特許 7515152 光学活性ヒドロキシニトリル化合物の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-07-04

(45)【発行日】2024-07-12

(54)【発明の名称】光学活性ヒドロキシニトリル化合物の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 41/00 20060101AFI20240705BHJP

   C12N 9/88 20060101ALN20240705BHJP

   C12R 1/07 20060101ALN20240705BHJP

【ＦＩ】

C12P41/00 H

C12N9/88 ZNA

C12R1:07

【請求項の数】 6

(21)【出願番号】P 2020036019

(22)【出願日】2020-03-03

(65)【公開番号】P2021136894

(43)【公開日】2021-09-16

【審査請求日】2023-01-30

(73)【特許権者】

【識別番号】515157758

【氏名又は名称】公立大学法人 富山県立大学

(74)【代理人】

【識別番号】110000109

【氏名又は名称】弁理士法人特許事務所サイクス

(72)【発明者】

【氏名】浅野 泰久

(72)【発明者】

【氏名】鄭 代軍

【審査官】松原 寛子

(56)【参考文献】

【文献】特開２００４－２４８５７２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平０９－２３４０９２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平０６－２１７７９２（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｐ ４１／００

Ｃ１２Ｎ ９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

イソキサゾリン誘導体のラセミ体にアルドキシム脱水酵素を作用させて、ラセミ体中の一方の光学活性体を選択的に開環して反応生成物中に光学活性ヒドロキシニトリル化合物を生成させる、光学活性ヒドロキシニトリル化合物の製造方法であって、
イソキサゾリン誘導体が下記一般式（１）で示される化合物であり、

【化1】

光学活性ヒドロキシニトリル化合物が下記一般式（２）で示される化合物であり、

【化2】

一般式（１）及び（２）中、
Ｒ ¹ は、
（ｉ）置換基を有してもよいフェニル基、
（ｉｉ）Ｏ，ＳおよびＮから任意に選択される同一または異なるヘテロ原子を環内に１以上有し、かつ置換基を有してもよい、単環の５員または６員の芳香族環式基、
（ｉｉｉ）置換基を有してもよい炭素数１～６の直鎖または分枝状のアルキル基、又は
（ｉｖ）置換基を有してもよいベンジル基
であり、
Ｒ ² は、水素原子であり、
アルドキシム脱水酵素は、シュードモナス・クロロラフィス（Pseudomonas chlororaphis）B23 (Oxd A)、 バシラス・エスピー（Bacillus sp.）OxB-1 (Oxd B)、若しくはロドコッカス・エスピー（Rhodococcus sp.）N-771 (Oxd RE)由来のアルドキシム脱水酵素であるか、または
配列表の配列番号１、２及び４のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して９０%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアルドキシム脱水活性を有するタンパク質である、製造方法。

【請求項2】

反応生成物中の光学活性ヒドロキシニトリル化合物と他方のイソキサゾリン誘導体を分離することを含み、
他方の光学活性体は、下記一般式（３）で示される化合物である請求項１に記載の製造方法。

【化3】

一般式（３）中、Ｒ¹及びＲ²は、一般式（１）と同義である。

【請求項3】

一般式（３）で示される化合物をアルカリで処理して一般式（４）で示される光学活性ヒドロキシニトリル化合物(但し、一般式（２）で示される光学活性ヒドロキシニトリル化合物と一般式（４）で示される光学活性ヒドロキシニトリル化合物とは、相補的なエナンチオマーである)を得ることをさらに含む、請求項２に記載の製造方法。

【化4】

一般式（４）中、Ｒ¹及びＲ²は、一般式（１）と同義である。

【請求項4】

イソキサゾリン誘導体の光学活性体にアルドキシム脱水酵素を作用させて、ヒドロキシニトリル化合物の光学活性体を生成させる、光学活性ヒドロキシニトリル化合物の製造方法であって、
イソキサゾリン誘導体の光学活性体が下記一般式（１）で示されるラセミ体の光学活性体であり、

【化5】

光学活性ヒドロキシニトリル化合物が下記一般式（２）で示される化合物であり、

【化2】

但し、一般式（１）及び（２）中、
Ｒ ¹ は、
（ｉ）置換基を有してもよいフェニル基、
（ｉｉ）Ｏ，ＳおよびＮから任意に選択される同一または異なるヘテロ原子を環内に１以上有し、かつ置換基を有してもよい、単環の５員または６員の芳香族環式基、
（ｉｉｉ）置換基を有してもよい炭素数１～６の直鎖または分枝状のアルキル基、又は
（ｉｖ）置換基を有してもよいベンジル基、
Ｒ ² は、水素原子であり、
アルドキシム脱水酵素は、シュードモナス・クロロラフィス（Pseudomonas chlororaphis）B23 (Oxd A)、 バシラス・エスピー（Bacillus sp.）OxB-1 (Oxd B)、若しくはロドコッカス・エスピー（Rhodococcus sp.）N-771 (Oxd RE)由来のアルドキシム脱水酵素であるか、または
配列表の配列番号１、２及び４のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して９０%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアルドキシム脱水活性を有するタンパク質である、製造方法。

【請求項5】

アルドキシム脱水酵素は、バシラス・エスピー（Bacillus sp.）OxB-1 (Oxd B)若しくはロドコッカス・エスピー（Rhodococcus sp.）N-771 (Oxd RE)由来のアルドキシム脱水酵素であるか、または配列表の配列番号２及び４のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して９０%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアルドキシム脱水活性を有するタンパク質である、請求項１～４のいずれかに記載の製造方法。

【請求項6】

アルドキシム脱水酵素は、バシラス・エスピー（Bacillus sp.）OxB-1 (Oxd B)由来のアルドキシム脱水酵素であるか、または配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９０%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアルドキシム脱水活性を有するタンパク質である、請求項１～４のいずれかに記載の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、光学活性ヒドロキシニトリル化合物の製造方法に関する。本発明は、アルドキシムデヒドラターゼの触媒作用により、β-ヒドロキシニトリルの両エナンチオマーを合成する新しい酵素的手法に関する。

【背景技術】

【0002】

キラルなβ-ヒドロキシニトリルは、多くの医薬品や生物学的活性分子に関与する、汎用性のあるビルディングブロックの一種である。キラルなβ-ヒドロキシニトリルは、キラルなβ-ヒドロキシル酸、β-ヒドロキシルアミン、β-アミノ酸、ラクトン、ラクタムなどに容易に変換される。

【0003】

過去数十年、キラルなβ-ヒドロキシニトリルの効率的な合成に関して、多くの研究がなされて来た。有機合成で使用される一般的な方法には、不斉変換水素化（ATH）、不斉還元、不飽和カルボニル化合物のエナンチオ選択的共役付加、遷移メタ錯体の触媒による不斉アルドール反応が含まれる(例えば、非特許文献1～3)。さらに、酵素または細胞全体を使用する、グリーンケミストリーの多くの手法が開発された。それらの内、リパーゼ、レダクターゼまたはデヒドロゲナーゼは、キラルなβ-ヒドロキシニトリル合成の生体触媒として主に使用されている(例えば、非特許文献4～8)。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【文献】T. Touge, T. Hakamata, H. Nara, T. Kobayashi, N. Sayo, T. Saito, Y. Kayaki, T. Ikariya, J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 14960-14963;

【文献】H. Vazquez-Villa, S. Reber, M. A. Ariger, E. M. Carreira, Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 8979-8981;

【文献】O. Soltani, M. A. Ariger, H. Vaeuez-Villa, E. M. Carreira, Org. Lett. 2010, 12, 2893-2895.

【文献】H. Ankati, D. Zhu, Y. Yang, E. R. Biehl, L. Hua, J. Org. Chem. 2009, 74, 1658-1662;

【文献】O. Paees, J.-E. Baevall, Adv. Synth. Catal. 2002, 344, 947-952;

【文献】S. D. Sharma, R. D. Anand, G. Kaur, Synth. Commun. 2004, 34, 1855-1862.

【文献】C. Rodriguez, W. Borzecka, J. H. Sattler, W. Kroutil, I. Lavandera, V. Gotor, Org. Biomol. Chem. 2014, 12, 673-681.

【文献】S. Kamila, D. Zhu, E. R. Biehl, L. Hua, Org. Lett. 2006, 8, 4429-4431; b) C. Mukherjee, D. Zhu, E. R. Biehl, L. Hua, Eur. J. Org. Chem. 2006, 5238-5242.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

これらの方法のほとんどすべては、ケトニトリルの還元あるいは、ラセミのヒドロキシルニトリルの光学分割反応を利用している。また、これらは比較的高価で過酷な条件でニトリル基を合成している。

【0006】

本発明は、従来の方法に比べて穏和な条件で実施できる方法であり、かつ光学分割反応を利用する必要もない、光学活性ヒドロキシニトリル化合物の製造方法の提供を目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者らは、イソキサゾリン誘導体のラセミ体にアルドキシム脱水酵素を作用させると、ラセミ体中の一方の光学活性体を選択的に開環して反応生成物中にヒドロキシニトリル化合物の光学活性体が生成することを見出して、本発明の光学活性ヒドロキシニトリル化合物の製造方法を完成させた。

【0008】

本発明は以下の通りである。
[１]
イソキサゾリン誘導体のラセミ体にアルドキシム脱水酵素を作用させて、ラセミ体中の一方の光学活性体を選択的に開環して反応生成物中に光学活性ヒドロキシニトリル化合物を生成させる、光学活性ヒドロキシニトリル化合物の製造方法。
[２]
イソキサゾリン誘導体の光学活性体にアルドキシム脱水酵素を作用させて、ヒドロキシニトリル化合物の光学活性体を生成させる、光学活性ヒドロキシニトリル化合物の製造方法。
[３]
イソキサゾリン誘導体が下記一般式（１）で示される化合物であり、

【化1】

光学活性ヒドロキシニトリル化合物が下記一般式（２）で示される化合物である、［１]に記載の製造方法。

【化2】

一般式（１）及び（２）中、
Ｒ¹は、
（ｉ）置換基を有してもよい単環、２環または３環の芳香族炭化水素基、
（ｉｉ）Ｏ，ＳおよびＮから任意に選択される同一または異なるヘテロ原子を環内に１以上有し、かつ置換基を有してもよい、単環、２環または３環の芳香族環式基、
（ｉｉｉ）置換基を有してもよい炭素数１～１５の脂肪族基、
（ｉｖ）置換基を有してもよいベンジル基、又は
（ｖ）置換基を有してもよい単環の非芳香族炭素環式基であり、
Ｒ²は、水素原子、炭素数１～１５の置換基を有してもよい脂肪族基、ハロゲン原子、又はアルコキシ基であり、
Ｒ¹及びＲ²は一緒に、炭素数５～１０である単環又は２環の芳香族環式基を形成することができ、芳香族環式基はヘテロ原子を含まない環式基であるか、又はＯ，ＳおよびＮから任意に選択される同一または異なるヘテロ原子を環内に１以上有してもよい芳香族複素環式基であってもよい。
[４]
反応生成物中の光学活性ヒドロキシニトリル化合物と他方のイソキサゾリン誘導体を分離することを含み、
他方の光学活性体は、下記一般式（３）で示される化合物である［１]又は［２］に記載の製造方法。

【化3】

一般式（３）中、Ｒ¹及びＲ²は、一般式（１）と同義である。
[５]
一般式（３）で示される化合物をアルカリで処理して一般式（４）で示される光学活性ヒドロキシニトリル化合物(但し、一般式（２）で示される光学活性ヒドロキシニトリル化合物と一般式（４）で示される光学活性ヒドロキシニトリル化合物とは、相補的なエナンチオマーである)を得ることをさらに含む、［４］に記載の製造方法。

【化4】

一般式（４）中、Ｒ¹及びＲ²は、一般式（１）と同義である。
[６]
アルドキシム脱水酵素は、シュードモナス・クロロラフィス（Pseudomonas chlororaphis）B23 (Oxd A), バシラス・エスピー（Bacillus sp.）OxB-1 (Oxd B), フサリウム・グラミネアルム（Fusarium graminearum） (Oxd FG), ロドコッカス・エスピー（Rhodococcus sp.） N-771 (Oxd RE), 又はロドコッカス・グロベルルス（Rhodococcus globerulus）(Oxd RG)由来のアルドキシム脱水酵素である、［１]～［５］のいずれかに記載の製造方法。
[７]
アルドキシム脱水酵素は、配列表の配列番号１～５のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して９０%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアルドキシム脱水活性を有するタンパク質である、［１]～［５］のいずれかに記載の製造方法。

【発明の効果】

【0009】

本発明では、アルドキシム脱水酵素を用いることで、この酵素により触媒される4,5-ジヒドロイソキサゾリン誘導体の「ワンステップ」の開環反応によって、光学活性 β-ヒドロキシニトリルを効率的に合成することができる。この方法は、シアン化物及び光学分割を用いない合成法である。

【発明を実施するための形態】

【0010】

＜光学活性ヒドロキシニトリル化合物の製造方法＞
本発明の第一の態様は、イソキサゾリン誘導体のラセミ体にアルドキシム脱水酵素を作用させて、ラセミ体中の一方の光学活性体を選択的に開環して反応生成物中に光学活性ヒドロキシニトリル化合物を生成させることを含む、光学活性ヒドロキシニトリル化合物の製造方法に関する。

【0011】

本発明の製造方法の原料となるイソキサゾリン誘導体のラセミ体は、例えば、下記一般式（１）に記載の化合物であることができる。

【化5】

【0012】

さらに、光学活性ヒドロキシニトリル化合物は下記一般式（２）に記載の化合物であることができる。

【化6】

【0013】

一般式（１）及び（２）中、Ｒ¹は、
（ｉ）置換基を有してもよい単環、２環または３環の芳香族炭化水素基、
（ｉｉ）Ｏ，ＳおよびＮから任意に選択される同一または異なるヘテロ原子を環内に１以上有し、かつ置換基を有してもよい、単環、２環または３環の芳香族環式基、
（ｉｉｉ）置換基を有してもよい炭素数１～１５の脂肪族基、
（ｉｖ）置換基を有してもよいベンジル基、又は
（ｖ）単環の非芳香族炭素環式基であり、
Ｒ²は、水素原子、炭素数１～１５の置換基を有してもよい脂肪族基、ハロゲン原子、又はアルコキシ基であり、
Ｒ¹及びＲ²は一緒に、炭素数５～１０である単環又は２環の芳香族環式基を形成することができ、芳香族環式基はヘテロ原子を含まない環式基であるか、又はＯ，ＳおよびＮから任意に選択される同一または異なるヘテロ原子を環内に１以上有してもよい芳香族複素環式基であってもよい。

【0014】

以下、Ｒ¹の例について詳述する。

【0015】

（ｉ）「置換基を有してもよい単環、２環または３環の芳香族炭化水素基」は、単環の「芳香族炭素環式基」の好ましい態様として、フェニルが挙げられる。
「２環または３環の芳香族炭素環式基」の好ましい態様としては、ナフチル、アントリル、フェナントリル等が挙げられる。「芳香族炭素環式基」は、例えば、フェニル、ナフチルであることができる。尚、有してもよい置換基についてはまとめて後述する。

【0016】

（ｉｉ）「Ｏ，ＳおよびＮから任意に選択される同一または異なるヘテロ原子を環内に１以上有し、かつ置換基を有してもよい、単環、２環または３環の芳香族環式基」における単環の芳香族複素環式基としては、５～８員が好ましく、より好ましくは５員または６員である。例えば、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアゾリル、トリアジニル、テトラゾリル、フリル、チエニル、イソオキサゾリル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、イソチアゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル等が挙げられる。２環の芳香族複素環式基としては、８～１０員が好ましく、より好ましくは９員または１０員である。例えば、インドリル、イソインドリル、インダゾリル、インドリジニル、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリル、ナフチリジニル、キノキサリニル、プリニル、プテリジニル、ベンズイミダゾリル、ベンズイソオキサゾリル、ベンズオキサゾリル、ベンズオキサジアゾリル、ベンズイソチアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾフリル、イソベンゾフリル、ベンゾチエニル、ベンゾトリアゾリル、イミダゾピリジル、トリアゾロピリジル、イミダゾチアゾリル、ピラジノピリダジニル、オキサゾロピリジル、チアゾロピリジル等が挙げられる。３環以上の芳香族複素環式基としては、例えば、カルバゾリル、アクリジニル、キサンテニル、フェノチアジニル、フェノキサチイニル、フェノキサジニル、ジベンゾフリル等が挙げられる。

【0017】

（ｉｉｉ）「置換基を有してもよい炭素数１～１５の脂肪族基」における脂肪族基は、例えばアルキルであり、炭素数１～１５のアルキルとは、好ましくは炭素数１～１０、より好ましくは炭素数１～６、さらに好ましくは炭素数１～４の直鎖または分枝状の炭化水素基を包含する。例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ－ヘキシル、イソヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル、イソオクチル、ｎ－ノニル、ｎ－デシル等が挙げられる。

【0018】

（ｉｖ）「置換基を有してもよいベンジル基」における置換基は、後述する。

【0019】

（ｖ）「置換基を有してもよい単環の非芳香族炭素環式基」は、例えば、炭素数３～１６が好ましく、より好ましくは炭素数３～１２、さらに好ましくは炭素数４～８である。例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、シクロヘキサジエニル等が挙げられる。

【0020】

Ｒ¹が有してもよい置換基は、例えば、ハロゲン、ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、シアノ、アルキル、ハロアルキル、アルキルオキシ、ハロアルキルオキシ、アルキルカルボニル、カルバモイル、およびスルファモイルからなる群から選ばれる基が挙げられる。

【0021】

「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素を包含する。特にフッ素および塩素が好ましい。

【0022】

「アルキル」とは、炭素数１～１５、好ましくは炭素数１～１０、より好ましくは炭素数１～６、さらに好ましくは炭素数１～４の直鎖または分枝状の炭化水素基を包含する。例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ－ヘキシル、イソヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル、イソオクチル、ｎ－ノニル、ｎ－デシル等が挙げられる。
「アルキル」の好ましい態様としては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチルが挙げられる。さらに好ましい態様としては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｔｅｒｔ－ブチルが挙げられる。

【0023】

「アルキルオキシ」とは、上記「アルキル」に酸素原子が結合した基を意味する。好ましくは、炭素数１～１５、好ましくは炭素数１～１０、より好ましくは炭素数１～６、さらに好ましくは炭素数１～４の直鎖または分枝状の基である。例えば、メチルオキシ、エチルオキシ、ｎ－プロピルオキシ、イソプロピルオキシ、ｔｅｒｔ－ブチルオキシ、ｎ－オクチルオキシ、ｎ－ノニルオキシ等が挙げられる。特に、メチルオキシ、エチルオキシ、ｎ－プロピルオキシ、イソプロピルオキシ等が挙げられる。

【0024】

「ハロアルキル」および「ハロアルキルオキシ」とは、上記「アルキル」および「アルキルオキシ」のアルキル部分に、任意の数の上記「ハロゲン」が置換可能な任意の位置に置換した基を意味する。好ましくは、１～１０個、より好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～３個のハロゲンで置換された基である。２以上の「ハロゲン」で置換される場合、該「ハロゲン」は同一でも異なっていてもよい。例えば、モノハロアルキル、ジハロアルキル、トリハロアルキル等が挙げられる。特に、フルオロメチル、クロロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル等が好ましい。

【0025】

一般式（１）中のＲ¹としての「置換基を有してもよい単環、２環または３環の芳香族炭化水素基」は、好ましくは、置換基としてハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルキルオキシ、ハロアルキルオキシを有してもよいフェニル基、置換基としてハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルキルオキシ、ハロアルキルオキシを有してもよいナフタレン基である。

【0026】

一般式（１）中のＲ¹としての「Ｏ，ＳおよびＮから任意に選択される同一または異なるヘテロ原子を環内に１以上有し、かつ置換基を有してもよい、単環、２環または３環の芳香族環式基」は、好ましくは、「Ｏ，ＳおよびＮから任意に選択される同一または異なるヘテロ原子を環内に１以上有し、かつ置換基を有してもよい、単環の５員または６員の芳香族環式基」である。例えば、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアゾリル、トリアジニル、テトラゾリル、フリル、チエニル、イソオキサゾリル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、イソチアゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル等が挙げられる。置換基としては、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルキルオキシ、ハロアルキルオキシなどを有することができる。

【0027】

Ｒ¹としての「置換基を有してもよい炭素数１～１５の脂肪族基」は、好ましくは炭素数１～６のアルキルであり、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ－ヘキシル、イソヘキシル、ｎ－ヘプチルであることができる。

【0028】

Ｒ¹としての「置換基を有してもよいベンジル基」は、好ましくは、無置換ベンジル基、又は置換基として、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルキルオキシ、若しくはハロアルキルオキシなどを有するベンジル基であることができる。

【0029】

Ｒ¹としての「置換基を有してもよい単環の非芳香族炭素環式基」は、好ましくは炭素数４～８である。例えば、無置換のシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、シクロヘキサジエニル等が挙げられる。置換基として、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルキルオキシ、若しくはハロアルキルオキシなどを挙げることができる。

【0030】

Ｒ²は、水素原子、炭素数１～１５の置換基を有してもよい脂肪族基、ハロゲン原子、又はアルコキシ基である。炭素数１～１５の置換基を有してもよい脂肪族基、ハロゲン原子、又はアルコキシ基は、Ｒ¹における説明と同義である。Ｒ²は、好ましくは水素原子である。

【0031】

Ｒ¹及びＲ²は一緒に、炭素数５～１０である単環又は２環の芳香族環式基を形成することができ、芳香族環式基はヘテロ原子を含まない環式基であるか、又はＯ，ＳおよびＮから任意に選択される同一または異なるヘテロ原子を環内に１以上有してもよい芳香族複素環式基であってもよい、

【0032】

単環の芳香族複素環式基としては、５～８員が好ましく、より好ましくは５員または６員である。例えば、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアゾリル、トリアジニル、テトラゾリル、フリル、チエニル、イソオキサゾリル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、イソチアゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル等が挙げられる。

【0033】

２環の芳香族複素環式基としては、８～１０員が好ましく、より好ましくは９員または１０員である。例えば、インドリル、イソインドリル、インダゾリル、インドリジニル、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリル、ナフチリジニル、キノキサリニル、プリニル、プテリジニル、ベンズイミダゾリル、ベンズイソオキサゾリル、ベンズオキサゾリル、ベンズオキサジアゾリル、ベンズイソチアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾフリル、イソベンゾフリル、ベンゾチエニル、ベンゾトリアゾリル、イミダゾピリジル、トリアゾロピリジル、イミダゾチアゾリル、ピラジノピリダジニル、オキサゾロピリジル、チアゾロピリジル等が挙げられる。

【0034】

一般式（１）で示される化合物は、より具体的には下記に示される芳香族イソキサゾリン類（Aromatic isoxazolines）であることができる。

【化7】

【0035】

一般式（１）で示される化合物は、アルドキシム脱水酵素を用いる転換反応のためには、例えば、以下の芳香環を含む化合物が基質として好ましい。5-phenyl-4,5-dihydroisoxazole, 5-(o-tolyl)-4,5-dihydroisoxazole, 5-(m-tolyl)-4,5-dihydroisoxazole, 5-(p-tolyl)-4,5-dihydroisoxazole, 5-(4-methoxyphenyl)-4,5-dihydroisoxazole, 5-(2-chlorophenyl)-4,5-dihydroisoxazole, 5-(3-chlorophenyl)-4,5-dihydroisoxazole, 5-(4-chlorophenyl)-4,5-dihydroisoxazole, 5-(thiophen-2-yl)-4,5-dihydroisoxazole, 5-benzyl-4,5-dihydroisoxazole, 5-(4-fluorobenzyl)-4,5-dihydroisoxazole, 5-(2,4,5-trifluorobenzyl)-4,5-dihydroisoxazole, 5-((perfluorophenyl)methyl)-4,5-dihydroisoxazole, 5-(furan-2-yl)-4,5-dihydroisoxazole, 5-(1H-pyrrol-2-yl)-4,5-dihydroisoxazole, 5-([1,1'-biphenyl]-4-yl)-4,5-dihydroisoxazole.

【0036】

一般式（１）で示される化合物は、より具体的には下記に示される脂肪族イソキサゾリン類（Aliphatic isoxazolines）を挙げることができる。アルドキシム脱水酵素を用いる転換反応のために好ましい脂肪族基質は、5-propyl-4,5-dihydroisoxazole, 5-butyl-4,5-dihydroisoxazoleなど である。

【0037】

光学活性ヒドロキシニトリル化合物は、下記一般式（２）に記載の化合物であることができる。

【化8】

【0038】

一般式（２）中のＲ¹及びＲ²は、一般式（１）のＲ¹及びＲ²と同義である。一般式（２）の化合物は、相補的なエナンチオマー（鏡像異性体）である。

【0039】

アルドキシム脱水酵素は、アルドキシムの脱水反応によりニトリルの合成を触媒する酵素であり、本発明においては、アルドキシム脱水活性を有する酵素であれば良い。アルドキシム脱水酵素は、、例えば、Pseudomonas chlororaphis B23 (Oxd A), Bacillus sp.OxB-1 (Oxd B), Fusarium graminearum (Oxd FG), Rhodococcus sp. N-771 (Oxd RE), Rhodococcus globerulus (Oxd RG)等由来のアルドキシム脱水酵素であることができる。また、アルドキシム脱水酵素に関しては、以下の文献を参照できる。Y. Kato et al., Biochemistry, 39, 800 (2000); Y. Kato et al.,J. Molec. Catalysis B Enzym., 6, 249 (1999); 特開平2004-248572号公報；R. Metzner et al., ChemCatChem, 6, 3105 (2014)；Y. Miao et al., ChemBioChem, 18, 451 (2017)； T. Betke et al., ChemBioChem 19, 768 (2018)。

【0040】

アルドキシム脱水酵素は、上記に示す酵素以外に、以下の文献のTable1～5に列記された種々の微生物が有するアルドキシム脱水酵素であることもでき、これら微生物又はその破砕物等をアルドキシム脱水酵素源として用いることもできる。
Y. Kato, et al., Appl. Environ. Microbiol., 66, 2290 (2000)

【表1】

【0041】

さらに、アルドキシム脱水酵素は、アルドキシム脱水活性を示す酵素であることができ、または、入手可能なデータベースにある遺伝子配列からアルドキシム脱水酵素と想定される配列をコードする遺伝子を選択し、この遺伝子を、例えば、大腸菌のような遺伝子を発現可能な宿主で発現させて得られる、アルドキシム脱水活性を有するタンパク質であってもよい。そのような、天然の酵素および大腸菌で遺伝子発現を行い生産されるアルドキシム脱水活性を有するタンパク質、あるいはその他の形態（野生型細胞、組換え細胞、固定化細胞、固定化酵素またはその他の突然変異体など）であれば、いかなる由来の酵素でも使用可能である。以下に実施例において用いた各種のアルドキシム脱水酵素の同一性とアミノ酸配列を以下に示した。OxdA、OxdB、OxdFG、OxdRE、OxdRGのアミノ酸配列はそれぞれ配列番号1～5に示す。

【0042】

アルドキシム脱水酵素は、配列表の配列番号１～５のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して９０%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアルドキシム脱水活性を有するタンパク質であることもできる。配列表の配列番号１～５のいずれかに記載のアミノ酸配列に対する同一性は好ましくは９５%以上、より好ましくは９８%以上、さらに好ましくは９８%以上である。タンパク質のアルドキシム脱水活性は、例えば、表３に記載のいずれかの基質を用いて実施例に記載の条件で測定することができる。測定条件: 20 mM 基質（例えば、5-phenyl-4,5-dihydroisoxazole）、1U タンパク質、0.05 mM FMNおよび1 mM Na₂S₂O₅ を混合し、KPB (リン酸カリウム緩衝液、pH6.0, 100 mM)、500μLの混合液として、30℃で、2時間反応する。

【0043】

【表2】

【0044】

【化9】

【0045】

イソキサゾリン誘導体のラセミ体へのアルドキシム脱水酵素の作用は、使用するアルドキシム脱水酵素の至適温度及び至適ｐＨを考慮して、温度及びｐＨを制御した条件で実施することが適当である。イソキサゾリン誘導体のラセミ体にアルドキシム脱水酵素を作用させることで、ラセミ体中の一方の光学活性体を選択的に開環して、反応生成物中に一般式（２）で示される光学活性ヒドロキシニトリル化合物を生成させることができ、反応生成物中には、開環せずに残存する他方のイソキサゾリン誘導体も含まれる。

【0046】

本発明の第一の態様では、反応生成物中の一般式（２）で示される光学活性ヒドロキシニトリル化合物と開環せず残存する他方のイソキサゾリン誘導体を分離することを含むことができる。他方のイソキサゾリン誘導体は、下記一般式（３）で示される化合物である。一般式（２）で示される光学活性ヒドロキシニトリル化合物と一般式（３）で示されるイソキサゾリン誘導体の分離は、例えば、クロマトグラフィなどにより行うことができる。分離される一般式（３）で示されるイソキサゾリン誘導体もまた、優れた光学活性化合物である。

【0047】

【化10】

一般式（３）中、Ｒ¹及びＲ²は、一般式（１）と同義である。

【0048】

一般式（２）で示される光学活性ヒドロキシニトリル化合物から分離された一般式（３）で示されるイソキサゾリン誘導体は、アルカリで処理することで、一般式（４）で示される光学活性ヒドロキシニトリル化合物を得ることができる。アルカリ処理は、室温において、ＮａＯＨなどのアルカリ金属水酸化物を含有するアルコール溶媒（例えば、メタノール）中で容易に行うことができ、エナンチオマー過剰率 （ee ）は、低下することなく維持することができる。

【0049】

【化11】

一般式（４）中、Ｒ¹及びＲ²は、一般式（１）と同義である。

【0050】

【化12】

【0051】

一般式（２）で示される光学活性ヒドロキシニトリル化合物と一般式（４）で示される光学活性ヒドロキシニトリル化合物とは、相補的なエナンチオマー（鏡像異性体）である。

【0052】

本発明は、下記の式１の一般式（２）および（４）を有するβ－ヒドロキシニトリル合成のための新しい酵素的方法に関するものである。

【0053】

【化13】

【0054】

下記の式２は、一般式（１）で示される化合物のＲ¹及びＲ²が一緒に芳香族環式基を形成した場合である一般式（５）で示されるイソキサゾリン誘導体を原料とする場合の反応スキームである。一般式（５）で示されるイソキサゾリン誘導体のラセミ体にアルドキシム脱水酵素を作用させることで、ラセミ体中の一方の光学活性体を選択的に開環して、反応生成物中に一般式（６）で示される光学活性ヒドロキシニトリル化合物を生成させることができ、反応生成物中には、開環せずに残存する一般式（７）で示される他方のイソキサゾリン誘導体も含まれる。分離される一般式（７）で示されるイソキサゾリン誘導体もまた、優れた光学活性化合物である。

【0055】

一般式（７）で示される他方のイソキサゾリン誘導体は、アルカリで処理することで、一般式（８）で示される光学活性ヒドロキシニトリル化合物を得ることができる。アルカリ処理は、室温において、アルカリ条件で容易に行うことができ、エナンチオマー過剰率（ee）は、低下することなく維持することができる。一般式（６）で示される光学活性ヒドロキシニトリル化合物と一般式（８）で示される光学活性ヒドロキシニトリル化合物とは、相補的なエナンチオマー（鏡像異性体）である。

【0056】

本発明の第二の態様は、イソキサゾリン誘導体の光学活性体にアルドキシム脱水酵素を作用させて、ヒドロキシニトリル化合物の光学活性体を生成させる、光学活性ヒドロキシニトリル化合物の製造方法に関する。この態様では、光学活性イソキサゾリン誘導体にアルドキシム脱水酵素を作用させて、イソキサゾリン誘導体を開環して、光学活性ヒドロキシニトリル化合物を生成させる。原料に用いる光学活性イソキサゾリン誘導体は、使用するアルドキシム脱水酵素が基質として認識する化合物である。

【0057】

本発明の製造方法により合成される光学活性β-ヒドロキシニトリルは、例えば、下記のスキームに例示するように、種々の化合物の合成原料となり得る。

【0058】

【化14】

【0059】

以下に実施例で得られた結果を一覧表として示す。

【化15】

【0060】

【表3】

【0061】

[a] Oxd Aを用いる反応は、10U Oxd A、20 mM 基質、および4 mM Na₂S₂O₄を混合して100 mM KPB緩衝液 (pH 7.0) と共に500μLとした。この混合物を30℃で3時間反応した(n = 2); Oxd Bを用いる反応は、20U OxdB、20 mM 基質、0.05 mM FMN、および1mM Na₂S₂O₅を混合して100 mM KPB緩衝液 (pH6.0) と共に500μLとした。この混合物を30℃で2時間反応した(n = 2); Oxd RE用いる反応は、1U -RE、6 mM 基質、1 mMおよびNa₂Sを混合して100 mM KPB 緩衝液 (pH 7.0)と共に500μLとした。この混合物を30℃で2時間反応した(n = 2)。[b] 転換率は次の式を用いて算出した、転換率 = ee_s/(ee_s+ee_p) [c] エナンチオマー過剰率（ee）はキラルカラムを用いる HPLC あるいはGCを用いた。[d] 1m～1s (entry 13～entry 19) については、43U Oxd-B、10 mM 基質、0.25 mM FMN および1 mM Na₂S₂O₅を混合して、100 mM KPB 緩衝液 (pH6.0)と共に500μLとして、30℃で5時間反応した。[e] 1tの基質については、20U Oxd-B、20 mM 基質, 0.05 mM FMNおよび1 mM Na₂S₂O₅を混合して、100 mM KPB 緩衝液 (pH6.0) と共に500μLとして、30℃で2時間反応した。[f] 生成物は本分析方法では分離しなかった(本テストでは4種類のGCカラムを用いた。

【実施例】

【0062】

以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。但し、実施例は本発明の例示であって、本発明は実施例に限定される意図ではない。

【0063】

実施例 1: S(R)-3-hydroxy-3-phenylpropanenitrile および (S)-5-phenyl-4,5-dihydroisoxazoleの合成

【化16】

【0064】

１．Bacillus sp. OxB-1由来のアルドキシム脱水酵素（OxdB）
OxdBは、PET22bのベクターでBL21（DE3）で効率よく過剰発現させることができる。OxdBの生産では、Oxd Bの組換え体を5 mL LB培地に接種して37℃、300 rpmで一晩培養し、その後、1.4 L TB培地に形質転換してさらに30℃、150 rpmで12時間培養した。 その後、1 mM IPTGを添加して、26℃、120 rpmで24時間タンパク質発現を誘導した。細胞を遠心分離（6000 xg、4℃、15分）で回収し、ペレットを300 mM NaClおよび 20 mM イミダゾールを含むTris-HCl（pH 8.0、20 mM）緩衝液に再懸濁した。超音波処理（氷冷下、15分間）を行い、遠心分離（20000 xg、30分、4℃）により、細胞残を除去し、上清をニッケルセファロース ファースト フローカラムに吸着させた。赤色をした酵素画分を回収し、KPB（リン酸カリウム緩衝液、pH7.0、20 mM）に対して透析した。酵素溶液は、次の反応のために保存した。

【0065】

２．基質である、5-phenyl-4,5-dihydroisoxazoleは、styreneおよびnitromethaneから合成した。すなわち、20.8 g styrene, 12.6 g nitromethane および20.2 g triethylamine (TEA) を、200 mL のトルエンに溶解し、そこに、21.6 g trimethylchlorosilicane を室温でゆっくりと添加した。その溶液を室温で約16時間攪拌後、3時間加熱した。溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ、(ethyl acetate/ hexane=1/4 次に、1/2)の混合溶媒で留出させた。生成物は、薄黄色の油状物質として得られた(15.84 g, yield 54%)。

【0066】

３．アルドキシム脱水酵素を用いる酵素反応は以下の条件で行った: 20 mM 5-phenyl-4,5-dihydroisoxazole, 1U Oxd-B, 0.05 mM FMN (Flavin mononucleotide)および1 mM Na₂S₂O₅ を混合し、KPB (リン酸カリウム緩衝液、pH 6.0, 100 mM), 500μLの混合液として、30℃で、2時間反応した。(R)-3-hydroxy-3-phenylpropanenitrile （98.7% ee ）および(S)-5-phenyl-4,5-dihydroisoxazole（99% ee）が50.1%の転換率で得られた。転換率 = ee_s/(ee_s+ee_p)の式を用いて算出した。エナンチオマー過剰率（ee）はキラルカラムを用いるHPLC あるいはGCを用いた。

【0067】

実施例2: (S)-3-hydroxyheptanenitrileおよび(R)-5-butyl-4,5-dihydroisoxazoleの合成

【化17】

【0068】

１．Rhodococcus sp. N-771由来のOxd RE遺伝子をPET-28bのベクターに連結させ、大腸菌BL₂₁(DE₃)を形質転換して、Oxd REを良好に生産させた。すなわち、Oxd REの生産のための前培養として、Oxd REの大腸菌組換え体を5mLのLB培地に接種し、37℃、300rpmで培養した。次に、1.4L TB培地に接種し、30°でさらに150rpm 12時間培養した。次に、1 mM IPTGを添加して、26℃、120 rpmで24時間Oxd RE酵素の発現を誘導した。大腸菌菌体を遠心分離（6000 xg、4℃、15分）で回収し、ペレットを300 mM NaClおよび20 mMイミダゾールを含むTris-HCl（pH8.0、20 mM）緩衝液に再懸濁し、超音波処理に供した（氷浴下、15分間）。溶解溶液を遠心分離（20000 xg、30分、4℃）して細胞破砕物を除去し、上清をニッケルセファロースファーストフローカラムに付けた。赤色をした酵素画分をプールし、KPB（pH7.0、20 mM）に対して透析した。酵素溶液を、次の反応のために保存した。

【0069】

２．基質とする5-butyl-4,5-dihydroisoxazole を(E)-hept-2-enalおよびacetoximeから合成した。2.33 g (32 mmol) acetoxime および 2.65 g (20 mol%) (N-methylbenzenaminium trifluoroacetate)を触媒として含む50 mL n-pentane 溶液に4.25 g (39 mmol) の(E)-hept-2-enalを0℃でゆっくりと滴下した。その混合液を 0℃で約16時間攪拌し、上層の n-pentane層を回収後、下層をさらに n-pentane (50 mL×2)で抽出した。n-pentane層を減圧下濃縮し、濃縮物をシリカゲルカラムにかけて (溶媒: n-pentane/Et₂O=5/1)精製した。生成物は薄黄色の油状物質として得られた(1.29 g, 32% yield).

【0070】

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.03 (s, 1H), 4.43 (ddt, J = 14.3, 10.4, 7.0 Hz, 1H), 2.97 (ddd, J = 17.3, 10.5, 1.8 Hz, 1H), 2.54 (ddd, J = 17.4, 8.1, 1.8 Hz, 1H), 1.64-1.58 (m, 1H), 1.49-1.41 (m, 1H), 1.38-22 (m, 4H), 0.84 (t, J = 8.0 Hz, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 145.90, 78.77, 40.41, 34.77, 27.64, 22.49, 13.94.

【0071】

３．アルドキシム脱水酵素を用いる酵素反応は以下の条件で行った: 6 mM 5-butyl-4,5-dihydroisoxazole, 1 U Oxd-RE, 1 mM Na₂S を混合して KPB (pH 7.0, 100 mM)と共に500μLとした。混合物を30℃で2時間反応し、(S)-3-hydroxyheptanenitrile（82.2 % ee）および (R)-5-butyl-4,5-dihydroisoxazole （49.3% ee ）を37.5%の転換率で得た。

【0072】

実施例3: Synthesis of (R)-3-hydroxy-3-(o-tolyl)propanenitrileおよび(S)-5-(o-tolyl)-4,5-dihydroisoxazoleの合成

【化18】

【0073】

１．Bacillus sp. OxB-1由来のOxd B遺伝子をPET-28bのベクターに連結させ、大腸菌BL₂₁(DE₃)を形質転換して良好に生産させた。すなわち、Oxd Bの生産のための前培養として、Oxd Bの大腸菌組換え体を5mLのLB培地に接種し、37℃、300rpmで培養した。次に、1.4L TB培地に接種し、30°でさらに150rpm 12時間培養した。 次に、1 mM IPTGを添加して、26℃、120 rpmで24時間Oxd B酵素の発現を誘導した。大腸菌菌体を遠心分離（6000 xg、4℃、15分）で回収し、ペレットを300 mM NaClおよび20 mMイミダゾールを含むTris-HCl（pH 8.0、20 mM）緩衝液に再懸濁し、超音波処理に供した（氷浴下、15分間）。溶解溶液を遠心分離（20000 xg、30分、4℃）して細胞破砕物を除去し、上清をニッケルセファロースファーストフローカラムに付けた。赤色をした酵素画分をプールし、KPB（pH 7.0、20 mM）に対して透析した。 酵素溶液を、次の反応のために保存した。

【0074】

２．基質とする5-(o-tolyl)-4,5-dihydroisoxazole を 2-methylbenzaldehyde およびnitromethaneから合成した。2-methylbenzaldehyde (2.65 g, 22 mmol) および K₂CO₃ (3.03 g), 7.86 g methyltriphenylphosphonium を含む30 mLの1,4-dioxane solutionを110℃で5時間還流した。次に、室温まで放置した後、ろ過し、ろ過物中の溶媒を圧力をかけてできるだけ除去した。残留物を50 mL tolueneに溶解し、1.32 g CH₃NO₂, 2.22 g (CH₃CH₂)₃Nおよび2.2 g (CH₃)₃SiClを加えた。この混合物を室温で40時間攪拌後、110℃で3時間還流した。冷却後、溶媒を減圧下留去し、濃縮物をシリカゲルカラムにかけて(溶媒: Ethyl Acetate/hexane=1/5)精製した(730 mg, 収率 21%).

【0075】

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.38-7.27 (m, 1H), 7.23-7.04 (m, 4H), 5.62 (dd, J = 11.2, 8.1 Hz, 1H), 3.39 (ddd, J = 17.4, 11.3, 1.4 Hz, 1H), 2.77 (ddd, J = 17.4, 8.0, 0.9 Hz, 1H), 2.26 (s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 145.48, 139.08, 134.21, 130.59, 127.84, 126.38, 124.97, 77.45, 42.84, 19.30.

【0076】

３．アルドキシム脱水酵素を用いる酵素反応は以下の条件で行った: 20 mM 5-(o-tolyl)-4,5-dihydroisoxazole, 1 U Oxd-B, 0.05 mM FMNおよび 1 mM Na₂S₂O₅ を混合して KPB (pH 6.0, 100 mM) 緩衝液と共に500μLとした。混合物を30℃で2時間反応し、(R)-3-hydroxy-3-(o-tolyl)propanenitrile（95 % ee）および(S)-5-(o-tolyl)-4,5-dihydroisoxazole（43% ee）を 31% の転換率で得た。

【0077】

実施例4: (R)-3-hydroxy-3-(thiophen-2-yl)propanenitrileおよび(S)-5-(thiophen-2-yl)-4,5-dihydroisoxazoleの合成

【化19】

【0078】

１．（Bacillus sp. OxB-1由来のアルドキシム脱水酵素Oxd Bの製造は実施例3と同じ）

【0079】

２．基質とする5-(thiophen-2-yl)-4,5-dihydroisoxazole をthiophene-2-carbaldehyde およびnitromethaneから合成した。thiophene-2-carbaldehyde (3.36 g, 30 mmol) および t-BuOK (6.6 g, 48 mmol)を含む50 mL エーテル溶液に12.86 g methyltriphenylphosphoniumを加え、0 ℃で、3時間攪拌した。次に、室温まで放置した後、ろ過し、ろ過物中の溶媒を圧力をかけてできるだけ除去した。残留物を50 mL tolueneに溶解し、1.80 g CH₃NO₂, 3.03 g (CH₃CH₂)₃N および 3.30 g (CH₃)₃SiCl を加えた。この混合物を室温で16時間攪拌後、110 ℃ で 3 時間還流した。冷却後、溶媒を減圧下留去し、濃縮物をシリカゲルカラムにかけて(溶媒: Ethyl Acetate/hexane=1/5)精製し、茶色の油状物質として得た(310 mg, 収率 7%)。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.29-7.23 (m, 1H), 7.22 (t, J = 1.5 Hz, 1H), 7.06-7.00 (m, 1H), 7.00-6.93 (m, 1H), 5.72 (dd, J = 10.8, 7.8 Hz, 1H), 3.39 (ddd, J = 17.6, 10.8, 1.8 Hz, 1H), 3.10 (ddd, J = 17.6, 7.8, 1.8 Hz, 1H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 145.84, 143.46, 126.96, 125.71, 125.38, 75.89, 43.49.

【0080】

３．アルドキシム脱水酵素を用いる酵素反応は以下の条件で行った: 20 mM 5-(thiophen-2-yl)-4,5-dihydroisoxazole, 1U Oxd-B, 0.05 mM FMNおよび1 mM Na₂S₂O₅ を混合してKPB (pH 6.0, 100 mM) 緩衝液と共に500μLとした。混合物を30℃で2時間反応し(R)-3-hydroxy-3-(thiophen-2-yl)propanenitrile（99% ee ）および(S)-5-(thiophen-2-yl)-4,5-dihydroisoxazole （96% ee）を49%の転換率で得た。

【0081】

実施例5: (R)-3-hydroxy-3-(m-tolyl)propanenitrile および(S)-5-(m-tolyl)-4,5-dihydroisoxazoleの合成

【化20】

【0082】

１．（Bacillus sp. OxB-1由来のアルドキシム脱水酵素Oxd Bの製造は実施例3と同じ）

【0083】

２．基質とする5-(m-tolyl)-4,5-dihydroisoxazoleを1-methyl-3-vinylbenzeneおよびnitromethaneから合成した。2.36 g 1-methyl-3-vinylbenzene, 1.2 g nitromethaneおよび2.02 g triethylamine (TEA)を含む50 mL トルエン溶液に、室温で2.2 g trimethylchlorosilicaneをゆっくり加え、0℃で3時間攪拌した。次に、室温まで放置した後、ろ過し、ろ過物中の溶媒を圧力をかけてできるだけ除去した。残留物を50 mL tolueneに溶解し、1.80 g CH₃NO₂, 3.03 g (CH₃CH₂)₃N および3.30 g (CH₃)₃SiCl を加えた。この混合物を室温で16時間攪拌後、110℃で3時間還流した。冷却後、溶媒を減圧下留去し、濃縮物をシリカゲルカラムにかけて(溶媒: Ethyl Acetate/hexane=1/5)精製し、無色の油状物質として得た(730 mg, 収率 23%)。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.18 (dd, J = 8.5, 6.6 Hz, 1H), 7.13 (td, J = 1.8, 0.6 Hz, 1H), 7.10-7.01 (m, 3H), 5.42 (dd, J = 11.2, 8.1 Hz, 1H), 3.35 (ddd, J = 17.6, 11.2, 1.8 Hz, 1H), 2.90 (ddd, J = 17.6, 8.1, 1.9 Hz, 1H), 2.29 (s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 145.53, 140.80, 138.41, 128.81, 128.56, 126.32, 122.77, 79.86, 43.64, 21.35.

【0084】

３．アルドキシム脱水酵素を用いる酵素反応は以下の条件で行った: 20 mM 5-(m-tolyl)-4,5-dihydroisoxazole, 1 U Oxd-B, 0.05 mM FMNおよび 1 mM Na₂S₂O₅ を混合して KPB (pH 6.0, 100 mM) 緩衝液と共に500μLとした。混合物を30℃で2時間反応しof (R)-3-hydroxy-3-(m-tolyl)propanenitrile (86 % ee) (S)-5-(m-tolyl)-4,5-dihydroisoxazole (76% ee )を 47% の転換率で得た。

【0085】

実施例6: (R)-3-hydroxy-3-(p-tolyl)propanenitrileおよび(S)-5-(p-tolyl)-4,5-dihydroisoxazoleの合成

【化21】

【0086】

１．（Bacillus sp. OxB-1由来のアルドキシム脱水酵素Oxd Bの製造は実施例3と同じ）

【0087】

２．基質とする5-(p-tolyl)-4,5-dihydroisoxazoleを1-methyl-4-vinylbenzene およびnitromethaneから合成した。2.36 g 1-methyl-4-vinylbenzene, 1.8 g nitromethane および 3.03 g triethylamine (TEA)を含む50 mL トルエン溶液に、室温で3.3 g trimethylchlorosilicaneをゆっくり加えた。室温で約16時間攪拌し、その後3時間還流した。次に、室温まで放置した後、ろ過し、ろ過物中の溶媒を圧力をかけてできるだけ除去した。残留物を50 mL tolueneに溶解し、1.80 g CH₃NO₂, 3.03 g (CH₃CH₂)₃N および 3.30 g (CH₃)₃SiClを加えた。この混合物を室温で16時間攪拌後、110℃で3時間還流した。冷却後、溶媒を減圧下留去し、濃縮物をシリカゲルカラムにかけて(溶媒: Ethyl Acetate/hexane=1/5)精製し、黄色の油状物質として得た(1.02 g, 収率 32%)。

【0088】

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.29-7.04 (m, 5H), 5.47 (dd, J = 11.1, 8.2 Hz, 1H), 3.39 (ddd, J = 17.6, 11.1, 1.8 Hz, 1H), 2.95 (ddd, 17.6, 8.2, 1.8 Hz, 1H), 2.33 (s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 145.64, 137.95, 137.90, 129.40, 125.81, 79.91, 43.66, 21.16.

【0089】

３．アルドキシム脱水酵素を用いる酵素反応は以下の条件で行った: 20 mM 5-(p-tolyl)-4,5-dihydroisoxazole, 1 U Oxd-B, 0.05 mM FMNおよび1 mM Na₂S₂O₅ を混合して KPB (pH 6.0, 100 mM) 緩衝液と共に500μLとした。この混合物を30℃で2時間反応し、(R)-3-hydroxy-3-(p-tolyl)propanenitrile （97 % ee）、(S)-5-(p-tolyl)-4,5-dihydroisoxazole （45% ee）を 32%の転換率で得た。

【0090】

実施例 7: (R)-3-(2-chlorophenyl)-3-hydroxypropanenitrileおよび(S)-5-(2-chlorophenyl)-4,5-dihydroisoxazole の合成

【化22】

【0091】

１．（Bacillus sp. OxB-1由来のアルドキシム脱水酵素Oxd Bの製造は実施例3と同じ）

【0092】

２．基質とする5-(p-tolyl)-4,5-dihydroisoxazoleを1-chloro-2-vinylbenzeneおよびnitromethaneから合成した。2.77 g 1-chloro-2-vinylbenzene, 1.8 g nitromethane および 3.03 g triethylamine (TEA)を含む50 mL トルエン溶液に、室温で3.3 g trimethylchlorosilicaneをゆっくり加えた。室温で約16時間攪拌し、その後3時間還流した。次に、室温まで放置した後、ろ過し、ろ過物中の溶媒を圧力をかけてできるだけ除去した。残留物を50 mL tolueneに溶解し、1.80 g CH₃NO₂, 3.03 g (CH₃CH₂)₃N および 3.30 g (CH₃)₃SiClを加えた。この混合物を室温で16時間攪拌後、110℃で3時間還流した。冷却後、溶媒を減圧下留去し、濃縮物をシリカゲルカラムにかけて(溶媒: Ethyl Acetate/hexane=1/5)精製し、無色の油状物質として得た(600 mg, 収率 17%)。

【0093】

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.42-7.40 (m, 1H), 7.33-7.27 (m, 1H), 7.25-7.13 (m, 2H), 7.13-7.08 (m, 1H), 5.75 (dd, J = 11.3, 6.9 Hz, 1H), 3.52(ddd, J = 17.8, 11.3, 1.8 Hz, 1H), 2.79 (ddd, J = 17.8, 6.9, 1.9 Hz, 1H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 145.78, 139.01, 131.26, 129.65, 129.15, 127.28, 126.61, 76.97, 43.46.

【0094】

３．アルドキシム脱水酵素を用いる酵素反応は以下の条件で行った: 20 mM 5-(2-chlorophenyl)-4,5-dihydroisoxazole, 1U Oxd-B, 0.05 mM FMNおよび 1 mM Na₂S₂O₅を混合してKPB (pH 6.0, 100 mM) 緩衝液と共に500μLとした。混合物を30℃で2時間反応し、(R)-3-(2-chlorophenyl)-3-hydroxypropanenitrile（53 % ee）および(S)-5-(2-chlorophenyl)-4,5-dihydroisoxazole（47% ee）47%の転換率で得た。

【0095】

実施例 8: (R)-3-(4-chlorophenyl)-3-hydroxypropanenitrile および (S)-5-(4-chlorophenyl)-4,5-dihydroisoxazole の合成

【化23】

【0096】

１．（Bacillus sp. OxB-1由来のアルドキシム脱水酵素Oxd Bの製造は実施例3と同じ）

【0097】

２．基質とする 5-(4-chlorophenyl)-4,5-dihydroisoxazoleを4-chloro-2-vinylbenzene および nitromethaneから合成した。2.77 g 4-chloro-2-vinylbenzene, 1.2 g nitromethane および 2.02 g triethylamine (TEA) を含む50 mL トルエン溶液に、室温で2.2 g trimethylchlorosilicaneをゆっくり加えた。室温で約40時間攪拌し、その後3時間還流した。溶媒を除去し、残留物をシリカゲルカラムにかけて(溶媒: Ethyl Acetate/hexane=1/5)精製し、無色の油状物質として得た(670 mg, 収率 18%). ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.33-7.20 (m, 5H), 5.51-5.46 (m, 1H), 3.58-3.21 (m, 1H), 2.96-2.89 (m, 1H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 145.51, 139.51, 133.91, 128.90, 127.16, 79.13, 43.78.

【0098】

３．アルドキシム脱水酵素を用いる酵素反応は以下の条件で行った: 20 mM 5-(4-chlorophenyl)-4,5-dihydroisoxazole, 1U Oxd-B, 0.05 mM FMNおよび 1 mM Na₂S₂O₅ を混合して KPB (pH 6.0, 100 mM) 緩衝液と共に500μLとした。混合物を30℃で2時間反応し、(R)-3-(4-chlorophenyl)-3-hydroxypropanenitrile （95% ee）および(S)-5-(4-chlorophenyl)-4,5-dihydroisoxazole（40% ee）を40%の転換率で得た。

【0099】

実施例9: (R)-3- -3-(4-methoxyphenyl)propanenitrile および(S)-5-(4-methoxyphenyl)-4,5-dihydroisoxazole の合成

【化24】

【0100】

１．（Bacillus sp. OxB-1由来のアルドキシム脱水酵素Oxd Bの製造は実施例3と同じ）

【0101】

２．基質とする5-(4-methoxyphenyl)-4,5-dihydroisoxazoleを1-methoxy-4-vinylbenzeneおよびnitromethaneから合成した。2.68 g 1-methoxy-4-vinylbenzene, 1.2 g nitromethane および2.02 g triethylamine (TEA) を含む50 mL トルエン溶液に、室温で2.2 g trimethylchlorosilicane をゆっくり加えた。室温で約16時間攪拌し、その後3時間還流した。溶媒を除去し、残留物をシリカゲルカラムにかけて(溶媒: Ethyl Acetate/hexane=1/5)精製し、無色の油状物質として得た(870 mg, 収率 25%).

【0102】

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.26-7.20 (m, 3H), 6.95-6.80 (m, 2H), 5.46 (dd, J = 10.9, 8.6 Hz, 1H), 3.79 (s, 3H), 3.37 (ddd, J = 17.6, 11.1, 1.7 Hz, 1H), 2.95 (ddd, J = 17.6, 8.4, 1.7 Hz, 1H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 159.55, 145.71, 132.80, 127.26, 114.11, 79.81, 55.33, 43.48.

【0103】

３．アルドキシム脱水酵素を用いる酵素反応は以下の条件で行った: 20 mM 5-(4-methoxyphenyl)-4,5-dihydroisoxazole, 1 U Oxd-B, 0.05 mM FMNおよび1 mM Na₂S₂O₅ を混合して KPB (pH 6.0, 100 mM) 緩衝液と共に500μLとした。混合物を30℃で2 時間反応し、(R)-3-hydroxy-3-(4-methoxyphenyl)propanenitrile (99 % ee) および(S)-5-(4-methoxyphenyl)-4,5-dihydroisoxazole （87% ee）を47%の転換率で得た。

【0104】

実施例10: (R)-3-hydroxy-3-phenylpropanenitrile および(S)-3-hydroxy-3-phenylpropanenitrileの大量合成

【化25】

【0105】

１．（Bacillus sp. OxB-1由来のアルドキシム脱水酵素Oxd Bの製造は実施例3と同じ）

【0106】

２．アルドキシム脱水酵素を用いる酵素反応は以下の条件で行った: 50 mM 5-phenyl-4,5-dihydroisoxazole, 1.2U Oxd-B (還元剤無しの条件で測定), 0.5 mM FMN を混合し、を混合して KPB (pH 6.0, 100 mM) 緩衝液と共に40 mL とした。反応液は、30℃で6時間反応し、その後、ethyl acetate (30 mL) で3回抽出した。上層の有機溶媒層を分離し、無水 MgSO₄で乾燥し、ろ過して溶媒を減圧下除いた。残留物をシリカゲルカラムにかけて(溶媒: Ethyl Acetate/hexane=1/5)精製した。(R)-3-hydroxy-3-phenylpropanenitrile (96% ee、精製後収率 34%) and (S)-5-phenyl-4,5-dihydroisoxazole (75% ee 精製後収率44%) を得た。

【0107】

(R)-3-hydroxy-3-phenylpropanenitrile: 無色油状物質, 収率 34%, ee 96%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.38-7.27 (m, 5H), 4.90 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 3.52 (d, J = 13.2 Hz, 1H), 2.66-2.61 (m, 2H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 141.16, 128.86, 128.68, 125.65, 117.71, 69.70, 27.86.
(S)-5-phenyl-4,5-dihydroisoxazole: 無色油状物質, 収率 44%, ee 75%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.37-7.24 (m, 5H), 7.15 (td, J = 1.8, 0.5 Hz, 1H), 5.47 (dd, J = 11.2, 8.1 Hz, 1H), 3.38 (ddd, J = 17.6, 11.2, 1.8 Hz, 1H), 2.92 (ddd, J = 17.6, 8.1, 1.8 Hz 1H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 145.73, 141.01, 128.77, 128.17, 125.83, 79.87, 43.78.

【0108】

３．酵素反応を受けずに残留した上記の(S)-5-phenyl-4,5-dihydroisoxazole は200 mg のNaOH を含む10 mL CH₃OH に溶解し、室温で30分間攪拌した。溶媒を留去し、(S)-3-hydroxy-3-phenylpropanenitrile （80% ee）を77%の素収率として得た。
(S)-3-hydroxy-3-phenylpropanenitrile: 無色油状物質, 収率 77%, ee 80%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.38-7.26 (m, 5H), 4.90 (t, J = 6.2 Hz, 1H), 3.83-3.25 (bs, 1H), 2.64 (d, J = 5.9 Hz, 2H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 141.17, 128.86, 128.68, 125.65, 117.73, 69.69, 27.87.

【0109】

上記実施例で基質として使用したラセミ体及び生成物のNMRデータ及びHRMSデータを以下に示す。

【0110】

基質（4,5-dihydroisoxazoles）

【化26】

5-phenyl-4,5-dihydroisoxazole: pale yellow Oil, 収率 yield 54%. ¹H NMR ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.40-7.28 (m, 5H), 7.20 (td, J = 1.8, 0.6 Hz, 1H), 5.52 (dd, J = 11.2, 8.1 Hz, 1H), 3.44 (ddd, J = 17.6, 11.2, 1.8 Hz, 1H), 2.98 (ddd, J = 17.6, 8.1, 1.8 Hz, 1H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 145.62, 140.98, 128.75, 128.16, 125.79, 79.89, 43.75. HRMS (ESI): calcd for C₉H₁₀NO [M + H]⁺, 148.0757; found: 148.0755; calcd for C₉H₉NNaO [M + Na]⁺, 170.0576; found: 170.0577.

【0111】

【化27】

5-(m-tolyl)-4,5-dihydroisoxazole: colourless oil, yield 23%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.18 (dd, J = 8.5, 6.6 Hz, 1H), 7.13 (td, J = 1.8, 0.6 Hz, 1H), 7.10-7.01 (m, 3H), 5.42 (dd, J = 11.2, 8.1 Hz, 1H), 3.35 (ddd, J = 17.6, 11.2, 1.8 Hz, 1H), 2.90 (ddd, J = 17.6, 8.1, 1.9 Hz, 1H), 2.29 (s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 145.53, 140.80, 138.41, 128.81, 128.56, 126.32, 122.77, 79.86, 43.64, 21.35. HRMS (ESI): calcd for C₁₀H₁₂NO [M + H]⁺, 162.0913; found: 162.0911; calcd for C₁₀H₁₁NNaO [M + Na]⁺, 184.0733; found: 184.0734.

【0112】

【化28】

5-(p-tolyl)-4,5-dihydroisoxazole: yellow oil, yield 32%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.29-7.04 (m, 5H), 5.47 (dd, J = 11.1, 8.2 Hz, 1H), 3.39 (ddd, J = 17.6, 11.1, 1.8 Hz, 1H), 2.95 (ddd, 17.6, 8.2, 1.8 Hz, 1H), 2.33 (s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 145.64, 137.95, 137.90, 129.40, 125.81, 79.91, 43.66, 21.16. HRMS (ESI): calcd for C₁₀H₁₂NO [M + H]⁺, 162.0913; found: 162.0910; calcd for C₁₀H₁₁NNaO [M + Na]⁺, 184.0733; found: 184.0744.

【0113】

【化29】

5-(2-chlorophenyl)-4,5-dihydroisoxazole: colorless oil, yield 17%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.42-7.40 (m, 1H), 7.33-7.27 (m, 1H), 7.25-7.13 (m, 2H), 7.13-7.08 (m, 1H), 5.75 (dd, J = 11.3, 6.9 Hz, 1H), 3.52(ddd, J = 17.8, 11.3, 1.8 Hz, 1H), 2.79 (ddd, J = 17.8, 6.9, 1.9 Hz, 1H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 145.78, 139.01, 131.26, 129.65, 129.15, 127.28, 126.61, 76.97, 43.46. HRMS (ESI): calcd for C₉H₈ClNNaO [M + Na]⁺, 204.0187; found: 204.0186.

【0114】

【化30】

5-(3-chlorophenyl)-4,5-dihydroisoxazole: yellow oil, yield 5%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.32-7.26 (m, 3H), 7.20-7.18 (m, 2H), 5.49 (dd, J = 11.2, 7.7 Hz, 1H), 3.45 (ddd, J = 17.6, 11.3, 1.7 Hz, 1H), 2.95 (ddd, J = 17.6, 7.7, 1.6 Hz, 1H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 145.49, 143.10, 134.64, 130.10, 128.27, 125.86, 123.87, 79.00, 43.82. HRMS (ESI): calcd for C₉H₈ClNNaO [M + Na]⁺, 204.0187; found: 204.0182.

【0115】

【化31】

5-(4-chlorophenyl)-4,5-dihydroisoxazole: yellow oil, yield 18%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.33-7.20 (m, 5H), 5.51-5.46 (m, 1H), 3.58-3.21 (m, 1H), 2.96-2.89 (m, 1H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 145.51, 139.51, 133.91, 128.90, 127.16, 79.13, 43.78. HRMS (ESI): calcd for C₉H₈ClNNaO [M + Na]⁺, 204.0187; found: 204.0185.

【0116】

【化32】

5-(4-methoxyphenyl)-4,5-dihydroisoxazole: colorless oil, yield 25%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.26-7.19 (m, 3H), 6.90-6.86 (m, 2H), 5.46 (dd, J = 10.9, 8.6 Hz, 1H), 3.79 (s, 3H), 3.37 (ddd, J = 17.6, 11.1, 1.7 Hz, 1H), 2.95 (ddd, J = 17.6, 8.4, 1.7 Hz, 1H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 159.55, 145.71, 132.80, 127.26, 114.11, 79.81, 55.33, 43.48. HRMS (ESI): calcd for C₁₀H₁₁NNaO₂ [M + Na]⁺, 200.0682; found: 200.0696.

【0117】

【化33】

5-(naphthalen-1-yl)-4,5-dihydroisoxazole: yellow oil, yield 18%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.90-7.88 (m, 1H), 7.85-7.81 (m, 2H), 7.63-7.62 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 7.58-7.43 (m, 3H), 7.25 (s, 1H), 6.21 (dd, J = 11.3, 7.7 Hz, 1H), 3.65 (dd, J = 17.4, 11.4 Hz, 1H), 3.02 (dd, J = 17.4, 7.6 Hz, 1H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 145.85, 136.06, 133.97, 129.67, 129.14, 128.50, 126.36, 125.76 , 125.51, 122.85, 122.74, 77.62, 43.51. HRMS (ESI): calcd for C₁₃H₁₁NNaO [M + Na]⁺, 220.0733; found: 220.0748.

【0118】

【化34】

5-(o-tolyl)-4,5-dihydroisoxazole: colorless oil, yield 21%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.38-7.27 (m, 1H), 7.23-7.04 (m, 4H), 5.62 (dd, J = 11.2, 8.1 Hz, 1H), 3.39 (ddd, J = 17.4, 11.3, 1.4 Hz, 1H), 2.77 (ddd, J = 17.4, 8.0, 0.9 Hz, 1H), 2.26 (s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 145.48, 139.08, 134.21, 130.59, 127.84, 126.38, 124.97, 77.45, 42.84, 19.30. HRMS (ESI): calcd for C₁₀H₁₂NO [M + H]⁺, 162.0913; found: 162.0914; calcd for C₁₀H₁₁NNaO [M + Na]⁺, 184.0733; found: 184.0733.

【0119】

【化35】

5-(thiophen-2-yl)-4,5-dihydroisoxazole: brown oil, yield 7%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.29-7.23 (m, 1H), 7.22 (t, J = 1.5 Hz, 1H), 7.06-7.00 (m, 1H), 7.00-6.93 (m, 1H), 5.72 (dd, J = 10.8, 7.8 Hz, 1H), 3.39 (ddd, J = 17.6, 10.8, 1.8 Hz, 1H), 3.10 (ddd, J = 17.6, 7.8, 1.8 Hz, 1H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 145.84, 143.46, 126.96, 125.71, 125.38, 75.89, 43.49. HRMS (ESI): calcd for C₇H₇NNaOS [M + Na]⁺, 176.0141; found: 176.0139.

【0120】

【化36】

5-propyl-4,5-dihydroisoxazole: light yellow oil, yield 10%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.09 (t, J = 1.7 Hz, 1H), 4.58-4.33 (m, 1H), 3.02 (ddd, J = 17.3, 10.5, 1.8 Hz, 1H), 2.59 (ddd, J = 17.3, 8.1, 1.9 Hz, 1H), 1.78-1.55 (m, 1H), 1.56-1.23 (m, 3H), 1.03-0.79 (m, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 145.90, 78.52, 40.42, 37.18, 18.79, 13.86. HRMS (ESI): calcd for C₆H₁₁NNaO [M + Na]⁺, 136.0733; found: 136.0708.

【0121】

【化37】

5-butyl-4,5-dihydroisoxazole: light yellow oil, yield 32%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.03 (s, 1H), 4.43 (ddt, J = 14.3, 10.4, 7.0 Hz, 1H), 2.97 (ddd, J = 17.3, 10.5, 1.8 Hz, 1H), 2.54 (ddd, J = 17.4, 8.1, 1.8 Hz, 1H), 1.64-1.58 (m, 1H), 1.49-1.41 (m, 1H), 1.38 - 1.22 (m, 4H), 0.84 (t, J = 8.0 Hz, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 145.90, 78.77, 40.41, 34.77, 27.64, 22.49, 13.94. HRMS (ESI): calcd for C₇H₁₃NNaO [M + Na]⁺, 150.0889; found: 150.0900.

【0122】

【化38】

5-benzyl-4,5-dihydroisoxazole: yellow oil, yield 5%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.36 - 7.27 (m, 2H), 7.27 - 7.19 (m, 3H), 7.09 (t, J = 1.6 Hz, 1H), 4.79 (ddd, J = 13.7, 10.4, 6.9 Hz, 1H), 3.05 (dd, J = 13.9, 6.2 Hz, 1H), 2.97 (ddd, J = 17.5, 10.4, 1.8 Hz, 1H), 2.81 (dd, J = 13.9, 6.9 Hz, 1H), 2.71 (ddd, J = 17.5, 7.5, 1.9 Hz, 1H).¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 145.92, 136.87, 129.39, 128.60, 126.74, 79.17, 40.79, 39.86. HRMS (ESI): calcd for C₁₀H₁₂NO [M + H]⁺, 162.0913, found: 162.0913; calcd for C₁₀H₁₁NNaO [M + Na]⁺, 184.0733; found: 184.0735.

【0123】

【化39】

5-(4-fluorobenzyl)-4,5-dihydroisoxazole: light yellow oil, yield 8%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) 7.04-6.97 (m, 2H), 6.89 (t, J = 1.6 Hz, 1H), 6.85-6.75 (m, 2H), 4.61-4.51 (m, 1H), 2.81 (ddd, J = 17.5, 10.5, 1.8 Hz, 1H), 2.78 (dd, J = 14.1, 6.5 Hz , 1H), 2.62 (dd, J = 14.1, 6.1 Hz, 1H), 2.50 (ddd, J = 17.5, 7.5, 1.9 Hz, 1H). ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 161.83 (d), 145.97, 132.56 (d), 130.87 (d), 115.37 (d), 79.00, 39.92, 39.82. HRMS (ESI): calcd for C₁₀H₁₁FNO [M + H]⁺, 180.0819, found:180.0819; calcd for C₁₀H₁₀FNNaO [M + Na]⁺, 202.0639, found:202.0637.

【0124】

【化40】

5-(2,4,5-trifluorobenzyl)-4,5-dihydroisoxazole: light yellow oil, yield 3%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.21 - 7.07 (m, 2H), 6.92 (ddd, J = 9.9, 9.4, 6.6 Hz, 1H), 4.84 - 4.71 (m, 1H), 3.09 (ddd, J = 17.6, 10.5, 1.7 Hz, 1H), 2.88 (d, J = 6.3 Hz, 2H), 2.72 (ddd, J = 17.6, 7.1, 1.8 Hz, 1H). ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 145.93, 119.50 (m), 119.31 (m), 105.58, 105.37, 105.29, 105.09, 77.40, 40.12, 33.29. HRMS (ESI): calcd for C₁₀H₉F₃NO [M + H]⁺, 216.0631, found: 216.0632; calcd for C₁₀H₈F₃NNaO [M + Na]⁺, 238.0450, found: 238.0448.

【0125】

【化41】

5-((perfluorophenyl)methyl)-4,5-dihydroisoxazole: light yellow oil, yield 2%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.18 (t, J = 1.6 Hz, 1H), 4.85-4.70 (m, 1H), 3.13 (ddd, J = 17.6, 10.3, 1.6 Hz, 1H), 3.04 (dd, J = 13.9, 7.6 Hz, 1H), 2.90 (dd, J = 13.9, 5.8 Hz, 1H), 2.77 (ddd, J = 17.6, 6.3, 1.8 Hz, 1H). ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 145.69, 76.37, 40.40, 27.74. HRMS (ESI): calcd for C₁₀H₇F₅NO [M + H]⁺, 252.0442, found: 252.0448; calcd for C₁₀H₆F₅NNaO [M + Na]⁺, 274.0262, found: 274.0260 .

【0126】

【化42】

5-(furan-2-yl)-4,5-dihydroisoxazole: light yellow oil, yield 13%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.44-7.36 (m, 1H), 7.26-7.16 (m, 1H), 6.42 - 6.30 (m, 2H), 5.55-5.40 (m, 1H), 3.31 - 3.17 (m, 2H). ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 151.73, 145.84, 143.14, 110.50, 108.65, 73.10, 39.35. HRMS (ESI): calcd for C₇H₈NO₂ [M + H]⁺, 138.0550, found 138.0550; calcd for C₇H₇NNaO₂ [M + Na]⁺, 160.0369, found 160.0367.

【0127】

【化43】

5-(1H-pyrrol-2-yl)-4,5-dihydroisoxazole: light yellow oil, yield 5%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.84 (s, 1H), 7.12 (t, J = 1.7 Hz, 1H), 6.67-6.64 (m, 1H), 6.06 (t, J = 2.4 Hz, 2H), 5.45 (dd, J = 10.7, 8.5 Hz, 1H), 3.17 (ddd, J = 17.6, 10.7, 1.7 Hz, 1H), 3.03 (ddd, J = 17.6, 8.4, 1.8 Hz, 1H). ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 146.83, 129.54, 119.25, 108.42, 106.59, 74.30, 40.97. HRMS (ESI): calcd for C₇H₉N₂O [M + H]⁺, 137.0709, found: 137.0711; calcd for C₇H₈N₂NaO [M + Na]⁺, 159.0529, found: 159.0528.

【0128】

【化44】

5-([1,1'-biphenyl]-4-yl)-4,5-dihydroisoxazole: light yellow oil, yield 27%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.63 - 7.54 (m, 4H), 7.47-7.30 (m, 5H), 7.24-7.21 (m, 1H), 5.57 (dd, J = 11.2, 8.1 Hz, 1H), 3.46 (ddd, J = 17.6, 11.2, 1.8 Hz, 1H), 3.02 (ddd, J = 17.6, 8.0, 1.8 Hz, 1H). ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 145.57, 141.18, 140.62, 139.88, 128.83, 127.51, 127.47, 127.12, 126.26, 79.72, 43.74. HRMS (ESI): calcd for C₁₅H₁₄NO [M + H]⁺, 224.1070, found: 224.1070; calcd for C₁₅H₁₃NNaO [M + H]⁺, 246.0889, found: 246.0885.

【0129】

【化45】

5-(chloromethyl)-4,5-dihydroisoxazole: light yellow oil, yield 20%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.16 (t, J = 1.6 Hz, 1H), 4.85-4.72 (m, 1H), 3.62 (dd, J = 11.4, 4.6 Hz, 1H), 3.54 (dd, J = 11.4, 6.3 Hz, 1H), 3.17 (ddd, J = 18.0, 10.8, 1.7 Hz, 1H), 2.99 (ddd, J = 18.0, 6.5, 1.9 Hz, 1H). ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 145.92, 77.07, 45.04, 38.91. HRMS (ESI): calcd for C₄H₇ClNO[M + H]⁺, 120.0211, found: 120.0211; calcd for C₄H₆ClNNaO[M + Na]⁺, 142.0030, found: 142.0030 .

【0130】

参考例１
ラセミ体β-ヒドロキシニトリルの合成

【化46】

【0131】

NaOH200mg含有の 10mLメタノール溶液にジヒドロイソキサゾール誘導体(1.5 mmol)を添加し、次いで室温でさらに30分間攪拌した。溶媒は、減圧下で除去し、残さをシリカカラムに掛けて精製した(EA/hexane=1/5)。

【0132】

参考例2
1tを基質とするラセミ体β-ヒドロキシニトリルの合成

【化47】

【0133】

トリエチルアミン（1 mmol）含有の2mLアセトニトリル溶液に1t（2 mmol）を添加し、85℃で3.5時間加熱した。次いで、20 mL の100 mM H塩酸用植木を添加し、ジクロロメタンで抽出した (10 mL×4)。溶媒を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下で除去後、残さをシリカカラムに掛けて精製した。

【0134】

【化48】

3-hydroxy-3-phenylpropanenitrile: pale yellow oil, 63% yield. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.47-7.30 (m, 5H), 5.05 (m, 1H), 2.81-2.74 (m, 2H), 2.40 (s, 1H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 141.02, 128.97, 128.88, 125.54, 117.31, 70.15, 27.95. HRMS (ESI): calcd for C₉H₉NNaO [M + Na]⁺, 170.0576; found: 170.0575.

【0135】

【化49】

3-hydroxy-3-(o-tolyl)propanenitrile: colorless oil, yield 77%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.48-7.46 (m, 1H), 7.26-7.17 (m, 2H), 7.16-7.10 (m, 1H), 5.25-5.13 (m, 1H), 3.16 (s, 1H), 2.64 (dd, J = 6.1, 1.3 Hz, 2H), 2.30 (s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 139.24, 134.36, 130.75, 128.43, 126.72, 125.04, 117.71, 66.31, 26.66, 18.96. HRMS (ESI): calcd for C₁₀H₁₁NNaO [M + Na]⁺, 184.0733; found: 184.0733.

【0136】

【化50】

3-hydroxy-3-(m-tolyl)propanenitrile:colorless oil, yield 41%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.30-7.26 (m, 1H), 7.21-7.15 (m, 3H), 5.00 (td, J = 6.2, 3.7 Hz, 1H), 2.76 (dd, J = 6.2, 1.8 Hz, 2H), 2.43 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 2.37 (s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 140.98, 138.79, 129.63, 128.87, 126.16, 122.57, 117.33, 70.23, 27.90, 21.46. HRMS (ESI): calcd for C₁₀H₁₁NNaO [M + Na]⁺, 184.0733; found: 184.0735.

【0137】

【化51】

3-hydroxy-3-(p-tolyl)propanenitrile: colorless oil, yield 54%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.30-7.22 (m, 2H), 7.19 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 4.96 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 2.79 (s, 1H), 2.71 (dd, J = 12.5, 6.6 Hz, 2H), 2.35 (s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 138.66, 138.15, 129.57, 125.50, 117.50, 69.90, 27.89, 21.18. HRMS (ESI): calcd for C₁₀H₁₁NNaO [M + Na]⁺, 184.0733; found: 184.0733.

【0138】

【化52】

3-(2-chlorophenyl)-3-hydroxypropanenitrile: colorless oil, yield 60%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.74-7.60 (m, 1H), 7.38-7.30 (m, 2H), 7.27 (m, 1H), 5.40 (dt, J = 7.3, 3.8 Hz, 1H), 3.28 (d, J = 3.8 Hz, 1H), 2.88 (dd, J = 16.8, 4.0 Hz, 1H), 2.70 (dd, J = 16.7, 7.1 Hz, 1H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 138.41, 131.29, 129.67, 129.57, 127.56, 127.05, 117.31, 66.31, 26.32. HRMS (ESI): calcd for C₉H₈ClNNaO [M + Na]⁺, 204.0187; found: 204.0182.

【0139】

【化53】

3-(3-chlorophenyl)-3-hydroxypropanenitrile: colorless oil, yield 50%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.42-7.41 (m, 1H), 7.37-7.31 (m, 2H), 7.31-7.26 (m, 1H), 5.03 (td, J = 6.2, 3.7 Hz, 1H), 2.76 (d, J = 6.2 Hz, 2H), 2.65 (d, J = 3.8 Hz, 1H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 142.97, 134.92, 130.27, 129.00, 125.79, 123.74, 116.93, 69.49, 27.98. HRMS (ESI): calcd for C₉H₈ClNNaO [M + Na]⁺, 204.0187; found: 204.0184.

【0140】

【化54】

3-(4-chlorophenyl)-3-hydroxypropanenitrile: light yellow oil, yield 65%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.39-7.25 (m, 4H), 4.98 (t, J = 6.1 Hz, 1H), 3.23 (s, 1H), 2.71 (dd, J = 6.2, 1.0 Hz, 2H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 139.54, 134.49, 129.05, 127.01, 117.27, 69.19, 27.98. HRMS (ESI): calcd for C₉H₈ClNNaO [M + Na]⁺, 204.0187; found: 204.0182.

【0141】

【化55】

3-hydroxy-3-(4-methoxyphenyl)propanenitrile: colorless oil, yield 59%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.30-7.26 (m, 2H), 6.93-6.86 (m, 2H), 4.94 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 3.79 (s, 3H), 2.96 (s, 1H), 2.71 (dd, J = 6.2, 2.2 Hz, 2H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 159.82, 133.27, 126.91, 117.56, 114.24, 69.62, 55.36, 27.90. HRMS (ESI): calcd for C₁₀H₁₁NNaO₂ [M + Na]⁺, 200.0682; found: 200.0688.

【0142】

【化56】

3-hydroxy-3-(naphthalen-1-yl)propanenitrile: colorless oil, yield 56%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.97-7.81 (m, 2H), 7.77 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.64 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.58-7.35 (m, 3H), 5.67 (s, 1H), 3.24 (s, 1H), 2.81 (ddd, J = 24.4, 16.8, 6.0 Hz, 2H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 136.46, 133.78, 129.64, 129.28, 129.16, 126.76, 125.97, 125.53, 123.25, 122.16, 117.76, 66.75, 27.10. HRMS (ESI): calcd for C₁₃H₁₁NNaO [M + Na]⁺, 220.0733; found: 220.0733.

【0143】

【化57】

3-hydroxy-3-(thiophen-2-yl)propanenitrile: yellow oil, yield 50%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.31 (dd, J = 5.0, 1.2 Hz, 1H), 7.11-7.03 (m, 1H), 7.00 (dd, J = 5.0, 3.6 Hz, 1H), 5.26 (t, J = 6.2 Hz, 1H), 3.23 (s, 1H), 2.85 (dd, J = 6.2, 0.9 Hz, 2H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 144.51, 127.12, 125.75, 124.72, 117.07, 66.19, 28.21. HRMS (ESI): calcd for C₇H₇NNaOS [M + Na]⁺, 176.0141; found: 176.0139.

【0144】

【化58】

3-hydroxyhexanenitrile: yellow oil, yield 85%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 3.98-3.85 (m, 1H), 2.68-2.38 (m, 3H), 1.65-1.25 (m, 4H), 0.98-0.87 (m, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 117.87, 67.44, 38.57, 26.10, 18.62, 13.75. HRMS (ESI): calcd for C₆H₁₁NNaO [M + Na]⁺, 136.0733; found: 136.0729.

【0145】

【化59】

3-hydroxyheptanenitrile: yellow oil, yield 89%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 3.93-3.79 (m, 1H), 2.98 (s, 1H), 2.47 (qd, J = 16.6 Hz, J = 6.4 Hz, 2H), 1.60-1.44 (m, 2H), 1.43-1.13 (m, 4H), 0.91-0.76 (m, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 118.01, 67.57, 36.15, 27.49, 26.03, 22.39, 13.90. HRMS (ESI): calcd for C₇H₁₃NNaO [M + Na]⁺, 150.0889; found: 150.0886.

【0146】

【化60】

3-hydroxy-4-phenylbutanenitrile: yellow oil, yield 99%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.39-7.31 (m, 2H), 7.31-7.25 (m, 1H), 7.25-7.19 (m, 2H), 4.24 - 4.00 (m, 1H), 2.93 (dd, J = 13.4, 5.5 Hz, 1H), 2.88 (dd, J = 13.4, 7.2 Hz, 1H), 2.57 (dd, J = 16.7, 5.1 Hz, 1H), 2.49 (dd, J = 16.7, 6.1 Hz, 1H), 2.28 (s, 1H).¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 136.26, 129.36, 129.00, 127.27, 117.49, 68.62, 42.84, 25.69. HRMS (ESI): calcd for C₁₀H₁₂NO [M + H]⁺, 162.0913, found: 162.0910; calcd for C₁₀H₁₁NNaO [M + Na]⁺, 184.0733, found: 184.0732.

【0147】

【化61】

4-(4-fluorophenyl)-3-hydroxybutanenitrile: yellow oil, yield 50%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.25-7.11 (m, 2H), 7.09-6.94 (m, 2H), 4.13 (dq, J = 7.4, 5.8 Hz, 1H), 2.91 (dd, J = 13.6, 5.5 Hz, 1H), 2.86 (dd, J = 13.7, 7.3 Hz, 1H), 2.57 (dd, J = 16.7, 5.1 Hz, 1H), 2.49 (dd, J = 16.7, 6.1 Hz, 1H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 162.05 (d), 131.92 (d), 130.87 (d), 117.39, 115.89, 68.56, 41.91, 25.18. HRMS (ESI): calcd for C₁₀H₁₀FNNaO [M + Na]⁺, 202.0639; found:202.0638.

【0148】

【化62】

3-hydroxy-4-(2,4,5-trifluorophenyl)butanenitrile: yellow oil, yield 75%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.12 (ddd, J = 10.3, 8.7, 6.8 Hz, 1H), 6.99 - 6.90 (m, 1H), 4.20 (ddd, J = 12.0, 6.5, 4.9 Hz, 1H), 2.96-2.89 (m, 1H), 2.84 (ddd, J = 14.1, 7.7, 1.1 Hz, 1H), 2.61 (dd, J = 16.7, 4.8 Hz, 1H), 2.52 (dd, J = 16.7, 6.5 Hz, 1H). ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 119.50 (m), 119.30 (m), 117.17, 105.94, 105.73, 105.65, 105.45, 67.18, 35.46, 25.63. HRMS (ESI): calcd for C₁₀H₈F₃NNaO [M + Na]⁺, 238.0450; found: 238.0446.

【0149】

【化63】

3-hydroxy-4-(perfluorophenyl)butanenitrile: yellow oil, yield 72%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 4.32-4.16 (m, 1H), 3.07-2.90 (m, 2H), 2.65 (dd, J = 16.7, 4.9 Hz, 1H), 2.59 (dd, J = 16.7, 6.7 Hz, 1H). ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 116.84, 66.65, 29.50, 25.88. HRMS (ESI): calcd for C₁₀H₆F₅NNaO [M + Na]⁺, 274.0262, found:274.0259.

【0150】

【化64】

3-(furan-2-yl)-3-hydroxypropanenitrile: yellow oil, yield 61%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.42 (dd, J = 1.8, 0.8 Hz, 1H), 6.42 - 6.39 (m, 1H), 6.38 (dd, J = 3.3, 1.8 Hz, 1H), 5.05 (t, J = 6.2 Hz, 1H), 2.91 (d, J = 6.2 Hz, 2H). ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 152.84, 142.94, 116.90, 110.60, 107.51, 63.85, 24.93. HRMS (ESI): calcd for C₇H₇NNaO₂ [M + Na]⁺, 160.0369; found: 160.0367.

【0151】

【化65】

3-hydroxy-3-(1H-pyrrol-2-yl)propanenitrile: yellow oil, yield 55%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.79 (s, 1H), 6.79-6.75 (m, 1H), 6.18-6.14 (m, 1H), 6.13-6.08 (m, 1H), 5.04 (dd, J = 6.6, 5.1 Hz, 1H), 2.85 (dd, J = 16.7, 5.0 Hz, 1H), 2.78 (dd, J = 16.7, 6.8 Hz, 1H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 130.72, 118.87, 117.87, 108.56, 105.72, 64.01, 26.50. HRMS (ESI): calcd for C₇H₈N₂NaO [M + Na]⁺, 159.0529; found: 159.0528.

【0152】

【化66】

3-([1,1'-biphenyl]-4-yl)-3-hydroxypropanenitrile: yellow oil, yield 69 ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.69-7.53 (m, 4H), 7.52-7.41 (m, 4H), 7.40-7.30 (m, 1H), 5.09 (t, J = 6.2 Hz, 1H), 2.81 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 2.79 (d, J = 0.4 Hz, 1H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 141.84, 140.37, 139.93, 128.89, 127.68, 127.65, 127.13, 126.03, 117.30, 69.96, 27.95. HRMS (ESI): calcd for C₁₅H₁₃NO [M + Na]⁺, 246.0889; found: 246.0885.

【0153】

【化67】

4-chloro-3-hydroxybutanenitrile: yellow oil, yield 50%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 4.16-4.08 (m, 1H), 3.58 - 3.54 (m, 2H), 2.68 (dd, J = 17.1, 5.5 Hz, 1H), 2.62 (dd, J = 16.9, 6.6 Hz, 1H). ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 117.15, 67.23, 47.28, 23.27. HRMS (ESI): calcd for C₄H₆ClNNaO[M + Na]⁺, 142.0030; found:142.0032.

【産業上の利用可能性】

【0154】

本発明は、光学活性ヒドロキシニトリル化合物の製造に関する分野に有用である。

【配列表フリーテキスト】

【0155】

配列番号１：ＯｘｄＡのアミノ酸配列
配列番号２：ＯｘｄＢのアミノ酸配列
配列番号３：ＯｘｄＦＧのアミノ酸配列
配列番号４：ＯｘｄＲＥのアミノ酸配列
配列番号５：ＯｘｄＲＧのアミノ酸配列

【配列表】

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