特許 7516380 アデノウイルス型に特異的なＤＮＡアプタマー

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-07-05

(45)【発行日】2024-07-16

(54)【発明の名称】アデノウイルス型に特異的なＤＮＡアプタマー

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/115 20100101AFI20240708BHJP

   C12N 7/02 20060101ALI20240708BHJP

   C12Q 1/70 20060101ALI20240708BHJP

   C12Q 1/6888 20180101ALI20240708BHJP

   C12Q 1/68 20180101ALI20240708BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20240708BHJP

【ＦＩ】

C12N15/115 Z ZNA

C12N7/02

C12Q1/70

C12Q1/6888 Z

C12Q1/68

C12Q1/686 Z

【請求項の数】 13

(21)【出願番号】P 2021533338

(86)(22)【出願日】2019-12-02

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-02

(86)【国際出願番号】 EP2019083284

(87)【国際公開番号】W WO2020126435

(87)【国際公開日】2020-06-25

【審査請求日】2022-11-17

(31)【優先権主張番号】LU101073

(32)【優先日】2018-12-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】LU

(73)【特許権者】

【識別番号】516296566

【氏名又は名称】ルクセンブルク・インスティテュート・オブ・サイエンス・アンド・テクノロジー・（エルアイエスティ）

(74)【代理人】

【識別番号】100091683

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼川 俊雄

(74)【代理人】

【識別番号】100179316

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 寛奈

(72)【発明者】

【氏名】オゴーザリー，レスリー

(72)【発明者】

【氏名】ジョルダン，サミュエル

(72)【発明者】

【氏名】マルホランド，キャサリン

【審査官】岡部 佐知子

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０１７／０１１４４２０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特表２００５－５１８５５３（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１３／１８３３８３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２０１８－１７０９８５（ＪＰ，Ａ）

【文献】BMC Research Notes，2012年，Volume 5，633

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも１つのアデノウイルス型に特異的に結合することができる一本鎖核酸アプタマーであって、配列番号１～３の配列のうちの１つ、または少なくとも９０％の配列同一性を有するそのバリアントを含むかまたはそれらからなるアプタマー。

【請求項2】

少なくとも１つのアデノウイルス型に特異的に結合することができる少なくとも１つの一本鎖核酸アプタマーを含む組成物であって、前記アプタマーが、配列番号１～３の配列のうちの１つ、または少なくとも９０％の配列同一性を有するそのバリアントを含むかまたはそれらからなる、組成物。

【請求項3】

サンプル中の少なくとも１つのアデノウイルス型を捕捉するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、少なくとも１つのアデノウイルス型に特異的に結合できる一本鎖核酸アプタマーと前記サンプルとを接触させるステップを含み、前記アプタマーは、配列番号１～３の配列のうちの１つまたは少なくとも９０％の配列同一性を有するそのバリアントを含むかまたはそれらからなる、方法。

【請求項4】

サンプル中の少なくとも１つのアデノウイルス型を検出するかつ／または定量化するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、
－請求項３に従って捕捉するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を実施するステップと、
－アデノウイルスに結合したアプタマーの存在または不在を定量化するかまたは検出するステップと；
－前記サンプル中のアデノウイルスの量または存在もしくは不在を推定するステップと、を含む、方法。

【請求項5】

アデノウイルスに結合したアプタマーの存在または不在を定量化するステップまたは検出するステップが、対照群との比較を介して実施される、請求項４に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。

【請求項6】

前記サンプル中のアデノウイルスに結合したアプタマーの存在または不在を検出することが、前記アプタマーを増幅することを目的としたＰＣＲ、及び／または酵素結合アプタマー吸着アッセイを実施することによって実行され、前記ＰＣＲは、配列５’－ＧＴＧＣＣＡＧＣＴＡＴＧＣＣＡＴＴＧ－３’及び５’－ＧＣＡＧＣＡＧＡＧＡＴＡＧＡＣＧＣＴＡ－３’を含む２つのプライマーのセットを用いて実施される、請求項４または５に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。

【請求項7】

前記少なくとも１つのアプタマーが検出可能な標識を含み、前記サンプル中のアデノウイルスに結合したアプタマーの存在または不在を検出することは、前記標識を検出することによって実施される、請求項４または５に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。

【請求項8】

少なくとも１つのアデノウイルス型に特異的に結合することができる核酸アプタマーの少なくとも１つの一本鎖を含む少なくとも１つのアデノウイルス型を検出する、定量化する、捕捉する、及び／または濃縮するためのキットであって、前記アプタマーが、配列番号１～３の配列のうちの１つまたは少なくとも９０％の配列同一性を有するそのバリアントを含むかまたはそれらからなる、キット。

【請求項9】

前記キットが、前記少なくとも１つのアデノウイルス型のうちの少なくとも１つの捕捉要素及び／または検出手段を備えた支持体または溶液をさらに含む、請求項８に記載のキット。

【請求項10】

前記少なくとも１つの捕捉要素が、前記少なくとも１つのアプタマーのうちの１つ以上を含む、請求項９に記載のキット。

【請求項11】

前記検出手段が、連結された検出可能な標識を有するアプタマーのうちの１つ以上を含む、請求項９または１０に記載のキット。

【請求項12】

前記検出可能な標識が前記アプタマーの５’末端または３’末端に結合している、請求項１１に記載のキット。

【請求項13】

前記少なくとも１つのアプタマーに結合することができ、配列５’－ＧＴＧＣＣＡＧＣＴＡＴＧＣＣＡＴＴＧ－３’及び５’－ＧＣＡＧＣＡＧＡＧＡＴＡＧＡＣＧＣＴＡ－３’を含む２つのプライマーのセットをさらに含む、請求項８～１２のいずれか一項に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、１つ以上のアデノウイルス型に特異的なアプタマー及びそれらの用途を対象とする。

【背景技術】

【0002】

腸内ウイルス（その中でもエンテロウイルス、ノロウイルス、アデノウイルス、ならびにＡ型及びＥ型肝炎ウイルスなど）は、感染者の糞便中に高濃度で存在し、その後、廃水の排出を介して水生環境に拡散し得る。これらのウイルスは、主にヒト間で、または汚染された食品及び飲料水、入浴またはレクリエーション活動を通じて伝染する。これらのウイルスの中で、ヒトアデノウイルス（ＨＡｄＶ）は、胃腸炎、結膜炎、心筋炎、肺炎など、多くの疾患の原因となり得る。地理的には、これらのウイルスは世界中に分布しており、河川水、海水、または地下水などの様々な水源で一般的に見られる。他の腸内ウイルス（例えば、エンテロウイルスまたはノロウイルス）と比較して、それらは通常より豊富であり（Ｌｅｅ ａｎｄ Ｋｉｍ，２００８；Ｖｅｒｈｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｗｙｎ－Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１）、年間を通じて見られ、水中で注目に値する生存特性を有する（Ｅｎｒｉｑｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｏｇｏｒｚａｌｙ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。

【0003】

アデノウイルス（ＡｄＶ）は、エンベロープを有さないウイルスのファミリーであるアデノウイルス科の二本鎖ＤＮＡゲノムに属している。分析フレームワーク及びサンプルの種類（臨床、食品、または環境サンプル）に応じて、ウイルスゲノムまたはキャプシドのいずれかを標的とする様々な検出方法が適用され得るが、それぞれに利点及び欠点がある。分子増幅法、すなわちポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、食品及び環境の設定で一般的に使用されるが、抗体を使用する酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などの免疫学的手法が臨床サンプルのための規則である。抗原法は、高ウイルス濃度を提示するサンプルでは適切に機能するが、環境サンプル及び食品サンプルについては十分に感応しない。さらに、抗体の結合能力は、サンプルの複雑なマトリックスによって影響を受ける可能性がある。したがって、既存のツールを補完するための代替のＡｄＶ診断ツールを開発する必要があり、このため、迅速で高感度かつ効果的な方法を提供でき、これにより、関係当局は、腸疾患及び他の疾患による感染のリスクを減少させ、ウイルスの拡大を制限できるようになる。

【0004】

米国特許出願公開第２０１７／０１１４４２０号明細書に公開された先行技術の特許文書は、ノロウイルスに特異的に結合するアプタマーについて開示している。アプタマーは、ノロウイルスの存在を検出するため、及び試験サンプルからノロウイルスを捕捉し、かつ／または濃縮するために使用される。しかし、アデノウイルスを検出し、捕捉するための解決策は開示されていない。

【0005】

米国特許第９５６２９００号明細書に公開された先行技術の特許文書では、食品媒介性及び水媒介性病原体細菌または寄生虫、カビまたは他の病原性真菌を特異的に標的とし、それらに結合するアプタマーについて開示している。この特許では、ウイルス、より具体的には食品または水などのサンプル中のアデノウイルスを分析（検出など）するためのツールを開示していない。 欧州特許第２８５９１２１号明細書及び欧州特許第２６１３１４７号明細書で公開された先行技術の文書では、アプタマーを使用して、試験サンプル中に存在し得る１つ以上の標的分子を検出するための方法、デバイス、試薬、及びキットについて開示している。これらの特許文書では、アデノウイルスを分析するためのツールについてはいずれも開示していない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【文献】米国特許出願公開第２０１７／０１１４４２０号明細書

【文献】米国特許第９５６２９００号明細書

【文献】欧州特許第２８５９１２１号明細書

【文献】欧州特許第２６１３１４７号明細書

【非特許文献】

【0007】

【文献】Ｌｅｅ ａｎｄ Ｋｉｍ，２００８；Ｖｅｒｈｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｗｙｎ－Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１

【文献】Ｅｎｒｉｑｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｏｇｏｒｚａｌｙ ｅｔ ａｌ．，２０１０

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明は、サンプル中のアデノウイルス型分析のための迅速で高感度かつ効果的なツールを提供する際の技術的問題を有する。本発明はまた、技術的な問題について、高価ではない解決策を提供することを有する。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明は、少なくとも１つのアデノウイルス型に特異的に結合することができる一本鎖核酸アプタマーに関し、アプタマーは、配列番号１～３の配列のうちの１つ、または少なくとも５０％の配列同一性を有するそのバリアントを含むかまたはそれらからなる。

【0010】

本発明はまた、少なくとも１つのアデノウイルス型に特異的に結合することができる少なくとも１つの一本鎖核酸アプタマーを含む組成物に向けられ、アプタマーは、配列番号１～３の配列のうちの１つ、または５０％の配列同一性を有するそのバリアント、及び少なくとも１つのアデノウイルス型を含むかまたはそれらからなる。

【0011】

本発明はまた、少なくとも１つのアデノウイルス型を検出する、捕捉する、定量化する、かつ／または濃縮するために、少なくとも１つのアデノウイルス型に特異的に結合することができる一本鎖核酸アプタマーの使用に関し、アプタマーは、配列番号１～３の配列のうちの１つまたは少なくとも５０％の配列同一性を有するそのバリアントを含むかまたはそれらからなる。

【0012】

本発明はまた、サンプル中の少なくとも１つのアデノウイルス型を捕捉するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法に関し、本方法は、少なくとも１つのアデノウイルス型に特異的に結合できる一本鎖核酸アプタマーとサンプルとを接触させるステップを含み、アプタマーは、配列番号１～３の配列のうちの１つまたは少なくとも５０％の配列同一性を有するそのバリアントを含むかまたはそれらからなる。

【0013】

本発明はまた、サンプル中の少なくとも１つのアデノウイルス型を検出する、かつ／または定量化するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法に関し、本方法は、本発明に従って捕捉し、アデノウイルスに結合したアプタマーの存在または不在を定量化するかまたは検出するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を実施することと、そこから、サンプル中のアデノウイルスの量または存在もしくは不在を推定することと、を含む。

【0014】

好ましい実施形態によれば、アデノウイルスに結合したアプタマーの存在または不在を定量化するかまたは検出することは、対照群との比較を介して実施される。

【0015】

好ましい実施形態によれば、サンプル中のアデノウイルスに結合したアプタマーの存在または不在を検出することは、アプタマーを増幅することを目的としたＰＣＲを実施することによって実行され、ＰＣＲは、配列５’－ＧＴＧＣＣＡＧＣＴＡＴＧＣＣＡＴＴＧ－３’及び５’－ＧＣＡＧＣＡＧＡＧＡＴＡＧＡＣＧＣＴＡ－３’に対応する２つのプライマーのセットを用いて、かつ／または酵素結合アプタマー吸着アッセイによって実施される。

【0016】

好ましい実施形態によれば、少なくとも１つのアプタマーは検出可能な標識を含み、サンプル中のアデノウイルスに結合したアプタマーの存在または不在を検出することは、標識を検出することによって実行される。

【0017】

本発明はまた、少なくとも１つのアデノウイルス型に特異的に結合することができる核酸アプタマーの少なくとも１つの一本鎖を含む少なくとも１つのアデノウイルス型を検出する、定量化する、捕捉する、かつ／または濃縮するためのキットに関し、アプタマーは、配列番号１～３の配列のうちの１つまたは少なくとも５０％の配列同一性を有するそのバリアントを含むかまたはそれらからなる。

【0018】

好ましい実施形態によれば、キットは、少なくとも１つのアデノウイルス型のうちの少なくとも１つの捕捉要素及び／または検出手段を備えた支持体または溶液をさらに含む。

【0019】

好ましい実施形態によれば、少なくとも１つの捕捉要素は、少なくとも１つのアプタマーのうちの１つ以上を含む。

【0020】

好ましい実施形態によれば、検出手段は、連結された検出可能な標識を有する１つ以上のアプタマーを含む。

【0021】

好ましい実施形態によれば、検出可能な標識は、アプタマーの５’または３’末端に結合している。

【0022】

好ましい実施形態によれば、アデノウイルスに結合したアプタマーを増幅するために、少なくとも１つのアプタマーに結合でき、配列５’－ＧＴＧＣＣＡＧＣＴＡＴＧＣＣＡＴＴＧ－３’及び５’－ＧＣＡＧＣＡＧＡＧＡＴＡＧＡＣＧＣＴＡ－３’に対応する２つのプライマーのセットをさらに含む。

【発明の効果】

【0023】

本発明は、本発明のアプタマーがアデノウイルス型に特異的であり、かつ異なるアデノウイルス型に高い親和性で特異的に結合することができるという点で特に興味深い。アプタマーは、市販のモノクローナル抗体の代わりに使用できる。アプタマーは、抗体と同様のアデノウイルス型への親和性を示す。アプタマーは長期安定性を示す。アプタマーはまた、抗体と比較して低コストであり、保存が容易であるという利点もある。本発明の方法及びキットは、少なくとも１つのアデノウイルス型を定量化する、検出する、捕捉するかつ／または濃縮するために使用するかつ／または実行するのが容易である。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】２０個のビオチン化候補アプタマーとインキュベートしたＨＡｄＶ－２（約１０^７ＭＰＮ／ウェル）の直接ＥＬＩＳＡ結果を表す図であるり、すべてのアプタマーを同じ濃度１μＭで使用した。

【図2】配列番号１を含むアプタマー１０の濃度に応じた結合ＨＡｄＶ－２の割合（パーセンテージ）を示す図であり、アプタマーの濃度は、０～１０００ｎＭの範囲である。

【図3】０～２０ｎＭの範囲のアプタマーの濃度についての図２の拡大図を示す図である。

【図4】配列番号３を含むアプタマー２０の濃度に応じた結合ＨＡｄＶ－２の割合（パーセンテージ）を示す図であり、アプタマーの濃度は、０～１０００ｎＭの範囲である。

【図5】様々なウイルスに対するアプタマー１０の特異性を示す図である。

【図6】様々なウイルスに対するアプタマー２０の特異性を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0025】

ウイルス株の生産及び精製
ＨＡｄＶ－２（ヒトアデノウイルス２型）は、アプタマーの選択を行うために選択した。ＨＡｄＶ－２は、Ｈｅａｌｔｈ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｇｅｎｃｙの培養コレクション（ＮＣＰＶ＃２１３）から入手し、ヒト胎児腎細胞株２９３Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で増殖させた。細胞は、高濃度のグルコース及びＧｌｕｔａｍａｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含み、１％の非必須アミノ酸（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び５％の非熱不活化ウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ－ＭＥＭ）で成長させた。ＨＡｄＶ－２株は、感染させた２９３Ａ単層から凍結融解溶解、その後の遠心分離（１２００ｒｐｍ、１０分、４℃）によって調製し、細胞片を除去した。次に、ウイルス懸濁液を塩化セシウム平衡密度勾配遠心分離によって精製した。精製したＡｄＶバンドは、シリンジを使用して収集し、分子量が１００ＫＤａにカットオフしたｆｌｏａｔ－ａ－ｌｙｓｅｒ透析デバイス（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｓ、ＵＳＡ）に直接注入した。透析デバイスを、デュベルコのＰＢＳ（ＤＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）で満たした２Ｌの容器に入れ、４℃で穏やかに回転させた（５０ｒｐｍ）。ＤＰＢＳは、２～４時間、６～８時間、及び１２～１４時間後に変更した。透析ステップ後、ウイルス懸濁液を収集し、４℃で保存した。精製されたＨＡｄＶ－２株の定量化は、２９３Ａ細胞を使用した最確数（ＭＰＮ）アッセイによって実施した（Ｏｇｏｒｚａｌｙ ｅｔ ａｌ．２０１３）。

【0026】

アプタマーの選択
一定のフォワード領域及びリバース領域と、各位置に等モルのＡ、Ｔ、Ｃ、及びＧの取り込みを含む２８塩基対のランダム領域（Ｎ２８）を備えた６５塩基対のコンビナトリアルＤＮＡライブラリー（ＧＴＧＣＣＡＧＣＴＡＴＧＣＣＡＴＴＧ－Ｎ２８－ＴＡＧＣＧＴＣＴＡＴＣＴＣＴＧＣＴＧＣ）を合成した（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）。選択前に、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）プール１μＭを含む選択バッファー（ここではＳＢと称する）（ｐＨ７．４で、ＭｇＣｌ_２（３ｍＭ）及びＮａＣｌ_２（２０ｍＭ）を添加したＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で構成され、オートクレーブで滅菌後、０．２μｍの膜ろ過を行う）を９５℃まで加熱して、ＤＮＡを変性させ、次いで、室温まで３０分間冷却した後、ウイルスと共にインキュベートした。

【0027】

次表１は、ＡｄＶのアプタマーの選択に使用されるオリゴヌクレオチドを開示している。

【0028】

【表1】

【0029】

ＳＥＬＥＸの標的複合体は、精製されたＨＡｄＶ－２を抗体－磁性ビーズ複合体に固定化することによって生成した。ＡｄＶに対するビオチン化モノクローナル抗体８Ｃ４（ＨｙＴｅｓｔ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を、製造業者の指示に従ってストレプトアビジンダイナビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａａｌｓｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）に抱合させた。簡潔に説明すると、１００μＬのストレプトアビジンダイナビーズをアリコートし、洗浄バッファーＤＰＢＳ－Ｔ（０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。３倍過剰のビオチン化モノクローナル抗体８Ｃ４（３０μｇ）を、５～１０分ごとにピペッティングして混合しながら、室温で１時間インキュベートすることにより、ストレプトアビジンダイナビーズに結合させた。抗体－ビーズ複合体を磁石で分離し、ＤＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、０．０５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，Ｓｉｇｍａ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む１００μＬのＤＰＢＳで溶出した。１００μＬの精製ＨＡｄＶ－２株（約１０^７ＭＰＮ／ｍＬに相当）を４９０μＬのＳＢに懸濁した１０μＬの抗体ビーズ複合体と混合し、室温で２時間インキュベートした。標的複合体ＨＡｄＶ－２－抗体ビーズを０．１％ＢＳＡを補充したＰＢＳで３回洗浄し、最後に２０μＬのＤＰＢＳに再懸濁した。

【0030】

ＳＥＬＥＸは標的複合体（ＨＡｄＶ－２－抗体－ビーズ）を使用して実行し、陰性ＳＥＬＥＸは抗体－ビーズ複合体を使用して実行した。簡潔に説明すると、選択バッファー中の５００ｐｍｏｌ／５００μＬのＤＮＡライブラリーを、９５℃まで５分間加熱して変性させ、室温まで３０分間冷却した。陰性選択は、ＤＮＡプールと表面との非特異的相互作用を減少させるために、最初にＤＮＡライブラリーを抗体ビーズ複合体と室温で４５分間インキュベートすることによって実行した。結合したＤＮＡを磁石で分離し、上清（回収したＤＮＡライブラリー）をＳＥＬＥＸの最初のラウンドに直接使用した。回収したＤＮＡを１０μＬの標的複合体（約１０^７個の感染性ウイルス粒子／反応に相当）に加え、室温で３０分間インキュベートした。結合したＤＮＡ配列を磁気捕捉によって回収し、ＤＰＢＳ－Ｔで３回洗浄して、非結合剤及び／または不十分な結合剤の除去を容易にした。１００マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水をビーズに加え、サンプルを９０℃まで５分間加熱してＤＮＡを放出させた。ｓｓ－ＤＮＡは、コンスタントフォワードプライマー及びリン酸化リバースプライマーを使用したＰＣＲによって増幅させた（表１）。ＰＣＲの最終容量は５０μＬで、そのうち１０μＬにはＤＮＡ標的が含まれていた。反応は、Ｂｉｏｍｅｔｒａ Ｔ－Ａｄｖａｎｃｅｄ ９６ＳＧシステム（Ｇｅｒｍａｎｙ）で実施し、以下の条件を適用し、９５℃で２分間、次いで９５℃で１５秒間、６７℃で１分間、７２℃で３０秒間、最終伸長７２℃で２分間の様々なサイクルを行った。ＰＣＲ産物は、臭化エチジウムで染色した４％アガロースゲルで可視化した。６５ｂｐのバンドがアガロースゲルに現れたときに、ＰＣＲ反応を停止させた。二本鎖ＤＮＡ（ｄｓ ＤＮＡ）は、スピンカラム（Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ Ｇｅｌ及びＰＣＲクリーンアップシステム、Ｍａｃｈｅｒｙ及びＮａｇｅｌ）を使用して精製した。ｄｓＤＮＡを分離するために、１μＬの１Ｕラムダエキソヌクレアーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＫ）を３７℃で１時間インキュベートした後、４％アガロースゲル電気泳動でｓｓＤＮＡを確認した。すべての選択ラウンドは同じ方法で実行したが、ＨＡｄＶ－２感染性粒子の濃度が減少し、ＤＮＡプールの濃度が減少した。インキュベーション時間も各ラウンド間で短縮し、洗浄ステップは、容積及び量の両方が増加して、プロセスの選択圧が上昇した。

【0031】

アプタマー配列の同定 ９、１０、及び１１回目のＳＥＬＥＸラウンドから得たｓｓＤＮＡは、前述と同じ条件で、非修飾プライマー（表１のＤ１フォワード及びリバース）によって増幅させた。産物を臭化エチジウムで染色した４％アガロースゲルで分析し、６５ｂｐのバンドを切り出し、Ｐｕｒｅｌｉｎｋ Ｑｕｉｃｋゲル抽出及びＰＣＲ精製コンボキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して精製した。精製した産物は、ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の指示に従って使用して、デュアルプロモーターＰＣＲ２．１ＴＯＰＯベクターにクローニングした。合計で、８６の白いクローンがＳａｎｇｅｒシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で実行されたシーケンス用に選択した。

【0032】

結合親和性研究
選択されたアプタマーの各々の結合活性の試験を行うために、直接ＥＬＡＳＡ（酵素結合アプタマー吸着剤アッセイ）法を実施した。９６ウェルポリスチレンプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）を濃度１０^７ＭＰＮ／ｍＬ（約１０^６粒子／ウェル）のＨＡｄＶ－２粒子でコーティングし、３７℃で１時間インキュベートした。３００μＬのＤＰＢＳで５回洗浄した後、ウェルを３００μＬの３％ＢＳＡで４℃で一晩ブロックした。３００μＬのＤＰＢＳで５回洗浄した後、１００μＬの選択バッファーで希釈した１μＭの各ビオチン化候補アプタマーをウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。ウェルを３００μＬのＤＰＢＳ－Ｔで２回、３００μＬの１％ＢＳＡで２回洗浄した。１％ＢＳＡで希釈した１００マイクロリットルのストレプトアビジン抱合ＨＲＰ（１／３００、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を各ウェルに添加し、暗所で室温で３０分間インキュベートした。プレートを３００μＬのＤＰＢＳで３回洗浄し、５０μＬのＴＭＢ基質溶液（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で室温の暗所で３０分間現像した。最後に、５０μＬの２Ｍ硫酸を各ウェルに添加し、４５０ｎｍでの吸光度を記録した（Ｔｅｃａｎ）。結果に基づいて、上位３つのアプタマーをさらなる分析のために選択した。

【0033】

選択されたアプタマーの結合親和性は、前述のＥＬＡＳＡ法を使用して分析した。濃度１０^７ＭＰＮ／ｍＬのＨＡｄＶ－２を９６ウェルポリスチレンプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）にコーティングし、様々な濃度（０～１０００ｎＭ）のビオチン化アプタマー１０及び２０と反応させた。プレートを４５０ｎｍで読み取り、ＯＤ値をＳｉｇｍａＰｌｏｔソフトウェアに入力し、非特異的結合を伴う１つの部位飽和方程式を使用して処理してＫｄ値を決定した。

【0034】

図１は、様々なビオチン化候補アプタマーと１μＭでインキュベートした精製ＨＡｄＶ－２の直接ＥＬＡＳＡで得られた結果を表している。

【0035】

図１の結果に基づくと、アプタマー１０、１８、２０が最も有望な候補である。

【0036】

図２及び図３は、ＨＡｄＶ－２及びアプタマー１０のＥＬＡＳＡ結合研究を表している。これらの結果は、アプタマー１０が高い親和性でＨＡｄＶ－２に特異的に結合できることを示している。アプタマーのＫｄは、３．６±０．７ｎＭであると計算された。各点は、６回の独立した実験の平均である。

【0037】

図４は、ＨＡｄＶ－２及びアプタマー２０のＥＬＡＳＡ結合研究を表している。

【0038】

これらの結果は、アプタマー２０が高い親和性でＨＡｄＶ－２に特異的に結合できることを示している。Ｋｄ値は７５．９±６８．６ｎＭと推定された。各点は、７回の独立した実験の平均である。

【0039】

特異性研究 アプタマー１０及び２０の特異性は、様々な型のアデノウイルス（ヒツジアデノウイルス１型及びウシアデノウイルス９型）ならびに様々な型の他の水性ウイルス（Ｆ特異的ＲＮＡバクテリオファージＭＳ２、ＧＡ、Ｏβ及びＳＰ株）を使用してＥＬＡＳＡによって分析した。標的ウイルス及び非標的ウイルスを同じ初期濃度（約１０^７ウイルス粒子／ウェル）でプレートにコーティングし、前述のＥＬＡＳＡプロトコルに従って、それぞれ８０ｎＭ濃度のアプタマー１０及び２０に対して試験を行った。

【0040】

これらの結果は図５及び６に示され、アプタマー１０及び２０がアデノウイルス型に特異的であることを示している。アデノウイルスに対してのみ信号が生成され、他の水系ウイルスに対しては信号が生成されない。

【0041】

モチーフ及び構造の分析
モチーフ分析は、オンラインソフトウェアプログラムであるＭＥＭＥモチーフ発見ツールによって実行した。各アプタマーの予測される二次元フォールディングは、オンラインソフトウェアプログラムＭＦＯＬＤによって実行した。

【0042】

次のシーケンスが同定されている。

【0043】

【表2】

【0044】

【表3】

【0045】

【表4】

【0046】

配列番号１：

【0047】

配列番号２：

【0048】

配列番号３：

【0049】

アプタマー１０、１８及び２０は、それぞれ、配列番号１、配列番号２、配列番号３を含む。

【0050】

本発明は、配列番号１～３の配列のうちの１つ、または少なくとも５０％の配列同一性を有するそのバリアントを含むかまたはそれらからなる一本鎖核酸アプタマーを提供する。好ましくは、バリアントは、少なくとも８０％、より好ましくは９０％の配列同一性を有する。

【0051】

アプタマーは少なくとも１つのステムループ構造を有する。

【0052】

本発明はまた、配列番号１～３の配列のうちの１つまたは少なくとも５０％の配列同一性を有するそのバリアント及び少なくとも１つのアデノウイルス型を含むかまたはそれらからなる少なくとも１つの一本鎖核酸アプタマーを含む組成物を提供する。

【0053】

アデノウイルス型は、例えば、ヒトまたは動物のアデノウイルスであり得る。

【0054】

本発明はまた、少なくとも１つのアデノウイルス型を検出する、捕捉する、定量化するかつ／または濃縮するための、配列番号１～３の配列のうちの１つまたは少なくとも５０％の配列同一性を有するそのバリアントを含むかまたはそれらからなる少なくとも１つの一本鎖核酸アプタマーの使用を提供する。

【0055】

本発明はまた、サンプル中の少なくとも１つのアデノウイルス型を捕捉するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供し、本方法は、配列番号１～３の配列のうちの１つまたは少なくとも５０％の配列同一性を有するそのバリアントを含むかまたはそれらからなる一本鎖核酸アプタマーとサンプルとを接触させるステップを含む。

【0056】

本発明はまた、サンプル中の少なくとも１つのアデノウイルス型を検出し、かつ／または定量化するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供し、本方法は、結合したアプタマーの存在または不在を上記のとおり捕捉するため、定量化するまたは検出するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を実行するステップと；そこから、サンプル中のアデノウイルスの量または存在もしくは不在を推定するステップと、を含む。結合したアプタマーの存在または不在を定量化することまたは検出することは、対照群との比較を介して実行される。この方法は、結合したアプタマーの存在または不在を定量化するステップまたは検出するステップの前に、結合していないアプタマーを除去するステップを含むことができる。

【0057】

サンプル中の結合アプタマーの存在または不在を検出するステップは、結合アプタマーを増幅することを目的としたＰＣＲを実施することによって実行され、ＰＣＲは、配列５’－ＧＴＧＣＣＡＧＣＴＡＴＧＣＣＡＴＴＧ－３’（フォワード）及び５’－ＧＣＡＧＣＡＧＡＧＡＴＡＧＡＣＧＣＴＡ－３’（リバース）に対応する２つのプライマーのセットを使用して、及び／または酵素結合アプタマー吸着アッセイ（ＥＬＡＳＡ）によって実行する。あるいは、少なくとも１つのアプタマーは、検出可能な標識を含み、サンプル中のアデノウイルスに結合したアプタマーの存在または不在を検出することは、標識を検出することによって実行される。

【0058】

本発明はまた、配列番号１～３の配列のうちの１つまたは少なくとも５０％の配列同一性を有するそのバリアントを含むかまたはそれらからなる核酸の少なくとも１つの一本鎖を含む少なくとも１つのアデノウイルス型を検出する、定量化する、捕捉するかつ／または濃縮するためのキットを提供する。一実施形態によれば、キットは、少なくとも１つのアデノウイルス型のうちの少なくとも１つの捕捉要素及び／または検出手段を備えた支持体または溶液をさらに含む。支持体は、ポリスチレンプレート、磁気ビート、または抽出、クロマトグラフィー、またはアフィニティーカラムなどの固体支持体であり得るが、これらに限定されない。本発明の一実施形態によれば、少なくとも１つのアデノウイルス型の少なくとも１つの捕捉要素は、支持体上または溶液中に固定化された少なくとも１つのアプタマーである。

【0059】

キットはまた、アデノウイルスと結合したアプタマーの検出手段を含むことができる。一実施形態によれば、検出手段は、連結された検出可能な標識を有する１つ以上のアプタマーを含む。

【0060】

検出可能な標識は、当技術分野において公知である方法によって検出され得る部分であり得る。例えば、検出可能な標識は、光学的標識、電気化学的標識、放射性同位元素、またはそれらの組み合わせであり得る。検出可能な標識は、アプタマーの特定の塩基、アプタマーのヘアピンループ構造などの特定の構造の特定の部位、またはアプタマーの３’末端または５’末端に付着させ得る。光学標識は、例えば、蛍光材料であり得る。さらに、光学標識は酵素であり得、そのような酵素は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）のために使用され得る。他の材料は、当業者によって適切に選択され得る。

【0061】

キットはさらに、アデノウイルスに結合したアプタマーを増幅するために、少なくとも１つのアプタマーに結合でき、配列５’－ＧＴＧＣＣＡＧＣＴＡＴＧＣＣＡＴＴＧ－３’及び５’－ＧＣＡＧＣＡＧＡＧＡＴＡＧＡＣＧＣＴＡ－３’に対応する２つのプライマーのセットを含む。

【0062】

キットには、使用説明書がさらに含まれ得る。キットは、陽性対照、例えば、不活化アデノウイルス粒子及び陰性対照をさらに含み得る。

【0063】

サンプルは、これらに限定されないが、糞便、血液などの臨床サンプル、水、堆積物などの環境サンプル、及び／または食品サンプルであってもよい。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

0007516380000001.app