特許 7515914 生体内薬物伝達のための脂質ナノ粒子およびその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-07-05

(45)【発行日】2024-07-16

(54)【発明の名称】生体内薬物伝達のための脂質ナノ粒子およびその用途

(51)【国際特許分類】

   A61K 47/22 20060101AFI20240708BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20240708BHJP

   A61K 9/51 20060101ALI20240708BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20240708BHJP

   A61K 31/711 20060101ALI20240708BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20240708BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240708BHJP

   A61K 47/18 20170101ALI20240708BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20240708BHJP

   A61K 47/28 20060101ALI20240708BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240708BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20240708BHJP

   A61P 3/06 20060101ALI20240708BHJP

   A61P 31/20 20060101ALI20240708BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20240708BHJP

【ＦＩ】

A61K47/22

A61K9/14

A61K9/51 ZNA

A61K31/7105

A61K31/711

A61K38/02

A61K45/00

A61K47/18

A61K47/24

A61K47/28

A61K48/00

A61P1/16

A61P3/06

A61P31/20

C12N15/11 Z

【請求項の数】 16

(21)【出願番号】P 2022543192

(86)(22)【出願日】2020-12-31

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-03-13

(86)【国際出願番号】 KR2020019502

(87)【国際公開番号】W WO2021145595

(87)【国際公開日】2021-07-22

【審査請求日】2022-09-12

(31)【優先権主張番号】10-2020-0005642

(32)【優先日】2020-01-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2020-0040586

(32)【優先日】2020-04-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】520178685

【氏名又は名称】エンハンストバイオ インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＥＮＨＡＮＣＥＤＢＩＯ ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100120031

【弁理士】

【氏名又は名称】宮嶋 学

(74)【代理人】

【識別番号】100120617

【弁理士】

【氏名又は名称】浅野 真理

(74)【代理人】

【識別番号】100126099

【弁理士】

【氏名又は名称】反町 洋

(72)【発明者】

【氏名】リー、ヒョクジン

(72)【発明者】

【氏名】キム、ミンジョン

(72)【発明者】

【氏名】ジョン、ハンセム

(72)【発明者】

【氏名】クォン、ヒョキョン

(72)【発明者】

【氏名】ソ、ヨンミ

(72)【発明者】

【氏名】ジョン、ミヒャエラ

【審査官】新留 素子

(56)【参考文献】

【文献】韓国登録特許第１０－１６８５３０４（ＫＲ，Ｂ１）

【文献】国際公開第２０１９／１１００６７（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ

Ａ６１Ｐ

Ｃ１２Ｎ １５／１１

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

６員ヘテロ環アミンおよびアルキル－エポキシドが結合したイオン化可能な脂質（ｉｏｎｉｚａｂｌｅ ｌｉｐｉｄ）；リン脂質；コレステロール；およびセラミド－ＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）複合体を含み、
前記６員ヘテロ環アミンは、

【化1】

であり、
前記アルキル－エポキシドは、Ｃ６～Ｃ１４の炭素の長さを有するものであり、
前記セラミド－ＰＥＧ複合体は、０．５～５モル％で含まれるものである、
脂質ナノ粒子。

【請求項2】

前記アルキル－エポキシドは、１，２－エポキシドデカン（１，２－ｅｐｏｘｙｄｏｄｅｃａｎｅ）である、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項3】

前記リン脂質は、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、ＥＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＧ、ＤＰＰＧ、ＤＳＰＥ、Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、ＰＯＰＥ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＳ、および１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－［ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｌ－ｓｅｒｉｎｅ］からなる群から選択される１種以上である、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項4】

前記脂質ナノ粒子は、イオン化可能な脂質：リン脂質：コレステロール：セラミド－ＰＥＧ複合体を２０～５０：１０～３０：３０～６０：０．５～５のモル比で含む、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項5】

前記脂質ナノ粒子は、ｐＫａが６．０～７．０である、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項6】

前記脂質ナノ粒子は肝組織を特異的に標的化する、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項7】

前記脂質ナノ粒子は肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）を標的化する、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項8】

前記脂質ナノ粒子は、ＬＳＥＣ（ｌｉｖｅｒ ｓｉｎｕｓｏｉｄａｌ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）を標的化する、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項9】

（１）請求項１～８のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子；および（２）陰イオン性薬物、核酸、またはその組み合わせを含む、薬物伝達用組成物。

【請求項10】

前記陰イオン性薬物、核酸、またはその組み合わせは、前記脂質ナノ粒子内部に封入されている、請求項９に記載の薬物伝達用組成物。

【請求項11】

前記脂質ナノ粒子は平均直径が３０ｎｍ～１５０ｎｍである、請求項９に記載の薬物伝達用組成物。

【請求項12】

前記陰イオン性薬物は、ペプチド、タンパク質薬物、タンパク質－核酸構造体、および陰イオン性生体高分子－薬物複合体からなる群から選択される１種以上である、請求項９に記載の薬物伝達用組成物。

【請求項13】

前記核酸は、小干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）、リボソームリボ核酸（ｒＲＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ジオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、相補性ジオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、伝令リボ核酸（ｍＲＮＡ）、運搬リボ核酸（ｔＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）、ＰＮＡ、およびＤＮＡｚｙｍｅからなる群から選択される１種以上である、請求項９に記載の薬物伝達用組成物。

【請求項14】

（１）請求項１～８のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子；および（２）陰イオン性薬物、核酸、またはその組み合わせを含む、肝疾患の予防または治療用薬学的組成物。

【請求項15】

前記肝疾患は、ＡＴＴＲアミロイドーシス（ＡＴＴＲ ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ）、高コレステロール血症（Ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ）、Ｂ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、急性肝不全（Ａｃｕｔｅ ｌｉｖｅｒ ｆａｉｌｕｒｅ）、肝硬変（Ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、および肝線維化（ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）からなる群から選択される１種以上である、請求項１４に記載の薬学的組成物。

【請求項16】

前記脂質ナノ粒子は、平均直径が３０ｎｍ～１５０ｎｍである、請求項１４に記載の薬学的組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生体内薬物伝達のための脂質ナノ粒子およびその用途に関する。

【背景技術】

【0002】

医薬製剤産業にあたり、薬の副作用を減らし、効能および効果を極大化させて必要な量の薬物を効率的に伝達できるように設計した薬物送達システム（ＤＤＳ；Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ）は、新薬開発に釣り合う経済的利益を創出しながら成功の可能性が大きい高付加価値核心技術であって、薬物投与を効率化することによって患者の治療の質を高めるのにその目的がある。

【0003】

薬物伝達システムの核心技術の一つである薬物吸収促進技術に属する難溶性薬物の可溶化技術は、新薬物質の開発費用を減らすことができると同時に、現在販売されている医薬品の付加価値を高めることができる最も合理的な方法であると考えられる。特に、我が国のような新薬開発条件が劣悪な状況で薬物の可溶化技術の開発による改良新薬の開発は、少ない費用で莫大な付加価値を創出できる分野である。

【0004】

遺伝子薬物伝達システムを利用した遺伝子治療法は、遺伝的結合を修正し多くの病気を治療するにあたって大きな希望となる。このような遺伝子治療法を成功的かつ安全に行うにあたり、効果的な遺伝子伝達が主な課題の一つであり、ウイルス伝達体が遺伝子伝達に効果的であることが証明された。しかし、免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）、注入されたＤＮＡサイズの限界および大量生産の困難さなどいくつかの欠点によって遺伝子伝達システムとしてウイルス利用が制限されている。陽イオン性リポソームおよび重合体などの非－ウイルス性遺伝子担体がウイルス性システムの代替手段として注目を浴び始めた。

【0005】

改善された安定性プロファイルおよび重合体伝達体の製造と操作の容易性が効果的かつ安全な遺伝子伝達用非毒性および生分解性重合体担体のデザインおよび合成に対する研究を触発した。ポリ（Ｌ－リシン）、ポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）、スターバースト（ｓｔａｒｂｕｒｓｔ）、ポリアミドアミン（ｐｏｌｙａｍｉｄｏａｍｉｎｅ）デンドリマー、および陽イオン性リポソームなどが自発的に自己組立が可能であり、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）をエンドサイトーシスにより細胞内に侵入するのに十分に小さい構造で圧縮できるため、非－ウイルス性遺伝子伝達体として幅広く研究されてきた。

【0006】

Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどの核酸は、生体内で特定タンパク質の発現を抑制できる物質であって、癌、遺伝病、感染症、自己免疫疾患などの治療に重要なツールとして脚光を浴びている（Ｎｏｖｉｎａ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，Ｎａｔｕｒｅ，４３０，１６１－１６４，２００４）。しかし、ｓｉＲＮＡなどの核酸は細胞内に直接伝達が難しく、血液中に酵素によって容易に分解されるので、これを克服するための多くの研究が進められている。現在までに核酸を細胞内に運ぶ方法として、正電荷脂質または重合体と混合して運ぶ方法（それぞれ脂質－ＤＮＡの複合体（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）およびポリマー－ＤＮＡの複合体（ｐｏｌｙｐｌｅｘ）と称する）が主に用いられている（Ｈｉｒｋｏなど、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１０，１１８５－９３，２００３；Ｍｅｒｄａｎなど、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，５４，７１５－５８，２００２）。脂質－ＤＮＡの複合体は、核酸と結合して細胞内に核酸をうまく伝達して細胞レベルで多く使用されているが、生体内では局部的に注射の際、多くの場合体内に炎症を誘発させる（Ｆｉｌｏｎａｎｄ、およびＰｈｉｌｌｉｐｓ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１３２９，３４５－５６，１９９７）などの短所がある。

【0007】

また、このような非－ウイルス性伝達体は、トランスフェクション効率が低いという問題がある。トランスフェクション効率を高めるために多くの努力を注いできたが、これは、依然として安定していると考えられるシステムとは距離が遠い。また、非－ウイルス性遺伝子伝達体担体は、劣悪な生体適合性および非－生分解性により顕著に高い細胞毒性を示す。

【0008】

このような技術的背景下で、本発明者らは薬物封入率に優れ、目的とする器官または細胞に陰イオン性薬物、核酸などを効率的に伝達できる新規粒子を開発するために鋭意努力した結果、イオン化可能な脂質；リン脂質；コレステロール；および脂質－ＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）複合体を含む脂質ナノ粒子を製造し、前記脂質ナノ粒子が肝組織に特異的に伝達され、陰イオン性化合物または核酸などの薬物が高効率に封入できることを確認して本発明を完成した。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明の目的は、６員ヘテロ環アミンおよびアルキル－エポキシドが結合したイオン化可能な脂質、リン脂質、コレステロール、および脂質－ＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）複合体を含む脂質ナノ粒子を提供することである。

【0010】

本発明の他の目的は、（１）前記脂質ナノ粒子；および（２）陰イオン性薬物、核酸、またはその組み合わせを含む薬物（陰イオン性薬物、核酸、またはその組み合わせ）伝達用組成物を提供することである。

【0011】

本発明のさらに他の目的は、（１）前記脂質ナノ粒子；および（２）陰イオン性薬物核酸、またはその組み合わせを有効性分として含む肝疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0012】

以下、これについて具体的に説明する。一方、本発明に開示されたそれぞれの説明および実施形態はそれぞれの他の説明および実施形態にも適用される。すなわち、本発明に開示された多様な要素のすべての組み合わせが本発明の範疇に属する。また、後述する具体的な叙述によって本発明の範疇が限定されない。

【0013】

上記の目的を達成するための一態様は、６員ヘテロ環アミンおよびアルキル－エポキシドが結合したイオン化可能な脂質（ｉｏｎｉｚａｂｌｅ ｌｉｐｉｄ）；リン脂質；コレステロール；および脂質－ＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）複合体を含む脂質ナノ粒子を提供する。

【0014】

本発明の一実施形態による脂質ナノ粒子は、肝組織特異的で生体親和性に優れ、高効率に遺伝子治療剤などを伝達できるため、脂質ナノ粒子媒介遺伝子治療および画像診断技術などの関連技術分野で有用に使用することができる。

【0015】

本明細書において、「イオン化可能な脂質（ｉｏｎｉｚａｂｌｅ ｌｉｐｉｄ）」または「脂質類似体（ｌｉｐｉｄｏｉｄ）」は、容易にプロトン化できるアミン－含有脂質を意味し、例えば、周辺のｐＨにより電荷状態が変わる脂質である。前記イオン化可能な脂質は、６員ヘテロ環アミンおよびアルキル－エポキシドが結合したものであり得る。具体的には、前記イオン化可能な脂質は、６員ヘテロ環アミンおよびアルキル－エポキシドが反応して生成される脂質と類似した特性を有する化合物であり、より具体的には、６員ヘテロ環アミンをアルキル－エポキシドと反応させてエポキシドの開環反応（ｒｉｎｇ ｏｐｅｎｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎ）によって生成される化合物であり得る。

【0016】

一例として、前記イオン化可能な脂質は、６員ヘテロ環アミンおよびアルキル－エポキシドは１：ｎ（ｎ＝６員ヘテロ環アミンに含まれている第１級アミンの個数×２＋第２級アミンの個数×１）のモル比で反応させて結合したものであり得る。一実施形態によれば、２４６アミンおよび１，２－エポキシドデカンを１：４のモル比で混合して７００～８００ｒｐｍ、８５～９５の条件で２～４日間反応させて製造したものであり得る。

【0017】

前記イオン化可能な脂質は、陽イオン性脂質のｐＫａ未満のｐＨでプロトン化（正に荷電）され、ｐＫａ超過のｐＨでは実質的に中性である。一例として、前記脂質ナノ粒子は、プロトン化されたイオン化可能な脂質および／または中性を示すイオン化可能な脂質を含み得る。

【0018】

前記イオン化可能な脂質は、脂質と類似した特性を有するイオン化可能な化合物であって、薬物（例えば、陰イオン性薬物および／または核酸）との静電的相互作用により前記薬物が脂質ナノ粒子内に高効率に封入されるようにする役割を果たす。

【0019】

前記６員ヘテロ環アミンは、ピペラジン（ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ）またはピペリジン（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ）構造を含むものであり得る。

【0020】

前記６員ヘテロ環アミンは、第３級アミンを含む鎖状または非鎖状のアミンであり、一例として、

【化1】

からなる群から選択される１種以上であり得る。

【0021】

一例として、前記６員ヘテロ環アミンは、１，４－ｂｉｓ（３－ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ、Ｎ－（３－Ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ、（１－Ｍｅｔｈｙｌ－４－ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ）ｍｅｔｈａｎａｍｉｎｅ、２－（４－Ｍｅｔｈｙｌ－ｐｉｐｅｒａｚｉｎ－１－ｙｌ）－ｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ、１－（２－Ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ、および１－（３－ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅからなる群から選択される１種以上であり得る。

【0022】

前記イオン化可能な脂質に含まれるアミンの種類によって、脂質ナノ粒子の（ｉ）薬物封入率、（ｉｉ）ＰＤＩ（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ ｉｎｄｅｘ）、および／または（ｉｉｉ）肝組織、および／または肝を構成する細胞（例えば、肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）および／またはＬＳＥＣ（ｌｉｖｅｒ ｓｉｎｕｓｏｉｄａｌ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ；肝類洞内皮細胞））への薬物伝達効率が異なる。

【0023】

前記アミンを含むイオン化可能な脂質を含む脂質ナノ粒子は、下記特徴の１種以上を有する：
（１）高効率に薬物を封入；
（２）製造された粒子の大きさが均一（または低いＰＤＩ数値を有し）；および／または
（３）肝組織、および／または肝を構成する細胞（例えば、肝細胞および／またはＬＳＥＣ）への薬物伝達効率に優れる。

【0024】

一実施形態によれば、１，４－ｂｉｓ（３－ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ（例えば、Ｃａｓ Ｎｏｓ．７２０９－３８－３）を含むイオン化可能な脂質を含む脂質ナノ粒子は、他の種類のアミンを含むイオン化可能な脂質を含む脂質ナノ粒子より下記特徴の１種以上を有する：
（１）高効率に薬物を封入；
（２）製造された粒子の大きさが均一（または低いＰＤＩ数値を有し）；および／または
（３）肝組織、および／または肝を構成する細胞（例えば、肝細胞および／またはＬＳＥＣ）への薬物伝達効率に優れる。

【0025】

前記アルキル－エポキシドは、下記化学式１のような構造を有する。

【化2】

前記アルキル－エポキシドは、Ｃ６～Ｃ１４、Ｃ６～Ｃ１２、Ｃ６～Ｃ１０、Ｃ８～Ｃ１４、Ｃ８～Ｃ１２、Ｃ８～Ｃ１０、Ｃ１０～Ｃ１４、Ｃ１０～Ｃ１２、またはＣ１０の炭素の長さを有し、例えば、Ｃ１０の１，２－エポキシドデカン（１，２－ｅｐｏｘｙｄｏｄｅｃａｎｅ）である。イオン化可能な脂質に含まれるアルキル－エポキシドの炭素数を上記の範囲とすることにより脂質ナノ粒子内に封入される薬物に対する高い封入率を示すことができる。

【0026】

一例として、前記イオン化可能な脂質は、下記化学式２の一般式を有する。

【化3】

【0027】

上記化学式２の構造は、一実施形態によるイオン化可能な脂質を有する構造の一例であって、イオン化可能な脂質の構造は、６員ヘテロ環アミンおよびアルキル－エポキシドの種類によって異なる。

【0028】

一実施形態によれば、化学式２の構造を有するイオン化可能な脂質を含む脂質ナノ粒子は、他の種類のイオン化可能な脂質を含む脂質ナノ粒子より下記特徴の１種以上を有する：
（１）高効率に薬物を封入；
（２）製造された粒子の大きさが均一（または低いＰＤＩ数値を有し）；および／または
（３）肝組織、および／または肝を構成する細胞（例えば、肝細胞および／またはＬＳＥＣ）への薬物伝達効率に優れる。

【0029】

一実施形態によれば、前記脂質ナノ粒子は、ｐＫａが５～８、５．５～７．５、６～７、または６．５～７であり得る。ｐＫａは酸解離定数であって、対象物質の酸の強さを表した指標として一般に使用されているものを指す。前記脂質ナノ粒子のｐＫａ値は、脂質ナノ粒子の生体内安定性および脂質ナノ粒子の薬物放出側面において重要である。一例として、上記範囲のｐＫａ値を示す脂質ナノ粒子は、生体内に安全にターゲット臓器（例えば、肝）および／またはターゲット細胞（肝細胞、および／またはＬＳＥＣ）に伝達され、ターゲット臓器および／またはターゲット細胞に到達してエンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）後に正電荷を示して、エンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）膜の陰イオン性タンパク質と静電的相互作用により封入された薬物が放出されるようにすることができる。

【0030】

一実施形態による脂質ナノ粒子の構成要素中のリン脂質は、脂質ナノ粒子内にイオン化可能な脂質および薬物が相互作用して形成されたコアを囲んで保護する役割を果たし、ターゲット細胞のリン脂質二重層と結合して薬物の細胞内への伝達時、細胞膜通過およびエンドソーム脱出（ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｅｓｃａｐｅ）を容易にすることができる。

【0031】

前記リン脂質は、一実施形態による脂質ナノ粒子の融合を促進できるリン脂質を限定なく用いることができ、例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、ＤＯＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、ＤＳＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、ＰＯＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ｅｇｇ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、ＥＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ、ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ、ＤＰＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、ＤＳＰＥ）、ホスファチジルエタノールアミン（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、ＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、１－ｐａｌｍｉｔｏｙｌ－２－ｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＰＯＰＥ）、１－ｐａｌｍｉｔｏｙｌ－２－ｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ（ＰＯＰＣ）、１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－［ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｌ－ｓｅｒｉｎｅ］（ＤＯＰＳ）、１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－［ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｌ－ｓｅｒｉｎｅ］などからなる群から選択される１種以上であり得る。一例として、ＤＯＰＥを含む脂質ナノ粒子は、ｍＲＮＡ伝達に効果的（ｍＲＮＡに対する薬物伝達効率に優れ）であり、別の例として、ＤＳＰＥを含む脂質ナノ粒子は、ｓｉＲＮＡ伝達に効果的（ｓｉＲＮＡに対する薬物伝達効率に優れ）である。

【0032】

一実施形態による脂質ナノ粒子の構成要素中でコレステロールは、脂質ナノ粒子内に脂質充填に形態的側面から堅固性を付与し、ナノ粒子のコアおよび表面に分散してナノ粒子の安定性を向上させる役割を果たす。

【0033】

本明細書において「脂質－ＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）複合体」、「脂質－ＰＥＧ」、「ＰＥＧ－脂質」、「ＰＥＧ－ｌｉｐｉｄ」、または「ｌｉｐｉｄ－ＰＥＧ」は、脂質とＰＥＧがコンジュゲートされた形態を指し、一側端部に親水性重合体であるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）重合体が結合した脂質を意味する。前記脂質－ＰＥＧ複合体は、脂質ナノ粒子内でナノ粒子の血清内粒子安定性に寄与し、ナノ粒子間の凝集を防ぐ役割を果たす。また、脂質－ＰＥＧ複合体は、核酸の生体内伝達時、分解酵素から核酸を保護して核酸の体内安定性を強化させ、ナノ粒子内封入された薬物の半減期を増加させる。

【0034】

前記脂質－ＰＥＧ複合体でＰＥＧは脂質に直接接合されるか、またはリンカーモイエティにより脂質に連結される。ＰＥＧを脂質に結合させるために好適な任意のリンカーモイエティを用いることができ、例えば、エステル－非含有リンカーモイエティおよびエステル－含有リンカーモイエティが含まれる。前記エステル－非含有リンカーモイエティは、アミド（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）、アミノ（－ＮＲ－）、カルボニル（－Ｃ（Ｏ）－）、カルバメート（－ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ－）、尿素（－ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ－）、ジスルフィド（－Ｓ－Ｓ－）、エーテル（－Ｏ－）、スクシニル（－（Ｏ）ＣＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）－）、スクシンアミジル（－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）、エーテル、ジスルフィドのみならず、これらの組み合わせ（例えば、カルバメートリンカーモイエティおよびアミドリンカーモイエティの両方を含有するリンカー）が挙げられるが、これらに限定されない。前記エステル－含有リンカーモイエティは、例えば、カーボネート（－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－）、スクシニル、リン酸エステル（－Ｏ－（Ｏ）ＰＯＨ－Ｏ－）、スルホン酸エステル、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

【0035】

一例として、前記脂質－ＰＥＧ複合体の平均分子量は、１００ダルトン～１０，０００ダルトン、２００ダルトン～８，０００ダルトン，５００ダルトン～５，０００ダルトン、１，０００ダルトン～３，０００ダルトン、１，０００ダルトン～２，６００ダルトン、１，５００ダルトン～２，６００ダルトン、１，５００ダルトン～２，５００ダルトン、２，０００ダルトン～２，６００ダルトン、２，０００ダルトン～２，５００ダルトン、または２，０００ダルトンであり得る。

【0036】

前記脂質－ＰＥＧ複合体内脂質は、ポリエチレングリコールと結合できる脂質であれば限定なく使用することができ、前記脂質ナノ粒子の他の構成要素であるリン脂質および／またはコレステロールを使用することもできる。具体的には、脂質－ＰＥＧ複合体内脂質は、セラミド（ｃｅｒａｍｉｄｅ）、ジミリストイルグリセロール（ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ、ＤＭＧ）、スクシニルジアシルグリセロール（ｓｕｃｃｉｎｏｙｌ－ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ、ｓ－ＤＡＧ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、ＤＳＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルエターノルアミン（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、ＤＳＰＥ）、またはコレステロールであり得るが、これらに限定されない。

【0037】

一例として、前記脂質－ＰＥＧ複合体は、ジアルキルオキシプロピルに結合されたＰＥＧ（ＰＥＧ－ＤＡＡ）、ジアシルグリセロールに結合されたＰＥＧ（ＰＥＧ－ＤＡＧ）、ホスファチジルエタノールアミンなどのリン脂質に結合されたＰＥＧ（ＰＥＧ－ＰＥ）、セラミドに接合されたＰＥＧ（ＰＥＧ－ＣＥＲ、セラミド－ＰＥＧ複合体、セラミド－ＰＥＧ、ＰＥＧ－セラミド複合体、またはＰＥＧ－セラミド）、コレステロールまたはその誘導体に接合されたＰＥＧ、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、ＰＥＧ－ＤＳＰＥ（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）、およびこれらの混合物であり得、例えば、Ｃ１６－ＰＥＧ２０００セラミド（Ｎ－ｐａｌｍｉｔｏｙｌ－ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ－１－{ｓｕｃｃｉｎｙｌ［ｍｅｔｈｏｘｙ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）２０００］}）、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００、１４：０ ＰＥＧ２０００ＰＥであり得る。

【0038】

一実施形態によれば、セラミド－ＰＥＧ複合体を含む脂質ナノ粒子を含む場合、他の種類の脂質－ＰＥＧ複合体を含む脂質ナノ粒子を含む場合より下記特徴の１種以上を有する：
（１）高効率に薬物を封入；
（２）製造された粒子の大きさが均一（または低いＰＤＩ数値を有し）；および／または
（３）肝組織、および／または肝を構成する細胞（例えば、肝細胞および／またはＬＳＥＣ）への薬物伝達効率に優れる。

【0039】

前記脂質－ＰＥＧ複合体内ＰＥＧは、親水性高分子に血漿タンパク質の吸着を抑制する能力を有しているため、脂質ナノ粒子の体内循環時間を増加させてナノ粒子間の凝集現象を防ぐ役割を果たす。また、脂質－ＰＥＧ複合体は、生体内でステルス（ｓｔｅａｌｔｈ）機能を果たしてナノ粒子の分解を防止することができる。

【0040】

前記ＰＥＧは、脂質に結合しない側に官能基が結合したもの（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ ＰＥＧ）であり得る。この時、使用可能な官能基は、スクシニル基（ｓｕｃｃｉｎｙｌ）、カルボン酸（ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）、マレイミド（ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）、アミン基、ビオチン、シアヌル基（ｃｙａｎｕｒ）、および葉酸（ｆｏｌａｔｅ）などからなる群から選択される１種以上であり得る。

【0041】

一実施形態によれば、前記脂質－ＰＥＧ複合体は、０．１～１５モル％、０．２５～１５モル％、０．５～１５モル％、１～１５モル％、１．５～１５モル％、２～１５モル％、２．５～１５モル％、０．１～１２．５モル％、０．２５～１２．５モル％、０．５～１２．５モル％、１～１２．５モル％、１．５～１２．５モル％、２～１２．５モル％、２．５～１２．５モル％、０．１～１０モル％、０．２５～１０モル％、０．５～１０モル％、１～１０モル％、１．５～１０モル％、２～１０モル％、２．５～１０モル％、０．１～７．５モル％、０．２５～７．５モル％、０．５～７．５モル％、１～７．５モル％、１．５～７．５モル％、２～７．５モル％、２．５～７．５モル％、０．１～５モル％、０．２５～５モル％、０．５～５モル％、１～５モル％、１．５～５モル％、２～５モル％、２．５～５モル％、０．１～３モル％、０．２５～３モル％、０．５～３モル％、１～３モル％、１．５～３モル％、２～３モル％、２．５～３モル％、０．１～２．５モル％、０．２５～２．５モル％、０．５～２．５モル％、１～２．５モル％、１．５～２．５モル％、２～２．５モル％、０．１～４．５モル％、０．２５～４．５モル％、０．５～４．５モル％、１～４．５モル％、１．５～４．５モル％、２～４．５モル％、２．５～４．５モル％、０．１～４モル％、０．２５～４モル％、０．５～４モル％、１～４モル％、１．５～４モル％、２～４モル％、２．５～４モル％、０．１～３．５モル％、０．２５～３．５モル％、０．５～３．５モル％、１～３．５モル％、１．５～３．５モル％、２～３．５モル％、２．５～３．５モル％、０．１～２．０モル％、０．１～１．５モル％、０．１～１．０モル％、０．５～２．０モル％、０．５～１．５モル％、０．５～１．０モル％、１．０～２．０モル％、１．０～１．５モル％、１．５～２．０モル％、１．０モル％、または１．５モル％で前記脂質ナノ粒子に含まれる。

【0042】

一例として、前記脂質ナノ粒子の肝組織、肝細胞、および／またはＬＳＥＣターゲット効果（薬物伝達効果）は、脂質ナノ粒子に含まれる脂質－ＰＥＧ複合体の含有量に依存する。

【0043】

例えば、脂質－ＰＥＧ複合体を０．１～１５モル％、０．２５～１５モル％、０．５～１５モル％、１～１５モル％、１．５～１５モル％、２～１５モル％、２．５～１５モル％、０．１～１２．５モル％、０．２５～１２．５モル％、０．５～１２．５モル％、１～１２．５モル％、１．５～１２．５モル％、２～１２．５モル％、２．５～１２．５モル％、０．１～１０モル％、０．２５～１０モル％、０．５～１０モル％、１～１０モル％、１．５～１０モル％、２～１０モル％、２．５～１０モル％、０．１～７．５モル％、０．２５～７．５モル％、０．５～７．５モル％、１～７．５モル％、１．５～７．５モル％、２～７．５モル％、２．５～７．５モル％、０．１～５モル％、０．２５～５モル％、０．５～５モル％、１～５モル％、１．５～５モル％、２～５モル％、２．５～５モル％、０．１～３モル％、０．２５～３モル％、０．５～３モル％、１～３モル％、１．５～３モル％、２～３モル％、２．５～３モル％、０．１～２．５モル％、０．２５～２．５モル％、０．５～２．５モル％、１～２．５モル％、１．５～２．５モル％、２～２．５モル％、０．１～４．５モル％、０．２５～４．５モル％、０．５～４．５モル％、１～４．５モル％、１．５～４．５モル％、２～４．５モル％、２．５～４．５モル％、０．１～４モル％、０．２５～４モル％、０．５～４モル％、１～４モル％、１．５～４モル％、２～４モル％、２．５～４モル％、０．１～３．５モル％、０．２５～３．５モル％、０．５～３．５モル％、１～３．５モル％、１．５～３．５モル％、２～３．５モル％、２．５～３．５モル％、０．１～１０モル％、０．１～５．０モル％、０．１～４．５モル％、０．１～４．０モル％、０．１～３．５モル％、０．１～３．０モル％、０．１～２．５モル％、０．１～２．０モル％、０．１～１．５モル％、０．１～１．０モル％、０．５～１０モル％、０．５～５．０モル％、０．５～４．５モル％、０．５～４．０モル％、０．５～３．５モル％、０．５～３．０モル％、０．５～２．５モル％、０．５～２．０モル％、０．５～１．５モル％、０．５～１．０モル％、１．０～１０モル％、１．０～５．０モル％、１．０～４．５モル％、１．０～４．０モル％、１．０～３．５モル％、１．０～３．０モル％、１．０～２．５モル％、１．０～２．０モル％、１．０～１．５モル％、１．５～１０モル％、１．５～５．０モル％、１．５～４．５モル％、１．５～４．０モル％、１．５～３．５モル％、１．５～３．０モル％、１．５～２．５モル％、１．５～２．０モル％、１．０モル％、または１．５モル％で含む脂質ナノ粒子は、（上記の範囲以外の含有量で脂質－ＰＥＧ複合体を含む脂質ナノ粒子よりも）肝細胞へのターゲット効果に優れる。

【0044】

また、別の例として、脂質－ＰＥＧ複合体を０．１～１５モル％、０．２５～１５モル％、０．５～１５モル％、１～１５モル％、１．５～１５モル％、２～１５モル％、２．５～１５モル％、０．１～１２．５モル％、０．２５～１２．５モル％、０．５～１２．５モル％、１～１２．５モル％、１．５～１２．５モル％、２～１２．５モル％、２．５～１２．５モル％、０．１～１０モル％、０．２５～１０モル％、０．５～１０モル％、１～１０モル％、１．５～１０モル％、２～１０モル％、２．５～１０モル％、０．１～７．５モル％、０．２５～７．５モル％、０．５～７．５モル％、１～７．５モル％、１．５～７．５モル％、２～７．５モル％、２．５～７．５モル％、０．１～５モル％、０．２５～５モル％、０．５～５モル％、１～５モル％、１．５～５モル％、２～５モル％、２．５～５モル％、０．１～３モル％、０．２５～３モル％、０．５～３モル％、１～３モル％、１．５～３モル％、２～３モル％、２．５～３モル％、０．１～２．５モル％、０．２５～２．５モル％、０．５～２．５モル％、１～２．５モル％、１．５～２．５モル％、２～２．５モル％、０．１～４．５モル％、０．２５～４．５モル％、０．５～４．５モル％、１～４．５モル％、１．５～４．５モル％、２～４．５モル％、２．５～４．５モル％、０．１～４モル％、０．２５～４モル％、０．５～４モル％、１～４モル％、１．５～４モル％、２～４モル％、２．５～４モル％、０．１～３．５モル％、０．２５～３．５モル％、０．５～３．５モル％、１～３．５モル％、１．５～３．５モル％、２～３．５モル％、２．５～３．５モル％、０．１～１０モル％、０．１～５．０モル％、０．１～４．５モル％、０．１～４．０モル％、０．１～３．５モル％、０．１～３．０モル％、０．１～２．５モル％、０．１～２．０モル％、０．１～１．５モル％、０．１～１．０モル％、０．５～１０モル％、０．５～５．０モル％、０．５～４．５モル％、０．５～４．０モル％、０．５～３．５モル％、０．５～３．０モル％、０．５～２．５モル％、０．５～２．０モル％、０．５～１．５モル％、０．５～１．０モル％、１．０～１０モル％、１．０～５．０モル％、１．０～４．５モル％、１．０～４．０モル％、１．０～３．５モル％、１．０～３．０モル％、１．０～２．５モル％、１．０～２．０モル％、１．０～１．５モル％、１．５～１０モル％、１．５～５．０モル％、１．５～４．５モル％、１．５～４．０モル％、１．５～３．５モル％、１．５～３．０モル％、１．５～２．５モル％、１．５～２．０モル％、１．０モル％、または１．５モル％で含む脂質ナノ粒子は、（上記の範囲以外の含有量で脂質－ＰＥＧ複合体を含む脂質ナノ粒子よりも）ＬＳＥＣへのターゲット効果に優れる。

【0045】

一実施形態によれば、前記コレステロールは、１０～６０モル％、２０～６０モル％、３０～６０モル％、３０～５５モル％、３０～５２．５モル％、３０～５２モル％、３０～５１モル％、３０～５０モル％、３０～４７．５モル％、３０～４５モル％、３０～４４モル％、３０～４３．５モル％、３０～４３モル％、３０～４１．５モル％、３０～４０モル％、３０～３９．５モル％、３５～６０モル％、３５～５５モル％、３５～５２．５モル％、３５～５２モル％、３５～５１モル％、３５～５０モル％、３５～４７．５モル％、３５～４５モル％、３５～４４モル％、３５～４３．５モル％、３５～４３モル％、３５～４１．５モル％、３５～４０モル％、３５～３９．５モル％、３７～６０モル％、３７～５５モル％、３７～５２．５モル％、３７～５２モル％、３７～５１モル％、３７．５～５０モル％、３７．５～４７．５モル％、３７．５～４５モル％、３７．５～４４モル％、３７．５～４３．５モル％、３７．５～４３モル％、３７．５～４１．５モル％、３７．５～４０モル％、３７．５～３９．５モル％、３９．５～６０モル％、３９．５～５５モル％、３９．５～５２．５モル％、３９．５～５２モル％、３９．５～５１モル％、３９．５～５０モル％、３９．５～４７．５モル％、３９．５～４５モル％、３９．５～４４モル％、３９．５～４３．５モル％、３９．５～４３モル％、３９．５～４１．５モル％、３９．５～４０モル％、４０～６０モル％、４０～５５モル％、４０～５２．５モル％、４０～５２モル％、４０～５１モル％、４０～５０モル％、４０～４７．５モル％、４０～４５モル％、４０～４４モル％、４０～４３．５モル％、４０～４３モル％、４０～４１．５モル％、４１．５～６０モル％、４１．５～５５モル％、４１．５～５２．５モル％、４１．５～５２モル％、４１．５～５１モル％、４１．５～５０モル％、４１．５～４７．５モル％、４１．５～４５モル％、４１．５～４４モル％、４１．５～４３．５モル％、４１．５～４３モル％、４３～６０モル％、４３～５５モル％、４３～５２．５モル％、４３～５２モル％、４３～５１モル％、４３～５０モル％、４３～４７．５モル％、４３～４５モル％、４３～４４モル％、４３～４３．５モル％、４３．５～６０モル％、４３．５～５５モル％、４３．５～５２．５モル％、４３．５～５２モル％、４３．５～５１モル％、４３．５～５０モル％、４３．５～４７．５モル％、４３．５～４５モル％、４３．５～４４モル％、４５～６０モル％、４５～５５モル％、４５～５２．５モル％、４５～５２モル％、４５～５１モル％、４５～５０モル％、４５～４７．５モル％、４７．５～６０モル％、４７．５～５５モル％、４７．５～５２．５モル％、４７．５～５２モル％、４７．５～５１モル％、４７．５～５０モル％、５０～６０モル％、５０～５５モル％、５０～５２．５モル％、５０～５２モル％、５０～５２．５モル％、５０～５１．５モル％、５１～６０モル％、５１～５５モル％、５１～５２．５モル％、または５１～５２モル％、５１～６０モル％、５１～５５モル％、５１～５２．５モル％、または５１～５２モル％で前記脂質ナノ粒子に含まれる。

【0046】

一実施形態によれば、前記脂質－ＰＥＧ複合体とコレステロールの合計は３０～７０モル％、４０～７０モル％、４０～６０モル％、４０～５５モル％、４０～５３．５モル％、４０～５０モル％、４０～４７．５モル％、４０～４５モル％、４０～４４．５モル％、４２～６０モル％、４２～５５モル％、４２～５３．５モル％、４２～５０モル％、４２～４７．５モル％、４２～４５モル％、４２～４４．５モル％、４４～６０モル％、４４～５５モル％、４４～５３．５モル％、４４～５０モル％、４４～４７．５モル％、４４～４５モル％、４４～４４．５モル％、４４．５～６０モル％、４４．５～５５モル％、４４．５～５３．５モル％、４４．５～５０モル％、４４．５～４７．５モル％、または４４．５～４５モル％で前記脂質ナノ粒子に含まれる。

【0047】

一実施形態によれば、前記イオン化可能な脂質は、１０～７０モル％、１０～６０モル％、１０～５５モル％、１０～５０モル％、１０～４５モル％、１０～４２．５モル％、１０～４０モル％、１０～３５モル％、１０～３０モル％、１０～２６．５モル％、１０～２５モル％、１０～２０モル％、１５～６０モル％、１５～５５モル％、１５～５０モル％、１５～４５モル％、１５～４２．５モル％、１５～４０モル％、１５～３５モル％、１５～３０モル％、１５～２６．５モル％、１５～２５モル％、１５～２０モル％、２０～６０モル％、２０～５５モル％、２０～５０モル％、２０～４５モル％、２０～４２．５モル％、２０～４０モル％、２０～３５モル％、２０～３０モル％、２０～２６．５モル％、２０～２５モル％、２５～６０モル％、２５～５５モル％、２５～５０モル％、２５～４５モル％、２５～４２．５モル％、２５～４０モル％、２５～３５モル％、２５～３０モル％、２５～２６．５モル％、２６．５～６０モル％、２６．５～５５モル％、２６．５～５０モル％、２６．５～４５モル％、２６．５～４２．５モル％、２６．５～４０モル％、２６．５～３５モル％、２６．５～３０モル％、３０～６０モル％、３０～５５モル％、３０～５０モル％、３０～４５モル％、３０～４２．５モル％、３０～４０モル％、３０～３５モル％、３５～６０モル％、３５～５５モル％、３５～５０モル％、３５～４５モル％、３５～４２．５モル％、３５～４０モル％、４０～６０モル％、４０～５５モル％、４０～５０モル％、４０～４５モル％、４０～４２．５モル％、４２．５～６０モル％、４２．５～５５モル％、４２．５～５０モル％、または４２．５～４５モル％で前記脂質ナノ粒子に含まれる。

【0048】

一実施形態によれば、前記リン脂質は１～５０モル％、５～５０モル％、５～４０モル％、５～３０モル％、５～２５モル％、５～２０モル％、５～１５モル％、５～１３モル％、５～１０モル％、１０～３０モル％、１０～２５モル％、１０～２０モル％、１０～１５モル％、１０～１３モル％、１５～３０モル％、１５～２５モル％、１５～２０モル％、２０～３０モル％、または２０～２５モル％で前記脂質ナノ粒子に含まれる。

【0049】

本明細書において「モル％（ｍｏｌ％、モルパーセント）」は、特定の構成成分のモル数を構成成分全体のモル数の和で割った後、１００を乗じてパーセントで示したものであり、数式で表現すると、下記数式１の通りである。

【数1】

【0050】

前記脂質ナノ粒子は、イオン化可能な脂質：リン脂質：コレステロール：脂質－ＰＥＧ複合体を２０～５０：１０～３０：２０～６０：０．１～１０のモル比、２０～５０：１０～３０：２０～６０：０．２５～１０のモル比、２０～５０：１０～３０：３０～６０：０．２５～１０のモル比、２０～５０：１０～３０：３０～６０：０．１～５のモル比、２０～５０：１０～３０：３０～６０：０．５～５のモル比、２５～４５：１０～２５：４０～５０：０．５～３のモル比、２５～４５：１０～２０：４０～５５：０．５～３のモル比、２５～４５：１０～２０：４０～５５：１．０～１．５のモル比、４０～４５：１０～１５：４０～４５：０．５～３．０のモル比、４０～４５：１０～１５：４０～４５：０．５～３のモル比、４０～４５：１０～１５：４０～４５：１～１．５のモル比、２５～３０：１７～２２：５０～５５：０．５～３．０のモル比、２５～３０：１７～２２：５０～５５：１．０～２．５のモル比、または２５～３０：１７～２２：５０～５５：１．５～２．５のモル比で含まれる。一実施形態によれば、前記脂質ナノ粒子に含まれる構成成分中、脂質－ＰＥＧ複合体およびコレステロールのモル数の和を一定に維持しながら、脂質－ＰＥＧ複合体のモル数の増加分だけコレステロールのモル数を減少させることで、前記構成成分のモル比を維持する。

【0051】

本明細書において、モル比はモル数比を意味し、「重量部」は、各成分が含まれている重量比率を意味する。

【0052】

一例として、前記脂質ナノ粒子は、イオン化可能な脂質２０～５０重量部、リン脂質１０～３０重量部、コレステロール２０～６０重量部（または３０～６０重量部）、および脂質－ＰＥＧ複合体０．１～１０重量部（または０．２５～１０重量部、０．５～５重量部）を含み得る。前記脂質ナノ粒子は、ナノ粒子全体の重量を基準にしてイオン化可能な脂質２０～５０重量％、リン脂質１０～３０重量％、コレステロール２０～６０重量％（または３０～６０重量％）、および脂質－ＰＥＧ複合体を０．１～１０重量％（または０．２５～１０重量％、０．５～５重量％）を含み得る。別の例として、前記脂質ナノ粒子は、ナノ粒子全体の重量を基準にしてイオン化可能な脂質２５～５０重量％、リン脂質１０～２０重量％、コレステロール３５～５５重量％、および脂質－ＰＥＧ複合体を０．１～１０重量％（または０．２５～１０重量％、０．５～５重量％）で含み得る。

【0053】

上記の範囲（モル比、重量部、および／または重量％）でイオン化可能な脂質、コレステロール、リン脂質、および／または脂質－ＰＥＧ複合体を含む脂質ナノ粒子は、上記の範囲外でイオン化可能な脂質、コレステロール、リン脂質、および／または脂質－ＰＥＧ複合体を含む脂質ナノ粒子より、（ｉ）脂質ナノ粒子の安定度、（ｉｉ）薬物封入率、および／または（ｉｉｉ）肝組織、および／または細胞（例えば、肝細胞および／またはＬＳＥＣ）をターゲットとする薬物伝達効率に優れる。

【0054】

一実施形態による脂質ナノ粒子は、肝組織、肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）、および／またはＬＳＥＣ（ｌｉｖｅｒ ｓｉｎｕｓｏｉｄａｌ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）内導入が容易になるように平均直径が２０ｎｍ～２００ｎｍ、２０～１８０ｎｍ、２０ｎｍ～１７０ｎｍ、２０ｎｍ～１５０ｎｍ、２０ｎｍ～１２０ｎｍ、２０ｎｍ～１００ｎｍ、２０ｎｍ～９０ｎｍ、３０ｎｍ～２００ｎｍ、３０～１８０ｎｍ、３０ｎｍ～１７０ｎｍ、３０ｎｍ～１５０ｎｍ、３０ｎｍ～１２０ｎｍ、３０ｎｍ～１００ｎｍ、３０ｎｍ～９０ｎｍ、４０ｎｍ～２００ｎｍ、４０～１８０ｎｍ、４０ｎｍ～１７０ｎｍ、４０ｎｍ～１５０ｎｍ、４０ｎｍ～１２０ｎｍ、４０ｎｍ～１００ｎｍ、４０ｎｍ～９０ｎｍ、５０ｎｍ～２００ｎｍ、５０～１８０ｎｍ、５０ｎｍ～１７０ｎｍ、５０ｎｍ～１５０ｎｍ、５０ｎｍ～１２０ｎｍ、５０ｎｍ～１００ｎｍ、５０ｎｍ～９０ｎｍ、６０ｎｍ～２００ｎｍ、６０～１８０ｎｍ、６０ｎｍ～１７０ｎｍ、６０ｎｍ～１５０ｎｍ、６０ｎｍ～１２０ｎｍ、６０ｎｍ～１００ｎｍ、６０ｎｍ～９０ｎｍ、７０ｎｍ～２００ｎｍ、７０～１８０ｎｍ、７０ｎｍ～１７０ｎｍ、７０ｎｍ～１５０ｎｍ、７０ｎｍ～１２０ｎｍ、７０ｎｍ～１００ｎｍ、７０ｎｍ～９０ｎｍ、８０ｎｍ～２００ｎｍ、８０～１８０ｎｍ、８０ｎｍ～１７０ｎｍ、８０ｎｍ～１５０ｎｍ、８０ｎｍ～１２０ｎｍ、８０ｎｍ～１００ｎｍ、８０ｎｍ～９０ｎｍ、９０ｎｍ～２００ｎｍ、９０～１８０ｎｍ、９０ｎｍ～１７０ｎｍ、９０ｎｍ～１５０ｎｍ、９０ｎｍ～１２０ｎｍ、または９０ｎｍ～１００ｎｍであり得る。脂質ナノ粒子が上記の範囲より小さい場合、脂質ナノ粒子の表面積が増加しすぎるので安定性維持が難しく、したがって、標的組織への伝達および／または薬物効果が減少する。

【0055】

一実施形態による脂質ナノ粒子の肝組織、肝細胞、および／またはＬＳＥＣターゲット効果（薬物伝達効果）は、脂質ナノ粒子の大きさに依存する。例えば、４０～１２０ｎｍ、３０～１００ｎｍ、３５～９５ｎｍ、４０～９０ｎｍ、４５～９０ｎｍ、５０～９０ｎｍ、５５～８５ｎｍ、６０～８０ｎｍ、７０～９０ｎｍ、７０～８０ｎｍ、５０～７０ｎｍ、または６０～７０ｎｍの直径を有する脂質ナノ粒子の場合、肝細胞へのターゲット効果に（上記の範囲以外の直径を有するナノ粒子よりも）優れる。別の例として、２０～２００ｎｍ、２０～１８０ｎｍ、４０～１８０ｎｍ、４０～１７０ｎｍ、５０～１６０ｎｍ、７０～１８０ｎｍ、７０～１７０ｎｍ、７５～１７０ｎｍ、７５～１６５ｎｍ、７０～１５０ｎｍ、７０～１３０ｎｍ、７５～１３０ｎｍ、８０～１２０ｎｍ、８５～１２０ｎｍ、約９０～１２０ｎｍ、９０～１１０ｎｍ、９０～１００ｎｍ、８０～１１０ｎｍ、８０～１００ｎｍ、８５～９５ｎｍ、約９０ｎｍ、または９０ｎｍの直径を有する脂質ナノ粒子の場合、ＬＳＥＣへのターゲット効果に（上記の範囲以外の直径を有するナノ粒子よりも）優れる。

【0056】

前記脂質ナノ粒子は、肝組織を特異的標的化するものであり得る。一実施形態による脂質ナノ粒子は、天然のリポタンパク質の代謝挙動を非常に類似に模倣でき、肝による脂質代謝の過程およびこれを通じた治療メカニズムに有用に適用される。

【0057】

前記脂質ナノ粒子は、肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）を標的化するものであり得る。前記脂質ナノ粒子に含まれている脂質－ＰＥＧ複合体の含有量が０．１～１５モル％、０．２５～１５モル％、０．５～１５モル％、１～１５モル％、１．５～１５モル％、２～１５モル％、２．５～１５モル％、０．１～１２．５モル％、０．２５～１２．５モル％、０．５～１２．５モル％、１～１２．５モル％、１．５～１２．５モル％、２～１２．５モル％、２．５～１２．５モル％、０．１～１０モル％、０．２５～１０モル％、０．５～１０モル％、１～１０モル％、１．５～１０モル％、２～１０モル％、２．５～１０モル％、０．１～７．５モル％、０．２５～７．５モル％、０．５～７．５モル％、１～７．５モル％、１．５～７．５モル％、２～７．５、２．５～７．５モル％、０．１～５モル％、０．２５～５モル％、０．５～５モル％、１～５モル％、１．５～５モル％、２～５モル％、２．５～５モル％、０．１～３モル％、０．２５～３モル％、０．５～３モル％、１～３モル％、１．５～３モル％、２～３モル％、２．５～３モル％、０．１～２．５モル％、０．２５～２．５モル％、０．５～２．５モル％、１～２．５モル％、１．５～２．５モル％、２～２．５モル％、０．１～４．５モル％、０．２５～４．５モル％、０．５～４．５モル％、１～４．５モル％、１．５～４．５モル％、２～４．５モル％、２．５～４．５モル％、０．１～４モル％、０．２５～４モル％、０．５～４モル％、１～４モル％、１．５～４モル％、２～４モル％、２．５～４モル％、０．１～３．５モル％、０．２５～３．５モル％、０．５～３．５モル％、１～３．５モル％、１．５～３．５モル％、２～３．５モル％、２．５～３．５モル％、０．１～２．０モル％、０．１～１．５モル％、０．１～１．０モル％、０．５～２．０モル％、０．５～１．５モル％、０．５～１．０モル％、１．０～２．０モル％、１．０～１．５モル％、１．５～２．０モル％、１．０モル％、または１．５モル％の場合、前記脂質ナノ粒子の肝細胞への薬物伝達効率（肝細胞ターゲット効率）に優れる。

【0058】

前記脂質ナノ粒子は、ＬＳＥＣ（ｌｉｖｅｒ ｓｉｎｕｓｏｉｄａｌ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）を標的化するものであり得る。前記脂質ナノ粒子に含まれている脂質－ＰＥＧ複合体の含有量が０．１～１５モル％、０．２５～１５モル％、０．５～１５モル％、１～１５モル％、１．５～１５モル％、２～１５モル％、２．５～１５モル％、０．１～１２．５モル％、０．２５～１２．５モル％、０．５～１２．５モル％、１～１２．５モル％、１．５～１２．５モル％、２～１２．５モル％、２．５～１２．５モル％、０．１～１０モル％、０．２５～１０モル％、０．５～１０モル％、１～１０モル％、１．５～１０モル％、２～１０モル％、２．５～１０モル％、０．１～７．５モル％、０．２５～７．５モル％、０．５～７．５モル％、１～７．５モル％、１．５～７．５モル％、２～７．５モル％、２．５～７．５モル％、０．１～５モル％、０．２５～５モル％、０．５～５モル％、１～５モル％、１．５～５モル％、２～５モル％、２．５～５モル％、０．１～３モル％、０．２５～３モル％、０．５～３モル％、１～３モル％、１．５～３モル％、２～３モル％、２．５～３モル％、０．１～２．５モル％、０．２５～２．５モル％、０．５～２．５モル％、１～２．５モル％、１．５～２．５モル％、２～２．５モル％、０．１～４．５モル％、０．２５～４．５モル％、０．５～４．５モル％、１～４．５モル％、１．５～４．５モル％、２～４．５モル％、２．５～４．５モル％、０．１～４モル％、０．２５～４モル％、０．５～４モル％、１～４モル％、１．５～４モル％、２～４モル％、２．５～４モル％、０．１～３．５モル％、０．２５～３．５モル％、０．５～３．５モル％、１～３．５モル％、１．５～３．５モル％、２～３．５モル％、２．５～３．５モル％、０．１～２．０モル％、０．１～１．５モル％、０．１～１．０モル％、０．５～２．０モル％、０．５～１．５モル％、０．５～１．０モル％、１．０～２．０モル％、１．０～１．５モル％、１．５～２．０モル％、１．０モル％、または１．５モル％の場合、前記脂質ナノ粒子のＬＳＥＣへの薬物伝達効率（ＬＳＥＣターゲット効率）に優れる。

【0059】

本明細書において、前記脂質ナノ粒子が肝組織、肝細胞、および／またはＬＳＥＣへ「標的化（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）」、「位置化（ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）」するとは、組織内または細胞内に内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）することであり、核膜も透過できるので核内に内在化することを意味する。

【0060】

他の態様として、（１）前記脂質ナノ粒子；および（２）陰イオン性薬物、核酸、またはその組み合わせ（陰イオン性薬物および核酸の組み合わせ）を含む薬物伝達用組成物を提供する。前記薬物は、陰イオン性薬物、核酸、またはその組み合わせ（陰イオン性薬物および核酸）であり得る。

【0061】

前記薬物伝達用組成物は、前記脂質ナノ粒子内部に陰イオン性薬物および／または核酸などの生理活性物質が封入されているものであり、陰イオン性薬物および／または核酸などの生理活性物質が安定的かつ高効率に封入されて前記伝達用組成物によって優れた治療効果を示すことができる。また、前記脂質ナノ粒子内部に封入される薬物の種類を治療の目的に応じて多様に調節できる長所がある。

【0062】

前記脂質ナノ粒子は、陰イオン性薬物および／または核酸が（脂質ナノ粒子の）内部に封入されたものであり得る。陰イオン性薬物および／または核酸が（脂質ナノ粒子の内部に）封入された脂質ナノ粒子については上述した脂質ナノ粒子と同様である。

【0063】

一例として、前記脂質ナノ粒子に含まれているイオン化可能な脂質および薬物（陰イオン性薬物、核酸、またはその組み合わせ）の重量比は１～２０：１、１～１５：１、１～１０：１、５～２０：１、５～１５：１、５～１０：１、７．５～２０：１、７．５～１５：１、または７．５～１０：１であり得る。

【0064】

一例として、上記の範囲内の重量比で（１）イオン化可能な脂質；および（２）薬物（陰イオン性薬物、核酸、またはその組み合わせ）を含む場合、脂質ナノ粒子内部に薬物（陰イオン性薬物、核酸、またはその組み合わせ）の封入率および／または薬物伝達効率が上記の範囲外の重量比で（１）イオン化可能な脂質；および（２）陰イオン性薬物、核酸、またはその組み合わせを含む脂質ナノ粒子より高いこともある。

【0065】

前記陰イオン性薬物および／または核酸が封入された脂質ナノ粒子は、肝組織、肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）、および／またはＬＳＥＣ（ｌｉｖｅｒ ｓｉｎｕｓｏｉｄａｌ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）内導入が容易になるように平均直径が２０ｎｍ～２００ｎｍ、２０～１８０ｎｍ、２０ｎｍ～１７０ｎｍ、２０ｎｍ～１５０ｎｍ、２０ｎｍ～１２０ｎｍ、２０ｎｍ～１００ｎｍ、２０ｎｍ～９０ｎｍ、３０ｎｍ～２００ｎｍ、３０～１８０ｎｍ、３０ｎｍ～１７０ｎｍ、３０ｎｍ～１５０ｎｍ、３０ｎｍ～１２０ｎｍ、３０ｎｍ～１００ｎｍ、３０ｎｍ～９０ｎｍ、４０ｎｍ～２００ｎｍ、４０～１８０ｎｍ、４０ｎｍ～１７０ｎｍ、４０ｎｍ～１５０ｎｍ、４０ｎｍ～１２０ｎｍ、４０ｎｍ～１００ｎｍ、４０ｎｍ～９０ｎｍ、５０ｎｍ～２００ｎｍ、５０～１８０ｎｍ、５０ｎｍ～１７０ｎｍ、５０ｎｍ～１５０ｎｍ、５０ｎｍ～１２０ｎｍ、５０ｎｍ～１００ｎｍ、５０ｎｍ～９０ｎｍ、６０ｎｍ～２００ｎｍ、６０～１８０ｎｍ、６０ｎｍ～１７０ｎｍ、６０ｎｍ～１５０ｎｍ、６０ｎｍ～１２０ｎｍ、６０ｎｍ～１００ｎｍ、６０ｎｍ～９０ｎｍ、７０ｎｍ～２００ｎｍ、７０～１８０ｎｍ、７０ｎｍ～１７０ｎｍ、７０ｎｍ～１５０ｎｍ、７０ｎｍ～１２０ｎｍ、７０ｎｍ～１００ｎｍ、７０ｎｍ～９０ｎｍ、８０ｎｍ～２００ｎｍ、８０～１８０ｎｍ、８０ｎｍ～１７０ｎｍ、８０ｎｍ～１５０ｎｍ、８０ｎｍ～１２０ｎｍ、８０ｎｍ～１００ｎｍ、８０ｎｍ～９０ｎｍ、９０ｎｍ～２００ｎｍ、９０～１８０ｎｍ、９０ｎｍ～１７０ｎｍ、９０ｎｍ～１５０ｎｍ、９０ｎｍ～１２０ｎｍ、または９０ｎｍ～１００ｎｍであり得る。

【0066】

上記範囲の下限値より脂質ナノ粒子の大きさが小さい場合、（ｉ）脂質ナノ粒子が体循環（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）の際、血液中に存在するアポリポプロテイン（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）（例えば、ＡｐｏＥ（例えば、ＡｐｏＥ３））の結合が減少して細胞内に入る脂質ナノ粒子の数が減少することがあり、（ｉｉ）脂質ナノ粒子の表面積が増加しすぎるので安定性維持が難しく、したがって、標的組織（または標的細胞）への薬物伝達効率および／または脂質ナノ粒子が運ぶ薬物の治療効果が減少する。

【0067】

上記の範囲内の直径を有する脂質ナノ粒子は、上記範囲の上限値を超える直径を有する脂質ナノ粒子よりもターゲット臓器および／または細胞への薬物伝達効率に優れる。

【0068】

一例として、（１）前記脂質ナノ粒子；および（２）陰イオン性薬物、核酸、またはその組み合わせを含む薬物伝達用組成物は、肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）への薬物伝達用組成物であり得る。

【0069】

一実施形態によれば、前記肝細胞への薬物（陰イオン性薬物、核酸、またはその組み合わせ）伝達用組成物に含まれる脂質ナノ粒子の直径は４０～１２０ｎｍ、３０～１００ｎｍ、３５～９５ｎｍ、４０～９０ｎｍ、４５～９０ｎｍ、５０～９０ｎｍ、５５～８５ｎｍ、６０～８０ｎｍ、７０～９０ｎｍ、７０～８０ｎｍ、５０～７０ｎｍ、または６０～７０ｎｍであり得る。肝細胞への薬物伝達時、ｓｉｎｕｓｏｉｄａｌ ｌｕｍｅｎから肝細胞につながる穿孔（ｆｅｎｅｓｔｒａｅ）の直径は哺乳動物の場合約１４０ｎｍ、ヒトの場合約１００ｎｍであるので、上記範囲の直径を有する薬物伝達用組成物は、肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）への薬物伝達効率が上記の範囲外の直径を有する脂質ナノ粒子よりも優れる。

【0070】

一実施形態によれば、前記肝細胞への薬物伝達用組成物に含まれる脂質ナノ粒子は、脂質－ＰＥＧ複合体を０．１～１５モル％、０．２５～１５モル％、０．５～１５モル％、１～１５モル％、１．５～１５モル％、２～１５モル％、２．５～１５モル％、０．１～１２．５モル％、０．２５～１２．５モル％、０．５～１２．５モル％、１～１２．５モル％、１．５～１２．５モル％、２～１２．５モル％、２．５～１２．５モル％、０．１～１０モル％、０．２５～１０モル％、０．５～１０モル％、１～１０モル％、１．５～１０モル％、２～１０モル％、２．５～１０モル％、０．１～７．５モル％、０．２５～７．５モル％、０．５～７．５モル％、１～７．５モル％、１．５～７．５モル％、２～７．５モル％、２．５～７．５モル％、０．１～５モル％、０．２５～５モル％、０．５～５モル％、１～５モル％、１．５～５モル％、２～５モル％、２．５～５モル％、０．１～３モル％、０．２５～３モル％、０．５～３モル％、１～３モル％、１．５～３モル％、２～３モル％、２．５～３モル％、０．１～２．５モル％、０．２５～２．５モル％、０．５～２．５モル％、１～２．５モル％、１．５～２．５モル％、２～２．５モル％、０．１～４．５モル％、０．２５～４．５モル％、０．５～４．５モル％、１～４．５モル％、１．５～４．５モル％、２～４．５モル％、２．５～４．５モル％、０．１～４モル％、０．２５～４モル％、０．５～４モル％、１～４モル％、１．５～４モル％、２～４モル％、２．５～４モル％、０．１～３．５モル％、０．２５～３．５モル％、０．５～３．５モル％、１～３．５モル％、１．５～３．５モル％、２～３．５モル％、２．５～３．５モル％、０．１～２．０モル％、０．１～１．５モル％、０．１～１．０モル％、０．５～２．０モル％、０．５～１．５モル％、０．５～１．０モル％、１．０～２．０モル％、１．０～１．５モル％、１．５～２．０モル％、１．０モル％、または１．５モル％で含み得、上記の範囲で脂質－ＰＥＧ複合体を含む脂質ナノ粒子は、肝細胞特異的（または肝細胞をターゲットとする）薬物伝達効率に優れる。

【0071】

一実施形態によれば、前記肝細胞への薬物伝達用組成物に含まれる脂質ナノ粒子は、イオン化可能な脂質：リン脂質：コレステロール：脂質－ＰＥＧ複合体を上記の範囲または２０～５０：１０～３０：３０～６０：０．５～５のモル比、２５～４５：１０～２５：４０～５０：０．５～３のモル比、２５～４５：１０～２０：４０～５５：０．５～３のモル比、２５～４５：１０～２０：４０～５５：１．０～１．５のモル比で含み得る。上記の範囲のモル比で構成成分を含む脂質ナノ粒子は、肝細胞特異的（または肝細胞をターゲットとする）薬物伝達効率に優れる。

【0072】

一例として、（１）前記脂質ナノ粒子；および（２）陰イオン性薬物、核酸、またはその組み合わせを含む薬物伝達用組成物は、ＬＳＥＣへの薬物伝達用組成物であり得る。

【0073】

前記ＬＳＥＣへの薬物伝達用組成物に含まれる脂質ナノ粒子の直径は、前記穿孔（ｆｅｎｅｓｔｒａｅ）の直径と類似しているか、または若干小さい場合にＬＳＥＣへの薬物伝達効果に優れる。一例として、前記ＬＳＥＣへの薬物伝達用組成物に含まれる脂質ナノ粒子の直径は２０～２００ｎｍ、２０～１８０ｎｍ、４０～１８０ｎｍ、４０～１７０ｎｍ、５０～１６０ｎｍ、７０～１８０ｎｍ、７０～１７０ｎｍ、７５～１７０ｎｍ、７５～１６５ｎｍ、７０～１５０ｎｍ、７０～１３０ｎｍ、７５～１３０ｎｍ、８０～１２０ｎｍ、８５～１２０ｎｍ、約９０～１２０ｎｍ、９０～１１０ｎｍ、８０～１１０ｎｍ、８０～１００ｎｍ、８５～９５ｎｍ、約９０ｎｍ、または９０ｎｍであり得る。

【0074】

一実施形態によれば、前記ＬＳＥＣへの薬物伝達用組成物に含まれる脂質ナノ粒子は、脂質－ＰＥＧ複合体を０．１～１５モル％、０．２５～１５モル％、０．５～１５モル％、１～１５モル％、１．５～１５モル％、２～１５モル％、２．５～１５モル％、０．１～１２．５モル％、０．２５～１２．５モル％、０．５～１２．５モル％、１～１２．５モル％、１．５～１２．５モル％、２～１２．５モル％、２．５～１２．５モル％、０．１～１０モル％、０．２５～１０モル％、０．５～１０モル％、１～１０モル％、１．５～１０モル％、２～１０モル％、２．５～１０モル％、０．１～７．５モル％、０．２５～７．５モル％、０．５～７．５モル％、１～７．５モル％、１．５～７．５モル％、２～７．５モル％、２．５～７．５モル％、０．１～５モル％、０．２５～５モル％、０．５～５モル％、１～５モル％、１．５～５モル％、２～５モル％、２．５～５モル％、０．１～３モル％、０．２５～３モル％、０．５～３モル％、１～３モル％、１．５～３モル％、２～３モル％、２．５～３モル％、０．１～２．５モル％、０．２５～２．５モル％、０．５～２．５モル％、１～２．５モル％、１．５～２．５モル％、２～２．５モル％、０．１～４．５モル％、０．２５～４．５モル％、０．５～４．５モル％、１～４．５モル％、１．５～４．５モル％、２～４．５モル％、２．５～４．５モル％、０．１～４モル％、０．２５～４モル％、０．５～４モル％、１～４モル％、１．５～４モル％、２～４モル％、２．５～４モル％、０．１～３．５モル％、０．２５～３．５モル％、０．５～３．５モル％、１～３．５モル％、１．５～３．５モル％、２～３．５モル％、２．５～３．５モル％、０．１～２．０モル％、０．１～１．５モル％、０．１～１．０モル％、０．５～２．０モル％、０．５～１．５モル％、０．５～１．０モル％、１．０～２．０モル％、１．０～１．５モル％、１．５～２．０モル％、１．０モル％、または１．５モル％で含み得、上記の範囲で脂質－ＰＥＧ複合体を含む脂質ナノ粒子は、ＬＳＥＣ特異的（またはＬＳＥＣをターゲットとする）薬物伝達効率に優れる。

【0075】

一実施形態によれば、前記ＬＳＥＣへの薬物伝達用組成物に含まれる脂質ナノ粒子は、イオン化可能な脂質：リン脂質：コレステロール：脂質－ＰＥＧ複合体を上記の範囲または２０～５０：１０～３０：３０～６０：０．５～５のモル比、２５～４５：１０～２５：４０～５０：０．５～３のモル比、２５～４５：１０～２０：４０～５５：０．５～３のモル比、２５～４５：１０～２０：４０～５５：１．０～１．５のモル比で含み得る。上記範囲のモル比で構成成分を含む脂質ナノ粒子は、ＬＳＥＣ特異的（またはＬＳＥＣをターゲットとする）薬物伝達効率に優れる。

【0076】

一実施形態による脂質ナノ粒子は、肝組織特異的な特性により高効率的に治療剤を肝組織内部、肝細胞、および／またはＬＳＥＣに伝達でき、このような高効率の肝組織、肝細胞、および／またはＬＳＥＣ特異的脂質ナノ粒子を介した肝疾患治療用薬物、治療用遺伝子などの伝達方法および肝を通して媒介される治療剤などに有用に活用される。また、一実施形態による脂質ナノ粒子は、核酸などの遺伝子薬物と安定した複合体を形成し、低い細胞毒性および効果的な細胞吸水性を示すので、核酸などの遺伝子薬物を伝達するのに効果的である。

【0077】

前記脂質ナノ粒子は、上述した通りである。

【0078】

一実施形態による脂質ナノ粒子は５～８、５．５～７．５、６～７、または６．５～７のｐＫａを示すことによって酸性ｐＨ条件で正電荷を示して、負電荷を持つ核酸および陰イオン性薬物（例えば、タンパク質）などの治療剤と静電的相互作用を通じて容易に薬物との複合体を形成して高効率に薬物を封入することができ、薬物（例えば、核酸）の細胞内または生体内薬物伝達用組成物として有用に用いることができる。

【0079】

本明細書において、「封入（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ）」は、伝達物質を取り囲んで効率的に生体内に取り込ませるためにカプセル化することをいい、薬物封入率（カプセル化効率、Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）は、製造に使用された薬物全体の含有量に対して脂質ナノ粒子内に封入された薬物の含有量を意味する。

【0080】

前記伝達用組成物の陰イオン性または核酸薬物の封入率は７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９４％以上、８０％超過～９９％以下、８０％超過～９７％以下、８０％超過～９５％以下、８５％以上～９５％以下、８７％以上～９５％以下、９０％以上～９５％以下、９１％以上～９５％以下、９１％以上～９４％以下、９１％超過～９５％以下、９２％以上～９９％以下、９２％以上～９７％以下、または９２％以上～９５％以下であり得る。

【0081】

一実施形態によれば、前記封入率は、通常使用される方法によって計算され、例えば、前記薬物封入率は、一実施形態による脂質ナノ粒子にＴｒｉｔｏｎ－Ｘを処理し、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘが処理され、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘが処理されない脂質ナノ粒子の蛍光強度を特定の波長帯域幅（例えば、ｅｘｉｔａｔｉｏｎ：４８０～４９０ｎｍ、ｅｍｉｓｓｉｏｎ：５２０～５３０ｎｍ）を測定し、下記数式２によって求められる。

【数2】

【0082】

一実施形態による薬物伝達用組成物は、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを高い封入率で含み得る。既に知られているＣａｓ９ ｍＲＮＡ伝達用組成物は、低い比率でＣａｓ９ ｍＲＮＡを含むのでＣａｓ９ ｍＲＮＡ伝達用組成物として活用するには限界があった。これとは異なり、一実施形態による脂質ナノ粒子は高い封入率で、具体的には７０％以上の封入率でＣａｓ９ ｍＲＮＡを含むことができ、したがって、遺伝子矯正治療に有用に活用することができる。

【0083】

前記陰イオン性薬物は、陰イオンを帯びる各種ペプチド、タンパク質薬物、タンパク質－核酸構造体またはヒアルロン酸－ペプチド複合体、ヒアルロン酸－タンパク質複合体などの陰イオン性生体高分子－薬物複合体などであり得る。前記タンパク質薬物の非制限的な例としては、遺伝子矯正はさみであるＣａｓ９、ｃｐｆ１などの遺伝子矯正タンパク質をはじめとして、細胞死誘導因子（例えば、ｃｙｔｏｃｒｏｍｅ Ｃ、ｃａｓｐａｓｅ３／７／８／９など）および多様な細胞内タンパク質（例えば、転写因子）などであり得る。

【0084】

前記核酸は、小干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）、リボソームリボ核酸（ｒＲＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ジオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、相補性ジオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、伝令リボ核酸（ｍＲＮＡ）、運搬リボ核酸（ｔＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）、ＰＮＡ、ＤＮＡｚｙｍｅ、および遺伝子矯正のためのｓｇＲＮＡなどからなる群から選択される１種以上であり得るが、これらに限定されるものではない。

【0085】

本明細書において用語「ｓｉＲＮＡ」とは、特定のｍＲＮＡの切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）によりＲＮＡｉ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）現象を誘導できる二本鎖ＲＮＡ（ｄｕｐｌｅｘ ＲＮＡ）、あるいは一本鎖ＲＮＡの内部で二本鎖形態をとる一本鎖ＲＮＡを称する。ターゲット遺伝子のｍＲＮＡと相同な配列を有するセンスＲＮＡ鎖と、これと相補的な配列を有するアンチセンスＲＮＡ鎖で構成される。ｓｉＲＮＡは、ターゲット遺伝子の発現を抑制できるので、効率的な遺伝子ノックダウン方法として、または遺伝子治療（ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ）の方法として提供される。二本鎖間の結合はヌクレオチド間の水素結合により形成され、二本鎖の内部のすべてのヌクレオチドが相補的に完全結合していなくてもよい。

【0086】

ｓｉＲＮＡの長さは約１５～６０個、具体的には約１５～５０個、約１５～４０個、約１５～３０個、約１５～２５個、約１６～２５個、約１９～２５個、約２０～２５個、または約２０～２３個のヌクレオチドであり得る。前記ｓｉＲＮＡの長さは、二本鎖ＲＮＡの一方のヌクレオチドの数、すなわち塩基対の数を意味し、一本鎖ＲＮＡの場合は、一本鎖ＲＮＡの内部の二本鎖の長さを意味する。また、ｓｉＲＮＡは、血中安定性を増加させるか、または免疫反応を弱化させるなどの目的のために多様な官能基を導入したヌクレオチドから構成される。

【0087】

本明細書において用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、効能を増進させるために一つ以上の塩基、糖または骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）の位置で変形できる（Ｄｅ Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．，５（３）：３４３－５５，１９９５）。オリゴヌクレオチド骨格は、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、単鎖アルキル、シクロアルキル、単鎖ヘテロアトミック、ヘテロシクリック糖間結合などに変形できる。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一つ以上の置換された糖モイエティ（ｓｕｇａｒ ｍｏｉｅｔｙ）を含み得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、変形された塩基を含み得る。変形された塩基には、ヒポキサンチン、６－メチルアデニン、５－メチルピリミジン（特に５－メチルシトシン）、５－ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣ、ゲントビオシルＨＭＣ、２－アミノアデニン、２－チオウラシル、２－チオチミン、５－ブロモウラシル、５－ヒドロキシメチルウラシル、８－アザグアニン、７－デアザグアニン、Ｎ６（６－アミノヘキシル）アデニン、２，６－ジアミノフリンなどがある。

【0088】

本明細書において、「一本鎖ジオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）」は、特定のターゲットＤＮＡに選択的に結合してアンチジーン（ａｎｔｉｇｅｎｅ）効果を誘導する一本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。

【0089】

本明細書において、「アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）」は、特定のターゲットに結合するオリゴヌクレオチド（一般に、２０～８０ｎｔ ＤＮＡあるいはＲＮＡ）を意味する。好ましくは、本発明において「アプタマー」は、オリゴヌクレオチドアプタマー（例えば、ＤＮＡあるいはＲＮＡ ａｐｔａｍｅｒ）を意味する。

【0090】

本明細書において、「ｍＲＮＡ」は、遺伝子を発現可能な合成ｍＲＮＡ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｍＲＮＡ）を意味する。

【0091】

本明細書において、「ｓｈＲＮＡ」は、一本鎖で５０～７０個で構成されたヌクレオチドを意味し、ｉｎ ｖｉｖｏ上でステム－ループ（ｓｔｅｍｌｏｏｐ）構造をなしている。５～１０個のヌクレオチドのループ部位の両方に相補的に１９～２９個のヌクレオチドの長いＲＮＡが塩基対をなして二本鎖のステムを形成する。

【0092】

本明細書において、「ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）」は、遺伝子発現を調節し、全長２１～２３個のヌクレオチドで構成された一本鎖ＲＮＡ分子を意味する。ｍｉＲＮＡは、細胞内で発現しないオリゴヌクレオチドであり、短いステム－ループ構造を有する。ｍｉＲＮＡは、１または２以上のｍＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ）と全体または部分的に相同性を有し、前記ｍＲＮＡと相補的な結合によりターゲット遺伝子発現を抑制する。

【0093】

本明細書において、「リボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）」はＲＮＡの一種であって、特定なＲＮＡの塩基配列を認識して自体的にこれを切断する酵素のような機能を有するＲＮＡである。リボザイムは、ターゲット伝令ＲＮＡ鎖の相補的な塩基配列で特異性を有し結合する領域とターゲットＲＮＡを切断する領域からなる。

【0094】

本明細書において、「ＤＮＡｚｙｍｅ」は、酵素活性を有する一本鎖ＤＮＡ分子であって、１０～２３個のヌクレオチドで構成されたＤＮＡｚｙｍｅ（１０－２３ ＤＮＡｚｙｍｅ）は、生理的に類似した条件下でＲＮＡ鎖を特定位置で切断する。１０－２３ ＤＮＡｚｙｍｅは、塩基対を形成せず露出したいかなるフリンおよびピリミジンの間を切断する。１０－２３ ＤＮＡ酵素（ＤＮＡｚｙｍｅ）は、１５個の保存された塩基配列（例えば、５’－ＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡ－３’）からなる酵素の活性部位（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｄｏｍａｉｎ）および上述した酵素の活性部位の両方にＲＮＡ基質を認識する７～８個のＤＮＡ塩基配列からなる基質認識ドメイン（ＲＮＡ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）で構成される。

【0095】

本明細書において、「ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」は、核酸とタンパク質の性質を両方とも有する分子であって、ＤＮＡまたはＲＮＡと相補的に結合が可能な分子を意味する。ＰＮＡは、核酸塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）がペプチド結合で連結された類似ＤＮＡで１９９９年に最初に報告された（文献［Ｎｉｅｌｓｅｎ ＰＥ，Ｅｇｈｏｌｍ Ｍ，Ｂｅｒｇ ＲＨ，Ｂｕｃｈａｒｄｔ Ｏ，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｂｙ ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ａ ｔｈｙｍｉｎｅ－ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｐｏｌｙａｍｉｄｅ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１，Ｖｏｌ．２５４：ｐｐ１４９７－１５００］）。ＰＮＡは自然界には存在せず、人工的に化学的な方法で合成される。ＰＮＡは、相補的な塩基配列の天然核酸と混成化（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）反応を起こして二本鎖を形成する。長さが同じ場合、ＰＮＡ／ＤＮＡ二本鎖はＤＮＡ／ＤＮＡ二本鎖より、ＰＮＡ／ＲＮＡ二本鎖はＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖より安定である。ペプチド基本骨格としては、Ｎ－（２－アミノエチル）グリシンがアミド結合により繰り返し連結されたものが最もよく使用され、この場合、ペプチド核酸の基本骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）は、負電荷を帯びる天然核酸の基本骨格と異なり電気的に中性である。ＰＮＡに存在する４個の核酸塩基は、空間的大きさと核酸塩基間の距離が天然の核酸の場合とほぼ同じである。ＰＮＡは、化学的に天然の核酸よりも安定しているだけでなく、核酸分解酵素（ｎｕｃｌｅａｓｅ）やタンパク質分解酵素（ｐｒｏｔｅａｓｅ）によって分解されず、生物学的にも安定している。

【0096】

本明細書において、「ｓｇＲＮＡ」は、特定のＤＮＡターゲットに結合するオリゴヌクレオチド（一般にＲＮＡ分子）にｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とｔｒａｃｅｒ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の複合単一ＲＮＡ分子を意味する。ＣＲＩＳＰＲ ｓｙｓｔｅｍでＣａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅとともに特定のＤＮＡ配列を認識するために利用され、選択的な遺伝子切断を可能にするＲＮＡ分子であって、ほぼＤＮＡと相補的に結合が可能な２０－ｎｔ配列を含み、全長は１００ｎｔである。

【0097】

本明細書において、「遺伝子矯正タンパク質」は、Ｃａｓ９、ｓｐＣａｓ９、ｃｊＣａｓ９、ｃａｓＸ、ＣａｓＹおよびＣｐｆ１などを称し、ｓｇＲＮＡとともにターゲットＤＮＡ塩基配列を認識してＤＮＡ切断を起こすタンパク質をいう。

【0098】

一実施形態による脂質ナノ粒子によって薬物および／または核酸が伝達される標的細胞は、生体内または生体で分離された肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）、および／またはＬＳＥＣであり得る。一実施形態による薬物伝達用組成物および／または薬物（陰イオン性薬物、核酸、またはその組み合わせ）および脂質ナノ粒子との複合体は、肝細胞、および／またはＬＳＥＣをターゲットとするか、または特異的に標的化するものであり得る。したがって、一実施形態による脂質ナノ粒子または前記脂質ナノ粒子を含む薬物核酸伝達用組成物は、肝線維化、肝硬変、肝炎（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎など）などの急性または慢性肝疾患の治療のためのものであり、また、肝を通して吸収される治療剤（薬物）の伝達用組成物として活用される。

【0099】

また、他の態様は、（１）前記脂質ナノ粒子；および（２）陰イオン性薬物、核酸、またはその組み合わせを含む、肝疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。

【0100】

前記肝疾患の予防または治療用薬学的組成物に含まれる脂質ナノ粒子については上述した薬物伝達用組成物に含まれる脂質ナノ粒子に対するものと同様である。

【0101】

前記肝疾患の予防または治療用薬学的組成物に含まれる陰イオン性薬物および核酸については上述した薬物伝達用組成物に含まれる陰イオン性薬物および核酸に対するものと同様である。

【0102】

一実施形態による肝疾患の予防または治療用薬学的組成物は、内部に陰イオン性薬物および／または核酸が封入された脂質ナノ粒子を含み得る。

【0103】

前記肝疾患は、ＡＴＴＲアミロイドーシス（ＡＴＴＲ ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ）、高コレステロール血症（Ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ）、Ｂ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、急性肝不全（Ａｃｕｔｅ ｌｉｖｅｒ ｆａｉｌｕｒｅ）、肝硬変（Ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、および肝線維化（ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）からなる群から選択される１種以上であり得る。

【0104】

前記陰イオン性薬物は、肝疾患の予防または治療効果を有する。

【0105】

前記核酸は、肝疾患の予防または治療効果を有し、例えば、（１）ＴＴＲ（Ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ）（（ｅ．ｇ．，ヒトＴＴＲ（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．ＮＰ_０００３６２．１；遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．ＮＭ_０００３７１．４など）、マウスＴＴＲ（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．；ＮＰ_０３８７２５．１；遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ_０１３６９７．５など））、（２）ＰＣＳＫ９（Ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／ｋｅｘｉｎ ｔｙｐｅ９）（（ｅ．ｇ．，ヒトＰＣＳＫ９（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．ＮＰ_７７７５９６．２；遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．ＮＭ_１７４９３６．４など）、マウスＰＣＳＫ９（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ_７０５７９３．１；遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ_１５３５６５．２など））、（３）ＨＢＶ（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ）（例えば、ＨＢＶ ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ａ（ｅ．ｇ．，ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：Ｘ０２７６３、Ｘ５１９７０、またはＡＦ０９０８４２）；ＨＢＶ ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ｂ（ｅ．ｇ．，ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：Ｄ００３２９、ＡＦ１００３０９、またはＡＢ０３３５５４；ＨＢＶ ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ｃ（ｅ．ｇ．，ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：Ｘ０４６１５、Ｍ１２９０６、ＡＢ０１４３８１、ＡＢ０４２２８５、ＡＢ０４２２８４、ＡＢ０４２２８３、ＡＢ０４２２８２、ＡＢ０２６８１５、ＡＢ０２６８１４、ＡＢ０２６８１３、ＡＢ０２６８１２、またはＡＢ０２６８１１）；ＨＢＶ ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ｄ（ｅ．ｇ．，ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：Ｘ６５２５９、Ｍ３２１３８、またはＸ８５２５４）；ＨＢＶ ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ｅ（ｅ．ｇ．，ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：Ｘ７５６５７またはＡＢ０３２４３１）；ＨＢＶ ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ｆ（ｅ．ｇ．，ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：Ｘ６９７９８、ＡＢ０３６９１０、またはＡＦ２２３９６５）；ＨＢＶ ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ｇ（ｅ．ｇ．，ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＡＦ１６０５０１、ＡＢ０６４３１０、またはＡＦ４０５７０６）；ＨＢＶ ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ｈ（ｅ．ｇ．，ＡＹ０９０４５４、ＡＹ０９０４５７、またはＡＹ０９０４６０）（４）Ｂａｘ（ＢＣＬ２ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｘ））（（ｅ．ｇ．，ヒトＢａｘ（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．ＮＰ_００１２７８３５７．１、ＮＰ_００１２７８３５８．１、ＮＰ_００１２７８３５９．１、ＮＰ_００１２７８３６０．１、ＮＰ_００４３１５．１；遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．ＮＭ_００１２９１４２８．２、ＮＭ_００１２９１４２９．２、ＮＭ_００１２９１４３０．１、ＮＭ_００１２９１４３１．２、ＮＭ_００４３２４．４など）、マウスＢａｘ（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ_０３１５５３．１；遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ_００７５２７．３など）、（５）ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）（例えば、ＶＥＧＦＡ（（ｅ．ｇ．，ヒトＶＥＧＦＡ（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．ＮＰ_００１０２０５３７．２、ＮＰ_００１０２０５３８．２、ＮＰ_００１０２０５３９．２、ＮＰ_００１０２０５４０．２、ＮＰ_００１０２０５４１．２；遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．ＮＭ_００３３７６．６、ＮＭ_００１０２５３６６．３、ＮＭ_００１０２５３６７．３、ＮＭ_００１０２５３６８．３、ＮＭ_００１０２５３６９．３など）、マウスＶＥＧＦＡ（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ_００１０２０４２１．２、ＮＰ_００１０２０４２８．２、ＮＰ_００１１０３７３６．１、ＮＰ_００１１０３７３７．１、ＮＰ_００１１０３７３８．１；遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ_００１０２５２５０．３、ＮＭ_００１０２５２５７．３、ＮＭ_００１１１０２６６．１、ＮＭ_００１１１０２６７．１、ＮＭ_００１１１０２６８．１など）；ＶＥＧＦＢ（（ｅ．ｇ．，ヒトＶＥＧＦＢ（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．ＮＰ_００１２３０６６２．１、ＮＰ_００３３６８．１；遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．ＮＭ_００３３７７．５、ＮＭ_００１２４３７３３．２など）、マウスＶＥＧＦＢ（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ_００１１７２０９３．１、ＮＰ_０３５８２７．１；遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ_００１１８５１６４．１、ＮＭ_０１１６９７．３など）；ＶＥＧＦＣ（ｅ．ｇ．，ヒトＶＥＧＦＣ（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．ＮＰ_００５４２０．１；遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．ＮＭ_００５４２９．５など）、マウスＶＥＧＦＣ（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．；ＮＰ_０３３５３２．１；遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ_００９５０６．２など））、および／または（６）ＰＤＧＦ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）（例えば、ＰＤＧＦＡ（（ｅ．ｇ．，ヒトＰＤＧＦＡ（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．ＮＰ_００２５９８．４、ＮＰ_１４８９８３．１、；遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．ＮＭ_００２６０７．５、ＮＭ_０３３０２３．４など）、マウスＰＤＧＦＡ（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ_０３２８３４．１、ＮＰ_００１３５０２００．１；遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ_００８８０８．４、ＮＭ_００１３６３２７１．１など））；ＰＤＧＦＢ（（ｅ．ｇ．，ヒトＰＤＧＦＢ（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．ＮＰ_００２５９９．１、ＮＰ_１４８９３７．１；遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．ＮＭ_０３３０１６．３、ＮＭ_００２６０８．４など）、マウスＰＤＧＦＢ（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ_０３５１８７．２；遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ_０１１０５７．４など））；ＰＤＧＦＣ（（ｅ．ｇ．，ヒトＰＤＧＦＣ（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．ＮＰ_０５７２８９．１；遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．ＮＭ_０１６２０５．３など）、マウスＰＤＧＦＣ（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ_０６４３５５．１、ＮＰ_００１３４４６７５．１；遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ_０１９９７１．３、ＮＭ_００１３５７７４６．１など））；ＰＤＧＦＤ（ｅ．ｇ．，ヒトＰＤＧＦＤ（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．ＮＰ_０７９４８４．１、ＮＰ_１４９１２６．１；遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．ＮＭ_０３３１３５．４、ＮＭ_０２５２０８．５など）、マウスＰＤＧＦＤ（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ_０８２２００．１、ＮＰ_００１３４４３２６．１、ＮＰ_００１３４４３２７．１；遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ_０２７９２４．３、ＮＭ_００１３５７３９７．１、ＮＭ_００１３５７３９８．１など））の発現を抑制できるｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡであり得る。

【0106】

前記薬学的組成物は、ヒトを含む哺乳動物に非経口投与を含む多様な経路により投与され、非経口投与は静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用でき、投与量は、患者の身体状態および体重、病気の程度、薬物形態、投与経路および時間によって異なるが、当業者によって適宜選択される。

【0107】

一実施形態による前記薬学的組成物を製剤化する場合、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して製造される。

【0108】

非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶液、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤などが含まれる。

【0109】

非水性溶剤や懸濁剤には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、オレイン酸エチルなどの注射可能なエステルなどを使用することができる。坐剤基剤には、ウイテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロール、ゼラチンなどを使用することができる。

【0110】

一実施形態による薬学的組成物は、薬学的に有効な量を投与することができる。本発明において、「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な受益／リスク比で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効容量水準は、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路および排出比率、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素およびその他の医学分野でよく知られている要素により決定することができる。一実施形態による薬学的組成物は個別に治療剤として投与するか、または他の治療剤と併用して投与することができ、従来の治療剤とは順次的または同時に投与することができ、単一または多重投与することができる。前記要素をすべて考慮して副作用なく、最小限の量で最大の効果を得ることができる量を投与することが重要であり、これは当業者によって容易に決定することができる。

【0111】

具体的には、本発明による化合物の有効量は、患者の年齢、性別、体重により異なり、毎日または隔日に投与するか、１日１回～３回に分けて投与することができる。しかし、投与経路、肥満の重症度、性別、体重、年齢などによって増減できるので、前記投与量はいかなる方法でも本発明の範囲を限定するものではない。

【0112】

一実施形態によれば、前記薬学的組成物は薬学的組成物に含まれている薬物（陰イオン性薬物、核酸、またはその組み合わせ）の濃度を基準にして０．１～１００ｍｇ／ｋｇ、０．１～５０ｍｇ／ｋｇ、１～１０ｍｇ／ｋｇ、または１～５ｍｇ／ｋｇの容量を投与することができる。

【0113】

さらに他の態様は、（１）前記脂質ナノ粒子；および（２）陰イオン性薬物、核酸、またはその組み合わせを含む、組成物（例えば、前記肝疾患の予防または治療用薬学的組成物）を患者に投与する段階を含む肝疾患の予防または治療方法を提供する。脂質ナノ粒子、陰イオン性薬物、核酸、薬学的組成物、および肝疾患については上述した通りである。

【0114】

一実施形態によれば、前記肝疾患の予防または治療方法は、前記組成物を投与する段階以前に、前記肝疾患の予防および／または治療を必要とする患者を確認（選別）する段階をさらに含み得る。

【0115】

前記治療方法が適用される対象個体は、肝疾患が発病または発病し得るヒトを含むネズミ、家畜などを含む哺乳動物を意味するが、これらに限定されない。一実施形態による脂質ナノ粒子を含む前記薬学的組成物は、肝に陰イオン性薬物および／または核酸を効率的に伝達できるので、個体を効率的に治療することができる。

【0116】

一実施形態によれば、（１）前記脂質ナノ粒子；および（２）陰イオン性薬物、核酸、またはその組み合わせを含む、組成物（例えば、前記肝疾患の予防または治療用薬学的組成物）の薬学的有効量を患者に投与する段階を含む、肝疾患の予防または治療方法を提供することができる。薬学的有効量については上述した通りであり、好適な１日の総使用量は、正しい医学的判断の範囲内で処置によって決定され、１回または数回に分けて投与することができる。しかし、特定患者に対する具体的な治療的有効量は達成しようとする反応の種類と程度、場合により他の製剤の使用の有無をはじめとする具体的組成物、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別および食餌、投与時間、投与経路および組成物の分泌率、治療期間、具体的組成物と共に使用されるか、または同時に使用される薬物をはじめとする多様な因子と医薬分野でよく知られている類似因子に応じて異にして適用することができる。

【発明の効果】

【0117】

本発明の一実施形態による脂質ナノ粒子は、肝組織特異的で、生体親和性に優れ、高効率に遺伝子治療剤などを伝達することができ、脂質ナノ粒子媒介遺伝子治療などの関連技術分野において有用に使用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0118】

【図1a】一実施形態による脂質ナノ粒子の例示的な構造を示す図である。

【図1b】一実施形態によるナノ粒子をＣｒｙｏ－ＴＥＭで観察したイメージを示す図である。

【図2】ＣＤＣｌ_３で２４６－Ｃ１０の^１Ｈ ＮＭＲ（室温、４００ＭＨｚ）の結果を示す図である。

【図3a】２４１－Ｃ１０ ＬＮＰ～２４３－Ｃ１０ ＬＮＰは、各脂質ナノ粒子がｐＨ４．１～ｐＨ９．６の範囲を有する溶液における蛍光強度を測定した結果を示す図である。

【図3b】２４４－Ｃ１０ ＬＮＰ～２４６－Ｃ１０ ＬＮＰは、各脂質ナノ粒子がｐＨ４．１～ｐＨ９．６の範囲を有する溶液における蛍光強度を測定した結果を示す図である。

【図4a】各ナノ粒子の細胞内遺伝子伝達効率を示す結果である。具体的には、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ（ｌｕｃ ｍＲＮＡ）を封入したＬＮＰをＨｅＬａ ｃｅｌｌに形質転換させた後、細胞を溶解して測定した発光強度を示す図である。

【図4b】各ナノ粒子の細胞内遺伝子伝達効率を示す結果である。具体的には、ｌｕｃ ｍＲＮＡを封入したＬＮＰを肝細胞（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）に形質転換させた後、細胞を溶解して測定した発光強度を示す。図において、＋ＡｐｏＥはＡｐｏＥ３を処理した群を意味し、－ＡｐｏＥはＡｐｏＥ３を処理しない群を意味する。

【図5a】Ｌｕｃ ｍＲＮＡが封入された２４４－Ｃ１０ ＬＮＰ～２４６－Ｃ１０ ＬＮＰが投与されたマウスで生体内薬物伝達分布を示す図である、

【図5b】Ｌｕｃ ｍＲＮＡが封入された２４６－Ｃ１０ ＬＮＰが投与されたマウスで摘出されたマウスの各器官に対する薬物伝達分布を示す図である。

【図6】１．０～２．５モル％で脂質－ＰＥＧを含む２４６－Ｃ１０ ＬＮＰが投与されたマウスで脂質ナノ粒子に含まれている脂質－ＰＥＧの含有量に応じた、脂質ナノ粒子の薬物伝達効率およびナノ粒子の大きさを示す図である。

【図7】脂質ナノ粒子に封入して投与したｓｉＦＶＩＩの濃度に応じた肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）のターゲットの可能性をＦＶＩＩの発現量により確認した結果を示す図である。

【図8】脂質ナノ粒子に含まれている脂質－ＰＥＧの含有量に応じた脂質ナノ粒子の脂質ナノ粒子の大きさとＰＤＩ数値を示し（左表）、生体内肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）への薬物伝達効率をＦＶＩＩの発現量により確認した結果（右グラフ）を示すものである。

【図9】脂質ナノ粒子に含まれている脂質－ＰＥＧの含有量に応じた脂質ナノ粒子の大きさとＰＤＩ数値を示し（左表）、生体内ＬＳＥＣへの薬物伝達効率をＦＶＩＩＩの発現量により確認した結果（右グラフ）を示すものである。

【図10】セラミド－ＰＥＧまたはＤＳＰＥ－ＰＥＧを含む脂質ナノ粒子の細胞内ｓｉＲＮＡ伝達効率を測定した結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0119】

本発明は、下記の実施例を例に挙げて、さらに詳しく説明するが、下記の実施例によって権利範囲を制限することを意図するものではない。

【0120】

以下、実施例を通じて本発明をもっと詳しく説明する。これら実施例はただ本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは当業界で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。

【0121】

実施例１．イオン化可能な脂質（ｉｏｎｉｚａｂｌｅ ｌｉｐｉｄ）の製造
実施例１－１．イオン化可能な脂質の製造
６員ヘテロ環第３級アミンを含む下記表１のアミン系化合物および１，２－ｅｐｏｘｉｄｏｄｅｃａｎｅ（以下、Ｃ１０）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、米国）を１：ｎ（ｎ＝第１級アミン×２＋第２級アミン×１）のモル比で反応させて、イオン化可能な脂質を合成した。

【0122】

【表1】

【0123】

具体的には、５ｍｌバイアールに前記表１の２４１～２４６のアミンそれぞれとエポキシド（Ｃ１０）を１：ｎ（ｎ＝第１級アミン×２＋第２級アミン×１）のモル比でマグネチックバーと一緒に添加して、撹拌機で７５０ｒｐｍ、９０℃で３日間反応させた。その後、ＷＥＬＵＸ ｆｉｎｅ ｓｉｌｉｃａ ｃｏｌｕｍｎ（Ｉｎｔｅｒｔｅｃ社製、韓国）で精製した後、前記反応によって生成された各イオン化可能な脂質の分子量を計算し、エタノールを使用して１００ｍｇ／ｍｌの濃度に合わせて保管した。２４１のアミンとＣ１０を使用して製造したイオン化可能な脂質を「２４１－Ｃ１０」と称し、他の種類のアミンを使用して製造したイオン化可能な脂質も同様に、「使用されたアミンの名前（２４１～２４６）－Ｃ１０」と称した。

【0124】

実施例１－２．生成されたイオン化可能な脂質の確認
前記実施例１－１で製造したイオン化可能な脂質を確認するために、１Ｈ ＮＭＲを行った。具体的には、実施例１－１で合成したイオン化可能な脂質（２４６－Ｃ１０）５μｇをＣＤＣｌ_３（ｓｉｇｍａ社製、米国）０．５ｍｌに希釈して１００ｍｍｏｌｅの濃度となるように準備した。その後、４００ＭＨｚ ＮＭＲ専用チューブに０．５ｍｌずつ入れて上部を塞いだ後、パラフィルムでシールドしてＡｇｉｌｅｎｔ ４００ＭＨＺ ＦＴ－ＮＭＲ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製、米国）を用いてＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒａを得て、その結果を図２に示す。図２に示すように、２４６－Ｃ１０の各官能基を示す信号が飽和されたことが分かった。

【0125】

また、実施例１－１で製造したイオン化可能な脂質（２４１－Ｃ１０～２４６－Ｃ１０）を確認するためにＭＳ分析を行った。具体的には、イオン化可能な脂質は０．５ｐｐｍ以下の濃度にエタノールに希釈してＭＳ分析を行った。分析に用いられた装置は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、米国）の６２３０ＬＣ／ＭＳであり、分離管はＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＺｏｒｂａｘ ＳＢ－Ｃ１８（１００ｍｍ×２．１ｍｍ ｉ．ｄ．，３．５μｍ）を用い、移動相として０．１％ギ酸が含まれている蒸留水（Ａ）とアセトニトリル（Ｂ）の２種類の溶媒を勾配溶離した。移動相の溶媒勾配は、最初の有機溶媒のアセトニトリル（Ｂ）の比率を３０％から始まり、２分まで８０％まで上げた後、再び有機溶媒の比率が３０％まで下げ、安定化するまで４分間維持した。移動相の流速は３００ｕｌ／ｍｉｎであり、この時、分析装置の注入量は２ｕｌであった。ＭＳ分析を行った結果を下記表２に示す。表２に示すように、イオン化可能な脂質の測定されたｍ／ｚ ｒａｔｉｏと計算されたｍ／ｚ ｒａｔｉｏがほぼ一致することを確認することができた。

【0126】

【表2】

【0127】

上記結果から実施例１－１でイオン化可能な脂質がうまく作られたことを確認することができた。

【0128】

実施例２．脂質ナノ粒子の製造
実施例２－１．脂質ナノ粒子の製造
前記実施例１－１で製造したイオン化可能な脂質（２４１－Ｃ１０～２４６－Ｃ１０）、コレステロール（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｐｏｗｄｅｒ、ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔ、ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ、≧９９％、ｓｉｇｍａ社製、韓国）、リン脂質（ＤＳＰＣ）（Ａｖａｎｔｉ社製、米国）、および脂質－ＰＥＧ複合体（セラミド－ＰＥＧ複合体；Ｃ１６ ＰＥＧ２０００ Ｃｅｒａｍｉｄｅ、Ａｖａｎｔｉ社製、米国）をエタノールに４２．５：１３：４３：１．５のモル比で溶解させた。

【0129】

イオン化可能な脂質、コレステロール、リン脂質、および脂質－ＰＥＧが溶解したエタノールおよびアセテートバッファーを１：３の体積比で１２ｍｌ／ｍｉｎの流速で微細流体混合装置（Ｂｅｎｃｈｔｏｐ Ｎａｎｏａｓｓｅｍｂｌｒ；ＰＮＩ社製、Ｃａｎａｄａ）を用いて混合して、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を製造した。

【0130】

実施例２－２．核酸が封入された脂質ナノ粒子の製造
前記実施例１－１で製造したイオン化可能な脂質（２４１－Ｃ１０～２４６－Ｃ１０）、コレステロール（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｐｏｗｄｅｒ、ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔ、ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ、≧９９％、ｓｉｇｍａ社製、韓国）、リン脂質（ＤＳＰＣまたはＤＯＰＥ）（１８：０ ＰＣ（ＤＳＰＣ）、１８：１（△９－Ｃｉｓ）ＰＥ（ＤＯＰＥ）、Ａｖａｎｔｉ社製、米国）、および脂質－ＰＥＧ複合体（セラミド－ＰＥＧ複合体；Ｃ１６ ＰＥＧ２０００ Ｃｅｒａｍｉｄ、Ａｖａｎｔｉ社製、米国）をエタノールに溶解させた。ＲＮＡ治療剤であるｍＲＮＡ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｍＲＮＡ；配列番号１）３０μｇをクエン酸ナトリウム０．７５ｍｌに希釈させるか、またはｓｉＲＮＡ（ｓｉＦＶＩＩ；配列番号２および配列番号３を同じモル比で混合、またはｓｉＦＶＩＩＩ；配列番号４～配列番号１１を同じモル比で混合、またはｓｉＬｕｃ：配列番号１２および配列番号１３を同じモル比で混合）３０μｇを５０ｍＭの酢酸ナトリウム０．７５ｍｌに希釈させて水性相を製造した。

【0131】

使用されたｓｉＲＮＡ配列は次の通りである：配列番号２（ＦＶＩＩ ｔａｒｇｅｔ ｓｉＲＮＡ_ｓｅｎｓｅ；５’－ＧＧＡＵＣＡＵＣＵＣＡＡＧＵＣＵＵＡＣｄｔｄｔ－３’）、配列番号３（ＦＶＩＩ ｔａｒｇｅｔ ｓｉＲＮＡ_ａｎｔｉｓｅｎｓｅ；５’－ＧＵＡＡＧＡＣＵＵＧＡＧＡＵＧＡＵＣＣｄｔｄｔ－３’）、配列番号４（ＦＶＩＩＩ ｔａｒｇｅｔ ｓｉＲＮＡ_ｓｅｎｓｅ_１；５’ＣＵＵＡＵＡＵＣＧＵＧＧＡＧＡＡＵＵＡｄｔｄｔ－３’）配列番号５（ＦＶＩＩＩ ｔａｒｇｅｔ ｓｉＲＮＡ_ａｎｔｉｓｅｎｓｅ_１；５’－ＵＡＡＵＵＣＵＣＣＡＣＧＡＵＡＵＡＡＧｄｔｄｔ－３’）、配列番号６（ＦＶＩＩＩ ｔａｒｇｅｔ ｓｉＲＮＡ_ｓｅｎｓｅ_２；５’－ＵＣＡＡＡＧＧＡＵＵＣＧＡＵＧＧＵＡＵｄｔｄｔ－３’）、配列番号７（ＦＶＩＩＩ ｔａｒｇｅｔ ｓｉＲＮＡ_ａｎｔｉｓｅｎｓｅ_２；５’－ＡＵＡＣＣＡＵＣＧＡＡＵＣＣＵＵＵＧＡｄｔｄｔ－３’）、配列番号８（ＦＶＩＩＩ ｔａｒｇｅｔ ｓｉＲＮＡ_ｓｅｎｓｅ_３；５’－ＣＡＡＧＡＧＣＡＣＵＡＧＵＧＡＵＵＡＵｄｔｄｔ－３’）、配列番号９（ＦＶＩＩＩ ｔａｒｇｅｔ ｓｉＲＮＡ_ａｎｔｉｓｅｎｓｅ_３；５’－ＡＵＡＡＵＣＡＣＵＡＧＵＧＣＵＣＵＵＧｄｔｄｔ－３’）、配列番号１０（ＦＶＩＩＩ ｔａｒｇｅｔ ｓｉＲＮＡ_ｓｅｎｓｅ_４；５’－ＧＧＧＣＡＣＣＡＣＵＣＣＵＧＡＡＡＵＡｄｔｄｔ－３’）、配列番号１１（ＦＶＩＩＩ ｔａｒｇｅｔ ｓｉＲＮＡ_ａｎｔｉｓｅｎｓｅ_４；５’－ＵＡＵＵＵＣＡＧＧＡＧＵＧＧＵＧＣＣＣｄｔｄｔ－３’）、配列番号１２（ｓｉＬｕｃ_ｓｅｎｓｅ；５’－ＡＡＣＧＣＵＧＧＧＣＧＵＵＡＡＵＣＡＡｄｔｄｔ－３’）、配列番号１３（ｓｉＬｕｃ_ａｎｔｉｓｅｎｓｅ；５’－ＵＵＧＡＵＵＡＡＣＧＣＣＣＡＧＣＧＵＵｄｔｄｔ－３’）。

【0132】

イオン化可能な脂質、コレステロール、リン脂質、および脂質－ＰＥＧ複合体（以下、脂質－ＰＥＧ）が溶解した有機相（エタノール）およびＲＮＡ治療剤（核酸）が溶解した水性相（酢酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウム）を１２ｍｌ／ｍｉｎの流速で微細流体混合装置（Ｂｅｎｃｈｔｏｐ Ｎａｎｏａｓｓｅｍｂｌｒ；ＰＮＩ社製、Ｃａｎａｄａ）を用いて混合して、核酸が封入された脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を製造した。（ｉ）ｍＲＮＡが封入された脂質ナノ粒子を製造するために、イオン化可能な脂質：リン脂質（ＤＯＰＥ）：コレステロール：脂質－ＰＥＧ（Ｃ１６－ＰＥＧ２０００セラミド）を２６．５：２０：５２．５～５１：１．０～２．５（モル比の総和が１００となるようにコレステロールと脂質－ＰＥＧの含有量を調節）のモル比でエタノールに溶解させ、ｍＲＮＡ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｍＲＮＡ；配列番号１）：イオン化可能な脂質が１：１０の重量比となるように有機相および水性相を混合して脂質ナノ粒子を製造した。（ｉｉ）ｓｉＲＮＡが封入された脂質ナノ粒子を製造するためにイオン化可能な脂質：リン脂質（ＤＳＰＣ）：コレステロール：脂質－ＰＥＧ（Ｃ１６－ＰＥＧ２０００セラミド）を４２．５：１３：４４～３９．５：０．５～５．０（モル比の総和が１００となるようにコレステロールと脂質－ＰＥＧの含有量を調節）のモル比でエタノールに溶解させ、ｓｉＲＮＡ（ｓｉＦＶＩＩ；配列番号２および配列番号３を同じモル比で混合、またはｓｉＦＶＩＩＩ；配列番号４～配列番号１１を同じモル比で混合、またはｓｉＬｕｃ：配列番号１２および配列番号１３を同じモル比で混合）：イオン化可能な脂質が１：７．５の重量比となるように有機相および水性相を混合して脂質ナノ粒子（ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ；ＬＮＰ）を製造した。

【0133】

製造されたＬＮＰをエタノールの除去および体内のｐＨと脂質ナノ粒子のｐＨを合わせるために、３５００ ＭＷＣＯ透析カセットを用いて、１６時間ＰＢＳに対して透析した。

【0134】

イオン化可能な脂質「２４１－Ｃ１０」を含む脂質ナノ粒子を「２４１－Ｃ１０ ＬＮＰ」と称し、他の種類のアミンを含むイオン化可能な脂質を使用して製造した脂質ナノ粒子（核酸が封入された脂質ナノ粒子含み）を「含まれているアミンの名前（２４１～２４６）－Ｃ１０ ＬＮＰ」と称した。

【0135】

実施例２－３．核酸が封入された脂質ナノ粒子の観察
ｓｉＬｕｃ（配列番号１２および配列番号１３）が封入された脂質ナノ粒子をセラミド－ＰＥＧ複合体（Ｃ１６－ＰＥＧ２０００セラミド）を使用して実施例２－２と同様に製造した。製造された脂質ナノ粒子（セラミド－ＰＥＧ複合体を１．５モル％含み）を２００ｍｅｓｈ ｃａｒｂｏｎ ｌａｃｅｙ ｆｉｌｍ Ｃｕ－ｇｒｉｄにｓｉＲＮＡの濃度を基準にして６０ｕｇロードしてｖｉｔｒｏｂｏｔで液化した（約－１７０度以下）Ｅｔｈａｎｅに浸してｐｌｕｎｇｅ ｆｒｅｅｚｅさせて準備した後、Ｃｒｙｏ－ＴＥＭ（Ｔｅｃｎａｉ Ｆ２０、ＦＥＩ）で観察し、その結果を図１ｂに示す。図１ｂに示すように、中身の詰まった球状の粒子が観察された。

【0136】

実施例３．脂質ナノ粒子のｐＫａ
本実施例でインビトロＴＮＳ分析（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＴＮＳ ａｓｓａｙ）により前記実施例２－１で剤形化された各脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）のｐＫａを計算した。陰イオン性ＴＮＳは、正に荷電したイオン化可能な脂質と相互作用して親油性になり、ｐＨ値がそれぞれのＬＮＰのｐＫａ値に近接することによってＴＮＳの親油性が低くなり、さらに多くの水分子がＴＮＳ蛍光をクェンチング（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）させるので、６．０～７．０のｐＫａを有する脂質ナノ粒子は生体内薬物伝達効率に優れ、ｐＨによる蛍光（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を示すグラフにおいて、「ｓ字型曲線」を示す脂質ナノ粒子はエンドソーム膜と相互作用が容易であり、酸性化の際には、容易にエンドソームから脱出することを意味する。

【0137】

具体的には、２０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、２５ｍＭ ｃｉｔｒａｔｅ、２０ｍＭ ａｍｍｏｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ、および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む溶液のｐＨを０．１Ｎ ＮａＯＨおよび／または０．１Ｎ ＨＣｌを使用して、ｐＨ４．１からｐＨ９．６まで０．５の間隔で調整して多様なｐＨ単位の溶液を製造した。それぞれのｐＨ（ｐＨ４．１からｐＨ９．６まで０．５間隔のｐＨ）を有する溶液を１００ｕｌずつｂｌａｃｋ ９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに添加し、３００ｕＭのＴＮＳストック（ｓｔｏｃｋ）溶液を使用して６ｕＭの最終濃度となるように上記の範囲のｐＨを有する溶液にそれぞれ添加した。２４１－Ｃ１０ ＬＮＰ～２４６－Ｃ１０ ＬＮＰを最終濃度が２０ｕＭとなるように混合溶液に添加した。蛍光強度は、Ｔｅｃａｎ装置を用いて３２５ｎｍのｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ、４３５ｎｍのｅｍｉｓｓｉｏｎで測定して、各脂質ナノ粒子に対する蛍光強度を図３ａおよび図３ｂに示し、各脂質ナノ粒子に対するｐＫａは最大蛍光の半分に達するｐＨ値を計算して、下記表３に示す。図３ｂに示すように、２４４－Ｃ１０ ＬＮＰ～２４６－Ｃ１０ ＬＮＰは、非線形回帰分析（ｎｏｎｌｉｎｅａｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）により蛍光滴定ｓ字型曲線を示すことが分かった。

【0138】

【表3】

【0139】

上記表３で確認したように、一実施形態による脂質ナノ粒子は、生体内安全性および薬物放出に優れたｐＫａ６．０～７．０の範囲であることを確認した。

【0140】

実施例２－２と同様の方法で製造した、核酸が封入されたＬＮＰの場合も含まれているイオン化可能な脂質の種類（イオン化可能な脂質に含まれているアミンの種類）により同じ様相を示した。

【0141】

実施例４．脂質ナノ粒子の特性確認
実施例４－１．粒子の大きさの測定
本実施例で前記実施例２－２で製造したｍＲＮＡが封入された脂質ナノ粒子（ＬＮＰ；脂質－ＰＥＧを１．５モル％含み）の大きさを測定した。前記実施例２－２で製造した各脂質ナノ粒子に含まれているＲＮＡ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｍＲＮＡ；配列番号１）の濃度が１μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳを使用して希釈し、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＫ）で動的光散乱法（ＤＬＳ）を用いてＬＮＰの直径および多分散度（ＰＤＩ；ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ ｉｎｄｅｘ）を測定し、その結果は下記表４に示す。

【0142】

【表4】

【0143】

上記表４で確認したように、一実施形態による脂質ナノ粒子は、肝細胞内導入が容易で、薬物放出に優れた粒子の大きさを示し、２４１－Ｃ１０ ＬＮＰ＞２４３－Ｃ１０ ＬＮＰ＞２４２－Ｃ１０ ＬＮＰ＝２４５－Ｃ１０ ＬＮＰ＞２４４－Ｃ１０ ＬＮＰ＞２４６－Ｃ１０ ＬＮＰの順にＰＤＩ数値が小さく、粒子が均一であることが分かった。

【0144】

実施例４－２．薬物封入率の測定
核酸薬物としてｓｉＲＮＡ（ｓｉＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡ）を封入した各ＬＮＰ（脂質－ＰＥＧを１．５モル％含み）のカプセル化効率（薬物封入率、％）をＲｉｂｏｇｒｅｅｎ分析（Ｑｕａｎｔ－ｉＴ^ＴＭ ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ＲＮＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により測定した。前記実施例２－２で製造した核酸薬物を封入したＬＮＰを９６ウェルプレートでｓｉＲＮＡの最終濃度が４～７μｇ／ｍｌとなるように１×ＴＥ緩衝液５０ｕｌに希釈した。Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘを処理しないグループ（Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ ＬＮＰ（－））は１×ＴＥバッファー５０ｕｌを添加し、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘを処理したグループ（Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ ＬＮＰ（＋））は２％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘバッファー５０ｕｌを添加した。３７℃で１０分間インキュベーションして、Ｔｒｉｔｏｎ－ＸでＬＮＰを分解してカプセル化された核酸を放出させた。その後、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬１００ｕｌを各ウェルに添加した。Ｔｒｉｔｏｎ ＬＮＰ（－）とＴｒｉｔｏｎ ＬＮＰ（＋）の蛍光強度（ＦＬ）は、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）２００ ＰＲＯ ＮａｎｏＱｕａｎｔ（Ｔｅｃａｎ）で波長帯域幅（ｅｘｉｔａｔｉｏｎ：４８５ｎｍ、ｅｍｉｓｓｉｏｎ：５２８ｎｍ）で測定し、薬物封入率（カプセル化効率、％）は下記数式３のように計算した。各ＬＮＰに対する薬物封入率（％）は、２回繰り返して測定した結果値の平均値であり、下記表５に示す。

【0145】

【数3】

【0146】

【表5】

【0147】

上記表５で確認したように、一実施形態による脂質ナノ粒子は、高効率に薬物を封入できることを確認した。

【0148】

実施例５．脂質ナノ粒子を用いた細胞内核酸伝達確認
実施例５－１．ＬＮＰに含まれるイオン化可能な脂質の種類による核酸伝達効果
一実施形態によるＬＮＰを細胞に形質転換（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させる一日前にＨｅＬａ細胞（韓国細胞株銀行）をｗｈｉｔｅ ｐｌａｔｅ（９６ｗｅｌｌ）に０．０１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌに分注してＤＭＥＭ ｍｅｄｉａ（ＳＨ３００２２、Ｈｙｃｌｏｎｅ、米国）で３７℃、０．５～３％ＣＯ_２の条件で培養した。実施例２－２で製造した、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子をコードするｍＲＮＡ（ｌｕｃ ｍＲＮＡ；配列番号１）が封入されたＬＮＰ（脂質－ＰＥＧを１．５モル％含む２４１－Ｃ１０ ＬＮＰ～２４６－Ｃ１０ ＬＮＰ）をＡｐｏＥ３ ０．１μｇ／ｍｌとピペットで攪拌した後、常温で１０分間インキュベーションした後、ＨｅＬａ ｃｅｌｌで処理（脂質ナノ粒子に含まれているｍＲＮＡを基準にして１００ｎｇ／ｗｅｌｌ）した。ＡｐｏＥ３は、ＬＮＰ表面に結合して細胞表面に発現したＬＤＬ受容体を通じてＬＮＰが細胞内にエンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）により取り込まれる役割を果たす。

【0149】

２４時間後、Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ^ＴＭ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ溶液（ｐｒｏｍｅｇａ社製、米国）を１００ｕｌ／ｗｅｌｌずつ処理して１０分間常温に置いた後、溶解した細胞をＩｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００発光測定装置（Ｔｅｃａｎ社製、米国）を用いて発光強度（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を測定し、その結果を図４ａに示す。図４ａに示すように、ｐＫａの範囲が６．０～７．０である２４４－Ｃ１０ ＬＮＰ、２４５－Ｃ１０ ＬＮＰ、および２４６－Ｃ１０ ＬＮＰの場合、強い発光強度を示し、その中でも２４６－Ｃ１０ ＬＮＰの場合発光強度が最も高く、２４６－Ｃ１０ ＬＮＰが細胞内薬物伝達効率が最も高いことが分かった。

【0150】

実施例５－２．肝細胞内核酸伝達確認
実施例２－２で製造した２４６－Ｃ１０脂質ナノ粒子を用いて肝細胞（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）にｌｕｃ ｍＲＮＡを伝達して発光強度を測定して前記遺伝子の発現を確認した。

【0151】

具体的には、ｌｕｃ ｍＲＮＡ（配列番号１）が封入された２４６－Ｃ１０ ＬＮＰ（脂質－ＰＥＧを１．５モル％含み）をＡｐｏＥ３ ５μｇ／ｍｌと結合させた後、ナノ粒子に含まれているｍＲＮＡ濃度を基準にして０．２μｇ／ｗｅｌｌ、０．５μｇ／ｗｅｌｌ、または１μｇ／ｗｅｌｌに１×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注した肝細胞（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）の細胞株（Ｎｅｘｅｌ社製、Ｋｏｒｅａ）にＬＮＰを処理した。６時間後、Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ^ＴＭ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ溶液（ｐｒｏｍｅｇａ社製、米国）を１００ｕｌ／ｗｅｌｌ処理して１０分間常温に置いた後、溶解した細胞をＩｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００発光測定装置（Ｔｅｃａｎ社製、米国）を用いて発光強度（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を測定して、その結果を図４ｂに示す。

【0152】

図４ｂで確認したように、一実施形態による脂質ナノ粒子はＡｐｏＥ３との結合により細胞内に導入が容易であり、濃度依存的に薬物（核酸）伝達量が増加し、肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）に薬物を高効率に伝達できることを確認した。

【0153】

実施例６．脂質ナノ粒子を使用した生体内発現確認
前記実施例５－１で確認したように、インビトロで優れた遺伝子発現効果（遺伝子伝達効果）を示す２４４－Ｃ１０ ＬＮＰ～２４６－Ｃ１０ ＬＮＰの生体内薬物伝達効率および生体分布（ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を本実施例で確認した。

【0154】

前記実施例２－２の方法のとおりｌｕｃ ｍＲＮＡ（配列番号１）が封入された２４４－Ｃ１０～２４６－Ｃ１０ ＬＮＰ（脂質－ＰＥＧを１．５モル％含み）を製造し、各ナノ粒子をＰＢＳで１６時間透析してエタノールを除去した。脂質ナノ粒子に含まれているｍＲＮＡを基準にして０．１ｍｇ／ｋｇの容量でＣ５７ＢＬ／６ Ｆｅｍａｌｅで７週齢のマウス（オリエンタルバイオ）にｍＲＮＡが封入された脂質ナノ粒子を静脈（ｉ．ｖ）注射後、３時間後にルシフェリン（ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ）０．２５ｍｇ／ｋｇを腹腔投与してＩＶＩＳ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製、米国）装置を用いて生物発光（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）を確認して、その結果を図５ａに示す。

【0155】

ｌｕｃ ｍＲＮＡが封入された２４６－Ｃ１０ ＬＮＰが投与されたマウスを犠牲にして臓器を摘出し、各臓器で脂質粒子の生体分布（ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）をＩＶＩＳ装置により確認して、その結果を図５ｂに示す。

【0156】

図５ａに示すように、ｌｕｃ ｍＲＮＡが封入された２４４－Ｃ１０ ＬＮＰ～２４６－Ｃ１０ ＬＮＰが投与されたマウスの生体内で高い発光強度を示し、これは前記実施例５－１の結果とも一致する。特に、図５ａおよび図５ｂに示すように、全身イメージングとエキソビボ全臓器のイメージング（ｅｘ ｖｉｖｏ ｏｒｇａｎ ｉｍａｇｉｎｇ）によりｌｕｃ ｍＲＮＡが封入された２４６－Ｃ１０ ＬＮＰの場合、肝特異的に高い発光強度を示すことを確認して、一実施形態による脂質ナノ粒子は、肝への高い生体分布を示すことを確認することができた。

【0157】

実施例７．核酸伝達に最適な脂質ナノ粒子の組成比の確認
本実施例で、生体内で肝特異的に薬物伝達効率に最も優れた脂質ナノ粒子の組成比を確認した。

【0158】

脂質ナノ粒子の製造にあたって、脂質－ＰＥＧ（Ｃ１６－ＰＥＧ２０００セラミド）を１．０～２．５モル％で混合して前記実施例２－２と同様の方法で、ｌｕｃ ｍＲＮＡ（配列番号１）が封入された脂質ナノ粒子（２４６－Ｃ１０ ＬＮＰ）を製造した。脂質ナノ粒子に含まれているイオン化可能な脂質（Ｉｏｎｉｚａｂｌｅ ｌｉｐｉｄ）：ｍＲＮＡの重量比は１０：１であり、ＬＮＰに含まれるイオン化可能な脂質（２４６－Ｃ１０）：リン脂質（ＤＯＰＥ）：コレステロール：脂質－ＰＥＧ（Ｃ１６－ＰＥＧ２０００セラミド）のモル比は、２６．５：２０：５２．５～５１：１．０～２．５（モル比の総和が１００となるようにコレステロールと脂質－ＰＥＧの含有量を調節）であった。

【0159】

脂質－ＰＥＧを１．０モル％、１．５モル％、または２．５モル％で含有し、ｌｕｃ ｍＲＮＡが封入された２４６－Ｃ１０ ＬＮＰを前記実施例６と同様の方法で、脂質ナノ粒子に含まれているｌｕｃ ｍＲＮＡを基準にして０．１ｍｇ／ｋｇの容量でＣ５７ＢＬ／６ Ｆｅｍａｌｅ ７週齢のマウス（オリエンタルバイオ）にｍＲＮＡが封入された脂質ナノ粒子を静脈（ｉ．ｖ）注射後、３時間後にルシフェリン（ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ）０．２５ｍｇ／ｋｇを腹腔投与してＩＶＩＳ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製、米国）装置を用いて生物発光（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）を確認して、その結果を図６に示し、脂質－ＰＥＧの含有量に応じた脂質ナノ粒子の大きさを実施例４－１と同様の方法で測定して、下記表６および図６に示す。

【0160】

【表6】

【0161】

図６に示すように、一実施形態による脂質ナノ粒子を投与した群から肝への薬物伝達効率に優れたことを確認することができ、脂質－ＰＥＧを１．５モル％で含むＬＮＰの大きさは約７０ｎｍ程度であった。

【0162】

実施例８．肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）特異的薬物伝達効果確認
実施例８－１．脂質ナノ粒子を使用したＦＶＩＩノックアウト（ｋｎｏｃｋｏｕｔ）効果確認
ＦＶＩＩは、肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）で特異的に発現するので、本実施例の一例による脂質ナノ粒子の肝細胞ターゲットの可能性をｓｉＦＶＩＩを用いたＦＶＩＩ（Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ）ノックアウト効果により確認した。

【0163】

脂質ナノ粒子に含まれているｓｉＲＮＡの濃度を基準にして０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、または０．３ｍｇ／ｋｇの濃度で、前記実施例２－２で製造したＦＶＩＩ ｔａｒｇｅｔ ｓｉＲＮＡ（配列番号２および配列番号３）が封入された２４６－Ｃ１０脂質ナノ粒子（脂質－ＰＥＧを１．５モル％含み）をＣ５７ＢＬ／６雌で７週齢、２０ｇのマウスに静脈注射後、３日後に尾静脈から血液を収集し、ｃｏａｓｅｔ ＦＶＩＩ ａｓｓａｙ ｋｉｔのプロトコルにより血液分析し、ＰＢＳが投与されたマウスの血液から標準曲線（ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ）を示してＦＶＩＩの発現量を測定し、その結果を図７に示す。図７に示すように、２４６－Ｃ１０脂質ナノ粒子に封入されたｓｉＲＮＡの濃度依存的に生体内でＦＶＩＩ発現を抑制したので、一実施形態による脂質ナノ粒子が肝細胞をターゲットとして核酸を伝達できることを確認した。

【0164】

実施例８－２．脂質－ＰＥＧの含有量に応じた肝細胞への薬物伝達効果
脂質ナノ粒子に含まれる脂質－ＰＥＧの含有量を０．５～５．０モル％に変更し、前記実施例２－２と同様の方法でｓｉＦＶＩＩ（配列番号２および配列番号３）が封入された脂質ナノ粒子（２４６－Ｃ１０ ＬＮＰ）を製造した。脂質ナノ粒子に含まれているイオン化可能な脂質：ｓｉＲＮＡの重量比は７．５：１であり、ＬＮＰに含まれるイオン化可能な脂質（２４６－Ｃ１０）：リン脂質（ＤＳＰＣ）：コレステロール：脂質－ＰＥＧ（Ｃ１６－ＰＥＧ２０００セラミド）のモル比は、４２．５：１３：４４～３９．５：０．５～５．０（モル比の総和が１００となるようにコレステロールと脂質－ＰＥＧの含有量を調節）であった。

【0165】

上記で製造した脂質ナノ粒子の直径および多分散度（ＰＤＩ；ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ ｉｎｄｅｘ）を前記実施例４－１と同様の方法で測定して、下記表７および図８（左表）に示す。

【0166】

【表7】

【0167】

脂質ナノ粒子に含まれているｓｉＲＮＡを基準にして０．２ｍｇ／ｋｇの容量となるように、ｓｉＦＶＩＩが封入された脂質ナノ粒子（０．５～５モル％で脂質－ＰＥＧを含み）をＣ５７ＢＬ／６ ｆｅｍａｌｅで７週齢、２０ｇのマウスに静脈注射後、３日後に尾静脈から血液を収集して、前記実施例８－１と同様の方法で、ｃｏａｓｅｔ ＦＶＩＩ ａｓｓａｙ ｋｉｔを用いて、ＦＶＩＩの発現量を測定し、その結果を図８（右グラフ）に示す。図８に示すように、一例による脂質ナノ粒子の投与時、生体内のＦＶＩＩの発現が減少し、一例により０．５～５．０モル％の脂質－ＰＥＧの含有量を有する脂質ナノ粒子を投与した場合、ＦＶＩＩの発現の抑制に優れていることを確認した。

【0168】

実施例９．ＬＳＥＣの特異的薬物伝達効果
ＦＶＩＩＩは、ＬＳＥＣ（ｌｉｖｅｒ ｓｉｎｕｓｏｉｄａｌ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）に特異的に発現するので、本実施例で一例による脂質ナノ粒子のＬＳＥＣターゲットの可能性をｓｉＦＶＩＩＩを使用したＦＶＩＩＩ（Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ）ノックアウト効果により確認するために、脂質－ＰＥＧの含有量に応じた薬物伝達効果を観察した。

【0169】

脂質ナノ粒子に含まれる脂質－ＰＥＧの含有量を０．５～５．０モル％に変更し、前記実施例２と同様の方法でｓｉＦＶＩＩＩ（配列番号４～配列番号１１）が封入されたナノ粒子（２４６－Ｃ１０ ＬＮＰ）を製造した。脂質ナノ粒子に含まれているイオン化可能な脂質：ｓｉＲＮＡの重量比は７．５：１であり、ＬＮＰに含まれるイオン化可能な脂質（２４６－Ｃ１０）：リン脂質（ＤＳＰＣ）：コレステロール：脂質－ＰＥＧ（Ｃ１６－ＰＥＧ２０００セラミド）＝４２．５：１３：４４～３９．５：０．５～５．０（モル比の総和が１００となるようにコレステロールと脂質－ＰＥＧの含有量を調節）であった。

【0170】

上記で製造した脂質ナノ粒子の直径およびＰＤＩを前記実施例４－１と同様の方法で測定して、下記表８および図９（左表）に示す。

【0171】

【表8】

【0172】

脂質ナノ粒子に含まれているｓｉＲＮＡを基準にして０．５ｍｇ／ｋｇの容量となるように、ｓｉＦＶＩＩＩが封入された脂質ナノ粒子（０．５～５モル％で脂質－ＰＥＧを含み）をＣ５７ＢＬ／６雌で７週齢、２０ｇのマウスに静脈注射後、２日後に尾静脈から血液を収集し、前記実施例８－１と同様の方法で、ｃｏａｓｅｔ ＦＶＩＩＩ ａｓｓａｙ ｋｉｔを用いてＦＶＩＩＩの発現量を測定し、その結果を図９（右グラフ）に示す。図９に示すように、一例による脂質ナノ粒子の投与時、生体内のＦＶＩＩＩの発現が減少し、一例による脂質ナノ粒子がＬＳＥＣをターゲットとすることを確認し、一例により０．５～５．０モル％の脂質－ＰＥＧの含有量を有する脂質ナノ粒子を投与した場合、ＦＶＩＩの発現の抑制に優れていることを確認した。

【0173】

実施例１０．脂質－ＰＥＧ複合体の種類による薬物伝達効果
脂質－ＰＥＧ複合体として、セラミド－ＰＥＧ複合体（Ｃ１６－ＰＥＧ２０００セラミド；Ａｖａｎｔｉ社製、米国）またはＰＥＧ－ＤＳＰＥ（Ａｖａｎｔｉ社製、米国）を含む脂質ナノ粒子（脂質－ＰＥＧ複合体を０．２５～１０．０モル％で含み）を前記実施例２－２と同様の方法で脂質ナノ粒子を製造した。

【0174】

脂質ナノ粒子に含まれているイオン化可能な脂質：ｓｉＲＮＡ（ｓｉＬｕｃ）の重量比は７．５：１であり、ＬＮＰに含まれるイオン化可能な脂質（２４６－Ｃ１０）：リン脂質（ＤＳＰＣ）：コレステロール：脂質－ＰＥＧ（セラミド－ＰＥＧまたはＰＥＧ－ＤＳＰＥ）のモル比は、４２．５：１３：４４．２５～３４．５：０．２５～１０（モル比の総和が１００となるようにコレステロールと脂質－ＰＥＧの含有量を調節）であった。使用されたｓｉＬｕｃ（ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子をターゲットとするｓｉＲＮＡ；配列番号１２および配列番号１３）の配列は前記実施例２－２に記載した。

【0175】

一実施形態によるＬＮＰを細胞に形質転換（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させる一日前に、ＨｅＬａ細胞（韓国細胞株銀行）をｗｈｉｔｅ ｐｌａｔｅ（９６ｗｅｌｌ）に０．０１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注して、ＤＭＥＭ ｍｅｄｉａ（ＳＨ３００２２、Ｈｙｃｌｏｎｅ社製、米国）で３７℃、０．５～３％ＣＯ_２の条件で培養した。ｓｉＬｕｃが封入された脂質ナノ粒子をｓｉＲＮＡ濃度を基準にして１０ｎＭでＨｅＬａ－Ｌｕｃ細胞株処理２４時間後、Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ^ＴＭ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ溶液（ｐｒｏｍｅｇａ社製、米国）を１００ｕｌ／ｗｅｌｌずつ処理して１０分間常温に置いた後、溶解した細胞をＩｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００発光測定装置（Ｔｅｃａｎ社製、米国）を用いて発光強度（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を測定して、その結果を図１０に示す。測定された結果は平均±ＳＤで示された。結果値は、Ｔ－ｔｅｓｔによる方法で統計的検証を行い、ｐ＜０．０５以上である場合を統計的に有意であると定義した。

【0176】

図１０に示すように、一実施形態による脂質ナノ粒子は、細胞への核酸伝達効果に優れ、特に脂質－ＰＥＧ複合体としてセラミド－ＰＥＧ複合体を含む場合、核酸伝達効果が優れていることが分かった。

【図1a】

【図1b】

【図2】

【図3a】

【図3b】

【図4a】

【図4b】

【図5a】

【図5b】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

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