５６分の１のウイルス血症であり、これは、群れにおけるＰＲＲＳＶの疾患の制御および拡大の点で、野外において非常に重要である。
【0163】
また、これは、Ｓｃ３遺伝子をコードするアルファウイルスＲＮＡ ＲＰを含むワクチンを用いることによる、プライミングワクチン接種のＰＲＲＳＶ ＤＶ株からチャレンジウイルスのＰＲＲＳＶ Ｓｃ３株への免疫防御の拡大を示す。
【実施例4】
【0164】
実施例４： ＰＥＤＶ －プライム－ブーストワクチン接種実験
ＰＲＲＳＶについて実施された実験にしたがって、ＰＥＤＶの感染からブタを防御するために本発明のワクチン接種の方法を用いて同様の実験を実施した。
ＰＲＲＳＶについて実施された実験にしたがって、ＰＥＤＶの感染からブタを防御するために本発明のワクチン接種の方法を用いて同様の実験を実施した。
【0165】
４．１序文
本実験では、本発明に従ったワクチン接種方法を用いて、授乳後の子ブタをＰＥＤＶ感染および疾患から保護するために、妊娠ブタへのワクチン接種の有効性を試験した。生弱毒化ウイルスを含むワクチンについては、ＰＥＤＶ株Ｓ－ＩＮＤＥＬ Ｉｏｗａ １０６を用いた。これはＰＥＤＶの２種類の新興株の１つである（Ｌｉｎら、２０１６， Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．， ｖｏｌ． ２２６， ｐ． ２０－３９）。アルファウイルスＲＮＡ ＲＰのワクチンは、非Ｓ－ＩＮＤＥＬ株であるＰＥＤＶの毒性ＵＳ分離株のスパイク蛋白質をコードするＲＰを含んでいた。
本実験では、本発明に従ったワクチン接種方法を用いて、授乳後の子ブタをＰＥＤＶ感染および疾患から保護するために、妊娠ブタへのワクチン接種の有効性を試験した。生弱毒化ウイルスを含むワクチンについては、ＰＥＤＶ株Ｓ－ＩＮＤＥＬ Ｉｏｗａ １０６を用いた。これはＰＥＤＶの２種類の新興株の１つである（Ｌｉｎら、２０１６， Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．， ｖｏｌ． ２２６， ｐ． ２０－３９）。アルファウイルスＲＮＡ ＲＰのワクチンは、非Ｓ－ＩＮＤＥＬ株であるＰＥＤＶの毒性ＵＳ分離株のスパイク蛋白質をコードするＲＰを含んでいた。
【0166】
試験デザイン
１４頭の妊娠ブタを、３つのワクチン接種群と１つの非ワクチン接種対照群（４群）を含む４つの治療群に無作為に割り付けた。ワクチン接種した雌ブタ全頭（第１群～第３群）は、出産の６、３および１週間前に３回ワクチン接種を受けていた。第２群および第３群の雌ブタに対する１回目および２回目のワクチンは、ＰＥＤＶ株Ｓ－ＩＮＤＥＬ Ｉｏｗａ １０６の生弱毒化ウイルスを含むワクチンであり、２種類の異なる粘膜接着剤のいずれかを混合したものであった。第１群の雌ブタには、ＰＥＤＶ非Ｓ－ＩＮＤＥＬ株のスパイク遺伝子をコードするＲＰワクチンによる２回のプライミングワクチン接種を行った。３回目のワクチン接種として、第１群～第３群のすべての雌ブタに、ＰＥＤＶスパイク遺伝子をコードするアルファウイルスＲＮＡ ＲＰのワクチンによるブースターワクチン接種を行った。実験群の概要を表３に示す。
１４頭の妊娠ブタを、３つのワクチン接種群と１つの非ワクチン接種対照群（４群）を含む４つの治療群に無作為に割り付けた。ワクチン接種した雌ブタ全頭（第１群～第３群）は、出産の６、３および１週間前に３回ワクチン接種を受けていた。第２群および第３群の雌ブタに対する１回目および２回目のワクチンは、ＰＥＤＶ株Ｓ－ＩＮＤＥＬ Ｉｏｗａ １０６の生弱毒化ウイルスを含むワクチンであり、２種類の異なる粘膜接着剤のいずれかを混合したものであった。第１群の雌ブタには、ＰＥＤＶ非Ｓ－ＩＮＤＥＬ株のスパイク遺伝子をコードするＲＰワクチンによる２回のプライミングワクチン接種を行った。３回目のワクチン接種として、第１群～第３群のすべての雌ブタに、ＰＥＤＶスパイク遺伝子をコードするアルファウイルスＲＮＡ ＲＰのワクチンによるブースターワクチン接種を行った。実験群の概要を表３に示す。
【0167】
異なる雌ブタ群から生まれた哺乳子ブタに、毒性ＰＥＤＶ株を胃内投与した。ワクチンの有効性は、ワクチンが子ブタの死亡率を低下させ、子ブタの体重増加を維持する能力によって測定した。子ブタにおけるＰＥＤＶ特異的、母由来抗体（ＭＤＡ）に関する免疫応答も評価した。
【0168】
【0169】
材料および方法
被験物質
アルファウイルスＲＮＡ ＲＰのワクチン
アルファウイルスＲＮＡ ＲＰを含むワクチンは、ＶＥＥＶ株ＴＣ－８３からのレプリコン構築物に基づいた。これは、ＵＳ毒性ＰＥＤＶ株ＡＨ２０１２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＫＣ２１０１４５参照）のスパイクタンパク質のコード配列を含むように構築された。これは、ＩＭワクチン接種のために、アジュバントを用いずに、１ｍｌ用量で１０８ ＲＰ／ｍｌで処方された。
被験物質
アルファウイルスＲＮＡ ＲＰのワクチン
アルファウイルスＲＮＡ ＲＰを含むワクチンは、ＶＥＥＶ株ＴＣ－８３からのレプリコン構築物に基づいた。これは、ＵＳ毒性ＰＥＤＶ株ＡＨ２０１２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＫＣ２１０１４５参照）のスパイクタンパク質のコード配列を含むように構築された。これは、ＩＭワクチン接種のために、アジュバントを用いずに、１ｍｌ用量で１０８ ＲＰ／ｍｌで処方された。
【0170】
ＲＰは、９６ウェルプレート、１０倍連続希釈でＶｅｒｏ細胞単層培養上で力価測定した。この平板を３７°Ｃで１８～２４時間インキュベートした。次に、プレートを洗浄し、固定し、一次抗体で染色した後、結合二次抗体で染色した。細胞を蛍光顕微鏡を用いて調べる。個々の抗原陽性細胞を計数する。ＲＰ／ｍｌで表した力価は、既知の希釈および接種容量から計算し、重複したウェル間で平均した。
【0171】
生弱毒化ワクチン
第２群ワクチン
ＰＥＤＶ Ｓ－ＩＮＤＥＬ Ｉｏｗａ １０６の用量当たり１０６ ＴＣＩＤ５０の、継代３６を、経口接種の直前に、Ｇａｎｔｒｅｚ（商標） （１：１ ｖ／ｖ比）、５％ショ糖および２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．３と混合した。
第２群ワクチン
ＰＥＤＶ Ｓ－ＩＮＤＥＬ Ｉｏｗａ １０６の用量当たり１０６ ＴＣＩＤ５０の、継代３６を、経口接種の直前に、Ｇａｎｔｒｅｚ（商標） （１：１ ｖ／ｖ比）、５％ショ糖および２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．３と混合した。
【0172】
第３群ワクチン
ＰＥＤＶ Ｓ－ＩＮＤＥＬ Ｉｏｗａ １０６の用量当たり１０６ ＴＣＩＤ５０、継代３６を、経口ワクチン接種の直前に、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ） （１：１ ｖ／ｖ比）５％ショ糖および２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．３と混合した。
ＰＥＤＶ Ｓ－ＩＮＤＥＬ Ｉｏｗａ １０６の用量当たり１０６ ＴＣＩＤ５０、継代３６を、経口ワクチン接種の直前に、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ） （１：１ ｖ／ｖ比）５％ショ糖および２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．３と混合した。
【0173】
ＰＥＤＶ Ｓ－ＩＮＤＥＬ Ｉｏｗａ １０６ウイルスを、コンフルエントなＶｅｒｏ細胞を有する９６ウェルプレート上で力価測定した。プレートを５％ ＣＯ２と共に３７℃でインキュベートし、感染後の細胞変性作用について毎日２～３日間観察し、および／またはブタ抗ＰＥＤＶ特異抗体（ＵＳＤＡ－ＮＶＳＬ、エームズ、アイエームズ）によるＩＦＡ染色を用いて検査した後、インキュベーション期間の終わりにＦＩＴＣ結合二次抗体を用いて検査した。ＰＥＤＶ力価は、Ｓｐｅａｒｍａｎ／Ｋａｅｒｂｅｒ法を用いて、Ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０／ｍＬとして算出した。
【0174】
チャレンジウイルス
チャレンジは、３～５日齢の哺乳ブタにＰＥＤＶ株Ｃｏｌｏｒａｄｏ ２０１３分離株をブタあたり１０＾５ ＴＣＩＤ５０胃内投与して実施した。
チャレンジは、３～５日齢の哺乳ブタにＰＥＤＶ株Ｃｏｌｏｒａｄｏ ２０１３分離株をブタあたり１０＾５ ＴＣＩＤ５０胃内投与して実施した。
【0175】
ＰＥＤＶ生弱毒化ウイルスと同様に、Ｖｅｒｏ細胞上でチャレンジウイルスを力価測定した。
【0176】
糞便流出
Ｃｈｅｎら（２０１４， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ｖｏｌ． ５２， ｐ． ２３４－２４３）にしたがって、ＰＥＤＶ ＲＮＡ抽出およびＰＥＤＶウイルス血症の検出にはｑＲＴ－ＰＣＲ法を用いた。ＭａｇＭＡＸ（商標） Ｐａｔｈｏｇｅｎ ＲＮＡ／ＤＮＡ Ｋｉｔ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）およびＫｉｎｇｆｉｓｈｅｒ ９６ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ， ＵＳＡ）を製造業者の指示に従って使用した。ｑＲＴ－ＰＣＲはＰａｔｈ－ＩＤ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用い、ＡＢＩ ７５００ Ｆａｓｔ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（商標） （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）にて実施した。
Ｃｈｅｎら（２０１４， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ｖｏｌ． ５２， ｐ． ２３４－２４３）にしたがって、ＰＥＤＶ ＲＮＡ抽出およびＰＥＤＶウイルス血症の検出にはｑＲＴ－ＰＣＲ法を用いた。ＭａｇＭＡＸ（商標） Ｐａｔｈｏｇｅｎ ＲＮＡ／ＤＮＡ Ｋｉｔ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， ＵＳＡ）およびＫｉｎｇｆｉｓｈｅｒ ９６ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ， ＵＳＡ）を製造業者の指示に従って使用した。ｑＲＴ－ＰＣＲはＰａｔｈ－ＩＤ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用い、ＡＢＩ ７５００ Ｆａｓｔ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（商標） （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）にて実施した。
【0177】
血清学的検査
雌ブタにおける血清、初乳および乳汁中のＰＥＤＶ特異的中和抗体、ならびに子ブタ血清中の受動抗体を蛍光焦点中和（ＦＦＮ）試験により測定した。
雌ブタにおける血清、初乳および乳汁中のＰＥＤＶ特異的中和抗体、ならびに子ブタ血清中の受動抗体を蛍光焦点中和（ＦＦＮ）試験により測定した。
【0178】
チャレンジＰＥＤＶ株のＰＥＤＶスパイク蛋白質のＳ１部分に対する血清中のＰＥＤＶ抗体を抗体ＥＬＩＳＡで測定した。マイクロタイタープレートをＰＥＤＶスパイク蛋白質（ＰＥＤＶ株コロラド２０１３由来の組換えＳ１ダイマー；０．２５μｇ／ｍｌ）１００μLでコーティングした。血清をＰＢＳ ／１ ％ ＢＳＡで１：９００に希釈し、コーティングしたウェルに添加した後、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ ／０．０５ ％ Ｔｗｅｅｎ２０で２回洗浄した後、ＰＢＳ ／１ ％ ＢＳＡ ／０．５ ％ Ｔｗｅｅｎ２０で１：１０．０００に希釈したウサギ抗ブタＩｇＧ ＨＲＰＯ結合体１００ μLをウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ ／０．０５ ％ Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した後、ＴＭＢ「ｓｕｐｅｒ ｓｌｏｗ」（商標）基質１００ μL ／ｗｅｌｌを各ウェルに添加し、室温で暗所で１０分間インキュベートした。２５％硫酸１００ μL／ｗｅｌｌを加えて反応を停止した。４５０ｎｍの光学濃度（ＯＤ）をＥＬＩＳＡリーダーで測定した。自然ＰＥＤＶ感染ブタの血清を陽性対照として含めた。
【0179】
４．４ 結果および結論
結果を以下の表４～６に示す。
結果を以下の表４～６に示す。
【0180】
本発明によるワクチン接種の方法でワクチン接種された２群および３群の妊娠した雌ブタから生まれた子ブタは、非ワクチン接種雌ブタから生まれた子ブタ（４群）と比較して、また同種プライム－ブーストＲＰワクチンを受けた群（１群）と比較して、死亡率が有意に低下した。
【0181】
異種ワクチン接種法で経口プライムした雌ブタ（第２群および第３群）は、同種プライム－ブーストＲＰワクチンでワクチン接種した雌ブタ（第１群）および非ワクチン接種対照雌ブタ（第４群）と比較して、血清中のＰＥＤＶ特異抗体レベルが有意に高かった。
【0182】
第２群および第３群の雌ブタから生まれた子ブタは、第１群および第４群の雌ブタから生まれた子ブタと比較してＰＥＤＶ特異的中和ＭＤＡが有意に高かった。２群の雌ブタ由来の子ブタのＩｇＡ抗体レベルは、他のすべてのワクチン接種群よりも有意に高かった。
【0183】
【0184】
【0185】
【図1】
【図2】
【図3】