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特許7515672多重化した患者サンプル中のテストステロンのマススペクトロメトリーによる決定
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-07-04
(45)【発行日】2024-07-12
(54)【発明の名称】多重化した患者サンプル中のテストステロンのマススペクトロメトリーによる決定
(51)【国際特許分類】
G01N 27/62 20210101AFI20240705BHJP
G01N 30/06 20060101ALI20240705BHJP
G01N 30/72 20060101ALI20240705BHJP
G01N 33/74 20060101ALN20240705BHJP
C07J 1/00 20060101ALN20240705BHJP
【ＦＩ】
G01N27/62 V
G01N30/06 E
G01N30/72 C
G01N33/74
C07J1/00
【請求項の数】
14
(21)【出願番号】P 2023125964
(22)【出願日】2023-08-02
(62)【分割の表示】P 2020573092の分割
【原出願日】2019-03-15
(65)【公開番号】P2023164797
(43)【公開日】2023-11-14
【審査請求日】2023-08-02
(31)【優先権主張番号】62/644,351
(32)【優先日】2018-03-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】517308264
【氏名又は名称】クエスト ダイアグノスティックス インヴェストメンツ エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】230104019
【弁護士】
【氏名又は名称】大野 聖二
(74)【代理人】
【識別番号】100119183
【弁理士】
【氏名又は名称】松任谷 優子
(74)【代理人】
【識別番号】100149076
【弁理士】
【氏名又は名称】梅田 慎介
(74)【代理人】
【識別番号】100173185
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 裕
(74)【代理人】
【識別番号】100162503
【弁理士】
【氏名又は名称】今野 智介
(74)【代理人】
【識別番号】100144794
【弁理士】
【氏名又は名称】大木 信人
(72)【発明者】
【氏名】ゴールドマン，ミルドレッド エム．
(72)【発明者】
【氏名】ゴールドマン，スコット
(72)【発明者】
【氏名】コレティ，ジュリエット
(72)【発明者】
【氏名】クラーク，ニゲル
【審査官】赤木 貴則
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１１／０３０１０６３（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２００６／００４０２５６（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２０１７－５１９２２８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１４－５０５８６９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１４－５０７６５７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１７－５１４１０６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００２－０６０３４７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１５－１２１４０６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１５－１６６７４０（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１１／００３６１４４（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１２／０１２６１０７（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１６／００６１８４８（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１６／０３４９２２１（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特開２０１４－０１６３２９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１５－５０３７５３（ＪＰ，Ａ）
【文献】RHEA, Jeanne M. et al.，Direct total and free testosterone measurement by liquid chromatography tandem mass spectrometry acr，Clinical Biochemistry，2013年，46(7-8)，656-664，https://doi.org/10.1016/j.clinbiochem.2013.01.005
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ２７／６０－Ｇ０１Ｎ ２７／７０
Ｇ０１Ｎ ３０／００－Ｇ０１Ｎ ３０／９６
Ｇ０１Ｎ ３３／４８－Ｇ０１Ｎ ３３／９８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
単一のマススペクトロメトリーアッセイで、複数のヒトサンプルのそれぞれにおいて、テストステロンの量を決定する方法であって、ｉ）複数のヒトサンプルのそれぞれを、異なる誘導体化薬に付して、前記複数のサンプルのそれぞれにおいて個別に誘導体化されたテストステロンを生成すること、ここで、前記誘導体化薬は、塩化ヒドロキシルアミン及び塩化メトキシルアミンを含む、
ｉｉ）前記複数のサンプルを組み合わせて多重化サンプルを形成すること、
ｉｉｉ）前記複数のサンプルを液体クロマトグラフィーで精製すること、及び
ｉｖ）マススペクトロメトリーにより、各サンプル中のテストステロンの量を定量化すること
を含み、
前記方法の定量限界が、１ｎｇ／ｄＬ未満、又はそれに等しい、方法。
【請求項2】
前記液体クロマトグラフィーが、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記液体クロマトグラフィーが、高乱流液体クロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記マススペクトロメトリーが、加熱式エレクトロスプレーイオン化（ＨＥＳＩ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記ＨＥＳＩが、陽イオンモードである、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
３０４．１８±０．５及び３１８．２１±０．５からなる群から選択される質量対電荷の比を有する１つ又は複数の前駆イオンの量を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
１１２．０５±０．５、１２４．０５±０．５、１２６．０７±０．５、１３８．０７±０．５、及び１５２．０８±０．５からなる群から選択される質量対電荷の比を有する１つ又は複数のフラグメントイオンの量を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
内部標準を添加することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記内部標準が、同位体で標識されている、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
３０７．１９±０．５及び３２１．２１±０．５からなる群から選択される質量対電荷の比を有する１つ若しくは複数の内部標準前駆イオン、又は１２７．０６±０．５及び１２９．０７±０．５からなる群から選択される質量対電荷の比を有する１つ若しくは複数のプロダクトイオンの量を測定することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項11】
１ｎｇ／ｄＬ～２，０００ｎｇ／ｄＬの範囲にわたり定量の直線性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
完全に自動化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
抗体を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
前記サンプルが、血清である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連特許出願に対する相互参照
本出願は、２０１８年３月１６日出願の米国仮特許出願第６２／６４４，３５１号の利
益を主張し、参照によりその全体が本明細書に援用される。
本出願は、２０１８年３月１６日出願の米国仮特許出願第６２／６４４，３５１号の利
益を主張し、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【背景技術】
【0002】
テストステロン（４ アンドロステン １７β－オール－３－オン）はステロイドホル
モンであり、男性における主要なアンドロゲンである。男性におけるテストステロン低下
の主要な原因として、低ゴナドトロピン性性腺機能低下症、精巣機能不全、高プロラクチ
ン血症、下垂体機能低下症、いくつかの種類の肝臓及び腎臓の疾患、及び重要な疾病が挙
げられる。
モンであり、男性における主要なアンドロゲンである。男性におけるテストステロン低下
の主要な原因として、低ゴナドトロピン性性腺機能低下症、精巣機能不全、高プロラクチ
ン血症、下垂体機能低下症、いくつかの種類の肝臓及び腎臓の疾患、及び重要な疾病が挙
げられる。
【0003】
女性では、アンドロゲンのレベルが正常であれば、エストロゲン産生の基盤を提供し得
る。女性で血清テストステロンレベルが上昇すると、それは、様々な状態の中でもとりわ
け多嚢胞性卵巣症候群及び副腎皮質過形成症を示唆し得る。女性におけるテストステロン
過剰の臨床症状として、不妊症、多毛症、無月経症、及び肥満が挙げられる。
る。女性で血清テストステロンレベルが上昇すると、それは、様々な状態の中でもとりわ
け多嚢胞性卵巣症候群及び副腎皮質過形成症を示唆し得る。女性におけるテストステロン
過剰の臨床症状として、不妊症、多毛症、無月経症、及び肥満が挙げられる。
【0004】
テストステロンの正確且つ効率的な測定が必要とされる。
【発明の概要】
【0005】
本明細書において、異なる質量の少なくとも２つの異なる誘導体化薬を利用する、テス
トステロンをハイスループット定量する方法が提供される。
トステロンをハイスループット定量する方法が提供される。
【0006】
特定の実施形態では、１つのマススペクトロメトリーアッセイ内で、複数の患者サンプ
ルのそれぞれにおいて、テストステロンの量を検出する方法が、本明細書において提供さ
れる。方法は、各患者サンプルを個別に処理して、複数の処理済みのサンプルを形成する
ことであって、処理の結果として、各処理済みのサンプル中のテストステロンは、マスス
ペクトロメトリーにより、その他の処理済みのサンプル中のテストステロンから区別可能
であること；処理済みのサンプルを組み合わせて多重化サンプルを形成すること；マスス
ペクトロメトリーにより検出可能な１つ又は複数のイオンを生成するのに適する条件下で
、多重化サンプルをイオン源に付すことであって、各処理済みのサンプルに由来するテス
トステロンから生成した１つ又は複数のイオンは、その他の処理済みのサンプルに由来す
るテストステロンの１つ又は複数のイオンとは異なること；各処理済みのサンプルに由来
するテストステロンから得られた１つ又は複数のイオンの量をマススペクトロメトリーに
より検出すること；及び各処理済みのサンプルに由来するテストステロンから得られた１
つ又は複数のイオンの量を、各患者サンプル中のテストステロンの量と関連付けることを
含む。
ルのそれぞれにおいて、テストステロンの量を検出する方法が、本明細書において提供さ
れる。方法は、各患者サンプルを個別に処理して、複数の処理済みのサンプルを形成する
ことであって、処理の結果として、各処理済みのサンプル中のテストステロンは、マスス
ペクトロメトリーにより、その他の処理済みのサンプル中のテストステロンから区別可能
であること；処理済みのサンプルを組み合わせて多重化サンプルを形成すること；マスス
ペクトロメトリーにより検出可能な１つ又は複数のイオンを生成するのに適する条件下で
、多重化サンプルをイオン源に付すことであって、各処理済みのサンプルに由来するテス
トステロンから生成した１つ又は複数のイオンは、その他の処理済みのサンプルに由来す
るテストステロンの１つ又は複数のイオンとは異なること；各処理済みのサンプルに由来
するテストステロンから得られた１つ又は複数のイオンの量をマススペクトロメトリーに
より検出すること；及び各処理済みのサンプルに由来するテストステロンから得られた１
つ又は複数のイオンの量を、各患者サンプル中のテストステロンの量と関連付けることを
含む。
【0007】
特定の実施形態では、本明細書において提供される方法は、単一のマススペクトロメト
リーアッセイで、複数のヒトサンプルのそれぞれにおいて、テストステロンの量を決定す
ることを含み、同方法は、ｉ）複数のヒトサンプルのそれぞれを異なる誘導体化薬に付し
て、複数のサンプルのそれぞれにおいて個別に誘導体化されたテストステロンを生成する
こと；ｉｉ）複数のサンプルを組み合わせて多重化サンプルを形成すること；及びｉｉｉ
）マススペクトロメトリーにより、各サンプル中のテストステロンの量を定量化すること
を含む。
リーアッセイで、複数のヒトサンプルのそれぞれにおいて、テストステロンの量を決定す
ることを含み、同方法は、ｉ）複数のヒトサンプルのそれぞれを異なる誘導体化薬に付し
て、複数のサンプルのそれぞれにおいて個別に誘導体化されたテストステロンを生成する
こと；ｉｉ）複数のサンプルを組み合わせて多重化サンプルを形成すること；及びｉｉｉ
）マススペクトロメトリーにより、各サンプル中のテストステロンの量を定量化すること
を含む。
【0008】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、単一のマススペクトロ
メトリーアッセイで、２つのヒトサンプル中のテストステロンの量を決定することを含み
、同方法は、ｉ）２つのヒトサンプルのそれぞれを異なる誘導体化薬に付して、２つのサ
ンプルのそれぞれにおいて個別に誘導体化されたテストステロンを生成すること；ｉｉ）
２つのサンプルを組み合わせて多重化サンプルを形成すること；及びｉｉｉ）マススペク
トロメトリーにより、各サンプル中のテストステロンの量を定量化することを含む。
メトリーアッセイで、２つのヒトサンプル中のテストステロンの量を決定することを含み
、同方法は、ｉ）２つのヒトサンプルのそれぞれを異なる誘導体化薬に付して、２つのサ
ンプルのそれぞれにおいて個別に誘導体化されたテストステロンを生成すること；ｉｉ）
２つのサンプルを組み合わせて多重化サンプルを形成すること；及びｉｉｉ）マススペク
トロメトリーにより、各サンプル中のテストステロンの量を定量化することを含む。
【0009】
特定の実施形態では、本明細書において提供される誘導体化薬は、ヒドロキシルアミン
又はメトキシアミンを含む。
又はメトキシアミンを含む。
【0010】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、完全に自動化されてい
る。
る。
【0011】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、抗体を含まない方法で
ある。
ある。
【0012】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される精製することは、固相抽出（Ｓ
ＰＥ）を使用した血清の抽出を含む。いくつかの実施形態では、ＳＰＥは、陰イオン交換
固相抽出である。いくつかの実施形態では、ＳＰＥは、ミックスモード陰イオン交換固相
抽出である。いくつかの実施形態では、抽出後のサンプルは濃縮される。
ＰＥ）を使用した血清の抽出を含む。いくつかの実施形態では、ＳＰＥは、陰イオン交換
固相抽出である。いくつかの実施形態では、ＳＰＥは、ミックスモード陰イオン交換固相
抽出である。いくつかの実施形態では、抽出後のサンプルは濃縮される。
【0013】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される精製することは、液体クロマト
グラフィーを含む。いくつかの実施形態では、液体クロマトグラフィーは、高性能液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む。いくつかの実施形態では、液体クロマトグラフィ
ーは、高乱流液体クロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）を含む。
グラフィーを含む。いくつかの実施形態では、液体クロマトグラフィーは、高性能液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む。いくつかの実施形態では、液体クロマトグラフィ
ーは、高乱流液体クロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）を含む。
【0014】
好ましい実施形態では、イオン化は、加熱式エレクトロスプレーイオン化（ＨＥＳＩ）
を含む。好ましい実施形態では、イオン化は、ポジティブモードでイオン化することを含
む。いくつかの実施形態では、イオン化は、ネガティブモードでイオン化することを含む
。
を含む。好ましい実施形態では、イオン化は、ポジティブモードでイオン化することを含
む。いくつかの実施形態では、イオン化は、ネガティブモードでイオン化することを含む
。
【0015】
いくつかの実施形態では、イオン化は、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）を含む。いく
つかの実施形態では、イオン化は、ポジティブモードでイオン化することを含む。いくつ
かの実施形態では、イオン化は、ネガティブモードでイオン化することを含む。
つかの実施形態では、イオン化は、ポジティブモードでイオン化することを含む。いくつ
かの実施形態では、イオン化は、ネガティブモードでイオン化することを含む。
【0016】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、ヒドロキシルアミン誘
導体化テストステロンについて、３０４．１８±０．５の質量対電荷の比を有する前駆イ
オンの量を測定することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される
方法は、メトキシルアミン誘導体化テストステロンについて、３１８．２１±０．５の質
量対電荷の比を有する前駆イオンの量を測定することを含む。
導体化テストステロンについて、３０４．１８±０．５の質量対電荷の比を有する前駆イ
オンの量を測定することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される
方法は、メトキシルアミン誘導体化テストステロンについて、３１８．２１±０．５の質
量対電荷の比を有する前駆イオンの量を測定することを含む。
【0017】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、ヒドロキシルアミン誘
導体化テストステロンについて、１１２．０５±０．５又は１２４．０５±０．５の質量
対電荷の比を有するフラグメントイオンの量を測定することを含む。いくつかの実施形態
では、本明細書において提供される方法は、メトキシルアミン誘導体化テストステロンに
ついて、１２６．０７±０．５、１３８．０７±０．５又は１５２．０８±０．５の質量
対電荷の比を有するフラグメントイオンの量を測定することを含む。
導体化テストステロンについて、１１２．０５±０．５又は１２４．０５±０．５の質量
対電荷の比を有するフラグメントイオンの量を測定することを含む。いくつかの実施形態
では、本明細書において提供される方法は、メトキシルアミン誘導体化テストステロンに
ついて、１２６．０７±０．５、１３８．０７±０．５又は１５２．０８±０．５の質量
対電荷の比を有するフラグメントイオンの量を測定することを含む。
【0018】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、内部標準を添加するこ
とを更に含む。いくつかの実施形態では、内部標準は、同位体で標識されている。
とを更に含む。いくつかの実施形態では、内部標準は、同位体で標識されている。
【0019】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、３０７．１９±０．５
（ヒドロキシルアミン誘導体化の場合）若しくは３２１．２１±０．５（メトキシルアミ
ン誘導体化の場合）の質量対電荷の比を有する内部標準前駆イオン、及び／又は１２７．
０６±０．５（ヒドロキシルアミン誘導体化の場合）若しくは１２９．０７±０．５（メ
トキシルアミン誘導体化の場合）の質量対電荷の比を有するプロダクトイオンの量を測定
することを含む。
（ヒドロキシルアミン誘導体化の場合）若しくは３２１．２１±０．５（メトキシルアミ
ン誘導体化の場合）の質量対電荷の比を有する内部標準前駆イオン、及び／又は１２７．
０６±０．５（ヒドロキシルアミン誘導体化の場合）若しくは１２９．０７±０．５（メ
トキシルアミン誘導体化の場合）の質量対電荷の比を有するプロダクトイオンの量を測定
することを含む。
【0020】
特定の実施形態では、本明細書において提供されるサンプルの多重化は、単一アッセイ
又はカラムの多重化よりも少なくとも２倍高速である。特定の実施形態では、本明細書に
おいて提供されるサンプルの多重化は、単一アッセイよりも少なくとも３倍高速である。
特定の実施形態では、本明細書において提供されるサンプルの多重化は、単一アッセイよ
りも少なくとも４倍高速である。
又はカラムの多重化よりも少なくとも２倍高速である。特定の実施形態では、本明細書に
おいて提供されるサンプルの多重化は、単一アッセイよりも少なくとも３倍高速である。
特定の実施形態では、本明細書において提供されるサンプルの多重化は、単一アッセイよ
りも少なくとも４倍高速である。
【0021】
特定の実施形態では、方法の定量限界は、１０ｎｇ／ｄＬ未満、又はそれに等しい。い
くつかの実施形態では、方法の定量限界は、５ｎｇ／ｄＬ未満、又はそれに等しい。いく
つかの実施形態では、方法の定量限界は、４ｎｇ／ｄＬ未満、又はそれに等しい。いくつ
かの実施形態では、方法の定量限界は、３ｎｇ／ｄＬ未満、又はそれに等しい。いくつか
の実施形態では、方法の定量限界は、２ｎｇ／ｄＬ未満、又はそれに等しい。いくつかの
実施形態では、方法の定量限界は、１ｎｇ／ｄＬ未満、又はそれに等しい。
くつかの実施形態では、方法の定量限界は、５ｎｇ／ｄＬ未満、又はそれに等しい。いく
つかの実施形態では、方法の定量限界は、４ｎｇ／ｄＬ未満、又はそれに等しい。いくつ
かの実施形態では、方法の定量限界は、３ｎｇ／ｄＬ未満、又はそれに等しい。いくつか
の実施形態では、方法の定量限界は、２ｎｇ／ｄＬ未満、又はそれに等しい。いくつかの
実施形態では、方法の定量限界は、１ｎｇ／ｄＬ未満、又はそれに等しい。
【0022】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、２．５ｎｇ／ｄＬ～２
，０００ｎｇ／ｄＬの範囲にわたり定量の直線性を含む。いくつかの実施形態では、本明
細書において提供される方法は、１ｎｇ／ｄＬ～２，０００ｎｇ／ｄＬの範囲にわたり定
量の直線性を含む。
，０００ｎｇ／ｄＬの範囲にわたり定量の直線性を含む。いくつかの実施形態では、本明
細書において提供される方法は、１ｎｇ／ｄＬ～２，０００ｎｇ／ｄＬの範囲にわたり定
量の直線性を含む。
【0023】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、８～１，２００ｎｇ／
ｄＬにおいて、１％～１１％又は１％～９％又は２％～１１％の測定の不正確性（ＣＶ）
を含む。
ｄＬにおいて、１％～１１％又は１％～９％又は２％～１１％の測定の不正確性（ＣＶ）
を含む。
【0024】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、９０％～１１０％のう
ち、９５％から１０５％の回収率を含む。
ち、９５％から１０５％の回収率を含む。
【0025】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、最大１０，０００ｎｇ
／ｄＬの臨床的報告可能範囲（ＣＲＲ）を含む。
／ｄＬの臨床的報告可能範囲（ＣＲＲ）を含む。
【0026】
特定の実施形態では、サンプルは、体液である。いくつかの実施形態では、サンプルは
、血漿又は血清である。いくつかの実施形態では、サンプルは、全血である。いくつかの
実施形態では、サンプルは、唾液又は尿である。いくつかの実施形態では、サンプルは、
脳脊髄液（ＣＳＦ）である。
、血漿又は血清である。いくつかの実施形態では、サンプルは、全血である。いくつかの
実施形態では、サンプルは、唾液又は尿である。いくつかの実施形態では、サンプルは、
脳脊髄液（ＣＳＦ）である。
【0027】
いくつかの実施形態では、方法は、サンプルをタンパク質除去するのに十分な量で、薬
剤をサンプルに添加することを含み得る。
剤をサンプルに添加することを含み得る。
【0028】
適する試験サンプルとしては、目的とする分析物を含有し得る任意の試験サンプルが挙
げられる。いくつかの好ましい実施形態では、サンプルは、生体サンプルである；すなわ
ち、任意の生物起源物質、例えば動物、細胞培養物、臓器培養物等から得られるサンプル
である。特定の好ましい実施形態では、サンプルは、哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、ウマ
等から得られる。特に好ましい哺乳動物は、霊長類、最も好ましくは男性又は女性のヒト
である。特に好ましいサンプルとして、血液、血漿、血清、毛髪、筋肉、尿、唾液、涙、
脳脊髄液、又はその他の組織サンプルが挙げられる。そのようなサンプルは、例えば患者
；すなわち、疾患又は状態を診断、予測、又は処置するために、臨床現場において自己を
提示する生存者、男性又は女性から取得され得る。試験サンプルは、好ましくは患者、例
えば血清から得られる。
げられる。いくつかの好ましい実施形態では、サンプルは、生体サンプルである；すなわ
ち、任意の生物起源物質、例えば動物、細胞培養物、臓器培養物等から得られるサンプル
である。特定の好ましい実施形態では、サンプルは、哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、ウマ
等から得られる。特に好ましい哺乳動物は、霊長類、最も好ましくは男性又は女性のヒト
である。特に好ましいサンプルとして、血液、血漿、血清、毛髪、筋肉、尿、唾液、涙、
脳脊髄液、又はその他の組織サンプルが挙げられる。そのようなサンプルは、例えば患者
；すなわち、疾患又は状態を診断、予測、又は処置するために、臨床現場において自己を
提示する生存者、男性又は女性から取得され得る。試験サンプルは、好ましくは患者、例
えば血清から得られる。
【0029】
本明細書で用いる場合、別途記載がなければ、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ
」は、複数形の意味を含む。従って、例えば、「１つのタンパク質」と言う場合、複数の
タンパク質分子も含まれる。
」は、複数形の意味を含む。従って、例えば、「１つのタンパク質」と言う場合、複数の
タンパク質分子も含まれる。
【0030】
本明細書で用いる場合、用語「精製」又は「精製すること」とは、サンプルから目的と
する分析物以外のすべての物質を除去することを意味しない。むしろ、精製とは、目的と
する分析物の検出を妨害する可能性がある、サンプル中のその他の成分と比較して、目的
とする１つ又は複数の分析物の量を富化させる手順を意味する。サンプルは、本明細書で
は、１つ又は複数の妨害物質、例えば、マススペクトロメトリーによる、選択されたＴの
親及び娘イオンの検出を妨害する１つ又は複数の物質の除去を可能にする様々な手段によ
り精製される。
する分析物以外のすべての物質を除去することを意味しない。むしろ、精製とは、目的と
する分析物の検出を妨害する可能性がある、サンプル中のその他の成分と比較して、目的
とする１つ又は複数の分析物の量を富化させる手順を意味する。サンプルは、本明細書で
は、１つ又は複数の妨害物質、例えば、マススペクトロメトリーによる、選択されたＴの
親及び娘イオンの検出を妨害する１つ又は複数の物質の除去を可能にする様々な手段によ
り精製される。
【0031】
本明細書で用いる場合、用語「試験サンプル」とは、Ｔを含み得る任意のサンプルを指
す。本明細書で用いる場合、用語「体液」とは、個人の身体から単離可能な任意の液を意
味する。例えば、「体液」として、血液、血漿、血清、胆汁、唾液、尿、涙、汗等を挙げ
ることができる。
す。本明細書で用いる場合、用語「体液」とは、個人の身体から単離可能な任意の液を意
味する。例えば、「体液」として、血液、血漿、血清、胆汁、唾液、尿、涙、汗等を挙げ
ることができる。
【0032】
本明細書で用いる場合、用語「誘導体化すること」とは、２つの分子を反応させて新規
分子を形成することを意味する。誘導体化薬は、イソチオシアネート基、ジニトロフルオ
ロフェニル基、ニトロフェノキシカルボニル基、及び／又はフタルアルデヒド基等を含み
得る。
分子を形成することを意味する。誘導体化薬は、イソチオシアネート基、ジニトロフルオ
ロフェニル基、ニトロフェノキシカルボニル基、及び／又はフタルアルデヒド基等を含み
得る。
【0033】
本明細書で用いる場合、用語「クロマトグラフィー」とは、液体又は気体により搬送さ
れる化学的混合物が、静止した液相又は固相の周辺又は上方を流通する際に、化学的実体
の差動的分配の結果として成分に分離するプロセスを意味する。
れる化学的混合物が、静止した液相又は固相の周辺又は上方を流通する際に、化学的実体
の差動的分配の結果として成分に分離するプロセスを意味する。
【0034】
本明細書で用いる場合、用語「液体クロマトグラフィー」又は「ＬＣ」とは、微細な物
質からなるカラムを通じて、又はキャピラリー通路を通じて流体が均一に浸透する際に、
流体の溶液の１つ又は複数の成分が選択的に遅延するプロセスを意味する。遅延は、１つ
又は複数の固定相とバルク液（すなわち、移動相）の間で、この流体が固定相に対して相
対的に移動する際に生ずる、混合物中の成分の分配に起因する。「液体クロマトグラフィ
ー」の例として、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）、高性能液体クロマトグラフ
ィー（ＨＰＬＣ）、及び高乱流液体クロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）が挙げられる。
質からなるカラムを通じて、又はキャピラリー通路を通じて流体が均一に浸透する際に、
流体の溶液の１つ又は複数の成分が選択的に遅延するプロセスを意味する。遅延は、１つ
又は複数の固定相とバルク液（すなわち、移動相）の間で、この流体が固定相に対して相
対的に移動する際に生ずる、混合物中の成分の分配に起因する。「液体クロマトグラフィ
ー」の例として、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）、高性能液体クロマトグラフ
ィー（ＨＰＬＣ）、及び高乱流液体クロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）が挙げられる。
【0035】
本明細書で用いる場合、用語「高性能液体クロマトグラフィー」又は「ＨＰＬＣ」とは
、固定相、一般的には稠密充填カラムを通じて、加圧条件下で移動相に力を加えることに
より、分離度が増加する液体クロマトグラフィーを意味する。
、固定相、一般的には稠密充填カラムを通じて、加圧条件下で移動相に力を加えることに
より、分離度が増加する液体クロマトグラフィーを意味する。
【0036】
本明細書で用いる場合、用語「高乱流液体クロマトグラフィー」又は「ＨＴＬＣ」とは
、分離を実施する基本原理として、カラム充填材を通じてアッセイされる物質の乱流を活
用するクロマトグラフィーの一形態を意味する。ＨＴＬＣは、マススペクトロメトリーに
よる分析前に、２つの無名の薬物を含有するサンプルを調製するのに適用されてきた。例
えば、Ｚｉｍｍｅｒら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ８５４巻：２３～３５頁（１９９
９年）を参照；ＨＴＬＣについて更に説明する米国特許第５，９６８，３６７号、同第５
，９１９，３６８号、同第５，７９５，４６９号、及び同第５，７７２，８７４号も参照
。当業者は「乱流」について理解している。流体がゆっくりとスムーズに流れる場合、こ
の流れは「層流」と呼ばれる。例えば、ＨＰＬＣカラムを通じて、低い流速で移動する流
体は、層流である。層流内では、流体中の粒子の動きは規律正しく、粒子は直線的に移動
するのが一般的である。より高速では、水の慣性力が流体の摩擦力を上回り、その結果乱
流が生ずる。不規則な境界と接触しない流体は、摩擦により低速化した、又は不均等な表
面により向きが変わった流体を「追い越す」。流体が乱れた状態で流れるとき、ぐるぐる
渦巻いて（又は渦状に）流れ、流れが層状の場合よりもより「抵抗性」となる。どの場合
に流体の流れが層流又は乱流であるか判断するのに役立つ多くの参考資料が入手可能であ
る（例えば、Ｔｕｒｂｕｌｅｎｔ Ｆｌｏｗ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎ
ｔ ａｎｄ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ、Ｐ．Ｓ．Ｂｅｒｎａｒｄ＆Ｊ．Ｍ．Ｗａｌｌａｃｅ
、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、（２０００年）；Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕ
ｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｔｕｒｂｕｌｅｎｔ Ｆｌｏｗ Ｆｌｏｗ、Ｊｅａｎ Ｍａｔｈｉｅ
ｕ＆Ｊｕｌｉａｎ Ｓｃｏｔｔ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓ
ｓ（２００１年））。
、分離を実施する基本原理として、カラム充填材を通じてアッセイされる物質の乱流を活
用するクロマトグラフィーの一形態を意味する。ＨＴＬＣは、マススペクトロメトリーに
よる分析前に、２つの無名の薬物を含有するサンプルを調製するのに適用されてきた。例
えば、Ｚｉｍｍｅｒら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ８５４巻：２３～３５頁（１９９
９年）を参照；ＨＴＬＣについて更に説明する米国特許第５，９６８，３６７号、同第５
，９１９，３６８号、同第５，７９５，４６９号、及び同第５，７７２，８７４号も参照
。当業者は「乱流」について理解している。流体がゆっくりとスムーズに流れる場合、こ
の流れは「層流」と呼ばれる。例えば、ＨＰＬＣカラムを通じて、低い流速で移動する流
体は、層流である。層流内では、流体中の粒子の動きは規律正しく、粒子は直線的に移動
するのが一般的である。より高速では、水の慣性力が流体の摩擦力を上回り、その結果乱
流が生ずる。不規則な境界と接触しない流体は、摩擦により低速化した、又は不均等な表
面により向きが変わった流体を「追い越す」。流体が乱れた状態で流れるとき、ぐるぐる
渦巻いて（又は渦状に）流れ、流れが層状の場合よりもより「抵抗性」となる。どの場合
に流体の流れが層流又は乱流であるか判断するのに役立つ多くの参考資料が入手可能であ
る（例えば、Ｔｕｒｂｕｌｅｎｔ Ｆｌｏｗ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎ
ｔ ａｎｄ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ、Ｐ．Ｓ．Ｂｅｒｎａｒｄ＆Ｊ．Ｍ．Ｗａｌｌａｃｅ
、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、（２０００年）；Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕ
ｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｔｕｒｂｕｌｅｎｔ Ｆｌｏｗ Ｆｌｏｗ、Ｊｅａｎ Ｍａｔｈｉｅ
ｕ＆Ｊｕｌｉａｎ Ｓｃｏｔｔ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓ
ｓ（２００１年））。
【0037】
本明細書で用いる場合、用語「ガスクロマトグラフィー」又は「ＧＣ」とは、サンプル
混合物が気化され、そして液体又は微粒子固体から構成される固定相を含有するカラムを
通じて移動するキャリヤガス（窒素又はヘリウム）の流れの中に注入され、そして化合物
の固定相に対する親和性に基づき、その構成化合物に分離されるクロマトグラフィーを意
味する。
混合物が気化され、そして液体又は微粒子固体から構成される固定相を含有するカラムを
通じて移動するキャリヤガス（窒素又はヘリウム）の流れの中に注入され、そして化合物
の固定相に対する親和性に基づき、その構成化合物に分離されるクロマトグラフィーを意
味する。
【0038】
本明細書で用いる場合、用語「大型の粒子カラム」又は「抽出カラム」とは、約３５μ
ｍを上回る平均粒子径を含有するクロマトグラフィーカラムを意味する。この文脈で使用
される場合、用語「約」とは±１０％を意味する。好ましい実施形態では、カラムは、直
径約６０μｍの粒子を含有する。
ｍを上回る平均粒子径を含有するクロマトグラフィーカラムを意味する。この文脈で使用
される場合、用語「約」とは±１０％を意味する。好ましい実施形態では、カラムは、直
径約６０μｍの粒子を含有する。
【0039】
本明細書で用いる場合、用語「分析カラム」は、カラムから溶出するサンプル中の物質
について、分析物の存否又は量の決定を可能にするのに十分な分離を有効にする、十分な
クロマトグラフプレートを有するクロマトグラフィーカラムを意味する。そのようなカラ
ムは、更なる分析用として精製されたサンプルを取得するために、保持された物質を保持
されない物質から分離又は抽出するという一般的な目的を有する「抽出カラム」から多く
の場合区別される。この文脈で使用される場合、用語「約」とは、±１０％を意味する。
好ましい実施形態では、分析カラムは、直径約４μｍの粒子を含有する。
について、分析物の存否又は量の決定を可能にするのに十分な分離を有効にする、十分な
クロマトグラフプレートを有するクロマトグラフィーカラムを意味する。そのようなカラ
ムは、更なる分析用として精製されたサンプルを取得するために、保持された物質を保持
されない物質から分離又は抽出するという一般的な目的を有する「抽出カラム」から多く
の場合区別される。この文脈で使用される場合、用語「約」とは、±１０％を意味する。
好ましい実施形態では、分析カラムは、直径約４μｍの粒子を含有する。
【0040】
本明細書で用いる場合、例えば「オンライン自動化方式」又は「オンライン抽出」とし
て使用されるような用語「オンライン」又は「インライン」とは、オペレーターの介入を
必要とせずに実施される手順を意味する。対照的に、用語「オフライン」とは、本明細書
で用いる場合、オペレーターの手動介入を必要とする手順を意味する。従って、サンプル
が沈殿処理され、そして次に上清が手作業によりオートサンプラーにロードされる場合、
沈殿及びロードステップは後続ステップからオフラインの状態にある。本方法の様々な実
施形態では、１つ又は複数のステップが、オンライン自動化方式で実施され得る。
て使用されるような用語「オンライン」又は「インライン」とは、オペレーターの介入を
必要とせずに実施される手順を意味する。対照的に、用語「オフライン」とは、本明細書
で用いる場合、オペレーターの手動介入を必要とする手順を意味する。従って、サンプル
が沈殿処理され、そして次に上清が手作業によりオートサンプラーにロードされる場合、
沈殿及びロードステップは後続ステップからオフラインの状態にある。本方法の様々な実
施形態では、１つ又は複数のステップが、オンライン自動化方式で実施され得る。
【0041】
本明細書で用いる場合、用語「マススペクトロメトリー」又は「ＭＳ」とは、化合物を
その質量別に識別する分析技法を意味する。ＭＳは、イオンを、その質量対電荷の比、又
は「ｍ／ｚ」に基づきフィルター処理、検出、及び測定する方法を意味する。ＭＳ技術は
、（１）化合物をイオン化して、荷電した化合物を形成すること；及び（２）荷電した化
合物の分子量を検出し、そして質量対電荷の比を計算すること一般的に含む。化合物は、
任意の適する手段によりイオン化及び検出され得る。「質量分析装置」は、イオン化装置
及びイオン検出器を一般的に含む。一般的に、１つ又は複数の目的とする分子がイオン化
され、イオンがその後マススペクトログラフィック装置に導入され、そこでは磁場と電場
の組合せにより、イオンは、質量（「ｍ」）及び電荷（「ｚ」）に依存する空間内の経路
をたどる。例えば、「Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｆｒｏｍ Ｓｕｒｆａｃｅ
ｓ」と題する米国特許第６，２０４，５００号、「Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐａｒ
ａｔｕｓ ｆｏｒ Ｔａｎｄｅｍ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」と題する同第
６，１０７，６２３号、「ＤＮＡ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｂａｓｅｄ Ｏｎ Ｍａｓ
ｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」と題する同第６，２６８，１４４号、「Ｓｕｒｆａｃｅ
－Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ａｎｄ Ｒｅｌ
ｅａｓｅ Ｆｏｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ａｎａ
ｌｙｔｅｓ」と題する同第６，１２４，１３７号、Ｗｒｉｇｈｔら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ
Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、第２巻：２６４～７６
頁（１９９９年）；並びにＭｅｒｃｈａｎｔ及びＷｅｉｎｂｅｒｇｅｒ、Ｅｌｅｃｔｒｏ
ｐｈｏｒｅｓｉｓ、第２１巻：１１６４～６７頁（２０００年）を参照。
その質量別に識別する分析技法を意味する。ＭＳは、イオンを、その質量対電荷の比、又
は「ｍ／ｚ」に基づきフィルター処理、検出、及び測定する方法を意味する。ＭＳ技術は
、（１）化合物をイオン化して、荷電した化合物を形成すること；及び（２）荷電した化
合物の分子量を検出し、そして質量対電荷の比を計算すること一般的に含む。化合物は、
任意の適する手段によりイオン化及び検出され得る。「質量分析装置」は、イオン化装置
及びイオン検出器を一般的に含む。一般的に、１つ又は複数の目的とする分子がイオン化
され、イオンがその後マススペクトログラフィック装置に導入され、そこでは磁場と電場
の組合せにより、イオンは、質量（「ｍ」）及び電荷（「ｚ」）に依存する空間内の経路
をたどる。例えば、「Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｆｒｏｍ Ｓｕｒｆａｃｅ
ｓ」と題する米国特許第６，２０４，５００号、「Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐａｒ
ａｔｕｓ ｆｏｒ Ｔａｎｄｅｍ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」と題する同第
６，１０７，６２３号、「ＤＮＡ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｂａｓｅｄ Ｏｎ Ｍａｓ
ｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」と題する同第６，２６８，１４４号、「Ｓｕｒｆａｃｅ
－Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ａｎｄ Ｒｅｌ
ｅａｓｅ Ｆｏｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ａｎａ
ｌｙｔｅｓ」と題する同第６，１２４，１３７号、Ｗｒｉｇｈｔら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ
Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、第２巻：２６４～７６
頁（１９９９年）；並びにＭｅｒｃｈａｎｔ及びＷｅｉｎｂｅｒｇｅｒ、Ｅｌｅｃｔｒｏ
ｐｈｏｒｅｓｉｓ、第２１巻：１１６４～６７頁（２０００年）を参照。
【0042】
本明細書で用いる場合、用語「陰イオンモードでの操作」とは、陰イオンが生成及び検
出されるマススペクトロメトリー法を意味する。用語「陽イオンモードでの操作」とは、
本明細書で用いる場合、陽イオンが生成及び検出されるマススペクトロメトリー法を意味
する。
出されるマススペクトロメトリー法を意味する。用語「陽イオンモードでの操作」とは、
本明細書で用いる場合、陽イオンが生成及び検出されるマススペクトロメトリー法を意味
する。
【0043】
本明細書で用いる場合、用語「イオン化」又は「イオン化すること」とは、１又は複数
のエレクトロンユニットに等しい正味の電荷を有する分析物イオンを生成するプロセスを
意味する。陰イオンは、１又は複数のエレクトロンユニットの正味負電荷を有するイオン
である一方、陽イオンは、１又は複数のエレクトロンユニットの正味正電荷を有するイオ
ンである。
のエレクトロンユニットに等しい正味の電荷を有する分析物イオンを生成するプロセスを
意味する。陰イオンは、１又は複数のエレクトロンユニットの正味負電荷を有するイオン
である一方、陽イオンは、１又は複数のエレクトロンユニットの正味正電荷を有するイオ
ンである。
【0044】
本明細書で用いる場合、用語「電子イオン化法」又は「ＥＩ法」とは、気相〔gaseous
phase〕又は気相〔vapor phase〕の目的とする分析物が電子の流れと相互作用する方法を
意味する。分析物への電子の衝撃は分析物イオンを産生し、次にマススペクトロメトリー
技術の対象となり得る。
phase〕又は気相〔vapor phase〕の目的とする分析物が電子の流れと相互作用する方法を
意味する。分析物への電子の衝撃は分析物イオンを産生し、次にマススペクトロメトリー
技術の対象となり得る。
【0045】
本明細書で用いる場合、用語「化学イオン化法」又は「ＣＩ法」とは、試薬気体（例え
ば、アンモニア）が電子の衝撃を受け、そして試薬気体イオンと分析物分子との相互作用
により、分析物イオンが形成される方法を意味する。
ば、アンモニア）が電子の衝撃を受け、そして試薬気体イオンと分析物分子との相互作用
により、分析物イオンが形成される方法を意味する。
【0046】
本明細書で用いる場合、用語「高速原子衝撃法」又は「ＦＡＢ法」とは、高エネルギー
原子（多くの場合Ｘｅ又はＡｒ）のビームが、不揮発性サンプルに衝撃を与え、サンプル
に含まれる分子を脱離及びイオン化する方法を意味する。試験サンプルは、粘稠性の液体
マトリックス、例えばグリセロール、チオグリセロール、ｍ－ニトロベンジルアルコール
、１８－クラウン－６－クラウンエーテル、２－ニトロフェニルオクチルエーテル、スル
ホラン、ジエタノールアミン、及びトリエタノールアミン等に溶解する。化合物又はサン
プルに適するマトリックスの選択は、実験に基づいたプロセスである。
原子（多くの場合Ｘｅ又はＡｒ）のビームが、不揮発性サンプルに衝撃を与え、サンプル
に含まれる分子を脱離及びイオン化する方法を意味する。試験サンプルは、粘稠性の液体
マトリックス、例えばグリセロール、チオグリセロール、ｍ－ニトロベンジルアルコール
、１８－クラウン－６－クラウンエーテル、２－ニトロフェニルオクチルエーテル、スル
ホラン、ジエタノールアミン、及びトリエタノールアミン等に溶解する。化合物又はサン
プルに適するマトリックスの選択は、実験に基づいたプロセスである。
【0047】
本明細書で用いる場合、用語「マトリックス支援レーザー脱離イオン化法」又は「ＭＡ
ＬＤＩ」とは、光イオン化、プロトン化、脱プロトン化、及びクラスター崩壊を含む様々
なイオン化経路によって、不揮発性サンプルが、サンプル中の分析物を脱離及びイオン化
するレーザー照射に曝露される方法を意味する。ＭＡＬＤＩの場合、サンプルは、分析物
分子の脱離を促進するエネルギー吸収性マトリックスと混合される。
ＬＤＩ」とは、光イオン化、プロトン化、脱プロトン化、及びクラスター崩壊を含む様々
なイオン化経路によって、不揮発性サンプルが、サンプル中の分析物を脱離及びイオン化
するレーザー照射に曝露される方法を意味する。ＭＡＬＤＩの場合、サンプルは、分析物
分子の脱離を促進するエネルギー吸収性マトリックスと混合される。
【0048】
本明細書で用いる場合、用語「表面増強レーザー脱離イオン化法」又は「ＳＥＬＤＩ法
」とは、光イオン化、プロトン化、脱プロトン化、及びクラスター崩壊を含む様々なイオ
ン化経路によって、非揮発性サンプルが、サンプル中の分析物を脱離及びイオン化するレ
ーザー照射に曝露される別の方法を意味する。ＳＥＬＤＩでは、サンプルは、１つ又は複
数の目的とする分析物を優先的に保持する表面に一般的に結合する。ＭＡＬＤＩと同様に
、このプロセスも、イオン化を促進するために、エネルギー吸収性材料を利用し得る。
」とは、光イオン化、プロトン化、脱プロトン化、及びクラスター崩壊を含む様々なイオ
ン化経路によって、非揮発性サンプルが、サンプル中の分析物を脱離及びイオン化するレ
ーザー照射に曝露される別の方法を意味する。ＳＥＬＤＩでは、サンプルは、１つ又は複
数の目的とする分析物を優先的に保持する表面に一般的に結合する。ＭＡＬＤＩと同様に
、このプロセスも、イオン化を促進するために、エネルギー吸収性材料を利用し得る。
【0049】
本明細書で用いる場合、用語「エレクトロスプレーイオン化法」又は「ＥＳＩ法」は、
溶液が短尺のキャピラリー管に沿って通過し、そのキャピラリー管の端部に正又は負の高
電位が印加される方法を意味する。溶液が管の端部に到達すると気化（噴霧化）されて、
溶媒蒸気内で溶液の非常に小さい液滴からなるジェット又はスプレーとなる。この液滴の
ミストは、凝結を防止し、溶媒を蒸発させるためにわずかに加熱された蒸発チャンバーを
流通する。液滴がより小型になるに従い、表面電荷密度は増加し、やがて同一荷電間で自
然反発して、イオン並びに中性分子の放出が引き起こされる。
溶液が短尺のキャピラリー管に沿って通過し、そのキャピラリー管の端部に正又は負の高
電位が印加される方法を意味する。溶液が管の端部に到達すると気化（噴霧化）されて、
溶媒蒸気内で溶液の非常に小さい液滴からなるジェット又はスプレーとなる。この液滴の
ミストは、凝結を防止し、溶媒を蒸発させるためにわずかに加熱された蒸発チャンバーを
流通する。液滴がより小型になるに従い、表面電荷密度は増加し、やがて同一荷電間で自
然反発して、イオン並びに中性分子の放出が引き起こされる。
【0050】
本明細書で用いる場合、用語「大気圧化学イオン化法」又は「ＡＰＣＩ法」とは、ＥＳ
Ｉと類似する質量分析法を意味するが、しかしＡＰＣＩは、大気圧でプラズマ内に生ずる
イオン－分子反応によりイオンを産生する。プラズマは、スプレーキャピラリーと対電極
の間の放電により維持される。次にイオンは、差次的にポンプ搬送される一連のスキマー
ステージの使用により質量分析器中に一般的に抽出される。乾燥及び事前加熱されたＮ２
ガスの向流を使用して、溶媒の除去を改善することができる。極性がより低い種を分析す
る場合、ＡＰＣＩにおける気相イオン化の方がＥＳＩよりも有効であり得る。
Ｉと類似する質量分析法を意味するが、しかしＡＰＣＩは、大気圧でプラズマ内に生ずる
イオン－分子反応によりイオンを産生する。プラズマは、スプレーキャピラリーと対電極
の間の放電により維持される。次にイオンは、差次的にポンプ搬送される一連のスキマー
ステージの使用により質量分析器中に一般的に抽出される。乾燥及び事前加熱されたＮ２
ガスの向流を使用して、溶媒の除去を改善することができる。極性がより低い種を分析す
る場合、ＡＰＣＩにおける気相イオン化の方がＥＳＩよりも有効であり得る。
【0051】
用語「大気圧光イオン化法」又は「ＡＰＰＩ法」とは、本明細書で用いる場合、分子Ｍ
を光イオン化する機構が、分子イオンＭ＋を形成する光子吸収及び電子放出である質量分
析法の形態を意味する。光子エネルギーは、一般的にイオン化電位のすぐ上にあるので、
分子イオンは、それほど解離しやすくない。多くの場合、クロマトグラフィーを必要とせ
ずにサンプルを分析することができると考えられ、従ってかなりの時間及び出費が抑えら
れる。水蒸気又はプロトン性溶媒の存在下で、分子イオンは、Ｈを取り出してＭＨ＋を形
成することができる。これは、Ｍが高プロトン親和性を有する場合に生ずる傾向がある。
Ｍ＋とＭＨ＋の合計は一定なので、これは定量の正確性に影響を及ぼさない。プロトン性
溶媒中の薬物化合物は、通常ＭＨ＋として観察される一方、非極性化合物、例えばナフタ
レン又はテストステロン等は、通常Ｍ＋の形態を採る。Ｒｏｂｂ、Ｄ．Ｂ．、Ｃｏｖｅｙ
、Ｔ．Ｒ．及びＢｒｕｉｎｓ、Ａ．Ｐ．（２０００年）：例えば、Ｒｏｂｂら、Ａｔｍｏ
ｓｐｈｅｒｉｃ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｐｈｏｔｏｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：Ａｎ ｉｏｎｉ
ｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－
ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．第７２巻（１５号）：３６
５３～３６５９頁を参照。
を光イオン化する機構が、分子イオンＭ＋を形成する光子吸収及び電子放出である質量分
析法の形態を意味する。光子エネルギーは、一般的にイオン化電位のすぐ上にあるので、
分子イオンは、それほど解離しやすくない。多くの場合、クロマトグラフィーを必要とせ
ずにサンプルを分析することができると考えられ、従ってかなりの時間及び出費が抑えら
れる。水蒸気又はプロトン性溶媒の存在下で、分子イオンは、Ｈを取り出してＭＨ＋を形
成することができる。これは、Ｍが高プロトン親和性を有する場合に生ずる傾向がある。
Ｍ＋とＭＨ＋の合計は一定なので、これは定量の正確性に影響を及ぼさない。プロトン性
溶媒中の薬物化合物は、通常ＭＨ＋として観察される一方、非極性化合物、例えばナフタ
レン又はテストステロン等は、通常Ｍ＋の形態を採る。Ｒｏｂｂ、Ｄ．Ｂ．、Ｃｏｖｅｙ
、Ｔ．Ｒ．及びＢｒｕｉｎｓ、Ａ．Ｐ．（２０００年）：例えば、Ｒｏｂｂら、Ａｔｍｏ
ｓｐｈｅｒｉｃ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｐｈｏｔｏｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：Ａｎ ｉｏｎｉ
ｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－
ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．第７２巻（１５号）：３６
５３～３６５９頁を参照。
【0052】
本明細書で用いる場合、用語「誘導結合プラズマ法」又は「ＩＣＰ法」とは、ほとんど
の元素が微粒化及びイオン化されるような十分に高温度において、サンプルが部分的にイ
オン化した気体と相互作用する方法を意味する。
の元素が微粒化及びイオン化されるような十分に高温度において、サンプルが部分的にイ
オン化した気体と相互作用する方法を意味する。
【0053】
本明細書で用いる場合、用語「電界脱離法」とは、非揮発性の試験サンプルがイオン化
表面上に配置され、そして分析物イオンを生成するのに強電界が使用される方法を意味す
る。
表面上に配置され、そして分析物イオンを生成するのに強電界が使用される方法を意味す
る。
【0054】
本明細書で用いる場合、用語「脱離」とは、表面から分析物を取り出すこと、及び／又
は分析物を気相に導入することを意味する。
は分析物を気相に導入することを意味する。
【0055】
本明細書で用いる場合、用語「定量化限界〔limit of quantification〕」、「定量限
界〔limit of quantitation〕」、又は「ＬＯＱ」とは、測定が定量的に意味を有するよ
うになるポイントを意味する。このＬＯＱにおける分析物の応答は、識別可能であり、個
別的であり、並びに２０％の精密度及び８０％～１２０％の正確度で再現性を有する。
界〔limit of quantitation〕」、又は「ＬＯＱ」とは、測定が定量的に意味を有するよ
うになるポイントを意味する。このＬＯＱにおける分析物の応答は、識別可能であり、個
別的であり、並びに２０％の精密度及び８０％～１２０％の正確度で再現性を有する。
【0056】
本明細書で用いる場合、用語「検出限界」又は「ＬＯＤ」は、測定値が、それと関連し
た不確実性より大きくなるポイントである。ＬＯＤは、ゼロ濃度から２標準偏差（ＳＤ）
として任意に定義される。
た不確実性より大きくなるポイントである。ＬＯＤは、ゼロ濃度から２標準偏差（ＳＤ）
として任意に定義される。
【0057】
本明細書で用いる場合、体液サンプル中のＴの「量」とは、体液の容積内で検出可能な
Ｔの質量を反映する絶対値を一般的に意味する。但し、量は、別のＴの量と比較した相対
的な量についても考慮する。例えば、体液中のＴの量は、通常存在するＴの対照レベル又
は正常なレベルを上回る又はそれ未満である量であり得る。
Ｔの質量を反映する絶対値を一般的に意味する。但し、量は、別のＴの量と比較した相対
的な量についても考慮する。例えば、体液中のＴの量は、通常存在するＴの対照レベル又
は正常なレベルを上回る又はそれ未満である量であり得る。
【0058】
用語「約」とは、イオン質量測定を除き定量測定と関連して本明細書で用いる場合、表
示の数値±１０％を意味する。マススペクトロメトリー装置は、所与の分析物の質量を決
定する際に、ほとんど変化し得ない。用語「約」とは、イオンの質量又はイオンの質量／
電荷の比の文脈において、±０．５原子質量単位を意味する。
示の数値±１０％を意味する。マススペクトロメトリー装置は、所与の分析物の質量を決
定する際に、ほとんど変化し得ない。用語「約」とは、イオンの質量又はイオンの質量／
電荷の比の文脈において、±０．５原子質量単位を意味する。
【0059】
上記した本発明の概要は、非限定的であり、また本発明のその他の特性及び長所は、下
記の発明を実施するための形態から、及び特許請求の範囲から明白である。
記の発明を実施するための形態から、及び特許請求の範囲から明白である。
【図面の簡単な説明】
【0060】
【図1】図１は、多重化したテストステロンＬＣ－ＭＳ／ＭＳアッセイについて、分析ワークフローを示す。内部標準の、重同位体で標識されたＴが、処理期間中のサンプルの喪失を補正するのに使用される。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳは、ＴＳＱ（登録商標）Ｑｕａｎｔｕｍ Ｕｌｔｒａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）ＭＳ検出器を備えたＡｒｉａ ＴＸ－４ＬＣ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｆｒａｎｋｌｉｎ、ＭＡ）上で実施した。
【発明を実施するための形態】
【0061】
液体クロマトグラフィー－タンデム型質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）は、テストステロ
ン（Ｔ）を測定するためにこれまでに使用された技術よりも改善した正確性を提供する。
ハイスループットＬＣ－ＭＳ／ＭＳは、複数のサンプルが並行してランニングされるカラ
ムの多重化により実現される。ここでは、我々の目的は、１回のＬＣ－ＭＳ／ＭＳランに
つき少なくとも２つの患者サンプルを組み合わせることにより、スループットを更に増加
させることであった。「サンプルの多重化」の原理は、異なる質量の少なくとも２つの誘
導体化薬を使用することと関係する。患者サンプルは、一方又は他方の誘導体化薬を用い
て個別にタグ化される。各患者に対する結果は、誘導体化薬の特徴的なフラグメントの質
量により区別され、これにより１回のＬＣ－ＭＳ／ＭＳランで２つの個別の結果をもたら
す。
ン（Ｔ）を測定するためにこれまでに使用された技術よりも改善した正確性を提供する。
ハイスループットＬＣ－ＭＳ／ＭＳは、複数のサンプルが並行してランニングされるカラ
ムの多重化により実現される。ここでは、我々の目的は、１回のＬＣ－ＭＳ／ＭＳランに
つき少なくとも２つの患者サンプルを組み合わせることにより、スループットを更に増加
させることであった。「サンプルの多重化」の原理は、異なる質量の少なくとも２つの誘
導体化薬を使用することと関係する。患者サンプルは、一方又は他方の誘導体化薬を用い
て個別にタグ化される。各患者に対する結果は、誘導体化薬の特徴的なフラグメントの質
量により区別され、これにより１回のＬＣ－ＭＳ／ＭＳランで２つの個別の結果をもたら
す。
【0062】
特定の実施形態では、１つのマススペクトロメトリーアッセイ内で、複数の患者サンプ
ルのそれぞれにおいて、テストステロンの量を検出する方法が、本明細書において提供さ
れる。方法は、各患者サンプルを個別に処理して、複数の処理済みのサンプルを形成する
ことであって、処理の結果として、各処理済みのサンプル中のテストステロンは、マスス
ペクトロメトリーにより、その他の処理済みのサンプル中のテストステロンから区別可能
であること；処理済みのサンプルを組み合わせて多重化サンプルを形成すること；マスス
ペクトロメトリーにより検出可能な１つ又は複数のイオンを生成するのに適する条件下で
、多重化サンプルをイオン源に付すことであって、各処理済みのサンプルに由来するテス
トステロンから生成した１つ又は複数のイオンは、その他の処理済みのサンプルに由来す
るテストステロンの１つ又は複数のイオンとは異なること；各処理済みのサンプルに由来
するテストステロンから得られた１つ又は複数のイオンの量をマススペクトロメトリーに
より検出すること；及び各処理済みのサンプルに由来するテストステロンから得られた１
つ又は複数のイオンの量を、各患者サンプル中のテストステロンの量と関連付けることを
含む。
ルのそれぞれにおいて、テストステロンの量を検出する方法が、本明細書において提供さ
れる。方法は、各患者サンプルを個別に処理して、複数の処理済みのサンプルを形成する
ことであって、処理の結果として、各処理済みのサンプル中のテストステロンは、マスス
ペクトロメトリーにより、その他の処理済みのサンプル中のテストステロンから区別可能
であること；処理済みのサンプルを組み合わせて多重化サンプルを形成すること；マスス
ペクトロメトリーにより検出可能な１つ又は複数のイオンを生成するのに適する条件下で
、多重化サンプルをイオン源に付すことであって、各処理済みのサンプルに由来するテス
トステロンから生成した１つ又は複数のイオンは、その他の処理済みのサンプルに由来す
るテストステロンの１つ又は複数のイオンとは異なること；各処理済みのサンプルに由来
するテストステロンから得られた１つ又は複数のイオンの量をマススペクトロメトリーに
より検出すること；及び各処理済みのサンプルに由来するテストステロンから得られた１
つ又は複数のイオンの量を、各患者サンプル中のテストステロンの量と関連付けることを
含む。
【0063】
特定の実施形態では、本明細書において提供される方法は、単一のマススペクトロメト
リーアッセイで、複数のヒトサンプルのそれぞれにおいて、テストステロンの量を決定す
ることを含み、同方法は、ｉ）複数のヒトサンプルのそれぞれを異なる誘導体化薬に付し
て、複数のサンプルのそれぞれにおいて個別に誘導体化されたテストステロンを生成する
こと；ｉｉ）複数のサンプルを組み合わせて多重化サンプルを形成すること；及びｉｉｉ
）マススペクトロメトリーにより、各サンプル中のテストステロンの量を定量化すること
を含む。
リーアッセイで、複数のヒトサンプルのそれぞれにおいて、テストステロンの量を決定す
ることを含み、同方法は、ｉ）複数のヒトサンプルのそれぞれを異なる誘導体化薬に付し
て、複数のサンプルのそれぞれにおいて個別に誘導体化されたテストステロンを生成する
こと；ｉｉ）複数のサンプルを組み合わせて多重化サンプルを形成すること；及びｉｉｉ
）マススペクトロメトリーにより、各サンプル中のテストステロンの量を定量化すること
を含む。
【0064】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、単一のマススペクトロ
メトリーアッセイで、２つのヒトサンプル中のテストステロンの量を決定することを含み
、同方法は、ｉ）２つのヒトサンプルのそれぞれを異なる誘導体化薬に付して、２つのサ
ンプルのそれぞれにおいて個別に誘導体化されたテストステロンを生成すること；ｉｉ）
２つのサンプルを組み合わせて多重化サンプルを形成すること；及びｉｉｉ）マススペク
トロメトリーにより、各サンプル中のテストステロンの量を定量化することを含む。
メトリーアッセイで、２つのヒトサンプル中のテストステロンの量を決定することを含み
、同方法は、ｉ）２つのヒトサンプルのそれぞれを異なる誘導体化薬に付して、２つのサ
ンプルのそれぞれにおいて個別に誘導体化されたテストステロンを生成すること；ｉｉ）
２つのサンプルを組み合わせて多重化サンプルを形成すること；及びｉｉｉ）マススペク
トロメトリーにより、各サンプル中のテストステロンの量を定量化することを含む。
【0065】
特定の実施形態では、本明細書において提供される誘導体化薬は、ヒドロキシルアミン
又はメトキシアミンを含む。
又はメトキシアミンを含む。
【0066】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、完全に自動化されてい
る。
る。
【0067】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、抗体を含まない方法で
ある。
ある。
【0068】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される精製することは、固相抽出（Ｓ
ＰＥ）を使用した血清の抽出を含む。いくつかの実施形態では、ＳＰＥは、陰イオン交換
固相抽出である。いくつかの実施形態では、ＳＰＥは、ミックスモード陰イオン交換固相
抽出である。いくつかの実施形態では、抽出後のサンプルは濃縮される。
ＰＥ）を使用した血清の抽出を含む。いくつかの実施形態では、ＳＰＥは、陰イオン交換
固相抽出である。いくつかの実施形態では、ＳＰＥは、ミックスモード陰イオン交換固相
抽出である。いくつかの実施形態では、抽出後のサンプルは濃縮される。
【0069】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される精製することは、液体クロマト
グラフィーを含む。いくつかの実施形態では、液体クロマトグラフィーは、高性能液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む。いくつかの実施形態では、液体クロマトグラフィ
ーは、高乱流液体クロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）を含む。
グラフィーを含む。いくつかの実施形態では、液体クロマトグラフィーは、高性能液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む。いくつかの実施形態では、液体クロマトグラフィ
ーは、高乱流液体クロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）を含む。
【0070】
好ましい実施形態では、イオン化は、加熱式エレクトロスプレーイオン化（ＨＥＳＩ）
を含む。好ましい実施形態では、イオン化は、ポジティブモードでイオン化することを含
む。いくつかの実施形態では、イオン化は、ネガティブモードでイオン化することを含む
。
を含む。好ましい実施形態では、イオン化は、ポジティブモードでイオン化することを含
む。いくつかの実施形態では、イオン化は、ネガティブモードでイオン化することを含む
。
【0071】
いくつかの実施形態では、イオン化は、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）を含む。いく
つかの実施形態では、イオン化は、ポジティブモードでイオン化することを含む。いくつ
かの実施形態では、イオン化は、ネガティブモードでイオン化することを含む。
つかの実施形態では、イオン化は、ポジティブモードでイオン化することを含む。いくつ
かの実施形態では、イオン化は、ネガティブモードでイオン化することを含む。
【0072】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、ヒドロキシルアミン誘
導体化テストステロンについて、３０４．１８±０．５の質量対電荷の比を有する前駆イ
オンの量を測定することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される
方法は、メトキシルアミン誘導体化テストステロンについて、３１８．２１±０．５の質
量対電荷の比を有する前駆イオンの量を測定することを含む。
導体化テストステロンについて、３０４．１８±０．５の質量対電荷の比を有する前駆イ
オンの量を測定することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される
方法は、メトキシルアミン誘導体化テストステロンについて、３１８．２１±０．５の質
量対電荷の比を有する前駆イオンの量を測定することを含む。
【0073】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、ヒドロキシルアミン誘
導体化テストステロンについて、１１２．０５±０．５又は１２４．０５±０．５の質量
対電荷の比を有するフラグメントイオンの量を測定することを含む。いくつかの実施形態
では、本明細書において提供される方法は、メトキシルアミン誘導体化テストステロンに
ついて、１２６．０７±０．５、１３８．０７±０．５、又は１５２．０８±０．５の質
量対電荷の比を有するフラグメントイオンの量を測定することを含む。
導体化テストステロンについて、１１２．０５±０．５又は１２４．０５±０．５の質量
対電荷の比を有するフラグメントイオンの量を測定することを含む。いくつかの実施形態
では、本明細書において提供される方法は、メトキシルアミン誘導体化テストステロンに
ついて、１２６．０７±０．５、１３８．０７±０．５、又は１５２．０８±０．５の質
量対電荷の比を有するフラグメントイオンの量を測定することを含む。
【0074】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、内部標準を添加するこ
とを更に含む。いくつかの実施形態では、内部標準は、同位体で標識されている。
とを更に含む。いくつかの実施形態では、内部標準は、同位体で標識されている。
【0075】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、３０７．１９±０．５
（ヒドロキシルアミン誘導体化の場合）若しくは３２１．２１±０．５（メトキシルアミ
ン誘導体化の場合）の質量対電荷の比を有する内部標準前駆イオン、及び／又は１２７．
０６±０．５（ヒドロキシルアミン誘導体化の場合）若しくは１２９．０７±０．５（メ
トキシルアミン誘導体化の場合）の質量対電荷の比を有するプロダクトイオンの量を測定
することを含む。
（ヒドロキシルアミン誘導体化の場合）若しくは３２１．２１±０．５（メトキシルアミ
ン誘導体化の場合）の質量対電荷の比を有する内部標準前駆イオン、及び／又は１２７．
０６±０．５（ヒドロキシルアミン誘導体化の場合）若しくは１２９．０７±０．５（メ
トキシルアミン誘導体化の場合）の質量対電荷の比を有するプロダクトイオンの量を測定
することを含む。
【0076】
特定の実施形態では、本明細書において提供されるサンプルの多重化は、単一アッセイ
又はカラムの多重化よりも少なくとも２倍高速である。特定の実施形態では、本明細書に
おいて提供されるサンプルの多重化は、単一アッセイよりも少なくとも３倍高速である。
特定の実施形態では、本明細書において提供されるサンプルの多重化は、単一アッセイよ
りも少なくとも４倍高速である。
又はカラムの多重化よりも少なくとも２倍高速である。特定の実施形態では、本明細書に
おいて提供されるサンプルの多重化は、単一アッセイよりも少なくとも３倍高速である。
特定の実施形態では、本明細書において提供されるサンプルの多重化は、単一アッセイよ
りも少なくとも４倍高速である。
【0077】
特定の実施形態では、方法の定量限界は、１０ｎｇ／ｄＬ未満、又はそれに等しい。い
くつかの実施形態では、方法の定量限界は、５ｎｇ／ｄＬ未満、又はそれに等しい。いく
つかの実施形態では、方法の定量限界は、４ｎｇ／ｄＬ未満、又はそれに等しい。いくつ
かの実施形態では、方法の定量限界は、３ｎｇ／ｄＬ未満、又はそれに等しい。いくつか
の実施形態では、方法の定量限界は、２ｎｇ／ｄＬ未満、又はそれに等しい。いくつかの
実施形態では、方法の定量限界は、１ｎｇ／ｄＬ未満、又はそれに等しい。
くつかの実施形態では、方法の定量限界は、５ｎｇ／ｄＬ未満、又はそれに等しい。いく
つかの実施形態では、方法の定量限界は、４ｎｇ／ｄＬ未満、又はそれに等しい。いくつ
かの実施形態では、方法の定量限界は、３ｎｇ／ｄＬ未満、又はそれに等しい。いくつか
の実施形態では、方法の定量限界は、２ｎｇ／ｄＬ未満、又はそれに等しい。いくつかの
実施形態では、方法の定量限界は、１ｎｇ／ｄＬ未満、又はそれに等しい。
【0078】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、１ｎｇ／ｄＬ～２，０
００ｎｇ／ｄＬの範囲にわたり定量の直線性を含む。
００ｎｇ／ｄＬの範囲にわたり定量の直線性を含む。
【0079】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、８～１，２００ｎｇ／
ｄＬにおいて、１％～１１％又は１％～９％又は２％～１１％の測定の不正確性（ＣＶ）
を含む。
ｄＬにおいて、１％～１１％又は１％～９％又は２％～１１％の測定の不正確性（ＣＶ）
を含む。
【0080】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、９０％～１１０％のう
ち、９５％から１０５％の回収率を含む。
ち、９５％から１０５％の回収率を含む。
【0081】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、最大１０，０００ｎｇ
／ｄＬの臨床的報告可能範囲（ＣＲＲ）を含む。
／ｄＬの臨床的報告可能範囲（ＣＲＲ）を含む。
【0082】
特定の実施形態では、サンプルは、体液である。いくつかの実施形態では、サンプルは
、血漿又は血清である。いくつかの実施形態では、サンプルは、全血である。いくつかの
実施形態では、サンプルは、唾液又は尿である。いくつかの実施形態では、サンプルは、
脳脊髄液（ＣＳＦ）である。
、血漿又は血清である。いくつかの実施形態では、サンプルは、全血である。いくつかの
実施形態では、サンプルは、唾液又は尿である。いくつかの実施形態では、サンプルは、
脳脊髄液（ＣＳＦ）である。
【0083】
いくつかの実施形態では、方法は、サンプルをタンパク質除去するのに十分な量で、薬
剤をサンプルに添加することを含み得る。
剤をサンプルに添加することを含み得る。
【0084】
適する試験サンプルは、目的とする分析物を含有し得る任意の試験サンプルを含む。い
くつかの好ましい実施形態では、サンプルは、生体サンプルである；すなわち、任意の生
物起源物質、例えば動物、細胞培養物、臓器培養物等から得られるサンプルである。特定
の好ましい実施形態では、サンプルは、哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、ウマ等から得られ
る。特に好ましい哺乳動物は、霊長類、最も好ましくは男性又は女性のヒトである。特に
好ましいサンプルとして、血液、血漿、血清、毛髪、筋肉、尿、唾液、涙、脳脊髄液、又
はその他の組織サンプルが挙げられる。そのようなサンプルは、例えば患者；すなわち、
疾患又は状態を診断、予測、又は処置するために、臨床現場において自己を提示する生存
者、男性又は女性から取得され得る。試験サンプルは、好ましくは患者から得られ、例え
ば血清である。
くつかの好ましい実施形態では、サンプルは、生体サンプルである；すなわち、任意の生
物起源物質、例えば動物、細胞培養物、臓器培養物等から得られるサンプルである。特定
の好ましい実施形態では、サンプルは、哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、ウマ等から得られ
る。特に好ましい哺乳動物は、霊長類、最も好ましくは男性又は女性のヒトである。特に
好ましいサンプルとして、血液、血漿、血清、毛髪、筋肉、尿、唾液、涙、脳脊髄液、又
はその他の組織サンプルが挙げられる。そのようなサンプルは、例えば患者；すなわち、
疾患又は状態を診断、予測、又は処置するために、臨床現場において自己を提示する生存
者、男性又は女性から取得され得る。試験サンプルは、好ましくは患者から得られ、例え
ば血清である。
【0085】
マススペクトロメトリーのためのサンプル調製
サンプル中のその他の成分（例えば、タンパク質）と比較してそれよりもＴを富化させ
るのに利用可能である方法として、例えば、フィルター処理法、遠心分離法、薄層クロマ
トグラフィー（ＴＬＣ）法、キャピラリー電気泳動法を含む電気泳動法、免疫親和性分離
法を含む親和性分離法、酢酸エチル抽出法及びメタノール抽出法を含む抽出法、及びカオ
トロピック薬剤の使用、又は上記の任意の組合せ等が挙げられる。
サンプル中のその他の成分（例えば、タンパク質）と比較してそれよりもＴを富化させ
るのに利用可能である方法として、例えば、フィルター処理法、遠心分離法、薄層クロマ
トグラフィー（ＴＬＣ）法、キャピラリー電気泳動法を含む電気泳動法、免疫親和性分離
法を含む親和性分離法、酢酸エチル抽出法及びメタノール抽出法を含む抽出法、及びカオ
トロピック薬剤の使用、又は上記の任意の組合せ等が挙げられる。
【0086】
タンパク質沈殿法は、試験サンプルを調製する１つの好ましい方法である。そのような
タンパク質精製法は、当技術分野に周知であり、例えば、Ｐｏｌｓｏｎらの、Ｊｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ、第７８５巻：２６３～２７５頁（２０
０３年）は、本方法で使用するのに適するタンパク質沈殿技術について記載する。タンパ
ク質沈殿法は、上清にＴを残して、サンプルからほとんどのタンパク質を取り除くのに利
用可能である。サンプルは、沈殿したタンパク質から液体上清を分離するために遠心分離
され得る。得られた上清は、次に、液体クロマトグラフィー及び後続するマススペクトロ
メトリー分析に適用され得る。特定の実施形態では、タンパク質沈殿法、例えばアセトニ
トリルタンパク質沈殿法等を使用すれば、ＨＰＬＣ及びマススペクトロメトリーを行う前
に、高乱流液体クロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）又はその他のオンライン抽出を行う必要
がなくなる。従って、そのような実施形態では、方法は、（１）目的とするサンプルのタ
ンパク質沈殿を実施すること；及び（２）オンライン抽出又は高乱流液体クロマトグラフ
ィー（ＨＴＬＣ）を使用することなく、上清をＨＰＬＣ－質量分析装置に直接ロードする
ことと関係する。
タンパク質精製法は、当技術分野に周知であり、例えば、Ｐｏｌｓｏｎらの、Ｊｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ、第７８５巻：２６３～２７５頁（２０
０３年）は、本方法で使用するのに適するタンパク質沈殿技術について記載する。タンパ
ク質沈殿法は、上清にＴを残して、サンプルからほとんどのタンパク質を取り除くのに利
用可能である。サンプルは、沈殿したタンパク質から液体上清を分離するために遠心分離
され得る。得られた上清は、次に、液体クロマトグラフィー及び後続するマススペクトロ
メトリー分析に適用され得る。特定の実施形態では、タンパク質沈殿法、例えばアセトニ
トリルタンパク質沈殿法等を使用すれば、ＨＰＬＣ及びマススペクトロメトリーを行う前
に、高乱流液体クロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）又はその他のオンライン抽出を行う必要
がなくなる。従って、そのような実施形態では、方法は、（１）目的とするサンプルのタ
ンパク質沈殿を実施すること；及び（２）オンライン抽出又は高乱流液体クロマトグラフ
ィー（ＨＴＬＣ）を使用することなく、上清をＨＰＬＣ－質量分析装置に直接ロードする
ことと関係する。
【0087】
いくつかの好ましい実施形態では、ＨＰＬＣは、単独で、又は１つ若しくは複数の精製
法と組み合わせて、マススペクトロメトリーの前にＴを精製するのに利用可能である。そ
のような実施形態では、サンプルは、分析物を捕捉するＨＰＬＣ抽出カートリッジを使用
して抽出され、次に溶出され、そして第２のＨＰＬＣカラム上でクロマトグラフされ得る
、又はイオン化前に分析用ＨＰＬＣカラム上に溶出され得る。このようなクロマトグラフ
ィー手順に関与するステップは、自動化方式で連結可能であるので、分析物の精製期間中
にオペレーターが関与する必要性は、最低限に抑えることができる。このような特性は、
その結果、時間とコストの節約をもたらし、またオペレーターがミスする機会を取り除く
ことができる。
法と組み合わせて、マススペクトロメトリーの前にＴを精製するのに利用可能である。そ
のような実施形態では、サンプルは、分析物を捕捉するＨＰＬＣ抽出カートリッジを使用
して抽出され、次に溶出され、そして第２のＨＰＬＣカラム上でクロマトグラフされ得る
、又はイオン化前に分析用ＨＰＬＣカラム上に溶出され得る。このようなクロマトグラフ
ィー手順に関与するステップは、自動化方式で連結可能であるので、分析物の精製期間中
にオペレーターが関与する必要性は、最低限に抑えることができる。このような特性は、
その結果、時間とコストの節約をもたらし、またオペレーターがミスする機会を取り除く
ことができる。
【0088】
例えば、ＨＴＬＣカラムや諸方法等が引き起こす乱流は、物質移動速度を増強する可能
性があり、分離特性を改善すると考えられている。ＨＴＬＣカラムは、剛性粒子を含有す
る充填カラムを通じた、クロマトグラフィーの高い流速によって成分を分離する。高速流
速（例えば、３～５ｍＬ／分）を利用することにより、乱流がカラム内に生じ、固定相と
目的とする分析物の間でほぼ完全な相互作用を引き起こす。ＨＴＬＣカラムを使用する長
所として、高分子量の種は、乱流条件下では保持されないので、生体液マトリックスと関
連した高分子の蓄積が回避されることが挙げられる。１つの手順において複数の分離法を
組み合わせるＨＴＬＣ法では、サンプル調製を長時間行う必要性が低下し、また著しく高
速で作動する。そのような方法は、層流（ＨＰＬＣ）クロマトグラフィーよりも優れた分
離性能も実現する。ＨＴＬＣは、生体サンプル（血漿、尿、等）の直接注入を可能にする
。直接注入する場合、変性したタンパク質及びその他の生物学的デブリが分離カラムを急
速にブロックするので、従来型のクロマトグラフィーでは実現が難しい。また、ＨＴＬＣ
は、１ｍＬ未満、好ましくは０．５ｍＬ未満、好ましくは０．２ｍＬ未満、好ましくは０
．１ｍＬの非常に少ないサンプルボリュームも可能にする。
性があり、分離特性を改善すると考えられている。ＨＴＬＣカラムは、剛性粒子を含有す
る充填カラムを通じた、クロマトグラフィーの高い流速によって成分を分離する。高速流
速（例えば、３～５ｍＬ／分）を利用することにより、乱流がカラム内に生じ、固定相と
目的とする分析物の間でほぼ完全な相互作用を引き起こす。ＨＴＬＣカラムを使用する長
所として、高分子量の種は、乱流条件下では保持されないので、生体液マトリックスと関
連した高分子の蓄積が回避されることが挙げられる。１つの手順において複数の分離法を
組み合わせるＨＴＬＣ法では、サンプル調製を長時間行う必要性が低下し、また著しく高
速で作動する。そのような方法は、層流（ＨＰＬＣ）クロマトグラフィーよりも優れた分
離性能も実現する。ＨＴＬＣは、生体サンプル（血漿、尿、等）の直接注入を可能にする
。直接注入する場合、変性したタンパク質及びその他の生物学的デブリが分離カラムを急
速にブロックするので、従来型のクロマトグラフィーでは実現が難しい。また、ＨＴＬＣ
は、１ｍＬ未満、好ましくは０．５ｍＬ未満、好ましくは０．２ｍＬ未満、好ましくは０
．１ｍＬの非常に少ないサンプルボリュームも可能にする。
【0089】
マススペクトロメトリーによる分析前に、サンプル調製に適用されるＨＴＬＣの例は、
別途記載されている。例えば、Ｚｉｍｍｅｒら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ８５４巻
：２３～３５頁（１９９９年）を参照；米国特許第５，９６８，３６７号；同第５，９１
９，３６８号；同第５，７９５，４６９号；及び同第５，７７２，８７４号も参照。本方
法の特定の実施形態では、サンプルは、ＨＴＬＣカラムにロードする前に上記のようなタ
ンパク質沈殿処理がなされる；代替的な好ましい実施形態では、サンプルは、タンパク質
沈殿処理されることなく、ＨＴＬＣ上に直接ロードされ得る。ＨＴＬＣ抽出カラムは、好
ましくは大型の粒子カラムである。様々な実施形態では、方法の１つ又は複数のステップ
は、オンラインの自動化された方式で実施され得る。例えば、１つの実施形態では、ステ
ップ（ｉ）～（ｖ）は、オンラインの自動化された方式で実施される。別の場合、イオン
化及び検出のステップは、ステップ（ｉ）～（ｖ）の後に、オンラインで実施される。
別途記載されている。例えば、Ｚｉｍｍｅｒら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ８５４巻
：２３～３５頁（１９９９年）を参照；米国特許第５，９６８，３６７号；同第５，９１
９，３６８号；同第５，７９５，４６９号；及び同第５，７７２，８７４号も参照。本方
法の特定の実施形態では、サンプルは、ＨＴＬＣカラムにロードする前に上記のようなタ
ンパク質沈殿処理がなされる；代替的な好ましい実施形態では、サンプルは、タンパク質
沈殿処理されることなく、ＨＴＬＣ上に直接ロードされ得る。ＨＴＬＣ抽出カラムは、好
ましくは大型の粒子カラムである。様々な実施形態では、方法の１つ又は複数のステップ
は、オンラインの自動化された方式で実施され得る。例えば、１つの実施形態では、ステ
ップ（ｉ）～（ｖ）は、オンラインの自動化された方式で実施される。別の場合、イオン
化及び検出のステップは、ステップ（ｉ）～（ｖ）の後に、オンラインで実施される。
【0090】
高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む液体クロマトグラフィー（ＬＣ）は
、比較的低速の層流技術に基づく。従来型のＨＰＬＣ分析法は、カラムを通過するサンプ
ルの層流が、サンプルから目的とする分析物を分離する基礎となる、カラム充填材に依存
する。当業者は、そのようなカラムにおける分離は、拡散プロセスであると理解している
。ＨＰＬＣは、生体サンプル中の化合物の分離に問題なく適用されるが、かなりの量のサ
ンプル調製が、分離及び質量分析装置（ＭＳ）によるその後の分析の前に必要とされ、こ
の技術を労働集約的なものとしている。更に、ほとんどのＨＰＬＣシステムは、質量分析
装置をその能力の最大限まで活用しておらず、１つのＨＰＬＣシステムが１つのＭＳ装置
に接続可能としているにすぎず、その結果、多数のアッセイを実施するのに冗長な時間を
必要とする。
、比較的低速の層流技術に基づく。従来型のＨＰＬＣ分析法は、カラムを通過するサンプ
ルの層流が、サンプルから目的とする分析物を分離する基礎となる、カラム充填材に依存
する。当業者は、そのようなカラムにおける分離は、拡散プロセスであると理解している
。ＨＰＬＣは、生体サンプル中の化合物の分離に問題なく適用されるが、かなりの量のサ
ンプル調製が、分離及び質量分析装置（ＭＳ）によるその後の分析の前に必要とされ、こ
の技術を労働集約的なものとしている。更に、ほとんどのＨＰＬＣシステムは、質量分析
装置をその能力の最大限まで活用しておらず、１つのＨＰＬＣシステムが１つのＭＳ装置
に接続可能としているにすぎず、その結果、多数のアッセイを実施するのに冗長な時間を
必要とする。
【0091】
マススペクトロメトリー分析前のサンプル除去を目的としたＨＰＬＣの使用について、
様々な方法が記載されている。例えば、Ｔａｙｌｏｒら、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒ
ｕｇ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ、第２２巻：６０８～１２頁（２０００年）；及びＳａｌｍ
ら、Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、２２巻Ｓｕｐｌ．Ｂ：Ｂ７１～Ｂ８５頁（２
０００年）を参照。
様々な方法が記載されている。例えば、Ｔａｙｌｏｒら、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒ
ｕｇ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ、第２２巻：６０８～１２頁（２０００年）；及びＳａｌｍ
ら、Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、２２巻Ｓｕｐｌ．Ｂ：Ｂ７１～Ｂ８５頁（２
０００年）を参照。
【0092】
当業者は、Ｔと共に使用するのに適するＨＰＬＣ装置及びカラムを選択し得る。クロマ
トグラフ用カラムは、化学的部分の分離（すなわち、分画）を促進する媒体（すなわち、
充填材料）を一般的に含む。媒体として微細粒子を挙げることができる。粒子は、様々な
化学的部分と相互作用して化学的部分の分離を促進する結合表面を備える。１つの適する
結合表面は、疎水結合表面、例えばアルキル結合表面等である。アルキル結合表面は、Ｃ
－４、Ｃ－８、Ｃ－１２、又はＣ－１８結合アルキル基、好ましくはＣ－１８結合基を含
み得る。クロマトグラフ用カラムは、サンプルを受け取るための注入ポートと、分画され
たサンプルを含む流出物を排出するための排出ポートを備える。１つの実施形態では、サ
ンプル（又は事前精製されたサンプル）が、注入ポートにおいてカラムに適用され、溶媒
又は溶媒混合物により溶出され、そして排出ポートから排出される。異なる溶媒モードが
、目的とする分析物を溶出させるのに選択され得る。例えば、液体クロマトグラフィーは
、勾配モード、アイソクラチックモード、又は多型（すなわち、混合）モードを使用して
実施され得る。クロマトグラフィー期間中に、材料の分離は、変動要因、例えば溶離液（
「移動相」としても知られている）の選択、溶出モード、勾配条件、温度等により影響を
受ける。
トグラフ用カラムは、化学的部分の分離（すなわち、分画）を促進する媒体（すなわち、
充填材料）を一般的に含む。媒体として微細粒子を挙げることができる。粒子は、様々な
化学的部分と相互作用して化学的部分の分離を促進する結合表面を備える。１つの適する
結合表面は、疎水結合表面、例えばアルキル結合表面等である。アルキル結合表面は、Ｃ
－４、Ｃ－８、Ｃ－１２、又はＣ－１８結合アルキル基、好ましくはＣ－１８結合基を含
み得る。クロマトグラフ用カラムは、サンプルを受け取るための注入ポートと、分画され
たサンプルを含む流出物を排出するための排出ポートを備える。１つの実施形態では、サ
ンプル（又は事前精製されたサンプル）が、注入ポートにおいてカラムに適用され、溶媒
又は溶媒混合物により溶出され、そして排出ポートから排出される。異なる溶媒モードが
、目的とする分析物を溶出させるのに選択され得る。例えば、液体クロマトグラフィーは
、勾配モード、アイソクラチックモード、又は多型（すなわち、混合）モードを使用して
実施され得る。クロマトグラフィー期間中に、材料の分離は、変動要因、例えば溶離液（
「移動相」としても知られている）の選択、溶出モード、勾配条件、温度等により影響を
受ける。
【0093】
特定の実施形態では、分析物は、目的とする分析物がカラム充填材料により可逆的に保
持される一方、１つ又は複数のその他の物質は保持されない条件下で、サンプルをカラム
に適用することにより精製され得る。このような実施形態では、第１の移動相の条件は、
目的とする分析物がカラムにより保持されるように設定可能であり、また第２の移動相の
条件は、その後、保持されなかった物質が洗い出されたら、保持された物質がカラムから
取り出されるように、設定可能である。或いは、分析物は、１つ又は複数のその他の物質
と比較して、異なる速度で目的とする分析物が溶出するような移動相の条件下でサンプル
をカラムに適用することにより精製され得る。そのような手順は、サンプルの１つ又は複
数のその他の成分と比較して、目的とする１つ又は複数の分析物の量を富化させる可能性
がある。
持される一方、１つ又は複数のその他の物質は保持されない条件下で、サンプルをカラム
に適用することにより精製され得る。このような実施形態では、第１の移動相の条件は、
目的とする分析物がカラムにより保持されるように設定可能であり、また第２の移動相の
条件は、その後、保持されなかった物質が洗い出されたら、保持された物質がカラムから
取り出されるように、設定可能である。或いは、分析物は、１つ又は複数のその他の物質
と比較して、異なる速度で目的とする分析物が溶出するような移動相の条件下でサンプル
をカラムに適用することにより精製され得る。そのような手順は、サンプルの１つ又は複
数のその他の成分と比較して、目的とする１つ又は複数の分析物の量を富化させる可能性
がある。
【0094】
１つの好ましい実施形態では、ＨＴＬＣは、疎水性カラムクロマトグラフィーシステム
上のＨＰＬＣに後続し得る。特定の好ましい実施形態では、Ｃｏｈｅｓｉｖｅ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＴｕｒｂｏＦｌｏｗ Ｃｙｃｌｏｎｅ Ｐ（登録商標）ポリマー
ベースカラム（粒径６０μｍ、カラム寸法５０×１．０ｍｍ、ポアサイズ１００Å）が使
用される。関連する好ましい実施形態では、親水性エンドキャッピングを有する、Ｐｈｅ
ｎｏｍｅｎｅｘ Ｉｎｃ社製のＳｙｎｅｒｇｉ Ｐｏｌａｒ－ＲＰ（登録商標）エーテル
結合型フェニルの分析カラム（粒径４μｍ、カラム寸法１５０×２．０ｍｍ、ポアサイズ
８０Å）が使用される。特定の好ましい実施形態では、ＨＴＬＣ及びＨＰＬＣが、移動相
としてＨＰＬＣグレード超純水及び１００％メタノールを使用して実施される。
上のＨＰＬＣに後続し得る。特定の好ましい実施形態では、Ｃｏｈｅｓｉｖｅ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＴｕｒｂｏＦｌｏｗ Ｃｙｃｌｏｎｅ Ｐ（登録商標）ポリマー
ベースカラム（粒径６０μｍ、カラム寸法５０×１．０ｍｍ、ポアサイズ１００Å）が使
用される。関連する好ましい実施形態では、親水性エンドキャッピングを有する、Ｐｈｅ
ｎｏｍｅｎｅｘ Ｉｎｃ社製のＳｙｎｅｒｇｉ Ｐｏｌａｒ－ＲＰ（登録商標）エーテル
結合型フェニルの分析カラム（粒径４μｍ、カラム寸法１５０×２．０ｍｍ、ポアサイズ
８０Å）が使用される。特定の好ましい実施形態では、ＨＴＬＣ及びＨＰＬＣが、移動相
としてＨＰＬＣグレード超純水及び１００％メタノールを使用して実施される。
【0095】
慎重なバルブの選択及びコネクター配管作業により、手動ステップを一切必要とせずに
、物質が１つのカラムから次のカラムへと通過するように、２つ以上のクロマトグラフィ
ーカラムが、必要に応じて接続され得る。好ましい実施形態では、バルブの選択及び配管
作業は、必要なステップを実施するように事前プログラムされたコンピューターにより管
理される。最も好ましくは、クロマトグラフィーシステムも、検出器システム、例えばＭ
Ｓシステムと、そのようなオンライン方式で接続される。従って、オペレーターは、サン
プルのトレーをオートサンプラーに配置すればよく、そして残りの作業は、コンピュータ
ー制御下で実施され、その結果、選択されたすべてのサンプルの精製及び分析が完了する
。
、物質が１つのカラムから次のカラムへと通過するように、２つ以上のクロマトグラフィ
ーカラムが、必要に応じて接続され得る。好ましい実施形態では、バルブの選択及び配管
作業は、必要なステップを実施するように事前プログラムされたコンピューターにより管
理される。最も好ましくは、クロマトグラフィーシステムも、検出器システム、例えばＭ
Ｓシステムと、そのようなオンライン方式で接続される。従って、オペレーターは、サン
プルのトレーをオートサンプラーに配置すればよく、そして残りの作業は、コンピュータ
ー制御下で実施され、その結果、選択されたすべてのサンプルの精製及び分析が完了する
。
【0096】
特定の好ましい実施形態では、サンプル中のＴ又はそのフラグメントは、イオン化の前
に精製され得る。特に好ましい実施形態では、クロマトグラフィーは、ガスクロマトグラ
フィーではない。
に精製され得る。特に好ましい実施形態では、クロマトグラフィーは、ガスクロマトグラ
フィーではない。
【0097】
マススペクトロメトリーによる検出及び定量
様々な実施形態では、Ｔ又はそのフラグメントは、当業者にとって公知の任意の方法に
よりイオン化することができる。マススペクトロメトリーは、分画されたサンプルをイオ
ン化し、そして更なる分析用として荷電分子を生み出すイオン源を備える質量分析装置を
使用して実施される。例えば、サンプルのイオン化は、電子イオン化、化学イオン化、加
熱式エレクトロスプレーイオン化（ＨＥＳＩ）、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）
、光子イオン化、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、光イオン化、大気圧光イオン化（Ａ
ＰＰＩ）、高速原子衝撃（ＦＡＢ）、液体二次イオン化（ＬＳＩ）、マトリックス支援レ
ーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、電界イオン化、電界脱離、サーモスプレー／プラズ
マスプレーイオン化、表面増強レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）、誘導結合プラズマ
（ＩＣＰ）、及び粒子ビームイオン化により実施され得る。当業者は、イオン化法の選択
は、測定される分析物、サンプルの種類、検出器の種類、ポジティブモードとネガティブ
モードの選択等に基づき決定され得るものと理解する。
様々な実施形態では、Ｔ又はそのフラグメントは、当業者にとって公知の任意の方法に
よりイオン化することができる。マススペクトロメトリーは、分画されたサンプルをイオ
ン化し、そして更なる分析用として荷電分子を生み出すイオン源を備える質量分析装置を
使用して実施される。例えば、サンプルのイオン化は、電子イオン化、化学イオン化、加
熱式エレクトロスプレーイオン化（ＨＥＳＩ）、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）
、光子イオン化、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、光イオン化、大気圧光イオン化（Ａ
ＰＰＩ）、高速原子衝撃（ＦＡＢ）、液体二次イオン化（ＬＳＩ）、マトリックス支援レ
ーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、電界イオン化、電界脱離、サーモスプレー／プラズ
マスプレーイオン化、表面増強レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）、誘導結合プラズマ
（ＩＣＰ）、及び粒子ビームイオン化により実施され得る。当業者は、イオン化法の選択
は、測定される分析物、サンプルの種類、検出器の種類、ポジティブモードとネガティブ
モードの選択等に基づき決定され得るものと理解する。
【0098】
好ましい実施形態では、Ｔ又はそのフラグメントは、陽イオンモードでの加熱式エレク
トロスプレーイオン化（ＨＥＳＩ）によりイオン化する。
トロスプレーイオン化（ＨＥＳＩ）によりイオン化する。
【0099】
サンプルがイオン化した後、これにより生成した正に荷電したイオン又は負に荷電した
イオンは、質量対電荷の比を決定するために分析され得る。質量対電荷の比を決定するた
めの適するアナライザーとして、四重極型アナライザー、イオントラップアナライザー、
及び飛行時間アナライザーが挙げられる。イオンは、いくつかの検出モードを使用して検
出可能である。例えば、選択されたイオンは、すなわち、選択的イオンモニタリングモー
ド（ＳＩＭ）を使用して検出可能であるか、また或いは、イオンは、スキャニングモード
、例えば、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）又は選択的反応モニタリング（ＳＲＭ）を使
用して検出可能である。好ましくは、質量対電荷の比は、四重極型アナライザーを使用し
て決定される。例えば、「四重極」又は「四重極型イオントラップ」装置では、電極間に
印加されたＤＣ電位、ＲＦシグナルの振幅、及び質量／電荷の比に比例した力が、振動性
ラジオ周波数場内のイオンに加わる。電圧及び振幅は、特定の質量／電荷の比を有するイ
オンのみが、四重極の長さを移動する一方、その他のすべてのイオンは外れるように選択
され得る。従って、四重極型装置は、装置に注入されたイオンに対して、「マスフィルタ
ー」及び「マス検出器」の両方として作用し得る。
イオンは、質量対電荷の比を決定するために分析され得る。質量対電荷の比を決定するた
めの適するアナライザーとして、四重極型アナライザー、イオントラップアナライザー、
及び飛行時間アナライザーが挙げられる。イオンは、いくつかの検出モードを使用して検
出可能である。例えば、選択されたイオンは、すなわち、選択的イオンモニタリングモー
ド（ＳＩＭ）を使用して検出可能であるか、また或いは、イオンは、スキャニングモード
、例えば、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）又は選択的反応モニタリング（ＳＲＭ）を使
用して検出可能である。好ましくは、質量対電荷の比は、四重極型アナライザーを使用し
て決定される。例えば、「四重極」又は「四重極型イオントラップ」装置では、電極間に
印加されたＤＣ電位、ＲＦシグナルの振幅、及び質量／電荷の比に比例した力が、振動性
ラジオ周波数場内のイオンに加わる。電圧及び振幅は、特定の質量／電荷の比を有するイ
オンのみが、四重極の長さを移動する一方、その他のすべてのイオンは外れるように選択
され得る。従って、四重極型装置は、装置に注入されたイオンに対して、「マスフィルタ
ー」及び「マス検出器」の両方として作用し得る。
【0100】
「タンデム型質量分析」又は「ＭＳ／ＭＳ」を利用することにより、ＭＳ技術の分解能
を強化することができる。この技術では、目的とする分子から生成した前駆イオン（親イ
オンとも呼ばれる）を、ＭＳ装置内でフィルター処理することができ、そして前駆イオン
は、その後フラグメント化されて、次に第２のＭＳ手順において分析の対象とされる１つ
又は複数のフラグメントイオン（娘イオン又はプロダクトイオンとも呼ばれる）となる。
前駆イオンを慎重に選択することにより、特定の分析物より産生するイオンのみが、フラ
グメント化チャンバーを通過し、そこで、不活性気体の原子と衝突してフラグメントイオ
ンが産生する。前駆イオン及びフラグメントイオンのいずれも、イオン化／フラグメント
化させる一連の所定条件下で再現的に産生するので、ＭＳ／ＭＳ技術は、極めて強力な分
析ツールを提供し得る。例えば、フィルター処理／フラグメント化の組合せは、妨害物質
を取り除くのに利用可能であり、また複合サンプル、例えば生体サンプル等において特に
有用であり得る。
を強化することができる。この技術では、目的とする分子から生成した前駆イオン（親イ
オンとも呼ばれる）を、ＭＳ装置内でフィルター処理することができ、そして前駆イオン
は、その後フラグメント化されて、次に第２のＭＳ手順において分析の対象とされる１つ
又は複数のフラグメントイオン（娘イオン又はプロダクトイオンとも呼ばれる）となる。
前駆イオンを慎重に選択することにより、特定の分析物より産生するイオンのみが、フラ
グメント化チャンバーを通過し、そこで、不活性気体の原子と衝突してフラグメントイオ
ンが産生する。前駆イオン及びフラグメントイオンのいずれも、イオン化／フラグメント
化させる一連の所定条件下で再現的に産生するので、ＭＳ／ＭＳ技術は、極めて強力な分
析ツールを提供し得る。例えば、フィルター処理／フラグメント化の組合せは、妨害物質
を取り除くのに利用可能であり、また複合サンプル、例えば生体サンプル等において特に
有用であり得る。
【0101】
質量分析装置は、一般的に、イオンスキャン；すなわち、所定の範囲（例えば、１００
～１０００ａｍｕ）において、特定の質量／電荷を有する各イオンの相対的存在量をユー
ザーに提供する。分析物アッセイの結果、すなわち質量スペクトルは、当技術分野におい
て公知の非常に多くの方法により、オリジナルサンプル内の分析物の量と関連付けること
ができる。例えば、サンプリング及び分析パラメーターが慎重に管理されることを前提と
すれば、所定のイオンの相対的存在量は、相対的存在量をオリジナル分子の絶対量に変換
する表と比較することができる。或いは、分子標準をサンプルと共にランニングすること
ができ、そしてその標準から生成したイオンに基づき、標準曲線が構築される。そのよう
な標準曲線を使用して、所定のイオンの相対的存在量が、オリジナル分子の絶対量に変換
され得る。特定の好ましい実施形態では、内部標準が、Ｔの量を計算するための標準曲線
を生成するのに使用される。そのような標準曲線を生成及び使用する方法は、当技術分野
に周知であり、また当業者は、適切な内部標準を選択する能力を有する。例えば、Ｔの同
位体が、内部標準として利用可能である。イオンの量をオリジナル分子の量と関連付ける
ための非常に多くのその他の方法が、当業者に周知である。
～１０００ａｍｕ）において、特定の質量／電荷を有する各イオンの相対的存在量をユー
ザーに提供する。分析物アッセイの結果、すなわち質量スペクトルは、当技術分野におい
て公知の非常に多くの方法により、オリジナルサンプル内の分析物の量と関連付けること
ができる。例えば、サンプリング及び分析パラメーターが慎重に管理されることを前提と
すれば、所定のイオンの相対的存在量は、相対的存在量をオリジナル分子の絶対量に変換
する表と比較することができる。或いは、分子標準をサンプルと共にランニングすること
ができ、そしてその標準から生成したイオンに基づき、標準曲線が構築される。そのよう
な標準曲線を使用して、所定のイオンの相対的存在量が、オリジナル分子の絶対量に変換
され得る。特定の好ましい実施形態では、内部標準が、Ｔの量を計算するための標準曲線
を生成するのに使用される。そのような標準曲線を生成及び使用する方法は、当技術分野
に周知であり、また当業者は、適切な内部標準を選択する能力を有する。例えば、Ｔの同
位体が、内部標準として利用可能である。イオンの量をオリジナル分子の量と関連付ける
ための非常に多くのその他の方法が、当業者に周知である。
【0102】
方法の１つ又は複数のステップは、自動化された機械を使用して実施され得る。特定の
実施形態では、１つ又は複数の精製ステップが、オンラインで実施され、またより好まし
くは、精製及びマススペクトロメトリーステップのすべてが、オンライン方式で実施され
得る。
実施形態では、１つ又は複数の精製ステップが、オンラインで実施され、またより好まし
くは、精製及びマススペクトロメトリーステップのすべてが、オンライン方式で実施され
得る。
【0103】
特定の実施形態、例えば前駆イオンが更なるフラグメント化を目的として単離されるよ
うなＭＳ／ＭＳ等では、衝突活性化解離法〔collision activation dissociation〕が、
更なる検出を目的としてフラグメントイオンを生成するのに多くの場合使用される。ＣＡ
Ｄでは、前駆イオンは、不活性気体との衝突を通じてエネルギーを獲得するが、その後「
単分子分解反応」と呼ばれるプロセスによりフラグメント化する。振動エネルギーの増加
に起因して、イオン内の特定の結合が破壊され得るように、十分なエネルギーが、前駆イ
オン内に蓄積しなければならない。
うなＭＳ／ＭＳ等では、衝突活性化解離法〔collision activation dissociation〕が、
更なる検出を目的としてフラグメントイオンを生成するのに多くの場合使用される。ＣＡ
Ｄでは、前駆イオンは、不活性気体との衝突を通じてエネルギーを獲得するが、その後「
単分子分解反応」と呼ばれるプロセスによりフラグメント化する。振動エネルギーの増加
に起因して、イオン内の特定の結合が破壊され得るように、十分なエネルギーが、前駆イ
オン内に蓄積しなければならない。
【0104】
特に好ましい実施形態では、Ｔが、ＭＳ／ＭＳを使用して、以下のように検出及び／又
は定量化される。サンプルは、液体クロマトグラフィー、好ましくはＨＰＬＣで処理され
、クロマトグラフ用カラムからの液体溶媒の流れは、ＭＳ／ＭＳアナライザーの加熱され
たネブライザーインターフェースに進入し、そして溶媒／分析物混合物が、インターフェ
ースの加熱されたチューブ内で蒸気に変換される。分析物は、選択されたイオン化装置に
よりイオン化される。イオン、例えば前駆イオンは、装置の開口部を通過し、そして第１
の四重極に進入する。四重極１及び３（Ｑ１及びＱ３）は、質量フィルターであり、その
質量対電荷の比（ｍ／ｚ）に基づき、イオン（すなわち、「前駆」及び「フラグメント」
イオン）の選択を可能にする。四重極２（Ｑ２）は衝突セルであり、そこでイオンがフラ
グメント化される。質量分析装置の第１の四重極（Ｑ１）は、Ｔの質量対電荷の比を用い
て分子を選択する。Ｔの正しい質量／電荷の比を有する前駆イオンが、衝突チャンバー（
Ｑ２）に導入可能となる一方、その他の質量／電荷の比を有する望ましくないイオンはい
ずれも四重極の側面と衝突し、除去される。Ｑ２に進入する前駆イオンは、中性のアルゴ
ン気体分子と衝突して、フラグメント化する。このプロセスは衝突活性化解離（ＣＡＤ）
と呼ばれる。生成したフラグメントイオンは、四重極３（Ｑ３）に導入され、そこでは、
Ｔのフラグメントイオンが選択される一方、その他のイオンは除去される。
は定量化される。サンプルは、液体クロマトグラフィー、好ましくはＨＰＬＣで処理され
、クロマトグラフ用カラムからの液体溶媒の流れは、ＭＳ／ＭＳアナライザーの加熱され
たネブライザーインターフェースに進入し、そして溶媒／分析物混合物が、インターフェ
ースの加熱されたチューブ内で蒸気に変換される。分析物は、選択されたイオン化装置に
よりイオン化される。イオン、例えば前駆イオンは、装置の開口部を通過し、そして第１
の四重極に進入する。四重極１及び３（Ｑ１及びＱ３）は、質量フィルターであり、その
質量対電荷の比（ｍ／ｚ）に基づき、イオン（すなわち、「前駆」及び「フラグメント」
イオン）の選択を可能にする。四重極２（Ｑ２）は衝突セルであり、そこでイオンがフラ
グメント化される。質量分析装置の第１の四重極（Ｑ１）は、Ｔの質量対電荷の比を用い
て分子を選択する。Ｔの正しい質量／電荷の比を有する前駆イオンが、衝突チャンバー（
Ｑ２）に導入可能となる一方、その他の質量／電荷の比を有する望ましくないイオンはい
ずれも四重極の側面と衝突し、除去される。Ｑ２に進入する前駆イオンは、中性のアルゴ
ン気体分子と衝突して、フラグメント化する。このプロセスは衝突活性化解離（ＣＡＤ）
と呼ばれる。生成したフラグメントイオンは、四重極３（Ｑ３）に導入され、そこでは、
Ｔのフラグメントイオンが選択される一方、その他のイオンは除去される。
【0105】
方法は、陽イオンモード又は陰イオンモードのいずれかで実施されるＭＳ／ＭＳと関係
し得る。当技術分野において周知の標準法を使用して、当業者は、四重極３（Ｑ３）での
選択で利用可能な、特定のＴの前駆イオンの１つ又は複数のフラグメントイオンを識別す
る能力を有する。
し得る。当技術分野において周知の標準法を使用して、当業者は、四重極３（Ｑ３）での
選択で利用可能な、特定のＴの前駆イオンの１つ又は複数のフラグメントイオンを識別す
る能力を有する。
【0106】
イオンが検出器と衝突すると、イオンは、デジタルシグナルに変換される電子のパルス
を産生する。取得されたデータは、収集されたイオンのカウントを時間に対してプロット
するコンピューターに伝達される。得られた質量クロマトグラムは、従来型のＨＰＬＣ法
で生成されるクロマトグラムと類似している。特定のイオンに対応するピーク下面積、又
はそのようなピークの振幅が測定され、そして面積又は振幅が、目的とする分析物の量と
関連付けられる。特定の実施形態では、フラグメントイオン及び／又は前駆イオンに関す
る曲線下面積又はピークの振幅が、Ｔの量を決定するために測定される。上記のように、
内部分子標準の１つ又は複数のイオンに由来するピークに基づく校正標準曲線を使用して
、所定のイオンの相対的存在量は、オリジナルの分析物の絶対量に変換され得る。
を産生する。取得されたデータは、収集されたイオンのカウントを時間に対してプロット
するコンピューターに伝達される。得られた質量クロマトグラムは、従来型のＨＰＬＣ法
で生成されるクロマトグラムと類似している。特定のイオンに対応するピーク下面積、又
はそのようなピークの振幅が測定され、そして面積又は振幅が、目的とする分析物の量と
関連付けられる。特定の実施形態では、フラグメントイオン及び／又は前駆イオンに関す
る曲線下面積又はピークの振幅が、Ｔの量を決定するために測定される。上記のように、
内部分子標準の１つ又は複数のイオンに由来するピークに基づく校正標準曲線を使用して
、所定のイオンの相対的存在量は、オリジナルの分析物の絶対量に変換され得る。
【0107】
下記の実施例は、本発明を説明する役目を果たす。これらの実施例には、本方法の範囲
に制限を設けるような意図は一切存在しない。
に制限を設けるような意図は一切存在しない。
【実施例】
【0108】
［実施例１］
マススペクトロメトリーによる多重化したテストステロンの定量
ストリップ血清にテストステロンをスパイクすることにより、校正標準及び品質コント
ロール（ＱＣ）を調製した。ＱＣレベルは：ＱＣ１、８ｎｇ／ｄＬ；ＱＣ２、８０ｎｇ／
ｄＬ、ＱＣ３、２５０ｎｇ／ｄＬ；ＱＣ４、１，２００ｎｇ／ｄＬであった。患者血漿又
は血清試料、並びに標準及びＱＣ品のアリコート（２００μＬ）を、図１に示すワークフ
ローに基づき処理した。すべてのピペッティングステップは、Ｔｅｃａｎ ＩＰ８と連結
したＨａｍｉｌｔｏｎ Ｓｔａｒ液体取り扱いロボットを使用して自動化された。
マススペクトロメトリーによる多重化したテストステロンの定量
ストリップ血清にテストステロンをスパイクすることにより、校正標準及び品質コント
ロール（ＱＣ）を調製した。ＱＣレベルは：ＱＣ１、８ｎｇ／ｄＬ；ＱＣ２、８０ｎｇ／
ｄＬ、ＱＣ３、２５０ｎｇ／ｄＬ；ＱＣ４、１，２００ｎｇ／ｄＬであった。患者血漿又
は血清試料、並びに標準及びＱＣ品のアリコート（２００μＬ）を、図１に示すワークフ
ローに基づき処理した。すべてのピペッティングステップは、Ｔｅｃａｎ ＩＰ８と連結
したＨａｍｉｌｔｏｎ Ｓｔａｒ液体取り扱いロボットを使用して自動化された。
【0109】
分析対象サンプルを、サンプルプレートＡ及びサンプルプレートＢとして識別される２
つのセットに分割した。内部標準（ＩＳ）を添加し、そして次に（Ｔ）を、直接プレート
内タンパク質沈殿及び濾過を使用してサンプルから抽出した。両方のサンプルプレートを
独立に誘導体化した。サンプルプレートＡは、メトキシアミン塩酸塩を使用して誘導体化
した；サンプルプレートＢは、ヒドロキシルアミン塩酸塩を使用して誘導体化した。誘導
体化後、自動化された固相抽出を、Ｓｔｒａｔａ Ｃ１８固相抽出プレートを使用して、
Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＳＴＡＲと連結したＳＰＥｗａｒｅ ＩＰ８システム上でオートメー
ションにより実施した。２つの誘導体（サンプルプレートＡ及びＢ）をこのステップにお
いて組み合わせた。溶出の後、サンプルを窒素下で乾燥させ、そして注入の前に再構成し
た。
つのセットに分割した。内部標準（ＩＳ）を添加し、そして次に（Ｔ）を、直接プレート
内タンパク質沈殿及び濾過を使用してサンプルから抽出した。両方のサンプルプレートを
独立に誘導体化した。サンプルプレートＡは、メトキシアミン塩酸塩を使用して誘導体化
した；サンプルプレートＢは、ヒドロキシルアミン塩酸塩を使用して誘導体化した。誘導
体化後、自動化された固相抽出を、Ｓｔｒａｔａ Ｃ１８固相抽出プレートを使用して、
Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＳＴＡＲと連結したＳＰＥｗａｒｅ ＩＰ８システム上でオートメー
ションにより実施した。２つの誘導体（サンプルプレートＡ及びＢ）をこのステップにお
いて組み合わせた。溶出の後、サンプルを窒素下で乾燥させ、そして注入の前に再構成し
た。
【0110】
４０マイクロリットルのサンプルを高乱流液体クロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）システ
ムに注入し、そして加熱式エレクトロスプレーイオン化（ＨＥＳＩ）源を備えたＴＳＱ
Ｑｕａｎｔｕｍ Ｕｌｔｒａ ＭＳ／ＭＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔ
ｉｆｉｃ社）を検出器として使用した。質量分析装置データを陽イオンモードで取得した
。総ランタイムは、カラムの平衡化を含め１回の注入当たり６．５分であった。複数のチ
ャネルを使用することで、１．５分毎に２サンプル又は６．５分間で８サンプルの分析が
可能となった。定量は、固有の親－生成物遷移に基づいた。下記の前駆体－フラグメント
の対又は「質量遷移」を使用した：
ムに注入し、そして加熱式エレクトロスプレーイオン化（ＨＥＳＩ）源を備えたＴＳＱ
Ｑｕａｎｔｕｍ Ｕｌｔｒａ ＭＳ／ＭＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔ
ｉｆｉｃ社）を検出器として使用した。質量分析装置データを陽イオンモードで取得した
。総ランタイムは、カラムの平衡化を含め１回の注入当たり６．５分であった。複数のチ
ャネルを使用することで、１．５分毎に２サンプル又は６．５分間で８サンプルの分析が
可能となった。定量は、固有の親－生成物遷移に基づいた。下記の前駆体－フラグメント
の対又は「質量遷移」を使用した：
【0111】
ヒドロキシルアミン誘導体及びその（ＩＳ）について３０４．１８／１１２．０５、１
２４．０５、及び３０７．１９／１２７．０６；並びにメトキシアミン誘導体及びそのＩ
Ｓについて３１８．２１／１２６．０７、１３８．０７、１５２．０８、及び３２１．２
１／１２９／０７。
２４．０５、及び３０７．１９／１２７．０６；並びにメトキシアミン誘導体及びそのＩ
Ｓについて３１８．２１／１２６．０７、１３８．０７、１５２．０８、及び３２１．２
１／１２９／０７。
【0112】
多重化誘導体化Ｔアッセイ法の性能を、既存のＴアッセイ（Ｓａｌａｍｅｈ、２０１０
）から蓄積したサンプル廃棄品から得られた結果と並行テストにおいて比較した。２５９
個の残滓試料サンプルを、ＬＣＭＳ／ＭＳによりＴを検出するための最新の方法によりア
ッセイした。
）から蓄積したサンプル廃棄品から得られた結果と並行テストにおいて比較した。２５９
個の残滓試料サンプルを、ＬＣＭＳ／ＭＳによりＴを検出するための最新の方法によりア
ッセイした。
【0113】
カラムの多重化により、６．５分毎に４サンプルを分析することが可能になる。サンプ
ルの多重化は、６．５分間で８サンプルまでスループットを倍増させた。図２は、単一サ
ンプルとサンプルの多重化のクロマトグラフプロファイルについて比較する。
ルの多重化は、６．５分間で８サンプルまでスループットを倍増させた。図２は、単一サ
ンプルとサンプルの多重化のクロマトグラフプロファイルについて比較する。
【0114】
方法は、２，０００ｎｇ／ｄＬまで直線的であり（図３）、また校正曲線は、再現性及
び直線性において一貫性を示した。
び直線性において一貫性を示した。
【0115】
分析感度：定量限界は１ｎｇ／ｄＬであった。
【0116】
【0117】
患者サンプル中に２～４スパイクされたＱＣにおけるＴの回収率は、９５％から１０５
％であった（図４）。
％であった（図４）。
【0118】
１：４稀釈された患者サンプル中のＴの回収率は、９５％～１０９％であった（図５）
；従ってヒドロキシルアミン及びメトキシアミン誘導体の両方について、臨床的報告可能
範囲（ＣＲＲ）を１０，０００ｎｇ／ｄＬまで拡張した。
；従ってヒドロキシルアミン及びメトキシアミン誘導体の両方について、臨床的報告可能
範囲（ＣＲＲ）を１０，０００ｎｇ／ｄＬまで拡張した。
【0119】
個別にランニングした場合と多重化法を使用してランニングした場合の両方で、１，８
３０例の患者の廃棄品についてＴ結果の回帰分析を行い、３～４，８６２ｎｇ／ｄＬの濃
度範囲において、４．７９＋１．０３ｘのＤｅｍｉｎｇのフィッティングを得た（図６ａ
）。
３０例の患者の廃棄品についてＴ結果の回帰分析を行い、３～４，８６２ｎｇ／ｄＬの濃
度範囲において、４．７９＋１．０３ｘのＤｅｍｉｎｇのフィッティングを得た（図６ａ
）。
【0120】
Ｔ＜１００ｎｇ／ｄＬである８４２例の患者サンプルについて、回帰分析を行い、－１
．５１＋１．０９ｘのＤｅｍｉｎｇのフィッティングを得た（図６ｂ）。
．５１＋１．０９ｘのＤｅｍｉｎｇのフィッティングを得た（図６ｂ）。
【0121】
結論：我々は、アッセイの正確性及び特異性を損なわずに、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳスループ
ットを倍増させる、完全に自動化された「サンプルの多重化」法を開発し、妥当性確認し
た。
ットを倍増させる、完全に自動化された「サンプルの多重化」法を開発し、妥当性確認し
た。
【0122】
本明細書に記載又は引用する文献、特許、及び特許出願、並びにその他のすべての文書
及び電子的に利用可能な情報の内容は、個々の公開資料が参照として組み込まれるものと
特別及び個別に示唆されたのと同程度に、参照により本明細書にその全体が援用される。
出願者らは、任意のそのような文献、特許、特許出願、又はその他の物理的及び電子的な
文書に由来する任意の及びすべての資料及び情報を本出願に物理的に組み込む権利を留保
する。
及び電子的に利用可能な情報の内容は、個々の公開資料が参照として組み込まれるものと
特別及び個別に示唆されたのと同程度に、参照により本明細書にその全体が援用される。
出願者らは、任意のそのような文献、特許、特許出願、又はその他の物理的及び電子的な
文書に由来する任意の及びすべての資料及び情報を本出願に物理的に組み込む権利を留保
する。
【0123】
本明細書に事例的に記載する方法は、本明細書に特に開示されない、任意の１つの要素
又は複数の要素、１つの制限又は複数の制限が存在しなくても、好適に実践できる。従っ
て、例えば、用語「含む〔comprising〕」、「含む〔including〕」、「含有する〔conta
ining〕」等は、拡大的及び非限定的に解釈されなければならない。更に、本明細書で採
用されている用語及び表現は、制限の用語としてではなく、説明の用語として使用されて
おり、そのような用語及び表現の使用において、提示及び記載された特性の任意の等価物
又はその一部分を排除する意図は存在しない。様々な修正が、主張された本発明の範囲内
で可能であると認識される。従って、本発明は、好ましい実施形態及び任意選択的な特性
により特別に開示されているが、本明細書に開示する本発明に取り込まれた本発明の修正
及び変更は、当業者により実施可能であるものと理解し、またそのような修正及び変更は
、本発明の範囲内であるとみなされるものと理解すべきである。
又は複数の要素、１つの制限又は複数の制限が存在しなくても、好適に実践できる。従っ
て、例えば、用語「含む〔comprising〕」、「含む〔including〕」、「含有する〔conta
ining〕」等は、拡大的及び非限定的に解釈されなければならない。更に、本明細書で採
用されている用語及び表現は、制限の用語としてではなく、説明の用語として使用されて
おり、そのような用語及び表現の使用において、提示及び記載された特性の任意の等価物
又はその一部分を排除する意図は存在しない。様々な修正が、主張された本発明の範囲内
で可能であると認識される。従って、本発明は、好ましい実施形態及び任意選択的な特性
により特別に開示されているが、本明細書に開示する本発明に取り込まれた本発明の修正
及び変更は、当業者により実施可能であるものと理解し、またそのような修正及び変更は
、本発明の範囲内であるとみなされるものと理解すべきである。
【0124】
本発明は、本明細書において広範且つ全体的に記載されている。一般的な開示の範囲に
含まれるより狭い種及び亜属のグルーピングのそれぞれも、本方法の一部をなす。これに
は、属から主題のいずれかを除去する条件又は否定的限定を伴う方法の一般的な説明が、
切り取られた題材が本明細書において特に列挙されるか、又はされないかを問わず含まれ
る。
含まれるより狭い種及び亜属のグルーピングのそれぞれも、本方法の一部をなす。これに
は、属から主題のいずれかを除去する条件又は否定的限定を伴う方法の一般的な説明が、
切り取られた題材が本明細書において特に列挙されるか、又はされないかを問わず含まれ
る。
【0125】
その他の実施形態は、下記の特許請求の範囲内に含まれる。更に、方法の特徴又は態様
が、マーカッシュ群によって記載されている場合、当業者は、発明は、これにより、マー
カッシュ群の個々のメンバー又はメンバーのサブグループのいずれについても記載されて
いるものと認識する。
が、マーカッシュ群によって記載されている場合、当業者は、発明は、これにより、マー
カッシュ群の個々のメンバー又はメンバーのサブグループのいずれについても記載されて
いるものと認識する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
