特許 7518853 細胞集団のエネルギー代謝をプロファイリングする方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-07-09

(45)【発行日】2024-07-18

(54)【発明の名称】細胞集団のエネルギー代謝をプロファイリングする方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/06 20060101AFI20240710BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20240710BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/06

G01N33/50 K

【請求項の数】 22

(21)【出願番号】P 2021559444

(86)(22)【出願日】2020-04-14

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-06-16

(86)【国際出願番号】 EP2020060486

(87)【国際公開番号】W WO2020212362

(87)【国際公開日】2020-10-22

【審査請求日】2023-04-04

(31)【優先権主張番号】19305485.5

(32)【優先日】2019-04-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】513246469

【氏名又は名称】インサーム（インスティテュ ナシオナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシェ メディカル）

【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＥＲＭ（ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥＬＡ ＳＡＮＴＥ ＥＴ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＭＥＤＩＣＡＬＥ）

(73)【特許権者】

【識別番号】506316557

【氏名又は名称】サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィック

(73)【特許権者】

【識別番号】513210666

【氏名又は名称】ユニベルシテ デクス マルセイユ

【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ Ｄ‘ＡＩＸ－ＭＡＲＳＥＩＬＬＥ

(74)【代理人】

【識別番号】100121728

【弁理士】

【氏名又は名称】井関 勝守

(74)【代理人】

【識別番号】100165803

【弁理士】

【氏名又は名称】金子 修平

(74)【代理人】

【識別番号】100170900

【弁理士】

【氏名又は名称】大西 渉

(72)【発明者】

【氏名】アルグエリョ，ラファエル

(72)【発明者】

【氏名】ピエール，フィリップ

(72)【発明者】

【氏名】コンベ，アレクシ

【審査官】福間 信子

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１８－００８９１４（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許第０５９６２２４４（ＵＳ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１７／１５３９９２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１６／０２８１０４９（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｑ

Ｃ１２Ｎ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞集団のエネルギー代謝プロファイルをプロファイリングする方法であって、
ｉ）予め生体外に取り出されていた細胞集団又は生体外で培養されていた細胞集団から、前記細胞集団の４つのサンプル［Ｓ１］、［Ｓ２］、［Ｓ３］、及び［Ｓ４］を準備すること、
ｉｉ）任意の阻害剤の不在下において、前記サンプル［Ｓ１］のタンパク質合成レベル［ＬＣｏ］を測定すること、
ｉｉｉ）前記サンプル［Ｓ２］を、解糖及びグルコース由来ピルベートの酸化的リン酸化によるエネルギー産生の阻害剤［Ａ］に接触させ、該サンプルのタンパク質合成レベル［ＬＡ］を測定すること、
ｉｖ）前記サンプル［Ｓ３］を、ＴＣＡ回路、及びピルベート酸化を含む酸化的リン酸化、脂肪酸の酸化、及びアミノ酸の酸化によるエネルギー産生の阻害剤［Ｂ］に接触させ、該サンプルのタンパク質合成レベル［ＬＢ］を測定すること、
ｖ）前記サンプル［Ｓ４］細胞を、両方の阻害剤［Ａ］及び［Ｂ］に接触させ、該サンプルのタンパク質合成レベル［Ｌ（Ａ＋Ｂ）］を測定すること、
ｖｉ）前記細胞集団のグルコース依存度を、下記式（Ｉ）を計算することによって評価すること、
グルコース依存度＝（［ＬＣｏ］－［ＬＡ］）／（［ＬＣｏ］－［Ｌ（Ａ＋Ｂ）］）×１００（Ｉ）
ｖｉｉ）前記細胞集団のミトコンドリア依存度を、下記式（ＩＩ）を計算することによって評価すること、
ミトコンドリア依存度＝（［ＬＣｏ］－［ＬＢ］）／（［ＬＣｏ］－［Ｌ（Ａ＋Ｂ）］）×１００（ＩＩ）
ｖｉｉｉ）前記細胞集団の解糖能力を、下記式（ＩＩＩ）を計算することによって評価すること、
解糖能力＝（１－（［ＬＣｏ］－［ＬＢ］）／（［ＬＣｏ］－［Ｌ（Ａ＋Ｂ）］））×
１００（ＩＩＩ）
ｉｘ）前記細胞集団の脂肪酸の酸化及びアミノ酸の酸化に対する能力を、下記式（ＩＶ）を計算することによって評価すること
脂肪酸の酸化及びアミノ酸の酸化の能力＝（１－（［ＬＣｏ］－［ＬＡ］）／（［ＬＣｏ］－［Ｌ（Ａ＋Ｂ）］））×１００（ＩＶ）
並びに
ｘ）最後に、前記細胞集団の前記エネルギー代謝プロファイルを決定すること、を含む方法。

【請求項2】

前記細胞集団は均一な細胞集団又は不均一な細胞集団からなる、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記細胞集団は、対象から得られる任意の生体サンプルに由来する、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記細胞集団は、リンパ球（Ｂ細胞及びＴ細胞など）、ナチュラルキラー細胞、骨髄細胞（単球、マクロファージ、及び樹状細胞）、好中球、好酸球、マスト細胞、好塩基球、又は顆粒球などの免疫細胞を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記阻害剤［Ａ］は、２－デオキシ－グルコース、２－［Ｎ－（７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアキソール－４－イル）アミノ］－２－デオキシグルコース／２－ＮＢＤＧ、フロレチン、３－ブロモピルビン酸（Ｂｒｏｍｏｐｈｙｒｕｖｉｃ ａｃｉｄ）、ヨードアセテート、フルオライド及び６－アミノニコチンアミドからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

ステップｉｉｉ）は、所定量のピルベート又はアセテートの存在下で行う、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記阻害剤［Ｂ］は、オリゴマイシン（Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／／Ｆ及び誘導体）、ロテノン、カルボニルシアニド－ｐ－トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン／ＦＣＣＰ、トリメタジジン／ＴＭＺ、２［６（４－クロロフェノキシ）ヘキシル］オキシラン－２－カルボキシレート／エトモキシル（Ｅｔｏｍｏｘｉｒ）、ビス－２－（５－フェニルアセトアミド－１，３，４－チアジアゾール－２－イル）エチルスルフィド／ＢＰＴＥＳ、及びエナシデニブからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記阻害剤［Ｂ］は、ミトコンドリア代謝経路における野生型又は突然変異体酵素の阻害剤から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

予め生体外に取り出されていた細胞集団又は生体外で培養されていた細胞集団から、前記細胞集団のさらなるサンプル［Ｓ５］を準備すること、
前記サンプルを、脂肪酸の酸化によるエネルギー産生の阻害剤［Ｃ］に接触させ、該サンプルのタンパク質合成レベル［ＬＣ］を測定すること、及び
前記細胞集団における脂肪酸の酸化の依存度を評価すること、のステップをさらに含み、
前記脂肪酸の酸化の依存度は式（Ｖ）
脂肪酸の酸化の依存度＝（［ＬＣｏ］－［ＬＣ］）／（［ＬＣｏ］－［Ｌ（Ａ＋Ｂ）］）×１００（Ｖ）
を計算することによって評価される、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記阻害剤［Ｃ］は、トリメタジジン／ＴＭＺ、及び２［６（４－クロロフェノキシ）ヘキシル］オキシラン－２－カルボキシレート／エトモキシル（Ｅｔｏｍｏｘｉｒ）からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

予め生体外に取り出されていた細胞集団又は生体外で培養されていた細胞集団から、前記細胞集団のさらなるサンプル［Ｓ６］を準備すること、
前記サンプルを、アミノ酸の酸化によるエネルギー産生の阻害剤［Ｄ］に接触させ、該サンプルのタンパク質合成レベル［ＬＤ］を測定すること、及び
前記細胞集団におけるアミノ酸の酸化の依存度を評価すること、のステップをさらに含み、
前記アミノ酸の酸化の依存度は式（ＶＩ）
アミノ酸の酸化の依存度＝（［ＬＣｏ］－［ＬＤ］）／（［ＬＣｏ］－［Ｌ（Ａ＋Ｂ）］）×１００（ＶＩ）
を計算することによって評価される、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

前記阻害剤［Ｄ］は、ビス－２－（５－フェニルアセトアミド－１，３，４－チアジアゾール－２－イル）エチルスルフィド／ＢＰＴＥＳ、アミノオキシ酢酸／ＡＯＡ、及びエピガロカテキン－３－ガレート／ＥＧＣＧからなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記タンパク質合成レベルは、前記サンプルを所定量のピューロマイシンに接触させてから、典型的に検出可能な標識にコンジュゲートした、ピューロマイシンに特異的な所定量のモノクローナル抗体に接触させることによって、決定される、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

前記標識は、重金属、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識、生物発光標識、コロイド金、又はＤＮＡバーコードオリゴヌクレオチドである、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記タンパク質合成レベルは、サイトメトリー、ＣｙＴＯＦ、又はＣｉｔｅシーケンシングによって評価される、請求項１３に記載の方法。

【請求項16】

特に目的のいくつかの細胞表面マーカー（例えば、Ｂ細胞のＢＣＲ、ＣＤ１９又はＣＤ２０、及びＴ細胞のＴＣＲ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５）に特異的な結合パートナー群を使用することによって、前記細胞集団において特定の細胞型を同定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項17】

ステップｘ）において前記細胞の前記エネルギー代謝プロファイルを決定することは、前記細胞が呼吸性プロファイル又は解糖性プロファイルを示すことを結論づけることを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項18】

診断目的のための、請求項１に記載の方法の使用。

【請求項19】

がんに罹患する患者の生存期間を予測するための、請求項１に記載の方法の使用。

【請求項20】

がんに罹患する対象が治療、特に化学療法又は免疫療法の対象となるかどうかを予測するための、請求項１に記載の方法の使用。

【請求項21】

解糖及びグルコース由来ピルベートの酸化的リン酸化によるエネルギー産生の所定量の阻害剤［Ａ］、
ＴＣＡ回路、及びピルベート酸化を含む酸化的リン酸化、脂肪酸の酸化、及びアミノ酸の酸化によるエネルギー産生の所定量の阻害剤［Ｂ］、
所定量のピューロマイシン、
ピューロマイシンに特異的な、所定量のモノクローナル抗体を含む、請求項１に記載の方法を行うためのキット。

【請求項22】

脂肪酸の酸化によるエネルギー産生の所定量の阻害剤［Ｃ］、
アミノ酸の酸化によるエネルギー産生の所定量の阻害剤［Ｄ］、
所定量のピルベート、
所定量のアセテート、
細胞選別のための抗体群、及び
前記代謝プロファイル（すなわち様々な依存度）の評価に適する様々な式（Ｉ～ＶＩ）を計算するためのソフトウェアパッケージをさらに含む、請求項２１に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞集団のエネルギー代謝をプロファイリングする方法に関する。

【背景技術】

【0002】

エネルギー代謝（ＥＭ）プロファイルは、細胞がＡＴＰを生成するよりどころとなるエネルギーの主供給源及び生化学経路（依存関係）、並びにまた他の代替物を利用するその可能性（能力）を記述する。また、ＥＭプロファイルは、様々な解剖学的位置において並びに内因性及び外因性のシグナリングキューに曝された際に生存するという細胞のコンピテンスを決定する。この情報は、様々な細胞型の生理学的機能及び細胞状態を理解するための中心となる。とりわけ、がん幹細胞、腫瘍性細胞、免疫細胞、ニューロンは、増殖する、分化する、及びその生理学的機能を果たす能力に影響を与えるＥＭプロファイルを有する。さらに、ＥＭプロファイルはまた、特定の代謝経路の阻害剤に対するがん化細胞の感受性を決定することができるので、腫瘍における手がかりとなる（Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０）（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｇａｎｅｓｈａｎ ａｎｄ Ｃｈａｗｌａ，２０１４；ＭａｃＩｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。近年、免疫代謝の研究では、免疫細胞が、厳密に調節された細胞型特異的な代謝プロファイルを有することが示されている。この代謝プロファイルは、ＥＭを調節し、その分化プログラムの一部である、特定の遺伝子細胞の発現によって得られる。免疫細胞又はがん細胞特異的ＥＭプロファイルは、活性化又は分化の状態を反映するとともに、遊走する、生存する、又は様々な免疫学的負荷に応答するというこれらの細胞のコンピテンスを決定する。

【0003】

現在、免疫療法後の臨床試験における近年の結果により、がん処置における革命が起こっている。この療法は、がん発症を抑制するという適応免疫応答の細胞傷害性能力を利用している（Ａｓｓｍａｎｎ ａｎｄ Ｆｉｎｌａｙ，２０１６；Ｄｏｕｇａｎ ａｎｄ Ｄｒａｎｏｆｆ，２００９）。この療法は、一般に、直接的又は間接的に細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞を標的とする、免疫細胞の活性化状態を回復又は作り出すことを狙いとし、チェックポイント阻害剤、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、及び養子細胞移入を含む（Ｎｅｗｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｐａｇｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。この処置における強い関心は、第３次療法として使用したときでも、一部の患者のがんを治癒するという能力が示されていることに基づいている。しかしながら、この完全な寛解応答は、少数の患者のみに観察される。そうした不均一な応答により、この療法から利益を得られる患者を特定するために腫瘍及び腫瘍浸潤性細胞をより良好に特徴づけるマーカーが求められることとなった。免疫代謝の分野は、免疫状態及び腫瘍プロファイル決定し、患者をより良好に特徴づけるという、ＥＭの使用可能性のため、臨床腫瘍科医の注目を引いている。全体として、免疫療法における標的細胞の代謝状態の変化は、処置有効性の有望な早期の予後判定マーカーに相当する。

【0004】

細胞のエネルギー代謝プロファイルを決定する現在の方法は３つの群に分類可能であり、これらはすべてバルク細胞培養を使用する。第１の群は、代謝阻害剤（すなわち、２－デオキシグルコース／２－ＤＧ及びオリゴマイシン Ａ／オリゴ）を使用し、細胞外酸性化率及び様々なＥＭ経路の活性における非直接的であるが正確な他の結果の変化をモニタリングする（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。第２の群は、質量分析によって、様々な細胞内代謝物のレベルを測定する。第３の群は、固定細胞又はライセートにおいて、特定の代謝経路に関連づけられる酵素の活性をモニタリングする方法を含む（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。Ｍｉｌｌｅｒらの方法を除いて、これらの技術はすべて多量の精製細胞を必要とし、大がかりな操作、機器や、また十分な大きさの組織サンプルの入手が要求されるので、一般に、ヒト患者又は生検から得た生細胞を特徴づけるために使用できない。

【0005】

このように、現在の不十分な技術ではなく生物学及び医薬におけるいくつかの可能な用途を考慮すると、シングルセル分解能でエネルギー代謝プロファイルを決定するための、簡単で迅速な方法の開発が未だ求められている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

特許請求の範囲によって規定されるように、本発明は、細胞集団のエネルギー代謝をプロファイリングする方法に関する。

【図面の簡単な説明】

【0007】

【図1】図１は、ＺＥＮＩＴＨの根拠及び原理を示す。（Ａ）ＡＴＰ及びＧＴＰを生成するため、様々な細胞が様々なエネルギー供給源を使用する。これらの供給源は大部分がグルコース、アミノ酸、又は脂肪酸である。これらの様々な分子を使用する細胞は図示される様々なエネルギー代謝プロファイルを示す。タンパク質合成は、利用可能な細胞エネルギー（ＡＴＰ／ＧＴＰ）の約３０％を消費するので、栄養飢餓にすぐに影響を受ける。（Ｂ）ＺＥＮＩＴＨを使用してＥＭプロファイルを決定するため、細胞サンプルを細分し、エネルギー経路阻害剤あり又はなしでインキュベートする（例えば、阻害剤なし、阻害剤Ａ、阻害剤Ｂ、及び阻害剤Ａ＋Ｂ）。細胞は、解糖を用いて解糖生成物の酸化的リン酸化によって（ＧｌｙｃＯｘＰｈｏｓ）又は脂肪酸及びアミノ酸の分解によって（ＦＡＯ及びＧｌｎｌｙｓｉｓ）ＡＴＰを生成する。阻害剤Ａは解糖及びＧｌｙｃＯｘＰｈｏｓを遮断する一方、阻害剤ＢはＧｌｙｃＯｘＰｈｏｓ、ＦＡＯ及びアミノ酸からのエネルギー産生を遮断し、阻害剤Ａ及びＢ（及び、又はＣ）の組合せは、すべての供給源からのＡＴＰ生成を遮断する。バルクの処理細胞（コントロール、Ａ、Ｂ、Ａ＋Ｂ）は、フローサイトメトリーのため、短時間のピューロマイシン瞬間適用後にシングルセル及びタンパク質合成レベルを特定するように、同じ組み合わせのモノクローナル抗体で処理される。タンパク質合成レベルにおける各処理（エネルギー経路阻害剤）の影響を、マルチパラメーターフローサイトメトリーによって定量化し、適切な分析ソフトウェアで処理する。（Ｃ）ＥＭプロファイルを、式に記述されるように、様々な阻害剤で処理した細胞において認められるレベルから引いた、コントロール細胞（ＰｕｒｏＣｏ）におけるピューロマイシン取り込みレベルから直接的に推測した（ＭＦＩ ｐｕｒｏ）。

【図2】図２は、ＡＴＰレベル及びタンパク質合成を示す。４×１０^４のＭＥＦを、９６ウェルプレートに播種して、２－ＤＧ＋Ｏｌｉｇｏで様々な時間処理した。（Ａ）ＡＴＰプールにおけるタンパク質合成及びＲＮＡ合成阻害の作用を示す。翻訳阻害剤（ＣＨＸ）、転写阻害剤（ＡｃｔＤ）、又は両方のＣＨＸ＋ＡｃｔＤがない（Ｃｏ）又はある場合の総ＡＴＰレベルを示す（５分の処理）。（Ｂ）２－ＤＧ＋Ｏｌｉｇｏ処理後の時間の関数としてのＡＴＰレベルを示す。（Ｃ）ＦＡＣＳによってシングルセルにおいて測定した、２－ＤＧ＋Ｏｌｉｇｏ処理後の時間の関数としての翻訳レベル（ピューロマイシンＭＦＩ）を示す。（Ｄ）ＡＴＰレベルと翻訳レベルと（Ｐｕｒｏ ＭＦＩ）の相関性を示す。少なくとも３つの独立実験における両側ｔ検定（Ａ）（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１）。Ｎ＝３つの独立実験（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１）。

【図3】図３は、ＭＥＦにおけるＡＴＰレベル又はタンパク質合成活性を使用するＥＭプロファイル、及び活性化の際のヒト及びマウスＴ細胞におけるＥＭプロファイルの変化を示す。（Ａ）代謝阻害剤によって２０～３０分間処理したＭＥＦにおけるＡＴＰレベルを示す。（Ｂ）（Ａ）に示すＡＴＰレベルから得たＥＭプロファイルを示す。（Ｃ）代謝阻害剤の添加後の様々な時点におけるＡＴＰレベルから得たＥＭプロファイルを示す。（Ｄ）代謝阻害剤によって２０分間処理したＭＥＦにおけるタンパク質合成レベルを示す。（Ｅ）（Ｄ）に示すピューロ取り込みレベルで計算したＥＭプロファイルを示す。（Ｇ）ＺＥＮＩＴＨを使用してマウスの脾臓ＣＤ８Ｔ細胞を分析した。総ＰｕｒｏＭＦＩは、コントロール細胞（非活性化）又はＰＭＡ／イオノマイシン処理において示す。（Ｈ）（Ｇ）に示す値から得たＥＭプロファイルを示す。（Ｉ）２人の異なる対象（Ｐ１及びＰ３）からのヒト血液セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞のＥＭプロファイルを、コントロール（非刺激）又は活性化（ａＣＤ３／ａＣＤ２８ビーズ）においてＺＥＮＩＴＨ方法を使用して生成した。Ｔ細胞刺激なし又はありで代謝プロファイルを推定するため、セントラルメモリーＣＤ４Ｔ（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋）細胞の同定が可能な抗体の組合せを使用した。Ｎ＝３、少なくとも２つの独立実験における分散分析（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００５；＊＊＊ｐ＜０．０００５）。

【図4】図４は、Ｆｌｔ３Ｌでインビトロにおいて分化させたＷＴ及びＰＥＲＫ ＫＯｂｍＤＣにおけるＺＥＮＩＴＨに基づくＥＭプロファイルを示す。（Ａ）ＰＥＲＫ及びＥＲストレスが２－ＤＧ処理によって誘導される翻訳喪失に関連するかどうかを判定するため、ＺＥＮＩＴＨを使用して、ＷＴ及びＣＤ１１ｃ－Ｃｒｅ ＰＥＲＫｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスからのＦｌｔ３Ｌ－ｂｍＤＣ培養物を分析した。主要なマーカーを示す（方法参照）別個のＤＣサブセットを、ＤＣ１（ＸＣＲ１＋）、ＤＣ２（ＣＤ１１Ｂ＋）／ＤＣ３及びＤＣ６（ｐＤＣ）と示す。（Ｂ）同じインビトロの培養物のＤＣサブセットにおけるフローサイトメトリーによって測定したピューロマイシン取り込みレベルを示す。ピューロマイシン取り込みの前にコントロール、２－ＤＧ、Ｏｌｉｇｏ、及び２－ＤＧ＋Ｏｌｉｇｏと共にＤＣをインキュベートした。（Ｃ）（Ｂ）における生値から得たグルコース及びミトコンドリア依存度又は解糖及びＦＡＯ及びＧｌｎｌｙｓｉｓ（ＦＡＯ）能力は、ＰＥＲＫがなくても、細胞が翻訳の阻害を受けることを示す。データは３つの独立マウスの平均±ＳＤとして示し、２つの独立実験を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１。

【図5】図５は、骨髄由来樹状細胞サブセット（ＢＭＤＣ）のＺＥＮＩＴＨに基づくＥＭプロファイルを示す。（Ａ）２ＤＧ、コントロール処理、オリゴマイシン、及び２－ＤＧ＋オリゴマイシンに対応する、３匹のマウス（バイオロジカルレプリケート）のＢＭＤＣのタンパク質合成プロファイルの例を示す。タンパク質合成レベルの曲線下面積は、各阻害剤ありで代謝機能（すなわち翻訳）を持続させるという細胞の能力に相当し、代謝プロファイルを得ることができる（０、１、２、３、４、５）。（Ｂ）非刺激の（左）又はＬＰＳで４時間刺激した（右）３匹（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ）のＷＴマウスからのＦＬＴ３Ｌ由来ＢＭＤＣのＺＥＮＩＴＨによる代謝プロファイルを示す。樹状細胞分集団を分析し、その代謝プロファイルを示す。（Ｃ）様々なＤＣ分集団において得た、各マウス（ｎ＝３）における各レプリケート（ｎ＝３）の代謝プロファイルは、同様の代謝プロファイルを有する細胞サブセットをクラスタリングするために使用可能である。（Ｄ）様々なＤＣサブセットにおいて得た代謝プロファイルの統計分析から、ＤＣ２が、ＬＰＳによってより強力な代謝スイッチが入るサブセットである一方、ｐＤＣは、その代謝を変えないということが明らかになった。

【図6】図６は、休止及び活性化Ｔ細胞のＳｅａｈｏｒｓｅ（登録商標）及びＺＥＮＩＴＨの並行分析を示す。（Ａ）Ｓｅａｈｏｒｓｅ及びＺＥＮＩＴＨによって測定した、３人の異なる対象からの定常状態及び活性化（ａＣＤ３／ＣＤ２８）Ｔ細胞の解糖能力における変化の間の相関性を示す（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、ピアソン ｒ＝０．９２；Ｒ^２＝０．８５；ｐ＜０．０１）。（Ｂ）非活性（ｎｏｎ－Ａｃｔ）及び活性化（ａＣＤ３／ＣＤ２８）Ｔ細胞における基本酸素消費速度（ＯＣＲ）を示す。各バーはＰ１、Ｐ２、及びＰ３の平均を表す（トリプリケート）。（Ｃ）非活性（ｎｏｎ－Ａｃｔ）及び活性化（ａＣＤ３／ＣＤ２８）Ｔ細胞における基本翻訳レベル（抗ピューロ、幾何平均蛍光法、強度）を示す。各バーはＰ１、Ｐ２、及びＰ３の平均を表す（トリプリケート）。

【発明を実施するための形態】

【0008】

本発明者らは、様々なエネルギー産生経路の阻害の際に細胞集団におけるタンパク質合成レベルを迅速且つ効率的に測定する、本明細書においてＺＥＮＩＴＨと呼ばれる方法を設計した。実際に、本発明者らは、ピューロマイシン取り込みを新たな抗ピューロマイシンモノクローナル抗体と組み合わせて、表示としてのタンパク質合成強度に基づいてシングルセルレベル分解能でＥＭプロファイリングを行う確実な方法を開発した。本発明者らによって開発したこの方法は、エクスビボの豊富ではない細胞においてシングルセル分解能でエネルギー代謝プロファイルを得ることを可能し、最小の操作時間、インキュベーション、及びサンプル調製費用に下げることができる。ＺＥＮＩＴＨは、個々の細胞におけるエネルギー代謝（ＥＭ）活性をモニタリングする新たな方法であり、様々で不均一な細胞集団を含むエクスビボのサンプルに使用することができる。ＺＥＮＩＴＨは、いずれの大がかりな精製作業、専用機器、特定の専門的技術の必要もなく数時間で行うことができる。ＺＥＮＩＴＨの多用途性は、特に、ヒトの臨床サンプルにおける細胞代謝研究の範囲を広げ、本発明者らは、本明細書において、新たに同定された希少なＡＸＬ＋ＣＤ２２＋ＤＣ集団を含む、血液からの、又は腫瘍母地から単離した、ヒトＴ細胞及びＤＣサブセットにおけるＥＭの多様性をプロファイリングするというＺＥＮＩＴＨの特性の例を示す。さらに、この免疫細胞の機能的代謝プロファイリングを使用することによって、本発明者らは、発現パターンが様々な機能的ＥＭプロファイルに大きく相関している遺伝子を同定するため、シングルセルＲＮＡシーケンシングデータを利用することができる。このＥＭ遺伝子リストに基づいて、本発明者らは、４５０個のヒト腫瘍（すなわち、肺、頭部及び頸部、結腸直腸、膀胱、及び肝臓のがん）から単離し、選別した抗原提示細胞（ＡＰＣ）のＲＮＡシーケンシングデータを分析した。発明者らは、患者のＡＰＣが明らかな２つのクラスターとなり、一方は呼吸性ＡＰＣ遺伝子発現プロファイルを示し、他方は解糖性ＡＰＣ遺伝子発現プロファイルを有するということを観察した。

【0009】

したがって、本発明の第１の目的は、細胞集団のエネルギー代謝プロファイルをプロファイリングする方法に関し、該方法は、
ｉ）上述の細胞集団の４つのサンプル［Ｓ１］、［Ｓ２］、［Ｓ３］、及び［Ｓ４］を準備すること、
ｉｉ）任意の阻害剤の不在下において、サンプル［Ｓ１］のタンパク質合成レベル［ＬＣｏ］を測定すること、
ｉｉｉ）サンプル［Ｓ２］を、解糖及びグルコース由来ピルベートの酸化的リン酸化によるエネルギー産生の阻害剤［Ａ］に接触させ、該サンプルのタンパク質合成レベル［ＬＡ］を測定すること、
ｉｖ）サンプル［Ｓ３］を、ＴＣＡ回路、及びピルベート酸化を含む酸化的リン酸化、脂肪酸の酸化、及びアミノ酸の酸化によるエネルギー産生の阻害剤［Ｂ］に接触させ、該サンプルのタンパク質合成レベル［ＬＢ］を測定すること、
ｖ）サンプル［Ｓ４］細胞を、両方の阻害剤［Ａ］及び［Ｂ］に接触させ、該サンプルのタンパク質合成レベル［Ｌ（Ａ＋Ｂ）］を測定すること、
ｖｉ）細胞集団のグルコース依存度を評価すること、
ｖｉｉ）細胞集団のミトコンドリア依存度を評価すること、
ｖｉｉｉ）細胞集団の解糖能力を評価すること、
ｉｘ）細胞集団の脂肪酸の酸化及びアミノ酸の酸化に対する能力を評価すること、並びに
ｘ）最後に、細胞集団のエネルギー代謝プロファイルを決定すること、を含む。

【0010】

本明細書において使用するように、「細胞」という用語は任意の真核生物細胞を指す。真核生物細胞は、卵巣細胞、上皮細胞、免疫細胞、造血細胞、骨髄細胞、循環血管前駆細胞、心臓細胞、軟骨細胞、骨細胞、β細胞、肝細胞、及びニューロンを限定することなく含む。さらに、上述の用語は多能性幹細胞を含む。本明細書において意図するように、「多能性幹細胞」という表現は、１つ以上の細胞型に分化しやすい分裂可能（ｄｉｖｉｓｉｏｎ－ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）細胞に関する。好ましくは、多能性幹細胞は分化していない。多能性幹細胞は、幹細胞、特に成体幹細胞（例えば間葉系幹細胞（ＭＳＣ））及び胚性幹細胞を含む。また、上述の用語は誘導多能性幹細胞（ＩＰＳ）を含む。したがって、上述の用語は、精製した初代細胞及び不死化細胞株を含む。また、上述の用語は、懸濁液中の細胞（例えば、循環白血球（ＰＢＭＣ））又は接着細胞（例えば内皮細胞）を指す。

【0011】

一部の実施形態において、細胞集団は均一な細胞集団からなる。本明細書において使用するように、「均一な細胞集団」という用語は、１つの細胞型及び／又は１つの細胞状態を含む細胞集団を指す。典型的に、上述の細胞集団は、任意のルーチンの方法によってそれまでに選別又は単離されたものである。

【0012】

一部の実施形態において、細胞集団は不均一な細胞集団からなる。本明細書において使用するように、「不均一な細胞集団」という用語は、２つ以上の様々な細胞型又は細胞状態を含む細胞集団を指す。

【0013】

例えば、上述の細胞集団は、対象（例えば患者）から得られる任意の生体サンプルに由来することができる。本明細書において使用するように、「生体サンプル」という用語は、細胞集団を含む可能性がある生物学的由来の任意のサンプルを指す。生体サンプルの例は、組織、器官、又は全血、血漿、血清などの体液、組織、洗浄液、又は任意の他の試料を含む。一部の実施形態において、生体サンプルは、典型的に生検に由来する組織サンプルである。一部の実施形態において、サンプルは、腫瘍組織サンプルである。「腫瘍組織サンプル」という用語は、患者由来の任意の組織の腫瘍サンプルを意味する。一部の実施形態において、腫瘍サンプルは患者から切除した腫瘍に由来することができる。一部の実施形態において、腫瘍サンプルは、患者の原発腫瘍に行った、又は患者の原発腫瘍から離れた転移サンプルに行った生検に由来することができる。一部の実施形態において、腫瘍組織サンプルは、（ｉ）全体的な原発腫瘍（全体として）、（ｉｉ）腫瘍中心からの組織サンプル、（ｉｉｉ）腫瘍に近接したリンパ球島、（ｉｖ）腫瘍に最近接した位置にあるリンパ節、（ｖ）手術前に採取した腫瘍組織サンプル（例えば、処置後の患者の追跡調査のため）、及び（ｖｉ）遠隔転移を含む。一部の実施形態において、腫瘍組織サンプルは、腫瘍の外科的切除後、又は生検のための組織サンプルの採取後を含む、腫瘍から除去された組織片又は組織薄片を含む。腫瘍組織サンプルには、当然ながら、多様な周知の採取後の前処理及び保存手法を施すことができる。典型的に、細胞は、細胞懸濁液を調製するため、組織から解離させる。一次組織から懸濁液を得るための一般的方法は、酵素による脱凝集である。

【0014】

一部の実施形態において、細胞集団は免疫細胞を含む。本明細書において使用するように、「免疫細胞」という用語は、造血器由来であり、免疫応答において役割を担う細胞を含む。免疫細胞は、Ｂ細胞及びＴ細胞などのリンパ球、ナチュラルキラー細胞、単球、好中球、マクロファージ、樹状細胞などの骨髄細胞、好酸球、マスト細胞、好塩基球、及び顆粒球を含む。一部の実施形態において、細胞集団はＴ細胞を含む。本明細書において使用するように、「Ｔ細胞」という用語は、細胞媒介免疫において重要な役割を担うとともに、細胞表面におけるＴ細胞受容体の存在によって、Ｂ細胞などの他のリンパ球とは区別されるリンパ球の種類を指す。いくつかのＴ細胞サブセットが記載されており、文脈において示されない限り、典型的には、ヘルパーＴ細胞（例えば、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ９、及びＴｈ１７細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、制御性／抑制性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞、［γ／δ］Ｔ細胞、及び／又は自己攻撃性Ｔ細胞（例えば、ＴＨ４０細胞）を含む。一部の実施形態において、「Ｔ細胞」という用語は特にヘルパーＴ細胞を指す。一部の実施形態において、「Ｔ細胞」という用語は、より具体的にはＴＨ１７細胞（すなわち、ＩＬ－１７を分泌するＴ細胞）を指す。一部の実施形態において、「Ｔ細胞」という用語は制御性Ｔ細胞又は「Ｔｒｅｇ」細胞を指す。

【0015】

本明細書において使用するように、本発明の文脈における「プロファイリング」という用語は、細胞集団のエネルギー代謝プロファイルを規定することを意味する。

【0016】

本明細書において使用するように、「エネルギー代謝」という用語は、細胞にエネルギー産生物又は代謝物を作り出すこと又は貯蔵することに寄与する、すべての生物学的経路及び反応を指す。

【0017】

本明細書において使用するように、「タンパク質」という用語は、当該技術分野におけるその一般的な意味を有し、アミノ酸鎖を指す。「タンパク質合成」（又は翻訳）という用語は、細胞質又は小胞体のリボソームが細胞においてタンパク質を合成するプロセスを指す。

【0018】

本明細書において使用するように、「エネルギー産生」という用語は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）及びグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）などのエネルギー分子の合成をもたらす細胞における任意のプロセスを指す。

【0019】

本明細書において使用するように、「解糖」という用語は当該技術分野におけるその一般的な意味を有し、細胞によるグルコースの代謝酸化を指す。解糖の際、グルコースはピルベートに酸化される。一般的に、好気条件下において、ピルベートは主にアセチル－ＣｏＡに変換される。酸素が欠乏すると、ピルベートは乳酸に変換され、主な解糖生成物として排出される。

【0020】

本明細書において使用するように、「ピルベートの酸化的リン酸化」という用語は、当該技術分野におけるその一般的な意味を有し、クレブス回路から生成されたＮＡＤＨを酸化することによって内膜の境界においてプロトン勾配（化学浸透圧力性電位）を得る電子伝達系を含むミトコンドリアにおけるプロセスを指す。化学浸透厚圧性勾配がＡＤＰのリン酸化を促進するために使用されるとき、ＡＴＰは、ＡＴＰシンターゼ酵素によって合成される。電子は、最後に、外因性酸素に移送され、２つのプロトンを付加して、水が形成される。

【0021】

本明細書において使用するように、「解糖及びピルベートの酸化的リン酸化によるエネルギー産生の阻害剤」という用語は、解糖及びピルベートの酸化的リン酸化によるエネルギー産生を部分的又は全体的に遮断、抑制、又は阻害する、自然又は合成の、任意の化合物を指す。本発明において、上述の阻害剤を阻害剤［Ａ］と呼ぶ。

【0022】

一部の実施形態において、阻害剤［Ａ］は、２－デオキシ－グルコース、２－［Ｎ－（７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアキソール－４－イル）アミノ］－２－デオキシグルコース／２－ＮＢＤＧ、フロレチン、３－ブロモピルビン酸（Ｂｒｏｍｏｐｈｙｒｕｖｉｃ ａｃｉｄ）、ヨードアセテート、フルオライド及び６－アミノニコチンアミドからなる群より選択される。

【0023】

一部の実施形態において、ステップｉｉｉ）を、所定量のピルベートの存在下で行う。本明細書において使用するように、「ピルベート」という用語は当該技術分野におけるその一般的な意味を有し、ピルビン酸の共役塩基ＣＨ３ＣＯＣＯＯ－を指す。上述の実施形態において、ピルベートの存在により、解糖依存度（ＰＤＨ依存）を測定することができる。「解糖依存度（ＰＤＨ依存）」という用語は、解糖がピルベートの存在下において阻害されるとき（すなわち２－デオキシ－グルコース）にエネルギー産生を維持するという細胞の能力を意味する。この条件において、ピルベートはＰＤＨによってアセチル－ＣｏＡに変換される。

【0024】

一部の実施形態において、ステップｉｉｉ）を、所定量のアセテートの存在下で行う。本明細書において使用するように、「アセテート」又は「エタノエート」という用語は当該技術分野におけるその一般的な意味を有し、式ＣＨ３ＣＯＯ－のイオンを指す。上述の実施形態において、アセテートの存在により、解糖依存度（ＰＤＨ非依存）を測定することができる。「解糖依存度（ＰＤＨ非依存）」という用語は、解糖がアセテートの存在下において阻害されるとき（すなわち２－デオキシ－グルコース）にエネルギー産生を維持するという細胞の能力を意味する。この条件において、アセテートはＰＤＨ活性非依存的にアセチル－ＣｏＡに変換可能である。

【0025】

本明細書において使用するように、「ＰＤＨ」という用語は、当該技術分野におけるその一般的な意味を有し、ピルベートをアセチル－ＣｏＡに変換して、解糖生成物をクレブス回路につなげる主要な制御酵素である、ピルベート脱水素酵素を意味する。

【0026】

本明細書において使用するように、「脂肪酸の酸化」又は「β酸化」という用語は、当該技術分野におけるその一般的な意味を有し、脂肪酸分子が真核生物のミトコンドリアにおいて分解され、クエン酸回路に入るアセチル－ＣｏＡ、並びに電子伝達系に使用される補酵素であるＮＡＤＨ及びＦＡＤＨ２を生成する、異化プロセスを指す。

【0027】

本明細書において使用するように、「アミノ酸の酸化」という用語は、当該技術分野におけるその一般的な意味を有し、ＴＣＡ回路に入ることができるとともに、ＡＴＰ及び／又はＧＴＰ合成をもたらすアセチル－ＣｏＡ、アセテート、ピルベート、α－ケト－グルタレート、又は他の代謝物を生成するというアミノ酸の酸化を指す。

【0028】

本明細書において使用するように、「脂肪酸の酸化及びアミノ酸の酸化を含む酸化的リン酸化によるエネルギー産生の阻害剤」という用語は、脂肪酸の酸化及びアミノ酸の酸化を含む酸化的リン酸化によるエネルギー産生を部分的又は全体的に遮断、抑制、又は阻害する、自然又は合成の、任意の化合物を指す。本発明において、上述の阻害剤を阻害剤［Ｂ］と呼ぶ。

【0029】

一部の実施形態において、阻害剤［Ｂ］は、オリゴマイシン（Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ及び誘導体）、ロテノン、カルボニルシアニド－ｐ－トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン／ＦＣＣＰ、トリメタジジン／ＴＭＺ、２［６（４－クロロフェノキシ）ヘキシル］オキシラン－２－カルボキシレート／エトモキシル（Ｅｔｏｍｏｘｉｒ）、ビス－２－（５－フェニルアセトアミド－１，３，４－チアジアゾール－２－イル）エチルスルフィド／ＢＰＴＥＳ、及びエナシデニブからなる群より選択される。また、ミトコンドリア代謝経路における野生型又は突然変異体酵素の他の阻害剤も使用することができる。本明細書において使用するように、「突然変異」という用語は当該技術分野におけるその一般的な意味を有し、野生型ミトコンドリア酵素から逸脱したＤＮＡ又はタンパク質配列の任意の変化を指す。これは、ＤＮＡの単一の塩基変化、単一のアミノ酸変化、ＤＮＡにおける複数の塩基変化、及び複数のアミノ酸変化を含む。また、これは、遺伝子及びその対応タンパク質の挿入、欠失、及びトランケーションを含む。例えば、シトレート合成酵素、ＮＡＤ＋マレート脱水素酵素、ＮＡＤ＋グルタメート脱水素酵素、サクシネートシトクロムｃ還元酵素、ロテノン－感受性ＮＡＤＨシトクロムｃ還元酵素、アデニレートキナーゼ、ロテノン－非感受性ＮＡＤＨシトクロムｃ還元酵素、モノアミン酸化酵素、及びキヌレニン水酸化酵素である酵素の阻害剤を使用することができる。特に、イソシトレート脱水素酵素（ＩＤＨ）の阻害剤を使用することができる。本明細書において使用するように、「ＩＤＨ」という用語は当該技術分野におけるその一般的な意味を有し、イソシトレート脱水素酵素を指す。ＩＤＨはクエン酸回路に関与する酵素である。これは、ＮＡＤ（Ｐ）＋をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換しながら、α－ケトグルタレート（ａ－ケトグルタレート又はａ－ＫＧ）及びＣＯ２を生成する、イソシトレートの酸化的脱炭酸という、上述の回路の第３ステップを触媒する。これは２ステップのプロセスであり、イソシトレート（２級アルコール）をオキサロサクシネート（ケトン）に酸化、その後カルボキシル基βをケトンに脱炭酸して、α－ケトグルタレートを形成することに関与する。上述の酵素の他のアイソフォームが同じ反応を触媒する。しかしながら、この反応はクエン酸回路に関連せず、ミトコンドリア及びペルオキシソームと同様に細胞質基質において行われ、補因子としてＮＡＤ＋ではなくＮＡＤＰ＋を使用する。ＩＤＨ１及びＩＤＨ２における突然変異は、当該技術分野で周知であり、典型的には酵素の活性部位にあり、イソシトレート結合に関与する。多くの場合、これらは、ＩＤＨ２タンパク質のアルギニン－１４０（Ｒ１４０）残基に影響するミスセンス変化である。ＩＤＨ１突然変異体は、イソシトレートをａ－ケトグルタレートに変換する野生型酵素の能力を欠いているが、ａ－ＫＧをがん代謝物の２－ヒドロキシグルタレート（２ＨＧ）に変換させる新形態の活性を得ている。

【0030】

本明細書において使用するように、「グルコース依存度」という用語は、細胞がグルコースなしでエネルギーを産生できないことを指す。一部の実施形態において、細胞のグルコース依存度は式（Ｉ）を計算することによって評価される。
グルコース依存度＝（［ＬＣｏ］－［ＬＡ］）／（［ＬＣｏ］－［Ｌ（Ａ＋Ｂ）］）×１００（Ｉ）

【0031】

本明細書において使用するように、「ミトコンドリア依存度」という用語は、細胞がエネルギー性ミトコンドリア経路なしでエネルギーを産生できないことを指す。一部の実施形態において、細胞のミトコンドリア依存度は式（ＩＩ）を計算することによって評価される。
ミトコンドリア依存度＝（［ＬＣｏ］－［ＬＢ］）／（［ＬＣｏ］－［Ｌ（Ａ＋Ｂ）］）×１００（ＩＩ）

【0032】

本明細書において使用するように、「解糖能力」という用語は、解糖以外の他のすべての経路が阻害されるとき、細胞がエネルギーを産生できることを指す。一部の実施形態において、細胞の解糖能力は式（ＩＩＩ）を計算することによって評価される。
解糖能力＝（１－（［ＬＣｏ］－［ＬＢ］）／（［ＬＣｏ］－［Ｌ（Ａ＋Ｂ）］））×１００（ＩＩＩ）

【0033】

本明細書において使用するように、「脂肪酸の酸化及びアミノ酸の酸化の能力」という用語は、脂肪酸の酸化及びアミノ酸の酸化以外の他のすべての経路が阻害されるとき、細胞がエネルギーを産生できることを指す。一部の実施形態において、脂肪酸の酸化及びアミノ酸の酸化の能力は式（ＩＶ）を計算することによって評価される。
脂肪酸の酸化及びアミノ酸の酸化の能力＝（１－（［ＬＣｏ］－［ＬＡ］）／（［ＬＣｏ］－［Ｌ（Ａ＋Ｂ）］））×１００（ＩＶ）

【0034】

一部の実施形態において、細胞は、細胞型に応じて、２０～４０分の短時間、阻害剤に接触させる。例えば、線維芽細胞には２０分の阻害で十分である一方、ヒト血液Ｔ細胞では４０分が最適である。阻害剤と共により長時間のインキュベート（すなわち２時間以上）をすることにより、代償性機構に関与する遺伝子の誘導、細胞死の誘導、又は細胞の代謝活性を遮断する細胞ストレス経路の活性化などの、望ましくない作用がもたらされ得る。

【0035】

一部の実施形態において、本発明の方法は、
細胞集団のさらなるサンプル［Ｓ５］を準備すること、
上述のサンプルを、脂肪酸の酸化によるエネルギー産生の阻害剤［Ｃ］に接触させ、該サンプルのタンパク質合成レベル［ＬＣ］を測定すること、及び
細胞集団における脂肪酸の酸化の依存度を評価すること、のステップをさらに含む。

【0036】

本明細書において使用するように、「脂肪酸の酸化によるエネルギー産生の阻害剤」という用語は、脂肪酸の酸化によるエネルギー産生を部分的又は全体的に遮断、抑制、又は阻害する、自然又は合成の、任意の化合物を指す。本発明において、上述の阻害剤を阻害剤［Ｃ］と呼ぶ。

【0037】

一部の実施形態において、阻害剤［Ｃ］は、トリメタジジン／ＴＭＺ、及び２［６（４－クロロフェノキシ）ヘキシル］オキシラン－２－カルボキシレート／エタモキシル（Ｅｔａｍｏｘｉｒ）からなる群より選択される。

【0038】

本明細書において使用するように、「脂肪酸の酸化の依存度」という用語は、脂肪酸の酸化が阻害されるとき、細胞がエネルギーを産生できず、代謝活性を維持できないことを指す。一部の実施形態において、脂肪酸の酸化の依存度は式（Ｖ）を計算することによって評価される。
脂肪酸の酸化の依存度＝（［ＬＣｏ］－［ＬＣ］）／（［ＬＣｏ］－［Ｌ（Ａ＋Ｂ）］）×１００（Ｖ）

【0039】

一部の実施形態において、本発明の方法は、
細胞集団のさらなるサンプル［Ｓ６］を準備すること、
上述のサンプルを、アミノ酸の酸化によるエネルギー産生の阻害剤［Ｄ］に接触させ、該サンプルのタンパク質合成レベル［ＬＤ］を測定すること、及び
細胞集団におけるアミノ酸の酸化の依存度を評価すること、のステップをさらに含む。

【0040】

本明細書において使用するように、「アミノ酸の酸化によるエネルギー産生の阻害剤」という用語は、アミノ酸の酸化によるエネルギー産生を部分的又は全体的に遮断、抑制、又は阻害する、自然又は合成の、任意の化合物を指す。本発明において、上述の阻害剤を阻害剤［Ｄ］と呼ぶ。

【0041】

一部の実施形態において、阻害剤［Ｄ］は、ビス－２－（５－フェニルアセトアミド－１，３，４－チアジアゾール－２－イル）エチルスルフィド／ＢＰＴＥＳ、アミノオキシ酢酸／ＡＯＡ、及びエピガロカテキン－３－ガレート／ＥＧＣＧからなる群より選択される。

【0042】

本明細書において使用するように、「アミノ酸の酸化の依存度」という用語は、アミノ酸の酸化が阻害されるとき、細胞がエネルギーを産生できず、代謝活性を維持できないことを指す。一部の実施形態において、アミノ酸の酸化の依存度は式（ＶＩ）を計算することによって評価される。
アミノ酸の酸化の依存度＝（［ＬＣｏ］－［ＬＤ］）／（［ＬＣｏ］－［Ｌ（Ａ＋Ｂ）］）×１００（ＶＩ）

【0043】

一部の実施形態において、タンパク質合成レベルの測定は当該技術分野において周知であるいずれかのものによって決定される。例えば、タンパク質合成レベルは、Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｅ．Ｋ．、Ｃｌａｖａｒｉｎｏ，Ｇ．、Ｃｅｐｐｉ，Ｍ．、及びＰｉｅｒｒｅ，Ｐ．（２００９）の「ＳＵｎＳＥＴ，ａ ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｍｏｎｉｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６、２７５－２７７に記載されるように測定される。簡潔に述べると、この方法は、非放射性の蛍光活性化セルソーティングに基づくアッセイであり、個々の哺乳動物細胞おける及び不均一な細胞集団における全体的なタンパク質合成のモニタリング及び定量化を可能にする。より具体的には、この方法は、標準的な免疫化学的方法を使用して翻訳を直接モニタリングするための、ピューロマイシンに対するモノクローナル抗体の使用に関与する。ピューロマイシン（ｐｕｒｏ）は、そのｔＲＮＡ－ＡＡ擬態分子構造により、リボソームによるｍＲＮＡ翻訳のプロセス時に新生ポリペプチド鎖に非常に効率的に取り込まれる抗生剤である。

【0044】

したがって、一部の実施形態において、サンプルは、所定量のピューロマイシンに接触させてから、典型的に検出可能な標識にコンジュゲートした、ピューロマイシンに特異的な所定量のモノクローナル抗体に接触させる。

【0045】

適切である検出可能な標識は、例えば、重金属、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識、生物発光標識、又はコロイド金を含む。そうした検出可能に標識した免疫コンジュゲートを作製及び検出する方法は当業者に周知であり、より詳細に以下に記載する。

【0046】

一部の実施形態において、抗体は蛍光化合物によって標識される。蛍光標識した抗体の存在は、その免疫コンジュゲートを適当な波長の光に暴露して、それにより生じた蛍光を検出することにより決定される。検出可能な標識の特定の例は、蛍光分子（又は蛍光色素）を含む。数多くの蛍光色素が当業者に知られており、例えば、Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ-Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓを参照し、例えばＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（元Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から選択可能である。核酸分子（特有で特異的な結合領域など）に結合（例えば化学的にコンジュゲート）させることのできる特定のフルオロフォアの例は、Ｎａｚａｒｅｎｋｏらの米国特許第５，８６６，３６６号に提供され、例えば、４－アセトアミド－４’－イソチオシアネートスチルベン－２，２’－ジスルホン酸、アクリジン及び誘導体、例えばアクリジン及びアクリジンイソチオシアネート、５－（２’－アミノエチル）アミノナフタレン－１－スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４－アミノ－Ｎ－［３ビニルスルホニル］フェニル］ナフタルイミド－３，５－ジスルホネート（ルシファーイエローＶＳ）、Ｎ－（４－アニリノ－１－ナフチル）マレイミド、アントラニラミド、ブリリアントイエロー、クマリン及び誘導体、例えばクマリン、７－アミノ－４－メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、７－アミノ－４－トリフルオロメチルクマリン（クマリン１５１）；シアノシン；４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’，５’’ジブロモピロガロール－スルホンフタレイン（ブロモピロガロールレッド）；７－ジエチルアミノ－３－（４’－イソチオシアネートフェニル）－４－メチルクマリン；ジエチレントリアミンペンタアセテート；４，４’－ジイソチオシアネートジヒドロ－スチルベン－２，２’－ジスルホン酸；４，４’－ジイソチオシアネートスチルベン－２，２’－ジスルホン酸；５－［ジメチルアミノ］ナフタレン－１－スルホニルクロリド（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）；４－（４’－ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）；４－ジメチルアミノフェニルアゾフェニル－４’－イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシン及び誘導体、例えばエオシン及びエオシンイソチオシアネート；エリスロシン及び誘導体、例えばエリスロシンＢ及びエリスロシンイソチオシアネート；エチジウム；フルオレセイン及び誘導体、例えば５－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５－（４，６－ジクロロトリアジン－２－イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’７’ジメトキシ－４’５’－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、及びＱＦＩＴＣ Ｑ（ＲＩＴＣ）；２’，７’－ジフルオロフルオレセイン（オレゴングリーン）；フルオレスカミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マラカイトグリーンイソチオシアネート；４－メチルウンベリフェロン；オルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラローズアニリン；フェノールレッド；Ｂ－フィコエリスリン；ｏ－フタルジアルデヒド；ピレン及び誘導体、例えばピレン、ピレンブチレート及びスクシンイミジル１－ピレンブチレート；リアクティブレッド４（Ｃｉｂａｃｒｏｎブリリアントレッド３Ｂ－Ａ）；ローダミン及び誘導体、例えば６－カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）、６－カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、ローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、ローダミングリーン、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１及びスルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（テキサスレッド）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－６－カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン；テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロゾール酸及びテルビウムキレート誘導体である。他の適切なフルオロフォアは、約６１７ｎｍで発光するチオール反応性ユーロピウムキレート（Ｈｅｙｄｕｋ ａｎｄ Ｈｅｙｄｕｋ，Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４８：２１６－２７，１９９７；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３３１５－２２，１９９９）、並びに、ＧＦＰ、リサミン、ジエチルアミノクマリン、フルオレセインクロロトリアジニル、ナフトフルオレセイン、４，７－ジクロロローダミン及びキサンテン（Ｌｅｅらの米国特許第５，８００，９９６号に記載）及びその誘導体を含む。例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．））から入手できるものなどの当業者に知られている他のフルオロフォアも使用することができ、これには、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）シリーズの色素（例えば、米国特許第５，６９６，１５７号、第６，１３０，１０１号及び第６，７１６，９７９号に記載）、ＢＯＤＩＰＹシリーズの色素（例えば、米国特許第４，７７４，３３９号、第５，１８７，２８８号、第５，２４８，７８２号、第５，２７４，１１３号、第５，３３８，８５４号、第５，４５１，６６３号及び第５，４３３，８９６号に記載のようなジピロメテンホウ素ジフルオリド色素）、カスケードブルー（米国特許第５，１３２，４３２号に記載のスルホン化ピレンのアミン反応性誘導体）並びにマリーナブルー（米国特許第５，８３０，９１２号）を含む。標識のモノクローナル抗体へのコンジュゲーションは、当該技術分野で知られている標準的な技術を使用してなされ得る。これに関して、典型的な方法は、Ｋｅｎｎｅｄｙら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ７０：１、１９７６；Ｓｃｈｕｒｓら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ８１：１、１９７７；Ｓｈｉｈら、Ｉｎｔ’ｌ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４６：１１０１、１９９０；Ｓｔｅｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：１３３０，１９９０；及びＣｏｌｉｇａｎ、上述参照、によって記載されている。

【0047】

したがって、一部の実施形態において、フローサイトメトリー方法が、標識抗ピューロマイシン抗体のレベルを検出及び測定するために適切な方法である。フローサイトメトリーは、研究において広く受け入れられているツールであり、ユーザーはサンプル液体中の成分を迅速に分析及び選別することができる。フローサイトメーターは担体液（例えばシース液）を使用して、サンプル成分を照射領域において実質的に一度に１つずつ通過させる。各サンプル成分はレーザーなどの光源によって照射され、各サンプル成分によって散乱した光を検出して分析する。サンプル成分は、照射領域を出るとき、その光学的及び他の特性に基づいて分離することができる。この方法は当該技術分野で周知である。したがって、例えば、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を使用することができ、これは典型的に、複数のフルオロフォアを共に励起及び検出することができるフローサイトメーターの使用に関与する。サイトメトリーシステムは、以下に記載するようなサイトメトリーサンプル流体サブシステムを含むことができる。さらに、サイトメトリーシステムは、サイトメトリーサンプル流体サブシステムに連通したサイトメーターを含む。本開示のシステムは、例えばモニター、プリンター、及び／又はスピーカーなどのデータ出力装置、例えばインタフェースポート、マウス、キーボード等のデータ入力装置、流体搬送部品、電源等の多くのさらなる部品を含むことができる。好ましい方法は、典型的に、フローサイトメトリー前の細胞透過処理に関与する。この方法を行う際に、細胞を透過処理する任意の簡便な手段を使用することができる。

【0048】

一部の実施形態において、抗体はランタニドなどの金属化学元素で標識される。ランタニドは、安定な同位体であること、最大１００以上の別個の標識という利用可能な多数のランタニドが存在すること、比較的安定であること、及び、質量分析を使用して検出したときに非常に検出しやすく且つ検出チャネル間で容易に分離されることから、他の標識よりもいくつかの利点がある。また、ランタニド標識は広いダイナミックレンジの検出を提供する。ランタニドは、高い感度を示し、光及び時間に対して非感受性であり、したがって、非常に柔軟性かつロバストであり、そして、多数の異なる状況において利用可能である。周期表におけるランタニド系列は１５個の元素を含み、そのうちの１４個は安定な同位体である（Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、Ｌｕ）。これらは、希土類元素とも呼ばれる。ランタニドは、ＣｙＴＯＦ技術を使用して検出することができる。ＣｙＴＯＦは、誘導結合プラズマ飛行時間型質量分析法（ＩＣＰ－ＭＳ）である（Ｃｈｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：ＣｙＴＯＦ-ｔｈｅ ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ” Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，７：５０２－５０３，２０１１、及びＢｅｎｄａｌｌ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ Ｍａｓｓ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｅ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ Ａｃｒｏｓｓ ａ Ｈｕｍａｎ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ” Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３２（６０３０）：６８７－６９６，２０１１が参照され、これらは言及によって本明細書に援用される）。市販されているＣｙＴＯＦ機器（例えばＦｌｕｉｄｉｇｍ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）は、利用可能である安定な同位体タグの存在と同じくらい多くのパラメーターについて１秒間あたり最大１０００個の細胞を分析することができる。

【0049】

一部の実施形態において、抗体は、目的の抗体を標識するためにフィンガープリントとして使用されるＤＮＡバーコードにコンジュゲートされる。そうしたＤＮＡバーコード付き抗体は、タンパク質の検出を、定量的でシーケンシング可能な表示に変換することに適する。ＤＮＡバーコードは、予め規定した配列のオリゴヌクレオチドである。本発明において、ＤＮＡバーコードは少なくとも４つのヌクレオチドを含む。ＤＮＡバーコードは、非常に特異的な抗原の検出を行い得るとともに、最終的に多重アッセイにおいて複数のＤＮＡバーコード付き抗体の使用を可能にする、不特定多数の組合せを作ることができるという利点がある。例えば、ＤＮＡバーコード付き抗体は、多くの大規模なオリゴｄＴに基づくｓｃＲＮＡシーケンシングライブラリ調製プロトコル時（例えば、１０ｘＧｅｎｏｍｉｃｓ、Ｄｒｏｐ－ｓｅｑ、ｄｄＳｅｑ）に取得される、合成転写物として機能する。ＣＩＴＥシーケンシングと呼ばれるこの方法の原理は、Ｓｔｏｅｃｋｉｕｓ，Ｍａｒｌｏｎらの「Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｅｐｉｔｏｐｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ．」Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ １４．９（２０１７）：８６５に記載されている。

【0050】

一部の実施形態において、本発明の方法は、特に、目的のいくつかの細胞表面マーカー（例えば、Ｂ細胞のＢＣＲ、ＣＤ１９又はＣＤ２０、及びＴ細胞のＴＣＲ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５）に特異的な結合パートナー群を使用することによって、上述の細胞集団において特定の細胞型を同定することをさらに含む。したがって、結合パートナーは上述のような標識にコンジュゲートされる。

【0051】

一部の実施形態において、本発明の方法のステップｘ）において細胞のエネルギー代謝プロファイルを決定することは、該細胞が呼吸性プロファイル又は解糖性プロファイルを示すことを結論づけることを含む。本明細書において使用するように、「呼吸性プロファイル」という用語は、細胞がエネルギーを産生するために主にミトコンドリア呼吸を使用するということを意味する。本明細書において使用するように、「解糖性プロファイル」という用語は、細胞がエネルギーを産生するために主に解糖を使用するということを意味する。

【0052】

したがって、本発明の方法は、細胞集団の代謝特性評価に適する。ＴＣＡ回路（クレブス回路としても知られる）は、静止状態の細胞によって使用されると考えられている主な代謝経路である。ＴＣＡ回路及び酸化的リン酸化により、その主な要求がエネルギー及び長寿命である細胞において、効率的にＡＴＰを生成する。ＴＣＡ回路は複数の栄養素取り入れの中心である。とりわけ、グルコース由来ピルベート、脂肪酸、又はアミノ酸は、ＴＣＡ回路に加わってシトレートを形成するアセチル補酵素Ａ（アセチル－ＣｏＡ）に変換される。ＴＣＡ回路における３つの主な最終生成物は、ＧＴＰ、還元型ニコチン－アデノシンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ／Ｈ）、及び還元型フラビン－アデノシンジヌクレオチド（ＦＡＤＨ２）である。ニコチンアミド及びフラビンジヌクレオチドは、電子をミトコンドリア電子伝達系に移送し、酸化的リン酸化を支援し、最終的にＡＴＰ生成をもたらす。解糖代謝経路（解糖とも称される）は、環境からグルコースを取り込むことから開始し、その後の細胞質基質における細胞内処理を行って、ＡＴＰ、ピルベート、及び他の代謝物を生成する。解糖は、細胞ＡＴＰの生成おいて比較的非効率な経路であり、分解グルコース分子あたりＡＴＰ２分子のみを生成する。しかしながら、解糖はＮＡＤ＋のＮＡＤＨへの還元を可能にし、これが補因子として数多くの酵素に使用され、同化成長を支援する。解糖フラックスは、ピルベート還元をとおしてラクテートへと維持され、ＮＡＤＨを再利用するとともに、ＮＡＤ＋レベルを維持して、細胞外媒体の酸性化をもたらす。したがって、解糖は、様々な環境的キューに応答して急速に増殖する細胞の代謝において必須の役割を担う。

【0053】

一部の実施形態において、本発明の方法は、少なくとも１つのさらなる分析技術を組み合わせる。一部の実施形態において、シーケンシングを行う。本明細書において使用するように、「シーケンシング」という用語は、一般的に、核酸におけるヌクレオチドの順番を決定するプロセスを意味する。核酸をシーケンシングするための多様な方法が当該技術分野で周知であり、これらを使用することができる。一部の実施形態において、次世代シーケンシングが行われる。本明細書において使用するように、「次世代シーケンシング」という用語は、当該技術分野におけるその一般的な意味を有し、例えば、一度に数十万又は数百万の比較的短いシーケンス表示を生成することができることにより、サンガー及びキャピラリー電気泳動に基づく従来の手法と比較してスループットが増加したシーケンシング技術を指す。次世代シーケンシング技術のいくつかの例は、合成によるシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、及びハイブリダイゼーションによるシーケンシングを含むがこれらに限定されない。次世代シーケンシング方法の例は、ＧＳ ｊｕｎｉｏｒ及びＧＳ ＦＬＸシステム（４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって使用されるようなパイロシーケンシング、ＩＩｌｕｍｉｎａのＭｉｓｅｑ及びＳｏｌｅｘａシステム、ＳＯＬｉＤ（登録商標）（オリゴヌクレオチドライゲーション及び検出によるシーケンシング）システム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｉｎｃ．）、及びパーソナルゲノムマシーン又はＰｒｏｔｏｎシーケンサーなどのｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔシーケンシングシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｉｎｃ．）によって使用されるような合成によるシーケンシング、並びにナノポアシーケンシングシステム（Ｏｘｆｏｒｄ ｎａｎｏｐｏｒｅ）を含む。ＩＩｌｕｍｉｎａのシーケンシング技術を使用する合成によるシーケンシングの場合、供給源分子はフローセルに送る前にＰＣＲ増幅することができる。

【0054】

本発明の方法には種々の用途があり得る。

【0055】

したがって、本発明の方法は、細胞の活性化状態の決定に特に適する。実際に、実施例において示すように、細胞の活性化状態はその代謝プロファイルに直接的に相関し得る。典型的に、急性の免疫活性化状態は解糖プロファイルに相関する。本明細書において使用するように、「免疫活性化状態」という用語は、例えば、特定の分子（すなわち、抗原、ＰＡＭＰ、ＤＡＭＰ）の認識によって刺激される、様々な自然免疫細胞及び適応免疫細胞（すなわち、Ｔ細胞、ＣＡＲ Ｔ、Ｂ細胞、ＮＫ、ＤＣ及びその他のもの）の実証された能力に基づく。活性化された細胞はその代謝プロファイルを変化させるので、代謝プロファイルはその活性化状態の機能的尺度となり得る。

【0056】

一部の実施形態において、本発明の方法は、診断目的に特に適する。

【0057】

一部の実施形態において、本発明の方法は、炎症性疾患の診断に特に適する。「炎症性疾患」という用語は当該技術分野におけるその一般的な意味を有し、炎症に関連する任意の疾患及び状態を指す。上述の用語は、（１）炎症性又はアレルギー性疾患、例えば全身性アナフィラキシー又は過敏応答、薬剤アレルギー、昆虫刺咬アレルギー；炎症性腸疾患、例えばクローン病、潰瘍性大腸炎、回腸炎及び腸炎；腟炎；乾癬及び炎症性皮膚疾患、例えば、皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、じん麻疹；血管炎；脊椎関節症；強皮症；呼吸器アレルギー性疾患、例えば喘息、アレルギー性鼻炎、過敏性肺疾患、など、（２）自己免疫性疾患、例えば関節炎（リウマチ性及び乾癬性）、変形性関節症、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、糖尿病、糸球体腎炎、など、（３）移植片拒絶（同種移植片拒絶及び移植片対宿主疾患を含む）、並びに（４）望ましくない炎症応答が阻害される他の疾患（例えば、アテローム性動脈硬化、筋炎、炎症性ＣＮＳ障害、例えば卒中及び閉鎖性頭部損傷、神経変性疾患、アルツハイマー病、脳炎、髄膜炎、骨粗しょう症、痛風、肝炎、腎炎、敗血症、サルコイドーシス、結膜炎、耳炎、慢性閉塞性肺疾患、副鼻腔炎、及びベーチェット症候群）を含むことができるが、これらに限定されない。

【0058】

一部の実施形態において、本発明の方法は、がんに罹患する患者の生存期間を予測することに特に適する。本発明の方法は、がん患者の全生存期間（ＯＳ）、無増悪生存期間（ＰＦＳ）、及び／又は無病生存期間（ＤＦＳ）を予測することに特に適する。当業者は、ＯＳ生存期間が一般に、ある種類のがんを特定の期間乗り切った人のパーセンテージに基づき、該パーセンテージとして表されるということを理解する。がんの統計は多くの場合、全５年生存率を使用する。一般に、ＯＳ率は、がんサバイバーが５年で依然として処置を受けているかどうか、又はがんサバイバーが無がん状態となった（寛解に至った）かどうかを特定しない。ＤＳＦは、より具体的な情報を提供するものであり、寛解に至った、特定のがんを有する人の数である。また、無増悪生存（ＰＦＳ）率（依然としてがんを有するが、その疾患が進行していない人の数）には、処置にある程度成功している可能性があるが、がんが完全に消失していない人が含まれる。本明細書において使用するように、「短い生存期間」という表現は、患者が、上述のがんに罹患している患者の母集団において観察される中央値（又は平均）よりも短い生存期間を有することを示す。患者が短い生存期間を有する場合、患者が「不良な予後」を有することを意味する。反対に、「長い生存期間」という表現は、上述のがんに罹患している患者の母集団において観察される中央値（又は平均）よりも長い生存期間を有することを示す。患者が長い生存期間を有する場合、患者が「良好な予後」を有することを意味する。

【0059】

本明細書において使用するように、「がん」という用語は当該技術分野におけるその一般的な意味を有し、身体の他の部分に浸潤する又は広がる可能性を有する、異常な細胞増殖に関与する疾患群を指す。「がん」という用語は、原発性及び転移性がんの両方をさらに含む。本発明の方法及び組成物によって処置され得るがんの例は、循環腫瘍細胞や、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸管、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、又は子宮からのがん細胞を含むが、これらに限定されない。加えて、がんは、具体的には以下の組織型であってもよいが、これらに限定されない：悪性新生物；がん腫；未分化がん；巨細胞及び紡錘細胞がん；小細胞がん；乳頭がん；扁平上皮がん；リンパ上皮がん；基底細胞がん；石灰化上皮がん；移行上皮がん；乳頭状移行上皮がん；腺がん；悪性ガストリノーマ；胆管がん；肝細胞がん；肝細胞がんと胆管がんの混合型；索状腺がん；腺様嚢胞がん；腺腫性ポリープ中の腺がん；家族性大腸ポリポーシス腺がん；固形がん；悪性カルチノイド腫瘍；細気管支肺胞腺がん（ｂｒａｎｃｈｉｏｌｏ－ａｌｖｅｏｌａｒ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）；乳頭腺がん；色素嫌性がん；好酸球がん；好酸性腺がん；好塩基球がん；明細胞腺がん；顆粒細胞がん；濾胞腺がん；乳頭及び濾胞腺がん；非被包性硬化性がん；副腎皮質がん；類内膜がん（ｅｎｄｏｍｅｔｒｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）；皮膚付属器がん；アポクリン腺がん；皮脂腺がん；耳垢腺がん；粘液性類表皮がん；嚢胞腺がん；乳頭状嚢胞腺がん；乳頭状漿液性嚢胞腺がん；粘液性嚢胞腺がん；粘液腺がん；印環細胞がん；浸潤性導管がん；髄様がん；小葉がん；炎症性がん；乳房パジェット病；腺房細胞がん；腺扁平上皮がん；扁平上皮化生を伴う腺がん；悪性胸腺腫；悪性卵巣間質腫瘍；悪性莢膜腫瘍；悪性顆粒膜細胞腫；悪性神経芽細胞腫（ｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）；セルトリ細胞がん；悪性ライディッヒ細胞腫；悪性脂質細胞腫；悪性傍神経節腫；悪性乳房外傍神経節腫；褐色細胞腫；グロムス血管肉腫；悪性メラノーマ；無色素性メラノーマ；表在拡大型メラノーマ；巨大色素性母斑中の悪性メラノーマ；類上皮細胞メラノーマ；悪性青色母斑；肉腫；線維肉腫；悪性線維性組織球腫；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質肉腫；悪性混合腫瘍；ミュラー管混合腫瘍；腎芽腫；肝芽腫；がん肉腫；悪性間葉腫；悪性ブレンナー腫瘍；悪性葉状腫瘍；滑膜肉腫；悪性中皮腫；未分化胚細胞腫；胚性がん；悪性奇形腫；悪性卵巣甲状腺種；絨毛がん；悪性中腎腫；血管肉腫；悪性血管内皮腫；カポジ肉腫；悪性血管外皮腫；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；悪性軟骨芽細胞腫；間葉性軟骨肉腫；骨巨細胞腫；ユーイング肉腫；悪性歯原性腫瘍；エナメル上皮肉腫；悪性エナメル上皮腫；エナメル上皮線維肉腫；悪性松果体腫；脊索腫；悪性神経膠腫；上衣腫；星状細胞腫；原形質性星状細胞腫；線維性星状細胞腫；星状芽細胞腫；膠芽腫；乏突起膠腫；乏突起膠芽腫；原始神経外胚葉腫瘍（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｎｅｕｒｏｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ）；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽細胞腫；網膜芽細胞腫；嗅神経原性腫瘍；悪性髄膜腫；神経線維肉腫；悪性神経鞘腫；悪性顆粒細胞腫；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキンリンパ腫；側肉芽腫；悪性小リンパ球性リンパ腫；悪性びまん性大細胞型リンパ腫；悪性濾胞性リンパ腫；菌状息肉腫；その他の特定されている非ホジキンリンパ腫；悪性組織球増殖症；多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞性白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞性白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞性白血病；巨核芽球性白血病；骨髄性肉腫；及び有毛細胞白血病。

【0060】

近年、循環腫瘍細胞の代謝状態が、転移を生じる又は潜伏状態に留まるという能力を決定するということが示されている。

【0061】

したがって、一部の実施形態において、本発明の方法は、がんに罹患する対象が転移を発症し得るかどうかを予測することに特に適する。

【0062】

本明細書において使用するように、「転移」又は「転移性がん」という用語は当該技術分野において周知であり、別の器官におけるがんの広がりを指す。転移性腫瘍は、原発腫瘍の転移によって原発病変から離れた位置に形成される。これは、がん治療において最も重大な懸念の１つである。具体的に、原発病変を処置したとしても、患者は別の器官に転移した腫瘍の増殖のため亡くなることがある。

【0063】

一部の実施形態において、本発明の方法は、がんに罹患する対象が治療の対象となり得るかどうかを予測することに特に適する。

【0064】

言い換えると、本発明の方法は、がんに罹患する対象の治療応答性を予測することに特に適する。

【0065】

例えば、治療は化学療法である。本明細書において使用するように、「化学療法」という用語は当該技術分野におけるその一般的な意味を有し、化学療法剤を患者に投与することに基づく処置を指す。化学療法剤の例としては、アルキル化剤、例えばチオテパ及びシクロホスファミド；アルキルスルホネート、例えばブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン；アジリジン、例えばベンゾドーパ、カルボクオン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、及びウレドパ（ｕｒｅｄｏｐａ）；エチレンイミン及びメチルメラミン、例えばアルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド及びトリメチロールメラミン；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ－１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体のＫＷ－２１８９及びＣＢ１－ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン：スポンギスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、シクロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノボエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソ尿素、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチン；抗生物質、例えばエンジイン抗生物質（例えばカリケアマイシン、特にカリケアマイシンγｌｌ及びカリケアマイシンωｌｌ；ダイネミシンＡを含むダイネミシン、；クロドロネートなどのビスホスホネート；エスペラミシン；並びに、ネオカルジノスタチンクロモフォア及び関連色素タンパク質エンジイン抗生物質クロモフォア）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルチノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ－ドキソルビシ、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、２－ピロリノ－ドキソルビシ、及びデオキシドキソルビシを含む）、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗剤、例えばメトトレキサート及び５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）；葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリン類似体、例えばフルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；アンドロゲン、例えばカルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎皮質剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充剤、例えばフォリン酸；アセグラトン；アルドホスファミド配糖体；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジクオン；エフロルニチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；マイタンシノイド、例えばマイタンシン及びアンサマイトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサンントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖複合体；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲンナニウム（ｓｐｉｒｏｇｅｎｎａｎｉｕｍ）；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ－２毒素、ベルカリンＡ、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；デカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル及びドセタキセル；クロラムブシル；ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金配位化合物、例えばシスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（例えばＣＰＴ－１１）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えばレチノイン酸；カペシタビン；並びに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸又は誘導体を含むが、これらに限定されない。

【0066】

一部の実施形態において、本発明の方法は、治療効果の予測及び予後予測に特に適する。

【0067】

一部の実施形態において、治療は免疫療法である。本明細書において使用するように、「免疫療法」という用語は、免疫応答に基づく疾患の治療を指す。一部の実施形態において、免疫療法は、チェックポイント阻害剤、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）及び適応細胞療法からなる群より選択される。「ＣＡＲ Ｔ細胞療法」という用語は、キメラ抗原受容体を発現するＴリンパ球を使用することに基づく療法を指す。一部の実施形態において、免疫療法は免疫チェックポイント阻害剤の使用に関与する。「免疫チェックポイント阻害剤」という用語は、本明細書において使用するように、免疫応答の減弱化に関与する分子の活性を遮断する物質を指す。免疫チェックポイント阻害剤の例は、ＰＤ－１拮抗剤、ＰＤ－Ｌ１拮抗剤、ＰＤ－Ｌ２拮抗剤、ＣＴＬＡ－４拮抗剤、ＶＩＳＴＡ拮抗剤，ＴＩＭ－３拮抗剤、ＬＡＧ－３拮抗剤、ＩＤＯ拮抗剤、ＫＩＲ２Ｄ拮抗剤、Ａ２ＡＲ拮抗剤、Ｂ７－Ｈ３拮抗剤、Ｂ７－Ｈ４拮抗剤、及びＢＴＬＡ拮抗剤を含む。「二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー」（ＢｉＴＥ）という用語は、抗がん剤としての使用が検討される人工二重特異性モノクローナル抗体からなる治療を指す。ＢｉＴＥは、がん細胞に対する、宿主の免疫系、より具体的にはＴ細胞の細胞傷害性活性を標的とする。ＢｉＴＥは、Ｔ細胞と腫瘍細胞との結合を形成するものであり、臨床試験において試験されている。

【0068】

本明細書において使用するように、「予測する」という用語は、患者が免疫療法又は化学療法剤による処置に応答する蓋然性又は可能性を指す。本明細書において使用するように、「応答性」という用語は、処置が臨床において有効である又は有効でないという可能性を評価する能力を指す。

【0069】

本発明のさらなる目的は、本発明の方法を行うためのキット又は試薬に関する。対象の試薬及びそのキットは非常に多様であり得る。しかしながら、本発明のキットは、阻害剤［Ａ］及び［Ｂ］、並びにピューロマイシン及びピューロマイシンに特異的なモノクローナル抗体を含む。本発明のキットは、阻害剤［Ｃ］及び［Ｄ］をさらに含むことができる。一部の実施形態において、本発明のキットは、所定量のピルベート及び／又はアセテートを含むことができる。一部の実施形態において、本発明のキットは、細胞選別のための抗体群など種々の方法に使用される試薬を含む。また、キットは種々のバッファー培地を含むことができる。キットは、代謝プロファイル（すなわち様々な依存度）の評価に適する様々な式（Ｉ～ＶＩ）を計算するためのソフトウェアパッケージをさらに含むことができる。上述の構成要素に加えて、対象のキットは、対象の方法を行うための指示書をさらに含み得る。この指示書は、多様な形態で対象のキット内に含むことができ、その１つ以上がキット内に含まれ得る。この指示書が含まれ得る一形態は、適切な媒体又基材における印刷情報としてであり、例えば、キットのパッケージ内、添付文書等における、情報が印刷された紙とする。さらに別の手段は、情報が記録されたコンピューター可読媒体であり得る。含まれ得るさらに別の手段は、削除したサイトにおける情報にアクセスするためインターネットを介して使用することができるウェブサイトアドレスである。任意の簡便な手段をキットに含ませることができる。上述の分析方法は、本発明の様々な態様を実施するため、コンピューターによって実行可能な指示のプログラムとして実現することができる。上述の技術のいずれも、コンピューター又は他の情報機器又はデジタル装置にロードしたソフトウェアコンポーネントによって実施することができる。そのように可能になると、コンピューター、機器、又は装置は、上述のように複数の遺伝子に関連する一式の値の分析を支援するため、又はそうした関連する値を比較するため、上述の技術を実施することができる。ソフトウェアコンポーネントは、固定媒体からロードされる、又はインターネット若しくは他の種類のコンピューターネットワークなどの通信媒体を通してアクセスすることができる。上述の機能は、１つ以上のコンピュータープログラムで実現され、そうしたプログラムを走らせる１つ以上のコンピューターによって実施することができる。ソフトウェア製品（又はコンポーネント）は、機械読み取り可能な媒体において具体的に実現され、１つ以上のデータプロセッシング装置に上述のような様々な計算を行わせるように操作可能な指示を含むことができる。また、コンピューターは、任意の適切な表示（例えば図表、ヒストグラム）によって結果を示すことができる。また、本明細書において、機械読み取り可能な媒体において具体的に実現され、１つ以上のデータプロセッシング装置に、多数の配列表示の配列データを保存することを含む操作を実施させるように操作可能な指示を含むソフトウェア製品（又はコンポーネント）を提供する。一部の例において、ソフトウェア製品（又はコンポーネント）は、配列データをＶ、Ｄ、Ｊ、Ｃ、ＶＪ、ＶＤＪ、ＶＪＣ、ＶＤＪＣ、若しくはＶＪ／ＶＤＪ系統使用分類に割り当てる指示、又は多次元プロットで分析出力を表示する指示を含む。一部の場合において、多次元プロットは、Ｖ、Ｄ、Ｊ、又はＣのうちの１つのためのすべての可能な値を示す（例えば、すべての可能なＶ値を示す１軸、すべての可能なＤ値を示す第２軸、及びすべての可能なＪ値を示す第３軸を含む３次元プロット）。一部の場合において、ソフトウェア製品（又はコンポーネント）は、ある状態に相関した単一のサンプルからの１つ以上の特有のパターンを特定する指示を含む。また、ソフトウェア製品（又はコンポーネント）は、増幅バイアスをノーマライズする指示を含むことができる。一部の例において、ソフトウェア製品（又はコンポーネント）は、シーケンシングの誤りをノーマライズするためコントロールデータを使用する、又はシーケンシングの誤りを少なくするためクラスター処理を使用する指示を含むことができる。また、ソフトウェア製品（又はコンポーネント）は、シーケンシングの誤りを少なくするため、２つの別のプライマーセット又はＰＣＲフィルターを使用する指示を含むことができる。

【0070】

本発明を以下の図面及び実施例によってさらに記載する。しかしながら、これらの実施例及び図面は、本発明の範囲を限定するとしていかようにも解釈されるべきでない。

【実施例】

【0071】

［材料及び方法］
細胞及び細胞培養
ＷＴのＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｊａｃｋｓｏｎ）又はＰＥＲＫ ＫＯ のＣ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドマウス（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２）のマウス脾細胞を、５％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）及び５０μＭの２－メルカプトエタノール（マウス細胞培地、ＭＣＣＭ）を含むＤＭＥＭ中で、５％ＣＯ２において３７℃で培養した。ＧＭ－ＣＳＦ ＢＭ由来樹状細胞（ＧＭ－ｂｍＤＣ）を、Ｊ５５８Ｌ細胞によって作製した、ＧＭ－ＣＳＦを使用して、６～８週齢のオスのマウスの骨髄からインビトロで分化させた。骨髄前駆体を、０．８×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、６ウェルプレートにおいて５ｍｌ／ｗｅｌｌでプレーティングし、ＲＰＭＩ（ＧＩＢＣＯ）、５％ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、２０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、５０μＭのβ－メルカプトエタノール（ＶＷＲ）、及びＧＭ－ＣＳＦとともに培養した。培地を２日毎に交換し、ＢＭ由来ＤＣを６日目に実験に使用した。同様に、ＦＬＴ３ＬのＢＭ由来樹状細胞（ＦＬＴ３Ｌ－ｂｍＤＣ）を、ＲＰＭＩ、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）及び５０μＭの２－メルカプトエタノール（マウス細胞培地、ＭＣＣＭ）にＦＬＴ３Ｌを加えることで、６日間、５％ＣＯ２において３７℃で分化させた。脾細胞を得るため、８週齢の野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを頸椎脱臼によって絶命させ、脾臓摘出した。脾臓からのシングルセル懸濁液を作製して、上述のようにＭＣＣＭで培養した。健康なドナーの血液から濃縮した単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ－ｐａｑｕｅ ｐｌｕｓ（ＰＢＬ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で処理した。ＰＢＭＣ及び全血を、所定の時間、なし（無刺激）又はありで培養した。０．１μｇ／ｍｌの一級リポポリサッカライド（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ ＬＰＳ，Ｃａｔ．ｔｌｒｌ－３ｐｅｌｐｓ）、１０μｇ／ｍｌのポリＩ：Ｃ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ｔｌｒｌ－ｐｉｃ）、ＣｐＧ－Ａ ＯＤＮ ２２１６（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ｔｌｒｌ－２２１６）又はＰＭＡ（５ｎｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．ｎｏ．Ｐ－８１３９）及びイオノマイシン（５００ｎｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ，ｃａｔ．ｎｏ．Ｉ－０６３４）なし（コントロール）又はありで、Ｔ細胞刺激には一晩、及び樹状細胞には４時間、免疫細胞刺激を行った。

【0072】

ＡＴＰ測定
２０×１０４のＭＥＦを、不透明な９６ウェルプレート内の１００μｌの５％ＦＣＳ ＤＭＥＭ培地ＯＮに播種した。細胞を、図に示す時間で阻害剤と共にインキュベートした。その後、１００μｌのＣｅｌｌ ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ ｌｕｍｉｎｉｓｃｅｎｃｅ ＡＴＰ再構成バッファー及び基質（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ７５７０）を各ウェルに加え、製造者の指示に従って１０分後に発光を測定した。同じキットを使用し、製造者の指示に従って、ＡＴＰの検量線を作成した。

【0073】

代謝インフラックス分析（Ｓｅａｈｏｒｓｅ（登録商標））
ＸＦ２４細胞外フラックスアナライザー（Ｓｅａｈｏｒｓｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって、ＯＣＲ及びＥＣＡＲを測定した。αＣＤ３／αＣＤ２８ビーズあり又はなしの４.１０５細胞を、ＸＦ培地（２．５ｍＭのグルコース、２ｍＭのＬ－グルタミン、及び１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含む無バッファーダルベッコ改変イーグル培地）にトリプリケートで配置し、基本条件下、及び１０ｍＭのグルコース、１μＭのオリゴマイシン、１００ｍＭの２－デオキシ－グルコースに対して、２５分モニタリングした。オリゴマイシン添加後及びグルコース添加前のＥＣＡＲレベルの差によって、解糖能力を測定した。ＯＣＲ、ＥＣＡＲ、及びＳＲＣパラメーターを分析し、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｓｅａｈｏｒｓｅ Ｗａｖｅデスクトップソフトウエアから抽出した。オリゴマイシン添加後及びグルコース添加前のＥＣＡＲレベルの差によって、解糖能力を得た。

【0074】

ＺＥＮＩＴＨ
細胞を、１～１０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌで、４８ウェルプレートにおいて０.５ｍｌ／ｗｅｌｌでプレーティングした。すべての条件において、実験をデュプリケートで行った。ヒト細胞の分化、活性化、又は採取の後、コントロール、２－デオキシグルコース（２－ＤＧ、最終濃度１００ｍＭ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｄ６１３４－５Ｇ）、オリゴマイシン（Ｏｌｉｇｏ、最終濃度１μＭ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃａｔ．Ｎｏ．７５３５１）、ＢＰＴＥＳ（最終濃度１μＭ； Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＭＬ０６０１）、トリメタジジン（ＴＭＺ、最終濃度１μＭ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃａｔ．Ｎｏ．６５３３２２）、又は前述の最終濃度のこれら薬剤の組合せで、ウェルを４５分間処理した。ネガティブコントロールとして、翻訳開始阻害剤のハリングトニンを、ピューロマイシンの添加の１５分前に加えた（ハリングトニン、２μｇ／ｍｌ、Ａｂｃａｍ、ｃａｔ．ａｂ１４１９４１）。ピューロマイシン（Ｐｕｒｏ、最終濃度１０μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ７２５５）を、代謝阻害剤処理の最後の１５分間で添加した。ピューロ処理の後、細胞を冷ＰＢＳ中で洗浄し、蛍光色素細胞生存度マーカー及び様々な表面マーカーに対するコンジュゲート抗体の組合せで、ＰＢＳ、５％ＦＣＳ、２ｍＭのＥＤＴＡ（ＦＡＣＳ洗浄バッファー）中で４℃において３０分間染色した。ＦＡＣＳ洗浄バッファーで洗浄した後、製造者の指示に従ってＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．５５４７１４）を使用して、細胞を固定及び透過処理した。細胞を４℃で１時間インキュベートすることによって、Ｐｅｒｍｗａｓｈで希釈した、蛍光標識抗ピューロモノクローナル抗体を使用するピューロの細胞内染色を行った（１：１０００，Ｃｌｏｎｅ １２Ｄ１０，Ｍｅｒｋ，Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．ＭＡＢＥ３４３）。

【0075】

フローサイトメトリー
ＢＤ ＬＳＲＩＩ及びＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ Ｘ－２０機器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してフローサイトメトリーを行い、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）及び／又はＣｙｔｏｂａｎｋによってデータを分析した。マウス脾細胞を染色するために使用した抗体は、抗ピューロＡＦ４８８（Ｍｅｒｋ，Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．ＭＡＢＥ３４３）又は抗ピューロクローンＲ４７４３Ｌ－Ｅ８、社内作製の、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７又はＡｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ ４８８にコンジュゲートしたラットＩｇＧ２Ａ、抗ホスホＳ６－ＰＥ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．＃５３１６）、抗Ｋｉ６７ ＰＥ－ｅＦｌｕｏｒ ６１０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．６１－５６９８－８２）、ＣＤ４－ＡＰＣ－ｅＦ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．４７－００４２－８２）、ＣＤ８－ＡＰＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．１７－００８１－８３）、ＣＤ８０－ＰｅｒｃＰＣｙ５．５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．１０４７２２）、抗Ｂ２２０－ＢＶ４２１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．１０３２５１）、抗－ＭＨＣ－ＩＩ－ＡＦ７００（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃ、Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．５６－５３２１－８２）、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標），Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．Ｌ３４９５７）であった。以下の抗ヒト抗原抗体を、ＺＥＮＩＴＨプロトコル適用の際、全血及びＰＢＭＣを染色するために使用した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－４８８ マウス抗ヒトＡｘｌ（Ｃｌｏｎｅ １０８７２４，Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＦＡＢ１５４Ｇ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－６４７ マウス抗ピューロマイシン（ｃｌｏｎｅ １２Ｄ１０，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＭＡＢＥ３４３－ＡＦ６４７）、ＢＵＶ３９５ マウス抗ヒトＣＤ１１ｃ（Ｃｌｏｎｅ Ｂ－ｌｙ６，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．５６３７８７）、ＢＵＶ７３７ マウス抗ヒトＣＤ８６（Ｃｌｏｎｅ ＦＵＮ－１，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．５６４４２８）、ＢＶ５１０ マウス抗ヒトＣＤ１９（Ｃｌｏｎｅ ＨＩＢ１９，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．７４０１６４）、ＢＶ５１０ マウス抗ヒトＣＤ３（Ｃｌｏｎｅ ＨＩＴ３ａ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．５６４７１３）、ＢＶ５１０ マウス抗ヒトＣＤ５６（Ｃｌｏｎｅ Ｂ１５９，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．７４０１７１）、ＢＶ６０５ 抗ヒトＨＬＡ－ＤＲ（Ｃｌｏｎｅ Ｌ２４３，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＬＥ３０７６４０）、ＢＶ６５０ マウス抗ヒトＣＤ１６（Ｃｌｏｎｅ ３Ｇ８，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．５６３６９２）、ＢＶ７１１ マウス抗ヒトＣＤ１４（Ｃｌｏｎｅ Ｍ５Ｅ２，ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．７４０７７３）、ＢＶ７８５ マウス抗ヒトＣＤ４５ＲＡ（Ｃｌｏｎｅ ＨＩ１００，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＬＥ３０４１４０）、Ｌｉｖｅ Ｄｅａｄ Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｌ３４９５７）、ＰＥ ウサギ抗ホスホ－Ｓ６ リボソームタンパク質（Ｓｅｒ２３５／２３６）モノクローナル（Ｃｌｏｎｅ Ｄ５７．２．２Ｅ，Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｃａｔ．Ｎｏ．５３１６Ｓ）、ＰＥ ラット抗ヒトＣｌｅｃ９Ａ／ＣＤ３７０（Ｃｌｏｎｅ ３Ａ４，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．５６３４８８）、ＰＥ－Ｃｙ７ マウス抗ヒトＣＤ２２（Ｃｌｏｎｅ ＨＩＢ２２，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．５６３９４１）、ＡＦ４８８ マウス抗ヒトＣＤ３８（Ｃｌｏｎｅ ＨＩＴ－２，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＬＥ３０３５１２）。

【0076】

動物研究
野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ社から購入し、特定の無病原体条件においてＣＩＭＬの動物用施設で管理した。妊娠胎生期１２．５日（Ｅ１２．５）におけるＣ５７Ｂｌ／６の胚は、すべての器官及び脳を取り除いて、ＰＢＳ内のＬｉｂｅｒａｓｅ（登録商標）Ｔｍ（０．５ｍｇ／ｍｌ，Ｒｏｃｈｅ）、ＤＮａｓｅＩ（０．２ｍｇ／ｍｌ，Ｒｏｃｈｅ）中で、３７℃で１５分間、絶えずかく拌しながら、分離した。免疫染色及びフローサイトメトリー分析の前に、細胞懸濁液を、２％の熱不活性化ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、及び１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で洗浄した。

【0077】

この研究は、仏国農業省と欧州連合との実験動物の管理及び使用に関する指針における推奨事項に厳密に従って行った。生きているマウスに実験を行うため、動物を仏国農業省によって認可されたＣＩＭＬ動物用施設にて飼育した。すべての動物実験は、ブーシュ・デュ・ローヌの獣医学サービス部会によって承認された（承認番号Ａ１３－５４３）。動物の苦痛を極力少なくするようにすべての取り組みを行った。

【0078】

統計分析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアによって統計分析を行った。いくつかの条件を比較するとき、一元配置分散分析を行い、その後テューキーの範囲検定を行って、条件ペアにおける有意性を評価した。２つの条件のみを試験するとき、等分散性の仮説の妥当性に従って、スチューデントのｔ検定又はウェルチのｔ検定を行った（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００５）。

【0079】

［結果］
他の代謝分析技術に困難が見受けられることから、本発明の目的は３つの主な必須事項に対応する方法を開発することであった。（Ａ）エクスビボの豊富ではない細胞においてＥＭをプロファリングすること、（Ｂ）最小の操作時間、インキュベーション、及びサンプル調製費用に下げること、（Ｃ）シングルセル分解能によってＥＭプロファイルを得ること。ＥＭプロファイルの変化は、細胞がその異化作用を変化させることができる、様々なシグナリング経路の活性化、また遺伝子リプログラミングを必要とする。ＺＥＮＩＴＨはこの概念に基づき、細胞が分解グルコース、アミノ酸、又は脂肪から得るエネルギーの大部分がタンパク質合成機構に絶えず消費されるということを組み込んでいる（Ｂｕｔｔｇｅｒｅｉｔ ａｎｄ Ｂｒａｎｄ，１９９５；Ｌｉｎｄｑｖｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｓｃｈｉｍｍｅｌ，１９９３）。タンパク質合成強度がＡＴＰ消費を直接反映するということを概念化することで、様々なエネルギー産生経路の阻害の際に、シングルセルにおけるタンパク質合成活性をフローサイトメトリーによって迅速且つ効率的に測定する方法を設計した（図１）。図に示され、実験に使用される２つの阻害剤は、２－デオキシ－Ｄ－グルコース（２－ＤＧ、阻害剤Ａ）及びオリゴマイシンＡ（Ｏｌｉｇｏ、阻害剤Ｂ）である。グルコースは、ＡＴＰを生成するため、解糖のみ（図１Ｂ）又は解糖とその後の酸化的リン酸化（ＧｌｙｃＯｘＰｈｏｓ）の２とおりで使用することができる。図１Ｂに示すように、阻害剤Ａの存在により、グルコース分解からのＡＴＰ／ＧＴＰ生成を遮断し、細胞が脂肪酸の酸化（ＦＡＯ）又はアミノ酸の酸化（すなわちＧｌｎｌｙｓｉｓ）由来のアセチル－ＣｏＡからのみＡＴＰ／ＧＴＰを生成することを可能にする。一方で、阻害剤Ｂは、ミトコンドリア呼吸（ＯｘＰｈｏｓ）からのＡＴＰ生成を妨げ、またＴＣＡ回路の阻害をもたらし、最終的にアセチル－ＣｏＡ、ＦＡＯ，及びＧｌｎｌｙｓｉｓからのエネルギー産生を阻害するので、細胞は、解糖を行うことによってのみタンパク質合成を持続させるためＡＴＰを生成することができる。解糖性ＥＭプロファイルを有する細胞は、ＡＴＰをＧＴＰに迅速に交換するとともに、ミトコンドリア呼吸が阻害されるとき翻訳を持続させることができる、ヌクレオシド二リン酸キナーゼ活性（ＮＤＰＫ／ＮＭＥ）を有する一式の酵素を発現する。一方で、呼吸性ＥＭプロファイルを有し、解糖に強制的に切り替えられる（すなわちミトコンドリア呼吸を遮断することによって）細胞は、生存するためＡＴＰを生成する可能性があり得るが、ＧＴＰの生成に対応せず、効率的にタンパク質合成を持続しない。

【0080】

従来、タンパク質合成速度の測定は、放射性アミノ酸の使用を必要とするものであった。ピューロマイシン（ｐｕｒｏ）は、そのｔＲＮＡーＡＡ擬態分子構造により、リボソームによるｍＲＮＡ翻訳のプロセス時に新生ポリペプチド鎖に非常に効率的に取り込まれる抗生剤である。これまでに、蛍光性モノクローナル抗体抗ピューロマイシンを開発して特許権利化し、抗ピューロマイシン染色レベルが、タンパク質合成レベルの非常に精度の良い尺度となることを示した（Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，２００９）、仏国特許第０８５６４９９号）。ＺＥＮＩＴＨの際のピューロマイシン細胞内検出におけるシグナル対ノイズ比をさらに最適化するため、特に細胞内フローサイトメトリーに適応した新たなモノクローナル抗ピューロマイシン抗体をスクリーニングし、開発した（データは示さず）。各細胞の代謝プロファイルは、様々な種類のシングルセルの特定を可能にするとともに、マルチパラメーターフローサイトメトリーの使用によってタンパク質合成レベルをモニタリングするため蛍光色素抗ピューロモノクローナル抗体に直接結合する、モノクローナル抗体群の組合せによって得られる。各阻害剤の作用機序、ＥＭ経路と全体的なタンパク質合成強度との直接の相互作用を考慮して、様々な測定から得た結果を各細胞サブセットの代謝プロファイルを示す簡単なグラフに取り込むために数式を適用する（図１Ｃ）。阻害剤による処理の際に所定の細胞がその代謝を補填し変化させる能力は、この方法の欠点として誤解され得る。ＺＥＮＩＴＨは、ミトコンドリア呼吸が阻害されたときの細胞の解糖能力、及び２－ＤＧの存在下におけるグルコース依存度を測定する。また、ＴＭＺ（ＦＡＯ阻害剤）及びＢＰＴＥＳ（グルタミノリシス阻害剤）の存在下において、ＦＡＯ及びＧｌｎｌｙｓｉｓ依存度を計算可能である。さらに、任意の供給源への低依存性は、ＥＭ適応度が大きい細胞を特定するために使用することができる。言い換えると、個別の阻害剤の作用の合計と比較して、いくつかの経路の阻害剤の存在下における相乗度を定量化する。この測定は、より適応性があり、迅速に適応可能なＥＭ代謝を有する細胞を特定することを可能にし、これは情報価値があるとともに所定の細胞にのみ観察された。

【0081】

ＡＴＰレベルの変化はタンパク質合成活性と密に相関する。
この方法論は、総ＡＴＰレベルとフローサイトメトリーによって測定されるタンパク質合成とを相関させることによって検証した。非形質転換のマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を使用して、様々なエネルギー経路を阻害するとき（Ｏｌｉｇｏ＋２－ＤＧ）、翻訳又は転写阻害（それぞれシクロヘキシミド／ＣＨＸ、又はアクチノマイシンＤ／ＡｃｔＤによって）がＡＴＰレベルに影響するかどうかを試験した。図２Ａに示すように、ＣＨＸを添加したときにのみ、ＡＴＰプールがＯｌｉｇｏ＋２－ＤＧ処理（Ｃｏ）と比べて有意に大きいと分かった（図２Ａ）。この結果は、翻訳が転写と比べてより高いエネルギーコストを有するので、細胞の代謝状態におけるより感受性の高いマーカーとなるということを示す以前の結果に沿うものである。その後、同様のパターンを示すかどうかを判定するために、ＡＴＰ合成の遮断の際、ＡＴＰレベルとタンパク質合成レベルとが時間の関数としてどのように変化するかを試験した。ＭＥＦをＯｌｉｇｏ＋２－ＤＧと共に様々な時間インキュベートし、ＡＴＰレベルをＣｅｌｌ ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏを使用して発光によって定量化し（図２Ｂ）、ピューロマイシン取り込み後のタンパク質合成をフローサイトメトリーによって定量化した（図２Ｃ）。ＡＴＰレベルと総タンパク質合成レベルとの間に統計的に有意な相関性を観察した（図２Ｄ、ピアソン ｒ＝０．９８５，Ｒ^２＝０．９７０３，ｐ＜０．０００１）。これらの結果は、細胞内のＡＴＰレベル及びタンパク質合成活性レベルの変動が直接相関し得、翻訳強度が、ＡＴＰ利用可能度及び合成の変動をモニタリングしてＥＭプロファイリングを行うために表示として使用可能であるということを示す。

【0082】

代謝阻害剤に対応するタンパク質合成レベルはバルクＡＴＰレベルよりもＥＭ活性をより良好に表す。
ヒト及びマウスの胚性線維芽細胞は、高酸素消費速度（ＯＣＲ）及び低細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）を表すことが示されている（Ｓｕｇａｎｙａ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。この重要なＯＣＲ／ＥＣＡＲ比率は、低解糖活性に対して高ミトコンドリア活性を有する非形質転換細胞に特有である（Ｓｕｇａｎｙａ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。結果として、ＭＥＦは、高密度で培養したときでもその培地を酸性化することはない。また、この表現型は、休止Ｔ細胞においても観察されるが、Ｔ細胞がＡＰＣによって活性化されて、解糖に急速に切り替わると急速に失われる（ＭａｃＩｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。

【0083】

これらの観察と、線維芽細胞及びＴ細胞における高ミトコンドリア依存度とに基づき、ＡＴＰレベル（バルクＡＴＰレベル）の定量化によって得たＥＭプロファイルを、フローによるタンパク質合成の定量化によって得たプロファイルと比較した。ＡＴＰによるＥＭプロファイルの計算に使用する式をこのように展開する。

【数1】

【数2】

【数3】

【数4】

【0084】

ＭＥＦにおいて、ＡＴＰレベルを使用することによって計算される最大解糖能力（図３Ａ）はほぼ１００％であり、最大ＦＡＯ及びＧｌｎｌｙｓｉｓ能力より有意に高い（図３Ｂ、ｐ＜０．００１、凡例）。動態研究を行うことによって、オリゴマイシンの存在下において変化しなかったＡＴＰレベルによって例示されるように（図３Ａ及び図３Ｂ）、阻害剤による処理後の様々な時間で計算しても、総ＥＭプロファイルが変化しないことを観察できた（図３Ｃ）。この結果は、ＭＥＦなどの極めて呼吸性である細胞において、代謝阻害剤での処理後の全体的なＡＴＰレベルが、エネルギーミトコンドリア依存度を反映できないことを示す。呼吸におけるオリゴマイシン阻害は、２－ＤＧ＋Ｏｌｉｇｏも細胞に添加したときにのみ観察できた。この結果は、推定される補填機序の誘導のため、様々なエネルギー産生経路の阻害の際のＡＴＰレベルの測定より、正確な細胞のＥＭプロファイルを得られないということを証明した。一方で、同じＭＥＦをプロファイリングするためＺＥＮＩＴＨを使用すると、完全に異なるが整合性のある様相が生じた（図３Ｄ、図３Ｅ、及び図３Ｆ）。ＺＥＮＩＴＨは、ＭＥＦがグルコース依存度よりも高いミトコンドリア依存度を有し、また解糖能力よりも高いＦＡＯ及びＧｌｎｌｙｓｉｓ能力を有すること（図３Ｅ、ｐ＜０，０５、凡例）を明らかにし、以前に公表した、この細胞のＥＭにおける観察結果を裏付けた（Ｓｕｇａｎｙａ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＺＥＮＩＴＨの有効性をさらに示すため、ＰＭＡ／イオノマイシンで６時間活性化した又は活性化していないマウスの脾臓細胞（ｎ＝５ｌ）及びＣＤ８＋Ｔ細胞を分析した。ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化は、ＥＭプロファイルを大幅に切り替え、代謝活性を増加させ、呼吸から好気的解糖に切り替えた（ＭａｃＩｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。休止脾臓ＣＤ８Ｔ細胞は、その活性化対応物よりも有意に低い代謝活性を示した（図３Ｇ、ｐ＜０．０００１）。非活性化から活性化ＣＤ８Ｔ細胞への移行ＥＭプロファイルの決定により、ミトコンドリアエネルギー依存度における大きな低下（５５％から１５％未満に、図３Ｈ、ｐ＜０．０００１）、及びほぼ９０％に達する、解糖能力の増加（図３Ｈ、ｐ＜０．０００１）を示した。これらの結果は、血液から単離し、作動剤の抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体でコーティングしたビーズで活性化した後のヒトセントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞において裏付けられた（図３Ｉ）。全体で、これらの結果は、ＺＥＮＩＴＨが、代謝阻害剤に暴露したシングルセルにおけるタンパク質合成の分析によって、不均一な集団に存在する個々の細胞におけるＥＭ経路活性のそれぞれの寄与を正確に測定するということを示す。

【0085】

２－ＤＧに短時間暴露した際のタンパク質合成阻害はＥＲストレス誘発に起因しない。
細胞を２－ＤＧで数時間処理することにより、グリコシル化における異常及び少し前に翻訳したタンパク質のフォールディングに起因する小胞体（ＥＲ）ストレスを誘発可能であることがこれまでに示されている（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｍａｒｑｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＥＲストレスは、翻訳開始のドミナントネガティブ阻害剤として作用する真核生物翻訳開始因子２（ｅＩＦ２α）のαサブユニットをリン酸化するキナーゼであるＰＥＲＫの活性化を誘導する。２－ＤＧ処理の際、ＥＲストレスがタンパク質合成に干渉するかどうかを特定するため、すべてのＤＣサブセットにおいてＰＥＲＫを欠失させたＣＤ１１ｃ－ＣＲＥ ＰＥＲＫｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスを利用した（ＣＤ１１ｃ＋細胞、データを示さず）。Ｆｌｔ３Ｌによる骨髄前駆体由来の、ＷＴのＰＥＲＫｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ（コントロール）ＤＣ及びＣＤ１１ｃ－ＣＲＥ ＰＥＲＫｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ（ＰＥＲＫ ＫＯ）ＤＣの両方において、２－ＤＧ作用を比較した。その遺伝的背景に関わらず、様々なＤＣサブセットは、２－ＤＧに対応してタンパク質合成を減少させるという同じ能力を有し、同じＥＭ特性を示して、ＰＥＲＫがＺＥＮＩＴＨを行うために必要とされる短時間の２－ＤＧ処理の際に観察される翻訳の喪失に関連しないということを示唆する。

【0086】

インビトロ生成及びエクスビボのマウス樹状細胞の代謝プロファイル
マウスのＤＣの代謝についての大部分の研究は、大量のこの細胞が得られる骨髄のインビトロでの分化培養を使用して行われてきた。ＦＬＴ３Ｌ及びＧＭ－ＣＳＦに対応するＤＣ分化は、実施し得るフローに基づく選別又は磁気精製の前に、完全補充培地及びＦＣＳ中で少なくとも１週間の、造血前駆体のインビトロにおけるインキュベーションを必要とする。これらのプロセスの両方により、エクスビボの対応物との代謝変化及び主な差がもたらされ得る。実に適切なＤＣモデルとしてのＧＭ－ＣＳＦ ｂｍＤＣの有効性は、議論の対象となっているが（Ｇｕｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｍａｌｉｓｓｅｎ，２０１５；Ｈｅｌｆｔ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｈｅｌｆｔ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｌｕｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０１６）、大部分の代謝研究はこの系を使用して行われている（Ｅｖｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２； Ｋｅｌｌｙ ａｎｄ Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，２０１５；Ｗｏｌｆ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＧＭ－ＣＳＦ由来骨髄培養により、マクロファージ（ＧＭ－Ｍａｃ）、樹状細胞（ＧＭ ｂｍＤＣ）、及び未熟ＤＣの不均一な集団が生成される（Ｈｅｌｆｔ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｌｕｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。ＺＥＮＩＴＨのシングルセル分解能により、さらなる操作及び単離の必要なく、サンプルにおいて低比率で存在する細胞集団における代謝プロファイルの特性評価が可能になる。バルクの未熟ＧＭ－ＣＳＦ ｂｍＤＣが、以前の記載のように（Ｅｖｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２）、ＬＰＳで活性化した際、グルコースに高い依存度を示し、解糖能力の増加及び呼吸の減少へと切り替える（データは示さず）ということを確認した。ＬＰＳ処理の際、すべての細胞が厳密に同じ活性動態に従うわけではなく、これは、その不均一な成熟マーカーのレベルによって明らかにされる。一部が成熟表現型を既に示し始める一方、これらはまた、ミトコンドリア呼吸へのより高い依存度を示し始める（データは示さず、ＬＰＳ未熟 ＤＣ５％ ｖｓ成熟ＤＣ－Ａ ４５％，Ｐ＜０．００１）。興味深いことに、このデータは、未熟ＧＭ－ｂｍＤＣが極めて解糖性であるヒト血液単球と等しいＥＭプロファイルを有するということを示唆する以前の研究に沿うものである（データは示さず）（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｏｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９６３）。

【0087】

さらに、培養において、高レベルの表面ＭＨＣ－ＩＩ及びＣＤ８６によって特徴づけられる、定常状態の「成熟」ＤＣの分集団を特定でき（成熟ＤＣ－Ｂ、データは示さず）、これは、ＬＰＳ刺激後に特定の代謝プロファイルを示し、異なる代謝変化を行った（データは示さず）。この集団の由来及び機能は未だ明らかにされていないが、既存の技術を使用して特定できなかったであろうとされ、様々な細胞サブセットに対して公平に且つ同時にＥＭプロファイルを得るというＺＥＮＩＴＨの力をさらに明らかにするものであるしたがって、ＺＥＮＩＴＨは、研究サンプルにおいて豊富であることと無関係に、個々の細胞の代謝プロファイルにおけるクラスタリングに基づいて、機能性細胞集団の分類を可能にする。

【0088】

また、ＦＬＴ３Ｌ由来及びエクスビボの脾臓ＤＣのＥＭプロファイルも得た。ＧＭ－ＣＳＦ由来と対照的に、ＦＬＴ３Ｌ－ｂｍＤＣは、ＤＣ１（ＸＣＲ１＋ｃＤＣ）、ＤＣ２（ＳＩＲＰＡ＋ＣＤ１１ｂ＋ｃＤＣ）、及びＤＣ６（ＣＤ１２３＋ＳｉｇｌｅｃＨ＋ｐＤＣ）を含むいくつかのＤＣサブセットを含む（Ｍｅｒａｄ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＦＬＴ３Ｌ由来ｂｍＤＣを新たに単離した脾臓ＤＣと比較し、様々なＤＣサブセットでのＥＭプロファイルとその活性状態との相関を行った。ＦＬＴ３Ｌ ｂｍＤＣ及び脾臓ＤＣは、極めてミトコンドリア呼吸に依存的であり、定常状態条件においてはより低い解糖能力で、ＤＣ６／ｐＤＣが最も依存的である（データは示さず）。脾臓ＤＣにおいて、解糖へのＬＰＳ依存的スイッチは、ＤＣ１において部分的に観察されるのみであり、ＤＣ２にもＤＣ６にも観察されなかった。この状況は、ＦＬＴ３Ｌ－ｂｍＤＣでは逆であり、ＤＣ２はほぼ独占的に解糖を行う一方、ＤＣ６は影響されない。また、これらの結果は、ＬＰＳによって直接活性化されるという様々なＤＣサブセットの能力に依存し得、ＴＬＲ４は大部分がＤＣ２に発現される。全体で、これらの結果は、ＧＭ－ＣＳＦ及びＦＬＴ３Ｌ－ｂｍＤＣの代謝プロファイルが外植した脾臓ＤＣのＥＭプロファイルを完全に再現するわけではないということを示す。ＬＰＳ活性化の際、解糖へのスイッチが、試験におけるＤＣの由来に応じて様々な個々のサブセットにおいてあるが観察できた。それでも、マウスＤＣのＥＭプロファイルは、成熟ではなく免疫活性化レベルと強く相関し、炎症状態の代替マーカーに相当し得る。

【0089】

ＺＥＮＩＴＨは定常状態及び活性化Ｔ細胞のＳｅａｈｏｒｓｅＥＭプロファイルを再現する。
活性化の際のＴ細胞の好気的解糖への代謝スイッチは１９７０年代に最初に記載され、近年ではＳｅａｈｏｒｓｅ法を使用して確認された。本方法を評価するため、Ｓｅａｈｏｒｓｅ及びＺＥＮＩＴＨによって並行して、定常状態における又は活性化した際の、単離したバルクのヒト血液Ｔ細胞で観察されたＥＭの変動をモニタリングした。ＳｅａｈｏｒｓｅとＺＥＮＩＴＨの両方によって、活性化の際、Ｔ細胞の解糖能力の増加を観察した（データは示さず）。２つの方法で得た測定値は、良好に一致した（スピアマンの相関ｒ^２ ０．８５，Ｐ＜０．０１）（図６Ａ）。Ｓｅａｈｏｒｓｅにおいて、活性化の際のバルクＴ細胞における余剰呼吸能力の有意な低下を観察した（データは示さず）。興味深いことに、ＳｅａｈｏｒｓｅによるＯＣＲの増加は、より多いが、ＺＥＮＩＴＨによって測定した全体的なＰＳレベルの大きな増加と対応した（それぞれ図６Ｂ及び図６Ｃ）。全体として、Ｓｅａｈｏｒｓｅ及びＺＥＮＩＴＨによって得た活性化の際のＴ細胞のＥＭプロファイルはゆえに、極めて整合しており、細胞の全体的な代謝活性及び阻害剤に対応する変化に相関する翻訳レベル（図６Ｃ）は、Ｔ細胞活性化の際に生じる好気的解糖への代謝スイッチを裏付けた。しかしながら、ＺＥＮＩＴＨはＳｅａｈｏｒｓｅ測定に対して２つの主な利点を示した。第１に、ＺＥＮＩＴＨでの信号の大きさ及び測定値のずれが優れていた（図６Ｂ及び図６Ｃ）。第２に、ＺＥＮＩＴＨ分析は、１０倍少ないＴ細胞で行った（それぞれトリプリケートで１，２．１０^５ｖｓ１，２．１０^６細胞）。さらに、ＺＥＮＩＴＨは、分析おいてＴ細胞マーカーのフルＦＣＳスペクトルを取り込むことができ、ナイーブ、メモリー、及びエフェクターＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットを含む、バルクサンプルに存在する様々なＣＤ３＋Ｔ細胞分集団を並行して研究できる（図６）。

【0090】

ＺＥＮＩＴＨによる血液Ｔ細胞サブセットの代謝逆畳み込みにより、高解糖能力を恒常的に示すメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットを同定する。
Ｔ細胞分集団を逆畳み込みする能力を詳しく述べるため、次に、ＺＥＮＩＴＨを、これまでにシングルセル分析に使用できなかった混合集団に適用した。このため、すべてヒト全血調製物からのナイーブ及びメモリーＣＤ４＋又はＣＤ８＋細胞のサブセット分析を可能にするものである、ＣＤ４５ＲＡ、ＩＬ７ＲＡ（ＣＤ１２７）、ＣＣＲ７、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５７、ＰＤ１、パーフォリンの染色を利用した。これら９個のマーカーに対する抗体を適用することで、様々な存在量である、表現型が別個の６つのクラスター／分集団を生成した（データは示さず）。非活性化ナイーブＴ細胞（ＣＤ８又はＣＤ４）、並びにメモリー（ＥＭ及びＣＭ）ＣＤ４及び高分化ＣＤ８（ＨＤＥ）の代謝プロファイルは、その代謝活性に対して以前に報告されたことと一致して、中高程度のミトコンドリア依存度を示した（データは示さず）。一方で、ＣＤ８早期エフェクターメモリー（ＥＦＭ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞など（Ｔ細胞とともに精製され、細胞のわずか５％に相当する）のあまり豊富ではない細胞サブセットは、より高い解糖能力を示した。同様の代謝傾向が他の種及び調製物において観察されるかどうかを判定するため、休止及び活性化したマウスの脾臓Ｔ細胞及びヒト血液セントラルメモリーＣＤ４Ｔ細胞サブセットに、ＺＥＮＩＴＨを行った（データは示さず）。結果として、また、活性化の際のマウス及びヒトＴ細胞において、高解糖能力及び高グルコース依存度への極めて整合したスイッチを測定できた（データは示さず）。

【0091】

バルクＴ細胞分析時に、ナイーブ細胞は４２％に相当する（７８％のうちの大多数）ので、Ｓｅａｈｏｒｓｅによる未分離の集団において行ったＥＭモニタリングを主導すると考えられるということが留意される（図６Ｂ）。したがって、Ｓｅａｈｏｒｓｅ測定は、多少低い「平均」解糖速度／能力及び高い「平均」酸素消費速度を示している（データは示さず）。休止Ｔ細胞のＳｅａｈｏｒｓｅ分析は、ＺＥＮＩＴＨによって測定したナイーブＴ細胞の代謝に沿うものである（データは示さず）。しかしながら、Ｓｅａｈｏｒｓｅの結果は、細胞の５％以下に相当し（処理のそれぞれにおいて５００細胞に相当し、２０００細胞となる）、定常状態では高解糖能力を示した、ＣＤ８＋ＥＥＭの存在を完全に消してしまった。

【0092】

マルチパラメーターＺＥＮＩＴＨの分解力における他の重要な特徴は、その表現型とは無関係に、その代謝阻害剤に対する感受性に応じてシングルセル挙動に着目するという可能性である。これにより、まず機能的代謝の不均一性を特定し、その後表現型など、様々な細胞を決定することができる。この概念の証拠として、翻訳モニタリングの前にミトコンドリア呼吸を阻害するため、休止した精製Ｔ細胞をオリゴマイシンで処理した。結果として、翻訳レベルをプロットするヒストグラムは、１つが高レベルの翻訳、１つが低レベルの翻訳を有する２つのＴ細胞分集団を示した（データは示さず）。ミトコンドリア阻害の際に高レベルの翻訳を示した集団は「解糖性」とラベル付けし、翻訳を遮断した細胞は「ミトコンドリア依存性」とラベル付けした（データは示さず）。Ｔ－ＳＮＥに示すように、解糖性及び呼吸性のＴ細胞の表現型は、以前の結果を再現するものであり（データは示さず）、大部分がナイーブＴ細胞及びＮＫ細胞に存在するＣＤ４５ＲＡの発現が「ミトコンドリア依存性」と良好に相関する（データは示さず）ということを示した。つまり、ＺＥＮＩＴＨは、目的となる、既知の豊富ではない細胞サブセットのＥＭプロファイルの決定だけでなく、不均一なサンプル内に存在する興味深い代謝プロファイルを有する「未知の」細胞を選別及び同定することができるということを見いだした。

【0093】

ヒト腫瘍関連骨髄細胞の代謝状態のプロファイリング
免疫療法は腫瘍学において革新的であるが、一部の患者のみが腫瘍に対する完全な免疫媒介の拒絶を示す。処置に対する患者の応答に観察されるに差異により、腫瘍関連免疫細胞の機能状態（免疫プロファイリング）を理解することが強く求められるようになっている。したがって、ＺＥＮＩＴＨがヒト腫瘍サンプルにおける並行した表現型及び代謝プロファイリングに使用できるかどうか、及びこれが、多様な起源の腫瘍と比較して、とりわけ腫瘍のない近くの組織と腫瘍とを比較して、免疫細胞サブセットの不均一性ついて何を明らかにするかを試験した。したがって、健康なドナーのＰＭＢＣを使用し、同じ組織の２つのがんを使用し（外植髄膜腫、脳転移（乳がん由来））、腎癌腫瘍及び腎臓腫瘍近傍組織を比較して、ＺＥＮＩＴＨを行った。腎癌及び腫瘍近傍組織の場合、ＺＥＮＩＴＨ及びシングルセルＲＮＡシーケンシング分析の両方を同じサンプルに並行して行った。組織状況に注目する一方、結果のヒートマップにおいて、同じ免疫細胞が健康なドナーの血液にて同定されたときのＥＭプロファイルを含めた。

【0094】

髄膜腫における８つの異なる骨髄集団、及び腎癌における６つの異なるサブセットを観察して（データは示さず）、これらをすべてＺＥＮＩＴＨによってプロファイリングした（データは示さず）。ＥＭプロファイルに基づく様々な細胞サブセットのクラスタリングの際、「解糖性クラスター」と「呼吸性クラスター」との２つの群が生じた（データは示さず）。Ｍｏｎｏ１及び好中球は、試験したすべての血液サンプル及び腫瘍において解糖性代謝プロファイルを示した（データは示さず）。一方で、Ｍｏｎｏ２、ＤＣ１及びＤＣ２は、腎臓腫瘍及び腫瘍近傍組織から単離されるとき、比較的高い解糖能力を示す一方、これらのサブセットは２つの脳腫瘍において高呼吸性代謝プロファイルを示した。反対に、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は高ミトコンドリア依存度を示す一方、腫瘍近傍マクロファージは高解糖能力を示し（データは示さず）、腫瘍微小環境がＴＡＭのＥＭを変化させることを示唆する。腫瘍近傍マクロファージと比較したときのＴＡＭにおける解糖能力の低下は、これまで腫瘍環境における免疫抑制の増大、栄養学的キュー及び免疫学的キューの両方を介した腫瘍進行、並び患者の低生存性と関連付けられていた。これらの結果は、また、ＺＥＮＩＴＨの分析能力及び識別力を表し、腫瘍型に加えて、その解剖学的由来が免疫サブセットの代謝に影響を与え、腫瘍環境におけるさらなる不均一性の層を取り入れ得ることを示唆する。この感受性は、現在利用可能なバルク測定を使用しては認識されないだろう。

【0095】

腫瘍関連骨髄細胞におけるｓｃＲＮＡシーケンシング及び機能性エネルギー代謝プロファイルの結合
これらの結果は以前に観察されておらず、ＺＥＮＩＴＨ方法は新しいことから、シングルセルＲＮＡシーケンシングを使用して同じサンプルを並行して処理することによってこの発見を発展及び検証することも試みた。したがって、各集団において、ＺＥＮＩＴＨによって得た機能的ＥＭプロファイルとｍＲＮＡシーケンシングによって得た代謝遺伝子発現プロファイルとを比較することを狙いとした。これを行うため、まず、血液の様々な骨髄細胞における機能的代謝と相関する特定の解糖性及び呼吸性遺伝子シグネチャーを同定した（データは示さず）。そして、腫瘍の様々な骨髄集団においてこれらの解糖性及び呼吸性代謝遺伝子シグネチャーの発現（ｍＲＮＡレベル）を試験することを狙いとした。そのため、腎癌及びその腫瘍近傍組織から骨髄細胞（ＣＤ４５＋Ｌｉｎ－ＨＬＡ－ＤＲ＋）を選別し、ディープシーケンシングと組み合わせた１０×ＧｅｎｏｍｉｃｓのＣｈｒｏｍｉｕｍプラットフォームを使用してシングルセルＲＮＡシーケンシングを行った（データは示さず）。腫瘍の１２，８０１細胞及び腫瘍近傍組織の２，０８０細胞の分析により、それぞれ６個及び５個の高品質集団クラスターを生じた。骨髄集団を厳密に同定するため、これらの集団における特有のシグネチャーの発現を確認して、ｔＳＮＥ表示における細胞同定を行った。この処理により、Ｍｏｎｏ１、Ｍｏｎｏ２、及びＤＣのクラスターを同定できた（データは示さず）。フローサイトメトリーによってモニタリングし、腫瘍及び腫瘍近傍組織の両方に存在した５つの単球及びマクロファージ（ＭＡＦＢ及び／又はＣＳＦ１Ｒを発現するクラスター）に注目した（データは示さず）。従来のマーカーの発現（すなわち、ＦＣＧＲ３Ａ／ＣＤ１６及びＣＤ１４（データは示さず））を確認することによって、クラスター０及び１がＣＤ１４＋ＣＤ１６－の古典的単球に相当することを確認した。クラスター２は、ＣＤ１４－ＣＤ１６＋の非古典的単球に相当する（Ｍｏｎｏ２）一方、クラスター３及び４におけるＣＤ１４とＣＤ１６との共発現は、マクロファージ様表現型を示唆する。全体で、これらの結果は、腫瘍の微小環境が機能的に且つ転写レベルでマクロファージ代謝プロファイルを明確に変化させることを示す。したがって、シングルセルＲＮＡシーケンシング分析は、同定したすべての様々な骨髄細胞サブセットにおいてＺＥＮＩＴＨを行うことによって得られた結果を裏付けた（データは示さず）。さらに、ＦＡＣＳによるＺＥＮＩＴＨデータと強く一致して、単球クラスター（０、１、２）は腫瘍及び腫瘍近傍組織の両方において解糖性シグネチャーの濃縮を示した。しかしながら、なおＺＥＮＩＴＨ機能データと一致するが、マクロファージ（クラスター３）は、腫瘍において呼吸性シグネチャーの高発現を示す一方で、これは腫瘍近傍組織では検出されなかった（データは示さず。）単球で観察されるように、樹状細胞は腫瘍及び腫瘍近傍組織の両方において解糖シグネチャーの濃縮を示した（データは示さず）。さらに、ＺＥＮＩＴＨを行うことによって、ＰＭＢＣから選別した骨髄細胞において同定された機能的遺伝子シグネチャーを同定でき（データは示さず）、これは組織及び腫瘍から選別した骨髄細胞に拡張可能である。したがって、ＺＥＮＩＴＨプロファイリングとシングルセルＲＮＡシーケンシングとの組み合わせを、多様な細胞型及び組織のエネルギー代謝のプロファイリングに使用可能である。

【0096】

検討
ＺＥＮＩＴＨは、シングルセル分解能でフローサイトメトリーによって細胞のエネルギー代謝プロファイルを評価する新しい迅速な技術とされる。この簡単なプロファイリング方法により、エネルギー代謝測定とトランスクリプトームデータとを直接的に統合することができ、そして免疫細胞集団クラスタリング、免疫刺激活性の分析及びがん患者の免疫モニタリングを可能にするということを示した。ヒト血液単球及び好中球が定常状態において非常に強力なグルコース依存度及び解糖能力を示す一方、樹状細胞は低解糖能力及びより高いミトコンドリア呼吸活性を有するということを示すことができた。ＬＰＳ活性化の際、ＤＣサブセットには解糖への強力なスイッチが入り、樹状細胞が成熟するとミトコンドリア依存度の増加及び解糖能力の低下が観察される。

【0097】

全体で、血液細胞において観察した様々な解糖性ＥＭプロファイルは、血流と比較して十分に酸素を含んでいない末梢組織にアクセスする必要がある遊走性好中球、単球（Ｍｏｎｏ１）、及びｍｏＤＣなどの、機能的要求を反映し得る。ＥＭ活性は、機能的細胞分化も指示するとともに、細胞がエフェクター機能を示す組織に達する前に細胞において実行される遺伝子発現プログラムに、明らかに依存する。したがって、ＥＭプロファイリングは、患者又は器官の免疫状態を予測するために使用可能である。定常状態のヒト血液及び扁桃腺ＤＣ又は脾臓由来ＤＣは、極めて灌流性の二次リンパ組織に移動し、これはその高ミトコンドリア依存度に相関する状況である。二次リンパ器官に入ると、成熟ＤＣはナイーブ及びセントラルメモリーＴ細胞を活性化することができ、これらは血流とリンパ流との間で循環してその寿命の大部分を過ごす。本明細書において、ナイーブ及びセントラルメモリーＴ細胞が定常状態において高ミトコンドリア依存度（５０％を超える）及び低解糖能力（４５％未満）を示す一方、そのＥＭプロファイルは活性化の際著しく変化し、ミトコンドリア依存度の低下（２０％未満まで）及び解糖能力の増加（８０％を超えて）を示すということを確認した。Ｔ細胞がリンパ節で活性化されると、高解糖性エフェクターＴ細胞に増殖、分化して、炎症性後毛細管小静脈及び血管外遊出物を見つける能力を有しながら血液循環に再び入る。しかしながら、第１の代謝スイッチは、活性化の６時間後にすら起こり、ゆえに、脾臓などの二次リンパ器官においても、高解糖の可能性が求められる又は効果的な免疫応答と関連する領域又は状況が存在するということが示唆される。

【0098】

ＺＥＮＩＴＨにより、研究者らは、適用すべき追加の特別な機器や熟練したスタッフを必要とすることなく、多数のヒト用医薬分野（腫瘍学、免疫学、感染症学など）における診断に使用されるマルチパラメーターフローサイトメトリーの高スループットパワーを利用できる。ＺＥＮＩＴＨのシングルセル分解能により、エネルギー代謝に影響する同定遺伝子又は細胞の遺伝子不活性化又はサイレンシングに基づくスクリーニング方法を設計することができる。例えば、樹状細胞における代謝プロファイルの調節に関与する新たな遺伝子を同定するため、ＣＡＳ９のノックアウトスクリーニングを使用することができる。特定の代謝プロファイルを示すシングルセルを選別し、次世代シーケンシングを行う能力は、細胞型特異的にエクスビボで代謝及びその調節に関与する新たな遺伝子の同定を初めて可能にする。

【0099】

また、この方法は、サンプルをフローサイトメトリーによって分析するためだけでなく、蛍光顕微鏡観察によってエクスビボの生組織薄片又は全器官イメージングを行うために使用可能である。これにより、現在の解剖病理学の知識と、不全組織の様々な領域及び細胞活性における代謝についての情報とを組み合わせることができる。最後に、この方法は、がんや他の疾患に対する最良の処置を選択する必要がある臨床医に重要な情報をもたらし得る、ルーチンの病理学研究となる可能性がある。

【0100】

蛍光顕微鏡観察によって生組織薄片、又は全胚、器官、及び腫瘍をイメージングするため、エクスビボのＺＥＮＩＴＨを行うことを計画している。その組織及び膜成分への付着により、インタクトなシングルセル懸濁液として単離することが困難であるため、現在利用可能な技術では研究できない免疫細胞分集団においてレポーター蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウスを研究するため、この技術を適用し得る。

【0101】

腫瘍学における免疫代謝の分野は、極めて有望な用途である。この技術により、腫瘍細胞及び腫瘍に浸潤する免疫細胞の代謝プロファイルが腫瘍進行の予測に対して情報価値があるかどうかを判定することができる。いくつかの腫瘍群から得られるトランスクリプトームデータは、腫瘍代謝に関与する遺伝子の発現パターンが、腫瘍を浸潤する免疫細胞のレベル又は種類よりも腫瘍進行のより良好な予測因子となることを示唆している。したがって、ＺＥＮＩＴＨは、新たな治療及びマーカーが最も緊急に求められているヒト用医薬の領域である、ヒト腫瘍学における診断及び免疫モニタリングに使用される方法となる可能性がある。

【0102】

ＺＥＮＩＴＨは、多くの基礎及びトランスレーショナル研究に、特に腫瘍学、免疫学、及び免疫代謝の中間に適用される可能性がある。これは、血液細胞、二次リンパ器官、及び腫瘍及び腫瘍浸潤細胞、並びに神経生物学における分析に使用可能である。この方法は、サンプルをフローサイトメトリーによって分析するためだけでなく、蛍光顕微鏡観察によってエクスビボの生組織薄片又は全器官イメージングを行うために使用可能である。最後に、これは、がんや他の疾患に対する最良の処置を選択する必要がある臨床医に重要な情報をもたらし得る、ルーチンの病理学研究となる可能性がある。実際に、フローサイトメーターは大部分の研究機関及び病院で利用可能であるが、ＺＥＮＩＴＨは、機能的代謝プロファイリングの最も利用しやすい方法に相当し、他の方法と比較して感受性、利便性、シングルセル分解能、表示の安定性、必要な時間、固定及び選別の互換性について、いくつかの利点がある。重要な点は、ＺＥＮＩＴＨは、血液から単離した総Ｔ細胞の約５％に相当する早期エフェクターＴ細胞の分析で例示するように（５００細胞）、極めてまれな細胞の代謝プロファイルを定めることができ、ゆえに、Ｓｅａｈｏｒｓｅ測定と比較して、約８００倍の感受性増加に相当する（トリプリケートで４００．０００）。

【0103】

ＥＭとリンパ性エフェクター細胞及び骨髄細胞の機能性との直接の関係から、ＺＥＮＩＴＨ分析は、「免疫ＥＭ構成」を規定し、腫瘍の免疫適応度を規定する免疫スコアの設定を補い、目的に合わせた治療のため患者を予測し分類するために使用され得る。

【0104】

参考文献
本願において、種々の参考文献によって、本発明が属する技術の現状が記載されている。これらの参考文献の開示は、本明細書において言及によって本開示に援用される。

【0105】

Ａｓｓｍａｎｎ， Ｎ．， ａｎｄ Ｆｉｎｌａｙ， Ｄ．Ｋ． （２０１６）． Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ： ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２６， ２０３１－２０３９．
Ｂｕｔｔｇｅｒｅｉｔ， Ｆ．， ａｎｄ Ｂｒａｎｄ， Ｍ．Ｄ． （１９９５）． Ａ ｈｉｅｒａｒｃｈｙ ｏｆ ＡＴＰ－ｃｏｎｓｕｍｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３１２ （ Ｐｔ １）， １６３－１６７．
Ｃｈｅｎｇ， Ｓ．Ｃ．， Ｑｕｉｎｔｉｎ， Ｊ．， Ｃｒａｍｅｒ， Ｒ．Ａ．， Ｓｈｅｐａｒｄｓｏｎ， Ｋ．Ｍ．， Ｓａｅｅｄ， Ｓ．， Ｋｕｍａｒ， Ｖ．， Ｇｉａｍａｒｅｌｌｏｓ－Ｂｏｕｒｂｏｕｌｉｓ， Ｅ．Ｊ．， Ｍａｒｔｅｎｓ， Ｊ．Ｈ．， Ｒａｏ， Ｎ．Ａ．， Ａｇｈａｊａｎｉｒｅｆａｈ， Ａ．， ｅｔ ａｌ． （２０１４）． ｍＴＯＲ－ ａｎｄ ＨＩＦ－１ａｌｐｈａ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｅｒｏｂｉｃ ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ ａｓ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｒａｉｎｅｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４５， １２５０６８４．
Ｃｏｎｎｏｌｌｙ， Ｎ．Ｍ．， Ｄｕｓｓｍａｎｎ， Ｈ．， Ａｎｉｌｋｕｍａｒ， Ｕ．， Ｈｕｂｅｒ， Ｈ．Ｊ．， ａｎｄ Ｐｒｅｈｎ， Ｊ．Ｈ． （２０１４）． Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｂｉｏｅｎｅｒｇｅｔｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｅｘｃｉｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｏｘｙｇｅｎ ａｎｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３４， １０１９２－１０２０５．
Ｄｏｕｇａｎ， Ｍ．， ａｎｄ Ｄｒａｎｏｆｆ， Ｇ． （２００９）． Ｉｍｍｕｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７， ８３－１１７．
Ｅｖｅｒｔｓ， Ｂ．， Ａｍｉｅｌ， Ｅ．， Ｈｕａｎｇ， Ｓ．Ｃ．， Ｓｍｉｔｈ， Ａ．Ｍ．， Ｃｈａｎｇ， Ｃ．Ｈ．， Ｌａｍ， Ｗ．Ｙ．， Ｒｅｄｍａｎｎ， Ｖ．， Ｆｒｅｉｔａｓ， Ｔ．Ｃ．， Ｂｌａｇｉｈ， Ｊ．， ｖａｎ ｄｅｒ Ｗｉｎｄｔ， Ｇ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ． （２０１４）． ＴＬＲ－ｄｒｉｖｅｎ ｅａｒｌｙ ｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｖｉａ ｔｈｅ ｋｉｎａｓｅｓ ＴＢＫ１－ＩＫＫｖａｒｅｐｓｉｌｏｎ ｓｕｐｐｏｒｔｓ ｔｈｅ ａｎａｂｏｌｉｃ ｄｅｍａｎｄｓ ｏｆ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ． Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５， ３２３－３３２．
Ｅｖｅｒｔｓ， Ｂ．， Ａｍｉｅｌ， Ｅ．， ｖａｎ ｄｅｒ Ｗｉｎｄｔ， Ｇ．Ｊ．， Ｆｒｅｉｔａｓ， Ｔ．Ｃ．， Ｃｈｏｔｔ， Ｒ．， Ｙａｒａｓｈｅｓｋｉ， Ｋ．Ｅ．， Ｐｅａｒｃｅ， Ｅ．Ｌ．， ａｎｄ Ｐｅａｒｃｅ， Ｅ．Ｊ． （２０１２）． Ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ ｔｏ ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ ｓｕｓｔａｉｎｓ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ＮＯ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ． Ｂｌｏｏｄ １２０， １４２２－１４３１．
Ｇａｎｅｓｈａｎ， Ｋ．， ａｎｄ Ｃｈａｗｌａ， Ａ． （２０１４）． Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３２， ６０９－６３４．
Ｇｕｉｌｌｉａｍｓ， Ｍ．， ａｎｄ Ｍａｌｉｓｓｅｎ， Ｂ． （２０１５）． Ａ Ｄｅａｔｈ Ｎｏｔｉｃｅ ｆｏｒ Ｉｎ－Ｖｉｔｒｏ－Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ＧＭ－ＣＳＦ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ？ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４２， ９８８－９９０．
Ｈｅｌｆｔ， Ｊ．， Ｂｏｔｔｃｈｅｒ， Ｊ．， Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｙ， Ｐ．， Ｚｅｌｅｎａｙ， Ｓ．， Ｈｕｏｔａｒｉ， Ｊ．， Ｓｃｈｒａｍｌ， Ｂ．Ｕ．， Ｇｏｕｂａｕ， Ｄ．， ａｎｄ Ｒｅｉｓ ｅ Ｓｏｕｓａ， Ｃ． （２０１５）． ＧＭ－ＣＳＦ Ｍｏｕｓｅ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ Ｃｏｍｐｒｉｓｅ ａ Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ１１ｃ（＋）ＭＨＣＩＩ（＋） Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ａｎｄ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４２， １１９７－１２１１．
Ｈｅｌｆｔ， Ｊ．， Ｂｏｔｔｃｈｅｒ， Ｊ．Ｐ．， Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｙ， Ｐ．， Ｚｅｌｅｎａｙ， Ｓ．， Ｈｕｏｔａｒｉ， Ｊ．， Ｓｃｈｒａｍｌ， Ｂ．Ｕ．， Ｇｏｕｂａｕ， Ｄ．， ａｎｄ Ｒｅｉｓ， Ｅ．Ｓ．Ｃ． （２０１６）． Ａｌｉｖｅ ｂｕｔ Ｃｏｎｆｕｓｅｄ： Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ ＣＤ１１ｃ（＋） ＭＨＣ Ｃｌａｓｓ ＩＩ（＋） Ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＧＭ－ＣＳＦ Ｍｏｕｓｅ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４４， ３－４．
Ｊｅｗｅｔｔ， Ｍ．Ｃ．， Ｍｉｌｌｅｒ， Ｍ．Ｌ．， Ｃｈｅｎ， Ｙ．， ａｎｄ Ｓｗａｒｔｚ， Ｊ．Ｒ． （２００９）． Ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｔ ｌｏｗ ［ＡＴＰ］ ａｎｄ ［ＧＴＰ］ ｅｎａｂｌｅｓ ｃｅｌｌ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｅｎｅｒｇｙ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ． Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９１， １０８３－１０９１．
Ｋｅｌｌｙ， Ｂ．， ａｎｄ Ｏ’Ｎｅｉｌｌ， Ｌ．Ａ． （２０１５）． Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｉｎ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ａｎｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２５， ７７１－７８４．
Ｌｉｎｄｑｖｉｓｔ， Ｌ．Ｍ．， Ｔａｎｄｏｃ， Ｋ．， Ｔｏｐｉｓｉｒｏｖｉｃ， Ｉ．， ａｎｄ Ｆｕｒｉｃ， Ｌ． （２０１７）． Ｃｒｏｓｓ－ｔａｌｋ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ｅｎｅｒｇｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ ４８， １０４－１１１．
Ｌｉｕ， Ｈ．， Ｋｕｒｔｏｇｌｕ， Ｍ．， Ｌｅｏｎ－Ａｎｎｉｃｃｈｉａｒｉｃｏ， Ｃ．Ｌ．， Ｍｕｎｏｚ－Ｐｉｎｅｄｏ， Ｃ．， Ｂａｒｒｅｄｏ， Ｊ．， Ｌｅｃｌｅｒｃ， Ｇ．， Ｍｅｒｃｈａｎ， Ｊ．， Ｌｉｕ， Ｘ．， ａｎｄ Ｌａｍｐｉｄｉｓ， Ｔ．Ｊ． （２０１６）． Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ２－ｄｅｏｘｙ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ ｗｉｔｈ ｆｅｎｏｆｉｂｒａｔｅ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｅｒｇｙ ａｎｄ ＥＲ ｓｔｒｅｓｓ． Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ７， ３６４６１－３６４７３．
Ｌｕｔｚ， Ｍ．Ｂ．， Ｉｎａｂａ， Ｋ．， Ｓｃｈｕｌｅｒ， Ｇ．， ａｎｄ Ｒｏｍａｎｉ， Ｎ． （２０１６）． Ｓｔｉｌｌ Ａｌｉｖｅ ａｎｄ Ｋｉｃｋｉｎｇ： Ｉｎ－Ｖｉｔｒｏ－Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ＧＭ－ＣＳＦ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ！ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４４， １－２．
Ｌｕｔｚ， Ｍ．Ｂ．， Ｓｔｒｏｂｌ， Ｈ．， Ｓｃｈｕｌｅｒ， Ｇ．， ａｎｄ Ｒｏｍａｎｉ， Ｎ． （２０１７）． ＧＭ－ＣＳＦ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ Ｃｅｌｌｓ Ａｓ Ｐａｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｆａｍｉｌｙ． Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８， １３８８．
ＭａｃＩｖｅｒ， Ｎ．Ｊ．， Ｍｉｃｈａｌｅｋ， Ｒ．Ｄ．， ａｎｄ Ｒａｔｈｍｅｌｌ， Ｊ．Ｃ． （２０１３）． Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３１， ２５９－２８３．
Ｍａｒｑｕｅｚ， Ｓ．， Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ， Ｊ．Ｊ．， Ｔｅｒａｎ－Ｃａｂａｎｉｌｌａｓ， Ｅ．， Ｈｅｒｒｅｒｏ， Ｃ．， Ａｌｏｎｓｏ， Ｓ．， Ａｚｏｇｉｌ， Ａ．， Ｍｏｎｔｅｒｏ， Ｏ．， Ｉｗａｗａｋｉ， Ｔ．， Ｃｕｂｉｌｌｏｓ－Ｒｕｉｚ， Ｊ．Ｒ．， Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ， Ｎ．， ｅｔ ａｌ． （２０１７）． Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ Ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ Ｓｔｒｅｓｓ Ｓｅｎｓｏｒ ＩＲＥ１ａｌｐｈａ Ｅｎｈａｎｃｅｓ ＩＬ－２３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ Ｈｕｍａｎ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ． Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８， ６３９．
Ｍｅｒａｄ， Ｍ．， Ｓａｔｈｅ， Ｐ．， Ｈｅｌｆｔ， Ｊ．， Ｍｉｌｌｅｒ， Ｊ．， ａｎｄ Ｍｏｒｔｈａ， Ａ． （２０１３）． Ｔｈｅ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅａｇｅ： ｏｎｔｏｇｅｎｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｓｕｂｓｅｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｅａｄｙ ｓｔａｔｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｆｌａｍｅｄ ｓｅｔｔｉｎｇ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３１， ５６３－６０４．
Ｍｉｌｌｅｒ， Ａ．， Ｎａｇｙ， Ｃ．， Ｋｎａｐｐ， Ｂ．， Ｌａｅｎｇｌｅ， Ｊ．， Ｐｏｎｗｅｉｓｅｒ， Ｅ．， Ｇｒｏｅｇｅｒ， Ｍ．， Ｓｔａｒｋｌ， Ｐ．， Ｂｅｒｇｍａｎｎ， Ｍ．， Ｗａｇｎｅｒ， Ｏ．， ａｎｄ Ｈａｓｃｈｅｍｉ， Ａ． （２０１７）． Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｔｉｓｓｕｅ Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ． Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ ２６， ７８８－８００ ｅ７８６．
Ｎｅｉｊｓｓｅｌ， Ｏ．Ｍ．， Ｍ． Ｊ． Ｔｅｉｘｅｉｒａ ｄｅ Ｍａｔｔｏｓ， ａｎｄ Ｄ． Ｗ． Ｔｅｍｐｅｓｔ （１９９６）． Ｇｒｏｗｔｈ ｙｉｅｌｄ ａｎｄ ｅｎｅｒｇｙ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ．
Ｎｅｗｉｃｋ， Ｋ．， Ｏ’Ｂｒｉｅｎ， Ｓ．， Ｍｏｏｎ， Ｅ．， ａｎｄ Ａｌｂｅｌｄａ， Ｓ．Ｍ． （２０１７）． ＣＡＲ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｅｄ ６８， １３９－１５２．
Ｏｒｅｎ， Ｒ．， Ｆａｒｎｈａｍ， Ａ．Ｅ．， Ｓａｉｔｏ， Ｋ．， Ｍｉｌｏｆｓｋｙ， Ｅ．， ａｎｄ Ｋａｒｎｏｖｓｋｙ， Ｍ．Ｌ． （１９６３）． Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ ｔｈｒｅｅ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｐｈａｇｏｃｙｔｉｚｉｎｇ ｃｅｌｌｓ． Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １７， ４８７－５０１．
Ｐａｇｅ， Ｄ．Ｂ．， Ｐｏｓｔｏｗ， Ｍ．Ａ．， Ｃａｌｌａｈａｎ， Ｍ．Ｋ．， Ａｌｌｉｓｏｎ， Ｊ．Ｐ．， ａｎｄ Ｗｏｌｃｈｏｋ， Ｊ．Ｄ． （２０１４）． Ｉｍｍｕｎｅ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｅｄ ６５， １８５－２０２．
Ｓｃｈｉｍｍｅｌ， Ｐ． （１９９３）． ＧＴＰ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： ｔｗｏ ｆｏｒ Ｔｕ？ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９， １２６４－１２６５．
Ｓｃｈｍｉｄｔ， Ｅ．Ｋ．， Ｃｌａｖａｒｉｎｏ， Ｇ．， Ｃｅｐｐｉ， Ｍ．， ａｎｄ Ｐｉｅｒｒｅ， Ｐ． （２００９）． ＳＵｎＳＥＴ， ａ ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｍｏｎｉｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６， ２７５－２７７．
Ｓｔｅｉｎｍａｎ， Ｒ．Ｍ． （２０１２）． Ｄｅｃｉｓｉｏｎｓ ａｂｏｕｔ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ： ｐａｓｔ， ｐｒｅｓｅｎｔ， ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３０， １－２２．
Ｓｔｅｉｎｍａｎ， Ｒ．Ｍ．， Ｈａｗｉｇｅｒ， Ｄ．， ａｎｄ Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ， Ｍ．Ｃ． （２００３）． Ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｉｃ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２１， ６８５－７１１．
Ｓｕｇａｎｙａ， Ｒ．， Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ， Ａ．， Ｍｉｒｉｙａｌａ， Ｓ．， Ｈａｚｒａ， Ｔ．Ｋ．， ａｎｄ Ｉｚｕｍｉ， Ｔ． （２０１５）． Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌｓ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ａｐｕｒｉｎｉｃ／ａｐｙｒｉｍｉｄｉｎｉｃ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ． ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ （Ａｍｓｔ） ２７， ４０－４８．
Ｖｉｌｌａｎｉ， Ａ．Ｃ．， Ｓａｔｉｊａ， Ｒ．， Ｒｅｙｎｏｌｄｓ， Ｇ．， Ｓａｒｋｉｚｏｖａ， Ｓ．， Ｓｈｅｋｈａｒ， Ｋ．， Ｆｌｅｔｃｈｅｒ， Ｊ．， Ｇｒｉｅｓｂｅｃｋ， Ｍ．， Ｂｕｔｌｅｒ， Ａ．， Ｚｈｅｎｇ， Ｓ．， Ｌａｚｏ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ． （２０１７）． Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ＲＮＡ－ｓｅｑ ｒｅｖｅａｌｓ ｎｅｗ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ， ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ， ａｎｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５６．
Ｗａｌｌａｃｅ， Ｄ．Ｃ．， Ｆａｎ， Ｗ．， ａｎｄ Ｐｒｏｃａｃｃｉｏ， Ｖ． （２０１０）． Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐａｔｈｏｌ ５， ２９７－３４８．
Ｗｏｌｆ， Ａ．Ｊ．， Ｒｅｙｅｓ， Ｃ．Ｎ．， Ｌｉａｎｇ， Ｗ．， Ｂｅｃｋｅｒ， Ｃ．， Ｓｈｉｍａｄａ， Ｋ．， Ｗｈｅｅｌｅｒ， Ｍ．Ｌ．， Ｃｈｏ， Ｈ．Ｃ．， Ｐｏｐｅｓｃｕ， Ｎ．Ｉ．， Ｃｏｇｇｅｓｈａｌｌ， Ｋ．Ｍ．， Ａｒｄｉｔｉ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ． （２０１６）． Ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ Ｉｓ ａｎ Ｉｎｎａｔｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ． Ｃｅｌｌ １６６， ６２４－６３６．
Ｚｈａｎｇ， Ｊ．， Ｎｕｅｂｅｌ， Ｅ．， Ｗｉｓｉｄａｇａｍａ， Ｄ．Ｒ．， Ｓｅｔｏｇｕｃｈｉ， Ｋ．， Ｈｏｎｇ， Ｊ．Ｓ．， Ｖａｎ Ｈｏｒｎ， Ｃ．Ｍ．， Ｉｍａｍ， Ｓ．Ｓ．， Ｖｅｒｇｎｅｓ， Ｌ．， Ｍａｌｏｎｅ， Ｃ．Ｓ．， Ｋｏｅｈｌｅｒ， Ｃ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ． （２０１２）． Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｅｎｅｒｇｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌｓ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ７， １０６８－１０８５．
Ｚｈａｎｇ， Ｌ．， Ｓｕ， Ｊ．， Ｘｉｅ， Ｑ．， Ｚｅｎｇ， Ｌ．， Ｗａｎｇ， Ｙ．， Ｙｉ， Ｄ．， Ｙｕ， Ｙ．， Ｌｉｕ， Ｓ．， Ｌｉ， Ｓ．， ａｎｄ Ｘｕ， Ｙ． （２０１５）． ２－Ｄｅｏｘｙ－ｄ－Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｓ Ｈｕｍａｎ Ｏｖａｒｉａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ ｔｏ Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ ｂｙ Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ＥＲ Ｓｔｒｅｓｓ ａｎｄ Ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ ＡＴＰ Ｓｔｏｒｅｓ ｉｎ Ａｃｉｄｉｃ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ． Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ ２９， ５７２－５７８．
Ｚｈａｎｇ， Ｐ．， ＭｃＧｒａｔｈ， Ｂ．， Ｌｉ， Ｓ．， Ｆｒａｎｋ， Ａ．， Ｚａｍｂｉｔｏ， Ｆ．， Ｒｅｉｎｅｒｔ， Ｊ．， Ｇａｎｎｏｎ， Ｍ．， Ｍａ， Ｋ．， ＭｃＮａｕｇｈｔｏｎ， Ｋ．， ａｎｄ Ｃａｖｅｎｅｒ， Ｄ．Ｒ． （２００２）． Ｔｈｅ ＰＥＲＫ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２ ａｌｐｈａ ｋｉｎａｓｅ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｓｙｓｔｅｍ， ｐｏｓｔｎａｔａｌ ｇｒｏｗｔｈ， ａｎｄ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｎｃｒｅａｓ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２２， ３８６４－３８７４．

【図1】

【図2】

【図3A-F】

【図3G-J】

【図4A】

【図4B-C】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図6】