特許 7514633 細胞培養用添加剤、培地および細胞の培養方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-07-03

(45)【発行日】2024-07-11

(54)【発明の名称】細胞培養用添加剤、培地および細胞の培養方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20240704BHJP

   C12N 1/00 20060101ALI20240704BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10

C12N1/00 F

【請求項の数】 12

(21)【出願番号】P 2020037957

(22)【出願日】2020-03-05

(65)【公開番号】P2021136933

(43)【公開日】2021-09-16

【審査請求日】2023-02-07

(73)【特許権者】

【識別番号】390008497

【氏名又は名称】日本電熱株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110001195

【氏名又は名称】弁理士法人深見特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】門 雅莉

(72)【発明者】

【氏名】田口 秀典

【審査官】坂崎 恵美子

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１５－２２４２０４（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１７／００２７６７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２０２０－０５８３２３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１２－１２０５２９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１１－５０９１２８（ＪＰ，Ａ）

【文献】Stem Cells，2017年，Vol.25, No.12，pp.3005-3015

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ ５／００－５／２８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

魚鱗爆砕物の成分を含む細胞培養用添加剤であって、
前記成分は、
魚鱗を温度が１５０℃～２５０℃、３分以上１５分以下の条件で加圧蒸煮処理して前記魚鱗爆砕物を得る処理工程と、
前記魚鱗爆砕物にエタノールを添加して前記成分を析出させる析出工程と、により得られ、
前記魚鱗はバラマンディ由来であり、
前記細胞培養用添加剤は、幹細胞の未分化維持に用いられ、
前記幹細胞は、人工多能性幹細胞である、細胞培養用添加剤。

【請求項2】

前記魚鱗爆砕物は、魚鱗水蒸気爆砕物である、請求項１に記載の細胞培養用添加剤。

【請求項3】

前記加圧蒸煮処理は、１５０℃～２５０℃、５分以上１５分以下の条件で実施される、請求項１または２に記載の細胞培養用添加剤。

【請求項4】

液体または粉末である、請求項１～３のいずれか１項に記載の細胞培養用添加剤。

【請求項5】

前記加圧蒸煮処理は、１９０℃～２００℃、５分以上１５分以下の条件で実施される、請求項１～４のいずれか１項に記載の細胞培養用添加剤。

【請求項6】

魚鱗爆砕物の成分を含む培地であって
前記成分は、
魚鱗を温度が１５０℃～２５０℃、３分以上１５分以下の条件で加圧蒸煮処理して前記魚鱗爆砕物を得る処理工程と、
前記魚鱗爆砕物にエタノールを添加して前記成分を析出させる析出工程と、により得られ、
前記魚鱗はバラマンディ由来であり、
前記培地全体の質量に対して、前記魚鱗爆砕物を０．６２５質量％以上２．５質量％以下含み、
前記培地は、幹細胞の未分化維持に用いられ、
前記幹細胞は、人工多能性幹細胞である、培地。

【請求項7】

前記魚鱗爆砕物は、魚鱗水蒸気爆砕物である、請求項６に記載の培地。

【請求項8】

前記加圧蒸煮処理は、１５０℃～２５０℃、５分以上１５分以下の条件で実施される、請求項６または７に記載の培地。

【請求項9】

前記加圧蒸煮処理は、１９０℃～２００℃、５分以上１５分以下の条件で実施される、請求項６～８のいずれか１項に記載の培地。

【請求項10】

前記培地全体の質量に対して、前記魚鱗爆砕物を１．２５質量％以上２．５質量％以下含む、請求項６～９のいずれか１項に記載の培地。

【請求項11】

請求項６～１０のいずれか１項に記載の培地を用いる、細胞の培養方法。

【請求項12】

継代せずに４日以上培養を行う、請求項１１に記載の培養方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞培養用添加剤、培地および細胞の培養方法に関する。

【背景技術】

【0002】

幹細胞を生体外で培養する場合に、未分化状態が維持されずに分化が進んでしまうと、目的の細胞に分化させることができず、特定の組織や臓器を製造することが難しい。幹細胞を再生医療等に利用するためには、未分化な状態を維持させたまま幹細胞を増殖させることが重要である。

【0003】

幹細胞を未分化状態を維持したまま培養する方法として、サイトカインを用いる方法がある。例えばマウスＥＳ細胞は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）を培地に添加することによって、未分化状態を維持することができる。霊長類のＥＳ細胞および体性幹細胞等の一部の幹細胞はＬＩＦのみでは未分化状態を維持することができず、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）等をさらに培地に添加することによって、未分化状態が維持される。しかしながら、サイトカインは高価であり、採取原料や保存性等の問題もあり、継続的に使用することは難しい。そこで、安価かつ効率的に幹細胞の未分化状態を維持することができる技術が求められている。特許文献１～３には、幹細胞の未分化状態を維持するための技術が開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【文献】特開２０１８－３０７８７号公報

【文献】国際公開第２０１５／１１１７３４号

【文献】特開２０１３－２４７９４３号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

特許文献１には、魚類の動脈球由来のエラスチンペプチドを有効成分として含有する幹細胞の未分化状態維持剤が開示されている。しかし、エラスチンペプチドの原料となる動脈球は、例えばカツオ１匹から１個（数グラム）しか採れない。特許文献２には、ナノファイバー形状の多糖類を用いて間葉系幹細胞の未分化を維持する方法が開示されている。しかし、未分化維持培養という目的を果たすために、ナノファイバーの形状を特定の平均粒子径、平均繊維径、平均繊維長、平均繊維長／平均繊維径比となるように微細化する必要があり、煩雑な作業が必要であると考えられる。特許文献３には、ゼラチンナノファイバーを架橋した基材の上で多能性幹細胞の未分化維持培養を行う方法が開示されているが、基材の作製には、ゼラチンをエレクトロスピニング法によりナノファイバー化する等、特殊な操作を必要とする。

【0006】

本発明は、幹細胞の未分化状態を維持することができる新規の細胞培養用添加剤および培地、ならびに細胞の培養方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明は、以下に例示される［１］～［１４］に関する。
［１］魚鱗爆砕物を含む細胞培養用添加剤。
［２］前記魚鱗爆砕物は、魚鱗水蒸気爆砕物である、［１］に記載の細胞培養用添加剤。
［３］前記魚鱗は、バラマンディ由来である、［１］または［２］に記載の細胞培養用添加剤。
［４］液体または粉末である、［１］～［３］のいずれかに記載の細胞培養用添加剤。
［５］幹細胞の未分化維持に用いられる、［１］～［４］のいずれかに記載の細胞培養用添加剤。
［６］魚鱗爆砕物を含む培地。
［７］前記魚鱗爆砕物は、魚鱗水蒸気爆砕物である、［６］に記載の培地。
［８］前記魚鱗は、バラマンディ由来である、［６］または［７］に記載の培地。
［９］培地全体の質量に対して、前記魚鱗爆砕物を０．１質量％以上１０質量％以下含む、［６］～［８］のいずれかに記載の培地。
［１０］幹細胞の未分化維持に用いられる、［６］～［９］のいずれかに記載の培地。
［１１］前記幹細胞は多能性幹細胞である、［１０］に記載の培地。
［１２］前記多能性幹細胞は、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞である、［１１］に記載の培地。
［１３］［６］～［１２］のいずれかに記載の培地を用いる、細胞の培養方法。
［１４］継代せずに４日以上培養を行う、［１３］に記載の培養方法。

【発明の効果】

【0008】

本発明によれば、幹細胞の未分化状態を維持することができる新規の細胞培養用添加剤および培地、ならびに細胞の培養方法を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】水蒸気爆砕装置の一例を示す概略図である。

【図2】魚鱗から魚鱗爆砕物およびその精製物を得る工程の例を示す図である。

【図3】実施例において、魚鱗爆砕物を製造した工程を示す図である。

【図4】実験１で得られた、ｉＰＳ細胞の光学顕微鏡画像である。Ａ：２．５質量％、Ｂ：１．２５質量％、Ｃ：０．６２５質量％、Ｄ：０質量％の魚鱗爆砕物を含む未分化維持培地で細胞を培養した。

【図5】実験２で得られた、ｉＰＳ細胞のコロニーのＡＬＰ染色画像である。Ａ：２．５質量％、Ｂ：１．２５質量％、Ｃ：０．６２５質量％、Ｄ：０．３１２質量％、Ｅ：０質量％の魚鱗爆砕物を含む未分化維持培地で細胞を培養した。

【図6】実験３で得られた、魚鱗爆砕物を含む未分化維持培地で７日間、１４日間または２１日間培養したｉＰＳ細胞のＯｃｔ３／４（上段）、Ｎａｎｏｇ（中段）、Ｓｏｘ２（下段）のｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。

【図7】実験４で得られた、ｉＰＳ細胞のコロニーのＯｃｔ４の免疫染色画像（左）および核染色画像（右）である。Ａ－１，Ａ－２は２．５質量％、Ｂ－１，Ｂ－２は１．２５質量％、Ｃ－１，Ｃ－２は０．６２５質量％、Ｄ－１，Ｄ－２は０質量％の魚鱗爆砕物を含む未分化維持培地で細胞を培養したときの染色画像である。

【図8】実験５で得られた、１４日間の未分化維持培養後に継代し、１日目のｉＰＳ細胞の光学顕微鏡画像である。ＡおよびＢは１．２５質量％、ＣおよびＤは０質量％の魚鱗爆砕物を含む未分化維持培地で培養を行った。ＡおよびＢ、並びにＣおよびＤは、それぞれの条件で培養されたｉＰＳ細胞の代表的なコロニーである。

【図9】実験６で得られた、１４日間の未分化維持培養後に継代し、４日目のｉＰＳ細胞のＯｃｔ３／４（上段）、Ｎａｎｏｇ（中段）、Ｓｏｘ２（下段）のｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0010】

［細胞培養用添加剤］
本発明に係る細胞培養用添加剤は、魚鱗爆砕物を含む。本発明に係る細胞培養用添加剤の存在下で培養した幹細胞は、未分化状態が維持されやすいため、本発明に係る細胞培養用添加剤は、幹細胞の未分化維持のための添加剤として用いることができる。

【0011】

「幹細胞の未分化状態が維持されている」とは、幹細胞が分化能を保持したまま増殖できることを意味する。幹細胞が未分化状態を維持しているかどうかは、例えば後述の実施例に示すように幹細胞の未分化マーカーのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現量を検出することによって評価できる。多能性幹細胞の未分化マーカーとしては、例えばＯｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２等が挙げられる。ｍＲＮＡの発現量測定方法としては、例えばＲＴ－ＰＣＲ、定量ＰＣＲ、ノーザンブロッティング等の方法が挙げられる。タンパク質の発現量測定方法としては、例えば抗体を用いたＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、ウエスタンブロッティング等の免疫学的方法が挙げられる。本発明に係る細胞培養用添加剤の存在下で幹細胞を培養した場合に、細胞培養用添加剤を用いなかった場合に比べて、幹細胞の未分化マーカーの発現量が高く維持されていれば、本発明に係る細胞培養用添加剤が幹細胞の未分化維持能を有すると評価することができる。

【0012】

魚鱗爆砕物は，魚鱗を爆砕したものであれば爆砕方法は特に限定されないが、短時間で低分子に爆砕できる観点から水蒸気爆砕物であることが好ましい。魚鱗水蒸気爆砕物は、魚鱗を飽和水蒸気下で加圧蒸煮処理した後、大気圧に開放して爆砕することで得ることができる。魚鱗を圧力容器に入れ、高圧・高温の水蒸気で蒸煮すると、魚鱗の組織内に水蒸気が浸透する。その後、瞬時に圧力を開放すると、水蒸気が急激に膨張し、魚鱗は粉砕される。魚鱗水蒸気爆砕物は、例えば国際公開第２０１７／００２７６７号に記載の方法によって得ることができる。

【0013】

図１に爆砕装置の一例として水蒸気爆砕装置１０の概略を示す。図１を用いて、魚鱗爆砕物を得る方法を具体的に例示する。水蒸気爆砕装置１０は公知のものであってよく、例えば日本電熱株式会社製の爆砕装置を用いることができる。

【0014】

純水器１３によってナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどの不純物が除去された水は、ポンプ１４によってボイラ１２に送り込まれ、高温・高圧の水蒸気となる。
水蒸気爆砕物の原料である魚鱗は、ホッパー１６からリアクター１５に投入される。このとき、バルブ１７は開、バルブ１８、１９は閉となっている。所定量の魚鱗がリアクター１５内に投入されると、バルブ１７は閉じられる。ボイラ１２に接続されるバルブ１８が開けられると、リアクター１５内に高温・高圧の蒸気が導入され、所定時間、加圧蒸煮処理がなされる。その後、バルブ１８は閉じられる。
バルブ１９が開かれると、魚鱗はパイプ２０を通じて受け槽２１内に急激に排出される。魚鱗は受け槽２１内で急激に大気下におかれ、爆砕処理される。受け槽２１は、サイレンサー２２を備えていてもよい。水蒸気爆砕された魚鱗は取り出し口２３から取り出される。

【0015】

魚鱗は、コラーゲンおよびリン酸カルシウム（灰分）を主成分として含むと考えられる。魚鱗爆砕物は、好ましくはコラーゲン、ゼラチン、コラーゲンペプチドおよびその他のコラーゲン分解物からなる群より選ばれる少なくとも１つを含むと考えられる。コラーゲンは動物の体を構成する主要なタンパク質であり、約１０万の分子量をもつ３本のポリペプチド鎖（α鎖、β鎖等）で構成されている。コラーゲンは水に溶けにくく、低温で粘稠である。コラーゲンを加熱変性させて、コラーゲンの立体構造や分子量が変化したものがゼラチンである。ゼラチンの分子量は数万～数十万程度であり、温めれば水に溶け、冷却すればゲル状になる。ゼラチンの分子量をさらに小さくしたものがコラーゲンペプチドである。コラーゲンペプチドの分子量は数百～数千程度であり、水溶性が向上している。

【0016】

加圧蒸煮処理の際に、圧力、時間、温度等の条件を変えることによって、コラーゲンの状態が異なる爆砕物を得ることができる。処理温度は例えば１５０℃～２５０℃であってもよく、１８０℃～２２０℃であってもよい。処理温度は例えば３０秒～１時間であってよく、１分～３０分であってもよい。処理条件が穏やかなときには、魚鱗は比較的高分子の物質に分解される。このとき、魚鱗爆砕物に含まれるコラーゲンの分子量は大きく、例えばゼラチンを多く含むゲル状の爆砕物が得られる。処理条件が中程度のときには、魚鱗は中程度の大きさの分子に分解される。このとき、魚鱗爆砕物に含まれるコラーゲンは中程度の大きさになり、粘性を有する液状の爆砕物が得られる。処理条件が厳しいときには、魚鱗は低分子の物質に分解される。このとき、魚鱗爆砕物に含まれるコラーゲンの分子量は小さくなり、例えばコラーゲンペプチドを多く含む液状の爆砕物が得られる。

【0017】

爆砕物は、必要に応じて精製されてもよく、例えば脱色の目的で過酸化水素処理をしたり、脱色や脱臭の目的で活性炭を使用したり、不純物や未分解物を除去する目的で遠心分離操作を行ってもよい。イオン交換樹脂、エタノール等を用いて精製してもよい。爆砕物は、液体であってもよいが、保管および運搬の取り扱い性を考慮して、固体としてもよい。固体としては、例えば液体を乾燥させて得た粉末であってもよい。乾燥方法は特に限定されず、凍結乾燥、熱風乾燥、噴霧乾燥等を行えばよい。

【0018】

ゼラチンおよびコラーゲンペプチドを工業的に生産する際の原料は、主に牛骨、牛皮、豚皮、鶏骨などの動物由来の原料が用いられてきた。しかし、Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ（ＢＳＥ）や鳥インフルエンザ等の人獣共通感染症が問題となっている。魚類由来のコラーゲンを使用することは、感染症の観点からも好ましい。また、一部の地域では、哺乳類（特にブタ）由来の物質を含む製品は使用に制限があるが、魚類由来の物質はハラール市場においても展開可能である。

【0019】

魚鱗としては、バラマンディ、テラピア、タイ等海水魚または淡水魚の魚鱗を原料として使用できる。一般に、魚類のコラーゲンの変性温度は３０℃以下であり、哺乳類のコラーゲンの変性温度（３７℃～４０℃）に比べて低い。添加剤の原料となる魚鱗としては、変性温度が比較的高いコラーゲンを含む魚鱗を用いることが好ましい。スズキ目アカメ科に属するバラマンディは、コラーゲンの変性温度が約３７℃と高く、扱いやすい。バラマンディはインド太平洋の熱帯域に分布する大型肉食魚であり、東南アジアでは食用のため養殖が行われている。バラマンディの魚鱗は、加工現場で廃棄物として生じるため、安価に入手することが可能である。

【0020】

魚鱗を原料とする爆砕物は、魚皮を原料とした爆砕物に比べて、臭いが生じにくい。

【0021】

魚鱗としては、魚鱗に含まれるカルシウム成分などを化学的に除去する脱灰処理をあらかじめ行った魚鱗を用いてもよい。脱灰処理の方法は特に限定されないが、例えば洗浄した魚鱗を希塩酸に数時間から２日間程度浸漬させる方法が挙げられる。脱灰処理を行った魚鱗を原料とした場合、好ましい加圧蒸煮処理の条件は、脱灰処理を行っていない魚鱗を原料とした場合とは異なり得る。

【0022】

培養される細胞は、特定の種類に限定されるものではないが、好ましくは真核生物であり、動物細胞が含まれる。細胞は幹細胞であってもよい。未分化維持される幹細胞は、分化能、および未分化状態のまま増殖できる自己増殖能を有する未分化細胞であれば特に限定されない。幹細胞としては、分化能力に応じて、多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、複能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、単能性幹細胞（ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）等が含まれる。本発明に係る細胞培養用添加剤が適用される幹細胞は、好ましくは多能性幹細胞である。

【0023】

多能性幹細胞としては、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞の他、始原生殖細胞に由来する胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、精巣組織から作製されるＧＳ細胞の樹立培養工程で単離されるｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ（ｍＧＳ細胞）、骨髄から探知されるｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ａｄｕｌｔ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ（ＭＡＰＣ）等が含まれる。多能性幹細胞は、好ましくはＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である。

【0024】

多能性幹細胞は、多能性幹細胞が樹立可能な任意の動物から樹立されたものであってよい。多能性幹細胞は、例えばマウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー等の霊長類等由来の多能性幹細胞であり、好ましくは霊長類由来の多能性幹細胞である。再生医療に用いられる場合は、好ましくはヒトｉＰＳ細胞である。

【0025】

本発明に係る細胞培養用添加剤は、細胞の培養に用いられる培地、基質（基材）、その他の材料に添加して用いることができる。本発明に係る細胞培養用添加剤の存在下で培養した幹細胞は未分化状態が維持されやすいことから、本発明に係る細胞培養用添加剤は、幹細胞の未分化維持培地、幹細胞の未分化維持に用いられる基質等に添加されることが好ましい。

【0026】

細胞培養用添加剤が培地に添加されるとき、培地に含まれる魚鱗爆砕物の濃度は、細胞の培養が可能な範囲で適宜設定することができるが、幹細胞の未分化状態を効果的に維持する観点からは、終濃度（使用時）において、例えば培地全体の質量に対して０．１質量％以上１０質量％以下であり、好ましくは０．５質量％以上であり、より好ましくは１．０質量％以上であり、好ましくは８質量％以下であり、より好ましくは５質量％以下である。

【0027】

培地は細胞の培養、特に幹細胞の未分化維持培養に一般に使用されている培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば細胞の生存および増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン、脂肪酸）を含む培地、具体的には、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｄ－ＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ １６４０、Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ）、ＢＧｊＢ培地、ＣＭＲＬ １０６６培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ－１２（Ｄ－ＭＥＭ／Ｆ－１２）、Ｇｌａｓｇｏｗ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ）、ハンクス液（Ｈａｎｋ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地等が挙げられる。

【0028】

培地には、必要に応じて、ｂＦＧＦ、ＬＩＦ、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ビタミン類、インターロイキン類、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン、ヘパラン硫酸、フィブロネクチン、プロゲステロン、セレナイト、Ｂ２７－サプリメント、Ｎ２－サプリメント、ＩＴＳ－サプリメント、抗生物質、脂肪酸または脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、抗酸化剤、２－メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有してもよい。

【0029】

培地は、血清含有培地であってもよく、無血清培地であってもよいが、異種成分の排除による細胞移植の安全性の確保という点からは、無血清培地であることが好ましい。ここで、無血清培地とは、無調整または未精製の血清を含まない培地を意味し、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）が混入している培地は無血清培地に該当するものとする。かかる無血清培地としては、例えば、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を適量（例えば、１－２０％）添加した培地、インスリンおよびトランスフェリンを添加した培地、細胞由来の因子を添加した培地等が挙げられる。

【0030】

本発明に係る細胞培養用添加剤は、基質に添加されてもよく、基質は培養器のコーティング剤として用いられ得る。培養器のコーティング方法は特に限定されないが、例えば培養器の細胞が接着する部分を魚鱗爆砕物を含む基質に浸漬させて、インキュベートすればよい。基質に含まれる魚鱗爆砕物の濃度、コーティング時間、コーティング温度は適宜設定することができ、例えば基質全体の質量に対して魚鱗爆砕物を１質量％を含む基質を用いて３７℃で３０分間インキュベートすればよい。インキュベート後、基質を除いて培地を添加してもよく、基質を希釈するように培地を添加してもよい。培地は魚鱗爆砕物を含む培地であってもよいし、含まない培地であってもよい。

【0031】

［培地］
本発明に係る培地は、魚鱗爆砕物を含む。魚鱗爆砕物を含む培地は、幹細胞の未分化状態を維持することができる。魚鱗爆砕物を含む培地は、上述の細胞培養用添加剤が添加された培地であってよい。魚鱗爆砕物は、上述の魚鱗爆砕物であってよい。培地は、好ましくは魚鱗爆砕物を培地全体の質量に対して０．１質量％以上１０質量％以下含む。幹細胞は上述の多能性幹細胞であってよく、好ましくはＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である。

【0032】

［細胞の培養方法］
本発明に係る細胞の培養方法は、魚鱗爆砕物を含む上述の培地を用いて細胞を培養する工程を含む。本発明に係る細胞の培養方法によれば、未分化状態を維持したまま幹細胞を培養することができる。

【0033】

本発明に係る細胞の培養方法においては、継代せずに４日以上培養を継続することができる。増殖する幹細胞は、通常２日～３日おきに継代しなければ、未分化性を失いやすい。魚鱗粉砕物を含む培地を用いて幹細胞を培養すれば、長期間継代を行わない場合でも、未分化状態が維持されやすい。培養可能な期間は幹細胞の種類および培養条件によって異なるが、例えば７日以上、１４日以上、または２１日以上継代せずに、未分化状態を維持したまま培養を行うことができる。継代せずに培養を行う期間は、例えば３０日以内である。

【0034】

本発明に係る細胞の培養方法によれば、長期間継代を行わずに幹細胞の培養が行える。２日～３日おきに継代する方法と比較して継代の間隔が長くなることから、培養によって得られる幹細胞の数を多くすることができる。なお、魚鱗粉砕物を含む培地を用いて幹細胞を培養しても、従来の幹細胞の培養方法と同様に約８０回の継代を経ても、未分化状態を維持しており、良好な分化能を示す。

【0035】

細胞の培養に用いる培養器は、細胞の培養が可能なものであれば特に限定されないが、例えばディッシュ、マルチウェルプレート、フラスコ、シャーレ、チャンバースライド、チューブ、トレイ、培養バッグ、ローラーボトルなどが挙げられる。

【0036】

培養器は、細胞非接着性であっても接着性であってもよく、目的に応じて適宜選択される。細胞接着性の培養器は、細胞との接着性を向上させる目的で、細胞外マトリックス等による細胞支持用基質などで処理したものを用いてもよい。細胞支持用基質としては、例えば、コラーゲン、ゼラチン、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｄ－リジン、ラミニン、フィブロネクチンなどが挙げられる。

【0037】

培養は、フィーダー細胞を使用しても、使用しなくてもよい。再生医療に使用される細胞を培養する場合は、移植後の安全性の観点から、フィーダー細胞を使用しないこと（フィーダーフリー）が好ましい。

【0038】

細胞の播種の際の細胞密度は特に制限はないが、細胞を維持することができ、かつ増殖させることができる密度であればよい。幹細胞であれば、密度は例えば１．０×１０^２～１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２であってよく、好ましくは５．０×１０^２～５．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２であり、より好ましくは１．０×１０^３～２．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２である。

【0039】

細胞の培養条件は、細胞の培養に用いられる通常の条件に従えばよく、特別な制御は必要ではない。培養温度は、例えば約３０～４０℃であり、好ましくは３６～３７℃である。ＣＯ_２ガス濃度は、例えば約１～１０％であり、好ましくは約２～５％である。なお、培地の交換は２～３日に１回行うことが好ましく、毎日行ってもよい。培地交換には、全量培地交換、半量培地交換、培地の追加の形態が含まれる。

【0040】

図２に記載の魚鱗爆砕物の製造方法を参照して、本発明において使用され得る魚鱗爆砕物を例示する。魚鱗爆砕物としては、爆砕処理直後の物質を用いてもよいし、精製した画分を用いてもよい。

【0041】

［魚鱗爆砕物１］
魚鱗として、バラマンディ（Ｌａｔｅｓ ｃａｌｃａｒｉｆｅｒ）の魚鱗を洗浄、脱灰後に乾燥させたものを用いた。

【0042】

魚鱗を水蒸気爆砕装置に投入し、温度２００℃で１５秒、３０秒または１分間、圧力１．４５ＭＰａＧで加圧蒸煮処理を行った。魚鱗を爆砕後、魚鱗爆砕物１が得られた。それぞれの魚鱗爆砕物１の１０倍量の蒸留水を添加して、６０℃で１０分間加熱した後、遠心分離し、上清を回収した。上清は、４℃に冷やすとゲル状になり、常温では液状であった。脱色および脱臭の目的で、上清を活性炭カラムに通し、粗精製した。カラム通過液を凍結乾燥機に設置し、凍結乾燥させた（画分１）。

【0043】

３０秒の加圧蒸煮処理を行って得られた魚鱗爆砕物１から凍結乾燥して得られた試料に２０％塩酸を添加して、１１０℃の電気炉に入れ、２４時間放置した。これにより、タンパク質がアミノ酸に分解される。この酸分解した試料をエバポレータに入れ乾燥させた。この過程で塩酸は除去される。０．０２Ｎの塩酸を加えて５０ｍＬの溶液にした後、０．２μｍのフィルターでろ過し、不純物を取り除いて得られた溶液をアミノ酸分析に供した。分析装置は、アミノ酸自動分析装置（株式会社日立ハイテクサイエンス社製Ｌ－８９００ＢＨ）を用いた。成分を分析したところ、コラーゲンに特有のアミノ酸であるヒドロキシプロリンの含有が認められた。さらに、アミノ酸の１０００残基あたりの比率を確認すると、グリシンが全体の約１／３であり、またアラニン、ヒドロキシプロリン、プロリンの合計が全体の約１／３であって、コラーゲンに特有の比率を示していた。以上の結果から、魚鱗爆砕物１にはゼラチンが含まれると考えられる。

【0044】

加圧蒸煮処理時間が１５秒の場合、魚鱗の分解は不十分であった（収率１２．９１％）。加圧蒸煮処理時間が３０秒の場合、収率は８９．４６％であり、加圧蒸煮処理時間が１分の場合、収率は８５．２９％（１回目）、６５．６３％（２回目）であった。加圧蒸煮処理時間が３０秒および１分の場合、得られた魚鱗爆砕物１は、爆砕処理直後はゲル状であった。加圧蒸煮処理時間が１分（２回目）の場合、爆砕処理直後はゲル状の魚鱗爆砕物１に加えて、液状の魚鱗爆砕物１が得られた。

【0045】

［魚鱗爆砕物１’］
魚鱗として、洗浄のみを行い、脱灰を行わないバラマンディの生鱗を用いた。魚鱗を水蒸気爆砕装置に投入し、温度１９０℃で３０秒、１分または２分間、圧力１．１５ＭＰａＧで加圧蒸煮処理を行った。魚鱗を爆砕後、魚鱗爆砕物１’が得られた。それぞれの魚鱗爆砕物１’の１０倍量の蒸留水を添加して、６０℃で１０分間加熱した後、遠心分離し、上清を回収した。上清は、４℃に冷やすとゲル状になり、常温では液体であった。脱色および脱臭の目的で、上清を活性炭カラムに通し、粗精製した。カラム通過液を凍結乾燥機に設置し、凍結乾燥させた（画分１）。

【0046】

１分間の加圧蒸煮処理を行って得られた魚鱗爆砕物１’から凍結乾燥して得られた試料を、魚鱗爆砕物１と同じ方法でアミノ酸分析に供したところ、コラーゲンに特有のアミノ酸であるヒドロキシプロリンの含有が認められた。さらに、アミノ酸の１０００残基あたりの比率を確認すると、グリシンが全体の約１／３であり、またアラニン、ヒドロキシプロリン、プロリンの合計が全体の約１／３であって、コラーゲンに特有の比率を示していた。以上の結果から、魚鱗爆砕物１’にはゼラチンが含まれると考えられる。

【0047】

１分間の加圧蒸煮処理を行って得られた魚鱗爆砕物１’から凍結乾燥して得られた試料を、カラムとしてＴＳＫｇｅｌ Ｇ２５００ＰＷＸＬ（東ソー株式会社）を用いたサイズ排除クロマトグラフィに供した。結果を表１に示す。

【0048】

【表1】

【0049】

加圧蒸煮処理時間が３０秒の場合、収率は３２．３３％であり、加圧蒸煮処理時間が１分の場合、収率は４６．２７％であり、加圧蒸煮処理時間が２分の場合、収率は５４．５７％であった。３０秒～２分の加圧蒸煮処理を行って得られた魚鱗爆砕物１’は、爆砕処理直後は液体であった。生鱗は含水率が約４９％であるため、収率の計算においては生鱗を乾燥させた時の相当重量を基準とした。生鱗を原料とする場合、加圧蒸煮処理後の処理物中に魚鱗の主な成分であるリン酸カルシウムなどが含まれるため、あらかじめ脱灰処理を行った乾燥魚鱗を原料とする場合と比較して収率が悪くなる。

【0050】

また、加圧蒸煮処理時間を１分間とし、加圧蒸煮処理温度が１７０℃の場合、収率は２１．２９％であり、加圧蒸煮処理温度が１８０℃の場合、収率は３６．６４％であり、加圧蒸煮処理温度が１９０℃の場合、収率は４６．２７％であり、加圧蒸煮処理温度が２００℃の場合、収率は２９．２９％であった。得られた魚鱗爆砕物１’は、爆砕処理直後は液体であった。

【0051】

［魚鱗爆砕物２］
魚鱗爆砕物１と同じ方法で、洗浄、脱灰した魚鱗を準備した。魚鱗を水蒸気爆砕装置に投入し、温度２００℃で２分、３分、５分、７．５分、１０分または１５分間、圧力１．４５ＭＰａＧで加圧蒸煮処理を行った。魚鱗を爆砕後、魚鱗爆砕物２が得られた。未破砕の魚鱗を遠心分離して除いた後、上清にエタノールを添加し、析出した成分を遠心分離によって沈殿させた。回収した沈殿物に蒸留水を加えて溶解した水溶液を、脱色および脱臭の目的で、活性炭カラムに通し、粗精製した。カラム通過液を凍結乾燥機に設置し、凍結乾燥させた（画分２Ａ）。

【0052】

５分間加圧蒸煮処理を行って得られた魚鱗粉砕物２から凍結乾燥して得られた試料を、魚鱗爆砕物１と同じ方法でアミノ酸分析に供したところ、コラーゲンに特有のアミノ酸であるヒドロキシプロリンの含有が認められた。さらに、アミノ酸の１０００残基あたりの比率を確認すると、グリシンが全体の約１／３であり、またアラニン、ヒドロキシプロリン、プロリンの合計が全体の約１／３であって、コラーゲンに特有の比率を示していた。魚鱗爆砕物２には、コラーゲン由来の物質（分解物）が含まれると考えられる。また、魚鱗爆砕物２には、分子量が１万以上１００万以下の物質が含まれていた。

【0053】

５分間の加圧蒸煮処理を行って得られた魚鱗爆砕物２のエタノール沈殿物に蒸留水を加えた水溶液に、有機溶剤（クロロホルム４：ブタノール１）を添加して混合した。これによりタンパク質が分離される。この混合液を遠心分離することにより、上層／中層／下層の三層に分離した。上層には多糖が、中層にはタンパク質が、下層には有機溶剤が含まれると考えられる。脱色および脱臭の目的で、上層を取り出して活性炭カラムに通し、粗精製した。カラム通過液を凍結乾燥機に設置し、凍結乾燥して固形状にした（画分２Ｂ）。
有機溶剤の代わりに、水溶液の５質量％程度の塩化カルシウムを添加してタンパク質を分離してもよい。この場合、混合物を遠心分離すると多糖溶液／タンパク質の二層に分離される。この多糖溶液を取り出して凍結乾燥すればよい。

【0054】

上層の溶液を凍結乾燥した試料をＴＳＫｇｅｌ ＧＭＰＷ_ＸＬカラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィに供したところ、分子量（数平均分子量）は、数百～数万の範囲であった。結果を表２に示す。

【0055】

【表2】

【0056】

加圧蒸煮処理時間が２分の場合、収率は６３．６６％であり、加圧蒸煮処理時間が３分の場合、収率は６５．１４％であり、加圧蒸煮処理時間が５分の場合、収率は５４．５３％であり、加圧蒸煮処理時間が７．５分の場合、収率は５３．９４％であり、加圧蒸煮処理時間が１０分の場合、収率は４４．０５％であり、加圧蒸煮処理時間が１５分の場合、収率は６１．３１％であった。５分以上の加圧蒸煮処理を行って得られた魚鱗爆砕物２は、爆砕処理直後は粘性のある液体であった。この液体は、常温および４℃でゲル化しなかった。３分以下の加圧蒸煮処理を行って得られた魚鱗爆砕物２は、液体状であったが、一部はゲル状であった。

【0057】

［魚鱗爆砕物２’］
魚鱗として、洗浄のみを行い、脱灰を行わないバラマンディの生鱗を用いた。魚鱗を水蒸気爆砕装置に投入し、温度１９０℃で５分または１０分間、圧力１．１５ＭＰａＧで加圧蒸煮処理を行った。魚鱗を爆砕後、魚鱗爆砕物２’が得られた。未破砕の魚鱗を遠心分離して除いた後、上清にエタノールを添加し、析出した成分を遠心分離によって沈殿させた。回収した沈殿物に蒸留水を加えて溶解した水溶液を、脱色および脱臭の目的で、活性炭カラムに通し、粗精製した。カラム通過液を凍結乾燥機に設置し、沈殿物を凍結乾燥させた（画分２Ａ）。

【0058】

５分間の加圧蒸煮処理を行って得られた魚鱗爆砕物２’にエタノールを添加して生じた沈殿物を、魚鱗爆砕物１と同じ方法でアミノ酸分析に供したところ、コラーゲンに特有のアミノ酸であるヒドロキシプロリンの含有が認められた。さらに、アミノ酸の１０００残基あたりの比率を確認すると、グリシンが全体の約１／３であり、またアラニン、ヒドロキシプロリン、プロリンの合計が全体の約１／３であって、コラーゲンに特有の比率を示していた。魚鱗爆砕物２’には、コラーゲン由来の物質（分解物）が含まれると考えられる。また、魚鱗爆砕物２’には、分子量が１万以上１００万以下の物質が含まれていた。

【0059】

５分間の加圧蒸煮処理を行って得られた魚鱗爆砕物２’のエタノール沈殿物に蒸留水を加えた水溶液に、水溶液の５質量％の塩化カルシウムを添加して８０℃で１時間加熱した。これによりタンパク質が分離される。この混合液を遠心分離して、上層／下層の２層に分離した。上層には多糖が、下層にはタンパク質が含まれると考えられる。上層の溶液を取り出して凍結乾燥して固形状にした（画分２Ｂ）。

【0060】

加圧蒸煮処理時間が５分の場合、収率は２２．２８％であり、加圧蒸煮処理時間が１０分の場合、収率は１６．６９％であった。５分または１０分間の加圧蒸煮処理を行って得られた魚鱗爆砕物２’は、粘性のある液体であった。魚鱗爆砕物２’は、常温および４℃でゲル化しなかった。

【0061】

また、加圧蒸煮処理温度が２１０℃、加圧蒸煮処理時間が１分のとき、収率は１７．０７％であった。得られた魚鱗爆砕物２’は、爆砕処理直後は粘性のある液体であった。

【0062】

［魚鱗爆砕物３］
魚鱗爆砕物１と同じ方法で、洗浄および脱灰した魚鱗を準備した。魚鱗を水蒸気爆砕装置に投入し、温度２００℃で２０分または３０分間、圧力１．４５ＭＰａＧで加圧蒸煮処理を行った。魚鱗を爆砕後、魚鱗爆砕物３が得られた。それぞれの魚鱗爆砕物３を遠心分離して未破砕の魚鱗沈殿物を除去し、脱色および脱臭の目的で、上清を活性炭カラムに通し、粗精製した。カラム通過液を凍結乾燥させた（画分３）。

【0063】

２０分間の加圧蒸煮処理を行って得られた魚鱗爆砕物３を、魚鱗爆砕物１と同じ方法でアミノ酸分析に供したところ、コラーゲンに特有のアミノ酸であるヒドロキシプロリンの含有が認められた。さらに、アミノ酸の１０００残基あたりの比率を確認すると、グリシンが全体の約１／３であり、またアラニン、ヒドロキシプロリン、プロリンの合計が全体の約１／３であって、コラーゲンに特有の比率を示していた。

【0064】

液状の魚鱗爆砕物３をカラムとしてＴＳＫｇｅｌ Ｇ２５００ＰＷＸＬ（東ソー株式会社）を用いたサイズ排除クロマトグラフィに供したところ、分子量（数平均分子量）は、数百～数千（低分子量）であった。結果を表３に示す。以上の結果から、魚鱗爆砕物３にはコラーゲンペプチドが含まれると考えられる。

【0065】

【表3】

【0066】

加圧蒸煮処理時間が２０分の場合、収率は７２．７５％であり、加圧蒸煮処理時間が３０分の場合、収率は６８．３１％であった。２０分または３０分間の加圧蒸煮処理を行って得られた魚鱗爆砕物３は、爆砕処理直後は液体であった。魚鱗爆砕物３は、常温および４℃でゲル化しなかった。また、液体の魚鱗爆砕物３にエタノールを添加しても沈殿物は得られなかった。

【0067】

［魚鱗爆砕物３’］
魚鱗として、洗浄のみを行い、脱灰を行わないバラマンディの生鱗を用いた。魚鱗を水蒸気爆砕装置に投入し、温度１９０℃で２０分、３０分または４０分間、圧力１．１５ＭＰａＧで加圧蒸煮処理を行った。魚鱗を爆砕後、魚鱗爆砕物３’が得られた。それぞれの魚鱗爆砕物３’を遠心分離して未破砕の魚鱗沈殿物を除去し、脱色および脱臭の目的で、上清を活性炭カラムに通し、粗精製した。カラム通過液を凍結乾燥させた（画分３）。

【0068】

２０分間の加圧蒸煮処理を行って得られた魚鱗爆砕物３’を、魚鱗爆砕物１と同じ方法でアミノ酸分析に供したところ、コラーゲンに特有のアミノ酸であるヒドロキシプロリンの含有が認められた。さらに、アミノ酸の１０００残基あたりの比率を確認すると、グリシンが全体の約１／３であり、またアラニン、ヒドロキシプロリン、プロリンの合計が全体の約１／３であって、コラーゲンに特有の比率を示していた。

【0069】

２０分間の加圧蒸煮処理を行って得られた魚鱗爆砕物３’を凍結乾燥させた粉末試料を、カラムとしてＴＳＫｇｅｌ Ｇ２５００ＰＷＸＬ（東ソー株式会社）を用いたサイズ排除クロマトグラフィに供したところ、分子量（数平均分子量）は、数百～数千（低分子量）であった。結果を表４に示す。以上の結果から、魚鱗爆砕物３’にはコラーゲンペプチドが含まれると考えられる。

【0070】

【表4】

【0071】

加圧蒸煮処理時間が２０分の場合、収率は１２．３０％であり、加圧蒸煮処理時間が３０分の場合、収率は１７．４０％であり、加圧蒸煮処理時間が４０分の場合、収率は１３．４７％であった。２０分～４０分間の加圧蒸煮処理を行って得られた魚鱗爆砕物３’は、爆砕処理直後は液体であった。魚鱗爆砕物３’は、常温および４℃でゲル化しなかった。また、液体の魚鱗爆砕物３’にエタノールを添加しても沈殿物は得られなかった。

【0072】

また、加圧蒸煮処理時間を１分として、加圧蒸煮処理温度が２２０℃の場合、収率は５．１８％であり、加圧蒸煮処理温度が２３０℃の場合、収率は１７．３５％であり、加圧蒸煮処理温度が２４０℃の場合、収率は４．４２％であった。得られた魚鱗爆砕物３’は、爆砕処理直後は粘性のある液体であった。

【実施例】

【0073】

以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【0074】

［魚鱗爆砕物］
実施例で用いた魚鱗爆砕物の製造方法を図３に示す。魚鱗としてバラマンディの魚鱗を使用した。魚鱗は冷凍保存されていたため、流水で解凍後、魚鱗を洗浄した。この工程では、魚皮および肉片を全て除去し、鱗に付着している粘性物質も取り除いた。目視で付着物が取り除かれた段階で、洗浄は完了したとみなした。

【0075】

２５０グラムの魚鱗を水蒸気爆砕装置に投入し、温度１９０℃で５分間、圧力１．１５ＭＰａＧで加圧蒸煮処理を行った。魚鱗を爆砕後、６９０～１０００ｍＬの魚鱗爆砕物が得られた。得られた魚鱗爆砕物は、常温および４℃で固化しなかった。魚鱗爆砕物を３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、未破砕の魚鱗沈殿物（固体）と上清（液体）に分けた。沈殿物が混入しないように上清を別の容器に回収した。脱色および脱臭の目的で、上清を活性炭カラムに通し、粗精製した。カラム通過液に終濃度８５体積％となるようにエタノールを添加し、ガラス棒で撹拌した。パラフィルムで容器に蓋をし、４℃または常温で一晩静置した。溶液を３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、沈殿物を回収した。沈殿物を－２０℃で２時間予備凍結させた。沈殿が十分に凍結したら、凍結乾燥機に設置し、凍結乾燥させた。約７２時間以内に、凍結乾燥が完了していることが目視で確認された。後述の実験では、魚鱗爆砕物として、凍結乾燥させた粉末試料を用いた。以下の実施例において培地に添加される魚鱗爆砕物の濃度は、培地全体の質量に対する濃度である。

【0076】

［幹細胞の前培養］
培養器は、あらかじめマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ、Ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ、ＰＭＥＦ－ＣＦＬ－Ｐ１）で被覆した。培養液はＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）に、１０％（ｖ／ｖ） ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ （ＦＢＳ、Ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ Ｉｎｃ）、０．５％（ｖ／ｖ） ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ）を添加したものを用いた。あらかじめ、Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ（Ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ） １０μｇ／ｍｌの濃度で３７℃、３時間処理したＭＥＦを凍結保存した。解凍後、ゼラチン（Ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ）コートした６ｗｅｌｌ ｄｉｓｈに３×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで細胞を播種し、６時間から一晩置いてから使用した。

【0077】

幹細胞として、ヒトｉＰＳ細胞（２５３Ｇ０、Ｋｙｏｔｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を準備した。培養液は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２に２０％（ｖ／ｖ） ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ （ＫＳＲ、ＧＩＢＣＯ）、１００μＭ Ｎｏｎ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ （ＮＥＡＡ）、２０ｍＭ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ＧＩＢＣＯ）、１００μＭ ２－ｍｅｒｃａｐｔｅｔｈａｎｏｌ（Ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ）、０．５％（ｖ／ｖ） ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｗａｋｏ、１６８－２３１９１）を添加したものを使用した。５％ＣＯ_２雰囲気下、３７℃のインキュベータ（Ｓａｎｙｏ）内でＭＥＦと共培養し、４－５日ごとに継代を行なった。

【0078】

［位相差顕微鏡下での観察］
コロニーのスクリーニングを位相差顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ ＩＸ７１）で行なった。小型で、核・細胞質比が大きい細胞がコロニーの大半を占め、コロニーの辺縁が明確で、異常な大型の細胞や紡錘形の細胞をほとんど含まないコロニーを未分化コロニーとした。

【0079】

［アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）染色による未分化性の解析］
ＡＬＰ染色にはＡＰ発色キット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、１７０６４３２）を使用した。具体的な手順を次に示す。
１）ヒトｉＰＳ細胞が接着したディッシュを３７℃の０．０２Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１回洗浄した。
２）４％ ＰＦＡ（Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ、Ｗａｋｏ）を入れて、室温で２０分間放置し、細胞を固定した。
３）室温で０．０２Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加し、５分間静置する操作を３回繰り返した。
４）ＡＰ発色キット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）中の試薬Ａ １０μＬと試薬Ｂ １０μＬとを予め希釈した発色バッファー１ｍＬに混合し、この混合液をディッシュに流し込み、室温で１５分間放置した。
５）蒸留水を添加し、３７℃で５分間静置する操作を３回繰り返すことで、発色反応の停止と洗浄を行った。
６）顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ ＩＸ７１）を使用し、４００倍で観察した。

【0080】

［Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ法による未分化性の解析］
［１］まず、以下の手順に従って、ＲＮＡを抽出した。
１）ｉＰＳ細胞が接着しているディッシュにトリゾール（ＴＲＩ Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．）１．０ｍＬを加え、ピペッティングにより細胞を剥がした。
２）細胞懸濁液を１．５ｍＬマイクロチューブに移し、室温で５分間静置した。
３）０．２ｍＬのクロロホルム（Ｗａｋｏ）を加え、３０秒間混和した後に１０分間室温で静置した。
４）卓上小型冷却遠心機（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５４１５Ｒ、エッペンドルフ社）を用いて１３５００ｒｐｍ、１５分間、４℃で遠心し、無色透明の上層（水相）、白色の中間層、赤色の下層（有機相）の三層に分離し、上層（水相）を新しいチューブに移しかえた。
５）イソプロピルアルコール（Ｗａｋｏ）を０．５ｍＬ加えて５分間混和した後、室温で１０分間静置した。
６）１３５００ｒｐｍ、１０分間、４℃で遠心し、上清を除去した。
７）７０％エタノールを加え、５分間混和し、８０００ｒｐｍ、１０分間、４℃で５分間遠心し、上清を除去した。
８）サンプルチューブを逆さにし、インキュベータ内で乾燥させた。
９）３０μＬのＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを入れ、ピペッティングした。
１０）吸光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｌｉｔｅ ＵＶ－Ｖｉｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＲＮＡの量を測定した。

【0081】

［２］続いて、ＤＮＡの除去およびＲＮＡの逆転写を、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）（タカラバイオ）を用いて行った。
１）ＤＮＡ除去反応
下記に示すゲノムＤＮＡ除去反応液（１反応当たり）を氷上で調製した。
５×ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ Ｂｕｆｆｅｒ ２．０μＬ
ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ １．０μＬ
ｔｏｔａｌ ＲＮＡ １．０μｇ
ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ｄＨ _２ Ｏ 残量
Ｔｏｔａｌ １０．０μＬ
４２℃で２分間反応（ＤＮＡ除去）を行った後、４℃で保存した。

【0082】

２）逆転写反応
下記に示す逆転写反応液を氷上で調製した。
上記１）の反応液（ゲノムＤＮＡ除去反応液） １０．０μＬ
５×ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ Ｂｕｆｆｅｒ ４．０μＬ
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ Ｉ １．０μＬ
ＲＴ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘ １．０μＬ
ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ｄＨ _２ Ｏ ４．０μＬ
Ｔｏｔａｌ ２０．０μＬ
３７℃で１５分、８５℃で５秒反応させた後、４℃で保存した。
上記１）ＤＮＡ除去反応および２）逆転写反応にはＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ Ｔｏｕｃｈ（タカラバイオ、Ｍｏｄｅｌ：ＴＰ３５０）を使用した。

【0083】

［３］Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ
逆転写反応を行った後、ＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ （Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）（タカラバイオ）を用いて、リアルタイムＰＣＲを行った。
１）下記に示すＰＣＲ反応液（１反応当たり）を調製した。
ＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ（２×） １２．５μＬ
ＰＣＲ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ） １μＬ
ＰＣＲ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ） １μＬ
上記逆転写反応液（ｃＤＮＡ液） ２μＬ
滅菌精製水 ８．５μＬ
Ｔｏｔａｌ ２５μＬ

【0084】

２）ＰＣＲ反応は、下記のシャトルＰＣＲ標準プロトコールで行った。
Ｈｏｌｄ （１Ｃｙｃｌｅ） ９５℃ ３０秒
２ＳＴＥＰ ＰＣＲ （４０Ｃｙｃｌｅ） ９５℃ ５秒
６０℃ ３０～６０秒
Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ

【0085】

ＰＣＲ反応終了後、増幅曲線と融解曲線を確認し、検量線を作成した。比較Ｃｔ法により発現量を比較した。リアルタイムＰＣＲにはＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ（タカラバイオ、Ｍｏｄｅｌ：ＴＰ８５０）を使用した。リアルタイムＰＣＲで使用したプライマーの配列を表５に示す。

【0086】

【表5】

【0087】

［免疫染色法による未分化性の解析］
１）ヒトｉＰＳ細胞が接着したディッシュを３７℃の０．０２Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１回洗浄した。
２）４％ＰＦＡ（Ｗａｋｏ、１６２－１６０６５）を入れ、室温で２０分間放置し、細胞を固定した。
３）ＰＦＡを除いた。０．０２Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加し、室温で５分間静置して洗浄する操作を３回繰り返した。
４）０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｗａｋｏ、Ａ１６０４６）を含む０．０２Ｍ ＰＢＳを添加し、室温で１５分間静置することで抗原賦活処理を行った。
５）０．０２Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加し、４分間静置する操作を３回繰り返した。
６）ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎＩ（１．５％ ｇｏａｔ ｎｏｒｍａｌ ｓｅｒｕｍ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓ－１０００）／０．０２Ｍ ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を添加し、室温で１時間以上静置した。
７）１次抗体液（Ｏｃｔ４抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、品番ＳＣ－５２７９）をｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎＩで３００倍希釈した溶液）を添加し、４℃で一晩静置した。
８）０．０２Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用い、室温で５分間放置して洗浄する操作を３回繰り返した。
以下の操作は暗室内で行った。
９）予め作成した二次抗体液（ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ－２１１２１）をｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎＩで１０００倍希釈した溶液。１００００倍希釈したＤＡＰＩを含む。）を添加し、室温にて１時間静置し、二次抗体反応を行った。
１０）０．０２Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用い、室温で５分間放置して洗浄する操作を３回繰り返した。
１１）サンプルに封入剤を１滴滴下し、カバーガラスで封入した。
１２）試料を蛍光顕微鏡（ＫＥＹＥＮＣＥ ＢＺ－Ｘ７００）にて、４００倍で観察した。

【0088】

（実験１）
魚鱗爆砕物を２．５質量％、１．２５質量％、０．６２５質量％または０質量％含む培地で、ｉＰＳ細胞を培養した。フィーダー細胞存在下で、ゼラチンでコーティングした６ｗｅｌｌ ｄｉｓｈに、３×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで細胞を播種し３７℃、５％ＣＯ_２の条件で培養した。基礎培地としては、前培養で用いた培地と同じ培地を用いた。毎日培地を交換しながら、継代を行わずに１４日間培養した。

【0089】

培養１４日目のｉＰＳ細胞の位相差光学顕微鏡画像を図４に示す。魚鱗爆砕物を２．５質量％および１．２５質量％含む培地を用いて培養されたｉＰＳ細胞は、コロニー中の細胞が小さく、丸い形状をしており、未分化状態を維持していると考えられる（図４ＡおよびＢ）。魚鱗爆砕物を０．６２５質量％含む培地を用いて培養されたｉＰＳ細胞は、一部に大型で多角形の扁平状の細胞が見られたが、多くの細胞は未分化状態を維持していると考えられる（図４Ｃ）。魚鱗爆砕物を含まない培地で培養されたｉＰＳ細胞は、大部分が分化していた（図４Ｄ）。

【0090】

（実験２）
実験１と同じ方法で、魚鱗爆砕物を２．５質量％、１．２５質量％、０．６２５質量％、０．３１２質量％または０質量％含む培地を用いて、１４日間培養したｉＰＳ細胞をＡＬＰ染色した。ＡＬＰ染色画像を図５に示す。アルカリフォスファターゼは、ＥＳ細胞、ＥＧ細胞およびｉＰＳ細胞を含む全ての多能性幹細胞で高発現しており、未分化状態で高い活性を示す未分化マーカーとして使用されている。ＡＬＰの組織学的染色によれば、多能性幹細胞の分化／未分化を容易に判断することができる。染色が薄い部分は分化したことを、染色が濃い部分は未分化であることを示す。

【0091】

魚鱗爆砕物を２．５質量％含む培地を用いて培養された幹細胞は、コロニーの大きさが少し小さいものの、コロニー全体が染色されており、未分化状態を維持していると考えられる（図５Ａ）。魚鱗爆砕物を１．２５質量％含む培地を用いて培養された幹細胞は、コロニー全体が染色されており、未分化状態を維持していると考えられる（図５Ｂ）。魚鱗爆砕物を０．６２５質量％含む培地を用いて培養された幹細胞は、コロニーの外周部で分化している細胞が見られるが、多くの細胞では未分化状態を維持していると考えられる（図５Ｃ）。魚鱗爆砕物を０．３１２質量％含む培地を用いて培養された幹細胞は、コロニーの中心部で分化している細胞が見られた（図５Ｄ）。魚鱗爆砕物を含まない培地を用いて培養された幹細胞は、コロニーが肥大化しており、コロニー外周部で分化している細胞が見られた（図５Ｅ）。

【0092】

（実験３）
実験１と同じ方法で、魚鱗爆砕物を２．５質量％、１．２５質量％、０．６２５質量％または０質量％含む培地を用いて、７日間、１４日間または２１日間継代せずにｉＰＳ細胞を培養した。培養後、Ｏｃｔ３／４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２のｍＲＮＡ発現量をリアルタイムＰＣＲにより検出した。結果を図６に示す。Ｏｃｔ３／４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２は多能性幹細胞の代表的な未分化マーカーである。

【0093】

魚鱗爆砕物を含まない培地で培養した４日目のｉＰＳ細胞でのｍＲＮＡ発現量を１とした。魚鱗爆砕物を含む培地を用いて培養されたｉＰＳ細胞は、長期間、特に１４日および２１日間培養を継続しても、Ｏｃｔ３／４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２のｍＲＮＡ発現量が高く維持されていた（図６）。魚鱗爆砕物を含まない培地を用いて培養されたｉＰＳ細胞では、魚鱗爆砕物を含む培地を用いて培養されたｉＰＳ細胞に比べて、これらの未分化マーカーの発現は低かった。

【0094】

（実験４）
実験１と同じ方法で、魚鱗爆砕物を２．５質量％、１．２５質量％、０．６２５質量％または０質量％含む培地を用いて、１４日間培養したｉＰＳ細胞を、抗Ｏｃｔ４抗体で免疫染色し、Ｏｃｔ４のタンパク質発現量を確認した。染色結果を図７に示す。Ｏｃｔ４は、ＰＯＵドメインを有する転写因子で、初期胚発生およびＥＳ細胞の多能性維持等に重要な役割を果たすことが知られている。

【0095】

魚鱗爆砕物を含む培地を用いて培養されたｉＰＳ細胞は、魚鱗爆砕物を含まない培地を用いて培養されたｉＰＳ細胞に比べて、Ｏｃｔ４陽性細胞の割合が多かった（図７）。

【0096】

実験３および実験４の結果から、魚鱗爆砕物を含む培地、特に魚鱗爆砕物を１．２５質量％および２．５質量％含む培地を用いて培養されたｉＰＳ細胞は、魚鱗爆砕物を含まない培地を用いて培養されたｉＰＳ細胞に比べて、未分化マーカーのｍＲＮＡ転写量およびタンパク質発現量が共に高く、幹細胞の未分化状態が良好に維持されていることがわかった。

【0097】

（実験５）
実験１と同じ方法で、魚鱗爆砕物を１．２５質量％または０質量％含む培地を用いて１４日間ｉＰＳ細胞を培養した後、継代を行った。フィーダー細胞存在下で、ゼラチンでコーティングした６ｗｅｌｌ ｄｉｓｈに、３×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで細胞を播種し３７℃、５％ＣＯ_２の条件で培養した。培地は、前培養で用いた培地と同じ培地を用い、魚鱗爆砕物を含まない。継代後１日目のコロニーの位相差光学顕微鏡画像を図８に示す。

【0098】

魚鱗爆砕物を１．２５質量％含む培地を用いて培養したｉＰＳ細胞は、継代後にコロニーが形成されており、形態的特徴から、未分化状態が維持されていると考えられる（図８ＡおよびＢ）。魚鱗爆砕物を含まない培地を用いて培養したｉＰＳ細胞は、継代後はコロニーが形成されず、細胞の多くは扁平な形状をしており、形態的特徴から、未分化状態が維持されていないと考えられる（図８ＣおよびＤ）。

【0099】

（実験６）
実験５で継代した細胞を４日目まで継続して培養を行い、未分化マーカーのｍＲＮＡ発現量を解析した。結果を図９に示す。魚鱗爆砕物を含まない培地で培養した４日目のｉＰＳ細胞でのｍＲＮＡ発現量を１とした。魚鱗爆砕物を含む培地を用いて培養したｉＰＳ細胞は、魚鱗爆砕物を含まない培地で培養したｉＰＳ細胞に比べて、継代後の未分化マーカー、特にＯｃｔ３／４およびＳｏｘ２の発現量が高く維持されていた。未分化マーカーの高発現維持は、魚鱗爆砕物を１．２５質量％含む培地を用いて培養したｉＰＳ細胞で特に顕著であった。

【0100】

今回開示された実施形態および実施例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。

【符号の説明】

【0101】

１０ 水蒸気爆砕装置、１２ ボイラ、１３ 純水器、１４ ポンプ、１５ リアクター、１６ ホッパー、１７，１８，１９ バルブ、２０ パイプ、２１ 受け槽、２２ サイレンサー、２３ 取り出し口。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】