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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-07-05
(45)【発行日】2024-07-16
(54)【発明の名称】腎移植後のＢＫウイルス腎症のリスクの層別化方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/686 20180101AFI20240708BHJP
C12Q 1/6888 20180101ALI20240708BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20240708BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20240708BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/686 Z
C12Q1/6888 Z
G01N33/53 M ZNA
C12N15/09 Z
【請求項の数】
14
(21)【出願番号】P 2020571477
(86)(22)【出願日】2019-06-18
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-10-21
(86)【国際出願番号】 EP2019066100
(87)【国際公開番号】W WO2019243372
(87)【国際公開日】2019-12-26
【審査請求日】2022-06-07
(31)【優先権主張番号】1855342
(32)【優先日】2018-06-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR
(73)【特許権者】
【識別番号】520179305
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ パリ－サクレー
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＰＡＲＩＳ－ＳＡＣＬＡＹ
(73)【特許権者】
【識別番号】505386960
【氏名又は名称】アンスティテュト ナショナル ド ラ サンテ エ ド ラ ルシェルシュ メディカル （アンセルム）
(73)【特許権者】
【識別番号】591140123
【氏名又は名称】アシスタンス ピュブリク－オピトー ドゥ パリ
【氏名又は名称原語表記】ＡＳＳＩＳＴＡＮＣＥ ＰＵＢＬＩＱＵＥ － ＨＯＰＩＴＡＵＸ ＤＥ ＰＡＲＩＳ
(74)【代理人】
【識別番号】100107342
【弁理士】
【氏名又は名称】横田 修孝
(74)【代理人】
【識別番号】100155631
【弁理士】
【氏名又は名称】榎 保孝
(74)【代理人】
【識別番号】100137497
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 未知子
(74)【代理人】
【識別番号】100207907
【弁理士】
【氏名又は名称】赤羽 桃子
(74)【代理人】
【識別番号】100217294
【弁理士】
【氏名又は名称】内山 尚和
(72)【発明者】
【氏名】ヤシン、タウフィーク
(72)【発明者】
【氏名】アントワーヌ、ドゥルバッハ
(72)【発明者】
【氏名】マノン、デカイザー
【審査官】松村 真里
(56)【参考文献】
【文献】PLoS Pathog，2016年，12(10): e1005903
【文献】American Journal of Transplantation，2011年，11:2443-2452
【文献】Transplantation，2017年，101(6):1479-1487
【文献】Clin J Am Soc Nephrol，2007年，2: 1037-1042
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
腎移植を受けた患者におけるＢＫウイルス（ＢＫＶ）腎症を発症するリスクの評価方法であって、下記の工程：ａ）前記患者の生物学的サンプル中のＢＫＶのウイルス量を測定する工程、
ｂ）前記患者からの生物学的サンプル中のＢＫＶウイルスに特異的なＣＤ４＋またはＣＤ８＋メモリーＴ細胞応答の正規化された強度を測定する工程（前記正規化は、工程ａ）において測定されたＢＫＶウイルス量に対して実行される）、ならびに
ｃ）腎臓ドナーと前記患者のＨＬＡ対立遺伝子差異を決定する工程
を含んでなり、
下記の場合にＢＫウイルス（ＢＫＶ）腎症の発症リスクが高いと結論付けられる、方法：
ａ）血液１ｍＬあたりＢＫウイルス１０３コピーのウイルス量に関連して、
ｂ）ＢＫＶに特異的なＣＤ４＋またはＣＤ８＋メモリーＴ細胞応答の前記正規化された強度が１００強度測定単位以下であり、かつ
ｃ）前記患者と移植された腎臓のドナーとの間での差異数が５以下である。
【請求項2】
前記工程ａ）、ｂ）およびｃ）により決定されるパラメーターが、前記患者がＢＫウイルス腎症を発症するリスクの層別化指標を作出するために、次いで編集される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ＢＫＶウイルス量が、工程ａ）において、前記患者からの全血または血漿のサンプルからの定量的ＰＣＲにより測定される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
工程ｂ）において測定されたＢＫＶ特異的ＣＤ４＋またはＣＤ８＋メモリーＴ細胞の応答が、前記患者からの末梢血単核細胞をＢＫＶウイルスペプチドと接触させ、次いで前記単核細胞に存在するＴ細胞の増殖を４～７日の培養後に評価することにより決定される、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項5】
前記増殖が、前記ペプチドの存在下で４～７日の培養後に増殖マーカーを希釈したＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を決定することにより測定される、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記増殖が、前記ペプチドの存在下で４～７日の培養後に増殖マーカーを希釈したＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を決定することにより測定される、請求項４に記載の方法。
【請求項7】
請求項１～６のいずれか一項に記載の方法であって、工程ｃ）が腎臓ドナーと前記患者のＨＬＡ ＩおよびＩＩの間での不適合数を決定する工程からなり、下記の場合にＢＫウイルス（ＢＫＶ）腎症の発症リスクが高いと結論付けられる、方法：前記患者と移植された腎臓のドナーとの間での不適合数が５以下である。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか一項に記載の方法であって、下記の場合にＢＫウイルス（ＢＫＶ）腎症の発症リスクが低いと結論付けられる、方法：ａ）血液１ｍＬあたりＢＫウイルス１０３コピーのウイルス量に関連して、
ｂ）ＢＫＶに特異的なＣＤ４＋またはＣＤ８＋メモリーＴ細胞応答の前記正規化された強度が１００強度測定単位より大きく、かつ
ｃ）前記患者と移植ドナーとの間での不適合数が５より大きい。
【請求項9】
免疫抑制治療の変更後のＢＫＶの血液複製に対する腎移植患者の応答のイン・ビトロ評価方法であって、移植後に一定の時間間隔で請求項１～８に記載の方法を繰り返すことを特徴とする、方法。
【請求項10】
請求項１～８に記載の方法を各治療変更の前および後に繰り返す、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
請求項１～８に記載の方法をおよそ３～６か月ごとに繰り返す、請求項９に記載の方法。
【請求項12】
請求項１～１１に記載の方法を血液において実施するためのキットであって、下記を含む、キット：ａ）ＢＫウイルス定量的ＰＣＲを行うための試薬、および
ｂ）請求項４～６に記載の免疫学的方法を血液に対して行うための試薬。
【請求項13】
前記試薬ｂ）が、ＢＫＶペプチド配列またはポリクローナルリンパ球刺激ペプチド配列を含む、請求項１２に記載のキット。
【請求項14】
下記を含む、請求項１２に記載のキット：ａ）ＢＫＶゲノムの一部を増幅するための特異的プライマー、ならびに
ｂ）ＢＫＶペプチド配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の要旨
本発明は、腎移植を受けた患者においてＢＫウイルス腎症（以下「ＢＫＶ Ｎx」）を発症するリスクを特定および層別化するための新しい方法を説明し、特許請求する。この方法は、ｉ）抗ＢＫＶメモリーＴ細胞応答（ＢＫＶに特異的なメモリーＴ細胞、以下「抗ＢＫＶ ＴＣｍ」)の強度、ｉｉ）移植ドナーとレシピエントの間でのクラスＩおよびクラスＩＩのＨＬＡ対立遺伝子についての不適合数、ｉｉｉ）患者の血液におけるＢＫＶウイルス量の考慮、という少なくとも３つのバイオマーカーを組み合わせた指標を使用する。本方法は、移植された腎臓をよりよく保存するために免疫抑制治療を最適化することを目的として、試験の翌月にＢＫＶ Ｎｘを発症するリスクを非常に正確に評価することを可能にする。
本発明は、腎移植を受けた患者においてＢＫウイルス腎症（以下「ＢＫＶ Ｎx」）を発症するリスクを特定および層別化するための新しい方法を説明し、特許請求する。この方法は、ｉ）抗ＢＫＶメモリーＴ細胞応答（ＢＫＶに特異的なメモリーＴ細胞、以下「抗ＢＫＶ ＴＣｍ」)の強度、ｉｉ）移植ドナーとレシピエントの間でのクラスＩおよびクラスＩＩのＨＬＡ対立遺伝子についての不適合数、ｉｉｉ）患者の血液におけるＢＫＶウイルス量の考慮、という少なくとも３つのバイオマーカーを組み合わせた指標を使用する。本方法は、移植された腎臓をよりよく保存するために免疫抑制治療を最適化することを目的として、試験の翌月にＢＫＶ Ｎｘを発症するリスクを非常に正確に評価することを可能にする。
【背景技術】
【0002】
本願では以下の略語を使用した：
・ＢＫＶ：ヒトＢＫポリオーマウイルス
・ＣＦＳＥ：リンパ球増殖マーカーであるカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル
・ＨＬＡ：ヒト白血球抗原
・ＪＣＶ：ヒトＪＣポリオーマウイルス
・抗ＢＫＶ ＴＣｍ： ＢＫＶに特異的なメモリーＴ細胞
・ＢＫＶ Ｎｘ：ＢＫウイルス腎症
・抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答：ＢＫＶに特異的なメモリーＴ細胞の応答
・ＢＫＶ：ヒトＢＫポリオーマウイルス
・ＣＦＳＥ：リンパ球増殖マーカーであるカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル
・ＨＬＡ：ヒト白血球抗原
・ＪＣＶ：ヒトＪＣポリオーマウイルス
・抗ＢＫＶ ＴＣｍ： ＢＫＶに特異的なメモリーＴ細胞
・ＢＫＶ Ｎｘ：ＢＫウイルス腎症
・抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答：ＢＫＶに特異的なメモリーＴ細胞の応答
【0003】
末期慢性腎疾患とその代替療法
末期慢性腎疾患は、腎機能の完全かつ決定的な障害であり、腎臓代替治療（透析または移植による）の使用を必要とする。フランスでは、２０１５年の末期慢性腎疾患の患者数は８２，２９５人、つまり住民１００万人あたり１，２３２人であった。
末期慢性腎疾患は、腎機能の完全かつ決定的な障害であり、腎臓代替治療（透析または移植による）の使用を必要とする。フランスでは、２０１５年の末期慢性腎疾患の患者数は８２，２９５人、つまり住民１００万人あたり１，２３２人であった。
【0004】
現在、末期慢性腎疾患の最も効果的な治療は、腎移植である。腎移植は、透析を維持することに比べて、患者の生存および生活の質を改善し、財務的コストを削減する。腎移植は、世界最大の実質臓器移植活動である。
【0005】
２０１４年には、臓器提供と移植の国際観察機関(the Global Observatory for Organ Donation and Transplantation)（ＧＯＤＴ、世界保健機関(the World Health Organization)の組織）によると、世界的に見て腎移植患者７９，９４８人（６７％）を含む１１９，８７３人の移植患者が記録された。フランスでは、２０１５年の機能性腎移植を受けた患者の推定数は３６，７２９人、つまり住民１００万人あたり５５２．４症例の患者数であり、従って、末期慢性腎疾患の治療を受けた８２，２９５人の患者の４４．６％に相当した。
【0006】
現在、総ての腎移植の必要性を満たす臓器が不足しているため（４．７人の待機者に対して１回の腎移植が利用可能であり、待機時間の中央値は１８．５か月である）、現在１３年と推定されている腎移植片の寿命を延ばすことが不可欠である。（［１］、［２］）。この目的のために、移植患者は、免疫抑制療法を日常的に受ける。この方策は、同種異系免疫応答を制御し、移植片生存期間を延長させるために実際に不可欠である。しかしながら、治療的免疫抑制は、合併症、特に感染性合併症と関連している可能性があり、これは移植に有害である可能性がある。これらの感染症は、移植された腎臓の喪失につながる可能性があり、従って、患者は透析に戻る必要があり（結果として生じる総ての有害な結果を伴い）、腎移植を待つ患者の数の増加につながる。
【0007】
腎移植におけるＢＫおよびＪＣポリオーマウイルスの再活性化
ウイルスの再活性化は、免疫不全の患者によく見られる合併症である。具体的には、特定のポリオーマウイルスの再活性化が特に懸念されている。ヒトでは、現在ポリオーマウイルスの１３の既知の種が存在する。ポリオーマウイルスはよく見られるウイルスであり、種特異性で多くの動物種に感染する。これらのウイルス感染の血清陽性率は世界的に非常に高く（成人年齢で８０～９０％）、早期かつ広範なウイルス曝露を示している。２つの主要な代表がＢＫウイルス（ＢＫＶ）およびＪＣウイルス（ＪＣＶ）である。これらのウイルスの共通の特徴は、体内で無症候で長期間存続し、免疫抑制の状況で病原体になる能力である（［３］、［４］）。
ウイルスの再活性化は、免疫不全の患者によく見られる合併症である。具体的には、特定のポリオーマウイルスの再活性化が特に懸念されている。ヒトでは、現在ポリオーマウイルスの１３の既知の種が存在する。ポリオーマウイルスはよく見られるウイルスであり、種特異性で多くの動物種に感染する。これらのウイルス感染の血清陽性率は世界的に非常に高く（成人年齢で８０～９０％）、早期かつ広範なウイルス曝露を示している。２つの主要な代表がＢＫウイルス（ＢＫＶ）およびＪＣウイルス（ＪＣＶ）である。これらのウイルスの共通の特徴は、体内で無症候で長期間存続し、免疫抑制の状況で病原体になる能力である（［３］、［４］）。
【0008】
移植後、ＢＫＶは、尿路の上皮細胞および移植された腎臓の腎実質に感染することが知られている。腎移植患者では、ＢＫウイルスの再活性化は、血液中での検出可能なウイルス量（２００コピー／ｍＬより多い）につながる可能性がある。
【0009】
従って、腎移植との関連において、ＢＫＶは、腎症（以下ＢＫＶ Ｎｘ）、腎不全または尿管狭窄の原因となる（［４］）。造血幹細胞移植との関連において、ＢＫＶは、出血性膀胱炎の原因となる（［４］）。
【0010】
腎移植を受けた患者では、ＢＫＶ再活性化のいくつかのレベルが観察される（図１）。
【0011】
患者は以下を提示する可能性がある：
１－ウイルス血症または腎障害が検出されない「ＢＫＶウイルス尿症」。これらの患者では、ＢＫＶは尿路で複製している。ウイルス尿症は、腎移植患者のほぼ４０％で観察され、通常移植後の最初の３～６か月で起こる。
２－腎移植片で検出可能な特定の腎臓損傷がない「孤立性ＢＫＶウイルス血症」。このようなウイルス血症は、腎移植患者のほぼ２４％で観察され、通常腎移植後の最初の１２か月で起こる。
３－ＢＫＶ Ｎｘ。これらの患者では、ウイルス血症およびウイルス尿症に加えて、腎移植片におけるウイルス複製が観察され、特定の腎臓損傷の原因となっている。診断は現在、組織学的であり、核内ウイルス封入体（ＳＶ４０ Ｔ陽性抗原）、核ジストロフィー、多形細胞浸潤および腎線維症を示す。この重篤な合併症は、腎移植患者のほぼ１０％で診断され、通常腎移植後の最初の２４か月で起こる。（［５］～［６］）。ＢＫＶ Ｎｘの進行は、腎実質損傷の程度に依存し、それ自体がウイルス量の強度に関連している（表８、Hirsch et al.、2014［７］参照）。転帰は、免疫系がＢＫＶ実質内複製の制御で成功した患者に有利である。見返りとして、ＢＫＶの強烈で長期の実質内ウイルス複製の持続は、腎実質に不可逆的損傷を引き起こし、慢性機能不全、腎疾患、最終的には５０％を上回る症例で移植片の喪失につながる。
１－ウイルス血症または腎障害が検出されない「ＢＫＶウイルス尿症」。これらの患者では、ＢＫＶは尿路で複製している。ウイルス尿症は、腎移植患者のほぼ４０％で観察され、通常移植後の最初の３～６か月で起こる。
２－腎移植片で検出可能な特定の腎臓損傷がない「孤立性ＢＫＶウイルス血症」。このようなウイルス血症は、腎移植患者のほぼ２４％で観察され、通常腎移植後の最初の１２か月で起こる。
３－ＢＫＶ Ｎｘ。これらの患者では、ウイルス血症およびウイルス尿症に加えて、腎移植片におけるウイルス複製が観察され、特定の腎臓損傷の原因となっている。診断は現在、組織学的であり、核内ウイルス封入体（ＳＶ４０ Ｔ陽性抗原）、核ジストロフィー、多形細胞浸潤および腎線維症を示す。この重篤な合併症は、腎移植患者のほぼ１０％で診断され、通常腎移植後の最初の２４か月で起こる。（［５］～［６］）。ＢＫＶ Ｎｘの進行は、腎実質損傷の程度に依存し、それ自体がウイルス量の強度に関連している（表８、Hirsch et al.、2014［７］参照）。転帰は、免疫系がＢＫＶ実質内複製の制御で成功した患者に有利である。見返りとして、ＢＫＶの強烈で長期の実質内ウイルス複製の持続は、腎実質に不可逆的損傷を引き起こし、慢性機能不全、腎疾患、最終的には５０％を上回る症例で移植片の喪失につながる。
【0012】
Hirsch et al, Clinical Microbiology and Infection 2014［７］の表８は、ＢＫＶ Ｎｘの種々の組織学的病期、ならびに組織学的損傷に関連する腎臓の予後診断を示す。
【0013】
図２は、ＢＫＶ Ｎｘを有する場合またはＢＫＶ Ｎｘのない場合の、患者における移植後３年での腎機能評価（糸球体濾過速度の測定による－パートａ）および腎移植片の生存率（パートｂ）を示す。これらのデータは、本発明の開発につながったコホート研究からえられている。この観察（非介入）研究は、本発明者らによって、２０１４年１１月から２０１７年１１月まで、ＢＫＶ再活性化の程度に応じて４グループに分けられた９４人の腎移植患者のコホートで行われた：ＢＫＶ再活性化のない１グループ（ｎ＝２５）、孤立性ＢＫＶウイルス尿症を有する１グループ（ｎ＝２５）、孤立性ＢＫＶウイルス血症を有するが組織学的に証明されたＢＫＶ Ｎｘのない１グループ（ｎ＝２２）および組織学的に証明されたＢＫＶ Ｎｘを有する１グループ（ｎ＝２２）。図２は、ＢＫＶ Ｎｘを有する患者が腎移植片の重度機能不全を有することを示す。この機能不全は、ＢＫＶ Ｎｘと診断されるとすぐに現れ、徐々に悪化し、３年間のフォローアップ後に症例の５０％で移植片は喪失している。
【0014】
従って、腎移植患者においてＢＫＶ Ｎｘを早期に検出すること、あるいはそれを予測することさえも不可欠であり、それを止めようとする方がよい。
【0015】
ＢＫＶ Ｎｘのリスク因子と現在の診断的および治療的アプローチ
ＢＫＶの複製は、免疫抑制治療の性質および強度ならびにＢＫＶに特異的な免疫応答の障害を含む種々の因子によって促進されることが知られている（［８］）。より正確には、ＢＫＶ Ｎｘを発症するリスクは、免疫抑制治療であるタクロリムス－ミコフェノール酸モフェチルの組合せ（腎移植における現在の標準治療）の強度ならびにコルチコステロイドへの実質的な累積曝露（ＢＫＶウイルス血症の前の６か月間に３０００ｍｇのコルチコステロイドより多い）と有意に関連している。ドナーおよびレシピエントの年齢、レシピエントの性別または虚血再潅流損傷などの移植片に特有の特徴など、免疫抑制治療とは関係のない他のリスク因子も特定されている（［７］）。
ＢＫＶの複製は、免疫抑制治療の性質および強度ならびにＢＫＶに特異的な免疫応答の障害を含む種々の因子によって促進されることが知られている（［８］）。より正確には、ＢＫＶ Ｎｘを発症するリスクは、免疫抑制治療であるタクロリムス－ミコフェノール酸モフェチルの組合せ（腎移植における現在の標準治療）の強度ならびにコルチコステロイドへの実質的な累積曝露（ＢＫＶウイルス血症の前の６か月間に３０００ｍｇのコルチコステロイドより多い）と有意に関連している。ドナーおよびレシピエントの年齢、レシピエントの性別または虚血再潅流損傷などの移植片に特有の特徴など、免疫抑制治療とは関係のない他のリスク因子も特定されている（［７］）。
【0016】
現在、このウイルスに対する特定の抗ウイルス療法はない。シドフォビルなどの治療は、腎移植の重大な毒性の原因であり、重度の移植片機能不全の場合には禁忌である。さらに、レフルノミドまたはフルオロキノロンは、孤立した症例で効果的であることが証明されている。しかしながら、これらの稀な症例の一貫性のない有効性と不十分な数により、現在、一般的な慣行でのこれらの薬物分子の使用の推奨は認められていない［２４］）。
【0017】
現在認識されている唯一のＢＫＶ Ｎｘの治療は、移植レシピエントが受ける治療的免疫抑制を軽減することである（［７］、［２４］）。実際に、ＢＫＶウイルスの再活性化は、免疫抑制治療により免疫系の活動が低下したときに起こる。ＢＫＶ Ｎｘが検出された場合、最初の治療反射は免疫抑制を減らすことである。しかしながら、この治療上の調整は経験的に行われ、量に関する制限はないため、患者は移植片の同種異系拒絶反応と喪失のリスクに曝される。従って、患者が実際にＢＫＶ Ｎｘを有するかまたはその発症リスクが非常に高いと考えられる場合にのみ、この治療的アプローチに頼ることが重要であり、それは段階的かつ制御された方法で行う必要がある。その後、移植拒絶のリスクを増加させないように、免疫抑制治療を再度増加させる必要がある。また、単に孤立性ＢＫＶウイルス血症またはウイルス尿症を有するだけの患者において免疫抑制を低下させないことも重要である。これは、移植片がＢＫＶに感染していなくても、この低下がそれを危険に曝すためである。
【0018】
ＢＫＶ感染は、尿または血液サンプルに対する定量的ＰＣＲにより容易に検出することができる。しかしながら、上で説明したように、ウイルス血症またはウイルス尿症を有する多数の患者はＢＫＶ Ｎｘを発症しない（ウイルスの再活性化は、移植片自体で常に達成されるとは限らない）ため、移植患者の血液または尿中のＢＫＶの検出は、必ずしも移植の不良の予後診断と関連しているわけではない。実際に、血液１ｍＬあたり１０４コピー以上のＢＫＶウイルス量は、感度９０％に関連しているが、この試験は、その陽性反応的中度が５５％を超えないため、ＢＫＶ Ｎｘの診断に十分な有効性はない（［１］、［２５］、［２６］）。
【0019】
現在、免疫抑制治療は、ＢＫＶが証明されているかまたは疑われる場合（少なくとも４週間のＰＣＲがＢＫＶ陽性および血液１ｍＬあたり１０４コピー以上）には減らしている。しかしながら、腎移植を伴わない単純な孤立性ウイルス血症を有する患者は、「リスクがある」と考えられるため、この解決法は最適ではない。図３はこの問題を示している。
【0020】
腎移植生検後の腎実質の組織学的分析は、現在唯一の信頼性が高いＢＫＶ Ｎｘ診断方法である。しかしながら、出血性合併症のリスクを伴う侵襲的な手技であり、また、症例の１０～３０％で、特に、ＢＫＶ Ｎｘの初期段階で偽陰性を示す可能性もある。さらに、腎移植片機能の低下がない場合、ＢＫＶに起因する損傷の存在を検出または確認するためにこれらの患者に繰り返し生検を行うことは推奨されない（［７］）。従って、ＢＫＶ Ｎｘに対して現在推奨される診断的アプローチは、患者の血液中のＢＫＶウイルス量の長期的モニタリングと、移植片機能の低下および／または少なくとも４週間連続してＢＫＶウイルス量が血液１ｍＬあたり１０４コピー以上である場合の腎移植生検の実施に依存している。しかしながら、糸球体濾過速度により評価された移植片機能障害は、ＢＫＶ Ｎｘ診断の場合、すでに著しい線維化病変拡大を伴う後期マーカーである。この不可逆的損傷は、移植片喪失の重大なリスクと関連している（Hirsch et al.、2014［７］の表８および図２参照）。
【0021】
従って、現在の戦略は診断の遅れと困難を引き起こすが、この合併症の治療管理は、不可逆的損傷の発生を回避するために可能な限り早期でなければならない。
【0022】
ＢＫＶ Ｎｘに対する他の診断試験は過去に提案されている。これらには、全Ｔ細胞または抗ウイルスＴ細胞の機能的能力の研究に基づいた、ウイルス合併症のリスクが最も高い患者を特定することを目的とした免疫ウイルス学的モニタリングが含まれる（［１２］）。一部の著者らは、ＢＫＶ Ｎｘのリスクがある患者を特定するために特定の抗ＢＫＶ免疫応答を研究している（［８］、［９］）、［２７］）。ＢＫＶ抗原によって刺激されたＴ細胞のインターフェロン－γ分泌能（ＥＬＩＳＡまたはＥＬＩＳＰＯＴ試験）によって評価される低特異的抗ＢＫＶ免疫応答は、ＢＫＶ血液再活性化を有する患者において見出された（［２２］、［２３］）。他のチームは、血液および尿のＢＫＶ反応との関連において「Ｃｙｌｅｘ ＩｍｍｕｎＫｎｏｗ Ｔｅｓｔ」などのリンパ球免疫応答全体の試験を使用した（［２０］）。この研究では、著者ら［２０］は、リンパ球応答全体とＢＫＶ Ｎｘとの関連を証明しておらず、ウイルス血症との関連だけであった。さらに、一部の著者らは、ＢＫＶウイルス量の測定［２５］、［３０］）または抗ＢＫＶリンパ球応答（［８］）など、ＢＫＶ Ｎｘのリスクを評価するための種々の個別技術を提案した。これらの文献は、ＢＫＶ Ｎｘのリスク予測指標を得るために、種々のパラメーターを組み合わせることまたは正規化パラメーターを適用することを提案していない。従って、これらの方法では、ＢＫＶ Ｎｘを診断することもまたはＢＫＶ Ｎｘを発症するリスクがある患者を確実に特定することもできなかった。最適なパラメーターの捜索は継続中である（［２１］）。現在、ＢＫＶ Ｎｘの客観的診断が可能なのは、腎臓生検で実施される組織学だけである（［７］、［９］）。
【発明の概要】
【0023】
従って、ＢＫＶ Ｎｘを有する患者を、確実に、早期にかつ非侵襲的に診断することだけでなく、腎移植を受けた患者においてこの合併症を発症するリスクを層別化することが急務である。これらの診断および予後診断方法は、ＢＫＶ Ｎｘを発症するリスクがある患者を、移植の関与やこのタイプの合併症のその後のリスクなしに、孤立性ＢＫＶウイルス血症を有する患者から理想的に区別する必要がある。
【0024】
本発明は、ＢＫＶ Ｎｘのリスクの非侵襲的かつ早期の個別化評価を提供することによって、この必要性を満たす。本発明の方法の独創性は、患者に固有の３つのパラメーター、すなわちｉ）患者の血液中のＢＫＶウイルス量によって評価されるウイルス学的パラメーター、ｉｉ）患者における抗ＢＫＶメモリーＴ細胞応答（抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答）の強度によって評価される免疫学的パラメーター、およびｉｉｉ）［ドナー／レシピエント］ペアにおけるＨＬＡ不適合数、の組合せの考慮に基づく（図４）。これらのパラメーターを組み合わせて、所定の時間tでの腎移植患者の個別のモニタリングを可能にする完全で信頼性が高く再現性のある指標を取得する必要がある。孤立性ＢＫＶウイルス血症を有する患者は「リスクがある」と分類されないため、この方法は従来技術の試験よりも信頼性が高い（試験した２７人の患者のうち、その陽性反応的中度は１００％であり、偽陽性率はゼロである；下記実施例参照）。さらに、抗ＢＫＶメモリーＴ細胞（抗ＢＫＶ ＴＣｍ）と関連しているマーカーの使用により、腎実質に対する不可逆的損傷が発生する前にＢＫＶ Ｎｘのリスクの早期評価が可能になる。とりわけ、この方法は、あまり侵襲的ではなく（単純な血液サンプルが必要である）、従って、患者のリスクなしに移植後の異なる時間に再現することができる。この潜在的再現性から、本発明の方法は、治療管理に対する応答をよりよく評価することを可能にし、最終的には、治療的免疫抑制またはＢＫＶ再活性化の制御を可能にするいずれもの他の治療を調節するのに役立ち、総ては腎移植生検を必要としない。
【0025】
本発明の方法は、３つの因子、ウイルス学的パラメーター、免疫学的パラメーターおよび遺伝学的パラメーターの考慮に基づいており、これらは一緒に組み合わせる必要がある。これにより、特定の患者のＢＫＶ Ｎｘを発症するリスクの完全で信頼性が高い早期指標を取得可能である。これらの因子は以下の通りである：
ｉ）所定の時間における患者の血液中のＢＫＶウイルスのウイルス量、
ｉｉ）同時に同じ患者の抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答の強度、
ｉｉｉ）腎移植時に決定された移植ドナーとその患者／レシピエントとの間でのＨＬＡ分子不適合数。
ｉ）所定の時間における患者の血液中のＢＫＶウイルスのウイルス量、
ｉｉ）同時に同じ患者の抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答の強度、
ｉｉｉ）腎移植時に決定された移植ドナーとその患者／レシピエントとの間でのＨＬＡ分子不適合数。
【0026】
図４は、これらの３つのパラメーターの組合せに基づいた本発明の方法を示す。
【0027】
これらのマーカーの組合せにより、所定の時間ｔで、試験した患者のＢＫＶ Ｎｘの発症リスクを個別に評価することが可能である。従って、この方法により、腎移植患者の個別のモニタリングが可能になる。
【0028】
本方法は、従来技術で提案された試験と比較して、以下の利点を有する:
・本方法は、ＢＫＶウイルス量、抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答の強度およびドナー／レシピエントペアにおけるＨＬＡ対立遺伝子差異をマルチパラメトリックに統合し、それによって各患者の免疫およびウイルス学的状況のより完全な評価が可能である。
・本方法は、迅速、安価、標準化可能で信頼性が高く、患者の状態、投与された治療および以前に得られた結果に応じて一定の時間間隔で繰り返すことができる患者の前向きモニタリングが可能である。
・本方法は、患者の血液サンプル１５ｍＬしか必要としないため、非侵襲的である。
・本方法は、従来技術の方法、特にＢＫＶに特異的なＴ細胞のサイトカイン分泌に基づく方法よりも早く、ＢＫＶ Ｎｘのリスクがある患者を検出することが可能である。
・その結果は、患者間および同じ患者の生涯にわたって比較できる絶対正規化値である。
・本方法は、ＢＫＶウイルス量、抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答の強度およびドナー／レシピエントペアにおけるＨＬＡ対立遺伝子差異をマルチパラメトリックに統合し、それによって各患者の免疫およびウイルス学的状況のより完全な評価が可能である。
・本方法は、迅速、安価、標準化可能で信頼性が高く、患者の状態、投与された治療および以前に得られた結果に応じて一定の時間間隔で繰り返すことができる患者の前向きモニタリングが可能である。
・本方法は、患者の血液サンプル１５ｍＬしか必要としないため、非侵襲的である。
・本方法は、従来技術の方法、特にＢＫＶに特異的なＴ細胞のサイトカイン分泌に基づく方法よりも早く、ＢＫＶ Ｎｘのリスクがある患者を検出することが可能である。
・その結果は、患者間および同じ患者の生涯にわたって比較できる絶対正規化値である。
【0029】
従って、第１の側面において、本発明は、腎移植を受けた患者のＢＫＶ Ｎｘを発症するリスクの評価方法であって、以下の工程を含んでなる方法に関する：
ａ）前記患者の生物学的サンプル中のＢＫＶのウイルス量を測定する工程、
ｂ）前記患者からの生物学的サンプル中の抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答の正規化強度（例えば、ＢＫＶペプチドに対するＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋メモリーＴ細胞の特異的増殖に基づく）を測定する工程、
ｃ）腎臓ドナーと前記患者のクラスＩおよびＩＩ ＨＬＡの間での不適合数を決定する工程。
ａ）前記患者の生物学的サンプル中のＢＫＶのウイルス量を測定する工程、
ｂ）前記患者からの生物学的サンプル中の抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答の正規化強度（例えば、ＢＫＶペプチドに対するＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋メモリーＴ細胞の特異的増殖に基づく）を測定する工程、
ｃ）腎臓ドナーと前記患者のクラスＩおよびＩＩ ＨＬＡの間での不適合数を決定する工程。
【0030】
この方法は、ＢＫＶ Ｎｘの診断を支援しまたはＢＫＶ Ｎｘを発症するリスクを層別化するための上記のパラメーターａ）、ｂ）およびｃ）の収集と組合せの両方が可能である。これらの工程は任意の順序で行うことができる。このようではあるが、腎移植時にＨＬＡ不適合数がわかっているため、工程ｃ）は工程ａ）およびｂ）の前に行われている。
【0031】
工程ａ）において使用される生物学的サンプルは、例えば、全血または血漿サンプルであり、一方、工程ｂ）において使用される生物学的サンプルは、好ましくは全血サンプルである。工程ａ）およびｂ）が２つの独立した実験室によって行われる態様では、工程ａ）およびｂ）の測定のために２つの別個のサンプル、例えば、互いに独立に採取された２つの血液サンプルが使用され得る。２つの別個のサンプルが使用される場合、それらは、好ましくは時間的に接近して、一般には同日に、例えば、数時間（１～４時間）おいて、あるいは同じ時間内にもサンプリングされた。
【0032】
好ましい態様では、工程ａ）およびｂ）は、同じ実験室により実施され、工程ａ）およびｂ）の測定のために同じ生物学的サンプルが使用される。いっそうより好ましい態様では、このサンプルは、従来の静脈内採血により非侵襲的かつ無痛で採取された血液サンプルである。この血液サンプルは、直接分析することができるしまたは実施される測定に関して以下に提案するように処理することができる。ＢＫＶウイルス血症の定量化（血液１ｍＬあたりのコピー数で表される）は、患者の血液からの遠心分離により得られた全血または血漿からの定量的ＰＣＲにより行うことができる。抗ＢＫＶ ＴＣｍを含む末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、患者の血液サンプルからフィコール勾配によって分離することができる。あるいは、患者の血液中に存在する赤血球を溶解し、フローサイトメトリーによってＴ細胞の存在を検出し（ＦＳＣ－ＡおよびＳＳＣ－Ａマーカー）、その後、細胞増殖マーカーＫｉ６７を使用してＢＫＶで刺激された抗ＢＫＶ ＴＣｍの増殖を測定することが可能である。
【0033】
本発明の文脈において、「患者」は、生涯に腎移植を受けたヒトまたは動物個体である。好ましい態様では、前記移植は、サンプル採取前の過去５年以内に行われた。いっそうより好ましい態様では、前記移植は、サンプル採取前の過去３年以内に行われた。最も好ましい態様では、前記移植は、サンプル採取前の過去２４か月以内に行われた。
【0034】
好ましい態様では、本発明の方法は、ＢＫＶ血液再活性化を有する患者においてＢＫＶ Ｎｘの診断または予後診断を行うために使用される。優先的には、本発明の方法は、ＢＫＶウイルス量が血液１ｍＬあたり２００コピーより多い患者に適用される。
【0035】
最初にＢＫＶウイルス血症を伴う腎移植のみを考慮した場合、これは、フランスでは年間ほぼ８４０人の患者（年間ほぼ３５００回の新規腎移植に対して）、欧州および米国では年間７２００人の患者（年間３０,０００回の新規腎移植に対して）に相当する。
【0036】
本発明の方法はまた、移植拒絶および／または最終的にＢＫＶ Ｎｘを発症するリスクの治療を受けた患者（全腎移植患者の１５～２０％の間、またはフランスでの５５００人の患者から欧州および米国での１２,０００人の間）だけでなく、移植の最初の年を過ぎてＢＫＶウイルス血症および／または原因不明の腎機能低下を有する患者にも適用することができる。
【0037】
従って、この方法は、毎年フランスでのほぼ６３４０人の腎移植患者と欧州および米国での１９,２００人以上の腎臓移植患者に関係し得る。本方法はまた、同じ患者をモニタリングするために定期的に再現し得る。
【0038】
本発明の方法の３つの工程を以下に詳述する。
ａ）工程ａ：患者の血液中のＢＫＶウイルス量の測定
この工程は、患者の全血または血漿サンプルからの血液１ｍＬあたりのＢＫＶコピー数を測定することからなる。このＢＫＶコピー数は、当技術分野で記載されている標準的な方法に従って定量することができる。一般に、この測定値は、定量的ＰＣＲなどのＰＣＲ 技術を使用することにより得ることができる。
ａ）工程ａ：患者の血液中のＢＫＶウイルス量の測定
この工程は、患者の全血または血漿サンプルからの血液１ｍＬあたりのＢＫＶコピー数を測定することからなる。このＢＫＶコピー数は、当技術分野で記載されている標準的な方法に従って定量することができる。一般に、この測定値は、定量的ＰＣＲなどのＰＣＲ 技術を使用することにより得ることができる。
【0039】
・ＢＫＶウイルス量の評価
患者の血液および／または尿１ｍＬあたりのＢＫＶウイルス量は、国際勧告に従って総ての腎移植患者について日常的に測定される。しかし、ＢＫＶウイルス血症またはウイルス尿症を有する多くの患者はＢＫＶ Ｎｘを持っていないため、患者の血液および／または尿中のＢＫＶウイルス量の単独測定は、単独では、ＢＫＶ Ｎｘの診断マーカーにならないことを覚えておくことが重要である（図１、［９］）。従って、この測定値は、一部のチームが提案し得たように（［１０］）、それ自体で、ＢＫＶ Ｎｘの診断マーカーとして使用することを意図したものではない。この最後の研究（［１０］）は、少数の患者で行われたものであり、より大きな集団では確認されていない。さらに、血中ＢＫＶウイルス量では、ＢＫＶ Ｎｘを有する患者と、孤立性ＢＫＶを有する患者を確実に区別することはできなかった。実際、最近のメタ分析では、血液１ｍＬあたり１０４コピー以上のＢＫＶウイルス量がＢＫＶ Ｎｘ診断での陽性反応的中度５５％と関連していることが示された（［２６］）。図５は、本方法を開発するために本発明者らによって実証された血液および尿のＢＫＶウイルス量のレベルの違いを示すことによってこの概念を示している。さらに、従来技術と一致して、１０５より多い血中ＢＫＶウイルス量は、ほぼ１００％の感度でＢＫＶ Ｎｘと関連している可能性がある（［２６］）が、このパラメーターは、ＢＫＶ Ｎｘ診断時の移植片の腎実質損傷および重度の慢性機能不全にすでに関連しているため、時期を逃していることに注意することが重要である（図２ａ）。さらに、孤立性ＢＫＶウイルス血症を有する患者とＢＫＶ Ｎｘを有する患者の間に有意差がないという事実により、本発明の開発において尿中ＢＫＶウイルス量を考慮しなかった（図５ｂ）。
患者の血液および／または尿１ｍＬあたりのＢＫＶウイルス量は、国際勧告に従って総ての腎移植患者について日常的に測定される。しかし、ＢＫＶウイルス血症またはウイルス尿症を有する多くの患者はＢＫＶ Ｎｘを持っていないため、患者の血液および／または尿中のＢＫＶウイルス量の単独測定は、単独では、ＢＫＶ Ｎｘの診断マーカーにならないことを覚えておくことが重要である（図１、［９］）。従って、この測定値は、一部のチームが提案し得たように（［１０］）、それ自体で、ＢＫＶ Ｎｘの診断マーカーとして使用することを意図したものではない。この最後の研究（［１０］）は、少数の患者で行われたものであり、より大きな集団では確認されていない。さらに、血中ＢＫＶウイルス量では、ＢＫＶ Ｎｘを有する患者と、孤立性ＢＫＶを有する患者を確実に区別することはできなかった。実際、最近のメタ分析では、血液１ｍＬあたり１０４コピー以上のＢＫＶウイルス量がＢＫＶ Ｎｘ診断での陽性反応的中度５５％と関連していることが示された（［２６］）。図５は、本方法を開発するために本発明者らによって実証された血液および尿のＢＫＶウイルス量のレベルの違いを示すことによってこの概念を示している。さらに、従来技術と一致して、１０５より多い血中ＢＫＶウイルス量は、ほぼ１００％の感度でＢＫＶ Ｎｘと関連している可能性がある（［２６］）が、このパラメーターは、ＢＫＶ Ｎｘ診断時の移植片の腎実質損傷および重度の慢性機能不全にすでに関連しているため、時期を逃していることに注意することが重要である（図２ａ）。さらに、孤立性ＢＫＶウイルス血症を有する患者とＢＫＶ Ｎｘを有する患者の間に有意差がないという事実により、本発明の開発において尿中ＢＫＶウイルス量を考慮しなかった（図５ｂ）。
【0040】
好ましい一態様では、工程ａ）に使用される生物学的サンプルは、全血サンプル（血漿および血液の有形成分、すなわち赤血球、白血球および血小板を含む）または血漿サンプルである。
【0041】
この全血または血漿サンプルは、標準的な従来技術に従って処理することができた。
【0042】
なおより好ましい態様では、ＢＫＶウイルス量は、工程ａ）において、前記患者からの生物学的サンプル（例えば、全血または血漿）からの定量的ＰＣＲにより測定される。
【0043】
・ＢＫＶ血中ウイルス量の正規化
本発明の文脈において、血中ＢＫＶウイルス量の測定は、本発明の試験が実施される時点での患者の血流中のウイルスの定量のみを可能にする。工程ａ）において測定されたこのウイルス量値により、工程ｂ）において得られた抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答の強度を正規化して、個体間で比較可能な独立した指標を得ることができる。本発明者らは、ウイルス量を閾値（例えば、少なくとも４週間の間で１ｍＬあたりＤＮＡ ４ｌｏｇ１０コピー）（［９］）と比較することによって、従来技術で提案されているような予後診断マーカーとしてそれを使用しない。
本発明の文脈において、血中ＢＫＶウイルス量の測定は、本発明の試験が実施される時点での患者の血流中のウイルスの定量のみを可能にする。工程ａ）において測定されたこのウイルス量値により、工程ｂ）において得られた抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答の強度を正規化して、個体間で比較可能な独立した指標を得ることができる。本発明者らは、ウイルス量を閾値（例えば、少なくとも４週間の間で１ｍＬあたりＤＮＡ ４ｌｏｇ１０コピー）（［９］）と比較することによって、従来技術で提案されているような予後診断マーカーとしてそれを使用しない。
【0044】
より正確には、この工程は、患者の血液中でウイルス感染がないか、存在するかまたは異常に上昇しているかを明らかにして、サンプリング時の前記患者における抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答の強度に関して工程ｂ）において得られた結果を重み付けする。
【0045】
本発明の好ましい態様では、血液１ｍＬあたりのＢＫＶコピー固定値に対して、本発明の方法のパラメーターｂ）を正規化することが可能である。本方法の開発を可能にした結果から、血液１ｍＬあたりＢＫＶ １０３コピーの固定正規化値を、本発明の方法の計算においてウイルス学的パラメーターとして統合した。ＢＫＶ １０３コピーのこの正規化値は、孤立性ＢＫＶウイルス血症の病期次第できるだけ早くＢＫＶ Ｎｘのリスクを評価することができるように定義された（図５ａ）。ＢＫＶコピーの最高閾値は、ＢＫＶ Ｎｘの診断（図５ａ）および腎実質損傷（図２ａ）と関連し、時期を逃していた。
【0046】
しかし、この閾値は、本発明者らによって設定された正規化閾値にすぎず、他の値を使用して、パラメーターｂ)を、患者、患者グループなどの関数として正規化することができる。
【0047】
ＢＫＶウイルス量の閾値陽性値は、血液１ｍＬあたり２００コピーで設定され、例えば、３.７ｌｏｇ１０、４ｌｏｇ１０または４.２ｌｏｇ１０を正規化閾値として使用することができる（以前に文献で提案された閾値（［２６］）。
【0048】
従って、正規化されると、工程ｂ）の測定において得られた結果は、個体間で、または、同じ個体の異なる期間で比較することができる。この個体間の比較により、グループのリスクレベルに従って患者を分類することが可能であり、一方、個体内の比較により、同じ患者においてＢＫＶ Ｎｘを発症するリスクレベルの経時的進行のモニタリングが可能である。
【0049】
ｂ）工程ｂ：抗ＢＫＶメモリーＴ細胞応答の正規化強度の評価
この工程は、末梢血サンプルから、特定のＢＫＶペプチドによる刺激に応答したリンパ球増殖能を測定することにより所定の時間tでの抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答を評価することからなる。血液中のＢＫＶウイルス量に対するこの特異的免疫応答の正規化により、抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答の正規化強度を得ることができるため、個体内および個体間の比較が可能になる。
この工程は、末梢血サンプルから、特定のＢＫＶペプチドによる刺激に応答したリンパ球増殖能を測定することにより所定の時間tでの抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答を評価することからなる。血液中のＢＫＶウイルス量に対するこの特異的免疫応答の正規化により、抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答の正規化強度を得ることができるため、個体内および個体間の比較が可能になる。
【0050】
・抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答の評価
抗ＢＫＶメモリーＴ細胞（抗ＢＫＶ ＴＣｍ）は、ＢＫＶとの事前接触によってすでに活性化されているＢＫＶ抗原に特異的な免疫受容体（ＴＣＲ）を備えたＴ細胞である。これらのリンパ球は、一次ウイルス感染時にこのウイルスと遭遇したことの「記憶」を保持する。この記憶は、迅速で効果的な二次応答を発現することにより、このウイルスとの新たな接触時にリンパ球がよりよく反応することを可能にする。ヒトポリオーマウイルスの血清陽性率は世界的に非常に高く（ＢＫＶおよびＪＣＶについては成人年齢で８０～９０％）、これらのウイルスへの早期かつ広範囲の曝露に直面することに注意することが重要である。
抗ＢＫＶメモリーＴ細胞（抗ＢＫＶ ＴＣｍ）は、ＢＫＶとの事前接触によってすでに活性化されているＢＫＶ抗原に特異的な免疫受容体（ＴＣＲ）を備えたＴ細胞である。これらのリンパ球は、一次ウイルス感染時にこのウイルスと遭遇したことの「記憶」を保持する。この記憶は、迅速で効果的な二次応答を発現することにより、このウイルスとの新たな接触時にリンパ球がよりよく反応することを可能にする。ヒトポリオーマウイルスの血清陽性率は世界的に非常に高く（ＢＫＶおよびＪＣＶについては成人年齢で８０～９０％）、これらのウイルスへの早期かつ広範囲の曝露に直面することに注意することが重要である。
【0051】
この二次応答の性能は、単に抗ＢＫＶ ＴＣｍの量的増加によるものではない。新たな抗原接触時にすぐに動員できる、より高頻度の特定のクローンに、増殖能、サイトカイン分泌能および細胞傷害能の観点からそれらをナイーブ細胞と比較した場合に、これらの「記憶」細胞のより優れた機能が追加される。メモリーＴ細胞のこれらの性能の向上は、免疫応答に関与する遺伝子のプロモーターにおけるエピジェネティックな変化に関連している。
【0052】
従って、本発明の方法の工程ｂ）は、試験された患者の生物学的サンプル中に存在する抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答の強度を、特定のＢＫＶペプチドによる刺激に応答した抗ＢＫＶ ＴＣｍの増殖能を測定することおよび固定ＢＫＶウイルス量に対してこの応答を正規化すること（正規化強度）により評価することからなる。
【0053】
増殖能は、ＣＤ４およびＣＤ８メモリーＴ細胞応答の多機能性において極めて重要な要素であり、慢性ウイルス感染症の免疫機能不全時に失われる最初の機能の１つである。増殖能は、ＴＣＭおよびＴＳＣＭ（セントラルメモリーＴ細胞およびメモリー幹細胞）におけるＣＤ８メモリーＴ細胞の存在量を反映している。これらの細胞は、増殖、自己複製およびエフェクター細胞への分化について高い能力を有する。さらに、それらはエフェクター細胞の最適な機能に不可欠なヘルプシグナルを出す。
【0054】
従来技術で提案されているように、ＢＫＶペプチドの存在下で、患者の血液中に含まれるＴ細胞のサイトカイン分泌を測定することは問題ではない（［９］）。より正確には、［２２］で提案されているように、ＥＬＩＳＡまたはＥＬＩＳＰＯＴ技術によりＢＫＶ抗原ペプチド刺激に応答したインターフェロンγの分泌を測定することも問題ではなく、［２３］で提案されているように、ましてや移植前後の問題でもない。これらの従来技術では、免疫記憶を再構成するための能力の正確な評価はできない。実際、インターフェロン－γの分泌能により、メモリーエフェクターまたはターミナルエフェクタータイプのいわゆる「ターミナル」メモリー細胞亜集団を優先的に研究することが可能になる。これらの高度に分化したリンパ球亜集団は、自己複製、増殖またはリンパ球分化の能力があったとしてもほとんどなく、従って、抗ウイルス免疫記憶の再構成能力を最適に評価することはできない（［１３］、［１４］）。本発明の開発を可能にした結果に基づいて、本発明者らは、インターフェロン－γサイトカイン分泌単独の評価は、ＢＫＶウイルス血症を有する患者とＢＫＶ Ｎｘを有する患者を確実にかつ再現性よく区別するためのリンパ球機能の最適なパラメーターではないことを実証することができた（図６／１ａ）。
【0055】
リンパ球増殖は、最も識別力のある評価方法である（図６／１ｂ）。実際、増殖応答は、ＢＫＶ Ｎｘを有する患者では、他の３つの患者グループ（ＢＫＶ再活性化なし、ＢＫＶウイルス尿症および孤立性ＢＫＶウイルス血症（図６／１ｂ））と比較して有意に弱かった。これは、インターフェロン－γ分泌の評価による場合には当てはまらず、サイトカイン応答はＢＫＶ Ｎｘを有する患者とＢＫＶウイルス尿症患者の間では有意に弱かったが、ＢＫＶ Ｎｘを有する患者とＢＫＶウイルス血症患者の間ではそうではなかった（図６／１ａ）。さらに、抗ＢＫＶ ＴＣｍ増殖応答の強度（ＣＦＳＥ低（ｌｏｗ）Ｔ細胞数によって評価される（下記参照））は、血液中のＢＫＶウイルス量と負の相関があった（図７）。
【0056】
従って、本発明者らは、ＢＫＶに特異的な免疫記憶を再構成するための能力を評価するため、また、本発明の方法を開発するために、以前に使用された他の技術よりもリンパ球増殖の評価を支持した。
【0057】
・抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答の特定
好ましい態様では、工程ｂ）において使用される生物学的サンプルは全血サンプルである。なおより好ましくは、生物学的サンプルは、末梢静脈穿刺により無痛で患者から採取された全血サンプルである。
好ましい態様では、工程ｂ）において使用される生物学的サンプルは全血サンプルである。なおより好ましくは、生物学的サンプルは、末梢静脈穿刺により無痛で患者から採取された全血サンプルである。
【0058】
上で説明したように、患者がＢＫＶウイルスに感染している場合、このタイプの生物学的サンプルにはメモリーＴ細胞が自然に存在する。これらのメモリー細胞は、ＢＫＶウイルス抗原と（再び）接触するとすぐに反応する。
【0059】
特定の一態様では、生物学的サンプル中に存在する単核細胞は、標準的な細胞精製方法に従って分離される。それらは、フィコール－ハイパック勾配（または同等のもの）を使用することによって密度によりサンプルの他の成分から分離される。遠心分離後、低密度の細胞（リンパ球、単球／マクロファージ、樹状細胞および他の抗原提示細胞）はフィコールの上に浮遊し、一方、サンプルの他の総ての成分はペレットを形成する。次に、単核細胞をピペットで収集することができる。
【0060】
より具体的な態様では、全血単核細胞を、次に、ＢＫＶウイルス抗原の混合物（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ（登録商標）により販売されているＰｅｐＴｉｖａｔｏｒ（登録商標）ＢＫＶ ＶＰ１もしくはＰｅｐＴｉｖａｔｏｒ（登録商標）ＢＫＶ ＬＴ、または同等のもの、終濃度１μｇ／ｍＬ／ペプチド）で刺激する。好ましくは、患者間でのＨＬＡの違いを克服するために、重複ＢＫＶペプチド混合物を使用する。従って、サンプル中に存在する抗ＢＫＶ ＴＣｍは、これらの抗原と接触して活発に増殖する。この刺激は数日続く可能性がある（一般には４～７日、好ましくは５日）。
【0061】
従って、本発明の方法の工程ｂ）において測定される抗ＢＫＶ ＣＤ４＋またはＣＤ８＋ ＴＣｍ応答は、好ましくは、前記患者の末梢血からの単核細胞をＢＫＶウイルスペプチドと接触させ、数日の培養（一般には４～７日、好ましくは５日の培養）後に前記単核細胞中に存在するＴ細胞の増殖を評価することにより決定される。この増殖は、細胞分裂中に強度が低下する細胞分裂マーカー（ＣＦＳＥまたは同等のもの）の発現を検出することにより測定することができ、各娘細胞は、母細胞に含まれるマーカーの半数を含む。活発に増殖した抗ＢＫ ＴＣｍを特異的に特定するために、このリンパ球増殖は、前記患者の自発的Ｔ細胞増殖から差し引かれる（Ｔ細胞を同じ条件下、同じ時間で、ＢＫＶペプチドなしで培養したため）。
【0062】
いっそうより好ましくは、抗ＢＫＶ ＴＣｍの前記特異的増殖は、前記ペプチドの存在下での数日の培養（一般には４～７日、好ましくは５日の培養）後に存在するＣＦＳＥ（または同等の細胞分裂マーカー）を希釈したＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を決定し、それから、前記ペプチドの不在下、同じ時間でＣＦＳＥ（または同等の細胞分裂マーカー）を希釈したＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を差し引くことにより測定される。
【0063】
いっそうより好ましくは、抗ＢＫＶ ＣＤ４＋ ＴＣｍの前記特異的増殖は、前記ペプチドの存在下での培養においてＣＦＳＥ（または同等の細胞分裂マーカー）を希釈したＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を、同じ培養条件下であるが前記ペプチドなしで培養した、同じマーカーを希釈した前記リンパ球の割合と比較することにより測定される。
【0064】
いっそうより好ましくは、抗ＢＫＶ ＣＤ８＋ ＴＣｍの前記特異的増殖は、前記ペプチドの存在下での培養においてＣＦＳＥ（または同等の細胞分裂マーカー）を希釈したＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を、同じ培養条件下であるが前記ペプチドなしで培養した、同じマーカーを希釈した前記リンパ球の割合と比較することにより測定される。
【0065】
抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答の強度は、任意の標準的な増殖マーカー（ＣＦＳＥ、３ＴＨ、ＢＲＤＵまたは同等のものなど）を使用することにより測定することができる。
【0066】
次に、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋陽性Ｔ細胞は、市販の抗ＣＤ４抗体および抗ＣＤ８抗体を使用したフローサイトメトリーにより特定することができる。
【0067】
好ましい態様では、工程ｂ）は、当技術分野で公知の任意の従来の方法（例えば、ＰＡＮ ＢＩＯＴＥＣＨの細胞分離媒体、参照番号Ｐ０４－６０５０５、を使用）により精製された末梢血単核細胞を使用する。
【0068】
特定のＢＫＶ抗原刺激後に増殖したＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞は、特定の抗原刺激に応答し、メモリー細胞の典型的な増殖動態を示すため、「レスポンダー」または「機能的」メモリー細胞と呼ばれる。
【0069】
特定のＢＫＶペプチドの存在下での数日の培養（一般には４～７日、好ましくは５日の培養）後、増殖試験は、患者のサンプル中に最初に存在したＣＤ４＋またはＣＤ８＋抗ＢＫＶメモリーＴ細胞の数に関する情報を提供する。
【0070】
特定のペプチド刺激後、ＣＦＳＥを希釈したＴＣ（ＣＦＳＥ低ＴＣ）の割合は、前記サンプル中に最初に存在した機能的抗ＢＫＶ ＴＣｍの存在と関連している。ペプチド刺激の存在下で測定されたＣＦＳＥ低ＴＣの割合は、ＢＫＶペプチドの不在下で得られたＣＦＳＥ低ＴＣの割合を差し引くことによって補正される。
【0071】
図８／１は、特定のＢＫＶペプチドのプールに応答した抗ＢＫＶ ＴＣｍの増殖（ＣＦＳＥ低ＴＣの割合）の分析により抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答の特定プロトコールを示している。
【0072】
・抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答の正規化強度の評価
上記で得られたＣＦＳＥ低抗ＢＫＶ ＴＣｍの割合から、抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答の強度を、「正規化強度測定単位」に定量化することができる。
上記で得られたＣＦＳＥ低抗ＢＫＶ ＴＣｍの割合から、抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答の強度を、「正規化強度測定単位」に定量化することができる。
【0073】
「正規化強度測定単位」は、本明細書において、１０６個の全Ｔ細胞に対して表され、血液１ｍＬあたりＢＫＶ １０３コピーに対して正規化されたＣＦＳＥ低、抗ＢＫＶ ＴＣｍの割合であると定義される。
【0074】
実際には、この「正規化強度測定単位」は、上で得られた抗ＢＫＶ ＴＣｍの割合に１０,０００を掛け、次に、このように得られた数値を血液１ｍＬあたりＢＫＶ １０３コピーに対して正規化することにより得られる（工程ａにおいて測定された、試験中の患者の実際のウイルス量を考慮に入れる）。
【0075】
より明確に言えば、ＣＦＳＥ低抗ＢＫＶ ＴＣｍの（１０６個の全Ｔ細胞に対して表される）この割合は、血液１ｍＬあたり固定数のＢＫＶコピーに対して正規化され、従って、所与のウイルス量についての抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答の正規化強度を反映する。抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答強度のこの正規化により、個体内および個体間の比較が可能になる。
【0076】
図８／２は、抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答の正規化強度の評価の例である。
【0077】
例えば：
・リンパ球増殖により測定されたＣＦＳＥ低抗ＢＫＶ ＴＣｍの割合が、３.１２％である場合（ＢＫＶペプチドによる刺激後のＣＦＳＥ低ＴＣの割合＝３.２０％（前記ペプチドなしでは０.０８％） 図８／１ｅおよび８／２ａ：「ＢＫＶウイルス血症」の例）。
従って、
・１０６個の全Ｔ細胞に対して表されたＣＦＳＥ低Ｔリンパ球のこの割合は３１,２００（３.１２*１０,０００）である（図８／２ｂ－「ＢＫＶウイルス血症」の例）
・また、試験した患者のウイルス量が血液１ｍＬあたりＢＫＶ２×１０４コピーである場合（図８／２ｃ－「ＢＫＶウイルス血症」の例）、
・抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答の正規化強度測定単位は以下である：
［３１,２００*１×１０３］／２.０×１０４＝１５６０（図８／２ｄ－「ＢＫＶウイルス血症」の例）。
・リンパ球増殖により測定されたＣＦＳＥ低抗ＢＫＶ ＴＣｍの割合が、３.１２％である場合（ＢＫＶペプチドによる刺激後のＣＦＳＥ低ＴＣの割合＝３.２０％（前記ペプチドなしでは０.０８％） 図８／１ｅおよび８／２ａ：「ＢＫＶウイルス血症」の例）。
従って、
・１０６個の全Ｔ細胞に対して表されたＣＦＳＥ低Ｔリンパ球のこの割合は３１,２００（３.１２*１０,０００）である（図８／２ｂ－「ＢＫＶウイルス血症」の例）
・また、試験した患者のウイルス量が血液１ｍＬあたりＢＫＶ２×１０４コピーである場合（図８／２ｃ－「ＢＫＶウイルス血症」の例）、
・抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答の正規化強度測定単位は以下である：
［３１,２００*１×１０３］／２.０×１０４＝１５６０（図８／２ｄ－「ＢＫＶウイルス血症」の例）。
【0078】
各個体に固有の抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答のこの正規化強度測定単位は、閾値と比較される。本方法の開発を可能にした結果から、閾値１０２を、本発明の方法の計算において免疫学的パラメーターとして統合した。この閾値１０２は、ＢＫＶ Ｎｘを有する患者グループにおける抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答の正規化強度の分布の程度の関数として定義された（図９）。
【0079】
より明確に言えば、ＢＫＶ Ｎｘを有する患者は、孤立性ＢＫＶウイルス血症を有する患者と比較して、抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答の正規化強度を低く提示する（図９）。閾値１０２は、ＢＫＶ Ｎｘを有する患者グループにおいて、正規化された抗ＢＫＶ ＴＣｍ値の最大９０パーセンタイルを考慮に入れるために、この応答の強度の非ガウス分布の程度の関数として定義された（図９）。
【0080】
本発明の好ましい一態様では、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖だけが、工程ｂ）において測定され、これが制限されることなく、本発明者らは、ＣＤ４＋Ｔ細胞と比較してＣＤ８＋Ｔ細胞に基づきＢＫＶ Ｎｘを有する患者のよりよい識別を示すことができた（図１０）。この改善された効果は、実質内ＢＫＶ複製の制御においてＣＤ８＋Ｔ細胞により媒介される直接作用の重要性にある可能性がある（免疫学的観点から、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、効果的なＣＤ８＋応答の発達および維持に寄与するが、実際には、移植片に浸潤し、ＢＫＶに感染した細胞を破壊するのはＣＤ８＋Ｔ細胞である）。
【0081】
従って、この態様では、［工程ｂ）において測定され、１０６個の全ＣＤ８＋Ｔ細胞に対して表された］ＣＦＳＥ低ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合は、血液１ｍＬあたりＢＫＶ １０３コピーに対して正規化され、次に、以下の本発明の指標の特性化で説明されているように、ＢＫＶ Ｎｘのリスクのレベルに従って患者を分類するために閾値１０２と比較される。
【0082】
ＣＦＳＥ低抗ＢＫＶ ＴＣｍの割合の評価ならびにＢＫＶウイルス量の測定は、移植後のこれらのパラメーターの値の発展性から、患者の生涯を通じて繰り返されることが好ましい。
【0083】
ｃ）工程ｃ：ドナーとレシピエントの間でのＨＬＡ不適合数の測定
この工程は、腎移植のドナーとレシピエントの間でのＨＬＡ不適合数を測定することからなる。
この工程は、腎移植のドナーとレシピエントの間でのＨＬＡ不適合数を測定することからなる。
【0084】
・ドナーとレシピエントの間でのＨＬＡ不適合数の評価
ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）に相当する。これは、総ての細胞（白血球を含む）の表面に存在する特殊なタンパク質（抗原）とそれらをコードする遺伝子を指す。ＭＨＣは、抗原を提示する機能を果たし、Ｔ細胞による、その抗原特異的受容体（ＴＣＲ）を介した認識を可能にする。ＭＨＣの極端な多様性（遺伝子多型）は、実際、個体間の臓器移植の受け入れまたは拒絶の主要決定要因である。
ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）に相当する。これは、総ての細胞（白血球を含む）の表面に存在する特殊なタンパク質（抗原）とそれらをコードする遺伝子を指す。ＭＨＣは、抗原を提示する機能を果たし、Ｔ細胞による、その抗原特異的受容体（ＴＣＲ）を介した認識を可能にする。ＭＨＣの極端な多様性（遺伝子多型）は、実際、個体間の臓器移植の受け入れまたは拒絶の主要決定要因である。
【0085】
ＨＬＡタイピングは、個体の主要なＨＬＡ遺伝子と細胞表面上に存在する対応する抗原を特定する。このタイピングは、血清学的技法または分子技法により（ＰＣＲにより）実施することができる。
【0086】
各移植ドナー－レシピエントペアについて、「ＨＬＡ不適合数」は、当技術分野で記載されている標準的な方法に従って移植時に決定される。
【0087】
この不適合数は、レシピエントに対する異なるドナーＨＬＡ抗原（ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、－ＤＲ、－ＤＱ）の数である。それは移植の成功を大きく保証するため、腎移植の間に行われなければならない。移植拒絶のリスクを最小限に抑えるには、ドナーおよびレシピエントのＨＬＡ抗原をできるだけ近づけることが重要である。このような理由で、２０１６年に実施された死亡したドナーからの腎移植の総てにおいて、９０％を上回るレシピエントのドナーとのＨＬＡ不適合性が６未満であった［２８］。
【0088】
ＨＬＡ適合性を計算するためのルールはよく知られている。例えば、ドナーがＨＬＡ－Ａ３および－Ａ３３タイプであり、レシピエントがＨＬＡ－Ａ３３および－Ａ３３タイプである場合、ドナー／レシピエントペアはＨＬＡ－Ａにおいて１つの不適合性を有する。これに対して、ドナーがＨＬＡ－Ａ３３および－Ａ３３タイプであり、レシピエントがＨＬＡ－Ａ３および－Ａ３３タイプである場合、ＨＬＡ不適合性に数えられない。ＨＬＡ不適合性についてのこの計算方法は、科学文献において十分に説明されている。
【0089】
ＨＬＡ不適合性は、一般的に腎移植時に評価される。これは固定評価である（つまり、進展しない）。
【0090】
ＢＫＶウイルス再活性化およびＢＫＶ Ｎｘの発症に対するＨＬＡ不適合性の潜在的な影響は、いくつかの研究において記載されており、矛盾する結果になっている（特に［２９］参照）。これはおそらく、文献での異なるＢＫＶ再活性化（ウイルス尿症、ウイルス血症およびＢＫＶ Ｎｘの区別）に関する定義の不均一性により説明される。ＨＬＡ不適合性は血漿ＢＫＶ複製に関連している（［１６］、［１８］）が、ＢＫＶ Ｎｘの発症に対するそれらの影響は依然として不明なところが多いままである。これらの１つである、Awadalla Y. et al.（［１１］）は２００４年に、これらの腎症が高レベルのＨＬＡ不適合性と関連していることを示した。従って、これらの著者らは、ＨＬＡ不適合数を減らすことで、これらの腎症を発症するリスクが低減することを示唆した。この研究に関する重要なコメントは、この関連がＢＫＶ Ｎｘを有する患者において、ＢＫＶ Ｎｘのない患者のウイルス血症またはウイルス尿症の存在を特定せずに、ＢＫＶ Ｎｘのない患者と比較して文書化されたことである。逆に、つい最近の研究では、ドナーとレシピエントの間で良好なＨＬＡ適合性状況にあってもＢＫＶ Ｎｘの発生が報告されている（［１７］;［１９］）。最後に、他の著者らは、ＢＫＶ Ｎｘ患者において低レベルのＨＬＡ不適合性とより高い移植片喪失頻度との間に反比例の関係を見出した（［１５］）。
【0091】
本方法の開発を可能にした結果に基づき、本発明者らは、ＢＫＶ－Ｎｘを有する患者においてＨＬＡ不適合数がより少ないことを示した。ＢＫＶ Ｎｘを有する患者は、孤立性ＢＫＶウイルス血症を有する患者と比較して、全ＨＬＡ不適合数［ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、－ＤＲ、－ＤＱ］が少なかった（図１１ａ）。さらに、このＨＬＡ不適合数は、ＢＫＶウイルス量と負の相関があった（図１１ｂ）。
【0092】
これらの結果から、ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、－ＤＲおよび－ＤＱにおけるＨＬＡ不適合性５の閾値を、本発明の方法の計算において遺伝学的パラメーターとして統合した。この閾値５は、ＢＫＶウイルス血症を有する患者グループにおいて、ＨＬＡ不適合性の最大７５パーセンタイルを考慮に入れるために、ＨＬＡ不適合数の非ガウス分布の程度の関数として特定された（図１１ａ）。
【0093】
本発明の診断指標を計算するための結果の編集
上記の３つのパラメーターａ）、ｂ）およびｃ）が、患者がＢＫＶ Ｎｘを発症するリスクの層別化指標を作出するために、次いで編集される。従って、本発明者らは、本発明の方法を作出し、ＢＫＶ Ｎｘを発症するリスクを評価するために、３つのパラメーターａ）、ｂ）およびｃ）を単独で使用することではなく、むしろそれらを互いに組み合わせることを提案する。図１２は、本発明の方法に従ってこのＢＫＶ Ｎｘリスクを評価することにつながる総ての意思決定段階を示す。
上記の３つのパラメーターａ）、ｂ）およびｃ）が、患者がＢＫＶ Ｎｘを発症するリスクの層別化指標を作出するために、次いで編集される。従って、本発明者らは、本発明の方法を作出し、ＢＫＶ Ｎｘを発症するリスクを評価するために、３つのパラメーターａ）、ｂ）およびｃ）を単独で使用することではなく、むしろそれらを互いに組み合わせることを提案する。図１２は、本発明の方法に従ってこのＢＫＶ Ｎｘリスクを評価することにつながる総ての意思決定段階を示す。
【0094】
実際、以下の実施例および図１２および１３に記載されるように、ＢＫＶ Ｎｘ発症リスクが高い患者とそれを発症しない患者との区別を可能にする本発明の３つのパラメーターの組合せから定義される閾値がある。
【0095】
本発明の実施例において使用されたコホートに基づき、これらの閾値は以下である：
・ＨＬＡ不適合数については５および
・抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答については正規化強度測定単位１０２。
・ＨＬＡ不適合数については５および
・抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答については正規化強度測定単位１０２。
【0096】
従って、本発明者らは、全ＨＬＡ不適合数５以下に関連する抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答の正規化強度１０２以下が、移植を受ける患者が短期的、中期的または長期的にいつかＢＫＶ Ｎｘを発症するリスクが高いことを反映することを実証した（図１３－濃灰色面）。
【0097】
逆に、厳密には５より大きい全ＨＬＡ不適合数に関連する厳密には１０２より大きい抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答の正規化強度は、移植を受ける患者が短期的、中期的または長期的にいつかＢＫＶ Ｎｘを発症するリスクが非常に低いことを反映する（図１３－白色面）。
【0098】
本願の実施例において使用されたコホートの断面解析では、抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答の正規化強度１０２以下かつ全ＨＬＡ不適合数５以下を有する患者の１００％がＢＫＶ Ｎｘを有していた（図１３、濃灰色面）。逆に、抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答の正規化強度が１０２より大きくかつ全ＨＬＡ不適合数が５より大きい患者でＢＫＶ Ｎｘを有する患者はいなかった（図１３、白色面）。
【0099】
これらの閾値（ＨＬＡ不適合数については５および抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答の正規化強度測定単位については１０２）は、本発明を開発するために研究されたコホートの特定のケースから確立された。これらの閾値は、長期的に追跡されたより大きなコホートの結果に応じて、進化しかつ／または精緻化し得る。本発明者らは、より一般には、そのような集団の特定の特徴を考慮するために、本発明の方法を適合させ得る。具体的には、本発明の指標を得るために、本発明者らは、上記の３つのパラメーターａ）、ｂ）およびｃ）の値を研究し、それらを組み合わせ、そのような集団の分析から得られた結果および図式方式（図１２および１３の形式の図式方式）に従って適当な閾値および適当な正規化値を特定することが可能である。
【0100】
研究されたコホートの特定のケースでは、２７名以上の腎移植患者（ＢＫＶウイルス血症を有する患者１１人およびＢＫＶ Ｎｘ患者１６人を含む）に対して実施された分析に基づき、本発明者らによって３つのリスクレベルが特定された：
・ＢＫＶ Ｎｘリスク高レベル 抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答の正規化強度が１０２以下でありかつ全ＨＬＡ不適合数が５以下である場合（図１３－濃灰色面）。このリスクレベルは、ＢＫＶ Ｎｘのリスク増大を支持する。強い免疫抑制はＢＫＶ Ｎｘのリスク因子であるため、このリスクレベルは、免疫抑制の実質的軽減とウイルス量および腎機能の綿密なモニタリングを主張する。
・ＢＫＶ Ｎｘリスク中間レベル 抗ＢＫＶ応答の正規化強度が１０２以下でありかつ全ＨＬＡ不適合数が５より大きい場合（図１３－右下の薄灰色面）または抗ＢＫＶ応答の正規化強度が１０２より大きくかつ全ＨＬＡ不適合数が５以下である場合（図１３－左上の薄灰色面）。このリスクレベルは、ＢＫＶ Ｎｘリスクの中間レベルとみなされるべきである。
・ＢＫＶ Ｎｘリスク低レベル 抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答の正規化強度が１０２より大きくかつ全ＨＬＡ不適合数が５より大きい場合（図１３－白色面）。このリスクレベルは、ＢＫＶ Ｎｘの低リスクを支持する。この状況では、ウイルス量および腎機能の監視が推奨されるべきである。免疫抑制は維持またはわずかに軽減し得る。
・ＢＫＶ Ｎｘリスク高レベル 抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答の正規化強度が１０２以下でありかつ全ＨＬＡ不適合数が５以下である場合（図１３－濃灰色面）。このリスクレベルは、ＢＫＶ Ｎｘのリスク増大を支持する。強い免疫抑制はＢＫＶ Ｎｘのリスク因子であるため、このリスクレベルは、免疫抑制の実質的軽減とウイルス量および腎機能の綿密なモニタリングを主張する。
・ＢＫＶ Ｎｘリスク中間レベル 抗ＢＫＶ応答の正規化強度が１０２以下でありかつ全ＨＬＡ不適合数が５より大きい場合（図１３－右下の薄灰色面）または抗ＢＫＶ応答の正規化強度が１０２より大きくかつ全ＨＬＡ不適合数が５以下である場合（図１３－左上の薄灰色面）。このリスクレベルは、ＢＫＶ Ｎｘリスクの中間レベルとみなされるべきである。
・ＢＫＶ Ｎｘリスク低レベル 抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答の正規化強度が１０２より大きくかつ全ＨＬＡ不適合数が５より大きい場合（図１３－白色面）。このリスクレベルは、ＢＫＶ Ｎｘの低リスクを支持する。この状況では、ウイルス量および腎機能の監視が推奨されるべきである。免疫抑制は維持またはわずかに軽減し得る。
【0101】
研究されたコホートの特定のケースでは、この指標は以下の優れた技術特性を示している：
・方法の結果がＢＫＶ Ｎｘリスク高レベルである場合、陽性反応的中度１００％（試験が陽性である場合のＢＫＶ Ｎｘの確率）、
・方法の結果がＢＫＶ Ｎｘリスク低レベルである場合、陰性反応的中度１００％（試験が陰性である場合のＢＫＶ Ｎｘ不存在の確率）、
・方法の結果がＢＫＶ Ｎｘリスク中間レベルである場合、６０％以上の感度（ＢＫＶ Ｎｘの場合は陽性試験の確率）、
・方法がＢＫＶ Ｎｘリスク高レベルを示す場合、偽陽性率ゼロ（陽性試験は、抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答の正規化強度が１０２以下でありかつ全ＨＬＡ不適合数が５以下であることにより定義される）。
・方法の結果がＢＫＶ Ｎｘリスク高レベルである場合、陽性反応的中度１００％（試験が陽性である場合のＢＫＶ Ｎｘの確率）、
・方法の結果がＢＫＶ Ｎｘリスク低レベルである場合、陰性反応的中度１００％（試験が陰性である場合のＢＫＶ Ｎｘ不存在の確率）、
・方法の結果がＢＫＶ Ｎｘリスク中間レベルである場合、６０％以上の感度（ＢＫＶ Ｎｘの場合は陽性試験の確率）、
・方法がＢＫＶ Ｎｘリスク高レベルを示す場合、偽陽性率ゼロ（陽性試験は、抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答の正規化強度が１０２以下でありかつ全ＨＬＡ不適合数が５以下であることにより定義される）。
【0102】
従って、本発明の指標は、ＢＫＶの血中ウイルス量の関数としてのＢＫＶ Ｎｘのリスクの評価について、文献に通常記載されているものよりも高い陽性反応的中度（５５％に対して１００％）を有するだけでなく、方法がＢＫＶ Ｎｘリスク高レベルを示す場合、偽陽性率はゼロである。表１は、ＢＫＶ Ｎｘのリスクの予測に関連する種々の試験の性能を示した（本発明の方法に対してＢＫＶの血中ウイルス量の関数として）。
【0103】
【表1】
【0104】
従って、本発明の方法は、好ましくは、以下の場合に、ＢＫウイルス（ＢＫＶ）腎症を発症するリスクが高いと診断されることを特徴とする：
ａ）血液１ｍＬあたりＢＫＶウイルス１０３コピーのウイルス量に関連して、
ｂ）抗ＢＫＶ ＣＤ４＋またはＣＤ８＋ ＴＣｍ応答の正規化強度が１００強度測定単位以下であり、かつ
ｃ）前記患者と移植された腎臓のドナーとの間での不適合数が５以下である。
ａ）血液１ｍＬあたりＢＫＶウイルス１０３コピーのウイルス量に関連して、
ｂ）抗ＢＫＶ ＣＤ４＋またはＣＤ８＋ ＴＣｍ応答の正規化強度が１００強度測定単位以下であり、かつ
ｃ）前記患者と移植された腎臓のドナーとの間での不適合数が５以下である。
【0105】
また、本発明の方法は、好ましくは、以下の場合に、ＢＫＶウイルス（ＢＫＶ）腎症を発症するリスクが高いと診断されることを特徴とする：
ａ）血液１ｍＬあたりＢＫＶウイルス１０３コピーのウイルス量に関連して、
ｂ）抗ＢＫＶ ＣＤ４＋またはＣＤ８＋ ＴＣｍの正規化強度が厳密には１００強度測定単位より大きく、かつ
ｃ）前記患者と移植された腎臓のドナーとの間でのＨＬＡ不適合数が厳密には５より大きい。
ａ）血液１ｍＬあたりＢＫＶウイルス１０３コピーのウイルス量に関連して、
ｂ）抗ＢＫＶ ＣＤ４＋またはＣＤ８＋ ＴＣｍの正規化強度が厳密には１００強度測定単位より大きく、かつ
ｃ）前記患者と移植された腎臓のドナーとの間でのＨＬＡ不適合数が厳密には５より大きい。
【0106】
本発明の指標の診断的および予後診断的使用。
本発明の方法は、侵襲的ではないため、リスクがある患者（一般には、腎移植を受けた患者）において必要に応じて何度でも再現し得る。その頻度は、各患者のプロファイルに従って、または先行する試験の結果を考慮して個別化し得る。さらに、この指標の結果を使用して、免疫抑制治療の用量を上方または下方へ個別に調整することが可能になる。治療の軽減は、ＢＫＶ Ｎｘ患者またはそれを発症するリスクが高い患者にのみ指示される。この軽減が移植に有益ではないかまたは有害でさえある患者（一般には、腎移植が関与しない孤立性ＢＫＶウイルス血症を有する患者）が特定され、最初に指示された治療を維持することができる。
・腎移植を受けた各患者に対して、一定の時間間隔で本発明の方法を実施することが奨励される。この再現は以下の可能性がある：
・ＢＫＶ Ｎｘの診断に役立つ
・ＢＫＶ Ｎｘを発症するリスクレベルを個別に特定して、そのような合併症の発生を防ぐ。
・患者の治療的免疫抑制を評価し、特に、免疫抑制治療の調整を誘導して、治療的免疫抑制の不足または過剰を防ぐ。
本発明の方法は、侵襲的ではないため、リスクがある患者（一般には、腎移植を受けた患者）において必要に応じて何度でも再現し得る。その頻度は、各患者のプロファイルに従って、または先行する試験の結果を考慮して個別化し得る。さらに、この指標の結果を使用して、免疫抑制治療の用量を上方または下方へ個別に調整することが可能になる。治療の軽減は、ＢＫＶ Ｎｘ患者またはそれを発症するリスクが高い患者にのみ指示される。この軽減が移植に有益ではないかまたは有害でさえある患者（一般には、腎移植が関与しない孤立性ＢＫＶウイルス血症を有する患者）が特定され、最初に指示された治療を維持することができる。
・腎移植を受けた各患者に対して、一定の時間間隔で本発明の方法を実施することが奨励される。この再現は以下の可能性がある：
・ＢＫＶ Ｎｘの診断に役立つ
・ＢＫＶ Ｎｘを発症するリスクレベルを個別に特定して、そのような合併症の発生を防ぐ。
・患者の治療的免疫抑制を評価し、特に、免疫抑制治療の調整を誘導して、治療的免疫抑制の不足または過剰を防ぐ。
【0107】
好ましい態様では、本発明の方法は、前記患者に投与される免疫抑制治療の投薬量と同時に実施される。ＢＫＶ Ｎｘのリスクが高いと結論付けた試験は、免疫抑制治療の軽減を支持して、その発生を防ぐであろう。
【0108】
いっそうより好ましい態様では、本発明の方法は、移植後の治療中に数回、例えば、ＢＫＶ Ｎｘを発症するリスクがある患者（ウイルス血症を有しかつ／または移植拒絶治療を受けかつ／または原因不明の腎移植片機能低下を有する患者）の集団において３～６か月ごとに繰り返される。
【0109】
ＢＫＶウイルス血症を提示する総ての患者における日常的な性能に加えて、以下の状況で本発明の方法を行うことが奨励される：
・移植拒絶の治癒的治療との関連においての治療強化中に、その後のＢＫＶ Ｎｘ発生リスクを評価するために。
・最初の陽性試験後の免疫抑制の軽減中に、抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答に対するこの軽減の影響を評価するために。
・原因不明の腎移植片機能低下の場合に、ＢＫＶ Ｎｘのリスクを評価しかつ／またはＢＫＶ Ｎｘの診断を支援するために。
・移植拒絶の治癒的治療との関連においての治療強化中に、その後のＢＫＶ Ｎｘ発生リスクを評価するために。
・最初の陽性試験後の免疫抑制の軽減中に、抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答に対するこの軽減の影響を評価するために。
・原因不明の腎移植片機能低下の場合に、ＢＫＶ Ｎｘのリスクを評価しかつ／またはＢＫＶ Ｎｘの診断を支援するために。
【0110】
本発明の方法は、免疫抑制治療の変更後２～３か月で実施され得る。本発明の方法の結果は、免疫応答が発生した場合、患者において免疫抑制治療を再び増加させるための時間を定めるのに役立ち得る。
【0111】
図１４は、本発明の方法の種々の適応症、ならびに前記方法を繰り返すための期間を示す。
【0112】
従って、図１５は、ＢＫＶ Ｎｘのリスクを評価するために提案されたアプローチを示している。この新規なアプローチは、最初はＢＫＶウイルス量の陽性の閾値（血液１ｍＬあたり２００コピー以上）からの患者の血液中のＢＫＶウイルス量の長期的モニタリングに基づく。ＢＫＶ Ｎｘの通常のアプローチ（図３）とは異なり、この新規なアプローチは、腎移植生検を実施することによるのではなく、本発明の方法を使用することによって調整される。本方法の適用は、血液ＢＫＶ再活性化を有する腎移植患者においてＢＫＶ Ｎｘのリスクレベルを層別化することを可能にする。これが制限されることなく、実際には、ＢＫＶ ＮＸのリスクが中程度から高いと評価された患者だけが免疫抑制治療を最小限に抑えられる。ＢＫＶ Ｎｘのリスクが低い患者は、免疫抑制治療を最小限に抑えられない。総ての場合において、ＢＫＶウイルス量の定期的なモニタリングと前記方法の繰り返しもまた推奨される。本発明は、腎移植片機能不全の前にＢＫＶ Ｎｘのリスクの評価を可能にする。それにより、時間が節約され、また、ＢＫＶ Ｎｘリスクの効果的な層別化が可能になり、最終的には治療的免疫抑制の誘導に役立つ（図１５）。
【0113】
本願はまた、免疫抑制治療の変更後のＢＫＶの血液複製に対する腎移植患者の応答のイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）評価方法であって、移植後に一定の時間間隔で上記の方法（本発明の指標）を繰り返すことを特徴とする方法に関する。
【0114】
好ましくは、本発明の方法を各治療変更の前および後に繰り返す。
【0115】
好ましくは、本発明の方法を、血漿ＢＫＶ再活性化のレベルおよび／または前記患者の免疫抑制治療を変更する必要性に応じた頻度で、およそ３～６か月ごとに繰り返す。
【0116】
腎移植で現在使用されている免疫抑制治療は、例えば、以下である：
・腎移植の初期の、高用量コルチコステロイドとポリクローナル抗リンパ球抗体（抗ヒト胸腺細胞免疫グロブリン、サイモグロブリン（登録商標）またはグラファロン（登録商標））または抗ＣＤ２５モノクローナル抗体（バシリキシマブ、シムレクト（登録商標））を組み合わせた誘導治療；
・誘導治療のフォローアップとして、以下を組み合わせた維持治療
・低用量コルチコセラピー、
・カルシニュリン阻害剤（タクロリムス、プログラフ（登録商標）またはシクロスポリン、ネオーラル（登録商標））およびプリン塩基合成阻害剤（ミコフェノール酸モフェチル、セルセプト（登録商標））、
・あるいはｍＴＯＲ経路阻害剤（エベロリムス、サーティカン（登録商標））またはＣＴＬＡ４－Ｉｇ（ベラタセプト、Ｎｕｌｏｊｉｘ（登録商標））などの分子［１］。
・腎移植の初期の、高用量コルチコステロイドとポリクローナル抗リンパ球抗体（抗ヒト胸腺細胞免疫グロブリン、サイモグロブリン（登録商標）またはグラファロン（登録商標））または抗ＣＤ２５モノクローナル抗体（バシリキシマブ、シムレクト（登録商標））を組み合わせた誘導治療；
・誘導治療のフォローアップとして、以下を組み合わせた維持治療
・低用量コルチコセラピー、
・カルシニュリン阻害剤（タクロリムス、プログラフ（登録商標）またはシクロスポリン、ネオーラル（登録商標））およびプリン塩基合成阻害剤（ミコフェノール酸モフェチル、セルセプト（登録商標））、
・あるいはｍＴＯＲ経路阻害剤（エベロリムス、サーティカン（登録商標））またはＣＴＬＡ４－Ｉｇ（ベラタセプト、Ｎｕｌｏｊｉｘ（登録商標））などの分子［１］。
【0117】
本発明の方法によりＢＫＶ Ｎｘを発症する有意なリスクが検出された場合には、治療管理は免疫抑制の軽減、または場合により治療の変更につながるはずである。
【0118】
本発明によるキット
別の側面によれば、本発明は、前述の方法を全血において実施するためのキットに関する。
別の側面によれば、本発明は、前述の方法を全血において実施するためのキットに関する。
【0119】
このキットは、例えば、以下を含む:
ａ）ＢＫＶ定量的ＰＣＲを行うための試薬、および
ｂ）上記の免疫学的方法を全血に対して行うための試薬。
ａ）ＢＫＶ定量的ＰＣＲを行うための試薬、および
ｂ）上記の免疫学的方法を全血に対して行うための試薬。
【0120】
好ましくは、前記キットは、ＢＫＶゲノムの一部を増幅するための特異的プライマー、および所望により、ＤＮＡ抽出を伴う定量的ＰＣＲを行うために必要な試薬（ｄＮＴＰ、酵素、バッファー、プローブおよび標準）を含む。
【0121】
これらのプライマーは、例えば、ＢＫＶウイルスゲノム内の２８１ヌクレオチドの配列を増幅する配列番号１（ＣＡＴＡＧＣＡＴＧＣＡＡＧＧＧＣＡＧＴＧ）および配列番号２（ＧＡＧＣＴＧＣＣＴＧＧＧＧＡＡＡＴＣＴＴ）である。
【0122】
ＰＣＲ反応の特異性を高めるためにプローブを含めることが可能である。そのようなプローブは、例えば、配列番号３の配列（ＴＡＧＧＣＣＡＴＴＣＣＴＴＧＣＡＧＴＡＣ）を有する。
【0123】
好ましくは、前記キットは、リンパ球刺激に必要な試薬、例えば、所望により、刺激剤を含む細胞培養チューブ（例えば、ブドウ球菌内毒素Ｂ（ＳＥＢ）またはフィトヘマグルチニンＰ（ＰＨＡ）、ホルボール１２－ミリスタート１３－アセタート（ＰＭＡ）－イオノマイシンのようなリンパ球刺激のためのＢＫＶペプチド配列またはポリクローナルペプチド配列）、および所望により、リンパ球標識に必要な試薬（例えば、Ｋｉ６７またはＣＦＳＥタイプのリンパ球増殖の核マーカー、ＲＢＣ溶解バッファータイプの赤血球溶解液および／または７０％エタノール）を含む。
【0124】
好ましくは、本発明のキットは、以下を含む：
ａ）ＢＫＶゲノムの一部を増幅するための特異的プライマー（ＢＫＶウイルス検出キットで提供されるものなど）、ならびに
ｂ）ＢＫＶペプチド配列および／またはポリクローナルリンパ球刺激ペプチド配列、好ましくは、ＰｅｐＴｉｖａｔｏｒ（登録商標）ＢＫＶ ＶＰ１またはＰｅｐＴｉｖａｔｏｒ（登録商標）ＢＫＶ ＬＴ（１１アミノ酸で重複する１５量体ペプチド）などの重複ペプチドの混合物、
ならびに、所望により、上記のような
ｃ）ＤＮＡ抽出を伴う定量的ＰＣＲを行うために必要な試薬あるいは
ｄ）リンパ球標識に必要な試薬。
ａ）ＢＫＶゲノムの一部を増幅するための特異的プライマー（ＢＫＶウイルス検出キットで提供されるものなど）、ならびに
ｂ）ＢＫＶペプチド配列および／またはポリクローナルリンパ球刺激ペプチド配列、好ましくは、ＰｅｐＴｉｖａｔｏｒ（登録商標）ＢＫＶ ＶＰ１またはＰｅｐＴｉｖａｔｏｒ（登録商標）ＢＫＶ ＬＴ（１１アミノ酸で重複する１５量体ペプチド）などの重複ペプチドの混合物、
ならびに、所望により、上記のような
ｃ）ＤＮＡ抽出を伴う定量的ＰＣＲを行うために必要な試薬あるいは
ｄ）リンパ球標識に必要な試薬。
【0125】
さらに、そのキットは、ＨＬＡ不適合数およびＢＫＶ Ｎｘリスク指標の自動計算をするためのコンピュータソフトウエアの参照を提供し得る。
【0126】
このキットは、ＢＫＶ Ｎｘを発症するリスクの定量化された指標を得るために、本発明の方法を医療病院および／または民間の分析研究所で実施するために使用される。
本発明は以下の通りである。
［１］腎移植を受けた患者におけるＢＫウイルス（ＢＫＶ）腎症を発症するリスクの評価方法であって、下記の工程を含んでなる、方法：
ａ）前記患者の生物学的サンプル中のＢＫＶのウイルス量を測定する工程、
ｂ）前記患者からの生物学的サンプル中のＢＫＶウイルスに特異的なＣＤ４ ＋ またはＣＤ８ ＋ メモリーＴ細胞応答の正規化された強度を測定する工程（前記正規化は、工程ａ）において測定されたＢＫＶウイルス量に対して実行される）、ならびに
ｃ）腎臓ドナーと前記患者のＨＬＡ ＩおよびＩＩの間での不適合数を決定する工程。
［２］前記３つのパラメーターａ）、ｂ）およびｃ）が、前記患者がＢＫウイルス腎症を発症するリスクの層別化指標を作出するために、次いで編集される、上記［１］に記載の方法。
［３］前記ＢＫＶウイルス量が、工程ａ）において、前記患者からの全血または血漿のサンプルからの定量的ＰＣＲにより測定される、上記［１］または［２］に記載の方法。
［４］工程ｂ）において測定されたＢＫＶ特異的ＣＤ４ ＋ またはＣＤ８ ＋ メモリーＴ細胞の応答が、前記患者からの末梢血単核細胞をＢＫＶウイルスペプチドと接触させることにより、および前記単核細胞に存在するＴ細胞の増殖を４～７日の培養後、一般には５日の培養後に評価することにより決定される、上記［１］、［２］または［３］に記載の方法。
［５］前記増殖が、前記ペプチドの存在下で４～７日の培養後、一般には５日の培養後にＣＦＳＥなどの増殖マーカーを希釈したＣＤ４ ＋ Ｔ細胞の割合を決定することにより測定される、上記［４］に記載の方法。
［６］前記増殖が、前記ペプチドの存在下で４～７日の培養後、一般には５日の培養後にＣＦＳＥなどの増殖マーカーを希釈したＣＤ８ ＋ Ｔ細胞の割合を決定することにより測定される、上記［４］に記載の方法。
［７］上記［１］～［６］のいずれかに記載の方法であって、下記の場合にＢＫウイルス（ＢＫＶ）腎症の発症リスクが高いと結論付けられる、方法：
ａ）血液１ｍＬあたりＢＫウイルス１０ ３ コピーのウイルス量に関連して、
ｂ）ＢＫＶに特異的なＣＤ４ ＋ またはＣＤ８ ＋ メモリーＴ細胞応答の前記正規化された強度が１００強度測定単位以下であり、かつ
ｃ）前記患者と移植された腎臓のドナーとの間での不適合数が５以下である。
［８］上記［１］～［７］のいずれかに記載の方法であって、下記の場合にＢＫウイルス（ＢＫＶ）腎症の発症リスクが低いと結論付けられる、方法：
ａ）血液１ｍＬあたりＢＫウイルス１０ ３ コピーのウイルス量に関連して、
ｂ）ＢＫＶに特異的なＣＤ４ ＋ またはＣＤ８ ＋ メモリーＴ細胞応答の前記正規化された強度が厳密には１００強度測定単位より大きく、かつ
ｃ）前記患者と移植ドナーとの間での不適合数が厳密には５より大きい。
［９］免疫抑制治療の変更後のＢＫＶの血液複製に対する腎移植患者の応答のイン・ビトロ評価方法であって、移植後に一定の時間間隔で上記［１］～［８］に記載の方法を繰り返すことを特徴とする、方法。
［１０］上記［１］～［８］に記載の方法を各治療変更の前および後に繰り返す、上記［９］に記載の方法。
［１１］上記［１］～［８］に記載の方法をおよそ３～６か月ごとに繰り返す、上記［９］に記載の方法。
［１２］上記［１］～［１１］に記載の方法を全血において実施することができ、また、実施するように設計されたキットであって、下記を含む、キット：
ａ）ＢＫウイルス定量的ＰＣＲを行うための試薬、および
ｂ）上記［４］～［６］に記載の免疫学的方法を全血に対して行うための試薬。
［１３］前記試薬ｂ）が、ＢＫＶペプチド配列またはポリクローナルリンパ球刺激ペプチド配列および、所望により、リンパ球標識試薬を含む、上記［１２］に記載のキット。
［１４］下記を含む、上記［１２］に記載のキット：
ａ）ＢＫＶゲノムの一部を増幅するための特異的プライマー、ならびに
ｂ）ＢＫＶペプチド配列、好ましくは、ＰｅｐＴｉｖａｔｏｒ（登録商標）ＢＫＶ ＶＰ１もしくはＰｅｐＴｉｖａｔｏｒ（登録商標）ＢＫＶ ＬＴなどの重複ペプチドの混合物および／またはポリクローナルリンパ球刺激ペプチド配列、
ならびに、所望により、
ｃ）ＤＮＡ抽出を伴う定量的ＰＣＲを行うために必要な試薬ならびに／あるいは
ｄ）リンパ球標識のための試薬。
本発明は以下の通りである。
［１］腎移植を受けた患者におけるＢＫウイルス（ＢＫＶ）腎症を発症するリスクの評価方法であって、下記の工程を含んでなる、方法：
ａ）前記患者の生物学的サンプル中のＢＫＶのウイルス量を測定する工程、
ｂ）前記患者からの生物学的サンプル中のＢＫＶウイルスに特異的なＣＤ４ ＋ またはＣＤ８ ＋ メモリーＴ細胞応答の正規化された強度を測定する工程（前記正規化は、工程ａ）において測定されたＢＫＶウイルス量に対して実行される）、ならびに
ｃ）腎臓ドナーと前記患者のＨＬＡ ＩおよびＩＩの間での不適合数を決定する工程。
［２］前記３つのパラメーターａ）、ｂ）およびｃ）が、前記患者がＢＫウイルス腎症を発症するリスクの層別化指標を作出するために、次いで編集される、上記［１］に記載の方法。
［３］前記ＢＫＶウイルス量が、工程ａ）において、前記患者からの全血または血漿のサンプルからの定量的ＰＣＲにより測定される、上記［１］または［２］に記載の方法。
［４］工程ｂ）において測定されたＢＫＶ特異的ＣＤ４ ＋ またはＣＤ８ ＋ メモリーＴ細胞の応答が、前記患者からの末梢血単核細胞をＢＫＶウイルスペプチドと接触させることにより、および前記単核細胞に存在するＴ細胞の増殖を４～７日の培養後、一般には５日の培養後に評価することにより決定される、上記［１］、［２］または［３］に記載の方法。
［５］前記増殖が、前記ペプチドの存在下で４～７日の培養後、一般には５日の培養後にＣＦＳＥなどの増殖マーカーを希釈したＣＤ４ ＋ Ｔ細胞の割合を決定することにより測定される、上記［４］に記載の方法。
［６］前記増殖が、前記ペプチドの存在下で４～７日の培養後、一般には５日の培養後にＣＦＳＥなどの増殖マーカーを希釈したＣＤ８ ＋ Ｔ細胞の割合を決定することにより測定される、上記［４］に記載の方法。
［７］上記［１］～［６］のいずれかに記載の方法であって、下記の場合にＢＫウイルス（ＢＫＶ）腎症の発症リスクが高いと結論付けられる、方法：
ａ）血液１ｍＬあたりＢＫウイルス１０ ３ コピーのウイルス量に関連して、
ｂ）ＢＫＶに特異的なＣＤ４ ＋ またはＣＤ８ ＋ メモリーＴ細胞応答の前記正規化された強度が１００強度測定単位以下であり、かつ
ｃ）前記患者と移植された腎臓のドナーとの間での不適合数が５以下である。
［８］上記［１］～［７］のいずれかに記載の方法であって、下記の場合にＢＫウイルス（ＢＫＶ）腎症の発症リスクが低いと結論付けられる、方法：
ａ）血液１ｍＬあたりＢＫウイルス１０ ３ コピーのウイルス量に関連して、
ｂ）ＢＫＶに特異的なＣＤ４ ＋ またはＣＤ８ ＋ メモリーＴ細胞応答の前記正規化された強度が厳密には１００強度測定単位より大きく、かつ
ｃ）前記患者と移植ドナーとの間での不適合数が厳密には５より大きい。
［９］免疫抑制治療の変更後のＢＫＶの血液複製に対する腎移植患者の応答のイン・ビトロ評価方法であって、移植後に一定の時間間隔で上記［１］～［８］に記載の方法を繰り返すことを特徴とする、方法。
［１０］上記［１］～［８］に記載の方法を各治療変更の前および後に繰り返す、上記［９］に記載の方法。
［１１］上記［１］～［８］に記載の方法をおよそ３～６か月ごとに繰り返す、上記［９］に記載の方法。
［１２］上記［１］～［１１］に記載の方法を全血において実施することができ、また、実施するように設計されたキットであって、下記を含む、キット：
ａ）ＢＫウイルス定量的ＰＣＲを行うための試薬、および
ｂ）上記［４］～［６］に記載の免疫学的方法を全血に対して行うための試薬。
［１３］前記試薬ｂ）が、ＢＫＶペプチド配列またはポリクローナルリンパ球刺激ペプチド配列および、所望により、リンパ球標識試薬を含む、上記［１２］に記載のキット。
［１４］下記を含む、上記［１２］に記載のキット：
ａ）ＢＫＶゲノムの一部を増幅するための特異的プライマー、ならびに
ｂ）ＢＫＶペプチド配列、好ましくは、ＰｅｐＴｉｖａｔｏｒ（登録商標）ＢＫＶ ＶＰ１もしくはＰｅｐＴｉｖａｔｏｒ（登録商標）ＢＫＶ ＬＴなどの重複ペプチドの混合物および／またはポリクローナルリンパ球刺激ペプチド配列、
ならびに、所望により、
ｃ）ＤＮＡ抽出を伴う定量的ＰＣＲを行うために必要な試薬ならびに／あるいは
ｄ）リンパ球標識のための試薬。
【図面の簡単な説明】
【0127】
【図2】図２は、ＢＫＶ Ｎｘを有する場合またはＢＫＶ Ｎｘのない場合の、患者における腎移植から３年での転帰を記載している（ａ－ｍｌ／分／１.７３ｍ２で糸球体濾過速度（ＧＦＲ）（単位を測定することによって評価した腎機能、クラスカル・ウォリス検定およびｂ－腎移植片の生存、カプラン・マイヤーおよびログランク検定）。
【図4】図４は、以下の３つのパラメーターの組合せに基づいた本発明の方法を示す：・ｉ）患者の血液中のＢＫＶウイルス量によって評価されるウイルス学的パラメーター、・ｉｉ）患者における抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答の強度によって評価される免疫学的パラメーター、および・ｉｉｉ）［ドナー／レシピエント］ペアにおけるＨＬＡ不適合数によって評価される遺伝学的パラメーター。
【図5】図５は、本明細書において研究されたコホートの異なる患者グループの血液（ａ）および尿（ｂ）中のＢＫＶウイルス量レベル（ノンパラメトリックでのクラスカル・ウォリス検定）を示す。本発明の方法において使用される閾値（血液中のＢＫＶ １０３コピー／ｍＬ）は、可能な限り早期にリスクを評価できるように、これらの結果から定義した。
【図6】図６－パート１は、特定のＢＫＶペプチドによる刺激後に行われた種々のリンパ球機能試験を示す。サイトカイン分泌（１ａ）およびリンパ球増殖（１ｂ）を使用して、本明細書において研究されたコホートの異なる患者グループにおける抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答を評価した（ＴＣ：Ｔ細胞；ノンパラメトリックでのクラスカル・ウォリス検定）。図６－パート２は、抗ウイルスペプチド（サイトメガロウイルス、エプスタイン－バーおよびインフルエンザウイルスを対象としたペプチド）の混合物による刺激後に行われた種々のリンパ球機能試験を示す。サイトカイン分泌（２ａ）およびリンパ球増殖（２ｂ）を使用して、本明細書において研究されたコホートの異なる患者グループにおけるメモリーＴ細胞抗ウイルス応答全体を評価した（有意差なし）。
【図8】図８／１は、特定のＢＫＶペプチドのプールに応答した抗ＢＫＶ ＴＣｍの増殖（ＣＦＳＥ低Ｔ細胞の割合）の分析による、抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答についての評価プロトコールを示している。活発に増殖した抗ＢＫＶ ＴＣｍの割合（ＣＦＳＥ低ＴＣの割合）は、特定のＢＫＶペプチドの存在下で測定されたＣＦＳＥ低ＴＣの割合からペプチド刺激の不在下で測定されたＣＦＳＥ低ＴＣの割合を差し引くことにより測定される。図８／２は、抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答の正規化強度の評価を示す。抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答の正規化強度は「正規化強度測定単位」で定量化される。「正規化強度測定単位」は、本明細書において、１０６個の全Ｔ細胞に対して表され、血液１ｍＬあたりＢＫＶ １０３コピーに対して正規化されたＣＦＳＥ低抗ＢＫＶ ＴＣｍの割合であると定義される。この正規化により、個体内および個体間の比較が可能になる［本明細書における個体間の比較（孤立性ＢＫＶウイルス血症とＢＫＶ Ｎｘ）］。
【図9】図９は、孤立性ＢＫＶウイルス血症（ｎ＝１１）またはＢＫＶ Ｎｘ（ｎ＝１６）を有する患者における抗ＢＫＶ ＣＤ８＋ ＴＣｍ細胞応答の正規化強度を示す。本発明の方法において使用された唯一の閾値（正規化測定強度単位１０２）は、ＢＫＶ Ｎｘを有する患者において実証された応答強度値の最大９０パーセンタイルを考慮に入れるために、それらの結果から定義した。
【図11】図１１ａは、ＢＫＶ Ｎｘを有する患者では、孤立性ＢＫＶウイルス血症を有する患者と比較して、移植ドナーとレシピエントの間でのＨＬＡ不適合性数［ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、－ＤＲ、－ＤＱ］が少なかったことを示す（マン・ホイットニー検定）。本発明の方法において使用される閾値（移植ドナーとレシピエントの間でのＨＬＡ不適合性［ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、－ＤＲ、－ＤＱ］５）は、孤立性ＢＫＶウイルス血症を有する患者におけるＨＬＡ不適合性値の最大７５パーセンタイルを考慮に入れるために、これらの結果から定義した。図１１ｂは、ＨＬＡ不適合数とＢＫＶウイルス血症（血液１ｍＬあたりのコピー数）の負の相関を示す（ノンパラメトリックでのスピアマンの相関検定）。
【実施例】
【0128】
材料および方法：
腎移植後のＢＫＶに対して特異的な細胞応答を特徴付けるために、本発明者らは、９４人の腎移植患者を含む観察研究を行った。登録された患者は総てビセートル病院(Bicetre Hospital)（南パリの大学病院(University Hospitals of South Paris)）の腎臓科からであった。この場所は、機能性腎移植に関してモニタリングしている２０００人以上の患者のアクティブファイルを使用して、全体で年間１３０件以上の腎移植を実施している。ＣＰＰイル・ド・フランス(CPP Ile de France)［倫理委員会］に相談したところ、この研究を行う上での倫理的な障害は見つからなかった。総ての患者に情報書簡を渡し、彼らの同意を書面で集めた。
腎移植後のＢＫＶに対して特異的な細胞応答を特徴付けるために、本発明者らは、９４人の腎移植患者を含む観察研究を行った。登録された患者は総てビセートル病院(Bicetre Hospital)（南パリの大学病院(University Hospitals of South Paris)）の腎臓科からであった。この場所は、機能性腎移植に関してモニタリングしている２０００人以上の患者のアクティブファイルを使用して、全体で年間１３０件以上の腎移植を実施している。ＣＰＰイル・ド・フランス(CPP Ile de France)［倫理委員会］に相談したところ、この研究を行う上での倫理的な障害は見つからなかった。総ての患者に情報書簡を渡し、彼らの同意を書面で集めた。
【0129】
この研究は２０１４年１１月に開始し、登録期間は３６か月であった（登録は２０１７年１１月１日に終了した）。選定基準は以下の通りであった：
・１８歳以上の患者であること、
・腎臓以外の臓器移植がないこと、
・活動性慢性ＨＩＶ／ＨＢＶ／ＨＣＶ感染がないこと。
・１８歳以上の患者であること、
・腎臓以外の臓器移植がないこと、
・活動性慢性ＨＩＶ／ＨＢＶ／ＨＣＶ感染がないこと。
【0130】
これらの腎移植患者において、ＢＫＶウイルス再活性化の４つのグループを以下の基準に従って定義した：
・ＢＫＶ再活性化のない患者：
・血漿および尿中ＢＫＶウイルス量が少なくとも１２か月間未検出。
・ＢＫＶウイルス尿症を有する患者：
・ＢＫＶウイルス尿症陽性（２００コピー／ｍｌより多い）かつ
・ＢＫＶウイルス血症が少なくとも１２か月間未検出
・孤立性ＢＫＶウイルス血症を有する患者：
・過去６か月間ＢＫＶウイルス血症陽性（２００コピー／ｍｌより多い）かつ
・腎移植生検でＢＫＶ Ｎｘの組織学的診断なし
・ＢＫＶ Ｎｘを有する患者：
・腎移植生検でＢＫＶ Ｎｘの診断
・ＢＫＶウイルス血症陽性（２００コピー／ｍｌより多い）を伴う
・ＢＫＶ再活性化のない患者：
・血漿および尿中ＢＫＶウイルス量が少なくとも１２か月間未検出。
・ＢＫＶウイルス尿症を有する患者：
・ＢＫＶウイルス尿症陽性（２００コピー／ｍｌより多い）かつ
・ＢＫＶウイルス血症が少なくとも１２か月間未検出
・孤立性ＢＫＶウイルス血症を有する患者：
・過去６か月間ＢＫＶウイルス血症陽性（２００コピー／ｍｌより多い）かつ
・腎移植生検でＢＫＶ Ｎｘの組織学的診断なし
・ＢＫＶ Ｎｘを有する患者：
・腎移植生検でＢＫＶ Ｎｘの診断
・ＢＫＶウイルス血症陽性（２００コピー／ｍｌより多い）を伴う
【0131】
このコホートの異なる患者グループにおいて抗ＢＫＶ ＴＣｍを特徴付けるために、本研究には、臨床的側面（３６か月の前向きフォローアップにわたる臨床的および生物学的データの徹底的な収集）ならびに免疫学的側面（末梢血サンプル中の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の研究）を含めた。
【0132】
本研究の臨床的部分に関しては、３６か月の長期的フォローアップの一部として以下の臨床的および生物学的データを収集した：
・レシピエントの年齢、性別、初期腎疾患、透析の方法および長さ
・腎移植の特徴：
・腎移植の年齢
・ドナータイプ
・移植順位（初回移植または２回目／３回目等の移植）。
・臓器移植拒絶
・ＢＫＶウイルスの再活性化：
・血液および尿中ＢＫＶウイルス量（コピー／ｍＬで表される）
・複製期間（月単位で表される）
・ＭＤＲＤ式による糸球体濾過速度の推定：
・移植後１か月および６か月時点
・ＢＫＶ Ｎｘの診断時または移植後１２か月時点
・フォローアップ終了時
・免疫抑制治療
・誘導治療および維持治療
・免疫抑制剤の残留量
・ＢＫＶ Ｎｘの診断時または腎移植後１２か月時点
・ＢＫＶ Ｎｘの診断による免疫抑制治療変更。
・レシピエントの年齢、性別、初期腎疾患、透析の方法および長さ
・腎移植の特徴：
・腎移植の年齢
・ドナータイプ
・移植順位（初回移植または２回目／３回目等の移植）。
・臓器移植拒絶
・ＢＫＶウイルスの再活性化：
・血液および尿中ＢＫＶウイルス量（コピー／ｍＬで表される）
・複製期間（月単位で表される）
・ＭＤＲＤ式による糸球体濾過速度の推定：
・移植後１か月および６か月時点
・ＢＫＶ Ｎｘの診断時または移植後１２か月時点
・フォローアップ終了時
・免疫抑制治療
・誘導治療および維持治療
・免疫抑制剤の残留量
・ＢＫＶ Ｎｘの診断時または腎移植後１２か月時点
・ＢＫＶ Ｎｘの診断による免疫抑制治療変更。
【0133】
表２は、異なる腎移植患者グループにおいて治療的免疫抑制（免疫抑制治療の性質および強度）に関して差がないことを示す（ＮＳ＝有意差なし）。
【0134】
【表2】
【0135】
本研究の免疫学的部分に関しては、ベースライン時に１５ｍＬの全血（５ｍＬのリチウムヘパリン管３本）の単回採血を実施した。この採血は、通常の患者フォローアップのために実施された組織学的評価中に行った。孤立性ＢＫＶウイルス血症を有するグループおよびＢＫＶ Ｎｘを有するグループでは、長期的フォローアップも行い、抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答の進展を評価するために、ベースラインから１２か月および２４か月の時点で新しいサンプルを採取した。１５ｍＬの全血から、平均で８００～１０００万個のＰＢＭＣが分離された。これは、患者の相対的リンパ球減少（血液１ｍＬあたりＰＢＭＣ ５０～６０万個）を示している。
【0136】
異なる患者グループにおいて抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答を特徴付けた。抗ＢＫＶ ＴＣｍの特異的活性化は、ＢＫＶ ＶＰ１およびＬＴ－Ａｇタンパク質（ＰｅｐＴｉｖａｔｏｒ ＢＫＶ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ（登録商標）または同等のもの）を含む重複ペプチドプールとともにＰＢＭＣを培養することによって行った。これらのペプチドプールはＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞を活性化し、２つのＢＫＶ複製サイクルを対象とする（ＢＫＶウイルス複製の初期ではＬＴ－Ａｇ、後期ではＶＰ１）。特定のＢＫＶペプチドによる活性化後、抗ＢＫＶ ＴＣｍのリンパ球多機能性をフローサイトメトリーにより以下に関して評価した：
・サイトカイン分泌：
・特定のＢＫＶタンパク質およびブレフェルジンＡ（サイトカイン分泌阻害剤）の存在下での４００万個のＰＢＭＣ（１条件あたりＰＢＭＣ ８００,０００個）の一晩のインキュベーション、その後の
・ＩＬ２、ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－α合成能の研究。
・リンパ球増殖：
・ＣＦＳＥで標識した４００万個のＰＢＭＣ（１条件あたりＰＢＭＣ ５００,０００個）の、特定のＢＫＶペプチドの存在下での５日間の培養、その後の
・ＣＦＳＥ希釈の可視化による増殖能の研究。
・サイトカイン分泌：
・特定のＢＫＶタンパク質およびブレフェルジンＡ（サイトカイン分泌阻害剤）の存在下での４００万個のＰＢＭＣ（１条件あたりＰＢＭＣ ８００,０００個）の一晩のインキュベーション、その後の
・ＩＬ２、ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－α合成能の研究。
・リンパ球増殖：
・ＣＦＳＥで標識した４００万個のＰＢＭＣ（１条件あたりＰＢＭＣ ５００,０００個）の、特定のＢＫＶペプチドの存在下での５日間の培養、その後の
・ＣＦＳＥ希釈の可視化による増殖能の研究。
【0137】
全てのフローサイトメトリーの取得を１８カラーサイトメーター（ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）または同等のもの）で行い、ＦｌｏｗＪｏ固有の解析ソフトウエアで解析を行った。
【0138】
使用した統計的方法論：
連続変数は、データの正規分布がなく被験者が少数である（ｎ＜３０）場合、四分位範囲［２５～７５］の中央値で表される。これらの変数は、２つ以上の分布の比較により、マン・ホイットニー検定またはクラスカル・ウォリスノンパラメトリック検定を使用することによって比較した。相関は、ノンパラメトリックでのスピアマンの相関検定を使用することによって検査した。
連続変数は、データの正規分布がなく被験者が少数である（ｎ＜３０）場合、四分位範囲［２５～７５］の中央値で表される。これらの変数は、２つ以上の分布の比較により、マン・ホイットニー検定またはクラスカル・ウォリスノンパラメトリック検定を使用することによって比較した。相関は、ノンパラメトリックでのスピアマンの相関検定を使用することによって検査した。
【0139】
カテゴリー変数はパーセンテージで表される。異なるグループ間で割合を比較するために、カイ二乗検定を使用した。生存関数は、カプラン・マイヤー推定量に従って、ログランク比較検定を使用して行った。
【0140】
統計的有意性の閾値は、Ｐ値＜０.０５について確立した。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエアを使用して実施した。
【0141】
本発明の方法の開発：
ａ）ＢＫＶに特異的なメモリーＴ細胞の増殖の測定
ＢＫＶペプチドによる活性化後の抗ＢＫＶ ＴＣｍ増殖能の評価に基づいたこのリンパ球機能試験は、本発明者らによって特別に開発された。
ａ）ＢＫＶに特異的なメモリーＴ細胞の増殖の測定
ＢＫＶペプチドによる活性化後の抗ＢＫＶ ＴＣｍ増殖能の評価に基づいたこのリンパ球機能試験は、本発明者らによって特別に開発された。
【0142】
図８／１は、腎移植患者の全血からのＢＫＶウイルスペプチドによる特異的刺激に応答して増殖した抗ＢＫＶ ＴＣｍの特定プロトコールを示している。
【0143】
抗ＢＫＶ ＴＣｍを含んでなるＰＢＭＣは、各患者の全血の血液サンプル１５ｍＬから得た。この血液サンプルは末梢静脈タイプで、５ｍＬのリチウムヘパリン管３本（緑色のキャップの付いた試験管）使用して採取した（図８／１ａ）。
【0144】
抗ＢＫＶ ＴＣｍの増殖試験には、およそ５００～６００万個のＰＢＭＣが必要であり；血液サンプルは８００～１０００万個を提供する。
【0145】
ＰＢＭＣは、ＦＩＣＯＬＬ ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｃ（ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ（登録商標）－参照番号Ｐ０４-６０５０５または同等のもの）によって分離した。本発明者らは、全血１５ｍＬから、平均で８００～１０００万個のＰＢＭＣを分離する（図８／１ｂ）。
【0146】
ＰＢＭＣは、終濃度１μｇ／ｍＬ／ペプチドで２つのＢＫＶペプチドプールとともに５日間培養した。ペプチドプールは、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃによって販売されている（ＰｅｐＴｉｖａｔｏｒ（登録商標）ＢＫＶ ＶＰ１－参照番号：１３０－０９７－２７２およびＰｅｐＴｉｖａｔｏｒ（登録商標）ＢＫＶ ＬＴ－参照番号：１３０－０９６－５０４）または同等のもの（図８／１ｃ）。使用したＬＴ－ＡｇおよびＶＰ１ペプチド配列は、抗ＢＫＶ ＴＣｍを活性化できると科学文献で広く認識されている免疫優性ペプチドである。２つの応答のうちの強い方が機能的抗ＢＫＶ ＴＣｍの特定用に考えられた。
【0147】
Ｔ細胞増殖は、培養日に、リンパ球増殖マーカー（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＣＦＳＥ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）－参照番号：Ｃ３４５５４）を添加することによって測定した。他の同等のリンパ球増殖マーカーも使用し得る。細胞培養の５日目に、ＰＢＭＣを以下の抗体［ＢＤ（登録商標）抗ＣＤ３抗体（参照番号：５６４７１２）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ（登録商標）ＣＤ４（参照番号：１３０－０９６－９００）およびＭｉｌｔｅｎｙｉ（登録商標）ＣＤ８（参照番号：１３０－０９６－５６１）または同等のもの］により標識し、フローサイトメトリー（ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）サイトメーターまたは同等のもの）により分析した（図８／１ｄ）。ＢＫＶに特異的なＣＤ４およびＣＤ８ ＴＣｍを特定し、ＣＦＳＥ標識（ＣＦＳＥ低Ｔ細胞）の程度に基づいて計数する。上で説明したように、活発に増殖した抗ＢＫＶ ＴＣｍの割合（ＣＦＳＥ低ＴＣの割合）は、特定のＢＫＶペプチドの存在下で測定されたＣＦＳＥ低ＴＣの割合からペプチド刺激の不在下で測定されたＣＦＳＥ低ＴＣの割合を差し引くことにより測定される（図８／１ｅおよび８／２ａ）。
【0148】
次に、機能的抗ＢＫＶ ＴＣｍの割合を１０６個の全Ｔ細胞に対して表し、次いで、血液１ｍＬあたりＢＫＶ １０３コピーに対して正規化する。図８／２は、抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答の正規化強度の評価を可能にするために、機能的抗ＢＫＶ ＴＣｍの割合のこの正規化を示している。この応答の強度の評価により、個体内および個体間の比較が可能になる。
【0149】
ｂ）ウイルス量の測定
ＢＫＶウイルス量は、特定の市販キット（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ（登録商標）のＢＫＶ Ｒ－ＧＥＮＥ（登録商標）－参照番号 ６９－０１３Ｂまたは同等のもの）を介して測定した。使用される生物学的サンプルは、前記患者からの全血または血漿サンプルであり得る。
ｃ）ドナーとレシピエントの間でのＨＬＡ不適合数の測定
移植との関連における総てのＨＬＡタイピングは、セントルイスＨＬＡ研究所によって行われ、これらの試験はイル・ド・フランスで集中して行っている。レシピエントのＨＬＡタイピングは、現在次世代の対立遺伝子配列決定技術（ＨＬＡ Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤＲＢ１、ＤＱＢ１、ＤＱＡ１およびＤＰＢ１分子の対立遺伝子配列決定－Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）のＭｉＳｅｑ装置または同等のもの）によって行われている。ＨＬＡドナータイピングは、ＳＡＢＲ（Ｓｉｎｇｌｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｂｅａｄ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）キットまたは同等のものを使用した「配列特異的プライマー法」（Ｌｉｎｋａｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ（登録商標））により腎移植時に緊急時に行われている。
ＢＫＶウイルス量は、特定の市販キット（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ（登録商標）のＢＫＶ Ｒ－ＧＥＮＥ（登録商標）－参照番号 ６９－０１３Ｂまたは同等のもの）を介して測定した。使用される生物学的サンプルは、前記患者からの全血または血漿サンプルであり得る。
ｃ）ドナーとレシピエントの間でのＨＬＡ不適合数の測定
移植との関連における総てのＨＬＡタイピングは、セントルイスＨＬＡ研究所によって行われ、これらの試験はイル・ド・フランスで集中して行っている。レシピエントのＨＬＡタイピングは、現在次世代の対立遺伝子配列決定技術（ＨＬＡ Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤＲＢ１、ＤＱＢ１、ＤＱＡ１およびＤＰＢ１分子の対立遺伝子配列決定－Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）のＭｉＳｅｑ装置または同等のもの）によって行われている。ＨＬＡドナータイピングは、ＳＡＢＲ（Ｓｉｎｇｌｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｂｅａｄ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）キットまたは同等のものを使用した「配列特異的プライマー法」（Ｌｉｎｋａｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ（登録商標））により腎移植時に緊急時に行われている。
【0150】
ドナーおよびレシピエントのＨＬＡタイピングは、国際勧告に従って、腎移植を進めるかどうかを決定するために、移植時に総ての腎移植患者に対して日常的に行われていることを覚えておくことが重要である。それらの結果は、Ａｇｅｎｃｅ ｄｅ ｌａ Ｂｉｏｍｅｄｅｃｉｎｅ［フランスの生物医学局］を介して医療チームに伝達される。
【0151】
結果：
９４人の腎移植患者が登録され、ＢＫＶウイルス再活性化レベルに従って４グループに分けられた：
・ＢＫＶ再活性化のない患者（ｎ＝２５）：
・血漿および尿中ＢＫＶウイルス量＜２００コピー／ｍＬ
・ＢＫＶウイルス尿症を有する患者（ｎ＝２５）：
・尿中ＢＫＶウイルス量の中央値 １.９×１０４［３.９×１０３～１.８×１０５］コピー／ｍＬ
・血漿中ＢＫＶウイルス量（２００コピー／ｍｌより多い）
・再活性化までの時間の中央値 ２１.８［１４.６～３４.７］か月。
・孤立性ＢＫＶを有する患者（ｎ＝２２）：
・血漿中ＢＫＶウイルス量の中央値 ４.２×１０３［１.１×１０３～１.２×１０４］コピー／ｍＬ
・尿中ＢＫＶウイルス量 １.１×１０８［６.２×１０６～３.８×１０８］コピー／ｍＬ
・再活性化までの時間の中央値 １０.３［５.６～２１.１］か月および１３.８［９.３～２７.１］か月
・腎移植生検でＢＫＶ Ｎｘの組織学的診断なし
・ＢＫＶ Ｎｘを有する患者（ｎ＝２２）：
・腎移植生検でＢＫＶ Ｎｘの組織学的診断
・血漿中ＢＫＶウイルス量 ２.８×１０５［３×１０４～６.３×１０５］コピー／ｍＬ
・尿中ＢＫＶウイルス量 １×１０９［５.４×１０７～１.８×１０９］コピー／ｍＬ
・再活性化までの時間のそれぞれの中央値 １２.６［５.２～２４.７］か月および１３.８［４～２３.３］か月
９４人の腎移植患者が登録され、ＢＫＶウイルス再活性化レベルに従って４グループに分けられた：
・ＢＫＶ再活性化のない患者（ｎ＝２５）：
・血漿および尿中ＢＫＶウイルス量＜２００コピー／ｍＬ
・ＢＫＶウイルス尿症を有する患者（ｎ＝２５）：
・尿中ＢＫＶウイルス量の中央値 １.９×１０４［３.９×１０３～１.８×１０５］コピー／ｍＬ
・血漿中ＢＫＶウイルス量（２００コピー／ｍｌより多い）
・再活性化までの時間の中央値 ２１.８［１４.６～３４.７］か月。
・孤立性ＢＫＶを有する患者（ｎ＝２２）：
・血漿中ＢＫＶウイルス量の中央値 ４.２×１０３［１.１×１０３～１.２×１０４］コピー／ｍＬ
・尿中ＢＫＶウイルス量 １.１×１０８［６.２×１０６～３.８×１０８］コピー／ｍＬ
・再活性化までの時間の中央値 １０.３［５.６～２１.１］か月および１３.８［９.３～２７.１］か月
・腎移植生検でＢＫＶ Ｎｘの組織学的診断なし
・ＢＫＶ Ｎｘを有する患者（ｎ＝２２）：
・腎移植生検でＢＫＶ Ｎｘの組織学的診断
・血漿中ＢＫＶウイルス量 ２.８×１０５［３×１０４～６.３×１０５］コピー／ｍＬ
・尿中ＢＫＶウイルス量 １×１０９［５.４×１０７～１.８×１０９］コピー／ｍＬ
・再活性化までの時間のそれぞれの中央値 １２.６［５.２～２４.７］か月および１３.８［４～２３.３］か月
【0152】
図５は、異なる患者グループにおける血液および尿のＢＫＶウイルス量のレベルの違いをＢＫＶ再活性化程度の関数として示す。従来技術と一致して、１０５より多い血漿中ＢＫＶウイルス量は、ＢＫＶ Ｎｘと関連している可能性がある（図５ａ）が、このパラメーターは、ＢＫＶ Ｎｘ診断時の移植片の腎実質損傷および重度の慢性機能不全にすでに関連しているため、時期を逃していることに注意することが重要である（図２ａ）。さらに、孤立性ＢＫＶウイルス血症を有する患者とＢＫＶ Ｎｘを有する患者の尿中ＢＫＶウイルス量間に差異がないことを前提として、本発明の開発においてこのパラメーターを考慮しなかった。
【0153】
これまでに得られた臨床的および生物学的データに基づき、研究されたコホート全体の移植までの平均時間は３.５年であった。ＢＫＶ Ｎｘ発生までの時間の中央値は腎移植後１２か月であった。
【0154】
免疫抑制の標準化された単一施設管理により、グループは免疫抑制に関して同等であった（免疫抑制治療の性質および強度－表２参照）。
【0155】
ＢＫＶ Ｎｘの診断から慢性の重度の腎移植片機能不全が見つかった（ｐ＜０.０００１、図２ａ）。腎臓の転帰もまた、ＢＫＶ Ｎｘのない患者と比較して、ＢＫＶ Ｎｘを有する患者において移植片喪失率が高く不利であった（ｐ＜０.０００１、図２ｂ）。
【0156】
抗ＢＫＶ ＴＣｍの機能障害は、腎移植後のＢＫＶ Ｎｘを有する患者において報告された。ＢＫＶ Ｎｘを有する患者のグループはより低い抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答を示した：
・サイトカイン分泌能に関して：ＢＫＶウイルス尿症を有するグループと比較して、ＢＫＶ Ｎｘグループにおけるインターフェロンγ分泌能の低下（図６／１ａ）。
・リンパ球増殖能に関して：他の３つのグループ（ＢＫＶ再活性化のない患者、ＢＫＶウイルス尿症を有する患者および孤立性ＢＫＶウイルス血症を有する患者）と比較して、ＢＫＶ Ｎｘグループにおけるリンパ球増殖能の低下（図６／１ｂ）。
・サイトカイン分泌能に関して：ＢＫＶウイルス尿症を有するグループと比較して、ＢＫＶ Ｎｘグループにおけるインターフェロンγ分泌能の低下（図６／１ａ）。
・リンパ球増殖能に関して：他の３つのグループ（ＢＫＶ再活性化のない患者、ＢＫＶウイルス尿症を有する患者および孤立性ＢＫＶウイルス血症を有する患者）と比較して、ＢＫＶ Ｎｘグループにおけるリンパ球増殖能の低下（図６／１ｂ）。
【0157】
リンパ球応答のこの障害は、抗ＢＫＶ ＴＣｍに特異的であった。ＢＫＶ Ｎｘを有する患者は、サイトメガロウイルス、エプスタイン－バーおよびインフルエンザウイルスを対象としたペプチドのプール（Ａｘｘｏｒａ（登録商標）のＣＥＦペプチドプール、参照番号 ＰＴ－ＰＡ－ＣＥＦ－００２または同等のもの－図６／２ａ～ｂ）による刺激後に抗ウイルス応答が保存された。
【0158】
抗ＢＫＶ ＴＣｍ増殖応答の強度は、血液中のＢＫＶウイルス量と負の相関があった（図７）。血液１ｍＬあたりＢＫＶ １０３コピーに対して応答強度を正規化した後、抗ＢＫＶ応答のこの正規化強度は、孤立性ＢＫＶウイルス血症を有する患者と比較して、ＢＫＶ Ｎｘを有する患者において有意に低かった（図９）。これらのデータは、抗ＢＫＶ ＴＣｍのリンパ球多機能性の変化を示唆しており、これらのリンパ球の枯渇状態を示唆している。
【0159】
リンパ球増殖は、リンパ球機能の最も識別力のある評価方法である。さらに、この試験は、セントラルメモリーＴ細胞およびメモリー幹細胞を具体的に評価することを可能にする。しかしながら、すでに説明したように、病原体に対して特異的なメモリーＴ細胞内のこれらのリンパ球亜集団の大きさは、それらの自己複製、増殖、ヘルプシグナルおよびエフェクターへの分化についての能力を決定する。これらのセントラルメモリーおよびメモリー幹細胞の具体的な評価は、ＢＫＶウイルスから保護するための免疫学的能力のより正確な評価を可能にする。サイトカイン分泌能の評価により、メモリーエフェクターまたはターミナルエフェクターＴ細胞タイプの「ターミナル」メモリー細胞亜集団を優先的に研究することが可能になる。これらの高度に分化したリンパ球亜集団は、自己複製能、増殖能または分化能があったとしてもほとんどない（［１３］、［１４］）。従って、この評価方法が支持された。
【0160】
さらに、前述のように、ＢＫＶ Ｎｘを有する患者ではＨＬＡ不適合数がより少ないこと報告されている。ＢＫＶ Ｎｘを有する患者は、孤立性ＢＫＶウイルス血症を有する患者と比較して全ＨＬＡ不適合数［ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、－ＤＲ,および－ＤＱ］が低かった（図１１ａ）。さらに、この不適合数はＢＫＶウイルス量と負の相関があった（図１１ｂ）。
【0161】
得られたデータから、ＢＫＶ Ｎｘを発症するリスクの層別化指標を開発した。
【0162】
ＢＫＶ Ｎｘを有する患者では、以下の間の関連を報告することが可能であった：
・抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答の正規化強度（血液１ｍＬあたり１０３コピーのＢＫＶウイルスに対して正規化された応答強度）の低下および
・ドナーとレシピエントの間でのＨＬＡ分子不適合数が少ないこと。
・抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答の正規化強度（血液１ｍＬあたり１０３コピーのＢＫＶウイルスに対して正規化された応答強度）の低下および
・ドナーとレシピエントの間でのＨＬＡ分子不適合数が少ないこと。
【0163】
従って、コホートの断面解析では、抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答の正規化強度１０２以下かつ全ＨＬＡ不適合数５以下を有する患者の１００％がＢＫＶ Ｎｘを有していた（図１３、濃灰色面）。逆に、抗ＢＫＶ ＴＣｍ応答の正規化強度が１０２より大きくかつ全ＨＬＡ不適合数が５より大きい患者でＢＫＶ Ｎｘを有する患者はいなかった（図１３、白色面）。
【0164】
参考文献
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図6-4】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【配列表】