特許 7517707 タンパク質分泌増強のための細菌発現ベクター

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-07-08

(45)【発行日】2024-07-17

(54)【発明の名称】タンパク質分泌増強のための細菌発現ベクター

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/72 20060101AFI20240709BHJP

   C12N 15/31 20060101ALN20240709BHJP

【ＦＩ】

C12N15/72 Z ZNA

C12N15/31

【請求項の数】 4

(21)【出願番号】P 2021541576

(86)(22)【出願日】2020-02-15

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-03-30

(86)【国際出願番号】 IB2020051289

(87)【国際公開番号】W WO2020165874

(87)【国際公開日】2020-08-20

【審査請求日】2023-02-01

(31)【優先権主張番号】201941005938

(32)【優先日】2019-02-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】IN

(73)【特許権者】

【識別番号】521315766

【氏名又は名称】オンコシミス バイオテック プライベート リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＯＮＣＯＳＩＭＩＳ ＢＩＯＴＥＣＨ ＰＲＩＶＡＴＥ ＬＩＭＩＴＥＤ

(74)【代理人】

【識別番号】100109793

【弁理士】

【氏名又は名称】神谷 惠理子

(72)【発明者】

【氏名】ロキレディ，サダーサナレディ

【審査官】藤山 純

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２００９／０１４８８９４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特表２００８－５０９６８２（ＪＰ，Ａ）

【文献】KLEINER-GROTE, GRM et al.，Secretion of recombinant proteins from E. coli.，Eng Life Sci，18(8)，2018年04月14日，pp.532-550

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／７２

Ｃ１２Ｎ １５／３１

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

宿主細菌細胞からの組換えタンパク質の分泌を増強するためのラクトースまたはラクトース類似体誘導性細菌発現ベクターであって、
少なくとも1つの分泌シグナル配列;
少なくとも１つの誘導性プロモーター、ＲＢＳ、組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列、アフィニティタグをコードするＤＮＡ配列、及び少なくとも１つの遺伝子ターミネーターを含む少なくとも１つの遺伝子発現カセットであって、該遺伝子発現カセットは前記分泌シグナル配列に作動可能に連結され、前記アフィニティタグのＤＮＡ配列は前記組換えタンパク質のＤＮＡ配列に作動可能に連結されている遺伝子発現カセット；
宿主細菌細胞におけるベクターの複製のための少なくとも1つの細菌ｏｒｉ遺伝子配列;並びに
選択可能なマーカーをコードするＤＮＡ配列であって、当該選択可能マーカーコードＤＮＡ配列に隣接する適切なプロモーター配列、遺伝子ターミネーター配列、及び少なくとも1つの抗生物質抵抗性遺伝子配列を含む、選択可能なマーカーコードＤＮＡ配列；
を含み、
前記分泌シグナル配列は、下記ａ）とｂ）との組み合わせである発現ベクター
ａ）ｐｅｌＢ、ｏｍｐＡ、ｙｅｂＦ、およびｏｍｐＦからなる群から選択される少なくとも１つのシグナル配列をコードするＤＮＡ配列
ｂ）キャリアペプチドである切断型ｙｅｂＦをコードする、配列番号ＩＤ５と配列番号ＩＤ６からなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡ配列（ここで、配列番号ＩＤ５は配列番号ＩＤ７の切断型ｙｅｂＦをコードし、配列番号ＩＤ６は配列番号ＩＤ８の切断型ｙｅｂＦをコードしていて、配列番号ＩＤ６は、配列番号ＩＤ５の４０位のＴＧＣコドンをＧＣＧコドンに変異することで、配列番号ＩＤ７のアミノ酸配列の１４位のＣｙｓを配列番号ＩＤ８のアミノ酸配列の１４位のＡｌａに変異するように合成されたＤＮＡ配列である）。

【請求項2】

前記シグナル配列をコードするＤＮＡ配列が、
アミノ酸配列ＩＤ９をコードする配列番号ＩＤ１、
アミノ酸配列ＩＤ１１をコードする配列番号ＩＤ２、
アミノ酸配列ＩＤ１０をコードする配列番号ＩＤ３、および
アミノ酸配列ＩＤ１２をコードする配列番号ＩＤ４によって表されるＤＮＡ配列からなる群より選択される、請求項１に記載の細菌発現ベクター。

【請求項3】

前記分泌シグナル配列は、配列番号ＩＤ４で表されるｏｍｐＦのシグナルペプチドのＤＮＡ配列と、切断型ｙｅｂＦペプチドをコードする配列番号ＩＤ６のＤＮＡ配列の組み合わせであり、
前記細菌発現ベクターは、配列番号ＩＤ１３で表される６７９３塩基対である、
請求項１に記載の細菌発現ベクター。

【請求項4】

前記細菌発現ベクターは、組換えタンパク質を、収量０．５ｇ／Ｌから５ｇ／Ｌの範囲で提供する、請求項３に記載の細菌発現ベクター。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、組換えタンパク質の、ペリプラズム空間または細胞外への分泌を増強することができる細菌発現ベクターに関する。より詳細には、本発明は、大腸菌から組換えタンパク質を発現および分泌するための発現ベクターに関する。

【背景技術】

【0002】

インビトロおよびインビボでの組換えタンパク質の異種発現および精製は、近代分子生物学のルーチンな応用により行われる。組換えタンパク質の発現は、典型的には原核宿主細胞において実施され、通常、微生物大腸菌（Eescherichia coli）が、医薬および工業的産業に関連する組換えタンパク質の大量生産のために使用されてきた。このように、公知の方法および機構を用いて、宿主細胞をわずかに改変するだけで、これらの宿主細胞における目的タンパク質の産生を高め、工業的生産におけるその有用性を最大にしてきた。

【0003】

工業的生産の場合、大量の目的タンパク質の精製、及びその後に続く処理を単純化するために、宿主細胞からタンパク質を分泌させることが必要である。大腸菌における目的タンパク質の細胞外産生を増強するために、細菌における発現適合化についての努力がずっと続いている。そのような重要な適合化の1つは、特定の分泌シグナルペプチドを用いて、目的の組換えタンパク質の、ペリプラズム空間または細胞外培地へのトランスロケーションを補助する分泌シグナルペプチドと共に、目的タンパク質を共発現させることである。

【0004】

いくつかの先行技術の引用文献は、宿主細胞から分泌される目的タンパク質を生成するための新規な発現系を提供している。

【0005】

ＵＳ５８３０３８Ａには、宿主細菌の発現タンパク質と異種のタンパク質を発現し、分泌するための発現ベクターが開示されている。この発現ベクターは、異種タンパク質の脂質アシル化および表面発現を達成するように設計され、少なくともリポタンパク質の分泌シグナルをコードするＤＮＡをさらに含んでいる。使用する細菌系は、具体的にはミコバクテリアであり、開示された分泌シグナルは、外側表面タンパク質Ａのミコバクテリアリポタンパク質分泌シグナル配列である。この発現ベクターは、ライム病を治療するために使用されるBorrelia Burgdorferiに対する抗体を誘発する抗原を発現および分泌するために特異的に設計された。

【0006】

ＵＳ５４３２０８２Ａは、異種タンパク質を調製するのに有用な酵母の発現ベクターを開示している。当該発現ベクターは、異種タンパク質の分泌を誘導する合成オリゴヌクレオチドを含み、該合成オリゴヌクレオチドは誘導性ハイブリッドプロモーターＧＡＬ－ＣＹＣと多部位ポリリンカーとの間に配置され、続いて酵母のＲＮＡポリメラーゼによって認識される転写終結のシグナルが続くように配置されている。

【0007】

ＣＮ１０１６８７９１０Ａは、哺乳動物細胞ベースの発現および分泌系を開示している。シグナルペプチド配列をコードするＤＮＡは、ＭＭＲＰをコードするアミノ酸配列（[疎水性アミノ酸]nＴＳＡＬＡ）のＤＮＡ配列、またはコードされたアミノ酸配列（ＭＫＴ[疎水性アミノ酸]ｎＣＡＴＶＨＣ）のＤＮＡ配列から選択される。ここで、ｎは４～１６の整数であり、疎水性アミノ酸はＡ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、ＦまたはＶである。

【0008】

ＣＮ１０７０８２８０１Ａは、タンパク質の分泌効率を向上させることができるｐｅｌＢシグナルペプチド変異体を開示している。

【0009】

大腸菌における分泌方法を操作することにより、多数のタンパク質を産生することに成功したが、依然として産生量を限定する要因がある。すなわち、正しくタンパク質がエクスポートされなかったり、細胞質内での凝集のために、機能的な状態でエクスポートされないといった限定的要因がある。また、細胞の分解；不正確なフォールディング；トランスロケーションまたはタンパク質の分解といった限定的要因もある。

【0010】

本発明は、このような先行技術の欠点を考慮し、組換えタンパク質の細胞外への分泌のための新規な細菌発現ベクターを提供する。

【発明の目的】

【0011】

本発明の主な目的は、組換えタンパク質の細胞外培地への分泌を誘導するための新規な分泌シグナル配列と当該分泌シグナル配列に作動可能に連結された組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列を担持した細菌発現ベクターを提供することにある。前記分泌シグナル配列は、シグナルペプチドのＤＮＡ配列とこれに直列的に結合したキャリアタンパク質のＤＮＡ配列との新規な組み合わせである。

【0012】

従って、本発明の別の目的は、宿主細胞からの組換えタンパク質の分泌を増強するための細菌発現ベクターの構築のための新規な分泌シグナル配列を提供することにある。ここで前記分泌シグナル配列は、
ａ）配列番号ＩＤ１で表されるｐｅｌＢ；配列番号ＩＤ２で表されるｏｍｐＡ；配列番号ＩＤ３で表されるｙｅｂＦ；及び配列番号ＩＤ４で表されるｏｍｐＦからなる群から選択される少なくとも1つのシグナル配列コード遺伝子のＤＮＡ配列と
ｂ）キャリアタンパク質をコードするＤＮＡ配列、好ましくは、配列番号ＩＤ５および配列番号ＩＤ６（配列番号ＩＤ６のＤＮＡは、配列番号ＩＤ５の変異体）で表される切断型ペプチドｙｅｂＦをコードするＤＮＡ配列
との組み合わせである。

【0013】

本発明のさらに別の目的は、宿主細胞、より具体的には、大腸菌からの、組換えタンパク質の細胞外培地への分泌を増強するためのシステムを提供することである。

【発明の概要】

【0014】

本発明の主な実施態様では、本発明は、組換えタンパク質の容易かつ効率的な精製のために、宿主細菌細胞、好ましくは大腸菌からの組換えタンパク質の分泌を増強するための新規な細菌発現ベクターを提供する。宿主細菌細胞からの組換えタンパク質の分泌を増強するための前記細菌発現ベクターは、
少なくとも1つの分泌シグナル配列；
少なくとも１つの誘導性プロモーター、ＲＢＳ、組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列、アフィニティタグをコードするＤＮＡ配列、及び少なくとも１つの遺伝子ターミネーターからなる少なくとも１つの遺伝子発現カセットで、前記分泌シグナル配列と前記遺伝子カセットとは作動可能に連結されていて、前記組換えタンパク質のＤＮＡ配列と前記アフィニティタグのＤＮＡ配列とが作動可能に連結されている遺伝子発現カセット；
宿主細菌細胞においてベクターを複製するための、少なくとも1つの細菌性ｏｒｉ遺伝子配列；並びに
好適なプロモータを伴った選択マーカーをコードする少なくとも1つのＤＮＡ配列と、当該選択マーカーのＤＮＡ配列に隣接する遺伝子ターミネーター配列
を含む。

【0015】

さらに、前記分泌シグナル配列は、以下のａ）とｂ）との組み合わせである。
ａ）配列番号ＩＤ９のアミノ酸配列をコードする配列番号ＩＤ１に示されるｐｅｌＢのＤＮＡ配列、配列番号ＩＤ１１のアミノ酸配列をコードする配列番号ＩＤ２に示されるシグナルペプチドｏｍｐＡのＤＮＡ配列、配列番号ＩＤ１０のアミノ酸配列をコードする配列番号ＩＤ３に示されるシグナルペプチドｙｅｂＦのＤＮＡ配列、及び配列番号ＩＤ１２のアミノ酸配列をコードする配列番号ＩＤ４に示されるシグナルペプチドｏｍｐＦのＤＮＡ配列からなる群より選択される少なくとも1つのシグナルペプチド遺伝子のＤＮＡ配列；及び
ｂ）キャリアペプチドをコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列、好ましくは、切断型ｙｅｂＦをコードするＤＮＡ配列。当該切断型ｙｅｂＦコードＤＮＡ配列は、配列番号ＩＤ５および配列番号ＩＤ６からなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡ配列で、配列番号ＩＤ５は、配列番号ＩＤ７の切断型ｙｅｂＦをコードし、配列番号ＩＤ６は、配列番号ＩＤ８の切断型ｙｅｂＦをコードする。また、配列番号ＩＤ６のＤＮＡは、配列番号ＩＤ５のＤＮＡを変異させることによって合成される。具体的には、配列番号ＩＤ５における４０位のＴＧＣコドンが、配列番号ＩＤ６ではＧＣＧコドンに変異することで、配列番号ＩＤ７で表されるアミノ酸配列の14位のＣｙｓが配列番号ＩＤ８で表されるアミノ酸配列１４位のＡｌａに変異する。

【0016】

配列番号ＩＤ１３で表される細菌発現ベクターは、６７９３塩基対のベクターであり、分泌シグナル配列を含んでいる。当該分泌シグナル配列は、配列番号ＩＤ４で表されるｏｍｐＦのシグナルペプチドのＤＮＡ配列と、配列番号ＩＤ６でコードされる切断型ｙｅｂＦペプチドのＤＮＡ配列との組み合わせである。

【0017】

さらに別の実施形態では、組換えタンパク質の精製が可能な組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結された少なくとも1つのアフィニティタグ配列を含む新規な細菌発現ベクターを提供する。

【0018】

さらに別の実施形態では、ベクターとしての機能に必要な基礎的ベクター中で、分泌シグナル配列に、追加的要素を接合していてもよい。別の実施形態のベクターでは、少なくとも1つの抗生物質選択マーカー、および少なくとも1つの追加的選択マーカーを含む。選択マーカーは誘導性ｌａｃオペロンであり、ベクターはｌａｃオペロン下で、ラクトース又はＩＰＴＧなどのラクトース類似体によって誘導される誘導性ベクターである。

【図面の簡単な説明】

【0019】

本発明の目的は、本明細書の一部を形成する添付図面に示されている特定の実施形態を参照しつつ、上記で簡単に要約された本発明のより詳細かつより特定的に理解されることができる。添付図面は、本発明の好ましい実施形態を示しているだけであり、本発明の範囲を限定するものではない。本発明は、効果的に等しい他の等価的態様を含むことに留意されたい。

【0020】

【図1】目的のタンパク質／ペプチドの、宿主細胞外への分泌を増強するための分泌シグナル配列の組み合わせを含む新規な細菌発現ベクターの概略図である

【図2】ｐＢａｃＳｅｃ－ＬＣベクターの概略図である

【図3】ガウス型ルシフェラーゼアッセイを用いた、配列番号ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３及びＩＤ４の効率を比較したグラフである。

【図4】配列番号ＩＤ４と配列番号ＩＤ６との組み合わせである分泌シグナル配列を有するｐＢａｃＳｅｃ－ＬＣ発現ベクターの細菌細胞培養の培地成分及びライセートについてのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの写真である。

【図5】ＩＰＴＧによる誘導後、経過時間毎の組換えタンパク質の収量を表すグラフである。

【図6】還元又は非還元条件下における、配列番号ＩＤ４とＩＤ５の組み合わせ、又は配列番号ＩＤ４とＩＤ６の組合せである分泌シグナル配列を有するｐＢａｃＳｅｃ－ＬＣ発現ベクターの細菌細胞培養の培地成分に関するＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの写真である。

【発明の詳細な説明】

【0021】

使用した略号は以下のとおり。
ｐｅｌＢ：pectatelyase ＢのＮ末端アミノ酸残基をコードするリーダーＤＮＡ配列。
ｏｍｐＡ：外膜タンパク質Ａのアミノ酸残基をコードするリーダーＤＮＡ配列。
ｏｍｐＦ：外膜タンパク質Ｆのアミノ酸残基をコードするリーダーＤＮＡ配列。
ｙｅｂＦ：タンパク質ｙｅｂＦのアミノ酸残基をコードするリーダーＤＮＡ配列。
Ａｍｐ^ｒ/Ｋａｎ^ｒ：アンピシリン／カナマイシン抵抗性遺伝子をコードするＤＮＡ配列。
Ｆｌ Ｏｒｉ：複製起点。
ｐｔａｃプロモーター：ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ７ポリメラーゼを結合するためのプロモーター。
ＬａｃまたはＬａｃｌ：ｌａｃリプレッサー／オペロンをコードするＤＮＡ配列。
ＩＰＴＧ：イソプロピルβ－d－l－チオガラクトピラノシドで、lacオペロンの誘導剤。
Ｌａｃｔｏｓｅ：ｌａｃオペロンの二糖誘導剤。
ＲＢＳ：リボソーム結合部位。
組換えタンパク質：発現ベクター中でクローニングされた遺伝子によりコードされ、且つ細菌細胞内で発現される目的タンパク質。

【0022】

以下、本発明を詳細な説明を参照して説明する。詳細な説明には、本発明のいくつかの実施形態が示されているが、全ての実施形態は示されていない。実際、本発明は、多くの異なる形態で実施することができ、本明細書に記載された実施形態に限定されるように解釈されるべきではなく、むしろ、これらの実施形態は、本開示が適用可能な法的要件を満たすように提供される。本発明は、非限定的な実施形態および例示的な実験を用いて本明細書に完全に記載される。

【0023】

本発明は、組換えタンパク質の容易かつ効率的な精製のために、宿主細菌細胞、好ましくはＥ．ｃｏｌｉからの組換えタンパク質の分泌を増強するための新規な細菌発現ベクターに関する。

【0024】

主な実施形態において、本発明は、組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列（１０３）と直列に結合している分泌シグナル配列を含む、図１に示される細菌発現ベクター（１００）を提供する。ここで、分泌シグナル配列とは、下記ａ）とｂ）とからなる組み合わせである。
ａ）アミノ酸配列ＩＤ９をコードする配列番号ＩＤ１で表されるｐｅｌＢ（ＤＮＡ）、アミノ酸配列ＩＤ１１をコードするＩＤ２によって表されるｏｍｐＡ（ＤＮＡ）、アミノ酸配列ＩＤ１０をコードするＩＤ３によって表されるｙｅｂＦ（ＤＮＡ）、及びアミノ酸配列ＩＤ１２をコードするＩＤ４によって表されるｏｍｐＦ（ＤＮＡ）からなる群より選択される少なくとも1つのシグナル配列コード遺伝子のＤＮＡ配列（１０１）；並びに
ｂ）キャリアペプチドをコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列（１０２）、好ましくは、切断型ｙｅｂＦをコードする配列番号ＩＤ５およびＩＤ６で表されＤＮＡ配列。
配列番号ＩＤ５はＩＤ７で表される３３アミノ酸のキャリアペプチドをコードし、配列番号ＩＤ６はＩＤ８で表されるペプチドをコードする。
ＤＮＡ配列ＩＤ６は配列ＩＤ５を変異させることによって合成される。配列番号ＩＤ５の40位のＴＧＣコドンがＧＣＧコドンに変異することで、配列番号ＩＤ７の１４位のＣｙｓが配列番号ＩＤ８の１４位のＡｌａに変異される。

【0025】

表１は、シグナル配列またはキャリアペプチドをコードするＤＮＡ配列を提供する。

【表1】

【0026】

別の実施形態では、細菌発現ベクターは、さらに、少なくとも1つの誘導性プロモーター、ＲＢＳ、組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列、アフィニティタグをコードするＤＮＡ配列、および少なくとも1つの遺伝子ターミネーターを含む少なくとも１つの遺伝子発現カセットで、分泌シグナル配列が当該遺伝子発現カセットに作動可能に連結され、アフィニティタグのＤＮＡ配列が組換えタンパク質のＤＮＡ配列に作動可能に連結されている。この細菌発現ベクターは、さらに、プロモーター下で組換えタンパク質のＤＮＡ配列のクローニングを可能にする少なくとも1つの多重クローニング部位（ＭＳＣ）を含む。

【0027】

さらに別の実施形態では、細菌発現ベクターは、少なくとも1つの抗生物質抵抗性遺伝子、およびそれぞれの遺伝子プロモーターによって制御される少なくとも1つの選択マーカーをさらに含む。

【0028】

さらに別の実施形態では、細菌発現ベクターは、宿主細胞における発現ベクターの複製を可能にするための少なくとも1つのｏｒｉ配列を含む。

【0029】

さらに別の実施形態では、細菌発現ベクターであるｐＢａｃＳｅｃ－ＬＣは、ｌａｃオペロン下で誘導可能であり、ラクトースまたはＩＰＴＧ等のラクトース類似体によって誘導される。図２に示されているように、新規な細菌発現ベクターであるｐＢａｃＳｅｃ－ＬＣは、分泌シグナル配列と直列的に結合された組換えタンパク質の効率的かつ分泌増強のための分泌シグナル配列を含んだ、約６７９３塩基対である。ｐＢａｃＳｅｃ－ＬＣベクターは、以下のものを含む。
ｔａｃプロモーターおよび誘導性プロモーターとしてのｌａｃオペレーター；
ＲＢＳ；
配列番号ＩＤ１～４からなる群より選択されるシグナル配列遺伝子のＤＮＡ配列と、配列番号ＩＤ５または配列番号ＩＤ６で表されるＤＮＡ配列との組み合わせである分泌シグナル配列；
アフィニティタグである６－Ｈｉｓタグ及びＦＬＡＧタグをコードするＤＮＡ配列；
組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列；
組換えタンパク質の転写終結のための遺伝子ターミネーター；
Ｅ.ｃｏｌｉ内のベクターの複製を可能にするためのｏｒｉ配列；
青色－白色組換えコロニー選択のための選択マーカーとしてのｌａｃオペロン；並びに
抗生物質選択マーカーとしてのカナマイシン抵抗性遺伝子。

【0030】

配列番号ＩＤ１３で表されるｐＢａｃＳｅｃ－ＬＣベクターは、ｏｍｐＦのシグナル配列をコードする配列番号ＩＤ４で表されるＤＮＡ配列と、切断型ｙｅｂＦをコードする配列番号ＩＤ６で表されるＤＮＡ配列との組み合わせである分泌シグナル配列を含む。

【実施例1】

【0031】

シグナル配列とキャリアペプチドとの異なる組み合わせの分泌効率
Ａ．ルシフェラーゼアッセイ
Ｅ.ｃｏｌｉ株、ＮＥＢ５－ａｌｐｈａおよびＢＬ２１（ＤＥ３）を、形質転換およびルシフェラーゼアッセイのために使用した。

【0032】

組み合わせが異なる、以下のような分泌シグナルを構築した。
ａ）配列番号ＩＤ１で表されるシグナル配列と、配列番号ＩＤ５で表されるキャリアタンパク質との組み合わせ。
ｂ）配列番号ＩＤ２で表されるシグナル配列と、配列番号ＩＤ５で表されるキャリアタンパク質との組み合わせ。
ｃ）配列番号ＩＤ３で表されるシグナル配列と、配列番号ＩＤ５で表されるキャリアタンパク質との組み合わせ。
ｄ）配列番号ＩＤ４で表されるシグナル配列と、配列番号ＩＤ５で表されるキャリアタンパク質の組み合わせ。

【0033】

大腸菌の分泌活性の検査のためのレポーター系として、ガウス型ルシフェラーゼを使用した。ガウス型ルシフェラーゼ分析は、Pierce Gaussia Luciferase glowアッセイキットを用いて行った。製造業者のプロトコルに記載されているように、誘導後に、一定時間間隔で培地を採集し、培地のルシフェラーゼ活性を測定した。

【0034】

図３に示すように、配列番号ＩＤ５で表されるキャリアタンパク質と各シグナルペプチドとの組み合わせのうち、配列ＩＤ４で表されるｏｍｐＦのシグナルペプチドとＩＤ５で表されるキャリアタンパク質との組み合わせが、より優れた分泌効率を示した。

【0035】

Ｂ．５－２０ｋＤａのペプチド分泌の効率
i 発現ベクターの構築：５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１５ｋＤａ、および２０ｋＤａのペプチドをコードする組換えタンパク質のＤＮＡ配列を、配列番号ＩＤ４および配列番号ＩＤ６を含む分泌シグナル配列を有するｐＢａｃＳｅｃ－ＬＣベクター中にクローン化した。
ii スターター培養の調製：オートクレーブ処理した増殖培地３ｍｌ（ｐＨ６．９０）を、無菌スナップキャップ管に入れた。Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ寒天プレートから１ＣＦＵを採取し、増殖培地に無菌的に接種し、回転インキュベーター内で２２５ｒｐｍで３７℃で一晩インキュベートした。
iii 振盪フラスコ培養：一晩培養したスターター培地（１ｍｌ）を、ｐＨ６．９０の増殖培地（２５ｍｌ）がはいったバッフル付きフラスコ（２５０ｍｌ）に接種した（１：２５希釈液）。フラスコは、３７℃、２２５ｒｐｍに維持した回転振盪器インキュベーター中でインキュベートした。４時間培養後、ＯＤ６００は、１．８から２．０に達した。細胞を０．２ｍＭイソプロピルβ－ｄ－ｌ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導した。ＩＰＴＧは、ｌａｃオペロンの誘導剤である。誘導後、グリシン、グルタミン酸、アルギニン、還元型グルタチオンを添加した。誘導後、１時間毎にサンプルを採取し、３００μｌの培養物を、１４Ｋｒｐｍで３分間遠心分離することにより、細胞と培地を分離し、タンパク質の発現および分泌を確認した。細胞を破砕し、細胞ライセートを得た。得られた細胞ライセートと培地成分を比較することにより、組換えペプチドの存否を調べた。
ｉｖ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ：誘導後の培養培地から目的の組換えタンパク質の異種遺伝子発現を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析した。図４に示すように、５～２０ｋＤａの組換えペプチドは、細胞ライセートよりも、培地成分中に存在することが明確に認められた。５～２０ｋＤａの全ペプチドが同程度の効率で等しく分泌された。このことは、この分泌配列が５～２０ｋＤａの範囲のペプチドを分泌できることを示す。

【0036】

Ｃ．組換えタンパク質の収量
組換えタンパク質のＤＮＡ配列を、配列番号ＩＤ１３のｐＢａｃＳｅｃ－ＬＣベクター中にクローニングし、大腸菌（Ｅ.ｃｏｌｉ）中で形質転換した。大腸菌（Ｅ.ｃｏｌｉ）スターター培養物を調製し、そして前述の実施例１のセクションＢよりもさらにスケールアップした。Ｅ.ｃｏｌｉ培養物を、組換えタンパク質発現のために０．２ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、そしてＩＰＴＧによる誘導後の異なる時間間隔で、分泌された組換えタンパク質の量を測定した。

【0037】

図５に示すように、誘導１時間後の組換えタンパク質の収率は約０．５ｇ／ｌであり、６時間後には、組換えタンパク質の収率は５ｇ／ｌ以上となった。組換えタンパク質の収量は誘導後、１時間毎に一貫して増加する。このことは、本発明の細菌分泌技術により、所望の細胞密度に達成した後は、誘導による細胞のタンパク質発現および分泌について、細胞を最大限利用できることが可能になったことを示唆している。誘導後の最初の１時間は、細胞増殖機構を止めることなく、組換えタンパク質が培地中に分泌される。

【実施例2】

【0038】

配列番号ＩＤ５と配列番号ＩＤ６の分泌効率の比較
配列番号ＩＤ４と配列番号ＩＤ５との組み合わせ、または配列番号ＩＤ４と配列番号ＩＤ６の組み合わせからなる分泌シグナル配列を有するｐＢａｃＳｅｃ－ＬＣベクターに、組換えタンパク質のＤＮＡ配列をクローン化した。

【0039】

配列番号ＩＤ６は、配列番号ＩＤ５を変異させることにより合成され、配列番号ＩＤ５の４０位のＴＧＣコドンが配列番号ＩＤ６ではＧＣＧコドンに変異し、配列番号ＩＤ７の１４位のＣｙｓが配列番号ＩＤ８においてＡｌａに変異している。ペプチドの１４位のＣｙｓ残基は二量体化することができ、封入体を発生しやすくする。ＣｙｓをＡｌａに変異することによりペプチドの二量体化を抑制でき、これにより封入体の形成可能性を低減し、結果として、ペプチドおよび組換えペプチドの分泌を増強できるであろう。

【0040】

Ｅ.ｃｏｌｉ細胞をそれぞれのベクターで形質転換し、そして２組の培養物を還元条件下および非還元条件下で調製し、次いで、ＩＰＴＧを用いてペプチド分泌を誘導した。

【0041】

図６に示すように、配列番号ＩＤ５を用いた場合、還元条件下では、非還元条件下よりも多くの分泌を示した。このことは、還元条件下では、コードされたペプチドの１４位のＣｙｓ残基の二量体化による封入体の発生が、減少したためと考えられる。したがって、１４位でのＣｙｓのＡｌａへの変異は分泌に重要であると考えられる。配列番号ＩＤ６の場合は、還元条件下及び非還元条件下で同じ結果を示した。

【0042】

特定の例示的な実施形態が添付の図面に記載および示されているが、そのような実施形態は単なる例示であり、広範な発明を限定するものではない。以上に記載された態様に、他の様々な変更、組み合わせ、省略、修正および置換が可能であるから、本発明は、示される特定の構造および配置に限定されないことを理解されたい。当業者は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、今説明した実施形態の様々な適合および修正を構成できることを理解するであろう。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

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