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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-07-05
(45)【発行日】2024-07-16
(54)【発明の名称】ブタサーコウイルス２型ＶＬＰワクチン
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20240708BHJP
C07K 14/315 20060101ALI20240708BHJP
C07K 14/01 20060101ALI20240708BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20240708BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240708BHJP
C12N 15/34 20060101ALI20240708BHJP
A61K 39/12 20060101ALI20240708BHJP
A61P 31/20 20060101ALI20240708BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20240708BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20240708BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240708BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00 ZNA
C07K14/315
C07K14/01
C12N7/01
C12P21/02 C
C12N15/34
A61K39/12
A61P31/20
A61K38/16
A61K47/68
C12N15/62 Z
【請求項の数】
10
(21)【出願番号】P 2021540647
(86)(22)【出願日】2020-06-23
(86)【国際出願番号】 JP2020024491
(87)【国際公開番号】W WO2021033420
(87)【国際公開日】2021-02-25
【審査請求日】2023-03-27
(31)【優先権主張番号】P 2019150494
(32)【優先日】2019-08-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】512272948
【氏名又は名称】株式会社ジェクタス・イノベーターズ
(73)【特許権者】
【識別番号】322003710
【氏名又は名称】明治アニマルヘルス株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】新川 武
(72)【発明者】
【氏名】玉城 志博
(72)【発明者】
【氏名】山崎 憲一
(72)【発明者】
【氏名】山田 陣也
(72)【発明者】
【氏名】平良 望
(72)【発明者】
【氏名】上藤 洋敬
(72)【発明者】
【氏名】與那嶺 育子
(72)【発明者】
【氏名】原國 哲也
(72)【発明者】
【氏名】山口 類
【審査官】上條 のぶよ
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１９－５０４０４７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１９－５０７７８４（ＪＰ，Ａ）
【文献】LI, Yangyang, et al.，Virology Journal，2020年06月09日，Vol. 17, No. 72，pp. 1-9
【文献】KIM, Hyun Jin, et al.，Biotechnology and Bioengineering，2015年09月04日，Vol. 113, No. 2，pp. 268-274
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １９／００
Ｃ１２Ｎ １５／６２
Ｃ０７Ｋ １４／３１５
Ｃ０７Ｋ １４／０１
Ｃ１２Ｎ ７／０１
Ｃ１２Ｐ ２１／０２
Ｃ１２Ｎ １５／３４
Ａ６１Ｋ ３９／１２
Ａ６１Ｋ ３８／１６
Ａ６１Ｋ ４７／６８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ブタサーコウイルス２型のカプシドタンパク質と、免疫グロブリン結合ドメインと、を有し、
前記免疫グロブリン結合ドメインが、プロテインＧのＢドメイン、プロテインＬのＢドメイン、および、プロテインＡのＺドメインからなる群より選択されるいずれか１種のドメインを含む、融合タンパク質。
【請求項2】
ブタサーコウイルス２型のカプシドタンパク質と、免疫グロブリン結合ドメインと、を有し、
前記免疫グロブリン結合ドメインが、前記カプシドタンパク質のＣ末端に結合している、融合タンパク質。
【請求項3】
ブタサーコウイルス２型のカプシドタンパク質と、免疫グロブリン結合ドメインと、を有し、
前記免疫グロブリン結合ドメインが、プロテインＧのＢドメイン、プロテインＬのＢドメイン、および、プロテインＡのＺドメインからなる群より選択されるいずれか１種のドメインが２個連結した構造を有する、融合タンパク質。
【請求項4】
前記カプシドタンパク質と前記免疫グロブリン結合ドメインとが、リンカーを介して結合している、請求項１～３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか一項に記載の融合タンパク質により形成されている、ウイルス様粒子。
【請求項6】
請求項５に記載のウイルス様粒子を含むワクチン。
【請求項7】
ブタサーコウイルス２型のカプシドタンパク質と、免疫グロブリン結合ドメインと、を有する融合タンパク質の製造方法であって、
前記ブタサーコウイルス２型のカプシドタンパク質と、免疫グロブリン結合ドメインと、の融合タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを調製する工程、および、
前記発現ベクターを大腸菌に導入し、前記融合タンパク質を発現させる工程、を含み、
前記免疫グロブリン結合ドメインが、プロテインＧのＢドメイン、プロテインＬのＢドメイン、および、プロテインＡのＺドメインからなる群より選択されるいずれか１種のドメインを含む、製造方法。
【請求項8】
ブタサーコウイルス２型のカプシドタンパク質と、免疫グロブリン結合ドメインと、を有する融合タンパク質の製造方法であって、
前記ブタサーコウイルス２型のカプシドタンパク質と、免疫グロブリン結合ドメインと、の融合タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを調製する工程、および、
前記発現ベクターを大腸菌に導入し、前記融合タンパク質を発現させる工程、を含み、
前記免疫グロブリン結合ドメインが、前記カプシドタンパク質のＣ末端に結合している、製造方法。
【請求項9】
ブタサーコウイルス２型のカプシドタンパク質と、免疫グロブリン結合ドメインと、を有する融合タンパク質の製造方法であって、
前記ブタサーコウイルス２型のカプシドタンパク質と、免疫グロブリン結合ドメインと、の融合タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを調製する工程、および、
前記発現ベクターを大腸菌に導入し、前記融合タンパク質を発現させる工程、を含み、
前記免疫グロブリン結合ドメインが、プロテインＧのＢドメイン、プロテインＬのＢドメイン、および、プロテインＡのＺドメインからなる群より選択されるいずれか１種のドメインが２個連結した構造を有する、製造方法。
【請求項10】
前記カプシドタンパク質と前記免疫グロブリン結合ドメインとが、リンカーを介して結合している、請求項７～９のいずれか一項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、融合タンパク質、当該融合タンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ：virus－like particles）、および当該ＶＬＰを含むワクチンに関する。本発明はまた、上記融合タンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２：porcine circovirus 2）は、ブタに感染すると免疫不全を誘発し、他の感染症への感受性を高めるため、ＰＣＶ２感染症対策は養豚農家にとって重要である。ＰＣＶ２に感染したブタは、ブタサーコウイルス関連疾患（ＰＣＶＡＤ：porcine circovirus associated diseases）を発症するが、その主要な症状である離乳後多臓器性発育不良症候群（ＰＭＷＳ：postweaning multisystemic wasting syndrome）は、５～６週齢のブタに好発し、臨床的には削痩、皮膚の蒼白、発育不全、呼吸困難、下痢および黄疸を特徴とする（非特許文献２）。ＰＣＶ２は、この原因ウイルスとして、カナダ西部のＰＭＷＳを発症するブタから初めて分離された（非特許文献３）。
【0003】
ＰＣＶ２は、一本鎖環状ＤＮＡをゲノムに持つ直径約２０ｎｍのノンエンベロープウイルスである。ＰＣＶ２は、３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦｓ（open reading frames）：ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３）を有し、ＯＲＦ２がカプシドタンパク質（Ｃａｐ（capsid protein））をコードしている。Ｃａｐは、当該単量体６０個が会合し、正二十面体の多量体分子として、ウイルス様粒子を形成することが知られている（非特許文献１）。ＶＬＰはウイルスゲノムＤＮＡを含まないため増殖できず、ＰＣＶ２の感染予防のためのワクチンに適用することができる。
【0004】
ＰＣＶ２の感染予防のためのワクチンとしては、ＰＣＶ２不活化ワクチン「サーコバック（登録商標）」やＰＣＶ１／ＰＣＶ２キメラウイルス不活化ワクチン「スバキシン（登録商標）ＰＣＶ２」が上市されている。また、これらの不活化ワクチン以外にも、遺伝子組換えバキュロウイルス・昆虫細胞発現系でＣａｐを産生したＶＬＰワクチン「ポーシリス（登録商標）ＰＣＶ」（非特許文献４）および「インゲルバックサーコフレックス（登録商標）」（特許文献１）等が実用化されている。
【0005】
さらに、発現系として、ピキア酵母（Pichia pastoris）、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）および大腸菌（Escherichia coli）等を用いて、ＰＣＶ２のＣａｐを産生する試みが行われている（非特許文献１、５～１３）。
【0006】
ところで、非特許文献１６には、免疫グロブリン結合ドメイン（ＩＢＤ：immunoglobulin-binding domain）について、これと融合した抗原が、リンパ濾胞へ効率よく運搬され、当該抗原の免疫原性が向上したことが報告されている。
【0007】
また、非特許文献１７には、ＩＢＤとして、Ｚドメインが記載されている。Ｚドメインは、黄色ブドウ球菌のプロテインＡ由来のＩＢＤであり、３－ヘリックスバンドル（three－helix bundle）と呼ばれる３本のα－ヘリックスが折畳まれて束（bundled）になったタンパク質立体構造を有する。なお、プロテインＡは、黄色ブドウ球菌の病原因子のひとつであり、菌体外膜上に存在する４２ｋＤａのタンパク質である。また、プロテインＡは、一次配列的に類似性の高い５つのＩＢＤｓ（Ｅ、Ｄ、Ａ、ＢおよびＣドメイン）を有する。なお、Ｚドメインは、Ｂドメインに２ヶ所のアミノ酸置換を導入して作製された人工的な配列である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【文献】日本国公開特許公報「特表２００８-５２６２１２号公報」
【非特許文献】
【0009】
【文献】Khayat R. et al., J. Virol. 2011, 85, 7856-7862
【文献】Harding J.C.S. et al., Swine Health Prod. 1997, 5, 201-203
【文献】Ellis J. et al., Can. Vet. J. 1998, 39, 44-51
【文献】Liu L.-J. et al., Arch. Virol. 2008, 153, 2291-2295
【文献】Tu Y. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2013, 97, 2867-2875
【文献】Zaveckas M. et al., J. Chromatogr. B 2015, 991, 21-28
【文献】Marcekova Z. et al., J. Virol. Methods 2009, 162, 133-141
【文献】Liu Q. et al., Protein Expr. Purif. 2001, 21, 115-120
【文献】Yin S. et al., Virol. J. 2010, 7, 166
【文献】Wu PC et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2012, 95, 1501-1507
【文献】Wu PC et al., J. Biotechnol. 2016, 220, 78-85
【文献】Zhang Y. et al., Arch. Virol. 2016, 161, 1485-1491
【文献】Xi X. et al., J. Biotechnol. 2016, 223, 8-12
【文献】Wang N. et al., J. Virol. Methods 2017, 243, 146-150
【文献】Burroughs A.M. et al., Biol. Direct 2007, 2, 18
【文献】Miyata T. et al., Infect. Immun. 2011, 79, 4260-4275
【文献】Bjorn N. et al., Protein Eng. 1987, 1, 107-113
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
上記のとおり、ＰＣＶ２の感染予防薬として、幾つかのワクチンが既に上市されているが、ＰＣＶ２は、培養細胞に感染させても高いウイルス力価を得ることが難しいとの問題がある。
【0011】
また、ＰＣＶ２のＣａｐを産生するための発現系として、遺伝子組換えバキュロウイルス・昆虫細胞発現系を用いた場合は、コスト面および作業的な煩雑さにおいて課題がある。加えて、当該発現系で産生されたＣａｐから形成されるＶＬＰは、物理化学的負荷に対する分子安定性においても課題があり、長期にわたって安定的に保存することが困難であるとの問題がある。
【0012】
さらに、ＰＣＶ２のＣａｐを産生するための発現系として、大腸菌発現系を用いた場合、発現タンパク質は、不溶性凝集体（封入体：inclusion bodies）となって菌体内に蓄積されるため、ＶＬＰが大腸菌細胞質内で自発的に再構築（自然会合）され、可溶性のＶＬＰタンパク質として回収されたという例は報告されていない。
【0013】
したがって、さらなるＰＣＶ２ワクチンの開発が求められている。
【0014】
本発明は、上述の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、畜産分野で用いるワクチンとして利用可能であり、且つ、物理化学的負荷に対する高い分子安定性を有するＰＣＶ２のＶＬＰおよびその利用技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0015】
本発明者らは、上記課題について鋭意検討した結果、（ｉ）ＰＣＶ２のＣａｐとＩＢＤとの融合タンパク質（Ｃａｐ－ＩＢＤ融合タンパク質）が、大腸菌発現宿主の細胞質内で自然会合して、インビトロでの人工的会合工程を経ることなくＶＬＰを形成し得ること、（ｉｉ）このようにして形成されたＶＬＰが、加熱処理や長期間の低温・冷凍保存等の物理化学的負荷に対する分子安定性を有すること、（ｉｉｉ）得られたＶＬＰがワクチンとして使用し得ること、等の新規知見を見出し、本発明を完成させるに至った。
【0016】
すなわち、本発明の一態様は、ブタサーコウイルス２型のカプシドタンパク質と、免疫グロブリン結合ドメインと、を有する融合タンパク質に関する。
【0017】
また、本発明の別の一態様は、ブタサーコウイルス２型のカプシドタンパク質と、免疫グロブリン結合ドメインと、を有する融合タンパク質の製造方法であって、上記ブタサーコウイルス２型のカプシドタンパク質と、免疫グロブリン結合ドメインと、の融合タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを調製する工程、および、上記発現ベクターを大腸菌に導入し、上記融合タンパク質を発現させる工程、を含む、製造方法に関する。
【発明の効果】
【0018】
本発明の一態様によれば、畜産分野で用いるワクチンとして利用可能であり、且つ、物理化学的負荷に対する高い分子安定性を有するＰＣＶ２のＶＬＰおよびその利用技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】ＰＣＶ２のＣａｐからのＶＬＰ形成における従来技術の問題点および本発明の特徴点を説明する概念図である。
【図2】可溶化促進タグ（ＳＵＭＯ）およびＩＢＤｓ（ＳｐＧＢ、ＰｐＬＢ、Ｚ）のタンパク質構造、並びに、β－graspフォールド構造および３－ヘリックスバンドル構造の模式図である。
【図3】実施例で回収された融合タンパク質における、ＣａｐおよびＩＢＤｓ（ＳｐＧＢ１－Ｂ２、ＰｐＬＢ１－Ｂ２、ＺＺ）または可溶化促進タグ（ＳＵＭＯ）の配置を示す模式図である。
【図4】ＰＣＶ２ Ｃａｐ－ＳｐＧＢ１－Ｂ２のＶＬＰの電子顕微鏡写真である。
【図5】ＰＣＶ２ Ｃａｐ－ＰｐＬＢ１－Ｂ２のＶＬＰの電子顕微鏡写真である。
【図6】ＰＣＶ２ Ｃａｐ－ＺＺのＶＬＰの電子顕微鏡写真である。
【図7】ＰＣＶ２ Ｃａｐ－ＳＵＭＯのＶＬＰの電子顕微鏡写真である。
【図8】ＰＣＶ２ Ｃａｐ－ＺＺのＶＬＰについての、加熱処理前後のゲルろ過クロマトグラフィーの解析結果を示すクロマトグラムである。
【図9】ＰＣＶ２ Ｃａｐ－ＺＺのＶＬＰ表層からＺＺを乖離させた後のＶＬＰについての、加熱処理前後のゲルろ過クロマトグラフィーの解析結果を示すクロマトグラムである。
【図10】ＰＢＳ溶液中４℃で１年間保存した後の、ＰＣＶ２ Ｃａｐ－ＺＺのＶＬＰの電子顕微鏡写真である。
【図11】ＰＢＳ溶液中－３０℃で１年間保存した後の、ＰＣＶ２ Ｃａｐ－ＺＺのＶＬＰの電子顕微鏡写真である。
【図12】ＰＢＳ溶液中－８０℃で１年間保存した後の、ＰＣＶ２ Ｃａｐ－ＺＺのＶＬＰの電子顕微鏡写真である。
【図13】血清中のウイルスコピー数測定結果を示すグラフである。
【図14】リンパ節中のウイルスコピー数測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0020】
〔従来技術の問題点と本発明の概要〕
上述の通り、ＰＣＶ２ワクチンに関する従来技術には、種々の問題がある。
上述の通り、ＰＣＶ２ワクチンに関する従来技術には、種々の問題がある。
【0021】
例えば、非特許文献１４において報告されているように、大腸菌発現系を用いた場合は、当該発現系で産生されたＣａｐから形成されるＶＬＰが物理化学的負荷に対して分子が不安定になるという問題がある。当該文献によれば、ＰＣＶ２ ＣａｐのＶＬＰを、ＰＢＳ溶液中で４℃保存したところ、僅か１ヶ月すらその粒子形状を維持できず、長期間保存のためには、１５％トレハロース等を含む複数の化合物を混合した特殊な溶液を使用する必要がある。
【0022】
また、非特許文献５に記載されるピキア酵母発現系では、産生されるＣａｐからＶＬＰを形成したという証拠はない。また、非特許文献６に記載される出芽酵母発現系では、産生されるＣａｐから形成されるＶＬＰは、その形状に歪みがある。
【0023】
さらに、非特許文献１、７～１３に記載される大腸菌発現系は、コスト面および作業的な簡便性の面において魅力があるが、ＶＬＰのような構造的に複雑な多量体分子の発現には、未だに多くの課題がある。
【0024】
具体的には、大腸菌発現系で発現された異種タンパク質は、その大部分が不溶性凝集体（封入体：inclusion bodies）となって菌体内に蓄積されることが多い。そして、封入体となった異種タンパク質は、天然の立体構造をとっていないため、そのほとんどは、効果的なワクチンとして機能しない。封入体となった異種タンパク質を天然の立体構造に巻き戻す方法としては、リフォールディング法が知られており、上述の幾つかの大腸菌発現系においても、封入体から回収したＰＣＶ２のＣａｐをグアニジン塩酸塩等の変性剤で可溶化し、透析法等によってリフォールディングすることが試みられている。
【0025】
一方、異種タンパク質を可溶性タンパク質として発現させる方法として、目的タンパク質に可溶化促進タグを融合する方法が一般的に用いられている。このような可溶化促進タグとしては、ＧＳＴ（glutathione S-transferase）およびＭＢＰ（maltose－binding protein）、並びに、β－graspフォールド構造（１本のα－ヘリックスが１つのβ－シートに握られた（grasped）ようなタンパク質構造）を有するＳＵＭＯ（small ubiquitin－like modifier）（非特許文献１５）等が知られている。これらの可溶化促進タグを、主に目的タンパク質のＮ末端に融合させて発現させると、大腸菌発現宿主の可溶性画分から、当該融合タンパク質を回収し得る場合がある。上述の幾つかの大腸菌発現系においても、ＰＣＶ２のＣａｐのＮ末端に可溶化促進タグを融合させて、可溶性タンパク質として回収することが試みられている。しかしながら、回収した可溶性Ｃａｐから、ワクチンとして機能し得るＶＬＰを形成するには、多くの問題がある。
【0026】
例えば、非特許文献１に記載される大腸菌発現系では、可溶性タンパク質として発現させたＰＣＶ２のＣａｐから、ＶＬＰを形成するために、ニッケルアフィニティー精製やそれに続くインビトロでのバッファー交換等の煩雑な作業工程が必要である。
【0027】
また、非特許文献７に記載される大腸菌発現系では、同じく、可溶性タンパク質としてＰＣＶ２のＣａｐを発現させているが、得られたＣａｐにイオン交換クロマトグラフィー等の後処理を施しても、ＶＬＰの形成には至っていない。
【0028】
非特許文献８に記載される大腸菌発現系では、ＰＣＶ２のＣａｐのＮ末端に、可溶化促進タグとしてＧＳＴまたはＭＢＰを融合させている。しかしながら、ＧＳＴ－Ｃａｐ融合タンパク質は、分解産物としてしか検出されていない。また、ＭＢＰ－Ｃａｐ融合タンパク質は、可溶性タンパク質として発現したが、その後のアフィニティー精製工程を経ても、インビトロでのＶＬＰ形成には至っていない。
【0029】
非特許文献９に記載される大腸菌発現系では、ＰＣＶ２のＣａｐのＮ末端に、可溶化促進タグとしてＳＵＭＯを融合させている。その結果、可溶性のＳＵＭＯ－Ｃａｐ融合タンパク質が発現したが、この融合タンパク質は、自然（自己）会合によってはＶＬＰを形成しなかった。そこで、ＳＵＭＯプロテアーゼによってＳＵＭＯタグを切断・除去し、得られたＣａｐに透析処理等の煩雑な後処理を施して、インビトロでＶＬＰを形成することを試みている。しかしながら、形成されたＶＬＰは、天然のＰＣＶ２粒子とは形態的に異なり、粒子形状の歪み、および、粒子径の不均一性等の問題を有するものである。
【0030】
非特許文献１０および１１に記載される大腸菌発現系では、融合タグ等を一切含まない天然のＣａｐ配列のみを利用して、ＶＬＰ形成を試みている。しかしながら、得られるＶＬＰは極めて少量であり、また、ショ糖密度勾配遠心法（非特許文献１０）や、ゲルろ過クロマトグラフィー法（非特許文献１１）等の精製処理等が必要である。また、形成されたＶＬＰは、非特許文献９のＶＬＰと同様に、形態的に問題を有するものである。
【0031】
非特許文献１２に記載される大腸菌発現系においても、発現させた可溶性ＣａｐからのＶＬＰ形成が試みられているが、上記と同様に、種々の煩雑な作業工程が必要である。
【0032】
非特許文献１３に記載される大腸菌発現系は、特定の遺伝子型ＰＣＶ２のみに限定された方法であり、また、発現させた可溶性Ｃａｐから、インビトロでのＶＬＰ形成を促進するためには、バッファー交換等の作業工程が必須である。
【0033】
すなわち、上述の非特許文献１および７～１３の大腸菌発現系は、可溶化促進タグの融合またはその他の操作によって、インビトロでのＶＬＰの再構築を試みるものである。しかしながら、そのいずれにおいても、バッファー交換等の種々の煩雑な作業工程が必須である。また、形成されたＶＬＰの多くは、粒子形状の歪み、粒子径の不均一性、凝集塊の形成等の問題を有するものである。
【0034】
畜産分野で用いるワクチンを製造するためには、煩雑な作業工程の必要なしに、粒子形状の歪み等がない良好な形態を有するＶＬＰを製造し得る、大腸菌発現系の開発が求められている。煩雑な作業工程を省く手段として、大腸菌発現宿主の細胞内で可溶性Ｃａｐを自然（自己）会合させることにより、大腸菌発現宿主に自発的にＶＬＰを形成させることが考えられる。これにより、インビトロでの人工的会合工程を経ることなしに、良好な形態を有するＶＬＰを回収し得る。
【0035】
天然のＰＣＶ２のＶＬＰは、粒子の内腔側にＣａｐのＮ末端が位置し、表層側にＣ末端が位置することが報告されている（非特許文献１）。しかし、既報の可溶化促進タグは、ＣａｐのＮ末端に融合されているため、Ｃａｐを自然会合させるには物理的な制限がある。そのため、このような可溶化促進タグを利用する大腸菌発現系において、Ｃａｐを自然会合させることは困難である。
【0036】
本発明者らは、上記の問題を解決するべく鋭意検討を進める中で新たな知見を得て、それに基づき、新規のＰＣＶ２ワクチンを開発することに成功した。
【0037】
本発明の概要を、図１を用いて、従来技術と比較しながら説明する。
【0038】
【0039】
図１の上段に示すように、昆虫細胞または哺乳動物細胞を宿主とするＰＣＶ２ Ｃａｐ発現系では、可溶性Ｃａｐが発現され、発現宿主の細胞内で自然（自己）会合し、ＶＬＰを形成する。しかし、低温長期保存等の物理化学的負荷を与えると、そのＶＬＰは本来の粒子形状を維持できなくなり、Ｃａｐ単量体への崩壊や凝集体（Ｃａｐ aggregates）の形成を起こす。
【0040】
また、図１の中段に示すように、大腸菌を宿主とするＰＣＶ２ Ｃａｐ発現系では、たとえＣａｐが可溶性タンパク質として発現したとしても、その細胞内での自然（自己）会合自体が非常に困難であり、インビトロでの煩雑な作業工程なしでは、ＶＬＰを形成することができない。
【0041】
一方、図１の下段に示すように、本発明では、大腸菌を宿主とするＰＣＶ２ Ｃａｐ発現系で、Ｃａｐ－ＩＢＤ融合タンパク質を発現させたところ、昆虫・哺乳動物細胞発現系と同様に、発現宿主の細胞内で、Ｃａｐが自然（自己）会合し、ＶＬＰを形成することが明らかとなった。さらに、形成されたＶＬＰは、上記昆虫・哺乳動物細胞発現系で形成されたＶＬＰとは異なり、物理化学的負荷に対して良好な分子安定性（長期低温保存安定性等）を有することも明らかとなった。しかし、このようにして形成されたＶＬＰの表層からＩＢＤｓを乖離させると、上記昆虫・哺乳動物細胞発現系で形成されたＶＬＰと同様に、物理化学的負荷を与えることによって、ＶＬＰは崩壊することが分かった。すなわち、ＣａｐにＩＢＤを融合させることで、（１）「ＶＬＰ形成促進機能」および（２）「ＶＬＰ崩壊抑制機能」が新たに付与されることが明らかとなった。
【0042】
〔融合タンパク質およびウイルス様粒子（ＶＬＰ）〕
本発明の一実施形態に係る融合タンパク質は、ＰＣＶ２のＣａｐと、ＩＢＤと、を有する融合タンパク質（「Ｃａｐ－ＩＢＤ融合タンパク質」とも称する）である。
本発明の一実施形態に係る融合タンパク質は、ＰＣＶ２のＣａｐと、ＩＢＤと、を有する融合タンパク質（「Ｃａｐ－ＩＢＤ融合タンパク質」とも称する）である。
【0043】
また、本発明の一実施形態に係るＰＣＶ２のＶＬＰは、複数のＣａｐ－ＩＢＤ融合タンパク質が会合することにより形成される多量体分子である。
【0044】
Ｃａｐ－ＩＢＤ融合タンパク質は、大腸菌発現系により可溶性タンパク質として発現し、大腸菌発現宿主の細胞内で自然（自己）会合して、自発的にＶＬＰを形成することができる。
【0045】
本明細書において、「ＶＬＰ」とは、天然のウイルスと類似した形状を有する粒子であって、且つ、非感染性の粒子を指す。ＶＬＰは、上述のとおり、天然のウイルスと類似した形状を有する粒子であるため、天然のウイルスと免疫学的な交叉反応性を示し、有効なワクチンとして機能する。なお、ＶＬＰは、ウイルスゲノムを欠くため、非増殖性・非感染性であり、安全性が極めて高い。
【0046】
本明細書において、「Ｃａｐ」とは、ＰＣＶ２のカプシドタンパク質を意味する。
【0047】
本発明の一実施形態において、Ｃａｐは、以下の（１）～（３）に示されるタンパク質、以下の（４）または（５）に示されるポリヌクレオチドからなる遺伝子にコードされるタンパク質であり得る：
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＶＬＰを形成する機能を有するタンパク質；
（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＶＬＰを形成する機能を有するタンパク質；
（４）配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または、
（５）配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＶＬＰを形成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＶＬＰを形成する機能を有するタンパク質；
（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＶＬＰを形成する機能を有するタンパク質；
（４）配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または、
（５）配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＶＬＰを形成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【0048】
ＰＣＶ２ ＣａｐがＶＬＰを形成する機能を有するタンパク質であるか否かは、当該タンパク質を、本発明の一実施形態におけるＩＢＤと融合タンパク質を形成させて、当該融合タンパク質を大腸菌で発現させたときに、ＶＬＰが形成されていれば、ＶＬＰを形成する機能を有するタンパク質であると判定することができる。
【0049】
上記（３）のタンパク質に関して、配列同一性は高いほど好ましく、例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または、９９％以上であってもよい。なお、アミノ酸配列の配列同一性は、例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．１４（株式会社ゼネティックス社製の商品名）を当該商品のマニュアルに従って使用して算出することができる。なお、後述する下記（８）、（１３）および（１８）のタンパク質の同一性についても同様である。
【0050】
本明細書における「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸」では、欠失、置換若しくは付加が生じる位置は特に限定されない。
【0051】
また、「１若しくは数個のアミノ酸」が意図するアミノ酸の数は特に限定されないが、５０個以内、４０個以内、３０個以内、２０個以内、１９個以内、１８個以内、１７個以内、１６個以内、１５個以内、１４個以内、１３個以内、１２個以内、１１個以内、１０個以内、９個以内、８個以内、７個以内、６個以内、５個以内、４個以内、３個以内、２個以内、または、１個のアミノ酸であり得る。
【0052】
アミノ酸の置換は、保存的置換であることが好ましい。なお、保存的置換とは、特定のアミノ酸から、当該アミノ酸と同様な化学的性質および／または構造を有する他のアミノ酸に置換されることをいう。化学的性質としては、例えば、疎水性度（疎水性および親水性）、電荷（中性、酸性および塩基性）が挙げられる。構造としては、例えば、側鎖、または、側鎖の官能基として存在する芳香環、脂肪炭化水素基およびカルボキシル基が挙げられる。
【0053】
保存的置換の例としては、例えば、セリンとスレオニンとの置換、リジンとアルギニンとの置換、およびフェニルアラニンとトリプトファンアミノとの置換、が挙げられる。勿論、本発明は、これらの置換に限定されない。
【0054】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントな条件」は、いわゆる塩基配列に特異的な２本鎖のポリヌクレオチドが形成され、非特異的な２本鎖のポリヌクレオチドが形成されない条件をいう。換言すれば、相同性が高い核酸同士、例えば完全にマッチしたハイブリッドの融解温度（Ｔｍ値）から１５℃、好ましくは１０℃、更に好ましくは５℃低い温度までの範囲の温度でハイブリダイズする条件ともいえる。
【0055】
例えば、一例を示すと、０．２５Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２、７％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１×デンハルト溶液からなる緩衝液中で温度が６０～６８℃、好ましくは６５℃、さらに好ましくは６８℃の条件下で１６～２４時間ハイブリダイズさせ、さらに２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２、１％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡからなる緩衝液中で温度が６０～６８℃、好ましくは６５℃、さらに好ましくは６８℃の条件下で１５分間の洗浄を２回行う条件を挙げることができる。
【0056】
他の例としては、２５％ホルムアミド、より厳しい条件では５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．０、１０×デンハルト溶液、２０μｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液中、４２℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、４２℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後の洗浄における洗浄液および温度条件は、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度で、より厳しい条件としては「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度で、さらに厳しい条件としては「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度で実施することができる。このようにハイブリダイゼーションの洗浄の条件が厳しくなるほど、特異性の高いハイブリダイズとなる。ただし、上記ＳＳＣ、ＳＤＳおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間等）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。このことは、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory（2001）等に記載されている。
【0057】
本明細書において、「ＩＢＤ」とは、免疫グロブリン結合能を有するポリペプチドの機能単位を指す。本発明において好適に使用されるＩＢＤとしては、β－graspフォールド構造を有するＩＢＤ、および、３－ヘリックスバンドル構造を有するＩＢＤが挙げられる。
【0058】
β－graspフォールド構造を有するＩＢＤとしては、プロテインＧのＢドメイン（ＳｐＧＢ）およびプロテインＬのＢドメイン（ＰｐＬＢ）が挙げられる。
【0059】
ＳｐＧＢとしては、プロテインＧのＢ１ドメインおよびＢ２ドメインが挙げられる。本発明の一実施形態においては、Ｂ１ドメインとＢ２ドメインとを連結したものを特に好ましく用いることができる。
【0060】
本発明の一実施形態において、ＳｐＧＢは、以下の（６）～（８）に示されるタンパク質、以下の（９）または（１０）に示されるポリヌクレオチドからなる遺伝子にコードされるタンパク質であり得る：
（６）配列番号３または５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（７）配列番号３または５で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＶＬＰを形成する機能を有するタンパク質；
（８）配列番号３または５で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＶＬＰを形成する機能を有するタンパク質；
（９）配列番号４または６で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または、
（１０）配列番号４または６で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＶＬＰを形成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（６）配列番号３または５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（７）配列番号３または５で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＶＬＰを形成する機能を有するタンパク質；
（８）配列番号３または５で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＶＬＰを形成する機能を有するタンパク質；
（９）配列番号４または６で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または、
（１０）配列番号４または６で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＶＬＰを形成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【0061】
ＳｐＧＢがＶＬＰを形成する機能を有するタンパク質であるか否かは、当該タンパク質を、本発明の一実施形態におけるＰＣＶ２ Ｃａｐと融合タンパク質を形成させて、当該融合タンパク質を大腸菌で発現させたときに、ＶＬＰが形成されていれば、ＶＬＰを形成する機能を有するタンパク質であると判定することができる。
【0062】
ＰｐＬＢとしては、プロテインＬのＢ１ドメインおよびＢ２ドメインが挙げられる。本発明の一実施形態においては、Ｂ１ドメインとＢ２ドメインとを連結したものを特に好ましく用いることができる。
【0063】
本発明の一実施形態において、ＰｐＬＢは、以下の（１１）～（１３）に示されるタンパク質、以下の（１４）または（１５）に示されるポリヌクレオチドからなる遺伝子にコードされるタンパク質であり得る：
（１１）配列番号７または９で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（１２）配列番号７または９で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＶＬＰを形成する機能を有するタンパク質；
（１３）配列番号７または９で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＶＬＰを形成する機能を有するタンパク質；
（１４）配列番号８または１０で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または、
（１５）配列番号８または１０で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＶＬＰを形成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（１１）配列番号７または９で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（１２）配列番号７または９で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＶＬＰを形成する機能を有するタンパク質；
（１３）配列番号７または９で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＶＬＰを形成する機能を有するタンパク質；
（１４）配列番号８または１０で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または、
（１５）配列番号８または１０で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＶＬＰを形成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【0064】
ＰｐＬＢがＶＬＰを形成する機能を有するタンパク質であるか否かは、当該タンパク質を、本発明の一実施形態におけるＰＣＶ２ Ｃａｐと融合タンパク質を形成させて、当該融合タンパク質を大腸菌で発現させたときに、ＶＬＰが形成されていれば、ＶＬＰを形成する機能を有するタンパク質であると判定することができる。
【0065】
３－ヘリックスバンドル構造を有するＩＢＤとしては、プロテインＡのＺドメイン（Ｚ）が挙げられる。Ｚは、非特許文献１７等に記載される、プロテインＡのＢドメインに２ヶ所のアミノ酸置換を導入して作製された人工的なポリペプチドである。
【0066】
本発明の一実施形態において、Ｚは、以下の（１６）～（１８）に示されるタンパク質、以下の（１９）または（２０）に示されるポリヌクレオチドからなる遺伝子にコードされるタンパク質であり得る：
（１６）配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（１７）配列番号１１で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＶＬＰを形成する機能を有するタンパク質；
（１８）配列番号１１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＶＬＰを形成する機能を有するタンパク質；
（１９）配列番号１２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または、
（２０）配列番号１２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＶＬＰを形成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（１６）配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（１７）配列番号１１で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＶＬＰを形成する機能を有するタンパク質；
（１８）配列番号１１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＶＬＰを形成する機能を有するタンパク質；
（１９）配列番号１２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または、
（２０）配列番号１２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＶＬＰを形成する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【0067】
ＺがＶＬＰを形成する機能を有するタンパク質であるか否かは、当該タンパク質を、本発明の一実施形態におけるＰＣＶ２ Ｃａｐと融合タンパク質を形成させて、当該融合タンパク質を大腸菌で発現させたときに、ＶＬＰが形成されていれば、ＶＬＰを形成する機能を有するタンパク質であると判定することができる。
【0068】
本発明の一実施形態において、Ｃａｐに融合するＩＢＤは、ＳｐＧＢ、ＰｐＬＢおよびＺからなる群より選択されるドメインを含むことが好ましく、Ｚを含むことが特に好ましい。
【0069】
図２に、可溶化促進タグ（ＳＵＭＯ）およびＩＢＤｓ（ＳｐＧＢ、ＰｐＬＢ、Ｚ）のタンパク質構造、並びに、β－graspフォールド構造および３－ヘリックスバンドル構造の模式図を示す。図２に示されるとおり、公知の可溶化促進タグであるＳＵＭＯ（９６アミノ酸残基）は、ＳｐＧＢおよびＰｐＬＢと同様にβ－graspフォールド構造を有する。ＳｐＧＢ、ＰｐＬＢおよびＺは、５５～６０個のアミノ酸残基から構成されており、一次構造的には、ＳＵＭＯの半分程度の大きさである。
【0070】
上記ＩＢＤは、Ｃａｐに融合させることによりこれを成熟化させるという、本来の抗体結合能とは全く異なる機能を有することが、本発明により明らかとなった。なお、ここでいうＣａｐの「成熟化」とは、Ｃａｐが大腸菌発現宿主の細胞質内で自然（自己）会合することによって、天然のＰＣＶ２粒子と形態的に酷似したＶＬＰを形成することを意味する。このようなＶＬＰは、ＰＣＶ２の感染予防のためのワクチンとして好適に用いることができる。また、当該ＶＬＰを含むワクチンを対象動物に投与または接種することにより、感染性ＰＣＶ２に対する高い抗原特異性を備える免疫を誘導し、ウイルス中和抗体誘導能を獲得させることができる。その結果、ＰＣＶ２のＶＬＰのワクチネーションによって、対象動物のＰＣＶ２感染を効果的に抑制することができる。
【0071】
本発明の好ましい一実施形態において、上記Ｃａｐ－ＩＢＤ融合タンパク質を構成するＩＢＤは、同種のドメインが２個連結した構造を有する。このような構造としては、例えば、２個のＳｐＧＢが連結した構造（ＳｐＧＢ１－Ｂ２：配列番号１３（アミノ酸配列）、配列番号１４（塩基配列））、２個のＰｐＬＢが連結した構造（ＰｐＬＢ１－Ｂ２：配列番号１５（アミノ酸配列）、配列番号１６（塩基配列））、および、２個のＺが連結した構造（ＺＺ：配列番号１７（アミノ酸配列）、配列番号１８（塩基配列））等が挙げられる。Ｃａｐ－ＩＢＤ融合タンパク質を構成するＩＢＤとして、ＳｐＧＢ１－Ｂ２、ＰｐＬＢ１－Ｂ２またはＺＺを用いることにより、当該融合タンパク質の可溶性タンパク質としての安定性をより高めることができる。これは、ＳｐＧＢ、ＰｐＬＢまたはＺを２個連結させてなるＩＢＤが、可溶性促進タグ（ＳＵＭＯ）と同等の分子量を有することにより、ＳＵＭＯに匹敵する可溶化促進機能を獲得したと推測される。なお、ＩＢＤにおいて同種のドメインが複数連結される場合、その数は２個に限定されず、例えば、３個、４個、あるいは、５個以上であってもよい。
【0072】
本発明の一実施形態において、Ｃａｐ－ＩＢＤ融合タンパク質におけるＩＢＤは、ＣａｐのＣ末端に結合していることが好ましい。ＩＢＤがＣａｐのＣ末端に結合していることにより、ＩＢＤのＶＬＰ形成促進機能およびＶＬＰ崩壊抑制機能がより向上される。すなわち、大腸菌発現宿主の細胞内で、Ｃａｐ－ＩＢＤ融合タンパク質が、Ｎ末端を粒子の内腔側に、Ｃ末端を粒子の表層側にして自然（自己）会合してＶＬＰを形成する。形成されたＶＬＰは、表層にＩＢＤｓを有し、物理化学的負荷に対する良好な分子安定性を有する。
【0073】
本発明の一実施形態において、ＣａｐとＩＢＤとの連結、および、ドメイン間の連結は、適当なアミノ酸配列からなるリンカーを介していてもよい。
【0074】
本発明の一実施形態において用いられるリンカーとしては、特に限定されないが、好ましくは４～１０数アミノ酸残基からなる任意のペプチドが挙げられる。このようなペプチドとしては、ＧＰＧＰ（４アミノ酸残基、配列番号１９）、（Ｇ４Ｓ）３（１５アミノ酸残基、配列番号２０）、およびこれらの組み合わせ等の慣用のペプチドが挙げられる。
【0075】
また、リンカー内にトロンビン認識配列（ＬＶＰＲＧＳ）等を挿入し、所望のタイミングで、ＣａｐとＩＢＤとを切断・乖離し得るように設計してもよい。このように設計することにより、例えば、Ｃａｐ－ＩＢＤ融合タンパク質がＶＬＰを形成した後で、ＶＬＰの表層からＩＢＤを切断・乖離させることができる。
【0076】
また、本明細書の実施例に記載したとおり、ＧＰＧＰＧＬＶＰＲＧＳＧＰＧＰＧ（配列番号２１）や、当該配列からトロンビン認識配列（ＬＶＰＲＧＳ）を除いたＧＰＧＰＧＧＳＧＰＧＰＧ（配列番号２２）等もリンカーとして使用できる。
【0077】
なお、上記トロンビン認識配列を除いたＧＰＧＰＧＧＳＧＰＧＰＧをリンカーとして用いた場合には、例えば、配列番号２９で表されるアミノ酸配列からなる（または、配列番号３０で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドからなる遺伝子にコードされた）Ｃａｐ－ＩＢＤ（この場合は、Ｃａｐ－ＺＺ）を作製することができる。
【0078】
〔Ｃａｐ－ＩＢＤ融合タンパク質の製造方法〕
本発明の一実施形態に係るＰＣＶ２のＶＬＰの製造方法は、上述のＣａｐ－ＩＢＤ融合タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを調製する工程、および、当該発現ベクターを大腸菌に導入し、当該Ｃａｐ－ＩＢＤ融合タンパク質を発現させる工程、を含む。
本発明の一実施形態に係るＰＣＶ２のＶＬＰの製造方法は、上述のＣａｐ－ＩＢＤ融合タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを調製する工程、および、当該発現ベクターを大腸菌に導入し、当該Ｃａｐ－ＩＢＤ融合タンパク質を発現させる工程、を含む。
【0079】
Ｃａｐをコードする核酸およびＩＢＤ（例えば、ＳｐＧＢ、ＰｐＬＢおよびＺ）をコードする核酸は、例えば、公知の塩基配列（配列番号２、４、６、８、１０および１２）を基に、常法によって、例えば、ＰＣＲクローニング、化学合成等によって調製することができる。
【0080】
また、Ｃａｐ－ＩＢＤ融合タンパク質をコードする核酸は、常法によって、例えば、ＰＣＲサブクローニング、化学合成等によって調製することができる。
【0081】
Ｃａｐ－ＩＢＤ融合タンパク質を製造するための発現ベクターは、公知の手法を用いる組換えＤＮＡ技術によって構築することができ、Ｃａｐ－ＩＢＤ融合タンパク質をコードする核酸、および、当該核酸に作動可能に連結した調節配列を含む。
【0082】
上記発現ベクターを、宿主細胞となる大腸菌に導入することにより、形質転換細胞を作製することができる。大腸菌の形質転換法は、特に限定されず、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等の公知の方法を用いることができる。
【0083】
作製された形質転換細胞を、Ｃａｐ－ＩＢＤ融合タンパク質の発現が可能な条件下で培養することにより、可溶性タンパク質としてＣａｐ－ＩＢＤ融合タンパク質が発現される。可溶性発現したＣａｐ－ＩＢＤ融合タンパク質は、大腸菌発現宿主の細胞内で、自然（自己）会合することにより、自発的にＶＬＰを形成する。
【0084】
〔ワクチン〕
本発明の一実施形態に係るワクチンは、有効成分として、上述のＶＬＰを含む。なお、ワクチンにおける有効成分の含有量は特に限定されず、適宜設定することができる。
本発明の一実施形態に係るワクチンは、有効成分として、上述のＶＬＰを含む。なお、ワクチンにおける有効成分の含有量は特に限定されず、適宜設定することができる。
【0085】
本発明の一実施形態において、ワクチンは、ＶＬＰの他に、薬学的に許容される添加剤、例えば、担体、潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤等を含んでいてもよい。
【0086】
ワクチンの形態も特に限定されず、例えば、注射剤、液剤、懸濁剤、乳剤、散剤、顆粒剤、およびカプセル剤等が挙げられる。ワクチンの投与形態も特に限定されず、経口投与であってもよいし、非経口投与（例えば、皮下投与、筋肉内投与、皮内投与、経鼻投与、静脈内投与、腹腔内投与等）であってもよい。
【0087】
ワクチンが投与される対象動物としては、ＰＣＶ２に感染し得る非ヒト動物であれば特に限定されないが、好ましくはブタである。
【0088】
本発明の一態様は、以下の発明を包含する。
＜１＞ブタサーコウイルス２型のカプシドタンパク質と、免疫グロブリン結合ドメインと、を有する融合タンパク質。
＜２＞上記免疫グロブリン結合ドメインが、プロテインＧのＢドメイン、プロテインＬのＢドメイン、および、プロテインＡのＺドメインからなる群より選択されるいずれか１種のドメインを含む、上記＜１＞に記載の融合タンパク質。
＜３＞上記免疫グロブリン結合ドメインが、上記カプシドタンパク質のＣ末端に結合している、上記＜１＞または＜２＞に記載の融合タンパク質。
＜４＞上記免疫グロブリン結合ドメインが、プロテインＧのＢドメイン、プロテインＬのＢドメイン、および、プロテインＡのＺドメインからなる群より選択されるいずれか１種のドメインが２個連結した構造を有する、上記＜１＞～＜３＞のいずれかに記載の融合タンパク質。
＜５＞上記カプシドタンパク質と上記免疫グロブリン結合ドメインとが、リンカーを介して結合している、上記＜１＞～＜４＞のいずれかに記載の融合タンパク質。
＜６＞上記＜１＞～＜５＞のいずれかに記載の融合タンパク質により形成されている、ウイルス様粒子。
＜７＞上記＜６＞に記載のウイルス様粒子を含むワクチン。
＜８＞ブタサーコウイルス２型のカプシドタンパク質と、免疫グロブリン結合ドメインと、を有する融合タンパク質の製造方法であって、
上記ブタサーコウイルス２型のカプシドタンパク質と、免疫グロブリン結合ドメインと、の融合タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを調製する工程、および、
上記発現ベクターを大腸菌に導入し、上記融合タンパク質を発現させる工程、を含む、製造方法。
＜９＞上記免疫グロブリン結合ドメインが、プロテインＧのＢドメイン、プロテインＬのＢドメイン、および、プロテインＡのＺドメインからなる群より選択されるいずれか１種のドメインを含む、上記＜８＞に記載の製造方法。
＜１０＞上記免疫グロブリン結合ドメインが、上記カプシドタンパク質のＣ末端に結合している、上記＜８＞または＜９＞に記載の製造方法。
＜１１＞上記免疫グロブリン結合ドメインが、プロテインＧのＢドメイン、プロテインＬのＢドメイン、および、プロテインＡのＺドメインからなる群より選択されるいずれか１種のドメインが２個連結した構造を有する、上記＜８＞～＜１０＞のいずれかに記載の製造方法。
＜１２＞上記カプシドタンパク質と上記免疫グロブリン結合ドメインとが、リンカーを介して結合している、上記＜８＞～＜１１＞のいずれかに記載の製造方法。
＜１＞ブタサーコウイルス２型のカプシドタンパク質と、免疫グロブリン結合ドメインと、を有する融合タンパク質。
＜２＞上記免疫グロブリン結合ドメインが、プロテインＧのＢドメイン、プロテインＬのＢドメイン、および、プロテインＡのＺドメインからなる群より選択されるいずれか１種のドメインを含む、上記＜１＞に記載の融合タンパク質。
＜３＞上記免疫グロブリン結合ドメインが、上記カプシドタンパク質のＣ末端に結合している、上記＜１＞または＜２＞に記載の融合タンパク質。
＜４＞上記免疫グロブリン結合ドメインが、プロテインＧのＢドメイン、プロテインＬのＢドメイン、および、プロテインＡのＺドメインからなる群より選択されるいずれか１種のドメインが２個連結した構造を有する、上記＜１＞～＜３＞のいずれかに記載の融合タンパク質。
＜５＞上記カプシドタンパク質と上記免疫グロブリン結合ドメインとが、リンカーを介して結合している、上記＜１＞～＜４＞のいずれかに記載の融合タンパク質。
＜６＞上記＜１＞～＜５＞のいずれかに記載の融合タンパク質により形成されている、ウイルス様粒子。
＜７＞上記＜６＞に記載のウイルス様粒子を含むワクチン。
＜８＞ブタサーコウイルス２型のカプシドタンパク質と、免疫グロブリン結合ドメインと、を有する融合タンパク質の製造方法であって、
上記ブタサーコウイルス２型のカプシドタンパク質と、免疫グロブリン結合ドメインと、の融合タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを調製する工程、および、
上記発現ベクターを大腸菌に導入し、上記融合タンパク質を発現させる工程、を含む、製造方法。
＜９＞上記免疫グロブリン結合ドメインが、プロテインＧのＢドメイン、プロテインＬのＢドメイン、および、プロテインＡのＺドメインからなる群より選択されるいずれか１種のドメインを含む、上記＜８＞に記載の製造方法。
＜１０＞上記免疫グロブリン結合ドメインが、上記カプシドタンパク質のＣ末端に結合している、上記＜８＞または＜９＞に記載の製造方法。
＜１１＞上記免疫グロブリン結合ドメインが、プロテインＧのＢドメイン、プロテインＬのＢドメイン、および、プロテインＡのＺドメインからなる群より選択されるいずれか１種のドメインが２個連結した構造を有する、上記＜８＞～＜１０＞のいずれかに記載の製造方法。
＜１２＞上記カプシドタンパク質と上記免疫グロブリン結合ドメインとが、リンカーを介して結合している、上記＜８＞～＜１１＞のいずれかに記載の製造方法。
【0089】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【0090】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこの例示に限定されるものではない。
【0091】
〔１．Ｃａｐと可溶化促進タグ（ＧＳＴ、ＳＵＭＯ）との融合化〕
Ｃａｐ－ＧＳＴ以外の全ての遺伝子コンストラクトについては、大腸菌発現系に最適化した塩基配列（コドン最適化配列）を用いて全遺伝子合成した。なお、Ｃａｐ－ＧＳＴ融合遺伝子の構築方法は、以下のとおりである。
Ｃａｐ－ＧＳＴ以外の全ての遺伝子コンストラクトについては、大腸菌発現系に最適化した塩基配列（コドン最適化配列）を用いて全遺伝子合成した。なお、Ｃａｐ－ＧＳＴ融合遺伝子の構築方法は、以下のとおりである。
【0092】
ＰＣＲサブクローニングにより、Ｃａｐ（配列番号４１）のＣ末端に、ペプチドリンカーを介して、可溶性促進タグ（ＧＳＴ）を融合させた融合タンパク質（Ｃａｐ－ＧＳＴ）をコードする核酸を調製した。具体的には、Ｃａｐ－ＺＺをテンプレートとして、primeSTAR（登録商標）（タカラバイオ株式会社製）およびプライマーセット（Cap F（配列番号３７：5’-tatacatatgacctatccgcgtcgccgcta-3’）；Cap link R（配列番号３８：5’-gtataggggaacccggacccggaccagagc-3’））を用いたＰＣＲにより、Ｃａｐ－ｌｉｎｋｅｒ配列を増幅させた。また、pET-41a（メルク株式会社製）をテンプレートとして、primeSTAR（登録商標）およびプライマーセット（GST F（配列番号３９：5’-gggtccgggttcccctatactaggttattg-3’）；GST R（配列番号４０：5’-agcgagctcttaatccgattttggaggatg-3’））を用いたＰＣＲにより、ＧＳＴ配列を増幅させた。続いて、増幅させたＣａｐ－ｌｉｎｋｅｒ配列およびＧＳＴ配列をテンプレートとして、primeSTAR（登録商標）およびプライマーセット（Cap F;GST R）を用いたオーバーラップＰＣＲにより、Ｃａｐ－ｌｉｎｋｅｒ－ＧＳＴ配列を増幅させた。制限酵素ＮｄｅＩ（タカラバイオ株式会社製）およびＳａｃＩ（タカラバイオ株式会社製）で処理したpJexpress441-01（ＡＴＵＭ社製）と、同じく制限酵素ＮｄｅＩおよびＳａｃＩで処理したＣａｐ－ｌｉｎｋｅｒ－ＧＳＴ配列とをライゲーションさせたものを用いて、大腸菌ＤＨ５α株（タカラバイオ株式会社製）を形質転換させた。形質転換させた大腸菌ＤＨ５α株からアルカリＳＤＳ法によりpJ4-CapGSTを回収し、大腸菌ＢＬ２１株（タカラバイオ株式会社製）を形質転換させた。
【0093】
得られた形質転換細胞を、アンピシリンを含むＬＢ培地（ナカライテスク株式会社製）にて濁度（ＯＤ６００）が０．４～０．６になるまで３７℃で振とう培養後、イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（シグマアルドリッチ社製）を終濃度１ｍＭになるように添加し、さらに３７℃で４時間振とう培養することでＣａｐ－ＧＳＴの発現を試みたところ、Ｃａｐ－ＧＳＴは全く可溶性発現せず、全て封入体となった。
【0094】
次に、上記と同様にして、可溶化促進タグ（ＳＵＭＯ）を、ＣａｐのＣ末端側に融合させた融合タンパク質（Ｃａｐ－ＳＵＭＯ）の発現を試みた。遠心分離により菌体を回収し、これをBugBuster（登録商標）（メルク株式会社製）で破砕した可溶性画分には、Ｃａｐ－ＳＵＭＯが３．２ｍｇ／Ｌ cultureレベル程度含まれていた。
【0095】
また、上記破砕液について、ゲルろ過クロマトグラフィー（Sephacryl S-300、GE Healthcare社製）解析を行った。期待されるＶＬＰの位置（約４０ｍＬ付近）に相当するフラクションを回収し、これを電子顕微鏡で撮影した。観察されたＶＬＰは、天然のＰＣＶ２粒子とは形態的に異なり、粒子形状に歪みがあり、また、粒子径も極めて不均一であった（図７）。
【0096】
なお、ＧＳＴは、一般的に広く使われている分子量２５．６ｋＤａの可溶化促進タグであり、β－graspフォールド構造および３－ヘリックスバンドル構造のいずれの構造も有しない。一方、ＳＵＭＯは、近年よく利用されている分子量１１．０ｋＤａの可溶化促進タグであり、β－graspフォールド構造を有する。
【0097】
これらの結果から、ＧＳＴは、Ｃａｐ可溶化促進機能およびＶＬＰ形成促進機能のいずれも有しなかった。したがって、単にＣａｐと可溶化促進タグとを融合させるだけでは、大腸菌発現宿主において、可溶性タンパク質としてＣａｐを発現させることはできないことが分かった。また、ＳＵＭＯは、ＧＳＴとは異なり、Ｃａｐ可溶化促進機能を有するものの、ＶＬＰ形成促進機能は有しなかった。同じ可溶化促進タグであるにもかかわらず、ＧＳＴとＳＵＭＯとでＣａｐの可溶性に与える影響が異なる理由は、両者の分子量（ＧＳＴ：２５．６ｋＤａ；ＳＵＭＯ：１１．０ｋＤａ）および立体構造等が影響していることが考えられる。
【0098】
〔２．ＣａｐとＩＢＤｓ（ＳｐＧＢ１－Ｂ２、ＰｐＬＢ１－Ｂ２）との融合化〕
β-graspフォールド構造を有するＳＵＭＯが、Ｃａｐ可溶化促進機能を有するという上述の結果に基づき、同じくβ-graspフォールド構造を有する他のタンパク質として、プロテインＧのＢドメイン（ＳｐＧＢ）およびプロテインＬのＢドメイン（ＰｐＬＢ）を用いて、それらのＣａｐ可溶化促進機能およびＶＬＰ形成促進機能を検証した。
β-graspフォールド構造を有するＳＵＭＯが、Ｃａｐ可溶化促進機能を有するという上述の結果に基づき、同じくβ-graspフォールド構造を有する他のタンパク質として、プロテインＧのＢドメイン（ＳｐＧＢ）およびプロテインＬのＢドメイン（ＰｐＬＢ）を用いて、それらのＣａｐ可溶化促進機能およびＶＬＰ形成促進機能を検証した。
【0099】
ＣａｐのＣ末端に、ペプチドリンカーを介して、ＳｐＧＢが２個連結した構造を有するＩＢＤを融合させた融合タンパク質（Ｃａｐ－ＳｐＧＢ１－Ｂ２：配列番号２３）をコードする核酸（配列番号２４）を調製し、上記１．と同様の方法で、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株においてＣａｐ－ＳｐＧＢ１－Ｂ２の発現を試みた。遠心分離により菌体を回収し、これをBugBuster（登録商標）（メルク株式会社製）で破砕した可溶性画分には、Ｃａｐ－ＳｐＧＢ１－Ｂ２が１．５ｍｇ／Ｌ cultureレベル程度含まれていた。
【0100】
また、上記破砕液について、ゲルろ過クロマトグラフィー（Sephacryl S-300、GE Healthcare社製）で解析した結果、期待されるＶＬＰの位置（約４０ｍＬ付近）にピークが認められたので、そのフラクションを回収した。回収したフラクションを電子顕微鏡で撮影した結果、水溶液中に均一にＶＬＰが分散している像が認められた（図４）。観察されたＶＬＰは、天然のＰＣＶ２粒子に酷似した粒子形状および粒子径を有し、高い均一性を有していた。
【0101】
ＰｐＬＢが２個連結した構造を有するＩＢＤを融合させた融合タンパク質（Ｃａｐ－ＰｐＬＢ１－Ｂ２：配列番号２５）をコードする核酸（配列番号２６）についても同様の操作を行ったところ、破砕液の可溶性画分には、Ｃａｐ－ＰｐＬＢ１－Ｂ２が１．５ｍｇ／Ｌ cultureレベル程度含まれていた。また、破砕液のゲルろ過クロマトグラフィー解析および電子顕微鏡撮影により、水溶液中に均一にＶＬＰが分散している像が認められた（図５）。観察されたＶＬＰは、天然のＰＣＶ２粒子に酷似した粒子形状および粒子径を有し、高い均一性を有していた。
【0102】
これらの結果から、ＳＵＭＯと同様なβ－graspフォールド構造を有するＳｐＧＢおよびＰｐＬＢは、ＳＵＭＯとは異なり、Ｃａｐ可溶化促進機能に加え、優れたＶＬＰ形成促進機能を有することが明らかとなった。
【0103】
〔３．ＣａｐとＩＢＤ（ＺＺ）との融合化〕
β－graspフォールド構造を有するＩＢＤｓが優れたＶＬＰ形成促進機能を有するという上記２．の結果を考慮し、β－graspフォールド構造以外の構造を有するＩＢＤについて、Ｃａｐ可溶化促進機能およびＶＬＰ形成促進機能を検証した。具体的には、上記ＩＢＤとして、３－ヘリックスバンドル構造を有するプロテインＡのＺドメイン（Ｚ）を用いて、そのＣａｐ可溶化促進機能およびＶＬＰ形成促進機能を検証した。
β－graspフォールド構造を有するＩＢＤｓが優れたＶＬＰ形成促進機能を有するという上記２．の結果を考慮し、β－graspフォールド構造以外の構造を有するＩＢＤについて、Ｃａｐ可溶化促進機能およびＶＬＰ形成促進機能を検証した。具体的には、上記ＩＢＤとして、３－ヘリックスバンドル構造を有するプロテインＡのＺドメイン（Ｚ）を用いて、そのＣａｐ可溶化促進機能およびＶＬＰ形成促進機能を検証した。
【0104】
ＣａｐのＣ末端に、ペプチドリンカーを介して、Ｚが２個連結した構造を有するＩＢＤを融合させた融合タンパク質（Ｃａｐ－ＺＺ：配列番号２７）をコードする核酸（配列番号２８）を調製し、上記１．と同様の方法で、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株においてＣａｐ－ＺＺの発現を試みた。遠心分離により菌体を回収し、これをBugBuster（登録商標）（メルク株式会社製）で破砕した可溶性画分には、Ｃａｐ－ＳｐＧＢ１－Ｂ２およびＣａｐ－ＰｐＬＢ１－Ｂ２を超えるレベルでＣａｐ－ＺＺが発現していた（６．０ｍｇ／Ｌ culture）。
【0105】
また、上記破砕液について、ゲルろ過クロマトグラフィー解析を行い、ＶＬＰに相当するピークを示すフラクションを回収した。回収したフラクションを電子顕微鏡で撮影した結果、水溶液中に均一にＶＬＰが分散している像が認められた（図６）。
【0106】
観察されたＶＬＰは、天然のＰＣＶ２粒子に酷似した粒子形状および粒子径を有し、高い均一性を有していた。
【0107】
これらの結果から、３－ヘリックスバンドル構造を有するＺは、極めて優れたＣａｐ可溶化促進機能およびＶＬＰ形成促進機能をもつことが明らかとなった。
【0108】
なお、図３に、上記で回収された融合タンパク質（Ｃａｐ－ＳＵＭＯ、Ｃａｐ－ＳｐＧＢ１－Ｂ２、Ｃａｐ－ＰｐＬＢ１－Ｂ２、Ｃａｐ－ＺＺ）における、ＣａｐおよびＩＢＤｓ（ＳｐＧＢ１－Ｂ２、ＰｐＬＢ１－Ｂ２、ＺＺ）または可溶化促進タグ（ＳＵＭＯ）、並びに、これらの間に存在するリンカー（Ｌ）の配置を模式的に示す。
【0109】
〔４．ＩＢＤ融合分子数がＣａｐ可溶化およびＶＬＰ形成に及ぼす影響の検証〕
ＩＢＤ融合分子数の影響を検証するため、プロテインＡのＺドメイン（Ｚ）１分子のみをＣａｐに融合させた融合タンパク質（Ｃａｐ－Ｚ：配列番号３１）をコードする核酸（配列番号３２）を調製し、上記１．と同様の方法で、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を用いてＣａｐ－Ｚを発現させた結果、その発現レベルは１．３ｍｇ／Ｌ culture程度であり、Ｃａｐ－ＺＺと比較して、可溶性発現レベルの低下が認められた。
ＩＢＤ融合分子数の影響を検証するため、プロテインＡのＺドメイン（Ｚ）１分子のみをＣａｐに融合させた融合タンパク質（Ｃａｐ－Ｚ：配列番号３１）をコードする核酸（配列番号３２）を調製し、上記１．と同様の方法で、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を用いてＣａｐ－Ｚを発現させた結果、その発現レベルは１．３ｍｇ／Ｌ culture程度であり、Ｃａｐ－ＺＺと比較して、可溶性発現レベルの低下が認められた。
【0110】
この結果から、２分子のＺを連結することにより、融合タンパク質の可溶性タンパク質としての安定性が高められたと推察される。
【0111】
〔５．ＩＢＤ融合位置がＶＬＰ形成に及ぼす影響の検証〕
ＶＬＰ形成におけるＩＢＤ融合位置の影響を検証するため、ペプチドリンカーを介して、ＺＺまたはＺをＣａｐのＮ末端に融合させた融合タンパク質（ＺＺ－Ｃａｐ：配列番号３３、Ｚ－Ｃａｐ：配列番号３５）をコードする核酸（それぞれ、配列番号３４および３６）を調製し、上記１．と同様の方法で、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株において、ＺＺ－ＣａｐおよびＺ－Ｃａｐの発現を試みた。
ＶＬＰ形成におけるＩＢＤ融合位置の影響を検証するため、ペプチドリンカーを介して、ＺＺまたはＺをＣａｐのＮ末端に融合させた融合タンパク質（ＺＺ－Ｃａｐ：配列番号３３、Ｚ－Ｃａｐ：配列番号３５）をコードする核酸（それぞれ、配列番号３４および３６）を調製し、上記１．と同様の方法で、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株において、ＺＺ－ＣａｐおよびＺ－Ｃａｐの発現を試みた。
【0112】
ＺＺ－ＣａｐおよびＺ－Ｃａｐの形質転換細胞破砕液を非変性環境下で電気泳動（BN－PAGE（インビトロジェン社製））したところ、Ｃａｐ－ＺＺやＣａｐ－Ｚでは検出されたＶＬＰのバンドが顕著に薄くなっていた。これは、ＺＺ－ＣａｐやＺ－ＣａｐがＶＬＰを形成するためには、Ｎ末端側に位置するＺＺやＺをＶＬＰの内腔に包含する必要があり、物理的な制限がかかったためと推察される。
【0113】
〔６．高温処理安定性試験：高温処理がＶＬＰ維持に及ぼす影響の検証〕
上記２．および３．で得られた融合タンパク質（Ｃａｐ－ＳｐＧＢ１－Ｂ２、Ｃａｐ－ＺＺ）のＶＬＰについて、以下の方法によって高温処理安定性試験を行い、高温処理がＶＬＰの形状に及ぼす影響を調べた。
上記２．および３．で得られた融合タンパク質（Ｃａｐ－ＳｐＧＢ１－Ｂ２、Ｃａｐ－ＺＺ）のＶＬＰについて、以下の方法によって高温処理安定性試験を行い、高温処理がＶＬＰの形状に及ぼす影響を調べた。
【0114】
Ｃａｐ－ＺＺのＶＬＰ水溶液を、５２℃および９７℃でそれぞれ３０分間加熱処理し、その後、ゲルろ過クロマトグラフィー（Sephacryl S-300、GE Healthcare社製）解析を行った。
【0115】
Ｃａｐ－ＺＺのＶＬＰについての、加熱処理前後のゲルろ過クロマトグラフィーの解析結果を示すクロマトグラムを、図８に示す。
【0116】
図８に示すとおり、Ｃａｐ－ＺＺのＶＬＰは、５２℃および９７℃のいずれの温度でも、３０分間加熱処理した後でも、クロマトグラムの形状に大きな変化は生じず、ＶＬＰが高温処理に対して高い分子安定性を有することが確認された。また、Ｃａｐ－ＳｐＧＢ１－Ｂ２のＶＬＰについても、同様の結果が得られた。
【0117】
次に、ＩＢＤｓの存在がＶＬＰの高温処理安定性に与える影響を評価するために、ペプチドリンカー（Ｌ）内に存在するトロンビン認識配列（ＬＶＰＲ↓ＧＳ（↓：トロンビン特異的切断部位））の部位でＣａｐ－ＩＢＤｓ（Ｃａｐ－ＳｐＧＢ１－Ｂ２およびＣａｐ－ＺＺ）をトロンビン処理によって切断し、ＶＬＰからＩＢＤｓを乖離させた。
【0118】
ＶＬＰ表層に露出しているＩＢＤｓを切断・乖離した後も、ＶＬＰはその形状を維持していた。
【0119】
ＩＢＤｓを切断・乖離させたＶＬＰについて、上記と同様にして、高温処理安定性試験を実施した。Ｃａｐ－ＺＺのＶＬＰ表層からＺＺを乖離させた後のＶＬＰについての、加熱処理前後のゲルろ過クロマトグラフィーの解析結果を示すクロマトグラムを、図９に示す。
【0120】
図９に示すとおり、５２℃で３０分間の加熱処理後のクロマトグラムにおいて、ＶＬＰに相当するピークは完全に消失した。したがって、ＺＺを乖離させた後のＶＬＰは、当該加熱処理により崩壊したと考えられる。Ｃａｐ－ＳｐＧＢ１－Ｂ２のＶＬＰ表層からＳｐＧＢ１－Ｂ２を乖離させた後のＶＬＰについても、同様の結果が得られた。
【0121】
これらの結果から、上記ＩＢＤｓが、高温処理に対する分子安定性を付与する、ＶＬＰ崩壊抑制機能を有することが確認された。
【0122】
〔７．低温処理安定性試験：低温処理がＶＬＰ維持に及ぼす影響の検証〕
上記３．で得られた融合タンパク質（Ｃａｐ－ＺＺ）のＶＬＰについて、以下の方法によって低温処理安定性試験を行い、低温処理がＶＬＰの形状維持に及ぼす影響を調べた。
上記３．で得られた融合タンパク質（Ｃａｐ－ＺＺ）のＶＬＰについて、以下の方法によって低温処理安定性試験を行い、低温処理がＶＬＰの形状維持に及ぼす影響を調べた。
【0123】
Ｃａｐ－ＺＺのＶＬＰを分散させたＰＢＳ溶液を、４℃、－３０℃および－８０℃の異なる温度条件下で１年間保存した。保存後のＰＢＳ溶液を室温に戻し、電子顕微鏡で観察した。各温度で１年間保存した後のＣａｐ－ＺＺのＶＬＰの電子顕微鏡写真を、図１０（４℃）、図１１（－３０℃）および図１２（－８０℃）に示す。
【0124】
図１０～１２に示すとおり、Ｃａｐ－ＺＺのＶＬＰは、低温保存後もその形状および均一性を維持しており、いずれの温度条件下においてもＶＬＰの凝集、形状変化、崩壊等による粒子数減少といった現象は認められなかった。
【0125】
これらの結果から、上記ＩＢＤが、低温処理に対する分子安定性を付与する、ＶＬＰ崩壊抑制機能を有することが確認された。
【0126】
〔８．ワクチン抗原調製並びにブタへの免疫および攻撃試験〕
上記３．で得られた融合タンパク質（Ｃａｐ－ＺＺ）のＶＬＰを含む水溶液と、オイルアジュバントとを混合し、ワクチン抗原を調製した。このワクチン抗原１ｍＬは、２０μｇ相当のＣａｐ抗原を含む。
上記３．で得られた融合タンパク質（Ｃａｐ－ＺＺ）のＶＬＰを含む水溶液と、オイルアジュバントとを混合し、ワクチン抗原を調製した。このワクチン抗原１ｍＬは、２０μｇ相当のＣａｐ抗原を含む。
【0127】
また、ＰＢＳとオイルアジュバントとを混合し、Ｍｏｃｋワクチン（疑似対照）を調製した。
【0128】
野外農場から購入した４週齢のブタに、２週間隔で２回、頚部筋肉内にＣａｐ－ＺＺワクチン抗原１ｍＬまたはＭｏｃｋワクチンを投与した（１群３～４頭）。２回目投与後の２週目に、１０５ ＦＡＩＤ５０／ｍＬの感染性ＰＣＶ２を含む攻撃用乳剤を鼻腔内および臀部筋肉内に接種することで攻撃した。
【0129】
攻撃後７日目、１０日目および１４日目に採血し、血清分離後、QIAamp（登録商標） DNA Blood Mini Kit（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＰＣＶ２のＤＮＡを抽出した。また、攻撃後１４日目に剖検し、扁桃、鼠径リンパ節および腸間膜リンパ節を採取して１０％乳剤を作製し、血清と同様の方法でＤＮＡを抽出した。
【0130】
SYBR Premix Taq（タカラバイオ株式会社製）およびＰＣＶ２特異的プライマーセット（CircoDF；CircoDR）を用い、リアルタイムＰＣＲ法（バイオラッド社製Chromo4システム）にてＰＣＶ２のウイルスコピー数（copies/mLまたはcopies/g）を測定した。
【0131】
なお、検量線作成用のスタンダードには、Ｃａｐ遺伝子を組み込んだコピー数既知のプラスミドを用いた。本リアルタイムＰＣＲにおけるＰＣＶ２のウイルスコピー数の定量限界は、血清で２，０００copies/mLであり、組織中で２０，０００copies/gであった。
【0132】
【0133】
図１３および図１４に示すとおり、Ｃａｐ－ＺＺ免疫群は、Ｍｏｃｋ群と比較し、血清中（図１３）および各リンパ節中（図１４）のウイルスコピー数が減少した。この結果は、Ｃａｐ－ＺＺ融合タンパク質のＶＬＰが、ＰＣＶ２感染に対し、効果的なワクチンとして利用可能であることを示している。
【0134】
（まとめ）
上記の実施例で用いたＩＢＤｓ（ＳｐＧＢ、ＰｐＬＢおよびＺ）、並びに、可溶化促進タグ（ＧＳＴ、ＳＵＭＯ）について、その公知の機能、立体構造、および、本発明により見出された各種機能の評価試験結果（Ｃａｐ可溶化促進機能、ＶＬＰ形成促進機能、ＶＬＰ崩壊抑制機能（分子安定性付与機能）、ワクチン機能）を、以下の表１にまとめた。
上記の実施例で用いたＩＢＤｓ（ＳｐＧＢ、ＰｐＬＢおよびＺ）、並びに、可溶化促進タグ（ＧＳＴ、ＳＵＭＯ）について、その公知の機能、立体構造、および、本発明により見出された各種機能の評価試験結果（Ｃａｐ可溶化促進機能、ＶＬＰ形成促進機能、ＶＬＰ崩壊抑制機能（分子安定性付与機能）、ワクチン機能）を、以下の表１にまとめた。
【0135】
【表1】
【産業上の利用可能性】
【0136】
本発明は医薬品分野、特にワクチンの分野において有用である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】