(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-07-08
(45)【発行日】2024-07-17
(54)【発明の名称】生体原料の抽出残渣の製造方法
(51)【国際特許分類】
B01D 11/02 20060101AFI20240709BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20240709BHJP
【ＦＩ】
B01D11/02 A
C12N5/071
【請求項の数】
5
(21)【出願番号】P 2023004825
(22)【出願日】2023-01-17
(62)【分割の表示】P 2018155506の分割
【原出願日】2018-08-22
(65)【公開番号】P2023041718
(43)【公開日】2023-03-24
【審査請求日】2023-01-17
(31)【優先権主張番号】P 2018050256
(32)【優先日】2018-03-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】592042750
【氏名又は名称】株式会社アルビオン
(74)【代理人】
【識別番号】100116850
【弁理士】
【氏名又は名称】廣瀬 隆行
(74)【代理人】
【識別番号】100165847
【弁理士】
【氏名又は名称】関 大祐
(72)【発明者】
【氏名】鳥井 昭吾
(72)【発明者】
【氏名】篠原 悟史
(72)【発明者】
【氏名】鈴木 章悟
【審査官】河野 隆一朗
(56)【参考文献】
【文献】特表２００９－５３８３６６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１０－２４０６０９（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２００６／０５８３８２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２００１－１０６６３６（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１６／０５３６７８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１５／１５２１４４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２００６－５１６４０４（ＪＰ，Ａ）
【文献】Solvent Extraction Research and Development，2017年，Vol.24，P.37-45
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｂ０１Ｄ １１／００ － １１／０４
Ｃ１１Ｂ １／００ － １／１６
Ｃ１１Ｂ ９／００ － ９／０２
Ａ２３Ｌ ５／００ － ５／４９
Ｃ１２Ｎ ５／００ － ５／２８
Ｇ０１Ｎ １／１０
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
生体原料の抽出残渣の製造方法において、前記生体原料は動物由来原料であり、
前記生体原料に液化ジメチルエーテルを接触させて当該生体原料中の成分を抽出し、当該成分を含む液化ジメチルエーテル溶液を得る抽出工程と、
前記抽出工程後、前記生体原料からジメチルエーテルを揮発または分離させることで抽出残渣を得る抽出残渣生成工程と、
核酸分解酵素を用いて前記抽出残渣に含まれる核酸成分を分解させる工程と、
前記抽出残渣から前記核酸成分を取り除く洗浄工程を含む
生体原料の抽出残渣の製造方法。
【請求項2】
前記液化ジメチルエーテルには、飽和量以下の補助溶媒が添加されている請求項１に記載の生体原料の抽出残渣の製造方法。
【請求項3】
前記補助溶媒は水またはアルコールである請求項２に記載の生体原料の抽出残渣の製造方法。
【請求項4】
前記補助溶媒は、前記ジメチルエーテルに対して７質量％以下である請求項２に記載の生体原料の抽出残渣の製造方法。
【請求項5】
前記液化ジメチルエーテルは、温度が１～４０℃である請求項１に記載の生体原料の抽出残渣の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生体原料の抽出残渣の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【0002】
従来、抽出溶媒として液化ジメチルエーテルを用いる抽出方法が特許文献１に提案されている。かかる特許文献１では、水分及び油分を含有する対象材料に対して飽和量の水分が溶存する液化ジメチルエーテルを接触させて液化ジメチルエーテルと油分との混合物、並びに脱油された対象材料を得ることが開示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
しかしながら、特許文献１に開示された抽出方法では、飽和量の水分が溶存する液化ジメチルエーテルを用いているので、次のような問題があった。すなわち、植物原料に対して飽和量の水分が溶存する液化ジメチルエーテルを接触させることとなり、該液化ジメチルエーテルに植物原料の水分や水溶性化合物が溶解されず、植物由来の水分や水溶性化合物を抽出することができなかった。
【0004】
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであって、植物に限らない生体由来の水分や水溶性化合物を良好に抽出することができる生体原料の抽出物及び抽出残渣の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0005】
上述した課題を解決して目的を達成するために、本発明は、生体原料の抽出物及び抽出残渣の製造方法において、前記生体原料に対し、液化ジメチルエーテルを用いて、前記生体原料中の成分を抽出し当該成分を含む液化ジメチルエーテル溶液を得る抽出工程と、前記溶液を前記生体原料から分離させる分離工程と、前記溶液から前記液化ジメチルエーテルを揮発または分離させる抽出物濃縮工程と、前記生体原料から前記ジメチルエーテルを揮発または分離させることで抽出残渣を得る抽出残渣生成工程と、を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【0006】
本発明によれば、抽出工程においては、生体原料に対して飽和量以下の補助溶媒を添加した液化ジメチルエーテルを接触させることで前記生体原料中の水分、水溶性化合物、脂溶性化合物といった成分が前記生体原料中から該液化ジメチルエーテルへ移行した混合液を得ることができる。分離工程においては、混合液を生体原料から分離させ、また抽出物濃縮工程においては、混合液から液化ジメチルエーテルを蒸発・分離させることで抽出物を得るため、生体由来の水分や水溶性化合物を良好に抽出することができる。抽出残渣生成工程においては、生体原料から液化ジメチルエーテルを蒸発・分離させることで抽出残渣を得るため、水分と抽出物が良好に除去された抽出残渣を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【発明を実施するための形態】
【0008】
以下に添付の図面を参照して、本発明に係る生体原料の抽出物及び抽出残渣の製造方法の好適な実施の形態について詳細に説明する。なお、生体原料とは細胞が細胞壁を有する植物、菌類、古細菌、真正細菌、もしくは細胞が細胞壁を有しない動物のいずれかを由来とする原料を意味する。このとき、植物由来原料の場合は、葉、枝、樹木、花弁、茎、根、果肉、果皮及び種子の少なくとも１つを由来とする原料であり、動物由来原料の場合は、ヒトまたは異種哺乳動物由来の皮膚、血管、心臓弁膜、角膜、羊膜、硬膜等を含む軟組織またはその一部、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脳等を含む臓器またはその一部、骨、軟骨、腱またはその一部等の少なくとも１つである動物由来原料である。
【0009】
図１は、本実施の形態である生体原料の抽出物及び抽出残渣の製造方法を実現するための抽出装置の一例を示す。なお、図１は、抽出装置を理解することができる程度に、構成要素の形状、大きさ及び配置を概略的に示すものに過ぎない。
【0010】
抽出装置１００は、飽和量以下の補助溶媒が添加された液化ジメチルエーテル（以下、単に液化ジメチルエーテルとも称する）２を貯蔵する貯槽１と、生体原料７を液化ジメチルエーテル２と接触させる抽出槽６と、抽出槽６から導出された液体を分離する分離槽１１と、貯槽１から抽出槽６へ液化ジメチルエーテル２を送液するポンプ３とを有している。
【0011】
上記貯槽１に貯蔵される液化ジメチルエーテル２は、ジメチルエーテルを飽和蒸気圧以上にすることにより、液体状態とされるものであるが、飽和量以下の水やアルコール等の補助溶媒が添加されたものであることが好ましい。ここで補助溶媒の添加量は、液化ジメチルエーテル中への飽和量以下が好ましく、より具体的には液化ジメチルエーテル２に対して７質量％以下であることが好ましい。補助溶媒を加えることにより、液化ジメチルエーテルの溶解度や極性といった溶媒特性を変化させることができる。
【0012】
また抽出装置１００は、液化ジメチルエーテル２を導出又は導入する導管５，１０，１２，１４，１６，１９，２０，２３、各槽内の気圧を調節し、液化ジメチルエーテル２の導出及び導入を制御するバルブ４，９，１３，１５，１８，２１，２２を有している。抽出槽６及び分離槽１１は、液化ジメチルエーテル２の液体状態を維持するため、温度については１～４０℃に調整することができ、圧力については０．２～５ＭＰａに調整することができる。
【0013】
上記抽出装置１００において、貯槽１から抽出槽６に液化ジメチルエーテル２を導入するポンプ３、バルブ４及び導管５が、送液手段として機能する。抽出槽６は、接触手段として機能する。抽出槽６から液化ジメチルエーテル２を導出させる導管１０及びバルブ９が、導出手段として機能する。また分離槽１１は、分離手段として機能する。導管１６に接続された凝縮器１７は、凝縮手段として機能する。分離槽１１に接続された導管１２及びバルブ１３は、気化手段として機能する。貯槽１は、貯蔵手段として機能する。導管１９，２０は、供給手段として機能する。
【0014】
抽出装置１００は、各槽内の温度及び気圧を検知する温度計及び圧力計、各槽内における撹拌を実施するための撹拌機、各槽内及び導管内における例えば酸素等の活性ガスをパージするための例えば窒素等の不活性ガスを流通させる装置等の任意の構成要素をさらに含むものである。
【0015】
図２は、本実施の形態である生体原料の抽出物及び抽出残渣の製造方法の一例を示すフローチャートである。
【0016】
生体原料の抽出物及び抽出残渣の製造方法は、図２に示すように、抽出工程（ステップＳ１０１）と、分離工程（ステップＳ１０２）と、抽出物濃縮工程（ステップＳ１０３）と、抽出残渣生成工程（ステップＳ１０４）とを含むものである。
【0017】
以下においては、上記抽出装置１００の動作を説明しながら生体原料から抽出される抽出物及び抽出残渣の製造方法の各工程を説明する。
【0018】
まず、フィルタ８が上流側及び下流側に設置されている抽出槽６に、生体原料を導入する。このとき、バルブ４，９，１３，１５，１８，２１，２２は、閉状態である。貯槽１に液化ジメチルエーテル２が十分に貯蔵されていない場合は、バルブ２１を開状態とし、導管２０を経由して、貯槽１に液化ジメチルエーテル２を供給した後、バルブ２１を閉状態とする。
【0019】
抽出工程（ステップＳ１０１）は、原料７に対し、飽和量以下の補助溶媒（水又はアルコール）を添加した液化ジメチルエーテル２を接触させ、原料７が含有する水、水溶性化合物、脂溶性化合物を該液化ジメチルエーテル２に移行させ、混合液を得るものである。なお、水とは原料が含有する水分のことを意味する。かかる抽出工程（ステップＳ１０１）は次のようにして行われる。
【0020】
抽出装置１００におけるバルブ４を開状態とし、ポンプ３により、貯槽１内から液化ジメチルエーテル２を導出し、導管５を経由して、原料７と接触するまで抽出槽６に導入した後、バルブ４を閉状態とすることにより行われる。
【0021】
その結果、原料由来成分として、主に植物原料においては、水、芳香族化合物、天然色素化合物、抗酸化化合物、抗菌化合物、及び抗ウイルス化合物といった水溶性化合物、脂溶性化合物が液化ジメチルエーテル２に移行した混合液が得られる。また、動物細胞においては、水や水溶性ビタミン、水溶性タンパク質、水溶性食物繊維といった水溶性化合物や、脂質、脂溶性ビタミンといった脂溶性化合物が液化ジメチルエーテルに移行した混合液が得られる。
【0022】
分離工程（ステップＳ１０２）は、混合液を原料７から分離させるものである。この分離工程（ステップＳ１０２）は次のようにして行われる。
【0023】
抽出装置１００におけるバルブ４，９を開状態とし、ポンプ３により、貯槽１から液化ジメチルエーテル２、導管５を経由して抽出槽６に導入すると、抽出槽６内の混合液は、導管１０を経由して分離槽１１に導入される。すなわち、貯槽１から抽出槽６に新たな液化ジメチルエーテルが導出されると、抽出槽６内の混合液は分離槽１１に押し出される。その結果、抽出槽６の内部には、新たな液化ジメチルエーテルに置換される。一方、抽出槽６内の原料７は、抽出槽６には上流側及び下流側にフィルタ８があることから抽出槽６内に残留する。すなわち、抽出槽６に新たな液化ジメチルエーテルが導入されることで、混合液は、抽出槽６から押し出され原料７から分離される。
【0024】
バルブ４，９を開状態とするタイミングは、抽出槽６に液化ジメチルエーテル２が導入されてから原料７が含有する水等を液化ジメチルエーテル２に移行させるために十分な所定時間が経過した後である。このとき、液化ジメチルエーテル２が原料７と接触した状態で所定時間静置してもよいし、撹拌してもよい。
【0025】
抽出物濃縮工程（ステップＳ１０３）では、混合液から液化ジメチルエーテルを蒸発・分離させることで抽出物を得る。また抽出残渣生成工程（ステップＳ１０４）では、原料７から液化ジメチルエーテルを蒸発・分離させることで抽出残渣を得る。これら抽出物濃縮工程（ステップＳ１０３）及び抽出残渣生成工程（ステップＳ１０４）は、次のようにして行われる。
【0026】
抽出装置１００においてバルブ４を閉状態、バルブ９，１３，２２を開状態とすると、バルブ４からバルブ１３までの経路内はジメチルエーテルの飽和蒸気圧未満の圧力になる。その結果、この経路における液化ジメチルエーテル２は気化し、導管１４を経由して、導管２３から排出される。このとき、必要に応じてポンプ３を用いてジメチルエーテルを排出してもよい。
【0027】
分離槽１１には混合液から液化ジメチルエーテル２が蒸発・分離することで抽出物を含む液化ジメチルエーテル溶液は濃縮され、その結果、抽出物が生成される。また、抽出槽６には原料７の抽出残渣が生成される。
【0028】
この液化ジメチルエーテル２の蒸発・分離操作はバルブ９を閉状態にしたまま行ってもよい。抽出槽６は液化ジメチルエーテル２と原料７が接触したままの状態で、バルブ９以降の経路のジメチルエーテルが排出される。その結果、分離槽１１には混合液から液化ジメチルエーテル２が蒸発・分離した抽出物が生成される。尚、上記原料の抽出物及び抽出残渣の製造方法においては、抽出物濃縮工程（ステップＳ１０３）及び抽出残渣生成工程（ステップＳ１０４）で分離させた液化ジメチルエーテルを凝縮させる工程を含むようにしてもよい。
【0029】
この場合には、抽出装置１００においてバルブ２２を閉状態としバルブ１５を開状態とすることにより、気化したジメチルエーテルが導管１６を経由して、凝縮器１７に導入される。その結果、導入されたジメチルエーテルは、凝集機１７にて凝縮され液化ジメチルエーテル２が生成する。また、バルブ１８を開状態とすることにより、生成された液化ジメチルエーテル２は、導管１９を経由して貯槽１に導入されるため、液化ジメチルエーテル２を再利用することができる。
【0030】
以上、貯槽１内の液化ジメチルエーテル２を不連続的に導出する場合に説明したが、次のようにして貯槽１内の液化ジメチルエーテル２を連続的に導出してもよい。
【0031】
バルブ４，９を開状態とすることで、貯槽１内の液化ジメチルエーテル２を、貯槽１から導管５を経由して抽出槽６に連続的に導入するとともに、導管１０を経由して抽出槽６内の混合液を分離槽１１へ連続的に導出してもよい。この場合、液化ジメチルエーテル２が原料７と連続的に接触するように、抽出槽６を構成することが好ましい。
【0032】
尚、抽出装置１００は装置内の圧力を変化させることでジメチルエーテルの気液の状態変化を行っていたが、圧力ではなく、温度変化により気液の状態変化をさせてもよい。
【0033】
抽出装置１００により、動物由来原料から生成された抽出残渣は、核酸を除去することによって再生医療材料として利用することができる。たとえば、抽出装置１００により、豚の皮膚を原料として用い、抽出した場合について説明する。まず豚の皮膚から生成された抽出残渣を液化ジメチルエーテルに接触させる。すると、細胞膜の主成分であるリン脂質は溶解される。その結果、生体組織の細胞は破壊され、細胞内に存在していた核酸は細胞外に露出された豚の皮膚が抽出残渣として生成される。この抽出残渣に対して核酸分解酵素を含む溶液を接触させることにより、細胞外に露出した核酸を分解する。その後、核酸を分解した抽出残渣を洗浄液と接触させることにより、残った核酸や分解生成物は完全に洗い流し、その結果、核酸が除去された抽出残渣を得ることができる。
【0034】
核酸分解酵素としては、ＤＮＡを分解させることが可能であれば、特に限定されないが、ＤＮａｓｅ（例えば、ＤＮａｓｅＩ）等が挙げられる。
【0035】
破壊された細胞と核酸分解酵素を含む溶液を接触させる方法としては、特に限定されないが、核酸分解酵素を含む溶液と細胞が破壊された抽出残渣を混合し、撹拌する方法、核酸分解酵素を含む溶液に細胞が破壊された抽出残渣を浸漬する方法、核酸分解酵素を含む溶液を細胞が破壊された抽出残渣に接触させる方法等が挙げられる。
【0036】
破壊された細胞と核酸分解酵素を含む溶液を接触させる方法は、細胞が破壊された抽出残渣の性状に応じて、適宜選択することができる。
【0037】
洗浄液としては、水、生理的に適合する液体、生理的に許容し得る有機溶媒の水溶液、液化ガスを含む液体等が挙げられる。
【0038】
生理的に適合する液体としては、特に限定されないが、生理食塩水、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）などが挙げられ、二種以上を併用してもよい。これらの中でも、生理食塩水が好ましい。
【0039】
生理的に許容し得る有機溶媒としては、特に限定されないが、生体への毒性が低いことからエタノール等が挙げられる。
【0040】
液化ガスを含む液体は、液化ジメチルエーテルを含む液体であってもよいし、異なる液化ガスを含む液体でもよい。
【0041】
核酸が分解された抽出残渣と洗浄液を接触させる方法としては、特に限定されないが、洗浄液と核酸成分が分解した抽出残渣とを混合し、撹拌する方法、洗浄液に核酸が分解された抽出残渣を浸漬する方法、洗浄液核酸成分が分解された抽出残渣に接触させる方法等が挙げられる。
【0042】
核酸が分解された抽出残渣を洗浄液と接触させる方法は、核酸が分解された抽出残渣の性状に応じて、適宜選択することができる。
【0043】
核酸が分解された抽出残渣を洗浄液で洗浄する温度は、４℃と４０℃との間であることが好ましい。これは４℃より低い温度では水分の凍結により抽出残渣である細胞組織が損傷を受ける可能性があること、４０℃より高い温度では抽出残渣である細胞組織のたんぱく質の変性が生じて損傷を受ける可能性がある可能性があるためである。
【0044】
なお、核酸が分解された抽出残渣を、液化ガスを含む液体により洗浄する場合は、液化ガスの液体状態を維持するため、気密状態の抽出槽内等の飽和蒸気圧以上の環境下で実施されることが望ましい。
【0045】
核酸が分解された抽出残渣を洗浄液により洗浄する時間は、核酸分解酵素、核酸、核酸分解生成物を十分に除去することが可能であれば、特に限定されない。
【0046】
なお、核酸が分解された抽出残渣を洗浄液により洗浄する際に、洗浄液を交換して繰り返し洗浄してもよい。繰り返し洗浄を行うことで、洗浄効率を高めることができる。
【0047】
以上の工程により、動物由来原料の抽出残渣として、実質的に損傷がなく、乾燥質量あたりのＤＮＡ量が５０ｎｇ／ｍｇ未満である脱細胞化組織が得られる。脱細胞化組織の乾燥質量あたりのＤＮＡ量が５０ｎｇ／ｍｇ未満であると、生体内に移植した際の免疫反応を避けることができる（非特許文献１：Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３２（２０１１）３２３３－３２４３）。
【実施例】
【0048】
以下において、実施例を参照して本発明をより具体的に説明するが、本発明は、実施例に限定されない。
【0049】
＜細胞壁を有する原料から生成される抽出物及び抽出残渣＞
［実施例１］
図３に示す抽出装置を用いて、植物原料の抽出物及び抽出残渣の製造方法を実施し、抽出物及び抽出残渣を生成した。なお、植物原料としてちしゃとう（水分含有率１０質量％）を用いた。ちしゃとうは緑色野菜である。
［実施例１］
図３に示す抽出装置を用いて、植物原料の抽出物及び抽出残渣の製造方法を実施し、抽出物及び抽出残渣を生成した。なお、植物原料としてちしゃとう（水分含有率１０質量％）を用いた。ちしゃとうは緑色野菜である。
【0050】
具体的には、フィルタ５５，５８が上流側及び下流側に設置されている内容積１０ｍＬの抽出槽５６に、ちしゃとう５７を３．０ｇ載置した。続いて、バルブ５２を開状態及びバルブ５３を閉状態にし、シリンジポンプ５０に補助溶媒を添加したジメチルエーテル５１を充填して、２５℃、０．７ＭＰａとして液化させた。分離槽６２を予めジメチルエーテルで置換し、バルブ５２，５３，５４，５９，６０，６１を閉状態とした。なお、補助溶媒として水を用い、補助溶媒の添加量は、液化ジメチルエーテルに対して５質量％であった。
【0051】
次に、バルブ５３，５４，５９，６０を開状態とし、シリンジポンプ５０で液化ジメチルエーテルを供給した。液化ジメチルエーテルで抽出槽５６が満たされたところで、シリンジポンプ５０を停止させ、バルブ５４，５９を閉状態とすることで、ちしゃとう５７を液化ジメチルエーテルに浸漬させて混合液とした。
【0052】
そして、バルブ５４，５９を開状態とし、シリンジポンプ５０で液化ジメチルエーテルを再度供給し、流量を１．０ｍＬ／ｍｉｎ（滞留時間１０分）に調整して、混合液を分離槽６２で６０ｍＬ回収した。その後、バルブ６０を閉状態とし、分離槽６２を装置から取り外し、所定のドラフト内で大気圧として、液化ジメチルエーテルを揮発させて、抽出物を生成した。
【0053】
上述した操作を２回繰り返すことにより、飽和量以下の水が５質量％添加した液化ジメチルエーテル１２０ｍＬとちしゃとう５７とを接触させ、抽出を行った。その後、バルブ５４を閉状態とし、バルブ５９，６０，６１を開状態とし、抽出槽５６内の圧力を大気圧とし、抽出槽５６内の液化ジメチルエーテルを排気した。その後、抽出後のちしゃとう５７を抽出残渣として生成した。
【0054】
液化ジメチルエーテルを完全に揮発させることで得られた抽出物の質量測定を行うと０．１２３ｇであった。これを用いて下記式（１）により抽出率を計算した。その結果、ちしゃとう５７から得られた抽出物の抽出率は、４．１質量％であった。抽出物の色は緑色であり、原料のちしゃとうの緑色の色素であるクロロフィルが含まれていることが吸光光度法によって確認できた。
【0055】
式（１）
抽出率［質量％］＝（抽出物の質量／抽出槽に導入した原料の質量）×１００
抽出率［質量％］＝（抽出物の質量／抽出槽に導入した原料の質量）×１００
【0056】
また得られた抽出残渣について、植物由来原料であるちしゃとうの抽出前の外観を維持しており、抽出操作における損傷や変色は生じていなかった。さらに抽出残渣は、水分含有率が約５質量％であった。
【0057】
［実施例２］
実施例１と同じ構成で、飽和量以下である５質量％の水を添加した液化ジメチルエーテルの代わりに、補助溶媒が添加されていない液化ジメチルエーテルを用いて、ちしゃとう３．０ｇから抽出物及び抽出残渣を生成した。抽出物が０．０６０ｇ得られ、その抽出率は、上記式（１）を用いた結果、２．０質量％であった。抽出物の色は緑色であり、原料のちしゃとうの緑色の色素であるクロロフィルが含まれていることが吸光光度法によって確認できた。また得られた抽出残渣について、植物由来原料であるちしゃとうの抽出前の外観を維持しており、抽出操作における損傷や変色は生じていなかった。さらに抽出残渣は、水分含有率が約２質量％であった。
実施例１と同じ構成で、飽和量以下である５質量％の水を添加した液化ジメチルエーテルの代わりに、補助溶媒が添加されていない液化ジメチルエーテルを用いて、ちしゃとう３．０ｇから抽出物及び抽出残渣を生成した。抽出物が０．０６０ｇ得られ、その抽出率は、上記式（１）を用いた結果、２．０質量％であった。抽出物の色は緑色であり、原料のちしゃとうの緑色の色素であるクロロフィルが含まれていることが吸光光度法によって確認できた。また得られた抽出残渣について、植物由来原料であるちしゃとうの抽出前の外観を維持しており、抽出操作における損傷や変色は生じていなかった。さらに抽出残渣は、水分含有率が約２質量％であった。
【0058】
［比較例１］
植物由来原料としてちしゃとうを用い、ヘキサンを抽出溶媒とし、２５℃、０．１MPa、８時間で抽出物及び抽出残渣を生成した。なお２５℃とは室温であることを表し、０．１MPaとは常圧のことである。具体的には、三角フラスコにちしゃとう３．０ｇとヘキサン１２０ｍLを入れ、室温常圧下で8時間攪拌し、抽出物とヘキサンの混合液を得た。その後、ろ過によって混合液とちしゃとうを分離し、混合液をエバポレーターを用いて３０℃で減圧蒸留を行い、ヘキサンを揮発させ、抽出物を生成した。また抽出後のちしゃとうから完全にヘキサンを揮発させるために、真空乾燥器を用いて３０℃で真空乾燥し、抽出残渣を生成した。ちしゃとうから得られた抽出物の重量は０．０４ｇであり、抽出率は１．３質量％であった。抽出物の色は実施例２と同じく緑色であり、クロロフィルが含まれていた。また得られた抽出残渣について、植物由来原料であるちしゃとうの抽出前の外観に比べて、撹拌による組織の損傷が確認されたが、変色は見られなかった。また抽出残渣は、水分含有率が約１質量％であった。これはヘキサンを揮発させるために真空乾燥した際に、水も揮発されたためである。
植物由来原料としてちしゃとうを用い、ヘキサンを抽出溶媒とし、２５℃、０．１MPa、８時間で抽出物及び抽出残渣を生成した。なお２５℃とは室温であることを表し、０．１MPaとは常圧のことである。具体的には、三角フラスコにちしゃとう３．０ｇとヘキサン１２０ｍLを入れ、室温常圧下で8時間攪拌し、抽出物とヘキサンの混合液を得た。その後、ろ過によって混合液とちしゃとうを分離し、混合液をエバポレーターを用いて３０℃で減圧蒸留を行い、ヘキサンを揮発させ、抽出物を生成した。また抽出後のちしゃとうから完全にヘキサンを揮発させるために、真空乾燥器を用いて３０℃で真空乾燥し、抽出残渣を生成した。ちしゃとうから得られた抽出物の重量は０．０４ｇであり、抽出率は１．３質量％であった。抽出物の色は実施例２と同じく緑色であり、クロロフィルが含まれていた。また得られた抽出残渣について、植物由来原料であるちしゃとうの抽出前の外観に比べて、撹拌による組織の損傷が確認されたが、変色は見られなかった。また抽出残渣は、水分含有率が約１質量％であった。これはヘキサンを揮発させるために真空乾燥した際に、水も揮発されたためである。
【0059】
［比較例２］
植物原料としてちしゃとうを用い、９０℃に加熱したヘキサンを抽出溶媒とし、９０℃、０．１MPa、８時間で抽出物及び抽出残渣を生成した。なお０．１MPaとは常圧のことである。具体的には、丸フラスコにちしゃとう３．０ｇとヘキサン１２０ｍLを入れ、オイルバスでヘキサンを９０℃に加熱した。揮発するヘキサンを還流しながら、常圧下で8時間抽出し、抽出物とヘキサンの混合液を得た。その後、ろ過によって混合液とちしゃとうを分離し、混合液はエバポレーターを用いて３０℃で減圧蒸留を行い、ヘキサンを揮発させて抽出物を生成した。抽出後のちしゃとうは真空乾燥器を用いて３０℃で真空乾燥し、ヘキサンを完全に揮発させることで抽出残渣を得た。ちしゃとうから得られた抽出物の重量は０．０８ｇであり、抽出率は２．７質量％であった。抽出液の色は茶色であり、クロロフィルが比較例１よりも減少していた。これはクロロフィルが抽出時の熱によって変化したためと考えられる。また得られた抽出残渣について、植物由来原料であるちしゃとうの抽出前の外観に比べて、緑色から茶色に変色していた。これはクロロフィルが熱分解によって変化したためと考えられる。水分含有率については約１質量％であった。これはヘキサンを揮発させるために真空乾燥した際に、水も揮発されたためである。
植物原料としてちしゃとうを用い、９０℃に加熱したヘキサンを抽出溶媒とし、９０℃、０．１MPa、８時間で抽出物及び抽出残渣を生成した。なお０．１MPaとは常圧のことである。具体的には、丸フラスコにちしゃとう３．０ｇとヘキサン１２０ｍLを入れ、オイルバスでヘキサンを９０℃に加熱した。揮発するヘキサンを還流しながら、常圧下で8時間抽出し、抽出物とヘキサンの混合液を得た。その後、ろ過によって混合液とちしゃとうを分離し、混合液はエバポレーターを用いて３０℃で減圧蒸留を行い、ヘキサンを揮発させて抽出物を生成した。抽出後のちしゃとうは真空乾燥器を用いて３０℃で真空乾燥し、ヘキサンを完全に揮発させることで抽出残渣を得た。ちしゃとうから得られた抽出物の重量は０．０８ｇであり、抽出率は２．７質量％であった。抽出液の色は茶色であり、クロロフィルが比較例１よりも減少していた。これはクロロフィルが抽出時の熱によって変化したためと考えられる。また得られた抽出残渣について、植物由来原料であるちしゃとうの抽出前の外観に比べて、緑色から茶色に変色していた。これはクロロフィルが熱分解によって変化したためと考えられる。水分含有率については約１質量％であった。これはヘキサンを揮発させるために真空乾燥した際に、水も揮発されたためである。
【0060】
実施例１、実施例２及び比較例１、比較例２により生成した抽出物の抽出率と変色の有無を、抽出原料、抽出溶媒、抽出温度、抽出圧力とともに図４に示した。かかる図４により、実施例１と実施例２の抽出物は、変色がないことが理解される。
【0061】
本実施形態では、細胞壁を有する原料として、植物を由来とする原料である場合について説明したが、植物の他にも植物同様に細胞壁を有するきのこやかびなどといった菌類や古細菌、真正細菌由来の原料も用いることができる。
【0062】
＜細胞壁を有しない原料から生成される抽出物及び抽出残渣＞
［実施例３］
ちしゃとう５７の代わりにブタ大動脈を用いる点以外は実施例１と同様の条件で抽出物及び抽出残渣の生成を行った。具体的には、まず、抽出槽５６に、動物由来原料としてブタ大動脈５７（水分含有率７０重量％）を３．０ｇ載置した。続いて、バルブ５２を閉状態及びバルブ５３を開状態にし、シリンジポンプ５０に補助溶媒を添加したジメチルエーテル５１を充填して、２５℃、０．７ＭＰａとして液化させた。分離槽６２を予めジメチルエーテルで置換し、バルブ５２，５３，５４，５９，６０，６１を閉状態とした。なお、補助溶媒として水を用い、補助溶媒の添加量は、液化ジメチルエーテルに対して５質量％であった。
［実施例３］
ちしゃとう５７の代わりにブタ大動脈を用いる点以外は実施例１と同様の条件で抽出物及び抽出残渣の生成を行った。具体的には、まず、抽出槽５６に、動物由来原料としてブタ大動脈５７（水分含有率７０重量％）を３．０ｇ載置した。続いて、バルブ５２を閉状態及びバルブ５３を開状態にし、シリンジポンプ５０に補助溶媒を添加したジメチルエーテル５１を充填して、２５℃、０．７ＭＰａとして液化させた。分離槽６２を予めジメチルエーテルで置換し、バルブ５２，５３，５４，５９，６０，６１を閉状態とした。なお、補助溶媒として水を用い、補助溶媒の添加量は、液化ジメチルエーテルに対して５質量％であった。
【0063】
次にバルブ５３，５４，５９，６０を開状態とし、シリンジポンプ５０で液化ジメチルエーテルを供給した。液化ジメチルエーテルで抽出槽５６が満たされたところで、シリンジポンプ５０を停止させ、バルブ５４，５９を閉状態とし、ブタ大動脈５７を液化ジメチルエーテルで浸漬させ、混合液とした。
【0064】
バルブ５４，５９を開状態とし、シリンジポンプ５０で液化ジメチルエーテルを再度供給し、流量を１．０ｍＬ／ｍｉｎ（滞留時間１０分）に調整し、混合液を分離槽６２で６０ｍＬ回収した。その後、バルブ６０を閉状態とし、分離槽６２を装置から取り外し、所定のドラフト内で大気圧として、液化ジメチルエーテルを揮発させて、抽出物を生成した。
【0065】
上述した操作を１０回繰り返すことにより、液化ジメチルエーテル６００ｍＬとブタ大動脈５７とを接触させ、抽出を行った。その後、バルブ５４を閉状態、バルブ５９，６０，６１を開状態とし、抽出槽５６内の圧力を大気圧とすることで、抽出槽５６内の液化ジメチルエーテルを排気した。その後、抽出後のブタ大動脈５７を抽出残渣として生成した。
【0066】
得られた抽出物について、液化ジメチルエーテルを完全に揮発させた状態で質量測定を行った結果、ブタ大動脈５７から得られた抽出物の重量は０．０９０ｇであり、抽出率は３．０質量％であった。抽出物の色は透明であり、リン脂質が含まれていることがガスクロマトグラフによって確認できた。細胞膜の主成分であるリン脂質が検出されたことから細胞が破壊され、細胞外に核酸が露出していると考えられる。
【0067】
また得られた抽出残渣について、動物由来原料であるブタ大動脈の抽出前の外観を維持しており、抽出操作における変色は生じていなかった。さらに抽出残渣は、水分含有率が約５質量％であった。
【0068】
細胞が破壊された抽出残渣をＤＮａｓｅＩ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）０．２ｍｇ／ｍＬ、ＭｇＣｌ２（和光純薬工業社製）０．０５Ｍを含む生理食塩水に入れ、４℃の雰囲気で７日間振とうし、核酸を分解させた。
【0069】
次に、核酸が分解した抽出残渣を、エタノール８０体積％を含む生理食塩水に入れ、４℃の雰囲気で３日間振とうさせた後、生理食塩水に入れ、４℃の雰囲気で１日間振とうさせ、脱細胞化組織を得た。
【0070】
［評価］
脱細胞化組織の評価として、生成した脱細胞化組織に含まれる核酸の量を測定した。ＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｋｉｔｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、脱細胞化組織から核酸を抽出し、超微量分光光度計Ｎａｎｏ Ｄｒｏｐ ２０００ｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で測定した。
脱細胞化組織の評価として、生成した脱細胞化組織に含まれる核酸の量を測定した。ＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｋｉｔｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、脱細胞化組織から核酸を抽出し、超微量分光光度計Ｎａｎｏ Ｄｒｏｐ ２０００ｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で測定した。
【0071】
脱細胞化組織に含まれる乾燥重量当たりの核酸の量は２ｎg／ｍｇであり、非特許文献１に記載されている目標値５０ｎｇ／ｍｇ未満となっており、本発明により製造された抽出残渣から再生医療材料である脱細胞化組織を生成することができることがわかる。
【0072】
［実施例４］
実施例３と同じ構成で、飽和量以下である５質量％の水を添加した液化ジメチルエーテルの代わりに、補助溶媒が添加されていない液化ジメチルエーテルを用いて、ブタ大動脈３．０ｇから抽出物及び抽出残渣を生成した。抽出物が０．０８４ｇ得られ、その抽出率は２．８質量％であった。抽出物の色は透明であった。また得られた抽出残渣について、動物由来原料であるブタ大動脈の抽出前の外観を維持しており、抽出操作における変色は生じていなかった。さらに抽出残渣は、水分含有率が約２質量％であった。
実施例３と同じ構成で、飽和量以下である５質量％の水を添加した液化ジメチルエーテルの代わりに、補助溶媒が添加されていない液化ジメチルエーテルを用いて、ブタ大動脈３．０ｇから抽出物及び抽出残渣を生成した。抽出物が０．０８４ｇ得られ、その抽出率は２．８質量％であった。抽出物の色は透明であった。また得られた抽出残渣について、動物由来原料であるブタ大動脈の抽出前の外観を維持しており、抽出操作における変色は生じていなかった。さらに抽出残渣は、水分含有率が約２質量％であった。
【0073】
［比較例３］
動物由来原料としてブタ大動脈を用い、ヘキサンを抽出溶媒とし、２５℃、０．１MPa、８時間で抽出物及び抽出残渣を生成した。なお２５℃とは室温であることを表し、０．１MPaとは常圧のことである。具体的には、三角フラスコにブタ大動脈３．０ｇとヘキサン１２０ｍLを入れ、室温常圧下で8時間攪拌し、抽出物とヘキサンの混合液を得た。その後、混合液からブタ大動脈を取り出し、混合液をエバポレーターを用いて３０℃で減圧蒸留を行い、ヘキサンを揮発させ、抽出物を生成した。また抽出後のブタ大動脈から完全にヘキサンを揮発させるために、真空乾燥器を用いて３０℃で真空乾燥し、抽出残渣を生成した。ブタ大動脈から得られた抽出物の重量は０．０３ｇであり、抽出率は１．０質量％であった。抽出物の色は実施例３と同じく透明だった。また得られた抽出残渣について、動物由来原料であるブタ大動脈の抽出前の外観に比べて、変色は見られなかった。また抽出残渣は、水分含有率が約１質量％であった。これはヘキサンを揮発させるために真空乾燥した際に、水も揮発されたためである。
動物由来原料としてブタ大動脈を用い、ヘキサンを抽出溶媒とし、２５℃、０．１MPa、８時間で抽出物及び抽出残渣を生成した。なお２５℃とは室温であることを表し、０．１MPaとは常圧のことである。具体的には、三角フラスコにブタ大動脈３．０ｇとヘキサン１２０ｍLを入れ、室温常圧下で8時間攪拌し、抽出物とヘキサンの混合液を得た。その後、混合液からブタ大動脈を取り出し、混合液をエバポレーターを用いて３０℃で減圧蒸留を行い、ヘキサンを揮発させ、抽出物を生成した。また抽出後のブタ大動脈から完全にヘキサンを揮発させるために、真空乾燥器を用いて３０℃で真空乾燥し、抽出残渣を生成した。ブタ大動脈から得られた抽出物の重量は０．０３ｇであり、抽出率は１．０質量％であった。抽出物の色は実施例３と同じく透明だった。また得られた抽出残渣について、動物由来原料であるブタ大動脈の抽出前の外観に比べて、変色は見られなかった。また抽出残渣は、水分含有率が約１質量％であった。これはヘキサンを揮発させるために真空乾燥した際に、水も揮発されたためである。
【0074】
［比較例４］
動物由来原料としてブタ大動脈を用い、９０℃に加熱したヘキサンを抽出溶媒とし、９０℃、０．１MPa、８時間で抽出物及び抽出残渣を生成した。なお０．１MPaとは常圧のことである。具体的には、丸フラスコにブタ大動脈３．０ｇとヘキサン１２０ｍLを入れ、オイルバスでヘキサンを９０℃に加熱した。揮発するヘキサンを還流しながら、常圧下で8時間抽出し、抽出物とヘキサンの混合液を得た。その後、混合液からブタ大動脈を取り出し、混合液をエバポレーターを用いて３０℃で減圧蒸留を行い、ヘキサンを揮発させて抽出物を生成した。抽出後のブタ大動脈は真空乾燥器を用いて３０℃で真空乾燥し、ヘキサンを完全に揮発させることで抽出残渣を得た。ブタ大動脈から得られた抽出物の重量は０．０５ｇであり、抽出率は１．７質量％であった。抽出液の色は白色であり、また得られた抽出残渣について、動物由来原料であるブタ大動脈の抽出前の外観に比べて、白色から茶色に変色していた。これはたんぱく質が抽出時の熱によって熱変性したためと考えられる。水分含有率については約１質量％であった。これはヘキサンを揮発させるために真空乾燥した際に、水も揮発されたためである。
動物由来原料としてブタ大動脈を用い、９０℃に加熱したヘキサンを抽出溶媒とし、９０℃、０．１MPa、８時間で抽出物及び抽出残渣を生成した。なお０．１MPaとは常圧のことである。具体的には、丸フラスコにブタ大動脈３．０ｇとヘキサン１２０ｍLを入れ、オイルバスでヘキサンを９０℃に加熱した。揮発するヘキサンを還流しながら、常圧下で8時間抽出し、抽出物とヘキサンの混合液を得た。その後、混合液からブタ大動脈を取り出し、混合液をエバポレーターを用いて３０℃で減圧蒸留を行い、ヘキサンを揮発させて抽出物を生成した。抽出後のブタ大動脈は真空乾燥器を用いて３０℃で真空乾燥し、ヘキサンを完全に揮発させることで抽出残渣を得た。ブタ大動脈から得られた抽出物の重量は０．０５ｇであり、抽出率は１．７質量％であった。抽出液の色は白色であり、また得られた抽出残渣について、動物由来原料であるブタ大動脈の抽出前の外観に比べて、白色から茶色に変色していた。これはたんぱく質が抽出時の熱によって熱変性したためと考えられる。水分含有率については約１質量％であった。これはヘキサンを揮発させるために真空乾燥した際に、水も揮発されたためである。
【0075】
実施例３、実施例４及び比較例３、比較例４により生成した抽出物の抽出率と変色の有無を、抽出原料、抽出溶媒、抽出温度、抽出圧力とともに図５に示した。かかる図５により、実施例３の抽出物は、変色がないことが理解される。またヘキサンは人体に有害な溶媒であるため、ヘキサン抽出によって生成された抽出残渣を再生医療材料として用いることは不可能である。
【0076】
以上説明したように、上記生体原料の抽出物及び抽出残渣の製造方法によれば、抽出工程において、生体原料に対し、液化ジメチルエーテルを用いて、生体原料中の成分を抽出することで、当該成分を含む液化ジメチルエテール溶液を得ることができる。これにより、生体由来の水分や水溶性化合物を良好に抽出することができる。しかも、水分と抽出物が良好に除去された抽出残渣を得ることができる。
【符号の説明】
【0077】
１ 貯槽
２ 液化ジメチルエーテル
６ 抽出槽
１１ 分離槽
１００ 抽出装置
２ 液化ジメチルエーテル
６ 抽出槽
１１ 分離槽
１００ 抽出装置
【先行技術文献】
【特許文献】
【0078】
【文献】特開２０１０－２４０６０９号公報
【非特許文献】
【0079】
【文献】Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３２（２０１１）３２３３－３２４３
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
