特許 7518915 ＣＤ３融合タンパク質およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-07-09

(45)【発行日】2024-07-18

(54)【発明の名称】ＣＤ３融合タンパク質およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20240710BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20240710BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240710BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20240710BHJP

   C07K 14/725 20060101ALN20240710BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20240710BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20240710BHJP

【ＦＩ】

C07K19/00

C12N5/0783

C12N15/12 ZNA

C12Q1/02

C07K14/725

C07K16/28

C12N5/10

【請求項の数】 14

(21)【出願番号】P 2022559692

(86)(22)【出願日】2021-03-29

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-05-12

(86)【国際出願番号】 EP2021058124

(87)【国際公開番号】W WO2021198163

(87)【国際公開日】2021-10-07

【審査請求日】2022-11-25

(31)【優先権主張番号】20167540.2

(32)【優先日】2020-04-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】517419917

【氏名又は名称】メディジーン イミュノテラピーズ ゲーエムベーハー

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100110663

【弁理士】

【氏名又は名称】杉山 共永

(72)【発明者】

【氏名】サイラー，ナジャ

(72)【発明者】

【氏名】エリンガー，クリスティアン

【審査官】長谷川 強

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１９－１４６５９８（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ １９／００

Ｃ１２Ｎ ５／０７８３

Ｃ１２Ｎ １５／１２

Ｃ１２Ｑ １／０２

Ｃ０７Ｋ １４／７２５

Ｃ０７Ｋ １６／２８

Ｃ１２Ｎ ５／１０

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

－ ＣＤ８シグナルペプチドドメイン、
－ ＣＤ３δ外部ドメインおよびＣＤ３ε外部ドメインを含むＣＤ３ヘテロ二量体、
－ ＣＤ８ヒンジドメイン、
－ ＣＤ２８膜貫通ドメイン、および
－ ＣＤ３ζドメイン
を含むＣＤ３融合タンパク質であって、
前記ＣＤ３δ外部ドメインが、配列番号２であるアミノ酸配列を含み、前記ＣＤ３ε外部ドメインが、配列番号４であるアミノ酸配列を含み、前記ＣＤ３ζドメインが、配列番号８であるアミノ酸配列を含む、前記ＣＤ３融合タンパク質。

【請求項2】

請求項１に記載の融合タンパク質をコードする配列を含有する核酸分子。

【請求項3】

インビトロまたはエクスビボでのＴ細胞のＴＣＲ非依存性活性化のための方法であって、
－ 請求項１に記載の融合タンパク質を前記Ｔ細胞において発現させるステップ、
－ 前記Ｔ細胞をＣＤ３刺激剤およびＣＤ２８刺激剤で刺激するステップ
を含む、インビトロまたはエクスビボ方法。

【請求項4】

－ 請求項１に記載の融合タンパク質を前記Ｔ細胞において発現させるステップ、
－ 前記Ｔ細胞の内因性ＴＣＲを欠失させるステップ、
－ 前記Ｔ細胞をＣＤ３刺激剤およびＣＤ２８刺激剤で刺激するステップ
を含む、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記ＣＤ３刺激剤が、活性化抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合性断片である、請求項３または４に記載の方法。

【請求項6】

前記ＣＤ２８刺激剤が、活性化抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合性断片である、請求項３または４に記載の方法。

【請求項7】

前記ＣＤ３刺激剤および前記ＣＤ２８刺激剤が、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物である、請求項３または４に記載の方法。

【請求項8】

抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合性断片を含む前記組成物が、固定化されている、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合性断片を含む前記組成物が、ビーズ上に固定化されている、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

請求項１に記載の融合タンパク質を含むＴ細胞。

【請求項11】

前記Ｔ細胞が、内因性ＴＣＲを欠いている、請求項１０に記載のＴ細胞。

【請求項12】

医薬としての使用のための、請求項１０または１１に記載のＴ細胞。

【請求項13】

がんまたはウイルス性疾患の処置における使用のための、請求項１０または１１に記載のＴ細胞。

【請求項14】

外因性エフェクター分子の試験および特性評価のための、請求項１０または１１に記載のＴ細胞の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｔ細胞、特に、ＴＣＲ陰性Ｔ細胞のＴＣＲ非依存性活性化のためのツールおよび方法を提供する。特に、本発明は、ＣＤ３ε外部ドメイン、ＣＤ３δ外部ドメインまたはＣＤ３γ外部ドメイン、膜貫通ドメイン、およびＣＤ３ζドメインを含むＣＤ３融合タンパク質に関する。本発明は、そのようなＣＤ３融合タンパク質をコードする核酸分子、そのようなＣＤ３融合タンパク質をコードするＴ細胞、および医学的使用のための前記Ｔ細胞にさらに関する。さらに、外因性エフェクター分子の試験および特性評価のためのＴ細胞の使用が記載される。

【背景技術】

【0002】

Ｔリンパ球は、適応免疫応答の一部であり、骨髄に位置する造血幹細胞が起源である。Ｔリンパ球は、それらの膜上で固有の抗原結合性受容体を発現し、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子との会合において抗原を認識する。

【0003】

免疫系におけるそれらの中心的な役割により、Ｔ細胞は、典型的には、病原体または悪性細胞からの保護を提供する。各Ｔ細胞は、感染した細胞または変更された細胞を認識するためにＴ細胞によって使用される構造である単一形態のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する。

【0004】

免疫療法の概念は、病原体および腫瘍細胞の認識および排除のための適応免疫応答の特異性に基づく。免疫療法の成功の目標は、免疫系による破壊のために腫瘍細胞を特異的に標的にするために、患者の免疫応答の操作または再プログラミングである。

【0005】

がんの処置において免疫系を再プログラムするために使用される治療アプローチは、ＤＣワクチンを含むワクチン接種戦略の使用を含む能動免疫療法、および腫瘍抗原を特異的に認識する腫瘍特異的抗体または遺伝子操作されたリンパ球またはＴ細胞の養子移入の適用を含む受動免疫療法を含む。

【0006】

養子Ｔ細胞移入の原理は、自己または同種異系の腫瘍特異的Ｔリンパ球のエクスビボ拡大増殖、およびその後の患者への再注入に基づく。転移性黒色腫を患っている患者におけるがんの退縮は、エクスビボで拡大増殖された自己腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の移入後に観察された。この治療アプローチの欠点は、あらゆる個々の患者から単離される必要がある既存の腫瘍反応性細胞についての要件、および黒色腫以外のがんに対するＴＩＬの困難な検出である。したがって、患者から単離されたＴ細胞の遺伝子改変に焦点を合わせた他の方法が開発された。これらの遺伝子操作されたＴ細胞は、例えば、腫瘍特異的ＴＣＲのα鎖およびβ鎖による、すなわち組換えＴＣＲによる、自己Ｔ細胞の形質導入によって作出され得る。

【0007】

２００９年にWilde et al.によって開発され、国際公開第２００７／０１７２０１号パンフレットに記載されているようなアプローチは、ＴＡＡおよび選択された同種異系ＭＨＣ分子の両方をコードするＲＮＡ種で共トランスフェクトされた自己ＤＣを使用する同種制限ペプチド特異的Ｔ細胞の単離を可能にする。自己Ｔ細胞を自己ペプチド／同種ＭＨＣ複合体を提示するＤＣとともに共培養することによって、自己抗原を認識する高アビディティーのＴ細胞を得ることができる（Wilde et al., 2009, Dendritic cells pulsed with RNA encoding allogeneic MHC and antigen induce T cells with superior antitumor activity and higher TCR functional avidity. Blood, 114(10), 2131-9）。Ｔ細胞培養およびＴ細胞クローンの拡大増殖は、面倒であり、かつ再刺激の反復ラウンドを必要とするので、レシピエントＰＢＬにそれらを導入することによってそれらの特性評価を可能にするために、早い時点でＴＣＲのｃＤＮＡを単離することは有利である。これは、それらが患者における治療適用のために使用される前に、抗原特異性、アビディティーおよび機能性に関するＴＣＲの特性評価を可能にする。しかしながら、この方法は、面倒であり、時間がかかる。さらに、未知の特異性を有するリンパ球の内因性ＴＣＲは、導入された導入遺伝子／組換えＴＣＲとヘテロ二量体を形成することができ、再度の未知の特異性の交差反応性に至る。

【0008】

加えて、がんのための養子免疫療法においてなされている実質的な前進を踏まえると、養子Ｔ細胞療法における使用のためのそれらの可能性について、トランスジェニックＴＣＲを試験および特性評価するための決定的で迅速な方法の提供についての必要性が存在する。

【0009】

Ｔ細胞が増殖することができ、その結果、さらに繁殖することができることがＴ細胞開発の前提条件である。しかしながら、Ｔ細胞の増殖は、とりわけ、インタクトＴＣＲの発現に依存する。そのため、機能的ＴＣＲを欠いているレシピエント細胞では、レシピエントＴ細胞が機能的ＴＣＲの非存在下で分裂することを可能にする代替の増殖シグナルについての必要性が存在する。特に、Ｔ細胞の増殖をインビトロおよび／またはインビボで始動することができることが必要である。

【0010】

さらに、治療剤として使用される場合、レシピエント細胞が、治療効果を媒介する受容体とは独立して、インビトロまたはインビボで増殖することができることが望ましい。このことは、その治療の運命が決定される前に、レシピエント細胞の繁殖を可能にする。加えて、このアプローチは、治療的に活性な受容体が導入された後に、インビトロおよび／またはインビボでの増殖刺激の均一な誘導を可能にする。それにより、ＴＣＲなどの異なる治療用受容体をそれぞれ持つ異なる治療用細胞株は、治療効果を媒介する分子と独立している増殖刺激による均一で標準化された様式でさらに刺激され得る。

【0011】

したがって、直接的な戦略が、それらの内因性ＴＣＲの刺激と独立してＴ細胞を培養するために必要である。

【発明の概要】

【0012】

本発明は、ＴＣＲと独立したＴ細胞の繁殖のための戦略を提供する。特に、本発明は、
－ ＣＤ３ε外部ドメイン、
－ ＣＤ３δ外部ドメインまたはＣＤ３γ外部ドメイン、
－ 膜貫通ドメイン、および
－ ＣＤ３ζドメイン
を含むＣＤ３融合タンパク質を提供する。

【0013】

このＣＤ３融合タンパク質は、Ｔ細胞において発現されると、ＣＤ３およびＣＤ２８の活性化刺激の際に、Ｔ細胞のＴＣＲ非依存性活性化を可能にする。特に、Ｔ細胞は、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を含む組成物によって容易に活性化され得る。そのため、Ｔ細胞のＴＣＲ非依存性活性化は、市販の製品、例えば、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体が固定化されているミクロスフェアビーズを使用して行うことができる。そのため、ＬＣＬ細胞などのフィーダー細胞を使用する時間のかかる活性化は不必要になる。それにより、ＴＣＲのＴＣＲ非依存性活性化のための直接的な経済的方法が提供される。ＣＤ３融合タンパク質は、インビトロで任意の特異的標的を認識しないので、細胞アッセイにおけるバックグラウンド活性化が低減される。

【0014】

典型的には、言及される膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインである。ＣＤ３外部ドメインは、ヒンジドメインによって膜貫通ドメインに連結されていてもよい。ＣＤ３外部ドメインを膜貫通ドメインに連結するヒンジドメインは、ＩｇＧヒンジドメイン、ＣＤ２８ヒンジドメイン、またはＣＤ８ヒンジドメインからなる群から選択されてもよい。

【0015】

ＣＤ３外部ドメインを膜貫通ドメインに連結するヒンジドメインは、ＩｇＧヒンジドメイン、ＣＤ２８ヒンジドメイン、またはＣＤ８ヒンジドメインからなる群から選択されてもよい。好ましくは、ヒンジドメインは、ＣＤ８ヒンジドメインである。

【0016】

さらに、融合タンパク質は、ＥＲ膜への共翻訳局在化を可能にするシグナルペプチドドメインをさらに含んでもよい。シグナルドメインは、好ましくは、ＣＤ８シグナルドメインである。

【0017】

典型的には、ＣＤ３δ外部ドメインおよびＣＤ３ε外部ドメイン、またはＣＤ３ε外部ドメインおよびＣＤ３γ外部ドメインは、リンカー、好ましくは、非免疫原性リンカーを介して接続される。典型的には、リンカーは、少なくとも５アミノ酸を含む。アミノ酸は、グリシンおよびセリン残基の群から選択されてもよい。

【0018】

好ましい実施形態において、ＣＤ３融合タンパク質は、
－ ＣＤ８シグナルペプチドドメイン、
－ ＣＤ３δ外部ドメインおよびＣＤ３ε外部ドメイン、
－ ＣＤ８ヒンジドメイン、
－ ＣＤ２８膜貫通ドメイン、
－ ＣＤ３ζドメイン
を含む。

【0019】

ＣＤ８シグナルペプチドは、配列番号１であるアミノ酸配列、または配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0020】

ＣＤ３δ外部ドメインは、配列番号２であるアミノ酸配列、または配列番号２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0021】

ＣＤ３γ外部ドメインは、配列番号３であるアミノ酸配列、または配列番号３と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0022】

ＣＤ３ε外部ドメインは、配列番号４であるアミノ酸配列、または配列番号４と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0023】

ＣＤ３δ外部ドメインおよびＣＤ３ε外部ドメイン、またはＣＤ３δドメインおよびＣＤ３γ外部ドメインを接続するリンカーは、配列番号５であるアミノ酸配列、または配列番号５と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0024】

ＣＤ８ヒンジドメインは、配列番号６であるアミノ酸配列、または配列番号６と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0025】

膜貫通ドメインは、配列番号７であるアミノ酸配列、または配列番号７と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0026】

ＣＤ３ζドメインは、配列番号８であるアミノ酸配列、または配列番号８と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0027】

具体的な実施形態において、融合タンパク質は、配列番号１１であるアミノ酸配列、または配列番号１１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0028】

典型的には、ＣＤ３融合タンパク質のＮ末端からＣ末端の方向でのドメインの順序は、ＣＤ３δ外部ドメインまたはＣＤ３γ外部ドメイン、リンカー、ＣＤ３ε外部ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、およびＣＤ３ζドメインである。

【0029】

ＣＤ３融合タンパク質は、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＩＣＯＳおよびＣＤ２８からなる群から選択される少なくとも１つの共刺激分子をさらに含んでもよい。

【0030】

本発明のさらなる態様は、本明細書に記載されるＣＤ３融合タンパク質をコードする配列を含有する核酸分子に言及する。

【0031】

核酸分子は、蛍光タンパク質をコードする配列をさらに含んでもよい。典型的には、ＣＤ３融合タンパク質をコードする配列と蛍光タンパク質をコードする配列との間に、リボソームスキッピング配列が存在する。

【0032】

本発明の別の態様は、ＣＤ３刺激剤およびＣＤ２８刺激剤によるＴＣＲ陰性Ｔ細胞の活性化のための、本明細書に記載されるＣＤ３融合タンパク質または本明細書に記載される核酸分子の使用に言及する。好ましくは、ＣＤ３刺激剤は、活性化抗ＣＤ３抗体またはその結合性断片である。

【0033】

ＣＤ２８刺激剤は、フィーダー細胞、例えば、リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）の細胞との共培養物の形態、または活性化抗ＣＤ２８抗体によってであり得る。好ましくは、ＣＤ２８刺激剤は、活性化抗ＣＤ２８抗体またはその結合性断片である。

【0034】

好ましくは、ＴＣＲ非依存性活性化のために、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を含む組成物が使用される。抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体は、好適な表面に、例えば、ミクロスフェアビーズの表面上に、Ｓｔｒｅｐｔａｍｅｒｓ（登録商標）上に、または組織培養容器表面上に固定化されていてもよい。好ましくは、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体またはその結合性断片を含む組成物は、ミクロスフェアビーズ上に固定化されている。

【0035】

そのため、本方法は、サイトカインもフィーダー細胞も刺激のために必要ではないので有利であり、より価格が安く、より効率的な刺激をもたらす。

【0036】

本発明の別の態様は、Ｔ細胞のＴＣＲ非依存性活性化のための方法であって、
－ 本明細書に記載されるＣＤ３融合タンパク質を発現させるステップ、
－ Ｔ細胞をＣＤ３刺激剤およびＣＤ２８刺激剤で刺激するステップ
を含む、方法に言及する。

【0037】

方法はまた、内因性ＴＣＲの欠失のステップを含んでもよい。そのため、方法は、
－ 本明細書に記載されるＣＤ３融合タンパク質を発現させるステップ、
－ 内因性ＴＣＲを欠失させるステップ、
－ Ｔ細胞をＣＤ３刺激剤およびＣＤ２８刺激剤で刺激するステップ
を含んでもよい。

【0038】

本発明の別の態様は、本明細書に記載されるＣＤ３融合タンパク質を含むＴ細胞に言及する。

【0039】

当業者は、Ｔ細胞がＣＤ２８陽性であること、すなわち、Ｔ細胞が、その細胞表面上でＣＤ２８を発現することを理解する。

【0040】

ＴＣＲ非依存性Ｔ細胞活性化の目標は、細胞培養の間に生存可能な発現されるＴＣＲを欠いているＴ細胞を保つこと、すなわち、細胞培養においてＴ細胞を拡大増殖することである。トランスジェニック／組換えＴＣＲまたはキメラ抗原受容体の発現の際に、Ｔ細胞は、細胞のエフェクター機能（すなわち、ＩＦＮ－γ放出）および死滅能力を誘発する。そのため、典型的には、ＴＣＲ複合体は、ノックアウトされるか、その発現は、本発明の方法の一段階で抑制される。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＣＤ３融合タンパク質を含むＴ細胞は、機能的ＴＣＲを発現しないか、または言い換えると、ＴＣＲ受容体陰性である。

【0041】

本明細書に記載されるＣＤ３融合タンパク質を含むそのようなＴＣＲ陰性Ｔ細胞は、レシピエント細胞の免疫エフェクター機能を活性化することができる外因性受容体の導入のために直ぐに使用できる。

【0042】

本発明は、医薬としての使用のためのＴ細胞にも言及する。特に、本発明は、がんの処置のためのＴ細胞に言及する。

【図面の簡単な説明】

【0043】

【図1】ＣＤ３融合タンパク質のドメイン構造。可撓性（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３リンカーによって分離されたＣＤ３δ外部ドメインおよびＣＤ３ε外部ドメインの細胞外一本鎖断片（ｓｃＦｖ）は、ＣＤ８ヒンジドメインを介してＣＤ２８膜貫通ドメインおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインにカップリングされる。ｓｃＦｖは、ネイティブフォールディングの際に、α－ＣＤ３抗体のＯＫＴ－３の結合エピトープを保持する。ＣＤ３融合タンパク質のコード配列は、ＥＲ（小胞体）膜への共翻訳局在化を確実にするために、ＣＤ８シグナルペプチドが先行する。Ｐ２Ａエレメントを介してカップリングされたｅＧＦＰを使用して、細胞への形質導入の成功をモニターすることができる。多重クローニング部位（ＭＣＳ）は、異なる骨格のベクターへのクローニングを容易にする。

【図2】ＣＤ３融合タンパク質を用いるための戦略。ＣＤ３融合タンパク質で形質導入されたＴ細胞は、ノックアウト後に内因性ＴＣＲの非存在下で刺激シグナル１および２を送達するために、α－ＣＤ３抗体およびα－ＣＤ２８抗体によって活性化され得る。ＣＤ３融合タンパク質と結合する抗体は、フィーダー細胞の存在下で可溶性形態、またはα－ＣＤ２８抗体と組み合わされたビーズ結合（ミクロスフェア）形態のいずれかで使用され得る。

【図3】ＴＣＲ欠損Ｊｕｒｋａｔ－７６細胞におけるＣＤ３融合タンパク質発現。形質導入Ｊｕｒｋａｔ－７６細胞を、α－ＣＤ３抗体による染色とその後のフローサイトメトリー分析によって、形質導入の７日後にＣＤ３融合タンパク質の発現およびｅＧＦＰ発現について分析した。生じた単一細胞クローン（単一細胞クローニング）を、その後、ＦＡＣＳの２週後のα－ＣＤ３抗体染色とそれに続くフローサイトメトリー分析によって、ＣＤ３融合タンパク質およびｅＧＦＰの発現についても評価した。２つの代表的なクローンの結果を示す。形質導入細胞を灰色で表す。非形質導入Ｊｕｒｋａｔ－７６細胞は陰性対照としての役割を果たした（黒色線）。ヒストグラム内に、ＣＤ３陽性細胞およびそれぞれのｅＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを示す。

【図4】ＣＤ３融合タンパク質で形質導入されたＴＣＲ欠損Ｔ細胞クローンのＸ倍拡大増殖。ａ）１４日ごとの反復刺激で５６日の過程にわたる４つの異なるＴ細胞クローン（ＣＤ８＋＿００１、ＣＤ８＋＿００２、ＣＤ８＋＿００３およびＣＤ８＋＿００４）のＸ倍拡大増殖。細胞数を各拡大増殖ラウンド後に決定した。その内因性ＴＣＲを持つクローンＣＤ４＋＿５０は、増殖能力を比較するための対照としての役割を果たした（対照）。ｂ）異なる活性化条件を使用する単回刺激サイクルにわたる２つの選択されたＴ細胞クローンのＸ倍拡大増殖。細胞を、それぞれ、ＬＣＬフィーダー細胞、ＩＬ－２およびＯＫＴ－３抗体を含む完全刺激ミックス（黒色長方形または黒色丸）、またはＯＫＴ－３を欠く刺激ミックス（灰色長方形または灰色丸）、またはＯＫＴ－３およびＬＣＬ（白色長方形または白色丸）のいずれかで刺激した。生存細胞の数を５日目および１０日目に決定した。

【図5-1】チロシナーゼ特異的ＴＣＲのＴ５８またはＤ１１５のいずれかでの形質導入後のＣＤ３融合タンパク質形質導入Ｔ細胞クローンのエフェクター機能。図５ａ）それぞれのトランスジェニックＴＣＲβ鎖、およびＹＭＤＧＴＭＳＱＶ（ＹＭＤ）ペプチドを含む四量体に特異的なα－ＣＤ３抗体およびα－ＴＣＲ－Ｖβ抗体による、Ｔ５８またはＤ１１５のいずれかでそれぞれ形質導入された単離されたＴ細胞クローン（ＣＤ３融合タンパク質００１＝ＣＤ８＋＿００１およびＣＤ３融合タンパク質００２＝ＣＤ８＋＿００２）およびＰＢＬの染色。示される数は、ＣＤ３陽性であり、同時に特異的ＴＲＢＶ抗体またはそれぞれの四量体と結合する、細胞のパーセンテージを表す。ＦＡＣＳによる富化後、細胞は、フローサイトメトリー分析によってその後に分析した。非形質導入ＣＤ８＋＿００１およびＣＤ８＋＿００２Ｔ細胞クローン、ならびに未処理ＰＢＬを、それぞれの陰性対照として使用した（ヒストグラムにおいて灰色で表す）。

【図5-2】図５ｂ）同じ共培養物に由来する上清のＩＦＮ－γＥＬＩＳＡを、形質導入Ｔ細胞（ＣＤ３融合タンパク質００１＝ＣＤ８＋＿００１、ＣＤ３融合タンパク質００２＝ＣＤ８＋＿００２またはＰＢＬ）の標的細胞との２：１のＥ：Ｔ比でのインキュベーション２０時間後に、死滅アッセイにおいて使用した。陽性対照は、７５０ｎｇ／ｍＬのＰＭＡおよび５ｎｇ／ｍＬのイオノマイシン（ＰＭＡ／Ｉｏｎｏ）で活性化されたエフェクター細胞を含んでいた。形質導入ＰＢＬのＩＦＮ－γ放出を２つの独立した実験において決定した。非形質導入細胞（ｗ／ｏ）は陰性対照としての役割を果たした。標的細胞は、チロシナーゼ陽性腫瘍細胞（Ｍｅｌ６２４．３８）およびチロシナーゼ陰性腫瘍細胞（Ａ３７５）を含んでいた。

【図5-3】図５ｃ）ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞クローン（ＣＤ３融合タンパク質００１＝ＣＤ８＋＿００１、ＣＤ３融合タンパク質００２＝ＣＤ８＋＿００２）およびＰＢＬの機能的アビディティーを、ペプチド濃度の減少に応答する相対ＩＦＮ－γ放出としてプロットした。Ｋ５６２＿Ａ２＿ＣＤ８６細胞に、漸減量のペプチド（１０^－４～１０^－１２Ｍ）をロードし、それぞれＴ５８またはＤ１１５を発現するＴ細胞とともに２：１の固定Ｅ：Ｔ比で共培養した。ＩＦＮ－γ放出を、ＩＦＮ－γＥＬＩＳＡによって２０時間後に決定し、相対ＩＦＮ－γ放出を、最大ＩＦＮ－γ放出を１００％の参照値に設定することによって算出した。より低い値は、この参照に従って算出した。値は、生物学的な二反復に由来した。破線は、算出されたＥＣ５０値を示す。１０^－４Ｍの無関係なＳＬＬＭＷＩＴＱＣペプチド（配列番号２５）がロードされたＫ６５２＿Ａ２＿ＣＤ８６細胞は陰性対照としての役割を果たした。

【図6】トランスジェニックチロシナーゼ特異的ＴＣＲのＴ５８（００１＿Ｔ５８）またはＤ１１５（００１＿Ｄ１１５）のいずれかの形質導入後の単離されたＣＤ３融合タンパク質を発現するＴ細胞クローンの死滅能力。死滅アッセイを、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）ＺＯＯＭシステムを使用して実施して、２：１のＥ：Ｔ比で、７２時間にわたってＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ色素で標識されたチロシナーゼ陽性（Ｍｅｌ６２４．３８）および陰性（Ａ３７５）の腫瘍細胞の死滅（細胞溶解）をモニターした。それぞれの腫瘍細胞単独（白色丸）は、エフェクター細胞の非存在下で増殖についての対照としての役割を果たした。非形質導入エフェクター細胞（白色四角、００１）は、トランスジェニックＴＣＲの非存在下でバックグラウンド死滅を推定するための対照としての役割を果たした。細胞数／ウェルを、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）ＺＯＯＭソフトウェア２０１６Ｂを使用することによって決定して、各アプローチの四反復で分析した。

【図7】ＣＤ３融合タンパク質で形質導入され、フィーダー細胞（ＬＣＬ細胞）およびα－ＣＤ３抗体もしくはα－ＣＤ３／ＣＤ２８抗体でコーティングされたミクロスフェアビーズを介した刺激、またはＣＤ３／ＣＤ２８ ｓｔｒｅｐｔａｍｅｒを介した刺激のいずれかを使用して刺激された、Ｔ細胞クローン（００１および００２）のＸ倍拡大増殖。２つの異なるＴ細胞クローン（００１および００２）のＸ倍拡大増殖を示す。

【発明を実施するための形態】

【0044】

本発明をその好ましい実施形態のいくつかに関して詳細に説明する前に、以下の一般的定義を提供する。

【0045】

本発明は、以下に例示的に説明される場合、本明細書に具体的に開示されていない任意の１つまたは複数の要素、１つまたは複数の限定の非存在下で、好適に実施され得る。

【0046】

本発明は、特定の実施形態に関しておよびある特定の図を参照して説明されるが、本発明は、それらに限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。

【0047】

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語が本記載および特許請求の範囲において使用される場合、それは、他の要素を排除しない。本発明の目的のために、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語は、「を構成する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｏｆ）」という用語の好ましい実施形態であると考えられる。本明細書の以下で群が少なくともある一定数の実施形態を含むと定義される場合、これはまた、好ましくはこれらの実施形態のみからなる群を開示すると理解されるべきである。

【0048】

不定冠詞または定冠詞が、単数の名詞、例えば、「ａ」、「ａｎ」または「ｔｈｅ」を指す場合に使用される場合、これは、他のものが具体的に述べられない限り、その名詞の複数を含む。

【0049】

技術用語は、それらの一般的な意味で使用される。具体的な意味がある特定の用語によって伝えられる場合、用語の定義は、以下に、その用語が使用される文脈において示される。

【0050】

本発明は、ＴＣＲと独立したＴ細胞の繁殖のための戦略を提供する。特に、本発明は、
－ ＣＤ３ε外部ドメイン、
－ ＣＤ３δ外部ドメインまたはＣＤ３γ外部ドメイン、
－ 膜貫通ドメイン、および
－ ＣＤ３ζドメイン
を含むＣＤ３融合タンパク質を提供する。

【0051】

典型的には、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインである。ＣＤ３ε外部ドメインおよびＣＤ３δ外部ドメインまたはＣＤ３γ外部ドメインは、ヒンジドメインによって膜貫通ドメインに連結されていてもよい。ＣＤ３ε外部ドメインおよびＣＤ３δ外部ドメインまたはＣＤ３γ外部ドメインを膜貫通ドメインに連結するヒンジドメインは、ＩｇＧヒンジドメイン、ＣＤ２８ヒンジドメイン、またはＣＤ８ヒンジドメインからなる群から選択されてもよい。

【0052】

ＣＤ３ε外部ドメインおよびＣＤ３δ外部ドメインまたはＣＤ３γ外部ドメインを膜貫通ドメインに連結するヒンジドメインが、ＩｇＧヒンジドメイン、ＣＤ２８ヒンジドメイン、またはＣＤ８ヒンジドメインからなる群から選択される、請求項１～３に記載のＣＤ３融合タンパク質。好ましくは、ヒンジドメインは、ＣＤ８ヒンジドメインである。

【0053】

さらに、融合タンパク質は、ＥＲ膜への共翻訳局在化を可能にするシグナルペプチドドメインをさらに含んでもよい。シグナルドメインは、好ましくは、ＣＤ８シグナルドメインである。

【0054】

典型的には、ＣＤ３δ外部ドメインおよびＣＤ３ε外部ドメイン、またはＣＤ３ε外部ドメインおよびＣＤ３γ外部ドメインは、好ましくは、非免疫原性リンカーによって接続される。典型的には、リンカーは、少なくとも５アミノ酸を含有する。アミノ酸は、グリシンおよびセリン残基の群から選択されてもよい。

【0055】

好ましい実施形態において、ＣＤ３融合タンパク質は、
－ ＣＤ８シグナルペプチドドメイン、
－ ＣＤ３δ外部ドメインおよびＣＤ３ε外部ドメイン、
－ ＣＤ８ヒンジドメイン、
－ ＣＤ２８膜貫通ドメイン、
－ ＣＤ３ζドメイン
を含む。

【0056】

ＣＤ８シグナルペプチドは、配列番号１であるアミノ酸配列、または配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0057】

ＣＤ３δ外部ドメインは、配列番号２であるアミノ酸配列、または配列番号２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0058】

ＣＤ３γ外部ドメインは、配列番号３であるアミノ酸配列、または配列番号３と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0059】

ＣＤ３ε外部ドメインは、配列番号４であるアミノ酸配列、または配列番号４と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0060】

ＣＤ３δ外部ドメインおよびＣＤ３ε外部ドメイン、またはＣＤ３δ外部ドメインおよびＣＤ３γ外部ドメインを接続するリンカーは、配列番号５であるアミノ酸配列、または配列番号５と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0061】

ＣＤ８ヒンジドメインは、配列番号６であるアミノ酸配列、または配列番号６と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0062】

膜貫通ドメインは、配列番号７であるアミノ酸配列、または配列番号７と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0063】

ＣＤ３ζドメインは、配列番号８であるアミノ酸配列、または配列番号８と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0064】

具体的な実施形態において、融合タンパク質は、配列番号１１であるアミノ酸配列、または配列番号１１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んでもよい。

【0065】

本明細書で使用される「少なくとも８０％同一」、特に、「少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する」は、アミノ酸配列が、提示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であることを含む。

【0066】

多数の配列間の同一性パーセントの決定は、好ましくは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ａｄｖａｎｃｅ（商標）１０プログラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ、ＵＳＡ）のＡｌｉｇｎＸアプリケーションを使用して達成される。このプログラムは、改変Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗアルゴリズムを使用する（Thompson et al., 1994. Nucl Acids Res. 22: pp. 4673-4680; Invitrogen Corporation; Vector NTI AdvanceTM 10 DNA and protein sequence analysis software. User’s Manual, 2004, pp.389-662）。同一性パーセントの決定は、ＡｌｉｇｎＸアプリケーションの標準パラメーターを用いて行われる。

【0067】

典型的には、融合タンパク質のＮ末端からＣ末端の方向でのドメインの順序は、ＣＤ３δ外部ドメインまたはＣＤ３γ外部ドメイン、ＣＤ３εドメイン、ヒンジドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ３ζドメインである。

【0068】

ＣＤ３融合タンパク質は、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＩＣＯＳおよびＣＤ２８からなる群から選択される少なくとも１つの共刺激分子をさらに含んでもよい。

【0069】

「ＴＣＲと独立したＴ細胞の繁殖」という用語は、ＴＣＲの刺激の必要性なく増殖するＴ細胞を指す。「ＴＣＲからの増殖刺激と独立して増殖するヒトＴ細胞」がＴＣＲを発現し得ることが理解され、したがって、Ｔ細胞がＴＣＲからの増殖刺激にさらに基づいて増殖することが可能であり得る。

【0070】

ＴＣＲは、２つの異なる別々のタンパク質鎖、すなわち、ＴＣＲアルファ（ａ）およびＴＣＲベータ（ｂ）鎖から構成される。ＴＣＲα鎖は、可変（Ｖ）領域、接合（Ｊ）領域、および定常（Ｃ）領域を含む。ＴＣＲｂ鎖は、可変（Ｖ）領域、多様性（Ｄ）領域、接合（Ｊ）領域、および定常（Ｃ）領域を含む。ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の両方の再構成Ｖ（Ｄ）Ｊ領域は、超可変領域（ＣＤＲ、相補性決定領域）を含有し、その中で、ＣＤＲ３領域は、特異的エピトープ認識を決定する。Ｃ末端領域において、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖は両方とも、疎水性膜貫通ドメインを含有し、短い細胞質尾部で終わる。

【0071】

典型的には、ＴＣＲは、１つのα鎖および１つのβ鎖のヘテロ二量体である。このヘテロ二量体は、ペプチドを提示するＭＨＣ分子に結合することができる。

【0072】

本発明の文脈における「可変ＴＣＲα領域」または「ＴＣＲα可変鎖」または「可変ドメイン」という用語は、ＴＣＲα鎖の可変領域を指す。本発明の文脈における「可変ＴＣＲβ領域」または「ＴＣＲβ可変鎖」という用語は、ＴＣＲβ鎖の可変領域を指す。

【0073】

ＴＣＲ遺伝子座および遺伝子は、国際免疫遺伝学（ＩＭＧＴ）ＴＣＲ学名命名法（ＩＭＧＴデータベース、ｗｗｗ．ＩＭＧＴ．ｏｒｇ；Giudicelli, V., et al., IMGT/LIGM-DB, the IMGT(R) comprehensive database of immunoglobulin and T cell receptor nucleotide sequences, Nucl. Acids Res., 34, D781-D784 (2006). PMID: 16381979; T cell Receptor Factsbook, LeFranc and LeFranc, Academic Press ISBN 0-12- 441352-8）を使用して命名される。

【0074】

本発明のさらなる態様は、本明細書に記載されるＣＤ３融合タンパク質をコードする配列を含有する核酸分子に言及する。

【0075】

核酸分子は、蛍光タンパク質をコードする配列をさらに含んでもよい。典型的には、ＣＤ３融合タンパク質をコードする配列と蛍光タンパク質をコードする配列との間に、リボソームスキッピング配列が存在する。

【0076】

以下の表は、それぞれのペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を示す。

【0077】

【表1】

【0078】

「核酸分子」は、一般に、ＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーを意味し、これは、一本鎖または二本鎖であり得、天然起源から合成または得ることができ（例えば、単離および／または精製される）、天然、非天然または変更されたヌクレオチドを含有することができ、未改変オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間で見られるホスホジエステルの代わりに、天然、非天然または変更されたヌクレオチド間の連結、例えば、ホスホロアミデート連結またはホスホロチオエート連結を含有することができる。好ましくは、本明細書に記載される核酸は、組換え体である。本明細書で使用される場合、「組換え体」という用語は、（ｉ）天然もしくは合成核酸セグメントを、生細胞中で複製し得る核酸分子に接合することによって、生細胞の外側で構築される分子、または（ｉｉ）上記（ｉ）に記載されたものの複製から得られる分子を指す。本発明の目的のために、複製は、インビトロ複製またはインビボ複製であり得る。核酸は、当技術分野において公知の手順、または市販の手順（例えば、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒおよび同様の会社から）を使用して、化学合成および／または酵素的ライゲーション反応に基づいて構築することができる。例えば、Sambrook et al.を参照されたく、核酸は、天然に存在するヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増加させるように、もしくはハイブリダイゼーションの際に形成される二重鎖の物理的安定性を増加させるように設計されたさまざまな改変ヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチド）を使用して化学的に合成することができる。核酸は、組換えＴＣＲ、ポリペプチド、もしくはタンパク質、またはその機能的部分もしくは機能的バリアントのいずれかをコードする任意のヌクレオチド配列を含み得る。

【0079】

本開示は、単離された核酸または精製された核酸のバリアントであって、バリアント核酸が、本明細書に記載されるＣＤ３融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なヌクレオチド配列を含む、バリアントも提供する。

【0080】

本開示は、本明細書に記載される核酸のいずれかのヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列、またはストリンジェントな条件下で本明細書に記載される核酸のいずれかのヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸または精製された核酸も提供する。

【0081】

ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列は、好ましくは、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。「高ストリンジェンシー条件」とは、ヌクレオチド配列が、非特異的ハイブリダイゼーションよりも検出可能な強い量で、標的配列（本明細書に記載される核酸のいずれかのヌクレオチド配列）に特異的にハイブリダイズすることを意味する。高ストリンジェンシー条件は、ヌクレオチド配列に適合したわずかな小領域（例えば、３～１０塩基）を偶然有するランダム配列から、正確に相補的な配列を有するポリヌクレオチド、または散在するわずかな不適合のみを含有するポリヌクレオチドを識別するであろう条件を含む。そのような相補性の小領域は、１４～１７塩基またはそれより多い塩基の全長相補体よりも容易に融解し、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、それらを容易に識別可能にする。比較的高ストリンジェンシー条件は、例えば、低塩および／または高温の条件、例えば、約５０～７０℃の温度で、約０．０２～０．１ＭのＮａＣｌまたは等価物によって提供されるような条件を含むであろう。そのような高ストリンジェンシー条件は、存在する場合、ヌクレオチド配列と鋳型または標的鎖との間の不適合をほとんど許容せず、本明細書に記載されるＴＣＲのいずれかの発現を検出するために特に好適である。一般に、条件が、ホルムアミドの漸増量の添加によって、よりストリンジェントになり得ることが認識されている。

【0082】

本明細書の他の箇所で既に記載されているように、ＴＣＲをコードする核酸は、改変されていてもよい。核酸配列全体における有用な改変は、コドン最適化であり得る。発現されるアミノ酸配列内に保存的置換をもたらす変更がなされてもよい。これらのバリエーションは、機能に影響を及ぼさないＴＣＲ鎖のアミノ酸配列の相補性決定領域および非相補性決定領域においてなされ得る。通常、付加および欠失は、ＣＤＲ３領域において行われることはない。

【0083】

別の実施形態は、本明細書に記載されるＣＤ３融合タンパク質をコードする核酸を含むベクターに言及する。

【0084】

ベクターは、好ましくは、プラスミド、シャトルベクター、ファージミド、コスミド、発現ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、または遺伝子治療において使用される粒子および／もしくはベクターである。

【0085】

「ベクター」は、核酸配列を、コードされたポリペプチドの合成が起こり得る好適な宿主細胞中に運ぶ能力を有する任意の分子または組成物である。典型的には、かつ好ましくは、ベクターは、所望の核酸配列（例えば、本発明の核酸）を組み込むために、当技術分野において公知である組換えＤＮＡ技法を使用して操作された核酸である。ベクターは、ＤＮＡもしくはＲＮＡを含んでいてもよく、かつ／またはリポソームを含んでもよい。ベクターは、プラスミド、シャトルベクター、ファージミド、コスミド、発現ベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、または遺伝子治療において使用される粒子および／もしくはベクターであり得る。ベクターは、宿主細胞における複製を可能にする核酸配列、例えば、複製開始点を含んでもよい。ベクターはまた、１つまたは複数の選択マーカー遺伝子、および当業者に公知の他の遺伝要素を含んでもよい。ベクターは、好ましくは、前記核酸の発現を可能にする配列に作動可能に連結された本発明による核酸を含む発現ベクターである。

【0086】

好ましくは、ベクターは、発現ベクターである。より好ましくは、ベクターは、レトロウイルス、より具体的には、ガンマ－レトロウイルス、またはレンチウイルスのベクターである。

【0087】

本発明の別の態様は、ＣＤ３刺激剤およびＣＤ２８刺激剤によるＴＣＲ陰性Ｔ細胞の活性化のための、本明細書に記載される融合タンパク質または本明細書に記載される核酸分子の使用に言及する。好ましくは、ＣＤ３刺激剤は、活性化抗ＣＤ３抗体またはその結合性断片である。

【0088】

ＣＤ２８刺激剤は、リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）の細胞（典型的には、ＣＤ８６および／またはＣＤ８０を介してＣＤ２８を活性化する）または活性化抗ＣＤ２８抗体であり得る。好ましくは、ＣＤ２８刺激剤は、活性化抗ＣＤ２８抗体である。

【0089】

好ましくは、ＴＣＲ非依存性活性化のために、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体またはその結合性断片、例えば、Ｆａｂ断片を含む組成物が使用される。抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体またはその結合性断片は、例えば、ビーズ上に、Ｓｔｒｅｐｔａｍｅｒｓ（登録商標）上に、または組織培養容器表面上に固定化されていてもよい。好ましくは、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を含む組成物は、ビーズ上に固定化されている。

【0090】

したがって、結合性断片は、インタクトな全長抗体の部分、例えば、完全抗体の抗原結合性領域または可変領域を含み得る。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＩｄおよびＦｖ断片；ダイアボディ；線状抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；多重特異性抗体断片、例えば、二重特異性、三重特異性、および多重特異性抗体（例えば、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ）；ミニボディ；キレート組換え抗体；トリボディまたはバイボディ；イントラボディ；ナノボディ；小モジュール免疫製剤（ＳＭＩＰ）、結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質；ラクダ化抗体；ＶＨＨ含有抗体；および抗体断片から形成される任意の他のポリペプチドが挙げられる。当業者は、抗体の抗原結合機能が全長抗体の断片によって行われ得ることを承知している。好ましくは、結合性断片は、Ｆａｂ断片である。

【0091】

Ｆａｂ断片は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる。Ｆ（ａｂ’）２断片は、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む。Ｆｄは、抗体のシングルアームのＶＨおよびＣＨ１ドメインである。Ｆｖ断片は、抗体のシングルアームのＶＬおよびＶＨドメインである。

【0092】

Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 番号１１１３２Ｄ）などの固定化された抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を有するビーズは市販されている。また、（Ｉｂａ、番号６－８９０１－０００）などのｓｔｒｅｐｔａｍｅｒｓ（登録商標）を使用することができる。好ましくは、ビーズ、すなわち、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 番号１１１３２Ｄ）が使用される。

【0093】

ｓｔｒｅｐｔａｍｅｒｓ（登録商標）は、Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）多量体に結合しているＦａｂ断片を含有する。Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）多量体は、多量体化されたＳｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）であり、これはストレプトアビジンのムテインである。

【0094】

そのため、本方法は、サイトカインもフィーダー細胞も刺激のために必要ではないので有利であり、より価格が安く、より効率的な刺激をもたらす。

【0095】

本発明の別の態様は、Ｔ細胞のＴＣＲ非依存性活性化のための方法であって、
－ 本明細書に記載されるＣＤ３融合タンパク質をＴ細胞において発現させるステップ、
－ Ｔ細胞をＣＤ３刺激剤およびＣＤ２８刺激剤で刺激するステップ
を含む、方法に言及する。

【0096】

方法はまた、内因性ＴＣＲの欠失のステップを含んでもよい。そのため、方法は、
－ 本明細書に記載されるＣＤ３融合タンパク質をＴ細胞において発現させるステップ、
－ Ｔ細胞の内因性ＴＣＲを欠失させるステップ、
－ Ｔ細胞をＣＤ３刺激剤およびＣＤ２８刺激剤で刺激するステップ
を含んでもよい。

【0097】

本発明の具体的な実施形態において、方法は、
－ 本明細書に記載されるＣＤ３融合タンパク質をＴ細胞において発現させるステップ、
－ Ｔ細胞の内因性ＴＣＲを欠失させるステップ、
－ Ｔ細胞をＣＤ３刺激剤およびＣＤ２８刺激剤で刺激するステップ
－ 外因性Ｔ細胞エフェクター分子を発現させるステップ
－ 任意選択で、ＣＤ３融合タンパク質を欠失させるステップ
を含む。

【0098】

Ｔ細胞の内因性ＴＣＲを欠失させるステップおよびＣＤ３融合タンパク質をＴ細胞において発現させるステップは、実質的に並行して起こってもよい。これは、２つのステップ間、すなわち、Ｔ細胞の内因性ＴＣＲを欠失させることとＣＤ３融合タンパク質を発現させることとの間、またはＣＤ３融合タンパク質を発現させることＴ細胞の内因性ＴＣＲを欠失させることとの間の時間が、１２時間未満、好ましくは、６時間未満、より好ましくは、１時間未満、さらにより好ましくは、１０分未満、さらにより好ましくは、５分未満、最も好ましくは、１分未満であることを意味する。

【0099】

外因性Ｔ細胞エフェクター分子は、外因性抗原特異的受容体、より具体的には、Ｔ細胞の少なくとも１つのエフェクター機能を活性化することができる外因性抗原特異的受容体であり、ＴＣＲ、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、または抗体がカップリングしたＴ細胞受容体であり得る。好ましくは、Ｔ細胞の少なくとも１つのエフェクター機能を活性化することができる外因性抗原特異的受容体は、ＴＣＲである。

【0100】

エフェクター分子は、安定にまたは一過性にＴ細胞に導入され得る。安定導入は、典型的には、限定されないが、安定トランスフェクション、ウイルス形質導入、またはゲノムの定義された標的部位での安定導入を可能にする方法、例えば、セーフハーバー遺伝子座またはｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙ技法によって行われ得る。一過性導入は、典型的には、一過性トランスフェクションによって、好ましくは、ｉｖｔＲＮＡの一過性トランスフェクションによって起こる。好ましい実施形態において、特に遺伝子操作されたＴ細胞が治療のために使用される場合、エフェクター分子、例えば、外因性のＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖は、Ｔ細胞に安定に導入され得る。遺伝子操作されたＴ細胞が所望のＴＣＲを特性評価するために使用される場合、Ｔ細胞は、典型的には、一過性トランスフェクトされる、好ましくは、ｉｖｔＲＮＡで一過性トランスフェクトされる。本発明のさらなる態様は、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の両方がノックアウトされ、インビトロでの内因性ＴＣＲ増殖刺激と独立してＴ細胞の増殖を可能にする少なくとも１つの外因性分子を含む、Ｔ細胞に関する。

【0101】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、モノクローナル抗体のＴ細胞に対する特異性を付与するモジュール的にアセンブルされた人工受容体である。細胞外ドメインは、可撓性リンカーによって分離された免疫グロブリン軽鎖および重鎖からなる抗体由来一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。ｓｃＦｖは、スペーサーおよび膜貫通ドメインを介してサイトゾルシグナル伝達ドメインに連結される。ＣＡＲは、限定されないが、ＣＤ３ζ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＤＡＰ１０、ＦｃＲ、および／またはＯＸ４０などの共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。

【0102】

ＴＣＲ非依存性Ｔ細胞活性化の目標は、細胞培養の間に生存可能な発現されるＴＣＲを欠いているＴ細胞を保つこと、すなわち、細胞培養においてＴ細胞を拡大増殖することである。トランスジェニック／組換えＴＣＲまたはキメラ抗原受容体の発現の際に、Ｔ細胞は、細胞のエフェクター機能（すなわち、ＩＦＮ－γ放出）および死滅能力を誘発する。典型的には、ＴＣＲ複合体は、ノックアウトされるか、その発現は、本発明の方法の一段階で抑制される。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＣＤ３融合タンパク質を含むＴ細胞は、機能的ＴＣＲを発現しないか、または言い換えると、ＴＣＲ受容体陰性である。

【0103】

本明細書に記載されるＣＤ３融合タンパク質を含むそのようなＴＣＲ陰性Ｔ細胞は、レシピエント細胞の免疫エフェクター機能を活性化することができる外因性受容体の導入のために直ぐに使用できる。

【0104】

いくつかの実施形態において、細胞は、単離されているか、または天然に存在しない。

【0105】

具体的な実施形態において、細胞は、本明細書に記載されるＣＤ３融合タンパク質をコードする核酸、または前記核酸を含むベクターを含み得る。

【0106】

細胞において、上記に記載のＣＤ３融合タンパク質をコードする核酸配列を含む上記に記載のベクターが導入され得るか、または前記ＣＤ３融合タンパク質をコードするｉｖｔＲＮＡが導入され得る。細胞は、Ｔ細胞などの末梢血リンパ球であり得る。初代ヒトＴ細胞のレンチウイルスベクターによる形質導入は、例えば、Cribbs “simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells” BMC Biotechnol. 2013; 13: 98に記載されている。

【0107】

「トランスフェクション」および「形質導入」という用語は交換可能であり、外因性核酸配列が、宿主細胞、例えば、真核宿主細胞に導入されるプロセスを指す。核酸配列の導入または移入は、言及される方法に限定されないが、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、遺伝子銃送達、リポフェクション、スーパーフェクション、およびレトロウイルス、または形質導入もしくはトランスフェクションのための他の好適なウイルスによる言及される感染を含む任意のいくつかの手段によって達成され得ることに留意されたい。

【0108】

いくつかの実施形態において、細胞は、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。細胞は、ナチュラルキラー細胞またはＴ細胞であってもよい。好ましくは、細胞は、Ｔ細胞である。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞であってもよい。いくつかの実施形態において、細胞は、幹細胞様メモリーＴ細胞である。

【0109】

幹細胞様メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、自己再生および長期間存続する能力によって特徴付けられる、分化の程度が低いＣＤ８＋Ｔ細胞の亜集団である。これらの細胞がインビボでそれらの抗原に遭遇すると、それらは、一部の静止して残っているＴＳＣＭとともに、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ）および最終分化エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭＲＡ）にさらに分化する（Flynn et al., Clinical & Translational Immunology (2014)）。これらの残っているＴＳＣＭ細胞は、インビボで永続的な免疫記憶を構築する能力を示し、したがって、養子Ｔ細胞療法のための重要なＴ細胞亜集団であると考えられる（Lugli et al., Nature Protocols 8, 33-42 (2013)、Gattinoni et al., Nat. Med. 2011 Oct; 17(10): 1290-1297）。幹細胞メモリーＴ細胞サブタイプにＴ細胞プールを限定するために、免疫磁気選択を使用することができる。（Riddell et al. 2014, Cancer Journal 20(2): 141-44）を参照されたい。

【0110】

本発明はまた、医薬としての使用のためであり得るＴ細胞にも言及する。特に、本発明は、がんまたはウイルス性疾患の処置のためのＴ細胞に言及する。

【0111】

ＴＣＲの欠失
ＴＣＲなどのヘテロ二量体細胞表面タンパク質についての効率的なノックアウト戦略の作成が、レシピエント細胞の作製のために重要であることは当業者には明らかである。

【0112】

ＴＣＲの両方の鎖のダブルノックアウトは、以下のステップ：
（ａ）内因性ＴＣＲα鎖のノックアウト、
（ｂ）機能的ＴＣＲを欠いている細胞についての選択、
（ｃ）内因性ＴＣＲβ鎖のノックアウト、
（ｄ）ＴＣＲα鎖の一過性発現、
（ｅ）機能的ＴＣＲを欠いている細胞についての選択
によって達成され得るか、または代わりに、以下のステップ：
（ａ）内因性ＴＣＲβ鎖のノックアウト、
（ｂ）機能的ＴＣＲを欠いている細胞についての選択、
（ｃ）内因性ＴＣＲα鎖のノックアウト、
（ｄ）ＴＣＲβ鎖の一過性発現、
（ｅ）機能的ＴＣＲを欠いている細胞についての選択
によって達成される。

【0113】

特定の実施形態において、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖両方のダブルノックアウトは、以下のステップ：
（ａ）内因性ＴＣＲβ鎖のノックアウト、
（ｂ）機能的ＴＣＲを欠いている細胞についての選択、
（ｃ）内因性ＴＣＲα鎖のノックアウト、
（ｄ）ＴＣＲβ鎖の一過性発現、
（ｅ）機能的ＴＣＲを欠いている細胞についての選択
によって達成され得る。

【0114】

当業者は、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の連続したノックアウトのこの戦略が、好ましい実施形態であり、したがって、本出願の開示を限定するものではないことを理解する。あるいは、ダブルノックアウトは、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の同時ノックアウトによっても達成され得る。

【0115】

ステップ（ｄ）において、プレＴＣＲα鎖または成熟α鎖のいずれかが一過性に発現され得る。プレＴＣＲα鎖は、サロゲートＴＣＲα鎖（インバリアントｐＴα鎖とも呼ばれる）であり、これは、Ｔ細胞の発達の間に発現される。「ＴＣＲα鎖の成熟形態」または「成熟ＴＣＲα鎖」という用語は、ＴＣＲα鎖遺伝子の配置後に通常存在し、プレＴＣＲα鎖が排除されたＴＣＲα鎖配列を指す。

【0116】

好ましくは、ステップ（ｄ）「ＴＣＲα鎖の一過性発現」において、ＴＣＲα鎖の成熟形態は、一過性に発現される。

【0117】

「レシピエント細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、内因性のＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の両方のダブルノックアウトに起因して機能的ＴＣＲを発現せず、内因性ＴＣＲ増殖刺激と独立して増殖することができる、Ｔ細胞を指す。

【0118】

（内因性）ＴＣＲαおよびβ鎖のノックアウトおよびダブルノックアウトは、例えば、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）系を含む分子クローニングツール、照射、または化学的変異誘発によって達成することができる。ダブルノックアウトという用語は、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の両方をコードする生産的に配列された対立遺伝子が働かなくなり、その結果、ＴＣＲα鎖もＴＣＲβ鎖もダブルノックアウト細胞中に存在しないことを意味する。これは、ダブルノックアウト細胞が、細胞表面上でのＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の両方の機能的発現を欠くことを意味するだけでなく、機能的内因性ＴＣＲα鎖も機能的内因性ＴＣＲβ鎖も細胞中に存在しないことも意味する（例えば、ＥＲ）。

【0119】

「機能的内因性ＴＣＲα鎖」、「機能的ＴＣＲα鎖」および「機能的ＴＣＲ鎖」という用語は、本明細書で使用される場合、機能的ＴＣＲα鎖が機能的ＴＣＲβ鎖と対形成することができ、したがって、細胞表面で発現され得ることを意味する。したがって、機能的ではないＴＣＲα鎖は、機能的ＴＣＲβ鎖と対形成することができないＴＣＲα鎖を指し、したがって、ＴＣＲα鎖は、細胞表面で発現されない。

【0120】

「機能的内因性ＴＣＲβ鎖」、「機能的ＴＣＲβ鎖」および「機能的ＴＣＲ鎖」という用語は、本明細書で使用される場合、機能的ＴＣＲβ鎖が機能的ＴＣＲα鎖と対形成することができ、したがって、細胞表面で発現され得ることを意味する。したがって、機能的ではないＴＣＲβ鎖は、機能的ＴＣＲα鎖と対形成することができないＴＣＲβ鎖を指し、したがって、ＴＣＲβ鎖は、細胞表面で発現されない。

【0121】

ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮは、調節可能な配列特異的ＤＮＡ結合性ドメインおよび非特異的ＤＮＡ切断ドメインから構成される。指向性ＤＮＡ二本鎖破壊を導入すること、およびエラープローン非相同末端接合または相同性－指向性修復機構を刺激することによって、それらは遺伝子操作のための優れたツールを提供する。ＴＡＬＥＮのＤＮＡ結合性ドメインは、可変の長さの中央のリピートドメインによって特徴付けられる一方、各リピートは、典型的には、３４アミノ酸からなる。ＤＮＡ結合性ドメインの特異性は、各リピートの１２位および１３位の超可変アミノ酸の隣接対に依存し、これは、リピート－可変二残基（ＲＶＤ）と称されている。配列特異性は、単純なコードによって支配され、各ＲＶＤは、独立して、ＤＮＡ中の１つの塩基対を特定する。４つの最も一般的なＲＶＤは、ＤＮＡ中の４つの塩基の１つと優先的に会合する（ＮＧ＝Ｔ、ＨＤ＝Ｃ、ＮＩ＝Ａ、ＮＮ＝Ｇ）。

【0122】

当業者は、ＴＡＬＥＮの構築のための異なるプロトコールを承知している。ほとんどの戦略は、指示された方法で多数のＤＮＡ断片の同時アセンブリーを可能にするゴールデンゲートクローニングに基づく（Cermak et al., 2011, Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic acids research, 39(12), e82；Li et al., 2011, Modularly assembled designer TAL effector nucleases for targeted gene knockout and gene replacement in eukaryotes. Nucleic acids research, 39(14), 6315-25；Morbitzer et al., 2011, Assembly of custom TALE-type DNA binding domains by modular cloning. Nucleic acids research, 39(13), 5790-9, 2011；Sanjana, et al. 2012; A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering. Nature protocols, 7(1), 171-92.）。この方法は、単一の反応混合物中で消化およびライゲーションを行うことを可能にするＩＩＳ型制限酵素の使用に基づく。ＩＩＳ型制限酵素は、固有の４ｂｐのオーバーハングを作出する認識部位の外側を切断するそれらの性質によって特徴付けられる。プラスミドのクローニングのために使用される場合、正しいライゲーションは、断片の正しいアセンブリーの際に、固有のオーバーハングおよび認識部位の排除によって確保される（Engler et al., 2009 Golden gate shuffling: a one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PloS one, 4(5), e5553）。この適用において、Cermak et al. (2011)の方法は、ＴＡＬＥＮの構築のために使用された。市販のキット、例えば、ＥＺ－ＴＡＬ（商標）（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）またはＦａｓｔＴＡＬＥＮ（商標）（Ｓｉｄａｎｓａｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，ＬＴＤ）、ならびに市販のサービス、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃまたはＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａによって提供されるサービスが、ＴＡＬＥＮアセンブリーのために利用可能である。

【0123】

具体的な実施形態において、ダブルノックアウトは、ＴＡＬＥＮによって得られる。ＴＣＲα鎖のＴＡＬＥＮ標的領域は、可変ＡＶセグメント中または定常ＡＣセグメント中にあり得る。ＴＣＲβ鎖のＴＡＬＥＮ標的領域は、可変ＢＶセグメント中または定常ＢＣセグメント中にあり得る。ある特定の実施形態において、ＴＣＲα鎖のＴＡＬＥＮ標的領域は、定常ＡＣセグメント中にあり、かつ／またはＴＣＲβ鎖のＴＡＬＥＮ標的領域は、定常ＢＣセグメント中にある。具体的な実施形態において、ＴＣＲα鎖のＴＡＬＥＮ標的領域は、定常ＡＣセグメント中にあり、かつＴＣＲβ鎖のＴＡＬＥＮ標的領域は、定常ＢＣセグメント中にある。

【0124】

ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの代替は、ＣＲＩＳＰＲ系によって提供される。細菌において、ＣＲＩＳＰＲ系は、ＣＲＩＳＰＲ系を使用する場合にＲＮＡがガイドするＤＮＡ切断を介して、外来性ＤＮＡの侵入に対する獲得免疫を提供し、２つの構成要素は、ゲノム編集を行うために細胞に導入されなければならない：ヌクレアーゼ（一般に、Ｃａｓ９）およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）。ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）部分およびトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）部分からなる。ｇＲＮＡの５’末端の２０ヌクレオチドは、ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９を特異的標的ＤＮＡ部位に向かわせ、これは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列の直ぐ５’側になければならない。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、マウス、ラットおよびヒトの細胞株を含む各種の種において遺伝子を変更するために使用され得る（例えば、Sander and Joung, 2014, Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs, Nat Biotechnol. 2014 Mar; 32(3): 279-284を参照されたい）。

【0125】

ＴＣＲα鎖の標的領域は、定常ＡＣセグメント中で選択され得、かつ／またはＴＣＲβ鎖の標的領域は、定常ＢＣセグメント中で選択され得る。それにより、任意の特異性の任意のＴＣＲα鎖が標的にされ得、かつ／または任意の特異性の任意のＴＣＲβ鎖が標的にされ得る。そのため、異なる特異性を有する異なるＴＣＲ、例えば、異なる可変鎖を有するＴＣＲに対する異なる標的領域を選択する必要はない。しかしながら、ノックアウトが、可変ＴＣＲα鎖の種類および可変ＴＣＲβ鎖の種類が公知である特異的細胞クローンにおいて行われる場合、ＴＣＲα鎖の標的領域は、可変ＡＶセグメント中で選択され得、かつ／またはＴＣＲβ鎖の標的領域は、可変ＢＶセグメント中で選択され得る。

【0126】

あるいは、ノックアウトおよび／またはダブルノックアウトは、照射または化学的変異誘発によって達成されてもよい。照射または化学的変異誘発によるノックアウトは標的化されていないので、処理された細胞は、細胞表面で機能的ＴＣＲを発現しない変異体について効率的に選択されなければならない。したがって、本発明の方法、すなわち、第２のノックアウト後の相補的ＴＣＲ鎖の一過性発現と組み合わせた細胞表面でのＴＣＲの存在に基づくノックアウト細胞の選択は、ランダム変異誘発戦略と組み合わせて非常に有用である。

【0127】

加えて、特にレシピエント細胞がインビボで使用される場合、照射された細胞は、例えばＴ細胞エフェクター機能の喪失をもたらす他の変異によって影響を受けないＴＣＲノックアウト細胞を選択するために、機能的に分析され得る。

【0128】

「内因性のＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖」という用語は、Ｔ細胞に固有であるＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を指す。

【0129】

ＴＣＲα鎖の欠失は、欠失の７～１０日後に成熟Ｔ細胞の細胞表面上のＴＣＲの喪失をもたらすが、少量の表面結合したＴＣＲβ鎖は、長期間にわたって発現された（Polic et al., How αβ T cells deal with induced TCRα ablation. Proceedings of the National Academy of Sciences, 98(15), 8744-8749.2001）。さらに、外因性ＴＣＲがシングルノックアウト変異体に導入される場合、内因性ＴＣＲ鎖の存在は、未知の特異性を有する混合ＴＣＲヘテロ二量体の発現をもたらし得る（Sommermeyer et al., 2006, Designer T cells by T cell receptor replacement; European Journal of Immunology, 36(11), 3052-9.）。そのため、両方のＴＣＲ鎖をノックアウトすることは、細胞表面上での内因性ＴＣＲ鎖のさらに低レベルの発現、および外因性ＴＣＲ鎖の発現の際に混合ＴＣＲヘテロ二量体の可能性のある形成を防止する利点を有する。

【0130】

一過性発現は、例えば、ｉｖｔＲＮＡの発現によって行われ得る。

【0131】

好ましい実施形態において、ステップ（ｄ）において一過性に発現されるＴＣＲα鎖は、ＴＣＲα鎖の成熟形態である。

【0132】

当業者は、３つの異なるタンパク質を含むタンパク質複合体のノックアウトのこの例から、本原理の適用によって、３つ超のタンパク質を含む表面タンパク質複合体のノックアウトも作製され得ることを理解する。

【0133】

「細胞表面でＴＣＲを欠いている」という用語は、細胞表面上でＴＣＲα／ＴＣＲβヘテロ二量体を発現しない細胞を指す。Ｔ細胞が細胞表面でＴＣＲを発現するかどうかは、例えば、ＴＣＲ複合体のタンパク質への抗体結合およびフローサイトメトリーに基づいて検出することができる。

【0134】

本適用の一実施形態は、ＴＣＲレシピエント細胞を得るための方法の提供に言及する。得られる両方のＴＣＲレシピエント細胞において、内因性のＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖はノックアウトされている。

【0135】

「ＴＣＲα鎖の一過性発現」、「成熟ＴＣＲα鎖の一過性発現」または「ＴＣＲβ鎖の一過性発現」という用語は、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の非安定発現を指す。ある特定の実施形態において、一過性発現は、細胞のｉｖｔＲＮＡによるトランスフェクションを介して起こる。第２のノックアウトステップ後のＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の一過性発現は、２つのＴＣＲ鎖の１つが依然として存在し、一過性に発現したＴＣＲ鎖が細胞中で永続的に発現されない利点を有する細胞間を識別することを可能にする。そのため、ｉｖｔＲＮＡの産物がもはや発現されず、発現した産物が分解される場合、細胞は、一過性に発現されるＴＣＲ鎖を欠いている。

【0136】

したがって、ステップ（ｅ）における細胞表面でＴＣＲを欠いている細胞の選択後、ｉｖｔＲＮＡがもはや発現されず、発現した産物が分解される場合、細胞は、機能的なＴＣＲα鎖もＴＣＲβ鎖も発現しない。

【0137】

通常、ＣＤ３融合タンパク質は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１４０、少なくとも１６０、少なくとも１８０、少なくとも２００、少なくとも２２０、少なくとも２４０、少なくとも２６０、少なくとも２８０、少なくとも３００世代、またはそれ以上の世代の間、インビトロで、内因性ＴＣＲ増殖刺激と独立したＴ細胞の増殖を可能にする。これは、細胞集団の実質的に一部が、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１４０、少なくとも１６０、少なくとも１８０、少なくとも２００、少なくとも２２０、少なくとも２４０、少なくとも２６０、少なくとも２８０、少なくとも３００回、またはそれ以上の回数、分裂することを意味する。

【0138】

例えば患者が良くない副作用を経験する場合、治療用細胞を選択的に死滅させるために、例えばカスパーゼドメインを含む分子を、レシピエント細胞に導入することができ、これは、リガンド結合の際にアポトーシスを誘導する。

【0139】

さらに、操作されたＴ細胞に対する患者の免疫応答を回避するために、免疫原性表面タンパク質は、レシピエント細胞においてノックアウトされてもよい。したがって、細胞表面上でのＭＨＣ ＩおよびＭＨＣ ＩＩ複合体分子の発現は、例えばノックアウトによって、妨げられ得る。例えば、ＭＨＣ Ｉ複合体は、例えばベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の両方の対立遺伝子を破壊することによって、レシピエント細胞においてノックアウトされ得る。

【0140】

Ｔ細胞は、ＣＤ８および／もしくはＣＤ４を発現してもよく、またはＣＤ８およびＣＤ４の両方を欠いていてもよい。

【0141】

ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ４を発現する。他の実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ８を発現し得る。

【0142】

「Ｔ細胞エフェクター機能」は、とりわけ、サイトカインおよび／もしくは細胞傷害性エフェクタータンパク質、例えば、パーフォリン、グランザイム、およびグラニュリシンの放出、ならびに／またはＦａｓリガンドの発現を指す。Ｔ細胞エフェクター機能は、Janeway, Immunobiology: The Immune System in Health and disease, 2011に詳細に記載されている。異なるＴ細胞型は、異なるＴ細胞エフェクター機能を示す。

【0143】

例えば、ＩＦＮ－γは、Ｔ_Ｈ１型のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方によって放出される。したがって、ＩＦＮ－γの放出は、Ｔ細胞エフェクター機能についての一般的な試験である。当業者は、ＩＦＮ－γの測定のための異なる技法、例えば、ＩＦＮ－γ酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）（ＢＤ ＯｐｔＥＩＡ（商標））を承知している。

【0144】

「外因性」という用語は、分子が遺伝子工学技法のいずれかによって各細胞に移入されていることを指す。

【0145】

本出願は、外因性エフェクター分子、特に、外因性ＴＣＲを試験および特性評価するための遺伝子操作されたＴ細胞の使用も企図する。本出願は、ＴＣＲペプチド感受性、多量体結合特性、ならびに細胞傷害性アッセイおよびサイトカイン放出アッセイにおける機能性の調査を企図する。特性評価されるべき目的のＴＣＲは、レシピエント細胞に導入されていてもよい。目的のＴＣＲを持つそれによって作製された遺伝子操作されたＴ細胞は、外因性ＴＣＲの試験および特性評価のために使用することができる。

【0146】

具体的な実施形態において、本発明のＴ細胞は、正常な核型を有する。特に、レシピエント細胞が治療のために使用される場合、異常な核型を有する細胞はがん性細胞に進行する可能性が非常に高いので、レシピエント細胞は、正常な核型を有し、異常な核型を有するように変更されていないことが好ましい。「正常な核型」という用語は、例えば、染色体バンディング分析または蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）で検出可能な任意の眼に見える核型の異常を欠く細胞の状態を指す。

【実施例】

【0147】

構築物の正しい発現およびフォールディングを、α－ＣＤ３抗体およびｅＧＦＰ発現を介して、図１に記載されるように、ＣＤ３融合タンパク質の検出によって、ＴＣＲ欠損Ｊｕｒｋａｔ－７６細胞において検証した（図３）。形質導入Ｊｕｒｋａｔ－７６細胞を、抗ＣＤ３抗体による染色とその後のフローサイトメトリー分析によって、形質導入の７日後にＣＤ３融合タンパク質の発現およびｅＧＦＰ発現について分析した。生じた単一細胞クローンを、ＦＡＣＳの２週後に、抗ＣＤ３抗体染色とそれに続くフローサイトメトリー分析によって、ＣＤ３融合タンパク質およびｅＧＦＰの発現について再び評価した。作製された単一細胞クローンは、ＣＤ３キメラの発現レベルが、異なるクローンにおいて変わることを実証した。

【0148】

２人のドナー由来のＴＣＲ陰性Ｔ細胞を作製し、α－ＣＤ３抗体刺激を介して細胞の拡大増殖が可能になるように、ＣＤ３融合タンパク質で同時に形質導入した。単離されたクローンのＣＤ８^＋＿００１およびＣＤ８^＋＿００２は、インビトロで拡大増殖し、内因性ＴＣＲと独立した非常に高い増殖速度を示した（図４ａ）。これらのＴ細胞クローンの高い拡大増殖速度は、抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ－３）の存在下でのみ達成され得、これは、α－ＣＤ３抗体のＣＤ３キメラ構築物への結合が、これらのＴＣＲ陰性Ｔ細胞の活性化をもたらしたことを実証した（図４ｂ）。

【0149】

ＣＤ３融合タンパク質を使用して作製された汎用レシピエント細胞は、細胞の任意のバックグラウンド活性化なしで、トランスジェニックＴＣＲ（国際公開第２０１０／０５８０２３Ａ１号およびWilde, S., D. Sommermeyer, B. Frankenberger, M. Schiemann, S. Milosevic, S. Spranger, H. Pohla, W. Uckert, D. H. Busch, and D. J. Schendel. 2009. Dendritic cells pulsed with RNA encoding allogeneic MHC and antigen induce T cells with superior antitumor activity and higher TCR functional avidity. Blood 114: 2131-2139に開示されるＴ５８、Ｄ１１５）発現、特異性、機能的アビディティー（図５ａ～５ｃ）、および死滅能力（図６）の試験を可能にする。それぞれＴ５８またはＤ１１５のいずれかで形質導入された単離されたＴ細胞クローン（ＣＤ８＋＿００１およびＣＤ８＋＿００２）およびＰＢＬを、それぞれのトランスジェニックＴＣＲβ鎖およびＹＭＤＧＴＭＳＱＶ（ＹＭＤ、供給源：ｉｍｍｕｎＡｗａｒｅ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）ペプチドを含む四量体に特異的なα－ＣＤ３およびα－ＴＣＲ－Ｖβ抗体（ＴＲＢＶ抗体、ＴＣＲ－Ｖβ２３、Ｔ５８、ＡＦ２３、ＩｇＧ１マウスＰＥ；ＴＣＲ－Ｖβ８、Ｄ１１５、５６Ｃ５．２、ＩｇＧ２ａマウス、両方ともＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で染色した（図５ａ）。ＦＡＣＳによる富化後、細胞は、フローサイトメトリー分析によってその後に分析した。非形質導入ＣＤ８＋＿００１およびＣＤ８＋＿００２Ｔ細胞クローン、ならびに未処理ＰＢＬを、それぞれの陰性対照として使用した。ＩＦＮ－γを、形質導入Ｔ細胞（ＣＤ８＋＿００１、ＣＤ８＋＿００２またはＰＢＬ）の標的細胞との２：１のＥ：Ｔ比でのインキュベーション２０時間後の死滅アッセイにおいて使用された同じ共培養物に由来する上清のＥＬＩＳＡによって測定した。陽性対照は、７５０ｎｇ／ｍＬのＰＭＡおよび５ｎｇ／ｍＬのイオノマイシン（ＰＭＡ／Ｉｏｎｏ）で活性化されたエフェクター細胞を含んでいた。形質導入ＰＢＬのＩＦＮ－γ放出を２つの独立した実験において決定した。非形質導入細胞（ｗ／ｏ）は陰性対照としての役割を果たした。標的細胞は、チロシナーゼ陽性腫瘍細胞（Ｍｅｌ６２４．３８）およびチロシナーゼ陰性腫瘍細胞（Ａ２７３）を含んでいた（図５ｂ）。Ｋ５６２＿Ａ２＿ＣＤ８６細胞に、漸減量のペプチド（１０^－４～１０^－１２Ｍ）をロードし、それぞれＴ５８またはＤ１１５を発現するＴ細胞とともに２：１の固定Ｅ：Ｔ比で共培養した。ＩＦＮ－γ放出を、ＩＦＮ－γＥＬＩＳＡによって２０時間後に決定し、相対ＩＦＮ－γ放出を、最大ＩＦＮ－γ放出を１００％の参照値に設定することによって算出した。より低い値は、この参照に従って算出した。ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞クローン（ＣＤ８＋＿００１、ＣＤ８＋＿００２）およびＰＢＬの機能的アビディティーを、ペプチド濃度の減少に応答する相対ＩＦＮ－γ放出として図５ｃ）にプロットする。値は、生物学的な二反復に由来した。

【0150】

比較実験において、単離されたクローンのＣＤ８^＋＿００１およびＣＤ８^＋＿００２を、フィーダー（ＬＣＬ）細胞およびＯＫＴ－３抗体（標準として示す）、ＣＤ３／ＣＤ２８ｓｔｒｅｐｔａｍｅｒ（登録商標）（Ｉｂａ、番号６－８９０１－０００）、またはそこに固定化されたα－ＣＤ３抗体およびα－ＣＤ２８抗体を有するミクロスフェアビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、番号１１１３２Ｄ）のいずれかによる活性化の下、インビトロで拡大増殖させた。細胞を、２～３日間拡大増殖させた。細胞を、１５日の期間にわたって刺激した。１５日目に、細胞数を決定した。死滅アッセイを、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）ＺＯＯＭシステムを使用して実施して、２：１のＥ：Ｔ比で、７２時間にわたってＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ色素で標識されたチロシナーゼ陽性（Ｍｅｌ６２４．３８）および陰性（Ａ３７５）の腫瘍細胞の死滅（細胞溶解）をモニターした。それぞれの腫瘍細胞単独は、エフェクター細胞の非存在下で増殖についての対照としての役割を果たした。非形質導入エフェクター細胞は、トランスジェニックＴＣＲの非存在下でバックグラウンド死滅を推定するための対照としての役割を果たした。細胞数／ウェルを、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）ＺＯＯＭソフトウェア２０１６Ｂを使用することによって決定して、各アプローチの四反復で分析した。しかし、フィーダー細胞のさらなる共刺激分子は欠けており、ｓｔｒｅｐｔａｍｅｒ（登録商標）またはビーズによる刺激は、同等またはより良好なレベルで、有意な活性化さえ可能にする。

【0151】

項目
項目１． － ＣＤ３ε外部ドメイン、
－ ＣＤ３δ外部ドメインまたはＣＤ３γ外部ドメイン、
－ 膜貫通ドメイン、および
－ ＣＤ３ζドメイン
を含むＣＤ３融合タンパク質。

【0152】

項目２． 膜貫通ドメインが、ＣＤ２８膜貫通ドメインである、項目１に記載のＣＤ３融合タンパク質。

【0153】

項目３． ＣＤ３ヘテロ二量体が、ヒンジドメインによって膜貫通ドメインに連結されている、項目１または２に記載のＣＤ３融合タンパク質。

【0154】

項目４． ＣＤ３ε外部ドメインおよびＣＤ３δ外部ドメインまたはＣＤ３γ外部ドメインを膜貫通ドメインに連結するヒンジドメインが、ＩｇＧヒンジドメイン、ＣＤ２８ヒンジドメイン、またはＣＤ８ヒンジドメインからなる群から選択される、項目１～３に記載のＣＤ３融合タンパク質。

【0155】

項目５． ヒンジドメインが、ＣＤ８ヒンジドメインである、項目４に記載のＣＤ３融合タンパク質。

【0156】

項目６． 融合タンパク質が、ＣＤ８シグナルペプチドドメインをさらに含む、先行する項目に記載のＣＤ３融合タンパク質。

【0157】

項目７． ＣＤ３δ外部ドメインおよびＣＤ３ε外部ドメイン、またはＣＤ３ε外部ドメインおよびＣＤ３γ外部ドメインが、少なくとも５アミノ酸を含有するリンカーによって接続されている、先行する項目に記載のＣＤ３融合タンパク質。

【0158】

項目８． アミノ酸が、グリシンおよびセリン残基の群から選択される、項目７に記載のＣＤ３融合タンパク質。

【0159】

項目９． 融合タンパク質が、ＴＣＲ陰性Ｔ細胞がＣＤ３活性化刺激剤およびＣＤ２８活性化刺激剤と接触すると、前記融合タンパク質が発現される前記ＴＣＲ陰性Ｔ細胞を活性化することができる、項目８に記載のＣＤ３融合タンパク質。

【0160】

項目１０． ＣＤ３活性化刺激剤が、抗ＣＤ３抗体である、項目９に記載のＣＤ３融合タンパク質。

【0161】

項目１１． ＣＤ２８活性化刺激剤が、抗ＣＤ２８抗体である、項目９または１０に記載のＣＤ３融合タンパク質。

【0162】

項目１２． 融合タンパク質が、
－ ＣＤ８シグナルペプチドドメイン、
－ ＣＤ３δ外部ドメインおよびＣＤ３ε外部ドメイン、
－ ＣＤ８ヒンジドメイン、
－ ＣＤ２８膜貫通ドメイン、
－ ＣＤ３ζドメイン
を含む、先行する項目に記載のＣＤ３融合タンパク質。

【0163】

項目１３． ＣＤ８シグナルペプチドが、配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、先行する項目６～１２に記載のＣＤ３融合タンパク質。

【0164】

項目１４． ＣＤ８シグナルペプチドが、配列番号１であるアミノ酸配列を含む、先行する項目６～１２に記載のＣＤ３融合タンパク質。

【0165】

項目１５． ＣＤ３δ外部ドメインが、配列番号２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、先行する項目に記載のＣＤ３融合タンパク質。

【0166】

項目１６． ＣＤ３δ外部ドメインが、配列番号２であるアミノ酸配列を含む、先行する項目に記載のＣＤ３融合タンパク質。

【0167】

項目１７． ＣＤ３γ外部ドメインが、配列番号３と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、先行する項目に記載のＣＤ３融合タンパク質。

【0168】

項目１８． ＣＤ３γ外部ドメインが、配列番号３であるアミノ酸配列を含む、先行する項目に記載のＣＤ３融合タンパク質。

【0169】

項目１９． ＣＤ３ε外部ドメインが、配列番号４と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、先行する項目に記載のＣＤ３融合タンパク質。

【0170】

項目２０． ＣＤ３ε外部ドメインが、配列番号４であるアミノ酸配列を含む、項目３～１４に記載のＣＤ３融合タンパク質。

【0171】

項目２１． ＣＤ３δドメインおよびＣＤ３εドメイン、またはＣＤ３δドメインおよびＣＤ３γドメインを接続するリンカーが、配列番号５と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、先行する項目に記載のＣＤ３融合タンパク質。

【0172】

項目２２． ＣＤ３δ外部ドメインおよびＣＤ３ε外部ドメイン、またはＣＤ３δ外部ドメインおよびＣＤ３γ外部ドメインを接続するリンカーが、配列番号５であるアミノ酸配列を含む、先行する項目に記載のＣＤ３融合タンパク質。

【0173】

項目２３． ＣＤ８ヒンジドメインが、配列番号６と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、先行する項目に記載のＣＤ３融合タンパク質。

【0174】

項目２４． ＣＤ８ヒンジドメインが、配列番号６であるアミノ酸配列を含む、先行する項目に記載のＣＤ３融合タンパク質。

【0175】

項目２５． 膜貫通ドメインが、配列番号７と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、先行する項目に記載のＣＤ３融合タンパク質。

【0176】

項目２６． 膜貫通ドメインが、配列番号７であるアミノ酸配列を含む、先行する項目に記載のＣＤ３融合タンパク質。

【0177】

項目２７． ＣＤ３ζドメインが、配列番号８と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、先行する項目に記載のＣＤ３融合タンパク質。

【0178】

項目２８． ＣＤ３ζドメインが、配列番号８であるアミノ酸配列を含む、先行する項目に記載のＣＤ３融合タンパク質。

【0179】

項目２９． 融合タンパク質が、配列番号１１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、先行する項目に記載のＣＤ３融合タンパク質。

【0180】

項目３０． 融合タンパク質が、配列番号１１であるアミノ酸配列を含む、先行する項目に記載のＣＤ３融合タンパク質。

【0181】

項目３１． 融合タンパク質のＮ末端からＣ末端の方向でのドメインの順序が、ＣＤ３δ外部ドメインまたはＣＤ３γ外部ドメイン、リンカー、ＣＤ３ε外部ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ３ζドメインである、先行する項目に記載のＣＤ３融合タンパク質。

【0182】

項目３２． ＣＤ３融合タンパク質が、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＩＣＯＳおよびＣＤ２８からなる群から選択される共刺激分子をさらに含む、先行する項目に記載のＣＤ３融合タンパク質。

【0183】

項目３３． 項目１～３２に記載される融合タンパク質をコードする配列を含有する核酸分子。

【0184】

項目３４． ベクターが、蛍光タンパク質をコードする配列をさらに含む、項目３３に記載の核酸分子。

【0185】

項目３５． 項目１～３２に記載のＣＤ３融合タンパク質をコードする配列と蛍光タンパク質をコードする配列との間が、リボソームスキッピング配列である、項目３４に記載の核酸分子。

【0186】

項目３６． ＣＤ３刺激剤およびＣＤ２８刺激剤によるＴＣＲ陰性Ｔ細胞の活性化のための、項目１～３２に記載の融合タンパク質または項目３３～３５に記載の核酸分子の使用。

【0187】

項目３７． ＣＤ３刺激剤が、活性化抗ＣＤ３抗体またはその結合性断片である、項目３６に記載の使用。

【0188】

項目３８． ＣＤ２８刺激剤が、活性化抗ＣＤ２８抗体またはその結合性断片である、項目３６～３７に記載の使用。

【0189】

項目３９． Ｔ細胞のＴＣＲ非依存性活性化のための方法であって、
－ 項目１～３２に記載の融合タンパク質を発現させるステップ、
－ Ｔ細胞をＣＤ３刺激剤およびＣＤ２８刺激剤で刺激するステップ
を含む、方法。

【0190】

項目４０． － 項目１～３２に記載の融合タンパク質を発現させるステップ、
－ ＴＣＲを欠失させるステップ、
－ Ｔ細胞をＣＤ３刺激剤およびＣＤ２８刺激剤で刺激するステップ
を含む、項目３９に記載の方法。

【0191】

項目４１． ＣＤ３刺激剤およびＣＤ２８刺激剤が、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体またはその結合性断片を含む組成物である、項目３８に記載の使用、および項目３９または４０に記載の方法。

【0192】

項目４２． 抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体またはその結合性断片を含む組成物が、固定化されている、項目３８に記載の使用、および項目４１に記載の方法。

【0193】

項目４３． 抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体またはその結合性断片を含む組成物が、ビーズ上または組織培養容器表面上に固定化されている、項目３８に記載の使用、および項目４２に記載の方法。

【0194】

項目４４． 抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体またはその結合性断片を含む組成物が、ビーズ上に固定化されている、項目３８に記載の使用、および項目４３に記載の方法。

【0195】

項目４５． サイトカインが、ＴＣＲ陰性Ｔ細胞の活性化のために必要ではない、項目３８に記載の使用、および項目３９～４４に記載の方法。

【0196】

項目４６． Ｔ細胞が、ＣＤ２８陽性である、項目３８に記載の使用、および項目３９～４５のいずれか一項に記載の方法。

【0197】

項目４７． ＴＣＲ複合体がノックアウトされているか、またはその発現が抑制されている、項目３８に記載の使用、および項目３９～４６のいずれか一項に記載の方法。

【0198】

項目４８． 項目１～３２に記載の融合タンパク質を含むＴ細胞。

【0199】

項目４９． Ｔ細胞が、内因性ＴＣＲを欠いている、項目４８に記載のＴ細胞。

【0200】

項目５０． 医薬としての使用のための、項目４８および４９のいずれか一項に記載のＴ細胞。

【0201】

項目５１． がんまたはウイルス性疾患の処置における使用のための、項目４８および４９のいずれか一項に記載のＴ細胞。

【0202】

項目５２． 外因性エフェクター分子の試験および特性評価のための、項目４８および４９に記載のＴ細胞の使用。

【0203】

項目５３． エフェクター分子が、ＴＣＲである、項目５２に記載の使用。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図6】

【図7】

【配列表】

0007518915000001.app