特許 7513709 抗コハク酸モノクローナル抗体およびヒト化抗コハク酸抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-07-01

(45)【発行日】2024-07-09

(54)【発明の名称】抗コハク酸モノクローナル抗体およびヒト化抗コハク酸抗体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/18 20060101AFI20240702BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20240702BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240702BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240702BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20240702BHJP

【ＦＩ】

C07K16/18 ZNA

C07K16/46

A61K39/395 T

A61K39/395 N

A61P35/00

C12P21/08

【請求項の数】 12

(21)【出願番号】P 2022522953

(86)(22)【出願日】2020-10-16

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-12-14

(86)【国際出願番号】 US2020056052

(87)【国際公開番号】W WO2021076942

(87)【国際公開日】2021-04-22

【審査請求日】2023-01-19

(31)【優先権主張番号】62/916,376

(32)【優先日】2019-10-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】512175133

【氏名又は名称】ナショナル ヘルス リサーチ インスティテューツ

【氏名又は名称原語表記】Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ

(74)【代理人】

【識別番号】110003214

【氏名又は名称】弁理士法人服部国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】クオ チェン‐チン

(72)【発明者】

【氏名】ウー ジン‐イン

【審査官】松本 淳

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１９／０５３７３１（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＰＤＢ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の（ａ）または（ｂ）を含む、抗コハク酸モノクローナル抗体。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を含む重鎖、および、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を含む軽鎖
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列を含む重鎖、および、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸配列を含む軽鎖

【請求項2】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を含む重鎖と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を含む軽鎖と、を有する、請求項１に記載の抗コハク酸モノクローナル抗体。

【請求項3】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列を含む重鎖と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸配列を含む軽鎖と、を有する、請求項１に記載の抗コハク酸モノクローナル抗体。

【請求項4】

血清コハク酸を中和する、請求項１に記載の抗コハク酸モノクローナル抗体。

【請求項5】

癌転移およびマクロファージの腫瘍関連マクロファージへの形質転換を阻害する、請求項１に記載の抗コハク酸モノクローナル抗体。

【請求項6】

ＳＵＣＮＲ１シグナル伝達経路を阻害する、請求項１に記載の抗コハク酸モノクローナル抗体。

【請求項7】

ＡＲＧ１の発現を抑制する、請求項１に記載の抗コハク酸モノクローナル抗体。

【請求項8】

以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）を含む、ヒト化抗コハク酸抗体。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインＶＨ３、および、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインＶＬ３
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインＶＨ４、および、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインＶＬ２
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインＶＨ４、および、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインＶＬ３

【請求項9】

血清コハク酸を中和する、請求項８に記載のヒト化抗コハク酸抗体。

【請求項10】

癌転移およびマクロファージの腫瘍関連マクロファージへの形質転換を阻害する、請求項８に記載のヒト化抗コハク酸抗体。

【請求項11】

ＳＵＣＮＲ１シグナル伝達経路を阻害する、請求項８に記載のヒト化抗コハク酸抗体。

【請求項12】

ＡＲＧ１の発現を抑制する、請求項８に記載のヒト化抗コハク酸抗体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本特許出願は、２０１９年１０月１７日に出願された仮特許出願第６２／９１６，３７６号の利益を主張するものである。米国特許出願第６２／９１６，３７６号の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。

【0002】

本発明は、癌を診断または治療するための新規バイオマーカーとしてコハク酸を使用することに関する。特に、本発明は、抗コハク酸モノクローナル抗体およびヒト化抗コハク酸抗体に関する。

【背景技術】

【0003】

免疫系は正常細胞と悪性細胞を識別するように進化してきた。活性化された免疫系は、損傷を受けた細胞および悪性細胞を排除して宿主を保護するための免疫応答を開始する。免疫監視の古典的概念によれば、免疫系は、健康における腫瘍のイニシエーションおよび発生を防止すべきである。実際、癌免疫サーベイランスの存在が、原発癌の発生に対して宿主を保護するだけでなく、腫瘍の免疫原性を形成することを示唆する証拠が増えている（ｄｅ Ｖｉｓｓｅｒら ２００６、Ｄｕｎｎら ２００４）。しかしながら、腫瘍のイニシエーションおよび形成に際して、腫瘍細胞は免疫系のホメオスタシスを損なうために寛容性シグナル伝達経路を活性化することができ、腫瘍免疫寛容を導き、古典的な免疫攻撃から逃れる。さらに、免疫細胞、内皮細胞、線維芽細胞が腫瘍微小環境に動員され、活性化されて腫瘍関連細胞となり、癌の増殖や転移の一因となる。

【0004】

腫瘍微小環境内で、癌細胞は可溶性分子を放出して、増殖、生存、および転移に有益なために発癌シグナル伝達を開始するだけでなく、腫瘍発生を増強するために免疫細胞を含む周囲の細胞に影響を及ぼす。しかし、宿主細胞は腫瘍細胞を異物として認識し、免疫学的監視の対象となる。したがって、腫瘍と免疫系との動的な相互作用は、腫瘍のイニシエーションとプログレッションの調節において極めて重要である。腫瘍微小環境における細胞の主要な集団であるマクロファージは、免疫恒常性および防御において必須の役割を果たしている。さらに、これらは微小環境中のシグナルによって活性化され、極性化されて機能的に異なる表現型、すなわち古典的に活性化された（Ｍ１）マクロファージと、選択的に活性化された（Ｍ２）マクロファージになる。多くの証拠が、腫瘍微小環境内のマクロファージが腫瘍由来サイトカインによってＭ２極性腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）に活性化され、腫瘍進行を促進し、抗腫瘍免疫応答を抑制することを示唆している。癌細胞は、それらを取り巻く様々な非癌性細胞の機能的表現型を制御するシグナルを生成し、腫瘍の発生を助ける。腫瘍細胞がその微小環境に細胞を動員し、周囲の細胞の表現型を変化させる機構を理解することは、より効果的な治療戦略を提供するかもしれない。

【0005】

細胞代謝産物プロファイルは、例えば健康または癌性などの生理学的または病理学的状態の重要な指標とみなされている。さらに、内因性代謝産物は、免疫ホメオスタシスおよび腫瘍発生などの細胞生物学的プロセスの調節に関与している。言い換えると、特定の代謝産物は正常な生理学的過程を維持するために必要である。逆に、ストレス下で有害な反応を誘発する代謝産物もある。例えば、腫瘍細胞から放出されるトリプトファン代謝産物キヌレニンは、癌細胞の進行を促進する。しかし、宿主細胞は防御代謝産物を放出して腫瘍の進行を抑制することができる。例えば、線維芽細胞は、新規トリプトファン代謝産物である５－メトキシトリプトファンを産生し、細胞外環境に放出して、パラクリン様式、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでＣＯＸ－２の過剰発現および腫瘍形成を抑制する。特に、癌関連線維芽細胞ではこの代謝産物の産生が抑制されることから、腫瘍細胞は宿主細胞の表現型に影響を及ぼすことにより抗腫瘍反応を打ち消す可能性が示唆される。癌細胞が内在性因子を産生・放出し、抗腫瘍免疫応答を抑制することで腫瘍の進行を促進する可能性が非常に高い。

【0006】

したがって、本発明は、抗コハク酸モノクローナル抗体およびヒト化抗コハク酸抗体を提供する。

【0007】

なお、以下明細中、「コハク酸」には「コハク酸塩」を含む場合がある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

上記の目的に基づき、本発明は、分泌された腫瘍由来コハク酸受容体（ＳＵＣＮＲ１）シグナル伝達を活性化して、マクロファージを腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）に極性化し、腫瘍転移を促進し、癌患者において血清コハク酸のレベルが上昇する原因となることを開示する。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明の一態様は、以下の（ａ）または（ｂ）を含む、抗コハク酸モノクローナル抗体を提供する。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を含む重鎖、および、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を含む軽鎖。
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列を含む重鎖、および、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸配列を含む軽鎖。

【0010】

いくつかの実施形態では、抗コハク酸モノクローナル抗体は、ヒト化抗コハク酸抗体である。

【0011】

本発明のいくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、血清コハク酸を中和することができる。

【0012】

他の実施形態では、モノクローナル抗体は、癌転移およびマクロファージの腫瘍関連マクロファージへの形質転換を阻害することができる。

【0013】

別の実施形態において、モノクローナル抗体は、ＳＵＣＮＲ１シグナル伝達経路を阻害し得、ＡＲＧ１の発現を抑制する。

【0014】

いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を含む重鎖と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を含む軽鎖と、を有する。

【0015】

他の実施形態において、モノクローナル抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列を含む重鎖と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸配列を含む軽鎖と、を有する。

【0016】

いくつかの実施形態では、ヒト化抗コハク酸抗体は、以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）を含む。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインＶＨ３、および、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインＶＬ３。
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインＶＨ４、および、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインＶＬ２。
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインＶＨ４、および、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインＶＬ３。

【0017】

他の実施形態では、ヒト化抗コハク酸抗体は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２、２３、２４、２５、および２６のＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインＶＨ１～ＶＨ５と、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、および３４のＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインＶＬ１～ＶＬ８と、を含む。

【0018】

参考態様は、コハク酸アンタゴニストを必要とする対象に投与することを含む、癌を治療する方法に関する。

【0019】

参考態様のいくつかの実施形態において、癌は、非小肺癌、肺癌、前立腺癌、乳癌または結腸癌である。

【0020】

参考態様のいくつかの実施形態において、コハク酸アンタゴニストは、抗コハク酸モノクローナル抗体である。

【0021】

参考態様の他の実施形態では、コハク酸アンタゴニストは、ＳＵＣＮＲ１阻害剤である。参考態様のいくつかの実施形態では、ＳＵＣＮＲ１阻害剤はＳＵＣＮＲ１ ｓｉＲＮＡである。

【0022】

別の参考態様は、対象における血清コハク酸レベルを検出することを含む、癌を診断する方法に関する。

【0023】

別の参考態様のいくつかの実施形態において、癌は、非小肺癌、肺癌、前立腺癌、乳癌または結腸癌である。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1A】対照培地、ＬＣＣ－ＣＭ、またはＡ５４９－ＣＭ中でインキュベートした腹膜マクロファージのＡＲＧ１タンパク質発現を示す図である。マクロファージにおけるＴＡＭマーカー発現を誘導する癌調整培地中に可溶性因子が存在することを示している。

【図1B】対照培地、ＬＣＣ－ＣＭ、またはＡ５４９－ＣＭ中でインキュベートした腹膜マクロファージのＡｒｇ１ ｍＲＮＡ発現を示す図である。マクロファージにおけるＴＡＭマーカー発現を誘導する癌調整培地中に可溶性因子が存在することを示している。

【図1C】対照培地またはＰＣ３－ＣＭで処理したマクロファージにおけるＡＲＧ１発現レベルを示す図である。マクロファージにおけるＴＡＭマーカー発現を誘導する癌調整培地中に可溶性因子が存在することを示している。

【図1D】対照培地またはＭＣＦ－７（ＭＣＦ７－ＣＭ）またはＨＴ－２９（ＨＴ２９－ＣＭ）から収集した条件培地中で、２４時間インキュベートしたマクロファージのＡｒｇ１ ｍＲＮＡ発現を示す図である。マクロファージにおけるＴＡＭマーカー発現を誘導する癌調整培地中に可溶性因子が存在することを示している。

【図1E】ＳＣＭまたはＰＣＭで２４時間培養した腹膜マクロファージにおけるＡｒｇ１、Ｆｉｚｚ１およびＭｇｌ１ ｍＲＮＡ発現を示す図である。マクロファージにおけるＴＡＭマーカー発現を誘導する癌調整培地中に可溶性因子が存在することを示している。

【図1F】対照培地、ＬＬＣ－ＣＭ、ＬＬＣ－ＳＣＭ、またはＬＬＣ－ＰＣＭで３日間培養されたマクロファージにおけるＶＣＡＭ１⁺ＣＤ１１ｃ⁺ＣＤ１１ｂ^low－マクロファージ集団を示す図である。マクロファージにおけるＴＡＭマーカー発現を誘導する癌調整培地中に可溶性因子が存在することを示している。

【図2A】対照培地およびＬＬＣ－ＳＣＭのＬＣ－ＭＳスペクトルに基づくＰＣＡのスコアプロットを示す図である。肺癌ならし培地の小分子画分からのコハク酸の同定を示している。図中「Ｃｏｎｔｒｏｌ ｍｅｄｉｕｍ」は「対照培地」を意味する。

【図2B】ＯＰＬＳ－ＤＡから生成されたＳプロットを示す図である。肺癌ならし培地の小分子画分からのコハク酸の同定を示している。図中「Ｃｏｎｔｒｏｌ ｍｅｄｉｕｍ」は「対照培地」を意味する。

【図2C】ＬＬＣ－ＣＭ、Ａ５４９－ＳＣＭ、対照培地ＤＭＥＭまたは純粋コハク酸の代表的な質量スペクトル（保持時間１．８分、ｍ／ｚ５０－４００）を示す図である。肺癌ならし培地の小分子画分からのコハク酸の同定を示している。図中「Ａｂｕｎｄａｎｃｅ」は「存在量」を、「Ｃｏｎｔｒｏｌ ｍｅｄｉｕｍ」は「対照培地」を、「Ｐｕｒｅ ｓｕｃｃｉｎａｔｅ」は「純粋コハク酸」を意味する。

【図2D】ＬＬＣ－ＣＭ、Ａ５４９－ＳＣＭ、対照培地ＤＭＥＭまたは純粋コハク酸の代表的な質量スペクトル（保持時間１．８分、ｍ／ｚ５０－４００）を示す図である。肺癌ならし培地の小分子画分からのコハク酸の同定を示している。図中「Ａｂｕｎｄａｎｃｅ」は「存在量」を、「Ｃｏｎｔｒｏｌ ｍｅｄｉｕｍ」は「対照培地」を意味する。

【図2E】ＬＣ－ＭＳＭＳ（ＭＳ２）による、ＬＬＣ－ＳＣＭ ＭＳ１スペクトルのｍ／ｚ１１７．０の娘プロファイル対、純粋コハク酸の娘プロファイルの分析を示す図である。肺癌ならし培地の小分子画分からのコハク酸の同定を示している。図中「Ａｂｕｎｄａｎｃｅ」は「存在量」を、「Ｐｕｒｅ ｓｕｃｃｉｎａｔｅ」は「純粋コハク酸」を意味する。

【図3A】対照培地、ＬＬＣ－ＣＭ、Ａ５４９－ＣＭ、ＰＣ３－ＣＭ、ＭＣＦ－７－ＣＭ、ＨＴ－２９－ＣＭまたは腹膜マクロファージ－ＣＭ中のコハク酸濃度を示す図である。異なる癌細胞調整培地および原発性皮下腫瘍におけるコハク酸の濃度を示している。図中「Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ」は「コハク酸」を意味する。

【図3B】ＬＬＣ細胞を皮下注射したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスから切除した原発性皮下腫瘍におけるコハク酸濃度を示す図である。異なる癌細胞調整培地および原発性皮下腫瘍におけるコハク酸の濃度を示している。図中、「Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ」は「コハク酸」を、「Ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ ｐｒｉｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ」は「同系原発腫瘍」を意味する。

【図4A】異なる濃度のコハク酸で２４時間処理したマクロファージにおけるＡＲＧ１発現を示す図である。コハク酸がマクロファージのＴＡＭへの分極を促進することを示している。図中「Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ」は「コハク酸」を意味する。

【図4B】コハク酸（１ｍＭ）で２４時間培養したマクロファージにおけるＡｒｇ１、Ｆｉｚｚ１、Ｍｇｌ１、およびＭｇｌ２のｍＲＮＡ発現を示す図である。コハク酸がマクロファージのＴＡＭへの分極を促進することを示している。図中「Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ」は「コハク酸」を意味する。

【図4C】３日間コハク酸（１ｍＭ）で促進されたマクロファージにおけるＶＣＡＭ１⁺ＣＤ１１ｃ⁺ＣＤ１１ｂ^low－ＴＡＭ集団を示す図である。コハク酸がマクロファージのＴＡＭへの分極を促進することを示している。図中「Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ」は「コハク酸」を意味する。

【図4D】続いてコハク酸（２０および１００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射を受けたＬＬＣ注射マウスから得られた一次皮下腫瘍におけるＴＡＭ集団の割合を示す図である。コハク酸がマクロファージのＴＡＭへの分極を促進することを示している。図中「Ｓａｌｉｎｅ」は「生理食塩水」を、「Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ」は「コハク酸」を、「ｍｅａｎ」は「平均」を、「ＳＥＭ」は「標準誤差」を意味する。

【図5A】無腫瘍肺組織および肺癌組織におけるＳＵＣＮＲ１ ｍＲＮＡ発現量を示す図である。非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）における血清コハク酸と腫瘍ＳＵＣＮＲ１の臨床的意義を示している。図中「ｍｅａｎ」は「平均」を、「ＳＥＭ」は「標準誤差」を、「Ｔｕｍｏｒ－ｆｒｅｅ」は「無腫瘍」を、「Ｔｕｍｏｒ」は「腫瘍」を意味する。

【図5B】ＬＬＣ接種の前および１６日後のマウスにおける血清コハク酸濃度を示す図である。ＮＳＣＬＣにおける血清コハク酸と腫瘍ＳＵＣＮＲ１の臨床的意義を示している。図中「Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ」は「コハク酸」を、「Ｔｕｍｏｒ－ｆｒｅｅ」は「無腫瘍」を、「Ｔｕｍｏｒ」は「腫瘍」を意味する。

【図5C】健常被験者およびＮＳＣＬＣ患者における血清コハク酸濃度を示す図である。ＮＳＣＬＣにおける血清コハク酸と腫瘍ＳＵＣＮＲ１の臨床的意義を示している。図中「Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ」は「コハク酸」を、「ｍｅａｎ」は「平均」を、「ＳＥＭ」は「標準誤差」を、「Ｈｅａｌｔｈｙ ｄｏｎｏｒ」は「健康なドナー」を、「Ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔ」は「癌患者」を意味する。

【図5D】ＡＵＲＯＣ曲線によるＮＳＣＬＣ患者における血清コハク酸の識別力の分析を示す図である。ＮＳＣＬＣにおける血清コハク酸と腫瘍ＳＵＣＮＲ１の臨床的意義を示している。図中「Ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ」は「肺癌」を、「ＲＯＣ ｃｕｒｖｅ」は「ＲＯＣ曲線」を、「Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ」は「感度」を、「Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ」は「特異性」を、「Ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ」は「肺癌患者」を、「ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒｖａｌ」は「信頼区間」を、「Ｐ ｖａｌｕｅ」は「Ｐ値」を、「Ｃｕｔｏｆｆ」は「カットオフ」を、「Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ」は「コハク酸」を意味する。

【図6A】抗コハク酸抗体の特異性を示す図である。抗コハク酸抗体がコハク酸を中和する能力およびその特異性を示している。図中「Ｄｉｌｕｔｉｏｎ」は「希釈度」を、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ａｎｔｉ-ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ａｃｉｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ」は「プロテインＡ精製抗コハク酸抗体」を、「Ｔｉｔｅｒ」は「力価」を、「Ｓｔａｒｔｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ」は「開始希釈」を、「Ｔｈｅ ｔｉｔｅｒ ｉｓ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｓ／Ｂ （Ｓｉｇｎａｌ／Ｂｌａｎｋ）」は「力価はシグナル／ブランクによる最高希釈度である。」を意味する。

【図6B】異なる濃度の抗コハク酸抗体と共にインキュベートしたＬＬＣ－ＣＭまたはＡ５４９－ＣＭにおけるコハク酸レベルを示す図である。抗コハク酸抗体がコハク酸を中和する能力およびその特異性を示している。図中「Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ」は「コハク酸」を意味する。

【図6C】対照ＩｇＧまたは抗コハク酸抗体（Ｓｕｃｃ Ａｂ）で２４時間処理したＬＬＣ細胞の遊走アッセイ結果を示す図である。抗コハク酸抗体がコハク酸を中和する能力およびその特異性を示している。図中「Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ」は「遊走」を意味する。

【図7A】対照ＩｇＧまたは抗コハク酸抗体と共に２４時間インキュベートしたＬＬＣ－ＣＭ処理ＰＭφにおけるＡＲＧ１発現レベルを示す図である。モノクローナル抗体が担癌マウスにおいてＴＡＭの極性化および癌転移を有意に抑制し、生存率を改善することを示している。

【図7B】コハク酸（１ｍＭ）で３日間刺激された抗コハク酸抗体または対照ＩｇＧ前処理ＰＭφのＶＣＡＭ１⁺ＣＤ１１ｃ⁺ＣＤ１１ｂ^low－ＴＡＭ集団を示す図である。モノクローナル抗体が担癌マウスにおいてＴＡＭの極性化および癌転移を有意に抑制し、生存率を改善することを示している。図中「Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ」は「コハク酸」を意味する。

【図7C】対照ＩｇＧ、抗コハク酸抗体を含むまたは含まないコハク酸（１ｍＭ）で２４時間処理したマクロファージの遊走アッセイ結果を示す図である。モノクローナル抗体が担癌マウスにおいてＴＡＭの極性化および癌転移を有意に抑制し、生存率を改善することを示している。図中「Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ」は「遊走」を、「Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ」は「コハク酸」を意味する。

【図7D】６Ｇ１０Ｆ６モノクローナル抗体（１および５ｍｇ／ｋｇ）またはＩｇＧ対照抗体（５ｍｇ／ｋｇ）で処置したＬＬＣ腫瘍保有Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスのＴＡＭ分極レベルを示す図である。モノクローナル抗体が担癌マウスにおいてＴＡＭの極性化および癌転移を有意に抑制し、生存率を改善することを示している。図中「Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ」は「コハク酸」を意味する。

【図7E】６Ｇ１０Ｆ６モノクローナル抗体（１および５ｍｇ／ｋｇ）またはＩｇＧ対照抗体（５ｍｇ／ｋｇ）で処置したＬＬＣ腫瘍保有Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの小結節数を示す図である。モノクローナル抗体が担癌マウスにおいてＴＡＭの極性化および癌転移を有意に抑制し、生存率を改善することを示している。図中「Ｎｏｄｕｌｅｓ ｎｕｍｂｅｒ」は「小結節数」を、「Ｓａｌｉｎｅ」は「生理食塩水」を、「ａｎｔｉ－ｓｕｃｃｉｎａｔｅ」は「抗コハク酸」を意味する。

【図7F】６Ｇ１０Ｆ６モノクローナル抗体（１および５ｍｇ／ｋｇ）またはＩｇＧ対照抗体（５ｍｇ／ｋｇ）で処置したＬＬＣ腫瘍保有Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの生存時間を示す図である。モノクローナル抗体が担癌マウスにおいてＴＡＭの極性化および癌転移を有意に抑制し、生存率を改善することを示している。図中「Ｓａｌｉｎｅ」は「生理食塩水」を意味する。

【図8】抗体６Ｇ１０Ｆ６のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す図である。図中「Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ６Ｇ１０Ｆ６ ｗｅｒｅ ｌｉｓｔｅｄ ａｓ ｂｅｌｏｗ」は「６Ｇ１０Ｆ６の抗体配列は以下の通りである」を、「Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ」は「重鎖」を、「Ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ」は「リーダー配列」を、「ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ」は「ＤＮＡ配列」を、「Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ」は「アミノ酸配列」を、「Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ」は「軽鎖」を意味する。

【図9】抗体６Ｇ１０Ｇ５のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す図である。図中「Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ６Ｇ１０Ｇ５ ｗｅｒｅ ｌｉｓｔｅｄ ａｓ ｂｅｌｏｗ」は「６Ｇ１０Ｇ５の抗体配列は以下の通りである」を、「Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ」は「重鎖」を、「Ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ」は「リーダー配列」を、「ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ」は「ＤＮＡ配列」を、「Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ」は「アミノ酸配列」を、「Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ」は「軽鎖」を意味する。

【図10】６Ｇ１０Ｆ６モノクローナル抗体をヒト化するクローニング戦略を示す図である。図中「Ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｙ」は「クローニング戦略」を、「Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ」は「重鎖」を、「ＥｃｏＲＩ－－Ｋｏｚａｋ ｓｅｑｕｅｎｃｅ－－Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ－－Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ―ｈｕｍａｎ ＩｇＧ４ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ―ｓｔｏｐ ｃｏｄｏｎ－－ＨｉｎｄIII」は「ＥｃｏＲＩ－－コザック配列－－人工シグナルペプチド－－重鎖可変領域―ヒトＩｇＧ４定常領域―終止コドン－－ＨｉｎｄIII」を、「Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ」は「重鎖配列」を、「Ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ」は「遺伝子配列」を、「Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ」は「軽鎖」を、「ＥｃｏＲＩ－－Ｋｏｚａｋ ｓｅｑｕｅｎｃｅ－－Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ－－Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ―ｈｕｍａｎ Ｉｇ ｌａｍｂｄａ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ―ｓｔｏｐ ｃｏｄｏｎ－－ＨｉｎｄIII」は「ＥｃｏＲＩ－－コザック配列－－人工シグナルペプチド－－軽鎖可変領域―ヒトＩｇラムダ定常領域―終止コドン－－ＨｉｎｄIII」を、「Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ」は「軽鎖配列」を意味する。

【図11】マウスモノクローナル抗体Ｆｖフラグメントの相同性モデリングを示す図である。図中「Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏ ａｎｄ ２ＢＪＭ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｉｓ ｓｈｏｗｎ ｂｅｌｏｗ， ｗｈｅｒｅ '｜' ｉｓ ｔｈｅ ｃｈａｉｎ ｂｒｅａｋ ａｎｄ ＊ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ｂｏｔｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」は「マウスモノ鋳型と２ＢＪＭ鋳型との間のアミノ酸配列アライメントを以下に示す。'｜'は鎖切断、＊は両配列の同一アミノ酸残基を示す」を意味する。

【図12A】レーンＭ１がタンパク質マーカーであるＴａＫａＲａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．３４５２、レーン１が還元条件、レーン２が非還元条件である、６Ｇ１０Ｆ６キメラ抗体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析、および、レーンＭ２がタンパク質マーカーであるＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ００５２１、レーンＰが正の制御としてヒトＩｇＧ１ Ｋａｐｐａ（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ.Ｎｏ．Ｉ５１５４）、レーン１が還元条件であり、レーン２が非還元条件である、６Ｇ１０Ｆ６キメラ抗体のウェスタンブロット分析を示す図である。６Ｇ１０Ｆ６キメラ抗体の結合確認を示している。

【図12B】キメラ抗体の親和性測定を示す図である。６Ｇ１０Ｆ６キメラ抗体の結合確認を示している。図中「Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ」は「キメラ抗体の親和性測定」を、「Ｌｉｇａｎｄ」は「リガンド」を、「Ａｎａｌｙｔｅ」は「分析物」を、「Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＩｇＧ」は「キメラＩｇＧ」を、「ＢＳＡ－ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ」は「ＢＳＡコハク酸」意味する。

【図12C】キメラ抗体の親和性測定を示す図である。６Ｇ１０Ｆ６キメラ抗体の結合確認を示している。

【図13】Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）を用いたヒト化抗体のアフィニティーランキングを示す図である。図中「ｋｉｎｅｔｉｃ ｄａｔａ ｏｆ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ Ａｇ ｕｓｉｎｇ Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ」は「Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標） ８Ｋを使用したＡｇに対する選択されたヒト化抗体の動態データ」を、「Ａｎａｌｙｔｅ」は「分析物」を意味する。

【図14A】非還元条件および還元条件下での選択された抗体の結果を示す図である。選択された復帰突然変異抗体の産生を示している。

【図14B】精製ＩｇＧの純度および収率を示す図である。選択された復帰突然変異抗体の産生を示している。

【図15A】Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）を使用することによる１：１相互作用モデルの結果を示す図である。キメラおよび３つのヒト化抗体の親和性測定を示している。図中「１：１ ｂｉｎｄｉｎｇ」は「１対１結合」を意味する。

【図15B】親キメラ抗体に対する抗原結合親和性を示す図である。キメラおよび３つのヒト化抗体の親和性測定を示している。図中「Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｄ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」は「キメラ抗体とヒト化抗体の親和性測定」を、「Ｌｉｇａｎｄ」は「リガンド」を、「Ａｎａｌｙｔｅ」は「分析物」を、「ＢＳＡ－ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ」は「ＢＳＡコハク酸」を意味する。

【図16A】抗原に対する４つの精製抗体の熱安定性評価結果を示す図である。すべての抗体は－８０℃、４℃、２５℃、および４０℃で１ヶ月から２ヶ月まで処理される。図中「Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＩｇＧ」は「キメラＩｇＧ」を、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ」は「抗体濃度」を意味する。

【図16B】抗原に対する４つの精製抗体の熱安定性評価結果を示す図である。すべての抗体は－８０℃、４℃、２５℃、および４０℃で１ヶ月から２ヶ月まで処理される。図中「Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ」は「抗体濃度」を意味する。

【図16C】抗原に対する４つの精製抗体の熱安定性評価結果を示す図である。すべての抗体は－８０℃、４℃、２５℃、および４０℃で１ヶ月から２ヶ月まで処理される。図中「Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ」は「抗体濃度」を意味する。

【図16D】抗原に対する４つの精製抗体の熱安定性評価結果を示す図である。すべての抗体は－８０℃、４℃、２５℃、および４０℃で１ヶ月から２ヶ月まで処理される。図中「Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ」は「抗体濃度」を意味する。

【図16E】抗原に対する９つの粗ＩｇＧサンプルの熱安定性評価結果を示す図である。すべての抗体は－８０℃、４℃、２５℃、および４０℃で１ヶ月から２ヶ月まで処理される。図中「Ｓｕｐ」は「Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ」の略で「上清」を、「Ｄｉｌｕｔｉｏｎ」は「希釈度」を意味する。

【図16F】抗原に対する９つの粗ＩｇＧサンプルの熱安定性評価結果を示す図である。すべての抗体は－８０℃、４℃、２５℃、および４０℃で１ヶ月から２ヶ月まで処理される。図中「Ｓｕｐ」は「Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ」の略で「上清」を、「Ｄｉｌｕｔｉｏｎ」は「希釈度」を意味する。

【図16G】抗原に対する９つの粗ＩｇＧサンプルの熱安定性評価結果を示す図である。すべての抗体は－８０℃、４℃、２５℃、および４０℃で１ヶ月から２ヶ月まで処理される。図中「Ｓｕｐ」は「Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ」の略で「上清」を、「Ｄｉｌｕｔｉｏｎ」は「希釈度」を意味する。

【図17A】対照ＩｇＧおよび抗ＳＵＣＮＲ１抗体で１時間処理したコハク酸誘導マクロファージにおけるＶＣＡＭ１⁺ＣＤ１１ｃ⁺ＣＤ１１ｂ^low－ＴＡＭの倍数変化を示す図である。ＳＵＣＮＲ１がコハク酸誘導マクロファージ分極に必要であることを示している。

【図17B】スクランブル対照ｓｉＲＮＡ、マウスＳＵＣＮＲ１ ｓｉＲＮＡ－２７８、－５５９、または－７５８で４８時間トランスフェクトしたマクロファージにおけるＳｕｃｎｒ１ ｍＲＮＡ発現を示す図である。ＳＵＣＮＲ１がコハク酸誘導マクロファージ分極に必要であることを示している。

【図17C】スクランブル対照ｓｉＲＮＡ、マウスＳＵＣＮＲ１ ｓｉＲＮＡ－２７８、－５５９、または－７５８で４８時間トランスフェクトしたマクロファージにおけるＳＵＣＮＲ１タンパク質レベルを示す図である。ＳＵＣＮＲ１がコハク酸誘導マクロファージ分極に必要であることを示している。

【図17D】マクロファージにおけるＡｒｇ１、Ｆｉｚｚ１、Ｍｇｌ１、およびＭｇｌ２ ｍＲＮＡ発現を示す図である。マクロファージは対照ｓｉＲＮＡ、マウスＳＵＣＮＲ１ ｓｉＲＮＡ－２７８、－５５９、または－７５８を１６時間スクランブルした。ＳＵＣＮＲ１がコハク酸誘導マクロファージ分極に必要であることを示している。

【図17E】種々のｓｉＲＮＡで処理したコハク酸誘導マクロファージにおけるＶＣＡＭ１⁺ＣＤ１１ｃ⁺ＣＤ１１ｂ^low－ＴＡＭ集団を示す図である。ＳＵＣＮＲ１がコハク酸誘導マクロファージ分極に必要であることを示している。図中「ｓｕｃｃｉｎａｔｅ」は「コハク酸」を意味する。

【図18A】対照培地（ＤＭＥＭ）またはＡ５４９由来のＣＭ（Ａ５４９－ＣＭ）で培養したマクロファージの遊走アッセイ結果を示す図である。腫瘍由来のコハク酸がＳＵＣＮＲ１を活性化し、腹腔マクロファージの遊走を促進することを示している。図中「Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ」は「遊走」を意味する。

【図18B】対照ＩｇＧまたは抗ＳＵＣＮＲ１抗体の存在下または非存在下で、対照培地（ＤＭＥＭ）またはＡ５４９－ＣＭで培養したマクロファージの遊走アッセイ結果を示す図である。腫瘍由来のコハク酸がＳＵＣＮＲ１を活性化し、腹腔マクロファージの遊走を促進することを示している。図中「Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ」は「遊走」を意味する。

【図18C】異なる濃度のコハク酸で処理したマクロファージの遊走アッセイ結果を示す図である。腫瘍由来のコハク酸がＳＵＣＮＲ１を活性化し、腹腔マクロファージの遊走を促進することを示している。図中「Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ」は「遊走」を、「Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ」は「コハク酸」を意味する。

【図18D】対照ＩｇＧまたは抗ＳＵＣＮＲ１抗体の有無にかかわらず、コハク酸（１ｍＭ）で処理したマクロファージの遊走アッセイ結果を示す図である。腫瘍由来のコハク酸がＳＵＣＮＲ１を活性化し、腹腔マクロファージの遊走を促進することを示している。図中「Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ」は「遊走」を、「Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ」は「コハク酸」を意味する。

【図18E】底部チャンバーにおけるＰＤＧＦおよび異なる濃度のコハク酸の遊走アッセイ結果を示す図である。腫瘍由来のコハク酸がＳＵＣＮＲ１を活性化し、腹腔マクロファージの遊走を促進することを示している。図中「Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ」は「遊走」を、「Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ」は「コハク酸」を、「Ｌｏｗｅｒ ｃｈａｍｂｅｒ」は「底部チャンバー」を意味する。

【図19A】異なる濃度のコハク酸で処理したＬＬＣ細胞の遊走および浸潤アッセイ結果を示す図である。コハク酸が腫瘍細胞の遊走と浸潤を促進することを示している。図中「Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ」は「遊走」を、「Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ」は「コハク酸」を、「Ｉｎｖａｓｉｏｎ」は「浸潤」を意味する。

【図19B】異なる濃度のコハク酸で処理したＡ５４９、ＨＴ－２９、ＭＣＦ－７、およびＰＣ３細胞の遊走および浸潤アッセイ結果を示す図である。コハク酸が腫瘍細胞の遊走と浸潤を促進することを示している。図中「Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ」は「遊走」を、「Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ」は「コハク酸」を意味する。

【図19C】異なる濃度のコハク酸で処理したＡ５４９、ＨＴ－２９細胞の遊走および浸潤アッセイ結果を示す図である。コハク酸が腫瘍細胞の遊走と浸潤を促進することを示している。図中「Ｉｎｖａｓｉｏｎ」は「浸潤」を、「Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ」は「コハク酸」を意味する。

【図19D】ビヒクルまたはコハク酸（０．５、１および２．５ｍＭ）で２４時間処理したＡ５４９細胞におけるＥ－カドヘリン、Ｎ－カドヘリン、およびビメンチン発現レベルを示す図である。コハク酸が腫瘍細胞の遊走と浸潤を促進することを示している。図中「Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ」は「コハク酸」を意味する。

【図19E】指示された期間ビヒクルまたはコハク酸（１ｍＭ）で処理したＡ５４９細胞におけるＥ－カドヘリン、Ｎ－カドヘリン、およびビメンチン発現レベルを示す図である。コハク酸が腫瘍細胞の遊走と浸潤を促進することを示している。図中「Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ」は「コハク酸」を意味する。

【図19F】メトホルミン（２ｍＭ）を含むかまたは含まないコハク酸で２４時間処理したＡ５４９細胞の遊走アッセイ結果を示す図である。コハク酸が腫瘍細胞の遊走と浸潤を促進することを示している。図中「Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ」は「遊走」を、「Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ」は「未処理」を、「Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ」は「メトホルミン」を意味する。

【図20A】腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスから切除した肺および転移性結節の数を示す図である。コハク酸が癌転移を促進することを示している。図中「Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ」は「コハク酸」を、「Ｓａｌｉｎｅ」は「生理食塩水」を、「Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｎｏｄｕｌｅｓ」は「転移結節」を、「Ｎｏｄｕｌｅｓ ｎｕｍｂｅｒ」は「小結節数」を、「Ｌｕｎｇ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｎｏｄｕｌｅｓ」は「肺転移結節」を意味する。

【図20B】腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスから切除した肝臓および脾臓における転移結節を示す図である。コハク酸が癌転移を促進することを示している。図中「Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ」は「コハク酸」を、「Ｓａｌｉｎｅ」は「生理食塩水」を、「Ｎｏｄｕｌｅｓ ｎｕｍｂｅｒ」は「小結節数」を、「Ｌｉｖｅｒ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｎｏｄｕｌｅｓ」は「肝臓転移結節」を、「Ｓｐｌｅｅｎ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｎｏｄｕｌｅｓ」は「脾臓転移結節」を意味する。

【図20C】腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスから切除した副腎における転移結節を示す図である。コハク酸が癌転移を促進することを示している。図中「Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ」は「コハク酸」を、「Ｓａｌｉｎｅ」は「生理食塩水」を、「Ａｄｒｅｎａｌ ｇｌａｎｄ」は「副腎」を、「Ｎｏｎｍｅｔａｓｔａｔｉｃ」は「非転移性」を、「Ａｄｒｅｎａｌ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ」は「副腎転移」を、「Ａｄｒｅｎａｌ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ」は「副腎転移発生率」を意味する。

【図21A】単培養ＬＬＣおよびコハク酸分極マクロファージと共培養したＬＬＣにおける遊走アッセイ結果を示す図である。コハク酸誘導分極マクロファージが癌細胞遊走を増強することを示している。図中「Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ」は「遊走」を、「ｍｏｎｏｃｕｌｔｕｒｅ」は「単培養」を、「Ｐｏｌａｒｉｚｅｄ」は「分極化した」を意味する。

【図21B】単培養ＬＬＣおよびコハク酸分極マクロファージと共培養したＬＬＣにおけるＩＬ－６レベルを示す図である。コハク酸誘導分極マクロファージが癌細胞遊走を増強することを示している。図中「ｍｏｎｏｃｕｌｔｕｒｅ」は「単培養」を、「Ｐｏｌａｒｉｚｅｄ」は「分極化した」を意味する。

【図21C】単培養ＬＬＣ、および、抗ＩＬ－６中和抗体または対照ＩｇＧ（２．５μｇ／ｍｌ）を添加したコハク酸分極マクロファージと共培養したＬＬＣにおける遊走アッセイ結果を示す図である。コハク酸誘導分極マクロファージが癌細胞遊走を増強することを示している。図中「Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ」は「遊走」を、「ｍｏｎｏｃｕｌｔｕｒｅ」は「単培養」を、「Ｐｏｌａｒｉｚｅｄ」は「分極化した」を意味する。

【図21D】単培養ＬＬＣ、および、抗ＩＬ－６中和抗体または対照ＩｇＧ（２．５μｇ／ｍｌ）を添加したコハク酸分極マクロファージと共培養した単培養ＬＬＣにおけるＩＬ－６レベルを示す図である。コハク酸誘導分極マクロファージが癌細胞遊走を増強することを示している。図中「ｍｏｎｏｃｕｌｔｕｒｅ」は「単培養」を、「Ｐｏｌａｒｉｚｅｄ」は「分極化した」を意味する。

【図21E】スクランブル対照ｓｉＲＮＡ（ｓｃ）またはＳＵＣＮＲ１ ｓｉＲＮＡ－７５８でトランスフェクトされたマクロファージと共培養されたＬＬＣ細胞におけるＩＬ－６レベルを示す図である。コハク酸誘導分極マクロファージが癌細胞遊走を増強することを示している。図中「Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ」は「遊走」を、「Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ」は「コハク酸」を意味する。

【図22A】示された期間コハク酸（１ｍＭ）で処理されたＡ５４９／ｓｈＮＣおよびＡ５４９／ｓｈＳＵＣＮＲ１細胞における、ＥＲＫ１／２およびホスホ－ＥＲＫ１／２発現レベルを示す図である。細胞内カルシウム動員、ＥＲＫ１／２活性化およびプロスタグランジンＥ２産生に対するコハク酸の作用を示している。図中「Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ」は「コハク酸」を意味する。

【図22B】コハク酸（１ｍＭ）で２時間処理したＬＬＣ／ｓｈＮＣ、ＬＬＣ／ｓｈＳＵＣＮＲ１、Ａ５４９／ｓｈＮＣおよびＡ５４９／ｓｈＳＵＣＮＲ１細胞における、細胞内カルシウムレベルを示す図である。細胞内カルシウム動員、ＥＲＫ１／２活性化およびプロスタグランジンＥ２産生に対するコハク酸の作用を示している。

【図22C】コハク酸（１ｍＭ）で２時間処理したＬＬＣ／ｓｈＮＣ、ＬＬＣ／ｓｈＳＵＣＮＲ１における、ならし培地ＰＧＥ２レベルを示す。細胞内カルシウム動員、ＥＲＫ１／２活性化およびプロスタグランジンＥ２産生に対するコハク酸の作用を示している。

【図23A】対照ＩｇＧまたは抗ＳＵＣＮＲ１抗体の有無にかかわらず、コハク酸（１ｍＭ）で処理したＬＬＣ、Ａ５４９、ＰＣ３、およびＨＴ－２９細胞の遊走アッセイ結果を示す図である。コハク酸がＳＵＣＮＲ１シグナル伝達を介して腫瘍細胞の遊走と浸潤を促進することを示している。図中「Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ」は「遊走」を、「Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ」は「コハク酸」を意味する。

【図23B】対照ＩｇＧまたは抗ＳＵＣＮＲ１抗体の有無にかかわらず、コハク酸（１ｍＭ）で処理したＬＬＣおよびＨＴ－２９細胞の浸潤アッセイ結果を示す図である。コハク酸がＳＵＣＮＲ１シグナル伝達を介して腫瘍細胞の遊走と浸潤を促進することを示している。図中「Ｉｎｖａｓｉｏｎ」は「浸潤」を、「Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ」は「コハク酸」を意味する。

【図24A】ｓｈＳＵＣＮＲ１（Ａ５４９／ｓｈＳＵＣＮＲ１）またはｓｈＮＣ（Ａ５４９／ｓｈＮＣ）を発現する、異なるＡ５４９安定クローンにおけるＳＵＣＮＲ１発現レベルを示す図である。腫瘍分泌コハク酸がＳＵＣＮＲ１シグナル伝達を介して腫瘍転移を促進することを示している。

【図24B】対照ｓｈＲＮＡ（Ａ５４９／ｓｈＮＣ）またはＳＵＣＮＲ１ ｓｈＲＮＡ（Ａ５４９／ｓｈＳＵＣＮＲ１）で安定にトランスフェクトされたコハク酸刺激（１ｍＭ、２４時間）Ａ５４９細胞の遊走および浸潤アッセイ結果を示す図である。腫瘍分泌コハク酸がＳＵＣＮＲ１シグナル伝達を介して腫瘍転移を促進することを示している。図中「Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ」は「遊走」を、「Ｉｎｖａｓｉｏｎ」は「浸潤」を意味する。

【図24C】ｓｈＳＵＣＮＲ１（ＬＬＣ／ｓｈＳＵＣＮＲ１）を発現するＬＬＣ細胞安定クローンにおけるＳｕｃｎｒ１ ｍＲＮＡレベルを示す図である。腫瘍分泌コハク酸がＳＵＣＮＲ１シグナル伝達を介して腫瘍転移を促進することを示している。

【図24D】コハク酸（１ｍＭ）で２４時間刺激したＬＬＣおよびＬＬＣ／ｓｈＳＵＣＮＲ１細胞の遊走アッセイ結果を示す図である。腫瘍分泌コハク酸がＳＵＣＮＲ１シグナル伝達を介して腫瘍転移を促進することを示している。図中「Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ」は「遊走」を意味する。

【図24E】コハク酸（１００ｍｇ／ｋｇ）を８週間にわたって週２回腹腔内注射を受けた、Ａ５４９／ｓｈＮＣまたはＡ５４９／ｓｈＳＵＣＮＲ１を注射したマウスにおける肺転移結節の評価を示す図である。腫瘍分泌コハク酸がＳＵＣＮＲ１シグナル伝達を介して腫瘍転移を促進することを示している。図中「Ｌｕｎｇ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｎｏｄｕｌｅｓ」は「肺転移結節」を、「Ｎｏｄｕｌｅｓ ｎｕｍｂｅｒ」は「小結節数」を意味する。

【図24F】コハク酸（１００ｍｇ／ｋｇ）を８週間にわたって週２回腹腔内注射を受けた、ＬＬＣまたはＬＬＣ／ｓｈＳＵＣＮＲ１細胞注射マウスにおける肺転移結節の評価を示す図である。腫瘍分泌コハク酸がＳＵＣＮＲ１シグナル伝達を介して腫瘍転移を促進することを示している図中「Ｌｕｎｇ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｎｏｄｕｌｅｓ」は「肺転移結節」を、「Ｎｏｄｕｌｅｓ ｎｕｍｂｅｒ」は「小結節数」を意味する。

【図25A】示された期間コハク酸（１ｍＭ）で処理されたＡ５４９およびＬＬＣ細胞におけるＨＩＦ－１α、Ａｋｔ、ホスホ－Ａｋｔ、ＡＭＰＫ、ホスホ－ＡＭＰＫ、ｐ３８ ＭＡＰＫ、およびホスホ－ｐ３８ ＭＡＰＫ発現レベルを示す図である。Ａ５４９およびＬＬＣ細胞におけるＨＩＦ－１αおよびキナーゼリン酸化に対するコハク酸の効果を示している。図中「ｓｕｃｃｉｎａｔｅ」は「コハク酸」を意味する。

【図25B】示された期間コハク酸（１ｍＭ）で処理されたＬＬＣ細胞におけるＨｉｆ－１α ｍＲＮＡレベルを示す図である。Ａ５４９およびＬＬＣ細胞におけるＨＩＦ－１αおよびキナーゼリン酸化に対するコハク酸の効果を示している。図中「ｓｕｃｃｉｎａｔｅ」は「コハク酸」を意味する。

【図25C】異なる濃度のＬＹ２９４００２またはＳＢ２０２１９０で１２時間処理したＬＬＣ細胞におけるＨｉｆ－１α ｍＲＮＡレベルを示す図である。Ａ５４９およびＬＬＣ細胞におけるＨＩＦ－１αおよびキナーゼリン酸化に対するコハク酸の効果を示している。

【図25D】コハク酸（１ｍＭ）で１２時間処理したＬＹ２９４００２またはＳＢ２０２１９０前処理ＬＬＣ細胞におけるＨｉｆ－１α ｍＲＮＡレベルを示す図である。Ａ５４９およびＬＬＣ細胞におけるＨＩＦ－１αおよびキナーゼリン酸化に対するコハク酸の効果を示している。図中「ｓｕｃｃｉｎａｔｅ」は「コハク酸」を意味する。

【図25E】コハク酸（１ｍＭ）またはジメチルエステルコハク酸（ＤＭＳ、２０ｍＭ）で１２時間処理したＡ５４９／ｓｈＮＣおよびＡ５４９／ｓｈＳＵＣＮＲ１細胞におけるＨｉｆ－１α ｍＲＮＡレベルを示す図である。Ａ５４９およびＬＬＣ細胞におけるＨＩＦ－１αおよびキナーゼリン酸化に対するコハク酸の効果を示している。

【図26A】種々の濃度のＨＩＦ－１α阻害剤、２－ＭｅＯＥ２およびＢａｙ８７－２２４３を含むかまたは含まないコハク酸で２４時間処理したＬＬＣおよびＡ５４９細胞の遊走アッセイ結果を示す図である。ＰＩ３Ｋ媒介ＨＩＦ－１αアップレギュレーションが、コハク酸が誘導する癌遊走およびＥＭＴにとって極めて重要であることを示している。図中「Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ」は「遊走」を、「ｓｕｃｃｉｎａｔｅ」は「コハク酸」を意味する。

【図26B】α－ＫＧ（１ｍＭ）を含むまたは含まないコハク酸（１ｍＭ）で２４時間処理したＡ５４９細胞の遊走アッセイ結果を示す図である。ＰＩ３Ｋ媒介ＨＩＦ－１αアップレギュレーションが、コハク酸が誘導する癌遊走およびＥＭＴにとって極めて重要であることを示している。図中「Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ」は「遊走」を意味する。

【図26C】ＤＭＯＧ（２００μＭ）を含むまたは含まないコハク酸（１ｍＭ）で２４時間処理したＡ５４９細胞の遊走アッセイ結果を示す図である。ＰＩ３Ｋ媒介ＨＩＦ－１αアップレギュレーションが、コハク酸が誘導する癌遊走およびＥＭＴにとって極めて重要であることを示している。図中「Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ」は「遊走」を意味する。

【図26D】Ａ５４９／ｓｈＮＣまたはＡ５４９／ＨＩＦ－１α細胞におけるＨＩＦ－１α ｍＲＮＡレベル、および、コハク酸（１ｍＭ）を用いてまたは用いずに処理したＡ５４９／ｓｈＮＣまたはＡ５４９／ＨＩＦ－１α細胞の遊走アッセイ結果を示す図である。ＰＩ３Ｋ媒介ＨＩＦ－１αアップレギュレーションが、コハク酸が誘導する癌遊走およびＥＭＴにとって極めて重要であることを示している。図中「Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ」は「遊走」を意味する。

【図26E】ビヒクルまたはコハク酸（１ｍＭ）で２４時間処理したＬＹ２９４００２前処理Ａ５４９細胞におけるビメンチン発現レベルを示す図である。ＰＩ３Ｋ媒介ＨＩＦ－１αアップレギュレーションが、コハク酸が誘導する癌遊走およびＥＭＴにとって極めて重要であることを示している。図中「Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ」は「未処理」を意味する。

【図26F】ビヒクルまたはコハク酸（１ｍＭ）で２４時間処理したＢａｙ８７－２２４３前処理Ａ５４９細胞におけるＥ－カドヘリンおよびビメンチン発現レベルを示す図である。ＰＩ３Ｋ媒介ＨＩＦ－１αアップレギュレーションが、コハク酸が誘導する癌遊走およびＥＭＴにとって極めて重要であることを示している。図中「Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ」は「未処理」を意味する。

【図27A】８週間にわたって週２回、コハク酸（１００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射を受けた、Ａ５４９／ｓｈＮＣまたはＡ５４９／ＨＩＦ－１α注射マウスにおける肺転移結節評価を示す図である。ｉｎ ｖｉｖｏでのコハク酸誘導転移におけるＨＩＦ－１αの役割を示している。図中「Ｌｕｎｇ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｎｏｄｕｌｅｓ」は「肺転移結節」を、「Ｎｏｄｕｌｅｓ ｎｕｍｂｅｒ」は「小結節数」を意味する。

【図27B】Ａ５４９／ｓｈＮＣまたはＡ５４９／ｓｈＨＩＦ１－αの原発性皮下腫瘍から抽出された総タンパク質中のＥ－カドヘリンおよびビメンチンのレベルを示す図である。ｉｎ ｖｉｖｏでのコハク酸誘導転移におけるＨＩＦ－１αの役割を示している。図中「ｓｕｃｃｉｎａｔｅ」は「コハク酸」を意味する。

【発明を実施するための形態】

【0025】

本発明の他の特徴および利点は、以下の実施例においてさらに例示および記載される。これらは、例示のみを意図し、本発明の範囲を限定することを意図しない。

【0026】

（実施例１。癌細胞由来のコハク酸はマクロファージの極性化を誘導する）

【0027】

（癌調整培地中の可溶性因子はマクロファージ中のＴＡＭマーカーを誘導する）

【0028】

腹膜マクロファージを、対照培地またはＬＬＣ（ＬＬＣ－ＣＭ）またはＡ５４９（Ａ５４９－ＣＭ）から収集した条件培地（ＣＭ）中で２４時間インキュベートする。マクロファージ中のＡＲＧ１タンパク質およびＡｒｇ１ ｍＲＮＡは、それぞれイムノブロット分析およびｑＰＣＲにより測定される。ヒト前立腺癌ＰＣ３細胞から収集したＣＭを、１０％ ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で２４、４８および７２時間培養し、そして腹膜マクロファージと共にインキュベートする。対照培地またはＰＣ３－ＣＭで２４時間処理したマクロファージからの細胞溶解物を、ＡＲＧ１またはβ－アクチンに対する抗体で免疫ブロットする。実験を３回繰り返し、同様の結果を得た。対照培地と比較して、マクロファージＡＲＧ１タンパク質およびｍＲＮＡレベルは、肺癌細胞株（マウスＬＬＣおよびヒトＡ５４９）のＣＭにおいて増加し（図１Ａおよび１Ｂ）、一方、ヒト前立腺細胞（ＰＣ３）のＣＭも同程度にマクロファージＡＲＧ１タンパク質を誘導する（図１Ｃ）。一方、腹膜マクロファージを対照培地またはＭＣＦ－７（ＭＣＦ７－ＣＭ）またはＨＴ－２９（ＨＴ２９－ＣＭ）から採取した条件培地中で２４時間インキュベートする。マクロファージ中のＡｒｇ１ ｍＲＮＡはｑＰＣＲで測定される。また、ヒト乳癌細胞（ＭＣＦ－７）や結腸癌細胞（ＨＴ－２９）のＣＭも、Ａｒｇ１やＦｉｚｚ１やＭｇｌ１のｍＲＮＡなど他のＴＡＭマーカーの発現を上昇させる（図１Ｄ）。内因性分子の存在がマクロファージのＴＡＭへの変換を媒介することを示唆した。

【0029】

活性分子を同定するために、ＬＬＣ－ＣＭおよびＡ５４９－ＣＭを、小分子（＜３ｋＤａ）を有するＳＣＭおよびタンパク質－ペプチド画分（＞３ｋＤａ）を有するＰＣＭに分画する。Ａｒｇ１、ＳＣＭまたはＰＣＭで２４時間培養した腹腔マクロファージ中のＦｉｚｚ１、およびＭｇｌ１ ｍＲＮＡをｑＰＣＲにより分析する。そして、腹膜マクロファージを対照培地、ＬＬＣ－ＣＭ、ＬＬＣ－ＳＣＭまたはＬＬＣ－ＰＣＭ中で３日間培養する。ＬＬＣ（ＬＬＣ－ＣＭ）およびＡ５４９（Ａ５４９－ＣＭ）のＣＭをサイズ（＜３ｋＤａおよび＞３ｋＤａ）に従って分画し、マクロファージＡｒｇ１発現に対するその効果も評価する。小分子分画（＜３ｋＤａ、ＳＣＭ）はＡｒｇ１、Ｆｉｚｚ１、Ｍｇｌ１の発現をアップレギュレートするだけでなく、ＶＣＡＭ１⁺ＣＤ１１ｃ⁺ＣＤ１１ｂ^low－ＴＡＭの集団を増加させる。

【0030】

タンパク質－ペプチド画分（＞３ｋＤａ、ＰＣＭ）は同じ効果を示さない（図１Ｅおよび１Ｆ）（ＶＣＡＭ１⁺ＣＤ１１ｃ⁺ＣＤ１１ｂ^low－マクロファージ集団をフローサイトメトリーで測定し、対照培地処理の細胞数に対して正規化した。データは３つの独立した実験の平均±ＳＥＭを表す。** Ｐ＜０．００５、*** Ｐ＜０．０００５）。

【0031】

次に、ＬＣ－ＭＳを用いて、ＬＬＣ－ＳＣＭおよびＡ５４９－ＳＣＭ中の可溶性分子を同定する。主成分分析（ＰＣＡ）は、ＬＬＣ－ＳＣＭと対照培地との間の成分分布の明確な分離を示し（図２Ａ）、これら２つの群の間の代謝産物組成の差を示す。癌に由来する代謝産物を同定するために、直交部分最小二乗判別分析（ＯＰＬＳ－ＤＡ）モデルからＳプロットを構築する。Ｓ－プロットに基づいて、１１のＬＬＣ由来代謝産物が、ｐ（ｃｏｒｒ）［１］およびＣｏｅｆｆＣＳ（０．００１より大きい）の両方の有意な倍数変化および大きな値を示すことが同定される（図２Ｂおよび表１）。組織内代謝産物データベース検索および純粋化合物バリデーションにより、３つのＬＬＣ由来代謝産物がコハク酸、乳酸およびクエン酸として同定される。残りの８つの代謝産物の化学的同一性は、現在のところ未知のままであった。さらに、質量スペクトルの分析は、癌細胞－ＳＣＭと対照培地との間の顕著な差異を明らかにする。主要なｍ／ｚ１１７．０ピークは、ＬＬＣ－ＳＣＭ（図２Ｃ）およびＡ５４９－ＳＣＭ（図２Ｄ）において観察されるが、対照培地（保持時間１．８分、ｍ／ｚ５０－４００）においては観察されない。ｍ／ｚ１１７．０の娘イオンプロファイルは、純粋なコハク酸のそれと一致する（図２Ｅ）。

【0032】

【表1】

【0033】

癌細胞－ＣＭ中のコハク酸の存在を確認するため、コハク酸比色定量キットを実施し、ＣＭ中のコハク酸を分析する。結果は、ＬＬＣ－ＣＭ（０．５７ｍＭ）、Ａ５４９－ＣＭ（０．４３ｍＭ）、ＰＣ３－ＣＭ（０．４１ｍＭ）、ＭＣＦ－７－ＣＭ（０．２８ｍＭ）、およびＨＴ－２９－ＣＭ（０．２５ｍＭ）において検出されるコハク酸の同等の量があることを示す（図３Ａ）。少量のコハク酸が、マクロファージ－ＣＭ（０．０７ｍＭ）および新鮮な対照培地（０．０７ｍＭ）中で検出される。コハク酸はマクロファージ極性化を駆動する癌－ＣＭの主要代謝産物であることを示唆した。また、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにＬＬＣ細胞を２１日間皮下注射して腫瘍を誘発する。腫瘍を切除し、皮下腫瘍におけるコハク酸濃度が０．６５±０．０３９ｍＭ（ｎ＝１１、データは平均±ＳＥＭ、***Ｐ＜０．０００５を表す）であることを示すさらなる解析を用いて実施する（図３Ｂ）。それは、癌細胞が細胞外環境にコハク酸を放出し、それがＴＡＭマーカーアップレギュレーションとＴＡＭ極性化を説明するかもしれないことを示す。

【0034】

（癌細胞由来コハク酸はマクロファージの極性化を誘導する）

【0035】

マウス腹腔マクロファージをコハク酸で処理し、ＴＡＭマーカーの発現レベルを検出する。その結果、コハク酸は濃度依存的にマウス腹腔マクロファージのＡＲＧ１タンパク質の発現を増加させることが明らかになった（図４Ａ）。さらに、腹腔マクロファージにおけるＴＡＭ特異的遺伝子の転写産物の解析から、コハク酸はＡｒｇ１、Ｆｉｚｚ１、Ｍｇｌ１、Ｍｇｌ２などのＴＡＭマーカー遺伝子の発現を用量依存的に上昇させることが示されている（図４Ｂ）。また、ＣＤ１１ｃ、ＶＣＡＭ１（ＶＣＡＭ１⁺ＣＤ１１ｃ⁺ＣＤ１１ｂ^low）を含むＴＡＭ表面マーカーのアップレギュレーションも行う（図４Ｃ）。それは、コハク酸がマクロファージ集団をＶＣＡＭ１⁺ＣＤ１１ｃ⁺ＣＤ１１ｂ^low－ＴＡＭに分極することを示唆する。ＬＬＣの同系マウス腫瘍モデルを使用して、ｉｎ ｖｉｖｏでのＴＡＭ分極に対するコハク酸の効果を評価する。ＬＬＣ細胞をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに皮下注射し、続いてコハク酸（２０および１００ｍｇ／ｋｇ）または賦形剤を週２回、３週間腹腔内注射する。２１日目に、原発性皮下腫瘍を採取し、ＴＡＭのパーセンテージを分析する。各群の異なるマウス（生理食塩水 ｎ＝１１、２０ｍｇ／ｋｇコハク酸 ｎ＝８、１００ｍｇ／ｋｇコハク酸 ｎ＝１０）から得た原発性皮下腫瘍におけるＴＡＭ集団の割合をフローサイトメトリーにより分析する（データは３実験の平均±ＳＥＭ、* Ｐ＜０．０５、** Ｐ＜０．００５、*** Ｐ＜０．０００５）。コハク酸処理マウスの原発性皮下腫瘍は、生理食塩水処理マウスよりも有意に多いＶＣＡＭ１⁺ＣＤ１１ｃ⁺ＣＤ１１ｂ^low－ＴＡＭを含む（図４Ｄ）。集合的に、これはコハク酸がＴＡＭの機能分極を促進することを示す。

【0036】

（実施例２。血清コハク酸は癌の診断バイオマーカーとして用いられる）

【0037】

（コハク酸受容体発現はヒト肺癌で上昇する）

【0038】

ＳＵＣＮＲ１に関する臨床的意義を提供するために、２１３のヒト肺癌組織および７８の無腫瘍肺組織における受容体ｍＲＮＡレベルをｑＰＣＲにより分析する（表２）。肺癌組織における平均受容体ｍＲＮＡレベルは、腫瘍のない肺組織よりも有意に高かった（図５Ａ）。肺癌組織におけるレセプターｍＲＮＡレベルは広い分布を示し、かなりの数（３７．５６％）が正常値より高かった（図５Ａ）。腫瘍のＳＵＣＮＲ１レベルが肺癌患者の生存率と相関するかどうか疑った。これらの結果は、腫瘍ＳＵＣＮＲ１レベルがコハク酸の腫瘍促進活性に寄与することを示唆した。

【0039】

【表2】

【0040】

（血清コハク酸は肺癌の潜在的バイオマーカーである）

【0041】

Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにＬＬＣ細胞を注射し、ＬＬＣ細胞の接種前後のマウス血清中のコハク酸レベルを評価するために分析する。コハク酸は、ＬＬＣ注射前のマウスで検出され（平均０．１９±０．０３７ｍＭ、ｎ＝７）、これは、ＬＬＣ接種後１６日で増加する（平均０．３６±０．０５９ｍＭ、１７７．６ｍｍ³の腫瘍を有するマウス、ｎ＝７）（図５Ｂ）。これらの結果は、血清コハク酸レベルが担癌マウスで上昇していることを示している。血清コハク酸の臨床的意義を明らかにするため、健常被験者２１例およびＮＳＣＬＣ患者９７例の血清中コハク酸濃度を測定する（表３）。肺癌患者の血清コハク酸濃度の平均値（０．５３±０．０３８ｍＭ）は健康被験者（図５Ｃ）よりも有意に高く、ＮＳＣＬＣ患者の血清コハク酸濃度の上昇は癌の発生を反映している可能性があり、癌の進行のマーカーとなる可能性が示唆される。さらに、受信者動作特性（ＡＵＲＯＣ）曲線下面積を使用して、この患者群における識別力を決定する（図５Ｄ）。コハク酸のＡＵＣは０．７０（９５％ＣＩ:０．５９４～０．８１３、ｐ＝０．００３６）である。ＡＵＲＯＣ曲線に由来する最適診断効率を有するコハク酸のカットオフレベルは、０．３４ｍＭ（５３．６１％感度、８５．７１％特異性）である。ＡＵＲＯＣ解析は、血清コハク酸がＮＳＣＬＣ患者に対してより高い適中率を有することを明らかにする。まとめると、これらの結果は、血清コハク酸がＮＳＣＬＣ患者の予測バイオマーカーとして役立つ可能性を示している。

【0042】

【表3】

【0043】

（実施例３。モノクローナル抗コハク酸抗体の開発と治療効果）

【0044】

（抗癌治療抗体としてのコハク酸モノクローナル抗体の開発）

【0045】

癌細胞が腫瘍微小環境にコハク酸を分泌してＴＡＭ分極と癌転移を促進すること、肺癌患者の血清コハク酸濃度が有意に上昇することを考慮し、抗コハク酸抗体により血清コハク酸を中和して腫瘍形成を抑制する可能性を検討する。これに対処するために、コハク酸抱合担体ペプチドを抗原として生成し、ポリクローナルコハク酸抗体を生成し、ＬＬＣ遊走に対するその効果を評価する。コハク酸－ＢＳＡ結合体を用いて、ニュージーランドウサギを免疫する。３回目の免疫時に、抗血清をタンパク質担体に予め吸収させ、プロテインＡカラム（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）によって精製する。コハク酸－ＫＬＨ（リジン－ロイシン－ヒスチジン）結合体を使用して、抗体特異性を間接ＥＬＩＳＡ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）で分析する（図６Ａ）。さらに、抗コハク酸抗体が癌－ＣＭにおいてコハク酸を中和することを確認するために、抗コハク酸抗体または対照抗体で処置した癌－ＣＭにおけるコハク酸レベルを測定する。ＬＬＣ－ＣＭまたはＡ５４９－ＣＭを異なる濃度の抗コハク酸抗体とともに３７℃で一晩インキュベートし、次いでＬＬＣ－ＣＭまたはＡ５４９－ＣＭ中のコハク酸レベルをコハク酸比色分析キットによって測定する。抗コハク酸抗体は癌－ＣＭのコハク酸濃度を有意に低下させるが、対照抗体は低下させない（図６Ｂ）。さらに、トランスウェルプレートの上部チャンバー上に播種したＬＬＣ細胞を対照ＩｇＧまたは抗コハク酸抗体（Ｓｕｃｃ Ａｂ）で２４時間処理し、化学誘引物質としてＰＤＧＦ－ＢＢを用いて遊走アッセイを行う。これは、対照抗体ではなく抗コハク酸抗体がＬＬＣ細胞遊走を抑制することを示す（図６Ｃ）。

【0046】

従って、潜在的な治療用モノクローナルコハク酸抗体がさらに生成される。２０のマウスモノクローナル抗体を作製し、ＥＬＩＳＡ試験のために選択する。それらの中で、より高い結合親和性を有する上位５クローンを、抗癌能力の評価のために選択する。結果は、５つの細胞系により誘導されたこれら５つのモノクローナル抗体がＡ５４９の細胞遊走を有意に抑制し、６Ｇ１０細胞系由来モノクローナル抗体が最良の抗遊走活性を有することを明らかにする。腫瘍由来コハク酸が癌－ＣＭ誘導マクロファージＡＲＧ１発現の原因であることを確かめるために、ＡＲＧ１発現に対する６Ｇ１０モノクローナル抗体の効果を評価する。ＬＬＣ－ＣＭ処理ＰＭφを、対照ＩｇＧまたは抗コハク酸抗体と共に２４時間インキュベートする。細胞溶解物を、ＡＲＧ１またはβ－アクチンに対する抗体で免疫ブロットする。ＬＬＣ－ＣＭによるＡＲＧ１アップレギュレーションは、Ｆ５モノクローナル抗体によって抑制されるが、対照ＩｇＧによっては抑制されない（図７Ａ）。さらに、ＰＭφを抗コハク酸抗体または対照ＩｇＧで１時間前処理し、次いでコハク酸（１ｍＭ）で３日間刺激する。ＶＣＡＭ１⁺ＣＤ１１ｃ⁺ＣＤ１１ｂ^low－ＴＡＭ集団をフローサイトメトリーによって定量し、対照培地処理の細胞数に対して標準化する。そして、腹膜マクロファージを、対照ＩｇＧを含むかまたは含まないコハク酸（１ｍＭ）、抗コハク酸抗体で２４時間処理し、次いで、細胞遊走をトランスウェルアッセイによって行う。このデータは、対照ＩｇＧではなくＦ６モノクローナル抗体が、ＣＤ１１ｃおよびＶＣＡＭ１（ＶＣＡＭ１⁺ＣＤ１１ｃ⁺ＣＤ１１ｂ^low）（図７Ｂ）を含むコハク酸アップレギュレートＴＡＭ表面マーカーを抑制するだけでなく、コハク酸誘導マクロファージ遊走も抑制することを示している（図７Ｃ）。従って、６Ｇ１０モノクローナル抗体を、ＬＬＣの同系マウス腫瘍モデルに対するその治療効果を評価するための最初の候補として選択する。ＬＬＣ細胞をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに皮下注射する。５０ｍｍ³の皮下腫瘍を有するマウス（ＬＬＣ腫瘍接種８日後）に、６Ｇ１０Ｆ６モノクローナル抗体（１および５ｍｇ／ｋｇ）またはＩｇＧ対照抗体（５ｍｇ／ｋｇ）を週２回、５週間腹腔内注射する。ＴＡＭ偏光の評価のためにＬＬＣ注射の３週間後に皮下腫瘍を外科的に除去する。腫瘍転移の決定のために原発腫瘍の除去の２週間後に、マウスから肺、肝臓、脾臓、および副腎を切除する。その結果、ＩｇＧ抗体ではなく６Ｇ１０Ｆ６モノクローナル抗体が、生理食塩水と比較して、皮下腫瘍（図７Ｄ）のＴＡＭ集団だけでなく、肺腫瘍の多発性（図７Ｅ）も有意に抑制することがわかった。特に、６Ｇ１０Ｆ６モノクローナル抗体はＬＬＣ担癌マウスの生存期間を有意に延長する（図７Ｆ）。これらの結果は、６Ｇ１０Ｆ６モノクローナル抗体が治療用抗癌モノクローナル抗体として存在し得ることを示唆する。

【0047】

（ハイブリドーマ６Ｇ１０Ｆ６および６Ｇ１０Ｇ５のモノクローナル抗体配列決定）

【0048】

６Ｇ１０細胞株に由来する抗コハク酸抗体配列を決定する。２つのハイブリドーマ６Ｇ１０Ｆ６および６Ｇ１０Ｇ５は、抗体配列決定に選択的である。ＴＲＩｚｏｌＲ試薬の技術マニュアルに従って、ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを単離する。次いで、全ＲＮＡを、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） １^st Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔの技術マニュアルに従って、アイソタイプ特異的アンチセンスプライマーまたはユニバーサルプライマーを使用してｃＤＮＡに逆転写する。ＶＨおよびＶＬの抗体フラグメントを、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔのｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）の標準操作手順（ＳＯＰ）に従って増幅する。増幅された抗体断片は、標準的なクローニングベクターに別々にクローニングされる。コロニーＰＣＲを行って、正しいサイズのインサートを有するクローンをスクリーニングする。正しいサイズのインサートを有する５つ以上のコロニーを、各フラグメントについて配列決定する。異なるクローンの配列を整列させ、これらのクローンのコンセンサス配列を図８および９に示す。６Ｇ１０Ｆ６抗体重鎖のＤＮＡ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列を有し、アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列を有し、６Ｇ１０Ｆ６抗体軽鎖のＤＮＡ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の配列を有し、アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の配列を有する。一方、６Ｇ１０Ｇ５抗体重鎖のＤＮＡ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５の配列を有し、アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６の配列を有し、６Ｇ１０Ｇ５抗体軽鎖のＤＮＡ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７の配列を有し、アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８の配列を有する。

【0049】

（マウス６Ｇ１０Ｆ６モノクローナル抗体の抗体ヒト化と復帰突然変異デザイン）

【0050】

６Ｇ１０Ｆ６モノクローナル抗体の評価の機能は、それがコハク酸を中和し、ＴＡＭ分極および癌転移を抑制する能力を有することを明らかにする。したがって、親（キメラ）抗体の結合親和性を犠牲にすることなく、相補性決定領域（ＣＤＲ）移植および復帰突然変異法を使用することによって、マウス６Ｇ１０Ｆ６モノクローナル抗体をヒト化するために、抗体ヒト化をさらに行う。免疫原性を低下させるために、マウス６Ｇ１０Ｆ６モノクローナル抗体の定常領域を、ヒト化抗体の開発に使用されるキメラマウス－ヒト６Ｇ１０Ｆ６抗体の生成のために、ヒトＩｇＧ４（重鎖）およびラムダ鎖（軽鎖）の定常領域で置き換える（図１０）。ヒト化を進行させるために、ヒト化抗体は、ＣＤＲ移植およびその後の移植抗体の置換された推定復帰突然変異部位を使用することによって設計される。簡潔には、キメラ６Ｇ１０Ｆ６抗体のＣＤＲをヒトアクセプター（免疫グロブリンμ重鎖ＶＨおよび免疫グロブリンλ鎖可変領域ＶＬ、図１０）に移植して、各キメラ抗体についてヒト化軽鎖およびヒト化重鎖を得る。結合活性に重要であると考えられる、ＣＤＲ中のカノニカル残基、フレームワーク領域、および移植された抗体中のＶＨ－ＶＬ界面上の残基は、親抗体対応物との置換のために選択される。

【0051】

キメラマウス－ヒト６Ｇ１０Ｆ６抗体の構造は、逆突然変異の位置を同定するためにコンピュータ支援相同モデリングプログラムによってモデリングされる。簡潔には、マウス６Ｇ１０Ｆ６抗体配列を、Ｆｖフラグメントのための最良のテンプレートを同定するため、および特にドメイン界面を構築するために、ＰＤＢ＿Ａｎｔｉｂｏｄｙデータベースに対してＢＬＡＳＴ検索する。構造テンプレート２ＢＪＭ（ＳＰＥ７の結晶構造：アントロン複合体）を選択し、同一性＝６６％である。マウスモノ鋳型と２ＢＪＭ鋳型との間のアミノ酸配列アライメントを図１１に示す。２ＢＪＭの相同性モデルに基づいて、内部コア中のすべてのフレームワーク残基が選択される。このような残基を変異させてマウスモノクローナル抗体に戻すために、対応物は、内部疎水性相互作用を保持し、そして戻り変異に起因する潜在的な免疫原性を減少させる。重鎖のヒト化可変ドメインは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１０、１１、１２、および１３のアミノ酸配列を含むＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、およびＶＨ５と命名される。一方、軽鎖のヒト化可変ドメインは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、および２１のアミノ酸配列を含むＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４、ＶＬ５、ＶＬ６、ＶＬ７、およびＶＬ８と命名される。これに対して、重鎖ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４およびＶＨ５のヒト化可変ドメインは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２、２３、２４、２５および２６のＤＮＡ配列を含み、軽鎖ＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４、ＶＬ５、ＶＬ６、ＶＬ７およびＶＬ８のヒト化可変ドメインは、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３および３４のＤＮＡ配列を含む。

【0052】

（キメラ６Ｇ１０Ｆ６抗体とヒト化抗体の結合親和性の測定）

【0053】

キメラ６Ｇ１０Ｆ６抗体およびヒト化抗体を構築および産生するために、ヒト化ＩｇＧ重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡ配列を合成し、ｐＣＤＮＡ３．４ベクターに挿入して、全長ＩｇＧの発現プラスミドを構築する（図１１に示すように）。４０のヒト化抗体をＨＥＫ２９３細胞培養物中で発現させ、次いで細胞をスピンダウンする。上清を、ＥＬＩＳＡによる発現評価のために行う。Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標） ８Ｋを用いて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって結合確認および親和性ランキングを試験する。キメラ６Ｇ１０Ｆ６抗体を精製し（図１２Ａ）、コハク酸抗体のＡｇに対する親和性を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサーを用いて決定する。一次抗体は、ヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、カタログ番号Ａ００１６６）およびヤギ抗ヒトラムダ－ＨＲＰ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号２０７０－０５）である。ＢＳＡ－コハク酸に対するキメラ抗体の親和性および動態を図１２Ｂに要約し、センサーグラムを図１２Ｃに示す。親抗体を加えた発現抗体を、アフィニティーランキングのために行う。各ヒト化抗体を発現するＨＥＫ２９３細胞からの２４の上清に対するＢＳＡ－コハク酸の親和性を図１３に要約する。標的と結合していないクローンは、灰色で強調されている。

【0054】

親和性ランキング結果に基づいて、上位３つのヒト化抗体（ＶＨ３＋ＶＬ３、ＶＨ４＋ＶＬ２、ＶＨ４＋ＶＬ３）を発現させ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔのＳＯＰに従って精製する。ＳＤＳ－ＰＡＧＥから評価すると、ヒト化ＩｇＧの純度は約８５％である（図１４Ａ）。精製ＩｇＧの収率を図１４Ｂに列挙する。上位３つの精製された抗体を、異なる濃度下での親和性測定のためにさらに選択する。各抗体の結合データを処理し、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標） ８Ｋ評価ソフトウェアを用いて１：１相互作用モデルに適合させる。すべての実験データをモデルによく適合させることができた（図１５Ａ）。図１５Ｂに列挙されるように、３つのヒト化抗体は、親キメラ抗体に対する同等の抗原結合親和性を保持する。

【0055】

（精製ヒト化ＩｇＧの熱安定性測定）

【0056】

さらに、４つの精製抗体（キメラ抗体、ＶＨ３＋ＶＬ３、ＶＨ４＋ＶＬ２、ＶＨ４＋ＶＬ３ヒト化抗体を含む）および各ヒト化を発現するＨＥＫ２９３細胞からの９つの上清を、ＥＬＩＳＡによる安定性評価のために選択した。ＥＬＩＳＡの結果は、３つのヒト化抗体が、２ヶ月間の異なる温度処理後に抗原に強く結合したことを示す（図１６）。

【0057】

集合的に、マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、首尾よくヒト化される。５つの重鎖および８つのヒト化軽鎖を設計し、合成し、ｐＣＤＮＡ３．４発現ベクターに挿入する。

【0058】

（実施例４。コハク酸は癌細胞の遊走を誘導し、特定の膜受容体、ＳＵＣＮＲ１を介して癌転移を増強する）

【0059】

（ＳＵＣＮＲ１シグナル伝達はコハク酸介在ＴＡＭ分極に関与する）

【0060】

コハク酸はＳＵＣＮＲ１リガンドとして知られている。従って、コハク酸がＳＵＣＮＲ１を通してＴＡＭ分極を促進することを調べた。最初に、対照ＩｇＧおよび抗ＳＵＣＮＲ１抗体で腹膜マクロファージを１時間前処理した後、細胞をコハク酸（１ｍＭ）で３日間刺激する。ＶＣＡＭ１⁺ＣＤ１１ｃ⁺ＣＤ１１ｂ^low－ＴＡＭは、フローサイトメトリーにより定量化され、制御媒体処理の倍数として表現される。マクロファージを抗ＳＵＣＮＲ１抗体で処理するが、対照ＩｇＧでは処理しないと、ＶＣＡＭ１⁺ＣＤ１１ｃ⁺ＣＤ１１ｂ^low－ＴＡＭのコハク酸介在アップレギュレーションが消失する（図１７Ａ）。さらに、腹腔マクロファージにスクランブル対照ｓｉＲＮＡ、マウスＳＵＣＮＲ１ ｓｉＲＮＡ－２７８、－５５９、または－７５８を４８時間トランスフェクトし、細胞を１ｍＭコハク酸（Ｓｕｃｃ）の有無にかかわらず１６時間または３日間刺激する。マクロファージにおけるＳｕｃｎｒ１ ｍＲＮＡ発現およびＳＵＣＮＲ１タンパク質レベルは、それぞれＡＲＧ１またはβ－アクチンに対する抗体を用いたｑＰＣＲおよびウェスタンブロットにより測定される（データは３実験の平均±ＳＥＭを表す。* Ｐ＜０．０５、**Ｐ ＜０．００５、*** Ｐ＜０．０００５）。結果は、特異的ｓｉＲＮＡ（ｓｉ－２７８、ｓｉ－５５９およびｓｉ－７５８）によるＳＵＣＮＲ１レベルの抑制（図１７Ｂおよび１７Ｃ）が、対照ｓｉＲＮＡではなく、Ａｒｇ１、Ｆｉｚｚ１、Ｍｇｌ１およびＭｇｌ２ ｍＲＮＡのコハク酸誘導発現を阻害することを示す（図１７Ｄ）。ＶＣＡＭ１⁺ＣＤ１１ｃ⁺ＣＤ１１ｂ^low－ＴＡＭの後続的な仲介による上方調節は、３種類のＳＵＣＮＲ１ ｓｉＲＮＡによって廃止されているが、スクランブルされたｓｉＲＮＡによっては廃止されていない（図１７Ｅ）。これらの結果は、コハク酸がＳＵＣＮＲ１シグナル伝達経路を介してＴＡＭ分極を促進することを示唆する。

【0061】

（コハク酸で活性化されたＳＵＣＮＲ１はマクロファージの遊走を促進する）

【0062】

癌－ＣＭとコハク酸がマクロファージ遊走を誘発するか否かをさらに検討した。腹膜マクロファージをトランスウェルプレートの上部チャンバーに播種し、対照培地（ＤＭＥＭ）またはＡ５４９由来のＣＭ（Ａ５４９－ＣＭ）で２４時間培養する。一方、腹膜マクロファージをトランスウェルプレートの上部チャンバーに播種し、コントロールＩｇＧまたは抗ＳＵＣＮＲ１抗体の存在下または非存在下でコントロール培地（ＤＭＥＭ）またはＡ５４９－ＳＣＭで２４時間培養する。次いで、遊走アッセイを、化学誘引物質としてＰＤＧＦ－ＢＢを用いて行い、そして遊走した細胞数を、基礎対照の倍数として表す。図１８Ａおよび１８Ｂに示されるように、Ａ５４９－ＣＭおよびＡ５４９－ＳＣＭは、対照培地と比較してマクロファージ遊走を増加させ、これは、抗ＳＵＣＮＲ１抗体によって阻害されるが、対照ＩｇＧによっては阻害されない。さらに、腹膜マクロファージを異なる濃度のコハク酸で２４時間処理する。それは、抗ＳＵＣＮＲ１抗体がコハク酸誘導マクロファージ遊走を抑制するが、対照ＩｇＧは抑制しないことを示す（図１８Ｃ）。コハク酸／ＳＵＣＮＲ１シグナル伝達がマクロファージ遊走に必須であることを示している。

【0063】

腫瘍由来コハク酸がマクロファージの可溶性走化性因子として作用するかどうかを決定するために、腹膜マクロファージを、対照ＩｇＧまたは抗ＳＵＣＮＲ１抗体の有無にかかわらずコハク酸（１ｍＭ）で２４時間処理し、次いで、細胞遊走をトランスウェルアッセイによって分析する。そして、ＰＤＧＦおよび異なる濃度のコハク酸を、マクロファージ遊走アッセイのためにトランスウェルプレートの底部チャンバーに配置した。対照と比較して、コハク酸はマクロファージ遊走を劇的に増加させる（図１８Ｄ）。コハク酸によって誘導される遊走の程度は、ＰＤＧＦによって誘導される遊走の程度に近い。結果は、腫瘍細胞がマクロファージの動員と遊走および結果としてのＴＡＭ極性化を促進するためにコハク酸を分泌することを示唆する。

【0064】

（コハク酸は癌細胞移動と上皮間葉転換（ＥＭＴ）を誘導し、癌転移を増強する）

【0065】

コハク酸はマクロファージの遊走を促進するので、コハク酸が癌細胞の遊走を調節するのではないかと考えられている。ＬＬＣ細胞を、規則的またはマトリゲル被覆膜上に播種し、そして異なる濃度のコハク酸で２４時間処理する。トランスウェル遊走および浸潤アッセイを行う。遊走または浸潤の相対的能力は、光学顕微鏡下で３つの視野から計算される。また、Ａ５４９、ＨＴ－２９、ＭＣＦ－７、およびＰＣ３細胞を含む細胞をトランスウェルプレートの上部チャンバーに播種し、異なる濃度のコハク酸で２４時間処理する。次いで、遊走アッセイおよびマトリゲル浸潤アッセイを、化学誘引物質としてＰＤＧＦ－ＢＢを用いて行い、そして移動した細胞数を基礎対照の倍数として表す。その結果、コハク酸はＬＬＣ肺癌細胞（図１９Ａ）とＡ５４９、結腸（ＨＴ－２９）、乳房（ＭＣＦ－７）、前立腺癌細胞（ＰＣ３）の細胞遊走と浸潤を用量依存的に促進することが明らかになった（図１９Ｂと１９Ｃ）。

【0066】

また、コハク酸は癌細胞ＥＭＴにも影響する。要約すると、Ａ５４９細胞をビヒクルまたはコハク酸（０．５、１および２．５ｍＭ）で２４時間処理する。また、Ａ５４９細胞を、指示された期間、ビヒクルまたはコハク酸（１ｍＭ）で処理する。細胞を溶解し、細胞溶解物を、Ｅ－カドヘリン、Ｎ－カドヘリン、ビメンチン、またはβ－アクチンに特異的な抗体で免疫ブロットする。一方、Ａ５４９細胞を、メトホルミン（２ｍＭ）の有無にかかわらずコハク酸で２４時間処理して、ＥＭＴ阻害を評価し、細胞遊走を、トランスウェルアッセイを用いて決定する。コハク酸は濃度と時間依存的にＥ－カドヘリンとＮ－カドヘリンとビメンチンの増加を抑制する（図１９Ｄと１９Ｅ）。重要なことに、ＥＭＴ阻害剤であるメトホルミンは、コハク酸誘導Ａ５４９遊走を無効にする（図１９Ｆ）。以上の結果から、癌細胞分泌コハク酸はオートクリン・パラクリン様式で作用し、ＥＭＴ依存的な機構を介して癌細胞の遊走・浸潤を促進することが示唆された。

【0067】

腫瘍転移における腫瘍由来コハク酸の生理学的関連性は、同系マウスＬＬＣ腫瘍モデルにおいて決定される。ＬＬＣ細胞をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに皮下注射し、続いてビヒクルまたはコハク酸（２０および１００ｍｇ／ｋｇ）を週２回腹腔内注射する。３週間後に皮下原発腫瘍を外科的に除去し、マウスをさらに２週間飼育し、その時点で動物を屠殺する。肺、肝臓、脾臓、副腎を切除し、転移を判定する。コハク酸を投与されたマウスでは（用量依存的に）、生理食塩水を投与されたマウスよりも肺の転移性癌結節が高い（図２０Ａ）。肝臓と脾臓の転移癌結節も同様にコハク酸処理動物で高い（図２０Ｂ）。コハク酸投与動物では副腎転移の発生率が高いが、その差は統計的有意には達しない（ｐ＝０．０８８）（図２０Ｃ）。

【0068】

（コハク酸誘導極性マクロファージは癌細胞遊走を増強する）

【0069】

マクロファージ表現型変化を介して間接的に癌細胞遊走を増加させるコハク酸として、癌細胞遊走に対するコハク酸誘導極性マクロファージの効果が評価される。マクロファージをコハク酸で３日間処理することによって誘導される極性化マクロファージを、トランスウェル培養皿中でＬＬＣ癌細胞と共培養し、癌細胞遊走をトランスウェルアッセイによって分析する。結果は、分極したマクロファージが、ＬＬＣ細胞単培養と比較した場合、ＬＬＣ細胞遊走を増強することを示す（図２１Ａ）。一方、ＩＬ－６濃度は共培養培地で増加するが、単培養培地では増加しない（図２１Ｂ）。特に、分極マクロファージと共培養されたＬＬＣ細胞の増強された遊走能力は、共培養培地中のＩＬ６を排除するための抗ＩＬ－６中和抗体（図２１Ｃ）の添加によって排除される（図２１Ｄ）。これらの結果は、極性マクロファージ媒介ＩＬ－６分泌がＬＬＣ遊走において中心的であることを示す。

【0070】

ＳＵＣＮＲ１ ｓｉＲＮＡ７５８を一時的にトランスフェクトしたマクロファージをコハク酸で３日間処理し、これをＬＬＣ細胞と共培養する。対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたマクロファージと比較して、ＳＵＣＮＲ１ ｓｉＲＮＡ７５８をトランスフェクトしたマクロファージの細胞遊走は有意に減少する（図２１Ｅ）。結果は、コハク酸誘導マクロファージ極性化が癌細胞移動の促進に寄与することを示唆する。

【0071】

（コハク酸はＳＵＣＮＲ１シグナル伝達を介して癌転移を促進する）

【0072】

ＳＵＣＮＲ１へのコハク酸結合は、いくつかのシグナル伝達標的、特にマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）を活性化し、細胞内カルシウムおよびプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ₂）を増加させる。糖質が癌細胞ＳＵＣＮＲ１を活性化することを確認するために、コハク酸によって刺激されたＡ５４９細胞のカノニックターゲットを分析する。Ａ５４９／ｓｈＮＣおよびＡ５４９／ｓｈＳＵＣＮＲ１細胞を、示された期間コハク酸（１ｍＭ）で処理し、次いで細胞溶解物を、ＥＲＫ１／２、ホスホ－ＥＲＫ１／２に特異的な抗体で免疫ブロットする。コハク酸処理後、２分でリン酸化ＥＲＫ１／２が急速に上昇し、これはＳＵＣＮＲ１ ｓｈＲＮＡを安定にトランスフェクトしたＡ５４９では消失するが、対照ＲＮＡを安定にトランスフェクトしたＡ５４９では消失しない（図２２Ａ）。ＬＬＣ／ｓｈＮＣ、ＬＬＣ／ｓｈＳＵＣＮＲ１、Ａ５４９／ｓｈＮＣ、およびＡ５４９／ｓｈＳＵＣＮＲ１細胞をさらにコハク酸（１ｍＭ）で２時間処理し、次いで細胞内カルシウムレベルおよび調整培地ＰＧＥ２レベルを、それぞれカルシウム比色アッセイキットおよびＰＧＥ２ ＥＬＩＳＡキットによって測定する。細胞内Ｃａ²⁺は、Ａ５４９またはＬＬＣ細胞をコハク酸で２時間処理した後に増加する（図２２Ｂ）。しかし、ＳＵＣＮＲ１ ｓｈＲＮＡで安定にトランスフェクトされたいずれの細胞型においても、Ｃａ²⁺濃度は上昇しない（図２２Ｂ）。培地中に放出されるＰＧＥ₂は、対照ｓｈＲＮＡで安定にトランスフェクトされたＬＬＣ細胞において増加するが、ＳＵＣＮＲ１ ｓｈＲＮＡで安定にトランスフェクトされたＬＬＣ細胞においては増加しない（図２２Ｃ）。これらの結果は、コハク酸がＳＵＣＮＲ１シグナル伝達標的を活性化するという解釈と一致する。

【0073】

ＳＵＣＮＲ１を介して癌細胞遊走を誘導するコハク酸の能力をさらに評価する。ＬＬＣ、Ａ５４９、ＰＣ３、およびＨＴ－２９細胞を、対照ＩｇＧまたは抗ＳＵＣＮＲ１抗体の有無にかかわらずコハク酸（１ｍＭ）で２４時間処理し、遊走をトランスウェルアッセイによって決定する。ＬＬＣ、Ａ５４９、ＰＣ３およびＨＴ－２９細胞のコハク酸誘導遊走は、抗ＳＵＣＮＲ１抗体によってブロックされるが、対照ＩｇＧ抗体によってはブロックされない（図２３Ａ）。さらに、対照ＩｇＧまたは抗ＳＵＣＮＲ１抗体を含むまたは含まないコハク酸（１ｍＭ）で処理したＬＬＣおよびＨＴ－２９細胞の２４時間の侵入を、マトリゲル浸潤アッセイを用いて決定する。結果は、コハク酸誘導性のＬＬＣおよびＨＴ－２９の侵入が、ＩｇＧ抗体によってではなく、ＳＵＣＮＲ１抗体によって同様に阻害されることを示す（図２３Ｂ）。

【0074】

次に、減少したＳＵＣＮＲ１発現を示したＳＵＣＮＲ１ ｓｈＲＮＡで安定にトランスフェクトされたＡ５４９におけるコハク酸誘導細胞遊走および浸潤を分析する（安定な＃３および＃８、図２４Ａ）。対照ｓｈＲＮＡ（Ａ５４９／ｓｈＮＣ）またはＳＵＣＮＲ１ ｓｈＲＮＡ（Ａ５４９／ｓｈＳＵＣＮＲ１）で安定にトランスフェクトされたＡ５４９細胞を、コハク酸（１ｍＭ）で２４時間刺激する。細胞遊走および浸潤を、トランスウェルアッセイおよびマトリゲル浸潤アッセイによって測定する。結果は、コハク酸誘導Ａ５４９遊走および浸潤がＳＵＣＮＲ１ノックダウンによって抑制されることを示す（図２４Ｂ）。さらに、減少したＳｕｃｎｒ１を発現するｓｈＳＵＣＮＲ１（ＬＬＣ／ｓｈＳＵＣＮＲ１）で安定にトランスフェクトされたＬＬＣは、対照と比較して、コハク酸誘導細胞遊走を減少させた（図２４Ｃおよび２４Ｄ）。

【0075】

コハク酸増強転移におけるＳＵＣＮＲ１の役割をｉｎ ｖｉｖｏで調べるために、Ａ５４９／ｓｈＮＣまたはＡ５４９／ｓｈＳＵＣＮＲ１細胞をヌードマウスの皮下に移植する。その後、マウスにコハク酸（１００ｍｇ／ｋｇ）を週２回、８週間腹腔内注射する。５６日目にマウスを安楽死させ、転移性結節検査のために肺組織を切除する。Ａ５４９／ｓｈＳＵＣＮＲ１を接種したマウスでは、Ａ５４９／ｓｈＮＣを接種した動物よりも肺転移結節が有意に低い（図２４Ｅ）。同様に、ＬＬＣ／ｓｈＳＵＣＮＲ１を接種したマウスでは、肺の転移結節が有意に減少する（図２４Ｆ）。以上より、コハク酸はＳＵＣＮＲ１を介して癌転移を促進することが示唆された。

【0076】

（コハク酸はＰＩ３Ｋ／ＡＫＴおよびＨＩＦ－１αシグナル伝達を介して癌転移を誘導する）

【0077】

ＭＡＰＫ－、ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）－ＡＫＴ－ｍＴＯＲ－、およびＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼ（ＡＭＰＫ）媒介低酸素誘導因子－１α（ＨＩＦ－１α）アップレギュレーションはマクロファージ活性化および癌進行において重要な役割を果たす。したがって、これらのシグナル伝達分子がコハク酸の作用を媒介するかどうかを調べる。Ａ５４９およびＬＬＣ細胞を、示された期間コハク酸（１ｍＭ）で処理し、次いで、細胞溶解物を、ＨＩＦ－１α、Ａｋｔ、ホスホ－Ａｋｔ、ＡＭＰＫ、ホスホ－ＡＭＰＫ、ｐ３８ ＭＡＰＫ、ホスホ－ｐ３８ ＭＡＰＫ、またはβ－アクチンに特異的な抗体で免疫ブロットする。そして、コハク酸（１ｍＭ）で示された期間処理されたＬＬＣ細胞中のＨｉｆ－１α ｍＲＮＡをｑＰＣＲによって決定する。ＬＬＣおよびＡ５４９細胞において、コハク酸はｐ３８ ＭＡＰＫ、ＡＫＴ、ＡＭＰＫのリン酸化を時間依存的に誘導し、ＨＩＦ－１αタンパク質（図２５Ａ）およびｍＲＮＡ発現を増加させる（図２５Ｂ）。選択的キナーゼ阻害剤を用いて、ＬＬＣ細胞を異なる濃度のＬＹ２９４００２またはＳＢ２０２１９０で１２時間処理し、Ｈｉｆ－１α ｍＲＮＡを測定する。ＬＬＣ細胞をＬＹ２９４００２またはＳＢ２０２１９０で１時間前処理した後、ＬＬＣ細胞をコハク酸（１ｍＭ）で１２時間刺激し、Ｈｉｆ－１α ｍＲＮＡを測定する。ｐ３８ ＭＡＰＫではなくＰＩ３Ｋ／ＡＫＴの阻害剤は、Ｈｉｆ－１αの構成的およびコハク酸誘導性発現を抑制することが見出される（図２５Ｃおよび２５Ｄ）。ＨＩＦ－１α発現の駆動におけるＳＵＣＮＲ１の役割を理解するために、Ａ５４９／ｓｈＳＵＣＮＲ１におけるＨＩＦ－１αの発現レベルを決定する。コハク酸（１ｍＭ）またはコハク酸ジメチルエステル（ＤＭＳ、２０ｍＭ）で１２時間処理したＡ５４９／ｓｈＮＣおよびＡ５４９／ｓｈＳＵＣＮＲ１細胞におけるＨＩＦ－１α発現をｑＰＣＲによって測定する。ＨＩＦ－１αのアップレギュレーションは、コハク酸処理Ａ５４９／ｓｈＮＣ細胞において観察される（図２５Ｅ）。膜透過性コハク酸ジメチルエステル（ＤＭＳ）で処理したＡ５４９／ｓｈＮＣ細胞は、ＨＩＦ－１αの上昇をもたらす。しかし、Ａ５４９／ｓｈＳＵＣＮＲ１細胞では、コハク酸によって誘導されるがＤＭＳによっては誘導されないＨＩＦ－１αの発現が消失する（図２５Ｆ）ことから、コハク酸はＳＵＣＮＲ１依存的にＨＩＦ－１αの発現を誘導し、一方、ＤＭＳによって誘導されるＨＩＦ－１αの発現はＳＵＣＮＲ１非依存的であることが示唆される。

【0078】

ＨＩＦ－１α経路はＥＭＴの誘導を介して癌転移を媒介することが報告されているので、コハク酸がＨＩＦ－１α依存性シグナル伝達を介して肺癌細胞遊走とＥＭＴを促進するかどうかを評価する。ＬＬＣおよびＡ５４９の肺癌細胞を異なった濃度のＨＩＦ－１α特殊阻害剤で処理し、トランスウェルアッセイで細胞遊走を評価する。ＨＩＦ－１αの薬理学的阻害薬である２－ＭｅＯＥ２およびＢａｙ８７－２２４３は、コハク酸を介したＬＬＣおよびＡ５４９の遊走を用量依存的に阻害する（図２６Ａ）。プロリルヒドロキシラーゼ（ＰＨＤ）は、ＨＩＦ－１α中の２つの保存されたプロリン残基のヒドロキシル化によってＨＩＦ－１αタンパク質の安定性を制御し、それによってその分解を促進する。コハク酸誘導癌細胞遊走におけるＨＩＦ－１αの重要な役割を支持するさらなる証拠を提供するため、細胞遊走分析のために、細胞をＰＨＤ活性化剤α－ケトグルタル酸（α－ＫＧ）または阻害剤ジメチルオキサリルグリシン（ＤＭＯＧ）で処理する。α－ＫＧは減少するが、ＤＭＯＧはコハク酸介在細胞遊走を増加させる（図２６Ｂおよび２６Ｃ）。さらに、Ａ５４９／ｓｈＮＣまたはＡ５４９／ＨＩＦ－１α細胞中のＨＩＦ－１α ｍＲＮＡをｑＰＣＲによって測定し、コハク酸（１ｍＭ）を用いて、または、用いずに処理したＡ５４９／ｓｈＮＣまたはＡ５４９／ＨＩＦ－１α細胞の細胞遊走をトランスウェルアッセイによって決定する。結果は、コハク酸誘導Ａ５４９ｓ遊走がＨＩＦ－１αノックダウン（Ａ５４９／ｓｈＨＩＦ－１α）によって抑制されるが、対照（Ａ５４９／ｓｈＮＣ）では抑制されないことを示す（図２６Ｄ）。さらに、Ａ５４９細胞をＬＹ２９４００２またはＢａｙ８７－２２４３で１時間前処理し、ビヒクルまたはコハク酸（１ｍＭ）で２４時間処理する。細胞溶解物を、Ｅ－カドヘリン、ビメンチン、または□－アクチンに特異的な抗体で免疫ブロットする。それは、Ｂａｙ８７－２２４３によるＬＹ２９４００２またはＨＩＦ－１αシグナル伝達によるＰＩ３Ｋの遮断が、コハク酸媒介ビメンチン増大およびＥ－カドヘリン減少を抑制することを示す（図２６Ｅおよび２６Ｆ）。

【0079】

異種移植片Ａ５４９／ｓｈＨＩＦ－１α腫瘍モデルを用いて、ｉｎ ｖｉｖｏでのコハク酸誘導転移におけるＨＩＦ－１αの役割を確認する。Ａ５４９／ｓｈＮＣまたはＡ５４９／ＨＩＦ－１α細胞をヌードマウスの皮下に移植する。その後、マウスにコハク酸（１００ｍｇ／ｋｇ）を週２回、８週間腹腔内注射する。Ａ５４９／ｓｈＨＩＦ－１αを接種したマウスでは、Ａ５４９／ｓｈＮＣを接種した動物よりも肺転移結節が有意に低い（図２７Ａ）。さらに、Ａ５４９／ｓｈＮＣまたはＡ５４９／ｓｈＨＩＦ１－αの原発性皮下腫瘍から抽出した総タンパク質中のＥ‐カドヘリンおよびビメンチンのレベルは、Ｅ－カドヘリン、ビメンチン、または□－アクチンに特異的な抗体でイムノブロットすることによって測定される。結果は、原発性皮下Ａ５４９／ｓｈＨＩＦ－１α腫瘍におけるコハク酸誘導Ｅ－カドヘリン減少およびビメンチン上昇が、Ａ５４９／ｓｈＮＣ腫瘍と比較して逆転することを示す（図２７Ｂ）。まとめると、これらの結果は、コハク酸活性化ＳＵＣＮＲ１がＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達を介してＨＩＦ－１α媒介ＥＭＴを誘導することにより癌転移を促進することを示唆する。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図7F】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図15A】

【図15B】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図16D】

【図16E】

【図16F】

【図16G】

【図17A】

【図17B】

【図17C】

【図17D】

【図17E】

【図18A】

【図18B】

【図18C】

【図18D】

【図18E】

【図19A】

【図19B】

【図19C】

【図19D】

【図19E】

【図19F】

【図20A】

【図20B】

【図20C】

【図21A】

【図21B】

【図21C】

【図21D】

【図21E】

【図22A】

【図22B】

【図22C】

【図23A】

【図23B】

【図24A】

【図24B】

【図24C】

【図24D】

【図24E】

【図24F】

【図25A】

【図25B】

【図25C】

【図25D】

【図25E】

【図26A】

【図26B】

【図26C】

【図26D】

【図26E】

【図26F】

【図27A】

【図27B】

【配列表】

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