▶ イラミーナ インコーポレーテッドの特許一覧 ▶ イルミナ シンガポール ピーティーイー リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-07-04
(45)【発行日】2024-07-12
(54)【発明の名称】ポリメラーゼ、組成物、および使用方法
(51)【国際特許分類】
C12N 9/12 20060101AFI20240705BHJP
C12N 15/31 20060101ALN20240705BHJP
C12N 15/54 20060101ALN20240705BHJP
【ＦＩ】
C12N9/12 ZNA
C12N15/31
C12N15/54
【請求項の数】
2
(21)【出願番号】P 2020572427
(86)(22)【出願日】2019-10-31
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-12
(86)【国際出願番号】 US2019059246
(87)【国際公開番号】W WO2020092830
(87)【国際公開日】2020-05-07
【審査請求日】2022-06-24
(31)【優先権主張番号】62/753,558
(32)【優先日】2018-10-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】514202402
【氏名又は名称】イラミーナ インコーポレーテッド
(73)【特許権者】
【識別番号】518199104
【氏名又は名称】イルミナ シンガポール ピーティーイー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＩＬＬＵＭＩＮＡ ＳＩＮＧＡＰＯＲＥ ＰＴＥ ＬＴＤ
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(72)【発明者】
【氏名】ミーシャ ゴリンスキー
(72)【発明者】
【氏名】セス マクドナルド
(72)【発明者】
【氏名】サウラブ ニランター
(72)【発明者】
【氏名】マシュー ケリンジャー
(72)【発明者】
【氏名】マイケル プリバイト
(72)【発明者】
【氏名】セルジオ ペイサジョビッチ
(72)【発明者】
【氏名】モリー ヘ
【審査官】西澤 龍彦
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２００７／００４８７４８（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１８／０１１９１１５（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１１／０３０１０４１（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２０１７－５１８７５０（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１０～３４から選択されるアミノ酸配列を含む組換えＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項2】
配列番号１０～１１、２３～２５及び２７～３４から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組換えＤＮＡポリメラーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願への相互参照）
この出願は、２０１８年１０月３１日に出願された米国仮出願シリアル番号第６２／７５３，５５８号の利益を主張し、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
この出願は、２０１８年１０月３１日に出願された米国仮出願シリアル番号第６２／７５３，５５８号の利益を主張し、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
（配列表）
この出願は、２２４キロバイトのサイズを有し２０１９年１０月３１日に創生された、「ＩＰ－１５４６－ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と表題されたＡＳＣＩＩテキストファイルとしてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して米国特許商標庁に電子的に提出された配列表を含む。当該配列表に含まれる情報は、参照により本明細書に組み込まれる。
この出願は、２２４キロバイトのサイズを有し２０１９年１０月３１日に創生された、「ＩＰ－１５４６－ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と表題されたＡＳＣＩＩテキストファイルとしてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して米国特許商標庁に電子的に提出された配列表を含む。当該配列表に含まれる情報は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0003】
（分野）
本開示は、とりわけ、合成による核酸シーケンシングの文脈において、ヌクレオチド取込み反応を実施する際に使用するための改変（ａｌｔｅｒｅｄ）ポリメラーゼに関する。
本開示は、とりわけ、合成による核酸シーケンシングの文脈において、ヌクレオチド取込み反応を実施する際に使用するための改変（ａｌｔｅｒｅｄ）ポリメラーゼに関する。
【背景技術】
【0004】
（背景）
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）テクノロジーは、シーケンシングプロセスの重要なコンポーネントとしてＤＮＡポリメラーゼに依存する。高い忠実度を維持しつつテンプレートをシーケンシングする時間を減少することが望まれる。合成によるシーケンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＳＢＳ）プロセスの各サイクルを減少することは、より短いシーケンシングランタイムを達成するために有用なステップである。サイクルタイムを減少するための１つのアプローチは、取込みステップの時間を減少することである。しかしながら、取込み時間を減少することで、ランタイム全体に大幅な向上を与えることができた一方で、典型的には、そのようにすると忠実度に犠牲を払うことになる。例えば、フェージング率、プレフェージング率、および／またはバイパス率が増加すると、その結果、エラー率が増加する。低エラー率では、シーケンシングランの最中に、クラスター中の大部分のテンプレート分子が同じラベル化ヌクレオチドで終結し、シグナルが明確である。対照的に、減少した忠実度では、シーケンシングランの最中に、クラスター中で不正確にラベル化されたヌクレオチドで終結したテンプレート分子の数が増加し、シグナルがノイズ化しすぎてしまい得て、どのヌクレオチドが取り込まれたかを正確に決定することができなくなる。
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）テクノロジーは、シーケンシングプロセスの重要なコンポーネントとしてＤＮＡポリメラーゼに依存する。高い忠実度を維持しつつテンプレートをシーケンシングする時間を減少することが望まれる。合成によるシーケンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＳＢＳ）プロセスの各サイクルを減少することは、より短いシーケンシングランタイムを達成するために有用なステップである。サイクルタイムを減少するための１つのアプローチは、取込みステップの時間を減少することである。しかしながら、取込み時間を減少することで、ランタイム全体に大幅な向上を与えることができた一方で、典型的には、そのようにすると忠実度に犠牲を払うことになる。例えば、フェージング率、プレフェージング率、および／またはバイパス率が増加すると、その結果、エラー率が増加する。低エラー率では、シーケンシングランの最中に、クラスター中の大部分のテンプレート分子が同じラベル化ヌクレオチドで終結し、シグナルが明確である。対照的に、減少した忠実度では、シーケンシングランの最中に、クラスター中で不正確にラベル化されたヌクレオチドで終結したテンプレート分子の数が増加し、シグナルがノイズ化しすぎてしまい得て、どのヌクレオチドが取り込まれたかを正確に決定することができなくなる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
（要旨）
本明細書で提供されるのは、組換えＤＮＡポリメラーゼである。本開示のポリメラーゼの一例は、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。
本明細書で提供されるのは、組換えＤＮＡポリメラーゼである。本開示のポリメラーゼの一例は、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【課題を解決するための手段】
【0006】
一実施形態では、ポリメラーゼはまた、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列中の、Ｔｙｒ４９７と機能的に等価な位置でのアミノ酸置換変異およびＰｈｅ１５２、Ｖａｌ２７８、Ｍｅｔ３２９、Ｖａｌ４７１、Ｔｈｒ５１４、Ｌｅｕ６３１、またはＧｌｕ７３４と機能的に等価な位置での少なくとも１つのアミノ酸置換変異を含み、および任意に、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列中のアミノ酸Ｍｅｔ１２９、Ａｓｐ１４１、Ｇｌｕ１４３、Ｃｙｓ２２３、Ｌｅｕ４０８、Ｔｙｒ４０９、Ｐｒｏ４１０、およびＡｌａ４８５と機能的に等価な位置でのアミノ酸置換変異をさらに含む。
【0007】
一実施形態では、ポリメラーゼはまた、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列中の、Ｔｙｒ４９７と機能的に等価な位置でのアミノ酸置換変異およびＬｙｓ４７６、Ｌｙｓ４７７、Ｔｈｒ５１４、Ｉｌｅ５２１、またはＴｈｒ５９０と機能的に等価な位置での少なくとも１つのアミノ酸置換変異を含み、および任意に、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列中のアミノ酸Ｍｅｔ１２９、Ａｓｐ１４１、Ｇｌｕ１４３、Ｃｙｓ２２３、Ｌｅｕ４０８、Ｔｙｒ４０９、Ｐｒｏ４１０、およびＡｌａ４８５と機能的に等価な位置でのアミノ酸置換変異をさらに含む。
【0008】
一実施形態では、ポリメラーゼはまた、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列中の、Ｔｙｒ４９７と機能的に等価な位置でのアミノ酸置換変異およびＡｒｇ２４７、Ｇｌｕ５９９、Ｌｙｓ６２０、Ｈｉｓ６３３、またはＶａｌ６６１と機能的に等価な位置での少なくとも１つのアミノ酸置換変異を含み、および任意に、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列中のアミノ酸Ｍｅｔ１２９、Ａｓｐ１４１、Ｇｌｕ１４３、Ｃｙｓ２２３、Ｌｅｕ４０８、Ｔｙｒ４０９、Ｐｒｏ４１０、およびＡｌａ４８５と機能的に等価な位置でのアミノ酸置換変異をさらに含む。
【0009】
一実施形態では、ポリメラーゼはまた、（ｉ）Ｔｙｒ４９７と機能的に等価な位置でのアミノ酸置換変異；（ｉｉ）９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列中のＰｈｅ１５２、Ｖａｌ２７８、Ｍｅｔ３２９、Ｖａｌ４７１、Ｌｅｕ６３１、またはＧｌｕ７３４と機能的に等価な位置での少なくとも１つのアミノ酸置換変異、および（ｉｉｉ）９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列中のＬｙｓ４７６、Ｌｙｓ４７７、Ｔｈｒ５１４、Ｉｌｅ５２１、またはＴｈｒ５９０と機能的に等価な位置での少なくとも１つのアミノ酸置換変異を含み、および任意に、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列中のアミノ酸Ｍｅｔ１２９、Ａｓｐ１４１、Ｇｌｕ１４３、Ｃｙｓ２２３、Ｌｅｕ４０８、Ｔｙｒ４０９、Ｐｒｏ４１０、およびＡｌａ４８５と機能的に等価な位置でのアミノ酸置換変異をさらに含む。
【0010】
一実施形態では、ポリメラーゼはまた、（ｉ）Ｔｙｒ４９７と機能的に等価な位置でのアミノ酸置換変異；（ｉｉ）９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列中のＬｙｓ４７６、Ｌｙｓ４７７、Ｔｈｒ５１４、Ｉｌｅ５２１、またはＴｈｒ５９０と機能的に等価な位置での少なくとも１つのアミノ酸置換変異、および（ｉｉｉ）９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列中のＡｒｇ２４７、Ｇｌｕ５９９、Ｌｙｓ６２０、Ｈｉｓ６３３、またはＶａｌ６６１と機能的に等価な位置での少なくとも１つのアミノ酸置換変異を含み、および任意に、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列中のアミノ酸Ｍｅｔ１２９、Ａｓｐ１４１、Ｇｌｕ１４３、Ｃｙｓ２２３、Ｌｅｕ４０８、Ｔｙｒ４０９、Ｐｒｏ４１０、およびＡｌａ４８５と機能的に等価な位置でのアミノ酸置換変異をさらに含む。
【0011】
一実施形態では、ポリメラーゼはまた、（ｉ）Ｔｙｒ４９７と機能的に等価な位置でのアミノ酸置換変異；（ｉｉ）９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列中のＰｈｅ１５２、Ｖａｌ２７８、Ｍｅｔ３２９、Ｖａｌ４７１、Ｌｅｕ６３１、またはＧｌｕ７３４と機能的に等価な位置での少なくとも１つのアミノ酸置換変異、（ｉｉｉ）９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列中のＬｙｓ４７６、Ｌｙｓ４７７、Ｔｈｒ５１４、Ｉｌｅ５２１、またはＴｈｒ５９０と機能的に等価な位置での少なくとも１つのアミノ酸置換変異、および（ｉｖ）Ａｒｇ２４７、Ｇｌｕ５９９、Ｌｙｓ６２０、Ｈｉｓ６３３、またはＶａｌ６６１と機能的に等価な位置での少なくとも１つのアミノ酸置換変異を含み、および任意に、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列中のアミノ酸Ｍｅｔ１２９、Ａｓｐ１４１、Ｇｌｕ１４３、Ｃｙｓ２２３、Ｌｅｕ４０８、Ｔｙｒ４０９、Ｐｒｏ４１０、およびＡｌａ４８５と機能的に等価な位置でのアミノ酸置換変異をさらに含む。
【0012】
本開示のポリメラーゼの別の例は、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列配列番号８と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、また、（ｉ）９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列中のＴｙｒ４９７、Ｐｈｅ１５２、Ｖａｌ２７８、Ｍｅｔ３２９、Ｖａｌ４７１、およびＴｈｒ５１４と機能的に等価な位置でのアミノ酸置換変異；（ｉｉ）９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列中のＴｙｒ４９７、Ｍｅｔ３２９、Ｖａｌ４７１、およびＧｌｕ７３４と機能的に等価な位置でのアミノ酸置換変異；（ｉｉｉ）９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列中のＴｙｒ４９７、Ａｒｇ２４７、Ｇｌｕ５９９、およびＨｉｓ６３３と機能的に等価な位置でのアミノ酸置換変異；（ｉｖ）９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列中のＴｙｒ４９７、Ａｒｇ２４７、Ｇｌｕ５９９、Ｌｙｓ６２０、およびＨｉｓ６３３と機能的に等価な位置でのアミノ酸置換変異；（ｖ）９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列中のＴｙｒ４９７、Ｍｅｔ３２９、Ｔｈｒ５１４、Ｌｙｓ６２０、およびＶａｌ６６１と機能的に等価な位置でのアミノ酸置換変異；または（ｖｉ）９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列中のＴｙｒ４９７、Ｖａｌ２７８、Ｖａｌ４７１、Ａｒｇ２４７、Ｇｌｕ５９９、およびＨｉｓ６３３と機能的に等価な位置でのアミノ酸置換変異を含む。
【0013】
また、本明細書で提供されるのは、配列番号１０～３４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む組換えＤＮＡポリメラーゼ、本明細書に記載のポリメラーゼをコードする核酸分子、当該核酸分子を含む発現ベクター、および当該ベクターを含む宿主細胞である。
【0014】
本開示はまた、方法を含む。一実施形態では、方法は、修飾ヌクレオチド類を成長中のＤＮＡ鎖の中へ取り込ませるためのものである。当該方法は、以下の成分が相互作用することを可能にすることを含む：（ｉ）本明細書に記載のポリメラーゼ；（ｉｉ）ＤＮＡテンプレート；および（ｉｉｉ）ヌクレオチド溶液。
【0015】
また、本明細書で提供されるのは、キットである。一実施形態では、当該キットは、ヌクレオチド取込み反応を実施するためのものである。当該キットは、例えば、本明細書に記載のポリメラーゼおよびヌクレオチド溶液を含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】図１は、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ９°Ｎ－７（９°Ｎ、配列番号１）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（Ｖｅｎｔ、配列番号２およびＤｅｅｐ Ｖｅｎｔ、配列番号３）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｉｏｔａｐｕｅｎｓｉｓ（Ｔｗａ、配列番号７）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｉｓ（ＫＯＤ、配列番号５）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ、配列番号４）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ（Ｐａｂ、配列番号６）に由来するポリメラーゼアミノ酸配列のアラインメントを示す概略図である。「＊」（アスタリスク）は、すべてのポリメラーゼ間で完全に保存された単一の残基を有する位置を表示する。「：」（コロン）は、以下のような強同類性プロパティのグループ間の保存－Ｇｏｎｎｅｔ ＰＡＭ２５０マトリックスのスコアリング＞ ０．５とほぼ同等－を表示する。「．」（ピリオド）は、以下のような弱同類性プロパティのグループ間の保存－Ｇｏｎｎｅｔ ＰＡＭ２５０マトリックスのスコアリング＝＜０．５および＞０とほぼ同等－を表示する。
【図2】図２は、Ｐｏｌ ８１２（配列番号８）対照と比較した場合の、本開示の改変ポリメラーゼの１つであるＰｏｌ １５５８（配列番号１１）によって示される短い取込み時間での減少したフェージングおよび累積エラー率を示す（左パネル）。２つの酵素は、標準取込み時間で同類の（ｃｏｍｐａｒａｂｌｅ）フェージングおよびエラー率を示す（右パネル）。
【図3A】図３Ａは、Ｐｏｌ ８１２（配列番号８）およびＰｏｌ ９６３（配列番号９）対照と比較した場合の、選択された本開示の改変ポリメラーゼであるＰｏｌ １５５８（配列番号１１）、Ｐｏｌ １６７１（配列番号２３）、Ｐｏｌ １６８２（配列番号２５）、Ｐｏｌ １６８２（配列番号２６）、およびＰｏｌ １７４５（配列番号２８）によって示される短い取込み時間での減少したＲ１フェージングおよび累積Ｅ．ｃｏｌｉエラー率を示す。上部パネルおよび下部パネルの破線は、標準取込み時間でＰｏｌ８１２により示される累積Ｅ．ｃｏｌｉエラーおよびＲ１フェージング率を示す。
【図4】図４は、長いシーケンシング読取り（２×２５０サイクル）の最中の標準および短い取込み時間での、Ｐｏｌ １５５０（配列番号１０）およびＰｏｌ １５５８（配列番号１１）の累積ＰｈｉＸエラー率とＰｏｌ ８１２（配列番号８）対照のそれとを比較する。両方の変異体は、ペアエンドターン後のエラー率の顕著な減少を示す。
【図5A】図５Ａは、短い取込み時間で示される本発明の改変ポリメラーゼの１つであるＰｏｌ １６７１（配列番号２３）のＮｏｖａＳｅｑ（商標）シーケンシングメトリックスと、標準および短い取込み時間で示されるＰｏｌ ８１２（配列番号８）対照のそれらとの間の比較を示す。上部パネルは、フィルターを通過するクラスター（「クラスターＰＦ」）のパーセンテージを示す；下部パネルは、累積ＰｈｉＸエラー率を示す。明るい白丸は、標準取込み時間でのＰｏｌ ８１２メトリックスを示し、一方暗い白丸は、短い取込み時間でのＰｏｌ ８１２メトリックスを示す。黒丸で示されたすべてのＰｏｌ １６７１メトリックスは、短い取込み時間である。
【発明を実施するための形態】
【0017】
（例示的実施形態の詳細な説明）
「および／または」の用語は、リストされた要素の１つもしくはすべて、またはリストされた要素の任意の２つ以上の組合せを意味する。
「および／または」の用語は、リストされた要素の１つもしくはすべて、またはリストされた要素の任意の２つ以上の組合せを意味する。
【0018】
「好ましい（ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）」および「好ましく（ｐｒｅｆｅｒａｂｌｙ）」の語は、特定の状況下で特定の利益をもたらし得る本発明の実施形態を指す。しかしながら、同じまたは他の状況下では、他の実施形態もまた、好ましくなり得る。さらに、１つ以上の好ましい実施形態の記述は、他の実施形態が有用でないことを暗示するものではなく、他の実施形態を本発明の範囲から除外することを意図するものではない。
【0019】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」の用語およびその変形は、これらの用語が明細書および特許請求の範囲に現れる場合、限定的な意味を有しない。
【0020】
実施形態が「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」等の言語で本明細書に記載される場合は常に、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」および／または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」に関して記載される類似の実施形態もまた提供されることが、理解される。
【0021】
特に明記しない限り、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」は交換可能に使用され、１つまたは１つより多くを意味する。
【0022】
イベントが発生するために「適している（ｓｕｉｔａｂｌｅ）」条件または「適した（ｓｕｉｔａｂｌｅ）」条件とは、そのようなイベントの発生を妨げない状態である。したがって、これらの条件は、イベントを許可、増強、促進し、および／またはイベントに助長的である。
【0023】
本明細書で使用される場合、組成物、物品、核酸、または核の文脈で「提供する（ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ）」とは、組成物、物品、核酸、または核を作製すること、組成物、物品、核酸、または核を購入すること、あるいはそれ以外の、化合物、組成物、物品、または核を取得することを意味する。
【0024】
また、本明細書において、エンドポイントによる数値範囲の記述は、その範囲内に包含されるすべての数を含む（例、１～５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５等を含む）。
【0025】
本明細書全体を通じて、「一実施形態（ｏｎｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「実施形態（ａｎ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「特定の実施形態（ｃｅｒｔａｉｎ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔｓ）」、または「いくつかの実施形態（ｓｏｍｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔｓ）」等への参照は、実施形態に関連して説明される特定の特徴（ｆｅａｔｕｒｅ）、構成、組成、または特徴（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）が本開示の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体を通じての種々の場所でのそのような語句の出現は、必ずしも本開示の同じ実施形態を参照しているわけではない。さらには、１つ以上の実施形態では、特定の特徴（ｆｅａｔｕｒｅ）、構成、組成、または特徴（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）を任意の適切な様式で組み合わせ得る。
【0026】
より急速な取込み時間で現在のレベルのパフォーマンスを維持または超えることは、新世代のポリメラーゼによって支援することができる。本明細書に提示されるのは、合成によるシーケンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＳＢＳ）の急速なサイクルタイム条件下で優位に向上したパフォーマンスを有するポリメラーゼ酵素である。本発明者らは、驚くべきことに、短い取込み時間の最中の向上した正確性を含む向上した特徴（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ）を示す特定の改変ポリメラーゼを同定した。向上した正確性は、減少したエラー率および減少したフェージングを含む。改変ポリメラーゼは、減少したプレフェージング、減少したバイパス率、ＳＢＳ反応の向上した品質メトリックスを含めた、多数の他の関連する利点を有する。この向上は、ポリメラーゼが低濃度で使用された場合でも維持される。よって、一実施形態では、ＳＢＳ反応におけるＤＮＡポリメラーゼの濃度は、１２０ｎｇ／μｌから８０ｎｇ／μｌまでであり得る。一実施形態では、ＳＢＳ反応におけるＤＮＡポリメラーゼの濃度は、１２０ｎｇ／μｌ以下、１１０ｎｇ／μｌ以下、１００ｎｇ／μｌ以下、または９０ｎｇ／μｌ以下であり得る。一実施形態では、ＳＢＳ反応におけるＤＮＡポリメラーゼの濃度は、少なくとも８０ｎｇ／μｌ、少なくとも９０ｎｇ／μｌ、少なくとも１００ｎｇ／μｌ、または少なくとも１１０ｎｇ／μｌであり得る。
【0027】
エラー率とは、シーケンシング反応の最中での、特定の位置でのテンプレート配列の正しい塩基、即ち、相補物の同定におけるエラーの頻度の測定値を指す。シーケンスされたライブラリーが元のゲノム配列と合致する忠実度は、核酸の抽出からシーケンシングプラットフォームでのシーケンシングまでの任意の段階で発生する塩基変異の頻度に依存して変化し得る。この頻度は、シーケンスされた塩基が正しくなる蓋然性に上限を設ける。いくつかの実施形態では、品質スコアは、数値として提示される。例えば、品質スコアはＱＸＸとして引用することができ、ＸＸはスコアであり、特定の呼び値が１０－ＸＸ／１０のエラーの蓋然性を有することを意味する。したがって、例として、Ｑ３０は、１０００分の１、あるいは０．１％のエラー率に等しく、Ｑ４０は、１０，０００分の１、つまり０．０１％のエラー率に等しい。
【0028】
フェージングおよびプレフェージングは、当業者に公知の用語であり、クラスターの配列コピーの読出しにおける同期性の喪失を記載するために使用される。フェージングおよびプレフェージングによって、特定のサイクルで抽出された強度が、現在のサイクルのシグナルと前後のサイクル由来のノイズとを含むことになる。したがって、本明細書で使用される場合、「フェージング」の用語は、所定のシーケンシングサイクルでのポリメラーゼによるクラスター内のＤＮＡ鎖のある部分でのヌクレオチドの不完全な取込みによって引き起こされるＳＢＳにおける現象を指し、したがってクラスター内の単一分子が互いとの同期を喪失する率の尺度である。フェージングは、各サイクルでのクラスターシグナルの検出中に測定することができ、クラスター中のシグナルと同期していないクラスター由来の検出可能なシグナルのパーセンテージとして報告することができる。例として、クラスターは、第Ｎサイクルの最中に「緑」のフルオロフォアシグナルで検出される。次のサイクル（第Ｎ＋１サイクル）では、９９．９％のクラスターシグナルが「赤」チャネルで検出され、０．１％のシグナルが前のサイクルから残存し、「緑」チャネルで検出される。この結果は、フェージングが発生していることを示したであろうし、０．１のフェージング値といったような数値として報告することができ、クラスター中の０．１％の分子が各サイクルで遅滞していることを示す。
【0029】
本明細書で使用される「プレフェージング」の用語は、有効な３’ターミネーターなしでのヌクレオチド類の取込みによって引き起こされ、取込みイベントを１サイクル先に進行させる、ＳＢＳにおける現象を指す。サイクル数が増加すると、フェージングの影響を受けるクラスターあたりの配列のフラクションが増加し、正しい塩基の特定が妨げられる。プレフェージングは、シーケンシング機器で検出することができ、０．１のプレフェージング値といったような数値として報告することができ、クラスター中の０．１％の分子が各サイクルで先行していることを示す。
【0030】
フェージングおよびプレフェージングの検出は、例えば、米国特許第８，９６５，０７６号に記載されているように、当該分野で公知の任意の適した方法に従って実施および報告することができる。例えば、以下の例で説明するように、フェージングは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）からのＨｉＳｅｑ（商標）、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）、ＮｅｘｔＳｅｑ（商標）、ＮｏｖａＳｅｑ（商標）、ｉＳｅｑ（商標）、ＭｉｎｉＳｅｑ（商標）、またはＭｉＳｅｑ（商標）シーケンシングプラットフォーム等のシーケンシング機器または当該分野で公知の他の適した機器でのＳＢＳシーケンシングランの最中にルーチン的に検出および報告される。
【0031】
サイクルタイムを減少すると、それぞれがエラー率に寄与するフェージング、プレフェージング、および／またはバイパス率の発生が増加し得る。急速サイクルタイム条件で使用された場合でも、フェージング、プレフェージング、および／またはバイパス率の発生を減少させる改変ポリメラーゼの発見は、驚くべきことであり、ＳＢＳアプリケーションに大きな利点を提供する。例えば、改変ポリメラーゼは、より急速なＳＢＳサイクル時間、より低いフェージングおよびプレフェージング値、および／またはより長いシーケンシング読取り長を提供することができる。本明細書で提供されるような改変ポリメラーゼのエラー率およびフェージングの特徴付けは、以下の実施例のセクションに示される。
【0032】
（ポリメラーゼ）
本明細書で提供されるのは、ポリメラーゼ、ポリメラーゼを含む組成物、およびポリメラーゼを使用する方法である。本明細書に記載のポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼである。一実施形態では、本明細書で「改変ポリメラーゼ」とも呼ばれる本開示のポリメラーゼは、参照ポリメラーゼのアミノ酸配列に基づく。改変ポリメラーゼは、参照ポリメラーゼと比較した場合に１つ以上の残基に置換変異を含む。置換変異は、参照ポリメラーゼと比較して同じ位置または機能的に等価な位置であり得る。参照ポリメラーゼおよび機能的に等価な位置は、本明細書に詳細に記載される。当業者は、本明細書に記載の改変ポリメラーゼが天然に生じないことを容易に理解するであろう。
本明細書で提供されるのは、ポリメラーゼ、ポリメラーゼを含む組成物、およびポリメラーゼを使用する方法である。本明細書に記載のポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼである。一実施形態では、本明細書で「改変ポリメラーゼ」とも呼ばれる本開示のポリメラーゼは、参照ポリメラーゼのアミノ酸配列に基づく。改変ポリメラーゼは、参照ポリメラーゼと比較した場合に１つ以上の残基に置換変異を含む。置換変異は、参照ポリメラーゼと比較して同じ位置または機能的に等価な位置であり得る。参照ポリメラーゼおよび機能的に等価な位置は、本明細書に詳細に記載される。当業者は、本明細書に記載の改変ポリメラーゼが天然に生じないことを容易に理解するであろう。
【0033】
本明細書に記載の参照ポリメラーゼは、ＳＢＳ反応に有用なエラー率を有する；しかしながら、より短い取込み時間を伴うＳＢＳ反応で参照ポリメラーゼを使用すると、エラー率が増加する。本明細書に記載の改変ポリメラーゼは、改変ポリメラーゼがより短い取込み時間のＳＢＳ反応で使用される場合でさえ、参照ポリメラーゼで観察される優れたエラー率を維持する。一実施形態では、改変ポリメラーゼが急速な取込み時間を使用してテストされる場合、エラー率の減少が生じる。取込みとは、ＤＮＡポリメラーゼがテンプレートと接触している時間量を指す。本明細書で使用される場合、遅い取込み時間は、ＭｉｎｉＳｅｑ（商標）ベンチトップシーケンシングシステムを使用する標準サイクル下で使用される取込み時間である。遅い取込み時間としては、４０秒から５０秒までが挙げられる。本明細書で使用される場合、急速なサイクル時間は、１０秒から４０秒までである取込みステップを指す。一実施形態では、急速なサイクル時間は、４０秒以下、３０秒以下、２０秒以下、１８秒以下、１６秒以下、１４秒以下、または１２秒以下の取込み時間である。一実施形態では、急速なサイクル時間は、少なくとも１０秒、少なくとも１２秒、少なくとも１４秒、少なくとも１６秒、少なくとも１８秒、少なくとも２０秒、または少なくとも３０秒の取込み時間である。一実施形態では、急速なサイクル時間は、４０秒未満、３０秒未満、２０秒未満、１８秒未満、１６秒未満、１４秒未満、１２秒未満、または１０秒未満の取込み時間である。
【0034】
本明細書に記載の改変ポリメラーゼは、異なる長さのランについてのＳＢＳ反応で使用することができる。「ラン」とは、テンプレート上で同定されるヌクレオチド類の数を指す。ランは、典型的に、テンプレートの１つの鎖を読み取る第１のプライマー（例、ｒｅａｄ１プライマー）に基づくランおよびテンプレートの相補鎖を読み取る第２のプライマー（例、ｒｅａｄ２プライマー）に基づくランを含む。一実施形態では、第１のプライマーまたは第２のプライマーを使用して同定されるヌクレオチド類の数は、１０から１５０ヌクレオチドまでであり得る。一実施形態では、第１のプライマーまたは第２のプライマーを使用して同定されるヌクレオチド類の数は、１５０ヌクレオチド以下、１３０ヌクレオチド以下、１１０ヌクレオチド以下、９０ヌクレオチド以下、７０ヌクレオチド以下、５０ヌクレオチド以下、３０ヌクレオチド以下、または２０ヌクレオチド以下であり得る。一実施形態では、第１のプライマーまたは第２のプライマーを使用して同定されるヌクレオチド類の数は、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも７０、少なくとも９０、少なくとも１１０、または少なくとも１３０ヌクレオチドであり得る。
【0035】
特定の実施形態において、改変ポリメラーゼは、ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼに基づく。改変ポリメラーゼは、例えば、ファミリーＢ古細菌ＤＮＡポリメラーゼ、ヒトＤＮＡポリメラーゼ－α、またはファージポリメラーゼに基づき得る。
【0036】
ファミリーＢ古細菌ＤＮＡポリメラーゼは、米国特許第８，２８３，１４９号の開示によって例示されるように当該分野で周知である。特定の実施形態において、古細菌ＤＮＡポリメラーゼは、超好熱性古細菌に由来し、熱安定性である。
【0037】
特定の実施形態において、ファミリーＢ古細菌ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、またはメタノコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）等の属に由来する。サーモコッカス属のメンバーは当該分野で周知であり、Ｔ．４５５７、Ｔ．ｂａｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔ．ｇａｍｍａｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｔ．ｏｎｎｕｒｉｎｅｕｓ、Ｔ．ｓｉｂｉｒｉｃｕｓ、Ｔ．ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ、Ｔ．ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、およびＴ．ｗａｉｏｔａｐｕｅｎｓｉｓが含まれるが、これらに限定されない。パイロコッカス属のメンバーは当該分野で周知であり、Ｐ．ＮＡ２、Ｐ．ａｂｙｓｓｉ、Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ｐ．ｙａｙａｎｏｓｉｉ、Ｐ．ｅｎｄｅａｖｏｒｉ、Ｐ．ｇｌｙｃｏｖｏｒａｎｓ、およびＰ．ｗｏｅｓｅｉ．が含まれるが、これらに限定されない。メタノコッカス属のメンバーは当該分野で周知であり、Ｍ．ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｍ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍ．ｖａｎｎｉｅｌｉｉ、Ｍ．ｖｏｌｔａｅ、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、およびＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉが含まれるが、これらに限定されない。
【0038】
一実施形態では、改変されたポリメラーゼは、Ｖｅｎｔ（登録商標）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（登録商標）、９°Ｎ、Ｐｆｕ、ＫＯＤ、またはＰａｂポリメラーゼに基づく。Ｖｅｎｔ（登録商標）およびＤｅｅｐＶｅｎｔ（登録商標）は、超好熱性古細菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓから単離されたファミリーＢ ＤＮＡポリメラーゼに使用される商品名である。９°Ｎポリメラーゼは、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．から単離されたファミリーＢポリメラーゼである。Ｐｆｕポリメラーゼは、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓから分離されたファミリーＢポリメラーゼである。ＫＯＤポリメラーゼは、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｉｓから単離されたファミリーＢポリメラーゼである。Ｐａｂポリメラーゼは、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉから単離されたファミリーＢポリメラーゼである。Ｔｗａは、Ｔ．ｗａｉｏｔａｐｕｅｎｓｉｓから単離されたファミリーＢポリメラーゼである。Ｖｅｎｔ（登録商標）、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（登録商標）、９°Ｎ、Ｐｆｕ、ＫＯＤ、Ｐａｂ、およびＴｗａポリメラーゼの例は、図１に開示されている。
【0039】
特定の実施形態において、ファミリーＢ古細菌ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、Ｔ４、ＲＢ６９、またはφ２９ファージ等といったファージに由来する。
【0040】
図１は、配列番号１～７に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の配列アラインメントを示す。アラインメントは、異なるファミリーＢポリメラーゼで保存されているアミノ酸を示す。当業者は、保存されたアミノ酸および保存された領域は、それらがポリメラーゼの機能にとって重要であり、それゆえに、ポリメラーゼの構造と機能との間の相関を示すので、最も保存され易いことを理解するであろう。アラインメントは、異なるファミリーＢポリメラーゼ間で変動する領域も示す。当業者は、改変ポリメラーゼの生物学的活性に過度に影響を与えることなく、置換、とりわけ保存的置換が許容され得るポリメラーゼのそのようなデータ領域から推測することができる。
【0041】
本明細書に記載の改変ポリメラーゼは、公知のポリメラーゼ（本明細書では参照ポリメラーゼとも呼ばれる）のアミノ酸配列に基づき、１つ以上の残基での置換変異をさらに含む。一実施形態では、置換変異は、参照ポリメラーゼのアミノ酸と機能的に等価な位置でのものある。「機能的に同等」とは、改変ポリメラーゼが、参照ポリメラーゼおよび改変ポリメラーゼの両方において同じ機能的役割を有する参照ポリメラーゼのアミノ酸位置でのアミノ酸置換を有することを意味する。
【0042】
概して、２つ以上の異なるポリメラーゼにおける機能的に等価な置換変異は、ポリメラーゼのアミノ酸配列の相同アミノ酸位置で発生する。したがって、本明細書での「機能的に同等」の用語の使用は、変異アミノ酸の特定の機能が知られているかどうかに関係なく、所定の変異に対して「位置的に同等」または「相同」である変異も包含する。配列アラインメントおよび／または分子モデリングに基づいて、２つ以上の異なるポリメラーゼのアミノ酸配列における機能的に同等および位置的に等価なアミノ酸残基の位置を同定することが可能である。位置的に同等および／または機能的に等価な残基を同定するための配列アラインメントの例は、図１に示される。例えば、図１の垂直に整列させたＴｗａ、ＫＯＤ、Ｐａｂ、Ｐｆｕ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、およびＶｅｎｔポリメラーゼの残基は、９°Ｎのポリメラーゼアミノ酸配列の対応する残基と位置的に同等であると同時に機能的に同等であると考慮される。したがって、例えば、９°Ｎ、Ｔｗａ、ＫＯＤ、Ｐｆｕ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、およびＰａｂポリメラーゼの残基３４９およびＶｅｎｔポリメラーゼの残基３５１は、機能的に同等であり、位置的に同等である。同様に、例えば、９°Ｎ、Ｔｗａ、ＫＯＤ、およびＰａｂポリメラーゼの残基６３３、ＰｆｕおよびＤｅｅｐ Ｖｅｎｔポリメラーゼの残基６３４、およびＶｅｎｔポリメラーゼの残基６３６は、機能的に同等であり、位置的に同等である。当業者は、ＤＮＡポリメラーゼにおける機能的に等価な残基を容易に同定することができる。
【0043】
特定の実施形態において、置換変異は、非極性側鎖を有する残基への変異を含む。非極性側鎖を有するアミノ酸は、当該分野で周知であり、例えば、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、およびバリンが挙げられる。
【0044】
特定の実施形態において、置換変異は、極性側鎖を有する残基への変異を含む。極性側鎖を有するアミノ酸は、当該分野で周知であり、例えば、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、セリン、システイン、チロシン、およびスレオニンが挙げられる。
【0045】
特定の実施形態において、置換変異は、疎水性側鎖を有する残基への変異を含む。疎水性側鎖を有するアミノ酸は、当該分野で周知であり、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、およびトリプトファンが挙げられる。
【0046】
特定の実施形態において、置換変異は、非荷電側鎖を有する残基への変異を含む。非荷電側鎖を有するアミノ酸は、当該分野で周知であり、例えば、グリシン、セリン、システイン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、およびスレオニンが挙げられる。
【0047】
一実施形態では、改変されたポリメラーゼは、本明細書に開示される参照ポリメラーゼと構造的に類似（ｓｉｍｉｌａｒ）であるアミノ酸配列を有する。一実施形態では、参照ポリメラーゼは、９°Ｎのアミノ酸配列（配列番号１）を含むものである。任意で、参照ポリメラーゼは、配列番号１に以下の置換変異を持つものである：Ｍｅｔ１２９Ａｌａ、Ａｓｐ１４１Ａｌａ、Ｇｌｕ１４３Ａｌａ、Ｃｙｓ２２３Ｓｅｒ、Ｌｅｕ４０８Ａｌａ、Ｔｙｒ４０９Ａｌａ、Ｐｒｏ４１０Ｉｌｅ、およびＡｌａ４８５Ｖａｌ。置換変異Ｍｅｔ１２９Ａｌａ、Ａｓｐ１４１Ａｌａ、Ｇｌｕ１４３Ａｌａ、Ｃｙｓ２２３Ｓｅｒ、Ｌｅｕ４０８Ａｌａ、Ｔｙｒ４０９Ａｌａ、Ｐｒｏ４１０Ｉｌｅ、およびＡｌａ４８５Ｖａｌを持つ９°Ｎのアミノ酸配列（配列番号１）を有するポリメラーゼは、配列番号８で開示されており、また本明細書では、Ｐｏｌ ８１２ポリメラーゼとして参照される。他の参照配列としては、配列番号２、３、４、５、６、または７が挙げられる。任意で、参照ポリメラーゼは、配列番号２、３、４、５、６、または７に、配列番号１の以下の置換変異：Ｍｅｔ１２９Ａｌａ、Ａｓｐ１４１Ａｌａ、Ｇｌｕ１４３Ａｌａ、Ｃｙｓ２２３Ｓｅｒ、Ｌｅｕ４０８Ａｌａ、Ｔｙｒ４０９Ａｌａ、Ｐｒｏ４１０Ｉｌｅ、およびＡｌａ４８５Ｖａｌと機能的および位置的に等価な置換変異を持つものである。
【0048】
本明細書で使用される場合、改変ポリメラーゼのアミノ酸配列が、参照ポリメラーゼと比較して特定の量の配列類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）および／または配列同一性を有する場合、改変されたポリメラーゼは、参照ポリメラーゼと「構造的に類似」であり得る。
【0049】
２つのアミノ酸配列の構造的類似性は、２つの配列（例えば、本明細書に記載の候補ポリメラーゼおよび参照ポリメラーゼ）の残基を整列させて、それらの配列の長さに沿って同一のアミノ酸の数を最適化することによって決定することができる；同一のアミノ酸の数を最適化するために、いずれかまたは両方の配列のギャップが、アラインメントの作成において許可されるが、それでも、各配列のアミノ酸は適切な順序のままでなければならない。候補ポリメラーゼは、参照ポリメラーゼと比較されているポリメラーゼである。参照ポリメラーゼおよびポリメラーゼ活性と構造的類似性を有する候補ポリメラーゼは、改変ポリメラーゼである。
【0050】
本明細書に別段の記載があるように改変されない限り、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列のペアワイズ比較分析は、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性方法のためのサーチによって、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、マディソン、ウィスコンシン中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または目視検査（概して、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．の間の合弁、２００４年までの補遺）によって実施することができる。
【0051】
構造的類似性を決定するのに適したアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）に記載される。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センターを通じて公衆に入手可能である。このアルゴリズムでは、最初に、クエリ配列で長さＷの短いワードを同定することにより、データベース配列で同じ長さのワードと整列すると、正値の閾値スコアＴと合致するか充足するかのいずれかである、高スコアのシーケンシングペア（ＨＳＰ）を特定することを含む。Ｔは、近傍ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０））。これらの最初の近隣ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するためのシードとして作用する。次いで、ワードヒットは、累積アラインメントスコアを増やすことができる限り、各配列に沿って両方向に拡張される。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメーターＭ（合致する残基のペアの報酬スコア；常に＞０）およびＮ（非合致の残基のペナルティスコア；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列の場合、スコアリングマトリックスを使用して累積スコアを計算する。各方向へのワードヒットの拡張は、次の場合に中断される：累積アラインメントスコアが最大達成値から数量Ｘだけ低下する場合；１つ以上の負のスコアの残基アラインメントの蓄積により、累積スコアがゼロ以下になる場合；または、いずれかの配列の終結に到達する場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度およびスピードを決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、１００のカットオフ、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムはデフォルトとして、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５を参照）。
【0052】
パーセント配列同一性を計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析を実施する（例、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５７７８（１９９３）を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の合致が偶然に発生する確率の指標を提供する。例えば、テスト核酸と参照核酸との比較における最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は参照配列に類似していると考慮される。
【0053】
２つのアミノ酸配列の比較において、構造的類似性は、パーセント「同一性」によって参照され得るか、またはパーセント「類似性」によって参照され得る。「同一性」とは、同一であるアミノ酸の存在を指す。「類似性」は、同一であるアミノ酸の存在だけでなく、保存的置換の存在も指す。タンパク質中のアミノ酸の保存的置換は、アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択し得る。例えば、特定のサイズまたは特性（電荷、疎水性、または親水性等）を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸を、タンパク質の活性、特に生物学的活性に直接関連しないタンパク質の領域を変更することなく別のアミノ酸に置換することができることは、タンパク質生化学の分野で周知である。例えば、非極性アミノ酸としては、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、およびバリンが挙げられる。疎水性アミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、およびトリプトファンが挙げられる。極性アミノ酸としては、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、セリン、システイン、チロシン、およびスレオニンが挙げられる。非荷電アミノ酸としては、とりわけ、グリシン、セリン、システイン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、およびスレオニンが挙げられる。
【0054】
したがって、本明細書で使用される場合、本明細書に記載の１つ以上の配列番号のアミノ酸配列への参照等の本明細書に記載のポリメラーゼへの参照は、参照ポリメラーゼに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列類似性を持つタンパク質を含み得る。
【0055】
あるいは、本明細書で使用される場合、本明細書に記載の１つ以上の配列番号のアミノ酸配列への参照等の本明細書に記載のポリメラーゼへの参照は、参照ポリメラーゼに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を持つのタンパク質を含み得る。
【0056】
本開示は、本明細書に記載の１つ以上の活性を有するポリメラーゼをもたらす変異のコレクションを記載する。本明細書に記載のポリメラーゼは、配列番号１または配列番号８等の参照ポリメラーゼと比較して任意の数の変異、例えば、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、または少なくとも１８の変異を含み得る。同様に、本明細書に記載のポリメラーゼは、任意の組み合わせで変異を含み得る。例えば、表１は、本明細書に記載の変異の異なる組合せを含む特定の改変ポリメラーゼの例を示す。チェックマーク（レ）は、リストされた変異の存在を示す。リストされた変異、例えば、Ｙ４９７Ｇ、Ｆ１５２Ｇ、Ｖ２７８Ｌ等は、配列番号１上の位置の変異である。
【0057】
【表1-1】
【0058】
【表1-2】
【0059】
本開示の改変ポリメラーゼは、９°Ｎポリメラーゼ（配列番号１）におけるＴｙｒ４９７と機能的に等価な位置での置換変異を含む。一実施形態では、Ｔｙｒ４９７と機能的に等価な位置での置換変異は、非極性、疎水性、または非荷電アミノ酸、例えばＧｌｙへの変異である。
【0060】
一実施形態では、改変ポリメラーゼは、９°Ｎポリメラーゼ（配列番号１）のＰｈｅ１５２と機能的に等価な位置での置換変異を含む。一実施形態では、Ｐｈｅ１５２と機能的に等価な位置での置換変異は、非極性、疎水性、または非荷電アミノ酸、例えばＧｌｙへの変異である。
【0061】
一実施形態では、改変ポリメラーゼは、９°Ｎポリメラーゼ（配列番号１）のＶａｌ２７８と機能的に等価な位置での置換変異を含む。一実施形態では、Ｖａｌ２７８と機能的に等価な位置での置換変異は、非極性または疎水性アミノ酸、例えば、Ｌｅｕへの変異である。
【0062】
一実施形態では、改変ポリメラーゼは、９°Ｎポリメラーゼ（配列番号１）のＭｅｔ３２９と機能的に等価な位置での置換変異を含む。一実施形態では、Ｍｅｔ３２９と機能的に等価な位置での置換変異は、極性アミノ酸、例えば、Ｈｉｓへの変異である。
【0063】
一実施形態では、改変ポリメラーゼは、９°Ｎポリメラーゼ（配列番号１）のＶａｌ４７１と機能的に等価な位置での置換変異を含む。一実施形態では、Ｖａｌ４７１と機能的に等価な位置での置換変異は、極性または非荷電アミノ酸、例えば、Ｓｅｒへの変異である。
【0064】
一実施形態では、改変ポリメラーゼは、当該分野で公知であり、米国特許出願第２０１６／００３２３７７号によって例示されるように、９°Ｎポリメラーゼ（配列番号１）中のＴｈｒ５１４と機能的に等価な位置での置換変異を含む。一実施形態では、Ｔｈｒ５１４と機能的に等価な位置での置換変異は、非極性または疎水性アミノ酸、例えば、Ａｌａへの変異である。いくつかの実施形態では、Ｔｈｒ５１４と機能的に等価な位置での非極性または疎水性アミノ酸と組み合わせて使用することができる他の置換変異としては、Ｐｈｅ１５２、Ｖａｌ２７８、Ｍ３２９、Ｖａｌ４７１、Ｌｕｅ６３１、Ｇｌｕ７３４、またはそれらの組み合わせが挙げられる。一実施形態では、Ｔｈｒ５１４と機能的に等価な位置での置換変異は、極性または非荷電アミノ酸、例えば、Ｓｅｒである。いくつかの実施形態では、Ｔｈｒ５１４と機能的に等価な位置で極性または非荷電アミノ酸と組み合わせて使用することができる他の置換変異としては、Ｌｙｓ４７６、Ｌｙｓ４７７、Ｉｌｅ５２１、Ｔｈｒ５９０、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
【0065】
一実施形態では、改変ポリメラーゼは、９°Ｎポリメラーゼ（配列番号１）のＬｅｕ６３１と機能的に等価な位置での置換変異を含む。一実施形態では、Ｌｅｕ６３１と機能的に等価な位置での置換変異は、非極性または疎水性アミノ酸、例えば、Ｍｅｔへの変異である。
【0066】
一実施形態では、改変ポリメラーゼは、９°Ｎポリメラーゼ（配列番号１）のＧｌｕ７３４と機能的に等価な位置での置換変異を含む。一実施形態では、Ｇｌｕ７３４と機能的に等価な位置での置換変異は、極性または非荷電アミノ酸、例えば、Ａｒｇへの変異である。
【0067】
一実施形態では、改変ポリメラーゼは、９°Ｎポリメラーゼ（配列番号１）のＬｙｓ４７６と機能的に等価な位置での置換変異を含む。一実施形態では、Ｌｙｓ４７６と機能的に等価な位置での置換変異は、疎水性アミノ酸の非極性、例えば、Ｔｒｐへの変異である。
【0068】
一実施形態では、改変ポリメラーゼは、当該分野で知られており、米国特許第９，７６５，３０９号の開示によって例示されるように、９°Ｎポリメラーゼ（配列番号１）のＬｙｓ４７７と機能的に等価な位置での置換変異を含む。一実施形態では、Ｌｙｓ４７７と機能的に等価な位置での置換変異は、非極性または疎水性アミノ酸、例えば、Ｍｅｔへの変異である。
【0069】
一実施形態では、改変ポリメラーゼは、当該分野で公知であり、米国特許出願第２０１６／００３２３７７号によって例示されるように、９°Ｎポリメラーゼ（配列番号１）のＩｌｅ５２１と機能的に等価な位置での置換変異を含む。一実施形態では、Ｉｌｅ５２１と機能的に等価な位置での置換変異は、非極性アミノ酸、例えば、Ｌｅｕへの変異である。
【0070】
一実施形態では、改変ポリメラーゼは、９°Ｎポリメラーゼ（配列番号１）のＴｈｒ５９０と機能的に等価な位置での置換変異を含む。一実施形態では、Ｔｈｒ５９０と機能的に等価な位置での置換変異は、非極性または疎水性アミノ酸、例えばＩｌｅへの変異である。
【0071】
一実施形態では、改変ポリメラーゼは、９°Ｎポリメラーゼ（配列番号１）のＡｒｇ２４７と機能的に等価な位置での置換変異を含む。一実施形態では、Ａｒｇ２４７と機能的に等価な位置での置換変異は、非極性または非荷電アミノ酸、例えば、Ｔｙｒへの変異である。
【0072】
一実施形態では、改変ポリメラーゼは、９°Ｎポリメラーゼ（配列番号１）のＧｌｕ５９９と機能的に等価な位置での置換変異を含む。一実施形態では、Ｇｌｕ５９９と機能的に等価な位置での置換変異は、極性または非荷電アミノ酸、例えば、Ａｓｐへの変異である。
【0073】
一実施形態では、改変ポリメラーゼは、９°Ｎポリメラーゼ（配列番号１）のＬｙｓ６２０と機能的に等価な位置での置換変異を含む。一実施形態では、Ｌｙｓ６２０と機能的に等価な位置での置換変異は、極性または非荷電アミノ酸、例えば、Ａｒｇへの変異である。
【0074】
一実施形態では、改変ポリメラーゼは、９°Ｎポリメラーゼ（配列番号１）のＨｉｓ６３３と機能的に等価な位置での置換変異を含む。一実施形態では、Ｈｉｓ６３３と機能的に等価な位置での置換変異は、非極性、疎水性、または非荷電アミノ酸、例えばＧｌｙへの変異である。
【0075】
一実施形態では、改変ポリメラーゼは、９°Ｎポリメラーゼ（配列番号１）のＶａｌ６６１と機能的に等価な位置での置換変異を含む。一実施形態では、Ｖａｌ６６１と機能的に等価な位置での置換変異は、極性または非荷電アミノ酸、例えば、Ａｓｐへの変異である。
【0076】
一実施形態では、改変ポリメラーゼは、アミノ酸Ｍｅｔ１２９、Ａｓｐ１４１、Ｇｌｕ１４３、Ｃｙｓ２２３、Ｌｙｓ４０８、Ｔｙｒ４０９、Ｐｒｏ４１０、Ａｌａ４８５、またはそれらの組み合わせと機能的に等価な位置での少なくとも１つの置換変異を含む。一実施形態では、Ｍｅｔ１２９、Ａｓｐ１４１、Ｇｌｕ１４３、Ｌｙｓ４０８、またはＴｙｒ４０９と機能的に等価な位置での置換変異は、非極性または疎水性アミノ酸、例えば、Ａｌａへの変異である。一実施形態では、Ｃｙｓ２２３と機能的に等価な位置での置換変異は、極性または非荷電アミノ酸、例えばＳｅｒへの変異である。一実施形態では、Ｐｒｏ４１０と機能的に等価な位置での置換変異は、非極性または疎水性アミノ酸、例えばＩｌｅへの変異である。一実施形態では、Ａｌａ４８５と機能的に等価な位置での置換変異は、非極性または疎水性アミノ酸、例えばＶａｌへの変異である。
【0077】
一実施形態では、改変ポリメラーゼは、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列中の、Ｔｙｒ４９７と機能的に等価な位置でのアミノ酸置換変異およびＰｈｅ１５２、Ｖａｌ２７８、Ｍｅｔ３２９、Ｖａｌ４７１、Ｔｈｒ５１４、Ｌｅｕ６３１、およびＧｌｕ７３４から選択されるアミノ酸と機能的に等価な位置での少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または７つのアミノ酸置換変異を含む。一実施形態では、改変ポリメラーゼはまた、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列中のアミノ酸Ｍｅｔ１２９、Ａｓｐ１４１、Ｇｌｕ１４３、Ｃｙｓ２２３、Ｌｅｕ４０８、Ｔｙｒ４０９、Ｐｒｏ４１０、およびＡｌａ４８５と機能的に等価な位置でのアミノ酸置換変異を含む。
【0078】
一実施形態では、改変ポリメラーゼは、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列中の、Ｔｙｒ４９７と機能的に等価な位置でのアミノ酸置換変異およびＬｙｓ４７６、Ｌｙｓ４７７、Ｔｈｒ５１４、Ｉｌｅ５２１、およびＴｈｒ５９０から選択されるアミノ酸と機能的に等価な位置での少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または５つのアミノ酸置換変異を含む。一実施形態では、改変ポリメラーゼはまた、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列中のアミノ酸Ｍｅｔ１２９、Ａｓｐ１４１、Ｇｌｕ１４３、Ｃｙｓ２２３、Ｌｅｕ４０８、Ｔｙｒ４０９、Ｐｒｏ４１０、およびＡｌａ４８５と機能的に等価な位置でのアミノ酸置換変異を含む。
【0079】
一実施形態では、改変ポリメラーゼは、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列中の、Ｔｙｒ４９７と機能的に等価な位置でのアミノ酸置換変異およびＡｒｇ２４７、Ｇｌｕ５９９、Ｌｙｓ６２０、Ｈｉｓ６３３、およびＶａｌ６６１から選択されるアミノ酸と機能的に等価な位置での少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、または５つのアミノ酸置換変異を含む。一実施形態では、改変ポリメラーゼはまた、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列中のアミノ酸Ｍｅｔ１２９、Ａｓｐ１４１、Ｇｌｕ１４３、Ｃｙｓ２２３、Ｌｅｕ４０８、Ｔｙｒ４０９、Ｐｒｏ４１０、およびＡｌａ４８５と機能的に等価な位置でのアミノ酸置換変異を含む。
【0080】
一実施形態では、改変ポリメラーゼは、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列中の、Ｔｙｒ４９７と機能的に等価な位置でのアミノ酸置換変異、Ｐｈｅ１５２、Ｖａｌ２７８、Ｍｅｔ３２９、Ｖａｌ４７１、Ｔｈｒ５１４、Ｌｅｕ６３１、またはＧｌｕ７３４と機能的に等価な位置での少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または７つのアミノ酸置換変異、および（ｉｉｉ）９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列中のＬｙｓ４７６、Ｌｙｓ４７７、Ｔｈｒ５１４、Ｉｌｅ５２１、またはＴｈｒ５９０と機能的に等価な位置での少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または５つのアミノ酸置換変異を含む。一実施形態では、改変ポリメラーゼはまた、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列中のアミノ酸Ｍｅｔ１２９、Ａｓｐ１４１、Ｇｌｕ１４３、Ｃｙｓ２２３、Ｌｅｕ４０８、Ｔｙｒ４０９、Ｐｒｏ４１０、およびＡｌａ４８５と機能的に等価な位置でのアミノ酸置換変異を含む。
【0081】
一実施形態では、改変ポリメラーゼは、Ｔｙｒ４９７と機能的に等価な位置でのアミノ酸置換変異、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列中のＰｈｅ１５２、Ｖａｌ２７８、Ｍｅｔ３２９、Ｖａｌ４７１、Ｔｈｒ５１４、Ｌｅｕ６３１、およびＧｌｕ７３４から選択されるアミノ酸と機能的に等価な位置での少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または７つのアミノ酸置換変異、および９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列中のＡｒｇ２４７、Ｇｌｕ５９９、Ｌｙｓ６２０、Ｈｉｓ６３３、またはＶａｌ６６１から選択されたアミノ酸と機能的に等価な位置での少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたは５つのアミノ酸置換変異を含む。一実施形態では、改変ポリメラーゼはまた、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列中のアミノ酸Ｍｅｔ１２９、Ａｓｐ１４１、Ｇｌｕ１４３、Ｃｙｓ２２３、Ｌｅｕ４０８、Ｔｙｒ４０９、Ｐｒｏ４１０、およびＡｌａ４８５と機能的に等価な位置でのアミノ酸置換変異を含む。
【0082】
一実施形態では、改変ポリメラーゼは、Ｔｙｒ４９７と機能的に等価な位置でのアミノ酸置換変異、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列中のＬｙｓ４７６、Ｌｙｓ４７７、Ｔｈｒ５１４、Ｉｌｅ５２１、またはＴｈｒ５９０から選択されるアミノ酸と機能的に等価な位置での少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または５つのアミノ酸置換変異、および９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列中のＡｒｇ２４７、Ｇｌｕ５９９、Ｌｙｓ６２０、Ｈｉｓ６３３、またはＶａｌ６６１から選択されたアミノ酸と機能的に等価な位置での少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または５つのアミノ酸置換変異を含む。実施形態では、改変ポリメラーゼはまた、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列中のアミノ酸Ｍｅｔ１２９、Ａｓｐ１４１、Ｇｌｕ１４３、Ｃｙｓ２２３、Ｌｅｕ４０８、Ｔｙｒ４０９、Ｐｒｏ４１０、およびＡｌａ４８５と機能的に等価な位置でのアミノ酸置換変異を含む。
【0083】
一実施形態では、改変ポリメラーゼは、Ｔｙｒ４９７と機能的に等価な位置でのアミノ酸置換変異、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列中のＰｈｅ１５２、Ｖａｌ２７８、Ｍｅｔ３２９、Ｖａｌ４７１、Ｌｅｕ６３１、およびＧｌｕ７３４から選択されるアミノ酸と機能的に等価な位置での少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または６つのアミノ酸置換変異、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列中のＬｙｓ４７６、Ｌｙｓ４７７、Ｔｈｒ５１４、Ｉｌｅ５２１、またはＴｈｒ５９０から選択されるアミノ酸と機能的に等価な位置での少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または５つのアミノ酸置換変異、および９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列中のＡｒｇ２４７、Ｇｌｕ５９９、Ｌｙｓ６２０、Ｈｉｓ６３３、またはＶａｌ６６１から選択されるアミノ酸と機能的に等価な位置での少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または５つのアミノ酸置換変異を含む。一実施形態では、改変ポリメラーゼはまた、９°Ｎ ＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列中のアミノ酸Ｍｅｔ１２９、Ａｓｐ１４１、Ｇｌｕ１４３、Ｃｙｓ２２３、Ｌｅｕ４０８、Ｔｙｒ４０９、Ｐｒｏ４１０、およびＡｌａ４８５と機能的に等価な位置でのアミノ酸置換変異を含む。
【0084】
改変ポリメラーゼの特定の例としては、Ｐｏｌ １５５０（配列番号１０）、Ｐｏｌ １５５８（配列番号１１）、Ｐｏｌ １５６３（配列番号１２）、Ｐｏｌ １５６５（配列番号１３）、Ｐｏｌ １６３０（配列番号１４）、Ｐｏｌ １６３４（配列番号１５）、Ｐｏｌ １６４１（配列番号１６）、Ｐｏｌ １５７３（配列番号１７）、Ｐｏｌ １５７６（配列番号１８）、Ｐｏｌ １５８４（配列番号１９）、Ｐｏｌ １５８６（配列番号２０）、Ｐｏｌ １６０１（配列番号２１）、Ｐｏｌ １６１１（配列番号２２）、Ｐｏｌ １６７１（配列番号２３）、Ｐｏｌ １６７７（配列番号２４）、Ｐｏｌ １６８２（配列番号２５）、Ｐｏｌ １６８０（配列番号２７）、Ｐｏｌ １７４５（配列番号２８）、Ｐｏｌ １７５８（配列番号２９）、Ｐｏｌ １７６１（配列番号３０）、Ｐｏｌ １７６２（配列番号３１）、Ｐｏｌ １７６５（配列番号３２）、Ｐｏｌ １７６９（配列番号３３）、およびＰｏｌ １７７０（配列番号３４）が挙げられる。
【0085】
本明細書に記載の改変ポリメラーゼは、ポリメラーゼ活性に影響を与えることが知られている追加の変異を含み得る。そのような置換では、変異は、９°Ｎポリメラーゼ（配列番号１）のＡｒｇ７１３と機能的に等価な位置でのものである。減少したエキソヌクレアーゼ活性の結果を生じることが知られている１つ以上の位置での種々の置換変異のいずれかを、当該分野で公知であるように行うことができ、米国特許第８，６２３，６２８号に例示される。一実施形態では、位置Ａｒｇ７１３での置換変異は、非極性、疎水性、または非荷電アミノ酸、例えば、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、またはＡｌａへの変異である。
【0086】
一実施形態では、改変ポリメラーゼは、当該分野で公知であるように当該分野で公知であるように、Ａｒｇ７４３またはＬｙｓ７０５と機能的に等価な位置での置換変異を含み、米国特許第８，６２３，６２８号の開示に例示される。一実施形態では、位置Ａｒｇ７４３またはＬｙｓ７０５での置換変異は、非極性または疎水性アミノ酸、例えば、Ａｌａへの変異である。
【0087】
本開示はまた、本明細書に記載の改変ポリメラーゼを含む組成物を提供する。組成物は、改変ポリメラーゼに加えて他の成分を含むことができる。例えば、組成物は、バッファー、ヌクレオチド溶液、またはそれらの組合せを含むことができる。ヌクレオチド溶液は、ラベル化、合成、修飾、またはそれらの組合せをされたヌクレオチド類等のヌクレオチド類を含むことができる。一実施形態では、組成物は、標的核酸のライブラリー等の標的核酸を含む。
【0088】
（ポリメラーゼへの変異導入）
種々のタイプの変異導入が、例えば、上記のようなポリメラーゼモデルおよびモデル予測に従って、またはランダムまたはセミランダム変異アプローチを使用して、例えば、ポリメラーゼを改変して変異体を生成するために、本開示において任意で使用される。概して、利用可能な任意の変異導入手順を、ポリメラーゼ変異体を作製するために使用することができる。そのような変異導入手順は、目的の１つ以上の活性（例、減少したピロリン酸分解、増加した代謝回転、例えば、所定のヌクレオチドアナログについてのもの）のための変異体核酸およびポリペプチドの選択を任意で含む。使用することができる手順としては、以下が挙げられる：部位特異的点変異導入、ランダム点変異導入、インビトロまたはインビボ相同組換え（ＤＮＡシャッフリングおよびコンビナトリアルオーバーラップＰＣＲ）、ウラシル含有テンプレートを使用した変異導入、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ変異導入、ギャップ化デュプレックスＤＮＡを使用した変異導入、ポイントミスマッチ修復、修復欠損宿主株を使用した変異導入、制限選択および制限精製、欠失変異導入、全遺伝子合成による変異導入、縮重ＰＣＲ、二本鎖切断修復、および当業者に公知の他の多く。変異の開始ポリメラーゼは、例えば、米国特許第８，４６０，９１０号および米国特許第８，６２３，６２８号中で同定されたもの等の利用可能なポリメラーゼ変異体を含み、本明細書に記載のいずれかであり得、これらのそれぞれは、参照によりその全体が組み込まれる。
種々のタイプの変異導入が、例えば、上記のようなポリメラーゼモデルおよびモデル予測に従って、またはランダムまたはセミランダム変異アプローチを使用して、例えば、ポリメラーゼを改変して変異体を生成するために、本開示において任意で使用される。概して、利用可能な任意の変異導入手順を、ポリメラーゼ変異体を作製するために使用することができる。そのような変異導入手順は、目的の１つ以上の活性（例、減少したピロリン酸分解、増加した代謝回転、例えば、所定のヌクレオチドアナログについてのもの）のための変異体核酸およびポリペプチドの選択を任意で含む。使用することができる手順としては、以下が挙げられる：部位特異的点変異導入、ランダム点変異導入、インビトロまたはインビボ相同組換え（ＤＮＡシャッフリングおよびコンビナトリアルオーバーラップＰＣＲ）、ウラシル含有テンプレートを使用した変異導入、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ変異導入、ギャップ化デュプレックスＤＮＡを使用した変異導入、ポイントミスマッチ修復、修復欠損宿主株を使用した変異導入、制限選択および制限精製、欠失変異導入、全遺伝子合成による変異導入、縮重ＰＣＲ、二本鎖切断修復、および当業者に公知の他の多く。変異の開始ポリメラーゼは、例えば、米国特許第８，４６０，９１０号および米国特許第８，６２３，６２８号中で同定されたもの等の利用可能なポリメラーゼ変異体を含み、本明細書に記載のいずれかであり得、これらのそれぞれは、参照によりその全体が組み込まれる。
【0089】
任意で、変異導入は、天然に生じるポリメラーゼ分子からの公知情報、または公知の改変もしくは変異されたポリメラーゼ（例、既存の変異ポリメラーゼを使用する）、例えば、上で考察したような、配列、配列比較、物性、結晶構造等によって案内され得る。しかしながら、別のクラスの実施形態では、修飾は本質的にランダムであり得る（例えば、古典的または「ファミリー」ＤＮＡシャッフリングのように、例えば、Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ． （１９９８） ”ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｏｆ ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ｄｉｖｅｒｓｅ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ” Ｎａｔｕｒｅ ３９１：２８８－２９１を参照）。
【0090】
変異フォーマットに関する追加情報は、以下に見いだされる：Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （３ｒｄ Ｅｄ．）， Ｖｏｌ． １－３， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， ２０００ （”Ｓａｍｂｒｏｏｋ”）； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ． ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， （ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ２０１１） （”Ａｕｓｕｂｅｌ”）） ａｎｄ ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ （Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ． Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ． （１９９０） （”Ｉｎｎｉｓ”）。以下に引用される参考文献は、変異の形式に関する追加の詳細を提供する：Ａｒｎｏｌｄ， Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｕｎｕｓｕａｌ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：４５０－４５５ （１９９３）； Ｂａｓｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｕｔａｎｔ Ｔｒｐ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ ｗｉｔｈ ｎｅｗ ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：２４０－２４５ （１９８８）； Ｂｏｒｄｏ ａｎｄ Ａｒｇｏｓ （１９９１） Ｓｕｇｇｅｓｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ”Ｓａｆｅ” Ｒｅｓｉｄｕｅ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ２１７：７２１－７２９； Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ＆ Ｓｈｏｒｔｌｅ， Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１１９３－１２０１ （１９８５）； Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ Ｍ１３ ｖｅｃｔｏｒｓ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １３： ４４３１－４４４３ （１９８５）； Ｃａｒｔｅｒ， Ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２３７：１－７ （１９８６）； Ｃａｒｔｅｒ， Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ Ｍ１３ ｖｅｃｔｏｒｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５４： ３８２－４０３ （１９８７）； Ｄａｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５７：３６９－３７４ （１９９６）； Ｅｇｈｔｅｄａｒｚａｄｅｈ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｕｓｅ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｌａｒｇｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４： ５１１５ （１９８６）； Ｆｒｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ： ａ ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６： ６９８７－６９９９ （１９８８）； Ｇｒｕｎｄｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ ｀ｓｈｏｔ－ｇｕｎ｀ ｇｅｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １３： ３３０５－３３１６ （１９８５）； Ｈａｙｅｓ （２００２） Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ＰＮＡＳ ９９（２５） １５９２６－１５９３１； Ｋｕｎｋｅｌ， Ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ， ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｅｃｋｓｔｅｉｎ， Ｆ． ａｎｄ Ｌｉｌｌｅｙ， Ｄ． Ｍ． Ｊ． ｅｄｓ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， Ｂｅｒｌｉｎ）） （１９８７）； Ｋｕｎｋｅｌ， Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２：４８８－４９２ （１９８５）； Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５４， ３６７－３８２ （１９８７）； Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２： ９４４１－９４５６ （１９８４）； Ｋｒａｍｅｒ ＆ Ｆｒｉｔｚ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｖｉａ ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５４：３５０－３６７ （１９８７）； Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｏｉｎｔ Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｒｅｐａｉｒ， Ｃｅｌｌ ３８：８７９－８８７ （１９８４）； Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６： ７２０７ （１９８８）； Ｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ＤＮＡ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ： ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ， Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２５４（２）： １５７－１７８ （１９９７）； Ｌｏｒｉｍｅｒ ａｎｄ Ｐａｓｔａｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３， ３０６７－８ （１９９５）； Ｍａｎｄｅｃｋｉ， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ ｒｅｐａｉｒ ｉｎ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ： ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８３：７１７７－７１８１（１９８６）； Ｎａｋａｍａｙｅ ＆ Ｅｃｋｓｔｅｉｎ， Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｎｃｉ Ｉ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｇｒｏｕｐｓ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４： ９６７９－９６９８ （１９８６）； Ｎａｍｂｉａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｔｏｔａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｓ ｐｒｏｔｅｉｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２３： １２９９－１３０１（１９８４）； Ｓａｋａｍａｒ ａｎｄ Ｋｈｏｒａｎａ， Ｔｏｔａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ａ－ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｒｏｄ ｏｕｔｅｒ ｓｅｇｍｅｎｔ ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ （ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎ）， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４： ６３６１－６３７２ （１９８８）； Ｓａｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｙ－Ｔ Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ－ｂａｓｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：７９１－８０２ （１９８８）； Ｓａｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｒａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＤＮＡ ｂｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ， （１９８８） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６： ８０３－８１４； Ｓｉｅｂｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １９：４５６－４６０ （２００１）； Ｓｍｉｔｈ， Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． １９：４２３－４６２ （１９８５）； Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １００： ４６８－５００ （１９８３）； Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５４： ３２９－３５０ （１９８７）； Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ ３７０， ３８９－９１（１９９４）； Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＤＮＡ ｉｎ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｔｏ ｐｒｅｐａｒｅ ｎｉｃｋｅｄ ＤＮＡ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １３： ８７４９－８７６４ （１９８５）； Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｔ ｈｉｇｈ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｕｓｉｎｇ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＤＮＡ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １３： ８７６５－８７８７ （１９８５）； Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎ－ｂｏｎｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｓｔａｔｅ ｏｆ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ， Ｐｈｉｌ． Ｔｒａｎｓ． Ｒ． Ｓｏｃ． Ｌｏｎｄ． Ａ ３１７： ４１５－４２３ （１９８６）； Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｓｓｅｔｔｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ： ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｔ ｄｅｆｉｎｅｄ ｓｉｔｅｓ， Ｇｅｎｅ ３４：３１５－３２３ （１９８５）； Ｚｏｌｌｅｒ ＆ Ｓｍｉｔｈ， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ Ｍ １３－ｄｅｒｉｖｅｄ ｖｅｃｔｏｒｓ： ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｎｙ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ，
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １０：６４８７－６５００ （１９８２）； Ｚｏｌｌｅｒ ＆ Ｓｍｉｔｈ， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ Ｍ１３ ｖｅｃｔｏｒｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １００：４６８－５００ （１９８３）； Ｚｏｌｌｅｒ ＆ Ｓｍｉｔｈ， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ： ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｉｎｇ ｔｗｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ａ ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５４：３２９－３５０ （１９８７）； Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９１） ”Ｍａｋｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ” Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８； Ｇｉｂｂｓ ｅｔ ａｌ． （２００１） ”Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｇｅｎｅ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ （ＤＯＧＳ）： ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｔｈｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｆａｍｉｌｙ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ” Ｇｅｎｅ ２７１：１３－２０；およびＨｉｒａｇａ ａｎｄ Ａｒｎｏｌｄ （２００３） ”Ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｈｉｍｅｒａｇｅｎｅｓｉｓ： Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３３０：２８７－２９６。上記の方法の多くに関する追加の詳細は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ １５４に見いだすことができ、種々の変異導入方法が持つトラブルシューティング問題についての有用なコントロールについても記載している。
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １０：６４８７－６５００ （１９８２）； Ｚｏｌｌｅｒ ＆ Ｓｍｉｔｈ， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ Ｍ１３ ｖｅｃｔｏｒｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １００：４６８－５００ （１９８３）； Ｚｏｌｌｅｒ ＆ Ｓｍｉｔｈ， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ： ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｉｎｇ ｔｗｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ａ ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５４：３２９－３５０ （１９８７）； Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９１） ”Ｍａｋｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ” Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８； Ｇｉｂｂｓ ｅｔ ａｌ． （２００１） ”Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｇｅｎｅ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ （ＤＯＧＳ）： ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｔｈｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｆａｍｉｌｙ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ” Ｇｅｎｅ ２７１：１３－２０；およびＨｉｒａｇａ ａｎｄ Ａｒｎｏｌｄ （２００３） ”Ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｈｉｍｅｒａｇｅｎｅｓｉｓ： Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３３０：２８７－２９６。上記の方法の多くに関する追加の詳細は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ １５４に見いだすことができ、種々の変異導入方法が持つトラブルシューティング問題についての有用なコントロールについても記載している。
【0091】
（組換えポリメラーゼの作製および単離）
概して、本明細書に提示されるようなポリメラーゼをコードする核酸は、クローニング、組換え、インビトロ合成、インビトロ増幅、および／または他の利用可能な方法によって作製することができる。本明細書に提示されるようなポリメラーゼをコードする発現ベクターを発現させるために、種々の組換え法を使用することができる。組換え核酸を作製するための方法、発現された産物の発現および単離は、当該分野で周知であり、記載されている。多数の例示的な変異および変異の組み合わせ、ならびに望ましい変異を設計するための戦略は、本明細書に記載されている。ヌクレオチドアナログによるアクセスの改善を可能にするために活性部位内またはその近くの立体的特徴を改変することを含む、ポリメラーゼの活性部位における変異を作成および選択するための方法は、本明細書および例えば、国際公開第ＷＯ２００７／０７６０５７号および国際公開第２００８／０５１５３０号に見出される。
概して、本明細書に提示されるようなポリメラーゼをコードする核酸は、クローニング、組換え、インビトロ合成、インビトロ増幅、および／または他の利用可能な方法によって作製することができる。本明細書に提示されるようなポリメラーゼをコードする発現ベクターを発現させるために、種々の組換え法を使用することができる。組換え核酸を作製するための方法、発現された産物の発現および単離は、当該分野で周知であり、記載されている。多数の例示的な変異および変異の組み合わせ、ならびに望ましい変異を設計するための戦略は、本明細書に記載されている。ヌクレオチドアナログによるアクセスの改善を可能にするために活性部位内またはその近くの立体的特徴を改変することを含む、ポリメラーゼの活性部位における変異を作成および選択するための方法は、本明細書および例えば、国際公開第ＷＯ２００７／０７６０５７号および国際公開第２００８／０５１５３０号に見出される。
【0092】
変異、組換えおよびインビトロ核酸操作法（クローニング、発現、ＰＣＲ等を含む）に関する追加の有用な参考文献としては、以下が挙げられる。Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ， Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ １５２ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ． （Ｂｅｒｇｅｒ）； Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｃｅｓｋｅ （ｅｄ） ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ （Ｋａｕｆｍａｎ）； Ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｒａｌｐｈ Ｒａｐｌｅｙ （ｅｄ） （２０００） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ （Ｒａｐｌｅｙ）； Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ． （ｅｄ） ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌｕｍｅ １９２） Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；およびｉｎ Ｖｉｌｊｏｅｎ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ＰＣＲ Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， ＩＳＢＮ １４０２０３４０３２
【0093】
また、プラスミドまたは他の関連する核酸を細胞から精製するためのキットが多数市販されている（例えば、両方ともＰｈａｒｍａｃｉａ ＢｉｏｔｅｃｈからのＥａｓｙＰｒｅｐ（商標）およびＦｌｅｘｉＰｒｅｐ（商標）、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのＳｔｒａｔａＣｌｅａｎ（商標）、およびＱｉａｇｅｎからのＱＩＡｐｒｅｐ（商標）を参照）。任意の単離および／または精製された核酸は、他の核酸を生成するためにさらに操作され、細胞をトランスフェクトするために使用され、発現のために生物に感染するために関連するベクターに組み込まれる等をされ得る。典型的なクローニングベクターは、転写および翻訳ターミネーター、転写および翻訳開始配列、ならびに特定の標的核酸の発現の調節に有用なプロモーターを含む。ベクターは、少なくとも１つの独立したターミネーター配列、真核生物、または原核生物、あるいはその両方におけるカセットの複製を可能にする配列（例えば、シャトルベクター）、および原核生物と真核生物の両方のシステムの選択マーカーを含む一般的な発現カセットを任意で含む。ベクターは、原核生物、真核生物、またはその両方での複製および移入に適する。
【0094】
他の有用な参考文献、例えば細胞の単離および培養（例えば、その後の核酸の単離）としては、以下が挙げられる。Ｆｒｅｓｈｎｅｙ （１９９４） Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ， ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ， ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋおよびそれに引用される参考文献； Ｐａｙｎｅ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．； Ｇａｍｂｏｒｇ ａｎｄ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ （ｅｄｓ） （１９９５） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ； Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ （Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）； ａｎｄ Ａｔｌａｓ ａｎｄ Ｐａｒｋｓ （ｅｄｓ） Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ （１９９３） ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ｆｌａ
【0095】
本開示はまた、本明細書に開示される改変されたポリメラーゼをコードする核酸を含む。特定のアミノ酸は、複数のコドンによってコードされ得、特定の翻訳システム（例、原核生物または真核生物の細胞）はしばしばコドンバイアスを呈し、例えば、異なる生物体は、同じアミノ酸をコードするいくつかの同義コドンのうちの１つをしばしば好む。したがって、本明細書に提示される核酸は、任意で「コドン最適化」され、ポリメラーゼを発現するために使用される特定の翻訳システムによって好ましいコドンを含むように核酸が合成されることを意味する。例えば、細菌細胞（または特定の細菌株ですら）中でポリメラーゼを発現させることが望ましい場合、核酸は、ポリメラーゼの効率的な発現のために、その細菌細胞のゲノムで最も頻繁に見られるコドンを含むように合成され得る。真核細胞でポリメラーゼを発現することが望ましい場合、例えば、核酸がその真核細胞によって好ましいコドンを含み得る場合、同様の戦略を採用することができる。
【0096】
種々のタンパク質の単離および検出方法は、公知であり、ポリメラーゼを、例えば、本明細書に提示される組換えポリメラーゼを発現する細胞の組換え培養物から単離するために使用することができる。種々のタンパク質の単離および検出方法は、当該分野で周知であり、例えば、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１８２：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｓａｎｄａｎａ（１９９７）Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｏｌｌａｇ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，ＮＹ；Ｗａｌｋｅｒ（１９９６）Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ，Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ａｎｇａｌ（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ａｎｇａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｓｃｏｐｅｓ（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ；Ｊａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｒｙｄｅｎ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，ＮＹ；およびＷａｌｋｅｒ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｎ ＣＤ－ＲＯＭ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ；ならびにこれらに引用される参考文献に示されるものが挙げられる。タンパク質の精製および検出方法に関する追加の詳細は、Ｓａｔｉｎｄｅｒ Ａｈｕｊａ ｅｄ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（２０００）に見いだすことができる。
【0097】
（使用方法）
本明細書に提示される改変ポリメラーゼは、合成によるシーケンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＳＢＳ）技術等のシーケンシング手順で使用することができる。簡単に言えば、ＳＢＳは、標的核酸を１つ以上のヌクレオチド類（例えば、ラベル化、合成、修飾、またはそれらの組み合わせ）、ＤＮＡポリメラーゼ等と接触させることによって開始することができる。プライマーが標的核酸をテンプレートとして使用して伸長されるこれらの特徴は、検出することができるラベル化ヌクレオチドを取り込むであろう。シーケンシングランに使用される取込み時間は、本明細書に記載の改変ポリメラーゼを使用して大幅に減少することができる。任意で、ラベル化ヌクレオチド類は、いったんヌクレオチドがプライマーに添加さてしまうと、さらなるプライマー伸長を終結させる可逆的終結特性をさらに含むことができる。例えば、可逆的ターミネーター部分を有するヌクレオチドアナログは、脱ブロッキング剤が送達されて当該部分を除去するまでその後の伸長が起こり得ないように、プライマーに添加することができる。したがって、可逆的終結を使用する実施形態について、脱ブロッキング試薬をフローセルに送達することができる（検出が行われる前または後に）。洗浄は、種々の送達ステップの間に実施することができる。次いで、このサイクルをｎ回繰り返して、プライマーをｎ個のヌクレオチド類により延長させ、それによってｎ個の長さの配列を検出することができる。本開示の方法によって生成されたアレイを使用して容易に適合させることができる例示的なＳＢＳ手順、流体システム、および検出プラットフォームは、例えば、Ｂｅｎｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４５６：５３－５９（２００８）；国際公開第０４／０１８４９７号；国際公開第９１／０６６７８号；国際公開第０７／１２３７４４号；米国特許第７，０５７，０２６号、同第７，３２９，４９２号、同第７，２１１，４１４号、同第７，３１５，０１９号、同第７，４０５，２８１号、および同第８，３４３，７４６号に記載されている。
本明細書に提示される改変ポリメラーゼは、合成によるシーケンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＳＢＳ）技術等のシーケンシング手順で使用することができる。簡単に言えば、ＳＢＳは、標的核酸を１つ以上のヌクレオチド類（例えば、ラベル化、合成、修飾、またはそれらの組み合わせ）、ＤＮＡポリメラーゼ等と接触させることによって開始することができる。プライマーが標的核酸をテンプレートとして使用して伸長されるこれらの特徴は、検出することができるラベル化ヌクレオチドを取り込むであろう。シーケンシングランに使用される取込み時間は、本明細書に記載の改変ポリメラーゼを使用して大幅に減少することができる。任意で、ラベル化ヌクレオチド類は、いったんヌクレオチドがプライマーに添加さてしまうと、さらなるプライマー伸長を終結させる可逆的終結特性をさらに含むことができる。例えば、可逆的ターミネーター部分を有するヌクレオチドアナログは、脱ブロッキング剤が送達されて当該部分を除去するまでその後の伸長が起こり得ないように、プライマーに添加することができる。したがって、可逆的終結を使用する実施形態について、脱ブロッキング試薬をフローセルに送達することができる（検出が行われる前または後に）。洗浄は、種々の送達ステップの間に実施することができる。次いで、このサイクルをｎ回繰り返して、プライマーをｎ個のヌクレオチド類により延長させ、それによってｎ個の長さの配列を検出することができる。本開示の方法によって生成されたアレイを使用して容易に適合させることができる例示的なＳＢＳ手順、流体システム、および検出プラットフォームは、例えば、Ｂｅｎｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４５６：５３－５９（２００８）；国際公開第０４／０１８４９７号；国際公開第９１／０６６７８号；国際公開第０７／１２３７４４号；米国特許第７，０５７，０２６号、同第７，３２９，４９２号、同第７，２１１，４１４号、同第７，３１５，０１９号、同第７，４０５，２８１号、および同第８，３４３，７４６号に記載されている。
【0098】
パイロシーケンシング等の周期的反応を使用する他のシーケンシング手順を使用することができる。パイロシーケンシングは、特定のヌクレオチド類が新生核酸鎖に取り込まれる際に無機ピロリン酸（ＰＰｉ）の解放を検出する（Ｒｏｎａｇｈｉ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４２（１），８４－９（１９９６）；Ｒｏｎａｇｈｉ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１１（１），３－１１（２００１）；Ｒｏｎａｇｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１（５３７５），３６３（１９９８）；米国特許第６，２１０，８９１号；同第６，２５８，５６８号および同第６，２７４，３２０号）。パイロシーケンシングでは、放出されたＰＰｉは、ＡＴＰスルフリラーゼによってアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に変換されることで検出することができ、結果として生じるＡＴＰは、ルシフェラーゼで生成された光子を介して検出することができる。したがって、シーケンシング反応は、発光検出システムを介して監視することができる。蛍光ベースの検出システムに使用される励起放射線源は、パイロシーケンシング手順のためには必要でない。本開示のアレイへのパイロシーケンシングの適用に使用することができる有用な流体システム、検出器、および手順は、例えば、国際公開第２０１２／０５８０９６号、米国特許出願公開第２００５／０１９１６９８Ａ１号、米国特許第７，５９５，８８３号および同第７，２４４，５５９号に記載されている。
【0099】
いくつかの実施形態は、ＤＮＡポリメラーゼ活性のリアルタイムモニタリングを含む方法を使用することができる。例えば、ヌクレオチドの取込みは、フルオロフォアを含むポリメラーゼとγ－リン酸ラベル化ヌクレオチド類との間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）相互作用を介して、またはゼロモード導波路を用いて検出することができる。ＦＲＥＴベースのシーケンシングのための技術および試薬は、例えば、Ｌｅｖｅｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９，６８２-６８６（２００３）；Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ．Ｏｐｔ．Ｌｅｔｔ．３３，１０２６－１０２８（２００８）；Ｋｏｒｌａｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０５，１１７６－１１８１（２００８）に記載されている。
【0100】
いくつかのＳＢＳ実施形態は、ヌクレオチドが伸長産物に取り込まれると放出されるプロトンの検出を含む。例えば、放出されたプロトンの検出に基づくシーケンシングは、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（Ｇｕｉｌｆｏｒｄ、ＣＴ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの子会社）から市販されている電気検出器および関連技術、または米国特許第８，２６２，９００号、同第７，９４８，０１５号、同８，３４９，１６７号、および米国公開特許出願番号第２０１０／０１３７１４３Ａ１号に記載されるシーケンシング方法およびシステムを使用することができる。
【0101】
したがって、本明細書に提示されるのは、以下の成分が相互作用することを可能にすることを含む、ヌクレオチドアナログをＤＮＡに取り込ませるの方法である：（ｉ）上記実施形態のいずれかに従っての改変ポリメラーゼ、（ｉｉ）ＤＮＡテンプレート；および（ｉｉｉ）ヌクレオチド溶液。特定の実施形態では、ＤＮＡテンプレートは、クラスター化アレイを含む。特定の実施形態において、ヌクレオチド類は、３’糖ヒドロキシルにて修飾され、３’糖ヒドロキシルにて修飾を含み、その結果、置換基が、天然に生じる３’ヒドロキシル基よりもサイズが大きくなる。
【0102】
（改変ポリメラーゼをコードする核酸）
本開示はまた、本明細書に記載の改変ポリメラーゼをコードする核酸分子を含む。アミノ酸配列、好ましくはポリメラーゼをコードする野生型ヌクレオチド配列も公知であるポリメラーゼの変異体バージョンである任意の改変ポリメラーゼについて、分子生物学の基本原理に従って変異体をコードするヌクレオチド配列を得ることが可能である。例えば、９°Ｎポリメラーゼをコードする野生型ヌクレオチド配列が公知である場合、標準的遺伝暗号を使用して、１つ以上のアミノ酸置換を有する任意の所定の９°Ｎの変異体バージョンをコードするヌクレオチド配列を推定することが可能である。同様に、ヌクレオチド配列は、例えば、Ｖｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｐａｂポリメラーゼ等の他のポリメラーゼの変異体バージョンについて容易に導き出すことができる。次いで、必要なヌクレオチド配列を有する核酸分子は、当技術分野で公知の標準的な分子生物学技術を使用して構築し得る。
本開示はまた、本明細書に記載の改変ポリメラーゼをコードする核酸分子を含む。アミノ酸配列、好ましくはポリメラーゼをコードする野生型ヌクレオチド配列も公知であるポリメラーゼの変異体バージョンである任意の改変ポリメラーゼについて、分子生物学の基本原理に従って変異体をコードするヌクレオチド配列を得ることが可能である。例えば、９°Ｎポリメラーゼをコードする野生型ヌクレオチド配列が公知である場合、標準的遺伝暗号を使用して、１つ以上のアミノ酸置換を有する任意の所定の９°Ｎの変異体バージョンをコードするヌクレオチド配列を推定することが可能である。同様に、ヌクレオチド配列は、例えば、Ｖｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｐａｂポリメラーゼ等の他のポリメラーゼの変異体バージョンについて容易に導き出すことができる。次いで、必要なヌクレオチド配列を有する核酸分子は、当技術分野で公知の標準的な分子生物学技術を使用して構築し得る。
【0103】
本明細書に提示される実施形態によれば、定義された核酸は、同一の核酸のみならず、とりわけ保存的アミノ酸置換における縮重コードによって同義コドン（同じアミノ酸残基を特定する異なるコドン）の結果を生じる場合の置換が挙げられる、任意のマイナーな塩基バリエーションも含む。「核酸配列」の用語はまた、塩基バリエーションに関して与えられた任意の一本鎖配列に対する相補的配列を含む。
【0104】
本明細書に記載の核酸分子はまた、有利には、適した宿主中でそこからコードされるポリメラーゼタンパク質を発現するための適した発現ベクター中に含まれ得る。当該細胞のその後の形質転換および形質転換細胞のその後の選択のための適切な発現ベクター中へのクローン化ＤＮＡの取込みは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに提供されるように当業者に周知である。
【0105】
そのような発現ベクターは、当該ＤＮＡフラグメントの発現を有効化することが可能である、プロモーター領域等の調節配列に作動可能に連結された、本明細書に提示される実施形態による核酸を有するベクターを含む。「作動可能に連結された」の用語は、記載された構成要素がそれらが意図された方法で機能することを可能にする関係にある並置を指す。そのようなベクターは、本明細書に提示される実施形態にしたがってタンパク質の発現を提供するために適した宿主細胞に形質転換され得る。
【0106】
核酸分子は、成熟タンパク質またはプロ配列を有するタンパク質をコードし得、宿主細胞によって次いで切断されて成熟タンパク質を形成するプレタンパク質上のリーダー配列をコードするものが含まれる。ベクターは、例えば、複製起点、および任意で当該ヌクレオチドの発現のためのプロモーターおよび任意でプロモーターのレギュレーターを備えたプラスミド、ウイルスまたはファージベクターであり得る。ベクターは、例えば、抗生物質耐性遺伝子等の１つ以上の選択可能マーカーを含み得る。
【0107】
発現に必要な調節エレメントとしては、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、適切なレベルの転写開始を指示するプロモーター配列およびリボソーム結合のための翻訳開始配列が挙げられる。例えば、細菌発現ベクターは、ｌａｃプロモーター等のプロモーターを含み得、翻訳開始のために、Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ配列および開始コドンＡＵＧを含み得る。同様に、真核生物の発現ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの異種または同種プロモーター、下流ポリアデニル化シグナル、開始コドンＡＵＧ、およびリボソーム脱離のための終止コドンを含み得る。そのようなベクターは、商業的に入手するか、または当該分野で周知の方法によって記載される配列から組み立てることができる。
【0108】
高等真核生物によるポリメラーゼをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を含ませることによって最適化することができる。エンハンサーは、転写のレベルを増大させるためにプロモーターに作用するＤＮＡのシス作用エレメントである。ベクターは、概して選択可能マーカーに加えて複製起点も含むであろう。
【0109】
本開示はまた、ヌクレオチド取込み反応を実施するためのキットを提供する。キットは、本明細書に記載の少なくとも１つの改変ポリメラーゼおよび少なくとも１つのヌクレオチド取込み反応に十分な量の適切な包装材料中のヌクレオチド溶液を含む。任意で、改変ポリメラーゼおよびヌクレオチド溶液を使用するために必要なバッファーおよび溶液等の他の試薬も含まれる。パッケージ化されたコンポーネントの指示書も、典型的に含まれる。
【0110】
特定の実施形態では、ヌクレオチド溶液は、ラベル化ヌクレオチド類を含む。特定の実施形態では、ヌクレオチド類は、合成ヌクレオチドである。特定の実施形態では、ヌクレオチド類は、修飾ヌクレオチド類である。特定の実施形態において、修飾ヌクレオチドは、置換基が天然に生じる３’ヒドロキシル基よりもサイズが大きくなるように、３’糖ヒドロキシルにて修飾されている。特定の実施形態において、修飾ヌクレオチド類は、プリンまたはピリミジン塩基と、それに共有結合的に接合した除去可能な３’－ＯＨブロッキング基を有するリボースもしくはデオキシリボース糖部分とを含む修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシド分子を含み、その結果、３’炭素原子は、構造
－Ｏ－Ｚ
の基を接合したものとなり、
Ｚは、－Ｃ（Ｒ’）２－ＯＲ”、－Ｃ（Ｒ’）２－Ｎ（Ｒ”）２、－Ｃ（Ｒ’）２－Ｎ（Ｈ）Ｒ”、－Ｃ（Ｒ’）２－ＳＲ’および－Ｃ（Ｒ’）２－Ｆであり、
各Ｒ”は、除去可能な保護基であるか、またはその一部であり；
各Ｒ’は、独立して、水素原子、アルキル、置換されたアルキル、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロサイクリック、アシル、シアノ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシもしくはアミド基、または連結基を介して接合した検出可能なラベルであり；または、（Ｒ’）２は、式＝Ｃ（Ｒ’’’）２のアルキリデン基を表し、各Ｒ’’’は、同じであっても異なっていてもよく、水素およびハロゲン原子ならびにアルキル基を含む群から選択されれ；かつ
当該分子は、反応されて、各Ｒ”がＨと交換されているか、またはＺが－Ｃ（Ｒ’）２－Ｆである場合、ＦがＯＨ、ＳＨまたはＮＨ２、好ましくはＯＨと交換されている、中間体を生成してもよく、その中間体が、水性条件下で解離して、遊離の３’ＯＨを有する分子を与え；
ただし、Ｚが－Ｃ（Ｒ’）２－Ｓ－Ｒ”である場合、両方のＲ’基が、Ｈではない。
特定の実施形態において、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドのＲ’は、アルキルまたは置換されたアルキルである。特定の実施形態において、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドの－Ｚは、式－Ｃ（Ｒ’）２－Ｎ３のものである。特定の実施形態において、Ｚは、アジドメチル基である。
－Ｏ－Ｚ
の基を接合したものとなり、
Ｚは、－Ｃ（Ｒ’）２－ＯＲ”、－Ｃ（Ｒ’）２－Ｎ（Ｒ”）２、－Ｃ（Ｒ’）２－Ｎ（Ｈ）Ｒ”、－Ｃ（Ｒ’）２－ＳＲ’および－Ｃ（Ｒ’）２－Ｆであり、
各Ｒ”は、除去可能な保護基であるか、またはその一部であり；
各Ｒ’は、独立して、水素原子、アルキル、置換されたアルキル、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロサイクリック、アシル、シアノ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシもしくはアミド基、または連結基を介して接合した検出可能なラベルであり；または、（Ｒ’）２は、式＝Ｃ（Ｒ’’’）２のアルキリデン基を表し、各Ｒ’’’は、同じであっても異なっていてもよく、水素およびハロゲン原子ならびにアルキル基を含む群から選択されれ；かつ
当該分子は、反応されて、各Ｒ”がＨと交換されているか、またはＺが－Ｃ（Ｒ’）２－Ｆである場合、ＦがＯＨ、ＳＨまたはＮＨ２、好ましくはＯＨと交換されている、中間体を生成してもよく、その中間体が、水性条件下で解離して、遊離の３’ＯＨを有する分子を与え；
ただし、Ｚが－Ｃ（Ｒ’）２－Ｓ－Ｒ”である場合、両方のＲ’基が、Ｈではない。
特定の実施形態において、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドのＲ’は、アルキルまたは置換されたアルキルである。特定の実施形態において、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドの－Ｚは、式－Ｃ（Ｒ’）２－Ｎ３のものである。特定の実施形態において、Ｚは、アジドメチル基である。
【0111】
特定の実施形態において、修飾ヌクレオチド類は、それらの検出を可能にするために蛍光ラベルされる。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチド類は、切断可能なリンカーを介して検出可能なラベルに接合した塩基を有するヌクレオチドまたはヌクレオシドを含む。特定の実施形態において、検出可能なラベルは、蛍光ラベルを含む。
【0112】
本明細書で使用される場合、「包装材料」という語句は、キットの内容物を収容するために使用される１つ以上の物理的構造を指す。包装材料は、既知の方法によって、好ましくは無菌で汚染物質のない環境を提供するために、構築される。包装材料には、成分がヌクレオチド取込み反応を行うために使用することができることを示すラベルを有する。また、包装材料は、いかにしてキット内の材料を使用してヌクレオチド取込み反応を実行するかを示す指示を含む。本明細書で使用される場合、「包装」の用語は、ポリペプチドを一定の範囲内に保持することができる、ガラス、プラスチック、紙、ホイル等の固体マトリックスまたは材料を指す。「使用指示書」は、典型的に、試薬濃度または混合する試薬とサンプルの相対量、試薬／サンプル混合物のメンテナンス期間、温度、バッファー条件等の少なくとも１つのアッセイ方法パラメーターを説明する具体的な表現を含む。
【0113】
背景、例示的実施形態の詳細な説明、および本明細書の他の場所で引用される特許、特許文献、および刊行物の完全な開示は、それぞれが個別に組み込まれたかのように、参照によりそれらの全体が組み込まれる。
【0114】
本発明の例示的実施形態は、考察され、参照は、本発明の範囲内の可能な変形に対してなされてきている。本発明におけるこれらのおよび他の変形、組合せ、および改変は、本発明の範囲から逸脱することなく当業者に明らかであろうし、本発明が本明細書に記載の例示的実施形態に限定されないことを理解すべきである。よって、本発明は、以下に提供される特許請求の範囲およびそれらの均等物によってのみ限定されるべきである。
【実施例】
【0115】
本発明は、以下の例によって例示される。特定の例、材料、量、および手順は、本明細書に示される本発明の範囲および精神に従って広く解釈されるべきであることが理解されるべきである。
【0116】
（例１：一般的なアッセイ方法および条件）
特に断りのない限り、これは、本明細書に記載の実施例で使用される一般的なアッセイ条件を記載する。
特に断りのない限り、これは、本明細書に記載の実施例で使用される一般的なアッセイ条件を記載する。
【0117】
（Ａ．ポリメラーゼのクローニングおよび発現）
組換え核酸の作製、発現、および発現した産物の単離のための方法は、当該分野で公知であり記載されている。変異導入は、９°Ｎポリメラーゼ（配列番号１）をコードするコード領域で、標準の部位特異的変異導入方法論を使用して実施した。ＰＣＲベースのアプローチを使用して、変異したコード領域を増幅しＨｉｓタグを付加した。作製された各変異について、改変コード領域の適切な配列は、クローン化ＤＮＡの配列を決定することによって確認した。
組換え核酸の作製、発現、および発現した産物の単離のための方法は、当該分野で公知であり記載されている。変異導入は、９°Ｎポリメラーゼ（配列番号１）をコードするコード領域で、標準の部位特異的変異導入方法論を使用して実施した。ＰＣＲベースのアプローチを使用して、変異したコード領域を増幅しＨｉｓタグを付加した。作製された各変異について、改変コード領域の適切な配列は、クローン化ＤＮＡの配列を決定することによって確認した。
【0118】
Ｈｉｓタグ化変異体ポリメラーゼコード領域を、ｐＥＴ１１ａベクター中へサブクローニングし、ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）発現細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中へ形質転換した。シングルピックしたコロニー由来の一晩培養物を使用して、２．８Ｌフラスコに発現培養物を接種した。培養物を３７℃でＯＤ６００が約０．８になるまで増殖させ、次いで、タンパク質発現を０．２ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、その後４時間追加で増殖させた。培養物を７０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。精製まで細胞ペレットを－２０℃で保存した。
【0119】
ペレットを凍結融解し、製造者推奨に従ってＲｅａｄｙ－Ｌｙｓｅ試薬およびＯｍｎｉｃｌｅａｖｅ試薬（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）の存在下で５×ｗ／ｖ溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＢＭＥ、および５％グリセロール）で溶解した。最終ＮａＣｌ濃度を５００ｍＭに上げ、ライセートを氷上で５分間インキュベートした。遠心分離後、上清を８０℃で約７０分間インキュベートした。さらなる精製はすべて４℃で実施した。上清を３０分間氷結させた後、遠心分離し、５ｍＬ Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラム（ＧＥ）を使用して精製した。カラムは、バッファーＡ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５％グリセロール、５００ｍＭ ＮａＣｌ、および２０ｍＭイミダゾール）でプレ平衡化した。カラムは、２０から５００ｍＭまでのイミダゾールの７５ｍＬグラジエントを使用して溶出した。ピークフラクションをプールし、１０％グリセロールで希釈してＳＰバッファーＡ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５％グリセロール）の導電率に合致させ、５ｍＬ ＳＰセファロースカラム（ＧＥ）上へロードした。カラムは、１５０から１０００ｍＭまでのＮａＣｌの１００ｍＬグラジエントを使用して溶出した。ピークフラクションをプールし、保存バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＫＣＬ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、および５０％グリセロール）に透析し、－２０℃で保存した。
【0120】
（Ｂ．エラー率およびフェージング分析）
シーケンシング実験を使用して、エラー率およびフェージング値を比較した。特に明記しない限り、実験は、ＭｉｎｉＳｅｑ（商標）システム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、サンディエゴ、カリフォルニア）で、製造者の指示に従って実施した。例えば、各ポリメラーゼについて、個別の取込みミックス（ＩＭＸ）を調製し、短いラン（読取り１で３５サイクル）または長いラン（読取り１で１５１および読取り２で７６の２２７サイクルラン）で使用した。標準のポリメラーゼをテストされるポリメラーゼで置換し、９０μｇ／ｍＬの濃度で、標準のＭｉｎｉＳｅｑ Ｍｉｄ Ｏｕｔｐｕｔ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ製剤を使用した。フローセル上でのＩＭＸのインキュベーション時間を、本明細書の実施例に記載されているように変化させた。使用したＤＮＡライブラリーは、標準のＴｒｕＳｅｑ（商標）Ｎａｎｏプロトコール（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）に従って、３５０ｂｐターゲットインサートサイズで、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡを使用して、作製した；ＰｈｉＸ ＤＮＡ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ）を、結果として得られたライブラリーに～１：１０のモル比で添加した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＲＴＡ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して、両方のゲノムのエラー率、およびフェージングレベルを評価した。
シーケンシング実験を使用して、エラー率およびフェージング値を比較した。特に明記しない限り、実験は、ＭｉｎｉＳｅｑ（商標）システム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、サンディエゴ、カリフォルニア）で、製造者の指示に従って実施した。例えば、各ポリメラーゼについて、個別の取込みミックス（ＩＭＸ）を調製し、短いラン（読取り１で３５サイクル）または長いラン（読取り１で１５１および読取り２で７６の２２７サイクルラン）で使用した。標準のポリメラーゼをテストされるポリメラーゼで置換し、９０μｇ／ｍＬの濃度で、標準のＭｉｎｉＳｅｑ Ｍｉｄ Ｏｕｔｐｕｔ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ製剤を使用した。フローセル上でのＩＭＸのインキュベーション時間を、本明細書の実施例に記載されているように変化させた。使用したＤＮＡライブラリーは、標準のＴｒｕＳｅｑ（商標）Ｎａｎｏプロトコール（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）に従って、３５０ｂｐターゲットインサートサイズで、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡを使用して、作製した；ＰｈｉＸ ＤＮＡ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ）を、結果として得られたライブラリーに～１：１０のモル比で添加した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＲＴＡ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して、両方のゲノムのエラー率、およびフェージングレベルを評価した。
【0121】
（例２：改変ポリメラーゼのシーケンシング性能）
標準取込み時間下での短いランで使用された対照ポリメラーゼより実質的に大きくない、短い取込み時間下での短いランでのエラー率およびフェージングレベルを有する多数の改変ポリメラーゼを同定した。以下の表２は、Ｐｏｌ ８１２（配列番号８）によって表される対照ポリメラーゼと比較した、１４秒の取込み時間での表１にリストされた改変ポリメラーゼのシーケンシングパフォーマンスを比較する。改変ポリメラーゼを評価するために使用された品質メトリックスは、読取り１のフェージング率（「Ｒ１フェージング」）およびＥ．ｃｏｌｉ（「Ｅ．ｃｏｌｉエラー」）およびバクテリオファージＰｈｉＸ（「ＰｈｉＸエラー」）シーケンシング対照の累積エラー率であった。メトリックスは、標準（４６秒）取込み時間（「８１２ ＳＴＤ」）での対応するＰｏｌ ８１２フェージングおよびエラー率に正規化された。例えば、短い取込み時間でのＰｏｌ ８１２のＲ１フェージング率（「８１２ 急速」）は、標準取込み時間でのＲ１フェージングよりも６倍高く、一方で、累積Ｅ．ｃｏｌｉおよびＰｈｉＸエラー率は、それぞれ１２．５および６．４倍高い。同様に、短い取込み時間でのＰｏｌ ９６３（配列番号９）のＲ１フェージング率は、標準取込み時間でのＰｏｌ ８１２のＲ１フェージング率よりも５．９倍高く、一方で、Ｐｏｌ ９６３の累積Ｅ．ｃｏｌｉおよびＰｈｉＸエラー率は、それぞれ４．６倍および３．６倍高い。
標準取込み時間下での短いランで使用された対照ポリメラーゼより実質的に大きくない、短い取込み時間下での短いランでのエラー率およびフェージングレベルを有する多数の改変ポリメラーゼを同定した。以下の表２は、Ｐｏｌ ８１２（配列番号８）によって表される対照ポリメラーゼと比較した、１４秒の取込み時間での表１にリストされた改変ポリメラーゼのシーケンシングパフォーマンスを比較する。改変ポリメラーゼを評価するために使用された品質メトリックスは、読取り１のフェージング率（「Ｒ１フェージング」）およびＥ．ｃｏｌｉ（「Ｅ．ｃｏｌｉエラー」）およびバクテリオファージＰｈｉＸ（「ＰｈｉＸエラー」）シーケンシング対照の累積エラー率であった。メトリックスは、標準（４６秒）取込み時間（「８１２ ＳＴＤ」）での対応するＰｏｌ ８１２フェージングおよびエラー率に正規化された。例えば、短い取込み時間でのＰｏｌ ８１２のＲ１フェージング率（「８１２ 急速」）は、標準取込み時間でのＲ１フェージングよりも６倍高く、一方で、累積Ｅ．ｃｏｌｉおよびＰｈｉＸエラー率は、それぞれ１２．５および６．４倍高い。同様に、短い取込み時間でのＰｏｌ ９６３（配列番号９）のＲ１フェージング率は、標準取込み時間でのＰｏｌ ８１２のＲ１フェージング率よりも５．９倍高く、一方で、Ｐｏｌ ９６３の累積Ｅ．ｃｏｌｉおよびＰｈｉＸエラー率は、それぞれ４．６倍および３．６倍高い。
【0122】
【表2】
【0123】
短い取込み時間での相対フェージング率が３．０以下および累積エラー率が２．０以下であることを特徴とする改変ポリメラーゼは、急速ＳＢＳアプリケーションについて特に魅力的な候補を提示する。そのようなポリメラーゼの例は、表２に太字およびアスタリスクで示される。追加の結果は、図２および３に示す。
【0124】
図２は、Ｐｏｌ ８１２対照（左パネル）と比較した場合の実施例２で同定された改変ポリメラーゼの１つであるＰｏｌ １５５８（配列番号１１）によって示される短い取込み時間での減少したフェージングおよび累積エラー率を示す。２つの酵素は、標準的な取込み時間で同類のフェージングおよびエラー率を示す（右パネル）。
【0125】
図３Ａは、Ｐｏｌ ８１２およびＰｏｌ ９６３対照と比較した場合の実施例２で同定された選択された改変ポリメラーゼであるＰｏｌ １５５８、Ｐｏｌ １６７１（配列番号２３）、Ｐｏｌ １６８２（配列番号２５）、およびＰｏｌ １７４５（配列番号２８）によって示される短い取込み時間での減少したＲ１フェージングおよび累積Ｅ．ｃｏｌｉエラー率を示す。上部および下部パネルの破線は、標準取込み時間でＰｏｌ ８１２によって示された累積Ｅ．ｃｏｌｉエラーおよびＲ１フェージング率を示す。
【0126】
図３Ｂは、Ｐｏｌ ８１２およびＰｏｌ ９６３対照を参照しての同じ改変ポリメラーゼのフェージングおよびプレフェージング率を比較し、Ｐｏｌ １５５８、１６７１、１６８２、および１７４５によるフェージング率の減少を示す。
【0127】
（例３：長いラン条件下での改変ポリメラーゼの活性）
実施例２で同定された選択された改変ポリメラーゼを、異なるラン長を使用して評価した。標準取込み時間（４６秒）での改変ポリメラーゼのそれぞれの累積ＰｈｉＸエラー率を、長いシーケンシングラン（読取り１で２５０サイクルの後に読取り２で２５０サイクル、合計５００サイクル）の最中の短い取込み時間（２２秒）でのフェージングおよび累積エラー率と比較した。ラン条件がより長くなると、ランごとに、より多くの配列情報が得られ（即ち、より多くのヌクレオチド類の同一性が決定される）、例えばゲノム全体をシーケンスする場合に、シーケンシングプラットフォームで頻繁に使用される条件と同様となる。結果を図４に示す。
実施例２で同定された選択された改変ポリメラーゼを、異なるラン長を使用して評価した。標準取込み時間（４６秒）での改変ポリメラーゼのそれぞれの累積ＰｈｉＸエラー率を、長いシーケンシングラン（読取り１で２５０サイクルの後に読取り２で２５０サイクル、合計５００サイクル）の最中の短い取込み時間（２２秒）でのフェージングおよび累積エラー率と比較した。ラン条件がより長くなると、ランごとに、より多くの配列情報が得られ（即ち、より多くのヌクレオチド類の同一性が決定される）、例えばゲノム全体をシーケンスする場合に、シーケンシングプラットフォームで頻繁に使用される条件と同様となる。結果を図４に示す。
【0128】
図４は、長いシーケンシング読取り（２×２５０サイクル）の最中の標準および短い取込み時間でのＰｏｌ １５５０（配列番号１０）およびＰｏｌ １５５８（配列番号１１）の累積ＰｈｉＸエラー率を、Ｐｏｌ ８１２（配列番号８）対照のそれと比較する。両方の変異体は、ペアエンドターン後のエラー率の顕著な減少を示す。また、Ｐｏｌ １５５０は、最初の配列読取りの最中にＰｏｌ ８１２と比較してエラー率の大幅な減少を示す。
【0129】
（例４：ＮｏｖａＳｅｑ（商標）でのシーケンシングメトリックスの評価）
例２で同定された改変ポリメラーゼの１つであるＰｏｌ １６７１を、Ｓ１フローセルおよびＮｏｖａＳｅｑ（商標）シーケンシングケミストリーを使用して、ＩｌｌｕｍｉｎａのＮｏｖａＳｅｑ（商標）プラットフォームで評価した。エラー率、フェージングレベル、および他のシーケンシング品質メトリックスを、短いおよび標準の取込み時間での読取り１および２について決定した。Ｐｏｌ １６７１およびＰｏｌ ８１２の結果は、図１に要約される。
例２で同定された改変ポリメラーゼの１つであるＰｏｌ １６７１を、Ｓ１フローセルおよびＮｏｖａＳｅｑ（商標）シーケンシングケミストリーを使用して、ＩｌｌｕｍｉｎａのＮｏｖａＳｅｑ（商標）プラットフォームで評価した。エラー率、フェージングレベル、および他のシーケンシング品質メトリックスを、短いおよび標準の取込み時間での読取り１および２について決定した。Ｐｏｌ １６７１およびＰｏｌ ８１２の結果は、図１に要約される。
【0130】
図５Ａは、短い取込み時間（１０秒）で示されるＰｏｌ １６７１（配列番号２３）のＮｏｖａＳｅｑ（商標）シーケンシングメトリックスと、標準（４０秒）および短い（１０秒）取込み時間で示されたＰｏｌ ８１２（配列番号８）対照のそれらとの間の比較を示す。上部パネルは、フィルターを通過するクラスター（「クラスターＰＦ」）のパーセンテージを示す；下部パネルは、累積ＰｈｉＸエラー率を示す。明るい白丸は、標準取込み時間でのＰｏｌ ８１２メトリックスを示し、一方、暗い白丸は、短い取込み時間でのＰｏ ｌ８１２メトリックスを示す。黒丸で示された全てのＰｏｌ１６７１メトリックスは、短い取込み時間でのものある。結果は、Ｐｏｌ １６７１が、短い取込み時間での両方の読み取りで、標準取込み時間でのＰｏｌ ８１２と同類のパフォーマンスを示すことを示す。
【0131】
図５Ｂは、標準（４０秒）および短い（２２秒）取込み時間でのＮｏｖａＳｅｑ（商標）読取り１および２のＰｏｌ ８１２対象を参照してのＰｏｌ １６７１によって示された累積ＰｈｉＸエラー率、Ｑ３０値、およびフェージング率を要約する。Ｐｏｌ １６７１を使用した場合、両方の読取りのシーケンシング品質に大幅な向上が、観察された。
【0132】
本明細書で引用されるすべての特許、特許出願、および刊行物、ならびに電子的に入手可能な資料（例えば、ＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑでのヌクレオチド配列の提出、およびＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢなどでのアミノ酸配列の提出、およびＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑの注釈付きコーディング領域からの翻訳を含む）の完全な開示は、それらの全体が参照により組み込まれる。刊行物で参照されている補足資料（補足表、補足図、補足資料および方法、および／または補足実験データ等）も同様に、その全体が参照により組み込まれる。本出願の開示と、参照により本明細書に組み込まれる文書の開示との間に矛盾が存在する場合、本出願の開示が優先するものとする。前述の詳細な説明および例は、理解を明確にするためにのみ提供されてきている。そこから不必要な限定制を理解する必要はない。本発明は、示されおよび記載された正確な詳細に限定されず、当業者に明らかな変形が、特許請求の範囲によって定義される本発明に含まれるであろう。
【0133】
特に明記しない限り、本明細書および特許請求の範囲で使用される成分の量、分子量等を表す全ての数字は、すべての場合において「約」の用語によって修飾されるものとして理解すべきものである。したがって、特に明記しない限り、本明細書および特許請求の範囲に示される数値パラメーターは、本発明によって得られることが求められる所望の特性に応じて変化し得る近似である。少なくとも、均等論を特許請求の範囲の範囲に限定する試みとしてではなく、各数値パラメーターは、報告された有効桁数に照らして、通常の丸め手法を適用することによって少なくとも解釈されるべきである。
【0134】
本発明の広い範囲を示す数値範囲およびパラメーターが近似値であるにもかかわらず、特定の例に示される数値は、可能な限り正確に報告される。しかしながら、すべての数値は、それぞれのテスト測定で見いだされた標準偏差から必然的に生じる範囲を生来的に含む。
【0135】
すべての見出しは読者の便宜のためのものであり、特に明記されていない限り、見出しに続くテキストの意味を制限するために使用されるべきではない。
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図1-4】
【図1-5】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【配列表】