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特許7514546心筋細胞の成熟方法、心筋細胞の成熟度評価方法、成熟心筋細胞の純化方法、心筋細胞成熟度評価装置、心筋細胞成熟度評価プログラム、及び心筋細胞成熟キット
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-07-03
(45)【発行日】2024-07-11
(54)【発明の名称】心筋細胞の成熟方法、心筋細胞の成熟度評価方法、成熟心筋細胞の純化方法、心筋細胞成熟度評価装置、心筋細胞成熟度評価プログラム、及び心筋細胞成熟キット
(51)【国際特許分類】
C12N 5/077 20100101AFI20240704BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20240704BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20240704BHJP
【ＦＩ】
C12N5/077
C12M1/34 A
C12Q1/02
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2021562680
(86)(22)【出願日】2020-12-02
(86)【国際出願番号】 JP2020044816
(87)【国際公開番号】W WO2021112115
(87)【国際公開日】2021-06-10
【審査請求日】2022-03-04
(31)【優先権主張番号】P 2019218998
(32)【優先日】2019-12-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成３０年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、「事業名：再生医療実現拠点ネットワーク」「研究開発課題名：未成熟心筋細胞の成熟心筋細胞へのリプロミングとその分子メカニズムの解明」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(73)【特許権者】
【識別番号】505246789
【氏名又は名称】学校法人自治医科大学
(74)【代理人】
【識別番号】100097113
【弁理士】
【氏名又は名称】堀 城之
(74)【代理人】
【識別番号】100162363
【弁理士】
【氏名又は名称】前島 幸彦
(74)【代理人】
【識別番号】100194283
【弁理士】
【氏名又は名称】村上 大勇
(72)【発明者】
【氏名】魚崎 英毅
【審査官】市島 洋介
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１９－５１１４９２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１３－５２４８３７（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１６／１０４６１４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Cell Rep.，2015年，Vol. 13，pp.1705-1716
【文献】J. Mol. Cell. Cardiol.，2019年，Vol. 132，pp.120-135，Available online 11 May 2019
【文献】PLOS ONE，2016年，Vol. 11, Issue 11, e0166574
【文献】J. Thorac. Cardiovasc. Surg.，2020年，Vol. 159, Issue 6，pp.2260-2271.e7，Available online 10 July 2019
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ ５／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
未成熟の心筋細胞に、特定の核内受容体アゴニスト及び成熟促進化合物を加え、成熟させ、前記特定の核内受容体アゴニストは、甲状腺ホルモンと、ＲＸＲアゴニストと、
ＰＰＡＲアゴニスト及びＲＯＲアゴニストのいずれかとを含み、
前記成熟促進化合物は、ＨＩＦ１ａ阻害剤である
ことを特徴とする心筋細胞の成熟方法。
【請求項2】
前記心筋細胞の成熟を促進する転写因子も含んでもよく、前記転写因子は、Ａｈｒ、Ａｔｆ６、Ｃｅｂｐａ、Ｃｅｂｐｂ、Ｃｒｅｂｂｐ、Ｃｒｅｂｌ２、Ｃｔｃｆ、Ｅ２Ｆ６、Ｅｓｒｒａ、Ｅｓｒｒｇ、Ｆｏｘｃ２、Ｆｏｘｏ３、Ｇａｔａ３、Ｇｍｎｎ、Ｋｌｆ１５、Ｈｎｆ４ａ、Ｉｒｆ３、Ｉｒｆ４、Ｍｔａ１、Ｍｔｅｒｆ２、Ｎａｃｃ２、Ｎｆｅ２ｌ１、Ｎｏｓｔｒｉｎ、Ｎｒ１ｉ３、Ｎｒ３ｃ１、Ｎｒ４ａ３、Ｎｕｐｒ１、Ｐｐａｒｇｃ１ａ、Ｐｐａｒｇｃ１ｂ、Ｒｂｃｋ１、Ｒｂｌ１、Ｒｎｆ１４１、Ｒｏｒａ、Ｓｍｒｃｂ１、Ｚｂｔｂ２０、及びＺｂｔｂ７ａのからなる群の一種又は任意の組み合わせである
ことを特徴とする請求項１に記載の心筋細胞の成熟方法。
【請求項3】
発達段階にあるマウスの心臓のＲＮＡ－ｓｅｑによるトランスクリプトームのデータを参照として、請求項１又は２に記載の心筋細胞の成熟方法により成熟させたヒトの前記心筋細胞の成熟度を定量的に評価する
ことを特徴とする心筋細胞の成熟度評価方法。
【請求項4】
前記トランスクリプトームのデータのうち、共通の遺伝子についての参照により、他の種の前記心筋細胞の前記成熟度を定量的に評価することを特徴とする請求項３に記載の心筋細胞の成熟度評価方法。
【請求項5】
請求項１又は２に記載の心筋細胞の成熟方法により成熟させた前記心筋細胞、及び／又は請求項３又は４に記載の心筋細胞の成熟度評価方法により前記成熟度を評価した前記心筋細胞を純化する
ことを特徴とする成熟心筋細胞の純化方法。
【請求項6】
マウスの心臓の発達段階に対応したＲＮＡ－ｓｅｑによるトランスクリプトームについてのデータと、請求項１又は２に記載の心筋細胞の成熟方法により成熟させたヒトの心筋細胞のトランスクリプトーム解析の結果データとを格納する記憶部と、
前記トランスクリプトームのデータを参照として、前記結果データから前記心筋細胞の成熟度を評価する評価部とを備える
ことを特徴とする心筋細胞成熟度評価装置。
【請求項7】
記憶部と制御部とを備えるコンピュータにより実行されるプログラムであって、マウスの心臓の発達段階に対応したＲＮＡ－ｓｅｑによるトランスクリプトームについてのデータと、
請求項１又は２に記載の心筋細胞の成熟方法により成熟させたヒトの心筋細胞のトランスクリプトーム解析の結果データとを格納し、
格納された前記トランスクリプトームのデータを参照として、前記結果データから前記心筋細胞の成熟度を評価する
ことを特徴とする心筋細胞成熟度評価プログラム。
【請求項8】
特定の核内受容体アゴニスト及び成熟促進化合物を含み、未成熟の心筋細胞を成熟させ、前記特定の核内受容体アゴニストは、甲状腺ホルモンと、ＲＸＲアゴニストと、
ＰＰＡＲアゴニスト及びＲＯＲアゴニストのいずれかとを含み、
前記成熟促進化合物は、ＨＩＦ１ａ阻害剤である
ことを特徴とする心筋細胞成熟キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、特に、分化誘導した心筋細胞の成熟方法、心筋細胞の成熟度評価方法、成熟心筋細胞の純化方法、創薬支援方法、心疾患の治療方法、成熟心筋細胞マーカー、レポーター細胞、成熟心筋細胞、心筋細胞成熟度評価装置、心筋細胞成熟度評価プログラム、心筋細胞成熟キット、及び心筋細胞純化キットに関する。
【背景技術】
【0002】
日本生活習慣病予防協会（ＪＰＡＬＤ）の統計調査によると、特に成人以降に発症する心筋症等である心疾患の総患者数は１７２万９０００人（２０１６年４月１９日）、虚血性心疾患の年間死亡数、「急性心筋梗塞」３万７２２２人、「その他虚血性心疾患」３万４４５１人、心疾患による死亡数は年間１９万６１１３人（２０１６年１０月１３日）と報告されている。また、心筋梗塞が含まれる虚血性心疾患の医療費は７，５０３億円、このうち６５歳以上で５６３０億円を占める（２０１５年１１月１０日）。高齢化が進むことによりさらに増加することが予想されている。
【0003】
このような心疾患の治療のために、再生医療を用いることが検討されている。たとえば、ＥＳ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）やｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）等の多能性幹細胞を分化誘導して心筋細胞を作成し、これを移植することで、十度の心疾患を治療可能になると考えられる。さらに、このような分化誘導して作成した心筋細胞を用いることで、心疾患の解析や薬剤の毒性評価を行う技術も期待されている。
【0004】
たとえば、特許文献１を参照すると、幹細胞を原料細胞として培養し、分化成熟した心筋細胞を製造する方法であって、培養細胞中においてＳａｌｌ１遺伝子及びＭｅｓｐ１遺伝子を一過性に共発現させることを含む、心筋前駆細胞又は分化成熟した心筋細胞を製造する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】特開２０１７－６０４２２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
しかしながら、特許文献１に記載された技術等を用いて、多能性幹細胞等から分化誘導して作成された心筋細胞は、胎児型～新生児型となり、完全に成熟した大人（成人、成体）の心臓の心筋細胞と同様にはならなかった。
【0007】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、上述の課題を解消することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明の心筋細胞の成熟方法は、未成熟の心筋細胞に、特定の核内受容体アゴニスト及び成熟促進化合物を加え、成熟させ、前記特定の核内受容体アゴニストは、甲状腺ホルモンと、ＲＸＲアゴニストと、ＰＰＡＲアゴニスト及びＲＯＲアゴニストのいずれかとを含み、前記成熟促進化合物は、ＨＩＦ１ａ阻害剤であることを特徴とする。
本発明の心筋細胞の成熟方法は、前記心筋細胞の成熟を促進する転写因子も含んでもよく、前記転写因子は、Ａｈｒ、Ａｔｆ６、Ｃｅｂｐａ、Ｃｅｂｐｂ、Ｃｒｅｂｂｐ、Ｃｒｅｂｌ２、Ｃｔｃｆ、Ｅ２Ｆ６、Ｅｓｒｒａ、Ｅｓｒｒｇ、Ｆｏｘｃ２、Ｆｏｘｏ３、Ｇａｔａ３、Ｇｍｎｎ、Ｋｌｆ１５、Ｈｎｆ４ａ、Ｉｒｆ３、Ｉｒｆ４、Ｍｔａ１、Ｍｔｅｒｆ２、Ｎａｃｃ２、Ｎｆｅ２ｌ１、Ｎｏｓｔｒｉｎ、Ｎｒ１ｉ３、Ｎｒ３ｃ１、Ｎｒ４ａ３、Ｎｕｐｒ１、Ｐｐａｒｇｃ１ａ、Ｐｐａｒｇｃ１ｂ、Ｒｂｃｋ１、Ｒｂｌ１、Ｒｎｆ１４１、Ｒｏｒａ、Ｓｍｒｃｂ１、Ｚｂｔｂ２０、及びＺｂｔｂ７ａのからなる群の一種又は任意の組み合わせであることを特徴とする。
本発明の心筋細胞の成熟度評価方法は、発達段階にあるマウスの心臓のＲＮＡ－ｓｅｑによるトランスクリプトームのデータを参照として、前記心筋細胞の成熟方法により成熟させたヒトの前記心筋細胞の成熟度を定量的に評価することを特徴とする。
本発明の心筋細胞の成熟度評価方法は、前記トランスクリプトームのデータのうち、共通の遺伝子についての参照により、他の種の前記心筋細胞の前記成熟度を定量的に評価することを特徴とする。
本発明の成熟心筋細胞の純化方法は、前記心筋細胞の成熟方法により成熟させた前記心筋細胞、及び／又は前記心筋細胞の成熟度評価方法により前記成熟度を評価した前記心筋細胞を純化することを特徴とする。
本発明の心筋細胞成熟度評価装置は、マウスの心臓の発達段階に対応したＲＮＡ－ｓｅｑによるトランスクリプトームについてのデータと、前記心筋細胞の成熟方法により成熟させたヒトの心筋細胞のトランスクリプトーム解析の結果データとを格納する記憶部と、前記トランスクリプトームのデータを参照として、前記結果データから前記心筋細胞の成熟度を評価する評価部とを備えることを特徴とする。
本発明の心筋細胞成熟度評価プログラムは、記憶部と制御部とを備えるコンピュータにより実行されるプログラムであって、マウスの心臓の発達段階に対応したＲＮＡ－ｓｅｑによるトランスクリプトームについてのデータと、前記心筋細胞の成熟方法により成熟させたヒトの心筋細胞のトランスクリプトーム解析の結果データとを格納し、格納された前記トランスクリプトームのデータを参照として、前記結果データから前記心筋細胞の成熟度を評価することを特徴とする。
本発明の心筋細胞成熟キットは、特定の核内受容体アゴニスト及び成熟促進化合物を含み、未成熟の心筋細胞を成熟させ、前記特定の核内受容体アゴニストは、甲状腺ホルモンと、ＲＸＲアゴニストと、ＰＰＡＲアゴニスト及びＲＯＲアゴニストのいずれかとを含み、前記成熟促進化合物は、ＨＩＦ１ａ阻害剤であることを特徴とする。
本発明の心筋細胞の成熟方法は、前記心筋細胞の成熟を促進する転写因子も含んでもよく、前記転写因子は、Ａｈｒ、Ａｔｆ６、Ｃｅｂｐａ、Ｃｅｂｐｂ、Ｃｒｅｂｂｐ、Ｃｒｅｂｌ２、Ｃｔｃｆ、Ｅ２Ｆ６、Ｅｓｒｒａ、Ｅｓｒｒｇ、Ｆｏｘｃ２、Ｆｏｘｏ３、Ｇａｔａ３、Ｇｍｎｎ、Ｋｌｆ１５、Ｈｎｆ４ａ、Ｉｒｆ３、Ｉｒｆ４、Ｍｔａ１、Ｍｔｅｒｆ２、Ｎａｃｃ２、Ｎｆｅ２ｌ１、Ｎｏｓｔｒｉｎ、Ｎｒ１ｉ３、Ｎｒ３ｃ１、Ｎｒ４ａ３、Ｎｕｐｒ１、Ｐｐａｒｇｃ１ａ、Ｐｐａｒｇｃ１ｂ、Ｒｂｃｋ１、Ｒｂｌ１、Ｒｎｆ１４１、Ｒｏｒａ、Ｓｍｒｃｂ１、Ｚｂｔｂ２０、及びＺｂｔｂ７ａのからなる群の一種又は任意の組み合わせであることを特徴とする。
本発明の心筋細胞の成熟度評価方法は、発達段階にあるマウスの心臓のＲＮＡ－ｓｅｑによるトランスクリプトームのデータを参照として、前記心筋細胞の成熟方法により成熟させたヒトの前記心筋細胞の成熟度を定量的に評価することを特徴とする。
本発明の心筋細胞の成熟度評価方法は、前記トランスクリプトームのデータのうち、共通の遺伝子についての参照により、他の種の前記心筋細胞の前記成熟度を定量的に評価することを特徴とする。
本発明の成熟心筋細胞の純化方法は、前記心筋細胞の成熟方法により成熟させた前記心筋細胞、及び／又は前記心筋細胞の成熟度評価方法により前記成熟度を評価した前記心筋細胞を純化することを特徴とする。
本発明の心筋細胞成熟度評価装置は、マウスの心臓の発達段階に対応したＲＮＡ－ｓｅｑによるトランスクリプトームについてのデータと、前記心筋細胞の成熟方法により成熟させたヒトの心筋細胞のトランスクリプトーム解析の結果データとを格納する記憶部と、前記トランスクリプトームのデータを参照として、前記結果データから前記心筋細胞の成熟度を評価する評価部とを備えることを特徴とする。
本発明の心筋細胞成熟度評価プログラムは、記憶部と制御部とを備えるコンピュータにより実行されるプログラムであって、マウスの心臓の発達段階に対応したＲＮＡ－ｓｅｑによるトランスクリプトームについてのデータと、前記心筋細胞の成熟方法により成熟させたヒトの心筋細胞のトランスクリプトーム解析の結果データとを格納し、格納された前記トランスクリプトームのデータを参照として、前記結果データから前記心筋細胞の成熟度を評価することを特徴とする。
本発明の心筋細胞成熟キットは、特定の核内受容体アゴニスト及び成熟促進化合物を含み、未成熟の心筋細胞を成熟させ、前記特定の核内受容体アゴニストは、甲状腺ホルモンと、ＲＸＲアゴニストと、ＰＰＡＲアゴニスト及びＲＯＲアゴニストのいずれかとを含み、前記成熟促進化合物は、ＨＩＦ１ａ阻害剤であることを特徴とする。
【発明の効果】
【0009】
本発明によれば、多能性幹細胞等に由来する未成熟の心筋細胞に、特定の核内受容体アゴニスト、成熟促進化合物、及び、前記心筋細胞の成熟を促進する転写因子からなる群の一種又は任意の組み合わせを加え、成熟させることで、従来より成熟した成熟心筋細胞を得ることが可能な心筋細胞の成熟方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1A】本発明の実施の形態に係る心筋細胞（マウスＰＳＣ－ＣＭｓ、分化１０日目）の写真である。
【図1B】本発明の実施の形態に係る心筋細胞（マウスＰＳＣ－ＣＭｓ、分化２ヶ月）の写真である。
【図1C】本発明の実施の形態に係る心筋細胞（マウス新生仔由来）の写真である。
【図1D】本発明の実施の形態に係る心筋細胞（マウス成体由来）の写真である。
【図2】本発明の実施例１に係る心筋細胞成熟度評価装置の概略構成を示すブロック図である。
【図3】本発明の実施例１に係るマウス心臓の発達段階のトランスクリプトームの主成分分析の散布図である。
【図4A】本発明の実施例１に係るマウス心臓の発達段階別の成熟度スコアの例を示すグラフである。
【図4B】本発明の実施例１に係るマウスＰＳＣ－ＣＭｓの成熟度スコアの例を示すグラフである。
【図5A】本発明の実施例１に係るマウス心臓の発達段階別の成熟度スコアの例を示すグラフである。
【図5B】本発明の実施例１に係るヒトの成熟度スコアの例を示すグラフである。
【図6A】本発明の実施例２に係る成熟心筋細胞マーカーの候補遺伝子の成熟における発現量変化を示すグラフである。
【図6B】本発明の実施例２に係る成熟心筋細胞マーカーの候補遺伝子の成熟における発現量変化を示すグラフである。
【図6C】本発明の実施例２に係る成熟心筋細胞マーカーの候補遺伝子の成熟における発現量変化を示すグラフである。
【図7A】本発明の実施例２に係る心臓の発達段階におけるＭｙｏｍ２の発現を示すグラフである。
【図7B】本発明の実施例２に係る心臓の発達段階におけるサルコメア中のＭｙｏｍ２の局在の概念図である。
【図8A】本発明の実施例２に係るＭｙｏｍ２－ＲＦＰ陰性細胞の写真である。
【図8B】本発明の実施例２に係るＭｙｏｍ２－ＲＦＰ陽性細胞の写真である。
【図9A】本発明の実施例２に係るＭｙｏｍ２－ＲＦＰ株の心筋細胞分化過程および成熟過程における、経時的なＲＦＰ陽性率をＦＡＣＳにより解析した結果を示すグラフである。
【図9B】本発明の実施例２に係るＭｙｏｍ２－ＲＦＰ株のＲＦＰ陽性細胞中のＲＦＰの蛍光輝度を経時的にＦＡＣＳにより解析した結果を示すグラフである。
【図9C】本発明の実施例２に係るＭｙｏｍ２－ＲＦＰ株のＲＦＰ陽性細胞におけるα－アクチニンおよびＲＦＰのラインスキャン結果を示すグラフである。
【図10A】本発明の実施例２に係るＭｙｏｍ２－ＲＦＰ株の心筋細胞分化誘導後２１日目と２８日目におけるＲＦＰ陽性細胞と陰性細胞について、サルコメア長の比較を示すグラフである。
【図10B】本発明の実施例２に係るＭｙｏｍ２－ＲＦＰ株の心筋細胞分化誘導後２１日目と２８日目におけるＲＦＰ陽性細胞と陰性細胞について、細胞サイズの比較を示すグラフである。
【図10C】本発明の実施例２に係るＭｙｏｍ２－ＲＦＰ株の心筋細胞分化誘導後２１日目と２８日目におけるＲＦＰ陽性細胞と陰性細胞について、細胞周囲長の比較を示すグラフである。
【図10D】本発明の実施例２に係るＭｙｏｍ２－ＲＦＰ株の心筋細胞分化誘導後２１日目と２８日目におけるＲＦＰ陽性細胞と陰性細胞について、細胞の長さの比較を示すグラフである。
【図10E】本発明の実施例２に係るＭｙｏｍ２－ＲＦＰ株の心筋細胞分化誘導後２１日目と２８日目におけるＲＦＰ陽性細胞と陰性細胞について、細胞の幅の比較を示すグラフである。
【図10F】本発明の実施例２に係るＭｙｏｍ２－ＲＦＰ株の心筋細胞分化誘導後２１日目と２８日目におけるＲＦＰ陽性細胞と陰性細胞について、細胞の縦横比（Ａｓｐｅｃｔ Ｒａｔｉｏ）の比較を示すグラフである。
【図11】本発明の実施例２に係るＭｙｏｍ２－ＲＦＰ株の心筋細胞分化誘導後２１日目と２８日目におけるＲＦＰ陽性細胞と陰性細胞について、二核化の程度を示すグラフである。
【図12A】本発明の実施例２に係るＭｙｏｍ２－ＲＦＰ株の心筋細胞分化誘導後２８日目におけるＲＦＰ陽性細胞と陰性細胞について、カルシウムトランジェント測定の結果を示す写真である。
【図12B】本発明の実施例２に係るＭｙｏｍ２－ＲＦＰ株の心筋細胞分化誘導後２８日目におけるＲＦＰ陽性細胞と陰性細胞について、カルシウムトランジェント測定の結果を示すグラフである。
【図12C】本発明の実施例２に係るＭｙｏｍ２－ＲＦＰ株の心筋細胞分化誘導後２８日目におけるＲＦＰ陽性細胞と陰性細胞について、カルシウムトランジェント測定の結果を示すグラフである。
【図13A】本発明の実施例２に係るＭｙｏｍ２－ＲＦＰ陽性細胞のサルコメア短縮アッセイの結果を示す写真である。
【図13B】本発明の実施例２に係るＭｙｏｍ２－ＲＦＰ陽性細胞のサルコメア短縮アッセイの結果を示すグラフである。
【図13C】本発明の実施例２に係るＭｙｏｍ２－ＲＦＰ陽性細胞のサルコメア短縮アッセイの結果を示すグラフである。
【図13D】本発明の実施例２に係るＭｙｏｍ２－ＲＦＰ陽性細胞のサルコメア短縮アッセイの結果を示すグラフである。
【図13E】本発明の実施例２に係るＭｙｏｍ２－ＲＦＰ陽性細胞のサルコメア短縮アッセイの結果を示すグラフである。
【図14】本発明の実施例２に係るＭｙｏｍ２－ＲＦＰ株の分化、成熟過程におけるトランスクリプトーム分析を行った結果のヒートマップである。
【図15A】本発明の実施例２に係るＭｙｏｍ２－ＲＦＰ株の分化、成熟過程におけるトランスクリプトーム分析を行った結果のグラフである。
【図15B】本発明の実施例２に係るＭｙｏｍ２－ＲＦＰ株の分化、成熟過程におけるトランスクリプトーム分析を行った結果のグラフである。
【図16】本発明の実施例２に係るＭｙｏｍ２－ＲＦＰ株の分化、成熟過程における成熟度スコアを示すグラフである。
【図17】本発明の実施例３に係るＭｙｏｍ２－ＲＦＰ株にホルモン又はアゴニストを加えた際のＲＦＰ陽性率を示すグラフである。
【図18】本発明の実施例３に係るマウスＰＳＣ－ＣＭｓにホルモン又はアゴニスト（単剤）を加えた際の成熟度スコアを示すグラフである。
【図19】本発明の実施例３に係るマウスＰＳＣ－ＣＭｓにホルモン又はアゴニスト（２剤）を加えた際の成熟度スコアを示すグラフである。
【図20A】本発明の実施例３に係るマウスＰＳＣ－ＣＭｓにホルモン又はアゴニスト（３剤）を加えた際の成熟度スコアを示すグラフである。
【図20B】本発明の実施例３に係るマウスＰＳＣ－ＣＭｓにホルモン又はアゴニスト（３剤）を加えた際の成熟度スコアを示すグラフである。
【図21】本発明の実施例３に係るマウスＰＳＣ－ＣＭｓにＨＩＦ１ａ阻害剤を加えた際の成熟度スコアを示すグラフである。
【図22】本発明の実施例３に係るマウスＰＳＣ－ＣＭｓにホルモン・アゴニストを加えた際の細胞内カルシウムのトランジェント現象を示す写真及びグラフである。
【図23】本発明の実施例３に係るヒトのＰＳＣ－ＣＭｓにホルモン又はアゴニスト（３剤）を加えた際の成熟度スコアを示すグラフである。
【図24】本発明の実施例３に係る転写因子を導入した際の解析結果を示すグラフである。
【図25A】本発明の実施例４に係るヒトＴＣＡＰ－ＧＦＰ ＫＩ レポーター細胞のＧＦＰ発現量のプロット（ｄ１４）である。
【図25B】本発明の実施例４に係るヒトＴＣＡＰ－ＧＦＰ ＫＩ レポーター細胞のＧＦＰ発現量のプロット（ｄ２１）である。
【図25C】本発明の実施例４に係るヒトＴＣＡＰ－ＧＦＰ ＫＩ レポーター細胞のＧＦＰ発現量のプロット（ｄ３５）である。
【図26A】本発明の実施例４に係るヒトＴＣＡＰ－ＧＦＰ ＫＩ レポーター細胞の写真である。
【図27A】本発明の実施例４に係るマウス心臓の発達段階別のＴｎｎｉ３発現のグラフである。
【図27B】本発明の実施例４に係るＡｎｔｉ－Ｔｎｎｉ３のフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。
【図27C】本発明の実施例４に係るＡｎｔｉ－Ｔｎｎｉ３のフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。
【図27D】本発明の実施例４に係るＡｎｔｉ－Ｔｎｎｉ３のフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。
【図27E】本発明の実施例４に係るＡｎｔｉ－Ｔｎｎｉ３のフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。
【図27F】本発明の実施例４に係るＡｎｔｉ－Ｔｎｎｉ３のフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。
【図27G】本発明の実施例４に係るＡｎｔｉ－Ｔｎｎｉ３のフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。
【図28】本発明の実施例４に係るマウスＰＳＣ－ＣＭｓのミトコンドリア形態を示す写真である。
【図30A】本発明の実施例４に係るマウスＰＳＣ－ＣＭｓのミトコンドリア機能を示すグラフである。
【図30B】本発明の実施例４に係るマウスＰＳＣ－ＣＭｓのミトコンドリア機能を示すグラフである。
【図30C】本発明の実施例４に係るマウスＰＳＣ－ＣＭｓのミトコンドリア機能を示すグラフである。
【図30D】本発明の実施例４に係るマウスＰＳＣ－ＣＭｓのミトコンドリア機能を示すグラフである。
【図30E】本発明の実施例４に係るマウスＰＳＣ－ＣＭｓのミトコンドリア機能を示すグラフである。
【図31A】本発明の実施例４に係るヒトＰＳＣ－ＣＭｓのカルシウムトランジェントの結果を示すグラフである。
【図31B】本発明の実施例４に係るヒトＰＳＣ－ＣＭｓのカルシウムトランジェントの結果を示すグラフである。
【図31C】本発明の実施例４に係るヒトＰＳＣ－ＣＭｓのカルシウムトランジェントの結果を示すグラフである。
【図31D】本発明の実施例４に係るヒトＰＳＣ－ＣＭｓのカルシウムトランジェントの結果を示すグラフである。
【図31E】本発明の実施例４に係るヒトＰＳＣ－ＣＭｓのカルシウムトランジェントの結果を示すグラフである。
【図31F】本発明の実施例４に係るヒトＰＳＣ－ＣＭｓのカルシウムトランジェントの結果を示すグラフである。
【図31G】本発明の実施例４に係るヒトＰＳＣ－ＣＭｓのカルシウムトランジェントの結果を示すグラフである。
【図31H】本発明の実施例４に係るヒトＰＳＣ－ＣＭｓのカルシウムトランジェントの結果を示すグラフである。
【図31I】本発明の実施例４に係るヒトＰＳＣ－ＣＭｓのカルシウムトランジェントの結果を示すグラフである。
【図31J】本発明の実施例４に係るヒトＰＳＣ－ＣＭｓのカルシウムトランジェントの結果を示すグラフである。
【図32】本発明の実施例４に係るヒトＰＳＣ－ＣＭｓのミトコンドリア形態を示す写真である。
【図33A】本発明の実施例４に係るヒトＰＳＣ－ＣＭｓのミトコンドリア機能を調べる実験の概念図である。
【図33B】本発明の実施例４に係るヒトＰＳＣ－ＣＭｓのミトコンドリア機能を示すグラフである。
【図33C】本発明の実施例４に係るヒトＰＳＣ－ＣＭｓのミトコンドリア機能を示すグラフである。
【図34】本発明の実施例４に係るヒトＰＳＣ－ＣＭｓのミトコンドリア機能を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0011】
＜実施の形態＞
図１Ａ～図１Ｄに、多能性幹細胞から分化誘導して得られる心筋細胞（以下、「ＰＳＣ－ＣＭｓ」という。）の例を示す。ＰＳＣ－ＣＭｓは、胎児型～新生児型となり、完全に成熟した心臓の心筋細胞と同様にはならないことが分かっている。たとえば、図１Ａの例に示すように、マウスのＥＳ細胞のような多能性幹細胞から分化誘導した心筋細胞は、分化１０日目では胎児型の未熟な形態である。図１Ｂに示す、分化後２ヶ月の状態のように、長期培養することで、より長い形態となる。しかし、それでも、図１Ｃに示すような、マウス新生仔から単離した細胞と同程度にしかならず、図１Ｄに示すようなマウス成体の細胞とは形態的にも大きな差がある。さらに、各図右上に示すような、細胞内のカルシウム量の変化を見るカルシウムトランジェントでも、その未成熟パターンであることは明らかであった。
このため、ＰＳＣ－ＣＭｓをより成熟させる成熟方法が求められていた。この際、得られた心筋細胞全体の成熟度を定量的に評価するのは難しいことも、より効果的な成熟方法の開発を困難としていた。また、成熟した心筋細胞と未成熟な心筋細胞が混在している状態から、成熟した心筋細胞のみを純化する方法はなかった。
図１Ａ～図１Ｄに、多能性幹細胞から分化誘導して得られる心筋細胞（以下、「ＰＳＣ－ＣＭｓ」という。）の例を示す。ＰＳＣ－ＣＭｓは、胎児型～新生児型となり、完全に成熟した心臓の心筋細胞と同様にはならないことが分かっている。たとえば、図１Ａの例に示すように、マウスのＥＳ細胞のような多能性幹細胞から分化誘導した心筋細胞は、分化１０日目では胎児型の未熟な形態である。図１Ｂに示す、分化後２ヶ月の状態のように、長期培養することで、より長い形態となる。しかし、それでも、図１Ｃに示すような、マウス新生仔から単離した細胞と同程度にしかならず、図１Ｄに示すようなマウス成体の細胞とは形態的にも大きな差がある。さらに、各図右上に示すような、細胞内のカルシウム量の変化を見るカルシウムトランジェントでも、その未成熟パターンであることは明らかであった。
このため、ＰＳＣ－ＣＭｓをより成熟させる成熟方法が求められていた。この際、得られた心筋細胞全体の成熟度を定量的に評価するのは難しいことも、より効果的な成熟方法の開発を困難としていた。また、成熟した心筋細胞と未成熟な心筋細胞が混在している状態から、成熟した心筋細胞のみを純化する方法はなかった。
【0012】
このため、本発明者らは、鋭意実験を繰り返し、まず、発達の各段階（ステージ）にあるマウス心臓のトランスクリプトームデータ１１０（図２）を参照とすることで、ヒトの心筋細胞であっても、どれぐらい未成熟であるか又は成熟しているかを定量的に評価するための心筋細胞の成熟度評価方法、及び、これを実現するための心筋細胞成熟度評価装置並びにプログラムを開発した。この上で、その成熟度評価方法を用いて、心筋細胞が成熟するのに合わせて発現が増加する遺伝子座に対し、蛍光タンパク質を挿入した多能性幹細胞株（レポーター細胞）を樹立した。このレポーター細胞により、成熟させた心筋細胞を精製して純化させる純化方法を確立も確立させることができた。これらを用いて、成熟を促進する可能性を見出した転写因子、ホルモン、核内受容体アゴニスト、低分子化合物のスクリーニングを行い、至適組み合わせの決定及び転写因子を同定した。これにより、心筋細胞を成熟させる成熟方法を確立することで、本発明を完成させるに至った。
【0013】
〔心筋細胞の成熟度評価方法〕
本実施形態の心筋細胞の成熟度評価方法は、発達段階にある動物の心臓のトランスクリプトームのデータを参照として、心筋細胞の成熟度を定量的に評価することを特徴とする。
本実施形態の心筋細胞の成熟度評価方法は、発達段階にある動物の心臓のトランスクリプトームのデータを参照として、心筋細胞の成熟度を定量的に評価することを特徴とする。
【0014】
このうち、本実施形態の動物は、特に限定されるものではなく、心臓のある脊椎動物及び無脊椎動物を広く含む。脊椎動物としては、魚類、両生類、は虫類、鳥類、及び哺乳類を含む。具体的には、例えば、哺乳類は、例えば、マウス、ラット、フェレット、ハムスター、モルモット、又はウサギ等のげっ歯類、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、又は、アカゲザル、チンパンジー、オランウータン、ヒト等を含む霊長類等であってもよい。また、哺乳類の他にも、魚類、家禽を含む鳥類、爬虫類等を含む。また、無脊椎動物等であっても、脊索動物、軟体動物、環形動物、節足動物等、心臓を備える動物も広く含む。
【0015】
本実施形態に係る発達段階にある動物の心臓のトランスクリプトームのデータは、例えば、次世代シーケンサーによる大規模ＲＮＡシークエンス（以下、「ＲＮＡ－ｓｅｑ」という。）、複数の遺伝子を設定した評価パネル（Ｔａｒｇｅｔｅｄ ＲＮＡ－ｓｅｑ、又はｑＰＣＲ）、ＤＮＡチップ、その他の複数の遺伝子発現を測定したものを解析したデータを用いることが可能である。このデータは、例えば、受精からの日数に対応した胎児又は胎仔～出生後の新生児～成熟の各段階（ステージ）において、各遺伝子の発現量のデータを含んでいる。ＲＮＡ－ｓｅｑの場合、発現量は、転写産物の量であるＴｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ（以下、「ＴＰＭ」という。）のデータとなる。
【0016】
本実施形態に係る多能性幹細胞は、例えば、ヒトを含む霊長類、霊長類以外のほ乳類、その他の脊椎動物等の生物で各種細胞に分化可能な、多分化能を備える幹細胞（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）を含む。ここで、本実施形態の多能性幹細胞は、継代可能であり、継代しても分化が進まない状態を保ち、核型等が変化しにくく、又はエピジェネティックな表現型が変化しにくい性質を有することが好適である。また、本実施形態の多能性幹細胞は、これに関連して、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）又は生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で十分な増殖能力を備えていることが好適である。このような本実施形態の多能性幹細胞の具体例としては、胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、以下、「ＥＳ細胞」という。）、人工多能性幹細胞（Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、以下、「ｉＰＳ細胞」という。）、その他の人工的に生成され若しくは選択された多能性を備える幹細胞等が挙げられる。本実施形態の多能性幹細胞は、特定の遺伝子を含むレトロウイルスやアデノウイルスやプラスミド等の各種ベクター、ＲＮＡ、低分子化合物等により、体細胞を再プログラミングして作成された幹細胞であってもよい。
なお、本実施形態の多能性幹細胞としては、必ずしも全能性に近い多分化能を備えている細胞である必要はないものの、通常より多分化能が高いナイーブ（Ｎａｉｖｅ）な細胞を用いることも可能である。また、本実施形態の多能性幹細胞は、疾患の患者から得られた細胞から作成された細胞、その他の疾患のモデルとなる細胞、レポーター遺伝子が組み込まれた細胞、コンディショナルノックアウトが可能な細胞、その他の遺伝子組み換えされた細胞等であってもよい。この遺伝子組み換えは、染色体内の遺伝子の追加や修飾や削除、各種ベクターや人工染色体による遺伝子等の付加、エピジェネティック制御の変更、ＰＮＡ等の人工遺伝物質の付加、その他の遺伝子組み換えを含む。
なお、本実施形態の多能性幹細胞としては、必ずしも全能性に近い多分化能を備えている細胞である必要はないものの、通常より多分化能が高いナイーブ（Ｎａｉｖｅ）な細胞を用いることも可能である。また、本実施形態の多能性幹細胞は、疾患の患者から得られた細胞から作成された細胞、その他の疾患のモデルとなる細胞、レポーター遺伝子が組み込まれた細胞、コンディショナルノックアウトが可能な細胞、その他の遺伝子組み換えされた細胞等であってもよい。この遺伝子組み換えは、染色体内の遺伝子の追加や修飾や削除、各種ベクターや人工染色体による遺伝子等の付加、エピジェネティック制御の変更、ＰＮＡ等の人工遺伝物質の付加、その他の遺伝子組み換えを含む。
【0017】
本実施形態に係る心筋細胞は、各種の中胚葉系への分化誘導因子等を用いた手法により多能性幹細胞から分化されたＰＳＣ－ＣＭｓであってもよい。加えて、本実施形態の心筋細胞は、患者等の線維芽細胞や血液細胞に転写因子を導入して誘導されるｉｎｄｕｃｅｄ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ（ｉＣＭ）であってもよい。さらに加えて、本実施形態の心筋細胞は、患者等の心臓から得られた初代培養（Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ）心筋細胞であってもよい。
さらに、本実施形態の心筋細胞は、心筋細胞に分化誘導された細胞を、各種マーカーや目視等によりコロニー等の形式で選択したものであってもよい。また、本実施形態の心筋細胞は、各種細胞の混合細胞集団、組織、臓器等（以下、「組織等」という。）であってもよい。これらの心筋細胞は、後述する成熟度スコアで示されるような様々な状態のものを混合して含んでいてもよい。すなわち、各細胞は、十分分化していなかったり、未成熟であったり、成体の細胞程、成熟していなかったりしてもよい。
さらに加えて、本実施形態の心筋細胞は、本実施形態の心筋細胞の成熟方法で成熟されたＰＳＣ－ＣＭｓ、及び／又は、本実施形態の成熟心筋細胞の純化方法で純化されたレポーター細胞を含んでいてもよい。これらの細胞については後述する。
また、以下、これらの心筋細胞のうち、成熟した心筋細胞を、単に「成熟心筋細胞」という。
さらに、本実施形態の心筋細胞は、心筋細胞に分化誘導された細胞を、各種マーカーや目視等によりコロニー等の形式で選択したものであってもよい。また、本実施形態の心筋細胞は、各種細胞の混合細胞集団、組織、臓器等（以下、「組織等」という。）であってもよい。これらの心筋細胞は、後述する成熟度スコアで示されるような様々な状態のものを混合して含んでいてもよい。すなわち、各細胞は、十分分化していなかったり、未成熟であったり、成体の細胞程、成熟していなかったりしてもよい。
さらに加えて、本実施形態の心筋細胞は、本実施形態の心筋細胞の成熟方法で成熟されたＰＳＣ－ＣＭｓ、及び／又は、本実施形態の成熟心筋細胞の純化方法で純化されたレポーター細胞を含んでいてもよい。これらの細胞については後述する。
また、以下、これらの心筋細胞のうち、成熟した心筋細胞を、単に「成熟心筋細胞」という。
【0018】
具体的には、本実施形態の心筋細胞の成熟度評価方法は、トランスクリプトームデータ１１０（図２）のうち、共通の遺伝子についての参照により、他の種の前記心筋細胞の前記成熟度を定量的に評価することも可能である。
本実施形態においては、例えば、後述する実施例で示すように、発達の各段階にあるマウスの心臓のＲＮＡ－ｓｅｑによるトランスクリプトームデータ１１０のうち、マウスとヒトで共通の遺伝子を参照として、ヒトのｉＰＳ細胞から分化誘導されたＰＳＣ－ＣＭｓのＲＮＡ－ｓｅｑの結果データ１２０から、成熟度を評価することが可能である。すなわち、特にヒトＰＳＣ－ＣＭｓについて、どの程度成熟しているかを定量的に評価することが可能である。
本実施形態においては、例えば、後述する実施例で示すように、発達の各段階にあるマウスの心臓のＲＮＡ－ｓｅｑによるトランスクリプトームデータ１１０のうち、マウスとヒトで共通の遺伝子を参照として、ヒトのｉＰＳ細胞から分化誘導されたＰＳＣ－ＣＭｓのＲＮＡ－ｓｅｑの結果データ１２０から、成熟度を評価することが可能である。すなわち、特にヒトＰＳＣ－ＣＭｓについて、どの程度成熟しているかを定量的に評価することが可能である。
【0019】
これにより、本実施形態に係る成熟心筋細胞は、他の手法で成熟させたものであるかを区別させることが可能となる。さらに、後述する実施例４に示すように、ミトコンドリアがパックされた形状を備えることで、従来の手法よりも成熟していることで、区別することが可能となる。加えて、上述のレポーター細胞としてクローニングすることで、当業者にとって、他の心筋細胞と区別することが可能である。
加えて、本実施形態に係る成熟心筋細胞の更なる特性を特定する作業を行うためには、特許出願の性質上、迅速性等を必要とすることに鑑みて、生物学的な実験、試験を行う為には著しく過大な経済的支出や時間を要する作業を行う必要があり、いわゆる不可能、非実際的事情が存在する。
なお、定量的評価の詳細については、後述する。
加えて、本実施形態に係る成熟心筋細胞の更なる特性を特定する作業を行うためには、特許出願の性質上、迅速性等を必要とすることに鑑みて、生物学的な実験、試験を行う為には著しく過大な経済的支出や時間を要する作業を行う必要があり、いわゆる不可能、非実際的事情が存在する。
なお、定量的評価の詳細については、後述する。
【0020】
〔心筋細胞成熟度評価装置、心筋細胞成熟度評価プログラム〕
次に、図２により、本実施形態の心筋細胞成熟度評価装置１について説明する。
心筋細胞成熟度評価装置１は、例えば、ＰＣ（Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ）、ワークステーション、汎用機、専用機等のコンピュータである。心筋細胞成熟度評価装置１は、図示しないＲＮＡ－ｓｅｑを行うシーケンサー、フローサイトメトリー装置等の外部装置やネットワークと接続され、又は、これらからのデータが入力される。そして、心筋細胞成熟度評価装置１は、解析用の心筋細胞成熟度評価プログラム１３０が実行されることで、心筋細胞の成熟度を評価する装置として機能する。
本実施形態の心筋細胞成熟度評価装置１は、例えば、制御部１０、記憶部１１、入力部１２、及び表示部１３を含んで構成される。
次に、図２により、本実施形態の心筋細胞成熟度評価装置１について説明する。
心筋細胞成熟度評価装置１は、例えば、ＰＣ（Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ）、ワークステーション、汎用機、専用機等のコンピュータである。心筋細胞成熟度評価装置１は、図示しないＲＮＡ－ｓｅｑを行うシーケンサー、フローサイトメトリー装置等の外部装置やネットワークと接続され、又は、これらからのデータが入力される。そして、心筋細胞成熟度評価装置１は、解析用の心筋細胞成熟度評価プログラム１３０が実行されることで、心筋細胞の成熟度を評価する装置として機能する。
本実施形態の心筋細胞成熟度評価装置１は、例えば、制御部１０、記憶部１１、入力部１２、及び表示部１３を含んで構成される。
【0021】
制御部１０は、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ、中央処理装置）、ＭＰＵ（Ｍｉｃｒｏ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）、ＤＳＰ（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｉｇｎａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ）、ＧＰＵ（Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）、ＡＳＩＣ（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｃｉｒｃｕｉｔ）等の情報処理部である。
制御部１０は、記憶部１１のＲＯＭやＨＤＤに記憶されている心筋細胞成熟度評価プログラム１３０を含む制御プログラムを読み出して、この制御プログラムをＲＡＭに展開させて実行することで、後述する評価部１００として動作させられる。また、制御部１０は、入力部１２からの指示に応じて、装置全体の制御を行う。
制御部１０は、記憶部１１のＲＯＭやＨＤＤに記憶されている心筋細胞成熟度評価プログラム１３０を含む制御プログラムを読み出して、この制御プログラムをＲＡＭに展開させて実行することで、後述する評価部１００として動作させられる。また、制御部１０は、入力部１２からの指示に応じて、装置全体の制御を行う。
【0022】
記憶部１１は、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ Ｏｎｌｙ Ｍｅｍｏｒｙ）、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｃｅｓｓ Ｍｅｍｏｒｙ）等の半導体メモリーやＨＤＤ（Ｈａｒｄ Ｄｉｓｋ Ｄｒｉｖｅ）等の一時的でない記録媒体である。記憶部１１には、ファームウェア、ＯＳ（Ｏｐｒａｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）を含む各種データ及びプログラムが格納されている。
【0023】
入力部１２は、キーボード、マウスやタッチパネル等のポインティングデバイス、カメラ、各種Ｉ／Ｏインターフェイス等を含む。入力部１２により、心筋細胞成熟度評価装置１の使用者（ユーザー）の指示を取得することが可能である。
【0024】
表示部１３は、ＬＣＤ（Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｄｉｓｐｌａｙ）、有機ＥＬディスプレイ、プロジェクター、プリンター（印刷手段）等を含む。表示部１３は、心筋細胞成熟度についての出力情報を表示、印刷等して出力することが可能である。
【0025】
この他にも、心筋細胞成熟度評価装置１は、インターネットやイントラネット等の各種ネットワーク、及び／又は、フローサイトメトリー装置、ＲＮＡ抽出装置、次世代シーケンサー、外部のサーバー等の外部機器に接続されていてもよい。外部機器は、ＵＳＢ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｓｅｒｉａｌ Ｂｕｓ）、ＲＳ－２３２Ｃ、専用インターフェイス等で接続されていてもよい。
【0026】
次に、心筋細胞成熟度評価装置１の制御構成について説明する。
制御部１０は、評価部１００を備えている。
記憶部１１は、トランスクリプトームデータ１１０、結果データ１２０、及び心筋細胞成熟度評価プログラム１３０を格納する。
制御部１０は、評価部１００を備えている。
記憶部１１は、トランスクリプトームデータ１１０、結果データ１２０、及び心筋細胞成熟度評価プログラム１３０を格納する。
【0027】
評価部１００は、トランスクリプトームデータ１１０を参照として、結果データ１２０から、ヒトの心筋細胞の成熟度を評価する。具体的には、評価部１００は、後述する心筋細胞の成熟度評価方法により、結果データ１２０から成熟度スコアを算出し、表示部１３に出力させる。このため、評価部１００は、例えば、トランスクリプトームデータ１１０から、成熟度スコアを算出するための各遺伝子に対応する係数を算出することも可能である。この係数については、下記で説明する。
【0028】
トランスクリプトームデータ１１０は、心筋細胞の成熟度を評価するための成熟度スコアを算出するための参照用のトランスクリプトームのデータである。本実施形態においては、この参照用のデータとして、動物の心臓の発達上の各ステージの細胞を取得し、ＲＮＡ－ｓｅｑを用いる例について説明する。このＲＮＡ－ｓｅｑの解析のデータは、例えば、受精からの発達段階の各ステージ（日数）と各遺伝子のＴＰＭとを含むデータを主成分分析し、第一主成分（ＰＣ１軸）に対応する係数をかけたものについて、概ね０～１００になるよう調整した値を用いることが可能である。すなわち、参照用のデータは、例えば、各遺伝子における係数データを含んだテーブルであってもよい。さらに、本実施形態においては、ＲＮＡ－ｓｅｑのデータとして、例えば、３’－ｍＲＮＡのみを扱うＱＵＡＮＴ－ｓｅｑ（Ｌｅｘｏｇｅｎ社製）の等のデータを用いることが可能である。
さらに、トランスクリプトームデータ１１０は、種の異なる心筋細胞について成熟度スコアを算出するために、例えば、マウスとヒトのように、種の違う場合の参照を行うための相同遺伝子（オーソログ）を指定したデータを含んでいてもよい。
さらに、トランスクリプトームデータ１１０は、種の異なる心筋細胞について成熟度スコアを算出するために、例えば、マウスとヒトのように、種の違う場合の参照を行うための相同遺伝子（オーソログ）を指定したデータを含んでいてもよい。
【0029】
結果データ１２０は、成熟度スコアを評価するためのトランスクリプトームのデータである。本実施形態においては、例えば、後述する実施例１等で示すように、マウスのＰＳＣ－ＣＭｓやヒトの心筋細胞について、ＲＮＡ－ｓｅｑを行った結果のデータを用いることが可能である。この結果のデータは、例えば、各遺伝子についてのＴＰＭを含んでいてもよい。この結果のデータのＴＰＭは、オーソログについてのデータのみを含んでいてもよい。
【0030】
心筋細胞成熟度評価プログラム１３０は、本実施形態の心筋細胞の成熟度評価方法を実現するためのプログラムである。このプログラムが記憶部の補助記憶部にインストールされ、主記憶部に読み出されて実行されることで、制御部１０を評価部１００として機能させ、ハードウェア資源を用いて、心筋細胞成熟度評価装置１を実現することが可能となる。心筋細胞成熟度評価プログラム１３０は、例えば、統計解析用のプログラムである「Ｒ」等で実行させるコードを用いて作成することが可能である。
【0031】
〔心臓細胞の純化方法、レポーター細胞、心筋細胞純化キット〕
本実施形態の心臓細胞の純化方法は、成熟心筋細胞マーカーを指標として、ＰＳＣ－ＣＭｓから、成熟心筋細胞を純化することを特徴とする。
本実施形態の心臓細胞の純化方法は、成熟心筋細胞マーカーを指標として、ＰＳＣ－ＣＭｓから、成熟心筋細胞を純化することを特徴とする。
【0032】
このうち、本実施形態に係る成熟心筋細胞マーカーは、心筋細胞の成熟に伴い発現が増加するＡｃａｄｖｌ、Ａｃｓｌ１、Ａｃｓｓ１、Ａｎｋｒｄ２３、Ａｑｐ１、Ａｔｐ１ａ２、Ｃａｓｑ２、Ｃｄ３６、Ｃｅｐ８５ｌ、Ｃｋｍｔ２、Ｃｌｕ、Ｃｍｙａ５、Ｃｏｑ１０ａ、Ｃｏｘ７ａ１、Ｃｏｘ８ｂ、Ｃｒｙａｂ、Ｄｃｎ、Ｅｃｈ１、Ｅｐｈｘ２、Ｆｎｄｃ５、Ｇｓｎ、Ｇｓｔｍ１、Ｈｆｅ２、Ｈｒｃ、Ｈｓｐｂ６、Ｈｓｐｂ８、Ｋｃｎｉｐ２、Ｋｌｆ９、Ｌｐｉ１、Ｌｒｒｃ２、Ｌｒｔｍ１、Ｍｂ、Ｍｇｐ、Ｍｙｏｍ２、Ｍｙｏｚ２、Ｍｙｚａｐ、Ｎｆｉｘ、Ｐｄｋ２、Ｐｅｒｍ１、Ｐｉｎｋ１、Ｐｔｇｄｓ、Ｒｇｓ５、Ｒｐｌ３ｌ、Ｓ１００ａ１、Ｓｇｃｇ、Ｓｌｃ２ａ４、Ｓｐａｒｃｌ１、Ｔｃａｐ、Ｔｍｅｍ１８２、Ｔｕｂａ４ａ、Ｔｘｌｎｂ、Ｘｉｒｐ２、及びＹｉｐｆ７からなる群の一種又は任意の組み合わせを含む。
このうち、Ｍｙｏｍ２は、成人の心筋で発現し、Ｍバンド構造を含むタンパク質の３次元配列を安定化するタンパクの遺伝子である。Ａｃｓｓ１は、ミトコンドリアａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｅｎｚｙｍｅの遺伝子である。Ａｔｐ１ａ２は、Ｐ－ｔｙｐｅ ｃａｔｉｏｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ＡＴＰａｓｅｓ、Ｎａ+／Ｋ+ －ＡＴＰａｓｅｓのサブファミリーの遺伝子である。Ｃｋｍｔ２は、Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｃｒｅａｔｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ （ＭｔＣＫ）の遺伝子である。Ｇｓｎは、ａｃｔｉｎ ｍｏｎｏｍｅｒｓとｆｉｌａｍｅｎｔｓを安定化させるタンパクの遺伝子である。Ｈｒｃは、Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ Ｒｉｃｈ Ｃａｌｃｉｕｍ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎである。Ｈｓｐｂ８は、Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆａｍｉｌｙ Ｂ （Ｓｍａｌｌ） Ｍｅｍｂｅｒ ８である。Ｔｃａｐは、Ｔｉｔｉｎ Ｃａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎである。Ｃｏｘ７ａ１は、Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ Ｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ７Ａ１である。Ｘｉｒｐ２は、Ｘｉｎ Ａｃｔｉｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｒｅｐｅａｔ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ２である。Ｃｄ３６は、Ｃｌａｓｓ Ｂスカベンジャー受容体に属する膜糖タンパクである。
このうち、Ｍｙｏｍ２は、成人の心筋で発現し、Ｍバンド構造を含むタンパク質の３次元配列を安定化するタンパクの遺伝子である。Ａｃｓｓ１は、ミトコンドリアａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｅｎｚｙｍｅの遺伝子である。Ａｔｐ１ａ２は、Ｐ－ｔｙｐｅ ｃａｔｉｏｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ＡＴＰａｓｅｓ、Ｎａ+／Ｋ+ －ＡＴＰａｓｅｓのサブファミリーの遺伝子である。Ｃｋｍｔ２は、Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｃｒｅａｔｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ （ＭｔＣＫ）の遺伝子である。Ｇｓｎは、ａｃｔｉｎ ｍｏｎｏｍｅｒｓとｆｉｌａｍｅｎｔｓを安定化させるタンパクの遺伝子である。Ｈｒｃは、Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ Ｒｉｃｈ Ｃａｌｃｉｕｍ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎである。Ｈｓｐｂ８は、Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆａｍｉｌｙ Ｂ （Ｓｍａｌｌ） Ｍｅｍｂｅｒ ８である。Ｔｃａｐは、Ｔｉｔｉｎ Ｃａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎである。Ｃｏｘ７ａ１は、Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ Ｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ７Ａ１である。Ｘｉｒｐ２は、Ｘｉｎ Ａｃｔｉｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｒｅｐｅａｔ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ２である。Ｃｄ３６は、Ｃｌａｓｓ Ｂスカベンジャー受容体に属する膜糖タンパクである。
【0033】
具体的には、本実施形態に係る心臓細胞の純化方法では、上述の成熟心筋細胞マーカーの遺伝子座にレポーター遺伝子をノックインした多能性幹細胞を作成し、これをレポーター細胞として用いることが可能である。すなわち、レポーター遺伝子をノックインした多能性幹細胞としてレポーター細胞を用意することが可能である。この上で、このレポーター細胞を分化誘導してＰＳＣ－ＣＭｓを作成し、レポーター遺伝子が活性化（発現）したものを指標としてフローサイトメトリーで選択して取得することで、成熟心筋細胞を純化することが可能である。本実施形態では、例えば、赤色蛍光タンパク質（Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ、以下「ＲＦＰ」という。）やＧＦＰ緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ、以下「ＧＦＰ」という。）等の蛍光タンパク質の遺伝子を上述の遺伝子座にノックインし、これをレポーター細胞として作成可能である。また、Ｃｄ３６については、表面抗原に対応する、蛍光色素結合した抗体を指標とすることも可能である。この表面抗原は、Ｃｄ３６の転写産物の細胞膜外の部分である。この上で、フローサイトメトリーを用いた蛍光活性化セルソーティング（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ、以下、「ＦＡＣＳ」という。）により、蛍光を発する成熟した心筋細胞を取得し、純化することが可能である。
なお、蛍光タンパク以外にも、薬剤耐性遺伝子を導入することで、成熟することで薬剤耐性を獲得した心筋細胞を純化することも可能である。すなわち、広義の「レポーター」細胞として用いることが可能である。
なお、蛍光タンパク以外にも、薬剤耐性遺伝子を導入することで、成熟することで薬剤耐性を獲得した心筋細胞を純化することも可能である。すなわち、広義の「レポーター」細胞として用いることが可能である。
【0034】
このように、本実施形態に係るレポーター細胞は、上述の成熟心筋細胞マーカーの遺伝子座にレポーター遺伝子をノックインした多能性幹細胞として提供可能である。以下の実施例２、３では、Ｍｙｏｍ２に、レポーター遺伝子としてＲＦＰ遺伝子をノックインしたレポーター細胞を作成する例を示している。さらに、本発明者らは、既にＣｋｍｔ２、Ｈｓｐｂ８、Ｔｃａｐについてもレポーター細胞を作成し、予備的な実験で同様な結果を得られている。
さらに、本実施形態に係るレポーター細胞は、例えば、マウスＥＳ細胞を用いる場合、キメラマウスを作成することが可能であってもよい。これにより、レポーター細胞を、動物の心臓の発達段階に対する実験等に広く用いることが可能となる。具体的には、本実施形態のレポーター細胞は、心筋細胞の成熟をより進めるための、細胞外マトリックス（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ、以下、「ＥＣＭ」という。）、ホルモン等の心筋細胞の成熟に関連する外部刺激のスクリーニング、成熟の最適化等に関するツールとして使用可能である。より具体的には、本実施形態のレポーター細胞は心臓病のモデリングや、後述する本実施形態の創薬支援方法において、治療薬の候補（候補薬物）、心疾患を治療するための候補薬物等のスクリーニングに用いることが可能である。
さらに、本実施形態に係るレポーター細胞は、例えば、マウスＥＳ細胞を用いる場合、キメラマウスを作成することが可能であってもよい。これにより、レポーター細胞を、動物の心臓の発達段階に対する実験等に広く用いることが可能となる。具体的には、本実施形態のレポーター細胞は、心筋細胞の成熟をより進めるための、細胞外マトリックス（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ、以下、「ＥＣＭ」という。）、ホルモン等の心筋細胞の成熟に関連する外部刺激のスクリーニング、成熟の最適化等に関するツールとして使用可能である。より具体的には、本実施形態のレポーター細胞は心臓病のモデリングや、後述する本実施形態の創薬支援方法において、治療薬の候補（候補薬物）、心疾患を治療するための候補薬物等のスクリーニングに用いることが可能である。
【0035】
ここで、本実施形態に係る心臓細胞の純化方法は、レポーター細胞を下記で説明する心筋細胞の成熟方法により成熟させたＰＳＣ－ＣＭｓについても純化可能である。または、Ｃｄ３６については、レポーター遺伝子をノックインしていないＰＳＣ－ＣＭｓについても、純化することが可能である。
さらに、本実施形態の心臓細胞の純化方法は、心筋細胞の成熟度評価方法により成熟度を評価した心筋細胞を純化することも可能である。これは、例えば、生体組織やＰＳＣ－ＣＭｓのコロニーの一部等を取得して、成熟度を評価し、残りの心筋細胞を純化するような構成で対応可能である。
さらに、本実施形態の心臓細胞の純化方法は、心筋細胞の成熟度評価方法により成熟度を評価した心筋細胞を純化することも可能である。これは、例えば、生体組織やＰＳＣ－ＣＭｓのコロニーの一部等を取得して、成熟度を評価し、残りの心筋細胞を純化するような構成で対応可能である。
【0036】
本実施形態に係る心筋細胞純化キットは、本実施形態の心臓細胞の純化方法に必要な各種試薬を含むことを特徴とする。これらの試薬には、例えば、培養用の培地、ＦＡＣＳ用の試薬、抗体、容器等を含む。加えて、上述のレポーター細胞自体も本実施形態の心筋細胞純化キットに加えられていてもよい。この場合、レポーター細胞を保存したり維持したりするための特別の培地、分化誘導や成熟に必要な薬剤等も含んでいてもよい。
【0037】
〔心筋細胞の成熟方法、心筋細胞成熟キット、成熟心筋細胞〕
次に、本実施形態に係る心筋細胞の成熟方法について説明する。
本実施形態に係る心筋細胞の成熟方法は、ＰＳＣ－ＣＭｓに、特定の核内受容体アゴニスト、成熟促進化合物、及び、前記心筋細胞の成熟を促進する転写因子からなる群の一種又は任意の組み合わせ（以下、「心筋細胞成熟剤」という。）を加え、成熟させることを特徴とする。
次に、本実施形態に係る心筋細胞の成熟方法について説明する。
本実施形態に係る心筋細胞の成熟方法は、ＰＳＣ－ＣＭｓに、特定の核内受容体アゴニスト、成熟促進化合物、及び、前記心筋細胞の成熟を促進する転写因子からなる群の一種又は任意の組み合わせ（以下、「心筋細胞成熟剤」という。）を加え、成熟させることを特徴とする。
【0038】
この本実施形態に係る心筋細胞の成熟方法におけるＰＳＣ－ＣＭｓは、上述のレポーター細胞を含む、多能性幹細胞を分化誘導した任意の心筋細胞を用いることが可能である。つまり、本実施形態のレポーター細胞及びレポーター細胞以外のＰＳＣ－ＣＭｓを用いることも可能である。さらに、多能性幹細胞の分化誘導を行う際に、心筋細胞成熟剤を同時に用いることも可能である。または、心筋細胞成熟剤を多能性幹細胞の分化誘導のために用いてもよい。
【0039】
本実施形態に係る心筋細胞成熟剤のうち、特定の核内受容体アゴニストは、ホルモン、ＲＸＲ（Ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）アゴニスト、ＰＰＡＲ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）アゴニスト、及びＲＯＲ（Ｒｅｔｉｏｉｄ ｒｅｌａｔｅｄ Ｏｒｐｈａｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）アゴニストからなる群の一種又は任意の組み合わせを用いることが可能である。
このうち、ホルモンとしては、甲状腺ホルモンであるトリヨードサイロニン（Ｔｒｉｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ、Ｔ３）とサイロキシン（Ｔｈｙｒｏｘｉｎ、Ｔ４）、エストロゲンであるＥｓｔｒａｄｉｏｌ（Ｅ２）、アンドロゲンであるＴｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ、ステロイドホルモンであるＨｙｄｒｏｘｙｃｏｒｔｉｓｏｎｅやその誘導体ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ等を用いることが可能である。ＲＸＲアゴニストとしては、例えば、ＳＲ１１２３７等を用いることが可能である。ＰＰＡＲアゴニストとしては、例えば、ＧＷ７６４７、ＧＷ０７４２、ＧＷ１９２９、ＷＹ１４６４３等を用いることが可能である。ＲＯＲアゴニストとしては、例えば、ＳＲ１０７８、ＳＲ１００１等を用いることが可能である。
このうち、ホルモンとしては、甲状腺ホルモンであるトリヨードサイロニン（Ｔｒｉｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ、Ｔ３）とサイロキシン（Ｔｈｙｒｏｘｉｎ、Ｔ４）、エストロゲンであるＥｓｔｒａｄｉｏｌ（Ｅ２）、アンドロゲンであるＴｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ、ステロイドホルモンであるＨｙｄｒｏｘｙｃｏｒｔｉｓｏｎｅやその誘導体ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ等を用いることが可能である。ＲＸＲアゴニストとしては、例えば、ＳＲ１１２３７等を用いることが可能である。ＰＰＡＲアゴニストとしては、例えば、ＧＷ７６４７、ＧＷ０７４２、ＧＷ１９２９、ＷＹ１４６４３等を用いることが可能である。ＲＯＲアゴニストとしては、例えば、ＳＲ１０７８、ＳＲ１００１等を用いることが可能である。
【0040】
本実施形態に係る心筋細胞成熟剤のうち、成熟促進化合物は、ＨＩＦ１ａ阻害剤であり、例えば、Ｃｈｅｔｏｍｉｎ（ＣＴＭ）を用いることが可能である。
【0041】
本実施形態に係る心筋細胞成熟剤のうち、転写因子は、Ａｈｒ、Ａｔｆ６、Ｃｅｂｐａ、Ｃｅｂｐｂ、Ｃｒｅｂｂｐ、Ｃｒｅｂｌ２、Ｃｔｃｆ、Ｅ２Ｆ６、Ｅｓｒｒａ、Ｅｓｒｒｇ、Ｆｏｘｃ２、Ｆｏｘｏ３、Ｇａｔａ３、Ｇｍｎｎ、Ｋｌｆ１５、Ｈｎｆ４ａ、Ｉｒｆ３、Ｉｒｆ４、Ｍｔａ１、Ｍｔｅｒｆ２、Ｎａｃｃ２、Ｎｆｅ２ｌ１、Ｎｏｓｔｒｉｎ、Ｎｒ１ｉ３、Ｎｒ３ｃ１、Ｎｒ４ａ３、Ｎｕｐｒ１、Ｐｐａｒｇｃ１ａ、Ｐｐａｒｇｃ１ｂ、Ｒｂｃｋ１、Ｒｂｌ１、Ｒｎｆ１４１、Ｒｏｒａ、Ｓｍｒｃｂ１、Ｚｂｔｂ２０、及びＺｂｔｂ７ａのからなる群の一種又は任意の組み合わせを用いることが可能である。
これらの転写因子は、例えば、適当な核内移行するウイルスベクター、各種プラスミド、ＰＮＡ等を用いて加えることが可能である。このウイルスベクターは、例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス等の当業者に一般的なウイルスを用いて構成されてもよい。
これらの転写因子は、例えば、適当な核内移行するウイルスベクター、各種プラスミド、ＰＮＡ等を用いて加えることが可能である。このウイルスベクターは、例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス等の当業者に一般的なウイルスを用いて構成されてもよい。
【0042】
本実施形態に係る心筋細胞成熟剤において、特定の核内受容体アゴニスト、成熟促進化合物のうち、２剤の組み合わせとしては、Ｔ３とＧＷ０７４２の組み合わせ、又はＴ３とＳＲ１１２３７の組み合わせが好適である。また、３剤の組み合わせとしては、Ｔ３又はＳＲ１１２３７と、ＧＷ０７４２、Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ（Ｅ２）、ＷＹ１４６４３、及びＧＷ１９２９のいずれか、又は、ＨＩＦ１ａ阻害剤であるＣＴＭを組み合わせることが可能である。
【0043】
さらに、これらの核内受容体アゴニスト、成熟促進化合物、及び、前記心筋細胞の成熟を促進する転写因子は、適切なＤＤＳ（Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ）、エレクトロポーション、その他の当業者に用いられる手法で細胞内、核内に導入することが可能である。
【0044】
本実施形態に係る心筋細胞成熟キットは、本実施形態の心臓細胞の成熟方法に必要な各種試薬を含むことを特徴とする。これらの試薬には、例えば、心筋細胞成熟剤、培地、ＦＡＣＳ用の試薬、抗体、容器等を含む。心筋細胞成熟剤は、例えば、各種ホルモンやアゴニスト、転写因子を含むベクター等として提供されてもよい。加えて、上述のレポーター細胞自体、特別の培地や薬剤についても、本実施形態の心筋細胞成熟キットに加えられていてもよい。さらに、本実施形態の心筋細胞成熟キットは、本実施形態の心筋細胞純化キットと合わせて、心筋細胞成熟純化キットとして提供されてもよい。
【0045】
本実施形態に係る心筋細胞の成熟方法にて成熟させたＰＳＣ－ＣＭｓ（成熟心筋細胞）は、集合し線維状のサルコメア構造を形成することが可能である。本実施形態の成熟方法にて成熟させたＰＳＣ－ＣＭｓが培養された細胞塊中にサルコメア構造が認められる場合、心筋細胞が機能性の心筋を構成していると判定することが可能である。または、本実施形態の成熟方法にて成熟させたＰＳＣ－ＣＭｓの細胞塊の一部を取得し、本実施形態の成熟度評価方法にて成熟度スコアを評価することも可能である。
【0046】
ここで、本実施形態に係る心筋細胞の成熟方法にて成熟させた成熟心筋細胞は、生体内に存在する成人の心筋細胞と機能的及び形態的に近似した心筋細胞となる。すなわち、本実施形態の成熟心筋細胞は、細胞内カルシウムのトランジェント現象及びサルコメア短縮が観察され、ミトコンドリア活性が高くなる。さらに、イオンチャネル機能が発達し、例えば、静止膜電位、ピーク電圧、振幅等も、より生体内の成人の心筋細胞に類似した細胞となる。さらに、本実施形態の心筋細胞の成熟度評価方法で評価した場合、マウスの成体の心筋細胞の成熟度スコアはＰ２８で７０～８０、Ｐ５６で８０～９０になるのに対し、本実施形態のマウスの成熟心筋細胞は、実施例３の図２０Ｂに示すように、成熟度スコアが６０以上、７０程度と高スコアになる。さらに、本実施形態のレポーター細胞由来の成熟心筋細胞を、本実施形態の成熟心筋細胞の純化方法により純化させることにより、更に成熟度スコアが高い成熟心筋細胞を得ることも可能である。このため、従来の分化誘導方法において分化誘導した心筋細胞と、製造物として区別することが可能である。
【0047】
本実施形態に係る心筋細胞の成熟方法にて成熟させた成熟心筋細胞、及びこれを本実施形態の成熟心筋細胞の純化方法により純化させた成熟心筋細胞は、下記で説明するように、本実施形態の創薬支援方法や治療方法に用いることが可能である。このため、本実施形態の心筋細胞の成熟方法及び本実施形態の成熟心筋細胞の純化方法は、成熟心筋細胞の製造方法ともなる。
なお、生物基礎医学分野において、特定の時点において、数万の遺伝子の発現と、生体細胞内において実際に進行している物質的、化学的変化、動作の関係とを完全に知ることは不可能である。よって、本実施形態のように遺伝子の発現レベル（トランスクリプトーム）を用いた成熟度スコア以上に、定量的に心筋細胞の成熟度を測定することは、当業者にとって非常に難しいため、本実施形態の成熟心筋細胞をその構造又は特性により直接特定することは困難であるという特段の事情が存在する。
なお、生物基礎医学分野において、特定の時点において、数万の遺伝子の発現と、生体細胞内において実際に進行している物質的、化学的変化、動作の関係とを完全に知ることは不可能である。よって、本実施形態のように遺伝子の発現レベル（トランスクリプトーム）を用いた成熟度スコア以上に、定量的に心筋細胞の成熟度を測定することは、当業者にとって非常に難しいため、本実施形態の成熟心筋細胞をその構造又は特性により直接特定することは困難であるという特段の事情が存在する。
【0048】
〔創薬支援方法〕
本実施形態の創薬支援方法は、上述の心筋細胞の成熟方法により成熟させたＰＳＣ－ＣＭｓ（成熟心筋細胞）、及び／又は上述の成熟心筋細胞の純化方法により純化されたレポーター細胞のＰＳＣ－ＣＭｓ（成熟心筋細胞）を培養し、培養された成熟心筋細胞に対して、創薬のための毒性及び／又は疾患に関する薬物を投与し、成熟心筋細胞の状態を評価することを特徴とする。
本実施形態の創薬支援方法は、上述の心筋細胞の成熟方法により成熟させたＰＳＣ－ＣＭｓ（成熟心筋細胞）、及び／又は上述の成熟心筋細胞の純化方法により純化されたレポーター細胞のＰＳＣ－ＣＭｓ（成熟心筋細胞）を培養し、培養された成熟心筋細胞に対して、創薬のための毒性及び／又は疾患に関する薬物を投与し、成熟心筋細胞の状態を評価することを特徴とする。
【0049】
本実施形態の創薬のための毒性及び／又は疾患に関する薬物としては、心毒性を調べる必要のある薬剤スクリーニングの候補薬物、心疾患を治療するための候補薬物等を用いることが可能である。本実施形態の候補薬物は、例えば、低分子化合物、ペプチド、タンパク質、細胞の抽出物や上清や発酵産物、その他の合成化合物や天然化合物等が挙げられる。これらの候補薬物は、純度や精製度等が任意であってもよい。また、本実施形態の薬剤スクリーニングが対象とする疾患は、心疾患以外の任意の疾患を含む。
【0050】
本実施形態の心毒性としては、患者に重篤な不整脈を引き起こす疾患である、薬物誘発性（後天性）ＱＴ延長症候群を、下記で説明する生理学的特性の解析により評価してもよい。薬物誘発性ＱＴ延長症候群は、薬物の投与後に心電図上のＱＴ間隔の延長が起こり、ＴｄＰ（Ｔｏｒｓａｄｅｓ ｄｅ ｐｏｉｎｔｅｓ、トルサード・ド・ポアンツ、非持続性多形性心室頻拍）から、しばしば心室細動が起こり、失神や突然死をきたす、重篤な疾患である。
【0051】
本実施形態の成熟心筋細胞の状態の評価としては、生理学的特性の解析、毒性マーカー遺伝子の発現解析等を行うことで評価が可能である。このうち、生理学的特性の解析は、例えば、得られたＰＳＣ－ＣＭｓを１個の細胞又は細胞塊として、電気生理学的特性をパッチクランプ試験等でフィールドポテンシャル（細胞外活動電位）を測定して解析することが可能である。この細胞外活動電位は、多数の電極を有するディッシュ上に、サンプルを載せて測定することが可能である。細胞外活動電位の測定により、ＱＴインターバル、拍動（ＢＰＭ）解析、Ｎａピーク解析等を行うことが可能である。ＱＴインターバルは、心室筋の収縮から拡張期に入るまでの時間であり、Ｎａチャネルによる脱分極からＫチャネルによる再分極が起こり、静止膜電位となるまでの時間をいう。このＱＴインターバルが長くなるＱＴ延長が認められる場合、Ｋチャンネルの阻害による薬物誘導性の不整脈の原因となり得るので、スクリーニングにて不適なものとして候補薬物から除くような評価をすることが可能である。
【0052】
この他にも、各種、毒性マーカー遺伝子の発現解析を行うことで、心毒性の評価が可能である。さらに、臨床試験のプロトコルに合わせたり、当業者に任意の方法を用いたりして、スクリーニングを行うことが可能である。
これらの解析において、候補薬物を投与した成熟心筋細胞において、正常な機能が維持された場合に、当該候補薬物が心毒性の少ないものと推定可能である。
これらの解析において、候補薬物を投与した成熟心筋細胞において、正常な機能が維持された場合に、当該候補薬物が心毒性の少ないものと推定可能である。
【0053】
〔心疾患の治療方法〕
本実施形態に係る心疾患の治療方法は、多能性幹細胞由来の未成熟の心筋細胞に、上述の心筋細胞成熟剤を加え、成熟させた成熟心筋細胞を移植することを特徴とする。
本実施形態に係る心疾患の治療方法は、多能性幹細胞由来の未成熟の心筋細胞に、上述の心筋細胞成熟剤を加え、成熟させた成熟心筋細胞を移植することを特徴とする。
【0054】
具体的には、本実施形態の治療方法においては、心臓の再生医療として、ヒトを含む動物の心臓疾患（心臓病、心疾患）を治療するために、本実施形態の成熟心筋細胞を用いることが可能である。たとえば、本実施形態の成熟心筋細胞は、当該患者から取得して作成又は生成された多能性幹細胞、又は、ＨＬＡ等の型が近い多能性幹細胞のライブラリーから取得され、分化誘導され、その後、心筋細胞成熟剤を加えて特定期間培養されて成熟させる。そして、成熟させた成熟心筋細胞は、分離された細胞又は細胞塊の状態で心疾患等の患者の疾病の心臓に注入、心筋シートや心筋組織や心臓臓器（以下、「心筋シート等」という。）を形成しての移植等の治療に用いることができる。この心筋シート等は、当業者に用いられる培養器材を用いて単層又は多層のシートを作成し、心疾患患者の心臓に移植してもよい。さらに、本実施形態の成熟心筋細胞を、サルコメア構造をもつ心臓の筋繊維や組織の状態にして、心疾患患者の心臓に移植してもよい。さらに、適切な担体を用いて培養したり、３Ｄプリンター等を用いて積層したりして、より組織化された培養物を心疾患患者の心臓に移植することも可能である。この心疾患としては、心筋梗塞、虚血性心疾患、心筋炎、その他の心不全等が挙げられる。
なお、本実施形態の成熟心筋細胞は、再生医療以外の治療用途、例えば、バイオリアクター、人工臓器の製造、クローン個体の作成等、各種用途に使用可能である。
また、本発明を日本で実施する場合、培養物の提供より後の治療は医師により行われるため、本発明の治療方法の「動物」は、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）を含まないものとする。一方、それ以外の国においては、「動物」「治療法」の定義は、限定されない。
なお、本実施形態の成熟心筋細胞は、再生医療以外の治療用途、例えば、バイオリアクター、人工臓器の製造、クローン個体の作成等、各種用途に使用可能である。
また、本発明を日本で実施する場合、培養物の提供より後の治療は医師により行われるため、本発明の治療方法の「動物」は、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）を含まないものとする。一方、それ以外の国においては、「動物」「治療法」の定義は、限定されない。
【0055】
本発明の実施の形態に係る成熟心筋細胞を上述の治療に用いる際に、投与（導入）間隔及び投与量は、疾患の状況、さらに対象の状態等の種々の条件に応じて適宜選択及び変更することが可能である。
本発明の実施の形態に係る成熟心筋細胞の１回の投与量及び投与回数は、投与の目的により、更に、患者の年齢及び体重、症状及び疾患の重篤度等の種々の条件に応じて適宜選択及び変更することが可能である。
投与回数及び期間は、１回のみでもよいし、１日１回～数回、数週間程度投与し、疾患の状態をモニターし、その状態により再度又は繰り返し投与を行ってもよい。
本発明の実施の形態に係る成熟心筋細胞の１回の投与量及び投与回数は、投与の目的により、更に、患者の年齢及び体重、症状及び疾患の重篤度等の種々の条件に応じて適宜選択及び変更することが可能である。
投与回数及び期間は、１回のみでもよいし、１日１回～数回、数週間程度投与し、疾患の状態をモニターし、その状態により再度又は繰り返し投与を行ってもよい。
【0056】
加えて、本発明の成熟心筋細胞は、他の組成物や薬剤等と併用することも可能である。また、他の組成物と同時に本発明の組成物を投与してもよく、また間隔を空けて投与してもよいが、その投与順序は特に問わない。
また、本発明の実施の形態において、疾患が改善または軽減される期間は特に限定されないが、一時的な改善または軽減であってもよいし、一定期間の改善または軽減であってもよい。
また、本発明の実施の形態において、疾患が改善または軽減される期間は特に限定されないが、一時的な改善または軽減であってもよいし、一定期間の改善または軽減であってもよい。
【0057】
さらに、本実施形態に係る心筋細胞成熟剤を、そのまま心筋細胞成熟用医薬として用いることも可能である。この医薬としては、例えば、未成熟の心筋細胞が存在することが原因となっている疾病、心筋シート等を移植された際の最終的な成熟等に用いることが可能である。
【0058】
また、本発明の実施の形態に係る心筋細胞成熟用医薬は、任意の製剤上許容しうる担体を含んでいてもよい。この担体は、例えば、リポソーム担体、コロイド金粒子、ポリペプチド、リポ多糖類、多糖類、脂質膜等であってもよい。これらの中で、機能活性調整剤の発現調整効果を向上させる担体を用いることが好適である。
【0059】
さらに、製薬上許容される担体としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウム等を含んでいてもよい。さらに、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ－５０等と共に投与することが可能である。また、適切な賦形剤等を更に含んでもよい。
【0060】
また、本実施形態の心筋細胞成熟用医薬は、製剤上許容しうる担体を調製するために、適切な薬学的に許容可能なキャリアを含んでいてもよい。このキャリアは、シリコーン、コラーゲン、ゼラチン等の生体親和性材料を含んでもよい。また、キャリアは、乳濁液として提供されてもよい。さらには、例えば、希釈剤、香料、防腐剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、乳化剤、可塑剤等の製剤用添加物のいずれか又は任意の組み合わせを含有させてもよい。
【0061】
本実施形態に係る心筋細胞成熟用の投与経路は、特に限定されず、非経口的又は経口的に投与を行うことが可能である。非経口投与としては、例えば、静脈内、動脈内、皮下、真皮内、筋肉内、腹腔内の投与、又は、腎臓等への直接投与が可能である。
本発明の実施の形態に係る心筋細胞成熟用医薬は、非経口的又は経口的の投与に適した投与形態において、当該分野で周知の製剤上許容しうる担体を用いて処方され得る。
本発明の実施の形態に係る心筋細胞成熟用医薬は、非経口的又は経口的の投与に適した投与形態において、当該分野で周知の製剤上許容しうる担体を用いて処方され得る。
【0062】
以上のように構成することで、以下のような効果を得ることができる。
従来、患者から得られた初代培養の心筋細胞は、ディッシュで維持することが困難であった。このため、多能性幹細胞に成長因子又は小分子を順次添加することにより、心臓分化誘導させるプロトコルが開発された。これにより生成された多能性幹細胞由来の心筋細胞（ＰＳＣ－ＣＭｓ）は、疾患モデリング及び薬物スクリーニングのために用いられることが期待されている。しかしながら、これらのＰＳＣ－ＣＭｓは、その構造と機能に関して、胎児又は新生児の心筋細胞に近い未成熟の状態であり、典型的なｉｎ ｖｉｖｏの出生後の成熟した心筋細胞とは異なることが知られていた。そのため、特に成人以降に発症する心筋症等の心疾患の病態の再現や解析、薬剤の毒性評価を行う用途では不十分であった。この制限により、特にｉｎ ｖｉｔｒｏモデル及び創薬のための医療目的でのＰＳＣ－ＣＭｓの有用性が毀損されていた。したがって、ＰＳＣ－ＣＭｓを、成体の細胞に近いレベルまで成熟させるための方法が求められていた。
従来、患者から得られた初代培養の心筋細胞は、ディッシュで維持することが困難であった。このため、多能性幹細胞に成長因子又は小分子を順次添加することにより、心臓分化誘導させるプロトコルが開発された。これにより生成された多能性幹細胞由来の心筋細胞（ＰＳＣ－ＣＭｓ）は、疾患モデリング及び薬物スクリーニングのために用いられることが期待されている。しかしながら、これらのＰＳＣ－ＣＭｓは、その構造と機能に関して、胎児又は新生児の心筋細胞に近い未成熟の状態であり、典型的なｉｎ ｖｉｖｏの出生後の成熟した心筋細胞とは異なることが知られていた。そのため、特に成人以降に発症する心筋症等の心疾患の病態の再現や解析、薬剤の毒性評価を行う用途では不十分であった。この制限により、特にｉｎ ｖｉｔｒｏモデル及び創薬のための医療目的でのＰＳＣ－ＣＭｓの有用性が毀損されていた。したがって、ＰＳＣ－ＣＭｓを、成体の細胞に近いレベルまで成熟させるための方法が求められていた。
【0063】
これに対して、本実施形態に係る心筋細胞の成熟方法でＰＳＣ－ＣＭｓを成熟させることで、従来の手法で得られるよりも明らかに成熟した成熟心筋細胞が得られた。たとえば、本実施形態の心筋細胞の成熟度評価方法で成熟度を評価したところ、成体の心筋から取得した心臓細胞の成熟度スコア８０以上に対し、本実施形態の心筋細胞の成熟方法で得られたマウスの成熟心筋細胞は、成熟度スコアで６０以上７０程度と、成体の細胞に近い程度の好スコアの成熟度を示すことが可能である。本発明者らの予備実験では、ヒトにおいても、同様の成熟度を得ることができている。
この本実施形態の成熟心筋細胞を疾患のモデルとなるｉＰＳ細胞等に応用することで、これまで病態が再現できなかったものであっても、再現できるようになる可能性がある。具体的には、心筋梗塞等、虚血性心疾患を原因とする特発性心疾患等についても候補薬物を選択可能になる。また、ＱＴ延長について、子供では症状がないものの大人では症状が出るといった状態に対応して、候補薬物をふるい分けることが可能となる。このため、心筋症治療に向けた再生医療への応用に資することができる。
この本実施形態の成熟心筋細胞を疾患のモデルとなるｉＰＳ細胞等に応用することで、これまで病態が再現できなかったものであっても、再現できるようになる可能性がある。具体的には、心筋梗塞等、虚血性心疾患を原因とする特発性心疾患等についても候補薬物を選択可能になる。また、ＱＴ延長について、子供では症状がないものの大人では症状が出るといった状態に対応して、候補薬物をふるい分けることが可能となる。このため、心筋症治療に向けた再生医療への応用に資することができる。
【0064】
さらに、従来、これまでの心筋細胞の成熟度評価のために用いられる手法は、活動電位パターンの変化や目視での細胞形態の観察等、定性的であり、どの程度の成熟が得られているのか不明であった。加えて、従来のＤＮＡマイクロアレイを用いた場合、例えば、ＮＣＢＩ ＧＥＯ（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ）に登録されているマウス心臓に関するマイクロアレイでは、最も成熟に重要な生後の情報が少ない。また、直接、発現量を比較することができないため、ヒトに応用が困難であった。さらに、マイクロアレイは、高コストであった。
これに対して、本実施形態に係る心筋細胞の成熟度評価方法では、発達段階にあるマウス心臓のトランスクリプトームデータ１１０を参照とすることで、ヒトの心筋細胞であっても、定量的にその成熟度を評価することが可能となる。すなわち、マウス心臓を参照（リファレンス）とし、ＲＮＡ－ｓｅｑを行って情報量を増加させることで、ヒトに応用可能となった。これにより、マウス及びヒトの心筋細胞の成熟度を定量的に評価することができる。その結果、これまででは検出することができないような成熟の差を明らかにすることが可能となった。加えて、３’－ｍＲＮＡのみを扱うようなＲＮＡ－ｓｅｑを用いることで、マイクロアレイより低コストで、精密なデータセットを取得することが可能になる。
これに対して、本実施形態に係る心筋細胞の成熟度評価方法では、発達段階にあるマウス心臓のトランスクリプトームデータ１１０を参照とすることで、ヒトの心筋細胞であっても、定量的にその成熟度を評価することが可能となる。すなわち、マウス心臓を参照（リファレンス）とし、ＲＮＡ－ｓｅｑを行って情報量を増加させることで、ヒトに応用可能となった。これにより、マウス及びヒトの心筋細胞の成熟度を定量的に評価することができる。その結果、これまででは検出することができないような成熟の差を明らかにすることが可能となった。加えて、３’－ｍＲＮＡのみを扱うようなＲＮＡ－ｓｅｑを用いることで、マイクロアレイより低コストで、精密なデータセットを取得することが可能になる。
【0065】
また、従来、ＰＳＣ－ＣＭｓにおいて、成熟した心筋細胞と未成熟な心筋細胞が混在している培養物から、成熟した心筋細胞のみを純化する方法はなかった。
これに対して、本実施形態では、成熟に伴い発現が増加する成熟心筋細胞マーカーの遺伝子座に、レポーター遺伝子として蛍光タンパク質の遺伝子をノックインした多能性幹細胞であるレポーター細胞を樹立した。この成熟心筋細胞（群）から、レポーター細胞におけるレポーター、又は、Ｃｄ３６の表面抗原を指標として、ＦＡＣＳ等で分離することにより、高純度な成熟心筋細胞を得ることができる。すなわち、成熟心筋細胞を純化することが可能となる。
蛍光タンパク質を利用したレポーターは、分化及び生物学的プロセスを研究するための発達及び幹細胞生物学でしばしば使用される。したがって、本実施形態の蛍光レポーター細胞は、心筋細胞成熟をｉｎ ｖｉｔｒｏで研究するための効果的なツールとして役立つ。さらに、本実施形態のレポーター細胞から作成した成熟心筋細胞は、病態モデルの作成が可能となり、心筋症の治療に向けた再生医療への応用に近づく可能性がある。たとえば、大人になって発症する心筋症の治療法開発に役立つ可能性がある。
これに対して、本実施形態では、成熟に伴い発現が増加する成熟心筋細胞マーカーの遺伝子座に、レポーター遺伝子として蛍光タンパク質の遺伝子をノックインした多能性幹細胞であるレポーター細胞を樹立した。この成熟心筋細胞（群）から、レポーター細胞におけるレポーター、又は、Ｃｄ３６の表面抗原を指標として、ＦＡＣＳ等で分離することにより、高純度な成熟心筋細胞を得ることができる。すなわち、成熟心筋細胞を純化することが可能となる。
蛍光タンパク質を利用したレポーターは、分化及び生物学的プロセスを研究するための発達及び幹細胞生物学でしばしば使用される。したがって、本実施形態の蛍光レポーター細胞は、心筋細胞成熟をｉｎ ｖｉｔｒｏで研究するための効果的なツールとして役立つ。さらに、本実施形態のレポーター細胞から作成した成熟心筋細胞は、病態モデルの作成が可能となり、心筋症の治療に向けた再生医療への応用に近づく可能性がある。たとえば、大人になって発症する心筋症の治療法開発に役立つ可能性がある。
【0066】
より具体的には、本実施形態においては、実施例に示すように、Ｍｙｏｍ２遺伝子座にＲＦＰをノックインした多能性幹細胞株を樹立し、より成熟が進んだ心筋細胞が純化可能となった。Ｍｙｏｍ２はニワトリ、マウス、ヒトの間で、強く保存されていることが知られている。このため、心筋細胞の成熟のレポーター細胞として、病態解析等に、より適切に使用可能となる。
【0067】
なお、本発明者らは、Ｍｙｏｍ２以外にも、Ｃｋｍｔ２、Ｈｓｐｂ８、Ｔｃａｐについてノックイン細胞を作成済みであり、予備実験にて同様の結果を示した。これらでは、キメラマウスの作成も可能であり、胎仔～成熟したマウスの心臓を取得して、成熟した細胞を取得することが可能である。また、それ以外の成熟心筋細胞マーカーの遺伝子についても、各遺伝子座にノックインを行うと同様の結果を示すものと考えられる。
【0068】
また、上述の実施形態においては、心筋細胞の成熟度評価方法、装置、及びプログラムとして、発達段階の各ステージにおけるトランスクリプトームのデータを主成分分析し、その第一主成分（係数）を参照として用いる例について記載した。しかしながら、他の統計手法、人工知能手法等についても、心筋細胞の成熟度評価方法に用いることが可能である。たとえば、発達段階の各ステージにおけるトランスクリプトームのデータを、ディープラーニング等の人工ニューラルネット、ベイジアンネットワーク、ＨＭＭ等に導入して学習させて成熟度のモデルを作成し、これに結果データを入力して、成熟度スコアを求めるように構成することも可能である。これにより、より実際の心筋細胞の発達段階に則した成熟度スコアを算出できる可能性が高まる。
【0069】
また、上述の実施形態においては、セルソーティングにＦＡＣＳを用いる例について記載したものの、ＦＡＣＳ以外のセルソーティングも使用可能である。
【0070】
また、後述の実施例４で示すように、本実施形態の成熟心筋細胞は、マウスでもヒトでも、ミトコンドリアがサルコメア内にパックされたような形態まで成熟させることができる。このような成熟度の高い細胞は、従来には存在せず、上述の各種用途において、いわゆる技術的ブレークスルーとして、成熟心筋細胞の実用性を高めることが期待できる。さらに、本実施形態のホルモン、アゴニスト処理を利用して、更なる添加物を加えたり、培養法を改良することで、より成熟した心筋細胞を得る技術を当業者によりが開発することが期待でき得る。
【0071】
以下で、本発明の実施の形態に係る多能性幹細胞から分化した心筋細胞の成熟方法、心筋細胞の成熟度評価方法、成熟心筋細胞の純化方法について、具体的な実験を基にして、実施例としてさらに具体的に説明する。しかしながら、この実施例は一例にすぎず、これに限定されるものではない。
【実施例1】
【0072】
まず、実施例１として、心筋細胞の成熟度評価方法についての実験を行った。以下、その材料と方法、結果について説明する。
【0073】
〔材料と方法〕
（マウスＥＳ細胞の培養と分化誘導、成熟処理）
Ｎｃｘプロモーター下にＰｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子を発現するトランスジェニックマウスＥＳ細胞（ｓｙＮＰ４）を、ＬＩＦ、ＣＨＩＲ０００２１、ＰＤ０３２５９０１、及び血清存在下で未分化維持培養を行い、週３回継代を行った。
分化誘導は、血清の代わりにＢ２７サプリメント（Ｖｉｔａｍｉｎ Ａ不含），Ｎ２サプリメント存在下で浮遊培養にて胚様体を形成させた。分化２日目からはＡｃｔｉｖｉｎ Ａ，ＢＭＰ４，ＶＥＧＦを加え、分化を継続した。分化４日目に胚様体をＴｒｙｐｌｅにより単離し、高密度平面培養（２５０ｋ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2程度）をｂＦＧＦ，ＦＧＦ１０，ＶＥＧＦ存在下で行った。分化７日目頃より拍動する心筋細胞が観察される。Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを加えることにより、心筋細胞へと分化しなかった細胞を死滅させ、純度の高い心筋細胞を得た。また、この手法は以下で記載するノックイン細胞でも同様であった。
分化１０日目にはＴｒｙｐｌｅを用いて細胞を単離し、５０ｋ／ｃｍ2で播種し直した。播種する際には培養プレートを０．１％ゼラチンでコートしたものを用い、上記分化培地に１０％の血清を加えた（分化１１日目まで）。ウイルス感染は分化１１日目～１２日目にかけて行った。分化１２日目～１４日目はＰｕｒｏｍｙｃｉｎによる心筋細胞の純化を継続した。アゴニスト等を加えるアゴニスト処理については、分化１１日目～１４日目までＰｕｒｏｍｙｃｉｎ処理を行った後、分化１４日目から最大４週間アゴニスト等を添加する処理を行った。
（マウスＥＳ細胞の培養と分化誘導、成熟処理）
Ｎｃｘプロモーター下にＰｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子を発現するトランスジェニックマウスＥＳ細胞（ｓｙＮＰ４）を、ＬＩＦ、ＣＨＩＲ０００２１、ＰＤ０３２５９０１、及び血清存在下で未分化維持培養を行い、週３回継代を行った。
分化誘導は、血清の代わりにＢ２７サプリメント（Ｖｉｔａｍｉｎ Ａ不含），Ｎ２サプリメント存在下で浮遊培養にて胚様体を形成させた。分化２日目からはＡｃｔｉｖｉｎ Ａ，ＢＭＰ４，ＶＥＧＦを加え、分化を継続した。分化４日目に胚様体をＴｒｙｐｌｅにより単離し、高密度平面培養（２５０ｋ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2程度）をｂＦＧＦ，ＦＧＦ１０，ＶＥＧＦ存在下で行った。分化７日目頃より拍動する心筋細胞が観察される。Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを加えることにより、心筋細胞へと分化しなかった細胞を死滅させ、純度の高い心筋細胞を得た。また、この手法は以下で記載するノックイン細胞でも同様であった。
分化１０日目にはＴｒｙｐｌｅを用いて細胞を単離し、５０ｋ／ｃｍ2で播種し直した。播種する際には培養プレートを０．１％ゼラチンでコートしたものを用い、上記分化培地に１０％の血清を加えた（分化１１日目まで）。ウイルス感染は分化１１日目～１２日目にかけて行った。分化１２日目～１４日目はＰｕｒｏｍｙｃｉｎによる心筋細胞の純化を継続した。アゴニスト等を加えるアゴニスト処理については、分化１１日目～１４日目までＰｕｒｏｍｙｃｉｎ処理を行った後、分化１４日目から最大４週間アゴニスト等を添加する処理を行った。
【0074】
（ＲＮＡサンプルの調製とＲＮＡ－ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＲＮＡ－ｓｅｑ））
マウスの心臓を胎生１１日～生後１０ヶ月から摘出し、心房及び心室に分離、ＴＲＩｚｏｌを用いて溶解した。また、ＰＳＣ－ＣＭｓは、分化１０日目のものを０．１％ Ｇｅｌａｔｉｎ上に播種し、分化１４日目からアゴニスト処理を行い、２週後にＴＲＩｚｏｌにて溶解した。ＲＮＡの抽出は、マウス心臓についてはフェノールクロロホルム抽出、又はＤｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡ ｋｉｔ（ザイモリサーチ社製）、ＰＳＣ－ＣＭｓについてはＤｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡ ｋｉｔにより抽出した。ＲＮＡは、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）又はＱｕｂｉｔ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて定量した。また、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて、ＲＮＡが分解されていないことを確認した。それぞれ５００ｎｇのＲＮＡを１００ｎｇ／ｕＬに調製し、ＱＵＡＮＴ－ｓｅｑ ３’ ｍＲＮＡ－Ｓｅｑ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｌｅｘｏｇｅｎ社製）を用いて、ＲＮＡ－ｓｅｑ用のライブラリーを作成した。得られたライブラリーサイズはＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（アジレント・テクノロジー株式会社製）を用いて確認し、その濃度はＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒの結果ないしＱｕｂｉｔ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒを用いて定量した。それぞれのサンプルについて同量ずつになるよう混合し、Ｎｅｘｔ－ｓｅｑ ｈｉｇｈ ｏｕｔｐｕｔ ７５ＳＥ（イルミナ株式会社製）を用いて、超並列シーケンスを行った。なお、心臓サンプルは４８サンプルずつ、ＰＳＣ－ＣＭｓは９６サンプルずつ混合した。追加で行った心臓サンプル生後１０日目、３０週、１０ヶ月のものは９６サンプルずつシーケンスを行った。
マウスの心臓を胎生１１日～生後１０ヶ月から摘出し、心房及び心室に分離、ＴＲＩｚｏｌを用いて溶解した。また、ＰＳＣ－ＣＭｓは、分化１０日目のものを０．１％ Ｇｅｌａｔｉｎ上に播種し、分化１４日目からアゴニスト処理を行い、２週後にＴＲＩｚｏｌにて溶解した。ＲＮＡの抽出は、マウス心臓についてはフェノールクロロホルム抽出、又はＤｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡ ｋｉｔ（ザイモリサーチ社製）、ＰＳＣ－ＣＭｓについてはＤｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡ ｋｉｔにより抽出した。ＲＮＡは、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）又はＱｕｂｉｔ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて定量した。また、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて、ＲＮＡが分解されていないことを確認した。それぞれ５００ｎｇのＲＮＡを１００ｎｇ／ｕＬに調製し、ＱＵＡＮＴ－ｓｅｑ ３’ ｍＲＮＡ－Ｓｅｑ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｌｅｘｏｇｅｎ社製）を用いて、ＲＮＡ－ｓｅｑ用のライブラリーを作成した。得られたライブラリーサイズはＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（アジレント・テクノロジー株式会社製）を用いて確認し、その濃度はＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒの結果ないしＱｕｂｉｔ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒを用いて定量した。それぞれのサンプルについて同量ずつになるよう混合し、Ｎｅｘｔ－ｓｅｑ ｈｉｇｈ ｏｕｔｐｕｔ ７５ＳＥ（イルミナ株式会社製）を用いて、超並列シーケンスを行った。なお、心臓サンプルは４８サンプルずつ、ＰＳＣ－ＣＭｓは９６サンプルずつ混合した。追加で行った心臓サンプル生後１０日目、３０週、１０ヶ月のものは９６サンプルずつシーケンスを行った。
【0075】
ＲＮＡ－ｓｅｑで得られたサンプルごとのＦａｓｔｑファイルは、ＢＢｔｏｏｌｓのＢＢＤｕｋを用いてｐｏｌｙ Ａ配列及びシーケンス末端の配列、アダプター配列、シーケンスクオリティの低い配列などをトリミングした。続いて、ＳＴＡＲ ＲＮＡ－ｓｅｑ ａｌｉｇｎｅｒを用いて、マウスゲノム（ＧＲＣ ｍｍ１０）へとマッピングを行った。最後にＳｕｂｒｅａｄ ｐａｃｋａｇｅに含まれるｆｅａｔｕｒｅ Ｃｏｕｎｔｓを用いてそれぞれの遺伝子ごとのカウントデータを得た。カウントデータは更に、心筋細胞成熟度評価プログラム１３０と、統計解析用のプログラム「Ｒ」とを用いて解析を行った。まず、１００万カウント以下のサンプルを除外し、遺伝子ごとのカウントを総カウント数で除した、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ（ＴＰＭ）を各サンプル、各遺伝子ごとに算出した。２０１９年８月末時点で実験済みの全ての実験データ（マウス）を用いて、平均して、１ＴＰＭ以上ある遺伝子を発現遺伝子と定義し、以下の解析では発現遺伝子のみを用いて解析を行った。
【0076】
（定量的成熟度評価法（マウス））
マウスの胎仔（Ｅ）１１～生後（Ｐ）５６まで、さらに１０ヶ月までの各段階（Ｓｔａｇｅｓ）の心臓サンプルについてＲＮＡ－ｓｅｑを行った結果のデータについて、主成分分析を行い、成熟度スコア（Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ Ｓｃｏｒｅ）を算出する基準（以下、「参照」という。）となる各遺伝子の固有ベクトル（係数）を算出した。この際、ＴＰＭに１を加えた数字に、１０を底とする対数に変換した上で、主成分分析を行った。成熟度スコアは、各遺伝子発現に第一主成分に対応する係数を掛けたものの総和を用い、一定のオフセット値（３２）を加え、係数（１．５）を掛けることで得た。この計算により、成熟度スコアは、概ね０～１００の幅となった。
マウスの胎仔（Ｅ）１１～生後（Ｐ）５６まで、さらに１０ヶ月までの各段階（Ｓｔａｇｅｓ）の心臓サンプルについてＲＮＡ－ｓｅｑを行った結果のデータについて、主成分分析を行い、成熟度スコア（Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ Ｓｃｏｒｅ）を算出する基準（以下、「参照」という。）となる各遺伝子の固有ベクトル（係数）を算出した。この際、ＴＰＭに１を加えた数字に、１０を底とする対数に変換した上で、主成分分析を行った。成熟度スコアは、各遺伝子発現に第一主成分に対応する係数を掛けたものの総和を用い、一定のオフセット値（３２）を加え、係数（１．５）を掛けることで得た。この計算により、成熟度スコアは、概ね０～１００の幅となった。
【0077】
（定量的成熟度評価法（ヒト））
ｂｉｏｍａＲｔ（ＲからＢｉｏＭａｒｔを利用するパッケージ）を用いて、ヒトとマウスで対応する遺伝子リストを得た。この際、ｈｓａｐｉｅｎｓ＿ｇｅｎｅ＿ｅｎｓｅｍｂｌと、ｍｍｕｓｃｕｌｕｓ＿ｇｅｎｅ＿ｅｎｓｅｍｂｌの２つのデータセットを用いた。同一遺伝子名を持つものに加えて、ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅとして単一の遺伝子が登録されている遺伝子を、対応リストとして設定した。
ヒト心筋細胞の定量的成熟度評価は、これらの遺伝子のＲＮＡ－ｓｅｑのデータをマウスのデータへと投写することで行った。ヒト胎児心臓ＲＮＡサンプル、ヒト成人心臓ＲＮＡサンプル、及び、ｉｎ ｈｏｕｓｅで分化誘導を行ったヒトＰＳＣ－ＣＭｓを用いて分化誘導後１８日目、３２日目、４６日目のサンプルについてＲＮＡ－ｓｅｑを行い、マウスのデータへ投写した。また、ヒトＰＳＣ－ＣＭｓについては、成熟を促進するホルモン処理として、Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ（ＨＣ）と甲状腺ホルモンＴ３の処理を行ったものも作成した。
具体的には、対応リストに含まれる遺伝子のみを用いて、上述の各サンプルについてのＲＮＡ－ｓｅｑのデータの主成分分析を行い、成熟度スコアを算出する基準となる各遺伝子ごとの固有ベクトル（係数）を算出した。同様に、概ね０～１００の幅となるように、第一主成分得点に対し、オフセット値（３０）、係数（１．５）を算出した。
ｂｉｏｍａＲｔ（ＲからＢｉｏＭａｒｔを利用するパッケージ）を用いて、ヒトとマウスで対応する遺伝子リストを得た。この際、ｈｓａｐｉｅｎｓ＿ｇｅｎｅ＿ｅｎｓｅｍｂｌと、ｍｍｕｓｃｕｌｕｓ＿ｇｅｎｅ＿ｅｎｓｅｍｂｌの２つのデータセットを用いた。同一遺伝子名を持つものに加えて、ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅとして単一の遺伝子が登録されている遺伝子を、対応リストとして設定した。
ヒト心筋細胞の定量的成熟度評価は、これらの遺伝子のＲＮＡ－ｓｅｑのデータをマウスのデータへと投写することで行った。ヒト胎児心臓ＲＮＡサンプル、ヒト成人心臓ＲＮＡサンプル、及び、ｉｎ ｈｏｕｓｅで分化誘導を行ったヒトＰＳＣ－ＣＭｓを用いて分化誘導後１８日目、３２日目、４６日目のサンプルについてＲＮＡ－ｓｅｑを行い、マウスのデータへ投写した。また、ヒトＰＳＣ－ＣＭｓについては、成熟を促進するホルモン処理として、Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ（ＨＣ）と甲状腺ホルモンＴ３の処理を行ったものも作成した。
具体的には、対応リストに含まれる遺伝子のみを用いて、上述の各サンプルについてのＲＮＡ－ｓｅｑのデータの主成分分析を行い、成熟度スコアを算出する基準となる各遺伝子ごとの固有ベクトル（係数）を算出した。同様に、概ね０～１００の幅となるように、第一主成分得点に対し、オフセット値（３０）、係数（１．５）を算出した。
【0078】
〔結果〕
（マウスの定量的成熟度評価法）
本実施例の心筋細胞の成熟度評価方法について説明する。本実施例においては、次世代型トランスクリプトームとして、ＲＮＡ－ｓｅｑを用いた定量的成熟度評価法を検証した。具体的には、胎仔の１１日目（Ｅ１１）から出生後１０ヶ月までの各発達段階（ステージ）においてＲＮＡ－ｓｅｑを行い、これにより得られた結果データ１２０を主成分分析した。
（マウスの定量的成熟度評価法）
本実施例の心筋細胞の成熟度評価方法について説明する。本実施例においては、次世代型トランスクリプトームとして、ＲＮＡ－ｓｅｑを用いた定量的成熟度評価法を検証した。具体的には、胎仔の１１日目（Ｅ１１）から出生後１０ヶ月までの各発達段階（ステージ）においてＲＮＡ－ｓｅｑを行い、これにより得られた結果データ１２０を主成分分析した。
【0079】
図３は、発達段階にあるマウスの発達段階のトランスクリプトームのデータから主成分分析にて心筋細胞の成熟度評価を行った例を示す。具体的には、各点の三角（Ｖ）は心室（Ｖｅｎｔｒｉｃｕｌｅ）、丸（Ａ）は心房（Ａｔｒｉｕｍ）について、各ステージの結果を主成分分析したものをプロットした。横軸はＰＣ１軸（寄与率４２％）、縦軸はＰＣ２軸（寄与率１６％）を示す。また、各点の大きさはそのステージに対応する。このように、ＰＣ１軸に沿って成熟が進むことが明らかとなった。
【0080】
図４Ａは、結果データ１２０のうち、マウスの心室の心臓サンプルでのデータについて、成熟度スコアを算出した例を示す。図４Ａの横軸は各ステージを示し、縦軸は、成熟度スコア（０～１００）を示す。上述したように、本実施形態の成熟度スコアは、ＰＣ１軸の点数に対して、補正（オフセット、係数）を掛けることで、概ね０～１００となるように調整したものである。各バーは、それぞれのステージにおける成熟度の平均、各サンプルの値（点）、及びエラーバーを示す。すなわち、例えば、この発達段階にあるマウスのトランスクリプトームのデータが、参照用のトランスクリプトームデータ１１０として、記憶部１１に格納される。
成熟度スコアは、胎仔の１１日目（Ｅ１１）から出生後３０日目（Ｐ３０）まで単調増加した。その間生後１日から７日まで増加が鈍化し、３０週と１０ヶ月では、ほぼ同等の成熟度スコアとなった。
成熟度スコアは、胎仔の１１日目（Ｅ１１）から出生後３０日目（Ｐ３０）まで単調増加した。その間生後１日から７日まで増加が鈍化し、３０週と１０ヶ月では、ほぼ同等の成熟度スコアとなった。
【0081】
図４Ｂは、図４Ａのトランスクリプトームデータ１１０を参照として投写し、マウス多能性幹細胞から成熟させたＰＳＣ－ＣＭｓの成熟度スコアを得た例を示す。すなわち、新たに得た結果データ１２０について、上述のマウス心室での心臓サンプルと同様の計算方法を適応して、成熟度を評価することが可能となる。図４の横軸は培養日時（ｄ）、縦軸は成熟度スコアを示す。各バーは、それぞれのステージにおける成熟度の平均、各サンプルの値（点）、及びエラーバーを示す。
結果として、ＰＳＣ－ＣＭｓの成熟はｄ１０からｄ１７までは進み、それ以降も進むものの、非常に鈍化し、成熟度スコア４０～５０程度に留まっていた。これは、上述の図１で示したような目視やカルシウムトランジェントの測定結果等と一致していた。
結果として、ＰＳＣ－ＣＭｓの成熟はｄ１０からｄ１７までは進み、それ以降も進むものの、非常に鈍化し、成熟度スコア４０～５０程度に留まっていた。これは、上述の図１で示したような目視やカルシウムトランジェントの測定結果等と一致していた。
【0082】
（定量的成熟度評価法（ヒト））
図５は、ヒト心筋細胞のＲＮＡ－ｓｅｑの結果データ１２０から定量的な成熟度の評価をした例を示す。すなわち、マウスのトランスクリプトームデータ１１０を参照として、ヒトのトランスクリプトームのデータを投写することで、成熟度スコアを得ることができる。
図５は、ヒト心筋細胞のＲＮＡ－ｓｅｑの結果データ１２０から定量的な成熟度の評価をした例を示す。すなわち、マウスのトランスクリプトームデータ１１０を参照として、ヒトのトランスクリプトームのデータを投写することで、成熟度スコアを得ることができる。
【0083】
図５Ａは、ヒトの成熟度スコアの算出用に、参照用のトランスクリプトームデータ１１０を作成した例を示す。これは、ヒトの成熟度スコアの指標となるものである。具体的には、図５Ａは、マウスとヒトにて同一遺伝子名で単一オーソログである共通の遺伝子を用い、マウスの心臓について主成分分析を行い、概ね０～１００になるようにオフセット、係数を補正した参照用のトランスクトリームデータを示すグラフである。ほぼ、図４Ａと同様の値となる。
【0084】
図５Ｂは、図５Ａの参照を用いて、ヒトのデータについて同様に計算を行い、ヒトの成熟度スコアを算出した例を示す。各バーは、ヒトの胎児心臓ＲＮＡサンプル（ｆｅｔａｌ）、ヒト成人心臓ＲＮＡサンプル（ａｄｕｌｔ）、ヒトＰＳＣ－ＣＭｓの１８日目（ｄ１８）をベースラインとし、そこから更に２週間目（２ｗ）、４週間目（４ｗ）の成熟度スコアを示す。
結果として、ヒト胎児心臓ＲＮＡサンプル、ヒト成人心臓ＲＮＡサンプルでは、ヒト胎児はマウスの胎仔相当、ヒト成人はマウスの成体相当の成熟度スコアが得られた。
また、分化誘導後１８日目から、更に２週間（２ｗ）、４週間（４ｗ）培養することで、培養期間に伴い、ヒトＰＳＣ－ＣＭｓのサンプルは、徐々に成熟度スコアが増加した。また、成熟を促進するホルモン処理として、Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ（ＨＣ）と甲状腺ホルモンＴ３（Ｔ３）の処理を行うと、２ｗの時点で、大幅に成熟度が増加した。なお、このホルモンの組み合わせは、マウスの実験でも同様の効果が得られている。
このように、マウス心臓をリファレンスとし、ＲＮＡ－ｓｅｑを行うことで、マウス及びヒトＰＳＣ－ＣＭｓの成熟度を定量的に評価することが可能となった
結果として、ヒト胎児心臓ＲＮＡサンプル、ヒト成人心臓ＲＮＡサンプルでは、ヒト胎児はマウスの胎仔相当、ヒト成人はマウスの成体相当の成熟度スコアが得られた。
また、分化誘導後１８日目から、更に２週間（２ｗ）、４週間（４ｗ）培養することで、培養期間に伴い、ヒトＰＳＣ－ＣＭｓのサンプルは、徐々に成熟度スコアが増加した。また、成熟を促進するホルモン処理として、Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ（ＨＣ）と甲状腺ホルモンＴ３（Ｔ３）の処理を行うと、２ｗの時点で、大幅に成熟度が増加した。なお、このホルモンの組み合わせは、マウスの実験でも同様の効果が得られている。
このように、マウス心臓をリファレンスとし、ＲＮＡ－ｓｅｑを行うことで、マウス及びヒトＰＳＣ－ＣＭｓの成熟度を定量的に評価することが可能となった
【実施例2】
【0085】
次に、実施例２として、成熟心筋細胞マーカーの探索、成熟心筋細胞の純化方法、及びレポーター細胞についての実験を行った。以下、その材料と方法、結果について説明する。なお、以下、実施例１と同様の用語、材料、実験方法等については記載を省略する。
【0086】
〔材料と方法〕
（ノックインＥＳ細胞株（レポーター細胞）の樹立）
心筋細胞の成熟度レポーター細胞は、マウスＥＳ細胞であるｓｙＮＰ４細胞に対し、ゲノム編集を行うことで樹立した。Ｍｙｏｍ２は骨格筋細胞でも発現しているため、ｓｏｄｉｕｍ－ｃａｌｃｉｕｍ ｅｘｃｈａｎｇｅｒ １ ｐｒｏｍｏｔｅｒによって駆動されるピューロマイシン耐性カセットを含んでいるｓｙＮＰ４株の細胞を用いることで、ｉｎ ｖｉｔｒｏで心筋細胞を、確実に純化することが可能となる。また、ゲノム編集はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によりゲノムを切断し、ノックインベクターを目的部位に挿入することで行った。Ｃａｓ９タンパク及びｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡを一つのベクターから発現するｐｘ３３０のｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ位置に、Ｍｙｏｍ２のストップコドン直上となるｇｕｉｄｅ ＲＮＡを設計し、挿入したｐｘ３３０－Ｍｙｏｍ２を作成した。ノックインベクターはｇＲＮＡ標的部位より約１０００ｂｐのホモロジーアームを持ち、Ｍｙｏｍ２遺伝子と同一フレームでＴａｇＲＦＰが挿入されている。また、ＴａｇＲＦＰより下流にＦＲＴ－Ｂｌａｓｔｃｉｄｉｎ耐性遺伝子－ＦＲＴというカセットを持つ（Ｍｙｏｍ２－ＴａｇＲＦＰ－Ｂｌａｓｔ）。Ｐｘ３３０－Ｍｙｏｍ２、及びＭｙｏｍ２－ＴａｇＲＦＰ－ＢｌａｓｔをＳｙｎｐ４にリポフェクションで導入し、ｂｌａｓｔｃｉｔｉｄｉｎ処置を行うことで、ノックイン細胞を得た。ノックイン細胞はクロナール密度から培養することで、単一細胞由来のコロニーを得た。それぞれのコロニーについて、ノックインが正しく行われていることをＰＣＲ及びシーケンスで確認し、心筋細胞分化能が維持されていることを合わせて確認した。このようにして得られたＭｙｏｍ２－ＲＦＰノックインマウスＥＳ細胞を、ＳＭＭ１８と名付けた。さらに、ｐＣＡＧ－Ｆｌｐｅ－ＩＲＥＳ－ｐｕｒｏプラスミドをリポフェクションにより導入し、短期間のｐｕｒｏｍｙｃｙｎセレクションを行うことで、ＦＲＴ－Ｂｌａｓｔ－ＦＲＴカセットを喪失した、別のＭｙｏｍ２－ＲＦＰ株を樹立し、ＳＭＭ－Ｂ２と名付けた。カセットの喪失は薬剤の感受性試験及びＰＣＲにより確認した。本研究では、ＳＭＭ１８又はＳＭＭ－Ｂ２（以下、これらを単に「Ｍｙｏｍ２－ＲＦＰ株」という。）を用いて実験を行った。
（ノックインＥＳ細胞株（レポーター細胞）の樹立）
心筋細胞の成熟度レポーター細胞は、マウスＥＳ細胞であるｓｙＮＰ４細胞に対し、ゲノム編集を行うことで樹立した。Ｍｙｏｍ２は骨格筋細胞でも発現しているため、ｓｏｄｉｕｍ－ｃａｌｃｉｕｍ ｅｘｃｈａｎｇｅｒ １ ｐｒｏｍｏｔｅｒによって駆動されるピューロマイシン耐性カセットを含んでいるｓｙＮＰ４株の細胞を用いることで、ｉｎ ｖｉｔｒｏで心筋細胞を、確実に純化することが可能となる。また、ゲノム編集はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によりゲノムを切断し、ノックインベクターを目的部位に挿入することで行った。Ｃａｓ９タンパク及びｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡを一つのベクターから発現するｐｘ３３０のｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ位置に、Ｍｙｏｍ２のストップコドン直上となるｇｕｉｄｅ ＲＮＡを設計し、挿入したｐｘ３３０－Ｍｙｏｍ２を作成した。ノックインベクターはｇＲＮＡ標的部位より約１０００ｂｐのホモロジーアームを持ち、Ｍｙｏｍ２遺伝子と同一フレームでＴａｇＲＦＰが挿入されている。また、ＴａｇＲＦＰより下流にＦＲＴ－Ｂｌａｓｔｃｉｄｉｎ耐性遺伝子－ＦＲＴというカセットを持つ（Ｍｙｏｍ２－ＴａｇＲＦＰ－Ｂｌａｓｔ）。Ｐｘ３３０－Ｍｙｏｍ２、及びＭｙｏｍ２－ＴａｇＲＦＰ－ＢｌａｓｔをＳｙｎｐ４にリポフェクションで導入し、ｂｌａｓｔｃｉｔｉｄｉｎ処置を行うことで、ノックイン細胞を得た。ノックイン細胞はクロナール密度から培養することで、単一細胞由来のコロニーを得た。それぞれのコロニーについて、ノックインが正しく行われていることをＰＣＲ及びシーケンスで確認し、心筋細胞分化能が維持されていることを合わせて確認した。このようにして得られたＭｙｏｍ２－ＲＦＰノックインマウスＥＳ細胞を、ＳＭＭ１８と名付けた。さらに、ｐＣＡＧ－Ｆｌｐｅ－ＩＲＥＳ－ｐｕｒｏプラスミドをリポフェクションにより導入し、短期間のｐｕｒｏｍｙｃｙｎセレクションを行うことで、ＦＲＴ－Ｂｌａｓｔ－ＦＲＴカセットを喪失した、別のＭｙｏｍ２－ＲＦＰ株を樹立し、ＳＭＭ－Ｂ２と名付けた。カセットの喪失は薬剤の感受性試験及びＰＣＲにより確認した。本研究では、ＳＭＭ１８又はＳＭＭ－Ｂ２（以下、これらを単に「Ｍｙｏｍ２－ＲＦＰ株」という。）を用いて実験を行った。
【0087】
（免疫染色）
ＣｅｌｌＣａｒｒｉｅｒ ９６ウェルブラックポリスチレンマイクロプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で培養したＰＳＣ－ＣＭを４％パラホルムアルデヒドで一晩固定した。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１０を含むＰＢＳ中を使用して、室温で１５分間透過処理した。透過処理後、細胞をＰＢＳ中の２％ＦＢＳでブロックした後、抗α－アクチニン抗体（１：５００、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）又は抗カーディアックトロポニンＴ抗体（１：５００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、及び抗ｔＲＦＰ抗体（１：５００、エブロゲン）で一晩処理した。細胞を洗浄し、二次抗体、抗マウスＩｇＧ（１：５００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）及び抗ウサギＩｇＧ（１：５００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で染色し、それぞれＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８及び５５５と重合させた。核は、ＤＡＰＩ溶液で染色された。共焦点レーザー走査顕微鏡（オリンパス社製、ＦｌｕｏＶｉｅｗ ＦＶ１２００）又は倒立蛍光顕微鏡（オリンパス社製、ＩＸ８３）により免疫蛍光画像を収集した。サルコメアの長さ、細胞の大きさ、真円度、周囲、及び細胞の形状は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアによって分析された。
ＣｅｌｌＣａｒｒｉｅｒ ９６ウェルブラックポリスチレンマイクロプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で培養したＰＳＣ－ＣＭを４％パラホルムアルデヒドで一晩固定した。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１０を含むＰＢＳ中を使用して、室温で１５分間透過処理した。透過処理後、細胞をＰＢＳ中の２％ＦＢＳでブロックした後、抗α－アクチニン抗体（１：５００、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）又は抗カーディアックトロポニンＴ抗体（１：５００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、及び抗ｔＲＦＰ抗体（１：５００、エブロゲン）で一晩処理した。細胞を洗浄し、二次抗体、抗マウスＩｇＧ（１：５００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）及び抗ウサギＩｇＧ（１：５００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で染色し、それぞれＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８及び５５５と重合させた。核は、ＤＡＰＩ溶液で染色された。共焦点レーザー走査顕微鏡（オリンパス社製、ＦｌｕｏＶｉｅｗ ＦＶ１２００）又は倒立蛍光顕微鏡（オリンパス社製、ＩＸ８３）により免疫蛍光画像を収集した。サルコメアの長さ、細胞の大きさ、真円度、周囲、及び細胞の形状は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアによって分析された。
【0088】
（カルシウムトランジェントとサルコメア短縮）
細胞内カルシウムトランジェントを測定するために、ＰＳＣ－ＣＭｓを、ガラス底の２４ウェルプレート（ＭａｔＴｅｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）で２８日間培養した。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、カルシウム指示薬Ｃａｌｂｒｙｔｅ ５２０－ＡＭ（ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ社製）を含むタイロード液（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５．４ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．３３ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、２ ｍＭＣａＣｌ2、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、及び１１ｍＭ Ｄ－グルコース、ＮａＯＨでｐＨを７．４に調整）で３０分間、処理された。細胞は、１Ｈｚの電界刺激された（Ｃ－Ｐａｃｅ、ＩｏｎＯｐｔｉｃｓ社製）。倒立蛍光顕微鏡（オリンパス社製ＩＸ８３、ＯＲＣＡ－Ｆｌａｓｈ ４．０ Ｖ３搭載）により、４０倍の対物レンズ、露出１０ミリ秒、２０ミリ秒の間隔で細胞内カルシウムのトランジェント現象を記録した。ＩｍａｇｅＪを使用して、細胞内カルシウムトランジェントを定量化した。サルコメア短縮については、生細胞イメージング用のタイムラプス記録で細胞収縮を継続的に記録した。タイムラプス記録は、ＩｍａｇｅＪに対してＳａｒｃＯｐｔｉＭによって分析された。
細胞内カルシウムトランジェントを測定するために、ＰＳＣ－ＣＭｓを、ガラス底の２４ウェルプレート（ＭａｔＴｅｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）で２８日間培養した。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、カルシウム指示薬Ｃａｌｂｒｙｔｅ ５２０－ＡＭ（ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ社製）を含むタイロード液（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５．４ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．３３ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、２ ｍＭＣａＣｌ2、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、及び１１ｍＭ Ｄ－グルコース、ＮａＯＨでｐＨを７．４に調整）で３０分間、処理された。細胞は、１Ｈｚの電界刺激された（Ｃ－Ｐａｃｅ、ＩｏｎＯｐｔｉｃｓ社製）。倒立蛍光顕微鏡（オリンパス社製ＩＸ８３、ＯＲＣＡ－Ｆｌａｓｈ ４．０ Ｖ３搭載）により、４０倍の対物レンズ、露出１０ミリ秒、２０ミリ秒の間隔で細胞内カルシウムのトランジェント現象を記録した。ＩｍａｇｅＪを使用して、細胞内カルシウムトランジェントを定量化した。サルコメア短縮については、生細胞イメージング用のタイムラプス記録で細胞収縮を継続的に記録した。タイムラプス記録は、ＩｍａｇｅＪに対してＳａｒｃＯｐｔｉＭによって分析された。
【0089】
（フローサイトメトリー）
Ｍｙｏｍ２－ＲＦＰ株から生成されたＰＳＣ－ＣＭｓを、ＴｒｙｐＬＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）にて１０分、３７℃で処理して、単一細胞に解離した。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を、ＤＡＰＩ（１：２０００）を含むＰＢＳ中の２％ＦＢＳで懸濁した。ＲＦＰ＋及びＲＦＰ強度の割合の測定と細胞選別は、ＳＨ８００（ＳＯＮＹ社製）を使用して実行された。
Ｍｙｏｍ２－ＲＦＰ株から生成されたＰＳＣ－ＣＭｓを、ＴｒｙｐＬＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）にて１０分、３７℃で処理して、単一細胞に解離した。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を、ＤＡＰＩ（１：２０００）を含むＰＢＳ中の２％ＦＢＳで懸濁した。ＲＦＰ＋及びＲＦＰ強度の割合の測定と細胞選別は、ＳＨ８００（ＳＯＮＹ社製）を使用して実行された。
【0090】
（統計分析）
データは、少なくとも３つの繰り返しサンプルの平均±標準偏差（ＳＤ）として表示された。トランスクリプトームデータ等、それ以下のサンプル数の実験については、すべてのデータ点を示した。スチューデントのｔ検定、デネットの検定、カイ２乗検定、又は一元配置分散分析は、適切な場所で使用された。統計分析はすべて、統計プログラム「Ｒ」を使用して行った。０．０５未満のｐ値（ｐ＜０．０５）は有意と見なされた。
データは、少なくとも３つの繰り返しサンプルの平均±標準偏差（ＳＤ）として表示された。トランスクリプトームデータ等、それ以下のサンプル数の実験については、すべてのデータ点を示した。スチューデントのｔ検定、デネットの検定、カイ２乗検定、又は一元配置分散分析は、適切な場所で使用された。統計分析はすべて、統計プログラム「Ｒ」を使用して行った。０．０５未満のｐ値（ｐ＜０．０５）は有意と見なされた。
【0091】
〔結果〕
（成熟心筋細胞マーカー）
成熟心筋細胞の精製方法とそれを応用したスクリーニング法の開発のため、上述のＲＮＡ－ｓｅｑの結果から、成熟に伴い発現が増加する遺伝子（成熟心筋細胞マーカー）の候補を選択した。
図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃは、Ｅ１１～Ｐ５６、３０週（３０ｗ）、１０ヶ月（１０Ｍ）までの範囲で一定以上の遺伝子発現に変化が見られた遺伝子群のＲＮＡ－ｓｅｑによる発現量を示す。これらのうち、Ａｃａｄｖｌ、Ａｃｓｌ１、Ａｃｓｓ１、Ａｎｋｒｄ２３、Ａｑｐ１、Ａｔｐ１ａ２、Ｃａｓｑ２、Ｃｄ３６（ＣＤ３６）、Ｃｅｐ８５ｌ、Ｃｋｍｔ２、Ｃｌｕ、Ｃｍｙａ５、Ｃｏｑ１０ａ、Ｃｏｘ７ａ１、Ｃｏｘ８ｂ、Ｃｒｙａｂ、Ｄｃｎ、Ｅｃｈ１、Ｅｐｈｘ２、Ｆｎｄｃ５、Ｇｓｔｍ１、Ｈｆｅ２、Ｈｓｐｂ６、Ｋｃｎｉｐ２、Ｋｌｆ９、Ｌｐｉ１、Ｌｒｒｃ２、Ｌｒｔｍ１、Ｍｂ、Ｍｇｐ、Ｍｙｏｍ２、Ｍｙｏｚ２、Ｍｙｚａｐ、Ｎｆｉｘ、Ｐｄｋ２、Ｐｅｒｍ１、Ｐｉｎｋ１、Ｐｔｇｄｓ、Ｒｇｓ５、Ｒｐｌ３ｌ、Ｓ１００ａ１、Ｓｇｃｇ、Ｓｌｃ２ａ４、Ｓｐａｒｃｌ１、Ｔｃａｐ、Ｔｍｅｍ１８２、Ｔｕｂａ４ａ、Ｔｘｌｎｂ、Ｘｉｒｐ２、及びＹｉｐｆ７と、図にないものの、Ｇｓｎ、Ｈｒｃ、及びＨｓｐｂ８とを含めたものを本実施例の成熟心筋細胞マーカーとして選択した。なお、Ｍｈｒｔ、Ｎｅａｔ１、ＲＰ～のものはノンコーディングＲＮＡと考えられるため、マーカー候補から除外した。
（成熟心筋細胞マーカー）
成熟心筋細胞の精製方法とそれを応用したスクリーニング法の開発のため、上述のＲＮＡ－ｓｅｑの結果から、成熟に伴い発現が増加する遺伝子（成熟心筋細胞マーカー）の候補を選択した。
図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃは、Ｅ１１～Ｐ５６、３０週（３０ｗ）、１０ヶ月（１０Ｍ）までの範囲で一定以上の遺伝子発現に変化が見られた遺伝子群のＲＮＡ－ｓｅｑによる発現量を示す。これらのうち、Ａｃａｄｖｌ、Ａｃｓｌ１、Ａｃｓｓ１、Ａｎｋｒｄ２３、Ａｑｐ１、Ａｔｐ１ａ２、Ｃａｓｑ２、Ｃｄ３６（ＣＤ３６）、Ｃｅｐ８５ｌ、Ｃｋｍｔ２、Ｃｌｕ、Ｃｍｙａ５、Ｃｏｑ１０ａ、Ｃｏｘ７ａ１、Ｃｏｘ８ｂ、Ｃｒｙａｂ、Ｄｃｎ、Ｅｃｈ１、Ｅｐｈｘ２、Ｆｎｄｃ５、Ｇｓｔｍ１、Ｈｆｅ２、Ｈｓｐｂ６、Ｋｃｎｉｐ２、Ｋｌｆ９、Ｌｐｉ１、Ｌｒｒｃ２、Ｌｒｔｍ１、Ｍｂ、Ｍｇｐ、Ｍｙｏｍ２、Ｍｙｏｚ２、Ｍｙｚａｐ、Ｎｆｉｘ、Ｐｄｋ２、Ｐｅｒｍ１、Ｐｉｎｋ１、Ｐｔｇｄｓ、Ｒｇｓ５、Ｒｐｌ３ｌ、Ｓ１００ａ１、Ｓｇｃｇ、Ｓｌｃ２ａ４、Ｓｐａｒｃｌ１、Ｔｃａｐ、Ｔｍｅｍ１８２、Ｔｕｂａ４ａ、Ｔｘｌｎｂ、Ｘｉｒｐ２、及びＹｉｐｆ７と、図にないものの、Ｇｓｎ、Ｈｒｃ、及びＨｓｐｂ８とを含めたものを本実施例の成熟心筋細胞マーカーとして選択した。なお、Ｍｈｒｔ、Ｎｅａｔ１、ＲＰ～のものはノンコーディングＲＮＡと考えられるため、マーカー候補から除外した。
【0092】
（レポーター細胞の作成）
これらの成熟心筋細胞マーカーの代表例としてＭｙｏｍ２を用いて、分化時に成熟度を測定（評価）可能なレポーター細胞を作成した。Ｍｙｏｍ２の発現は、新生児から成人の心臓に向かって連続的に増加するためである。具体的には、赤色蛍光タンパク（ＲＦＰ）のＭｙｏｍ２へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ノックインを行って、Ｍｙｏｍ２－ＲＦＰ株を作成した。
これらの成熟心筋細胞マーカーの代表例としてＭｙｏｍ２を用いて、分化時に成熟度を測定（評価）可能なレポーター細胞を作成した。Ｍｙｏｍ２の発現は、新生児から成人の心臓に向かって連続的に増加するためである。具体的には、赤色蛍光タンパク（ＲＦＰ）のＭｙｏｍ２へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ノックインを行って、Ｍｙｏｍ２－ＲＦＰ株を作成した。
【0093】
図７Ａは、マウスの心臓の発達段階、胎仔１１日目（Ｅ１１）～生後５６日目（Ｐ５６）の各ステージにおけるＭｙｏｍ２の発現を示すグラフである。３’ｍＲＮＡ－ｓｅｑの結果は、１００万リードあたりの転写産物の量として示されている。青い線は、局所的に推定された散布図平滑化（ＬＯＥＳＳ）を用いた局所回帰曲線を示す。胎仔（Ｅｍｂｒｙｏ）、新生時（Ｎｅｏｎａｔｅ）、成熟（Ａｄｕｌｔ）で発現が増加していることが分かる。
図７Ｂは、サルコメアの細いフィラメント（Ｔｈｉｎ Ｆｉｌａｍｅｎｔ）における、Ｍｙｏｍ２－ＲＦＰのＭ－ｂａｎｄ、α－アクチニンのＺ－ｌｉｎｅ、及び心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）の局在化の概念を示す。すなわち、Ｍｙｏｍ２遺伝子によってコードされるＭタンパク質は、サルコメアのＭラインにのみ局在している。
図７Ｂは、サルコメアの細いフィラメント（Ｔｈｉｎ Ｆｉｌａｍｅｎｔ）における、Ｍｙｏｍ２－ＲＦＰのＭ－ｂａｎｄ、α－アクチニンのＺ－ｌｉｎｅ、及び心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）の局在化の概念を示す。すなわち、Ｍｙｏｍ２遺伝子によってコードされるＭタンパク質は、サルコメアのＭラインにのみ局在している。
【0094】
ここで、Ｍｙｏｍ２－ＲＦＰ株を心筋細胞（ＰＳＣ－ＣＭｓ）へと分化誘導し、培養を行った。この心筋細胞成熟レポーター細胞の特性について説明する。
図８Ａは、分化誘導後２８日目（ｄ２８）の時点で免疫染色を行ったＲＦＰ陰性（以下、「ＲＦＰ－」と称する。）の代表的なＰＳＣ－ＣＭｓの蛍光を示す。スケールバーは２０μｍである。
図８Ｂは、同様に、ＲＦＰ陽性（以下「ＲＦＰ＋」と称する。）の代表的なＰＳＣ－ＣＭｓの蛍光を示す。Ｍ－ｂａｎｄに局在するＲＦＰとＺ－ｌｉｎｅに局在するα－アクチニンが交互に見られるので、Ｍｙｏｍ２－ＲＦＰが正しくノックインされ、且つ、融合タンパクとして発現していることが分かる。細胞の大きさやα－ａｃｔｉｎｉｎで染色されているサルコメアのパターンが異なっており、ＲＦＰ陽性の細胞の方が整列していることが分かる。
図８Ａは、分化誘導後２８日目（ｄ２８）の時点で免疫染色を行ったＲＦＰ陰性（以下、「ＲＦＰ－」と称する。）の代表的なＰＳＣ－ＣＭｓの蛍光を示す。スケールバーは２０μｍである。
図８Ｂは、同様に、ＲＦＰ陽性（以下「ＲＦＰ＋」と称する。）の代表的なＰＳＣ－ＣＭｓの蛍光を示す。Ｍ－ｂａｎｄに局在するＲＦＰとＺ－ｌｉｎｅに局在するα－アクチニンが交互に見られるので、Ｍｙｏｍ２－ＲＦＰが正しくノックインされ、且つ、融合タンパクとして発現していることが分かる。細胞の大きさやα－ａｃｔｉｎｉｎで染色されているサルコメアのパターンが異なっており、ＲＦＰ陽性の細胞の方が整列していることが分かる。
【0095】
図９Ａ、図９Ｂは、長期培養中のＭｙｏｍ２－ＲＦＰ株のＲＦＰの発現をＦＡＣＳでの定量した結果を示す。図９ＡはＲＦＰ陽性率（Ｍｙｏｍ２－ＲＦＰ＋ ｃｅｌｌ（％））、図９ＢはＲＦＰ陽性細胞中のＲＦＰ蛍光輝度（Ｍｅａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（ａ．ｕ．））を示す。各バーは、平均値±ＳＤ（ｎ＝４）を示す。「§」「†」は、Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡと事後テューキーＨＳＤ検定の結果を示し、「§」は、Ｐ＜０．０１、「†」はＰ＜０．０００１を示す。ＲＦＰ蛍光強度は、任意単位（ａ．ｕ．）として示される。このように、ＲＦＰ陽性率が培養期間に伴い増加する。また、ＲＦＰ陽性細胞中のＲＦＰ蛍光輝度も増加する。
図９Ｃは、サルコメア内のＭｙｏｍ２－ＲＦＰ及びα－アクチニンのラインスキャンの例を示す。Ｍｙｏｍ２－ＲＦＰ及びα－アクチニンが交互に出現するパターンを呈し、ＲＦＰがＭ－ｂａｎｄに局在していることを示している。
図９Ｃは、サルコメア内のＭｙｏｍ２－ＲＦＰ及びα－アクチニンのラインスキャンの例を示す。Ｍｙｏｍ２－ＲＦＰ及びα－アクチニンが交互に出現するパターンを呈し、ＲＦＰがＭ－ｂａｎｄに局在していることを示している。
【0096】
図１０Ａ～図１０Ｆは、Ｍｙｏｍ２－ＲＦＰ株を使用したＰＳＣ－ＣＭｓにおける構造と形態の比較を、分化誘導後２１日目（ｄ２１）及び２８日目（ｄ２８）に行った結果である（ｎ＞６５）。図１０Ａはサルコメア長（α－アクチニン間の長さ）、図１０Ｂは細胞面積、図１０Ｃは細胞周囲長（ｐｅｒｉｍｅｔｅｒ）、図１０Ｄは細胞長、図１０Ｅは細胞幅、図１０Ｆはアスペクト比をそれぞれ調べた。バイオリンプロットの場合、白いボックスの黒い線は中央値を示し、ボックスの制限は２５パーセンタイルと７５パーセンタイルを示し、ウィスカーは２５パーセンタイルと７５パーセンタイルの四分位範囲の１．５倍に伸び、多角形はデータの密度推定値を示し、極値まで伸びている。スチューデントのｔ検定において、「＊」はＰ＜０．０５、「§」はＰ＜０．０１、「＃」はＰ＜０．００１、「†」はＰ＜０．０００１をそれぞれ示す。
【0097】
図１１は、図１０と同じＲＦＰ＋及びＲＦＰ－の細胞の二核化の程度を調べた結果である。分化誘導後２１日目（ｄ２１）及び２８日目（ｄ２８）（ｎ＞６５）の単核細胞及び二核細胞の割合を示す。カイ二乗検定において、「＃」は、Ｐ＜０．００１、「†」は、Ｐ＜０．０００１を示す。
【0098】
次に、ＲＦＰ＋及びＲＦＰ－の細胞の構造及び形態学的分析に加えて、心臓分化の２８日目にＲＦＰ－及びＲＦＰ＋のＰＳＣ－ＣＭｓのカルシウムトランジェントを測定することにより、生理学的特徴も調べた。カルシウム感知色素であるＣａｌｂｒｙｔｅ ５２０－ＡＭをＰＳＣ－ＣＭｓにロードし、タイムラプスイメージングを使用してカルシウムトランジェントを取得した。
【0099】
図１２Ａは、ＲＦＰ－及びＲＦＰ＋のＰＳＣ－ＣＭｓのカルシウムトランジェントの代表的なタイムラプス画像である。スケールバーは２０μｍである。これらの写真では、ＲＦＰ＋のＰＳＣ－ＣＭｓがＲＦＰ－のＰＳＣ－ＣＭｓよりも生理学的により成熟した表現型を示した。
図１２Ｂは、ＲＦＰ－及びＲＦＰ＋のＰＳＣ－ＣＭｓのＰＳＣ－ＣＭｓについて、それぞれ、２８日目（ｄ２８）に、１Ｈｚの電界刺激により誘発されたサイトゾルカルシウムトランジェントの空間平均プロファイルを示す。ＲＦＰ＋のＰＳＣ－ＣＭｓは、１Ｈｚの電界刺激によって、大きな細胞内カルシウム濃度の増加を示した。
図１２Ｃは、左から、振幅のピークまでの時間、ピーク振幅（ΔＦ／Ｆ０）、及びＣａ2+トランジェントの減衰時間をそれぞれ示すグラフである（ｎ＞３０）。「＃」は、スチューデントｔ検定においてＰ＜０．００１、「†」は、Ｐ＜０．０００１であることをそれぞれ示す。ＲＦＰ＋のＰＳＣ－ＣＭｓのトランジェント電流は、ＲＦＰ－のＰＳＣ－ＣＭｓよりも高い振幅と、ベースラインまでの速い減衰時間を示した。
図１２Ｂは、ＲＦＰ－及びＲＦＰ＋のＰＳＣ－ＣＭｓのＰＳＣ－ＣＭｓについて、それぞれ、２８日目（ｄ２８）に、１Ｈｚの電界刺激により誘発されたサイトゾルカルシウムトランジェントの空間平均プロファイルを示す。ＲＦＰ＋のＰＳＣ－ＣＭｓは、１Ｈｚの電界刺激によって、大きな細胞内カルシウム濃度の増加を示した。
図１２Ｃは、左から、振幅のピークまでの時間、ピーク振幅（ΔＦ／Ｆ０）、及びＣａ2+トランジェントの減衰時間をそれぞれ示すグラフである（ｎ＞３０）。「＃」は、スチューデントｔ検定においてＰ＜０．００１、「†」は、Ｐ＜０．０００１であることをそれぞれ示す。ＲＦＰ＋のＰＳＣ－ＣＭｓのトランジェント電流は、ＲＦＰ－のＰＳＣ－ＣＭｓよりも高い振幅と、ベースラインまでの速い減衰時間を示した。
【0100】
次に、Ｍｙｏｍ２－ＲＦＰ株を使用したＰＳＣ－ＣＭｓについて、ＲＦＰ＋の心筋細胞についてサルコメア短縮アッセイを行った。
【0101】
図１３Ａは、ＲＦＰ＋のＰＳＣ－ＣＭｓにおいて、黄色のバーで示される測定領域でのサルコメア短縮の代表的な写真を示している。
図１３Ｂは、当該黄色のバーの箇所に対応するサルコメア長のラインスキャンの結果を示す。
図１３Ｃは、ＲＦＰ＋のＰＳＣ－ＣＭｓのサルコメア短縮の長さ（μｍ）のプロファイルを示す。
図１３Ｄは、正規化されたサルコメアの長さのバイオリンプロット、図１３Ｅは、サルコメアのＲＦＰ＋のＰＳＣ－ＣＭｓの短縮率（ｎ＝３８）を示す。ＲＦＰ＋のＰＳＣ－ＣＭｓは一定の収縮を示し、サルコメア短縮は約６．８％（約２．０３±０．１９μｍ～１．８９±０．２０μｍ程度）であった。
図１３Ｂは、当該黄色のバーの箇所に対応するサルコメア長のラインスキャンの結果を示す。
図１３Ｃは、ＲＦＰ＋のＰＳＣ－ＣＭｓのサルコメア短縮の長さ（μｍ）のプロファイルを示す。
図１３Ｄは、正規化されたサルコメアの長さのバイオリンプロット、図１３Ｅは、サルコメアのＲＦＰ＋のＰＳＣ－ＣＭｓの短縮率（ｎ＝３８）を示す。ＲＦＰ＋のＰＳＣ－ＣＭｓは一定の収縮を示し、サルコメア短縮は約６．８％（約２．０３±０．１９μｍ～１．８９±０．２０μｍ程度）であった。
【0102】
次に、ＲＦＰ＋のＰＳＣ－ＣＭｓは、ＲＦＰ－のＰＳＣ－ＣＭｓよりも成熟しているか否かをさらに確認するために、トランスクリプトーム分析を行った。具体的には、ＲＮＡ－ｓｅｑを行った。このため、ＦＡＣＳにて、分化誘導後１０日目（ｄ１０）、１７日目（ｄ１７）、２４日目（ｄ２４）、及び３８日目（ｄ３８）のＲＦＰ＋及びＲＦＰ－のＰＳＣ－ＣＭｓを取得した。
【0103】
図１４は、トランスクリプトーム分析を行った結果のヒートマップを示す。分化誘導後１０日目（ｄ１０）～２４日目（ｄ３８）において、ＲＦＰ＋のＰＳＣ－ＣＭｓで発現量が変化した遺伝子のＲｌｏｇ値を濃い色で示す。心筋細胞の成熟に関連する既知の遺伝子において、サルコメア遺伝子（Ｍｙｈ７、Ｍｙｌ２、Ｍｙｌ３、Ｍｙｏｚ２、及びＭｙｐｎ）、カルシウム処理遺伝子（Ｃａｓｑ２）、及び筋細胞膜のイオン輸送体（Ｋｃｎａ４）等の発現が、ＲＦＰ＋のＰＳＣ－ＣＭｓにて上昇した。
【0104】
図１５Ａは、分子機能のＧＯ（ｇｅｎｅ ｏｎｔｏｌｏｇｙ）分析を行った結果を示す。ＧＯタームにおいて、ＲＦＰ＋及びＲＦＰ－のＰＳＣ－ＣＭｓで際のある遺伝子が特定された。横軸は、調整されたｐ値の対数を示す。ＧＯ分析により、構造及び筋肉の発達に関与するＧＯタームが、ＲＦＰ＋のＰＳＣ－ＣＭｓで頻出することが明らかになった。一方、ＥＣＭ組織のＧＯタームが、ＲＦＰ－のＰＳＣ－ＣＭｓで頻出した。
図１５Ｂは、発現に差異がある遺伝子の機能的特性を調べるために、生物学的プロセスにおけるＧＯ用語で選択された遺伝子の全体的な発現レベルを調べた結果である。図１５Ｂは、ＲＦＰ＋（ポジティブ）及びＲＦＰ－（ネガティブ）の各細胞について、生物学的プロセスで選択された８つのＧＯタームの平均遺伝子発現を示すグラフである。両方とも未熟な心筋細胞の状態に関連するグルコース代謝と細胞周期関連の遺伝子は、ＲＦＰ＋及びＲＦＰ－細胞の両方で、ｄ１０ですぐに発現低下していた。このうち、ＲＦＰ＋のＰＳＣ－ＣＭｓは、少しだけ発現低下されていた。一方、上述の各実験結果と関連するように、脂質代謝プロセス、脂肪酸β酸化、及びミトコンドリアの遺伝子は、ＲＦＰ－心筋細胞と比較して、ＲＦＰ＋心筋細胞で発現が上昇していた。これは、代謝スイッチがＲＦＰ＋のＰＳＣ－ＣＭｓで発生し、生後、ｉｎ ｖｉｖｏで発生することを示唆している。さらに、マイオフィブリルアセンブリ、心筋組織の発達、及びＴ細管組織の遺伝子は、ＲＦＰ＋心筋細胞で発現が上昇していた。
これらの結果は、ＲＦＰ＋のＰＳＣ－ＣＭｓが、ＲＦＰ－のＰＳＣ－ＣＭｓよりも成熟していることを示している。
図１５Ｂは、発現に差異がある遺伝子の機能的特性を調べるために、生物学的プロセスにおけるＧＯ用語で選択された遺伝子の全体的な発現レベルを調べた結果である。図１５Ｂは、ＲＦＰ＋（ポジティブ）及びＲＦＰ－（ネガティブ）の各細胞について、生物学的プロセスで選択された８つのＧＯタームの平均遺伝子発現を示すグラフである。両方とも未熟な心筋細胞の状態に関連するグルコース代謝と細胞周期関連の遺伝子は、ＲＦＰ＋及びＲＦＰ－細胞の両方で、ｄ１０ですぐに発現低下していた。このうち、ＲＦＰ＋のＰＳＣ－ＣＭｓは、少しだけ発現低下されていた。一方、上述の各実験結果と関連するように、脂質代謝プロセス、脂肪酸β酸化、及びミトコンドリアの遺伝子は、ＲＦＰ－心筋細胞と比較して、ＲＦＰ＋心筋細胞で発現が上昇していた。これは、代謝スイッチがＲＦＰ＋のＰＳＣ－ＣＭｓで発生し、生後、ｉｎ ｖｉｖｏで発生することを示唆している。さらに、マイオフィブリルアセンブリ、心筋組織の発達、及びＴ細管組織の遺伝子は、ＲＦＰ＋心筋細胞で発現が上昇していた。
これらの結果は、ＲＦＰ＋のＰＳＣ－ＣＭｓが、ＲＦＰ－のＰＳＣ－ＣＭｓよりも成熟していることを示している。
【0105】
図１６は、分化誘導後１０日目（ｄ１０）、及び１７日目（ｄ１７）～３８日目（ｄ３８）までのＲＦＰ－及びＲＦＰ＋のＰＳＣ－ＣＭｓをフローサイトメトリーでセルソーティングして取得した後、実施例１と同様の手法で、成熟度スコアを測定したものを示す。結果として、ＲＦＰ＋の細胞のみがより成熟していくことがわかる。すなわち、ＲＦＰ＋のＰＳＣ－ＣＭｓを取得することで、成熟した心筋細胞を取得（純化）することが可能となる。
【0106】
まとめると、Ｍｙｏｍ２－ＲＦＰ株を分化したＲＦＰ＋のＰＳＣ－ＣＭｓは、サルコメア短縮が観察され、ＲＦＰ－のＰＳＣ－ＣＭｓよりも形態的、構造的、機能的に成熟していた。よって、Ｍｙｏｍ２－ＲＦＰ株は、心筋細胞の成熟度の指標となる心筋細胞成熟のレポーター細胞として使用できる。また、Ｍｙｏｍ２－ＲＦＰ株のＲＦＰ＋のＰＳＣ－ＣＭｓを取得することで、成熟心筋細胞を純化することが可能となる。
【実施例3】
【0107】
次に、実施例３として、心筋細胞を成熟させる成熟方法を実現するため、ホルモン、転写因子、転写因子のアゴニスト等を用いた実験を行った。
以下、その材料と方法、結果について説明する。なお、以下、実施例１、２と同様の用語、材料、実験方法等については記載を省略する。
以下、その材料と方法、結果について説明する。なお、以下、実施例１、２と同様の用語、材料、実験方法等については記載を省略する。
【0108】
〔材料と方法〕
（使用したホルモン、アゴニストの一覧）
Ｔ３（Ｔｒｉ－ｉｏｄ－ｔｈｙｒｏｎｉｎｅ、甲状腺ホルモン），０．１μＭ、Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ（ＨＣ），０．１μＭ、Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ（Ｅ２），０．１μＭ、Ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ，０．１μＭ、ＧＷ７６４７（ＰＰＡＲ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）αアゴニスト），０．１μＭ、ＧＷ０７４２（ＰＰＡＲδ／βアゴニスト），０．１μＭ、ＧＷ１９２９（ＰＰＡＲγアゴニスト），０．１μＭ、ＤＹ１３１（ＥＲＲ（ｅｓｔｒｏｇｅｎ－ｒｅｌａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）β／γアゴニスト），２０μＭ、ＧＳＫ４７１６（ＥＲＲβ／γアゴニスト），２０μＭ、ＳＲ１０７８（ＲＯＲ（Ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｒｅｌａｔｅｄ ｏｒｐｈａｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）α／γアゴニスト），１μＭ、ＳＲ１００１（ＲＯＲα／γアトニスト），１μＭ、ＳＲ１１２３７（ＲＸＲ（Ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）アゴニスト），１０μＭ、ＧＳＫ４１１２（ＲＥＶ－ＥＲＢ（ｎｕｃｌｅａｒ ｈｅｍｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）αアゴニスト），１μＭ、ＳＲ１００６７（ＲＥＶ－ＥＲＢアゴニスト），０．１μＭ、２７－ＯＨＣ（ＬＸＲ（Ｌｉｖｅｒ Ｘ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）アゴニスト），１μＭ、ＷＡＹ２５２６２３（ＬＸＲアゴニスト），１μＭ、ＴＣＰＯＢＯＰ（ｍＣＡＲ（Ａｎｄｒｏｓｔａｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）アゴニスト），１μＭ、ＤＬＰＣ（ＬＲＨ－１ （ｌｉｖｅｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｈｏｍｏｌｏｇ－１，ＮＲ５Ａ２）アゴニスト），１０μＭ、ＰＱＱ，０．１μＭ、ＷＹ１４６４３（ＰＰＡＲアゴニスト），０．１μＭ。同様に、ＨＩＦ１α阻害剤Ｃｈｅｔｏｍｉｎ（ＣＴＭ）を、５ｎＭで使用した。いずれもフナコシ社から入手した。
（使用したホルモン、アゴニストの一覧）
Ｔ３（Ｔｒｉ－ｉｏｄ－ｔｈｙｒｏｎｉｎｅ、甲状腺ホルモン），０．１μＭ、Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ（ＨＣ），０．１μＭ、Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ（Ｅ２），０．１μＭ、Ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ，０．１μＭ、ＧＷ７６４７（ＰＰＡＲ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）αアゴニスト），０．１μＭ、ＧＷ０７４２（ＰＰＡＲδ／βアゴニスト），０．１μＭ、ＧＷ１９２９（ＰＰＡＲγアゴニスト），０．１μＭ、ＤＹ１３１（ＥＲＲ（ｅｓｔｒｏｇｅｎ－ｒｅｌａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）β／γアゴニスト），２０μＭ、ＧＳＫ４７１６（ＥＲＲβ／γアゴニスト），２０μＭ、ＳＲ１０７８（ＲＯＲ（Ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｒｅｌａｔｅｄ ｏｒｐｈａｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）α／γアゴニスト），１μＭ、ＳＲ１００１（ＲＯＲα／γアトニスト），１μＭ、ＳＲ１１２３７（ＲＸＲ（Ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）アゴニスト），１０μＭ、ＧＳＫ４１１２（ＲＥＶ－ＥＲＢ（ｎｕｃｌｅａｒ ｈｅｍｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）αアゴニスト），１μＭ、ＳＲ１００６７（ＲＥＶ－ＥＲＢアゴニスト），０．１μＭ、２７－ＯＨＣ（ＬＸＲ（Ｌｉｖｅｒ Ｘ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）アゴニスト），１μＭ、ＷＡＹ２５２６２３（ＬＸＲアゴニスト），１μＭ、ＴＣＰＯＢＯＰ（ｍＣＡＲ（Ａｎｄｒｏｓｔａｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）アゴニスト），１μＭ、ＤＬＰＣ（ＬＲＨ－１ （ｌｉｖｅｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｈｏｍｏｌｏｇ－１，ＮＲ５Ａ２）アゴニスト），１０μＭ、ＰＱＱ，０．１μＭ、ＷＹ１４６４３（ＰＰＡＲアゴニスト），０．１μＭ。同様に、ＨＩＦ１α阻害剤Ｃｈｅｔｏｍｉｎ（ＣＴＭ）を、５ｎＭで使用した。いずれもフナコシ社から入手した。
【0109】
（使用した転写因子の一覧）
Ａｈｒ、Ａｒｎｔｌ、Ａｔｆ３、Ａｔｆ６、Ｂｃｌ６、Ｃａｌｒ、Ｃｅｂｐａ、Ｃｅｂｐｂ、Ｃｒｅｂ１、Ｃｒｅｂｂｐ、Ｃｒｅｂｌ２、Ｃｓｄｃ２、Ｃｔｃｆ、Ｅ２ｆ６、Ｅｐ３００、Ｅｓｒ２、Ｅｓｒｒａ、Ｅｓｒｒｇ、Ｆｏｘｃ２、Ｆｏｘｏ３、Ｆｏｘｐ３、Ｇａｔａ３、Ｇｍｎｎ、Ｈｄａｃ１、Ｈｄａｃ２、Ｈｄａｃ３、ｃｏｎｔｒｏｌ１、Ｈｉｐｋ２、Ｈｍｇ２０ｂ、Ｈｎｆ４ａ、Ｈｏｐｘ、Ｈｏｘａ９、Ｉｆｉ２０４、Ｉｒｆ３、Ｉｒｆ４、Ｉｒｆ８、Ｉｒｆ９、Ｊｕｎｂ、Ｋｄｍ５ｂ、Ｋｌｆ１５、Ｍａｆｋ、Ｍｅｄ１、Ｍｅｎ１、Ｍｋｌ２、Ｍｔａ１、Ｍｔｅｒｆ２、Ｎａｃｃ２、Ｎｃｏａ２、Ｎｆａｔｃ２、Ｎｆｅ２ｌ１、Ｎｏｓｔｒｉｎ、Ｎｐａｓ２、Ｎｒ１ｄ１、ｃｏｎｔｒｏｌ２、Ｎｒ１ｈ３、Ｎｒ１ｉ３、Ｎｒ２ｃ２、Ｎｒ３ｃ１、Ｎｒ４ａ３、Ｎｒ５ａ２、Ｎｕｐｒ１、Ｐａｘ６、Ｐｐａｒａ、Ｐｐａｒｄ、Ｐｐａｒｇ、Ｐｐａｒｇｃ１ａ、Ｐｐａｒｇｃ１ｂ、Ｐｒｄｍ１、Ｒｂ１、Ｒｂｃｋ１、Ｒｂｌ１、Ｒｂｐｊ、Ｒｎｆ１４１、Ｒｏｒａ、Ｒｘｒｇ、Ｓｉｒｔ１、Ｓｍｒｃｂ１、Ｓｏｘ２、Ｓｐｄｅｆ、Ｓｐｉ１、ｃｏｎｔｒｏｌ３、Ｓｒｅｂｆ１、Ｓｔａｔ５ａ、Ｓｔａｔ５ｂ、Ｔａｆ１ａ、Ｔｃｆ７ｌ２、Ｔｆａｍ、Ｔｏｂ１、Ｔｐ５３、Ｔｒｉｍ２１、Ｕｓｆ１、Ｖｈｌ、Ｗｔ１、Ｚｂｔｂ２０、Ｚｂｔｂ７ａ
Ａｈｒ、Ａｒｎｔｌ、Ａｔｆ３、Ａｔｆ６、Ｂｃｌ６、Ｃａｌｒ、Ｃｅｂｐａ、Ｃｅｂｐｂ、Ｃｒｅｂ１、Ｃｒｅｂｂｐ、Ｃｒｅｂｌ２、Ｃｓｄｃ２、Ｃｔｃｆ、Ｅ２ｆ６、Ｅｐ３００、Ｅｓｒ２、Ｅｓｒｒａ、Ｅｓｒｒｇ、Ｆｏｘｃ２、Ｆｏｘｏ３、Ｆｏｘｐ３、Ｇａｔａ３、Ｇｍｎｎ、Ｈｄａｃ１、Ｈｄａｃ２、Ｈｄａｃ３、ｃｏｎｔｒｏｌ１、Ｈｉｐｋ２、Ｈｍｇ２０ｂ、Ｈｎｆ４ａ、Ｈｏｐｘ、Ｈｏｘａ９、Ｉｆｉ２０４、Ｉｒｆ３、Ｉｒｆ４、Ｉｒｆ８、Ｉｒｆ９、Ｊｕｎｂ、Ｋｄｍ５ｂ、Ｋｌｆ１５、Ｍａｆｋ、Ｍｅｄ１、Ｍｅｎ１、Ｍｋｌ２、Ｍｔａ１、Ｍｔｅｒｆ２、Ｎａｃｃ２、Ｎｃｏａ２、Ｎｆａｔｃ２、Ｎｆｅ２ｌ１、Ｎｏｓｔｒｉｎ、Ｎｐａｓ２、Ｎｒ１ｄ１、ｃｏｎｔｒｏｌ２、Ｎｒ１ｈ３、Ｎｒ１ｉ３、Ｎｒ２ｃ２、Ｎｒ３ｃ１、Ｎｒ４ａ３、Ｎｒ５ａ２、Ｎｕｐｒ１、Ｐａｘ６、Ｐｐａｒａ、Ｐｐａｒｄ、Ｐｐａｒｇ、Ｐｐａｒｇｃ１ａ、Ｐｐａｒｇｃ１ｂ、Ｐｒｄｍ１、Ｒｂ１、Ｒｂｃｋ１、Ｒｂｌ１、Ｒｂｐｊ、Ｒｎｆ１４１、Ｒｏｒａ、Ｒｘｒｇ、Ｓｉｒｔ１、Ｓｍｒｃｂ１、Ｓｏｘ２、Ｓｐｄｅｆ、Ｓｐｉ１、ｃｏｎｔｒｏｌ３、Ｓｒｅｂｆ１、Ｓｔａｔ５ａ、Ｓｔａｔ５ｂ、Ｔａｆ１ａ、Ｔｃｆ７ｌ２、Ｔｆａｍ、Ｔｏｂ１、Ｔｐ５３、Ｔｒｉｍ２１、Ｕｓｆ１、Ｖｈｌ、Ｗｔ１、Ｚｂｔｂ２０、Ｚｂｔｂ７ａ
【0110】
（レンチウイルスの作成）
転写因子を導入するためのレンチウイルスの作成は、まず、２４ウェルディッシュに１０5／ウェルでＨＥＫ２９３Ｔ細胞を播種し、２４時間程度培養する。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞はＤＭＥＭ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ培地にＦＢＳ（終濃度１０％ ｖ／ｖ）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（終濃度１％ ｖ／ｖ）、Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｙｒｕｖａｔｅ（終濃度１％ ｖ／ｖ）、ＮＥＡＡ（終濃度１％ ｖ／ｖ）を混合した培地で培養した。播種翌日夕方にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸを用いてプラスミドをトランスフェクションした。この際、２４ウェルであればＯＰＴＩ－ＭＥＭ ５０μＬ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ ２μＬ、Ｐｌｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔ ０．４ｕＬ、ｐｘＰＡＸ２ ０．１μｇ、ｐＭＤ２．Ｇ ０．３μｇ、Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｖｅｃｔｏｒ ０．３μｇを混合する。なお、Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｖｅｃｔｏｒはｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５－ＤＥＳＴベクターに対し、各種転写因子を持つｐＥＮＴＲベクターをＬＲ反応により作成した。Ｔｉｔｅｒの測定、ＰＳＣ－ＣＭｓへの感染効率の推定のために、ＧＦＰを発現するｐＬｅｎｔｉ６－ＧＦＰをコントロールとして用いた。混合後、２０分間、室温でインキュベートした後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションを行った。トランスフェクションを行ったＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、３７℃のＣＯ2インキュベーターで一晩培養を行い、翌朝（１８から２０時間後）に培養液を交換し（５００μＬ／ｗ）、さらに２日間培養を行うことでレンチウイルスを培養上清中へと産生した。培養上清を回収後、２０００ＲＰＭで遠心することで、残存しているＨＥＫ２９３細胞を除去した。新しく２４ウェルにＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０5／ウェルで播種し、そこに、１，５，１０μＬのＧＦＰ発現ウイルスを含む培養上清を加えることで、レンチウイルスの感染能（Ｔｉｔｅｒ）を測定した。感染３日目にＧＦＰを測定することでｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｕｎｉｔｓ（ＩＦＵ）を計算した（播種細胞数（１０5）×ＧＦＰ％／１００×１０００（１μＬの場合））。概ね１ｘ１０7 ＩＦＵ／ｍＬ以上のＴｉｔｅｒであった。
転写因子を導入するためのレンチウイルスの作成は、まず、２４ウェルディッシュに１０5／ウェルでＨＥＫ２９３Ｔ細胞を播種し、２４時間程度培養する。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞はＤＭＥＭ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ培地にＦＢＳ（終濃度１０％ ｖ／ｖ）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（終濃度１％ ｖ／ｖ）、Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｙｒｕｖａｔｅ（終濃度１％ ｖ／ｖ）、ＮＥＡＡ（終濃度１％ ｖ／ｖ）を混合した培地で培養した。播種翌日夕方にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸを用いてプラスミドをトランスフェクションした。この際、２４ウェルであればＯＰＴＩ－ＭＥＭ ５０μＬ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ ２μＬ、Ｐｌｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔ ０．４ｕＬ、ｐｘＰＡＸ２ ０．１μｇ、ｐＭＤ２．Ｇ ０．３μｇ、Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｖｅｃｔｏｒ ０．３μｇを混合する。なお、Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｖｅｃｔｏｒはｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５－ＤＥＳＴベクターに対し、各種転写因子を持つｐＥＮＴＲベクターをＬＲ反応により作成した。Ｔｉｔｅｒの測定、ＰＳＣ－ＣＭｓへの感染効率の推定のために、ＧＦＰを発現するｐＬｅｎｔｉ６－ＧＦＰをコントロールとして用いた。混合後、２０分間、室温でインキュベートした後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションを行った。トランスフェクションを行ったＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、３７℃のＣＯ2インキュベーターで一晩培養を行い、翌朝（１８から２０時間後）に培養液を交換し（５００μＬ／ｗ）、さらに２日間培養を行うことでレンチウイルスを培養上清中へと産生した。培養上清を回収後、２０００ＲＰＭで遠心することで、残存しているＨＥＫ２９３細胞を除去した。新しく２４ウェルにＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０5／ウェルで播種し、そこに、１，５，１０μＬのＧＦＰ発現ウイルスを含む培養上清を加えることで、レンチウイルスの感染能（Ｔｉｔｅｒ）を測定した。感染３日目にＧＦＰを測定することでｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｕｎｉｔｓ（ＩＦＵ）を計算した（播種細胞数（１０5）×ＧＦＰ％／１００×１０００（１μＬの場合））。概ね１ｘ１０7 ＩＦＵ／ｍＬ以上のＴｉｔｅｒであった。
【0111】
（ＰＳＣ－ＣＭｓへの感染）
マウスＭｙｏｍ２－ＲＦＰ株を分化誘導して作成したＰＳＣ－ＣＭｓへの感染は、産生したレンチウイルスを凍結せずそのまま用いた。分化１０日目に播種したＰＳＣ－ＣＭｓは、１１日目に通常の分化培地５００μＬへと交換した。そこに、２００μＬのウイルスを含む培養上清を加えた。約２４時間感染を行った後、分化培地（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含む）５００μＬへと交換した。この際、甲状腺ホルモン処理を行う条件ではＴ３ ０．１μＭを添加した。分化１４日目以降は分化培地のみ、あるいは分化培地＋Ｔ３にて培養を行った。分化１８日目に、上述の実施例２と同様のＲＦＰ＋の解析を行い、分化２１日目にＲＮＡ－ｓｅｑ用のサンプルを回収した。
マウスＭｙｏｍ２－ＲＦＰ株を分化誘導して作成したＰＳＣ－ＣＭｓへの感染は、産生したレンチウイルスを凍結せずそのまま用いた。分化１０日目に播種したＰＳＣ－ＣＭｓは、１１日目に通常の分化培地５００μＬへと交換した。そこに、２００μＬのウイルスを含む培養上清を加えた。約２４時間感染を行った後、分化培地（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含む）５００μＬへと交換した。この際、甲状腺ホルモン処理を行う条件ではＴ３ ０．１μＭを添加した。分化１４日目以降は分化培地のみ、あるいは分化培地＋Ｔ３にて培養を行った。分化１８日目に、上述の実施例２と同様のＲＦＰ＋の解析を行い、分化２１日目にＲＮＡ－ｓｅｑ用のサンプルを回収した。
【0112】
〔結果〕
（転写因子の候補）
まず、本発明者らは、上述の実施例１のトランスクリプトーム解析から、心筋細胞の成熟を促進しうる転写因子として、上述の９２転写因子を推定していた。
このうち、２０個の転写因子はアゴニストが既知の核内受容体であったため、実施例２のＭｙｏｍ２－ＲＦＰ株を用いて、実際に成熟を促進するアゴニストを検索した。
（転写因子の候補）
まず、本発明者らは、上述の実施例１のトランスクリプトーム解析から、心筋細胞の成熟を促進しうる転写因子として、上述の９２転写因子を推定していた。
このうち、２０個の転写因子はアゴニストが既知の核内受容体であったため、実施例２のＭｙｏｍ２－ＲＦＰ株を用いて、実際に成熟を促進するアゴニストを検索した。
【0113】
（アゴニストの組み合わせ）
図１７は、Ｍｙｏｍ２－ＲＦＰ株を用いたアゴニストのスクリーニングをした結果を示す。具体的には、各種ホルモン、アゴニストがＭｙｏｍ２－ＲＦＰに与える影響を分化誘導後１４日目から２週間処理を行い、ＲＦＰ陽性率をＦＡＣＳで評価した。各バーは、各化合物において、ＲＦＰ陽性率として、ＲＦＰ＋となった細胞の割合（％）を示す。ｔ検定において「＊」はＰ＜０．０５、「＊＊」はＰ＜０．０１で有意であったものを示す。なお、各薬剤の濃度は、ＲＦＰ陽性率及び高濃度での毒性を勘案し、有効な範囲で最も高濃度を選択した。
図１７は、Ｍｙｏｍ２－ＲＦＰ株を用いたアゴニストのスクリーニングをした結果を示す。具体的には、各種ホルモン、アゴニストがＭｙｏｍ２－ＲＦＰに与える影響を分化誘導後１４日目から２週間処理を行い、ＲＦＰ陽性率をＦＡＣＳで評価した。各バーは、各化合物において、ＲＦＰ陽性率として、ＲＦＰ＋となった細胞の割合（％）を示す。ｔ検定において「＊」はＰ＜０．０５、「＊＊」はＰ＜０．０１で有意であったものを示す。なお、各薬剤の濃度は、ＲＦＰ陽性率及び高濃度での毒性を勘案し、有効な範囲で最も高濃度を選択した。
【0114】
図１８は、Ｍｙｏｍ２－ＲＦＰ株から分化誘導させたＰＳＣ－ＣＭｓ全体（ＲＦＰ＋及びＲＦＰ－の細胞）について、実施例１の成熟度評価法を用いた解析を行い、効果の高いホルモン、アゴニストを決定した結果を示す。図１８は、単剤で上述のアゴニストを加えたものについて、成熟度スコアを用いて評価したものである。単剤ではＴ３が最も高い成熟度スコアとなった。
【0115】
図１９は、２剤の組み合わせを示すグラフである。具体的には、効果の高かったＴ３に残りのアゴニストを加えて、アゴニストの組み合わせを調べた結果を示す。ここでは、Ｔ３に他のアゴニストを加え、成熟度スコアで評価したものを示す。結果として、Ｔ３＋ＳＲ１１２３７の組み合わせが好適であり、Ｔ３＋ＧＷ０７４２の組み合わせ、又はＴ３＋ＧＳＫ４７１６の組み合わせも良好な結果であった。
【0116】
図２０Ａ及び図２０Ｂは、同様に、３剤の組み合わせを示すグラフである。Ｔ３＋ＳＲ１１２３７の組み合わせに、残りのアゴニストを加えて、アゴニストの組み合わせを調べた結果を示す。結果として、Ｔ３＋ＳＲ１１２３７＋ＧＷ０７４２の組み合わせを筆頭に、ＳＲ１００１、Ｅ２、ＧＷ１９２９、ＷＹ１４６４３の組み合わせも効果があった。Ｐ１４程度と同様の成熟を示した。
【0117】
図２１は、分化誘導後１４日目から１週間（１ｗ）又は２週間（２ｗ）について、Ｔ３にＨＩＦ１ａ阻害剤であるＣｈｅｔｏｍｉｎを加えて、成熟度を評価した結果を示す。図２１は、Ｔ３にＣｈｅｔｏｍｉｎ（ＣＴＭ）を加え、成熟度スコアで評価したものを示す。それぞれ、「ｎｏ ｔｘ」はコントロール、「Ｔ３」はＴ３のみ加えたもの、「ＣＴＭ」はＣｈｅｔｏｍｉｎのみ加えたもの、「Ｔ３＋ＣＴＭ」は、Ｔ３とＣｈｅｔｏｍｉｎとを添加したものについて示す。結果として、Ｔ３にＣｈｅｔｏｍｉｎを加えると、ＰＳＣ－ＣＭｓの成熟が促進された。
【0118】
まとめると、心筋細胞の成熟を促進しうる、推定された９２転写因子の候補のうち２０は、アゴニスト既知の核内受容体であったため、好適なアゴニストの組み合わせを決定した。
具体的には、３アゴニストの組み合わせとして、Ｔ３（Ｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ）又はＳＲ１１２３７（Ｐａｎ ＲＸＲアゴニスト）と、ＧＷ０７４２（選択的ＰＰＡＲδアゴニスト）、ＳＲ１００１（ＲＯＲアゴニスト）、Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ（Ｅ２）、ＷＹ１４６４３（ＰＰＡＲαアゴニストで、ＰＰＡＲγも活性化する）、及びＧＷ１９２９（選択的ＰＰＡＲγアゴニスト）のいずれか、又は、ＨＩＦ１ａの阻害剤（ＣＴＭ）を組み合わせることで、心筋細胞を成熟させることができる。これは、上述の実施例１のトランスクリプトームにおいて、ＰＳＣ－ＣＭｓでは、ＨＩＦ１ａを阻害するＶＨＬ（ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ－Ｌｉｎｄａｕ）病の原因遺伝子産物）の活性が低く、更に、生後の心筋細胞ではＨＩＦ１ａの活性が低下することからも裏付けられる。
具体的には、３アゴニストの組み合わせとして、Ｔ３（Ｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ）又はＳＲ１１２３７（Ｐａｎ ＲＸＲアゴニスト）と、ＧＷ０７４２（選択的ＰＰＡＲδアゴニスト）、ＳＲ１００１（ＲＯＲアゴニスト）、Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ（Ｅ２）、ＷＹ１４６４３（ＰＰＡＲαアゴニストで、ＰＰＡＲγも活性化する）、及びＧＷ１９２９（選択的ＰＰＡＲγアゴニスト）のいずれか、又は、ＨＩＦ１ａの阻害剤（ＣＴＭ）を組み合わせることで、心筋細胞を成熟させることができる。これは、上述の実施例１のトランスクリプトームにおいて、ＰＳＣ－ＣＭｓでは、ＨＩＦ１ａを阻害するＶＨＬ（ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ－Ｌｉｎｄａｕ）病の原因遺伝子産物）の活性が低く、更に、生後の心筋細胞ではＨＩＦ１ａの活性が低下することからも裏付けられる。
【0119】
（カルシウムトランジェント）
図２２は、本実施例のＰＳＣ－ＣＭｓをＴ３、Ｔ３＋ＳＲ１１２３７（ＳＲ）、Ｔ３＋ＳＲ＋ＧＷ（ＧＷ０７４２）についてのカルシウムトランジェント解析の結果を示す。コントロールの何も加えないものに比べて、シャープな波形となり、いずれも明らかに成熟していることが分かる。
図２２は、本実施例のＰＳＣ－ＣＭｓをＴ３、Ｔ３＋ＳＲ１１２３７（ＳＲ）、Ｔ３＋ＳＲ＋ＧＷ（ＧＷ０７４２）についてのカルシウムトランジェント解析の結果を示す。コントロールの何も加えないものに比べて、シャープな波形となり、いずれも明らかに成熟していることが分かる。
【0120】
（ヒトＰＳＣ－ＣＭｓの結果）
図２３に、ヒトのＰＳＣ－ＣＭｓ（Ｔａｋａｒａ社ＭｉｒａＣｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ）を上述のホルモン又はアゴニストを加え、４週間（４ｗ）培養した際の成熟度スコアを示す。Ｔ３とＳＲ１１２３７（ＳＲ）のいずれを加えても、成熟度スコアは上がった。上述の３剤の組み合わせを用いることで、成熟度スコアをより高めることが期待できる。また、ヒトのレポーター細胞株を樹立し、これを用いて純化することで、更に成熟度スコアを高められると考えられる。
図２３に、ヒトのＰＳＣ－ＣＭｓ（Ｔａｋａｒａ社ＭｉｒａＣｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ）を上述のホルモン又はアゴニストを加え、４週間（４ｗ）培養した際の成熟度スコアを示す。Ｔ３とＳＲ１１２３７（ＳＲ）のいずれを加えても、成熟度スコアは上がった。上述の３剤の組み合わせを用いることで、成熟度スコアをより高めることが期待できる。また、ヒトのレポーター細胞株を樹立し、これを用いて純化することで、更に成熟度スコアを高められると考えられる。
【0121】
（心筋細胞の成熟を促進する転写因子の探索）
次に、実際に、推定された９２の転写因子の候補から、実際に心筋細胞の成熟を促進する転写因子をスクリーニングした。
具体的には、９２の各転写因子を発現するレンチウイルスをそれぞれ作成し、上述の実施例２のＭｙｏｍ２－ＲＦＰ株を分化誘導させ、分化誘導後１１日目（ｄ１１）のＰＳＣ－ＣＭｓに感染させ、Ｔ３を加え又は加えず、１８日目（ｄ１８）でＦＡＣＳを行って選択し、２１日目（ｄ２１）にＲＮＡを抽出してＲＮＡ－ｓｅｑを行った。
次に、実際に、推定された９２の転写因子の候補から、実際に心筋細胞の成熟を促進する転写因子をスクリーニングした。
具体的には、９２の各転写因子を発現するレンチウイルスをそれぞれ作成し、上述の実施例２のＭｙｏｍ２－ＲＦＰ株を分化誘導させ、分化誘導後１１日目（ｄ１１）のＰＳＣ－ＣＭｓに感染させ、Ｔ３を加え又は加えず、１８日目（ｄ１８）でＦＡＣＳを行って選択し、２１日目（ｄ２１）にＲＮＡを抽出してＲＮＡ－ｓｅｑを行った。
【0122】
図２４は、発達段階の各ステージのマウスに転写因子を導入した際の成熟度スコアによる解析の結果を示す。それぞれの転写因子を導入したものについて、Ｘ軸は各転写因子のみで甲状腺ホルモン（Ｔ３）を加えないもの、Ｙ軸は各転写因子及びＴ３を添えものを示す。
大きな黒丸で示すＣｒｅｂｌ２、Ｇａｔａ３、Ｎｒ４ａ３、Ｚｂｔｂ２０、Ｐｐａｇｃ１ｂ、Ｃｅｂｐｂ、及びＰｐａｇｃ１ａは、Ｔ３の有無に寄らず成熟度スコアが高かったものを示す。三角で示すＡｒｎｔｌ、Ａｔｆ６、Ｈｎｆ４ａ、Ｉｒｆ４、Ｒｎｆ１４１、Ｅ２ｆ６、Ｃｒｅｂｂｐ、Ｇｍｎｎ、Ｓｒｅｂｆ１、Ｒｂｌ１、Ｍｔｅｒｆ２、Ｚｂｔｂ７ａ、及びＲｂｃｋ１はいずれかでのみ成熟度スコアが高かったものを示す。それ以外の灰色の点は、いずれでも成熟度スコアが高くないものを示し、小さな黒丸はコントロールを示す。
大きな黒丸で示すＣｒｅｂｌ２、Ｇａｔａ３、Ｎｒ４ａ３、Ｚｂｔｂ２０、Ｐｐａｇｃ１ｂ、Ｃｅｂｐｂ、及びＰｐａｇｃ１ａは、Ｔ３の有無に寄らず成熟度スコアが高かったものを示す。三角で示すＡｒｎｔｌ、Ａｔｆ６、Ｈｎｆ４ａ、Ｉｒｆ４、Ｒｎｆ１４１、Ｅ２ｆ６、Ｃｒｅｂｂｐ、Ｇｍｎｎ、Ｓｒｅｂｆ１、Ｒｂｌ１、Ｍｔｅｒｆ２、Ｚｂｔｂ７ａ、及びＲｂｃｋ１はいずれかでのみ成熟度スコアが高かったものを示す。それ以外の灰色の点は、いずれでも成熟度スコアが高くないものを示し、小さな黒丸はコントロールを示す。
【0123】
この他にも、Ａｈｒ、Ｃｅｂｐａ、Ｃｔｃｆ、Ｅ２ｆ６、Ｅｓｒｒａ、Ｅｓｒｒｇ、Ｆｏｘｃ２、Ｆｏｘｏ３、Ｋｌｆ１５、Ｉｒｆ３、Ｍｔａ１、Ｍｔｅｒｆ２、Ｎａｃｃ２、Ｎｆｅ２ｌ１、Ｎｏｓｔｒｉｎ、Ｎｒ１ｉ３、Ｎｒ３ｃ１、Ｎｕｐｒ１、Ｐｐａｒｇｃ１ａ、Ｐｐａｒｇｃ１ｂ、Ｒｏｒａ、及びＳｍｒｃｂ１についても、Ｔ３の添加の有無にかかわらず、成熟度スコアは上がっていた。
【0124】
以上のように、ホルモン、核内受容体アゴニスト、ＨＩＦ１ａ阻害剤、及び転写因子のいずれか及び／又は任意の組み合わせを用いて、心筋細胞を成熟させることができた。
【実施例4】
【0125】
（ヒトＴＣＡＰ－ＧＦＰ ＫＩ レポーター）
次に、上述のＭｙｏｍ２以外の成熟心筋細胞マーカーとして、実施例２の図６Ｃで示したＴｃａｐについてより詳細に試験した。
具体的には、ヒトｉＰＳ細胞のＴＣＡＰ遺伝子座にＧＦＰをノックインし、心筋細胞へと分化誘導した（以下、「ヒトＴＣＡＰ－ＧＦＰ ＫＩ レポーター細胞」という。）。
ノックインの元細胞として、理研バイオリソースセンターより分与を受けた６１０Ｂ１ヒトｉＰＳ細胞に対して、ＴＮＮＴ２遺伝子座３’－ＵＴＲにｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ（ＩＲＥＳ）とｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子をノックインしたＴＮＮＴ２－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ株を用いた。
分化誘導はｉＭａｔｒｉｘ－５１１に未分化ｉＰＳＣを播種後、分化誘導の基礎培地としてＲＭＰＩ１６４０培地にＢ２７ ｍｉｎｕｓ ｉｎｓｕｌｉｎサプリメントを添加した培地に、分化０日目から２日目まで、ＣＨＩＲ９９０２１ ６μＭを添加し、分化２日目から４日目までＷｎｔ－Ｃ５９ ２μＭを添加した。分化４日目から７日目まで基礎培地のみで培養した後、分化７日目より基礎培地をＲＰＭＩ１６０４０にＢ２７サプリメントを添加した培地とし、Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ １０μｇ／ｍＬを分化７日目、９日目、１１日目に添加することでＰＳＣ－ＣＭｓを純化した。分化１４日目にＰＳＣ－ＣＭｓを継代し、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１上で再播種した。
次に、上述のＭｙｏｍ２以外の成熟心筋細胞マーカーとして、実施例２の図６Ｃで示したＴｃａｐについてより詳細に試験した。
具体的には、ヒトｉＰＳ細胞のＴＣＡＰ遺伝子座にＧＦＰをノックインし、心筋細胞へと分化誘導した（以下、「ヒトＴＣＡＰ－ＧＦＰ ＫＩ レポーター細胞」という。）。
ノックインの元細胞として、理研バイオリソースセンターより分与を受けた６１０Ｂ１ヒトｉＰＳ細胞に対して、ＴＮＮＴ２遺伝子座３’－ＵＴＲにｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ（ＩＲＥＳ）とｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子をノックインしたＴＮＮＴ２－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ株を用いた。
分化誘導はｉＭａｔｒｉｘ－５１１に未分化ｉＰＳＣを播種後、分化誘導の基礎培地としてＲＭＰＩ１６４０培地にＢ２７ ｍｉｎｕｓ ｉｎｓｕｌｉｎサプリメントを添加した培地に、分化０日目から２日目まで、ＣＨＩＲ９９０２１ ６μＭを添加し、分化２日目から４日目までＷｎｔ－Ｃ５９ ２μＭを添加した。分化４日目から７日目まで基礎培地のみで培養した後、分化７日目より基礎培地をＲＰＭＩ１６０４０にＢ２７サプリメントを添加した培地とし、Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ １０μｇ／ｍＬを分化７日目、９日目、１１日目に添加することでＰＳＣ－ＣＭｓを純化した。分化１４日目にＰＳＣ－ＣＭｓを継代し、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１上で再播種した。
【0126】
図２５Ａ～図２５Ｃは、それぞれ、この細胞の分化誘導後１４日目（ｄ１４）、２１日目（ｄ２１）、３５日目（ｄ３５）のＧＦＰの発現量を示すＲＱ（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ）プロットの例である。陽性値（Ｒ）は、それぞれ、０．１０％、０．２６％、１．４６％である。分化誘導後１４日目～２１日目ではＧＦＰ陽性細胞はみられず、３５日目に、初めてＧＦＰ陽性の心筋細胞が認められた。なお、この細胞は、クローニング化されていないため、陽性率自体は低くなっている。
図２６Ａは、分化誘導後５週間程度の状態を示すヒトＴＣＡＰ－ＧＦＰ ＫＩ レポーター細胞の写真である。
図２６Ｂは、図２６Ａの四角で示す箇所を拡大したものである。サルコメアに局在するＧＦＰが確認できた。
このように、ヒトＰＳＣ－ＣＭｓの成熟レポーターとして、ＴＣＡＰ－ＧＦＰ ＫＩ レポーター細胞を用いることが可能であった。また、ＴＣＡＰは生体内で成熟に伴い増加する遺伝子であることから、成熟心筋細胞マーカーとして有用であると考えられる。
図２６Ａは、分化誘導後５週間程度の状態を示すヒトＴＣＡＰ－ＧＦＰ ＫＩ レポーター細胞の写真である。
図２６Ｂは、図２６Ａの四角で示す箇所を拡大したものである。サルコメアに局在するＧＦＰが確認できた。
このように、ヒトＰＳＣ－ＣＭｓの成熟レポーターとして、ＴＣＡＰ－ＧＦＰ ＫＩ レポーター細胞を用いることが可能であった。また、ＴＣＡＰは生体内で成熟に伴い増加する遺伝子であることから、成熟心筋細胞マーカーとして有用であると考えられる。
【0127】
（ホルモン、アゴニスト処理におけるＰＳＣ－ＣＭｓの成熟心筋細胞マーカーＴｎｎｉ３発現）
Ｔｎｎｉ３は、従来から成熟心筋細胞マーカーとして知られている、心筋に含まれるＴｒｏｐｏｎｉｎ Ｉタンパクをコードする遺伝子である。
図２７Ａは、実施例２と同様の手法にして取得したＲＮＡ－ｓｅｑによる発達段階別のＴｎｎｉ３の発現量を示す。このように、Ｔｎｎｉ３も、成熟に伴い発現量が変化する。
Ｔｎｎｉ３は、従来から成熟心筋細胞マーカーとして知られている、心筋に含まれるＴｒｏｐｏｎｉｎ Ｉタンパクをコードする遺伝子である。
図２７Ａは、実施例２と同様の手法にして取得したＲＮＡ－ｓｅｑによる発達段階別のＴｎｎｉ３の発現量を示す。このように、Ｔｎｎｉ３も、成熟に伴い発現量が変化する。
【0128】
ここでは、マウスＰＳＣ－ＣＭｓを心筋細胞へと分化誘導し、１０日目に再播種し、１４日目より２週間、上述の実施例３で記載したホルモン、アゴニストであるＴ３、Ｔ３＋ＳＲ１１２３７（ＳＲ）、Ｔ３＋ＳＲ＋ＧＷ０７４２（ＧＷ）、Ｔ３＋ＳＲ＋Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ（Ｅ２）＋Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ（ＨＣ）でそれぞれ処理した際の例である。その後、Ａｎｔｉ－Ｔｎｎｉ３抗体で染色し、フローサイトメトリーを行った。
図２７Ｂ～図２７Ｇは、各このフローサイトメトリーの結果を示すプロットである。図２７Ｂはコントロール、図２７ＣはＴ３のみ、図２７ＤはＳＲのみ、図２７ＥはＴ３＋ＳＲ、図２７ＦはＴ３＋ＳＲ＋ＧＷ、図２７ＧはＴ３＋ＳＲ＋ＧＷ＋ＨＣの結果を示す。結果として、コントロールでは２２％程度がＴｎｎｉ３で染色されたが、Ｔ３＋ＳＲで６１％、Ｔ３＋ＳＲにＥ２およびＨＣを追加することで、６８％がＴｎｎｉ３陽性となった。
このように、本実施例のホルモン、アゴニスト処理では、従来の成熟心筋細胞マーカーにおいても成熟度が高くなることが示された。
図２７Ｂ～図２７Ｇは、各このフローサイトメトリーの結果を示すプロットである。図２７Ｂはコントロール、図２７ＣはＴ３のみ、図２７ＤはＳＲのみ、図２７ＥはＴ３＋ＳＲ、図２７ＦはＴ３＋ＳＲ＋ＧＷ、図２７ＧはＴ３＋ＳＲ＋ＧＷ＋ＨＣの結果を示す。結果として、コントロールでは２２％程度がＴｎｎｉ３で染色されたが、Ｔ３＋ＳＲで６１％、Ｔ３＋ＳＲにＥ２およびＨＣを追加することで、６８％がＴｎｎｉ３陽性となった。
このように、本実施例のホルモン、アゴニスト処理では、従来の成熟心筋細胞マーカーにおいても成熟度が高くなることが示された。
【0129】
（マウスＰＳＣ－ＣＭｓのミトコンドリア形態）
次に、マウスＰＳＣ－ＣＭｓのミトコンドリアの形態について観察した。ここでは、ホルモン、アゴニストで処理したマウスＰＳＣ－ＣＭｓのミトコンドリアの形態を観察した。具体的には、マウスＰＳＣ－ＣＭｓを心筋細胞へと分化誘導し、１０日目に再播種し、１４日目より２週間、ホルモン、アゴニストであるＴ３、ＳＲ、ＧＷ、ＨＣとこれらの組み合わせでそれぞれ処理した。
次に、マウスＰＳＣ－ＣＭｓのミトコンドリアの形態について観察した。ここでは、ホルモン、アゴニストで処理したマウスＰＳＣ－ＣＭｓのミトコンドリアの形態を観察した。具体的には、マウスＰＳＣ－ＣＭｓを心筋細胞へと分化誘導し、１０日目に再播種し、１４日目より２週間、ホルモン、アゴニストであるＴ３、ＳＲ、ＧＷ、ＨＣとこれらの組み合わせでそれぞれ処理した。
【0130】
図２８は、この処理後の細胞について、Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ及びＨｅｏｃｈｓｅｓｔにより、ミトコンドリア及び核をそれぞれ染色した例である。各写真において、左上枠は小さい枠内を拡大したものである。結果として、コントロールでは未熟な心筋細胞で、特徴的な網目状のミトコンドリアが観察された。一方、Ｔ３＋ＳＲ＋ＧＷにより、ミトコンドリアがサルコメア内にパックされた形態となった。
図２９に、コントロールとＴ３＋ＳＲ＋ＧＷとを更に拡大した写真を示す。この写真においても、左上枠は小さい枠内を拡大したものである。
サルコメア内にパックされた形態は、成熟した心筋細胞で認められるミトコンドリア形態である。すなわち、ホルモン、アゴニスト処理により、成熟した心筋細胞らしいミトコンドリア形態となることが示された。
図２９に、コントロールとＴ３＋ＳＲ＋ＧＷとを更に拡大した写真を示す。この写真においても、左上枠は小さい枠内を拡大したものである。
サルコメア内にパックされた形態は、成熟した心筋細胞で認められるミトコンドリア形態である。すなわち、ホルモン、アゴニスト処理により、成熟した心筋細胞らしいミトコンドリア形態となることが示された。
【0131】
（マウスＰＳＣ－ＣＭｓのミトコンドリア機能）
さらに、マウスＰＳＣ－ＣＭｓのミトコンドリア機能について調べた。ここでは、ホルモン、アゴニストで処理したマウスＰＳＣ－ＣＭｓのミトコンドリアの機能として、酸素消費量、酸素消費速度（Ｏｘｙｇｅｎ Ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ Ｒａｔｅ、以下、「ＯＣＲ」という。）について調べた。具体的には、マウスＰＳＣ－ＣＭｓを心筋細胞へと分化誘導し、１０日目に再播種し、１４日目より２週間、ホルモン、アゴニストであるＴ３、ＳＲ、ＧＷで処理を行った。酸素消費量は、Ａｇｉｌｅｎｔ社製のＳｅａｈｏｒｓｅを用いて評価した。
さらに、マウスＰＳＣ－ＣＭｓのミトコンドリア機能について調べた。ここでは、ホルモン、アゴニストで処理したマウスＰＳＣ－ＣＭｓのミトコンドリアの機能として、酸素消費量、酸素消費速度（Ｏｘｙｇｅｎ Ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ Ｒａｔｅ、以下、「ＯＣＲ」という。）について調べた。具体的には、マウスＰＳＣ－ＣＭｓを心筋細胞へと分化誘導し、１０日目に再播種し、１４日目より２週間、ホルモン、アゴニストであるＴ３、ＳＲ、ＧＷで処理を行った。酸素消費量は、Ａｇｉｌｅｎｔ社製のＳｅａｈｏｒｓｅを用いて評価した。
【0132】
図３０Ａ～図３０Ｅにより、この結果について説明する。図３０Ａは、抽出されたミトコンドリアに、阻害剤であるオリゴマイシン（Ｏｌｉｇｏｍｙｃｉｎ）、ＦＣＣＰ、ロテノン（Ｒｏｔｅｎｏｎｅ）及びアンチマイシンＡ（Ａｎｔｉｍｙｃｉｎ Ａ）をそれぞれ添加しながら、継続的にＯＣＲを計測し、ミトコンドリア機能の評価を行ったグラフである。横軸は時間、縦軸はＯＣＲ（ｐｍｏｌ／分）を示す。また、図３０ＢはＢａｓａｌ Ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ、図３０ＣはＡＴＰ－ｌｉｎｋｅｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ、図３０ＤはＰｒｏｔｏｎ ｌｅａｋ、図３０Ｅは、Ｍａｘｉｍａｌ Ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎをそれぞれ示す。このアッセイの阻害剤（脱共役剤）であるＦＣＣＰを投与した後に見られるＭａｘｉｍａｌ Ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎがミトコンドリア機能の最大能と考えられる。すなわち、結果として、Ｔ３＋ＳＲ（＋ＧＷ）により、ＯＣＲやＭａｘｉｍａｌ Ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎが増加、マウスＰＳＣ－ＣＭｓでミトコンドリア機能の向上がみられた。
【0133】
（ヒトＰＳＣ－ＣＭｓのカルシウムトランジェント）
次に、ヒトＰＳＣ－ＣＭｓの心筋細胞の生理学的な機能について、まずはカルシウムトランジェントを調べた。ここでは、上述した通り、ヒトｉＰＳ細胞を心筋細胞へと分化誘導、純化した後、分化誘導後１０日目に再播種し、１４日目より２週間、上述のホルモン、アゴニストで処理を行った。その後、上述の実施例２と同様に、細胞内カルシウムに応答し、蛍光を発するＣａｌｂｒｙｔｅ ５２０を用いて、細胞内のカルシウム動態を評価した。本実施例では、１秒ごとに心筋細胞へ電気刺激を加え、Ｃａｌｂｒｙｔｅ ５２０による蛍光輝度の変化を測定、評価した。
次に、ヒトＰＳＣ－ＣＭｓの心筋細胞の生理学的な機能について、まずはカルシウムトランジェントを調べた。ここでは、上述した通り、ヒトｉＰＳ細胞を心筋細胞へと分化誘導、純化した後、分化誘導後１０日目に再播種し、１４日目より２週間、上述のホルモン、アゴニストで処理を行った。その後、上述の実施例２と同様に、細胞内カルシウムに応答し、蛍光を発するＣａｌｂｒｙｔｅ ５２０を用いて、細胞内のカルシウム動態を評価した。本実施例では、１秒ごとに心筋細胞へ電気刺激を加え、Ｃａｌｂｒｙｔｅ ５２０による蛍光輝度の変化を測定、評価した。
【0134】
図３１Ａ～図３１Ｊにより、この結果について説明する。図３１Ａはコントロールの無処理、図３１ＢもコントロールのＤＭＳＯのみ、図３１ＣはＴ３、図３１ＤはＳＲ、図３１ＥはＧＷ、図３１ＦはＴ３＋ＳＲ、図３１ＧはＴ３＋ＧＷ、図３１ＨはＳＲ＋ＧＷ、図３１ＩはＴ３＋ＳＲ＋ＧＷ、図３１ＪはＴ３＋ＨＣでそれぞれ処理した結果を示す。各グラフは、横軸が時間（秒）、縦軸がピーク振幅（Ｆ／Ｆ０）の値を示す。
結果として、コントロールでは僅かな変動しか示さないのに対して、Ｔ３＋ＳＲ処理、あるいはＴ３＋ＳＲにＧＷを加えた条件で大幅なカルシウム濃度の変動が認められた。これは成熟した心筋細胞に特徴的な変化であった。すなわち、Ｔ３＋ＳＲ（＋ＧＷ）の処理により、心筋細胞の生理学的な機能が向上したことが示された。
結果として、コントロールでは僅かな変動しか示さないのに対して、Ｔ３＋ＳＲ処理、あるいはＴ３＋ＳＲにＧＷを加えた条件で大幅なカルシウム濃度の変動が認められた。これは成熟した心筋細胞に特徴的な変化であった。すなわち、Ｔ３＋ＳＲ（＋ＧＷ）の処理により、心筋細胞の生理学的な機能が向上したことが示された。
【0135】
（ヒトＰＳＣ－ＣＭｓのミトコンドリア形態）
さらに、ホルモン、アゴニストで処理したヒトＰＳＣ－ＣＭｓのミトコンドリアの形態を観察した。具体的には、ヒトｉＰＳ細胞を心筋細胞へと分化誘導した後、分化誘導後１０日目に再播種し、１４日目より２週間、上述のホルモン、アゴニストで処理を行った。
さらに、ホルモン、アゴニストで処理したヒトＰＳＣ－ＣＭｓのミトコンドリアの形態を観察した。具体的には、ヒトｉＰＳ細胞を心筋細胞へと分化誘導した後、分化誘導後１０日目に再播種し、１４日目より２週間、上述のホルモン、アゴニストで処理を行った。
【0136】
図３２は、この処理後の細胞を、Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ（緑）及びＨｅｏｃｈｓｅｓｔ（青）により、ミトコンドリア及び核を染色したものを示す。Ｔ３＋ＳＲ、Ｔ３＋ＧＷ、Ｔ３＋ＳＲ＋ＧＷの条件で、コントロールに対して大幅なミトコンドリア量の増加が認められた。
【0137】
（ヒトＰＳＣ－ＣＭｓのミトコンドリア機能）
また、ヒトｉＰＳ細胞を心筋細胞へと分化誘導した後、分化誘導後１０日目に再播種し、１４日目より２週間、上述のホルモン、アゴニストで処理を行った。ここでは、脂質（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｌｉｐｉｄ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、カタログ番号１１９０５、以下「ＣＤ ｌｉｐｉｄ」という。）を加えた条件と、加えない条件とて培養した。その後、ＪＣ－１色素を用いて、活性型ミトコンドリア量の評価を行った。
また、ヒトｉＰＳ細胞を心筋細胞へと分化誘導した後、分化誘導後１０日目に再播種し、１４日目より２週間、上述のホルモン、アゴニストで処理を行った。ここでは、脂質（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｌｉｐｉｄ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、カタログ番号１１９０５、以下「ＣＤ ｌｉｐｉｄ」という。）を加えた条件と、加えない条件とて培養した。その後、ＪＣ－１色素を用いて、活性型ミトコンドリア量の評価を行った。
【0138】
図３３Ａに、このＪＣ１色素による蛍光の概念を示す。ＪＣ－１色素は、活性型のミトコンドリアで赤色蛍光を、不活性型のミトコンドリアでは緑色の蛍光を発する。
図３３Ｂにこの結果を示す。脂質（ＣＤ ｌｉｐｉｄ）を添加していない培養条件では、いずれの条件であっても、活性型ミトコンドリアの割合が少なかった。一方、ＣＤ ｌｉｐｉｄを培地の１／１００量、１０時間添加することで、活性型：不活性型ミトコンドリア比は逆転し、多くが活性型ミトコンドリアとなった。
図３３Ｃは、図３３ＢのＴ３＋ＨＣの結果を示す結果のプロットである。「Ｇ」が活性型ＪＣ－１、「Ｉ」が不活性型ＪＣ－１の割合を示す。
図３３Ｂにこの結果を示す。脂質（ＣＤ ｌｉｐｉｄ）を添加していない培養条件では、いずれの条件であっても、活性型ミトコンドリアの割合が少なかった。一方、ＣＤ ｌｉｐｉｄを培地の１／１００量、１０時間添加することで、活性型：不活性型ミトコンドリア比は逆転し、多くが活性型ミトコンドリアとなった。
図３３Ｃは、図３３ＢのＴ３＋ＨＣの結果を示す結果のプロットである。「Ｇ」が活性型ＪＣ－１、「Ｉ」が不活性型ＪＣ－１の割合を示す。
【0139】
次に、これらの各処理後の細胞について、上述のマウスＰＳＣ－ＣＭｓと同様にＯＣＲを調べた。ここでは、ヒトｉＰＳ細胞を心筋細胞へと分化誘導した後、分化誘導後１０日目に再播種し、１４日目より２週間、記載のホルモン・アゴニストに加えてＣＤ ｌｉｐｉｄ（１／１００量）を添加し培養した。
【0140】
図３４にこの結果を示す。Ｔ３＋ＳＲ＋ＧＷ＋脂質の組み合わせにより、酸素消費量（ＯＣＲ、特にＭａｘ Ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ）が増大した。このように、ホルモン、アゴニストの処理に加えて脂質を加えることで、ヒトのＰＳＣ－ＣＭｓでも心筋細胞の生理学的な機能をより向上させることが可能となった。すなわち、ヒト細胞でも、十分な成熟度が得られた。
【0141】
なお、上記実施の形態の構成及び動作は例であって、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更して実行することができることは言うまでもない。
【産業上の利用可能性】
【0142】
本発明によれば、心筋細胞の成熟方法により実際に成熟した心筋細胞を提供し、これを移植医療や創薬支援等に用いることができ、産業上利用可能である。
【符号の説明】
【0143】
１ 心筋細胞成熟度評価装置
１０ 制御部
１１ 記憶部
１２ 入力部
１３ 表示部
１００ 評価部
１１０ トランスクリプトームデータ
１２０ 結果データ
１３０ 心筋細胞成熟度評価プログラム
１０ 制御部
１１ 記憶部
１２ 入力部
１３ 表示部
１００ 評価部
１１０ トランスクリプトームデータ
１２０ 結果データ
１３０ 心筋細胞成熟度評価プログラム
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図10E】
【図10F】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図13D】
【図13E】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20A】
【図20B】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25A】
【図25B】
【図25C】
【図26A】
【図26B】
【図27A】
【図27B】
【図27C】
【図27D】
【図27E】
【図27F】
【図27G】
【図28】
【図29】
【図30A】
【図30B】
【図30C】
【図30D】
【図30E】
【図31A】
【図31B】
【図31C】
【図31D】
【図31E】
【図31F】
【図31G】
【図31H】
【図31I】
【図31J】
【図32】
【図33A】
【図33B】
【図33C】
【図34】