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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-07-04
(45)【発行日】2024-07-12
(54)【発明の名称】筋肉幹細胞培養用架橋型ハイドロゲルの調製方法及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12M 1/00 20060101AFI20240705BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20240705BHJP
【ＦＩ】
C12M1/00 A
C12N5/071
【請求項の数】
10
(21)【出願番号】P 2023526244
(86)(22)【出願日】2021-12-20
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-28
(86)【国際出願番号】 CN2021139539
(87)【国際公開番号】W WO2022156456
(87)【国際公開日】2022-07-28
【審査請求日】2023-07-31
(31)【優先権主張番号】202110080342.9
(32)【優先日】2021-01-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】514262886
【氏名又は名称】江南大学
【氏名又は名称原語表記】ＪＩＡＮＧＮＡＮ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ． １８００ Ｌｉｈｕ Ａｖｅｎｕｅ， Ｂｉｎ Ｈｕ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｗｕｘｉ， Ｊｉａｎｇｓｕ， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】胡静
(72)【発明者】
【氏名】尹健
(72)【発明者】
【氏名】汪翔
【審査官】吉門 沙央里
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１０２６８８５２５（ＣＮ，Ａ）
【文献】特表２００６－５００９５３（ＪＰ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０９４６４７００（ＣＮ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－７／０８
Ｃ１２Ｍ １／００－３／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の順序で、以下のステップ：（１）コラーゲンと酢酸水溶液を均一に混合・溶解してコラーゲン溶液を得るコラーゲン溶液の調製ステップと、
（２）ステップ（１）で調製して得られたコラーゲン溶液にアルギン酸塩を加えて、前記アルギン酸塩が溶解するまで撹拌し、コラーゲン／アルギン酸塩溶液を得るコラーゲン／アルギン酸塩溶液調製ステップと、
（３）ステップ（２）で調製して得られたコラーゲン／アルギン酸塩溶液にヘパラン硫酸プロテオグリカンを加えて、溶解するまで撹拌し、コラーゲン／アルギン酸塩／ヘパラン硫酸プロテオグリカン溶液を得るコラーゲン／アルギン酸塩／ヘパラン硫酸プロテオグリカン溶液調製ステップと、
（４）ステップ（３）で調製して得られたコラーゲン／アルギン酸塩／ヘパラン硫酸プロテオグリカン溶液に、ε－ＰＬを加えて均一に撹拌し、物理架橋により第１のスラリーを得る、物理架橋による第１のスラリー調製ステップと、
（５）ステップ（４）で調製して得られた第１のスラリーにＴＧ酵素を加えて均一に撹拌し、酵素架橋により第２のスラリーを得る、酵素架橋による第２のスラリー調製ステップと；
（６）ステップ（５）で調製して得られたスラリーを鋳型に入れて、１２～３６時間架橋させ、型から出し、筋肉幹細胞増殖用ハイドロゲルを得るハイドロゲルの調製ステップと、
を含むことを特徴とする、筋肉幹細胞培養用架橋型ハイドロゲルの調製方法。
【請求項2】
ステップ（１）において、酢酸水溶液の濃度が、０．０２～０．０５ｍｏｌ／Ｌであり、コラーゲンの質量が、水の質量に対して１０～１５％であることを特徴とする、請求項１に記載の筋肉幹細胞培養用架橋型ハイドロゲルの調製方法。
【請求項3】
ステップ（２）において、アルギン酸塩の質量が、水の質量に対して１５～２５％であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の筋肉幹細胞培養用架橋型ハイドロゲルの調製方法。
【請求項4】
ステップ（３）において、コラーゲン／アルギン酸塩／ヘパラン硫酸プロテオグリカン溶液中のヘパラン硫酸プロテオグリカンの濃度が、２００～５００μｇ／Ｌであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の筋肉幹細胞培養用架橋型ハイドロゲルの調製方法。
【請求項5】
ステップ（３）において、コラーゲン／アルギン酸塩／ヘパラン硫酸プロテオグリカン溶液中のヘパラン硫酸プロテオグリカンの濃度が、２００～５００μｇ／Ｌであることを特徴とする、請求項３に記載の筋肉幹細胞培養用架橋型ハイドロゲルの調製方法。
【請求項6】
ステップ（４）において、アルギン酸塩のカルボキシル基とε－ＰＬのアミノ基とのモル比が、１：１～１：２であり、ステップ（５）において、ＴＧ酵素の用量が、コラーゲンの質量に対して１～１０％であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の筋肉幹細胞培養用架橋型ハイドロゲルの調製方法。
【請求項7】
ステップ（４）において、アルギン酸塩のカルボキシル基とε－ＰＬのアミノ基とのモル比が、１：１～１：２であり、ステップ（５）において、ＴＧ酵素の用量が、コラーゲンの質量に対して１～１０％であることを特徴とする、請求項３に記載の筋肉幹細胞培養用架橋型ハイドロゲルの調製方法。
【請求項8】
請求項１に記載の筋肉幹細胞培養用架橋型ハイドロゲルの調製方法を含むことを特徴とする、筋肉幹細胞培養用架橋型ハイドロゲルを含む培地の調製方法。
【請求項9】
請求項１に記載の筋肉幹細胞培養用架橋型ハイドロゲルの調製方法により調製される筋肉幹細胞培養用架橋型ハイドロゲルを培地として用いることを特徴とする、筋肉幹細胞の培養方法。
【請求項10】
請求項１に記載の筋肉幹細胞培養用架橋型ハイドロゲルの調製方法の、培養肉分野における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、筋肉幹細胞培養用架橋型ハイドロゲルの調製方法及びその使用に関し、特に、新規な酵素法・物理的方法によるダブルネットワーク型架橋ハイドロゲルの調製方法及びその使用に関し、バイオ食品材料の技術分野に属する。
【背景技術】
【0002】
世界人口の９０％以上が肉を食べている中、肉の大量消費は大きな環境負荷となっている。幹細胞培養肉は、筋肉細胞を用いて体外で肉を培養する新たな技術である。現在、培養肉は、持続可能な生産が可能であることから、その開発プロセスは加速し続けている。幹細胞培養肉は、従来の食肉生産に比べて、動物の苦しみを軽減するだけでなく、畜産による環境汚染も軽減する（Ｆｏｏｄ ＆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｎａｔｉｏｎｓ、 ２００６）。同時に、畜産業界では抗生物質の乱用が続いている。明らかに、培養肉はこの問題の解決策となり得る。しかしながら、スケーラブルな細胞培養基材（ブラケット）の欠如が、幹細胞培養肉が制限される主な課題の一つとなっている。
【0003】
今頃、多糖系材料（ヒアルロン酸、キトサン、アルギン酸塩など）やタンパク質系材料（コラーゲン、ゼラチンなど）などの天然バイオマテリアルから抽出されたハイドロゲルは、その生体適合性及び生分解性が良いため、幹細胞ブラケットに幅広く用いられている（Ｓｍａｌｌ、 ２０２０、１６、１－１７）。アルギン酸塩は、広く入手可能で安価であり、且つ生体適合性など多くの優れた特性を具備している。しかも、アルギン酸塩は、プラスイオンと相互作用して緻密な三次元「エッグボックス」構造を形成したことにより、機械的特性を向上させることができる。ポリリジン（ε－ＰＬ）は、約２５個のリジンの繰り返し単位を含む代表的な天然ポリアミノ酸系バイオマテリアルであり、豊富な正電荷、豊富な生体適合性、生分解性、及び優れた水溶性などを有している。天然タンパク質系材料であるコラーゲンは、生理活性配列（ＲＧＤなど）を豊富に保持していることにより、細胞の接着及び増殖を促進できる。しかしながら、天然ハイドロゲルは、架橋が不十分で、機械的特性が低いという問題が存在している。グルタルアルデヒドやエポキシ樹脂などのほとんどの架橋剤は毒性があり、ハイドロゲルの生体適合性に影響を及ぼす。したがって、無毒で、機械的安定性が良く、細胞接着性が強い天然ハイドロゲルブラケットは、依然として課題となっている。
【0004】
さらに、培養肉に用いられる筋肉幹細胞の幹性の維持と接着性の向上は、ハイドロゲル材料に対する新たな課題となっており、ハイドロゲルの特性に対して新たな要求を提出した。成長因子ｂＦＧＦの添加により、筋肉幹細胞を活性化・増殖させることができる。しかしながら、成長因子は培地の中での保持時間が短い。したがって、無毒で、機械的安定性が良く、筋肉幹細胞接着性が強く、筋肉幹細胞の幹性維持を促進できる天然ハイドロゲルブラケットについて、まだ良い解決策はない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、無毒で、機械的安定性が高く、細胞接着性が強く、筋肉幹細胞の幹性を維持できる天然ハイドロゲルを如何に調製するかという上記課題を解決するために、強い吸着力を有して崩壊しにくい、新規な酵素法・物理的方法による幹細胞培養用ダブルネットワーク型架橋ハイドロゲルを提案する。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明は、まず、酵素法と物理的方法とを組み合わせることにより、ＴＧ酵素を用いて、酵素法・物理的方法による、コラーゲン／ε－ＰＬ／ヘパラン硫酸プロテオグリカン／アルギン酸塩に基づくダブルネットワーク型ハイドロゲルを調製する。これらの修飾基により、細胞に接着し成長因子の放出を制御する能力をハイドロゲルに具備させている。また、ダブルネットワーク型架橋構造によって、ハイドロゲルが大量の水にて膨潤した後、２つのネットワークの相乗作用によりハイドロゲルの機械的特性も増強し、且つハイドロゲルの完全性を維持することができる。同時に、このハイドロゲルは、化学的架橋ネットワークに必要な有毒な化学架橋剤による細胞毒性を改善できるという特徴を有している。
【0007】
本発明は、まず、筋肉幹細胞培養用架橋型ハイドロゲルの調製方法を提供するものである。前記方法は、まず、コラーゲンを溶解して溶液とした後、この溶液に一定量のアルギン酸塩及びヘパラン硫酸プロテオグリカンを加えて均一に混合するステップと、その後、混合溶液にポリリジンε－ＰＬとＴＧ酵素を加えて均一に撹拌してスラリーを得るステップと、当該スラリーを鋳型に入れて架橋させることで、ハイドロゲルを得るステップと、を含む。
【0008】
好ましくは、前記方法は、具体的に以下のステップを含む：
（１）コラーゲンと酢酸水溶液を均一に混合・溶解してコラーゲン溶液を得るコラーゲン溶液の調製ステップと、
（２）ステップ（１）で調製して得られたコラーゲン溶液にアルギン酸塩を加えて、前記アルギン酸塩が溶解するまで撹拌し、コラーゲン／アルギン酸塩溶液を得るコラーゲン／アルギン酸塩溶液調製ステップと、
（３）ステップ（２）で調製して得られたコラーゲン／アルギン酸塩溶液にヘパラン硫酸プロテオグリカンを加えて、溶解するまで撹拌し、コラーゲン／アルギン酸塩／ヘパラン硫酸プロテオグリカン溶液を得るコラーゲン／アルギン酸塩／ヘパラン硫酸プロテオグリカン溶液調製ステップと、
（４）ステップ（３）で調製して得られたコラーゲン／アルギン酸塩／ヘパラン硫酸プロテオグリカン溶液に、ポリリジンε－ＰＬを加えて均一に撹拌し、物理架橋により第１のスラリーを得る、物理架橋による第１のスラリー調製ステップと、
（５）ステップ（４）で調製して得られた第１のスラリーにＴＧ酵素を加えて均一に撹拌し、酵素架橋により第２のスラリーを得る、酵素架橋による第２のスラリー調製ステップと、
（６）ステップ（５）で調製して得られたスラリーを鋳型に入れて、１２～３６時間架橋させ、型から出し、筋肉幹細胞増殖用ハイドロゲルを得るハイドロゲルの調製ステップ。
（１）コラーゲンと酢酸水溶液を均一に混合・溶解してコラーゲン溶液を得るコラーゲン溶液の調製ステップと、
（２）ステップ（１）で調製して得られたコラーゲン溶液にアルギン酸塩を加えて、前記アルギン酸塩が溶解するまで撹拌し、コラーゲン／アルギン酸塩溶液を得るコラーゲン／アルギン酸塩溶液調製ステップと、
（３）ステップ（２）で調製して得られたコラーゲン／アルギン酸塩溶液にヘパラン硫酸プロテオグリカンを加えて、溶解するまで撹拌し、コラーゲン／アルギン酸塩／ヘパラン硫酸プロテオグリカン溶液を得るコラーゲン／アルギン酸塩／ヘパラン硫酸プロテオグリカン溶液調製ステップと、
（４）ステップ（３）で調製して得られたコラーゲン／アルギン酸塩／ヘパラン硫酸プロテオグリカン溶液に、ポリリジンε－ＰＬを加えて均一に撹拌し、物理架橋により第１のスラリーを得る、物理架橋による第１のスラリー調製ステップと、
（５）ステップ（４）で調製して得られた第１のスラリーにＴＧ酵素を加えて均一に撹拌し、酵素架橋により第２のスラリーを得る、酵素架橋による第２のスラリー調製ステップと、
（６）ステップ（５）で調製して得られたスラリーを鋳型に入れて、１２～３６時間架橋させ、型から出し、筋肉幹細胞増殖用ハイドロゲルを得るハイドロゲルの調製ステップ。
【0009】
好ましくは、前記方法における水は、好ましくは脱イオン水又は超純水である。
【0010】
好ましくは、前記コラーゲンは、牛、羊、豚、ロバ、禽類、水産動物等の皮膚、牛アキレス腱、骨組織等の部位から抽出されたコラーゲン、ゼラチン、加水分解コラーゲン、コラーゲンポリペプチド等のうちの１種又は２種以上の混合物を含む。
【0011】
好ましくは、ステップ（１）において、前記酢酸水溶液の濃度は、０．０２～０．０５ｍｏｌ／Ｌである。
【0012】
好ましくは、ステップ（１）において、コラーゲンの質量は、水の質量に対して１０～１５％である。
【0013】
好ましくは、ステップ（２）において、アルギン酸塩の質量は、水の質量に対して１５～２５％である。
【0014】
好ましくは、ステップ（２）において、前記アルギン酸塩の粘度は、４～１２ｃＰである。
【0015】
好ましくは、ステップ（３）において、コラーゲン／アルギン酸塩／ヘパラン硫酸プロテオグリカン溶液中のヘパラン硫酸プロテオグリカンの濃度は、２００～５００μｇ／Ｌである。
【0016】
好ましくは、ステップ（４）において、アルギン酸塩のカルボキシル基とポリリジンε－ＰＬのアミノ基とのモル比は、１：１～１：２である。
【0017】
好ましくは、ステップ（５）において、ＴＧ酵素の用量は、コラーゲンの質量に対して、１～１０％である。
【0018】
好ましくは、ステップ（６）における架橋の温度は、３７～５０℃である。
【0019】
本発明は、上記調製方法により調製して得られた筋肉幹細胞培養用架橋型ハイドロゲルを提供する。
【0020】
本発明は、上記筋肉幹細胞培養用架橋型ハイドロゲルを含む培地を提供する。
【0021】
本発明は、上記筋肉幹細胞培養用架橋型ハイドロゲルを培地として用いる、筋肉幹細胞の培養方法を提供する。
【0022】
好ましくは、上記筋肉幹細胞は、特に限定されていないが、ブタ筋肉幹細胞、ウシ筋肉幹細胞などを含む。
【0023】
本発明は、上記調製方法又は上記筋肉幹細胞培養用架橋型ハイドロゲルの、培養肉分野における使用を提供する。
【0024】
本発明により得られる有利な効果
１．本発明に係るハイドロゲルの調製に用いるスラリーによれば、コラーゲンとアルギン酸塩をベースとし、ポリリジンとヘパラン硫酸プロテオグリカンを加え、ＴＧ酵素によってコラーゲン、ポリリジン及びヘパラン硫酸プロテオグリカンを連結して共有結合による架橋を形成し、さらにポリリジンとアルギン酸塩との物理的静電相互作用によって緻密な三次元「エッグボックス」構造を形成した。酵素法と物理的方法による架橋により、内外とも、緻密なダブルネットワーク型架橋ハイドロゲルを形成した。
２．本発明は、ハイドロゲル系内にポリリジンとＴＧ酵素が導入されているため、酵素法・物理的方法による二重架橋の実施に有利であり、より高い機械的強度を有するハイドロゲルを得ることができる。
３．本発明は、ハイドロゲル系内にコラーゲンが導入されているため、幹細胞への接着に有利であり、ハイドロゲルの生体適合性を向上させることができる。
４．本発明は、ハイドロゲル系内にヘパラン硫酸プロテオグリカンが導入されているため、幹細胞成長因子の固定・保持に有利であり、成長因子の長期的放出が可能となる。
１．本発明に係るハイドロゲルの調製に用いるスラリーによれば、コラーゲンとアルギン酸塩をベースとし、ポリリジンとヘパラン硫酸プロテオグリカンを加え、ＴＧ酵素によってコラーゲン、ポリリジン及びヘパラン硫酸プロテオグリカンを連結して共有結合による架橋を形成し、さらにポリリジンとアルギン酸塩との物理的静電相互作用によって緻密な三次元「エッグボックス」構造を形成した。酵素法と物理的方法による架橋により、内外とも、緻密なダブルネットワーク型架橋ハイドロゲルを形成した。
２．本発明は、ハイドロゲル系内にポリリジンとＴＧ酵素が導入されているため、酵素法・物理的方法による二重架橋の実施に有利であり、より高い機械的強度を有するハイドロゲルを得ることができる。
３．本発明は、ハイドロゲル系内にコラーゲンが導入されているため、幹細胞への接着に有利であり、ハイドロゲルの生体適合性を向上させることができる。
４．本発明は、ハイドロゲル系内にヘパラン硫酸プロテオグリカンが導入されているため、幹細胞成長因子の固定・保持に有利であり、成長因子の長期的放出が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1】酵素法・物理的方法による、コラーゲン／ε－ＰＬ／ヘパラン硫酸プロテオグリカン／アルギン酸塩に基づくダブルネットワーク型ハイドロゲルの調製フローチャートである。
【図2】３種のヘパリン及びその誘導体とｂＦＧＦとの、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの結合の効率を示すグラフである。
【図3】３種のヘパリン及びその誘導体とｂＦＧＦとの、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの放出の曲線を示すグラフである。
【図4】実施例１で調製して得られたハイドロゲルを用いて初代ブタ筋肉幹細胞を培養した顕微鏡画像であり、ａ）は分化前の初代ブタ筋肉幹細胞の顕微鏡画像（４Ｘ）であり、ｂ）は７２時間分化後の初代ブタ筋肉幹細胞の顕微鏡画像（４Ｘ）である。
【図5】実施例１で調製して得られたハイドロゲルのＳＥＭ画像であり、ａ）は５００μｍでのＳＥＭ画像であり、ｂ）は２００μｍでのＳＥＭ画像である。
【図6】比較例１で調製して得られたハイドロゲルを用いて初代筋肉幹細胞を培養した顕微鏡画像である。
【図7】比較例２で調製して得られたハイドロゲルを用いて初代筋肉幹細胞を培養した顕微鏡画像である。
【図8】比較例３で調製して得られたハイドロゲルを用いて初代筋肉幹細胞を培養した顕微鏡画像である。
【図9】比較例４で調製して得られたハイドロゲルを用いて初代筋肉幹細胞を培養した顕微鏡画像である。
【図10】比較例５で調製して得られたハイドロゲルを用いて初代筋肉幹細胞を培養した顕微鏡画像である。
【発明を実施するための形態】
【0026】
以下、本発明の実施形態を実施例と併せて詳細に説明するが、以下の実施例は本発明を説明することのみを目的としており、本発明の範囲を限定するものと考えるべきではないことは、当業者であれば理解できるであろう。実施例において具体的な条件が示されていない場合、当該実施例は従来の条件、又は製造者によって推奨される条件に従って実施される。使用される試薬又は装置について製造者が明記されていない場合、当該試薬又は装置はいずれも市販で入手できる通常の製品である。
【0027】
ＴＧ酵素は、中国安徽大唐生物工程有限公司から購入し、酵素活性は１０９Ｕ／ｇである。
【0028】
アルギン酸塩は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入し、粘度は８ｃＰである。
【0029】
実施例１：酵素法・物理的方法による、コラーゲン／ε－ＰＬ／ヘパラン硫酸プロテオグリカン／アルギン酸塩に基づくダブルネットワーク型ハイドロゲルの調製
図１のフローチャートに従って以下の通りハイドロゲルを調製した。コラーゲン１０ｇを０．０２ｍｏｌ／Ｌ酢酸溶液１００ｍＬに加え、撹拌して溶解させ、コラーゲン溶液を得た。コラーゲン溶液にアルギン酸塩を１５ｇ加え、アルギン酸塩が溶解するまで撹拌して、コラーゲン／アルギン酸塩溶液を得た。続いて、調製して得られた溶液にヘパラン硫酸プロテオグリカンを２０μｇ加え、コラーゲン／アルギン酸塩／ヘパラン硫酸プロテオグリカン溶液を得た。当該溶液に、ε－ＰＬを、そのアミノ基と、アルギン酸塩のカルボキシル基とのモル比が１：１となるように加え、均一に撹拌して、物理架橋による第１のスラリーを調製した。第１のスラリーにＴＧ酵素を０．１ｇ加え、均一に撹拌して、酵素架橋により第２のスラリーを調製した。このスラリーを鋳型に入れ、３７℃で１２時間架橋させ、型から出し、酵素法・物理的方法による、コラーゲン／ε－ＰＬ／ヘパラン硫酸プロテオグリカン／アルギン酸塩に基づくダブルネットワーク型ハイドロゲルを得た。ハイドロゲルでブタ筋肉幹細胞を７日間培養した後、ブタ筋肉幹細胞が大量に確認された。ハイドロゲルを真空凍結乾燥機で凍結乾燥（－８０℃）した後、走査型電子顕微鏡で観察したところ、ハイドロゲルは複数の孔径を有する多孔質結構であった。
図１のフローチャートに従って以下の通りハイドロゲルを調製した。コラーゲン１０ｇを０．０２ｍｏｌ／Ｌ酢酸溶液１００ｍＬに加え、撹拌して溶解させ、コラーゲン溶液を得た。コラーゲン溶液にアルギン酸塩を１５ｇ加え、アルギン酸塩が溶解するまで撹拌して、コラーゲン／アルギン酸塩溶液を得た。続いて、調製して得られた溶液にヘパラン硫酸プロテオグリカンを２０μｇ加え、コラーゲン／アルギン酸塩／ヘパラン硫酸プロテオグリカン溶液を得た。当該溶液に、ε－ＰＬを、そのアミノ基と、アルギン酸塩のカルボキシル基とのモル比が１：１となるように加え、均一に撹拌して、物理架橋による第１のスラリーを調製した。第１のスラリーにＴＧ酵素を０．１ｇ加え、均一に撹拌して、酵素架橋により第２のスラリーを調製した。このスラリーを鋳型に入れ、３７℃で１２時間架橋させ、型から出し、酵素法・物理的方法による、コラーゲン／ε－ＰＬ／ヘパラン硫酸プロテオグリカン／アルギン酸塩に基づくダブルネットワーク型ハイドロゲルを得た。ハイドロゲルでブタ筋肉幹細胞を７日間培養した後、ブタ筋肉幹細胞が大量に確認された。ハイドロゲルを真空凍結乾燥機で凍結乾燥（－８０℃）した後、走査型電子顕微鏡で観察したところ、ハイドロゲルは複数の孔径を有する多孔質結構であった。
【0030】
実施例２：酵素法・物理的方法による、コラーゲン／ε－ＰＬ／ヘパラン硫酸プロテオグリカン／アルギン酸塩に基づくダブルネットワーク型ハイドロゲルの調製
図１のフローチャートに従って以下の通りハイドロゲルを調製した。コラーゲン１５ｇを０．０５ｍｏｌ／Ｌ酢酸溶液１００ｍＬに加え、撹拌して溶解させ、コラーゲン溶液を得た。コラーゲン溶液にアルギン酸塩を２５ｇ加え、アルギン酸塩が溶解するまで撹拌して、コラーゲン／アルギン酸塩溶液を得た。続いて、調製して得られた溶液にヘパラン硫酸プロテオグリカンを５０μｇ加え、コラーゲン／アルギン酸塩／ヘパラン硫酸プロテオグリカン溶液を得た。当該溶液に、ε－ＰＬを、そのアミノ基と、アルギン酸塩のカルボキシル基とのモル比が２：１となるように加え、均一に撹拌して、物理架橋により第１のスラリーを調製した。第１のスラリーにＴＧ酵素を１．５ｇ加え、均一に撹拌して、酵素架橋により第２のスラリーを調製した。このスラリーを鋳型に入れ、３７℃で３６時間架橋させ、型から出し、酵素法・物理的方法による、コラーゲン／ε－ＰＬ／ヘパラン硫酸プロテオグリカン／アルギン酸塩に基づくダブルネットワーク型ハイドロゲルを得た。ハイドロゲルでブタ筋肉幹細胞を７日間培養した後、ブタ筋肉幹細胞が大量に確認された。ハイドロゲルを真空凍結乾燥機で凍結乾燥（－８０℃）した後、走査型電子顕微鏡で観察したところ、ハイドロゲルは複数の孔径を有する多孔質結構である。
図１のフローチャートに従って以下の通りハイドロゲルを調製した。コラーゲン１５ｇを０．０５ｍｏｌ／Ｌ酢酸溶液１００ｍＬに加え、撹拌して溶解させ、コラーゲン溶液を得た。コラーゲン溶液にアルギン酸塩を２５ｇ加え、アルギン酸塩が溶解するまで撹拌して、コラーゲン／アルギン酸塩溶液を得た。続いて、調製して得られた溶液にヘパラン硫酸プロテオグリカンを５０μｇ加え、コラーゲン／アルギン酸塩／ヘパラン硫酸プロテオグリカン溶液を得た。当該溶液に、ε－ＰＬを、そのアミノ基と、アルギン酸塩のカルボキシル基とのモル比が２：１となるように加え、均一に撹拌して、物理架橋により第１のスラリーを調製した。第１のスラリーにＴＧ酵素を１．５ｇ加え、均一に撹拌して、酵素架橋により第２のスラリーを調製した。このスラリーを鋳型に入れ、３７℃で３６時間架橋させ、型から出し、酵素法・物理的方法による、コラーゲン／ε－ＰＬ／ヘパラン硫酸プロテオグリカン／アルギン酸塩に基づくダブルネットワーク型ハイドロゲルを得た。ハイドロゲルでブタ筋肉幹細胞を７日間培養した後、ブタ筋肉幹細胞が大量に確認された。ハイドロゲルを真空凍結乾燥機で凍結乾燥（－８０℃）した後、走査型電子顕微鏡で観察したところ、ハイドロゲルは複数の孔径を有する多孔質結構である。
【0031】
実施例３：ハイドロゲルの、成長因子に対する吸着
成長因子に対する吸着実験：
酵素法・物理的方法により架橋されたダブルネットワーク型ハイドロゲル（実施例１及び実施例２のハイドロゲル）をＰＢＳで洗浄し、得られたハイドロゲルを７５％エタノールに２０分間浸漬した。その後、無菌脱イオン水に５分間浸漬して無菌水でエタノールを洗浄する操作を、３回繰り返することにより、残ったエタノールをすべて除去した（Ｆｏｏｄ Ｈｙｄｒｏｃｏｌｌｏｉｄｓ、２０１７、７２、２１０－２１８）。その後、成長因子であるビタミンＣ（０．０５μｇ／ｍＬ）及びｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）を含む溶液にハイドロゲルを移し、２４時間膨潤させた。最後に、残った溶液中のｂＦＧＦ（４５０ｎｍ）及びビタミンＣ（５３６ｎｍ）の含有量を、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定し、前記溶液中のｂＦＧＦ及びビタミンＣの初期濃度と、残った溶液中のｂＦＧＦ及びビタミンＣの濃度との差から、ハイドロゲルの成長因子に対する吸着を算出した。
成長因子に対する吸着実験：
酵素法・物理的方法により架橋されたダブルネットワーク型ハイドロゲル（実施例１及び実施例２のハイドロゲル）をＰＢＳで洗浄し、得られたハイドロゲルを７５％エタノールに２０分間浸漬した。その後、無菌脱イオン水に５分間浸漬して無菌水でエタノールを洗浄する操作を、３回繰り返することにより、残ったエタノールをすべて除去した（Ｆｏｏｄ Ｈｙｄｒｏｃｏｌｌｏｉｄｓ、２０１７、７２、２１０－２１８）。その後、成長因子であるビタミンＣ（０．０５μｇ／ｍＬ）及びｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）を含む溶液にハイドロゲルを移し、２４時間膨潤させた。最後に、残った溶液中のｂＦＧＦ（４５０ｎｍ）及びビタミンＣ（５３６ｎｍ）の含有量を、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定し、前記溶液中のｂＦＧＦ及びビタミンＣの初期濃度と、残った溶液中のｂＦＧＦ及びビタミンＣの濃度との差から、ハイドロゲルの成長因子に対する吸着を算出した。
【0032】
その結果、実施例１及び実施例２のハイドロゲルは、成長因子をすべて吸着することができ、本発明に係る方法により調製したハイドロゲルは、成長因子の吸着に役立っていると判明した。
【0033】
実施例４：ハイドロゲルからの成長因子の放出
成長因子の放出試験：
実施例３において成長因子を吸着したハイドロゲルを１ｍＬの無菌ＰＢＳ溶液に入れ、２４時間毎に、実験中のＰＢＳ液をピペットで採集するとともに等量の新たな無菌ＰＢＳ溶液を補充した。ウェルプレートに採集した前記液体を、ＥＰ管で保存し、－２０℃の冷蔵庫に入れて測定用とした。採集した液体中のｂＦＧＦ濃度（４５０ｎｍ）及びビタミンＣ（５３６ｎｍ）の含有量は、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定した。
成長因子の放出試験：
実施例３において成長因子を吸着したハイドロゲルを１ｍＬの無菌ＰＢＳ溶液に入れ、２４時間毎に、実験中のＰＢＳ液をピペットで採集するとともに等量の新たな無菌ＰＢＳ溶液を補充した。ウェルプレートに採集した前記液体を、ＥＰ管で保存し、－２０℃の冷蔵庫に入れて測定用とした。採集した液体中のｂＦＧＦ濃度（４５０ｎｍ）及びビタミンＣ（５３６ｎｍ）の含有量は、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定した。
【0034】
成長因子の放出試験から分かるように、実施例１のハイドロゲルに吸着されたｂＦＧＦ及びビタミンＣは、１２日目の時点でも検出され、実施例２のハイドロゲルに吸着されたｂＦＧＦ及びビタミンＣは、１２日目の時点でも検出され、しかも、実施例１と実施例２とで結果に有意差はなかった。この結果から、本発明により調製して得られたハイドロゲルは、幹細胞成長因子の固定・維持に有利であり、成長因子の長期的放出も可能であることが分かった。
【0035】
実施例５：ダブルネットワーク型ハイドロゲルを用いるブタ筋肉幹細胞の培養
実施例１のハイドロゲルを用いて実施例３の実験を経て得られた成長因子含有ハイドロゲルを用い、調製された酵素法・物理的方法によるダブルネットワーク型ハイドロゲルに細胞を１５００個／ｍｍ２の密度で接種し、成長培地（７９％ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１％二重抗体、７９％ＤＭＥＭ）中で２４時間培養した。その後、前記培地を分化培地（９７％ＤＭＥＭ、２％ウマ血清、１％二重抗体）に変更し、前記細胞をさらに７日間培養した。培養７日後、有意に増殖した細胞が大量に確認された。その結果を図４に示す。
実施例１のハイドロゲルを用いて実施例３の実験を経て得られた成長因子含有ハイドロゲルを用い、調製された酵素法・物理的方法によるダブルネットワーク型ハイドロゲルに細胞を１５００個／ｍｍ２の密度で接種し、成長培地（７９％ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１％二重抗体、７９％ＤＭＥＭ）中で２４時間培養した。その後、前記培地を分化培地（９７％ＤＭＥＭ、２％ウマ血清、１％二重抗体）に変更し、前記細胞をさらに７日間培養した。培養７日後、有意に増殖した細胞が大量に確認された。その結果を図４に示す。
【0036】
実施例６：ハイドロゲルに対する機械的試験
ハイドロゲルについて、インストロン社製メカニカルテストのフレーム（モデル５５６５Ａ）を用いて一軸圧縮試験を行った。応力は、力曲線σ＝Ｆ／Ａ０に従って計算した。ＦとＡ０は試料を圧縮するための力、及び試料の初期面積である。ゲルの弾性率は、Ｇ（ｔ）＝σ（ｔ）／γに従って計算した。試料について、試験を少なくとも３回繰り返した。試験の前に、ハイドロゲルに亀裂や変形がないかどうかをよく検査した。ゲルをステンレス製圧縮板の中央に揃えた。ゲルは非常に滑りやすいので、圧縮される際にゲルが自由に膨張するようにした。初期クロスヘッド速度を４％ひずみ／秒とし、それぞれ５％、１０％、２０％ひずみとなる圧縮により、試料の応力緩和を調べた。
ハイドロゲルについて、インストロン社製メカニカルテストのフレーム（モデル５５６５Ａ）を用いて一軸圧縮試験を行った。応力は、力曲線σ＝Ｆ／Ａ０に従って計算した。ＦとＡ０は試料を圧縮するための力、及び試料の初期面積である。ゲルの弾性率は、Ｇ（ｔ）＝σ（ｔ）／γに従って計算した。試料について、試験を少なくとも３回繰り返した。試験の前に、ハイドロゲルに亀裂や変形がないかどうかをよく検査した。ゲルをステンレス製圧縮板の中央に揃えた。ゲルは非常に滑りやすいので、圧縮される際にゲルが自由に膨張するようにした。初期クロスヘッド速度を４％ひずみ／秒とし、それぞれ５％、１０％、２０％ひずみとなる圧縮により、試料の応力緩和を調べた。
【0037】
調べた結果、本発明により調製して得られた実施例１のハイドロゲルは、その緩和時の応力応答が２９０秒にも及び、実施例２のハイドロゲルは、その緩和時の応力応答が３００秒にも及んだことが分かった。
【0038】
実施例７：走査型電子顕微鏡観察用のハイドロゲル試料の調製
ハイドロゲルの形態について、Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓ－４８００ ＳＥＭ（日立、日本）を用いて、凍結乾燥されたハイドロゲルに対して５ｋＶの加速電圧をかけてイメージングした。試験の前に、ハイドロゲルの断面を導電性テープで金属基材に固定し、金でスパッタリングメッキを行った。この観察の結果、本発明により調製されたハイドロゲルは、複数の孔径を有する多孔質構造であり、当該構造は成長因子に関する膨潤に有利であり、ハイドロゲル内部への成長因子の拡散を促進できることが判明した。さらに、これらの孔は、大きな比表面積を提供し、筋肉幹細胞の接着に有利である。
ハイドロゲルの形態について、Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓ－４８００ ＳＥＭ（日立、日本）を用いて、凍結乾燥されたハイドロゲルに対して５ｋＶの加速電圧をかけてイメージングした。試験の前に、ハイドロゲルの断面を導電性テープで金属基材に固定し、金でスパッタリングメッキを行った。この観察の結果、本発明により調製されたハイドロゲルは、複数の孔径を有する多孔質構造であり、当該構造は成長因子に関する膨潤に有利であり、ハイドロゲル内部への成長因子の拡散を促進できることが判明した。さらに、これらの孔は、大きな比表面積を提供し、筋肉幹細胞の接着に有利である。
【0039】
比較例１
アルギン酸塩を添加しないこと以外は、各ステップを実施例１と同様にして、酵素法により架橋されたハイドロゲルを得た。
アルギン酸塩を添加しないこと以外は、各ステップを実施例１と同様にして、酵素法により架橋されたハイドロゲルを得た。
【0040】
実施例３に従って成長因子の吸着実験を行ったところ、成長因子を２４時間吸着した後、ハイドロゲルは崩壊しており、崩壊の割合は８％を占めたことが確認された。また、調製されたハイドロゲルに対して応力試験を行ったところ、応力応答はわずか１５０秒であった。ハイドロゲルでブタ筋肉幹細胞を７日間培養した後、少量のブタ筋肉幹細胞が確認された。
【0041】
結果として、アルギン酸塩が存在していない場合、調製して得られたハイドロゲルは、成長因子に対する吸着性が著しく悪くなり、膨潤性及び機械的特性がいずれも著しく悪くなり、筋肉幹細胞の培養に不利であることがわかった。
【0042】
比較例２
コラーゲンとＴＧ酵素を添加しないこと以外は、各ステップを実施例１と同様にして、ハイドロゲルを調製した。
コラーゲンとＴＧ酵素を添加しないこと以外は、各ステップを実施例１と同様にして、ハイドロゲルを調製した。
【0043】
調製したハイドロゲルに対して、実施例３に従って成長因子の吸着実験を行ったところ、成長因子を２４時間吸着した後、ハイドロゲルは崩壊しており、崩壊の割合は５％を占めたことが分かった。また、調製されたハイドロゲルに対して応力試験を行ったところ、応力応答はわずか１８０秒であった。ハイドロゲルでブタ筋肉幹細胞を７日間培養した後、少量のブタ筋肉幹細胞が確認された。
【0044】
結果として、コラーゲンとＴＧ酵素が存在していない場合、調製して得られたハイドロゲルは、成長因子に対する吸着性が著しく悪くなり、膨潤性及び機械的特性がいずれも著しく悪くなり、筋肉幹細胞の培養に不利であることがわかった。
【0045】
比較例３
ヘパラン硫酸プロテオグリカンを添加しないこと以外は、各ステップを実施例１と同様にして、ハイドロゲルを調製した。
ヘパラン硫酸プロテオグリカンを添加しないこと以外は、各ステップを実施例１と同様にして、ハイドロゲルを調製した。
【0046】
調製したハイドロゲルに対して、成長因子の吸着実験を行ったところ、成長因子を２４時間吸着した後、ハイドロゲルは少量の成長因子しか吸着しないことが分かった。また、その後、成長因子の放出試験を行ったところ、２日後の時点でハイドロゲルからの成長因子が検出できなくなった。また、調製されたハイドロゲルに対して応力試験を行ったところ、応力応答は２８５秒であった。ハイドロゲルでブタ筋肉幹細胞を７日間培養した後、少量のブタ筋肉幹細胞が確認された。
【0047】
比較例４
アルギン酸塩１５ｇを脱イオン水５０ｍＬに加え、撹拌してアルギン酸塩溶液を得た。この溶液にε－ＰＬを、そのアミノ基と、アルギン酸塩のカルボキシル基とのモル比が１：１となるように加え、均一に撹拌し、物理架橋により第１のスラリーを調製した。次に、０．０４ｍｏｌ／Ｌの酢酸溶液５０ｍＬで、コラーゲン１０ｇを溶解し、コラーゲン溶液を得た。コラーゲン溶液にヘパラン硫酸プロテオグリカンを２０μｇ加え、均一に撹拌して溶液を得た。当該溶液を第１のスラリーに注ぎ、第１のスラリーと混合して均一に撹拌し、さらにＴＧ酵素を０．１ｇ加え、均一に撹拌し、酵素架橋により第２のスラリーを調製した。このスラリーを鋳型に入れ、３７℃で１２時間架橋させ、型から出し、ハイドロゲルを得た。ハイドロゲルでブタ筋肉幹細胞を７日間培養した後、少量のブタ筋肉幹細胞が確認された。
アルギン酸塩１５ｇを脱イオン水５０ｍＬに加え、撹拌してアルギン酸塩溶液を得た。この溶液にε－ＰＬを、そのアミノ基と、アルギン酸塩のカルボキシル基とのモル比が１：１となるように加え、均一に撹拌し、物理架橋により第１のスラリーを調製した。次に、０．０４ｍｏｌ／Ｌの酢酸溶液５０ｍＬで、コラーゲン１０ｇを溶解し、コラーゲン溶液を得た。コラーゲン溶液にヘパラン硫酸プロテオグリカンを２０μｇ加え、均一に撹拌して溶液を得た。当該溶液を第１のスラリーに注ぎ、第１のスラリーと混合して均一に撹拌し、さらにＴＧ酵素を０．１ｇ加え、均一に撹拌し、酵素架橋により第２のスラリーを調製した。このスラリーを鋳型に入れ、３７℃で１２時間架橋させ、型から出し、ハイドロゲルを得た。ハイドロゲルでブタ筋肉幹細胞を７日間培養した後、少量のブタ筋肉幹細胞が確認された。
【0048】
比較例５
０．０４ｍｏｌ／Ｌの酢酸溶液５０ｍＬに、コラーゲン１０ｇを加え、溶解するまでように撹拌し、コラーゲン溶液を得た。コラーゲン溶液にＴＧ酵素を０．１ｇ添加し、均一に撹拌してゲル状のものを得た。アルギン酸塩１５ｇを脱イオン水５０ｍＬに加え、撹拌してアルギン酸塩溶液を得た。この溶液にヘパラン硫酸プロテオグリカンを２０μｇ加え、均一に撹拌した。続いて、ε－ＰＬを、そのアミノ基と、アルギン酸塩のカルボキシル基とのモル比が１：１となるように加え、均一に撹拌し、物理架橋によりスラリーを調製した。このスラリーとゲル状のものとを混合して、ゲル料を鋳型に入れ、３７℃で１２時間架橋させ、型から出し、ハイドロゲルを得た。ハイドロゲルでブタ筋肉幹細胞を７日間培養した後、少量のブタ筋肉幹細胞が確認された。
０．０４ｍｏｌ／Ｌの酢酸溶液５０ｍＬに、コラーゲン１０ｇを加え、溶解するまでように撹拌し、コラーゲン溶液を得た。コラーゲン溶液にＴＧ酵素を０．１ｇ添加し、均一に撹拌してゲル状のものを得た。アルギン酸塩１５ｇを脱イオン水５０ｍＬに加え、撹拌してアルギン酸塩溶液を得た。この溶液にヘパラン硫酸プロテオグリカンを２０μｇ加え、均一に撹拌した。続いて、ε－ＰＬを、そのアミノ基と、アルギン酸塩のカルボキシル基とのモル比が１：１となるように加え、均一に撹拌し、物理架橋によりスラリーを調製した。このスラリーとゲル状のものとを混合して、ゲル料を鋳型に入れ、３７℃で１２時間架橋させ、型から出し、ハイドロゲルを得た。ハイドロゲルでブタ筋肉幹細胞を７日間培養した後、少量のブタ筋肉幹細胞が確認された。
【0049】
以上、本発明が好ましい実施例により開示されたが、本発明を限定するためのものではない。当業者であれば、本発明の思想及び範囲から逸脱しない限り、様々な変更及び修正を行うことができるので、本発明の権利範囲は、請求の権利範囲に規定されているものに準じるべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】