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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-07-08
(45)【発行日】2024-07-17
(54)【発明の名称】ヘルペスウイルス感染を処置するための手段及び方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/38 20060101AFI20240709BHJP
A61K 39/245 20060101ALI20240709BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240709BHJP
A61P 31/22 20060101ALI20240709BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20240709BHJP
【ＦＩ】
C12N15/38
A61K39/245
A61K48/00
A61P31/22
C12N7/01 ZNA
【請求項の数】
14
(21)【出願番号】P 2018545647
(86)(22)【出願日】2017-02-28
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2019-05-09
(86)【国際出願番号】 EP2017054615
(87)【国際公開番号】W WO2017148928
(87)【国際公開日】2017-09-08
【審査請求日】2020-02-20
【審判番号】
【審判請求日】2022-04-06
(31)【優先権主張番号】16000493.3
(32)【優先日】2016-03-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】93002
(32)【優先日】2016-03-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】LU
(73)【特許権者】
【識別番号】501357201
【氏名又は名称】ヘルムホルツ ツェントゥルム ミュンヘン ドイチェス フォルシュングスツェントゥルム フューア ゲズントハイト ウント ウムヴェルト （ゲーエムベーハー）
(74)【代理人】
【識別番号】110001508
【氏名又は名称】弁理士法人 津国
(72)【発明者】
【氏名】ハンマーシュミット，ヴォルフガング
(72)【発明者】
【氏名】ツァイドラー，ラインハルト
(72)【発明者】
【氏名】ピヒ，ダクマー
【合議体】
【審判長】光本 美奈子
【審判官】冨永 みどり
【審判官】田村 直寛
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１５－５０３９１５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１３－５４１５０７（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
A61K
C07K
C12N
C12P
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＭＥＤＬＩＮＥ／ＣＡｐｌｕｓ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ／ＷＰＩＤＳ／ＦＳＴＡ／ＡＧＲＩＣＯＬＡ／ＢＩＯＴＥＣＨＮＯ／ＳＣＩＳＥＡＲＣＨ／ＴＯＸＣＥＮＴＥＲ（ＳＴＮ）
Ｐｕｂｍｅｄ
Ｇｏｏｇｌｅ
Ｇｏｏｇｌｅ Ｓｃｈｏｌａｒ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）タンパク質を含み、ＥＢＶｍｉＲＮＡを欠いており、該ＥＢＶｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－ＢＨＲＦ１－１、ｍｉＲ－ＢＨＲＦ１－２、ｍｉＲ－ＢＨＲＦ１－３、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ１、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ２、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ３、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ４、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ５及びｍｉＲ－ＢＡＲＴ１５である、エプスタイン・バーＶＬＰ（ＥＢＶＬＰ）。
【請求項2】
ＥＢＶｍｉＲＮＡがＥＢＶＬＰをコードする核酸分子に対する遺伝子的改変により欠いており、ここで遺伝子改変は、前記ＥＢＶｍｉＲＮＡが発現されない、前記ＥＢＶｍｉＲＮＡの前駆体が間違った３次元構造を有する、前記ＥＢＶｍｉＲＮＡの前駆体がさらにプロセシングされない、前記ＥＢＶｍｉＲＮＡの前駆体が細胞によって分解される、前記ＥＢＶｍｉＲＮＡがスクランブル配列を有する、前記ＥＢＶｍｉＲＮＡが欠失する、及び／又は、前記ＥＢＶｍｉＲＮＡの前駆体が突然変異、欠失、若しくは挿入を含むことをもたらす、請求項１のＥＢＶＬＰ。
【請求項3】
前記のＥＢＶＬＰが、ＥＢＶｍｉＲＮＡを含むＥＢＶＬＰと比較したとき、増加した免疫応答をもたらし、該増加は、請求項１又は２のＥＢＶＬＰと共にインキュベートした免疫細胞の上清中の炎症誘発性サイトカインの濃度を測定すること、及び前記のサイトカイン濃度を、野生型ウイルスと同一であるｍｉＲＮＡを含むＥＢＶＬＰと共にインキュベートした免疫細胞の上清中のサイトカイン濃度と比較することを含む、定量的ＥＬＩＳＡで決定したところ少なくとも５％である、請求項１又は２のＥＢＶＬＰ。
【請求項4】
前記ＥＢＶタンパク質をコードしている少なくとも１つの核酸分子が、ＥＢＶＬＰを産生する段階でＥＢＶＬＰにパッケージングされないように遺伝子改変されている、請求項２又は３のＥＢＶＬＰ。
【請求項5】
（ｉ）前記ＥＢＶタンパク質をコードしている少なくとも１つの核酸分子が、ＥＢＶＬＰを産生する段階でパッケージングに必要とされる機能的なシスエレメントを欠いているか、（ｉｉ）前記ＥＢＶタンパク質をコードしている少なくとも１つの核酸分子が、該ＥＢＶタンパク質が機能しないように遺伝子改変されている、パッケージングに必要とされるＥＢＶタンパク質をコードしている少なくとも１つの遺伝子を含む、請求項４のＥＢＶＬＰ。
【請求項6】
前記ＥＢＶＬＰが、ＥＢＶゲノムを含まない、請求項１～５のいずれか一項のＥＢＶＬＰ。
【請求項7】
前記ＥＢＶタンパク質をコードしている核酸分子が、ＥＢＶＬＰを産生する段階で
（ｉ）該ＥＢＶタンパク質が機能しないように遺伝子改変されている、細胞形質転換に必要とされるＥＢＶタンパク質をコードしている少なくとも１つの遺伝子、及び／又は
（ｉｉ）該ＥＢＶタンパク質が機能しないように遺伝子改変されている、ウイルス合成を誘導するために必要とされるＥＢＶタンパク質をコードしている少なくとも１つの遺伝子
を含む、請求項１～６のいずれか一項のＥＢＶＬＰ。
【請求項8】
（ｉ）前記ＥＢＶタンパク質をコードしている核酸分子が、ＥＢＶＬＰを産生する段階でＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ－ＬＰ、ＥＢＮＡ２、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２、ＥＢＮＡ３Ａ、及びＥＢＮＡ３Ｃからなる群より選択される、Ｂ細胞形質転換に必要とされるＥＢＶタンパク質をコードしている、少なくとも１つの遺伝子を含み、ＥＢＶタンパク質が機能しないように遺伝子改変されており、（ｉｉ）前記ＥＢＶタンパク質をコードしている核酸分子が、該ＥＢＶタンパク質が機能しないように遺伝子改変されている、ＢＺＦＬ１、ＢＲＬＦ１、及びＢＭＬＦ１からなる群より選択される、ウイルス合成を誘導するために必要とされるＥＢＶタンパク質をコードしている少なくとも１つの遺伝子を含む、
（ｉｉｉ）前記ＥＢＶタンパク質をコードしている核酸分子が、パッケージングエレメントＴＲを欠失している、
（ｉｖ）前記ＥＢＶタンパク質をコードしている少なくとも１つの核酸分子が、該ＥＢＶタンパク質が機能しないように遺伝子改変されている、ＢＦＬＦ１、ＢＢＲＦ１、ＢＧＲＦ１、ＢＤＲＦ１、ＢＡＬＦ３、ＢＦＲＦ１Ａ、及びＢＦＲＦ１からなる群より選択される、ＥＢＶ ＤＮＡのパッケージングに必要とされるＥＢＶタンパク質をコードしている少なくとも１つの遺伝子を含む、及び／又は
（ｖ）前記ＥＢＶタンパク質をコードしている核酸分子が、ＥＢＶゲノムを含む、請求項１～７のいずれか一項のＥＢＶＬＰ。
【請求項9】
（ｉ）ＥＢＶＬＰと関連するｍｉＲＮＡ（ＥＢＶｍｉＲＮＡ）をコードするｍｉＲＮＡコード遺伝子座を含むエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）ゲノムを含む宿主細胞を得る工程であって、全てのＥＢＶｍｉＲＮＡをコードする遺伝子座が、ＥＢＶｍｉＲＮＡが産生されないように遺伝子的に修飾されており、前記ＥＢＶｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ－ＢＨＲＦ１－１、ｍｉＲ－ＢＨＲＦ１－２、ｍｉＲ－ＢＨＲＦ１－３、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ１、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ２、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ３、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ４、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ５及びｍｉＲ－ＢＡＲＴ１５である、工程；（ｉｉ）ＥＢＶタンパク質の発現を可能とする条件下で（ｉ）の宿主細胞を培養する工程；及び
（ｉｉｉ）ＥＢＶＬＰを得る工程
を含む、ＥＢＶＬＰを生成するための方法。
【請求項10】
工程（ｉｉ）の後及び工程（ｉｉｉ）の前に、エプスタイン・バーウイルスの複製期を誘導する工程を含むさらなる工程（ｉｉ'）を含み、該複製期は、ＥＢＶ合成を誘導するために必要とされるＥＢＶタンパク質をコードしている、少なくとも１つの遺伝子を発現させることによって誘導され、該ＥＢＶＬＰのＥＢＶタンパク質をコードしている少なくとも１つの核酸分子によって含まれる少なくとも１つの遺伝子は、該ＥＢＶタンパク質が機能しないように遺伝子改変されている、請求項９の方法。
【請求項11】
（ａ）前記遺伝子が、前記宿主細胞によって含まれる安定にトランスフェクトされたベクターから発現され、及び／又は、該遺伝子の発現が誘導的に調節されている、及び／又は（ｂ）前記ＥＢＶタンパク質をコードしている前記遺伝子が、ＢＺＬＦ１、ＢＲＬＦ１、及びＢＭＬＦ１からなる群より選択される、請求項１０の方法。
【請求項12】
ＥＢＶＬＰをコードする核酸分子に対する該遺伝子改変について、前記ＥＢＶｍｉＲＮＡが発現しないように、前記ＥＢＶｍｉＲＮＡの前駆体は誤った３Ｄ構造を有し、前記ＥＢＶｍｉＲＮＡの前駆体はさらにプロセシングされず、前記ＥＢＶｍｉＲＮＡの前駆体は細胞により分解され、前記ＥＢＶｍｉＲＮＡコード遺伝子座がスクランブルされた配列を有し、前記ＥＢＶｍｉＲＮＡコード遺伝子座が欠失され、及び／又は前記ＥＢＶｍｉＲＮＡの前駆体が突然変異、欠失又は挿入を含むような効果を有する、請求項９～１１のいずれか一項の方法。
【請求項13】
請求項１～８のいずれか一項のＥＢＶＬＰを含み、賦形剤をさらに含む、ワクチン組成物。
【請求項14】
ＥＢＶ感染を予防又は治療するための被験者のワクチン接種又は処置における使用のための、請求項１～８のいずれか一項のＥＢＶＬＰ、又は請求項１３のワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）は、世界の人口の９０％以上に感染している発癌性ヘルペスウイルスであるが、免疫力の低下した宿主に対して特に大きな脅威を引き起こす。ＥＢＶは、多くの急性及び慢性の障害、炎症障害、自己免疫障害、及び悪性障害に関与し、これには、免疫抑制患者における数種類の重篤かつ生命に脅威を及ぼすリンパ増殖性疾患も含まれる。リスクのある患者、並びにＨＩＶ感染患者、及び先天性免疫不全症患者は、実質臓器又は造血幹細胞移植（ＳＯＴ／ＳＣＴ）の候補である。ＥＢＶに関連した移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）の重要なリスク因子は移植時の血清陰性であり、これは小児における特に高い比率のＰＴＬＤを説明する。移植の種類に応じて、１５％以下の小児移植患者が罹患し、最終的にはその中の２０％がＰＴＬＤに陥る（Mynarek et al., Clin Dev Immunol. 2013; 2013:814973）。
【0002】
ＥＢＶは、遍在性かつ免疫原性である。この発癌性ヘルペスウイルス（IARC Working Group, IARC Monogr. Eval. Carcinog. Risks Hum. 94, 46-70 (2010)）は、その感染が確立されると免疫応答をかわすために複数の遺伝子を進化させてきた（Ressing et al., Semin. Cancer Biol. 18, 397-408 (2008))）。しかしながら、これらのウイルス遺伝子は、ＥＢＶの主な標的細胞であるＢリンパ球への感染時に直ちに蓄積するわけではない。したがって、治療好機である初期感染はその弱点であり、ＥＢＶが宿主の免疫応答により防御されていない。
【0003】
予防ワクチンは、ＥＢＶに関連した悪性疾患及び非悪性疾患の負荷を低減させることに対する最も効果的な工程であると考えられている。ＰＴＬＤだけでなく小児及び成人における伝染性単核球症（ＩＭ）及び風土病のバーキットリンパ腫も、ＥＢＶ予防ワクチンの適応症として同定された疾患である（Balfour, Curr Opin Virol., 2014, vol.6, pp. 1-5; Cohen et al., Sci Transl Med., 2011, 3(107):107fs7; Cohen et al., Vaccine, 2013, 31 Suppl 2:B194-6）。これらの疾患はまた、計画されたＶＬＰワクチンを用いての有効性試験の第二の標的でもある。エプスタインは、ほぼ４０年前に最初のワクチンの提案を行なったが、生ワクチンは依然として入手できていない。類人猿以外の扱いやすい動物モデルがないこと及びウイルスの複雑さによって進歩がかなり妨げられている。ＥＢＶ感染又は関連疾患を予防するための大半のワクチンの努力は、ビリオンの最も豊富な糖タンパク質でありかつ天然に存在する中和抗体の主な標的である、ｇｐ３５０に焦点が当てられている。可溶形のｇｐ３５０を用いてのワクチン接種は、ＥＢＶ血清陰性成人におけるＩＭの比率を低下させたが、ＥＢＶ感染率に対しては全く効果を及ぼさなかった（Sokal et al., J Infect Dis., 2007, 196(12):1749-53）。別のｇｐ３５０に基づいたワクチンは、移植を待っている慢性腎疾患を有するＥＢＶ陰性小児において抗体応答を誘導したが、移植後のＥＢＶ関連疾患の有害な結果を予防しなかった（Rees et al., Transplantation, 2009, 88(8):1025-9）。要約すると、いくつかのワクチン接種臨床試験は、ＥＢＶ関連疾患に対する予防的ワクチン接種は実行可能であることを示すが、該試験はまた、現在のワクチン接種戦略は、全てのワクチン接種者における一次感染及び／又はＥＢＶ関連疾患を予防するためにかなり改善される必要があることを実証する。したがって、ＥＢＶに対するワクチンの充足されていない緊急の必要性がある。
【0004】
本発明者らは、ＥＢＶが初代Ｂ細胞に感染すると、そのコードされているｍｉＲＮＡを用いて獲得免疫応答の複数の部門を効率的に抑制することを明らかとした。ＥＢＶは、抗原特異的Ｔ細胞の活性化及び認識に必要とされる３つ全てのシグナル（（ｉ）抗原性ペプチドの処理及びＴ細胞への提示；（ｉｉ）Ｔ細胞活性化を調節するＥＢＶ感染Ｂ細胞上における重要な共受容体のレベル；及び（ｉｉｉ）ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を抗ウイルスＴｈ１ヘルパー細胞へと傾ける炎症性サイトカイン及び他のサイトカインの分泌）を制御し、これによりｍｉＲＮＡは、新たに感染したＢリンパ球が免疫により根絶されることから防御し、ＥＢＶの生涯続く成功を可能とする。すなわち、本発明者らは、ＥＢＶのｍｉＲＮＡが細胞内の遺伝子に直接標的化して、サイトカインの分泌、抗原の処理、ＥＢＶ特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞によるウイルス感染細胞の認識、並びに／又はナイーブＴ細胞から抗ウイルスＴｈ１細胞への分化を阻害することを発見した。単一の病原体の複数のｍｉＲＮＡによる獲得免疫応答の多様かつ強力な阻害は、意外であり前例のないものであった。
【0005】
本発明者らによって得られた結果はまた、複合した持続的なウイルス中のｍｉＲＮＡの豊富さを説明し得、ヒト病原体が、強力な獲得免疫応答にも関わらずその宿主の生涯にわたりどのようにして排除から逃れ得るかを明白にし得る。この全体的な抑制により、ウイルスは、Ｔ細胞による破壊を逃れつつ、その生涯におよぶ感染を確立するために初期に必要とされる、細胞における抗原性機能を発現することが可能となる。
【0006】
自然な感染を綿密に模倣したヒト細胞モデルを使用することによって、本発明者らは、ＥＢＶのｍｉＲＮＡが、添付の実施例に詳細に記載されかつ図に例示されているような抗ウイルス獲得免疫の複数の経路を打ち消すことを発見した。
【0007】
感染におけるＥＢＶ ｍｉＲＮＡの卓越した役割に関する本発明者らの驚くべき所見から、ＥＢＶからだけでなく、ＥＢＶが属する他のヘルペスウイルスからもこのようなｍｉＲＮＡを排除することが望ましいだろう。事実、ＥＢＶとは別に、他のヘルペスウイルスも、ＥＢＶのｍｉＲＮＡと同様なこのような卓越した役割を有すると考えられるｍｉＲＮＡを有することが知られている（Boss et al,. 2009, Trends in Microbiology, vol. 17, issue 12, pp. 544-553）。
【0008】
したがって、本発明は、少なくとも１つのウイルスｍｉＲＮＡ又は好ましくは全てのウイルスｍｉＲＮＡを欠失しているヘルペスウイルス、例えばガンマヘルペスウイルス、例えば、ＥＢＶを提供する。少なくとも１つのウイルスｍｉＲＮＡ又は好ましくは全てのウイルスｍｉＲＮＡを欠失しているこのようなヘルペスウイルスは有利にはまた、それらのゲノム又は該ウイルスのタンパク質部分をコードしている核酸分子をキャプシドにパッケージングすることができず、これにより、ヘルペスウイルスゲノム又は該ウイルスのタンパク質部分をコードしている核酸分子及びｍｉＲＮＡを実質的に含まない、ヘルペスウイルス様粒子（ＨＶＬＰ）又はエプスタイン・バーウイルス様粒子（ＥＢＶＬＰ）が生成される。
【0009】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、成熟ビリオンに構造的に類似しているが、ウイルスゲノムを欠失している。それ故、ＶＬＰは、ワクチン接種のための有望な候補である。したがって、本発明のこのようなＨＶＬＰ及びＥＢＶＬＰは、ヘルペスウイルスワクチンとして使用され得る。
【0010】
それ故、本発明は、ヘルペスウイルスｍｉＲＮＡをコードしているｍｉＲＮＡコード遺伝子座を依然として含む少なくとも１つの核酸分子によってコードされるヘルペスウイルスタンパク質を含むヘルペスウイルス様粒子（ＨＶＬＰ）を提供し、該ｍｉＲＮＡコード遺伝子座の少なくとも１つは遺伝子改変されている。
【0011】
「ヘルペスウイルス様粒子」及び「ＨＶＬＰ」という用語は本明細書において同義語として使用され、感染性ヘルペスウイルス粒子と形態学的特性及び免疫学的特性を共有しているが、ウイルスゲノムを欠失しており、したがって、好ましくは感染を伝播できず及び／又は適切な宿主細胞において複製できない粒子に関する。本発明によるＨＶＬＰは原則的に、野生型ウイルスの全てのウイルスタンパク質を含み、したがって好ましくは、電子顕微鏡によって分析することができるような典型的なヘルペスウイルス構造を有し、すなわち、それらは、キャプシド、外被、及び外膜を有する。したがって、本発明のＨＶＬＰは、ヘルペスウイルスキャプシド又はキャプシド前駆体タンパク質、表面タンパク質、エンベロープタンパク質、被覆タンパク質、シェルタンパク質、糖タンパク質、外被タンパク質、Ｂ細胞及び／又はＴ細胞エピトープを生じるタンパク質を含み得る。しかしながら、本発明のＨＶＬＰの特定のヘルペスウイルスタンパク質は、本明細書に記載のように、野生型ウイルス株と比較して遺伝子改変されていてもよい。しかしながらまた、ＨＶＬＰは、１つ以上の必須ではないウイルスタンパク質を欠失していることも想定される。このような必須ではないウイルスタンパク質は、野生型ＨＶＬＰに取り込まれているが、該遺伝子によってコードされるポリペプチドの非存在下において本明細書に記載の方法に従って生成されたＨＶＬＰの電子顕微鏡によって検出することができるように、ＨＶＬＰの形成にとっては必須ではない。本発明のＨＶＬＰは好ましくは、１つのヘルペスウイルス（例えばエプスタイン・バーウイルス）を起源とする、さらにより好ましくは１つのヘルペスウイルス株、例えばエプスタイン・バーウイルス株Ｂ９５．８、エプスタイン・バーウイルス１型又はエプスタイン・バーウイルス２型を起源とするタンパク質を含むか又はからなり、エプスタイン・バーウイルスＢ９５．８株が好ましい。
【0012】
本明細書において使用する「ヘルペスウイルスタンパク質」という用語は、野生型ヘルペスウイルス株のタンパク質を含むが、配列に関して野生型ヘルペスウイルス株のタンパク質とは同一ではないタンパク質も含み、しかし野生型ヘルペスウイルス株のタンパク質に対して少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２％、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、又は少なくとも７５％の配列相同率を共有する。例えば、野生型エプスタイン・バーウイルスタンパク質は好ましくは、原型エプスタイン・バーウイルスＢ９５．８（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションナンバーＶ０１５５５）によってコードされる。さらに、野生型エプスタイン・バーウイルスタンパク質は、エプスタイン・バーウイルス１型（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションナンバーＮＣ＿００７６０５．１）又はエプスタイン・バーウイルス２型（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションナンバーＮＣ＿００９３３４．１）によってコードされ得る。
【0013】
「配列同一率」又は「配列相同率」は、標準化されたアルゴリズムを使用してアラインさせた少なくとも２つのポリペプチド配列又はポリヌクレオチド配列間の残基の一致率を指す。このようなアルゴリズムは、標準化され再現可能な方法で、比較される配列にギャップを挿入することにより、２つの配列間のアラインメントを最適化し得、それ故、２つの配列のより意味ある比較を成し遂げ得る。本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の配列同一率は、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴプログラムバージョン２．３．０（２０１６年１月１３日）を使用して決定される（Altschul et al., Nucleic Acids Res. (1997) 25:3389-3402）。２つのアミノ酸配列の配列同一率は、以下のパラメーターで設定されたｂｌａｓｔｐを用いて決定され得る：マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２、ワードサイズ：３；期待値：１０；ギャップコスト：イクジステンス＝１１、エクステンション＝１；組成調整：条件付組成スコアマトリックス調整。
【0014】
本発明のＨＶＬＰはさらに、ヘルペスウイルスタンパク質に加えて、１つ以上の人工タンパク質を含み得る。本明細書において使用する「人工タンパク質」という用語は、野生型ヘルペスウイルスによってコードされていないタンパク質に関する。人工タンパク質は、追加の外来抗原性配列、サイトカイン、ＣｐＧモチーフ、ｇ－ＣＭＳＦ、蛍光タンパク質、粒子の精製目的のために又は標識を付着させるために有用なタンパク質、輸送プロセスに必要とされるタンパク質構造、及びその他の群から選択され得る。
【0015】
本発明のＨＶＬＰは、そのタンパク質部分が少なくとも１つの核酸分子によってコードされている粒子に関する。したがって、少なくとも１つの核酸分子は、野生型ヘルペスウイルスの全ての遺伝子を含んでいてもよく、したがって野生型ヘルペスウイルスの全てのヘルペスウイルスタンパク質をコードしていてもよく、さらにヘルペスウイルスの全ての非コード核酸配列（例えばｍｉＲＮＡコード遺伝子座、シスエレメント）も含んでいてもよい。したがって、少なくとも１つの核酸分子は、野生型ウイルスの全てのコード核酸配列及び非コード核酸配列を含んでいてもよい。しかしながら、少なくとも１つの核酸分子の特定の遺伝子、コード配列又は非コード配列は、本明細書に記載のように、野生型ヘルペスウイルスと比較して改変され得る。さらに、少なくとも１つの核酸分子は、該遺伝子によってコードされるポリペプチドの非存在下において本明細書に記載の方法に従って生成されるＨＶＬＰの電子顕微鏡によって決定することができるように、野生型ウイルスと比較して、ＨＶＬＰの形成に必須ではない、１つ以上の遺伝子を欠失していてもよい。したがって、少なくとも１つの核酸分子は、適切な宿主細胞において本発明のＨＶＬＰの生成を付与することができる。例えば、エプスタイン・バーウイルス様粒子（ＥＢＶＬＰ）をコードする少なくとも１つの核酸分子は、野生型エプスタイン・バーウイルス（例えばＥＢＶ Ｂ９５．８株）の全てのコード配列及び／又は非コード配列を含み得、これは１つ以上の遺伝子的改変、例えば（ｉ）Ｂ細胞形質転換に必要とされる１つ以上のウイルス発癌遺伝子（例えば、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ－ＬＰ、ＥＢＮＡ２、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２、ＥＢＮＡ３Ａ、及びＥＢＮＡ３Ｃ）の機能的不活性化、（ｉｉ）１つ以上のシスエレメント（例えば末端反復配列、ＴＲ）、又は少なくとも１つの核酸分子の切断及びパッケージングに必須であるポータルタンパク質（例えばＢＦＬＦ１、ＢＢＲＦ１、ＢＧＲＦ１、ＢＤＲＦ１、ＢＡＬＦ３、ＢＦＲＦ１Ａ及びＢＦＲＦ１）をコードするウイルス遺伝子の機能的不活性化、（ｉｉｉ）ウイルス合成を誘導するのに必要とされる１つ以上のウイルス遺伝子（例えばＢＺＬＦ１、ＢＲＬＦ１及びＢＭＬＦ１）の機能的不活性化、並びに／又は（ｉｖ）少なくとも１つのｍｉＲＮＡコード遺伝子座の機能的不活性化などを含み得る。したがって、本発明の好ましい実施態様では、少なくとも１つの核酸分子は、上記に同定された特色に関してのみ野生型ＥＢＶゲノムとは異なる１つの核酸分子である。しかしながら、また、ＥＢＶＬＰは、１つ以上の必須ではないウイルスタンパク質を欠失していることも想定される。このような必須ではないウイルスタンパク質は、野生型ＥＢＶＬＰに取り込まれているが、該遺伝子によってコードされるポリペプチドの非存在下において本明細書に記載の方法に従って生成されたＥＢＶＬＰの電子顕微鏡によって検出することができるような、ＥＢＶＬＰの形成には必須ではない。さらに、少なくとも１つの核酸分子は好ましくは、１つのヘルペスウイルス（例えばエプスタイン・バーウイルス）を起源とする、さらにより好ましくは１つのヘルペスウイルス株、例えばエプスタイン・バーウイルスＢ９５．８株、エプスタイン・バーウイルス１型又はエプスタイン・バーウイルス２型を起源とする核酸配列を含むか又はからなり、エプスタイン・バーウイルスＢ９５．８株が好ましい。本発明のさらに好ましい実施態様では、ＥＢＶＬＰをコードする少なくとも１つの核酸分子は、機能的なＢＨＲＦ１タンパク質をコードしていない。
【0016】
「ヘルペスウイルス遺伝子」及び「野生型ヘルペスウイルス遺伝子」という用語は本明細書において同義語として使用され、野生型ヘルペスウイルス株の遺伝子を含むが、配列に関して野生型ヘルペスウイルス株の遺伝子とは同一ではない遺伝子も含み、しかし野生型ヘルペスウイルス株の遺伝子に対して少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２％、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、又は少なくとも７５％の配列相同率を共有する。例えば、野生型エプスタイン・バーウイルス遺伝子は好ましくは、原型エプスタイン・バーウイルスＢ９５．８によってコードされる。さらに、野生型エプスタイン・バーウイルス１型遺伝子は、エプスタイン・バーウイルス１型（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションナンバーＮＣ＿００７６０５．１）によってコードされ、野生型エプスタイン・バーウイルス２型遺伝子は、エプスタイン・バーウイルス２型（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションナンバーＮＣ＿００９３３４．１）によってコードされる。
【0017】
したがって、適切な宿主細胞において少なくとも１つの核酸が発現されると、ヘルペスウイルスタンパク質が発現され、その結果、ＨＶＬＰが形成される。結果として、本発明のＨＶＬＰは、ヘルペスウイルスｍｉＲＮＡをコードしているｍｉＲＮＡコード遺伝子座を依然として含むヘルペスウイルスタンパク質をコードしている少なくとも１つの核酸を含む宿主細胞によって得ることができ、該ｍｉＲＮＡコード遺伝子座の少なくとも１つは遺伝子改変されている。しかしながら、本発明のＨＶＬＰは、形成後に宿主細胞から、好ましくはエンドソーム輸送選別複合体（ＥＳＣＲＴ）を介して遊離される。したがって、本発明のＨＶＬＰはさらに、宿主細胞に由来する細胞成分、例えば脂質、タンパク質、糖タンパク質（例えばＣＤ６３）、核酸（例えばｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ）、細胞膜、及びその他を含む。
【0018】
本明細書において使用する「細胞膜」という用語は、自発的に整列することによって細胞膜を自然に形成して、脂質二重層、例えば両親媒性リン脂質を形成する脂質に関し、自己会合後には、両親媒性リン脂質の疎水性領域は二重層の内部を形成し、一方、疎水性領域は膜の外面を形成する。好ましくは、このような細胞膜は、本発明のＨＶＬＰが派生し、本発明のＨＶＬＰの外膜を形成する、宿主細胞を起源とする。さらに、このような細胞膜は、ＥＢＶＬＰの場合、タンパク質、例えばＥＢＶ構造タンパク質、例えばｇｐ３５０及び／又はＬＭＰ－１を含む。
【0019】
本明細書において使用する「ヘルペスウイルス」という用語は、ヘルペスウイルス科の任意のウイルスに関する。しかしながら、好ましいのは、ヒトに感染するヘルペスウイルス、例えばヒトヘルペスウイルス１型（単純ヘルペスウイルス１型すなわちＨＳＶ－１）、ヒトヘルペスウイルス２型（単純ヘルペスウイルス２型すなわちＨＳＶ－２）、ヒトヘルペスウイルス３型（水疱帯状疱疹ウイルスすなわちＶＺＶ）、ヒトヘルペスウイルス４型（エプスタイン・バーウイルスすなわちＥＢＶ）、ヒトヘルペスウイルス５型（ヒトサイトメガロウイルスすなわちＨＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス６型、ヒトヘルペスウイルス７型、ヒトヘルペスウイルス８型（カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスすなわちＫＳＨＶ）である。さらにより好ましいのは、ヒトヘルペスウイルス４型（エプスタイン・バーウイルスすなわちＥＢＶ）であり、これはＥＢＶ１型及びＥＢＶ２型、好ましくはＥＢＶＢ９５．８株に関する。しかしながら、ネズミ科ヘルペスウイルス４型（例えばマウスガンマヘルペスウイルス６８型すなわちＭＨＶ－６８）及びウシヘルペスウイルス１型（例えば伝染性ウシ鼻気管炎ウイルス）も考えられる。
【0020】
「タンパク質」又は「ポリペプチド」という用語は本明細書において同義語として使用され、ペプチド結合によって互いに連結されたアミノ酸ポリマーを含む分子を指す。該用語は、本明細書において特定の長さの分子を指すことを意味しない。ポリペプチドはアミノ酸配列を含み、したがって、時にアミノ酸配列を含むポリペプチドは本明細書において「ポリペプチド配列を含むポリペプチド」と称される。したがって、本明細書において「ポリペプチド配列」という用語は、「アミノ酸配列」という用語と同義語として使用される。
【0021】
「アミノ酸」すなわち「ａａ」という用語は、天然及び合成のアミノ酸、並びに、天然アミノ酸と同じような様式で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるもの、並びに、後で修飾されるアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタメート、及びＯ－ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然アミノ酸と同じ基本的な化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合している炭素を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。このような類似体は、修飾されたＲ基（例えばノルロイシン）又は修飾されたペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持する。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同じような様式で機能する化合物を指す。
【0022】
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸分子」、又は「核酸」という用語は本明細書において同義語として使用され、あるデオキシリボース又はリボースが別のデオキシリボース又はリボースに通常連結されている、ポリマー形のヌクレオチドを指す。「ポリヌクレオチド」という用語は好ましくは、一本鎖形及び二本鎖形のＤＮＡを含む。核酸分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖のＲＮＡの両方（リボヌクレオチドを含有している）、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成形、並びに上記の混合ポリマーを含み得る。
【0023】
本発明のＨＶＬＰのヘルペスウイルスタンパク質は、少なくとも１つの核酸分子によってコードされている。したがって、ＨＶＬＰのヘルペスウイルスタンパク質は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又はそれ以上の核酸分子によってコードされていてもよい。しかしながら、本発明の好ましい実施態様では、ＨＶＬＰのヘルペスウイルスタンパク質は、１つの核酸分子によってコードされている。
【0024】
ヘルペスウイルスタンパク質をコードしている少なくとも１つの核酸分子は、ＨＶＬＰのヘルペスウイルスｍｉＲＮＡをコードしているｍｉＲＮＡコード遺伝子座を依然として含み、該ｍｉＲＮＡコード遺伝子座の少なくとも１つは、遺伝子改変されている。このようなｍｉＲＮＡコード遺伝子座はヘルペスウイルスに由来し、それ故、ウイルスｍｉＲＮＡをコードしている。したがって、この脈絡における「依然として含む」という用語は、ｍｉＲＮＡコード遺伝子座がヘルペスウイルスを起源とし、好ましくは該タンパク質が起源とするのと同じヘルペスウイルスを起源とし、ヘルペスウイルスタンパク質をコードしている少なくとも１つの核酸分子に依然として含まれていることを意味する。又は換言すれば、少なくとも１つの核酸分子は、ｍｉＲＮＡコード遺伝子座を含むヘルペスウイルスのコード及び非コード核酸配列を含む。このようなウイルスｍｉＲＮＡは通常、宿主細胞において発現され、したがって、ウイルス合成時にウイルス粒子にパッケージングされる。結果として、ウイルスｍｉＲＮＡは、本明細書に記載のようなＨＶＬＰの生成時にＨＶＬＰに同様にパッケージングされる。しかしながら、このようなウイルスｍｉＲＮＡは、宿主の抗ウイルス免疫を打ち消し得、これはＨＶＬＰを用いてのワクチン接種時に有害であり得る。したがって、少なくとも１つのｍｉＲＮＡをコードする、少なくとも１つの核酸分子の少なくとも１つのｍｉＲＮＡコード遺伝子座が遺伝子改変されている。しかしながら、また、１つを超えるｍｉＲＮＡコード遺伝子座、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、又はそれ以上が遺伝子改変されていてもよい。本発明の好ましい実施態様では、全てのウイルスｍｉＲＮＡコード遺伝子座が遺伝子改変されている。さらなる実施態様では、ヘルペスウイルスの各々のｍｉＲＮＡクラスターの少なくとも１つのｍｉＲＮＡコード遺伝子座が遺伝子改変されている（例えば、エプスタイン・バーウイルスの場合、ＢＡＲＴクラスターの少なくとも１つのｍｉＲＮＡコード遺伝子座及びＢＨＲＦ１クラスターの少なくとも１つのｍｉＲＮＡコード遺伝子座）。
【0025】
本明細書において使用する「ｍｉＲＮＡ」という用語は、約２１～２５ヌクレオチド長の小型非コード一本鎖ＲＮＡに関する。ｍｉＲＮＡの５’末端、いわゆるシード配列は、通常それらの３’非翻訳領域内にある部分的に相補的なｍＲＮＡ標的を認識し、これらのｍＲＮＡの翻訳を抑制する。ｍｉＲＮＡコード遺伝子座はまず、通常ＲＮＡポリメラーゼＩＩによってより長い一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）へと転写される。次いで、ＲＮａｓｅＩＩＩ酵素のドローシャは、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡを認識及び切断して、プレ－ｍｉＲＮＡと呼ばれる通常６０～８０ヌクレオチド長のヘアピン構造を遊離し、これは細胞質へと輸送され、ダイサーと命名された別のＲＮａｓｅＩＩＩ酵素によってさらに処理されてＲＮＡ二本鎖を生成する。ＲＮＡ二本鎖は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）（ここでそれらは巻き戻される）においてアルゴノート（Ａｇｏ）タンパク質、ダイサー、及びＧＷ１８２と会合する。しばしば、この段階で、一方の鎖（「スター鎖」）は分解され、他方の鎖（成熟ｍｉＲＮＡ）は保持される。ＲＩＳＣはｍｉＲＮＡによって先導され、標的ｍＲＮＡを特異的に認識及び調節する。したがって、ｍｉＲＮＡは、発生のタイミング、分化、及びパターニングを含むがまた細胞増殖、細胞死、免疫応答、造血、及び細胞形質転換又は発癌も含む、多くの生物学的プロセスの重要な調節因子である。１つの単一のｍｉＲＮＡは、数百個の異なるｍＲＮＡの発現を直接調節し得る。
【0026】
例えば、ヘルペスウイルスｍｉＲＮＡは、単純ヘルペスウイルス１型のＨ１～Ｈ８及びＨ１１～Ｈ１８、単純ヘルペスウイルス２型のＨ２～Ｈ７及びＨ９～Ｈ１３及びＨ１９～Ｈ２５、サイトメガロウイルスのｍｉＲ－ＵＬ３６－５ｐ、ｍｉＲ－ＵＬ３６－３ｐ、ｍｉＲ－ＵＬ１１２、ｍｉＲ－ＵＳ４、ｍｉＲ－ＵＳ５－１、ｍｉＲ－ＵＳ５－２、ｍｉＲ－ＵＳ２５－１－５ｐ、ｍｉＲ－ＵＳ２５－１－３ｐ、ｍｉＲ－ＵＳ２５－２－５ｐ、ｍｉＲ－ＵＳ２５－２－３ｐ、ｍｉＲ－ＵＳ３３－３ｐ、ｍｉＲ－ＵＬ２２Ａ－５ｐ、ｍｉＲ－ＵＬ２２Ａ－３ｐ、ｍｉＲ－ＵＬ７０－５ｐ、ｍｉＲ－ＵＳ３３－５ｐ、ｍｉＲ－ＵＬ７０－３ｐ及びｍｉＲ－ＵＬ１１２－１、カポジ肉腫関連ウイルスのｍｉＲ－Ｋ１－５ｐ、ｍｉＲ－Ｋ２－５ｐ、ｍｉＲ－Ｋ３－５ｐ、ｍｉＲ－Ｋ３＿＋１＿５、ｍｉＲ－Ｋ４－３ｐ、ｍｉＲ－Ｋ４－５ｐ、ｍｉＲ－Ｋ５－３ｐ、ｍｉＲ－Ｋ６－３ｐ、ｍｉＲ－Ｋ６－５ｐ、ｍｉＲ－Ｋ７－３ｐ、ｍｉＲ－Ｋ７－５ｐ、ｍｉＲ－Ｋ８－３ｐ、ｍｉＲ－Ｋ８－５ｐ、ｍｉＲ－Ｋ９－３ｐ、ｍｉＲ－Ｋ９－５ｐ、ｍｉＲ－Ｋ１０ａ（－３ｐ）、ｍｉＲ－Ｋ１０ｂ－（－３ｐ）、ｍｉＲ－Ｋ１０ｂ＿＋１＿５（－３ｐ）、ｍｉＲ－Ｋ１０ｂ＿＋１＿５（－３ｐ）、ｍｉＲ－Ｋ１１－３ｐ、ｍｉＲ－Ｋ１２－３ｐ、ｍｉＲ－Ｋ１２－５ｐ、並びにエプスタイン・バーウイルスプレ－ｍｉＲＮＡのｍｉＲ－ＢＨＲＦ１－１、ｍｉＲ－ＢＨＲＦ１－２、ｍｉＲ－ＢＨＲＦ１－３、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ１、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ２、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ３、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ４、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ５、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ６、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ７、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ８、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ９、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ１０、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ１１、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ１２、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ１３、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ１４、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ１５、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ１６、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ１７、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ１８、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ１９、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ２０、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ２１、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ２２（これらは４つの成熟したＢＨＲＦ１ｍｉＲＮＡ及び４０個のＢＡＲＴｍｉＲＮＡを生じる）である。しかしながら、ヘルペスウイルス水痘帯状疱疹ウイルス及びＨＨＶ－７では、これまでｍｉＲＮＡは同定されていない。したがって、本発明の好ましいヘルペスウイルスは、ヒトヘルペスウイルス１型（単純ヘルペスウイルス１型すなわちＨＳＶ－１）、ヒトヘルペスウイルス２型（単純ヘルペスウイルス２型すなわちＨＳＶ－２）、ヒトヘルペスウイルス４型（エプスタイン・バーウイルスすなわちＥＢＶ）、ヒトヘルペスウイルス５型（ヒトサイトメガロウイルスすなわちＨＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス６型、ヒトヘルペスウイルス８型（カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスすなわちＫＳＨＶ）である。さらにより好ましいのは、ヒトヘルペスウイルス４型（エプスタイン・バーウイルスすなわちＥＢＶ）であり、これはＥＢＶ１型及びＥＢＶ２型、好ましくはＥＢＶ Ｂ９５．８株に関する。さらなる実施態様では、本発明は、ｍｉＲＮＡを発現していないヘルペスウイルスに由来するＨＶＬＰに関しない。
【0027】
本明細書において使用するｍｉＲＮＡコード遺伝子座に関して「遺伝子改変されている」という用語は一般的に、ウイルスｍｉＲＮＡの機能的不活性化を引き起こす任意の遺伝子的改変又は突然変異に関し、よってウイルスｍｉＲＮＡはもはや標的ｍＲＮＡの翻訳を妨害することができない。本発明の好ましい実施態様では、ｍｉＲＮＡコード遺伝子座のヌクレオチド配列は順番を入れ替えられ、よって、ウイルスｍｉＲＮＡの前駆体は転写されるが、さらにプロセシングされることにより機能的なｍｉＲＮＡを生じることはない。理論に束縛されるものではないが、このようなスクランブルｍｉＲＮＡコード配列は、宿主細胞における成熟ｍｉＲＮＡの発現を消失させ、したがって、ウイルスｍｉＲＮＡ又はその機能的前駆体を含有していないＨＶＬＰが生じる。このようなスクランブルｍｉＲＮＡコード遺伝子座により好ましくは、間違った３次元構造を有する一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）が得られる。
【0028】
本明細書において使用する「間違った３次元構造」という用語は、特定のヘアピン構造のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡへと折り畳むことができず、それ故、核内ＲＮａｓｅＩＩＩ酵素のドローシャによって成熟ｍｉＲＮＡへとプロセシングされない、遺伝子改変されたｐｒｉ－ｍｉＲＮＡに関する。しかしながら、ｍｉＲＮＡコード遺伝子座もまた欠失していてもよい。結果として、本明細書において使用する遺伝子的改変により、少なくとも１つのヘルペスウイルスｍｉＲＮＡが発現されないか若しくはほんの部分的にしか発現されない、少なくとも１つのヘルペスウイルスｍｉＲＮＡがその標的配列に結合しない、少なくとも１つのヘルペスウイルスｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ若しくは前駆体が間違った３次元構造を有する、ヘルペスウイルスｍｉＲＮＡの少なくとも１つの前駆体がさらにプロセシングされない、少なくとも１つのヘルペスウイルスｍｉＲＮＡ若しくはその前駆体が細胞によって分解される、少なくとも１つのヘルペスウイルスｍｉＲＮＡコード遺伝子座がスクランブル配列を有する、少なくとも１つのヘルペスウイルスｍｉＲＮＡコード遺伝子座が欠失している、及び／又は、少なくとも１つのヘルペスウイルスｍｉＲＮＡ若しくはその前駆体が突然変異、欠失、若しくは挿入を有するという効果を起こす。好ましい実施態様では、本明細書において使用する遺伝子的改変により、少なくとも１つのヘルペスウイルスｍｉＲＮＡが発現されないか若しくはほんの部分的にしか発現されない、少なくとも１つのヘルペスウイルスｍｉＲＮＡがその標的配列に結合しない、少なくとも１つのヘルペスウイルスｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ若しくは前駆体が間違った３次元構造を有する、ヘルペスウイルスｍｉＲＮＡの少なくとも１つの前駆体がさらにプロセシングされない、少なくとも１つのヘルペスウイルスｍｉＲＮＡ若しくはその前駆体が細胞によって分解される、少なくとも１つのヘルペスウイルスｍｉＲＮＡコード遺伝子座がスクランブル配列を有する、及び／又は、少なくとも１つのヘルペスウイルスｍｉＲＮＡ若しくはその前駆体が突然変異若しくは挿入を有するが、ヘルペスウイルスｍｉＲＮＡコード遺伝子座は全く欠失していないか若しくは欠失を含まないという効果を起こす。好ましくは、このような遺伝子的改変は、ウイルスの野生型ヌクレオチド組成及びゲノム構造を変化させない。遺伝子改変されたｍｉＲＮＡコード遺伝子座は、前記の遺伝子改変されたｍｉＲＮＡコード遺伝子座のヌクレオチド配列を、野生型ウイルスの対応するｍｉＲＮＡコード遺伝子座のヌクレオチド配列と比較することによって、すなわち、ＥＢＶの場合には、ＧｅｎｂａｎｋアクセッションナンバーＡＪ５０７７９９を有するＥＢＶ基準株と比較することによって同定され得る。したがって、本発明のｍｉＲＮＡコード遺伝子座の遺伝子的改変は、野生型ウイルス（ＥＢＶ株ＡＪ５０７７９９）の対応する遺伝子座の配列からの逸脱を引き起こし、そして、ｍｉＲＮＡが発現されないか若しくは部分的にしか発現されない、ｍｉＲＮＡがその標的配列に結合しない、ｍｉＲＮＡ若しくはその前駆体が間違った３次元構造を有する、ｍｉＲＮＡがさらにプロセシングされない、ｍｉＲＮＡ若しくはその前駆体が細胞によって分解される、ｍｉＲＮＡコード遺伝子座が順番の組み替えられた配列を有する、ｍｉＲＮＡコード遺伝子座が欠失している、及び／又は少なくとも１つのヘルペスウイルスｍｉＲＮＡ若しくはその前駆体が突然変異、欠失若しくは挿入を含むという効果を起こす。
【0029】
本発明者らは驚くべきことに、エプスタイン・バーウイルスのｍｉＲＮＡが免疫抑制的でありかつ宿主の獲得免疫応答を抑制する機能をコードしていることを発見した。したがって、少なくとも１つの核酸分子に含まれるｍｉＲＮＡコード遺伝子座の少なくとも１つの遺伝子的改変により、遺伝子改変されたヘルペスウイルスｍｉＲＮＡコード遺伝子座を全く含まない少なくとも１つの核酸によってコードされるヘルペスウイルスタンパク質を含むＨＶＬＰと比較した場合に増加した免疫応答がもたらされ、該増加は、本明細書に記載のようなアッセイで決定したところ、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％若しくはそれ以上、又は好ましくは少なくとも５％である。
【0030】
増加した免疫応答の検出に関する本明細書において記載のような「アッセイ」という用語は一般的には、免疫応答、好ましくはリンパ球、例えばＢ細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞の免疫応答を検出するのに適した任意のアッセイに関する。例えば、免疫細胞、好ましくはリンパ球、例えばＢ細胞、Ｔ細胞、又は任意の他のリンパ球による炎症誘発性サイトカインの新規合成又は遊離は、適切な免疫学的アッセイ、例えば定量ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）を使用することによって測定され得る。このような定量ＥＬＩＳＡを、本発明の脈絡において使用して、上清中の免疫細胞、好ましくはリンパ球、例えばＢ細胞、Ｔ細胞、又は任意の他のリンパ球、より好ましくはＢ細胞のサイトカイン濃度を測定することができる。本発明に従って測定され得るサイトカインは一般的に、全ての炎症誘発性サイトカイン、例えばＩＬ－６及びＴＮＦ－α及び他のサイトカイン、例えばＩＬ－１２（それぞれＩＬ１２Ａ及びＩＬ１２Ｂ遺伝子によってコードされるｐ３５及びｐ４０タンパク質を含む）、ＩＬ－１２Ｂ（ＩＬ１２Ｂ遺伝子によってコードされる２つのｐ４０タンパク質を含む）、及びＩＬ－２３（それぞれＩＬ１２Ｂ及びＩＬ２３Ａ遺伝子によってコードされるｐ４０及びｐ１９タンパク質を含む）である。ＩＬ－１２の場合、いくつかのＥＢＶｍｉＲＮＡがＩＬ１２Ｂ遺伝子の転写物を阻害し、よって、サイトカインＩＬ１２、ＩＬ１２Ｂ及びＩＬ２３の分泌を減少させることが知られている。したがって、増加した免疫応答は好ましくは、定量ＥＬＩＳＡを使用して、本発明に従って少なくとも１つのヘルペスウイルス又はＥＢＶのｍｉＲＮＡを欠失しているＨＶＬＰ又はＥＢＶＬＰ（すなわち、ＨＶＬＰ又はＥＢＶＬＰのヘルペスウイルスタンパク質又はＥＢＶタンパク質は、ヘルペスウイルス又はＥＢＶのｍｉＲＮＡをコードしているｍｉＲＮＡコード遺伝子座を依然として含む少なくとも１つの核酸分子によってコードされ、該ｍｉＲＮＡコード遺伝子座の少なくとも１つは遺伝子改変されている）と共にインキュベートしておいたＢ細胞の上清中のサイトカイン濃度（例えばＩＬ－１２、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α）を測定し、測定されたサイトカイン濃度を、少なくとも１つのヘルペスウイルス又はＥＢＶのｍｉＲＮＡを欠失していないＨＶＬＰ又はＥＢＶＬＰ（ここで、少なくとも１つのヘルペスウイルス又はＥＢＶのｍｉＲＮＡを欠失していないＨＶＬＰ又はＥＢＶＬＰは好ましくは、野生型ウイルス（すなわちＥＢＶの場合には基準株ＡＪ５０７７９９）と同一であるｍｉＲＮＡコード遺伝子座を含む核酸分子によってコードされている）と共にインキュベートしておいたＢ細胞の上清中で測定されたサイトカイン濃度と比較することによって測定される。記載のアッセイにおけるＢ細胞は、少なくとも３時間、少なくとも６時間、少なくとも９時間、少なくとも１２時間、少なくとも１５時間、少なくとも１８時間、少なくとも２１時間、少なくとも２４時間、少なくとも２７時間、少なくとも３０時間、少なくとも３６時間、少なくとも３９時間、少なくとも４２時間、少なくとも４５時間、少なくとも４８時間、少なくとも５４時間、少なくとも６０時間、少なくとも６６時間、少なくとも７２時間、少なくとも８４時間、少なくとも９６時間若しくはそれ以上、好ましくは２４時間若しくは３６時間、又はより好ましくは２４時間から３６時間までの間の任意の中間値の時間をかけてインキュベートされ得る。さらに、サイトカインの新規合成は、サイトカイン転写物（ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１２又は他のサイトカイン転写物）に対して特異的であるプライマーを用いて定量ＲＴ－ＰＣＲを使用して測定され得る。したがって、増加した免疫応答は、本明細書に記載のようなＨＶＬＰ又はＥＢＶＬＰと共にインキュベートしておいたＢ細胞のＩＬ－１２転写物を、ＩＬ－１２及び好ましくはＩＬ－１２Ｂ転写物に特異的なプライマーを用いての定量ＲＴ－ＰＣＲを使用することによって測定することによって、及び、本発明に従って少なくとも１つのヘルペスウイルス又はＥＢＶのｍｉＲＮＡを欠失しているＨＶＬＰ又はＥＢＶＬＰと共にインキュベートしておいたＢ細胞から得られた結果を、少なくとも１つのヘルペスウイルス又はＥＢＶのｍｉＲＮＡを欠失していないＨＶＬＰ又はＥＢＶＬＰと共にインキュベートしておいたＢ細胞から得られた結果と比較することによって測定され得、ここで、少なくとも１つのヘルペスウイルス又はＥＢＶのｍｉＲＮＡを欠失していない該ＨＶＬＰ又はＥＢＶＬＰは好ましくは、野生型ウイルス（すなわち、ＥＢＶの場合には基準株ＡＪ５０７７９９）と同一なｍｉＲＮＡコード遺伝子座を含む核酸分子によってコードされる。さらに、アッセイは、増加した免疫応答を測定するための読み出し情報として、免疫細胞、好ましくはリンパ球、例えばＴ細胞、ＮＫＴ細胞、又は他のリンパ球を使用するアッセイであり得る。エフェクター細胞と呼ばれるこのような免疫細胞は、ＨＶＬＰ又はＥＢＶＬと共にインキュベートされたＢ細胞（すなわち、ＨＶＬＰ又はＥＢＬＰに由来する抗原性エピトープを提示するＢ細胞）を認識する。エピトープ認識後、免疫細胞は、サイトカインの分泌の増加で応答するか、又はさらにはＨＶＬＰ若しくはＥＢＶＬＰと共にインキュベートされたＢ細胞を死滅さえする。したがって、増加した免疫応答は、例えば、少なくとも１つのヘルペスウイルス又はＥＢＶのｍｉＲＮＡを欠失していないＨＶＬＰ又はＥＢＶＬＰと共にインキュベートされたＢ細胞と共にインキュベートしておいた上清中の免疫フェクター細胞のサイトカイン濃度と比較して、少なくとも１つのヘルペスウイルス又はＥＢＶのｍｉＲＮＡを欠失したＨＶＬＰ又はＥＢＶＬＰと共にインキュベートされたＢ細胞と共にインキュベートしておいた上清中の免疫エフェクター細胞のサイトカイン濃度（例えばＧＭ－ＣＳＦ又はＩＦＮ－γ）を測定することによって測定され得、ここで、少なくとも１つのヘルペスウイルス又はＥＢＶのｍｉＲＮＡを欠失していない該ＨＶＬＰ又はＥＢＶＬＰは好ましくは、野生型ウイルス（すなわち、ＥＢＶの場合、基準株ＡＪ５０７７９９）と同一であるｍｉＲＮＡコード遺伝子座を含む核酸分子によってコードされている。増加した免疫応答はさらに、分泌されたサイトカインについてその表面を染色することによって、エフェクター細胞によるサイトカインの遊離を測定することによって測定され得る。エフェクター細胞の増加した免疫応答はまた、ＨＶＬＰ又はＥＢＶＬと共にインキュベートされたＢ細胞の死滅を測定することによって測定され得る。死滅実験の前に、少なくとも１つのウイルスｍｉＲＮＡを欠失しているＨＶＬＰ又はＥＢＶＬＰと共にインキュベートされたＢ細胞、及び少なくとも１つのウイルスｍｉＲＮＡを欠失していないＨＶＬＰ又はＥＢＶＬＰと共にインキュベートされたＢ細胞を、色素（例えばカルセイン－アセトキシメチルエステル）を用いて染色する。カルセインは、エフェクター細胞により媒介される死滅時に上清に遊離され、その濃度は死滅細胞の数に比例し、蛍光測定によって定量され得る。したがって、カルセインの増加は、増加した免疫応答の指標である。結果として、増加した免疫応答は、少なくとも１つのウイルスｍｉＲＮＡを欠失しているＨＶＬＰ又はＥＢＶＬＰと共にインキュベートされたＢ細胞の上清中のカルセイン濃度と、少なくとも１つのウイルスｍｉＲＮＡを欠失していないＨＶＬＰ又はＥＢＶＬＰと共にインキュベートされたＢ細胞の上清中のカルセイン濃度を比較することによって測定され得、少なくとも１つのヘルペスウイルス又はＥＢＶのｍｉＲＮＡを欠失していない該ＨＶＬＰ又はＥＢＶＬＰは好ましくは、野生型ウイルス（すなわち、ＥＢＶの場合、基準株ＡＪ５０７７９９）と同一である、ｍｉＲＮＡコード遺伝子座を含む核酸分子によってコードされる。
【0031】
本明細書において使用する「増加した免疫応答」という用語は、被験者への本発明のＨＶＬＰの投与時又はインビトロアッセイにおける増加した免疫応答に関する。このような増加は、本発明のＨＶＬＰによって引き起こされた免疫応答を、遺伝子改変されているヘルペスウイルスｍｉＲＮＡをコードしているｍｉＲＮＡコード遺伝子座を含まない少なくとも１つの核酸によってコードされるヘルペスウイルスタンパク質を含むＨＶＬＰによって引き起こされた免疫応答と比較した場合に明白となる。被験者におけるこのような増加した免疫応答は好ましくは、体液性免疫応答又は細胞性免疫応答、すなわちＢ細胞応答又はＴ細胞応答などの増加した獲得免疫応答である。より好ましくは、前記の増加した免疫応答は、増加したＴ細胞応答、例えばＣＤ８＋又はＣＤ４＋Ｔ細胞応答である。さらにより好ましいのは、増加したＣＤ８＋Ｔ細胞応答である。最も好ましくは、前記の増加した免疫応答は、増加したＢ細胞応答、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答、及びＣＤ８＋Ｔ細胞応答である。ＥＢＶＬＰの場合、このようなＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、ＥＢＶＬＰが、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導することが知られていない不活化ワクチンであるので驚きである。したがって、本発明のＥＢＶＬＰの内部移行時に、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答だけを予期し、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は予期しなかっただろう。
【0032】
本明細書において使用する「被験者」という用語は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトに関する。
【0033】
本発明のさらなる実施態様では、該ヘルペスウイルスタンパク質をコードしている少なくとも１つの核酸は、それがＨＶＬＰにパッケージングされないように遺伝子改変されている。通常、ヘルペスウイルスは、ウイルス粒子内にウイルスゲノムをパッケージングするのに必要とされるシスエレメント及びタンパク質を含む。例えば、ヘルペスウイルスは、ウイルスＤＮＡの両末端に、その鎖状コンフォメーションで、パッケージングに関与する配列、例えばエプスタイン・バーウイルス及びカポジ肉腫関連ウイルスの「末端反復配列」（ＴＲ）又はヒトサイトメガロウイルス及び単純ヘルペスウイルス１型の「配列」などを含む。例えば、ウイルスゲノムのパッケージングに関与するタンパク質は、エプスタイン・バーウイルスの場合にはＢＦＬＦ１、ＢＢＲＦ１、ＢＧＲＦ１、ＢＤＲＦ１、ＢＡＬＦ３、ＢＦＲＦ１Ａ及びＢＦＲＦ１、単純ヘルペスウイルス１型の場合にはＵＬ６、ＵＬ１５、ＵＬ１７、ＵＬ２５及びＵＬ２８、単純ヘルペスウイルス２型の場合にはＵＬ６、ＵＬ１５、ＵＬ１７、ＵＬ２５、ＵＬ２８、ＵＬ３２及びＵＬ３３、ＵＬ５１、ヒトサイトメガロウイルスの場合にはＵＬ５６及びＵＬ８９、水疱帯状疱疹ウイルスの場合にはＯＲＦ５４、並びにカポジ肉腫関連ウイルスの場合にはＯＲＦ７、ＯＲＦ２９及びＯＲＦ４３である。したがって、ウイルスＤＮＡのパッケージングに必要とされる１つ以上のシスエレメント及び／又はタンパク質の機能的不活性化により、核酸分子のパッケージングが損なわれ、したがって、本明細書に記載のような溶菌期の誘導時にＨＶＬＰが生成される。
【0034】
「パッケージング」という用語は、ウイルス構築に関連して当技術分野において周知であり、ウイルス粒子構築中に鎖状ヘルペスウイルスＤＮＡをヘルペスウイルス粒子に導入するプロセスに関し、本明細書において具体的にはウイルス粒子構築中に少なくとも１つの核酸分子をウイルス粒子に導入するプロセスに関する。
【0035】
したがって、本発明の好ましい実施態様では、該ヘルペスウイルスタンパク質をコードしている少なくとも１つの核酸は、パッケージングに必要とされる機能的なシスエレメントを欠失している。本明細書において使用する「パッケージングに必要とされるシスエレメント」という用語は、ウイルス粒子内にウイルスＤＮＡをパッケージングするために必要とされるヘルペスウイルスＤＮＡパッケージングシグナル配列に関する。結果として、シスエレメントの非存在下においては、少なくとも１つの核酸分子は、ウイルスの溶菌期中のウイルス合成時に本発明の野生型ウイルス粒子又はＨＶＬＰにパッケージングされない。
【0036】
本発明のさらに好ましい実施態様では、前記ヘルペスウイルスタンパク質をコードしている少なくとも１つの核酸は、該ヘルペスウイルスタンパク質が発現されないか又は機能しないように遺伝子改変されている、パッケージングのために必要とされるヘルペスウイルスタンパク質（すなわち、パッケージングの為に必要とされるタンパク質は、そのパッケージング能を欠失している）をコードしている少なくとも１つの遺伝子を含む。したがって、パッケージングのために必要とされるヘルペスウイルスタンパク質をコードしている遺伝子は遺伝子改変されていてもよく、これにより該タンパク質のパッケージング能は機能的に無効であるが、免疫原性は好ましくは維持されている。機能的に無効となるように、パッケージングのために必要とされる１つのシスエレメント又はタンパク質を改変するだけで十分であり得るが、代替的には、ウイルスＤＮＡパッケージングの可能性を排除するためにタンパク質とシスエレメントの組合せのパッケージング能を無効にしてもよい。
【0037】
ヘルペスウイルスタンパク質をコードしている核酸配列に関して本明細書において使用する「遺伝子改変されている」という用語は一般的に、ウイルスによりコードされているタンパク質を非機能的とするか又はこのようなタンパク質の発現を妨げる、任意の遺伝子的改変に関する。例えば、このような遺伝子的改変は、機能的ドメイン又はその一部又は全タンパク質をコードしている核酸配列の欠失であり得る。ヘルペスウイルスタンパク質をコードしている核酸配列はさらに、該タンパク質の１つ以上のアミノ酸をコードしている、好ましくは該タンパク質の機能的ドメインをコードしている１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、又は置換によって遺伝子改変され得る。このような改変は、コード配列に点突然変異を導入して例えば終止コドン又はオープンリーディングフレームのシフトを生じ、したがって、切断短縮されたタンパク質が生じる。このような改変によりさらに、生物学的機能が全くないか又は低下したタンパク質がもたらされ得る。さらに、ヘルペスウイルスタンパク質をコードしている遺伝子の発現はまた、他の遺伝子的改変、例えば、該遺伝子のオープンリーディングフレームの開始コドンのヌクレオチドの欠失若しくは置換（すなわち開始コドンはもはや存在しない）によって、又は遺伝子発現に必要とされるプロモーター配列若しくは他の制御核酸配列を機能的に不活性化することによって、及び当技術分野において周知である他の方法によって阻害され得る。
【0038】
したがって、さらなる実施態様では、本発明のＨＶＬＰは、ヘルペスウイルスゲノム及び／又は少なくとも１つの核酸分子を実質的に含まない。本明細書において使用する「ヘルペスウイルスゲノム及び／又は少なくとも１つの核酸分子を実質的に含まない」という用語は、定量ＰＣＲを使用して当業者によって容易に決定され得るように、上清 １mlあたり１０００個未満のヘルペスウイルスゲノム又は核酸分子、上清 １mlあたり１００個未満のヘルペスウイルスゲノム又は核酸分子、上清 １mlあたり１０個未満のヘルペスウイルスゲノム又は核酸分子、上清 １mlあたり１個未満のヘルペスウイルスゲノム又は核酸分子、上清 １mlあたり０．１個未満のヘルペスウイルスゲノム又は核酸分子、上清 １mlあたり０．０１個未満のヘルペスウイルスゲノム又は核酸分子を含むＨＶＬＰに関する。好ましくは、定量ＰＣＲを介した検出は、遊離ＤＮＡ又は膜結合ＤＮＡを除去するためのＤＮＡｓｅを用いてのインキュベーション工程を含む。したがって、ＨＶＬＰは好ましくは、ヘルペスウイルスＤＮＡ配列と同一であるＤＮＡ配列を実質的に含有せず、該配列は好ましくは、ヘルペスウイルス遺伝子配列に関する。さらに、ＨＶＬＰは好ましくは、野生型ヘルペスウイルス核酸配列に対して少なくとも（各々の値について）９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、及び少なくとも７５％の配列同一率を共有する核酸配列を実質的に含有していない。例えば、ＴＲ配列及びＢＺＬＦ１コード領域を欠失しているＢ９５．８ＥＢＶゲノムを用いてトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を、溶菌期を誘導するためにＢＺＬＦ１をコードしている発現ベクターを用いてトランスフェクトする。３日後、上清を収集し得、ＥＢＶＬＰを超遠心分離によって沈降させ得る。ＥＢＶゲノムの数は、前記のＢ９５．８ゲノムによって及び基準ＥＢＶゲノムによって含まれるＥＢＶ遺伝子に特異的なプライマーを使用して定量ＲＴ－ＰＣＲを介して定量され得る。定量のための基準として、細胞１個あたり２つのＥＢＶゲノムコピーを含有しているヒトバーキットリンパ腫細胞株であるナマルバＤＮＡの連続希釈液を使用し得る。ＥＢＶＬＰ内のＥＢＶゲノムコピーの定量はさらに国際公開公報第２０１３／０９８３６４号に記載され、記載された定量の感度は、１mlを超える上清を使用することによって高められ得る。好ましい実施態様では、本発明のＨＶＬＰは検出可能なウイルスゲノムを全く含まず、ここでの検出法は定量ＰＣＲである。
【0039】
しかしながら、本明細書に記載のように、ウイルス合成を誘導するために必要とされるタンパク質をコードしているヘルペスウイルスの少なくとも１つの遺伝子を、該ヘルペスウイルスタンパク質（例えばＥＢＶの場合にはＢＺＬＦ１）が発現されないか又は機能しないように遺伝子改変し得る。この場合、本発明のＨＶＬＰの生成のためにウイルス合成を誘導するために、宿主細胞に前記の少なくとも１つの遺伝子を提供しなければならない。少なくとも１つの遺伝子を含む発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることによって少なくとも１つの遺伝子が提供され得る。したがって、理論によって固めたくはないが、本発明のＨＶＬＰが、前記の少なくとも１つの遺伝子をコードしている発現ベクターを含むことがあるかもしれない。しかしながら、「ヘルペスウイルスゲノムを実質的に含まない」及び「少なくとも１つの核酸分子を実質的に含まない」という用語は、ウイルス合成を誘導するために必要とされる少なくとも１つの遺伝子をコードしている発現ベクターに関しないと理解されたい。
【0040】
本発明の別の実施態様では、前記ヘルペスウイルスタンパク質をコードしている少なくとも１つの核酸分子は、該ヘルペスウイルスタンパク質が発現されないように又は機能しないように遺伝子改変されている、細胞形質転換のために必要とされるヘルペスウイルスタンパク質をコードしている少なくとも１つの遺伝子を含む。
【0041】
エプスタイン・バーウイルス及びカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスなどのいくつかのヘルペスウイルスは、細胞形質転換を引き起こすことが知られ、したがって、腫瘍疾患を誘導する。被験者への投与時の本発明のＨＶＬＰを含む組成物の安全性を高めるために、細胞形質転換に必要とされるヘルペスウイルスタンパク質をコードしている少なくとも１つの遺伝子を、該ヘルペスウイルスタンパク質が発現されないように又は機能しないように、遺伝子改変し得る。したがって、細胞形質転換に必要とされるヘルペスウイルスタンパク質をコードしている遺伝子を、該タンパク質の形質転換能は機能的に無効となり、一方、免疫原性は好ましくは維持されるように、遺伝子改変し得る。細胞形質転換に必要とされる１つのタンパク質を改変することで十分であり得るが、細胞形質転換の可能性を排除するために、細胞形質転換に必要とされる１つを超えるタンパク質、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のタンパク質を改変することが好ましくあり得る。細胞形質転換に必要とされるヘルペスウイルス遺伝子は、当技術分野において周知である。例えば、このような遺伝子は、エプスタイン・バーウイルスの場合にはＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ－ＬＰ、ＥＢＮＡ２、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２、ＥＢＮＡ３Ａ及びＥＢＮＡ３Ｃ、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスの場合にはＬＡＮＡ、Ｋ１３、カポジンＡ、カポジンＢ、カポジンＣ、Ｋ１、ｖＩＬ－６、ｖＩＲＦ－１及びｖＧＰＣＲである。
【0042】
本発明のさらなる実施態様では、該ヘルペスウイルスタンパク質をコードしている少なくとも１つの核酸分子は、該ヘルペスウイルスタンパク質が発現されないように又は機能しないように遺伝子改変されている、ウイルス合成を誘導するのに必要とされるヘルペスウイルスタンパク質をコードしている少なくとも１つの遺伝子を含む。
【0043】
ヘルペスウイルスの生活環は、減少したウイルス遺伝子セットしか発現されず子孫ウイルスは全く生成されない潜伏期、及び、ウイルス合成が起こり子孫ウイルスが宿主細胞から遊離される溶菌期を含む。溶菌複製中に様々なクラスの溶菌遺伝子が発現され、ウイルスゲノムが増幅していわゆるコンカテマーを形成し、これは最終的に単位長さの鎖状ウイルスゲノムに切断され、これは予め形成されたプロキャプシドにパッケージングされる。ウイルスＤＮＡを含有しているキャプシドは、さらなるコンフォメーション的及び構造的変化を受け、感染細胞からエンベロープを有するウイルス粒子として放出される。したがって、ウイルス生活環の溶菌期は、ウイルス粒子の細胞内構築をもたらすプロセスである。しかしながら、ＨＶＬＰのタンパク質部分をコードしている少なくとも１つの核酸分子が、本明細書に記載のようにパッケージングに必要とされる１つ以上のシスエレメント及び／又はタンパク質を欠失している場合、ウイルス粒子の構築時にウイルスＤＮＡは全くパッケージングされず、したがって、溶菌期が誘導されるとＨＶＬＰが生成される。
【0044】
ヘルペスウイルスの溶菌期は、エプスタイン・バーウイルスの場合には特定のヘルペスウイルスタンパク質、例えばＢＺＦＬ１、ＢＲＬＦ１及びＢＭＬＦ１、カポジ肉腫関連ウイルスの場合にはＲＴＡ、単純ヘルペスウイルスの場合にはＶＰ１６の発現時に誘導及び維持される。
【0045】
さらなる安全性の措置として、溶菌期の誘導に必要とされるタンパク質をコードしている１つ以上の遺伝子を遺伝子改変することが望ましくあり得、これにより、残留している可能性のあるウイルスゲノムからのウイルス複製が妨げられ得る。したがって、ウイルス合成を誘導するのに必要とされるヘルペスウイルスタンパク質をコードしている遺伝子は、該タンパク質の溶菌誘導能は機能的に無効となり、一方、免疫原性は好ましくは維持されるように遺伝子改変され得る。
【0046】
ウイルス合成に必要とされる１つ以上の遺伝子が機能的に不活性化されているか又は欠失している場合には、ウイルスの溶菌期及びこれによるウイルス合成を誘導し、よって本発明のＨＶＬＰの生成を付与するために、少なくとも１つの核酸分子を含む宿主細胞に前記の１つ以上の遺伝子を与えなければならない。前記の１つ以上の遺伝子を含む発現ベクターをトランスフェクトすることによって、前記の１つ以上の遺伝子を宿主細胞に与え得、該発現ベクターは好ましくは安定な発現ベクターであり、溶菌期の誘導に必要とされる１つ以上の遺伝子の発現は好ましくは誘導的に調節されている。
【0047】
本明細書において使用する「誘導的に調節される」又は「誘導された発現」という用語は、例えば、テトラサイクリン誘導性プロモーター、Ｄｏｘ誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、又は重金属誘導性プロモーターを使用することによって、随意に遺伝子の発現を誘導することを可能とする任意の方法に関する。さらなる適切なプロモーターは当業者には周知である。あるいは、また、タンパク質コード配列を、エストロゲン受容体コード配列に融合させ、これにより、エストロゲンが添加され活性化が可能となると、発現を調節することもできる。
【0048】
本発明のさらなる実施態様では、ヘルペスウイルスタンパク質をコードしている少なくとも１つの核酸分子はヘルペスウイルスゲノムを含み、該ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、水疱帯状疱疹ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、ヒトヘルペスウイルス６型、ヒトヘルペスウイルス７型、ウシヘルペスウイルス１型、ウシヘルペスウイルス２型、ウシヘルペスウイルス３型、ウシヘルペスウイルス４型、ウシヘルペスウイルス５型、及びマウスガンマヘルペスウイルス６８型からなる群より選択される。
【0049】
したがって、少なくとも１つの核酸分子は、ヘルペスウイルスゲノムを含み得るか又はからなり得る。しかしながら、ヘルペスウイルスゲノムは、本明細書に記載のような野生型ヘルペスウイルスゲノムと比較して遺伝子改変されていてもよい。
【0050】
本発明のさらなる実施態様では、ＨＶＬＰは、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）タンパク質及びＥＢＶ ｍｉＲＮＡを含む、エプスタイン・バーＶＬＰ（ＥＢＶＬＰ）である。
【0051】
例えば、粒子に含まれるＥＢＶポリペプチドは、ＥＢＶ構造ポリペプチド及びＥＢＶ溶菌ポリペプチドの群に属する。当業者によって理解されるであろうように、ＥＢＶの特定のポリペプチドは、上記の１つを超えるポリペプチド群に属し得る。換言すれば、ＥＢＶポリペプチドは、構造ポリペプチド並びに溶菌ポリペプチドを示し得る。本発明によると、ＥＢＶの構造ポリペプチドは、ＥＢＶの構造的組立に関与するポリペプチドに関する。該ポリペプチドは好ましくは、膜ポリペプチド、外被ポリペプチド、及びキャプシドポリペプチドからなる群より選択される。ＥＢＶ膜ポリペプチドは、ＢＡＬＦ４、ＢＬＬＦ１（ｇｐ３５０とも呼ばれる）、ＢＤＬＦ２、ＢＤＬＦ３、ＢＫＲＦ２、ＢＬＲＦ１、ＢＮＬＦ１（ＬＭＰ－１とも呼ばれる）、ＴＰ（ＬＭＰ－２ａとも呼ばれる）、ＢＸＬＦ２、ＢＺＬＦ２、及びその任意の組合せからなる群より選択されたポリペプチドを含む。ＥＢＶ外被ポリペプチドは、ＢＢＲＦ２、ＢＧＬＦ２、ＢＭＬＦ１、ＢＮＲＦ１、ＢＯＬＦ１、ＢＰＬＦ１、ＢＴＲＦ１、ＢＶＲＦ１、及びその任意の組合せからなる群より選択されたポリペプチドを含む。ＥＢＶキャプシドポリペプチドは、ＢＢＲＦ１、ＢｃＬＦ１、ＢＤＬＦ１、ＢＦＲＦ３、及びその任意の組合せからなる群より選択されたポリペプチドを含む。ＥＢＶの溶菌ポリペプチドは、ＥＢＶ溶菌期の誘導及び維持に関与し、及び／又は、溶菌期の誘導の結果として発現される、ＥＢＶポリペプチドに関する。該溶菌ポリペプチドは好ましくは、最初期遺伝子、初期遺伝子、及び後期溶菌遺伝子を含む群から選択される（Kieff and Rickinson, 2007）。溶菌期は、ＢＺＬＦ１及びＢＲＬＦ１（両方共に最初期タンパク質）の発現、続いて、初期及び後期タンパク質の発現によって開始される。誘導後、ウイルス複製を許容されるようになった細胞は、ヘルペスウイルスに特徴的な細胞変性変化を受ける（Kieff and Rickinson, 2007）。
【0052】
本発明はまた、ＥＢＶ ｍｉＲＮＡをコードしているｍｉＲＮＡコード遺伝子座を依然として含む少なくとも１つの核酸分子によってコードされるＥＢＶタンパク質を含むＥＢＶＬＰに関し、該ｍｉＲＮＡコード遺伝子座の少なくとも１つは遺伝子改変され、前記の少なくとも１つのｍｉＲＮＡコード遺伝子座は、ｍｉＲ－ＢＨＲＦ１－１、ｍｉＲ－ＢＨＲＦ１－２、ｍｉＲ－ＢＨＲＦ１－３、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ１、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ２、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ３、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ４、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ５、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ１５からなる群より選択される。ＥＢＶの任意の他のｍｉＲＮＡコード遺伝子座は、未改変形で存在していても（すなわち、ＥＢＶの場合、基準株ＡＪ５０７７９９と同一）又は欠失していてもよい。
【0053】
ＥＢＶＬＰの場合、少なくとも１つの核酸分子に含まれる、ＥＢＶ ｍｉＲＮＡをコードしている少なくとも１つの遺伝子改変されたｍｉＲＮＡコード遺伝子座は、ｍｉＲ－ＢＨＲＦ１－１、ｍｉＲ－ＢＨＲＦ１－２、ｍｉＲ－ＢＨＲＦ１－３、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ１、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ２、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ３、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ４、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ５、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ１５からなる群より選択される。したがって、前記のｍｉＲＮＡコード遺伝子座の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つが、任意の可能な組合せで遺伝子改変されていてもよい。本発明の好ましい実施態様では、前記のＥＢＶ ｍｉＲＮＡコード遺伝子座の全てが、本明細書に記載のように改変されている。したがって、本発明は、ＥＢＶ Ｂ９５．８株（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションナンバーＶ０１５５５）に関しない。しかしながら、本発明は、本明細書に記載のような少なくとも１つのｍｉＲＮＡコード遺伝子座の遺伝子的改変を含む、任意のＥＢＶ Ｂ９５．８株に関する。本発明のさらなる実施態様では、ＥＢＶＬＰの場合、少なくとも１つの核酸分子に含まれる、ＥＢＶ ｍｉＲＮＡをコードしている少なくとも１つの遺伝子改変されたｍｉＲＮＡコード遺伝子座は、ｍｉＲ－ＢＨＲＦ１－１、ｍｉＲ－ＢＨＲＦ１－２、ｍｉＲ－ＢＨＲＦ１－３、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ１、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ２、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ３、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ４、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ１５からなる群より選択される。またさらなる好ましい実施態様では、本明細書に記載のような全てのＥＢＶ ｍｉＲＮＡコード遺伝子座が遺伝子改変されている。
【0054】
本発明のＥＢＶＬＰの投与時、例えばワクチン接種時における安全性を高める特色として、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ－ＬＰ、ＥＢＮＡ２、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２、ＢＨＲＦ１、ＢＡＬＦ１、ＥＢＮＡ３Ａ及びＥＢＮＡ３Ｃからなる群より選択された、Ｂ細胞形質転換に必要とされるＥＢＶタンパク質をコードしている少なくとも１つの核酸分子によって含まれる、少なくとも１つの遺伝子は、該ＥＢＶタンパク質が発現されないように又は機能しないように遺伝子改変されている。
【0055】
「Ｂ細胞形質転換に必要とされる」という用語は、本発明に従って、前記の１つ以上のＥＢＶポリペプチドが、野生型ＥＢＶを用いての感染時にＢ細胞を形質転換する際に必須であることを意味する。換言すれば、前記の１つ以上の必須なＥＢＶポリペプチドの非存在下では、Ｂ細胞は感染時に形質転換されない。したがって、ＥＢＶＬＰは、Ｂ細胞との融合時に、Ｂ細胞を形質転換することができない。１つの必須のＥＢＶポリペプチドのＢ細胞形質転換能を無効にすることで十分であり得るが、Ｂ細胞形質転換の可能性を排除するために、代替的には、たった１つの必須のポリペプチドを無効にした場合に達成されるのと同じ結果を達成するために、すなわち、Ｂ細胞形質転換の可能性の排除を達成するために、必須なＥＢＶポリペプチド組合せのＢ細胞形質転換能を無効にしてもよい。好ましくは、１つを超える必須なＥＢＶポリペプチド又は必須なＥＢＶポリペプチド組合せのＢ細胞形質転換能を無効にする。Ｂ細胞形質転換に必須である対応するＥＢＶポリペプチドはＥＢＮＡ２であり、Ｂ細胞形質転換において必須であるＥＢＶポリペプチド組合せは、ＢＨＲＦ１とＢＡＬＦ１の組合せである。ＥＢＮＡ２の、又はＢＨＲＦ１とＢＡＬＦ１のＢ細胞形質転換能の無効化は、Ｂ細胞形質転換の可能性を排除するのに十分である。Ｂ細胞形質転換に必要とされるさらなるＥＢＶポリペプチド及びＥＢＶポリペプチドの組合せは、ＬＭＰ１とＥＢＮＡ３ＡとＥＢＮＡ３Ｃ、ＥＢＮＡ１とＥＢＮＡ３Ａ、又はＥＢＮＡ－ＬＰとＥＢＮＡ３Ｃである。１つの実施態様では、ＥＢＶ遺伝子であるＥＢＮＡ２、ＬＭＰ１、ＥＢＮＡ１、ＥＢＮＡ３Ａ及びＥＢＮＡ３Ｃは、該ＥＢＶタンパク質が発現されないように又は機能しないように遺伝子改変されている。さらなる実施態様では、前記遺伝子の全てが、該ＥＢＶタンパク質が発現されないように又は機能しないように遺伝子改変されている。
【0056】
本発明のさらなる実施態様では、ＢＺＦＬ１、ＢＲＬＦ１及びＢＭＬＦ１からなる群より選択される、ウイルス合成を誘導するのに必要とされるＥＢＶタンパク質をコードしている、少なくとも１つの核酸分子に含まれる、少なくとも１つの遺伝子は、該ＥＢＶタンパク質が発現されないように又は機能しないように遺伝子改変され、該遺伝子は好ましくはＢＺＬＦ１である。
【0057】
さらなる安全性の措置として、溶菌期（本明細書において「複製期」という用語と同義語として使用される）の誘導に必要とされるタンパク質をコードしている１つ以上の遺伝子を遺伝子改変することが望ましくあり得、これにより、残留している可能性のあるウイルスゲノムからのウイルス合成が妨げられ得る。例えば、ＥＢＶ最初期ポリペプチドＢＺＬＦ１は、ＥＢＶ潜伏感染の破壊を媒介し、これは一般的にＥＢＶの溶菌期の誘導における重要な調節因子であると考えられている。ＥＢＶの持続感染は、溶菌期及び潜伏期が交互に来ることを特徴とし、溶菌期の誘導は、ＢＺＬＦ１の発現に起因する。したがって、ＢＺＬＦ１の欠失時又は機能的不活性化時に、ＥＢＶの溶菌期の誘導が妨げられる。結果として、ＢＺＬＦ１などの、欠失させたＢ細胞又は機能的に不活性化された、前記の１つ以上の遺伝子を、少なくとも１つの核酸分子を含む宿主細胞に与えることにより、ＥＢＶの溶菌期を誘導し、これによりウイルス合成を誘導し、よって本発明のＥＢＶＬＰの生成を付与しなければならない。前記の１つ以上の遺伝子を含む発現ベクターをトランスフェクトすることによって、前記の１つ以上の遺伝子を宿主細胞に与え得、該発現ベクターは好ましくは安定した発現ベクターであり、溶菌期の誘導に必要とされる１つ以上の遺伝子の発現は好ましくは誘導的に調節される。
【0058】
ＥＢＶタンパク質をコードしている少なくとも１つの核酸を、シスエレメントを欠失又は機能的に不活性化することによって改変し得、これにより少なくとも１つの核酸がＥＢＶＬＰにパッケージングされない。本発明の好ましい実施態様では、前記のＥＢＶタンパク質をコードしている少なくとも１つの核酸分子が、パッケージングエレメントＴＲを欠失している。ＥＢＶのゲノムＤＮＡのパッケージングは、その鎖状状態のウイルスゲノムの両末端において同方向に反復している末端反復配列（ＴＲ）において始まる。前記の末端反復配列は、「ターミナーゼ」と呼ばれる酵素によって認識される。したがって、少なくとも１つの核酸分子又はＥＢＶゲノムは、それがパッケージングエレメントＴＲを欠失している場合にはＥＢＶのプロキャプシドにパッケージングされず、その結果、本発明のＥＢＶＬＰが生成される。ＥＢＶＬＰの生成に使用される少なくとも１つの核酸分子又はＥＢＶゲノムが、パッケージングエレメントＴＲを欠失している場合、ＥＢＶ遺伝子のＢＡＬＦ４は、ＥＢＶＬＰの生成に使用される宿主細胞において共発現されていなくてもよい。
【0059】
本発明のさらなる実施態様では、ＥＢＶタンパク質をコードしている少なくとも１つの核酸分子は、該ＥＢＶタンパク質が発現しないように又は機能しないように遺伝子改変されている、ＢＦＬＦ１、ＢＢＲＦ１、ＢＧＲＦ１、ＢＤＲＦ１、ＢＡＬＦ３、ＢＦＲＦ１Ａ及びＢＦＲＦ１からなる群より選択された、ＥＢＶ ＤＮＡのパッケージングに必要とされるＥＢＶタンパク質をコードしている少なくとも１つの遺伝子を含み、ここでＢＦＲＦ１Ａが好ましい。該遺伝子のタンパク質は、ＥＢＶのプロキャプシドへのウイルスＤＮＡ（すなわち、ＥＢＶゲノム又は少なくとも１つの核酸分子）のパッケージングに必要とされる。したがって、少なくとも１つの核酸分子又はＥＢＶゲノムは、該遺伝子の１つ以上が、該ＥＢＶタンパク質が発現しないように又は機能しないように遺伝子改変されている場合にはＥＢＶのプロキャプシドにパッケージングされず、したがって、本発明のＥＢＶＬＰが生成される。
【0060】
本発明のさらなる実施態様では、該ＥＢＶタンパク質をコードしている少なくとも１つの核酸分子は、ＥＢＶゲノムを含む。この場合、ＥＢＶＬＰをコードしている少なくとも１つの核酸分子は、本明細書に記載のような野生型ＥＢＶゲノムと比較して遺伝子改変されていてもよい、ＥＢＶゲノムを含み得るか又はからなり得、ＥＢＶＬＰをコードしている少なくとも１つの核酸分子は依然としてＥＢＶコードｍｉＲＮＡを含む。
【0061】
例えば、本発明者らのDelecluse et al.（PNAS, vol. 96, pp. 5188-5193, 1999）及びRuiss et al.（Journal of Virology, pp. 13105-13113, 2011)の刊行物並びに国際公開公報第２０１２／０２５６０３号及び国際公開公報第２０１３／０９８３６４号の文書は、例えばＨＥＫ２９３細胞などの適切な細胞株における発現時にＥＢＶＬＰの生成を付与する核酸分子を開示している。該核酸分子は、本発明に従って改変されているが、依然としてｍｉＲＮＡコード遺伝子座を含む。したがって、本発明の核酸分子は、上記に引用されている刊行物及び文書に開示されている該核酸分子の１つを使用することによって及び本明細書に記載のような少なくとも１つのｍｉＲＮＡコード遺伝子座を欠失させることによって得ることができ、ここで得られた核酸分子はさらに本明細書に記載のように改変されていてもよい。
【0062】
本発明はさらに、ＨＶＬＰのヘルペスウイルスタンパク質又はＥＢＶＬＰのＥＢＶタンパク質をコードしている核酸分子に関する。本発明はまた、ＨＶＬＰのヘルペスウイルスタンパク質又はＥＢＶＬＰのＥＢＶタンパク質をコードしている核酸分子を含むベクターにも関する。
【0063】
ヘルペスウイルスタンパク質又はＥＢＶタンパク質をコードしている少なくとも１つの核酸分子に関して本明細書において使用する「ベクター」という用語は、関心対象のタンパク質をコードしている遺伝子を含む１つ以上の発現カセットが挿入又はクローニングされ得る、核酸配列を指す。さらに、該ベクターは好ましくは、宿主細胞の選択を付与する抗生物質耐性遺伝子及び／又は表現型マーカー、例えば蛍光タンパク質、例えばＧＦＰ、ＲＦＰ、ＹＦＰ、ＢＦＰ又はその他をコードしている。好ましくは、該ベクターはプラスミドベクター又はウイルスベクターである。該ベクターは、細菌（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシエ）、昆虫細胞、及び／又は哺乳動物細胞における増幅のための配列を含有し得る。好ましくは、該ベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける増幅を可能とする、細菌ミニＦ因子プラスミド配列を含む。
【0064】
さらなる実施態様では、本発明は、ＨＶＬＰのヘルペスウイルスタンパク質又はＥＢＶＬＰのＥＢＶタンパク質をコードしている少なくとも２つの核酸分子を含む問題の組成物を提供する。本発明のまたさらなる実施態様では、少なくとも２つの核酸分子は、少なくとも２つのベクターに含まれる（すなわち、２つの核酸分子は２つのベクターに含まれ、３つの核酸分子は３つのベクターに含まれ、４つの核酸分子は４つのベクターに含まれるなど）。
【0065】
本発明はさらに、ＨＶＬＰのヘルペスウイルスタンパク質若しくはＥＢＶＬＰのＥＢＶタンパク質をコードしている核酸分子を用いてトランスフェクトされた宿主細胞、該核酸分子を含むベクター、又はＨＶＬＰのヘルペスウイルスタンパク質若しくはＥＢＶＬＰのＥＢＶタンパク質をコードしている少なくとも２つの核酸分子を含む問題の組成物を提供し、ここでの少なくとも２つの核酸分子は好ましくは少なくとも２つのベクターに含まれる。
【0066】
本明細書において使用する「宿主細胞」という用語は、ＨＶＬＰ又はＥＢＶＬＰの形成がもたらされる、ヘルペスウイルス又はＥＢＶの溶菌複製を可能とする、細胞に関する。このような宿主細胞は好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくは霊長類細胞、さらにより好ましくはヒト細胞、最も好ましくはＨＥＫ２９３細胞である。ヘルペスウイルス又はＥＢＶがウイルス合成（すなわち溶菌期）を誘導するのに必要とされる１つ以上の機能的タンパク質を欠失している場合、宿主細胞は、１つ以上のタンパク質（例えば、ＥＢＶの場合にはＢＺＬＦ１）を提供し得ると考えられる。宿主細胞は、トランスフェクトされたベクター、安定にトランスフェクトされたベクターを介して、又は１つ以上のタンパク質をコードしている核酸配列の染色体への組み込みによって、１つ以上のタンパク質を提供し得、ここで前記の１つ以上のタンパク質の発現は好ましくは誘導的に調節されている。
【0067】
本明細書において使用する「トランスフェクション」という用語は、核酸を細胞に導入するプロセスに関する。トランスフェクションは、リン酸カルシウムにより媒介されるトランスフェクション又はリポソームにより媒介されるトランスフェクション（リポフェクション）のような化学に基づいた方法などの様々な方法によって達成され得る。また、電気穿孔法若しくはソノポレーション法などの非化学的方法、又は遺伝子銃により媒介されるトランスフェクション法若しくはマグネットフェクション法などの粒子に基づいた方法、並びに、ウイルスにより媒介される方法が、当技術分野において公知である。
【0068】
本発明はさらに、ＨＶＬＰ又はＥＢＶＬＰを生成するための方法に関し、該方法は、
（ｉ）ヘルペスウイルスタンパク質又はＥＢＶタンパク質の発現を可能とする条件下で宿主細胞を培養する工程；及び
（ｉｉ）該ＨＶＬＰ又はＥＢＶＬＰを得る工程
を含む。
（ｉ）ヘルペスウイルスタンパク質又はＥＢＶタンパク質の発現を可能とする条件下で宿主細胞を培養する工程；及び
（ｉｉ）該ＨＶＬＰ又はＥＢＶＬＰを得る工程
を含む。
【0069】
本発明はさらに、本発明のＨＶＬＰ又はＥＢＶＬＰを生成するための方法によって得ることのできるＨＶＬＰ又はＥＢＶＬＰに関する。本発明はまた、本発明のＨＶＬＰ又はＥＢＶＬＰを生成するための方法によって得ることのできるＨＶＬＰ又はＥＢＶＬＰを含むワクチンにも関する。
【0070】
本発明の方法は好ましくは、インビトロでの方法である。例えば、ＥＢＶＬＰの生成は、本発明者らのDelecluse et al.（PNAS, vol. 96, pp. 5188-5193, 1999）及びRuiss et al.（Journal of Virology, pp. 13105-13113, 2011)の刊行物並びに国際公開公報第２０１２／０２５６０３号及び国際公開公報第２０１３／０９８３６４号の文書に開示されている。
【0071】
本明細書において使用する「培養」という用語は、生物の外の細胞培養培地中で細胞を増殖することに関し、当業者には公知である。適切な細胞培養培地は細胞による生存及び複製を付与し、これらは市販されている。それらは、栄養分、塩、増殖因子、抗生物質、血清（例えばウシ胎児血清）及びｐＨ指示薬（例えばフェノールレッド）を含んでいてもよい。
【0072】
本明細書において使用する「得る」という用語は、好ましくは細胞培養上清から、ＨＶＬＰ又はＥＢＶＬＰを単離及び／又は精製することに関する。このような単離工程及び／又は精製工程は当業者には公知であり、これらは例えば、密度勾配遠心分離法、サイズ排除クロマトグラフィー法、アフィニティクロマトグラフィー法、沈降法などの方法、及びＥＢＶの場合にはＥＢＶＬＰを抗ｇｐ３５０抗体を介して磁気ビーズに結合させることによる方法を包含する。
【0073】
本発明の方法はさらに、工程（ｉ）の後及び工程（ｉｉ）の前に、ヘルペスウイルス又はエプスタイン・バーウイルスの複製期を誘導する工程を含むさらなる工程（ｉ’）を含み得、該複製期は、ヘルペスウイルス合成又はＥＢＶ合成を誘導するのに必要とされるヘルペスウイルスタンパク質又はＥＢＶタンパク質をコードしている、少なくとも１つの遺伝子を発現させることによって誘導され、ここでの該ヘルペスウイルスタンパク質又はＥＢＶタンパク質は、それが発現されないように又は機能しないように、ＨＶＬＰのヘルペスウイルスタンパク質又はＥＢＶＬＰのＥＢＶタンパク質をコードしている少なくとも１つの核酸分子において遺伝子改変されている。
【0074】
本発明の方法のさらなる実施態様では、ヘルペスウイルス合成又はＥＢＶ合成を誘導するのに必要とされるヘルペスウイルスタンパク質又はＥＢＶタンパク質をコードしている少なくとも１つの遺伝子は、該宿主細胞に安定にトランスフェクトされたベクターから発現され、並びに／あるいは、該遺伝子は誘導的に調節されている。本発明の方法のさらに好ましい実施態様では、ＥＢＶ合成を誘導するのに必要とされるＥＢＶタンパク質をコードしている少なくとも１つの遺伝子は、ＢＺＬＦ１、ＢＲＬＦ１及びＢＭＬＦ１からなる群より選択され、ＢＺＬＦ１が好ましい。
【0075】
さらなる実施態様では、本発明は、本明細書において定義されているようなＨＶＬＰ又はＥＢＶＬＰの少なくとも９９．９９％、９９．９％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３%、７２％、７１％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、又は好ましくは９５％を含む、組成物に関する。したがって、このような組成物はさらに、本明細書に記載のような含まれているＨＶＬＰ又はＥＢＶＬＰに関係なく、本明細書の記載に即していないＨＶＬＰ又はＥＢＶＬＰを含み得、例えば、このような組成物は、電子顕微鏡を使用して決定することができるように、ウイルス粒子に形態学的に類似していない異常なＨＶＬＰ又はＥＢＶＬＰを含んでいてもよい。
【0076】
別の実施態様では、本発明は、本明細書に記載のようなＨＶＬＰ若しくはＥＢＶＬＰを含むワクチン組成物、又は、本明細書に記載のようなＨＶＬＰ若しくはＥＢＶＬＰを含む組成物に関する。
【0077】
「ワクチン」及び「ワクチン組成物」という用語は本明細書において同義語として使用され、被験者に投与されると、ヘルペスウイルス又はＥＢＶに対して免疫応答を誘起する、本発明のＨＶＬＰ又はＥＢＶＬＰを含む組成物に関する。したがって、被験者への該ワクチン組成物の投与は免疫系を刺激し、ヘルペスウイルス又はＥＢＶによる新規感染及び／又は持続感染に対する免疫を確立又は改善する。好ましくは、本発明によるワクチンは、ＥＢＶによる新規感染及び／又は持続感染に対する免疫を確立又は改善することを可能とする。好ましくは、免疫化は、ＥＢＶ抗原、例えばＥＢＶ構造抗原を特異的に認識するＴ細胞及び／又はＢ細胞の活性化及び増幅を引き起こす。さらにより好ましくは、免疫化は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化及び増幅を引き起こす。また、免疫化が、ＥＢＶによる体細胞の感染を予防する抗体の生成を引き起こすことも好ましい。
【0078】
さらなる実施態様では、本発明のワクチン組成物はさらに賦形剤を含む。
【0079】
「担体」及び「賦形剤」という用語は本明細書において同義語として使用される。薬学的に許容される担体としては、希釈剤（充填剤、増量剤、例えば乳糖、微結晶セルロース）、崩壊剤（例えばグリコール酸デンプンナトリウム、クロスカルメロースナトリウム）、結合剤（例えばＰＶＰ、ＨＰＭＣ）、潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム）、滑沢剤（例えばコロイド状ＳｉＯ２）、溶媒／共溶媒（例えば水性ビヒクル、プロピレングリコール、グリセロール）、緩衝剤（例えばクエン酸塩、グルコン酸塩、乳酸塩）、保存剤（例えば安息香酸ナトリウム、パラベン（Ｍｅ、Ｐｒ、及びＢｕ）、ＢＫＣ）、抗酸化剤（例えばＢＨＴ、ＢＨＡ、アスコルビン酸）、湿潤剤（例えばポリソルベート、ソルビタンエステル）、消泡剤（例えばシメチコン）、増粘剤（例えばメチルセルロース又はヒドロキシエチルセルロース）、甘味剤（例えばソルビトール、サッカリン、アスパルテーム、アセスルファーム）、芳香剤（例えばペパーミント、レモン油、バタースコッチなど）、保水剤（例えばプロピレン、グリコール、グリコール、グリセロール、ソルビトール）が挙げられるがこれらに限定されない。さらなる薬学的に許容される担体は、（生分解性）リポソーム；生分解性ポリマーのポリ（Ｄ、Ｌ）－乳酸－グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）からなるミクロスフィア、アルブミンミクロスフィア；合成ポリマー（可溶性）；ナノファイバー、タンパク質－ＤＮＡ複合体；タンパク質コンジュゲート；赤血球；又はビロソームである。様々な担体に基づいた剤形としては、固形脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）、ポリマーナノ粒子、セラミックナノ粒子、ヒドロゲルナノ粒子、共重合ペプチドナノ粒子、ナノ結晶、及びナノ懸濁液、ナノ結晶、ナノチューブ及びナノワイヤー、官能基化ナノ担体、ナノスフィア、ナノカプセル、リポソーム、脂質エマルション、脂質マイクロチューブ／マイクロシリンダー、脂質マイクロバブル、リポスフィア、リポポリプレックス、逆脂質ミセル、デンドリマー、エトソーム、多成分超薄カプセル、アクアソーム（aquasome）、ファーマコソーム（pharmacosome）、コロイドソーム、ニオソーム、ディスコーム（discome）、プロニオソーム（proniosome）、ミクロスフィア、マイクロエマルション、及び高分子ミセルが挙げられる。他の適切な薬学的に許容される賦形剤は、とりわけ、Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Mack Publishing Co., New Jersey（1991）及びBauer et al., Pharmazeutische Technologie, 5th Ed., Govi-Verlag Frankfurt（1997）に記載されている。当業者は、例えば、医薬組成物の製剤及び投与経路に応じて、適切な薬学的に許容される担体を容易に選択することができるだろう。
【0080】
さらなる実施態様では、ワクチン組成物は、１つ以上のウイルス性若しくは非ウイルス性ポリペプチド、１つ以上のウイルス性若しくは非ウイルス性核酸配列、及び／又はワクチンアジュバントを含み、ここでの前記の１つ以上のウイルス性ポリペプチド若しくは前記の１つ以上のウイルス性核酸配列は、該ワクチン組成物におけるＨＶＬＰ若しくはＥＢＶＬＰと同じウイルスに由来しない。
【0081】
本明細書において使用する「アジュバント」という用語は、抗原又はその断片に対する宿主の免疫応答（抗体媒介性及び／又は細胞媒介性）を増強、増大、又は強化する物質を指す。本発明に従って使用するための例示的なアジュバントとしては、無機化合物、例えばミョウバン、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、水酸化リン酸カルシウム、ＴＬＲ９アゴニストのＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、ＴＬＲ４アゴニストのモノホスホリル脂質（ＭＰＬ）、ＴＬＲ４アゴニストのグルコピラノシル脂質（ＧＬＡ）、油中水滴型エマルションのモノタニドＩＳＡ５１及び７２０、鉱油、例えばパラフィン油、ビロソーム、細菌製剤、例えば死菌の百日咳菌、マイコバクテリウム・ボビス、トキソイド、細菌以外の有機物、例えばスクアレン、チメロサール、洗浄剤（クイルＡ）、サイトカイン、例えばＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－１０、及びＩＬ－１２、並びに複合組成物、例えばフロイント完全アジュバント、及びフロイント不完全アジュバントが挙げられる。一般的に、本発明に従って使用されるアジュバントは好ましくは、本発明の多量体複合体に対する免疫応答を強化し、及び／又は、免疫応答を所望の免疫応答の方向に調節する。
【0082】
「薬学的に許容される」という用語は、本発明による多量体複合体の生物学的活性の有効性を妨害しない無毒性材料を意味する。
【0083】
さらなる実施態様では、本発明は、被験者のワクチン接種又は処置における、本明細書に記載のようなＨＶＬＰ若しくはＥＢＶＬＰ、又は本明細書に記載のようなＨＶＬＰ若しくはＥＢＶＬＰを含む組成物、又は本明細書に記載のようなＨＶＬＰ若しくはＥＢＶＬＰを含むワクチン組成物の使用に関する。
【0084】
効果的な免疫化のために必要な量及び処置処方計画は変更され得、個体の大きさ、体表面積、年齢、性別、投与時刻及び投与経路、全身の健康状態、並びに併用投与される他の薬物などのこのような因子に依存し得る。前記の有効量は、幅広い範囲内にあると予想され、あらゆる所与の状況において、日常的な実験によって容易に決定され得、これは通常の臨床医又は医師の技能及び判断の範囲内である。投与形式は、免疫化用のワクチンに曝された個体の免疫化がもたらされる任意の投与形式であり得、例えば静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下、関節内注射、又は注入及び吸入などの非経口投与、並びに、経腸投与が挙げられる。好ましくは、ワクチンは、免疫化の効果を最大限にするために少なくとも２回投与される。
【0085】
本明細書において使用する「ワクチン接種」という用語は、被験者の免疫系を刺激することにより、ヘルペスウイルス又はＥＢＶによる感染又は該ウイルスに関連した疾患に対して被験者を予防的に又は治療的に免疫化するための、被験者への抗原性材料の投与に関する。本発明によると、予防的免疫化は、ヘルペスウイルス又はＥＢＶの抗原に対する、個体の免疫系、すなわちナイーブな免疫系の初めての曝露を指す。前記の初めての曝露により、曝露された個体の身体から該抗原が排除され、ヘルペスウイルス又はＥＢＶの抗原に特異的なＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞並びに抗体産生記憶Ｂ細胞が発生する。２回目の曝露により、免疫系は、ヘルペスウイルス若しくはＥＢＶ感染を予防することができ、及び／又は、該感染をより効果的に排除し、これによりヘルペスウイルス若しくはＥＢＶに関連した疾患の発生を予防若しくは軽減することができる。具体的には、前記の予防的免疫化の効果は、以下の少なくとも１つに現れる：免疫化された個体のヘルペスウイルス感染又はＥＢＶ感染の予防、感染の修飾又は制限；感染からの該個体の回復の補助、改善、増強、又は刺激、及び、その後のヘルペスウイルス又はＥＢＶによる感染を予防又は制限するであろう免疫学的記憶の発生。該効果のいずれかの存在を、当業者には公知である日常的な方法によって試験及び検出することができる。好ましくは、患者を、使用されたワクチンの一部であった１つ以上のヘルペスウイルス又はＥＢＶの抗原を用いてチャレンジし、前記の１つ以上の抗原に対する抗体力価及びＴ細胞数を決定する。また、インビトロにおいてヒトＢ細胞の感染を阻害する中和抗体の誘導も決定することができる。ヘルペスウイルス又はＥＢＶ抗原に対する免疫応答を等しく誘起するが、本発明による治療的免疫化は、該免疫化の前にヘルペスウイルス又はＥＢＶに曝されたことのある個体に対して実施され、すなわち該個体はすでにヘルペスウイルス又はＥＢＶに感染している。この場合、免疫化により、同族抗原と直面した休止中のエフェクターＴ細胞の再活性化が、これらの抗原がＭＨＣクラスＩ分子及び／又はＭＨＣクラスＩＩ分子と結合した状態でプロフェッショナル抗原提示細胞によって提示されるという形態でもたらされる。ＥＢＶに対する治療的免疫化は、ウイルスの再活性化が望ましくない場合、例えば移植レシピエント又はさもなくば免疫低下状態の患者（ＨＩＶ陽性個体、がん患者、重度の炎症疾患又は自己免疫疾患を有する患者）において、又はＥＢＶの再活性化により、移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）及び非ホジキンリンパ腫、慢性活動性ＥＢＶ感染（ＣＡＥＢＶ）、口腔毛状白板症のような疾患の発症する可能性があるか若しくは発症した場合、又はＥＢＶのＢ細胞形質転換能により例えばがんなどの疾患が発症した場合には、特に妥当であることが判明し得る。
【0086】
さらなる実施態様では、本発明は、ＨＶＬＰ又はＥＢＶＬＰの生成における、ＨＶＬＰのヘルペスウイルスタンパク質又はＥＢＶＬＰのＥＢＶタンパク質をコードしている核酸分子、該核酸分子を含むベクター、ＨＶＬＰのヘルペスウイルスタンパク質又はＥＢＶＬＰのＥＢＶタンパク質をコードしている少なくとも２つの核酸分子を含む問題の組成物（ここでの少なくとも２つの核酸分子は好ましくは、少なくとも２つのベクターに含まれる）、該核酸分子、該ベクター又は該組成物を用いてトランスフェクトされた宿主細胞の使用に関する。
【0087】
本発明はさらに、本明細書に記載のようなＨＶＬＰ、本明細書に記載のようなＥＢＶＬＰ、ＨＶＬＰのヘルペスウイルスタンパク質若しくはＥＢＶＬＰのＥＢＶタンパク質をコードしている核酸分子、該核酸分子を含むベクター、ＨＶＬＰのヘルペスウイルスタンパク質若しくはＥＢＶＬＰのＥＢＶタンパク質をコードしている少なくとも２つの核酸分子を含む問題の組成物（ここでの少なくとも２つの核酸分子は好ましくは、少なくとも２つのベクターに含まれる）、該核酸分子、該ベクター若しくは該組成物を用いてトランスフェクトされた宿主細胞、本明細書に記載のようなＨＶＬＰ若しくはＥＢＶＬＰの少なくとも９５％を含む組成物、及び／又は、本明細書に記載のようなワクチン組成物を含む、キットに関する。
【0088】
本明細書及びそれに続く特許請求の範囲の全体を通して、内容から別様である必要がない限り、「含む（comprise）」という単語並びに「含む（comprises）」及び「含んでいる」などの変化形は、記載された整数若しくは工程、又は整数群若しくは工程群の包含を意味すると理解されるが、任意の他の整数若しくは工程、又は整数群若しくは工程群の排除を意味するものではない。本明細書において使用する場合、「含んでいる」という用語は、「含有している」という用語で又は本明細書において使用される場合には時には「有している」という用語で置き換えることができる。本明細書において使用する場合、「からなる」は、特許請求の範囲の要素に明記されていないあらゆる要素、工程、又は成分を排除する。本明細書において使用する場合、「実質的にからなる」は、特許請求の範囲の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない材料又は工程を排除しない。本明細書ではそれぞれの場合において、「含んでいる」、「実質的にからなる」及び「からなる」という用語のいずれかを、他の２つの用語のいずれかで置き換えてもよい。
【0089】
本明細書において使用する「約」又は「およそ」という用語は、所与の数値又は範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内を意味する。それはまた、名数も含み、約２０は２０を含む。
【0090】
本明細書において特に定義されない限り、本発明に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。さらに、脈絡によって特に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。本発明の方法及び技術は一般的に、当技術分野において周知の慣用的な方法に従って実施される。一般的に、本明細書に記載の生化学、酵素学、分子生物学及び細胞生物学、微生物学、遺伝学、並びにタンパク質化学及び核酸化学、並びにハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法は、当技術分野において周知でありかつ一般的に使用されているものである。
【0091】
本発明の方法及び技術は一般的に、特記されない限り、当技術分野において周知である慣用的な方法に従って、並びに本明細書全体を通して引用及び考察されている様々な一般的な参考文献及びより特殊な参考文献に記載されているように実施される。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, J, Greene Publishing Associates (1992, and Supplements to 2002); Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol I 1976 CRC Press; Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol II 1976 CRC Pressを参照されたい。本明細書に記載の分子生物学及び細胞生物学、タンパク質生化学、酵素学、並びに医薬品化学及び薬化学に関連して使用される命名法、並びにその実験手順及び実験技術は、当技術分野において周知でありかつ一般的に使用されるものである。
【図面の簡単な説明】
【0092】
【図1-1】ＥＢＶ ｍｉＲＮＡは、免疫の主要な経路に影響を及ぼす。（Ａ）感染から５日後の、ｗｔ／Ｂ９５－８又はΔｍｉＲ ＥＢＶに感染させた６つのドナー（ドナーＡｄ１～Ａｄ６）のＢ細胞において最も強力に調節された遺伝子のヒートマップ。絶対ｚスコアが１．６を超えている発現差を有する遺伝子転写物が示されている。青色及び赤色は、ΔｍｉＲ ＥＢＶに感染させた細胞と比較してｗｔ／Ｂ９５－８に感染させた細胞においてそれぞれダウンレギュレート及びアップレギュレートされた転写物を示す。（Ｂ）獲得免疫応答又はｐ５３シグナル伝達経路に関連した選択された遺伝子の調節。以前に報告されたＥＢＶ ｍｉＲＮＡの標的及び一般的なハウスキーピング遺伝子も同様に示されている。青色の背景の陰影は、ウイルスｍｉＲＮＡによってダウンレギュレートされた遺伝子を示す。（Ｃ）全てのｍｉＲＮＡの中のＥＢＶ ｍｉＲＮＡの割合。６つのドナーの平均値が示されている。
【図1-2】ＥＢＶ ｍｉＲＮＡは、免疫の主要な経路に影響を及ぼす。（Ａ）感染から５日後の、ｗｔ／Ｂ９５－８又はΔｍｉＲ ＥＢＶに感染させた６つのドナー（ドナーＡｄ１～Ａｄ６）のＢ細胞において最も強力に調節された遺伝子のヒートマップ。絶対ｚスコアが１．６を超えている発現差を有する遺伝子転写物が示されている。青色及び赤色は、ΔｍｉＲ ＥＢＶに感染させた細胞と比較してｗｔ／Ｂ９５－８に感染させた細胞においてそれぞれダウンレギュレート及びアップレギュレートされた転写物を示す。（Ｂ）獲得免疫応答又はｐ５３シグナル伝達経路に関連した選択された遺伝子の調節。以前に報告されたＥＢＶ ｍｉＲＮＡの標的及び一般的なハウスキーピング遺伝子も同様に示されている。青色の背景の陰影は、ウイルスｍｉＲＮＡによってダウンレギュレートされた遺伝子を示す。（Ｃ）全てのｍｉＲＮＡの中のＥＢＶ ｍｉＲＮＡの割合。６つのドナーの平均値が示されている。
【図2-1】ＥＢＶ ｍｉＲＮＡは、炎症誘発性サイトカインの分泌、並びに抗原の処理及び提示に関与する分子の発現を阻害する。（Ａ）ｗｔ／Ｂ９５－８又はΔｍｉＲ ＥＢＶに感染させたＢ細胞による様々なサイトカインの分泌。４日間前又は１１日間前（感染後日数（days post infection）、ｄｐｉ）に感染させておいたＢ細胞を、さらに４日間培養して、ＥＬＩＳＡによってサイトカインレベルを決定した（ｎ＝３）。ＣｐＧ ＤＮＡを、示されているように添加した。（Ｂ）ＥＢＶ ｍｉＲＮＡは、ＩＬ１２Ｂ及びＴＡＰ２を調節する。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、示されているようなｍｉＲＮＡ発現ベクター及び野生型又は突然変異型３’－ＵＴＲを有するルシフェラーゼレポータープラスミド（図７）を用いて共トランスフェクトした（ｎ＝３）。ルシフェラーゼ活性を、野生型３’－ＵＴＲレポーター及び空プラスミドを用いて共トランスフェクトさせた細胞由来の溶解液に対して標準化した。ｗｔ：野生型３’－ＵＴＲ、ｍｕｔ：突然変異型３’－ＵＴＲ、Φ：空プラスミド。Ｐ値を、対応がない両側Ｔ検定によって計算した。アステリスク（＊）は、空プラスミドを用いて共トランスフェクトさせた野生型レポーターのルシフェラーゼ活性と比べてｐ＜０．０５を示す。（Ｃ）ＥＢＶに感染させたＢ細胞におけるＴＡＰ１及びＴＡＰ２のウェスタンブロット分析。チューブリン（ＴＵＢＢ）及びβ－アクチン（ＡＣＴＢ）はハウスキーピング対照としての役目を果たす。陽性対照はＩＰＯ７である。代表例（上）及びチューブリンに対して標準化されたタンパク質発現（下；ｎ＝３～５）が示されている。（Ｄ～Ｅ）ＥＢＶ ｍｉＲＮＡによって調節される、ＨＬＡ分子（Ｄ）並びに共刺激分子及び接着分子（Ｅ）の細胞表面発現。蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を、個々の表面タンパク質について免疫染色した後に測定し、比率（ｗｔ／Ｂ９５－８に感染させたＢ細胞を、ΔｍｉＲ ＥＢＶに感染させたＢ細胞で割る）を示す（ｎ＝５～１０）。平均値±標準偏差が示されている。n.d＝検出されず；ｗｔ：ｗｔ／Ｂ９５－８；＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１。
【図2-2】ＥＢＶ ｍｉＲＮＡは、炎症誘発性サイトカインの分泌、並びに抗原の処理及び提示に関与する分子の発現を阻害する。（Ａ）ｗｔ／Ｂ９５－８又はΔｍｉＲ ＥＢＶに感染させたＢ細胞による様々なサイトカインの分泌。４日間前又は１１日間前（感染後日数（days post infection）、ｄｐｉ）に感染させておいたＢ細胞を、さらに４日間培養して、ＥＬＩＳＡによってサイトカインレベルを決定した（ｎ＝３）。ＣｐＧ ＤＮＡを、示されているように添加した。（Ｂ）ＥＢＶ ｍｉＲＮＡは、ＩＬ１２Ｂ及びＴＡＰ２を調節する。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、示されているようなｍｉＲＮＡ発現ベクター及び野生型又は突然変異型３’－ＵＴＲを有するルシフェラーゼレポータープラスミド（図７）を用いて共トランスフェクトした（ｎ＝３）。ルシフェラーゼ活性を、野生型３’－ＵＴＲレポーター及び空プラスミドを用いて共トランスフェクトさせた細胞由来の溶解液に対して標準化した。ｗｔ：野生型３’－ＵＴＲ、ｍｕｔ：突然変異型３’－ＵＴＲ、Φ：空プラスミド。Ｐ値を、対応がない両側Ｔ検定によって計算した。アステリスク（＊）は、空プラスミドを用いて共トランスフェクトさせた野生型レポーターのルシフェラーゼ活性と比べてｐ＜０．０５を示す。（Ｃ）ＥＢＶに感染させたＢ細胞におけるＴＡＰ１及びＴＡＰ２のウェスタンブロット分析。チューブリン（ＴＵＢＢ）及びβ－アクチン（ＡＣＴＢ）はハウスキーピング対照としての役目を果たす。陽性対照はＩＰＯ７である。代表例（上）及びチューブリンに対して標準化されたタンパク質発現（下；ｎ＝３～５）が示されている。（Ｄ～Ｅ）ＥＢＶ ｍｉＲＮＡによって調節される、ＨＬＡ分子（Ｄ）並びに共刺激分子及び接着分子（Ｅ）の細胞表面発現。蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を、個々の表面タンパク質について免疫染色した後に測定し、比率（ｗｔ／Ｂ９５－８に感染させたＢ細胞を、ΔｍｉＲ ＥＢＶに感染させたＢ細胞で割る）を示す（ｎ＝５～１０）。平均値±標準偏差が示されている。n.d＝検出されず；ｗｔ：ｗｔ／Ｂ９５－８；＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１。
【図2-3】ＥＢＶ ｍｉＲＮＡは、炎症誘発性サイトカインの分泌、並びに抗原の処理及び提示に関与する分子の発現を阻害する。（Ａ）ｗｔ／Ｂ９５－８又はΔｍｉＲ ＥＢＶに感染させたＢ細胞による様々なサイトカインの分泌。４日間前又は１１日間前（感染後日数（days post infection）、ｄｐｉ）に感染させておいたＢ細胞を、さらに４日間培養して、ＥＬＩＳＡによってサイトカインレベルを決定した（ｎ＝３）。ＣｐＧ ＤＮＡを、示されているように添加した。（Ｂ）ＥＢＶ ｍｉＲＮＡは、ＩＬ１２Ｂ及びＴＡＰ２を調節する。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、示されているようなｍｉＲＮＡ発現ベクター及び野生型又は突然変異型３’－ＵＴＲを有するルシフェラーゼレポータープラスミド（図７）を用いて共トランスフェクトした（ｎ＝３）。ルシフェラーゼ活性を、野生型３’－ＵＴＲレポーター及び空プラスミドを用いて共トランスフェクトさせた細胞由来の溶解液に対して標準化した。ｗｔ：野生型３’－ＵＴＲ、ｍｕｔ：突然変異型３’－ＵＴＲ、Φ：空プラスミド。Ｐ値を、対応がない両側Ｔ検定によって計算した。アステリスク（＊）は、空プラスミドを用いて共トランスフェクトさせた野生型レポーターのルシフェラーゼ活性と比べてｐ＜０．０５を示す。（Ｃ）ＥＢＶに感染させたＢ細胞におけるＴＡＰ１及びＴＡＰ２のウェスタンブロット分析。チューブリン（ＴＵＢＢ）及びβ－アクチン（ＡＣＴＢ）はハウスキーピング対照としての役目を果たす。陽性対照はＩＰＯ７である。代表例（上）及びチューブリンに対して標準化されたタンパク質発現（下；ｎ＝３～５）が示されている。（Ｄ～Ｅ）ＥＢＶ ｍｉＲＮＡによって調節される、ＨＬＡ分子（Ｄ）並びに共刺激分子及び接着分子（Ｅ）の細胞表面発現。蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を、個々の表面タンパク質について免疫染色した後に測定し、比率（ｗｔ／Ｂ９５－８に感染させたＢ細胞を、ΔｍｉＲ ＥＢＶに感染させたＢ細胞で割る）を示す（ｎ＝５～１０）。平均値±標準偏差が示されている。n.d＝検出されず；ｗｔ：ｗｔ／Ｂ９５－８；＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１。
【図2-4】ＥＢＶ ｍｉＲＮＡは、炎症誘発性サイトカインの分泌、並びに抗原の処理及び提示に関与する分子の発現を阻害する。（Ａ）ｗｔ／Ｂ９５－８又はΔｍｉＲ ＥＢＶに感染させたＢ細胞による様々なサイトカインの分泌。４日間前又は１１日間前（感染後日数（days post infection）、ｄｐｉ）に感染させておいたＢ細胞を、さらに４日間培養して、ＥＬＩＳＡによってサイトカインレベルを決定した（ｎ＝３）。ＣｐＧ ＤＮＡを、示されているように添加した。（Ｂ）ＥＢＶ ｍｉＲＮＡは、ＩＬ１２Ｂ及びＴＡＰ２を調節する。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、示されているようなｍｉＲＮＡ発現ベクター及び野生型又は突然変異型３’－ＵＴＲを有するルシフェラーゼレポータープラスミド（図７）を用いて共トランスフェクトした（ｎ＝３）。ルシフェラーゼ活性を、野生型３’－ＵＴＲレポーター及び空プラスミドを用いて共トランスフェクトさせた細胞由来の溶解液に対して標準化した。ｗｔ：野生型３’－ＵＴＲ、ｍｕｔ：突然変異型３’－ＵＴＲ、Φ：空プラスミド。Ｐ値を、対応がない両側Ｔ検定によって計算した。アステリスク（＊）は、空プラスミドを用いて共トランスフェクトさせた野生型レポーターのルシフェラーゼ活性と比べてｐ＜０．０５を示す。（Ｃ）ＥＢＶに感染させたＢ細胞におけるＴＡＰ１及びＴＡＰ２のウェスタンブロット分析。チューブリン（ＴＵＢＢ）及びβ－アクチン（ＡＣＴＢ）はハウスキーピング対照としての役目を果たす。陽性対照はＩＰＯ７である。代表例（上）及びチューブリンに対して標準化されたタンパク質発現（下；ｎ＝３～５）が示されている。（Ｄ～Ｅ）ＥＢＶ ｍｉＲＮＡによって調節される、ＨＬＡ分子（Ｄ）並びに共刺激分子及び接着分子（Ｅ）の細胞表面発現。蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を、個々の表面タンパク質について免疫染色した後に測定し、比率（ｗｔ／Ｂ９５－８に感染させたＢ細胞を、ΔｍｉＲ ＥＢＶに感染させたＢ細胞で割る）を示す（ｎ＝５～１０）。平均値±標準偏差が示されている。n.d＝検出されず；ｗｔ：ｗｔ／Ｂ９５－８；＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１。
【図3-1】ＥＢＶ ｍｉＲＮＡは、ＥＢＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＴｈ１への分化及び認識を妨げる。（Ａ）ヘルパーＴ細胞分化に対するウイルスｍｉＲＮＡの影響を評価するための共培養実験の概観図。（Ｂ）ＥＢＶ感染Ｂ細胞との共培養時におけるナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞によるＴｈ１の分化。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、新規に感染させた自己Ｂ細胞及びαＣＤ３抗体／αＣＤ２８抗体と共に、示された比で７日間培養した（ｎ＝５～６）。ホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ）及びイオノマイシンにより再刺激された増殖中のＴｈ１細胞を、細胞内ＩＦＮ－γ染色によって定量した。左：代表的なフローサイトメトリー分析；右：全ての実験の要約。（Ｃ）抗ＩＬ１２Ｂ抗体（５μg/ml）は、１：１のＢ細胞：Ｔ細胞の比の、ｗｔ／Ｂ９５－８又はΔｍｉＲに感染させたＢ細胞と共培養したナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞によるＴｈ１細胞への分化を抑制した（ｎ＝８）。同じアイソタイプの関連性のない抗体を対照として使用した。（Ｄ）ＥＢＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の抗ウイルス機能に対するウイルスｍｉＲＮＡの影響を調べた共培養実験の概観図。（Ｅ）ＥＢＶに感染させた自己Ｂ細胞（ａｕｔｏ）、ＨＬＡの一致したＢ細胞、又はミスマッチのＢ細胞（ｍｉｓ．）と共培養したポリクローナルＥＢＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの遊離（ｎ＝３；図１２）。Ｂ細胞：Ｔ細胞の比は１：１であった。ＨＬＡクラスＩＩの一致した対立遺伝子が示されている。Φ：Ｔ細胞のみ；ｎ．ａ．：適用不可能。（Ｆ）ＥＢＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞障害活性。ＥＢＶに感染させたＢ細胞の死滅を、カルセイン遊離アッセイによって様々なＢ細胞：Ｔ細胞の比で分析した。ＨＬＡの一致したＥＢＶに感染させた標的Ｂ細胞を用いた代表的な実験（左；ｎ＝３）及びＨＬＡの一致したＢ細胞を用いた全ての実験の概観（右）が記載されている。平均値±標準偏差が示されている。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１。
【図3-2】ＥＢＶ ｍｉＲＮＡは、ＥＢＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＴｈ１への分化及び認識を妨げる。（Ａ）ヘルパーＴ細胞分化に対するウイルスｍｉＲＮＡの影響を評価するための共培養実験の概観図。（Ｂ）ＥＢＶ感染Ｂ細胞との共培養時におけるナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞によるＴｈ１の分化。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、新規に感染させた自己Ｂ細胞及びαＣＤ３抗体／αＣＤ２８抗体と共に、示された比で７日間培養した（ｎ＝５～６）。ホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ）及びイオノマイシンにより再刺激された増殖中のＴｈ１細胞を、細胞内ＩＦＮ－γ染色によって定量した。左：代表的なフローサイトメトリー分析；右：全ての実験の要約。（Ｃ）抗ＩＬ１２Ｂ抗体（５μg/ml）は、１：１のＢ細胞：Ｔ細胞の比の、ｗｔ／Ｂ９５－８又はΔｍｉＲに感染させたＢ細胞と共培養したナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞によるＴｈ１細胞への分化を抑制した（ｎ＝８）。同じアイソタイプの関連性のない抗体を対照として使用した。（Ｄ）ＥＢＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の抗ウイルス機能に対するウイルスｍｉＲＮＡの影響を調べた共培養実験の概観図。（Ｅ）ＥＢＶに感染させた自己Ｂ細胞（ａｕｔｏ）、ＨＬＡの一致したＢ細胞、又はミスマッチのＢ細胞（ｍｉｓ．）と共培養したポリクローナルＥＢＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの遊離（ｎ＝３；図１２）。Ｂ細胞：Ｔ細胞の比は１：１であった。ＨＬＡクラスＩＩの一致した対立遺伝子が示されている。Φ：Ｔ細胞のみ；ｎ．ａ．：適用不可能。（Ｆ）ＥＢＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞障害活性。ＥＢＶに感染させたＢ細胞の死滅を、カルセイン遊離アッセイによって様々なＢ細胞：Ｔ細胞の比で分析した。ＨＬＡの一致したＥＢＶに感染させた標的Ｂ細胞を用いた代表的な実験（左；ｎ＝３）及びＨＬＡの一致したＢ細胞を用いた全ての実験の概観（右）が記載されている。平均値±標準偏差が示されている。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１。
【図4-1】ＥＢＶ ｍｉＲＮＡは、ＥＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞による、ＥＢＶに感染したＢ細胞の認識を阻害する。（Ａ）ＥＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の抗ウイルス機能に対するウイルスｍｉＲＮＡの影響を調べた共培養実験の概観図。（Ｂ）ＥＢＶに感染させた自己Ｂ細胞（ａｕｔｏ）、ＨＬＡの一致したＢ細胞、又はミスマッチのＢ細胞（ｍｉｓ．）と共培養したポリクローナルＥＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの遊離（ｎ＝３；図１２）。Ｂ細胞：Ｔ細胞の比は１：１であった。ＨＬＡクラスＩＩの一致した対立遺伝子が示されている。Φ：Ｔ細胞のみ；ｎ．ａ．：適用不可能。（Ｃ）ＥＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞障害活性。ＥＢＶに感染させたＢ細胞（ｗｔ／Ｂ９５－８又はΔｍｉＲ ＥＢＶ）の死滅を、カルセイン遊離アッセイで様々なＢ細胞：Ｔ細胞の比で分析した。ＨＬＡの一致したＥＢＶに感染させた標的Ｂ細胞を用いた代表的な実験（左；ｎ＝３）及びＨＬＡの一致したＢ細胞を用いた全ての実験の概観（右）が記載されている。（Ｄ）ＬＭＰ２エピトープＩＥＤ（ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１拘束性）に対して指向されるＣＤ８＋Ｔ細胞クローンの反応性。Ｔ細胞を、１５日間かけて感染させておいたＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１陽性Ｂ細胞と共に１６時間培養した。ＥＬＩＳＡを用いて定量されたＩＦＮ－γ分泌レベル（左；ｎ＝３）及びＨＬＡ－Ｂ＊４０についてのＭＦＩ比（ｗｔ／Ｂ９５－８に感染させたＢ細胞を、ΔｍｉＲ ＥＢＶに感染させたＢ細胞で割る）（右；ｎ＝４）が記載されている。Φ：Ｔ細胞のみ：ペプチド：対照ペプチドの積載されたＴ細胞。ｗｔ：ｗｔ／Ｂ９５－８。平均値±標準偏差が示されている。＊：ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図4-2】ＥＢＶ ｍｉＲＮＡは、ＥＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞による、ＥＢＶに感染したＢ細胞の認識を阻害する。（Ａ）ＥＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の抗ウイルス機能に対するウイルスｍｉＲＮＡの影響を調べた共培養実験の概観図。（Ｂ）ＥＢＶに感染させた自己Ｂ細胞（ａｕｔｏ）、ＨＬＡの一致したＢ細胞、又はミスマッチのＢ細胞（ｍｉｓ．）と共培養したポリクローナルＥＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの遊離（ｎ＝３；図１２）。Ｂ細胞：Ｔ細胞の比は１：１であった。ＨＬＡクラスＩＩの一致した対立遺伝子が示されている。Φ：Ｔ細胞のみ；ｎ．ａ．：適用不可能。（Ｃ）ＥＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞障害活性。ＥＢＶに感染させたＢ細胞（ｗｔ／Ｂ９５－８又はΔｍｉＲ ＥＢＶ）の死滅を、カルセイン遊離アッセイで様々なＢ細胞：Ｔ細胞の比で分析した。ＨＬＡの一致したＥＢＶに感染させた標的Ｂ細胞を用いた代表的な実験（左；ｎ＝３）及びＨＬＡの一致したＢ細胞を用いた全ての実験の概観（右）が記載されている。（Ｄ）ＬＭＰ２エピトープＩＥＤ（ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１拘束性）に対して指向されるＣＤ８＋Ｔ細胞クローンの反応性。Ｔ細胞を、１５日間かけて感染させておいたＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１陽性Ｂ細胞と共に１６時間培養した。ＥＬＩＳＡを用いて定量されたＩＦＮ－γ分泌レベル（左；ｎ＝３）及びＨＬＡ－Ｂ＊４０についてのＭＦＩ比（ｗｔ／Ｂ９５－８に感染させたＢ細胞を、ΔｍｉＲ ＥＢＶに感染させたＢ細胞で割る）（右；ｎ＝４）が記載されている。Φ：Ｔ細胞のみ：ペプチド：対照ペプチドの積載されたＴ細胞。ｗｔ：ｗｔ／Ｂ９５－８。平均値±標準偏差が示されている。＊：ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図5】ＥＢＶ ｍｉＲＮＡによる機能的遺伝子群の調節。ＫＥＧＧ経路の分類を、遺伝子機能の分類のために使用した。経路を、統計学的有意性によって選別する。オレンジ色の点のサイズは、ｐ値のスコアの常用対数を示す。６つのドナーのそれぞれについて、発現差を有する転写物の変化倍数の数値をプロットする。図１ａのように、青色又は赤色はそれぞれＥＢＶ ｍｉＲＮＡによるダウンレギュレーション又はアップレギュレーションを示す。
【図6】ＲＩＳＣ－ＩＰ後のＥＢＶ ｍｉＲＮＡの定量。ＥＢＶのＢＨＲＦ及びＢＡＲＴ ｍｉＲＮＡは、ｗｔ／Ｂ９５－８ＥＢＶに感染させたＢ細胞に蓄積するが、ΔｍｉＲ ＥＢＶに感染させたＢ細胞においては殆ど検出できない。平均値±標準偏差が示されている。
【図7】３’－ＵＴＲレポーター及びそれらの突然変異。図２ｂで分析された、選択された転写物の３’－ＵＴＲの部分配列を、レポーターベクター内の対応するｍｉＲＮＡ、及び３’－ＵＴＲ内の突然変異と一緒に示す。相補性は、ＲＮＡハイブリッドアルゴリズムに従ってコンピューターシミュレーションによる予測に基づき、ワトソン－クリック（「｜」）又はＧ：Ｕ（「：」）として示される。一致していないヌクレオチド残基が示されている（Ｘ）。それらは、レポータープラスミド内の突然変異したｍＲＮＡ標的配列から生じる。
【図8】ポリクローナルＥＢＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の反応性。ＥＢＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を、５日間前に感染させておいた自己Ｂ細胞と一緒に１６時間共培養した。次いで、ＩＦＮ－γ分泌レベルを、ＥＬＩＳＡを用いて定量した。示されているような様々なＢ細胞：Ｔ細胞の比を使用した。
【図9】ｇｐ３５０特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンの反応性。ｇｐ３５０特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞クローン、エピトープＦＧＱ（ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊１３０１）を、エフェクター細胞として使用した。ドナーＪＭ（表Ｓ２）に由来する自己Ｂ細胞を、１：１のＢ細胞：Ｔ細胞の比で示された２つのＥＢＶ株を用いての感染から５日後及び１５日後に、標的細胞として使用した。１６時間共培養した後、ＩＦＮ－γ及びＧＭ－ＣＳＦ分泌レベルを、ＥＬＩＳＡによって定量した。平均値±標準偏差が示されている。
【図10】ＬＭＰ２特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンへの抗原提示に対するウイルスｍｉＲＮＡの影響を調べる共培養実験の概観図。
【図11】ＥＢＶ ｍｉＲＮＡによるウイルス遺伝子の調節。（Ａ）感染から１５日後における、ｗｔ／Ｂ９５－８又はΔｍｉＲ ＥＢＶに感染させたＢ細胞におけるＬＭＰ２Ａ発現のウェスタンブロット分析。代表例（上）及びチューブリンに対して標準化されたタンパク質発現（下、ｎ＝４）が記載されている。平均値±標準偏差が示されている。（Ｂ）ウイルスｍｉＲＮＡによる２つのＬＭＰ２遺伝子変異体の変化倍数の自然対数。分析は図１Ｂのように実施されたが、発現レベルの定量は、スプライシング変異体を正しく分析するためにエキソンに関して実施された。
【図12】ＨＬＡ対立遺伝子。ディープシークエンスによって同定されたドナーのＨＬＡの対立遺伝子（MVZ Martinsried、ドイツ）のリスト（そのＢ細胞及びＴ細胞が、本研究の共培養実験に使用されている）。ｎ．ａ．：入手不可能。
【図13】エプスタイン・バーウイルスＶＬＰを使用したＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化。ヒトＥＢＶにより不死化されたＢ細胞株（ＬＣＬ）を、ｍｉＲＮＡを有するか又は全てのｍｉＲＮＡを欠失している（ΔｍｉＲＮＡ）同じような数のＶＬＰ（１×１０４個の粒子／細胞）と共に２４時間インキュベートし、次いで、ＥＢＶ外被タンパク質ＢＮＲＦ１に対して特異的なＨＬＡの一致したＣＤ４＋Ｔ細胞クローンと共にさらに２４時間共培養した。Ｔ細胞の活性化を、ＩＦＮγ－ＥＬＩＳＡアッセイで定量した。対照は、ＬＣＬ、又はＬＣＬと共培養していなかったＴ細胞（Ｔ細胞のみ）である。
【0093】
実施例
以下の実施例は本発明を説明するが、本発明の範囲を限定するものと捉えられるべきではない。
以下の実施例は本発明を説明するが、本発明の範囲を限定するものと捉えられるべきではない。
【0094】
材料及び方法
ヒト初代細胞の分離
ヒト初代Ｂ細胞及びＴ細胞を、フィコール－ハイパック勾配遠心分離によって、咽頭扁桃単核細胞（ＭＮＣ）又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から調製した。Ｂ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、それぞれ、ＣＤ１９マイクロビーズ、ＣＤ４マイクロビーズ、ＣＤ８マイクロビーズ、及びナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞単離キットＩＩと共に、ＭＡＣＳ分離機（ミルテニーバイオテク社）を使用して咽頭扁桃ＭＮＣ又はＰＢＭＣから分離した。
ヒト初代細胞の分離
ヒト初代Ｂ細胞及びＴ細胞を、フィコール－ハイパック勾配遠心分離によって、咽頭扁桃単核細胞（ＭＮＣ）又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から調製した。Ｂ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、それぞれ、ＣＤ１９マイクロビーズ、ＣＤ４マイクロビーズ、ＣＤ８マイクロビーズ、及びナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞単離キットＩＩと共に、ＭＡＣＳ分離機（ミルテニーバイオテク社）を使用して咽頭扁桃ＭＮＣ又はＰＢＭＣから分離した。
【0095】
細胞株及び細胞培養液
ＥＢＶ陽性バーキットリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ及びＨＥＫ２９３系のＥＢＶ産生細胞株（Seto et al., PLoS Pathog. 6, e1001063 (2010)）、感染させたヒト一次Ｂ細胞、及び単離されたＴ細胞を、ＲＰＭＩ１６４０培地（ライフテクノロジーズ社）中に維持した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＤＭＥＭ培地中に維持した。全ての培地に、１０％ＦＢＳ（ライフテクノロジーズ社）、ペニシリン（１００U/ml；ライフテクノロジーズ社）及びストレプトマイシン（１００mg/ml；ライフテクノロジーズ社）を補充した。細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で培養した。
ＥＢＶ陽性バーキットリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ及びＨＥＫ２９３系のＥＢＶ産生細胞株（Seto et al., PLoS Pathog. 6, e1001063 (2010)）、感染させたヒト一次Ｂ細胞、及び単離されたＴ細胞を、ＲＰＭＩ１６４０培地（ライフテクノロジーズ社）中に維持した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＤＭＥＭ培地中に維持した。全ての培地に、１０％ＦＢＳ（ライフテクノロジーズ社）、ペニシリン（１００U/ml；ライフテクノロジーズ社）及びストレプトマイシン（１００mg/ml；ライフテクノロジーズ社）を補充した。細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で培養した。
【0096】
感染性ＥＢＶストックの調製及びヒト初代Ｂ細胞の感染
感染性ＥＢＶストックを記載の通りに調製した（Seto et al.,、同上）。簡潔に言えば、ΔｍｉＲ（４０２７）ＥＢＶ株及びｗｔ／Ｂ９５－８（２０８９）ＥＢＶ株のためのＥＢＶ産生細胞株を、ＢＺＬＦ１及びＢＡＬＦ４をコードしている発現プラスミドを用いて一過性にトランスフェクトすることにより、ＥＢＶの溶菌期を誘導した。上清を、トランスフェクションから３日後に回収し、破片を３０００rpmで１５分間の遠心分離によって清澄化した。ウイルスストックを、以前に報告されているように（Seto et al.,、同上）Ｒａｊｉ細胞に対して滴定した。ウイルスに感染させるために、一次Ｂ細胞を、各ウイルスストックと共に１８時間培養した。新鮮な培地と交換した後、感染した細胞を、５×１０５個の細胞／mlの初期密度で播種した。
感染性ＥＢＶストックを記載の通りに調製した（Seto et al.,、同上）。簡潔に言えば、ΔｍｉＲ（４０２７）ＥＢＶ株及びｗｔ／Ｂ９５－８（２０８９）ＥＢＶ株のためのＥＢＶ産生細胞株を、ＢＺＬＦ１及びＢＡＬＦ４をコードしている発現プラスミドを用いて一過性にトランスフェクトすることにより、ＥＢＶの溶菌期を誘導した。上清を、トランスフェクションから３日後に回収し、破片を３０００rpmで１５分間の遠心分離によって清澄化した。ウイルスストックを、以前に報告されているように（Seto et al.,、同上）Ｒａｊｉ細胞に対して滴定した。ウイルスに感染させるために、一次Ｂ細胞を、各ウイルスストックと共に１８時間培養した。新鮮な培地と交換した後、感染した細胞を、５×１０５個の細胞／mlの初期密度で播種した。
【0097】
ＲＮＡシークエンス及びＲＩＳＣ－ＩＰ
ヒト一次Ｂ細胞の感染から５日後、全ＲＮＡを、製造業者のプロトコールに従って、トリゾール（ライフテクノロジーズ社）及びＤｉｒｅｃｔ－Ｚｏｌ ＲＮＡ ＭｉｎｉＰｒｅｐ（ザイモリサーチ社）を用いて、６つの異なるドナー（Ａｄ１～Ａｄ６）から、ＲＮＡシークエンスのために抽出した。平行して、ＲＩＳＣ免疫沈降法（ＲＩＳＣ－ＩＰ）を以前に記載（Kuzembayeva, et al., PLoS ONE. 7, e47409 (2012)）のように実施した。簡潔に言えば、溶解した細胞を、抗Ａｇｏ２抗体（１１Ａ９）にコンジュゲートさせたダイナビーズ（ライフテクノロジーズ社）と共にインキュベートし、洗浄し、共沈降したＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡライブラリーを調製した（vertis Biotechnologie AG、フライジング、ドイツ）。ＲＮＡシークエンスのために、全ＲＮＡから、Ｒｉｂｏ－Ｚｅｒｏ ｒＲＮＡ除去キット（イルミナ社）によってｒＲＮＡを取り除き、超音波処理によって断片化し、ランダムプライマーを用いて一本鎖合成にかけた。ＲＩＳＣ－ＩＰのために、ＲＮＡにポリ（Ａ）テイルを付け、５’－リン酸にＲＮＡアダプターをライゲートすることによりイルミナ社のＴｒｕＳｅｑシークエンスを容易にし、オリゴ－（ｄＴ）プライマーを用いての一本鎖合成にかけた。ｃＤＮＡをＰＣＲで増幅させ、イルミナ社のＨｉＳｅｑ２０００機器を用いてウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンターＤＮＡシークエンス施設でシークエンスした。
ヒト一次Ｂ細胞の感染から５日後、全ＲＮＡを、製造業者のプロトコールに従って、トリゾール（ライフテクノロジーズ社）及びＤｉｒｅｃｔ－Ｚｏｌ ＲＮＡ ＭｉｎｉＰｒｅｐ（ザイモリサーチ社）を用いて、６つの異なるドナー（Ａｄ１～Ａｄ６）から、ＲＮＡシークエンスのために抽出した。平行して、ＲＩＳＣ免疫沈降法（ＲＩＳＣ－ＩＰ）を以前に記載（Kuzembayeva, et al., PLoS ONE. 7, e47409 (2012)）のように実施した。簡潔に言えば、溶解した細胞を、抗Ａｇｏ２抗体（１１Ａ９）にコンジュゲートさせたダイナビーズ（ライフテクノロジーズ社）と共にインキュベートし、洗浄し、共沈降したＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡライブラリーを調製した（vertis Biotechnologie AG、フライジング、ドイツ）。ＲＮＡシークエンスのために、全ＲＮＡから、Ｒｉｂｏ－Ｚｅｒｏ ｒＲＮＡ除去キット（イルミナ社）によってｒＲＮＡを取り除き、超音波処理によって断片化し、ランダムプライマーを用いて一本鎖合成にかけた。ＲＩＳＣ－ＩＰのために、ＲＮＡにポリ（Ａ）テイルを付け、５’－リン酸にＲＮＡアダプターをライゲートすることによりイルミナ社のＴｒｕＳｅｑシークエンスを容易にし、オリゴ－（ｄＴ）プライマーを用いての一本鎖合成にかけた。ｃＤＮＡをＰＣＲで増幅させ、イルミナ社のＨｉＳｅｑ２０００機器を用いてウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンターＤＮＡシークエンス施設でシークエンスした。
【0098】
ディープシークエンスの分析
ＲＮＡシークエンスのために、ペアエンド読み取りの処理（ポリＡテイルフィルタリング、Ｎ－フィルタリング、アダプターの除去）を、ＦａｓｔＱＣ及びＲ２Ｍ（ローリードマニュピュレーター）を使用して実施した。読み取り情報を、ヒトゲノム（ｈｇ１９「コア」染色体セット）にＳＴＡＲによってマッピングし、１つの転写物あたりのｆｅａｔｕｒｅ領域のカウント数を、ｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓ、及びＥＢＶの注釈（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＪ５０７７９９）と一緒にＧｅｎｅｃｏｄｅＣＶ１９注釈付けを使用して決定した。ウイルスｍｉＲＮＡによって異なって調節される遺伝子をスクリーニングするために、ドナー／レプリケートに関する変化倍数の順位に基づいた簡単であるが有効なスコアリングアルゴリズムを使用した。各遺伝子ｇ及びレプリケートｋについて、遺伝子特異的順位スコアが計算される：
（ここで、ｎは全てのレプリケートの数であり、ｍは全ての遺伝子／転写物の数であり、γｇｋは試料ｋにおける遺伝子ｇの順位である）。
ＲＮＡシークエンスのために、ペアエンド読み取りの処理（ポリＡテイルフィルタリング、Ｎ－フィルタリング、アダプターの除去）を、ＦａｓｔＱＣ及びＲ２Ｍ（ローリードマニュピュレーター）を使用して実施した。読み取り情報を、ヒトゲノム（ｈｇ１９「コア」染色体セット）にＳＴＡＲによってマッピングし、１つの転写物あたりのｆｅａｔｕｒｅ領域のカウント数を、ｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓ、及びＥＢＶの注釈（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＪ５０７７９９）と一緒にＧｅｎｅｃｏｄｅＣＶ１９注釈付けを使用して決定した。ウイルスｍｉＲＮＡによって異なって調節される遺伝子をスクリーニングするために、ドナー／レプリケートに関する変化倍数の順位に基づいた簡単であるが有効なスコアリングアルゴリズムを使用した。各遺伝子ｇ及びレプリケートｋについて、遺伝子特異的順位スコアが計算される：
【数1】
（ここで、ｎは全てのレプリケートの数であり、ｍは全ての遺伝子／転写物の数であり、γｇｋは試料ｋにおける遺伝子ｇの順位である）。
【0099】
高度に発現差を有する遺伝子を選択するために、順位スコアをｚスコアに変換し、絶対ｚスコアが１．６を超える全ての転写物を選択した。
【0100】
ＲＩＳＣ－ＩＰのために、マッピングした読み取り情報を、ＲパッケージＤＥｓｅｑ２を用いて推定されたサイズ係数を使用して標準化し、注釈付きの３’ＵＴＲ領域にマッピングされた読み取り情報についてＧｅｎｅｃｏｄｅ ｖ１９を使用してフィルタリングした。ΔｍｉＲ ＥＢＶに感染させたＢ細胞と比較したｗｔ ＥＢＶに感染させたＢ細胞との間で、３’ＵＴＲ上の読み取り情報の濃縮箇所における局所的な量的な差異を同定するために、ドナーに関する相対的な濃縮スコアを計算した。各ゲノム位置ｐについての、相対的な発現ｅｓｐは、以下のように計算された：
（ここでそれぞれ、ｅｔｐは、ｗｔ ＥＢＶ感染細胞における位置ｐにおける発現値であり、ｅｃｐは、ΔｍｉＲ ＥＢＶ感染Ｂ細胞における局所的な発現値である）。
【数2】
（ここでそれぞれ、ｅｔｐは、ｗｔ ＥＢＶ感染細胞における位置ｐにおける発現値であり、ｅｃｐは、ΔｍｉＲ ＥＢＶ感染Ｂ細胞における局所的な発現値である）。
【0101】
正規化係数ｎｐｕ＝ｅｔｐ／ｍａｘ（ｅｕ）を導入することにより、関心対象のＵＴＲ配列における局所的最大値を修正し、ここでｍａｘ（ｅｕ）は、ＵＴＲ配列ｕにおける最大発現値である。最後に、ガウシアン・フィルタを使用して局所ノイズを最小限とした。ウイルスｍｉＲＮＡに結合した３’－ＵＴＲを選択するために、閾値を以下のように設定した：２人以上のドナーの３’－ＵＴＲにおいて２０を超えるヌクレオチド鎖について濃縮スコアが０．６を超える。
【0102】
ＫＥＧＧ濃縮経路
特定の経路の濃縮を、ＫＥＧＧ ＡＰＩウェブサービスを介して超幾何分布試験を実施することによって推定した。全ての計算は、Ｍａｔｌａｂ（マスワークス社）を使用して実施された。
特定の経路の濃縮を、ＫＥＧＧ ＡＰＩウェブサービスを介して超幾何分布試験を実施することによって推定した。全ての計算は、Ｍａｔｌａｂ（マスワークス社）を使用して実施された。
【0103】
ＥＬＩＳＡ
感染Ｂ細胞からのサイトカインの分泌を検出するために、１×１０６個の細胞を、感染から４日後又は１１日後に６ウェルプレートに播種し、シクロスポリン（１μg/ml；ノバルティス社）と共に４日間培養した。上清を収集し、－２０℃で保存した。インターロイキン－６（ＩＬ－６）、ＩＬ－１０、ＩＬ１２Ｂ（ＩＬ－１２ｐ４０）、ＩＬ－１２、ＩＬ－２３、及びＴＮＦ－αについての酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を、製造業者のプロトコール（マブテック社）に従って実施した。ＩＬ－６、ＩＬ－１０、及びＴＮＦ－αについては、ＣｐＧ ＤＮＡを以前に記載（Iskra, et al., J. Virol. 84, 3612-3623 (2010)）のように加えて、感染Ｂ細胞を刺激した。ＩＦＮ－γレベルについてのＥＬＩＳＡを、製造業者のプロトコール（マブテック社）に従って実施した。
感染Ｂ細胞からのサイトカインの分泌を検出するために、１×１０６個の細胞を、感染から４日後又は１１日後に６ウェルプレートに播種し、シクロスポリン（１μg/ml；ノバルティス社）と共に４日間培養した。上清を収集し、－２０℃で保存した。インターロイキン－６（ＩＬ－６）、ＩＬ－１０、ＩＬ１２Ｂ（ＩＬ－１２ｐ４０）、ＩＬ－１２、ＩＬ－２３、及びＴＮＦ－αについての酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を、製造業者のプロトコール（マブテック社）に従って実施した。ＩＬ－６、ＩＬ－１０、及びＴＮＦ－αについては、ＣｐＧ ＤＮＡを以前に記載（Iskra, et al., J. Virol. 84, 3612-3623 (2010)）のように加えて、感染Ｂ細胞を刺激した。ＩＦＮ－γレベルについてのＥＬＩＳＡを、製造業者のプロトコール（マブテック社）に従って実施した。
【0104】
フローサイトメトリー及び抗体
フルオロフォアにコンジュゲートさせた抗体を用いての免疫染色後、単一細胞懸濁液を、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ又はＦＡＣＳＣａｎｔｏ（ＢＤ社）フローサイトメーター及びＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤバイオサイエンシーズ社）を用いて測定した。入手したデータを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアバージョン９．８（ＦｌｏｗＪｏ社）を用いて分析した。ヒト抗原に対して反応性である、以下のフルオロフォアにコンジュゲートさせた抗体を使用した：ＡＰＣ標識抗ヒトＩＦＮ－γ抗体（４Ｓ．Ｂ３、ＩｇＧ１；バイオレジェンド社）、ＰＥ標識抗ＣＤ４０抗体（５ｃ３、ＩｇＧ２ｂ；バイオレジェンド社）、ＰＥ標識抗ＩＣＯＳ－Ｌ抗体（Ｂ７－Ｈ２）（２Ｄ３、ＩｇＧ２ｂ；バイオレジェンド社）、ＡＰＣ標識抗ＰＤ－Ｌ１抗体（Ｂ７－Ｈ１）（２９Ｅ．２Ａ３、ＩｇＧ２ｂ；バイオレジェンド社）、ＰＥ標識抗ＣＤ８６抗体（Ｂ７－２）（３７３０１、ＩｇＧ１；Ｒ＆Ｄシステムズ社）、ＡＰＣ標識抗ＣＤ５４抗体（ＩＣＡＭ－１）（ＨＣＤ５４、ＩｇＧ１；バイオレジェンド社）、ＡＰＣ標識抗ＨＬＡ－ＡＢＣ抗体（Ｗ６／３２、ＩｇＧ２ａ；バイオレジェンド社）、ＰＥ－Ｃｙ５標識抗ＣＤ８０抗体（Ｌ３０７．４；ＢＤファーミンゲン社）、ＰＥ標識抗ＦＡＳ抗体（ＣＤ４５）抗体（Ｄｘ２、ＩｇＧ１；バイオレジェンド社）、非標識抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体（Ｌ２３４、ＩｇＧ２ａ；バイオレジェンド社）、非標識抗ＨＬＡ－ＤＱ抗体（ＳＰＶ－Ｌ３、ＩｇＧ２ａ；ＡｂＤセロテック社）、非標識抗ＨＬＡ－ＤＰ抗体（Ｂ７／２１、ＩｇＧ３；アブカム社）、ＡＰＣ標識抗マウスＦ（ａｂ’）２抗体（ポリクローナル、ＩｇＧ；イーバイオサイエンス社）、ＰＥ標識ＨＬＡ－Ｂｗ６（ＲＥＡ１４３、ＩｇＧ１；ミルテニーバイオテク社）、ＰＥ標識アイソタイプＩｇＧ１（ＭＯＰＣ－２１；バイオレジェンド社）、ＰＥ標識アイソタイプＩｇＧ２ｂ（ＭＰＣ－１１；バイオレジェンド社）、ＡＰＣ標識アイソタイプＩｇＧ１（ＭＯＰＣ－２１；ＢＤバイオサイエンス社）、ＡＰＣ標識アイソタイプＩｇＧ２ａ（ＭＯＰＣ－１７３；バイオレジェンド社）、ＡＰＣ標識アイソタイプＩｇＧ２ｂ（ＭＧ２ｂ－５７；バイオレジェンド社）。
フルオロフォアにコンジュゲートさせた抗体を用いての免疫染色後、単一細胞懸濁液を、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ又はＦＡＣＳＣａｎｔｏ（ＢＤ社）フローサイトメーター及びＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤバイオサイエンシーズ社）を用いて測定した。入手したデータを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアバージョン９．８（ＦｌｏｗＪｏ社）を用いて分析した。ヒト抗原に対して反応性である、以下のフルオロフォアにコンジュゲートさせた抗体を使用した：ＡＰＣ標識抗ヒトＩＦＮ－γ抗体（４Ｓ．Ｂ３、ＩｇＧ１；バイオレジェンド社）、ＰＥ標識抗ＣＤ４０抗体（５ｃ３、ＩｇＧ２ｂ；バイオレジェンド社）、ＰＥ標識抗ＩＣＯＳ－Ｌ抗体（Ｂ７－Ｈ２）（２Ｄ３、ＩｇＧ２ｂ；バイオレジェンド社）、ＡＰＣ標識抗ＰＤ－Ｌ１抗体（Ｂ７－Ｈ１）（２９Ｅ．２Ａ３、ＩｇＧ２ｂ；バイオレジェンド社）、ＰＥ標識抗ＣＤ８６抗体（Ｂ７－２）（３７３０１、ＩｇＧ１；Ｒ＆Ｄシステムズ社）、ＡＰＣ標識抗ＣＤ５４抗体（ＩＣＡＭ－１）（ＨＣＤ５４、ＩｇＧ１；バイオレジェンド社）、ＡＰＣ標識抗ＨＬＡ－ＡＢＣ抗体（Ｗ６／３２、ＩｇＧ２ａ；バイオレジェンド社）、ＰＥ－Ｃｙ５標識抗ＣＤ８０抗体（Ｌ３０７．４；ＢＤファーミンゲン社）、ＰＥ標識抗ＦＡＳ抗体（ＣＤ４５）抗体（Ｄｘ２、ＩｇＧ１；バイオレジェンド社）、非標識抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体（Ｌ２３４、ＩｇＧ２ａ；バイオレジェンド社）、非標識抗ＨＬＡ－ＤＱ抗体（ＳＰＶ－Ｌ３、ＩｇＧ２ａ；ＡｂＤセロテック社）、非標識抗ＨＬＡ－ＤＰ抗体（Ｂ７／２１、ＩｇＧ３；アブカム社）、ＡＰＣ標識抗マウスＦ（ａｂ’）２抗体（ポリクローナル、ＩｇＧ；イーバイオサイエンス社）、ＰＥ標識ＨＬＡ－Ｂｗ６（ＲＥＡ１４３、ＩｇＧ１；ミルテニーバイオテク社）、ＰＥ標識アイソタイプＩｇＧ１（ＭＯＰＣ－２１；バイオレジェンド社）、ＰＥ標識アイソタイプＩｇＧ２ｂ（ＭＰＣ－１１；バイオレジェンド社）、ＡＰＣ標識アイソタイプＩｇＧ１（ＭＯＰＣ－２１；ＢＤバイオサイエンス社）、ＡＰＣ標識アイソタイプＩｇＧ２ａ（ＭＯＰＣ－１７３；バイオレジェンド社）、ＡＰＣ標識アイソタイプＩｇＧ２ｂ（ＭＧ２ｂ－５７；バイオレジェンド社）。
【0105】
ウェスタンブロット
細胞を、ＲＩＰＡ緩衝液（５０mMトリス－ＨＣｌ（ｐＨ８）、１５０mM ＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ、１％ＮＰ－４０、０．５％ＤＯＣ）を用いて溶解し、レムリ緩衝液と共に抽出物を煮沸した。タンパク質を１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（カールルース社）上で分離し、ニトロセルロース膜（ＧＥヘルスケアライフサイエンス社）にＭｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ Ｔｅｔｒａ Ｃｅｌｌ（バイオラッド社）を使用して転写した。膜をＲｏｔｉ－Ｂｌｏｃｋ（カールルース社）を用いて３０分間かけて遮断し、その後、抗体をインキュベートした。セイヨウワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートさせた二次抗体を使用し（セルシグナリング社）、ＣＥＡフィルム（アグフアのヘルスケア）に感光した。タンパク質レベルをソフトウェアＩｍａｇｅＪを用いて定量した。ヒトタンパク質に対して反応性である以下の一次抗体を使用した：抗ヒトチューブリン抗体（Ｂ－５－１－２；サンタクルーズ社）、抗ヒトアクチン抗体（ＡＣ－７４；シグマ社）、抗ヒトＩＰＯ７抗体（ａｂ８８３３９；アブカム社）、抗ヒトＴＡＰ１抗体（１．２８；アクリス社）、及び抗ヒトＴＡＰ２抗体（２．１７、アクリス社）。ＥＢＶタンパク質ＬＭＰ２に対して反応性である（ＴＰ－１４Ｂ７）モノクローナル抗体は、Elisabeth Kremmerによって提供された。
細胞を、ＲＩＰＡ緩衝液（５０mMトリス－ＨＣｌ（ｐＨ８）、１５０mM ＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ、１％ＮＰ－４０、０．５％ＤＯＣ）を用いて溶解し、レムリ緩衝液と共に抽出物を煮沸した。タンパク質を１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（カールルース社）上で分離し、ニトロセルロース膜（ＧＥヘルスケアライフサイエンス社）にＭｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ Ｔｅｔｒａ Ｃｅｌｌ（バイオラッド社）を使用して転写した。膜をＲｏｔｉ－Ｂｌｏｃｋ（カールルース社）を用いて３０分間かけて遮断し、その後、抗体をインキュベートした。セイヨウワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートさせた二次抗体を使用し（セルシグナリング社）、ＣＥＡフィルム（アグフアのヘルスケア）に感光した。タンパク質レベルをソフトウェアＩｍａｇｅＪを用いて定量した。ヒトタンパク質に対して反応性である以下の一次抗体を使用した：抗ヒトチューブリン抗体（Ｂ－５－１－２；サンタクルーズ社）、抗ヒトアクチン抗体（ＡＣ－７４；シグマ社）、抗ヒトＩＰＯ７抗体（ａｂ８８３３９；アブカム社）、抗ヒトＴＡＰ１抗体（１．２８；アクリス社）、及び抗ヒトＴＡＰ２抗体（２．１７、アクリス社）。ＥＢＶタンパク質ＬＭＰ２に対して反応性である（ＴＰ－１４Ｂ７）モノクローナル抗体は、Elisabeth Kremmerによって提供された。
【0106】
ルシフェラーゼレポーターアッセイ
ＩＬ１２Ｂ（Ensembl: ENST00000231228）及びＴＡＰ２（Ensembl: ENST00000374897）の３’－ＵＴＲを、発現プラスミドｐｓｉＣＨＥＣＫ－２（プロメガ社）内のホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）の下流にクローニングした。ウイルスｍｉＲＮＡ発現ベクターを構築するために、ＴａｇＢＦＰ（エブロジェン社）を、ＥＦ１αプロモーターの制御下でｐＣＤＨ－ＥＦ１－ＭＣＳ（システムバイオサイエンシーズ社）にクローニングした。関心対象の単一のｍｉＲＮＡを、ＴａｇＢＦＰコード遺伝子の下流にクローニングした。ウイルスｍｉＲＮＡは、ｐ４０８０プラスミドからＰＣＲによって得られた（Seto、同上）。ｐｓｉＣＨＥＣＫ－２レポーター及びｐＣＤＨ－ＥＦ１ｍｉＲＮＡ発現プラスミドＤＮＡを、メタフェクテンプロ（ビオンテックス社）によってＨＥＫ２９３Ｔ細胞に共トランスフェクトした。２４時間かけてトランスフェクトした後、ルシフェラーゼ活性を、デュアル－ルシフェラーゼアッセイキット（プロメガ社）及びＯｒｉｏｎ ＩＩマイクロプレートルミノメーター（Titertek-Berthold社）を用いて測定した。Ｆｌｕｃの活性を、ｐｓｉＣＨＥＣＫ－２レポーターにコードされているウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）の活性に対して標準化した。主にＴａｒｇｅｔＳｃａｎ（www.targetscan.org）を用いて３’－ＵＴＲ上のＥＢＶ ｍｉＲＮＡ結合部位のコンピューターシミュレーションの予測を実施し、６ｍｅｒの結合部位をスクリーニングするためにＲＮＡハイブリッド（bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid）を使用した（Bartel, Cell. 136, 215-233 (2009)）。部位特異的突然変異誘発を、オーバーラップしているオリゴＤＮＡ及びＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いて実施した。
ＩＬ１２Ｂ（Ensembl: ENST00000231228）及びＴＡＰ２（Ensembl: ENST00000374897）の３’－ＵＴＲを、発現プラスミドｐｓｉＣＨＥＣＫ－２（プロメガ社）内のホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）の下流にクローニングした。ウイルスｍｉＲＮＡ発現ベクターを構築するために、ＴａｇＢＦＰ（エブロジェン社）を、ＥＦ１αプロモーターの制御下でｐＣＤＨ－ＥＦ１－ＭＣＳ（システムバイオサイエンシーズ社）にクローニングした。関心対象の単一のｍｉＲＮＡを、ＴａｇＢＦＰコード遺伝子の下流にクローニングした。ウイルスｍｉＲＮＡは、ｐ４０８０プラスミドからＰＣＲによって得られた（Seto、同上）。ｐｓｉＣＨＥＣＫ－２レポーター及びｐＣＤＨ－ＥＦ１ｍｉＲＮＡ発現プラスミドＤＮＡを、メタフェクテンプロ（ビオンテックス社）によってＨＥＫ２９３Ｔ細胞に共トランスフェクトした。２４時間かけてトランスフェクトした後、ルシフェラーゼ活性を、デュアル－ルシフェラーゼアッセイキット（プロメガ社）及びＯｒｉｏｎ ＩＩマイクロプレートルミノメーター（Titertek-Berthold社）を用いて測定した。Ｆｌｕｃの活性を、ｐｓｉＣＨＥＣＫ－２レポーターにコードされているウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）の活性に対して標準化した。主にＴａｒｇｅｔＳｃａｎ（www.targetscan.org）を用いて３’－ＵＴＲ上のＥＢＶ ｍｉＲＮＡ結合部位のコンピューターシミュレーションの予測を実施し、６ｍｅｒの結合部位をスクリーニングするためにＲＮＡハイブリッド（bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid）を使用した（Bartel, Cell. 136, 215-233 (2009)）。部位特異的突然変異誘発を、オーバーラップしているオリゴＤＮＡ及びＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いて実施した。
【0107】
ＥＢＶにより刺激されたエフェクターＴ細胞及びＴ細胞クローンの確立
ＥＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンは、リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）又は以前に記載（Adhikary et al.. PLoS ONE. 2, e583 (2007)）のような小型ＬＣＬによるＰＢＭＣの刺激によって生成された、ポリクローナルＴ細胞株から確立された。
ＥＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンは、リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）又は以前に記載（Adhikary et al.. PLoS ONE. 2, e583 (2007)）のような小型ＬＣＬによるＰＢＭＣの刺激によって生成された、ポリクローナルＴ細胞株から確立された。
【0108】
Ｔ細胞の分化及び認識
Ｔｈ１の分化は、選別されたナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞と感染から５日後の感染させたＢ細胞との共培養によって評価された。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ライフテクノロジーズ社）で染色された１×１０５個のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞及び０．５又は１×１０５個の感染Ｂ細胞を、９６ウェルプレート中でＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（ライフテクノロジーズ社）と共に培養し、７日間培養した。ＩＬ１２Ｂ（Ｃ８．６；バイオレジェンド社）に対する中和抗体又は対応するアイソタイプ対照抗体（ＭＯＰＣ－２１；バイオレジェンド社）を５μg/mlで、一部の実験のために加えた。細胞を、ＰＭＡ及びイオノマイシン（Cell Stimulation Cocktail；イーバイオサイエンス社）で５時間再刺激し、固定する前にブレフェルジンＡ及びモネンシン（バイオレジェンド社）を用いて処理した。Ｔｈ１個体群を、ＦＩＸ＆ＰＥＲＭ Ｃｅｌｌ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎキット（ライフテクノロジーズ社）を用いての細胞内ＩＦＮ－γの染色及び続くフローサイトメトリー分析によって測定した。Ｔｈ１個体群は、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔによる染色を介して同定された増殖中のＴ細胞画分における、ＩＦＮ－γ陽性Ｔ細胞として定義された。ＥＢＶ特異的エフェクターＴ細胞の活性を、ＥＬＩＳＡ及びカルセイン遊離アッセイを用いて測定した。Ｔ細胞からＩＦＮ－γを検出するために、エフェクター細胞及び標的細胞を各々、５×１０４個の細胞/ml（１：１比）で播種し、９６ウェルプレート（Ｖ底）中で１６時間共培養した。ＩＦＮ－γレベルはＥＬＩＳＡを用いて検出された。１６pg/mlよりも低いＩＦＮ－γ濃度は、検出されなかったと判断された。
Ｔｈ１の分化は、選別されたナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞と感染から５日後の感染させたＢ細胞との共培養によって評価された。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ライフテクノロジーズ社）で染色された１×１０５個のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞及び０．５又は１×１０５個の感染Ｂ細胞を、９６ウェルプレート中でＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（ライフテクノロジーズ社）と共に培養し、７日間培養した。ＩＬ１２Ｂ（Ｃ８．６；バイオレジェンド社）に対する中和抗体又は対応するアイソタイプ対照抗体（ＭＯＰＣ－２１；バイオレジェンド社）を５μg/mlで、一部の実験のために加えた。細胞を、ＰＭＡ及びイオノマイシン（Cell Stimulation Cocktail；イーバイオサイエンス社）で５時間再刺激し、固定する前にブレフェルジンＡ及びモネンシン（バイオレジェンド社）を用いて処理した。Ｔｈ１個体群を、ＦＩＸ＆ＰＥＲＭ Ｃｅｌｌ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎキット（ライフテクノロジーズ社）を用いての細胞内ＩＦＮ－γの染色及び続くフローサイトメトリー分析によって測定した。Ｔｈ１個体群は、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔによる染色を介して同定された増殖中のＴ細胞画分における、ＩＦＮ－γ陽性Ｔ細胞として定義された。ＥＢＶ特異的エフェクターＴ細胞の活性を、ＥＬＩＳＡ及びカルセイン遊離アッセイを用いて測定した。Ｔ細胞からＩＦＮ－γを検出するために、エフェクター細胞及び標的細胞を各々、５×１０４個の細胞/ml（１：１比）で播種し、９６ウェルプレート（Ｖ底）中で１６時間共培養した。ＩＦＮ－γレベルはＥＬＩＳＡを用いて検出された。１６pg/mlよりも低いＩＦＮ－γ濃度は、検出されなかったと判断された。
【0109】
Ｔ細胞の細胞障害性アッセイ
一次感染Ｂ細胞を、フィコールハイパック勾配遠心分離によって精製し、５×１０５個の標的細胞を０．５μg/mlのカルセインで標識した。ＰＢＳを用いての３回の洗浄工程後、標的細胞及びエフェクター細胞を様々な比で、９６ウェルプレート（Ｖ底）中で、バックグラウンドシグナルを減少させるためにフェノールレッド非含有のＲＰＭＩ培地中で共培養した。４時間共培養した後、遊離したカルセインの蛍光強度を、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ２００ ＰＲＯフルオロメーター（テカン社）によって測定した。対照として、エフェクター細胞の非存在下で培養された標的細胞、及び０．５％トリトン－Ｘ１００を用いて溶解された標的細胞の自発的なカルセイン遊離は、それぞれ、皆無な標的細胞又は完全に溶解された標的細胞のレベルを定義するために使用された。
一次感染Ｂ細胞を、フィコールハイパック勾配遠心分離によって精製し、５×１０５個の標的細胞を０．５μg/mlのカルセインで標識した。ＰＢＳを用いての３回の洗浄工程後、標的細胞及びエフェクター細胞を様々な比で、９６ウェルプレート（Ｖ底）中で、バックグラウンドシグナルを減少させるためにフェノールレッド非含有のＲＰＭＩ培地中で共培養した。４時間共培養した後、遊離したカルセインの蛍光強度を、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ２００ ＰＲＯフルオロメーター（テカン社）によって測定した。対照として、エフェクター細胞の非存在下で培養された標的細胞、及び０．５％トリトン－Ｘ１００を用いて溶解された標的細胞の自発的なカルセイン遊離は、それぞれ、皆無な標的細胞又は完全に溶解された標的細胞のレベルを定義するために使用された。
【0110】
統計分析
プリズム６．０ソフトウェア（グラフパッド社）を統計分析のために使用し、特記しない限り両側比Ｔ検定を適用した。
プリズム６．０ソフトウェア（グラフパッド社）を統計分析のために使用し、特記しない限り両側比Ｔ検定を適用した。
【0111】
実施例１
ウイルスがその効率的な感染を育むために標的化する細胞内ｍＲＮＡを検出するために設計されたアプローチを使用して、ＥＢＶのｍｉＲＮＡの標的を探索した。１３個のｍｉＲＮＡを発現する実験株（ｗｔ／Ｂ９５－８）と、ｍｉＲＮＡを全く発現していないその欠失誘導体（ΔｍｉＲ）という２つのＥＢＶストックを使用して、６つのドナーから新しく単離されたＢ細胞に感染させた。ＲＮＡを感染から５日後に単離し、シークエンスした。発現差を有していた遺伝子は、図１Ａで示されるｚスコアが１．６を超える遺伝子と同定された。これらの遺伝子は、ウイルスｍｉＲＮＡ標的ＬＹ７５／ＤＥＣ２０５（Skalsky et al., PLoS Pathog.8, e1002484 (2012))）及びＩＰＯ７（Dolken et al., Cell Host Microbe. 7, 324-334 (2010)）を含んでいた。同定された調節されていた遺伝子は、ｗｔ／Ｂ９５－８ＥＢＶ感染細胞において一貫してダウンレギュレートされている遺伝子に基づいて、京都遺伝子ゲノム百科事典（ＫＥＧＧ）経路分類に従ってグループ分けされた。このグループ分けは、アポトーシス、細胞周期調節、及びｐ５３シグナル伝達に関連した経路において濃縮されていた（Seto et al., PLoS Pathog. 6, e1001063 (2010)）。このグループ分けはまた際立ったことに、新しく感染した細胞において、ＥＢＶのｍｉＲＮＡは、抗原処理、ＨＬＡ及び共刺激分子、及びサイトカイン－サイトカイン受容体相互作用を包含する、多様な免疫機能を調節することを明らかとした（図１Ｂ、図５）。ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ－ＩＰ）を免疫沈降させ、全ｍｉＲＮＡのうち１４．５％（±２．４％の標準偏差）が、ｗｔ／Ｂ９５－８ＥＢＶ感染細胞においてウイルス起源であることが判明した（図１Ｃ及び図６）。また、ＰＡＲ－ＣＬＩＰ実験において見られているように、様々なｍＲＮＡが、ＲＩＳＣにおいて細胞試料間で異なって検出されたことが判明した（Skalsky、同上）（ＧＥＯ：ＧＳＥ４１４３７）。それ故、分析は、全試料におけるそれらの異なる発現によって同定された候補ｍＲＮＡに主に焦点が当てられ（図１Ａ）、ＲＩＳＣ－ＩＰの結果を使用してそれらを確認した。
ウイルスがその効率的な感染を育むために標的化する細胞内ｍＲＮＡを検出するために設計されたアプローチを使用して、ＥＢＶのｍｉＲＮＡの標的を探索した。１３個のｍｉＲＮＡを発現する実験株（ｗｔ／Ｂ９５－８）と、ｍｉＲＮＡを全く発現していないその欠失誘導体（ΔｍｉＲ）という２つのＥＢＶストックを使用して、６つのドナーから新しく単離されたＢ細胞に感染させた。ＲＮＡを感染から５日後に単離し、シークエンスした。発現差を有していた遺伝子は、図１Ａで示されるｚスコアが１．６を超える遺伝子と同定された。これらの遺伝子は、ウイルスｍｉＲＮＡ標的ＬＹ７５／ＤＥＣ２０５（Skalsky et al., PLoS Pathog.8, e1002484 (2012))）及びＩＰＯ７（Dolken et al., Cell Host Microbe. 7, 324-334 (2010)）を含んでいた。同定された調節されていた遺伝子は、ｗｔ／Ｂ９５－８ＥＢＶ感染細胞において一貫してダウンレギュレートされている遺伝子に基づいて、京都遺伝子ゲノム百科事典（ＫＥＧＧ）経路分類に従ってグループ分けされた。このグループ分けは、アポトーシス、細胞周期調節、及びｐ５３シグナル伝達に関連した経路において濃縮されていた（Seto et al., PLoS Pathog. 6, e1001063 (2010)）。このグループ分けはまた際立ったことに、新しく感染した細胞において、ＥＢＶのｍｉＲＮＡは、抗原処理、ＨＬＡ及び共刺激分子、及びサイトカイン－サイトカイン受容体相互作用を包含する、多様な免疫機能を調節することを明らかとした（図１Ｂ、図５）。ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ－ＩＰ）を免疫沈降させ、全ｍｉＲＮＡのうち１４．５％（±２．４％の標準偏差）が、ｗｔ／Ｂ９５－８ＥＢＶ感染細胞においてウイルス起源であることが判明した（図１Ｃ及び図６）。また、ＰＡＲ－ＣＬＩＰ実験において見られているように、様々なｍＲＮＡが、ＲＩＳＣにおいて細胞試料間で異なって検出されたことが判明した（Skalsky、同上）（ＧＥＯ：ＧＳＥ４１４３７）。それ故、分析は、全試料におけるそれらの異なる発現によって同定された候補ｍＲＮＡに主に焦点が当てられ（図１Ａ）、ＲＩＳＣ－ＩＰの結果を使用してそれらを確認した。
【0112】
実施例２
ＥＢＶのｍｉＲＮＡは、免疫機能に対して中心的であるサイトカインを調節することが確認された。２つのＥＢＶ株に感染させたＢ細胞に由来する上清を、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－α、ＩＬ１２Ｂ（ＩＬ－１２ｐ４０）、ＩＬ－１２（ｐ３５／ｐ４０）、及びＩＬ－２３（ｐ１９／ｐ４０）のレベルについてアッセイした。ＥＢＶ感染細胞から分泌されたＩＬ－６及びＴＮＦ－αの検出のために、ＴＬＲ９を刺激するＣｐＧ ＤＮＡを加えた（Iskra, et al., J. Virol. 84, 3612-3623 (2010)）。ｗｔ／Ｂ９５－８ＥＢＶに感染させたＢ細胞は、ΔｍｉＲ ＥＢＶに感染させたＢ細胞よりもより少ないＩＬ－６、ＴＮＦ－α、及びＩＬ－１２ｐ４０を分泌した。これに対し、抗炎症性サイトカインＩＬ－１０の遊離は、ウイルスｍｉＲＮＡ（図２Ａ）によって影響を受けないようであり、これはトランスクリプトーム分析（図１Ｂ）と一致する。ＩＬ－１２（ｐ３５／ｐ４０）及びＩＬ－２３（ｐ１９／ｐ４０）の分泌（どちらも、ＩＬ－１２ｐ４０サブユニットを含有している（Szabo et al., Annu. Rev. Immunol. 21, 713-758 (2003)）は、ΔｍｉＲ ＥＢＶに感染させた細胞と比較して、ｗｔ／Ｂ９５－８ＥＢＶに感染させた細胞において有意に減少していた（図２Ａ）。
ＥＢＶのｍｉＲＮＡは、免疫機能に対して中心的であるサイトカインを調節することが確認された。２つのＥＢＶ株に感染させたＢ細胞に由来する上清を、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－α、ＩＬ１２Ｂ（ＩＬ－１２ｐ４０）、ＩＬ－１２（ｐ３５／ｐ４０）、及びＩＬ－２３（ｐ１９／ｐ４０）のレベルについてアッセイした。ＥＢＶ感染細胞から分泌されたＩＬ－６及びＴＮＦ－αの検出のために、ＴＬＲ９を刺激するＣｐＧ ＤＮＡを加えた（Iskra, et al., J. Virol. 84, 3612-3623 (2010)）。ｗｔ／Ｂ９５－８ＥＢＶに感染させたＢ細胞は、ΔｍｉＲ ＥＢＶに感染させたＢ細胞よりもより少ないＩＬ－６、ＴＮＦ－α、及びＩＬ－１２ｐ４０を分泌した。これに対し、抗炎症性サイトカインＩＬ－１０の遊離は、ウイルスｍｉＲＮＡ（図２Ａ）によって影響を受けないようであり、これはトランスクリプトーム分析（図１Ｂ）と一致する。ＩＬ－１２（ｐ３５／ｐ４０）及びＩＬ－２３（ｐ１９／ｐ４０）の分泌（どちらも、ＩＬ－１２ｐ４０サブユニットを含有している（Szabo et al., Annu. Rev. Immunol. 21, 713-758 (2003)）は、ΔｍｉＲ ＥＢＶに感染させた細胞と比較して、ｗｔ／Ｂ９５－８ＥＢＶに感染させた細胞において有意に減少していた（図２Ａ）。
【0113】
実施例３
ＥＢＶのｍｉＲＮＡは、ＩＬ－１２ｐ４０をコードする、サイトカインによりコードされるＩＬ１２Ｂを直接調節することが判明した。所見は、ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて確認された。ＥＢＶのｍｉＲ－ＢＨＲＦ１－２、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ１、又はｍｉＲ－ＢＡＲＴ２は、ＩＬ１２Ｂレポーターのルシフェラーゼ活性を抑制した（図２Ｂ）。ｍｉＲ－ＢＡＲＴ１又はｍｉＲ－ＢＡＲＴ２の予測される結合部位を突然変異させると、ＩＬ１２Ｂレポーターを阻害するそれらの能力は消失し（図２Ｂ及び図７）、このことにより、この遺伝子転写物に対するウイルスｍｉＲＮＡの直接的な制御が確認された。同じように、ＥＢＶの野外株には存在するがｗｔ／Ｂ９５－８ＥＢＶには存在しない、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ１０及びｍｉＲ－ＢＡＲＴ２２を分析した（図２Ｂ及び図７）。それらの予測される標的部位の突然変異は、両方のｍｉＲＮＡによる阻害をほんの部分的にしか軽減せず、このことは、ＩＬ１２Ｂ転写物にはこれらのｍｉＲＮＡの追加の結合部位が存在することを示唆する。要約すると、サイトカインはＥＢＶ ｍｉＲＮＡによって調節されることが確認され、複数のウイルスｍｉＲＮＡの直接的な標的としてのＩＬ１２Ｂが確証された。
ＥＢＶのｍｉＲＮＡは、ＩＬ－１２ｐ４０をコードする、サイトカインによりコードされるＩＬ１２Ｂを直接調節することが判明した。所見は、ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて確認された。ＥＢＶのｍｉＲ－ＢＨＲＦ１－２、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ１、又はｍｉＲ－ＢＡＲＴ２は、ＩＬ１２Ｂレポーターのルシフェラーゼ活性を抑制した（図２Ｂ）。ｍｉＲ－ＢＡＲＴ１又はｍｉＲ－ＢＡＲＴ２の予測される結合部位を突然変異させると、ＩＬ１２Ｂレポーターを阻害するそれらの能力は消失し（図２Ｂ及び図７）、このことにより、この遺伝子転写物に対するウイルスｍｉＲＮＡの直接的な制御が確認された。同じように、ＥＢＶの野外株には存在するがｗｔ／Ｂ９５－８ＥＢＶには存在しない、ｍｉＲ－ＢＡＲＴ１０及びｍｉＲ－ＢＡＲＴ２２を分析した（図２Ｂ及び図７）。それらの予測される標的部位の突然変異は、両方のｍｉＲＮＡによる阻害をほんの部分的にしか軽減せず、このことは、ＩＬ１２Ｂ転写物にはこれらのｍｉＲＮＡの追加の結合部位が存在することを示唆する。要約すると、サイトカインはＥＢＶ ｍｉＲＮＡによって調節されることが確認され、複数のウイルスｍｉＲＮＡの直接的な標的としてのＩＬ１２Ｂが確証された。
【0114】
実施例４
さらに、ＴＡＰ１及びＴＡＰ２を含む（その転写物のレベルはΔｍｉＲ ＥＢＶに感染させた細胞と比較してｗｔ／Ｂ９５－８に感染させた細胞において減少していた）、抗原の処理及び提示に重要なタンパク質のレベルを定量した（図１Ｂ）。ＴＡＰ１及びＴＡＰ２の両方が、ＥＢＶのｍｉＲＮＡによって減少した（図２Ｃ）。それらはヘテロ二量体を形成し、これは小胞体内腔への抗原性ペプチドの細胞質内輸送を媒介し、小胞体内腔においてそれらは、それらを安定化させるＭＨＣクラスＩ分子上に積載される（Horst et al., J. Immunol.182, 2313-2324 (2009)）。ＭＨＣクラスＩ分子及びＭＨＣクラスＩＩ分子の３つ全てのサブクラス（ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ及びＨＬＡ－ＤＰ）が、感染から１５日目までに共刺激分子及び接着分子と同様に減少した（図２のＤ及びＥ）。
さらに、ＴＡＰ１及びＴＡＰ２を含む（その転写物のレベルはΔｍｉＲ ＥＢＶに感染させた細胞と比較してｗｔ／Ｂ９５－８に感染させた細胞において減少していた）、抗原の処理及び提示に重要なタンパク質のレベルを定量した（図１Ｂ）。ＴＡＰ１及びＴＡＰ２の両方が、ＥＢＶのｍｉＲＮＡによって減少した（図２Ｃ）。それらはヘテロ二量体を形成し、これは小胞体内腔への抗原性ペプチドの細胞質内輸送を媒介し、小胞体内腔においてそれらは、それらを安定化させるＭＨＣクラスＩ分子上に積載される（Horst et al., J. Immunol.182, 2313-2324 (2009)）。ＭＨＣクラスＩ分子及びＭＨＣクラスＩＩ分子の３つ全てのサブクラス（ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ及びＨＬＡ－ＤＰ）が、感染から１５日目までに共刺激分子及び接着分子と同様に減少した（図２のＤ及びＥ）。
【0115】
実施例５
ＲＩＳＣ－ＩＰ及びコンピューターシミュレーションでのアルゴリズムは、ＴＡＰ２の３’－ＵＴＲがＥＢＶ ｍｉＲＮＡによって標的化されることを示した。ルシフェラーゼレポーターアッセイでは、ｍｉＲ－ＢＨＲＦ１～３がＴＡＰ２レポーターを抑制した（図２Ｂ）。標的モチーフの突然変異は、ルシフェラーゼの抑制を消失させ、このことは、ＴＡＰ２がｍｉＲ－ＢＨＲＦ１～３の直接的な標的であることを示す（図２Ｂ及び図７）。同様に、ＥＢＶの野外株によってコードされているｍｉＲ－ＢＡＲＴ１７も、ＴＡＰ２転写物の３’－ＵＴＲを直接標的化した（図２Ｂ及び図７）。それ故、ＥＢＶ ｍｉＲＮＡは、感染後早期に、ペプチド抗原の処理、輸送及び提示において中心的な機能を有する遺伝子をダウンレギュレートする。
ＲＩＳＣ－ＩＰ及びコンピューターシミュレーションでのアルゴリズムは、ＴＡＰ２の３’－ＵＴＲがＥＢＶ ｍｉＲＮＡによって標的化されることを示した。ルシフェラーゼレポーターアッセイでは、ｍｉＲ－ＢＨＲＦ１～３がＴＡＰ２レポーターを抑制した（図２Ｂ）。標的モチーフの突然変異は、ルシフェラーゼの抑制を消失させ、このことは、ＴＡＰ２がｍｉＲ－ＢＨＲＦ１～３の直接的な標的であることを示す（図２Ｂ及び図７）。同様に、ＥＢＶの野外株によってコードされているｍｉＲ－ＢＡＲＴ１７も、ＴＡＰ２転写物の３’－ＵＴＲを直接標的化した（図２Ｂ及び図７）。それ故、ＥＢＶ ｍｉＲＮＡは、感染後早期に、ペプチド抗原の処理、輸送及び提示において中心的な機能を有する遺伝子をダウンレギュレートする。
【0116】
実施例６
ウイルスｍｉＲＮＡは、感染後早期に、ＩＬ－１２の分泌を阻害する（図１Ｂ及び２Ａ）。この阻害は、ＩＬ－１２が重要であるプロセスである、１型ヘルパーＴ（Ｔｈ１）細胞の分化を遮断した（Szabo、同上）。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＥＢＶに感染させた自己Ｂ細胞と共培養した（図３Ａ）。ｗｔ／Ｂ９５－８ ＥＢＶに感染させたＢ細胞は、ΔｍｉＲ ＥＢＶに感染させた細胞と比較してＴｈ１の分化を抑制した（図３Ｂ）。ＩＬ１Ｂの機能を中和する抗体は、細胞をΔｍｉＲ ＥＢＶに感染させた細胞と共培養した場合に、Ｔｈ１の分化を抑制したが、アイソタイプ対照抗体は抑制せず（図３Ｃ）、このことは、ＥＢＶに感染させたＢ細胞又は活性化されたＢ細胞から分泌されたＩＬ－１２それ自体が、Ｔｈ１細胞の生成を駆動することを示す。したがって、ＥＢＶ ｍｉＲＮＡは、感染した細胞からのＩＬ－１２の遊離を抑制し、これは、ウイルス特異的Ｔｈ１細胞による抗ウイルス制御を消失させ得る機能である。
ウイルスｍｉＲＮＡは、感染後早期に、ＩＬ－１２の分泌を阻害する（図１Ｂ及び２Ａ）。この阻害は、ＩＬ－１２が重要であるプロセスである、１型ヘルパーＴ（Ｔｈ１）細胞の分化を遮断した（Szabo、同上）。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＥＢＶに感染させた自己Ｂ細胞と共培養した（図３Ａ）。ｗｔ／Ｂ９５－８ ＥＢＶに感染させたＢ細胞は、ΔｍｉＲ ＥＢＶに感染させた細胞と比較してＴｈ１の分化を抑制した（図３Ｂ）。ＩＬ１Ｂの機能を中和する抗体は、細胞をΔｍｉＲ ＥＢＶに感染させた細胞と共培養した場合に、Ｔｈ１の分化を抑制したが、アイソタイプ対照抗体は抑制せず（図３Ｃ）、このことは、ＥＢＶに感染させたＢ細胞又は活性化されたＢ細胞から分泌されたＩＬ－１２それ自体が、Ｔｈ１細胞の生成を駆動することを示す。したがって、ＥＢＶ ｍｉＲＮＡは、感染した細胞からのＩＬ－１２の遊離を抑制し、これは、ウイルス特異的Ｔｈ１細胞による抗ウイルス制御を消失させ得る機能である。
【0117】
実施例７
さらに、ＥＢＶ ｍｉＲＮＡによるＭＨＣクラスＩＩ分子、共刺激分子、及び接着分子の阻害（図１Ｂ及び２Ｄ、Ｅ）は、ＭＨＣクラスＩＩにより媒介されるＣＤ４＋Ｔ細胞による感染細胞の認識を損なう。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、放射線照射されたｗｔ／Ｂ９５－８ ＥＢＶに感染させた自己リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）を用いての反復刺激によってエクスビボで増幅させた。次いで、ＥＢＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を、５日間前に２つのＥＢＶ株に感染させたおいた自己Ｂ細胞と共培養した（図３Ｄ）。ＥＢＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの遊離は、標的としてΔｍｉＲ ＥＢＶに感染させた細胞と共培養した場合にはかなりあったが、ｗｔ／Ｂ９５－８ ＥＢＶに感染させたＢ細胞と共培養した場合には試験された全ての細胞比において一貫して減少していた（図８）。この効果は、自己の状況及びＨＬＡの一致した状況において観察されたが、ＨＬＡの一致していない状況では観察されず（図３Ｅ及び図１２）、このことは、観察されたＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化は、ＨＬＡクラスＩＩ拘束性であったことを示す。ＥＢＶ抗原特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞クローンを、ＥＢＶの糖タンパク質ｇｐ３５０由来のエピトープであるＦＧＱに対して試験し（Adhikary, J. Exp. Med. 203, 995-1006 (2006)）、感染から５日後にΔｍｉＲ ＥＢＶと比較して、ｗｔ／Ｂ９５－８ ＥＢＶに感染させた標的Ｂ細胞を用いて減少したＴ細胞活性が観察された（図９）。Ｂ細胞に対するＴ細胞活性は、ウイルス抗原であるｇｐ３５０がもはや存在しなくなった、感染から１５日後には、殆ど検出されなかった。なぜなら、それはウイルス粒子の成分であり、Ｂ細胞に感染した直後に提示されるが（Adhikary、同上）、潜伏期には合成されないからである（Kalla et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 850-855 (2010）。
さらに、ＥＢＶ ｍｉＲＮＡによるＭＨＣクラスＩＩ分子、共刺激分子、及び接着分子の阻害（図１Ｂ及び２Ｄ、Ｅ）は、ＭＨＣクラスＩＩにより媒介されるＣＤ４＋Ｔ細胞による感染細胞の認識を損なう。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、放射線照射されたｗｔ／Ｂ９５－８ ＥＢＶに感染させた自己リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）を用いての反復刺激によってエクスビボで増幅させた。次いで、ＥＢＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を、５日間前に２つのＥＢＶ株に感染させたおいた自己Ｂ細胞と共培養した（図３Ｄ）。ＥＢＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの遊離は、標的としてΔｍｉＲ ＥＢＶに感染させた細胞と共培養した場合にはかなりあったが、ｗｔ／Ｂ９５－８ ＥＢＶに感染させたＢ細胞と共培養した場合には試験された全ての細胞比において一貫して減少していた（図８）。この効果は、自己の状況及びＨＬＡの一致した状況において観察されたが、ＨＬＡの一致していない状況では観察されず（図３Ｅ及び図１２）、このことは、観察されたＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化は、ＨＬＡクラスＩＩ拘束性であったことを示す。ＥＢＶ抗原特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞クローンを、ＥＢＶの糖タンパク質ｇｐ３５０由来のエピトープであるＦＧＱに対して試験し（Adhikary, J. Exp. Med. 203, 995-1006 (2006)）、感染から５日後にΔｍｉＲ ＥＢＶと比較して、ｗｔ／Ｂ９５－８ ＥＢＶに感染させた標的Ｂ細胞を用いて減少したＴ細胞活性が観察された（図９）。Ｂ細胞に対するＴ細胞活性は、ウイルス抗原であるｇｐ３５０がもはや存在しなくなった、感染から１５日後には、殆ど検出されなかった。なぜなら、それはウイルス粒子の成分であり、Ｂ細胞に感染した直後に提示されるが（Adhikary、同上）、潜伏期には合成されないからである（Kalla et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 850-855 (2010）。
【0118】
ＥＢＶ特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞は、細胞溶解活性を有する（Adhikary、同上）。同種のＨＬＡの一致した条件では、ＥＢＶ特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞は、ｗｔ／Ｂ９５－８ ＥＢＶに感染させた細胞よりも、ΔｍｉＲ ＥＢＶに感染させた標的Ｂ細胞の方がより強力な細胞溶解を一貫して示した（図３Ｆ）。ＥＢＶ ｍｉＲＮＡは、感染後早期に、ＨＬＡクラスＩＩ拘束性ＣＤ４＋Ｔ細胞による感染Ｂ細胞の認識を明らかに阻害した。
【0119】
また、ＥＢＶ ｍｉＲＮＡは、ＣＤ４＋Ｔ細胞に加えて、ＭＨＣクラスＩ拘束性ＥＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞による感染Ｂ細胞の認識も損なうことが判明した。これらの試験は、ＥＢＶに感染させたＢ細胞、及びポリクロ―ナルＥＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞並びに特定のＥＢＶ抗原に対して特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞クローンを用いての共培養アッセイを使用した。ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮ－γ分泌は、１５日間前に２つの異なるＥＢＶ株に感染させておいた一次Ｂ細胞と一晩培養して測定された（図４Ａ）。それらのＨＬＡ拘束性に従って（及び自己の状況及び一致した状況においてのみ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ΔｍｉＲ ＥＢＶ感染Ｂ細胞との共培養後にＩＦＮ－γを遊離したが、ｗｔ／Ｂ９５－８ ＥＢＶ感染Ｂ細胞と共培養した場合にはあまり遊離しなかった（図４Ｂ及び図１２）。同様に、ΔｍｉＲ ＥＢＶに感染させたＢ細胞は、ｍｉＲＮＡを発現しているｗｔ／Ｂ９５－８ ＥＢＶに感染させたＢ細胞と比較して、ＥＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞によって有意に死滅した（図４Ｃ）。最後に、ＨＬＡ－Ｂ＊４０によって提示されるウイルスタンパク質ＬＭＰ２のＩＥＤエピトープに対して特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞クローンのＩＦＮ－γ遊離（図１０）（Lautscham et al., J. Exp. Med.194, 1053-1068 (2001)）は、ΔｍｉＲ ＥＢＶ感染Ｂ細胞と比較して、ｗｔ／Ｂ９５－８ ＥＢＶ感染Ｂ細胞と共培養した場合に、強力かつ一貫して減少した（図４Ｄ）。ＨＬＡ－Ｂ＊４０の発現は、ＥＢＶ ｍｉＲＮＡによって影響されたが、ＬＭＰ２の発現は影響されなかった（図４Ｄ及び図１１）。これらの結果は、ＥＢＶ ｍｉＲＮＡが、抗原の処理及び提示を制御することにより、ＥＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞による感染Ｂ細胞の認識を防御することを示唆する。
【0120】
実施例８
ＥＢＶは結局のところ、殆どの人々の、増殖中ではないＢ細胞中に、宿主の免疫応答には殆ど見えない状態で存在する（Thorley-Lawson, J. Allergy Clin. Immunol. 116, 251-261 (2005)）。しかしながら、ＥＢＶは、それが最初に感染したＢ細胞の増殖を誘導し、それらの生存を育む。ＥＢＶは、新たに感染したＢ細胞において宿主の獲得免疫応答の複数の側面を調節するｍｉＲＮＡをコードしていることが判明した。ウイルスｍｉＲＮＡを欠失しているＥＢＶに感染したＢ細胞は、これらの応答の奏功、及びアポトーシスの阻害を含む他のｍｉＲＮＡ依存的機能のどちらも欠損している（Seto、同上）。これらの後者の異常は、後者の細胞の生存能異常のために、ヒト化マウスモデルにおけるｗｔ／Ｂ９５－８又はΔｍｉＲに新たに感染したＢ細胞の比較が妨げられている（C. Munz、私信）。培養液中の機能的アッセイは、ＥＢＶのｍｉＲＮＡが、サイトカインの分泌を阻害し、抗原の処理及び提示を阻害し、ＣＤ４＋Ｔ細胞の分化及びＣＤ４＋Ｔ細胞による感染Ｂ細胞の認識を阻害し、ＥＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞による感染Ｂ細胞の認識を阻害することを納得できるように示す。獲得免疫応答及び自然免疫応答を阻害するためのＥＢＶのそのｍｉＲＮＡの使用の幅広さ（Nachmani et al.. Cell Host Microbe. 5, 376-385 (2009)）は前例のないものであり、生涯続くＥＢＶ感染の効率的な確立を育むだろう。
ＥＢＶは結局のところ、殆どの人々の、増殖中ではないＢ細胞中に、宿主の免疫応答には殆ど見えない状態で存在する（Thorley-Lawson, J. Allergy Clin. Immunol. 116, 251-261 (2005)）。しかしながら、ＥＢＶは、それが最初に感染したＢ細胞の増殖を誘導し、それらの生存を育む。ＥＢＶは、新たに感染したＢ細胞において宿主の獲得免疫応答の複数の側面を調節するｍｉＲＮＡをコードしていることが判明した。ウイルスｍｉＲＮＡを欠失しているＥＢＶに感染したＢ細胞は、これらの応答の奏功、及びアポトーシスの阻害を含む他のｍｉＲＮＡ依存的機能のどちらも欠損している（Seto、同上）。これらの後者の異常は、後者の細胞の生存能異常のために、ヒト化マウスモデルにおけるｗｔ／Ｂ９５－８又はΔｍｉＲに新たに感染したＢ細胞の比較が妨げられている（C. Munz、私信）。培養液中の機能的アッセイは、ＥＢＶのｍｉＲＮＡが、サイトカインの分泌を阻害し、抗原の処理及び提示を阻害し、ＣＤ４＋Ｔ細胞の分化及びＣＤ４＋Ｔ細胞による感染Ｂ細胞の認識を阻害し、ＥＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞による感染Ｂ細胞の認識を阻害することを納得できるように示す。獲得免疫応答及び自然免疫応答を阻害するためのＥＢＶのそのｍｉＲＮＡの使用の幅広さ（Nachmani et al.. Cell Host Microbe. 5, 376-385 (2009)）は前例のないものであり、生涯続くＥＢＶ感染の効率的な確立を育むだろう。
【0121】
実施例９
ＶＬＰの生成は、Hettich et al.（Gene Therapy, 2006, vol. 13, pages 844-856）に記載されているように産生株細胞のトランスフェクションによって誘導された。上清を１．２μmのフィルターを通してろ過し、１００，０００×ｇで２時間の超遠心分離によって濃縮した。最後に、ペレットを１．５mLのＰＢＳ中に再懸濁した。
ＶＬＰの生成は、Hettich et al.（Gene Therapy, 2006, vol. 13, pages 844-856）に記載されているように産生株細胞のトランスフェクションによって誘導された。上清を１．２μmのフィルターを通してろ過し、１００，０００×ｇで２時間の超遠心分離によって濃縮した。最後に、ペレットを１．５mLのＰＢＳ中に再懸濁した。
【0122】
ヒトＥＢＶ不死化Ｂ細胞株（ＬＣＬ）を９６ウェルプレートに蒔き（５×１０４個の細胞／ウェル）、ｍｉＲＮＡを有するか又は全てのｍｉＲＮＡを欠失している（ΔｍｉＲＮＡ）ＶＬＰ（１×１０４個の粒子／細胞）と共に総容量２００μL/ウェル中でインキュベートした。２４時間インキュベートした後、１００μlの培養培地を取り出し、補助物質を含まないＲＰＭＩ １００μlを添加し、３００×ｇで５分間遠心分離にかけることによって細胞を洗浄した。再度、培地 １００μlを取り出し、ＬＣＬを、ＥＢＶ外被タンパク質ＢＮＲＦ１に特異的なＨＬＡの一致したＣＤ４＋Ｔ細胞クローン（５×１０４個の細胞を含有している細胞培養培地 １００μl）と混合し（ＬＣＬ：Ｔ細胞の比＝１：１）、次いで、さらに２４時間共培養した。Ｔ細胞の活性化を、製造業者のプロトコール（ヒトＩＦＮ－γ－ＥＬＩＳＡ展開キット（ＡＬＰ）、マブテック社）に従ってＩＦＮγ－ＥＬＩＳＡアッセイで定量した。アッセイを、５つの技術的レプリケートを用いて実施した。アッセイの結果を図１３に示す。
【0123】
特記しない限り、明細書及び特許請求の範囲において使用されている、成分の量、分子量などの特性、反応条件などを表現している全ての数字は、全ての場合において、「約」という用語によって修飾されていると理解されるべきである。本明細書において使用する「約」及び「およそ」という用語は、１０～１５％以内、好ましくは５～１０％以内を意味する。したがって、そうではないと特記されない限り、明細書及び添付の特許請求の範囲において示されている数値パラメーターは、本発明によって得られることが求められる所望の特性に応じて変更され得る近似である。少なくとも、特許請求の範囲の均等物の教義の適用を制限する試みとしてではなく、各々の数値パラメーターは、報告された有効数字の数字を鑑み、通常の丸めの技法を適用することによって少なくとも捉えられるべきである。本発明の幅広い範囲を示す数値範囲及び数値パラメーターは近似であるにも関わらず、具体例に示される数値は、できるだけ正確に報告されている。しかしながら、あらゆる数値は本来、それらのそれぞれの試験測定値に見られる標準偏差から生じた特定の誤差を必然的に含有している。
【0124】
本発明を記載する脈絡において（特に以下の特許請求の範囲の脈絡において）使用される「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」という用語及び類似の言及は、本明細書において特記されない限り又は文脈により明らかに矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方を網羅すると捉えられる。本明細書における数値の範囲の列挙は単に、範囲内に該当する各々の別々の数値を個々に言及する端的な方法としての役目を果たすことを意図する。本明細書において特記しない限り、各々の個々の数値は、それが個々に本明細書に列挙されているかのように明細書に組み入れられる。本明細書に記載の全ての方法は、本明細書において特記されない限り又は文脈により明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順番で実施され得る。本明細書において提供されたいずれかの及び全ての実施例、又は例えの言葉（例えば、「などの」）の使用は単に、本発明をより良く明らかにするためのものであり、別様に特許請求された本発明の範囲に対して制限を課すものではない。明細書中のどの言葉も、本発明の実施に不可欠であるいずれかの特許請求されていない要素を示すものと捉えるべきではない。
【0125】
本明細書に開示された本発明の代替的な要素又は実施態様のグループ分けは、制限と捉えられるべきではない。各々のグループメンバーは、個々に又は本明細書に見られる他のグループのメンバー又は他の要素と任意に組み合わせて言及及び特許請求され得る。グループの１つ以上のメンバーが、簡便性及び／又は特許性の理由から、グループに含まれ得るか又はグループから削除され得ることが予想される。いずれかのこのような包含又は削除が起こる場合には、明細書は、添付の特許請求の範囲に使用される全てのＭａｒｋｕｓｈグループの書面による明細書を履行するように改変されたグループも含有するとみなされる。
【0126】
本発明を実施するための本発明者らには公知の最善の形式を含む、本発明の特定の実施態様が本明細書に記載されている。勿論、これらの記載された実施態様に対する変更は、前記の明細書を読めば、当業者には明らかとなるだろう。本発明者らは、当業者が適宜、このような変更を使用することを期待し、本発明者らは、本明細書に明記されたのとは違う方法で本発明が実施されることを意図する。したがって、本発明は、適用法令によって許容されるようなこの文書に添付された特許請求の範囲に列挙された主題の全ての改変物及び均等物を含む。さらに、全ての可能なその変更における上記の要素の任意の組合せが、本明細書において特記されない限り又は文脈により明らかに矛盾しない限り、本発明によって包含される。
【0127】
本明細書に開示された具体的な実施態様は、言語からなる又は実質的に言語からなるを使用して特許請求の範囲においてさらに限定され得る。特許請求の範囲において使用される場合、出願されたままのものであれ、又は補正として付け加えられたものであれ、「からなる」という接続句は、特許請求の範囲において明記されていない全ての要素、工程、又は成分を排除する。「実質的にからなる」という接続句は、特許請求の範囲を、明記された材料又は工程、並びに実質的に基本的及び新規な特徴（群）に影響を及ぼさないものに限定する。このように特許請求された本発明の実施態様は、本明細書に固有に又ははっきりと記載されかつ可能となる。
【0128】
さらに、本明細書全体を通して、特許及び刊行物に数多くの言及がなされている。上記に引用された参考文献及び刊行物は各々、その全体が参照により本明細書に個々に組み入れられる。
【0129】
締めくくりに、本明細書に開示された本発明の実施態様は、本発明の原理の例示であることを理解されたい。使用され得る他の改変も、本発明の範囲内である。したがって、例えばであって限定されるものではないが、本発明の代替的な構成が、本明細書の教義に従って利用され得る。したがって、本発明は、示されかつ記載されているようなものに厳密に限定されない。
【図1-1】
【図1-2】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図2-4】
【図3-1】
【図3-2】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】