▶ エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーの特許一覧 ▶ サントル レオン ベラールの特許一覧 ▶ ユニベルシテ クロード ベルナール リヨン プルミエの特許一覧 ▶ サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィクの特許一覧 ▶ インセルム（インスティチュート ナショナル デ ラ サンテ エ デ ラ リシェルシェ メディカル）の特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-07-04
(45)【発行日】2024-07-12
(54)【発明の名称】Ｂ型肝炎ウイルス感染を治療するためのＦＵＢＰ１阻害剤の使用
(51)【国際特許分類】
A61K 31/4745 20060101AFI20240705BHJP
A61K 31/496 20060101ALI20240705BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20240705BHJP
A61K 31/711 20060101ALI20240705BHJP
A61P 31/20 20060101ALI20240705BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240705BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20240705BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240705BHJP
【ＦＩ】
A61K31/4745
A61K31/496
A61K31/713
A61K31/711
A61P31/20
A61P43/00 111
C12N15/113 100Z
A61K45/00 ZNA
【請求項の数】
16
(21)【出願番号】P 2020554482
(86)(22)【出願日】2019-04-05
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-08-19
(86)【国際出願番号】 EP2019058664
(87)【国際公開番号】W WO2019193165
(87)【国際公開日】2019-10-10
【審査請求日】2022-04-04
(31)【優先権主張番号】18165897.2
(32)【優先日】2018-04-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】591003013
【氏名又は名称】エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
(73)【特許権者】
【識別番号】504217063
【氏名又は名称】サントル レオン ベラール
(73)【特許権者】
【識別番号】511196870
【氏名又は名称】ユニベルシテ クロード ベルナール リヨン プルミエ
(73)【特許権者】
【識別番号】595040744
【氏名又は名称】サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィク
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ
(73)【特許権者】
【識別番号】511074305
【氏名又は名称】インセルム（インスティチュート ナショナル デ ラ サンテ エ デ ラ リシェルシェ メディカル）
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【氏名又は名称】中西 基晴
(74)【代理人】
【識別番号】100157923
【弁理士】
【氏名又は名称】鶴喰 寿孝
(72)【発明者】
【氏名】ルアンサイ，スーファローネ
(72)【発明者】
【氏名】テストーニ，バルバラ
(72)【発明者】
【氏名】ズーリム，ファビアン
(72)【発明者】
【氏名】オトスン，セーアン
(72)【発明者】
【氏名】ピーダスン，ルゲ
【審査官】濱田 光浩
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２００４／０２７０６１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１７－５０５６２３（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３１／００
Ａ６１Ｐ ３１／２０
Ａ６１Ｐ ４３／００
Ｃ１２Ｎ １５／１１３
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の治療および／または防止において使用するための、ＦＵＢＰ１阻害剤を含む薬学的組成物であって、
ＦＵＢＰ１阻害剤が、式ＶＩＩＩ、ＩＸまたはＸ
【化1】
【請求項2】
ＦＵＢＰ１／ＦＵＳＥ相互作用を防止するかまたは減少させる、請求項１の薬学的組成物。
【請求項3】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の治療および／または防止において使用するための、ＦＵＢＰ１阻害剤を含む薬学的組成物であって、
ＦＵＢＰ１阻害剤が、哺乳動物ＦＵＢＰ１ターゲット核酸に少なくとも９５％相補的であり、そしてＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡを減少させることが可能である、長さ１２～３０ヌクレオチドの隣接ヌクレオチド配列を含むかまたは該配列からなる、長さ１２～６０ヌクレオチドの核酸分子であり、
核酸分子が、
ａ． 一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド；
ｂ． ｓｉＲＮＡ分子；または
ｃ． ｓｈＲＮＡ分子
より選択される、薬学的組成物。
【請求項4】
ＨＢＶ感染が慢性感染である、請求項１～３のいずれか一項の薬学的組成物。
【請求項5】
感染細胞において、ｃｃｃＤＮＡおよび／またはｐｇＲＮＡを減少させることが可能である、請求項１～４のいずれか一項の薬学的組成物。
【請求項6】
哺乳動物ＦＵＢＰ１ターゲット核酸が配列番号１～８より選択される、請求項１～５のいずれか一項の薬学的組成物。
【請求項7】
隣接ヌクレオチド配列が、配列番号１および配列番号５のターゲット核酸に少なくとも９８％相補的である、請求項１～６のいずれか一項の薬学的組成物。
【請求項8】
対照に比較した際、ＨＢＶ感染細胞におけるｃｃｃＤＮＡが、少なくとも６０％減少している、請求項１～７のいずれか一項の薬学的組成物。
【請求項9】
対照に比較した際、ＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡが少なくとも６０％減少している、請求項１～７のいずれか一項の薬学的組成物。
【請求項10】
長さ１２～３０ヌクレオチドの隣接ヌクレオチド配列を含むかまたは該配列からなり、隣接ヌクレオチド配列が、哺乳動物ＦＵＢＰ１ターゲット核酸に少なくとも９５％相補的である、長さ１２～６０ヌクレオチドの核酸分子であって、該隣接ヌクレオチド配列が、配列番号１上の１４２００～１４２１８位、１４４１３～１４４３１位、１４９６６～１４９８４位および３０３４４～３０３６２位からなる群より選択されるターゲット配列に相補的である、
核酸分子を含む、ＨＢＶ感染の治療および／または防止において使用するための、薬学的組成物。
【請求項11】
請求項１０で定義される核酸分子、および該核酸分子のオリゴヌクレオチド構成要素に共有結合した少なくとも１つのコンジュゲート部分を含む、コンジュゲート化合物を含む、ＨＢＶ感染の治療および／または防止において使用するための、薬学的組成物。
【請求項12】
コンジュゲート部分が、三価ＧａｌＮＡｃ部分：
【化1-1】
【化1-2】
【化1-3】
【化1-4】
の１つより選択される、請求項１１の薬学的組成物。
【請求項13】
コンジュゲート化合物が、少なくとも２つの連続ホスホジエステル連結を含む２～５の連結されたヌクレオシドで構成される生理学的に不安定であるリンカーを含み、該生理学的に不安定なリンカーが、オリゴヌクレオチド構成要素の５’または３’末端で共有結合される、請求項１１または１２の薬学的組成物。
【請求項14】
請求項１０で定義される１つまたはそれより多い核酸分子（単数または複数）、あるいは請求項１１～１３のいずれか一項で定義される１つまたはそれより多いコンジュゲート化合物（単数または複数）、あるいはその許容されうる塩、ならびに薬学的に許容されうる希釈剤、キャリアー、塩および／またはアジュバントを含む、ＨＢＶ感染の治療および／または防止において使用するための、薬学的組成物。
【請求項15】
ＦＵＢＰ１を発現しているターゲット細胞において、ＦＵＢＰ１発現を調節するためのｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ法において使用するための、請求項１０で定義される核酸分子、または請求項１１～１３のいずれか一項で定義されるコンジュゲート化合物、または請求項１４の薬学的組成物を含む薬学的組成物であって、該ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ法は、請求項１０で定義される核酸分子、または請求項１１～１３のいずれか一項で定義されるコンジュゲート化合物、または請求項１４の薬学的組成物を有効量で、前記細胞に投与する工程を含む、
前記薬学的組成物。
【請求項16】
ＨＢＶ感染の治療および／または防止において使用するための薬剤として使用するための、請求項１０で定義される核酸分子、または請求項１１～１３のいずれか一項で定義されるコンジュゲート化合物、または請求項１４の薬学的組成物を含む薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染、特に慢性ＨＢＶ感染を治療し、そして／または防止する際に使用するための、遠位上流要素結合タンパク質１（ＦＵＢＰ１）阻害剤に関する。本発明は特に、ｃｃｃＤＮＡ、例えばＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡを不安定化させるためのＦＵＢＰ１阻害剤の使用に関する。本発明はまた、ＦＵＢＰ１に相補的であり、そしてＦＵＢＰ１ターゲット核酸、例えばｍＲＮＡを減少させることが可能である、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドなどの核酸分子にも関する。やはり本発明に含まれるのは、薬学的組成物、ならびにＨＢＶ感染の治療および／または防止におけるその使用である。
【発明の概要】
【0002】
遠位上流要素結合タンパク質１（ＦＵＢＰ１またはＦＢＰ１）は、多数のＤＮＡ要素に結合する、一本鎖ＤＮＡに結合するタンパク質である。このタンパク質はまた、ＲＮＡに結合すると考えられ、そしてＤＮＡ－ＤＮＡおよびＲＮＡ－ＲＮＡ二重鎖両方に対して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を伴う３’－５’ヘリカーゼ活性を含有する。ＦＵＢＰ１は、未分化細胞において、ｃ－ｍｙｃの上流に位置する遠位上流要素（ＦＵＳＥ）に結合することによって、癌原遺伝子ｃ－ｍｙｃの転写を活性化することが知られる。該タンパク質は主に、細胞核に存在する。ＦＵＢＰ１の上方制御は、多くのタイプの癌において観察されてきている。さらに、ＦＵＢＰ１は、Ｃ型肝炎ウイルスおよびエンテロウイルス由来のＲＮＡに結合し、そしてその複製を仲介することも可能である（ＺｈａｎｇおよびＣｈｅｎ ２０１３ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｖｏｌ ３２ ｐ．２９０７－２９１６）。
【0003】
ＦＵＢＰ１は、肝細胞癌（ＨＣＣ）においてもまた同定されてきており、ＨＣＣ腫瘍発生に関与すると示唆されており（Ｒａｍｄｚａｎら ２００８ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｖｏｌ ８ ｐ．５０８６－５０９６）、そしてＦＵＢＰ１は、ＦＵＢＰ１をターゲティングするレンチウイルス発現ｓｈＲＮＡを用いて例示されるように、ＨＣＣ腫瘍増殖に必要である（Ｒａｂｅｎｈｏｒｓｔら ２００９ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ｖｏｌ ５０ ｐ １１２１－１１２９）。
【0004】
レンチウイルス発現ｓｈＲＮＡでのＦＵＢＰ１のノックダウンが、卵巣癌において、治療反応を増進させることが立証されてきている（Ｚｈａｎｇら ２０１７ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ Ｖｏｌ １４ ｐ．５８１９－５８２４）。
【0005】
ＷＯ ２００４／０２７０６１は、試験物質がＦＢＰを阻害するかどうかを分析する工程を伴うスクリーニング法、および活性成分（単数または複数）として、ＦＢＰを阻害する物質を含有する増殖性疾患を治療するための医学的組成物を開示する。
【0006】
すべて癌を治療する目的で、ＦＵＢＰ１を阻害するいくつかの小細胞分子が同定されてきている（Ｈｕｔｈら ２００４ Ｊ Ｍｅｄ． Ｃｈｅｎ Ｖｏｌ ４７ ｐ．４８５１－４８５７； Ｈａｕｃｋら ２０１６ Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ ２４ ｐ．５７１７－５７２９ Ｈｏｓｓｅｉｎｉら ２０１７ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ １４６ ｐ．５３－６２およびＸｉｏｎｇら ２０１６ Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃ ｖｏｌ ４９ ｐ ６２３）。ＷＯ２００４／０１７９４０は、ＳＮ－３８の脂質に基づく配合物を記載し、ウイルス感染、特にＨＩＶの治療を主張するが、これを裏付ける例はない。
【0007】
ポリ（Ｕ）結合性スプライシング因子６０（ＰＵＦ６０）は、ＨＢＶプレゲノム発現の転写および転写後の両方の工程の潜在的な制御因子である。ＰＵＦ６０は、ｃ－ｍｙｃ抑制と関連して、ＦＵＢＰ１を含む複合体を形成することが知られる。しかし、ＦＵＢＰ１は、ＨＢＶプレゲノム発現のＰＵＦ６０依存性制御には関与しない（Ｓｕｎら ２０１７ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ７：１２８７４）。
【0008】
本発明者らが知る限り、ＦＵＢＰ１は、ｃｃｃＤＮＡに結合するかまたはｃｃｃＤＮＡ安定性と関連すると示されたことはなく、あるいはＦＵＢＰ１を阻害する分子が、ｃｃｃＤＮＡ不安定化因子として、またはＨＢＶ感染の治療のために示唆されたこともない。
【0009】
ＨＢＶ感染は、推定３億５０００万人の慢性キャリアーが関与する、世界的に大きな健康上の問題であり続けている。キャリアーのおよそ２５％は、慢性肝炎、肝硬変、または肝癌で死亡する。Ｂ型肝炎ウイルスは、タバコに次ぐ、二番目に重大な発癌要因であり、すべての原発性肝癌の６０％～８０％を引き起こす。ＨＢＶは、ＨＩＶよりも１００倍より伝染性である。
【0010】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、エンベロープ形成される部分的に二本鎖であるＤＮＡウイルスである。コンパクトな３．２ｋｂ ＨＢＶゲノムは、４つの重複オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からなり、これは、コア、ポリメラーゼ（Ｐｏｌ）、エンベロープおよびＸタンパク質をコードする。Ｐｏｌ ＯＲＦは最長であり、そしてエンベロープＯＲＦがその内部に位置する一方、ＸおよびコアＯＲＦは、Ｐｏｌ ＯＲＦと重複する。ＨＢＶの生活環は２つの主要イベントを有する：１）弛緩環状ＤＮＡ（ＲＣ ＤＮＡ）からの閉鎖環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）の生成、および２）ＲＣ ＤＮＡを産生する、プレゲノムＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）の逆転写。
【0011】
ＨＢｓＡｇ定量化は、慢性Ｂ型肝炎における予後および治療反応の有意なバイオマーカーである。しかし、ＨＢｓＡｇ喪失および血清変換（機能的治癒）の達成は、慢性感染患者においてまれにしか観察されない。Ｂ型肝炎ｅ抗原（ＨＢＶエンベロープ抗原またはＨＢｅＡｇとも呼ばれる）は、Ｂ型肝炎感染細胞によって分泌されるウイルスタンパク質である。ＨＢｅＡｇは、慢性Ｂ型肝炎感染と関連し、そして活性ウイルス疾患および患者の感染性の度合いのマーカーとして用いられる。
【0012】
したがって、ＨＢｓＡｇの分泌に加えてＨＢｅＡｇの分泌を減少させると、ＨＢｓＡｇ分泌のみの阻害に比較した際、慢性ＨＢＶ感染の発展の改善された阻害につながるであろう。
【0013】
ヌクレオシ（チ）ド類似体などの現在の療法は、ＨＢＶ ＤＮＡ合成を阻害するが、ＨＢｓＡｇレベルの減少に向けられていない分子である。機能的治療に到達することを目的とする現在開発中である大部分の療法は、耐久性ＨＢｓＡｇ喪失±抗ＨＢｓ血清変換、検出不能な血清ＤＮＡ、および転写不活性状態のｃｃｃＤＮＡを伴う機能的治癒に到達することを目的とするが、ｃｃｃＤＮＡ持続には取り組まない。したがって、これらのアプローチは、ｃｃｃＤＮＡ除去を伴う耐久性ＨＢＶ ＤＮＡおよびＨＢｓＡｇ喪失と定義される、ＨＢＶ感染の完全治癒を導かない。感染肝細胞におけるｃｃｃＤＮＡの持続は、ＣＨＢ患者においてウイルスを根絶するには大きな障壁であり、そしてｃｃｃＤＮＡを排除する、ＨＢＶ完全治癒のための新規療法を開発する緊急の必要性がある。
【0014】
発明の目的
本発明は、ＨＢＶ感染細胞においてＦＵＢＰ１の阻害およびｃｃｃＤＮＡの減少の間の相関があり、これがＨＢＶ感染個体の治療に関連することを示す。本発明の目的は、ＨＢＶ感染細胞においてｃｃｃＤＮＡを減少させるＦＵＢＰ１阻害剤を同定することである。こうしたＦＵＢＰ１阻害剤を、ＨＢＶ感染の治療に用いることができる。
本発明は、ＨＢＶ感染細胞においてＦＵＢＰ１の阻害およびｃｃｃＤＮＡの減少の間の相関があり、これがＨＢＶ感染個体の治療に関連することを示す。本発明の目的は、ＨＢＶ感染細胞においてｃｃｃＤＮＡを減少させるＦＵＢＰ１阻害剤を同定することである。こうしたＦＵＢＰ１阻害剤を、ＨＢＶ感染の治療に用いることができる。
【0015】
本発明はさらに、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＦＵＢＰ１の発現を阻害することが可能な新規核酸分子を同定する。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1-1】図１は、例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートを例示し、ここで、オリゴヌクレオチドは、波線（Ａ～Ｄ）として、または「オリゴヌクレオチド」（Ｅ～Ｈ）として、またはＴ２（Ｉ）としてのいずれかで示され、そしてアシアロ糖タンパク質受容体ターゲティングコンジュゲート部分は、三価Ｎ－アセチルガラクトサミン部分である。化合物Ａ～Ｄは、ジ－リジン分岐分子、ＰＥＧ３スペーサーおよび３つの末端ＧａｌＮＡｃ炭水化物部分を含む。化合物ＡおよびＢにおいて、オリゴヌクレオチドを、リンカーなしに、直接、アシアロ糖タンパク質受容体ターゲティングコンジュゲート部分に付着させる。化合物ＣおよびＤにおいて、オリゴヌクレオチドを、Ｃ６リンカーを通じて、アシアロ糖タンパク質受容体ターゲティングコンジュゲート部分に付着させる。化合物Ｅ～Ｉは、商業的に入手可能な三重（ｔｒｅｂｌｅｒ）分岐分子、ならびに多様な長さおよび構造のスペーサー、ならびに３つの末端ＧａｌＮＡｃ炭水化物部分を含む。
【図1-2】図１は、例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートを例示し、ここで、オリゴヌクレオチドは、波線（Ａ～Ｄ）として、または「オリゴヌクレオチド」（Ｅ～Ｈ）として、またはＴ２（Ｉ）としてのいずれかで示され、そしてアシアロ糖タンパク質受容体ターゲティングコンジュゲート部分は、三価Ｎ－アセチルガラクトサミン部分である。化合物Ａ～Ｄは、ジ－リジン分岐分子、ＰＥＧ３スペーサーおよび３つの末端ＧａｌＮＡｃ炭水化物部分を含む。化合物ＡおよびＢにおいて、オリゴヌクレオチドを、リンカーなしに、直接、アシアロ糖タンパク質受容体ターゲティングコンジュゲート部分に付着させる。化合物ＣおよびＤにおいて、オリゴヌクレオチドを、Ｃ６リンカーを通じて、アシアロ糖タンパク質受容体ターゲティングコンジュゲート部分に付着させる。化合物Ｅ～Ｉは、商業的に入手可能な三重（ｔｒｅｂｌｅｒ）分岐分子、ならびに多様な長さおよび構造のスペーサー、ならびに３つの末端ＧａｌＮＡｃ炭水化物部分を含む。
【図1-3】図１は、例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートを例示し、ここで、オリゴヌクレオチドは、波線（Ａ～Ｄ）として、または「オリゴヌクレオチド」（Ｅ～Ｈ）として、またはＴ２（Ｉ）としてのいずれかで示され、そしてアシアロ糖タンパク質受容体ターゲティングコンジュゲート部分は、三価Ｎ－アセチルガラクトサミン部分である。化合物Ａ～Ｄは、ジ－リジン分岐分子、ＰＥＧ３スペーサーおよび３つの末端ＧａｌＮＡｃ炭水化物部分を含む。化合物ＡおよびＢにおいて、オリゴヌクレオチドを、リンカーなしに、直接、アシアロ糖タンパク質受容体ターゲティングコンジュゲート部分に付着させる。化合物ＣおよびＤにおいて、オリゴヌクレオチドを、Ｃ６リンカーを通じて、アシアロ糖タンパク質受容体ターゲティングコンジュゲート部分に付着させる。化合物Ｅ～Ｉは、商業的に入手可能な三重（ｔｒｅｂｌｅｒ）分岐分子、ならびに多様な長さおよび構造のスペーサー、ならびに３つの末端ＧａｌＮＡｃ炭水化物部分を含む。
【図1-4】図１は、例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートを例示し、ここで、オリゴヌクレオチドは、波線（Ａ～Ｄ）として、または「オリゴヌクレオチド」（Ｅ～Ｈ）として、またはＴ２（Ｉ）としてのいずれかで示され、そしてアシアロ糖タンパク質受容体ターゲティングコンジュゲート部分は、三価Ｎ－アセチルガラクトサミン部分である。化合物Ａ～Ｄは、ジ－リジン分岐分子、ＰＥＧ３スペーサーおよび３つの末端ＧａｌＮＡｃ炭水化物部分を含む。化合物ＡおよびＢにおいて、オリゴヌクレオチドを、リンカーなしに、直接、アシアロ糖タンパク質受容体ターゲティングコンジュゲート部分に付着させる。化合物ＣおよびＤにおいて、オリゴヌクレオチドを、Ｃ６リンカーを通じて、アシアロ糖タンパク質受容体ターゲティングコンジュゲート部分に付着させる。化合物Ｅ～Ｉは、商業的に入手可能な三重（ｔｒｅｂｌｅｒ）分岐分子、ならびに多様な長さおよび構造のスペーサー、ならびに３つの末端ＧａｌＮＡｃ炭水化物部分を含む。
【図2】三価ＧａｌＮＡｃクラスター（ＧＮ２）の構造式。ＧＮ２は、本発明においてコンジュゲート化部分として有用である。波線は、例えばＣ６アミノリンカーへの、または直接オリゴヌクレオチドへの、クラスターのコンジュゲート化の部位を例示する。
【図3】対照（対照）またはＦＵＢＰ１ターゲティングｓｉＲＮＡ（プール）またはＨＢＶ ｓｉＲＮＡ（ＨＢＶ）のいずれかで処置したＨＢＶ感染ＰＰＨ細胞由来のサザンブロット。
【発明を実施するための形態】
【0017】
発明の要旨
本発明の１つの側面は、Ｂ型肝炎ウイルス感染の治療および／または予防において使用するためのＦＵＢＰ１阻害剤に関する。特に、ｃｃｃＤＮＡおよび／またはプレゲノムＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）を減少させることが可能であるＦＵＢＰ１阻害剤が有用である。ＦＵＢＰ１阻害剤が小分子である場合、これが、ＦＵＢＰ１タンパク質のＤＮＡ結合ドメインと相互作用し、そしてｃｃｃＤＮＡへのＦＵＢＰ１結合を防止するかまたは減少させることが好適である。ＦＵＢＰ１阻害剤はまた、ＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡを減少させることが可能な、長さ１２～６０ヌクレオチドの核酸分子であってもよい。
本発明の１つの側面は、Ｂ型肝炎ウイルス感染の治療および／または予防において使用するためのＦＵＢＰ１阻害剤に関する。特に、ｃｃｃＤＮＡおよび／またはプレゲノムＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）を減少させることが可能であるＦＵＢＰ１阻害剤が有用である。ＦＵＢＰ１阻害剤が小分子である場合、これが、ＦＵＢＰ１タンパク質のＤＮＡ結合ドメインと相互作用し、そしてｃｃｃＤＮＡへのＦＵＢＰ１結合を防止するかまたは減少させることが好適である。ＦＵＢＰ１阻害剤はまた、ＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡを減少させることが可能な、長さ１２～６０ヌクレオチドの核酸分子であってもよい。
【0018】
本発明のさらなる側面は、ＦＵＢＰ１の発現および／または活性を阻害する核酸分子に関する。特に、長さ１２～３０ヌクレオチドの隣接ヌクレオチド配列を含むかまたはこうした配列からなる、長さ１２～６０ヌクレオチドの核酸分子であって、隣接ヌクレオチド配列が、哺乳動物ＦＵＢＰ１ターゲット核酸に少なくとも９５％相補的である、前記分子。こうした核酸分子は、一本鎖アンチセンス、ｓｉＲＮＡおよび化学的に産生されたｓｈＲＮＡ分子（プラスミドまたはウイルスからの細胞に基づく発現に頼らない）より選択されてもよい。
【0019】
本発明のさらなる側面は、ＦＵＢＰ１の発現および／または活性を阻害する、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡに関する。特に、ＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡを減少させる、１つまたはそれより多い２’糖修飾ヌクレオシドおよび１つまたはそれより多いホスホロチオエート連結を含む修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは修飾ｓｉＲＮＡが好適である。
【0020】
本発明のさらなる側面は、本発明の核酸分子のコンジュゲート、および本発明の分子を含む薬学的組成物である。特に、肝臓をターゲティングするコンジュゲート、例えばＧａｌＮＡｃクラスターが関心対象である。
【0021】
定義
核酸分子
用語「核酸分子」または「療法核酸分子」は、本明細書において、当業者に一般的に理解されるように、２つまたはそれより多い共有結合ヌクレオシド（すなわちヌクレオチド配列）を含む分子と定義される。本発明の方法において言及される核酸分子（単数または複数）は、一般的に、長さ５０ヌクレオチド未満の療法オリゴヌクレオチドである。核酸分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチドであっても、または該オリゴヌクレオチドを含んでもよいし、あるいは別のオリゴマー核酸分子、例えばＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アプタマー、またはリボザイムであってもよい。療法核酸分子は、一般的に、固相化学合成後、精製および単離によって、実験室で作製される。しかし、ｓｈＲＮＡは、しばしば、レンチウイルスベクターを用いて細胞に送達され（例えばＳｏａｎおよびＹａｎｇ ２０１０ Ｎ Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ ２（１２）： ５９８を参照されたい）、これは次いで転写されて、一本鎖ＲＮＡを産生し、これがＲＮＡ干渉機構（ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を含む）と相互作用可能なステムループ（ヘアピン）ＲＮＡ構造を形成する。核酸分子の配列に言及する際、共有連結されたヌクレオチドまたはヌクレオシドの核酸塩基部分の配列または順序、あるいはその修飾に言及される。本発明の核酸分子は人工であり、そして化学的に合成され、そして典型的には精製されるかまたは単離されている。いくつかの態様において、本発明の核酸分子は、ターゲット細胞内への進入に際して、ベクターから転写されるｓｈＲＮＡではない。本発明の核酸分子は、１つまたはそれより多い修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含んでもよい。
核酸分子
用語「核酸分子」または「療法核酸分子」は、本明細書において、当業者に一般的に理解されるように、２つまたはそれより多い共有結合ヌクレオシド（すなわちヌクレオチド配列）を含む分子と定義される。本発明の方法において言及される核酸分子（単数または複数）は、一般的に、長さ５０ヌクレオチド未満の療法オリゴヌクレオチドである。核酸分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチドであっても、または該オリゴヌクレオチドを含んでもよいし、あるいは別のオリゴマー核酸分子、例えばＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アプタマー、またはリボザイムであってもよい。療法核酸分子は、一般的に、固相化学合成後、精製および単離によって、実験室で作製される。しかし、ｓｈＲＮＡは、しばしば、レンチウイルスベクターを用いて細胞に送達され（例えばＳｏａｎおよびＹａｎｇ ２０１０ Ｎ Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ ２（１２）： ５９８を参照されたい）、これは次いで転写されて、一本鎖ＲＮＡを産生し、これがＲＮＡ干渉機構（ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を含む）と相互作用可能なステムループ（ヘアピン）ＲＮＡ構造を形成する。核酸分子の配列に言及する際、共有連結されたヌクレオチドまたはヌクレオシドの核酸塩基部分の配列または順序、あるいはその修飾に言及される。本発明の核酸分子は人工であり、そして化学的に合成され、そして典型的には精製されるかまたは単離されている。いくつかの態様において、本発明の核酸分子は、ターゲット細胞内への進入に際して、ベクターから転写されるｓｈＲＮＡではない。本発明の核酸分子は、１つまたはそれより多い修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含んでもよい。
【0022】
いくつかの態様において、本発明の核酸分子は、長さ１２～６０ヌクレオチド、例えば長さ１３～５０、例えば１４～４０、例えば１５～３０、例えば１６～２２、例えば１６～１８または１５～１７の隣接ヌクレオチドを含むかまたは該ヌクレオチドからなる。
【0023】
いくつかの態様において、核酸分子またはその隣接ヌクレオチド配列は、２４またはそれ未満のヌクレオチド、例えば２２、例えば２０またはそれ未満のヌクレオチド、例えば１８またはそれ未満のヌクレオチド、例えば１４、１５、１６または１７ヌクレオチドを含むかまたは該ヌクレオチドからなる。本明細書に提供するいかなる範囲も、範囲終点を含むと理解されるものとする。したがって、核酸分子が１２～３０ヌクレオチドを含むと言う場合、１２および３０ヌクレオチドの両方が含まれる。
【0024】
いくつかの態様において、隣接ヌクレオチド配列は、長さ１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２の隣接ヌクレオチドを含むかまたは該ヌクレオチドからなる。
【0025】
核酸分子（単数または複数）は、哺乳動物において、ターゲット核酸の発現を調節するためのものである。いくつかの態様において、核酸分子、例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には、ターゲット核酸（単数または複数）の発現を阻害するためのものである。
【0026】
本発明の１つの態様において、核酸分子は、ＲＮＡｉ剤、例えばｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡより選択される。別の態様において、核酸分子は、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えばＲＮアーゼＨと相互作用する高アフィニティ修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【0027】
いくつかの態様において、核酸分子は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む。
いくつかの態様において、核酸分子は、非ヌクレオシド部分（コンジュゲート部分）にコンジュゲート化されてもよい。
いくつかの態様において、核酸分子は、非ヌクレオシド部分（コンジュゲート部分）にコンジュゲート化されてもよい。
【0028】
核酸分子のライブラリーは、変異体核酸分子のコレクションとして理解されるものとする。核酸分子のライブラリーの目的は多様でありうる。いくつかの態様において、核酸分子のライブラリーは、核酸分子のライブラリー内の最も強力な配列を同定する目的で、１つまたはそれより多い哺乳動物ＦＵＢＰ１ターゲット核酸をターゲティングする重複核酸塩基配列を含むオリゴヌクレオチドで構成される。いくつかの態様において、核酸分子のライブラリーは、親または祖先核酸分子の核酸分子設計変異体（子核酸分子）のライブラリーであって、核酸分子設計変異体が親核酸分子のコア核酸塩基配列を保持する、前記ライブラリーである。
【0029】
オリゴヌクレオチド
用語「オリゴヌクレオチド」は、本明細書において、２つまたはそれより多い共有結合ヌクレオシドを含む分子として、当業者に一般的に理解されるように定義される。こうした共有結合ヌクレオシドはまた、核酸分子またはオリゴマーとしても称されうる。オリゴヌクレオチドは、一般的に、固相化学合成後、精製および単離によって、実験室で作製される。オリゴヌクレオチド配列に言及する際、共有結合されたヌクレオチドまたはヌクレオシドの核酸塩基部分の配列または順序、あるいはその修飾に言及される。本発明のオリゴヌクレオチドは人工であり、そして化学的に合成され、そして典型的には精製されるかまたは単離されている。本発明のオリゴヌクレオチドは、１つまたはそれより多い修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチド、例えば２’糖修飾ヌクレオシドを含んでもよい。
用語「オリゴヌクレオチド」は、本明細書において、２つまたはそれより多い共有結合ヌクレオシドを含む分子として、当業者に一般的に理解されるように定義される。こうした共有結合ヌクレオシドはまた、核酸分子またはオリゴマーとしても称されうる。オリゴヌクレオチドは、一般的に、固相化学合成後、精製および単離によって、実験室で作製される。オリゴヌクレオチド配列に言及する際、共有結合されたヌクレオチドまたはヌクレオシドの核酸塩基部分の配列または順序、あるいはその修飾に言及される。本発明のオリゴヌクレオチドは人工であり、そして化学的に合成され、そして典型的には精製されるかまたは単離されている。本発明のオリゴヌクレオチドは、１つまたはそれより多い修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチド、例えば２’糖修飾ヌクレオシドを含んでもよい。
【0030】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、本明細書において、ターゲット核酸、特にターゲット核酸上の隣接配列にハイブリダイズすることによって、ターゲット遺伝子の発現を調節可能なオリゴヌクレオチドと定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本質的に二本鎖ではなく、そしてしたがってｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡでない。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖である。本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、分子内または分子間自己相補性の度合いが、オリゴヌクレオチドの全長に渡って、５０％未満である限り、ヘアピンまたは分子間二重鎖構造（同じオリゴヌクレオチドの２つの分子間の二重鎖）を形成可能であると理解される。
用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、本明細書において、ターゲット核酸、特にターゲット核酸上の隣接配列にハイブリダイズすることによって、ターゲット遺伝子の発現を調節可能なオリゴヌクレオチドと定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本質的に二本鎖ではなく、そしてしたがってｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡでない。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖である。本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、分子内または分子間自己相補性の度合いが、オリゴヌクレオチドの全長に渡って、５０％未満である限り、ヘアピンまたは分子間二重鎖構造（同じオリゴヌクレオチドの２つの分子間の二重鎖）を形成可能であると理解される。
【0031】
好適には、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドはＲＮＡヌクレオシドを含有せず、これはこれがヌクレアーゼ耐性を減少させるであろうためである。
好適には、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つまたはそれより多い修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチド、例えば２’糖修飾ヌクレオシドを含む。さらに、修飾されないヌクレオシドがＤＮＡヌクレオシドであることが好適である。
好適には、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つまたはそれより多い修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチド、例えば２’糖修飾ヌクレオシドを含む。さらに、修飾されないヌクレオシドがＤＮＡヌクレオシドであることが好適である。
【0032】
ＲＮＡｉ
本明細書において、用語「ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子」は、細胞質において、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を通じたＲＮＡ依存性遺伝子サイレンシングを誘導可能である小分子二本鎖ＲＮＡ分子を指し、細胞質において、これらは触媒性ＲＩＳＣ構成要素アルゴノートと相互作用する。１つのタイプのＲＮＡｉ分子は、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であり、これは、２つの相補性オリゴヌクレオチドで構成される二本鎖ＲＮＡ分子であり、ここで、転写後、一方の鎖が転写後の相補的ｍＲＮＡに結合すると、その分解および翻訳の喪失につながる。小分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、ステムループ（ヘアピン）構造を形成する一本鎖ＲＮＡ分子であり、該構造は、発現に際して、ＤＩＣＥＲおよびＲＮＡ減少サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を通じて、ｍＲＮＡを減少させることが可能である。ＲＮＡｉ分子は、関心対象の遺伝子（ターゲット核酸）の配列に基づいて設計されてもよい。対応するＲＮＡｉを次いで、化学的にまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって合成するか、あるいはベクターまたはＰＣＲ産物から発現させてもよい。
本明細書において、用語「ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子」は、細胞質において、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を通じたＲＮＡ依存性遺伝子サイレンシングを誘導可能である小分子二本鎖ＲＮＡ分子を指し、細胞質において、これらは触媒性ＲＩＳＣ構成要素アルゴノートと相互作用する。１つのタイプのＲＮＡｉ分子は、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であり、これは、２つの相補性オリゴヌクレオチドで構成される二本鎖ＲＮＡ分子であり、ここで、転写後、一方の鎖が転写後の相補的ｍＲＮＡに結合すると、その分解および翻訳の喪失につながる。小分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、ステムループ（ヘアピン）構造を形成する一本鎖ＲＮＡ分子であり、該構造は、発現に際して、ＤＩＣＥＲおよびＲＮＡ減少サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を通じて、ｍＲＮＡを減少させることが可能である。ＲＮＡｉ分子は、関心対象の遺伝子（ターゲット核酸）の配列に基づいて設計されてもよい。対応するＲＮＡｉを次いで、化学的にまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって合成するか、あるいはベクターまたはＰＣＲ産物から発現させてもよい。
【0033】
ｓｈＲＮＡ分子は、一般的に、長さ４０～７０ヌクレオチドの間、例えば長さ４５～６５ヌクレオチドの間、例えば長さ５０～６０ヌクレオチドであり、そしてＤｉｃｅｒとして知られるエンドヌクレアーゼと相互作用し、Ｄｉｃｅｒは、ｄｓＲＮＡを、特徴的な２塩基３’オーバーハングを含む１９～２３塩基対の小分子干渉ＲＮＡにプロセシングすると考えられており、このＲＮＡは次いで、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に取り込まれる。ｓｉＲＮＡ分子は二本鎖であり、各鎖は、長さ１８～３５ヌクレオチドの間、例えば長さ２０～３０ヌクレオチド、例えば長さ２２～２７ヌクレオチドである。ｓｉＲＮＡは、しばしば、Ｄｉｃｅｒによって産生され、ＲＩＳＣ基質を形成する産物と似た２塩基３’オーバーハングを伴って設計される。Ｄｉｃｅｒ基質の有効拡張型は、本明細書に援用されるＵＳ ８，３４９，８０９およびＵＳ ８，５１３，２０７に記載されてきている。適切なターゲットｍＲＮＡへの結合に際して、ＲＩＳＣ内の１つまたはそれより多いエンドヌクレアーゼは、ターゲットを切断してサイレンシングを誘導する。ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、ＬＮＡおよびｃＥＴまたは２’置換修飾、例えば２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’フルオロ－ＡＮＡを含めて、修飾ヌクレオチド間連結および２’糖修飾ヌクレオシド、例えば２’－４’二環状リボース修飾ヌクレオシドを用いて化学的に修飾されてもよい。
【0034】
いくつかの態様において、ＲＮＡｉ核酸分子は、１つまたはそれより多いホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む。ＲＮＡｉ分子において、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結はＲＩＳＣにおけるヌクレアーゼ切断を減少させる可能性もあり、したがって、すべてのヌクレオシド間連結が修飾されているわけではないことが好適である。ホスホロチオエートヌクレオシド間連結は、好適には、ＲＮＡｉ核酸分子の３’および／または５’端、特に、ターゲット核酸に相補的でない分子部分（例えばｓｉＲＮＡ分子中のセンス鎖またはパッセンジャー鎖）に配置されてもよい。しかし、ターゲット核酸に相補的であるＲＮＡｉ分子領域（例えばｓｉＲＮＡ分子中のアンチセンスまたはガイド鎖）もまた、３’および／または５’末端の最初の２～３のヌクレオシド間連結において修飾されていてもよい。
【0035】
隣接ヌクレオチド配列
用語「隣接ヌクレオチド配列」は、ターゲット核酸に相補的であるオリゴヌクレオチド領域を指す。該用語は、本明細書において、用語「隣接核酸塩基配列」および用語「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」と交換可能に用いられる。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオチドは、隣接ヌクレオチド配列を構成する。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、隣接ヌクレオチド配列を含み、そして随意に、さらなるヌクレオチド（単数または複数）、例えば隣接ヌクレオチド配列に官能基を付着させるために用いてもよい、ヌクレオチドリンカー領域を含んでもよい。ヌクレオチドリンカー領域は、ターゲット核酸に相補的であってもまた相補的でなくてもよい。
用語「隣接ヌクレオチド配列」は、ターゲット核酸に相補的であるオリゴヌクレオチド領域を指す。該用語は、本明細書において、用語「隣接核酸塩基配列」および用語「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」と交換可能に用いられる。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオチドは、隣接ヌクレオチド配列を構成する。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、隣接ヌクレオチド配列を含み、そして随意に、さらなるヌクレオチド（単数または複数）、例えば隣接ヌクレオチド配列に官能基を付着させるために用いてもよい、ヌクレオチドリンカー領域を含んでもよい。ヌクレオチドリンカー領域は、ターゲット核酸に相補的であってもまた相補的でなくてもよい。
【0036】
ヌクレオチド
ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの構築ブロックであり、そして本発明の目的のため、ヌクレオチドには、天然存在および非天然存在ヌクレオチドが含まれる。天然には、ヌクレオチド、例えばＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分および１つまたはそれより多いリン酸基（ヌクレオシドには存在しない）を含む。ヌクレオシドおよびヌクレオチドはまた、交換可能に、「単位」または「単量体」とも称されてもよい。
ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの構築ブロックであり、そして本発明の目的のため、ヌクレオチドには、天然存在および非天然存在ヌクレオチドが含まれる。天然には、ヌクレオチド、例えばＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分および１つまたはそれより多いリン酸基（ヌクレオシドには存在しない）を含む。ヌクレオシドおよびヌクレオチドはまた、交換可能に、「単位」または「単量体」とも称されてもよい。
【0037】
修飾ヌクレオシド
用語「修飾ヌクレオシド」または「ヌクレオシド修飾」は、本明細書において、糖部分または（核酸）塩基部分の１つまたはそれより多い修飾の導入によって、同等のＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドに比較した際、修飾されているヌクレオシドを指す。好ましい態様において、修飾ヌクレオシドは、修飾糖部分を含む。用語、修飾ヌクレオシドはまた、本明細書において、用語「ヌクレオシド類似体」または修飾「単位」または修飾「単量体」と交換可能に用いられてもよい。非修飾ＤＮＡまたはＲＮＡ糖部分を含むヌクレオシドは、本明細書において、ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドと称される。ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドの塩基領域における修飾を含むヌクレオシドは、ワトソン－クリック塩基対形成が可能であるならば、なお、一般的に、ＤＮＡまたはＲＮＡと称される。
用語「修飾ヌクレオシド」または「ヌクレオシド修飾」は、本明細書において、糖部分または（核酸）塩基部分の１つまたはそれより多い修飾の導入によって、同等のＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドに比較した際、修飾されているヌクレオシドを指す。好ましい態様において、修飾ヌクレオシドは、修飾糖部分を含む。用語、修飾ヌクレオシドはまた、本明細書において、用語「ヌクレオシド類似体」または修飾「単位」または修飾「単量体」と交換可能に用いられてもよい。非修飾ＤＮＡまたはＲＮＡ糖部分を含むヌクレオシドは、本明細書において、ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドと称される。ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドの塩基領域における修飾を含むヌクレオシドは、ワトソン－クリック塩基対形成が可能であるならば、なお、一般的に、ＤＮＡまたはＲＮＡと称される。
【0038】
修飾ヌクレオシド間連結
用語「修飾ヌクレオシド間連結」は、当業者によって一般的に理解されるように、２つのヌクレオシドを共に共有結合する、ホスホジエステル（ＰＯ）連結以外の連結と定義される。本発明の核酸分子は、したがって、修飾ヌクレオシド間連結を含む。いくつかの態様において、修飾ヌクレオシド間連結は、ホスホジエステル連結に比較して、本発明の核酸分子のヌクレアーゼ耐性を増加させる。天然存在オリゴヌクレオチドに関しては、ヌクレオシド間連結には、隣接ヌクレオシドの間のホスホジエステル結合を生成するリン酸基が含まれる。修飾ヌクレオシド間連結は、核酸分子、一本鎖アンチセンス、ならびに二本鎖ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ分子を、ｉｎ ｖｉｖｏ使用のために安定化させる際に特に有用であり、そして例えば、ギャップマーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内で、ならびに修飾ヌクレオシド領域中で、本発明の核酸分子中のＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドの領域でのヌクレアーゼ切断に対して保護するように働きうる。
用語「修飾ヌクレオシド間連結」は、当業者によって一般的に理解されるように、２つのヌクレオシドを共に共有結合する、ホスホジエステル（ＰＯ）連結以外の連結と定義される。本発明の核酸分子は、したがって、修飾ヌクレオシド間連結を含む。いくつかの態様において、修飾ヌクレオシド間連結は、ホスホジエステル連結に比較して、本発明の核酸分子のヌクレアーゼ耐性を増加させる。天然存在オリゴヌクレオチドに関しては、ヌクレオシド間連結には、隣接ヌクレオシドの間のホスホジエステル結合を生成するリン酸基が含まれる。修飾ヌクレオシド間連結は、核酸分子、一本鎖アンチセンス、ならびに二本鎖ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ分子を、ｉｎ ｖｉｖｏ使用のために安定化させる際に特に有用であり、そして例えば、ギャップマーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内で、ならびに修飾ヌクレオシド領域中で、本発明の核酸分子中のＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドの領域でのヌクレアーゼ切断に対して保護するように働きうる。
【0039】
１つの態様において、核酸分子、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、天然ホスホジエステルから修飾される１つまたはそれより多いヌクレオシド間連結、例えば、ヌクレアーゼ攻撃により耐性である１つまたはそれより多い修飾ヌクレオシド間連結を含む。ヌクレアーゼ耐性は、血清中でオリゴヌクレオチドをインキュベーションすることによって、またはヌクレアーゼ耐性アッセイ（例えばヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ＳＶＰＤ））を用いることによって、決定されてもよく、これらはどちらも当該技術分野に周知である。オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増進させることが可能であるヌクレオシド間連結は、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間連結と称される。いくつかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチド中のヌクレオシド間連結、またはその隣接ヌクレオチド配列の少なくとも５０％が修飾され、例えばオリゴヌクレオチド中のヌクレオシド間連結、またはその隣接ヌクレオチド配列の少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％または例えば少なくとも９０％は修飾される。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチド中のヌクレオシド間連結、またはその隣接ヌクレオチド配列のすべてが修飾される。いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドを非ヌクレオチド官能基、例えばコンジュゲートに連結するヌクレオシドは、ホスホジエステルであってもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間連結、またはその隣接ヌクレオチド配列のすべてが、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間連結である。
【0040】
いくつかの態様において、ヌクレオシド間連結は、イオウ（Ｓ）を含み、例えばホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。本発明の核酸分子では、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結、特に一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることが好適である。
【0041】
ホスホロチオエートヌクレオシド間連結は、ヌクレアーゼ耐性、有益な薬物動態および製造の容易さのために、特に有用である。いくつかの態様において、核酸分子中のヌクレオシド間連結、またはその隣接ヌクレオチド配列の少なくとも２０％、例えば少なくとも３０％が、ホスホロチオエートである。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに関しては、ヌクレオシド間連結の少なくとも６０％、例えばオリゴヌクレオチド中のヌクレオシド間連結、またはその隣接ヌクレオチド配列の少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、または例えば少なくとも９０％がホスホロチオエートであることが好適である。いくつかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間連結、またはその隣接ヌクレオチド配列のすべてがホスホロチオエートである。ヌクレアーゼ耐性連結、例えばホスホロチオエート連結は、ターゲット核酸と二重鎖を形成した際にヌクレアーゼをリクルート可能なアンチセンスオリゴヌクレオチド領域、例えばギャップマーに関する領域Ｇにおいて特に有用である。アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドにおいて、存在するならばホスホジエステル連結が、ギャップ領域Ｇ中の隣接ＤＮＡヌクレオシド間に位置しないことが好適である。好適には、アンチセンスオリゴヌクレオチドの隣接ヌクレオチド配列のヌクレオシド間連結のすべてがホスホロチオエートである。
【0042】
ＥＰ ２ ７４２ １３５に開示されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、他のヌクレオシド間連結（ホスホジエステルおよびホスホロチオエート以外）、例えば、ＥＰ ２ ７４２ １３５によれば例えばそれ以外はＤＮＡホスホロチオエートであるギャップ領域において耐性でありうる、アルキルホスホネート／メチルホスホネートヌクレオシド間連結を含んでもよい。
【0043】
核酸塩基
用語、核酸塩基には、核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成するヌクレオシドおよびヌクレオチド中に存在する、プリン（例えばアデニンおよびグアニン）およびピリミジン（例えばウラシル、チミンおよびシトシン）部分が含まれる。本発明の背景において、用語、核酸塩基はまた、天然存在核酸塩基とは異なりうるが、核酸ハイブリダイゼーション中に機能性である、修飾核酸塩基も含む。この背景において、「核酸塩基」は、天然存在核酸塩基、例えばアデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチンおよびヒポキサンチン、ならびに非天然存在変異体の両方を指す。こうした変異体は、例えば、Ｈｉｒａｏら（２０１２） Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ ４５ ２０５５ページ、およびＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ． ３７ １．４．１に記載される。
用語、核酸塩基には、核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成するヌクレオシドおよびヌクレオチド中に存在する、プリン（例えばアデニンおよびグアニン）およびピリミジン（例えばウラシル、チミンおよびシトシン）部分が含まれる。本発明の背景において、用語、核酸塩基はまた、天然存在核酸塩基とは異なりうるが、核酸ハイブリダイゼーション中に機能性である、修飾核酸塩基も含む。この背景において、「核酸塩基」は、天然存在核酸塩基、例えばアデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチンおよびヒポキサンチン、ならびに非天然存在変異体の両方を指す。こうした変異体は、例えば、Ｈｉｒａｏら（２０１２） Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ ４５ ２０５５ページ、およびＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ． ３７ １．４．１に記載される。
【0044】
いくつかの態様において、核酸塩基部分は、プリンまたはピリミジンを、修飾プリンまたはピリミジン、例えば置換プリンまたは置換ピリミジン、例えばイソシトシン、シュードイソシトシン、５－メチルシトシン、５－チオゾロ－シトシン、５－プロピニル－シトシン、５－プロピニル－ウラシル、５－ブロモウラシル、５－チアゾロ－ウラシル、２－チオ－ウラシル、２’チオ－チミン、イノシン、ジアミノプリン、６－アミノプリン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリンおよび２－クロロ－６－アミノプリンより選択される核酸塩基に変化させることによって修飾される。
【0045】
対応する各核酸塩基、例えばＡ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＵに関する文字コードによって、核酸塩基部分を示してもよく、ここで、各文字は、随意に、同等の機能の修飾核酸塩基を含んでもよい。例えば、例示的なオリゴヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、および５－メチルシトシンより選択される。随意に、ＬＮＡギャップマーに関して、５－メチルシトシンＬＮＡヌクレオシドを用いてもよい。
【0046】
修飾オリゴヌクレオチド
用語、修飾オリゴヌクレオチドまたは修飾核酸分子は、１つまたはそれより多い糖修飾ヌクレオシドおよび／または修飾ヌクレオシド間連結を含む、オリゴヌクレオチドまたは核酸分子を記載する。用語「キメラ」は、文献において、修飾ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドまたは核酸分子、特にギャップマーオリゴヌクレオチドを記載するよう用いられてきている用語である。
用語、修飾オリゴヌクレオチドまたは修飾核酸分子は、１つまたはそれより多い糖修飾ヌクレオシドおよび／または修飾ヌクレオシド間連結を含む、オリゴヌクレオチドまたは核酸分子を記載する。用語「キメラ」は、文献において、修飾ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドまたは核酸分子、特にギャップマーオリゴヌクレオチドを記載するよう用いられてきている用語である。
【0047】
相補性
用語「相補性」は、ヌクレオシド／ヌクレオチドのワトソン－クリック塩基対形成に関する能力を記載する。ワトソン－クリック塩基対は、グアニン（Ｇ）－シトシン（Ｃ）およびアデニン（Ａ）－チミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）である。オリゴヌクレオチドは、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドを含んでもよく、例えば、５－メチルシトシンは、しばしばシトシンの代わりに用いられ、そしてこうしたものとして、用語、相補性は、非修飾および修飾核酸塩基間のワトソン－クリック塩基対形成を含むことが理解されるであろう（例えば、Ｈｉｒａｏら（２０１２） Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ ４５ ２０５５ページ、およびＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ． ３７ １．４．１を参照されたい）。
用語「相補性」は、ヌクレオシド／ヌクレオチドのワトソン－クリック塩基対形成に関する能力を記載する。ワトソン－クリック塩基対は、グアニン（Ｇ）－シトシン（Ｃ）およびアデニン（Ａ）－チミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）である。オリゴヌクレオチドは、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドを含んでもよく、例えば、５－メチルシトシンは、しばしばシトシンの代わりに用いられ、そしてこうしたものとして、用語、相補性は、非修飾および修飾核酸塩基間のワトソン－クリック塩基対形成を含むことが理解されるであろう（例えば、Ｈｉｒａｏら（２０１２） Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ ４５ ２０５５ページ、およびＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ． ３７ １．４．１を参照されたい）。
【0048】
用語「相補性％」は、本明細書において、隣接ヌクレオチド配列に渡って、参照配列（例えばターゲット配列または配列モチーフ）に相補的である、核酸分子（例えばオリゴヌクレオチド）中の隣接ヌクレオチド配列のヌクレオチド比率（パーセント）を指す。相補性の割合は、したがって、２つの配列の間で相補的である（ワトソン・クリック塩基対から）（ターゲット配列５’－３’および３’－５’のオリゴヌクレオチド配列を整列させた際）整列核酸塩基の数を数え、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチド総数によってその数を割り、そして１００を乗じることによって、計算される。こうした比較において、整列しない（塩基対を形成しない）核酸塩基／ヌクレオチドはミスマッチと称される。隣接ヌクレオチド配列の相補性％の計算においては、挿入および欠失は許容されない。相補性を決定する際、核酸塩基がワトソン・クリック塩基対形成を形成する機能的能力が保持される限り、核酸塩基の化学修飾は考慮されない（例えば、５’－メチルシトシンは、同一性％を計算する目的のためには、シトシンと同一であると見なされる）ことが理解されるであろう。
【0049】
用語「完全相補性」は、１００％相補性を指す。
以下は、ターゲット核酸に完全に相補的であるオリゴヌクレオチドの例である。
以下は、ターゲット核酸（配列番号２２）に完全に相補的であるオリゴヌクレオチドモチーフ（配列番号３３）の例である。
以下は、ターゲット核酸に完全に相補的であるオリゴヌクレオチドの例である。
以下は、ターゲット核酸（配列番号２２）に完全に相補的であるオリゴヌクレオチドモチーフ（配列番号３３）の例である。
【0050】
【化1】
【0051】
同一性
用語「同一性」は、本明細書において、隣接ヌクレオチド配列に渡って、参照配列（例えば配列モチーフ）と同一である、核酸分子（例えばオリゴヌクレオチド）中の隣接ヌクレオチド配列のヌクレオチドの比率（パーセントで表す）を指す。したがって、同一性の割合は、２つの配列（本発明の化合物の隣接ヌクレオチド配列中および参照配列中）の間で同一である（マッチしている）整列核酸塩基の数を数え、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの総数によってその数を割り、そして１００を乗じることによって、計算される。したがって、同一性パーセント＝（マッチｘ１００）／整列領域の長さ（例えば隣接ヌクレオチド配列）である。隣接ヌクレオチド配列の同一性パーセントの計算においては、挿入および欠失は許容されない。同一性を決定する際、核酸塩基がワトソン・クリック塩基対形成を形成する機能的能力が保持される限り、核酸塩基の化学修飾は考慮されない（例えば、５－メチルシトシンは、同一性％を計算する目的のためには、シトシンと同一であると見なされる）ことが理解されるであろう。
用語「同一性」は、本明細書において、隣接ヌクレオチド配列に渡って、参照配列（例えば配列モチーフ）と同一である、核酸分子（例えばオリゴヌクレオチド）中の隣接ヌクレオチド配列のヌクレオチドの比率（パーセントで表す）を指す。したがって、同一性の割合は、２つの配列（本発明の化合物の隣接ヌクレオチド配列中および参照配列中）の間で同一である（マッチしている）整列核酸塩基の数を数え、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの総数によってその数を割り、そして１００を乗じることによって、計算される。したがって、同一性パーセント＝（マッチｘ１００）／整列領域の長さ（例えば隣接ヌクレオチド配列）である。隣接ヌクレオチド配列の同一性パーセントの計算においては、挿入および欠失は許容されない。同一性を決定する際、核酸塩基がワトソン・クリック塩基対形成を形成する機能的能力が保持される限り、核酸塩基の化学修飾は考慮されない（例えば、５－メチルシトシンは、同一性％を計算する目的のためには、シトシンと同一であると見なされる）ことが理解されるであろう。
【0052】
ハイブリダイゼーション
用語「ハイブリダイズしている」または「ハイブリダイズする」は、本明細書において、反対の鎖上の塩基対の間で水素結合を形成し、それによって二重鎖を形成している、２つの核酸鎖（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡガイド鎖およびターゲット核酸）と理解されるものとする。２つの核酸鎖の間の結合のアフィニティは、ハイブリダイゼーションの強度である。これは、しばしば、オリゴヌクレオチドの半分がターゲット核酸と二重鎖形成する温度として定義される、融解温度（Ｔｍ）に関して記載される。生理学的条件で、Ｔｍは、アフィニティに厳密には比例しない（ＭｅｒｇｎｙおよびＬａｃｒｏｉｘ， ２００３， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １３：５１５－５３７）。標準状態ギブス自由エネルギーΔＧ°は、結合アフィニティのより正確な提示であり、そしてΔＧ°＝－ＲＴｌｎ（Ｋｄ）、式中、Ｒは気体定数であり、そしてＴは絶対温度である、による反応の解離定数（Ｋｄ）に関連する。したがって、オリゴヌクレオチドおよびターゲット核酸の間の反応の非常に低いΔＧ°は、オリゴヌクレオチドおよびターゲット核酸の間の強いハイブリダイゼーションを反映する。ΔＧ°は、水性濃度が１Ｍであり、ｐＨが７であり、そして温度が３７℃である反応と関連するエネルギーである。オリゴヌクレオチドのターゲット核酸へのハイブリダイゼーションは自発的反応であり、そして自発的反応に関して、ΔＧ°はゼロ未満である。例えば、Ｈａｎｓｅｎら， １９６５，Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍ． ３６－３８およびＨｏｌｄｇａｔｅら， ２００５， Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙに記載されるような等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）法の使用によって、ΔＧ°を実験的に測定してもよい。当業者は、商業的装置がΔＧ°測定に利用可能であることを知っている。また、Ｓｕｇｉｍｏｔｏら， １９９５， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１１２１１－１１２１６およびＭｃＴｉｇｕｅら， ２００４， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３：５３８８－５４０５に記載される、適切に得られる熱力学パラメータを用い、ＳａｎｔａＬｕｃｉａ， １９９８， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ９５： １４６０－１４６５に記載されるような最近傍モデルを用いることによって、ΔＧ°を数値的に概算してもよい。ハイブリダイゼーションによる、意図される核酸ターゲットの調節可能性を有するため、本発明のオリゴヌクレオチドは、長さ１０～３０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドに関して、－１０ｋｃａｌ未満の概算ΔＧ°値でターゲット核酸にハイブリダイズする。いくつかの態様において、ハイブリダイゼーションの度合いまたは強度は、標準状態ギブス自由エネルギーΔＧ°によって測定される。オリゴヌクレオチドは、長さ８～３０ヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドに関して、－１０ｋｃａｌ未満の範囲、例えば－１５ｋｃａｌ未満、例えば－２０ｋｃａｌ未満および例えば－２５ｋｃａｌ未満の概算ΔＧ°値で、ターゲット核酸にハイブリダイズしてもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、－１０～－６０ｋｃａｌ、例えば－１２～－４０、例えば－１５～－３０ｋｃａｌまたは－１６～－２７ｋｃａｌ、例えば－１８～－２５ｋｃａｌの概算ΔＧ°値でターゲット核酸にハイブリダイズする。
用語「ハイブリダイズしている」または「ハイブリダイズする」は、本明細書において、反対の鎖上の塩基対の間で水素結合を形成し、それによって二重鎖を形成している、２つの核酸鎖（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡガイド鎖およびターゲット核酸）と理解されるものとする。２つの核酸鎖の間の結合のアフィニティは、ハイブリダイゼーションの強度である。これは、しばしば、オリゴヌクレオチドの半分がターゲット核酸と二重鎖形成する温度として定義される、融解温度（Ｔｍ）に関して記載される。生理学的条件で、Ｔｍは、アフィニティに厳密には比例しない（ＭｅｒｇｎｙおよびＬａｃｒｏｉｘ， ２００３， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １３：５１５－５３７）。標準状態ギブス自由エネルギーΔＧ°は、結合アフィニティのより正確な提示であり、そしてΔＧ°＝－ＲＴｌｎ（Ｋｄ）、式中、Ｒは気体定数であり、そしてＴは絶対温度である、による反応の解離定数（Ｋｄ）に関連する。したがって、オリゴヌクレオチドおよびターゲット核酸の間の反応の非常に低いΔＧ°は、オリゴヌクレオチドおよびターゲット核酸の間の強いハイブリダイゼーションを反映する。ΔＧ°は、水性濃度が１Ｍであり、ｐＨが７であり、そして温度が３７℃である反応と関連するエネルギーである。オリゴヌクレオチドのターゲット核酸へのハイブリダイゼーションは自発的反応であり、そして自発的反応に関して、ΔＧ°はゼロ未満である。例えば、Ｈａｎｓｅｎら， １９６５，Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍ． ３６－３８およびＨｏｌｄｇａｔｅら， ２００５， Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙに記載されるような等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）法の使用によって、ΔＧ°を実験的に測定してもよい。当業者は、商業的装置がΔＧ°測定に利用可能であることを知っている。また、Ｓｕｇｉｍｏｔｏら， １９９５， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１１２１１－１１２１６およびＭｃＴｉｇｕｅら， ２００４， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３：５３８８－５４０５に記載される、適切に得られる熱力学パラメータを用い、ＳａｎｔａＬｕｃｉａ， １９９８， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ９５： １４６０－１４６５に記載されるような最近傍モデルを用いることによって、ΔＧ°を数値的に概算してもよい。ハイブリダイゼーションによる、意図される核酸ターゲットの調節可能性を有するため、本発明のオリゴヌクレオチドは、長さ１０～３０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドに関して、－１０ｋｃａｌ未満の概算ΔＧ°値でターゲット核酸にハイブリダイズする。いくつかの態様において、ハイブリダイゼーションの度合いまたは強度は、標準状態ギブス自由エネルギーΔＧ°によって測定される。オリゴヌクレオチドは、長さ８～３０ヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドに関して、－１０ｋｃａｌ未満の範囲、例えば－１５ｋｃａｌ未満、例えば－２０ｋｃａｌ未満および例えば－２５ｋｃａｌ未満の概算ΔＧ°値で、ターゲット核酸にハイブリダイズしてもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、－１０～－６０ｋｃａｌ、例えば－１２～－４０、例えば－１５～－３０ｋｃａｌまたは－１６～－２７ｋｃａｌ、例えば－１８～－２５ｋｃａｌの概算ΔＧ°値でターゲット核酸にハイブリダイズする。
【0053】
ターゲット核酸
本発明にしたがって、ターゲット核酸は、哺乳動物ＦＵＢＰ１をコードする核酸であり、そして例えば、遺伝子、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびプレｍＲＮＡ、成熟ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列であってもよい。したがって、ターゲットは、ＦＵＢＰ１ターゲット核酸と称されてもよい。
本発明にしたがって、ターゲット核酸は、哺乳動物ＦＵＢＰ１をコードする核酸であり、そして例えば、遺伝子、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびプレｍＲＮＡ、成熟ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列であってもよい。したがって、ターゲットは、ＦＵＢＰ１ターゲット核酸と称されてもよい。
【0054】
本発明の療法核酸分子は、例えば哺乳動物ＦＵＢＰ１（特にｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡであるが、アンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよい）のエクソン領域をターゲティングしてもよいし、または例えば、ＦＵＢＰ１プレｍＲＮＡ（特にアンチセンスオリゴヌクレオチド）中の任意のイントロン領域をターゲティングしてもよい。表１は、配列番号１の予測されるエクソンおよびイントロン領域を列挙する。
【0055】
表１．ヒトＦＵＢＰ１プレｍＲＮＡ中のエクソンおよびイントロン領域
【0056】
【表1】
【0057】
適切には、ターゲット核酸は、ヒト、サルおよびマウスＦＵＢＰ１のゲノム配列、成熟ｍＲＮＡおよびプレｍＲＮＡ配列を提供する、ＦＵＢＰ１タンパク質、特に哺乳動物ＦＵＢＰ１、例えばヒトＦＵＢＰ１（例えば表２および３を参照されたい）をコードする。
【0058】
いくつかの態様において、ターゲット核酸は、配列番号２、３、４、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および／または２０、あるいはその天然存在変異体（例えば哺乳動物ＦＵＢＰ１をコードする配列）からなる群より選択される。
【0059】
いくつかの態様において、ターゲット核酸は、配列番号１、５および／または９、あるいはその天然存在変異体（例えば哺乳動物ＦＵＢＰ１をコードする配列）からなる群より選択される。
【0060】
いくつかの態様において、ターゲット核酸は、配列番号１および５、あるいはその天然存在変異体（例えば哺乳動物ＦＵＢＰ１をコードする配列）からなる群より選択される。
いくつかの態様において、ターゲット核酸は、配列番号１～８、あるいはその天然存在変異体（例えば哺乳動物ＦＵＢＰ１をコードする配列）からなる群より選択される。
いくつかの態様において、ターゲット核酸は、配列番号１～８、あるいはその天然存在変異体（例えば哺乳動物ＦＵＢＰ１をコードする配列）からなる群より選択される。
【0061】
表２．種に渡るＦＵＢＰ１に関するゲノムおよび組み立て情報
【0062】
【表2】
【0063】
順＝順方向鎖、逆＝逆方向鎖。ゲノム配置は、プレｍＲＮＡ配列（ゲノム配列）を提供する。
本発明の核酸分子を研究または診断に使用する場合、ターゲット核酸はｃＤＮＡであっても、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡ由来の合成核酸であってもよい。
本発明の核酸分子を研究または診断に使用する場合、ターゲット核酸はｃＤＮＡであっても、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡ由来の合成核酸であってもよい。
【0064】
ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ適用のため、本発明の療法核酸分子は、典型的には、ＦＵＢＰ１ターゲット核酸を発現している細胞において、ＦＵＢＰ１ターゲット核酸の発現を阻害することが可能である。本発明の核酸分子の核酸塩基の隣接配列は、典型的には、随意に１つまたは２つのミスマッチの例外を伴い、そして随意に、コンジュゲートまたは他の非相補的末端ヌクレオチドなどの随意の機能性基にオリゴヌクレオチドを連結可能なヌクレオチドに基づくリンカーを除いて、オリゴヌクレオチドの全長に渡って測定されるような、ＦＵＢＰ１ターゲット核酸の保存された領域に相補的である。例示的なターゲット核酸のさらなる情報を表３に提供する。
【0065】
表３．種に渡るＦＵＢＰ１に関する配列詳細
【0066】
【表3】
【0067】
配列番号５が多数のＮＮＮＮの領域を含み、ここで配列決定は該配列を正確に精錬することは不可能であり、そしてしたがって縮重配列が含まれることに注目されたい。疑義を回避するため、本発明の化合物は、実際のターゲット配列に相補的であり、そしてしたがって、縮重化合物ではない。
【0068】
ターゲット配列
用語「ターゲット配列」は、本明細書において、本発明のオリゴヌクレオチドまたは核酸分子に相補的である核酸塩基配列を含むターゲット核酸中に存在するヌクレオチド配列を指す。いくつかの態様において、ターゲット配列は、本発明のオリゴヌクレオチドの隣接ヌクレオチド配列に相補的である核酸塩基配列を含むターゲット核酸上の領域（すなわち下位配列）からなる。ターゲット核酸のこの領域を、交換可能に、ターゲットヌクレオチド配列、ターゲット配列またはターゲット領域と称してもよい。いくつかの態様において、ターゲット配列は、単一核酸分子の相補配列より長く、そして例えば、本発明のいくつかの核酸分子によってターゲティングされてもよい、ターゲット核酸の好ましい領域を示してもよい。
用語「ターゲット配列」は、本明細書において、本発明のオリゴヌクレオチドまたは核酸分子に相補的である核酸塩基配列を含むターゲット核酸中に存在するヌクレオチド配列を指す。いくつかの態様において、ターゲット配列は、本発明のオリゴヌクレオチドの隣接ヌクレオチド配列に相補的である核酸塩基配列を含むターゲット核酸上の領域（すなわち下位配列）からなる。ターゲット核酸のこの領域を、交換可能に、ターゲットヌクレオチド配列、ターゲット配列またはターゲット領域と称してもよい。いくつかの態様において、ターゲット配列は、単一核酸分子の相補配列より長く、そして例えば、本発明のいくつかの核酸分子によってターゲティングされてもよい、ターゲット核酸の好ましい領域を示してもよい。
【0069】
いくつかの態様において、ターゲット配列は、ヒトＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡエクソン、例えばｅ１、ｅ２、ｅ３、ｅ４、ｅ５、ｅ６、ｅ７、ｅ８、ｅ９、ｅ１０、ｅ１１、ｅ１２、１３、ｅ１４、ｅ１５、ｅ１６、ｅ１７、ｅ１８、ｅ１９およびｅ２０（例えば上記表１を参照されたい）からなる群より選択されるＦＵＢＰ１ヒトｍＲＮＡエクソンからなる群より選択される配列である。
【0070】
１つの態様において、ターゲット配列は、エクソン９、１０、１２および２０からなる群より選択されるヒトＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡエクソンの１つまたはそれより多くからなる群より選択される配列である。
【0071】
いくつかの態様において、ターゲット配列は、ヒトＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡイントロン、例えばｉ１、ｉ２、ｉ３、ｉ４、ｉ５、ｉ６、ｉ７、ｉ９、ｉ１０、ｉ１１、ｉ１２、１３、ｉ１４、ｉ１５、ｉ１６、ｉ１７、ｉ１８およびｉ１９（例えば上記表１を参照されたい）からなる群より選択されるＦＵＢＰ１ヒトｍＲＮＡイントロンからなる群より選択される配列である。
【0072】
本発明の核酸分子は、ターゲット核酸上の領域、例えば本明細書記載のターゲット配列に相補的であるかまたはハイブリダイズする、隣接ヌクレオチド配列を含む。
療法核酸分子が相補的であるかまたはハイブリダイズするターゲット核酸配列は、一般的に、少なくとも１０ヌクレオチドの隣接核酸塩基のストレッチを含む。隣接ヌクレオチド配列は、１２～７０ヌクレオチド、例えば１２～５０、例えば１３～３０、例えば１４～２５、例えば１５～２０、例えば１６～１８隣接ヌクレオチドの間である。
療法核酸分子が相補的であるかまたはハイブリダイズするターゲット核酸配列は、一般的に、少なくとも１０ヌクレオチドの隣接核酸塩基のストレッチを含む。隣接ヌクレオチド配列は、１２～７０ヌクレオチド、例えば１２～５０、例えば１３～３０、例えば１４～２５、例えば１５～２０、例えば１６～１８隣接ヌクレオチドの間である。
【0073】
ターゲット細胞
用語「ターゲット細胞」は、本明細書において、ターゲット核酸を発現している細胞を指す。本発明の療法使用のため、ターゲット細胞がＨＢＶに感染していることが好適である。いくつかの態様において、ターゲット細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにあってもよい。いくつかの態様において、ターゲット細胞は、哺乳動物細胞、例えば齧歯類細胞、例えばマウス細胞またはラット細胞、あるいは霊長類細胞、例えばサル細胞またはヒト細胞である。
用語「ターゲット細胞」は、本明細書において、ターゲット核酸を発現している細胞を指す。本発明の療法使用のため、ターゲット細胞がＨＢＶに感染していることが好適である。いくつかの態様において、ターゲット細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにあってもよい。いくつかの態様において、ターゲット細胞は、哺乳動物細胞、例えば齧歯類細胞、例えばマウス細胞またはラット細胞、あるいは霊長類細胞、例えばサル細胞またはヒト細胞である。
【0074】
好ましい態様において、ターゲット細胞は、ＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡ、例えばＦＵＢＰ１プレｍＲＮＡまたはＦＵＢＰ１成熟ｍＲＮＡを発現する。ＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡのポリＡテールは、典型的には、核酸分子ターゲティングに関しては無視される。
【0075】
天然存在変異体
用語「天然存在変異体」は、ターゲット核酸と同じ遺伝子座から生じるが、例えば同じアミノ酸をコードする複数のコドンを引き起こす遺伝暗号の縮重によって、またはプレｍＲＮＡの選択的スプライシングによって、または多型、例えば一塩基多型、およびアレル変異体の存在によって、異なる可能性がある、ＦＵＢＰ１遺伝子または転写物の変異体を指す。したがって、オリゴヌクレオチドに対する十分な相補的配列の存在に基づいて、本発明のオリゴヌクレオチドは、ターゲット核酸およびその天然存在変異体をターゲティングすることも可能である。
用語「天然存在変異体」は、ターゲット核酸と同じ遺伝子座から生じるが、例えば同じアミノ酸をコードする複数のコドンを引き起こす遺伝暗号の縮重によって、またはプレｍＲＮＡの選択的スプライシングによって、または多型、例えば一塩基多型、およびアレル変異体の存在によって、異なる可能性がある、ＦＵＢＰ１遺伝子または転写物の変異体を指す。したがって、オリゴヌクレオチドに対する十分な相補的配列の存在に基づいて、本発明のオリゴヌクレオチドは、ターゲット核酸およびその天然存在変異体をターゲティングすることも可能である。
【0076】
いくつかの態様において、天然存在変異体は、哺乳動物ＦＵＢＰ１ターゲット核酸、例えば配列番号１、５または９からなる群より選択されるターゲット核酸に、少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同性を有する。いくつかの態様において、天然存在変異体は、配列番号１のヒトＦＵＢＰ１ターゲット核酸に少なくとも９９％の相同性を有する。いくつかの態様において、天然存在変異体は、既知の多型である。
【0077】
発現の調節
用語「発現の調節」は、本明細書において、核酸分子の投与前のＦＵＢＰ１の量に比較した際に、ＦＵＢＰ１の量を改変する核酸分子の能力に関する、全体の用語として理解されるものとする。あるいは、対照実験を参照することによって、発現の調節を決定してもよい。一般的に、対照は、生理食塩水組成物で処置された個体またはターゲット細胞、あるいは非ターゲティングまたは核酸分子で処置された個体またはターゲット細胞（偽）であると理解される。しかし、これはまた、標準治療で処置された個体であってもよい。
用語「発現の調節」は、本明細書において、核酸分子の投与前のＦＵＢＰ１の量に比較した際に、ＦＵＢＰ１の量を改変する核酸分子の能力に関する、全体の用語として理解されるものとする。あるいは、対照実験を参照することによって、発現の調節を決定してもよい。一般的に、対照は、生理食塩水組成物で処置された個体またはターゲット細胞、あるいは非ターゲティングまたは核酸分子で処置された個体またはターゲット細胞（偽）であると理解される。しかし、これはまた、標準治療で処置された個体であってもよい。
【0078】
調節の１つのタイプは、例えばｍＲＮＡの分解または転写の遮断によって、ＦＵＢＰ１の発現を阻害するか、下方制御するか、減少させるか、除去するか、停止するか、防止するか、減弱させるか、低下させるか、回避するかまたは終結させる核酸分子の能力である。
【0079】
高アフィニティ修飾ヌクレオシド
高アフィニティ修飾ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチド内に取り込まれた際、例えば融解温度（Ｔｍ）によって測定した際に、相補的ターゲットに対するオリゴヌクレオチドのアフィニティを増進させる、修飾ヌクレオチドである。本発明の高アフィニティ修飾ヌクレオシドは、好ましくは、修飾ヌクレオシドあたり、＋０．５～＋１２℃、より好ましくは＋１．５～＋１０℃、そして最も好ましくは＋３～＋８℃の間の融解温度の増加を生じる。多くの高アフィニティ修飾ヌクレオシドが当該技術分野に知られ、そしてこれには、例えば、多くの２’糖修飾ヌクレオシド、例えば２’置換ヌクレオシド、例えばＯｍｅおよびＭＯＥ、ならびに２’から４’で架橋された核酸、例えばロックト核酸（ＬＮＡ）が含まれる（例えば、Ｆｒｅｉｅｒ ＆ Ａｌｔｍａｎｎ； Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．， １９９７， ２５， ４４２９－４４４３、およびＵｈｌｍａｎｎ； Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， ２０００， ３（２）， ２９３－２１３を参照されたい）。
高アフィニティ修飾ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチド内に取り込まれた際、例えば融解温度（Ｔｍ）によって測定した際に、相補的ターゲットに対するオリゴヌクレオチドのアフィニティを増進させる、修飾ヌクレオチドである。本発明の高アフィニティ修飾ヌクレオシドは、好ましくは、修飾ヌクレオシドあたり、＋０．５～＋１２℃、より好ましくは＋１．５～＋１０℃、そして最も好ましくは＋３～＋８℃の間の融解温度の増加を生じる。多くの高アフィニティ修飾ヌクレオシドが当該技術分野に知られ、そしてこれには、例えば、多くの２’糖修飾ヌクレオシド、例えば２’置換ヌクレオシド、例えばＯｍｅおよびＭＯＥ、ならびに２’から４’で架橋された核酸、例えばロックト核酸（ＬＮＡ）が含まれる（例えば、Ｆｒｅｉｅｒ ＆ Ａｌｔｍａｎｎ； Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．， １９９７， ２５， ４４２９－４４４３、およびＵｈｌｍａｎｎ； Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， ２０００， ３（２）， ２９３－２１３を参照されたい）。
【0080】
糖修飾
本発明の核酸分子は、修飾糖部分、すなわちＤＮＡおよびＲＮＡに見られるリボース糖部分と比較した際の糖部分の修飾を有する、１つまたはそれより多いヌクレオシドを含んでもよい。
本発明の核酸分子は、修飾糖部分、すなわちＤＮＡおよびＲＮＡに見られるリボース糖部分と比較した際の糖部分の修飾を有する、１つまたはそれより多いヌクレオシドを含んでもよい。
【0081】
リボース糖部分の修飾を含む多くのヌクレオシドは、主に、核酸分子の特定の特性、例えばアフィニティおよび／またはヌクレアーゼ耐性を改善する目的で、作製されてきている。
【0082】
こうした修飾には、リボース環構造が、例えばヘキソース環（ＨＮＡ）での置換によって修飾されているか、または典型的にはリボース環上のＣ２およびＣ４炭素の間のビラジカル（ｂｉｒａｄｉｃｌｅ）架橋を有する二環（ＬＮＡ）であるか、または典型的にはＣ２およびＣ３炭素の間の結合を欠く非連結リボース環（例えばＵＮＡ）であるものが含まれる。他の糖修飾ヌクレオシドには、例えば、ビシクロヘキソース核酸（ＷＯ２０１１／０１７５２１）または三環核酸（ＷＯ２０１３／１５４７９８）が含まれる。修飾ヌクレオシドにはまた、糖部分が非糖部分で置換されるヌクレオシド、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）の場合のようなもの、またはモルホリノ核酸が含まれる。
【0083】
糖修飾にはまた、ＲＮＡまたはＤＮＡヌクレオシドにおいて天然に見られる、水素または－ＯＨ基以外の基へのリボース環上の置換基の改変を通じて行われる修飾も含まれる。置換基は、例えば、２’、３’、４’または５’位で導入されてもよい。
【0084】
２’糖修飾ヌクレオシド
２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位でＨまたは－ＯＨ以外の置換基を有するヌクレオシド（２’置換ヌクレオシド）であるか、またはリボース環の２’炭素および第二の炭素の間で架橋を形成することが可能な２’連結ビラジカルを含むヌクレオシド、例えばＬＮＡ（２’－４’ビラジカル架橋）ヌクレオシドである。
２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位でＨまたは－ＯＨ以外の置換基を有するヌクレオシド（２’置換ヌクレオシド）であるか、またはリボース環の２’炭素および第二の炭素の間で架橋を形成することが可能な２’連結ビラジカルを含むヌクレオシド、例えばＬＮＡ（２’－４’ビラジカル架橋）ヌクレオシドである。
【0085】
実際、２’置換ヌクレオシドを開発することに多くの注力がなされてきており、そして多くの２’置換ヌクレオシドが、オリゴヌクレオチド内に取り込まれた際に、有益な特性を有することが見出されてきている。例えば、２’修飾糖は、オリゴヌクレオチドに、増進された結合アフィニティおよび／または増加したヌクレアーゼ耐性を提供しうる。２’置換修飾ヌクレオシドの例は、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ、および２’－Ｆ－ＡＮＡヌクレオシドである。さらなる例に関しては、例えば、Ｆｒｅｉｅｒ ＆ Ａｌｔｍａｎｎ； Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．， １９９７， ２５， ４４２９－４４４３、ならびにＵｈｌｍａｎｎ； Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， ２０００， ３（２）， ２９３－２１３、ならびにＤｅｌｅａｖｅｙおよびＤａｍｈａ， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１２， １９， ９３７を参照されたい。以下は、いくつかの２’置換修飾ヌクレオシドの例である。
【0086】
【化2】
【0087】
本発明に関して、２’置換にはＬＮＡのような２’架橋分子は含まれない。
ロックト核酸ヌクレオシド（ＬＮＡ）
「ＬＮＡヌクレオシド」は、前記ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’およびＣ４’を連結するビラジカル（「２’－４’架橋」とも称される）を含み、これがリボース環のコンホメーションを制限するかまたはロックする、２’修飾ヌクレオシドである。これらのヌクレオシドはまた、文献において、架橋核酸または二環核酸（ＢＮＡ）とも称される。リボースのコンホメーションのロックは、ＬＮＡが相補的ＲＮＡまたはＤＮＡ分子に対するオリゴヌクレオチド内に取り込まれた際に、ハイブリダイゼーションアフィニティの増進（二重鎖安定化）と関連する。これは、オリゴヌクレオチド／相補体二重鎖の融解温度を測定することによって、ルーチンに決定可能である。
ロックト核酸ヌクレオシド（ＬＮＡ）
「ＬＮＡヌクレオシド」は、前記ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’およびＣ４’を連結するビラジカル（「２’－４’架橋」とも称される）を含み、これがリボース環のコンホメーションを制限するかまたはロックする、２’修飾ヌクレオシドである。これらのヌクレオシドはまた、文献において、架橋核酸または二環核酸（ＢＮＡ）とも称される。リボースのコンホメーションのロックは、ＬＮＡが相補的ＲＮＡまたはＤＮＡ分子に対するオリゴヌクレオチド内に取り込まれた際に、ハイブリダイゼーションアフィニティの増進（二重鎖安定化）と関連する。これは、オリゴヌクレオチド／相補体二重鎖の融解温度を測定することによって、ルーチンに決定可能である。
【0088】
限定なしに、例示的なＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ ９９／０１４２２６、ＷＯ ００／６６６０４、ＷＯ ９８／０３９３５２、ＷＯ ２００４／０４６１６０、ＷＯ ００／０４７５９９、ＷＯ ２００７／１３４１８１、ＷＯ ２０１０／０７７５７８、ＷＯ ２０１０／０３６６９８、ＷＯ ２００７／０９００７１、ＷＯ ２００９／００６４７８、ＷＯ ２０１１／１５６２０２、ＷＯ ２００８／１５４４０１、ＷＯ ２００９／０６７６４７、ＷＯ ２００８／１５０７２９、Ｍｏｒｉｔａら， Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． １２，７３－７６、Ｓｅｔｈら Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ２０１０， Ｖｏｌ ７５（５） ｐｐ． １５６９－８１、およびＭｉｔｓｕｏｋａら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００９， ３７（４）， １２２５－１２３８、ならびにＷａｎおよびＳｅｔｈ， Ｊ． Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１６， ５９， ９６４５－９６６７に開示される。
【0089】
さらに限定なしに、例示的なＬＮＡヌクレオシドをスキーム１に開示する。
スキーム１：
スキーム１：
【0090】
【化3】
【0091】
特定のＬＮＡヌクレオシドは、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ、６’－メチル－ベータ－Ｄ－オキシＬＮＡ、例えば（Ｓ）－６’－メチル－ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ（ＳｃＥＴ）およびＥＮＡである。特に好適なＬＮＡはベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡである。
【0092】
ヌクレアーゼ仲介性分解
ヌクレアーゼ仲介性分解は、こうした配列を含む二重鎖を形成する際、相補ヌクレオチド配列の分解を仲介可能な核酸分子を指す。
ヌクレアーゼ仲介性分解は、こうした配列を含む二重鎖を形成する際、相補ヌクレオチド配列の分解を仲介可能な核酸分子を指す。
【0093】
いくつかの態様において、核酸分子は、ターゲット核酸のヌクレアーゼ仲介性分解を通じて機能しうる。特に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーションを認識し、そしてＲＮＡ核酸の切断を達成するエンドリボヌクレアーゼ（ＲＮＡアーゼ）をリクルートすることが可能である。ＲＮアーゼＨは、好適なリボヌクレアーゼであることが立証されてきている。ヌクレアーゼ仲介性機構を通じて作用するアンチセンスオリゴヌクレオチド設計の例は、典型的には少なくとも５つまたは６つの連続ＤＮＡヌクレオシドの領域を含み、そして片側または両側にアフィニティを増進させるヌクレオシド、例えばギャップマー、ヘッドマーおよびテールマーが隣接する、オリゴヌクレオチドである。
【0094】
ＲＮＡアーゼＨ活性およびリクルートメント
アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮアーゼＨ活性は、相補ＲＮＡ分子との二重鎖にある際に、ＲＮアーゼＨをリクルートする能力を指す。ＷＯ０１／２３６１３は、ＲＮアーゼＨ活性を決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法を提供し、該方法を用いて、ＲＮアーゼＨをリクルートする能力を決定してもよい。典型的には、オリゴヌクレオチドは、相補ターゲット核酸配列とともに提供された際、試験される修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、オリゴヌクレオチドにおけるすべての単量体の間にホスホロチオエート連結を持つＤＮＡ単量体のみを含有するオリゴヌクレオチドを用い、そしてＷＯ０１／２３６１３（本明細書に援用される）の実施例９１～９５によって提供される方法論を用いた際に決定される初速の少なくとも５％、例えば少なくとも１０％または２０％より高いｐｍоｌ／ｌ／分で測定される初速を有する場合、ＲＮアーゼＨをリクルート可能であると見なされる。ＲＮアーゼＨ活性を決定する際に使用するため、組換えヒトＲＮアーゼＨはＬｕｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＧｍｂＨ、スイス・ルツェルンより入手可能である。
アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮアーゼＨ活性は、相補ＲＮＡ分子との二重鎖にある際に、ＲＮアーゼＨをリクルートする能力を指す。ＷＯ０１／２３６１３は、ＲＮアーゼＨ活性を決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法を提供し、該方法を用いて、ＲＮアーゼＨをリクルートする能力を決定してもよい。典型的には、オリゴヌクレオチドは、相補ターゲット核酸配列とともに提供された際、試験される修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、オリゴヌクレオチドにおけるすべての単量体の間にホスホロチオエート連結を持つＤＮＡ単量体のみを含有するオリゴヌクレオチドを用い、そしてＷＯ０１／２３６１３（本明細書に援用される）の実施例９１～９５によって提供される方法論を用いた際に決定される初速の少なくとも５％、例えば少なくとも１０％または２０％より高いｐｍоｌ／ｌ／分で測定される初速を有する場合、ＲＮアーゼＨをリクルート可能であると見なされる。ＲＮアーゼＨ活性を決定する際に使用するため、組換えヒトＲＮアーゼＨはＬｕｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＧｍｂＨ、スイス・ルツェルンより入手可能である。
【0095】
ギャップマー
本発明の核酸分子、またはその連続ヌクレオチド配列は、ギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよい。アンチセンスギャップマーは、一般的に、ＲＮアーゼＨ仲介性分解を通じて、ターゲット核酸を阻害するために用いられる。本発明の１つの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＲＮアーゼＨをリクルートすることが可能である。
本発明の核酸分子、またはその連続ヌクレオチド配列は、ギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよい。アンチセンスギャップマーは、一般的に、ＲＮアーゼＨ仲介性分解を通じて、ターゲット核酸を阻害するために用いられる。本発明の１つの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＲＮアーゼＨをリクルートすることが可能である。
【0096】
ギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも３つの別個の構造領域、５’－フランク、ギャップおよび３’-フランクのＦ－Ｇ－Ｆ’を、５’→３’配向で含む。「ギャップ」領域（Ｇ）は、オリゴヌクレオチドがＲＮアーゼＨをリクルートすることを可能にする隣接ＤＮＡヌクレオチドのストレッチを含む。ギャップ領域には、１つまたはそれより多い糖修飾ヌクレオシド、好適には高アフィニティ糖修飾ヌクレオシドを含む５’フランキング領域（Ｆ）、そして１つまたはそれより多い糖修飾ヌクレオシド、好適には高アフィニティ糖修飾ヌクレオシドを含む３’フランキング領域（Ｆ’）が隣接する。領域ＦおよびＦ’中の１つまたはそれより多い糖修飾ヌクレオシドは、ターゲット核酸に対するオリゴヌクレオチドのアフィニティを増進させる（すなわちアフィニティ増進性糖修飾ヌクレオシドである）。いくつかの態様において、領域ＦおよびＦ’中の１つまたはそれより多い糖修飾ヌクレオシドは、２’糖修飾ヌクレオシド、例えば高アフィニティ２’糖修飾であり、例えばＬＮＡおよび２’－ＭＯＥより独立に選択される。
【0097】
ギャップマー設計において、ギャップ領域の最も５’および３’であるヌクレオシドは、ＤＮＡヌクレオシドであり、そしてそれぞれ、５’（Ｆ）または３’（Ｆ’）領域の糖修飾ヌクレオシドに隣接して配置される。フランクは、さらに、ギャップ領域から最も遠い端で、すなわち５’フランクの５’端および３’フランクの３’端で、少なくとも１つの糖修飾ヌクレオシドを有することによって定義されることも可能である。
【0098】
領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’は、隣接ヌクレオチド配列を形成する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはその隣接ヌクレオチド配列は、式Ｆ－Ｇ－Ｆ’のギャップマー領域を含んでもよい。
【0099】
ギャップマー設計Ｆ－Ｇ－Ｆ’の全体の長さは、例えば１２～３２ヌクレオシド、例えば１３～２４、例えば１４～２２ヌクレオシド、例えば、１４～１７、例えば１６～１８ヌクレオシドであってもよい。例えば、本発明のギャップマーオリゴヌクレオチドは、以下の式：
Ｆ１－８－Ｇ５－１６－Ｆ’１－８、例えば
Ｆ１－８－Ｇ７－１６－Ｆ’２－８
によって示されてもよく、但し、ギャップマー領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’の全体の長さは、長さ少なくとも１２、例えば少なくとも１４ヌクレオチドである。
Ｆ１－８－Ｇ５－１６－Ｆ’１－８、例えば
Ｆ１－８－Ｇ７－１６－Ｆ’２－８
によって示されてもよく、但し、ギャップマー領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’の全体の長さは、長さ少なくとも１２、例えば少なくとも１４ヌクレオチドである。
【0100】
本発明の側面において、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその隣接ヌクレオチド配列は、式５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’、式中、領域ＦおよびＦ’は、独立に１～８ヌクレオシドを含むかまたはこれらからなり、このうち１～４は２’糖修飾されており、そしてＦおよびＦ’領域の５’および３’端を定義し、そしてＧはＲＮアーゼＨをリクルート可能な６～１６の間のヌクレオシドの領域である、のギャップマーからなるかまたは該ギャップマーを含む。
【0101】
いくつかの態様において、ギャップ領域Ｇは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６の隣接ホスホロチオエート連結ＤＮＡヌクレオシドからなってもよい。いくつかの態様において、ギャップ中のすべてのヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエート連結である。
【0102】
いくつかの態様において、領域ＦおよびＦ’は、独立に、糖修飾ヌクレオシドの隣接配列からなるかまたは該配列を含む。いくつかの態様において、領域Ｆの糖修飾ヌクレオシドは、独立に、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ単位、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ単位、２’－フルオロ－ＤＮＡ単位、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、ＭＯＥ単位、ＬＮＡ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位および２’－フルオロ－ＡＮＡ単位より選択されてもよい。
【0103】
いくつかの態様において、領域ＦまたはＦ’あるいはＦおよびＦ’のすべてのヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドであり、例えば、これらは、ベータ－Ｄ－オキシＬＮＡ、ＥＮＡまたはＳｃＥＴヌクレオシドより独立に選択される。いくつかの態様において、領域Ｆは、１～５、例えば２～４、例えば３～４、例えば１、２、３、４または５の隣接ＬＮＡヌクレオシドからなる。いくつかの態様において、領域ＦおよびＦ’のすべてのヌクレオシドは、ベータ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドである。
【0104】
いくつかの態様において、領域ＦまたはＦ’あるいはＦおよびＦ’のすべてのヌクレオシドは、２’置換ヌクレオシド、例えばＯＭｅまたはＭＯＥヌクレオシドである。いくつかの態様において、領域Ｆは、１、２、３、４、５、６、７、または８の隣接ＯＭｅまたはＭＯＥヌクレオシドからなる。いくつかの態様において、フランキング領域の１つのみが、２’置換ヌクレオシド、例えばＯＭｅまたはＭＯＥヌクレオシドからなる。いくつかの態様において、２’置換ヌクレオシド、例えばＯＭｅまたはＭＯＥヌクレオシドからなるのは５’（Ｆ）フランキング領域である一方、３’（Ｆ’）フランキング領域は、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシド、例えばベータ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドまたはｃＥＴヌクレオシドを含む。いくつかの態様において、２’置換ヌクレオシド、例えばＯＭｅまたはＭＯＥヌクレオシドからなるのは３’（Ｆ’）フランキング領域である一方、５’（Ｆ）フランキング領域は、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシド、例えばベータ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドまたはｃＥＴヌクレオシドを含む。
【0105】
いくつかの態様において、領域ＦおよびＦ’のすべての修飾ヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドであり、例えばベータ－Ｄ－オキシＬＮＡ、ＥＮＡまたはＳｃＥＴヌクレオシドより独立に選択されるものであり、ここで、領域ＦまたはＦ’あるいはＦおよびＦ’は、随意に、ＤＮＡヌクレオシド（代替隣接、さらなる詳細に関してはこれらの定義を参照されたい）を含んでもよい。いくつかの態様において、領域ＦおよびＦ’のすべての修飾ヌクレオシドは、ベータ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドであり、ここで、領域ＦまたはＦ’あるいはＦおよびＦ’は、随意に、ＤＮＡヌクレオシド（代替隣接、さらなる詳細に関してはこれらの定義を参照されたい）を含んでもよい。
【0106】
さらなるギャップマー設計は、本明細書に援用される、ＷＯ２００４／０４６１６０、ＷＯ２００７／１４６５１１およびＷＯ２００８／１１３８３２に開示される。
コンジュゲート
用語、コンジュゲートは、本明細書において、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分または領域Ｃまたは第三の領域）に共有結合したオリゴヌクレオチドを指す。
コンジュゲート
用語、コンジュゲートは、本明細書において、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分または領域Ｃまたは第三の領域）に共有結合したオリゴヌクレオチドを指す。
【0107】
１つまたはそれより多い非ヌクレオチド部分への本発明の療法核酸分子のコンジュゲート化は、例えば活性、細胞分布、細胞取り込みまたは核酸分子の安定性に影響を及ぼすことによって、該核酸分子の薬効薬理を改善しうる。いくつかの態様において、コンジュゲート部分は、オリゴヌクレオチドの細胞分布、生物学的利用能、代謝、排出、浸透性、および／または細胞取り込みを改善することによって、核酸分子の薬物動態学的特性を修飾するかまたは増進させる。特に、コンジュゲートは、特定の臓器、組織または細胞タイプに核酸分子をターゲティングし、そしてそれによってその臓器、組織または細胞タイプにおけるオリゴヌクレオチドの有効性を増進させてもよい。同時に、コンジュゲートは、非ターゲット細胞タイプ、組織または臓器における核酸分子の活性、例えばオフターゲット活性あるいは非ターゲット細胞タイプ、組織または臓器における活性を減少させるように働いてもよい。ｓｉＲＮＡ核酸分子に関しては、コンジュゲート部分は、最も一般的には、ｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖に共有結合され、そしてｓｈＲＮＡ分子に関しては、コンジュゲート部分は、最も一般的には、ｓｈＲＮＡの隣接ヌクレオチド配列から最も離れた分子端に連結される。アンチセンスオリゴヌクレオチドに関しては、コンジュゲート部分は、好適には、生体切断可能リンカー、例えば２～５のホスホジエステル連結ＤＮＡヌクレオシドを用いて、末端のいずれかに共有連結されてもよい。
【0108】
本明細書に援用される、ＷＯ９３／０７８８３およびＷＯ２０１３／０３３２３０は、適切なコンジュゲート部分を提供する。さらなる適切なコンジュゲート部分は、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に結合可能なものである。特に、三価Ｎ－アセチルガラクトサミンコンジュゲート部分は、ＡＳＧＰＲに結合するために適しており、例えば、ＵＳ ２００９／０２３９８、ＷＯ ２０１４／０７６１９６、ＷＯ ２０１４／２０７２３２およびＷＯ ２０１４／１７９６２０（本明細書に援用される）を参照されたい。
【0109】
こうしたコンジュゲートは、腎臓における存在を減少させながら、肝臓への療法核酸分子の取り込みを増進するように働き、それによって、同じ核酸分子の非コンジュゲート化型に比較して、コンジュゲート化核酸分子の肝臓／腎臓比を増加させる。
【0110】
１つの態様において、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分）は、炭水化物、細胞表面受容体リガンド、薬剤物質、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素（例えば細菌毒素）、ビタミン、ウイルスタンパク質（例えばキャプシド）またはその組み合わせからなる群より選択される。
【0111】
コンジュゲートリンカー
連結またはリンカーは、１つまたはそれより多い共有結合を通じて、関心対象の１つの化学基またはセグメントを、関心対象の別の化学基またはセグメントに連結する、２つの原子の間の接続である。直接、または連結部分（例えばリンカーまたはテザー）を通じて、オリゴヌクレオチドにコンジュゲート部分を付着させてもよい。リンカーは、１つの領域、例えばコンジュゲート部分を、別の領域、例えばオリゴヌクレオチド（例えば領域ＡまたはＣの末端）に、共有結合するように働く。
連結またはリンカーは、１つまたはそれより多い共有結合を通じて、関心対象の１つの化学基またはセグメントを、関心対象の別の化学基またはセグメントに連結する、２つの原子の間の接続である。直接、または連結部分（例えばリンカーまたはテザー）を通じて、オリゴヌクレオチドにコンジュゲート部分を付着させてもよい。リンカーは、１つの領域、例えばコンジュゲート部分を、別の領域、例えばオリゴヌクレオチド（例えば領域ＡまたはＣの末端）に、共有結合するように働く。
【0112】
本発明のいくつかの態様において、本発明のコンジュゲートまたは療法核酸分子コンジュゲートは、随意に、オリゴヌクレオチドおよびコンジュゲート部分の間に位置するリンカー領域を含んでもよい。いくつかの態様において、コンジュゲートおよびオリゴヌクレオチドの間のリンカーは、生理学的に不安定なリンカーであり、交換可能に、生体切断可能リンカーと称される。リンカーおよびオリゴヌクレオチドは、しばしば、ホスホジエステル連結を通じて付着される。
【0113】
哺乳動物体内で通常遭遇するまたは遭遇するものに類似である条件下で切断可能である、生理学的に不安定な結合を含むかまたはこうした結合からなる生体切断可能リンカー（領域Ｂ）。生理学的に不安定であるリンカーが化学変換（例えば切断）を経る条件には、哺乳動物細胞において見られるかまたは該細胞において遭遇するものと類似の化学的条件、例えばｐＨ、温度、酸化または還元条件または剤、および塩濃度が含まれる。哺乳動物細胞内条件にはまた、タンパク質分解酵素または加水分解酵素またはヌクレアーゼに由来するものなどの、哺乳動物細胞に通常存在する酵素活性の存在も含まれる。１つの態様において、生体切断可能リンカーは、Ｓ１ヌクレアーゼ切断に感受性である。いくつかの態様において、生理学的に不安定であるリンカー（生体切断可能）は、１～１０の間の連結ヌクレオシド、例えば１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０の連結ヌクレオシド、例えば２～６の間の連結ヌクレオシド、例えば２～５の間の連結ヌクレオシド、例えば２～４の間の連結ヌクレオシドを含み、ここで少なくとも２つの連続連結は生体切断可能、例えばホスホジエステル連結であり、例えば少なくとも３つまたは４つまたは５つの連続ホスホジエステル連結を有する。好ましくはヌクレオシドはＤＮＡまたはＲＮＡである。
【0114】
１つの態様において、オリゴヌクレオチドおよびコンジュゲート部分の間のリンカーは、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡガイド鎖の隣接ヌクレオチド配列の５’または３’末端で少なくとも２つの連続ホスホジエステル連結を含む、２～５の連続ホスホジエステル連結ヌクレオシドで構成される、生理学的に不安定であるリンカーである。
【0115】
別の態様において、オリゴヌクレオチドおよびコンジュゲート部分の間のリンカーは、ｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖の５’または３’末端で少なくとも２つの連続ホスホジエステル連結を含む、２～５の連続ホスホジエステル連結ヌクレオシドで構成される、生理学的に不安定であるリンカーである。
【0116】
別の態様において、オリゴヌクレオチドおよびコンジュゲート部分の間のリンカーは、ｓｈＲＮＡの隣接ヌクレオチド配列から最も遠いｓｈＲＮＡ分子の末端で少なくとも２つの連続ホスホジエステル連結を含む、２～５の連続ホスホジエステル連結ヌクレオシドで構成される、生理学的に不安定であるリンカーである。
【0117】
いくつかの態様において、生理学的に不安定であるリンカーは、ＡＡ、ＡＴ、ＡＣ、ＡＧ、ＴＡ、ＴＴ、ＴＣ、ＴＧ、ＣＡ、ＣＴ、ＣＣ、ＣＧ、ＧＡ、ＧＴ、ＧＣ、またはＧＧからなる群より選択される配列を有するＤＮＡジヌクレオチドを含むかまたは該ヌクレオチドからなり、ここで、２つのＤＮＡヌクレオシドの間にはホスホジエステル連結があり、そしてジヌクレオチドに核酸分子のオリゴヌクレオチドを、またはジヌクレオチドにコンジュゲート部分を連結するいずれかのジヌクレオチドの５’または３’端で少なくとも１つのさらなるホスホジエステルがある。いくつかの態様において、生理学的に不安定であるリンカーは、配列、ＡＡＡ、ＡＡＴ、ＡＡＣ、ＡＡＧ、ＡＴＡ、ＡＴＴ、ＡＴＣ、ＡＴＧ、ＡＣＡ、ＡＣＴ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、ＡＧＡ、ＡＧＴ、ＡＧＣ、ＡＧＧ、ＴＡＡ、ＴＡＴ、ＴＡＣ、ＴＡＧ、ＴＴＡ、ＴＴＴ、ＴＴＣ、ＴＡＧ、ＴＣＡ、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＧ、ＴＧＡ、ＴＧＴ、ＴＧＣ、ＴＧＧ、ＣＡＡ、ＣＡＴ、ＣＡＣ、ＣＡＧ、ＣＴＡ、ＣＴＧ、ＣＴＣ、ＣＴＴ、ＣＣＡ、ＣＣＴ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＧＡ、ＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＧＡＡ、ＧＡＴ、ＧＡＣ、ＣＡＧ、ＧＴＡ、ＧＴＴ、ＧＴＣ、ＧＴＧ、ＧＣＡ、ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＧＡ、ＧＧＴ、ＧＧＣ、またはＧＧＧのＤＮＡトリヌクレオチドを含むかまたは該ヌクレオチドからなり、ここで、ＤＮＡヌクレオシドの間にホスホジエステル連結があり、そしてトリヌクレオチドの５’または３’に潜在的にさらなるホスホジエステルがある。ホスホジエステル含有生体切断可能リンカーは、ＷＯ２０１４／０７６１９５（本明細書に援用される）により詳細に記載される。生体切断可能リンカーを含むコンジュゲート化合物において、標準に比較した際に、コンジュゲート部分の少なくとも約５０％はオリゴヌクレオチドから切断され、例えば切断されるオリゴヌクレオチドから、少なくとも約６０％が切断され、例えば少なくとも約７０％が切断され、例えば少なくとも約８０％が切断され、例えば少なくとも約８５％が切断され、例えば少なくとも約９０％が切断され、例えば少なくとも約９５％が切断される。
【0118】
コンジュゲートはまた、非生体切断可能リンカーを通じてオリゴヌクレオチドに連結されてもよく、またはいくつかの態様において、コンジュゲートは、生体切断可能リンカーに共有結合された非切断可能リンカーを含んでもよい。必ずしも生体分解可能ではないリンカーは、主に、コンジュゲート部分をオリゴヌクレオチドまたは生体切断可能リンカーに共有結合するために働き、そして潜在的に、コンジュゲート部分およびオリゴヌクレオチドの間にある程度の距離を生じる。いくつかの例示的なリンカー（領域Ｙ）には、８－アミノ－３，６－ジオキサオクタン酸（ＡＤＯ）、スクシニミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－ｌ－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、６－アミノヘキサン酸（ＡＨＥＸまたはＡＨＡ）、６－アミノヘキシルオキシ、４－アミノ酪酸、４－アミノシクロヘキシルカルボン酸、スクシニミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－ｌ－カルボキシ－（６－アミド－カプロエート）（ＬＣＳＭＣＣ）、スクシニミジルｍ－マレイミド－ベンゾイレート（ＭＢＳ）、スクシニミジル－Ｎ－ｅ－マレイミド－カプロイレート（ＥＭＣＳ）、スクシニミジル６－（ベータ－マレイミド－プロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、スクシニミジルＮ－（ａ－マレイミドアセテート）（ＡＭＡＳ）、スクシニミジル４－（ｐ－マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、ベータ－アラニン（ベータ－ＡＬＡ）、フェニルグリシン（ＰＨＧ）、４－アミノシクロヘキサン酸（ＡＣＨＣ）、ベータ－（シクロプロピル）アラニン（ベータ－ＣＹＰＲ）、アミノドデカン酸（ＡＤＣ）、アリレンジオール、ポリエチレングリコール、アミノ酸等が含まれる。非切断可能リンカーはまた、鎖構造または反復単位のオリゴマー、例えばエチレングリコール、アミノ酸単位またはアミノアルキル基を含んでもよい。いくつかの態様において、リンカー（領域Ｙ）はアミノアルキル、例えばＣ２～Ｃ３６アミノアルキル基であり、例えばＣ６～Ｃ１２アミノアルキル基が含まれる。いくつかの態様において、リンカー（領域Ｙ）はＣ６アミノアルキル基（Ｃ６リンカーとも称される）である。コンジュゲートリンカー基は、アミノ修飾オリゴヌクレオチドの使用を通じて、そしてコンジュゲート基上の活性化エステル基を通じて、ルーチンにオリゴヌクレオチドに付着される。アミノアルキルおよびオリゴヌクレオチドの間の連結基は、例えば、ホスホロチオエートまたはホスホジエステル、あるいは本明細書に言及する他のヌクレオシド連結の１つであってもよい。本発明のコンジュゲート化合物は、以下の領域Ｃ－Ｂ－Ａ（コンジュゲート部分－生体切断可能リンカー－オリゴヌクレオチド／隣接ヌクレオチド配列）またはＣ－Ｙ－Ｂ－Ａ（コンジュゲート部分－非切断可能リンカー－生体切断可能リンカー－オリゴヌクレオチド／隣接ヌクレオチド配列）で構成されてもよい。
【0119】
治療
用語「治療」、「治療している」、「治療する」等は、本明細書において、一般的に、望ましい薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味する。この効果は、疾患および／または疾患に起因する不都合な影響を部分的にまたは完全に治癒させる観点で療法的である。用語「治療」は、本明細書において、被験体における疾患の任意の治療を含み、そしてこれには：（ａ）疾患の阻害、すなわちＨＢｓＡｇおよび／またはＨＢｅＡｇの増加の阻害のようなその発展の抑止；または（ｂ）疾患の軽減（すなわち緩和）、すなわちＨＢｓＡｇおよび／またはＨＢｅＡｇ産生の抑制のような疾患の後退の誘発が含まれる。したがって、ＨＢＶ感染を軽減し、そして／または阻害する化合物は、ＨＢＶ感染を治療する化合物である。好ましくは、用語「治療」は、本明細書において、すでに現れている障害の医学的介入、例えば既に定義されそして現れているＨＢＶ感染の治療に関する。
用語「治療」、「治療している」、「治療する」等は、本明細書において、一般的に、望ましい薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味する。この効果は、疾患および／または疾患に起因する不都合な影響を部分的にまたは完全に治癒させる観点で療法的である。用語「治療」は、本明細書において、被験体における疾患の任意の治療を含み、そしてこれには：（ａ）疾患の阻害、すなわちＨＢｓＡｇおよび／またはＨＢｅＡｇの増加の阻害のようなその発展の抑止；または（ｂ）疾患の軽減（すなわち緩和）、すなわちＨＢｓＡｇおよび／またはＨＢｅＡｇ産生の抑制のような疾患の後退の誘発が含まれる。したがって、ＨＢＶ感染を軽減し、そして／または阻害する化合物は、ＨＢＶ感染を治療する化合物である。好ましくは、用語「治療」は、本明細書において、すでに現れている障害の医学的介入、例えば既に定義されそして現れているＨＢＶ感染の治療に関する。
【0120】
防止
本明細書において、用語「防止している」、「防止」または「防止する」は、予防的治療、すなわち、その目的が、疾患を治癒させるよりは防止する手段または処置に関する。防止は、疾患またはその症状を完全にまたは部分的に防止する観点で予防的である、望ましい薬理学的および／または生理学的効果が得られることを意味する。したがって、本明細書において、「ＨＢＶ感染を防止する」には、被験体においてＨＢＶ感染が起こることを防止すること、およびＨＢＶ感染の症状の発生を防止することが含まれる。本発明において、特にＨＢＶ感染母からの、小児におけるＨＢＶ感染の防止が意図される。やはり意図されるのは、急性ＨＢＶ感染の慢性ＨＢＶ感染への転換の防止である。
本明細書において、用語「防止している」、「防止」または「防止する」は、予防的治療、すなわち、その目的が、疾患を治癒させるよりは防止する手段または処置に関する。防止は、疾患またはその症状を完全にまたは部分的に防止する観点で予防的である、望ましい薬理学的および／または生理学的効果が得られることを意味する。したがって、本明細書において、「ＨＢＶ感染を防止する」には、被験体においてＨＢＶ感染が起こることを防止すること、およびＨＢＶ感染の症状の発生を防止することが含まれる。本発明において、特にＨＢＶ感染母からの、小児におけるＨＢＶ感染の防止が意図される。やはり意図されるのは、急性ＨＢＶ感染の慢性ＨＢＶ感染への転換の防止である。
【0121】
患者
本発明の目的のため、「被験体」（または「患者」）は、脊椎動物であってもよい。本発明の背景において、用語「被験体」には、ヒトおよび他の動物の両方、特に哺乳動物、および他の生物が含まれる。したがって、本明細書に提供する手段および方法は、ヒト療法および獣医学適用の両方に適用可能である。したがって、本明細書において、被験体は、動物、例えばマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、モルモット、フェレット、ネコ、イヌ、ニワトリ、ヒツジ、ウシ種、ウマ、ラクダ、または霊長類であってもよい。好ましくは、被験体は哺乳動物である。より好ましくは、被験体はヒトである。
本発明の目的のため、「被験体」（または「患者」）は、脊椎動物であってもよい。本発明の背景において、用語「被験体」には、ヒトおよび他の動物の両方、特に哺乳動物、および他の生物が含まれる。したがって、本明細書に提供する手段および方法は、ヒト療法および獣医学適用の両方に適用可能である。したがって、本明細書において、被験体は、動物、例えばマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、モルモット、フェレット、ネコ、イヌ、ニワトリ、ヒツジ、ウシ種、ウマ、ラクダ、または霊長類であってもよい。好ましくは、被験体は哺乳動物である。より好ましくは、被験体はヒトである。
【0122】
ＨＢＶ感染
用語「Ｂ型肝炎ウイルス感染」または「ＨＢＶ感染」は、当該技術分野に一般的に知られ、そしてＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）によって引き起こされ、そして肝臓に影響を及ぼす、感染性疾患を指す。ＨＢＶ感染は、急性または慢性感染であってもよい。感染した人のある程度は、初期感染中に症状を示さず、そしてある程度は、嘔吐、黄色がかった皮膚、倦怠感、暗色尿および腹部疼痛を伴う、迅速な発病を発展させる（”Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｆａｃｔ ｓｈｅｅｔ Ｎｏ ２０４”． ｗｈｏ．ｉｎｔ． ２０１４年７月、２０１４年１１月４日検索）。しばしば、これらの症状は数週間持続し、そして死亡を生じる可能性もある。症状が始まるまでに３０～１８０日を要することもある。出産前後に感染した者は、９０％が慢性Ｂ型肝炎感染を発展させる一方、５歳以降に感染した者は１０％未満しか発展させない（“Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ＦＡＱｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｂｌｉｃ － Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ”， Ｕ．Ｓ． Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（ＣＤＣ）， ２０１１－１１－２９検索）。慢性疾患を有する者の大部分は症状を示さない；が、肝硬変および肝癌が最終的に発展しうる（Ｃｈａｎｇ， ２００７， Ｓｅｍｉｎ Ｆｅｔａｌ Ｎｅｏｎａｔａｌ Ｍｅｄ， １２： １６０－１６７）。これらの合併症は、慢性疾患を有する者の１５～２５％の死亡を生じる（“Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｆａｃｔ ｓｈｅｅｔ Ｎｏ ２０４”． ｗｈｏ．ｉｎｔ． ２０１４年７月、２０１４年１１月４日検索）。本明細書において、用語「ＨＢＶ感染」には、急性および慢性Ｂ型肝炎感染が含まれる。用語「ＨＢＶ感染」にはまた、初期感染の無症候性病期、症候性病期、ならびにＨＢＶ感染の無症候性慢性病期が含まれる。
用語「Ｂ型肝炎ウイルス感染」または「ＨＢＶ感染」は、当該技術分野に一般的に知られ、そしてＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）によって引き起こされ、そして肝臓に影響を及ぼす、感染性疾患を指す。ＨＢＶ感染は、急性または慢性感染であってもよい。感染した人のある程度は、初期感染中に症状を示さず、そしてある程度は、嘔吐、黄色がかった皮膚、倦怠感、暗色尿および腹部疼痛を伴う、迅速な発病を発展させる（”Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｆａｃｔ ｓｈｅｅｔ Ｎｏ ２０４”． ｗｈｏ．ｉｎｔ． ２０１４年７月、２０１４年１１月４日検索）。しばしば、これらの症状は数週間持続し、そして死亡を生じる可能性もある。症状が始まるまでに３０～１８０日を要することもある。出産前後に感染した者は、９０％が慢性Ｂ型肝炎感染を発展させる一方、５歳以降に感染した者は１０％未満しか発展させない（“Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ＦＡＱｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｂｌｉｃ － Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ”， Ｕ．Ｓ． Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（ＣＤＣ）， ２０１１－１１－２９検索）。慢性疾患を有する者の大部分は症状を示さない；が、肝硬変および肝癌が最終的に発展しうる（Ｃｈａｎｇ， ２００７， Ｓｅｍｉｎ Ｆｅｔａｌ Ｎｅｏｎａｔａｌ Ｍｅｄ， １２： １６０－１６７）。これらの合併症は、慢性疾患を有する者の１５～２５％の死亡を生じる（“Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｆａｃｔ ｓｈｅｅｔ Ｎｏ ２０４”． ｗｈｏ．ｉｎｔ． ２０１４年７月、２０１４年１１月４日検索）。本明細書において、用語「ＨＢＶ感染」には、急性および慢性Ｂ型肝炎感染が含まれる。用語「ＨＢＶ感染」にはまた、初期感染の無症候性病期、症候性病期、ならびにＨＢＶ感染の無症候性慢性病期が含まれる。
【0123】
ｃｃｃＤＮＡ
ｃｃｃＤＮＡ（共有閉鎖環状ＤＮＡ）は、細胞核における、いくつかのＤＮＡウイルス（ポリオーマウイルス科）の増殖中に生じる、特別なＤＮＡ構造である。ｃｃｃＤＮＡは、ＤＮＡリガーゼによって共有閉鎖環に連結される、直鎖型で生じる二本鎖ＤＮＡである。大部分の場合、ウイルスＤＮＡの転写は、環状型からのみ生じうる。ウイルスのｃｃｃＤＮＡはまた、エピソームＤＮＡとしても知られ、またときに、ミニ染色体としても知られる。
ｃｃｃＤＮＡ（共有閉鎖環状ＤＮＡ）は、細胞核における、いくつかのＤＮＡウイルス（ポリオーマウイルス科）の増殖中に生じる、特別なＤＮＡ構造である。ｃｃｃＤＮＡは、ＤＮＡリガーゼによって共有閉鎖環に連結される、直鎖型で生じる二本鎖ＤＮＡである。大部分の場合、ウイルスＤＮＡの転写は、環状型からのみ生じうる。ウイルスのｃｃｃＤＮＡはまた、エピソームＤＮＡとしても知られ、またときに、ミニ染色体としても知られる。
【0124】
ｃｃｃＤＮＡは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）を含む、カリモウイルス科およびヘパドナウイルス科に典型的である。ＨＢＶゲノムは、肝細胞の核において、安定なミニ染色体、共有閉鎖環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）を形成する。ｃｃｃＤＮＡは、キャプシド関連弛緩環状ＤＮＡ（ｒｃＤＮＡ）の変換によって形成される。ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡ形成は、細胞ＤＮＡ修復機構を必要とする多工程プロセスを伴い、そしてｒｃＤＮＡにおけるプラス鎖ＤＮＡの完成に寄与する特徴的な細胞構成要素との特異的相互作用に頼る（Ａｌｗｅｉｓｓら ２０１７， Ｖｉｒｕｓｅｓ， ９ （６）： １５６）。
【0125】
薬学的に許容されうる塩
用語「薬学的に許容されうる塩」は、生物学的にまたは別の意味で望ましくない遊離塩基または遊離酸の生物学的有効性および特性を保持する塩を指す。塩は、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、特に塩酸、および有機酸、例えば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、サリチル酸、Ｎ－アセチルシステインで形成される。さらに、これらの塩は、遊離酸への無機塩基または有機塩基の添加から調製されてもよい。無機塩基に由来する塩には、限定されるわけではないが、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム塩が含まれる。有機塩基に由来する塩には、限定されるわけではないが、一級、二級、および三級アミン、天然存在置換アミンを含む置換アミン、環状アミンおよび塩基性イオン交換樹脂、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、リジン、アルギニン、Ｎ－エチルピペリジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂の塩が含まれる。式（Ｉ）の化合物はまた、双性イオンの形で存在してもよい。式（Ｉ）の化合物の特に好ましい薬学的に許容されうる塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸およびメタンスルホン酸の塩である。
用語「薬学的に許容されうる塩」は、生物学的にまたは別の意味で望ましくない遊離塩基または遊離酸の生物学的有効性および特性を保持する塩を指す。塩は、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、特に塩酸、および有機酸、例えば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、サリチル酸、Ｎ－アセチルシステインで形成される。さらに、これらの塩は、遊離酸への無機塩基または有機塩基の添加から調製されてもよい。無機塩基に由来する塩には、限定されるわけではないが、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム塩が含まれる。有機塩基に由来する塩には、限定されるわけではないが、一級、二級、および三級アミン、天然存在置換アミンを含む置換アミン、環状アミンおよび塩基性イオン交換樹脂、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、リジン、アルギニン、Ｎ－エチルピペリジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂の塩が含まれる。式（Ｉ）の化合物はまた、双性イオンの形で存在してもよい。式（Ｉ）の化合物の特に好ましい薬学的に許容されうる塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸およびメタンスルホン酸の塩である。
【0126】
阻害剤
用語「阻害剤」は、当該技術分野に知られ、そして（ａ）特定のタンパク質（単数または複数）（例えばＦＵＢＰ１）の生理学的機能（すなわち活性）を完全にまたは部分的に防止するかまたは減少させることが可能な化合物／物質または組成物に関する。本発明の背景において、ＦＵＢＰ１の「阻害剤」は、ＦＵＢＰ１遺伝子産物の発現を防止するかまたは減少させることによって、それぞれＦＵＢＰ１の活性／機能を防止するかまたは減少させることが可能である。したがって、ＦＵＢＰ１の阻害剤は、ＦＵＢＰ１の発現レベルの減少（例えばＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡまたはＦＵＢＰ１タンパク質レベルの減少）を導くことも可能であり、これは、ＦＵＢＰ１の機能性（すなわち活性）の減少に反映され、ここで前記機能は、ポリＡポリメラーゼ機能を含む。したがって、ＦＵＢＰ１の阻害剤は、本発明の背景において、ＦＵＢＰ１のレベルを減少させることが可能である、ＦＵＢＰ１発現の転写リプレッサーも含んでもよい。好ましい阻害剤は、本発明の核酸分子である。
用語「阻害剤」は、当該技術分野に知られ、そして（ａ）特定のタンパク質（単数または複数）（例えばＦＵＢＰ１）の生理学的機能（すなわち活性）を完全にまたは部分的に防止するかまたは減少させることが可能な化合物／物質または組成物に関する。本発明の背景において、ＦＵＢＰ１の「阻害剤」は、ＦＵＢＰ１遺伝子産物の発現を防止するかまたは減少させることによって、それぞれＦＵＢＰ１の活性／機能を防止するかまたは減少させることが可能である。したがって、ＦＵＢＰ１の阻害剤は、ＦＵＢＰ１の発現レベルの減少（例えばＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡまたはＦＵＢＰ１タンパク質レベルの減少）を導くことも可能であり、これは、ＦＵＢＰ１の機能性（すなわち活性）の減少に反映され、ここで前記機能は、ポリＡポリメラーゼ機能を含む。したがって、ＦＵＢＰ１の阻害剤は、本発明の背景において、ＦＵＢＰ１のレベルを減少させることが可能である、ＦＵＢＰ１発現の転写リプレッサーも含んでもよい。好ましい阻害剤は、本発明の核酸分子である。
【0127】
化合物
本明細書において、用語「化合物」は、ＦＵＢＰ１発現または活性の阻害が可能な任意の分子を意味する。本発明の特定の化合物は、本発明記載の核酸分子、例えばＲＮＡｉ分子またはアンチセンスオリゴヌクレオチド、あるいはこうした核酸分子を含む任意のコンジュゲートである。例えば、本明細書において、化合物は、ＦＵＢＰ１をターゲティングする核酸分子、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡであってもよい。
本明細書において、用語「化合物」は、ＦＵＢＰ１発現または活性の阻害が可能な任意の分子を意味する。本発明の特定の化合物は、本発明記載の核酸分子、例えばＲＮＡｉ分子またはアンチセンスオリゴヌクレオチド、あるいはこうした核酸分子を含む任意のコンジュゲートである。例えば、本明細書において、化合物は、ＦＵＢＰ１をターゲティングする核酸分子、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡであってもよい。
【0128】
組成物
用語「組成物」はまた、核酸分子化合物または別のＦＵＢＰ１阻害剤を記載するために用いられてもよい。核酸分子組成物は、２０％未満の不純物、好ましくは１５％または１０％未満の不純物、より好ましくは９、８、７または６％未満の不純物、最も好ましくは５％未満の不純物を有する。不純物は、典型的には、主な核酸分子構成要素よりも１または２ヌクレオチド短い（ｎ－１またはｎ－２）核酸分子である。
用語「組成物」はまた、核酸分子化合物または別のＦＵＢＰ１阻害剤を記載するために用いられてもよい。核酸分子組成物は、２０％未満の不純物、好ましくは１５％または１０％未満の不純物、より好ましくは９、８、７または６％未満の不純物、最も好ましくは５％未満の不純物を有する。不純物は、典型的には、主な核酸分子構成要素よりも１または２ヌクレオチド短い（ｎ－１またはｎ－２）核酸分子である。
【0129】
本発明は、限定されない図および例を参照することによって、さらに記載される。
発明の詳細な説明
ＦＵＢＰ１の過剰発現および突然変異は、長年に渡り、癌と関連することが知られてきている。特に、ヒト肝細胞癌（ＨＣＣ）におけるＦＵＢＰ１の強い過剰発現は、腫瘍増殖を支持し、そして劣った患者予後と相関する。感染肝細胞におけるＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡは、持続性慢性感染および再活性化に関与し、すべてのウイルスサブゲノム転写物およびプレゲノムＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）のテンプレートであって、細胞内ヌクレオキャプシド・リサイクリングを通じて、ウイルス子孫の新規合成およびｃｃｃＤＮＡプール補充の両方を確実にする。本発明の背景において、ＦＵＢＰ１がｃｃｃＤＮＡ安定性に関与することが最初に示された。この知見は、ＨＢＶ感染被験体において、ｃｃｃＤＮＡを不安定化する機会を可能にし、これが次に、慢性感染ＨＢＶ患者の完全な治癒の機会を開く。ＨＣＣおよびｃｃｃＤＮＡ安定性におけるＦＵＢＰ１の役割は、互いに異なり、そして独立であると予期される。
発明の詳細な説明
ＦＵＢＰ１の過剰発現および突然変異は、長年に渡り、癌と関連することが知られてきている。特に、ヒト肝細胞癌（ＨＣＣ）におけるＦＵＢＰ１の強い過剰発現は、腫瘍増殖を支持し、そして劣った患者予後と相関する。感染肝細胞におけるＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡは、持続性慢性感染および再活性化に関与し、すべてのウイルスサブゲノム転写物およびプレゲノムＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）のテンプレートであって、細胞内ヌクレオキャプシド・リサイクリングを通じて、ウイルス子孫の新規合成およびｃｃｃＤＮＡプール補充の両方を確実にする。本発明の背景において、ＦＵＢＰ１がｃｃｃＤＮＡ安定性に関与することが最初に示された。この知見は、ＨＢＶ感染被験体において、ｃｃｃＤＮＡを不安定化する機会を可能にし、これが次に、慢性感染ＨＢＶ患者の完全な治癒の機会を開く。ＨＣＣおよびｃｃｃＤＮＡ安定性におけるＦＵＢＰ１の役割は、互いに異なり、そして独立であると予期される。
【0130】
本発明の１つの側面は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染、特に慢性ＨＢＶ感染の治療および／または防止において使用するためのＦＵＢＰ１阻害剤である。
本発明の１つの態様は、感染細胞、例えばＨＢＶ感染細胞において、ｃｃｃＤＮＡおよびｐｇＲＮＡを減少させることが可能なＦＵＢＰ１阻害剤である。
本発明の１つの態様は、感染細胞、例えばＨＢＶ感染細胞において、ｃｃｃＤＮＡおよびｐｇＲＮＡを減少させることが可能なＦＵＢＰ１阻害剤である。
【0131】
さらなる態様において、ＦＵＢＰ１阻害剤は、ＨＢｓＡｇおよび／またはＨＢｅＡｇを、ＨＢＶ感染個体において、ｉｎ ｖｉｖｏで減少させることが可能である。
ＨＢＶの治療において使用するためのＦＵＢＰ１阻害剤
理論によって束縛されることなく、ＦＵＢＰ１は、細胞核におけるｃｃｃＤＮＡの安定化に関与し、そしてＤＮＡ、特にｃｃｃＤＮＡへのＦＵＢＰ１の結合を防止することによって、ｃｃｃＤＮＡは不安定化され、そして分解されやすくなると考えられる。本発明の１つの態様は、したがって、ＦＵＢＰ１タンパク質のＤＮＡ結合ドメインと相互作用し、そしてｃｃｃＤＮＡへの結合を防止するかまたは減少させるＦＵＢＰ１阻害剤である。
ＨＢＶの治療において使用するためのＦＵＢＰ１阻害剤
理論によって束縛されることなく、ＦＵＢＰ１は、細胞核におけるｃｃｃＤＮＡの安定化に関与し、そしてＤＮＡ、特にｃｃｃＤＮＡへのＦＵＢＰ１の結合を防止することによって、ｃｃｃＤＮＡは不安定化され、そして分解されやすくなると考えられる。本発明の１つの態様は、したがって、ＦＵＢＰ１タンパク質のＤＮＡ結合ドメインと相互作用し、そしてｃｃｃＤＮＡへの結合を防止するかまたは減少させるＦＵＢＰ１阻害剤である。
【0132】
癌におけるＦＵＢＰ１の役割と関連して、ＦＵＢＰ１を阻害する小分子が同定されてきており、ここで、小分子は、ＦＵＢＰ１のＤＮＡ結合活性、特に一本鎖ＤＮＡ上のＦＵＳＥ要素への結合を阻害する。本発明において、ＦＵＢＰ１阻害剤は、ＨＢＶを治療する際に有用であると想定される。特に、例えばコンジュゲート化または配合を通じた、こうした小分子化合物の肝臓へのターゲティングは、ＨＢＶの治療において有益でありうる。
【0133】
Ｈｕｔｈら ２００４ Ｊ Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ Ｖｏｌ ４７ ｐ． ４８５１－４８５７は、ＦＵＢＰ１の４つのタンデムＫ相同性（ＫＨ）リピートに結合可能な一連のベンゾイルアントラニル酸化合物を開示する。Ｈｕｔｈら ２００４に開示される化合物はすべて、本明細書に援用される。特に、以下に示す式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの化合物は、ＦＵＢＰ１ ＤＮＡ結合活性を阻害する際に有効であることが見出された。
【0134】
【化4】
【0135】
本発明の１つの態様は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の治療および／または防止における使用のための式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの化合物である。
Ｈａｕｃｋら ２０１６ Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ ２４ ｐ．５７１７－５７２９は、高いＦＵＢＰ１阻害潜在能力を持つ一連のさらなる化合物を記載する（本明細書に援用される、表２を参照されたい）。特に、式ＩＶの以下の化合物は、ＦＵＢＰ１活性の阻害に有効であった。
Ｈａｕｃｋら ２０１６ Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ ２４ ｐ．５７１７－５７２９は、高いＦＵＢＰ１阻害潜在能力を持つ一連のさらなる化合物を記載する（本明細書に援用される、表２を参照されたい）。特に、式ＩＶの以下の化合物は、ＦＵＢＰ１活性の阻害に有効であった。
【0136】
【化5】
【0137】
式中、Ｒ１は、
【0138】
【化6】
【0139】
より選択され、そしてＲ２は、
【0140】
【化7】
【0141】
より選択される。
特に、式Ｖ、ＶＩおよびＶＩＩの化合物は、１５μＭ未満のＩＣ５０値を有することが示された。
特に、式Ｖ、ＶＩおよびＶＩＩの化合物は、１５μＭ未満のＩＣ５０値を有することが示された。
【0142】
【化8】
【0143】
２－（５－ブロモチオフェン－２－イル）－５－（３，４－ジメトキシフェニル）－７－（トリフルオロメチル）ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン
【0144】
【化9】
【0145】
２－（５－クロロチオフェン－２－イル）－５－（３，４－ジメトキシフェニル）－７－（トリフルオロメチル）ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン
【0146】
【化10】
【0147】
５－（３，４－ジメトキシフェニル）－２－（チオフェン－２－イル）－７－（トリフルオロメチル）ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン
本発明の１つの態様は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の治療および／または防止において使用するための式ＩＶの化合物である。
本発明の１つの態様は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の治療および／または防止において使用するための式ＩＶの化合物である。
【0148】
本発明の１つの態様は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の治療および／または防止において使用するための式Ｖ、ＶＩまたはＶＩの化合物である。
Ｓ－アデノシル－Ｌ－メチオニン（ＳＡＭ）競合的阻害剤、ＧＳＫ３４３（式ＶＩＩＩ）は、現在、骨肉腫のため前臨床開発中である。ＧＳＫ３４３が骨肉腫細胞において、ＦＵＢＰ１発現を阻害することが示されてきている（Ｘｉｏｎｇら ２０１６ Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃ ｖｏｌ ４９ ｐ ６２３）。
Ｓ－アデノシル－Ｌ－メチオニン（ＳＡＭ）競合的阻害剤、ＧＳＫ３４３（式ＶＩＩＩ）は、現在、骨肉腫のため前臨床開発中である。ＧＳＫ３４３が骨肉腫細胞において、ＦＵＢＰ１発現を阻害することが示されてきている（Ｘｉｏｎｇら ２０１６ Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃ ｖｏｌ ４９ ｐ ６２３）。
【0149】
【化11】
【0150】
本発明の１つの態様は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の治療および／または防止において使用するための式ＶＩＩの化合物である。
最近、トポイソメラーゼＩ（ＴＯＰ１）阻害剤である、ＦＤＡ認可癌薬剤カンプトテシン（ＣＰＴ、式ＩＸ）およびその誘導体ＳＮ－３８（７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン、式Ｘ）もまた、ＦＵＢＰ１／ＦＵＳＥ相互作用を防止することによって、ＦＵＢＰ１活性を阻害することが示された（Ｈｏｓｓｅｉｎｉら ２０１７ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ １４６ ｐ．５３－６２）。
最近、トポイソメラーゼＩ（ＴＯＰ１）阻害剤である、ＦＤＡ認可癌薬剤カンプトテシン（ＣＰＴ、式ＩＸ）およびその誘導体ＳＮ－３８（７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン、式Ｘ）もまた、ＦＵＢＰ１／ＦＵＳＥ相互作用を防止することによって、ＦＵＢＰ１活性を阻害することが示された（Ｈｏｓｓｅｉｎｉら ２０１７ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ １４６ ｐ．５３－６２）。
【0151】
【化12】
【0152】
カンプトテシン（（＋）－４（Ｓ）－エチル－４－ヒドロキシ－３，４，１２，１４－テトラヒドロ－１Ｈ－ピラノ［３’４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－３，１４－ジオン）。
【0153】
【化13】
【0154】
ＳＮ－３８（４（Ｓ），１１－ジエチル－４，９－ジヒドロキシ－３，４，１２，１４－テトラヒドロ－１Ｈ－ピラノ［３’４’：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－３，１４－ジオン ７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン）。
【0155】
本発明の１つの態様は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の治療および／または防止において使用するための式ＩＸまたはＸの化合物である。
Ｔｒｉｎｇａｌｉら ２０１２ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ ６４， ｐ． ３６０－３６５は、ヒアルロン酸にコンジュゲート化されたＳＮ－３８（ＨＡ－ＳＮ－３８、式ＩＸ）の薬物動態学的プロファイルを記載し、そして該分子は、肝臓への分布の増加を示す。
Ｔｒｉｎｇａｌｉら ２０１２ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ ６４， ｐ． ３６０－３６５は、ヒアルロン酸にコンジュゲート化されたＳＮ－３８（ＨＡ－ＳＮ－３８、式ＩＸ）の薬物動態学的プロファイルを記載し、そして該分子は、肝臓への分布の増加を示す。
【0156】
【化14】
【0157】
本発明の１つの態様は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の治療および／または防止において使用するための式ＸＩの化合物である。
ＳＮ－３８の多様な脂質コンジュゲートもまた文献中に存在する。ＷＯ２００６／０８２０５３は、例えば、式ＸＩＩの分子を記載する。
ＳＮ－３８の多様な脂質コンジュゲートもまた文献中に存在する。ＷＯ２００６／０８２０５３は、例えば、式ＸＩＩの分子を記載する。
【0158】
【化15】
【0159】
ＣＮ１０５７７７７７０は、以下の式ＸＩＩＩに示すパルミテートコンジュゲート化ＳＮ－３８を記載する。
【0160】
【化16】
【0161】
本発明の１つの態様は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の治療および／または防止において使用するための式ＸＩＩまたはＸＩＩＩの化合物である。
本発明のさらなる側面において、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の治療および／または防止に使用するためのＦＵＢＰ１阻害剤を、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰｒ）に結合可能なコンジュゲート部分、例えば二価または三価ＧａｌＮＡｃクラスターに共有結合させることによって、肝臓に直接ターゲティングしてもよい。
本発明のさらなる側面において、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の治療および／または防止に使用するためのＦＵＢＰ１阻害剤を、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰｒ）に結合可能なコンジュゲート部分、例えば二価または三価ＧａｌＮＡｃクラスターに共有結合させることによって、肝臓に直接ターゲティングしてもよい。
【0162】
本発明の核酸分子
核酸分子は、ＦＵＢＰ１転写物をターゲティングし、そしてＲＮＡ干渉経路を通じてまたはＲＮアーゼＨ切断を通じてのいずれかで、転写物の分解を促進することが可能であるため、潜在的に優れたＦＵＢＰ１阻害剤である。あるいは、核酸分子、例えばアプタマーはまた、上述の小分子と一致して、ＦＵＢＰ１のＤＮＡ結合部位の阻害剤として作用してもよい。
核酸分子は、ＦＵＢＰ１転写物をターゲティングし、そしてＲＮＡ干渉経路を通じてまたはＲＮアーゼＨ切断を通じてのいずれかで、転写物の分解を促進することが可能であるため、潜在的に優れたＦＵＢＰ１阻害剤である。あるいは、核酸分子、例えばアプタマーはまた、上述の小分子と一致して、ＦＵＢＰ１のＤＮＡ結合部位の阻害剤として作用してもよい。
【0163】
本発明の１つの側面は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の治療および／または防止において使用するための核酸分子である。こうした核酸分子は、一本鎖アンチセンス、オリゴヌクレオチド；ｓｉＲＮＡ分子；またはｓｈＲＮＡ分子からなる群より選択されてもよい。
【0164】
本セクションは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の治療および／または防止において使用するために適した新規核酸分子を記載する。
本発明の核酸分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで、ＦＵＢＰ１の発現を阻害することが可能である。阻害は、ＦＵＢＰ１をコードするターゲット核酸にオリゴヌクレオチドがハイブリダイズすることによって達成される。
本発明の核酸分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで、ＦＵＢＰ１の発現を阻害することが可能である。阻害は、ＦＵＢＰ１をコードするターゲット核酸にオリゴヌクレオチドがハイブリダイズすることによって達成される。
【0165】
ターゲット核酸は、哺乳動物ＦＵＢＰ１配列、例えば配列番号１～２０からなる群より選択される配列であってもよい。哺乳動物ＦＵＢＰ１配列が、配列番号１、２、３、４、５、６、７および８からなる群より選択されるならば好適である。
【0166】
いくつかの態様において、本発明の核酸分子は、ＦＵＢＰ１を阻害するかまたは下方制御することによって、ＦＵＢＰ１の発現を調節することが可能である。好ましくは、こうした調節は、ターゲットの正常発現レベルに比較して、少なくとも４０％の発現阻害、より好ましくは、ターゲットの正常発現レベルに比較して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の阻害を生じる。いくつかの態様において、本発明の核酸分子は、ＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ細胞またはＨＢＶ感染初代ヒト肝細胞を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、少なくとも６５％～９８％、例えば７０％～９５％、ＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡの発現レベルを阻害することが可能であり、ターゲット減少のこの範囲は、ｃｃｃＤＮＡ減少と優れた相関がある核酸分子を選択する際に好適である。いくつかの態様において、本発明の化合物は、ＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ細胞またはＨＢＶ感染初代ヒト肝細胞を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、少なくとも５０％、ＦＵＢＰ１タンパク質の発現レベルを阻害することが可能でありうる。本明細書の材料および方法セクション、ならびに実施例は、ＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ細胞またはＨＢＶ感染初代ヒト肝細胞ならびにｃｃｃＤＮＡにおけるターゲットＲＮＡ阻害を測定するために用いてもよいアッセイを提供する。ターゲット調節は、オリゴヌクレオチドの隣接ヌクレオチド配列、例えばｓｉＲＮＡのガイド鎖またはアンチセンスオリゴヌクレオチドのギャップマー領域、およびターゲット核酸の間のハイブリダイゼーションによって誘発される。いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドまたは隣接ヌクレオチド配列および一方または両方のターゲット核酸の間のミスマッチを含む。ミスマッチにも関わらず、ターゲット核酸へのハイブリダイゼーションは、ＦＵＢＰ１発現の望ましい調節を示すためになお十分でありうる。オリゴヌクレオチドの長さを増加させ、そして／またはオリゴヌクレオチド配列内のターゲットへの結合アフィニティを増加させることが可能な修飾ヌクレオシドの数を増加させることによって、ミスマッチから生じる減少した結合アフィニティを、好適に補償してもよい。好適には、本発明のオリゴヌクレオチドは、結合アフィニティを増加させることが可能な修飾ヌクレオシド、例えばＬＮＡを含む２’糖修飾ヌクレオシドを含有する。
【0167】
本発明の１つの側面は、ＦＵＢＰ１の発現を阻害可能である、長さ１２～３０ヌクレオチドの隣接ヌクレオチド配列を含む、長さ１２～６０ヌクレオチドの核酸分子に関する。
いくつかの態様において、核酸分子は、ターゲット核酸の領域またはターゲット配列と、少なくとも９０％相補的、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または１００％相補的である、隣接配列を含む。
いくつかの態様において、核酸分子は、ターゲット核酸の領域またはターゲット配列と、少なくとも９０％相補的、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、または１００％相補的である、隣接配列を含む。
【0168】
１つの態様において、本発明の核酸分子、またはその隣接ヌクレオチド配列は、ターゲット核酸の領域に、完全に相補的（１００％相補的）であるか、あるいはいくつかの態様において、オリゴヌクレオチドおよびターゲット核酸の間に１つまたは２つのミスマッチを含んでもよい。
【0169】
いくつかの態様において、核酸分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３および／または配列番号４に存在するターゲット核酸領域に、少なくとも９５％相補的、例えば完全に（または１００％）相補的な、長さ１２～３０ヌクレオチドの隣接ヌクレオチド配列を含む。
【0170】
いくつかの態様において、本発明の核酸分子または隣接ヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および／または配列番号８のターゲット核酸に、少なくとも９３％相補的、例えば完全に（または１００％）相補的である。
【0171】
いくつかの態様において、本発明の核酸分子または隣接ヌクレオチド配列は、配列番号１および配列番号５のターゲット核酸に、少なくとも９５％相補的、例えば完全に（または１００％）相補的である。
【0172】
いくつかの態様において、本発明の核酸分子または隣接ヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号５および配列番号９のターゲット核酸に、少なくとも９５％相補的、例えば完全に（または１００％）相補的である。
【0173】
いくつかの態様において、核酸分子または隣接ヌクレオチド配列は、配列番号１の１４２００～１４２１８位に１００％相補的である。
いくつかの態様において、核酸分子または隣接ヌクレオチド配列は、配列番号１の１４４１３～１４４３１位に１００％相補的である。
いくつかの態様において、核酸分子または隣接ヌクレオチド配列は、配列番号１の１４４１３～１４４３１位に１００％相補的である。
【0174】
いくつかの態様において、核酸分子または隣接ヌクレオチド配列は、配列番号１の１４９６６～１４９８４位に１００％相補的である。
いくつかの態様において、核酸分子または隣接ヌクレオチド配列は、配列番号１の３０３４４～３０６３２に１００％相補的である。
いくつかの態様において、核酸分子または隣接ヌクレオチド配列は、配列番号１の３０３４４～３０６３２に１００％相補的である。
【0175】
いくつかの態様において、本発明の核酸分子は、長さ１２～６０ヌクレオチド、例えば長さ１３～５０、例えば１４～３５、例えば１５～３０、例えば１６～２２ヌクレオチドを含むかまたは該ヌクレオチドからなる。
【0176】
いくつかの態様において、ターゲット核酸に相補的な核酸分子の隣接ヌクレオチド配列は、長さ１２～３０、例えば１４～２５、例えば１６～２３、例えば１８～２２の隣接ヌクレオチドを含むかまたは該ヌクレオチドからなる。
【0177】
いくつかの態様において、ターゲット核酸に相補的であるｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの隣接ヌクレオチド配列は、長さ１８～２８、例えば１９～２６、例えば２０～２４、例えば２１～２３の隣接ヌクレオチドを含むかまたは該ヌクレオチドからなる。
【0178】
いくつかの態様において、ターゲット核酸に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドの隣接ヌクレオチド配列は、長さ１２～２２、例えば１４～２０、例えば１６～２０、例えば１５～１８、例えば１６～１８、例えば１６～１７の隣接ヌクレオチドを含むかまたは該ヌクレオチドからなる。
【0179】
隣接核酸塩基配列（モチーフ配列）を修飾して、例えばヌクレアーゼ耐性および／またはターゲット核酸への結合アフィニティを増加させてもよいことが理解される。
修飾ヌクレオシド（例えば高アフィニティ修飾ヌクレオシド）がオリゴヌクレオチド配列内に取り込まれるパターンは、一般的に、オリゴヌクレオチド設計と称される。本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシドおよびＲＮＡヌクレオシド（特にｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ分子に関して）またはＤＮＡヌクレオシド（特に一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに関して）を含んで設計される。好適には、高アフィニティ修飾ヌクレオシドを用いる。
修飾ヌクレオシド（例えば高アフィニティ修飾ヌクレオシド）がオリゴヌクレオチド配列内に取り込まれるパターンは、一般的に、オリゴヌクレオチド設計と称される。本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシドおよびＲＮＡヌクレオシド（特にｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ分子に関して）またはＤＮＡヌクレオシド（特に一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに関して）を含んで設計される。好適には、高アフィニティ修飾ヌクレオシドを用いる。
【0180】
１つの態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド、例えば少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つの修飾ヌクレオシドを含む。１つの態様において、オリゴヌクレオチドは１～８の修飾ヌクレオシド、例えば２～７の修飾ヌクレオシド、例えば３～６の修飾ヌクレオシド、例えば４～６の修飾ヌクレオシド、例えば４または５の修飾ヌクレオシドを含む。適切な修飾は、「定義」セクション中、「修飾ヌクレオシド」、「高アフィニティ修飾ヌクレオシド」、「糖修飾」、「２’糖修飾」および「ロックト核酸（ＬＮＡ）」以下に記載される。
【0181】
１つの態様において、オリゴヌクレオチドは、１つまたはそれより多い糖修飾ヌクレオシド、例えば２’糖修飾ヌクレオシドを含む。好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’－フルオロ－ＡＮＡおよびＬＮＡヌクレオシドからなる群より独立に選択される１つまたはそれより多い２’糖修飾ヌクレオシドを含む。修飾ヌクレオシドの１つまたはそれより多くが、ロックト核酸（ＬＮＡ）であることが好適である。しばしば用いられるＬＮＡヌクレオシドは、オキシ－ＬＮＡまたはｃＥＴである。
【0182】
さらなる態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間連結を含む。適切なヌクレオシド間修飾は、「定義」セクションにおいて、「修飾ヌクレオシド間連結」以下に記載される。オリゴヌクレオチドの５’または３’端の少なくとも２～３のヌクレオシド間連結がホスホロチオエートヌクレオシド間連結であることが好適である。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドに関しては、隣接ヌクレオチド配列内の、少なくとも７５％、例えばすべてのヌクレオシド間連結が、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結であることが好適である。
【0183】
本発明のさらなる側面において、本発明の核酸分子、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、これらを二価または三価ＧａｌＮＡｃクラスターなどのアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰｒ）に結合可能なコンジュゲート部分に共有結合させることによって、肝臓に直接ターゲティングされてもよい。
【0184】
コンジュゲート
ＨＢＶ感染は、主に、肝臓における肝細胞に影響を及ぼすため、非コンジュゲート化阻害剤に比較して、肝臓への阻害剤の送達を増加させるであろうコンジュゲート部分に、ＦＵＢＰ１阻害剤をコンジュゲート化することが好適である。１つの態様において、肝臓ターゲティング部分は、コレステロールまたは他の脂質を含む部分あるいはアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に結合可能なコンジュゲート部分より選択される。
ＨＢＶ感染は、主に、肝臓における肝細胞に影響を及ぼすため、非コンジュゲート化阻害剤に比較して、肝臓への阻害剤の送達を増加させるであろうコンジュゲート部分に、ＦＵＢＰ１阻害剤をコンジュゲート化することが好適である。１つの態様において、肝臓ターゲティング部分は、コレステロールまたは他の脂質を含む部分あるいはアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に結合可能なコンジュゲート部分より選択される。
【0185】
いくつかの態様において、本発明は、コンジュゲート部分に共有結合した本発明の核酸分子を含むコンジュゲートを提供する。
アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）コンジュゲート部分は、ガラクトースのものと等しいかまたはそれより大きいアフィニティで、アシアロ糖タンパク質受容体に結合可能な１つまたはそれより多い炭水化物部分（ＡＳＧＰＲターゲティング部分）を含む。アシアロ糖タンパク質受容体に対する多くのガラクトース誘導体のアフィニティが研究されてきている（例えば：Ｊｏｂｓｔ， Ｓ．Ｔ．およびＤｒｉｃｋａｍｅｒ， Ｋ． ＪＢ．Ｃ． １９９６， ２７１， ６６８６を参照されたい）か、またはこうしたアフィニティは、当該技術分野に典型的な方法を用いて容易に決定される。
アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）コンジュゲート部分は、ガラクトースのものと等しいかまたはそれより大きいアフィニティで、アシアロ糖タンパク質受容体に結合可能な１つまたはそれより多い炭水化物部分（ＡＳＧＰＲターゲティング部分）を含む。アシアロ糖タンパク質受容体に対する多くのガラクトース誘導体のアフィニティが研究されてきている（例えば：Ｊｏｂｓｔ， Ｓ．Ｔ．およびＤｒｉｃｋａｍｅｒ， Ｋ． ＪＢ．Ｃ． １９９６， ２７１， ６６８６を参照されたい）か、またはこうしたアフィニティは、当該技術分野に典型的な方法を用いて容易に決定される。
【0186】
１つの態様において、コンジュゲート部分は、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ－ホルミル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、Ｎ－プロピオニル－ガラクトサミン、Ｎ－ｎ－ブタノイル－ガラクトサミンおよびＮ－イソブタノイルガラクトサミンからなる群より選択される、少なくとも１つのアシアロ糖タンパク質受容体ターゲティング部分を含む。好適には、アシアロ糖タンパク質受容体ターゲティング部分は、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である。
【0187】
ＡＳＧＰＲコンジュゲート部分を生成するため、ＡＳＰＧＲターゲティング部分（好ましくはＧａｌＮＡｃ）をコンジュゲート足場に付着させてもよい。一般的に、ＡＳＰＧＲターゲティング部分は、足場の同じ端にあってもよい。１つの態様において、コンジュゲート部分は、スペーサーに連結された２～４の末端ＧａｌＮＡｃ部分からなり、スペーサーは、各ＧａｌＮＡｃ部分を分岐分子に連結し、該分岐分子はアンチセンスオリゴヌクレオチドにコンジュゲート化されていてもよい。
【0188】
さらなる態様において、コンジュゲート部分は、アシアロ糖タンパク質受容体ターゲティング部分に関して、一価、二価、三価または四価である。好適には、アシアロ糖タンパク質受容体ターゲティング部分は、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分を含む。
【0189】
ＧａｌＮＡｃコンジュゲート部分には、例えばＷＯ ２０１４／１７９６２０およびＷＯ ２０１６／０５５６０１ならびにＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５９０８０（本明細書に援用される）に記載されるもの、ならびに付着したＧａｌＮＡｃ部分を含む小分子ペプチド、例えばＴｙｒ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－（アミノヘキシルＧａｌＮＡｃ）３（ＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３；肝細胞上のアシアロ糖タンパク質受容体に結合する糖トリペプチド、例えばＤｕｆｆら， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ， ２０００， ３１３， ２９７を参照されたい）；リジンに基づくガラクトースクラスター（例えばＬ３Ｇ４； Ｂｉｅｓｓｅｎら， Ｃａｒｄｏｖａｓｃ． Ｍｅｄ．， １９９９， ２１４）；およびコランに基づくガラクトースクラスター（例えば、アシアロ糖タンパク質受容体に対する炭水化物認識モチーフ）が含まれてもよい。
【0190】
当該技術分野に知られる方法を用いて、ＡＳＧＰＲコンジュゲート部分、特に三価ＧａｌＮＡｃコンジュゲート部分を、オリゴヌクレオチドの３’または５’端に付着させてもよい。１つの態様において、ＡＳＧＰＲコンジュゲート部分は、オリゴヌクレオチドの５’端に連結される。
【0191】
１つの態様において、コンジュゲート部分は、三価Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、例えば図１に示すもの、特に図１Ｄに示すものである。
製造法
さらなる側面において、本発明は、ヌクレオチド単位を反応させて、そしてそれによって、オリゴヌクレオチド中に含まれる、共有結合された隣接ヌクレオチド単位を形成する工程を含む、本発明の核酸分子を製造するための方法を提供する。好ましくは、方法は、ホスホラミダイト化学反応（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら， １９８７， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌ． １５４， ２８７－３１３ページを参照されたい）を用いる。さらなる態様において、方法は、コンジュゲート化部分（リガンド）とオリゴヌクレオチドを反応させて、コンジュゲート部分をオリゴヌクレオチドに共有結合させる工程をさらに含む。さらなる側面において、本発明の組成物を製造するための方法であって、本発明のオリゴヌクレオチドまたはコンジュゲート化オリゴヌクレオチドを、薬学的に許容されうる希釈剤、溶媒、キャリアー、塩および／またはアジュバントと混合する工程を含む、前記方法を提供する。核酸分子がｓｉＲＮＡである場合、オリゴヌクレオチドは対形成されて、そして二本鎖構造を形成することが可能になる。
製造法
さらなる側面において、本発明は、ヌクレオチド単位を反応させて、そしてそれによって、オリゴヌクレオチド中に含まれる、共有結合された隣接ヌクレオチド単位を形成する工程を含む、本発明の核酸分子を製造するための方法を提供する。好ましくは、方法は、ホスホラミダイト化学反応（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら， １９８７， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌ． １５４， ２８７－３１３ページを参照されたい）を用いる。さらなる態様において、方法は、コンジュゲート化部分（リガンド）とオリゴヌクレオチドを反応させて、コンジュゲート部分をオリゴヌクレオチドに共有結合させる工程をさらに含む。さらなる側面において、本発明の組成物を製造するための方法であって、本発明のオリゴヌクレオチドまたはコンジュゲート化オリゴヌクレオチドを、薬学的に許容されうる希釈剤、溶媒、キャリアー、塩および／またはアジュバントと混合する工程を含む、前記方法を提供する。核酸分子がｓｉＲＮＡである場合、オリゴヌクレオチドは対形成されて、そして二本鎖構造を形成することが可能になる。
【0192】
薬学的塩
本発明記載の化合物は、薬学的に許容されうる塩の形で存在してもよい。用語「薬学的に許容されうる塩」は、生物学的有効性および本発明の化合物の特性を保持し、そして適切な非毒性有機または無機酸あるいは有機または無機塩基より形成される、慣用的な酸付加塩または塩基付加塩を指す。酸付加塩には、例えば、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸および硝酸に由来するもの、ならびに有機酸、例えばｐ－トルエンスルホン酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸等に由来するものが含まれる。塩基付加塩には、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、および水酸化第四アンモニウム、例えば水酸化テトラメチルアンモニウムに由来するものが含まれる。薬学的化合物の塩への化学修飾は、化合物の物理的および化学的安定性、吸湿性、流動性および可溶性の改善を得るため、薬学的化学者に周知の技術である。これは、例えば、Ｂａｓｔｉｎ， Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２０００， ４， ４２７－４３５、またはＡｎｓｅｌ， ： Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， 第６版（１９９５）中， ｐｐ． １９６および１４５６－１４５７に記載される。例えば、本明細書に提供する化合物の薬学的に許容されうる塩は、ナトリウム塩であってもよい。
本発明記載の化合物は、薬学的に許容されうる塩の形で存在してもよい。用語「薬学的に許容されうる塩」は、生物学的有効性および本発明の化合物の特性を保持し、そして適切な非毒性有機または無機酸あるいは有機または無機塩基より形成される、慣用的な酸付加塩または塩基付加塩を指す。酸付加塩には、例えば、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸および硝酸に由来するもの、ならびに有機酸、例えばｐ－トルエンスルホン酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸等に由来するものが含まれる。塩基付加塩には、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、および水酸化第四アンモニウム、例えば水酸化テトラメチルアンモニウムに由来するものが含まれる。薬学的化合物の塩への化学修飾は、化合物の物理的および化学的安定性、吸湿性、流動性および可溶性の改善を得るため、薬学的化学者に周知の技術である。これは、例えば、Ｂａｓｔｉｎ， Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２０００， ４， ４２７－４３５、またはＡｎｓｅｌ， ： Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， 第６版（１９９５）中， ｐｐ． １９６および１４５６－１４５７に記載される。例えば、本明細書に提供する化合物の薬学的に許容されうる塩は、ナトリウム塩であってもよい。
【0193】
さらなる側面において、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲートの薬学的に許容されうる塩を提供する。好ましい態様において、薬学的に許容されうる塩は、ナトリウムまたはカリウム塩である。
【0194】
薬学的組成物
さらなる側面において、本発明は、本発明の核酸分子および／またはコンジュゲートあるいはその塩、および薬学的に許容されうる希釈剤、キャリアー、塩および／またはアジュバントを含む、薬学的組成物を提供する。薬学的に許容されうる希釈剤には、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。いくつかの態様において、薬学的に許容されうる希釈剤は、無菌リン酸緩衝生理食塩水である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドを、５０～３００μＭ溶液の濃度で、薬学的に許容されうる希釈剤において用いる。
さらなる側面において、本発明は、本発明の核酸分子および／またはコンジュゲートあるいはその塩、および薬学的に許容されうる希釈剤、キャリアー、塩および／またはアジュバントを含む、薬学的組成物を提供する。薬学的に許容されうる希釈剤には、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。いくつかの態様において、薬学的に許容されうる希釈剤は、無菌リン酸緩衝生理食塩水である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドを、５０～３００μＭ溶液の濃度で、薬学的に許容されうる希釈剤において用いる。
【0195】
本発明において使用するための適切な配合物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， Ｐａ．， 第１７版， １９８５に見られる。薬剤送達のための方法の簡単な概説に関しては、例えば、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３， １９９０）を参照されたい。ＷＯ ２００７／０３１０９１は、薬学的に許容されうる希釈剤、キャリアーおよびアジュバントのさらに適切でそして好ましい例を提供する（本明細書に援用される）。適切な投薬、配合、投与経路、組成物、投薬型、他の療法剤との組み合わせ、プロドラッグ配合物もまた、ＷＯ２００７／０３１０９１に提供される。
【0196】
本発明の核酸分子またはコンジュゲートは、薬学的組成物または配合物の調製のため、薬学的に許容されうる活性または不活性物質と混合されてもよい。薬学的組成物の配合のための組成物および方法は、限定されるわけではないが、投与経路、疾患の度合い、または投与しようとする用量を含む、いくつかの基準に依存する。
【0197】
これらの組成物を、慣用的な滅菌技術によって滅菌してもよいし、または滅菌濾過してもよい。生じる水溶液をそのまま使用するためにパッケージングするか、または凍結乾燥してもよく、凍結乾燥調製物は、投与前に無菌水性キャリアーと組み合わされる。調製物のｐＨは、典型的には、３～１１の間、より好ましくは５～９の間または６～８の間、そして最も好ましくは７～８の間、例えば７～７．５である。固体型で生じる組成物は、多数の単回用量単位でパッケージングされてもよく、各々は、固定された量の上述の単数または複数の剤を、例えば錠剤またはカプセルの密封パッケージ中に含有する。固体型の組成物はまた、柔軟な量の容器、例えば局所適用可能クリームまたは軟膏用に設計されたスクイーズ可能なチューブ中にパッケージングされてもよい。
【0198】
いくつかの態様において、本発明の核酸分子またはコンジュゲートはプロドラッグである。特に、オリゴヌクレオチドコンジュゲートに関して、コンジュゲート部分は、プロドラッグが作用部位、例えばターゲット細胞に送達されたならば、オリゴヌクレオチドから切り落とされる。
【0199】
適用
本発明の核酸分子は、例えば診断、療法および予防のための、研究試薬として、利用されてもよい。
本発明の核酸分子は、例えば診断、療法および予防のための、研究試薬として、利用されてもよい。
【0200】
研究において、こうした核酸分子を用いて、細胞（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養）および実験動物において、ＦＵＢＰ１タンパク質の合成を特異的に調節して、それによってターゲットの機能的分析、または療法介入のためのターゲットとしての有用性の評価を容易にしてもよい。典型的には、ターゲット調節は、タンパク質を産生するｍＲＮＡを分解するかまたは阻害し、それによってタンパク質形成を防止するか、あるいはタンパク質を産生する遺伝子またはｍＲＮＡの調節因子を分解するかまたは阻害することによって達成される。
【0201】
研究または診断において本発明の核酸分子を使用する場合、ターゲット核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ由来のｃＤＮＡまたは合成核酸であってもよい。
やはり本発明に含まれるのは、ＦＵＢＰ１を発現しているターゲット細胞において、ＦＵＢＰ１発現を調節するためのｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ法であって、本発明の核酸分子、コンジュゲート化合物または薬学的組成物を、有効量で前記細胞に投与する工程を含む、前記方法である。
やはり本発明に含まれるのは、ＦＵＢＰ１を発現しているターゲット細胞において、ＦＵＢＰ１発現を調節するためのｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ法であって、本発明の核酸分子、コンジュゲート化合物または薬学的組成物を、有効量で前記細胞に投与する工程を含む、前記方法である。
【0202】
いくつかの態様において、ターゲット細胞は哺乳動物細胞、特にヒト細胞である。ターゲット細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養または哺乳動物において組織の一部を形成するｉｎ ｖｉｖｏ細胞であってもよい。好ましい態様において、ターゲット細胞は肝臓中に存在する。ターゲット細胞は肝細胞であってもよい。
【0203】
本発明の１つの側面は、薬剤として使用するための本発明の核酸分子、コンジュゲート化合物または薬学的組成物に関する。
本発明の１つの側面において、本発明の核酸分子、コンジュゲート化合物または薬学的組成物は、感染細胞におけるｃｃｃＤＮＡレベルを減少させ、そしてしたがってＨＢＶ感染を阻害することが可能である。特に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つまたはそれより多い以下のパラメータ、ｉ）感染細胞におけるｃｃｃＤＮＡの減少および／またはｉｉ）ｐｇＲＮＡの減少および／またはｉｉｉ）ＨＢＶ ＤＮＡの減少および／またはｉｖ）ＨＢＶウイルス抗原の減少に影響を及ぼすことが可能である。
本発明の１つの側面において、本発明の核酸分子、コンジュゲート化合物または薬学的組成物は、感染細胞におけるｃｃｃＤＮＡレベルを減少させ、そしてしたがってＨＢＶ感染を阻害することが可能である。特に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つまたはそれより多い以下のパラメータ、ｉ）感染細胞におけるｃｃｃＤＮＡの減少および／またはｉｉ）ｐｇＲＮＡの減少および／またはｉｉｉ）ＨＢＶ ＤＮＡの減少および／またはｉｖ）ＨＢＶウイルス抗原の減少に影響を及ぼすことが可能である。
【0204】
例えば、ＨＢＶ感染を阻害する核酸分子は、ｉ）感染細胞におけるｃｃｃＤＮＡレベルを、対照に比較して、少なくとも４０％、例えば５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％減少させるか；あるいはｉｉ）ｐｇＲＮＡレベルを、対照に比較して、少なくとも４０％、例えば５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％減少させることも可能である。対照は、未処置細胞または動物、あるいは適切な対照で処置した細胞または動物であってもよい。
【0205】
ＨＢＶ感染の阻害を、ＨＢＶ感染初代ヒト肝細胞を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで、あるいはＨＢＶミニサークルマウス（Ｃｏｖａｎｃｅ Ｓｈａｎｇｈａｉより入手可能、Ｇｕｏら ２０１６ Ｓｃｉ Ｒｅｐ ６： ２５５２およびＹａｎら ２０１７ Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ６６（６）：１１４９－１１５７もまた参照されたい）またはヒト化肝細胞ＰＸＢマウスモデル（ＰｈｏｅｎｉｘＢｉｏより入手可能、Ｋａｋｕｎｉら ２０１４ Ｉｎｔ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｓｃｉ． １５：５８－７４もまた参照されたい）を用いて、マウスＦＵＢＰ１に相補的な核酸分子に関してｉｎ ｖｉｖｏで、測定してもよい。ＨＢｓＡｇおよび／またはＨＢｅＡｇの分泌の阻害を、ＥＬＩＳＡによって、例えば製造者の指示にしたがってＣＬＩＡ ＥＬＩＳＡキット（Ａｕｔｏｂｉｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）を用いることによって、測定してもよい。細胞内ｃｃｃＤＮＡまたはＨＢＶ ｍＲＮＡおよびｐｇＲＮＡの減少を、例えば材料および方法セクションに記載するように、ｑＰＣＲによって測定してもよい。試験化合物がＨＢＶ感染を阻害するかどうかを評価するためのさらなる方法は、例えばＷＯ ２０１５／１７３２０８に記載されるように、ｑＰＣＲによって、あるいはノーザンブロット；ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、または免疫蛍光を用いて、ＨＢＶ ＤＮＡの分泌を測定する。
【0206】
ＦＵＢＰ１レベルの減少により、本発明の核酸分子、コンジュゲート化合物または薬学的組成物をＨＢＶ感染の発展を阻害するためにまたは治療において用いてもよい。特に、ｃｃｃＤＮＡの不安定化および減少により、本発明の核酸分子、コンジュゲート化合物または薬学的組成物は、ＨＢｓＡｇの分泌を減少させるのみの化合物に比較した際、慢性ＨＢＶ感染の発展をより効率的に阻害するかまたは該感染をより効率的に治療する。
【0207】
したがって、本発明の１つの側面は、ＨＢＶ感染個体において、ｃｃｃＤＮＡおよび／またはｐｇＲＮＡを減少させるための、本発明の核酸分子、コンジュゲート化合物または薬学的組成物の使用に関する。
【0208】
本発明のさらなる側面は、慢性ＨＢＶ感染の発展を阻害するかまたは該感染を治療するための、本発明の核酸分子、コンジュゲート化合物または薬学的組成物の使用に関する。
本発明のさらなる側面は、ＨＢＶに感染したヒトの感染性を減少させるための、本発明の核酸分子、コンジュゲート化合物または薬学的組成物の使用に関する。本発明の特定の側面において、本発明の核酸分子、コンジュゲート化合物または薬学的組成物は、慢性ＨＢＶ感染の発展を阻害する。
本発明のさらなる側面は、ＨＢＶに感染したヒトの感染性を減少させるための、本発明の核酸分子、コンジュゲート化合物または薬学的組成物の使用に関する。本発明の特定の側面において、本発明の核酸分子、コンジュゲート化合物または薬学的組成物は、慢性ＨＢＶ感染の発展を阻害する。
【0209】
本発明の核酸分子、コンジュゲート化合物または薬学的組成物で治療されるべき被験体（あるいは本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲート化合物または薬学的組成物を予防的に投与される被験体）は、好ましくはヒトであり、より好ましくはＨＢｓＡｇ陽性および／またはＨＢｅＡｇ陽性であるヒト患者、さらにより好ましくはＨＢｓＡｇ陽性およびＨＢｅＡｇ陽性であるヒト患者である。
【0210】
したがって、本発明は、ＨＢＶ感染を治療し、そして／または防止する方法であって、有効量の本発明の核酸分子、コンジュゲート化合物または薬学的組成物を投与する工程を含む、前記方法に関する。
【0211】
本発明はまた、薬剤、特にＨＢＶ感染または慢性ＨＢＶ感染の治療または防止において、あるいはＨＢＶに感染したヒトの感染性の減少において使用するための薬剤の製造のための、本発明の核酸分子、コンジュゲート化合物または薬学的組成物の使用も提供する。好ましい態様において、薬剤は、皮下投与のための投薬型で製造される。
【0212】
本発明はまた、静脈内投与のための投薬型である薬剤の製造のための、本発明の核酸分子、コンジュゲート化合物または薬学的組成物の使用も提供する。
本発明の核酸分子、コンジュゲートまたは薬学的組成物は、併用療法で用いてもよい。例えば、本発明の核酸分子、コンジュゲートまたは薬学的組成物を、ＨＢＶの治療および／または予防のための、他の抗ＨＢＶ剤、例えばインターフェロンアルファ－２ｂ、インターフェロンアルファ－２ａ、およびインターフェロンアルファコン－１（ｐｅｇ化および非ｐｅｇ化）、リバビリン、ラミブジン（３ＴＣ）、エンテカビル、テノホビル、テルビブジン（ＬｄＴ）、アデホビル、または他の新規抗ＨＢＶ剤、例えばＨＢＶ ＲＮＡ複製阻害剤、ＨＢｓＡｇ分泌阻害剤、ＨＢＶキャプシド阻害剤、アンチセンスオリゴマー（例えばＷＯ２０１２／１４５６９７、ＷＯ ２０１４／１７９６２９およびＷＯ ２０１７／２１６３９０に記載されるもの）、ｓｉＲＮＡ（例えばＷＯ ２００５／０１４８０６、ＷＯ ２０１２／０２４１７０、ＷＯ ２０１２／２０５５３６２、ＷＯ ２０１３／００３５２０、ＷＯ ２０１３／１５９１０９、ＷＯ ２０１７／０２７３５０およびＷＯ２０１７／０１５１７５に記載されるもの）、ＨＢＶ療法ワクチン、ＨＢＶ予防ワクチン、ＨＢＶ抗体療法（モノクローナルまたはポリクローナル）、あるいはＴＬＲ２、３、７、８または９アゴニストと組み合わされてもよい。
本発明の核酸分子、コンジュゲートまたは薬学的組成物は、併用療法で用いてもよい。例えば、本発明の核酸分子、コンジュゲートまたは薬学的組成物を、ＨＢＶの治療および／または予防のための、他の抗ＨＢＶ剤、例えばインターフェロンアルファ－２ｂ、インターフェロンアルファ－２ａ、およびインターフェロンアルファコン－１（ｐｅｇ化および非ｐｅｇ化）、リバビリン、ラミブジン（３ＴＣ）、エンテカビル、テノホビル、テルビブジン（ＬｄＴ）、アデホビル、または他の新規抗ＨＢＶ剤、例えばＨＢＶ ＲＮＡ複製阻害剤、ＨＢｓＡｇ分泌阻害剤、ＨＢＶキャプシド阻害剤、アンチセンスオリゴマー（例えばＷＯ２０１２／１４５６９７、ＷＯ ２０１４／１７９６２９およびＷＯ ２０１７／２１６３９０に記載されるもの）、ｓｉＲＮＡ（例えばＷＯ ２００５／０１４８０６、ＷＯ ２０１２／０２４１７０、ＷＯ ２０１２／２０５５３６２、ＷＯ ２０１３／００３５２０、ＷＯ ２０１３／１５９１０９、ＷＯ ２０１７／０２７３５０およびＷＯ２０１７／０１５１７５に記載されるもの）、ＨＢＶ療法ワクチン、ＨＢＶ予防ワクチン、ＨＢＶ抗体療法（モノクローナルまたはポリクローナル）、あるいはＴＬＲ２、３、７、８または９アゴニストと組み合わされてもよい。
【0213】
投与
本発明の核酸分子、コンジュゲート化合物または薬学的組成物を、適正な医療行為に一致した様式で、配合し、投薬し、そして投与する。この背景において考慮する要因には、治療中の特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、剤の送達部位、投与法、投与のスケジューリング、患者の年齢および性別、ならびに医師に知られる他の要因が含まれる。本明細書において、「有効量」（「（療法的）有効用量」としてもまた知られる）は、医師または他の臨床家によって探求される被験体の生物学的または医学的反応を誘発する化合物の量を意味する。本発明の核酸分子、コンジュゲート化合物または薬学的組成物の「有効量」は、こうした考慮に支配され、そしてＨＢｓＡｇおよび／またはＨＢｅＡｇを阻害するために必要な最小量である。例えば、こうした量は、レシピエントの細胞に、または全体としての哺乳動物に毒性である量より低い。
本発明の核酸分子、コンジュゲート化合物または薬学的組成物を、適正な医療行為に一致した様式で、配合し、投薬し、そして投与する。この背景において考慮する要因には、治療中の特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、剤の送達部位、投与法、投与のスケジューリング、患者の年齢および性別、ならびに医師に知られる他の要因が含まれる。本明細書において、「有効量」（「（療法的）有効用量」としてもまた知られる）は、医師または他の臨床家によって探求される被験体の生物学的または医学的反応を誘発する化合物の量を意味する。本発明の核酸分子、コンジュゲート化合物または薬学的組成物の「有効量」は、こうした考慮に支配され、そしてＨＢｓＡｇおよび／またはＨＢｅＡｇを阻害するために必要な最小量である。例えば、こうした量は、レシピエントの細胞に、または全体としての哺乳動物に毒性である量より低い。
【0214】
いくつかの態様において、本発明の核酸分子、コンジュゲートまたは薬学的組成物は、０．１～１５ｍｇ／ｋｇ、例えば０．２～１０ｍｇ／ｋｇ、例えば０．２５～５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。投与は、週１回、２週ごと、３週ごとまたはさらに月１回であってもよい。
【0215】
本発明の核酸分子、コンジュゲートまたは薬学的組成物を、局所（例えば皮膚、吸入、眼または耳）または経腸（例えば経口または胃腸管を通じて）または非経口（例えば静脈内、皮下、筋内、脳内、脳室内またはクモ膜下腔内）投与してもよい。
【0216】
好ましい態様において、本発明の核酸分子、コンジュゲート化合物または薬学的組成物を、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋内注射または注入を含む非経口経路によって投与する。１つの態様において、活性オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートを、静脈内投与する。ＧａｌＮＡｃコンジュゲート化化合物を用いる場合、ＡＳＧＰ受容体の飽和を遅延させるため、皮下投与することが好適でありうる。
【0217】
併用療法
いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは薬学的組成物は、別の療法剤との併用療法で使用するためのものである。療法剤は、例えば、上述の疾患または障害のための標準治療であってもよい。
いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは薬学的組成物は、別の療法剤との併用療法で使用するためのものである。療法剤は、例えば、上述の疾患または障害のための標準治療であってもよい。
【0218】
例えば、本発明のオリゴマーまたはオリゴマーコンジュゲートは、他の活性剤、例えばアンチセンス（ＷＯ ２０１１／０４７３１２またはＷＯ２０１５／１７３２０８に記載されるようなＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド、あるいはＧＳＫ３３８９４０４などのＭＯＥアンチセンスオリゴヌクレオチド、あるいはＷＯ ２０１２／１４５６９７またはＷＯ ２０１４／７９６２９に記載されるものを含む）、ｓｉＲＮＡ（例えばＡＲＣ－５２０、ＡＲＣ－５２１、ＡＲＢ－１４６７、あるいはＷＯ２０１３／００３５２０、ＷＯ２０１６／０７７３２１、ＵＳ ２０１７／００１６０００またはＷＯ ２０１７／０２７３５０に記載されるもの）、アプタマー、モルホリノまたは任意の他の抗ウイルス性ヌクレオチド配列に依存する作用方式のいずれかを通じて作用する、オリゴヌクレオチドに基づく抗ウイルス剤、例えば配列特異的なオリゴヌクレオチドに基づく抗ウイルス剤と組み合わせて用いられてもよい。
【0219】
さらなる例として、本発明のオリゴマーまたはオリゴマーコンジュゲートを、他の活性剤、例えば免疫刺激性抗ウイルス化合物、例えばインターフェロン（例えばｐｅｇ化インターフェロンアルファ）、ＴＬＲ７アゴニスト（例えばＧＳ－９６２０）、ＴＬＲ８アゴニスト（例えばＧＳ－９６８８）または療法ワクチンと組み合わせても用いてもよい。
【0220】
さらなる例として、本発明のオリゴマーまたはオリゴマーコンジュゲートを、抗ウイルス活性を持つ他の活性剤、例えば小分子と組み合わせて用いてもよい。これらの他の活性剤は、例えばヌクレオシド／ヌクレオチド阻害剤（例えばエンテカビルまたはテノホビルジソプロキシルフマレート）、キャプシド形成阻害剤、進入阻害剤（例えばＭｙｒｃｌｕｄｅｘ Ｂ）であってもよい。
【0221】
特定の態様において、さらなる療法剤は、ＨＢＶ剤、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）剤、化学療法剤、抗生物質、鎮痛剤、非ステロイド性抗炎症性（ＮＳＡＩＤ）剤、抗真菌剤、抗寄生虫剤、鎮吐剤、止瀉剤、または免疫抑制剤であってもよい。
【0222】
特に関連する態様において、さらなるＨＢＶ剤は、インターフェロンアルファ－２ｂ、インターフェロンアルファ－２ａ、およびインターフェロンアルファコン－１（ｐｅｇ化および非ｐｅｇ化）、リバビリン；ＨＢＶ ＲＮＡ複製阻害剤；第二のアンチセンスオリゴマー；ＨＢＶ療法ワクチン；ＨＢＶ予防ワクチン；ラミブジン（３ＴＣ）；エンテカビル（ＥＴＶ）；テノホビルジソプロキシルフマレート（ＴＤＦ）；テルビブジン（ＬｄＴ）；アデホビル；またはＨＢＶ抗体療法（モノクローナルまたはポリクローナル）であってもよい。
【0223】
他の特に関連する態様において、さらなるＨＣＶ剤は、インターフェロンアルファ－２ｂ、インターフェロンアルファ－２ａ、およびインターフェロンアルファコン－１（ｐｅｇ化および非ｐｅｇ化）；リバビリン；ペガシス；ＨＣＶ ＲＮＡ複製阻害剤（例えばＶｉｒｏＰｈａｒｍａのＶＰ５０４０６シリーズ）；ＨＣＶアンチセンス剤；ＨＣＶ療法ワクチン；ＨＣＶプロテアーゼ阻害剤；ＨＣＶヘリカーゼ阻害剤；あるいはＨＣＶモノクローナルまたはポリクローナル抗体療法であってもよい。
【0224】
発明の態様
本発明の以下の態様を、本明細書に記載する任意の他の態様と組み合わせて用いてもよい。
本発明の以下の態様を、本明細書に記載する任意の他の態様と組み合わせて用いてもよい。
【0225】
１． Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の治療および／または防止において使用するためのＦＵＢＰ１阻害剤。
２． ＦＵＢＰ１阻害剤が有効量で投与される、態様１の使用のためのＦＵＢＰ１阻害剤。
２． ＦＵＢＰ１阻害剤が有効量で投与される、態様１の使用のためのＦＵＢＰ１阻害剤。
【0226】
３． ＨＢＶ感染が慢性感染である、態様１または２の使用のためのＦＵＢＰ１阻害剤。
４． ＦＵＢＰ１阻害剤は、感染細胞において、ｃｃｃＤＮＡおよび／またはｐｇＲＮＡを減少させることが可能である、態様１～３の使用のためのＦＵＢＰ１阻害剤。
４． ＦＵＢＰ１阻害剤は、感染細胞において、ｃｃｃＤＮＡおよび／またはｐｇＲＮＡを減少させることが可能である、態様１～３の使用のためのＦＵＢＰ１阻害剤。
【0227】
５． ＦＵＢＰ１阻害剤は、ＦＵＢＰ１のＤＮＡ、例えばｃｃｃＤＮＡへの結合を防止するかまたは減少させる、態様１～４のいずれか１つの使用のためのＦＵＢＰ１阻害剤。
６． 阻害剤は、ＦＵＢＰ１／ＦＵＳＥ相互作用を防止するかまたは減少させる、態様１～５のいずれか１つの使用のためのＦＵＢＰ１阻害剤。
６． 阻害剤は、ＦＵＢＰ１／ＦＵＳＥ相互作用を防止するかまたは減少させる、態様１～５のいずれか１つの使用のためのＦＵＢＰ１阻害剤。
【0228】
７． 阻害剤は、ＦＵＢＰ１タンパク質のＤＮＡ結合ドメインと相互作用する、態様１～６のいずれか１つの使用のためのＦＵＢＰ１阻害剤。
８． 阻害剤は、ｃｃｃＤＮＡ上のＦＵＳＥ要素と相互作用する、態様１～６のいずれか１つの使用のためのＦＵＢＰ１阻害剤。
８． 阻害剤は、ｃｃｃＤＮＡ上のＦＵＳＥ要素と相互作用する、態様１～６のいずれか１つの使用のためのＦＵＢＰ１阻害剤。
【0229】
９． 阻害剤は、ｃｃｃＤＮＡへのＦＵＢＰ１タンパク質の結合を特異的に防止するかまたは減少させる小分子である、態様６～８の使用のためのＦＵＢＰ１阻害剤。
１０． 阻害剤が式ＶＩＩ、ＩＸまたはＸ
１０． 阻害剤が式ＶＩＩ、ＩＸまたはＸ
【0230】
【化17】
【0231】
の化合物より選択される、請求項１～９のいずれか一項の使用のためのＦＵＢＰ１阻害剤。
１１．阻害剤が、
ａ． 部位特異的ＤＮＡヌクレアーゼまたは部位特異的ＤＮＡヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド；および
ｂ． ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド
を含むゲノム編集機構である、態様１～５のいずれか１つの使用のためのＦＵＢＰ１阻害剤。
１１．阻害剤が、
ａ． 部位特異的ＤＮＡヌクレアーゼまたは部位特異的ＤＮＡヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド；および
ｂ． ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド
を含むゲノム編集機構である、態様１～５のいずれか１つの使用のためのＦＵＢＰ１阻害剤。
【0232】
１２． 阻害剤は、哺乳動物ＦＵＢＰ１ターゲット核酸に少なくとも９０％相補的であり、そしてターゲット核酸のレベルを減少させることが可能である、長さ１２～３０ヌクレオチドの隣接ヌクレオチド配列を含むかまたは該配列からなる核酸分子である、態様１～５のいずれか１つの使用のためのＦＵＢＰ１阻害剤。
【0233】
１３． ターゲット核酸がＲＮＡである、態様１２の使用のためのＦＵＢＰ１阻害剤。
１４． ＲＮＡがプレｍＲＮＡである、態様１３の使用のためのＦＵＢＰ１阻害剤。
１５． 核酸分子が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡより選択される、態様１１～１４のいずれか１つの使用のためのＦＵＢＰ１阻害剤。
１４． ＲＮＡがプレｍＲＮＡである、態様１３の使用のためのＦＵＢＰ１阻害剤。
１５． 核酸分子が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡより選択される、態様１１～１４のいずれか１つの使用のためのＦＵＢＰ１阻害剤。
【0234】
１６． 核酸分子が一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは二本鎖ｓｉＲＮＡである、態様１５の使用のためのＦＵＢＰ１阻害剤。
１７． 哺乳動物ＦＵＢＰ１ターゲット核酸が配列番号１～２０より選択される、態様１２～１６のいずれか１つの使用のための核酸分子。
１７． 哺乳動物ＦＵＢＰ１ターゲット核酸が配列番号１～２０より選択される、態様１２～１６のいずれか１つの使用のための核酸分子。
【0235】
１８． 哺乳動物ＦＵＢＰ１ターゲット核酸が配列番号１～８より選択される、態様１２～１６の使用のための核酸分子。
１９． 哺乳動物ＦＵＢＰ１ターゲット核酸が配列番号１～４より選択される、態様１２～１６の使用のための核酸分子。
１９． 哺乳動物ＦＵＢＰ１ターゲット核酸が配列番号１～４より選択される、態様１２～１６の使用のための核酸分子。
【0236】
２０． 隣接ヌクレオチド配列が、配列番号１および配列番号５および配列番号９のターゲット核酸に少なくとも９８％相補的である、態様１２～１６のいずれか１つの使用のための核酸分子。
【0237】
２１． 隣接ヌクレオチド配列が、配列番号１および配列番号５のターゲット核酸に少なくとも９８％相補的である、態様１２～１６のいずれか１つの使用のための核酸分子。
２２． 対照に比較した際、ＨＢＶ感染細胞におけるｃｃｃＤＮＡが、少なくとも５０％、例えば６０％、例えば７０％、例えば８０％、例えば９０％、例えば９５％、例えば１００％、減少している、態様１～２１のいずれか一項の使用のためのＦＵＢＰ１阻害剤。
２２． 対照に比較した際、ＨＢＶ感染細胞におけるｃｃｃＤＮＡが、少なくとも５０％、例えば６０％、例えば７０％、例えば８０％、例えば９０％、例えば９５％、例えば１００％、減少している、態様１～２１のいずれか一項の使用のためのＦＵＢＰ１阻害剤。
【0238】
２３． 対照に比較した際、ＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡが、少なくとも５０％、例えば６０％、例えば７０％、例えば８０％、例えば９０％、例えば９５％、例えば１００％、減少している、態様１２～２２のいずれか一項の使用のための核酸分子。
【0239】
２４． 長さ１２～３０ヌクレオチドの隣接ヌクレオチド配列を含むかまたは該配列からなり、隣接ヌクレオチド配列が、哺乳動物ＦＵＢＰ１ターゲット核酸に、少なくとも９０％相補的、例えば９５％、例えば９８％、例えば完全に相補的である、長さ１２～６０ヌクレオチドの核酸分子。
【0240】
２５． 化学的に産生されている、態様２４の核酸分子。
２６． 哺乳動物ＦＵＢＰ１ターゲット核酸が、配列番号１～２０より選択される、態様２４または２５の核酸分子。
２６． 哺乳動物ＦＵＢＰ１ターゲット核酸が、配列番号１～２０より選択される、態様２４または２５の核酸分子。
【0241】
２７． 哺乳動物ＦＵＢＰ１ターゲット核酸が、配列番号１～８より選択される、態様２４または２５の核酸分子。
２８． 哺乳動物ＦＵＢＰ１ターゲット核酸が、配列番号１～４より選択される、態様２４または２５の核酸分子。
２８． 哺乳動物ＦＵＢＰ１ターゲット核酸が、配列番号１～４より選択される、態様２４または２５の核酸分子。
【0242】
２９． 隣接ヌクレオチド配列が、配列番号１および配列番号５および配列番号９のターゲット核酸に少なくとも９８％相補的である、態様２４または２５の核酸分子。
３０． 隣接ヌクレオチド配列が、配列番号１および配列番号５のターゲット核酸に少なくとも９８％相補的である、態様２４または２５の核酸分子。
３０． 隣接ヌクレオチド配列が、配列番号１および配列番号５のターゲット核酸に少なくとも９８％相補的である、態様２４または２５の核酸分子。
【0243】
３１． 長さ１２～３０ヌクレオチドである、態様２４～３０のいずれか１つの核酸分子。
３２． 二本鎖ｓｉＲＮＡまたは一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである、態様２４～３１のいずれか１つの核酸分子。
３２． 二本鎖ｓｉＲＮＡまたは一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである、態様２４～３１のいずれか１つの核酸分子。
【0244】
３３． 隣接ヌクレオチド配列が、配列番号１上の１４２００～１４２１８位、１４４１３～１４４３１位、１４９６６～１４９８４位および３０３４４～３０３６２位からなる群より選択されるターゲット配列に相補的である、態様２４～３１のいずれか１つの核酸分子。
【0245】
３４． －１５ｋｃａｌ未満のΔＧ°で配列番号１および配列番号５のターゲット核酸にハイブリダイズ可能である、態様２４～３３の核酸分子。
３５． 隣接ヌクレオチド配列が、少なくとも１４の隣接ヌクレオチド、特に１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２の隣接ヌクレオチドを含むかまたは該ヌクレオチドからなる、態様２４～３４のいずれか１つの核酸分子。
３５． 隣接ヌクレオチド配列が、少なくとも１４の隣接ヌクレオチド、特に１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２の隣接ヌクレオチドを含むかまたは該ヌクレオチドからなる、態様２４～３４のいずれか１つの核酸分子。
【0246】
３６． 隣接ヌクレオチド配列が１４～２２ヌクレオチドを含むかまたは該ヌクレオチドからなる、態様２４～３４のいずれか１つの核酸分子。
３７． 隣接ヌクレオチド配列が１６～１８ヌクレオチドを含むかまたは該ヌクレオチドからなる、態様３６の核酸分子。
３７． 隣接ヌクレオチド配列が１６～１８ヌクレオチドを含むかまたは該ヌクレオチドからなる、態様３６の核酸分子。
【0247】
３８． 長さ１４～２５ヌクレオチドを含むかまたは該ヌクレオチドからなる、態様２４～３７の核酸分子。
３９． 長さ１６～２２ヌクレオチドを含むかまたは該ヌクレオチドからなる、態様３８の核酸分子。
３９． 長さ１６～２２ヌクレオチドを含むかまたは該ヌクレオチドからなる、態様３８の核酸分子。
【0248】
４０． 隣接ヌクレオチド配列が、相補的であるターゲット核酸に比較して、ゼロ～３のミスマッチを有する、態様２４～３９のいずれか１つの核酸分子。
４１． 隣接ヌクレオチド配列が、ターゲット核酸に比較して１つのミスマッチを有する、態様４０の核酸分子。
４１． 隣接ヌクレオチド配列が、ターゲット核酸に比較して１つのミスマッチを有する、態様４０の核酸分子。
【0249】
４２． 隣接ヌクレオチド配列が、ターゲット核酸に比較して２つのミスマッチを有する、態様４０の核酸分子。
４３． 隣接ヌクレオチド配列が、両方のターゲット核酸配列に対して完全に相補的である、態様４０の核酸分子。
４３． 隣接ヌクレオチド配列が、両方のターゲット核酸配列に対して完全に相補的である、態様４０の核酸分子。
【0250】
４４． １つまたはそれより多い修飾ヌクレオシドを含む、態様２４～４３の核酸分子。
４５． １つまたはそれより多い修飾ヌクレオシドが高アフィニティ修飾ヌクレオシドである、態様４４の核酸分子。
４５． １つまたはそれより多い修飾ヌクレオシドが高アフィニティ修飾ヌクレオシドである、態様４４の核酸分子。
【0251】
４６． １つまたはそれより多い修飾ヌクレオシドが２’糖修飾ヌクレオシドである、態様４４または４５の核酸分子。
４７． １つまたはそれより多い２’糖修飾ヌクレオシドが、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＡＮＡおよびＬＮＡヌクレオシドからなる群より独立に選択される、態様４６の核酸分子。
４７． １つまたはそれより多い２’糖修飾ヌクレオシドが、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＡＮＡおよびＬＮＡヌクレオシドからなる群より独立に選択される、態様４６の核酸分子。
【0252】
４８． １つまたはそれより多い修飾ヌクレオシドがＬＮＡヌクレオシドである、態様４４～４７の核酸分子。
４９． 修飾ＬＮＡヌクレオシドが、オキシ－ＬＮＡ、アミノ－ＬＮＡ、チオ－ＬＮＡ、ｃＥＴ、およびＥＮＡより選択される、態様４８の核酸分子。
４９． 修飾ＬＮＡヌクレオシドが、オキシ－ＬＮＡ、アミノ－ＬＮＡ、チオ－ＬＮＡ、ｃＥＴ、およびＥＮＡより選択される、態様４８の核酸分子。
【0253】
５０． 修飾ＬＮＡヌクレオシドが、続く２’－４’架橋－Ｏ－ＣＨ２－を伴うオキシＬＮＡである、態様４８または４９の核酸分子。
５１． オキシ－ＬＮＡがベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡである、態様５０の核酸分子。
５１． オキシ－ＬＮＡがベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡである、態様５０の核酸分子。
【0254】
５２． 修飾ＬＮＡヌクレオシドが、続く２’－４’架橋－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ３）－を伴うｃＥＴである、態様４８または４９の核酸分子。
５３． ｃＥＴが（Ｓ）ｃＥＴ、すなわち６’（Ｓ）メチル－ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡである、態様５２の核酸分子。
５３． ｃＥＴが（Ｓ）ｃＥＴ、すなわち６’（Ｓ）メチル－ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡである、態様５２の核酸分子。
【0255】
５４． ＬＮＡが、続く２’－４’架橋－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－を伴うＥＮＡである、態様４８または４９の核酸分子。
５５． 少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間連結を含む、態様２４～５４のいずれか１つの核酸分子。
５５． 少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間連結を含む、態様２４～５４のいずれか１つの核酸分子。
【0256】
５６． 修飾ヌクレオシド間連結がヌクレアーゼ耐性である、態様５５の核酸分子。
５７． 修飾ヌクレオシド間連結がホスホロチオエートヌクレオシド間連結である、態様５５または５６の核酸分子。
５７． 修飾ヌクレオシド間連結がホスホロチオエートヌクレオシド間連結である、態様５５または５６の核酸分子。
【0257】
５８． ＲＩＳＣ複合体と相互作用可能な二本鎖ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドである、態様２４～５７のいずれか１つの核酸分子。
５９． ＲＮアーゼＨをリクルート可能であるアンチセンスオリゴヌクレオチドである、態様２４～５７のいずれか１つの核酸分子。
５９． ＲＮアーゼＨをリクルート可能であるアンチセンスオリゴヌクレオチドである、態様２４～５７のいずれか１つの核酸分子。
【0258】
６０． アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは隣接ヌクレオチド配列がギャップマーである、態様５９のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
６１． アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその隣接ヌクレオチド配列が、式５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’、式中、領域ＦおよびＦ’は、独立に１～８ヌクレオシドを含むかまたはこれらからなり、このうち１～４は２’糖修飾されており、そしてＦおよびＦ’領域の５’および３’端を定義し、そしてＧはＲＮアーゼＨをリクルート可能な６～１６ヌクレオシドの間の領域である、のギャップマーからなるかまたは該ギャップマーを含む、態様６０のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
６１． アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその隣接ヌクレオチド配列が、式５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’、式中、領域ＦおよびＦ’は、独立に１～８ヌクレオシドを含むかまたはこれらからなり、このうち１～４は２’糖修飾されており、そしてＦおよびＦ’領域の５’および３’端を定義し、そしてＧはＲＮアーゼＨをリクルート可能な６～１６ヌクレオシドの間の領域である、のギャップマーからなるかまたは該ギャップマーを含む、態様６０のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【0259】
６２． ２’糖修飾ヌクレオシドが、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’－フルオロ－ＡＮＡおよびＬＮＡヌクレオシドからなる群より独立に選択される、態様６１のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【0260】
６３． 領域ＦおよびＦ’中の１つまたはそれより多い２’糖修飾ヌクレオシドが、ＬＮＡヌクレオシドである、態様６１または６２のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
６４． 領域ＦおよびＦ’中のすべての２’糖修飾ヌクレオシドがＬＮＡヌクレオシドである、態様６３のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
６４． 領域ＦおよびＦ’中のすべての２’糖修飾ヌクレオシドがＬＮＡヌクレオシドである、態様６３のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【0261】
６５． ＬＮＡヌクレオシドが、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ、アルファ－Ｌ－オキシ－ＬＮＡ、ベータ－Ｄ－アミノ－ＬＮＡ、アルファ－Ｌ－アミノ－ＬＮＡ、ベータ－Ｄ－チオ－ＬＮＡ、アルファ－Ｌ－チオ－ＬＮＡ、（Ｓ）ｃＥＴ、（Ｒ）ｃＥＴベータ－Ｄ－ＥＮＡおよびアルファ－Ｌ－ＥＮＡより選択される、態様６２～６４のオリゴヌクレオチド。
【0262】
６６． 領域ＦおよびＦ’が同一のＬＮＡヌクレオシドからなる、態様６２～６５のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
６７． 領域ＦおよびＦ’中のすべての２’糖修飾ヌクレオシドがオキシ－ＬＮＡヌクレオシドである、態様６２～６６のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
６７． 領域ＦおよびＦ’中のすべての２’糖修飾ヌクレオシドがオキシ－ＬＮＡヌクレオシドである、態様６２～６６のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【0263】
６８． 領域Ｇ中のヌクレオシドがＤＮＡおよび／またはアルファ－Ｌ－ＬＮＡヌクレオシドである、態様６１～６７のいずれか1つのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
６９． 領域Ｇが少なくとも７５％、ＤＮＡヌクレオシドからなる、態様６８のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
６９． 領域Ｇが少なくとも７５％、ＤＮＡヌクレオシドからなる、態様６８のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【0264】
７０． 領域Ｇ中のすべてのヌクレオシドがＤＮＡヌクレオシドである、態様６９のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
７１． 態様２４～５９のいずれか1つに記載の核酸分子、または態様６０～７０のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、および前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合している少なくとも1つのコンジュゲート部分を含む、コンジュゲート化合物。
７１． 態様２４～５９のいずれか1つに記載の核酸分子、または態様６０～７０のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、および前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合している少なくとも1つのコンジュゲート部分を含む、コンジュゲート化合物。
【0265】
７２． 核酸分子が二本鎖ｓｉＲＮＡであり、そしてコンジュゲート部分がｓｉＲＮＡのセンス鎖に共有結合している、態様７１のコンジュゲート化合物。
７３． コンジュゲート部分が、炭水化物、細胞表面受容体リガンド、薬剤物質、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素、ビタミン、ウイルスタンパク質またはその組み合わせより選択される、態様７１または７２のコンジュゲート化合物。
７３． コンジュゲート部分が、炭水化物、細胞表面受容体リガンド、薬剤物質、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素、ビタミン、ウイルスタンパク質またはその組み合わせより選択される、態様７１または７２のコンジュゲート化合物。
【0266】
７４． コンジュゲート部分が、アシアロ糖タンパク質受容体に結合可能である、態様７１～７３のいずれか1つのコンジュゲート化合物。
７５． コンジュゲート部分が、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ－ホルミル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、Ｎ－プロピオニル－ガラクトサミン、Ｎ－ｎ－ブタノイル－ガラクトサミンおよびＮ－イソブタノイルガラクトサミンからなる群より選択される少なくとも１つのアシアロ糖タンパク質受容体ターゲティング部分を含む、態様７４のコンジュゲート化合物。
７５． コンジュゲート部分が、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ－ホルミル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、Ｎ－プロピオニル－ガラクトサミン、Ｎ－ｎ－ブタノイル－ガラクトサミンおよびＮ－イソブタノイルガラクトサミンからなる群より選択される少なくとも１つのアシアロ糖タンパク質受容体ターゲティング部分を含む、態様７４のコンジュゲート化合物。
【0267】
７６． アシアロ糖タンパク質受容体ターゲティング部分が、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である、態様７５のコンジュゲート化合物。
７７． コンジュゲート部分が、アシアロ糖タンパク質受容体ターゲティング部分に関して、一価、二価、三価または四価である、態様７５または７６のコンジュゲート化合物。
７７． コンジュゲート部分が、アシアロ糖タンパク質受容体ターゲティング部分に関して、一価、二価、三価または四価である、態様７５または７６のコンジュゲート化合物。
【0268】
７８． コンジュゲート部分が、２～４の末端ＧａｌＮＡｃ部分、および各ＧａｌＮＡｃ部分を、アンチセンス化合物にコンジュゲート化可能な分岐分子に連結させるスペーサーからなる、態様７７のコンジュゲート化合物。
【0269】
７９． スペーサーがＰＥＧスペーサーである、態様７８のコンジュゲート化合物。
８０． コンジュゲート部分が、三価Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分である、態様７４～７９のコンジュゲート化合物。
８０． コンジュゲート部分が、三価Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分である、態様７４～７９のコンジュゲート化合物。
【0270】
８１． コンジュゲート部分が、図１の三価ＧａｌＮＡｃ部分の1つより選択される、態様７４～８０のコンジュゲート化合物。
８２． コンジュゲート部分が図１Ｄの三価ＧａｌＮＡｃ部分である、態様８１のコンジュゲート化合物。
８２． コンジュゲート部分が図１Ｄの三価ＧａｌＮＡｃ部分である、態様８１のコンジュゲート化合物。
【0271】
８３． 核酸分子またはアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびコンジュゲート部分の間に配置されるリンカーを含む、態様７１～８２のコンジュゲート化合物。
８４． リンカーが生理学的に不安定なリンカーである、態様８３のコンジュゲート化合物。
８４． リンカーが生理学的に不安定なリンカーである、態様８３のコンジュゲート化合物。
【0272】
８５． 生理学的に不安定なリンカーが、ヌクレアーゼ感受性リンカーである、態様８４のコンジュゲート化合物。
８６． 生理学的に不安定なリンカーが、２～５の連続ホスホジエステル連結で構成される、態様８４または８５のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
８６． 生理学的に不安定なリンカーが、２～５の連続ホスホジエステル連結で構成される、態様８４または８５のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
【0273】
８７． 非コンジュゲート化核酸分子またはアンチセンスオリゴヌクレオチドに比較した際の、コンジュゲート化合物の、肝臓対腎臓の間の改善された細胞分布、あるいは肝臓内への改善された細胞取り込みを示す、態様７４～８６のコンジュゲート化合物。
【0274】
８８． 態様２４～５９のいずれか1つに記載の核酸分子、または態様６０～７０のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、態様７１～８７のコンジュゲート化合物、あるいはその許容されうる塩、ならびに薬学的に許容されうる希釈剤、キャリアー、塩および／またはアジュバントを含む、薬学的組成物。
【0275】
８９． Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染を防止し、軽減し、そして／または阻害する化合物を同定するための方法であって：
ａ． 試験化合物を
ｂ． ＦＵＢＰ１ポリペプチド；または
ｃ． ＦＵＢＰ１を発現している細胞と接触させ；
ｄ． 前記試験化合物の存在下および非存在下での、ＦＵＢＰ１の発現および／または活性を測定し；そして
ｅ． ＦＵＢＰ１の発現および／または活性を減少させ、そしてｃｃｃＤＮＡを減少させる化合物を同定する
工程を含む、前記方法。
ａ． 試験化合物を
ｂ． ＦＵＢＰ１ポリペプチド；または
ｃ． ＦＵＢＰ１を発現している細胞と接触させ；
ｄ． 前記試験化合物の存在下および非存在下での、ＦＵＢＰ１の発現および／または活性を測定し；そして
ｅ． ＦＵＢＰ１の発現および／または活性を減少させ、そしてｃｃｃＤＮＡを減少させる化合物を同定する
工程を含む、前記方法。
【0276】
９０． ＦＵＢＰ１を発現しているターゲット細胞において、ＦＵＢＰ１発現を調節するためのｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ法であって、態様２４～５９のいずれか１つの核酸分子、または態様６０～７０のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、態様７１～８７のコンジュゲート化合物、または態様８８の薬学的組成物を有効量で前記細胞に投与する工程を含む、前記方法。
【0277】
９１． ＦＵＢＰ１発現を、いかなる処置も伴わないかまたは対照で処置したレベルに比較して、ターゲット細胞において、少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、減少させる、態様９０の方法。
【0278】
９２． ターゲット細胞がＨＢＶに感染し、そしてＨＢＶ感染細胞中のｃｃｃＤＮＡが、いかなる処置も伴わないかまたは対照で処置したレベルに比較して、ＨＢＶ感染細胞において、少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、減少する、態様９０の方法。
【0279】
９３． 態様２４～５９のいずれか１つの核酸分子、または態様６０～７０のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、態様７１～８７のコンジュゲート化合物、または態様８８の薬学的組成物の療法的または予防的有効量を、疾患に罹患しているかまたは疾患に感受性である被験体に投与する工程を含む、疾患を治療するかまたは防止するための方法。
【0280】
９４． 被験体における疾患の治療または防止のための薬剤として使用するための、態様２４～５９のいずれか１つの核酸分子、または態様６０～７０のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または態様７１～８７のいずれか１つのコンジュゲート化合物、または態様８８の薬学的組成物。
【0281】
９５． 被験体における疾患の治療または防止のための薬剤の調製のための、態様２４～５９のいずれか１つの核酸分子、または態様６０～７０のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または態様７１～８７のいずれか１つのコンジュゲート化合物の使用。
【0282】
９６． 被験体が哺乳動物である、態様９３～９５の方法、核酸分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲートまたは使用。
９７． 哺乳動物がヒトである、態様９６の方法、核酸分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲート、または使用。
９７． 哺乳動物がヒトである、態様９６の方法、核酸分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲート、または使用。
【実施例】
【0283】
実施例は本発明を例示する。
材料および方法
ＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ細胞株およびＨＢＶ感染
ＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ細胞（Ｕｒｂａｎら ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２０１４， ＤＯＩ：１０．１０５３／ｊ．ｇａｓｔｒｏ．２０１３．１２．０２４）を、３７℃、５％ＣＯ２を含む加湿大気中、ＤＭＥＭ＋ＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉ（Ｇｉｂｃｏ ＃３１９６６－０２１）、５％ ＨＩ ＦＣＩＩ（Ｇｉｂｃｏ）、１ｘＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ、＃１５１４０）からなる完全増殖培地中で２週間培養した。ＨＢＶ感染のため、ＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ細胞をトリプシン処理し、そして感染培地（２．５％ＤＭＳＯを補った完全増殖培地）中に再懸濁し、そして４００ ０００細胞／ウェルで１２ウェルプレート内に植え付けた。３～４日後、細胞が８０％～９０％周密に到達したら（第０日と称する）、次いで、４％ＰＥＧ８０００およびＨＢＶ（ＭＯＩ１００）を加えた感染培地をウェルあたり５００μｌ用いて、細胞にＨＢＶを接種した。１６時間後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、そして培地を３～４日ごとにウェルあたり１ｍｌの修飾感染培地（３．５％ＤＭＳＯを補った完全増殖培地）に置き換えた。ＨＢＶ遺伝子型ＤはＨｅｐＡＤ３８細胞培養上清に由来し、そしてこれをＰＥＧ沈殿（Ｌａｄｎｅｒら １９９７ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ４１（８） １７１－１７２０）を用いて濃縮した。
材料および方法
ＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ細胞株およびＨＢＶ感染
ＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ細胞（Ｕｒｂａｎら ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２０１４， ＤＯＩ：１０．１０５３／ｊ．ｇａｓｔｒｏ．２０１３．１２．０２４）を、３７℃、５％ＣＯ２を含む加湿大気中、ＤＭＥＭ＋ＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉ（Ｇｉｂｃｏ ＃３１９６６－０２１）、５％ ＨＩ ＦＣＩＩ（Ｇｉｂｃｏ）、１ｘＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ、＃１５１４０）からなる完全増殖培地中で２週間培養した。ＨＢＶ感染のため、ＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ細胞をトリプシン処理し、そして感染培地（２．５％ＤＭＳＯを補った完全増殖培地）中に再懸濁し、そして４００ ０００細胞／ウェルで１２ウェルプレート内に植え付けた。３～４日後、細胞が８０％～９０％周密に到達したら（第０日と称する）、次いで、４％ＰＥＧ８０００およびＨＢＶ（ＭＯＩ１００）を加えた感染培地をウェルあたり５００μｌ用いて、細胞にＨＢＶを接種した。１６時間後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、そして培地を３～４日ごとにウェルあたり１ｍｌの修飾感染培地（３．５％ＤＭＳＯを補った完全増殖培地）に置き換えた。ＨＢＶ遺伝子型ＤはＨｅｐＡＤ３８細胞培養上清に由来し、そしてこれをＰＥＧ沈殿（Ｌａｄｎｅｒら １９９７ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ４１（８） １７１－１７２０）を用いて濃縮した。
【0284】
ＨｅＬａ細胞株
ＨｅＬａ細胞株をＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ、＃９３０２１０１３）より購入し、そして供給者に推奨されるように、５％ＣＯ２を含む加湿インキュベーター中、３７℃で維持した。アッセイのため、２，５００細胞／ウェルを、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭグルタミンＡＱ、１％ＮＥＡＡ、２５μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含むイーグルの最小必須培地（Ｓｉｇｍａ、Ｍ２２７９）中、９６マルチウェルプレート中に植え付けた。
ＨｅＬａ細胞株をＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ、＃９３０２１０１３）より購入し、そして供給者に推奨されるように、５％ＣＯ２を含む加湿インキュベーター中、３７℃で維持した。アッセイのため、２，５００細胞／ウェルを、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭグルタミンＡＱ、１％ＮＥＡＡ、２５μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含むイーグルの最小必須培地（Ｓｉｇｍａ、Ｍ２２７９）中、９６マルチウェルプレート中に植え付けた。
【0285】
初代マウス肝細胞（ＰＭＨ）
文献（ＢｅｒｒｙおよびＦｒｉｅｎｄ， １９６９， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ； Ｐａｔｅｒｎａら， １９９８， Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．）にしたがった２工程灌流プロトコル後、ペントバルビタールで麻酔したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの肝臓から、初代マウス肝細胞を単離した。第一の工程は、ＨＢＳＳ＋１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋０．４ｍＭ ＥＧＴＡで５分間であり、その後、ＨＢＳＳ＋２０ｍＭ ＮａＨＣＯ３＋０．０４％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ ＃Ａ７９７９）＋４ｍＭ ＣａＣＬ２（Ｓｉｇｍａ ＃２１１１５）＋０．２ｍｇ／ｍｌ ２型コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ ＃４１７６）で１２分であった。肝細胞を、氷上で、５ｍｌ氷冷ウィリアムズ培地Ｅ（ＷＭＥ）（Ｓｉｇｍａ ＃Ｗ１８７８、１ｘＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／グルタミン、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（ＡＴＣＣ＃３０－２０３０）を補充）中に捕捉した。
文献（ＢｅｒｒｙおよびＦｒｉｅｎｄ， １９６９， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ； Ｐａｔｅｒｎａら， １９９８， Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．）にしたがった２工程灌流プロトコル後、ペントバルビタールで麻酔したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの肝臓から、初代マウス肝細胞を単離した。第一の工程は、ＨＢＳＳ＋１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋０．４ｍＭ ＥＧＴＡで５分間であり、その後、ＨＢＳＳ＋２０ｍＭ ＮａＨＣＯ３＋０．０４％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ ＃Ａ７９７９）＋４ｍＭ ＣａＣＬ２（Ｓｉｇｍａ ＃２１１１５）＋０．２ｍｇ／ｍｌ ２型コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ ＃４１７６）で１２分であった。肝細胞を、氷上で、５ｍｌ氷冷ウィリアムズ培地Ｅ（ＷＭＥ）（Ｓｉｇｍａ ＃Ｗ１８７８、１ｘＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／グルタミン、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（ＡＴＣＣ＃３０－２０３０）を補充）中に捕捉した。
【0286】
未精製細胞懸濁物を、７０μｍ、その後、４０μｍの細胞ストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ ＃３５２３５０および＃３５２３４０）を通じて濾過し、２５ｍｌまでＷＭＥで満たし、そして室温で５分間、５０ｘｇで遠心分離して、肝細胞をペレットにした。上清を除去し、そして肝細胞を、２５ｍｌ ＷＭＥに再懸濁した。２５ｍｌ ９０％Ｐｅｒｃｏｌｌ溶液（Ｓｉｇｍａ ＃Ｐ４９３７；ｐＨ＝８．５～９．５）を添加し、そして５０ｘｇ、２５℃で１０分間遠心分離した後、上清および浮遊細胞を除去した。残ったＰｅｒｃｏｌｌを除去するため、ペレットを再び５０ｍＬ ＷＭＥ培地中に再懸濁し、２５℃、５０ｘｇで３分間遠心分離し、そして上清を廃棄した。細胞ペレットを２０ｍＬ ＷＭＥに再懸濁し、そして細胞数および生存度を決定し（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｅｌｌｃｏｕｎｔ）、そして２５０，０００細胞／ｍｌに希釈した。２５，０００細胞／ウェルを、コラーゲンをコーティングした９６ウェルプレート（ＰＤ ＢｉｏｃｏａｔコラーゲンＩ ＃３５６４０７）上に植え付け、そして３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーションした。植え付け２４時間後、オリゴヌクレオチドを所望の濃度で添加し、そして細胞を３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベーションした。
【0287】
ＨＢＶ感染ＰＨＨ細胞
新鮮な初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）は、２４ウェルプレート形式で、ＰｈｏｅｎｉｘＢｉｏ、日本・東広島市（カタログ番号ＰＸＢ－細胞）によって提供された。到着したら、ＰＨＨ細胞を、ＰＨＨ培地中、４％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ中で、ＨＢＶと１６時間インキュベーションすることによって、ＨｅｐＧ２ ２．２．１５由来ＨＢＶを用いて、２５ＧＥのＭＯＩにＰＨＨを感染させた。次いで、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、そして１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１００８２）、２％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ、１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１５１４０－１４８）、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１５６３０－０８０）、４４ｍＭ ＮａＨＣＯ３（和光、カタログ番号１９５－１４５１５）、１５μｇ／ｍｌ Ｌ－プロリン（ＭＰ－Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、カタログ番号０２１９４７２８２５）、０．２５μｇ／ｍｌインスリン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｉ１８８２）、５０ｎＭデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ８８９３）、５ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｅ９６４４）、および０．１ｍＭ Ｌ－アスコルビン酸２－リン酸（和光、カタログ番号０１３－１２０６１）を補ったＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号２１８８５）からなる新鮮なＰＨＨ培地中、５％ＣＯ２を含む加湿大気中で培養した。
新鮮な初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）は、２４ウェルプレート形式で、ＰｈｏｅｎｉｘＢｉｏ、日本・東広島市（カタログ番号ＰＸＢ－細胞）によって提供された。到着したら、ＰＨＨ細胞を、ＰＨＨ培地中、４％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ中で、ＨＢＶと１６時間インキュベーションすることによって、ＨｅｐＧ２ ２．２．１５由来ＨＢＶを用いて、２５ＧＥのＭＯＩにＰＨＨを感染させた。次いで、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、そして１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１００８２）、２％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ、１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１５１４０－１４８）、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１５６３０－０８０）、４４ｍＭ ＮａＨＣＯ３（和光、カタログ番号１９５－１４５１５）、１５μｇ／ｍｌ Ｌ－プロリン（ＭＰ－Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、カタログ番号０２１９４７２８２５）、０．２５μｇ／ｍｌインスリン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｉ１８８２）、５０ｎＭデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ８８９３）、５ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｅ９６４４）、および０．１ｍＭ Ｌ－アスコルビン酸２－リン酸（和光、カタログ番号０１３－１２０６１）を補ったＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号２１８８５）からなる新鮮なＰＨＨ培地中、５％ＣＯ２を含む加湿大気中で培養した。
【0288】
ｓｉＲＮＡ配列および化合物
表４． 個々のＦＵＢＰ１ ｓｉＲＮＡ分子によってターゲティングされるヒトＦＵＢＰ１配列
表４． 個々のＦＵＢＰ１ ｓｉＲＮＡ分子によってターゲティングされるヒトＦＵＢＰ１配列
【0289】
【表4】
【0290】
ｓｉＲＮＡのプール（ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ ＳＭＡＲＴプールｓｉＲＮＡ カタログ番号Ｌ－０１１５４８－００－０００５、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）は、表４に列挙する４つの個々のｓｉＲＮＡ分子を含有し、そして入手可能である。
【0291】
一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド
表４Ａ：オリゴヌクレオチドモチーフ配列（配列番号によって示される）リスト、これらの設計、ならびにモチーフ配列に基づいて設計される特異的オリゴヌクレオチド化合物（化合物番号によって示される）。
表４Ａ：オリゴヌクレオチドモチーフ配列（配列番号によって示される）リスト、これらの設計、ならびにモチーフ配列に基づいて設計される特異的オリゴヌクレオチド化合物（化合物番号によって示される）。
【0292】
【表5-1】
【0293】
【表5-2】
【0294】
モチーフ配列は、オリゴヌクレオチド中に存在する核酸塩基の隣接配列を示す。
設計は、ギャップマー設計、Ｆ－Ｇ－Ｆ’を指し、式中、各数字は隣接修飾ヌクレオシドの数を示し、例えば２’修飾ヌクレオシド（最初の数字＝５’フランク）、その後、ＤＮＡヌクレオシドの数（第二の数字＝ギャップ領域）、その後、修飾ヌクレオシド、例えば２’修飾ヌクレオシドの数（第三の数字＝３’フランク）であり、随意に、ターゲット核酸に相補的な隣接配列の必ずしも一部ではない、ＤＮＡおよびＬＮＡのさらなる反復領域が先行するかまたは続く。
設計は、ギャップマー設計、Ｆ－Ｇ－Ｆ’を指し、式中、各数字は隣接修飾ヌクレオシドの数を示し、例えば２’修飾ヌクレオシド（最初の数字＝５’フランク）、その後、ＤＮＡヌクレオシドの数（第二の数字＝ギャップ領域）、その後、修飾ヌクレオシド、例えば２’修飾ヌクレオシドの数（第三の数字＝３’フランク）であり、随意に、ターゲット核酸に相補的な隣接配列の必ずしも一部ではない、ＤＮＡおよびＬＮＡのさらなる反復領域が先行するかまたは続く。
【0295】
オリゴヌクレオチド化合物は、モチーフ配列の特異的設計に相当する。大文字はベータ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドに相当し、小文字はＤＮＡヌクレオシドに相当し、すべてのＬＮＡ Ｃは５－メチルシトシンであり、そして５－メチルＤＮＡシトシンは、「ｅ」によって示され、すべてのヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。
【0296】
ＨＢＶ感染細胞に関するｓｉＲＮＡトランスフェクションおよび処置プロトコル
ｓｉＲＮＡ処置をＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰまたはＰＨＨにおいて行った。細胞を、感染後第４日および第６日に、ＯｐｔｉｍＭＥＭ（５０μｌ／ウェル、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ血清減少培地）中で希釈した、２５ｎＭのスクランブルｓｉＲＮＡ（ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴプラス非ターゲティングｓｉＲＮＡ、Ｄ－００１８１０－０１、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、米国コロラド州）、ＦＵＢＰ１プールまたは単一ｓｉＲＮＡ（ＳＭＡＲＴプール： ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴプラス・ヒトＦＵＢＰ１ ｓｉＲＮＡ、Ｌ－０１１５４８－００、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、米国コロラド州）またはｓｉＲＮＡ不含（ＯｐｔｉｍＭＥＭ）（０．５μｌ／ウェル）のいずれかを含有する１００μｌ／ウェルのトランスフェクション混合物で、細胞をトランスフェクションし、そしてトランスフェクション前に、ＯｐｔｉｍＭＥＭ（５０μｌ／ウェル）で希釈した、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬（３μｌ／ウェル）（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１３７７８）と５分間混合した。
ｓｉＲＮＡ処置をＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰまたはＰＨＨにおいて行った。細胞を、感染後第４日および第６日に、ＯｐｔｉｍＭＥＭ（５０μｌ／ウェル、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ血清減少培地）中で希釈した、２５ｎＭのスクランブルｓｉＲＮＡ（ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴプラス非ターゲティングｓｉＲＮＡ、Ｄ－００１８１０－０１、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、米国コロラド州）、ＦＵＢＰ１プールまたは単一ｓｉＲＮＡ（ＳＭＡＲＴプール： ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴプラス・ヒトＦＵＢＰ１ ｓｉＲＮＡ、Ｌ－０１１５４８－００、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、米国コロラド州）またはｓｉＲＮＡ不含（ＯｐｔｉｍＭＥＭ）（０．５μｌ／ウェル）のいずれかを含有する１００μｌ／ウェルのトランスフェクション混合物で、細胞をトランスフェクションし、そしてトランスフェクション前に、ＯｐｔｉｍＭＥＭ（５０μｌ／ウェル）で希釈した、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬（３μｌ／ウェル）（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１３７７８）と５分間混合した。
【0297】
ＰＨＨサザンブロットのため、細胞をまた、陰性対照（２ｐｍоｌ）として用いたＨＢＶ特異的ｓｉＲＮＡ（ＨＢｘ ｓｉＲＮＡ）でも処置した。第二の陰性対照（ｓｉ対照）、Ｓｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）陰性対照＃１ ｓｉＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に加えて、ＨＢＶ特異的ｓｉＲＮＡを特注した（ＧＥ Ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ）（センス：５’－ＧＣＡＣＵＵＣＧＣＵＵＣＡＣＣＵＣＵＧ－３’ 配列番号８４）。トランスフェクション混合物を、ＤＭＳＯおよびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含まない１ｍｌのＤＭＥＭとともに細胞に２４時間添加し、次いで、培地を、それぞれ、ＨｅｐＧ２ ＮＴＣＰおよびＰＨＨ細胞培地に置き換えた。感染８日後（ｓｉＲＮＡ処置の４日後）に細胞を採取し、そしてＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡノックダウンの分析およびウイルスパラメータの定量化のため、－８０℃で保存した。
【0298】
サザンブロットプロトコル
サザンブロットのため、Ｈｉｒｔ Ｂ １９６７ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２６：３６５－３６９；およびＣａｉ Ｄ ２０１３ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１０３０：１５１－６１に以前記載された適応Ｈｉｒｔ抽出プロトコルを用いて、ＨＢＶ感染ＰＨＨからのｃｃｃＤＮＡ精製を行った。簡潔には、すべてのウイルス核酸を放出させるため、細胞をＨＩＲＴ溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．７％ＳＤＳ、２μｌ Ａｍｂｉｏｎ ＲＮアーゼ混合物／ｍｌ緩衝液）に溶解して、脂質膜およびウイルスキャプシドを破壊した。ＮａＣｌ（５Ｍ、４℃一晩）で、ウイルスポリメラーゼが共有結合したＨＢＶ ＤＮＡ複製中間体を含む、高分子量細胞クロマチン、タンパク質およびタンパク質会合ＤＮＡを沈殿させる前に、ＲＮアーゼ処理によってＲＮＡを除去した。一晩高塩タンパク質沈殿を行った後、清澄化した溶解物から、直接フェノール抽出によって、ウイルスＤＮＡ（濃縮ｃｃｃＤＮＡ）を抽出した。
サザンブロットのため、Ｈｉｒｔ Ｂ １９６７ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２６：３６５－３６９；およびＣａｉ Ｄ ２０１３ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１０３０：１５１－６１に以前記載された適応Ｈｉｒｔ抽出プロトコルを用いて、ＨＢＶ感染ＰＨＨからのｃｃｃＤＮＡ精製を行った。簡潔には、すべてのウイルス核酸を放出させるため、細胞をＨＩＲＴ溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．７％ＳＤＳ、２μｌ Ａｍｂｉｏｎ ＲＮアーゼ混合物／ｍｌ緩衝液）に溶解して、脂質膜およびウイルスキャプシドを破壊した。ＮａＣｌ（５Ｍ、４℃一晩）で、ウイルスポリメラーゼが共有結合したＨＢＶ ＤＮＡ複製中間体を含む、高分子量細胞クロマチン、タンパク質およびタンパク質会合ＤＮＡを沈殿させる前に、ＲＮアーゼ処理によってＲＮＡを除去した。一晩高塩タンパク質沈殿を行った後、清澄化した溶解物から、直接フェノール抽出によって、ウイルスＤＮＡ（濃縮ｃｃｃＤＮＡ）を抽出した。
【0299】
次いで、ＤＮＡを定量化し、そして調整して、アガロースゲル（ＴＡＥ緩衝液中、１．８％）上に、ウェルあたり１５μｌで１５μｇの各試料を装填した。ＤＮＡラダー（ＮＥＢ Ｑｕｉｃｋ－Ｌｏａｄ、１ｋｂ）、および組換えＨＢＶもまた装填し、そしてゲルを５０Ｖで３時間３０分間泳動した。
【0300】
サザンブロットのため、ゲルを変性緩衝液（０．５Ｍ ＮａＯＨ（５０ｍｌ）、１．５ＭＮａＣｌ（１５０ｍｌ））中に浸し、そして室温で３０分間揺動して、後にプローブにハイブリダイズさせるため、二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに分離した。アガロースゲルからＨｙｂｏｎｄ－ＸＬ膜（カタログ番号：ＲＰＮ２０２０Ｓ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）へのＤＮＡのトランスファーを、Ｗｈａｔｍａｎ Ｎｙｔｒａｎ ＳｕＰｅｒＣｈａｒｇｅ（ＳＰＣ）ＴｕｒｂｏＢｌｏｔｔｅｒキット（カタログ番号：ＷＨＡＴ１０４１６３２８、Ｓｉｇｍａ）を用いて行った。トランスファー後、ＵＶ架橋チャンバー中、１８００ＪのＵＶエネルギー量で膜を架橋した。ＤＩＧ ＲＮＡラベリングキット（（ＳＰ６／Ｔ７）カタログ番号１１１７５０２５９１０、Ｒｏｃｈｅ）を用い、ＨＢＶプラスミドＤＮＡ（ｐＧＥＭ３ＺプラスミドにクローニングされたＨＢＶ遺伝子型Ｄ）および以下のプライマー：
【0301】
【化18】
【0302】
を用いて、ＤＩＧ標識ＲＮＡプローブを生成した。
次いで、膜をＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ緩衝液（カタログ番号：１１６０３５５８００１、Ｒｏｃｈｅ）中のＤＩＧ標識プローブと、ハイブリダイゼーションオーブン中で回転させながら、５０℃で一晩ハイブリダイズさせた。次いで、膜を洗浄し、そしてＮｉｔｒｏＢｌｏｃｋを含むＣＤＰ－Ｓｔａｒとインキュベーションした後、フィルムに曝露した。シグナルの検出をＦｕｓｉｏｎ Ｆｘ（ＶＩＬＢＥＲ）で行った。
次いで、膜をＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ緩衝液（カタログ番号：１１６０３５５８００１、Ｒｏｃｈｅ）中のＤＩＧ標識プローブと、ハイブリダイゼーションオーブン中で回転させながら、５０℃で一晩ハイブリダイズさせた。次いで、膜を洗浄し、そしてＮｉｔｒｏＢｌｏｃｋを含むＣＤＰ－Ｓｔａｒとインキュベーションした後、フィルムに曝露した。シグナルの検出をＦｕｓｉｏｎ Ｆｘ（ＶＩＬＢＥＲ）で行った。
【0303】
ＨＢＶ抗原測定
ＨＢＶ抗原発現および分泌に対する影響を評価するため、細胞培養から上清を収集してもよい。製造者のプロトコルにしたがって、ＣＬＩＡ ＥＬＩＳＡキット（Ａｕｔｏｂｉｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ＃ＣＬ０３１０－２、＃ＣＬ０３１１２－２）を用いて、ＨＢＶ増殖パラメータ、ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇレベルを測定する。簡潔には、ウェルあたり２５μＬの上清を、それぞれの抗体をコーティングしたマイクロタイタープレートに移し、そして２５μＬの酵素コンジュゲート試薬を添加する。プレートを振盪装置上、室温で６０分間インキュベーションした後、自動洗浄装置を用いて、ウェルを洗浄緩衝液で５回洗浄した。２５μＬの基質ＡおよびＢを各ウェルに添加した。プレートを振盪装置上、室温で１０分間インキュベーションした後、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ発光読み取り装置（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて、発光を測定する。
ＨＢＶ抗原発現および分泌に対する影響を評価するため、細胞培養から上清を収集してもよい。製造者のプロトコルにしたがって、ＣＬＩＡ ＥＬＩＳＡキット（Ａｕｔｏｂｉｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ＃ＣＬ０３１０－２、＃ＣＬ０３１１２－２）を用いて、ＨＢＶ増殖パラメータ、ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇレベルを測定する。簡潔には、ウェルあたり２５μＬの上清を、それぞれの抗体をコーティングしたマイクロタイタープレートに移し、そして２５μＬの酵素コンジュゲート試薬を添加する。プレートを振盪装置上、室温で６０分間インキュベーションした後、自動洗浄装置を用いて、ウェルを洗浄緩衝液で５回洗浄した。２５μＬの基質ＡおよびＢを各ウェルに添加した。プレートを振盪装置上、室温で１０分間インキュベーションした後、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ発光読み取り装置（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて、発光を測定する。
【0304】
細胞内ＨＢＶ ｐｇＲＮＡおよびＦＵＢＰ１ ＲＮＡに関するリアルタイムＰＣＲ
ＳＹＢＲグリーンを用いたＲＴｑＰＣＲによって、ＦＵＢＰ１ ＲＮＡおよびＨＢＶ ｐｇＲＮＡを定量化した。ヒトＧｕｓ Ｂ内因性対照に対して結果を標準化した。参照遺伝子Ｇｕｓ Ｂおよび非処置細胞に対して標準化した比較サイクル閾値２－ΔΔＣｔ法を用いて、ｍＲＮＡ発現を分析した。ＦＵＢＰ１ ＲＮＡおよびＨＢＶ ｐｇＲＮＡ定量化のために用いたプライマーを表５に列挙する。ＲＴｑＰＣＲ条件は以下の通りであった：４８℃、１５分間（ＲＴ工程）；９５℃、１０分間；４０周期の９５℃、１５秒間および６０℃、１分間。
ＳＹＢＲグリーンを用いたＲＴｑＰＣＲによって、ＦＵＢＰ１ ＲＮＡおよびＨＢＶ ｐｇＲＮＡを定量化した。ヒトＧｕｓ Ｂ内因性対照に対して結果を標準化した。参照遺伝子Ｇｕｓ Ｂおよび非処置細胞に対して標準化した比較サイクル閾値２－ΔΔＣｔ法を用いて、ｍＲＮＡ発現を分析した。ＦＵＢＰ１ ＲＮＡおよびＨＢＶ ｐｇＲＮＡ定量化のために用いたプライマーを表５に列挙する。ＲＴｑＰＣＲ条件は以下の通りであった：４８℃、１５分間（ＲＴ工程）；９５℃、１０分間；４０周期の９５℃、１５秒間および６０℃、１分間。
【0305】
表５： ＦＵＢＰ１およびＨＢＶ ｐｇＲＮＡ ｑＰＣＲプライマー
【0306】
【表6】
【0307】
ＨＢＶ ＤＮＡおよびｃｃｃＤＮＡ ｔａｑｍａｎ ｑＰＣＲ
ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅＴＭ ＤＮＡ精製キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、米国ウィスコンシン州マディソン）プロトコルを用いて、ＨＢＶ感染細胞（ＨｅｐＧ２ ＮＴＣＰまたはＰＨＨ）からＤＮＡを抽出した。５００ｎｇのＤＮＡに対して１０ＵのＴ５を用い、２０μｌ総体積中、３７℃で１時間、Ｔ５エキソヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、米国マサチューセッツ州）で消化した後、ｃｃｃＤＮＡレベルを決定した。消化後、試料を５０μｌに希釈し、このうち４μｌをｑＰＣＲ反応に用いた。ＶｉｉＡ７リアルタイムＰＣＲ系（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応測定を行った。Ｔａｑｍａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号４４４４５５７）を用いて、ｑＰＣＲを行った。ｑＰＣＲ条件は以下の通りであった：５０℃、２分間；９５℃、１０分間；４０周期の９５℃、１５秒間および６０℃、１分間。ｃｃｃＤＮＡプライマーおよびプローブを表６に示す。
ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅＴＭ ＤＮＡ精製キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、米国ウィスコンシン州マディソン）プロトコルを用いて、ＨＢＶ感染細胞（ＨｅｐＧ２ ＮＴＣＰまたはＰＨＨ）からＤＮＡを抽出した。５００ｎｇのＤＮＡに対して１０ＵのＴ５を用い、２０μｌ総体積中、３７℃で１時間、Ｔ５エキソヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、米国マサチューセッツ州）で消化した後、ｃｃｃＤＮＡレベルを決定した。消化後、試料を５０μｌに希釈し、このうち４μｌをｑＰＣＲ反応に用いた。ＶｉｉＡ７リアルタイムＰＣＲ系（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応測定を行った。Ｔａｑｍａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号４４４４５５７）を用いて、ｑＰＣＲを行った。ｑＰＣＲ条件は以下の通りであった：５０℃、２分間；９５℃、１０分間；４０周期の９５℃、１５秒間および６０℃、１分間。ｃｃｃＤＮＡプライマーおよびプローブを表６に示す。
【0308】
表６： ｃｃｃＤＮＡ ｑＰＣＲプライマーおよびプローブ
【0309】
【表7】
【0310】
ｃｃｃＤＮＡプライマーおよびプローブは、Ｍａｌｍｓｔｒоｅｍら ２０１２ ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７（７）： ｅ３６３４９に記載される。
ＨＢＢ ＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイ（ＩＤ Ｈｓ００７５８８８９＿ｓ１、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてｂ－グロビンを、そしてＴａｑｍａｎプライマー（Ｐａ０３４５３４０６＿ｓ１、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ）を用いて総ＨＢＶ ＤＮＡを定量化した。
ＨＢＢ ＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイ（ＩＤ Ｈｓ００７５８８８９＿ｓ１、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてｂ－グロビンを、そしてＴａｑｍａｎプライマー（Ｐａ０３４５３４０６＿ｓ１、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ）を用いて総ＨＢＶ ＤＮＡを定量化した。
【0311】
オリゴヌクレオチド合成
オリゴヌクレオチド合成は、一般的に当該技術分野に知られる。以下は、適用してもよいプロトコルである。本発明のオリゴヌクレオチドは、用いる装置、支持体および濃度に関して、方法をわずかに変化させることによって産生されていてもよい。
オリゴヌクレオチド合成は、一般的に当該技術分野に知られる。以下は、適用してもよいプロトコルである。本発明のオリゴヌクレオチドは、用いる装置、支持体および濃度に関して、方法をわずかに変化させることによって産生されていてもよい。
【0312】
Ｏｌｉｇｏｍａｋｅｒ ４８上、１μｍоｌスケールで、ホスホラミダイトアプローチを用いて、ウリジン普遍的支持体上、オリゴヌクレオチドを合成する。合成終了時、水性アンモニアを用いて、６０℃で５～１６時間、固体支持体からオリゴヌクレオチドを切断する。逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）によって、または固相抽出によって、オリゴヌクレオチドを精製し、そしてＵＰＬＣによって特徴づけし、そしてＥＳＩ－ＭＳによって分子量をさらに確認する。
【0313】
オリゴヌクレオチドの伸長：
アセトニトリル中の０．１Ｍの５’－Ｏ－ＤＭＴ保護アミダイトおよび活性化剤としてのアセトニトリル中のＤＣＩ（４，５－ジシアノイミダゾール）（０．２５Ｍ）の溶液を用いることによって、β－シアノエチル－ホスホラミダイトのカップリング（ＤＮＡ－Ａ（Ｂｚ）、ＤＮＡ－Ｇ（ｉｂｕ）、ＤＮＡ－Ｃ（Ｂｚ）、ＤＮＡ－Ｔ、ＬＮＡ－５－メチル－Ｃ（Ｂｚ）、ＬＮＡ－Ａ（Ｂｚ）、ＬＮＡ－Ｇ（ｄｍｆ）、またはＬＮＡ－Ｔ）を行う。最終サイクルのため、所望の修飾を伴うホスホラミダイト、例えばコンジュゲート基を付着するためのＣ６リンカーまたはこうしたものとしてのコンジュゲート基を用いてもよい。水素化キサンチン（アセトニトリル／ピリジン９：１中、０．０１Ｍ）を用いることによって、ホスホロチオエート連結の導入のためのチオール化を行う。ＴＨＦ／ピリジン／水７：２：１中の０．０２Ｍイオジンを用いて、ホスホジエステル連結を導入してもよい。試薬の残りは、オリゴヌクレオチド合成に典型的に用いられるものである。
アセトニトリル中の０．１Ｍの５’－Ｏ－ＤＭＴ保護アミダイトおよび活性化剤としてのアセトニトリル中のＤＣＩ（４，５－ジシアノイミダゾール）（０．２５Ｍ）の溶液を用いることによって、β－シアノエチル－ホスホラミダイトのカップリング（ＤＮＡ－Ａ（Ｂｚ）、ＤＮＡ－Ｇ（ｉｂｕ）、ＤＮＡ－Ｃ（Ｂｚ）、ＤＮＡ－Ｔ、ＬＮＡ－５－メチル－Ｃ（Ｂｚ）、ＬＮＡ－Ａ（Ｂｚ）、ＬＮＡ－Ｇ（ｄｍｆ）、またはＬＮＡ－Ｔ）を行う。最終サイクルのため、所望の修飾を伴うホスホラミダイト、例えばコンジュゲート基を付着するためのＣ６リンカーまたはこうしたものとしてのコンジュゲート基を用いてもよい。水素化キサンチン（アセトニトリル／ピリジン９：１中、０．０１Ｍ）を用いることによって、ホスホロチオエート連結の導入のためのチオール化を行う。ＴＨＦ／ピリジン／水７：２：１中の０．０２Ｍイオジンを用いて、ホスホジエステル連結を導入してもよい。試薬の残りは、オリゴヌクレオチド合成に典型的に用いられるものである。
【0314】
固相合成後のコンジュゲート化のため、商業的に入手可能なＣ６アミノリンカーホスホラミダイトを固相合成の最終サイクルで用いてもよく、そして脱保護および固体支持体からの切断後、アミノ連結された脱保護オリゴヌクレオチドを単離する。標準合成法を用い、官能基の活性化を通じて、コンジュゲートを導入する。
【0315】
ＲＰ－ＨＰＬＣによる精製：
Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ１８ １０μ １５０ｘ１０ｍｍカラム上の調製用ＲＰ－ＨＰＬＣによって、未精製化合物を精製する。０．１Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ８およびアセトニトリルを、流速５ｍＬ／分で緩衝剤として用いる。収集した分画を凍結乾燥して、典型的には白色固体である精製化合物を得た。
Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ１８ １０μ １５０ｘ１０ｍｍカラム上の調製用ＲＰ－ＨＰＬＣによって、未精製化合物を精製する。０．１Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ８およびアセトニトリルを、流速５ｍＬ／分で緩衝剤として用いる。収集した分画を凍結乾燥して、典型的には白色固体である精製化合物を得た。
【0316】
略語：
ＤＣＩ：４，５－ジシアノイミダゾール
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＴ：４，４’－ジメトキシトリチル
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
Ｂｚ：ベンゾイル
Ｉｂｕ：イソブチリル
ＲＰ－ＨＰＬＣ：逆相高性能液体クロマトグラフィ
Ｔｍアッセイ：
オリゴヌクレオチドおよびＲＮＡターゲット（リン酸連結、ＰＯ）二重鎖を５００ｍｌ ＲＮアーゼ不含水中で３ｍＭに希釈し、そして５００ｍｌ ２ｘＴｍ緩衝液（２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ７．０）と混合した。溶液を９５℃に３分間加熱し、そして次いで室温で３０分間アニーリングさせた。ＰＥ Ｔｅｍｐｌａｂソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用い、ペルチェ温度プログラマーＰＴＰ６を装備したＬａｍｂｄａ ４０ ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計上で、二重鎖融解温度（Ｔｍ）を測定する。温度を２０℃から９５℃に増加させ、そして次いで２５℃に低下させて、２６０ｎｍでの吸収を記録する。融解およびアニーリング両方の一次導関数および局所最大値を用いて、二重鎖Ｔｍを評価する。
ＤＣＩ：４，５－ジシアノイミダゾール
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＴ：４，４’－ジメトキシトリチル
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
Ｂｚ：ベンゾイル
Ｉｂｕ：イソブチリル
ＲＰ－ＨＰＬＣ：逆相高性能液体クロマトグラフィ
Ｔｍアッセイ：
オリゴヌクレオチドおよびＲＮＡターゲット（リン酸連結、ＰＯ）二重鎖を５００ｍｌ ＲＮアーゼ不含水中で３ｍＭに希釈し、そして５００ｍｌ ２ｘＴｍ緩衝液（２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ７．０）と混合した。溶液を９５℃に３分間加熱し、そして次いで室温で３０分間アニーリングさせた。ＰＥ Ｔｅｍｐｌａｂソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用い、ペルチェ温度プログラマーＰＴＰ６を装備したＬａｍｂｄａ ４０ ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計上で、二重鎖融解温度（Ｔｍ）を測定する。温度を２０℃から９５℃に増加させ、そして次いで２５℃に低下させて、２６０ｎｍでの吸収を記録する。融解およびアニーリング両方の一次導関数および局所最大値を用いて、二重鎖Ｔｍを評価する。
【0317】
実施例１：ＨＢＶ感染ＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰにおけるＦＵＢＰ１のクロマチン免疫沈降（ＣｈｉＰ）。
本実験において、ＦＵＢＰ１がｃｃｃＤＮＡに結合するかどうかを調べた。簡潔には、ＨＢＶ感染細胞由来のクロマチン断片を、ＦＵＢＰ１特異的抗体で免疫沈降させ、そしてｃｃｃＤＮＡがＦＵＢＰ１ Ａｂとともに沈降するかどうかを分析した。
本実験において、ＦＵＢＰ１がｃｃｃＤＮＡに結合するかどうかを調べた。簡潔には、ＨＢＶ感染細胞由来のクロマチン断片を、ＦＵＢＰ１特異的抗体で免疫沈降させ、そしてｃｃｃＤＮＡがＦＵＢＰ１ Ａｂとともに沈降するかどうかを分析した。
【0318】
ＨＢＶ感染ＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ細胞（材料および方法セクションを参照されたい）を、血清または抗生物質を含まないウィリアムズ培地中の１％ホルムアルデヒドで１０分間架橋し、そしてＰＢＳ １Ｘ中の０．１２５Ｍグリシンを室温で５分間添加することによって、反応を停止した。冷ＰＢＳ中で細胞を２回洗浄し、そして細胞スクレーパーで採取した。ＰＩＣ １ＸおよびＰＭＳＦ １ｍＭを含む１ｍｌのＰＢＳ １Ｘの存在下で、４５００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した後、ペレット化した細胞を収集し、そしてクロマチン免疫沈降に進むまで、－８０℃で保存した。核溶解緩衝液（ＰＩＰＥＳ ５ｍＭ、ＫＣｌ ８５ｍＭ、ＮＰ－４０ ０．５％、ＰＭＳＦ １ｍＭおよびＰＩＣ １Ｘ）中、氷上で３０分間インキュベーションした後、ダンス（ｄｏｕｎｃｅ）（緊密な乳棒）を用いて、核抽出を行った。
【0319】
単離架橋核を１％ＳＤＳ超音波処理緩衝液中での超音波処理によって剪断し、２００～５００ｂｐの細胞クロマチン断片を生成した。２ｘ１０６細胞由来のクロマチン量を分離し、このうち１／１０を参照インプット試料として使用するために取り置き、そして残りを４℃で１４～１６時間、抗体との免疫沈降に供した（ＣｈＩＰは、Ｐｏｌｌｉｃｉｎｏら ２００６ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １３０：８２３－８３７にさらに記載される）。免疫沈降に用いる抗体は、５μｇ ＦＵＢＰ１特異的Ａｂ（Ｃ１５４１０２３３ Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）であった。逆架橋（ｒｅｖｅｒｓｅ ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｉｎｇ）工程において、沈殿クロマチン試料およびインプット試料をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）ＤＮＡ抽出に供し、そして次いで、ｃｃｃＤＮＡをｑＰＣＲによって定量化した（ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡ定量化に関する材料および方法セクションを参照されたい。Ｔ５エキソヌクレアーゼ処理で開始し、そしてｃｃｃＤＮＡをｂ－グロブリン（抗体によって沈殿しない）に対して標準化せず、インプット試料中のｃｃｃＤＮＡのパーセントとして表す変更を伴った）。
【0320】
ＦＵＢＰ抗体を伴い、およびＦＵＢＰ抗体を伴わずに沈殿させた試料中のｃｃｃＤＮＡ量を、インプット試料（非ＣｈＩＰ処理試料）中のｃｃｃＤＮＡの％として表す。結果を表７に示す。値は、３回の独立の実験の平均に相当する。
【0321】
表７：ＦＵＢＰ１特異的抗体または対照で免疫沈降させたｃｃｃＤＮＡ。
【0322】
【表8】
【0323】
ＣｈＩＰ実験は、陰性対照（抗体なし）に比較して、ｃｃｃＤＮＡに結合したＦＵＢＰ１タンパク質の有意な濃縮を示した。
実施例２：ＨＢＶ感染ＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ細胞におけるＨＢＶパラメータに対する、ＦＵＢＰ１をターゲティングするｓｉＲＮＡの影響
以下の実験において、ＨＢＶパラメータ、ＨＢＶ ｐｇＲＮＡおよびｃｃｃＤＮＡに対するＦＵＢＰ１ノックダウンの影響を試験した。
実施例２：ＨＢＶ感染ＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ細胞におけるＨＢＶパラメータに対する、ＦＵＢＰ１をターゲティングするｓｉＲＮＡの影響
以下の実験において、ＨＢＶパラメータ、ＨＢＶ ｐｇＲＮＡおよびｃｃｃＤＮＡに対するＦＵＢＰ１ノックダウンの影響を試験した。
【0324】
ＨＢＶ感染ＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ細胞を、材料および方法セクション「ＨＢＶ感染細胞に関するｓｉＲＮＡトランスフェクションおよび処置プロトコル」に記載するように、ＤｈａｒｍａｃｏｎのｓｉＲＮＡのプール（Ｌ－０１１５４８－００）で処置した。
【0325】
４日間処置した後、ＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡ、ｃｃｃＤＮＡおよびｐｇＲＮＡをｑＰＣＲによって測定した。ＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡおよびｐｇＲＮＡ ＲＴ－ｑＰＣＲを、材料および方法セクション「細胞内ＨＢＶ ｐｇＲＮＡおよびＦＵＢＰ１ ＲＮＡに関するリアルタイムＰＣＲ」に記載した。ＨｅｐＧ２ ＮＴＣＰ細胞におけるｃｃｃＤＮＡ絶対定量化のため、総体積５０μｌ中、５００ｎｇの非消化ＤＮＡを用いてｂ－グロビンを測定し、このうち４μｌをｑＰＣＲに用いて、そして標準化に用いた。ｂ－グロビンに関する標準曲線のため、商業的ゲノムＤＮＡを用い、そしてｃｃｃＤＮＡ標準曲線のため、ＨＢＶプラスミドＤＮＡ（ｐＧＥＭ３Ｚプラスミド内にクローニングされたＨＢＶ遺伝子型Ｄ）を用いた。用いたｃｃｃＤＮＡプライマーは、材料および方法セクション「ＨＢＶ ＤＮＡおよびｃｃｃＤＮＡ ｔａｑｍａｎ ｑＰＣＲ」に記載するものであった。結果を表８に示す。
【0326】
表８：ｓｉＲＮＡのプールでのＦＵＢＰ１のノックダウン後のＨＢＶパラメータに対する影響
【0327】
【表9】
【0328】
＊ＦＵＢＰ１およびＨＢＶ ｐｇＲＮＡをハウスキーピング遺伝子Ｇｕｓ Ｂに対して標準化した。
＾ｓｉＲＮＡ対照はｎ＝３であった。
＾ｓｉＲＮＡ対照はｎ＝３であった。
【0329】
ここから、ＦＵＢＰ１ ｓｉＲＮＡプールがＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡならびにＨＢＶ ｐｇＲＮＡをかなり効率的に減少させることが可能であることがわかる。ｃｃｃＤＮＡの減少を示す傾向もまた、短い処置時間にもかかわらず観察された。
【0330】
実施例３：ＨＢＶ感染ＰＨＨ細胞におけるＨＢＶパラメータに対する、ＦＵＢＰ１をターゲティングするｓｉＲＮＡの影響
以下の実験において、ＨＢＶ感染初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）における、ＨＢＶパラメータ、ＨＢＶ ｐｇＲＮＡ、ｃｃｃＤＮＡおよびＨＢＶ ＤＮＡに対するＦＵＢＰ１ノックダウンの影響を試験した。
以下の実験において、ＨＢＶ感染初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）における、ＨＢＶパラメータ、ＨＢＶ ｐｇＲＮＡ、ｃｃｃＤＮＡおよびＨＢＶ ＤＮＡに対するＦＵＢＰ１ノックダウンの影響を試験した。
【0331】
ＨＢＶ感染ＰＨＨ細胞を、実施例２で用いたｓｉＲＮＡのプール（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｌ－０１１５４８－００）ならびに材料および方法のｓｉＲＮＡ配列および化合物セクションに列挙する４つの個々のｓｉＲＮＡ化合物ＦＵ１、ＦＵ２、ＦＵ３およびＦＵ４で処置した。材料および方法セクション「ＨＢＶ感染細胞に関するｓｉＲＮＡトランスフェクションおよび処置プロトコル」に記載するように処置を行った。
【0332】
４日処置した後、ＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡ、ｃｃｃＤＮＡおよびｐｇＲＮＡを技術的２つ組でｑＰＣＲによって測定した。ＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡおよびｐｇＲＮＡ ＲＴ－ｑＰＣＲを、材料および方法セクション「細胞内ＨＢＶ ｐｇＲＮＡおよびＦＵＢＰ１ ＲＮＡに関するリアルタイムＰＣＲ」に記載した。材料および方法セクション「ＨＢＶ ＤＮＡおよびｃｃｃＤＮＡ ｔａｑｍａｎ ｑＰＣＲ」に記載するようにＨＢＶ ＤＮＡを測定した。示すＴａｑｍａｎプライマーを用いて、ハウスキーピング遺伝子ｂ－グロビンに対してＨＢＶ ＤＮＡを標準化した。ｃｃｃＤＮＡ定量化のため、ｃｃｃＤＮＡに関するＳＹＢＲグリーンプライマーおよびミトコンドリアＤＮＡ（ミトＤＮＡ、ハウスキーピング対照）を、Ｆａｓｔ ＳＹＢＲＴＭグリーンマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）および以下のプライマーを用いて行った：
【0333】
【化19】
【0334】
ｑＰＣＲ条件：９５℃５分間、次いで９５℃１秒間、６０℃３５秒間の４５サイクル。
結果を、比較サイクル閾値２－ΔΔＣｔ法を用いて、非処置細胞に対する相対発現として（すなわち数字が小さいほどターゲット減少が大きい）、表９に示す。
結果を、比較サイクル閾値２－ΔΔＣｔ法を用いて、非処置細胞に対する相対発現として（すなわち数字が小さいほどターゲット減少が大きい）、表９に示す。
【0335】
表９：ＦＵＢＰ１をターゲティングするｓｉＲＮＡでのＦＵＢＰ１のノックダウン後のＨＢＶパラメータに対する影響
【0336】
【表10】
【0337】
＊ｃｃｃＤＮＡをミトコンドリアＤＮＡ参照遺伝子に対して標準化した。
＊＊ＨＢＶ ＤＮＡをｂ－グロビン・ハウスキーピング遺伝子に対して標準化した。
＃ＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡおよびＨＢＶ ｐｇＲＮＡをＧｕｓ Ｂハウスキーピング遺伝子に対して標準化した。
＊＊ＨＢＶ ＤＮＡをｂ－グロビン・ハウスキーピング遺伝子に対して標準化した。
＃ＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡおよびＨＢＶ ｐｇＲＮＡをＧｕｓ Ｂハウスキーピング遺伝子に対して標準化した。
【0338】
ここから、ＦＵＢＰ１ ｓｉＲＮＡプールならびに個々のｓｉＲＮＡ化合物が、３０～４０％、ＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡおよびｃｃｃＤＮＡを減少させることが可能であることがわかる。ＨＢＶ ｐｇＲＮＡはさらに減少する。ＨＢＶ ＤＮＡ減少は、ｓｉＲＮＡプールならびに個々のｓｉＲＮＡのＦＵ１およびＦＵ４に関して観察される。個々のｓｉＲＮＡのＦＵ２およびＦＵ３で減少が観察されないのは、処置時間が短かったためである可能性があり、これは、ＨＢＶ ＤＮＡ減少が、一般的により長い処置時間を必要とするためである。
【0339】
ＦＵＢＰ１ ｓｉＲＮＡプールがｃｃｃＤＮＡを減少させる能力をサザンブロットによって確認し、そしてｃｃｃＤＮＡを減少させないことが知られるＨＢＶターゲティングｓｉＲＮＡ（ＨＢｘ）と比較した。
【0340】
ＨＢＶ感染ＰＨＨ細胞を、材料および方法セクション「ＨＢＶ感染細胞に関するｓｉＲＮＡトランスフェクションおよび処置プロトコル」に記載するように処置し、そしてサザンブロットを、材料および方法セクション「サザンブロットプロトコル」に記載するように行った。
【0341】
サザンブロットを図３に示し、そしてサザンブロットはこの実施例におけるｑＰＣＲ結果を確認し、これはＦＵＢＰ１ターゲティングｓｉＲＮＡのプールが、ｃｃｃＤＮＡバンドを減少させることが可能である一方、ＨＢＶターゲティングｓｉＲＮＡが（予期されるように）、対照に比較した際、ｃｃｃＤＮＡのいかなる減少も生じないことが明らかにわかるためである。
【0342】
実施例４：ＨＢＶ感染ＰＨＨ細胞におけるＨＢＶパラメータに対する、ＦＵＢＰ１小分子阻害剤の影響
いくつかの小分子が、ＤＮＡ上のＦＵＳＥ要素へのＦＵＢＰ１結合に影響を及ぼすことが示唆されてきている。以下において、本発明者らは、ＨＢＶパラメータ、ＨＢＶ ｐｇＲＮＡ、ｃｃｃＤＮＡおよびＨＢＶ ＤＮＡならびにＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡレベルに影響を及ぼす能力に関して、ＳＮ－３８（本明細書の式Ｘ）およびＧＳＫ３４３（本明細書の式ＶＩＩＩ）の影響を試験した。
いくつかの小分子が、ＤＮＡ上のＦＵＳＥ要素へのＦＵＢＰ１結合に影響を及ぼすことが示唆されてきている。以下において、本発明者らは、ＨＢＶパラメータ、ＨＢＶ ｐｇＲＮＡ、ｃｃｃＤＮＡおよびＨＢＶ ＤＮＡならびにＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡレベルに影響を及ぼす能力に関して、ＳＮ－３８（本明細書の式Ｘ）およびＧＳＫ３４３（本明細書の式ＶＩＩＩ）の影響を試験した。
【0343】
ＨＢＶ感染ＰＨＨ細胞（材料および方法を参照されたい）において、１μＭで用いる小分子ＳＮ－３８（Ｔｏｒｏｎｔｏ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｈｅｍｉｃａｌ、ＴＲＣ－Ｓ５８９９６０）およびＧＳＫ３４３（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ、ＭＣＥ－ＨＹ－１３５００）で、処置を行った。第７日に始まって、そして感染後２５日まで、処置を週２回行った（すなわち、処置を感染後第７、１１、１４、１８、２１および２５日に行った）。感染後第１２日および第２５日（処置の第５日および第１８日）に細胞を採取した。処置の５日後または１８日後、ＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡ、ｃｃｃＤＮＡ、ｐｇＲＮＡおよびＨＢＶ ＤＮＡを、ｑＰＣＲによって、技術的２つ組で測定した。ＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡおよびｐｇＲＮＡ ＲＴ－ｑＰＣＲを、材料および方法セクション「細胞内ＨＢＶ ｐｇＲＮＡおよびＦＵＢＰ１ ＲＮＡに関するリアルタイムＰＣＲ」に記載するように測定した。ＨＢＶ ＤＮＡおよびｃｃｃＤＮＡを、材料および方法セクション「ＨＢＶ ＤＮＡおよびｃｃｃＤＮＡ ｔａｑｍａｎ ｑＰＣＲ」に記載するように、ｂ－グロビン・ハウスキーピング遺伝子に対して標準化した。
【0344】
結果を、非処置細胞に対する相対発現として（すなわち数字が小さいほどターゲット減少が大きい）、表１０Ａおよび１０Ｂに示す。標準ＣＣＫ８毒性アッセイを用いて、化合物の毒性もまた試験し、そして２つの化合物に関して、細胞毒性は観察されなかった（データ未提示）。
【0345】
表１０Ａ：ＨＢＶ感染ＰＰＨにおける、ＦＵＢＰ１小分子阻害剤での処置５日後のＨＢＶパラメータに対する影響
【0346】
【表11】
【0347】
表１０Ｂ：ＨＢＶ感染ＰＰＨにおける、ＦＵＢＰ１小分子阻害剤での処置１８日後のＨＢＶパラメータに対する影響
【0348】
【表12】
【0349】
＊ｃｃｃＤＮＡ ＨＢＶ ＤＮＡをｂ－グロビン・ハウスキーピング遺伝子に対して標準化した。
＃ＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡおよびＨＢＶｐｇＲＮＡをＧｕｓ Ｂハウスキーピング遺伝子に対して標準化した。
＃ＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡおよびＨＢＶｐｇＲＮＡをＧｕｓ Ｂハウスキーピング遺伝子に対して標準化した。
【0350】
これらのデータから、ＦＵＢＰ１小分子阻害剤は、ＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡに影響を及ぼさないことがわかり、これは、これらがＦＵＢＰ１タンパク質のアンタゴニストとして作用するために予期されていることである。ＳＮ－３８は、第１２日、３つのＨＢＶパラメータすべてに対して有意な影響を有し、第２５日、ｐｇＲＮＡおよびｃｃｃＤＮＡに対する影響はリバウンドしているようである。ＧＳＫ３４３は、ｐｇＲＮＡおよびＨＢＶ ＤＮＡに対して顕著な影響は持たないが、第２５日、ｃｃｃＤＮＡの減少は６５％を超えており、この化合物が、有効であるためにより長い曝露を必要とし、しかしその一方でｃｃｃＤＮＡに対して非常に有効であることを示す。さらにより長い曝露がｐｇＲＮＡおよびＨＢＶＤＮＡに対する影響を導くかどうかはまだ示されないままである。
【0351】
実施例５：一本鎖ＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＨｅＬａ細胞において、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＦＵＢＰ１を減少させる能力
表４ａに列挙するアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ＨｅＬａ細胞においてＦＵＢＰ１を減少させる能力に関して試験した。
表４ａに列挙するアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ＨｅＬａ細胞においてＦＵＢＰ１を減少させる能力に関して試験した。
【0352】
ＨｅＬａ細胞を材料および方法セクションに記載するように培養した。細胞を２４時間インキュベーションした後、ＰＢＳ中に溶解したオリゴヌクレオチドを添加した。オリゴヌクレオチドの最終濃度は５および２５μＭであり、最終培養体積は１００μｌ／ウェルであった。オリゴヌクレオチド化合物を添加した３日後に細胞を採取した。ＲＮｅａｓｙ ９６抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＲＮＡを抽出し、そしてその後、製造者のプロトコルにしたがって、ターゲット遺伝子（ＦＵＢＰ１：Ｈｓ．ＰＴ．５８．２６８８３７７５ＦＡＭ（ＩＤＴ））およびハウスキーピング遺伝子（ＧＵＳＢ ４３２６３２０Ｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ））に関するＴａｑＭａｎアッセイを用いて、一工程ＲＴ－ＱＰＣＲ（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ｑＳｃｒｉｐｔ ＸＬＴ １－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲ ＴｏｕｇｈＭｉｘ）を行った。
【0353】
相対ＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡ発現レベルを、平均対照試料（ＰＢＳ処置細胞）の％として、表１１に示し、すなわち値が小さいほど阻害が大きい。
表１１：抗ＦＵＢＰ１化合物のｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性（二重鎖ＱＰＣＲを用いた単回実験）。ＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡレベルを、ＨｅＬａ細胞におけるＧＵＳＢに対して標準化し、そして対照（ＰＢＳ処置細胞）の％として示す。
表１１：抗ＦＵＢＰ１化合物のｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性（二重鎖ＱＰＣＲを用いた単回実験）。ＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡレベルを、ＨｅＬａ細胞におけるＧＵＳＢに対して標準化し、そして対照（ＰＢＳ処置細胞）の％として示す。
【0354】
【表13】
【0355】
これらのデータから、試験した一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの８０％が、２５μＭ用量で、少なくとも３０％、ＦＵＢＰ１を減少させることが可能であることがわかる。
【0356】
実施例６：ＰＭＨ細胞において、一本鎖ＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＦＵＢＰ１を減少させる能力
実施例５でスクリーニングしたオリゴヌクレオチドはまた、マウスＦＵＢＰ１もターゲティングする。ヒトＨｅＬａ細胞で観察されたＦＵＢＰ１の減少がまた、ＨＢＶの処置においてターゲティングされる細胞タイプである肝細胞にも当てはまるかどうかを検証するため、同じライブラリーを初代マウス肝細胞（ＰＭＨ）でも試験した。
実施例５でスクリーニングしたオリゴヌクレオチドはまた、マウスＦＵＢＰ１もターゲティングする。ヒトＨｅＬａ細胞で観察されたＦＵＢＰ１の減少がまた、ＨＢＶの処置においてターゲティングされる細胞タイプである肝細胞にも当てはまるかどうかを検証するため、同じライブラリーを初代マウス肝細胞（ＰＭＨ）でも試験した。
【0357】
ＰＭＨ細胞におけるスクリーニングを、「初代マウス肝細胞」以下、「材料および方法」セクションに記載されるように、５μＭおよび２５μＭオリゴヌクレオチドを用いて行い、最終培養体積は１００μｌ／ウェルであった。
【0358】
ＲＮＡ単離、およびＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡ発現レベルを測定するためのｑＰＣＲを、Ｆｕｂｐ１の代わりに以下のマウス特異的プライマー：Ｍｍ．ＰＴ．５８．７６０３７７７ ＦＡＭ－ＭＧＢ（ＩＤＴ）、およびハウスキーピング遺伝子（ＧｕｓＢ Ｍｍ＿０１１９７６９８＿ｍ１ ＶＩＣ－ＭＧＢ（ＩＤＴ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて、実施例５に記載するように行った。
【0359】
相対ＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡ発現レベルを、平均対照試料（ＰＢＳ処置細胞）の％として、表１２に示し、すなわち値が小さいほど阻害が大きい。
表１２：抗ＦＵＢＰ１化合物のｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性（二重鎖ＱＰＣＲを用いた単回実験）。ＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡレベルを、ＨｅＬａ細胞におけるＧＵＳＢに対して標準化し、そして対照（ＰＢＳ処置細胞）の％として示す。
表１２：抗ＦＵＢＰ１化合物のｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性（二重鎖ＱＰＣＲを用いた単回実験）。ＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡレベルを、ＨｅＬａ細胞におけるＧＵＳＢに対して標準化し、そして対照（ＰＢＳ処置細胞）の％として示す。
【0360】
【表14】
【0361】
これらのデータから、ＰＭＨにおいて試験した一本鎖ＬＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドが、一般的に、肝細胞において、ＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡを、そしてＨｅＬａ細胞において観察されたよりもより高い有効性で、減少させることが可能であることがわかる。
【0362】
実施例７：ＨＢＶ感染ＰＨＨ細胞におけるＨＢＶパラメータに対する、一本鎖ＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドの影響
実施例６における肝細胞スクリーニングに基づいて、化合物番号５０＿１を持つＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドを選択して、ＦＵＢＰ１減少がまた、ＨＢＶ感染ＰＨＨ細胞におけるｃｃｃＤＮＡに対する影響も生じることを確認した。
実施例６における肝細胞スクリーニングに基づいて、化合物番号５０＿１を持つＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドを選択して、ＦＵＢＰ１減少がまた、ＨＢＶ感染ＰＨＨ細胞におけるｃｃｃＤＮＡに対する影響も生じることを確認した。
【0363】
ＨＢＶ感染ＰＰＨ細胞（材料および方法セクション「ＨＢＶ感染ＰＨＨ細胞」を参照されたい）を、ＰＨＨ培地中、１０μＭのＦＵＢＰ１ ＬＮＡで、週２回、２週間処置し（すなわち処置を感染後第４、８、１１、１５、１８、２２日に行った）、そして非処置群に比較した、ＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡノックダウンおよびｃｃｃＤＮＡ ｑＰＣＲ測定のため、感染１８日後および２５日後（それぞれ、処置１４日および２１日）に細胞を採取した。
【0364】
ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡおよびＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡ減少を処置後第１４日および第２１日に測定した。結果を表１３に示す。
表１３：一本鎖ＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドでの処置後のＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡおよびｃｃｃＤＮＡ減少
表１３：一本鎖ＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドでの処置後のＦＵＢＰ１ ｍＲＮＡおよびｃｃｃＤＮＡ減少
【0365】
【表15】
【0366】
ここから、化合物番号５０＿１のオリゴヌクレオチドが、ｃｃｃＤＮＡを６０％減少させることがわかる。
要約すると、本出願の実施例は、ＦＵＢＰ１をターゲティングする二本鎖ｓｉＲＮＡ分子、ＦＵＢＰ１小分子阻害剤、および一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが、すべて、ＨＢＶ感染細胞においてｃｃｃＤＮＡを減少させることが可能であり、ｃｃｃＤＮＡ安定性を維持する際のＦＵＢＰ１の適切性が確認されることを示す。
要約すると、本出願の実施例は、ＦＵＢＰ１をターゲティングする二本鎖ｓｉＲＮＡ分子、ＦＵＢＰ１小分子阻害剤、および一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが、すべて、ＨＢＶ感染細胞においてｃｃｃＤＮＡを減少させることが可能であり、ｃｃｃＤＮＡ安定性を維持する際のＦＵＢＰ１の適切性が確認されることを示す。
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図1-4】
【図2】
【図3】
【配列表】