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特許7519417ＳＴＩＮＧ経路を活性化する遺伝子アジュバントの発現のためのウイルスベクター構築物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-07-10
(45)【発行日】2024-07-19
(54)【発明の名称】ＳＴＩＮＧ経路を活性化する遺伝子アジュバントの発現のためのウイルスベクター構築物
(51)【国際特許分類】
C12N 15/86 20060101AFI20240711BHJP
C07K 14/05 20060101ALI20240711BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240711BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240711BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240711BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20240711BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20240711BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240711BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20240711BHJP
A61P 7/00 20060101ALI20240711BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20240711BHJP
A61P 13/08 20060101ALI20240711BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20240711BHJP
A61P 15/00 20060101ALI20240711BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20240711BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240711BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20240711BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20240711BHJP
A61P 31/06 20060101ALI20240711BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20240711BHJP
A61P 31/16 20060101ALI20240711BHJP
A61P 31/18 20060101ALI20240711BHJP
A61P 31/20 20060101ALI20240711BHJP
A61P 31/22 20060101ALI20240711BHJP
A61P 33/02 20060101ALI20240711BHJP
A61P 33/06 20060101ALI20240711BHJP
A61P 33/12 20060101ALI20240711BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240711BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240711BHJP
【ＦＩ】
C12N15/86 Z ZNA
C07K14/05
C07K19/00
A61K31/7088
A61K35/76
A61K39/00 H
A61K38/17
A61K48/00
A61P1/00
A61P7/00
A61P11/00
A61P13/08
A61P13/12
A61P15/00
A61P17/00
A61P25/00
A61P31/00
A61P31/04
A61P31/06
A61P31/14
A61P31/16
A61P31/18
A61P31/20
A61P31/22
A61P33/02
A61P33/06
A61P33/12
A61P35/00
A61P37/04
【請求項の数】
14
(21)【出願番号】P 2022169062
(22)【出願日】2022-10-21
(62)【分割の表示】P 2019548779の分割
【原出願日】2017-11-28
(65)【公開番号】P2023002717
(43)【公開日】2023-01-10
【審査請求日】2022-11-18
(31)【優先権主張番号】62/426,855
(32)【優先日】2016-11-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】519192751
【氏名又は名称】アラティンガ．バイオ エーアイオー
【氏名又は名称原語表記】ＡＲＡＴＩＮＧＡ．ＢＩＯ ＡＩＯ
【住所又は居所原語表記】３， Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ Ｄｅ Ｓｅｂａｓｔｏｐｏｌ ７５００１ Ｐａｒｉｓ （ＦＲ）
(74)【代理人】
【識別番号】100186060
【弁理士】
【氏名又は名称】吉澤 大輔
(72)【発明者】
【氏名】ボッシュ，セシル
(72)【発明者】
【氏名】モレーン，フレデリック
(72)【発明者】
【氏名】ヴァイヤン，ルノー
(72)【発明者】
【氏名】サリー，エムリーヌ
【審査官】上條 のぶよ
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１４／０３９９６１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Journal for ImmunoTherapy of Cancer，2016年11月16日，Vol. 4, Supp. Supplement 1，Abstract Number: P286，DOI 10.1186/s40425-016-0173-6
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／８６
Ｃ０７Ｋ １４／０５
Ｃ０７Ｋ １９／００
Ａ６１Ｋ ３１／７０８８
Ａ６１Ｋ ３５／７６
Ａ６１Ｋ ３９／００
Ａ６１Ｋ ３８／１７
Ａ６１Ｋ ４８／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗原または抗原性エピトープをコードする第１の核酸配列、およびエプスタインバーウイルスの潜在膜タンパク質１（ＬＭＰ１）の膜貫通部分を含む融合タンパク質をコードする第２の核酸配列を含むウイルスベクターであって、ＬＭＰ１の細胞質内ドメインが、その膜貫通ドメインを欠くヒトＩＰＳ１で置換されており、ここで、前記ベクターを有する細胞の形質導入が前記細胞内のＳＴＩＮＧ経路を活性化する、そして、前記第２の核酸配列が、配列番号３および配列番号５からなる群から選択される配列を含む、前記ウイルスベクター。
【請求項2】
前記ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項3】
前記第１の核酸配列が、２以上の抗原または２以上の抗原性エピトープを含む融合タンパク質をコードする、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項4】
前記ベクターが、さらに、可溶性免疫チェックポイント阻害剤分子、または可溶性免疫モジュレータ分子をコードする第３の核酸配列を含む、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項5】
前記可溶性免疫チェックポイント阻害剤分子または前記可溶性免疫モジュレータ分子が、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ ３、Ｂ７－Ｈ３、ＩＣＯＳ、ＩＤＯ、４－１ＢＢ、ＣＤ４７、Ｂ７－Ｈ４、ＯＸ－４０、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１６０、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項４に記載のウイルスベクター。
【請求項6】
前記ベクターがさらに機能性レンチウイルス・インテグラーゼタンパク質を含み、前記ベクターが自己不活性化である、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項7】
前記抗原が、ＮＹ－ＥＳＯ－１、メソテリン、ＰＳＡ、ＭＡＲＴ－１、ＭＡＲＴ－２、Ｇｐ１００、チロシナーゼ、ｐ５３、ｒａｓ、ＭＵＣ１、ＳＡＰ－１、サバイビン、ＣＥＡ、Ｅｐ－ＣＡＭ，Ｈｅｒ２、ＢＲＣＡ１／２、ｇａｇ、逆トランスクリプターゼ、ｔａｔ、スポロゾイト周囲のタンパク質、ＨＣＶ非構造性タンパク質、ヘマグルチニンならびにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項8】
対象におけるがんまたは感染症を予防または処置するための免疫治療の処方物であって、前記処方物が請求項１に記載のウイルスベクターを含む、免疫治療の処方物。
【請求項9】
対象においてがんまたは感染症に対する免疫応答を誘導または増強する方法において用いるための、請求項１～７のいずれか１項に記載のウイルスベクターであって、それを必要とする対象に投与され、それによって、前記がんまたは感染症に対する免疫応答が対象において誘導または増強される、前記ウイルスベクター。
【請求項10】
前記免疫応答ががんに対して誘導または増強され、そして前記がんが黒色腫、神経膠腫、前立腺がん、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、腎臓がん、肺がん、リンパ腫、および膵臓がんからなる群から選択される、請求項９に記載のウイルスベクター。
【請求項11】
前記免疫応答が感染症に対して誘導または増強され、前記感染症が、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、Ｃ型肝炎、ＨＰＶ、肺炎、インフルエンザ、マラリア、リーシュマニア症、結核、ハンセン病、狂犬病、デング熱、ジカ、エボラ、および住血吸虫症からなる群から選択される、請求項９に記載のウイルスベクター。
【請求項12】
対象においてがんまたは感染症に対する免疫応答を誘導または増強する方法において用いるための、請求項８に記載の免疫治療の処方物であって、それを必要とする対象に投与され、それによって、前記がんまたは感染症に対する免疫応答が対象において誘導または増強される、前記免疫治療の処方物。
【請求項13】
前記免疫応答ががんに対して誘導または増強され、そして前記がんが黒色腫、神経膠腫、前立腺がん、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、腎臓がん、肺がん、リンパ腫、および膵臓がんからなる群から選択される、請求項１２に記載の免疫治療の処方物。
【請求項14】
前記免疫応答が感染症に対して誘導または増強され、前記感染症が、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、Ｃ型肝炎、ＨＰＶ、肺炎、インフルエンザ、マラリア、リーシュマニア症、結核、ハンセン病、狂犬病、デング熱、ジカ、エボラ、および住血吸虫症からなる群から選択される、請求項１２に記載の免疫治療の処方物。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本技術は、予防用および治療用ワクチン、ならびに細胞性免疫応答を増強するための組成物を含む、遺伝子免疫治療薬としての使用のためのウイルスベクターに関する。
【背景技術】
【0002】
抗体に基づく免疫応答の誘導に基づく標準的なワクチン戦略は、天然痘、ポリオ、および破傷風などの多くの以前に致命的であった感染症の根絶またはほぼ根絶をもたらした。しかし、これらの古典的なヒトワクチンは、ＨＩＶや肝炎などの他の感染症や、がんなどの非感染症には無効であるか、安全ではない。
【0003】
細胞性免疫応答を誘導することを目的とした新世代の免疫療法製品は、病原体自体の代わりにがん細胞および感染細胞を認識し殺すことによって伝統的なワクチンの限界を克服し得る。核酸ワクチン、そして特にウイルスベクターは、診療所に移す大きな可能性を示した。
【0004】
がん細胞や多くの感染因子には免疫システムを回避する方法があり、それが効果的なワクチンの作成を困難にしている。古典的ワクチンは、最適な有効性のためにしばしばアジュバント、例えばアルミニウム塩を必要とするが、従来のアジュバントは典型的には細胞性免疫応答の乏しい増強剤である。ウイルスベクターによって誘発される細胞性免疫応答の質および規模を改善するためのいくつかの戦略が提案されている。ベクターベースの免疫療法によって誘導される細胞性免疫応答を改善するために、新しいクラスの遺伝子アジュバントが開発された。遺伝子アジュバントは免疫調節分子をコードするＤＮＡ配列からなる。
【0005】
ストーンら（ＷＯ２０１４／０３９９６１）は、インターフェロンアルファおよびベータの分泌を誘導し、したがってインターフェロン刺激遺伝子の発現を誘導する遺伝子アジュバントの使用を開示している。このアプローチでは、核酸ワクチンは、場合によりマーカータンパク質または抗原をコードする導入遺伝子に加えて、細胞質内ドメインが免疫エフェクタまたはＩＰＳ１タンパク質などのアダプタータンパク質により置換されているＬＭＰ１タンパク質の膜貫通部分を含む融合タンパク質をコードする。ＩＦＮ－βプロモータ刺激因子（ＩＰＳ１；ＭＡＶＳ、ＶＩＳＡまたはＣａｒｄｉｆとも言う）の活性化は、ＳＴＩＮＧ（インターフェロン遺伝子刺激因子）経路を介して強力なＴ細胞応答を生じさせる。細胞内で発現されると、ＬＭＰ１の膜貫通ドメインは自発的にクラスターを形成し、これがＩＰＳ１の細胞質内クラスターへの凝集を可能にし、ＳＴＩＮＧ経路を活性化する。全長マウスＩＰＳ１と融合したＬＭＰ１の膜貫通ドメインは、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、およびＩＬ－６の分泌を誘導し、さらにマウスマクロファージにおける成熟（ＣＤ４０およびＣＣＲ７）および活性化マーカー（ＣＤ８０およびＣＤ８６）の発現を誘導することが示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
がん、ＨＩＶ、および他の満たされていない医学的必要性などの適応症において観察される免疫寛容を破壊するために必要とされる強い細胞性免疫応答を誘導する自己アジュバント化ワクチンに対する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本技術は、免疫応答、特にがんまたは感染症に対するものなどの免疫応答、特に細胞性免疫応答を改善するための遺伝子アジュバントをコードするウイルスベクター、およびウイルスベクターの使用方法を提供する。本技術の抗原およびアジュバント構築物は、ヒト対象における使用のために最適化されている。
【0008】
本技術の一態様は、（ｉ）１つ以上のマーカータンパク質、抗原、エピトープ、またはそれらの組み合わせをコードする１つ以上の導入遺伝子、および（ｉｉ）細胞質内ドメインがヒトＩＰＳ１、またはＳＴＩＮＧ経路を活性化することができるその変異体によって置換された、エプスタインバーウイルスの潜在膜タンパク質１（ＬＭＰ１）の膜貫通部分を含む融合タンパク質をコードする導入遺伝子、を含むウイルスベクターである。好ましい態様において、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの態様において、ベクターは機能性レンチウイルス・インテグラーゼ・タンパク質を含み、それによってそれが形質導入している細胞のゲノムに組み入れることができる。
【0009】
抗原は、腫瘍抗原、ウイルス抗原、または微生物抗原であり得る。複数の抗原または１つ以上の抗原の選択されたエピトープは、ベクターによってコードされ得る。特定の実施態様において、少なくとも１つの抗原は、ＮＹ－ＥＳＯ－１、メソテリン、ＰＳＡ、ＭＡＲＴ－１、ＭＡＲＴ－２、Ｇｐ１００、チロシナーゼ、ｐ５３、ｒａｓ、ＭＵＣ１、ＳＡＰ－１、サバイビン、ＣＥＡ、Ｅｐ－ＣＡＭ、Ｈｅｒ２、ＢＲＣＡ１／２、ｇａｇ、逆転写酵素、ｔａｔ、スポロゾイト周囲のタンパク質、ＨＣＶ非構造タンパク質、ヘマグルチニン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。特定の実施態様において、ベクターは、抗ＣＴＬＡ－４分子、ＰＤ－１遮断薬、ＰＤＬ１遮断薬、またはそれらの組み合わせなどの少なくとも１つの免疫チェックポイント阻害剤分子をさらにコードする。
【0010】
特定の実施態様において、ウイルスベクターは複数の核酸配列を含む。いくつかの実施態様において、第１の核酸配列は１つ以上のマーカータンパク質、抗原、エピトープ、またはそれらの組み合わせをコードする。第２の核酸配列は、細胞質内ドメインがヒトＩＰＳ１またはＳＴＩＮＧ経路を活性化することができるその変異体によって置換されている、潜在性膜タンパク質１の膜貫通部分を含む融合タンパク質をコードする。そして、場合によっては、第３の核酸配列は、１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤分子（「抗チェックポイント」）をコードする。好ましくは、第１および第２、および第２および第３の核酸配列は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をコードする核酸配列によって分離されている。第１および第２、ならびに第２および第３の核酸配列は、自己切断ペプチド（例えば、２Ａペプチド）をコードする核酸配列によって分離することができる。第１および第２、ならびに第２および第３の核酸配列は、自己切断ペプチド（例えば２Ａペプチド）または内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）のいずれかをコードする核酸配列によって分離することができる。
【0011】
本技術の別の態様は、ウイルスベクターを含む対象の疾病または容体を予防または処置するための免疫療法の処方物である。好ましい態様において、疾病または容体は、がんまたは感染症である。
【0012】
本技術の別の態様は、対象においてがんまたは感染症に対する免疫応答を誘導する方法であり、この方法はそれを必要とする対象にウイルスベクターまたは免疫療法処方物を投与することを含む。いくつかの実施態様において、ウイルスベクターを対象に投与することは、がんまたは感染症に対して対象にワクチン接種することである。
【0013】
いくつかの実施態様において、がんは、黒色腫、神経膠腫、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、腎臓癌、肺癌、リンパ腫、肉腫、および膵臓癌からなる群から選択される。いくつかの実施態様において、がんは上に列挙された腫瘍抗原を保有する。いくつかの実施態様において、がんは抗チェックポイントに感受性がある。いくつかの実施態様において、感染症は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、Ｃ型肝炎、ＨＰＶ、肺炎、インフルエンザ、マラリア、リーシュマニア症、結核、ハンセン病、狂犬病、デング熱、ジカウイルス感染症、エボラウイルス感染症、ならびに住血吸虫症からなる群から選択される。いくつかの実施態様において、感染性病原体は上に挙げたウイルスまたは微生物性抗原を保有する。いくつかの実施態様において、感染症は抗チェックポイントに敏感である。
【0014】
本技術は、また以下の実施態様の列挙に要約され得る。
１．抗原または抗原性エピトープをコードする第１の核酸配列、および細胞質内ドメインがヒトＩＰＳ１またはＳＴＩＮＧ経路を活性化することができるその変異体で置換されている、エプスタインバーウイルスの潜在膜タンパク質１（ＬＭＰ１）の膜貫通部分を含む融合タンパク質をコードする第２の核酸配列を含むウイルスベクターであって、ベクターのコード配列がヒト発現のためにコドン最適化されている。
１．抗原または抗原性エピトープをコードする第１の核酸配列、および細胞質内ドメインがヒトＩＰＳ１またはＳＴＩＮＧ経路を活性化することができるその変異体で置換されている、エプスタインバーウイルスの潜在膜タンパク質１（ＬＭＰ１）の膜貫通部分を含む融合タンパク質をコードする第２の核酸配列を含むウイルスベクターであって、ベクターのコード配列がヒト発現のためにコドン最適化されている。
【0015】
２．ベクターがレンチウイルスベクターである、実施態様１に記載のウイルスベクター。
【0016】
３．第１の核酸配列が、２以上の抗原または２以上の抗原エピトープを含む融合タンパク質をコードする、実施態様１または２に記載のウイルスベクター。
【0017】
４．第２の核酸配列が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、および配列番号７からなる群から選択される配列を含む、先行する実施態様のいずれかに記載のウイルスベクター。
【0018】
５．ベクターが可溶性免疫チェックポイント阻害剤分子または可溶性免疫モジュレータ分子をコードする第３の核酸配列をさらに含む、先行する実施態様のいずれかに記載のウイルスベクター。
【0019】
６．可溶性免疫チェックポイント阻害剤分子または可溶性免疫モジュレータ分子が、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ ３、Ｂ７－Ｈ３、ＩＣＯＳ、ＩＤＯ、４－１ＢＢ、ＣＤ４７、Ｂ７－Ｈ４、ＯＸ－４０、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１６０、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、実施態様５に記載のウイルスベクター。
【0020】
７．ベクターが、さらに機能性レンチウイルス・インテグラーゼタンパク質を含み、前記ベクターが自己不活性性である、先行する実施態様のいずれかに記載のウイルスベクター。
【0021】
８．抗原が、ＮＹ－ＥＳＯ－１、メソテリン、ＰＳＡ、ＭＡＲＴ－１、ＭＡＲＴ－２、Ｇｐ１００、チロシナーゼ、ｐ５３、ｒａｓ、ＭＵＣ１、ＳＡＰ－１、サバイビン、ＣＥＡ、Ｅｐ－ＣＡＭ、Ｈｅｒ２、ＢＲＣＡ１／２、ｇａｇ、逆転写酵素、ｔａｔ、スポロゾイト周囲のタンパク質、ＨＣＶ非構造性タンパク質、ヘマグルチニン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、先行する実施態様のいずれかに記載のウイルスベクター。
【0022】
９．対象のがんまたは感染症を予防または処置するための免疫療法処方物で、前記処方物は、実施態様１～８のいずれかに記載のウイルスベクターを含む。
【0023】
１０．対象におけるがんまたは感染症に対する免疫応答を誘導または増強する方法であって、該方法は、それを必要とする対象に、実施態様１～８のいずれかに記載のウイルスベクターまたは実施態様９の免疫療法処方物を投与することを含み、それによって、前記がんまたは感染症に対する免疫応答が、対象において誘導または増強される前記方法。
【0024】
１１．免疫応答ががんに対して誘導または増強され、そして該がんが黒色腫、神経膠腫、前立腺癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、腎臓癌、肺癌、リンパ腫、膵臓がんからなる群から選択される、実施態様１０に記載の方法。
【0025】
１２．免疫応答が感染症に対して誘導または増強され、そして該感染症が、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、Ｃ型肝炎、ＨＰＶ、肺炎、インフルエンザ、マラリア、リーシュマニア症、結核、ハンセン病、狂犬病、デング熱、ジカ、エボラ、ならびに住血吸虫症からなる群から選択される、実施形態１０に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【図8】図８Ａ～８Ｃは、いくつかの分子構築物の概略図を示す。図８Ａは、対照として使用されるレンチベクターを示し、ここで導入遺伝子はヒトユビキチンプロモータの制御下にある。導入遺伝子は、ａ）ＧＦＰレポーター遺伝子、ｂ）ＬＭＰ１タンパク質の膜貫通ドメイン、ｃ）ＧＦＰレポーター遺伝子およびＩＲＥＳ配列によって分離されたＬＭＰ１の膜貫通ドメイン、およびｄ）全長ヒトＩＰＳ１と融合したＬＭＰ１膜貫通ドメインである。図８Ｂは、導入遺伝子がヒトユビキチンプロモータの制御下にある、様々なアジュバントを評価するために使用されるレンチベクターを示す。導入遺伝子は、ａ）全長ヒトＩＰＳ１タンパク質と融合したＬＭＰ１膜貫通ドメインからＩＲＥＳによって分離されたＧＦＰレポーター遺伝子、ｂ）ヒトＩＰＳ１タンパク質と融合したＬＭＰ１膜貫通ドメインからＩＲＥＳによって分離されたＧＦＰレポーター遺伝子であり、膜貫通ドメインを除去し、ｃ）膜貫通ドメインおよびプロリン富裕ドメインがそこから削除された、ヒトＩＰＳ１タンパク質と融合しているＬＭＰ１膜貫通ドメインからＩＲＥＳによって分離されたＧＦＰレポーター遺伝子、およびｄ）そこから膜貫通ドメインが削除され、ＣＡＲＤおよびＰｒｏドメインが逆になっているヒトＩＰＳ１タンパク質と融合したＬＭＰ１膜貫通ドメインからのＩＲＥＳによって分離されたＧＦＰレポーター遺伝子。図８Ｃは、アジュバント配列の後にＩＲＥＳおよび抗チェックポイント可溶性分子または可溶性免疫モジュレータ分子が続く、図８Ｂと同じ構築物を示す。
【図9】図９Ａ－９Ｂは、ヒト樹状細胞およびレンチウイルスベクターによって形質導入されたマクロファージにおけるＧＦＰ導入遺伝子の発現レベルを示す。図９Ａは、レンチウイルス構築物による形質導入の９６時間後のヒト樹状細胞におけるＧＦＰ導入遺伝子の発現を示す。図９Ｂは、レンチウイルス構築物による形質導入の９６時間後のヒトマクロファージにおけるＧＦＰ導入遺伝子の発現を示す。
【図10】図１０Ａ～１０Ｄは、レンチウイルスベクターによってインビトロで誘導されたヒト樹状細胞およびマクロファージの活性化および成熟を示す図である。図１０Ａは、レンチウイルス構築物による形質導入の９６時間後のヒト樹状細胞におけるアップレギュレートされたサイトカインのパネルを示す。図１０Ｂは、レンチウイルス構築物による形質導入の９６時間後のヒトＧＦＰ陽性樹状細胞におけるアップレギュレートされたマーカーのパネルを示す（発現はＧＦＰに対して正規化されている）。図１０Ｃは、レンチウイルス構築物による形質導入の９６時間後のヒトマクロファージにおけるアップレギュレートされたサイトカインのパネルを示す。図１０Ｄは、レンチウイルス構築物による形質導入の９６時間後のＧＦＰ陽性ヒトマクロファージにおけるアップレギュレートされたマーカーのパネルを示す（発現はＧＦＰに対して正規化されている）。
【発明を実施するための形態】
【0027】
本技術は、免疫療法用製品に使用するための遺伝子アジュバントの発現のためのウイルスベクター構築物、およびそのベクターの使用方法を提供する。ベクター構築物は、細胞性免疫応答を誘導および／または増強するために特に適している、がんまたは感染症に対するものなどの免疫応答の質および強度を改善することができる。
【0028】
本技術は、抗原性カセットおよび遺伝子アジュバントを包含する単一のベクター構築物の使用を記載する。２つのベクター（１つは抗原をコードし、もう１つはアジュバントをコードする）の同時注入と比較すると、単一の製品の使用は開発を単純化し（産業的、規制的および臨床的側面を含む）、処置の有効性および安全性を高める。この独特の構築物により、抗原性カセットを発現する細胞は、誘発された免疫応答の強度および質を改善するアジュバントの発現から構成的に利益を得るであろう。形質導入された細胞は、規制当局によって疑問または懸案となり得る、遺伝子配列の長期的かつ非希望的発現の危険性を低減する前記免疫応答によって急速に排除されるであろう。加えて、１つのベクターのみの産生および注入は、２つの異なるベクターの注入と比較した場合、より費用効率が高いであろう。
【0029】
本技術は、細胞質内ドメインがヒトＩＰＳ１またはＳＴＩＮＧ経路を活性化できるその異性体および１以上の抗原によって置換されたＥＢＶ ＬＭＰ１タンパク質をコードする１以上の核酸配列を含む。
典型的な実施態様において、本技術は細胞膜内の２以上のＬＭＰ１タンパク質の凝集、および／または２以上のＩＰＳ１細胞質内シグナル伝達ドメインの凝集によって免疫応答の活性化を提供する。
典型的な実施態様において、本技術は細胞膜内の２以上のＬＭＰ１タンパク質の凝集、および／または２以上のＩＰＳ１細胞質内シグナル伝達ドメインの凝集によって免疫応答の活性化を提供する。
【0030】
直接注入後、核酸配列の導入およびそれに続くタンパク質発現は任意の種類の細胞で起こり得るが、免疫細胞で起こるのが好ましい。この技術は、がんおよび感染症に対する伝統的な予防用または治療用ワクチン、ならびに樹状細胞療法などの細胞ベースの治療に使用することができる。本明細書中に記載される実験において、ウイルスベクターは、免疫応答ならびに感染症およびがんからの保護またはそれらの処置を著しく増強することが期待される。
【0031】
「ベクター」とは、転写され得る遺伝子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含有する分子をいう。いくつかの場合において、核酸分子は、次いでタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに翻訳される。アンチセンス分子、リボザイムまたはアプタマーの産生におけるなどの他の場合では、これらの配列は翻訳されていない。ベクターは、特定の宿主生物における機能的に連結されたコード配列の転写およびおそらく翻訳に必要な核酸配列を指す、さまざまな制御配列を含有し得る。転写および翻訳を支配する制御配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターは同様に他の機能に役立つ核酸配列を含有し得る。
【0032】
「構築物」は、核酸コード配列の一部または全部が転写され得る遺伝子産物をコードする任意の種類の操作された核酸であり得る。転写物は一般にタンパク質に翻訳されるが、そうである必要はない。特定の実施態様において、発現は、遺伝子の転写およびｍＲＮＡの遺伝子産物への翻訳の両方を含む。他の実施態様において、発現は目的の遺伝子をコードする核酸の転写のみを含む。
本明細書で使用される場合、「ワクチン」は全ての予防用および治療用ワクチンを含む。
本明細書で使用される場合、「ワクチン」は全ての予防用および治療用ワクチンを含む。
【0033】
「アジュバント」は、抗原に対する免疫応答を活性化または増強する任意の分子または組成物であり得る。アジュバントは、特定の種類の免疫系細胞に対する免疫応答を修飾するのを助けることによってワクチンの効力を増強し得る。アジュバントは、樹状細胞、マクロファージ、およびＢ細胞などの抗原提示細胞の活性化を引き起こす免疫刺激剤であり得る。アジュバントはまた、免疫系が警戒状態に入るべきであることを示す「危険」信号を提供すると理解されている。アジュバントは、抗原提示細胞による抗原提示を促進することによって、マクロファージおよびリンパ球を活性化することによって、および／またはサイトカインの産生を支援することによって作用し得る。アジュバントがなければ、免疫反応は進行しないか、または無効な免疫または寛容性に転用される可能性がある。アジュバントは、効果的な予防用または治療用ワクチン、あるいは抗腫瘍免疫応答を誘導するためにしばしば必要とされる。「遺伝子アジュバント」は、アジュバントとして機能する分子を産生するために標的細胞によって発現される核酸の形態で提供されるアジュバントである。
【0034】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、その細胞表面上に（または細胞表面に）少なくとも１つの抗原または抗原性フラグメントを表示、獲得、または提示することが可能な種々の細胞のいずれかである。一般に、用語「抗原提示細胞」は、抗原または抗原組成物に対する免疫応答（すなわち、免疫系のＴ細胞またはＢ細胞アームからの）の増強を助けることによって本技術の目的を達成する任意の細胞を言うことができる。そのような細胞は、本明細書において、および当技術分野において開示されている方法を使用して当業者によって定義することができる。当業者に理解され、そして本明細書中で使用されるように、クラスＩＩ主要組織適合性分子または免疫細胞に対する複合体と通常または優先的に抗原を表示または提示する細胞が「抗原提示細胞」である。特定の態様において、細胞（例えば、ＡＰＣ）は、所望の抗原を発現する組換え細胞または腫瘍細胞などの他の細胞と融合することができる。２つ以上の細胞の分裂を調製するための方法は当技術分野において周知である。
【0035】
場合によっては、抗原提示細胞が抗原を表示または提示する免疫細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞またはＣＤ８＋ Ｔ細胞である。ＡＰＣまたは他の免疫細胞上で発現されるさらなる分子は、免疫応答の増強を補助または改善し得る。例えばサイトカインおよびアジュバントなどの分泌されたまたは可溶性の分子もまた、抗原に対する免疫応答を補助または増強し得る。樹状細胞（ＤＣ）は、インビボ、インビトロ、エクスビボ、または宿主もしくは対象中に存在する、または造血幹細胞もしくは単球に由来し得る抗原提示細胞である。樹状細胞およびそれらの前駆体は、骨髄および末梢血からと同様に、さまざまなリンパ系器官、例えば脾臓、リンパ節から単離することができる。ＤＣは、樹状細胞体から離れた複数の方向に伸びる薄いシート（葉状仮足）を伴う特徴的な形態を有する。典型的には、樹状細胞は高レベルの主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）および共刺激（例えばＢ７－１およびＢ７－２）分子を発現する。樹状細胞は、インビトロでＴ細胞の抗原特異的分化を誘導することができ、インビトロおよびインビボで一次Ｔ細胞応答を開始することができる。
【0036】
「免疫応答」という語句は、抗原、または抗原もしくはアレルゲンもしくは薬物もしくは生物学的物質に対して特異的な抗体および／または免疫細胞媒介性応答の誘導を意味する。免疫応答の誘導は、攻撃された生物の免疫原性の構成、抗原またはアレルゲンまたは薬物または生物学的物質の化学組成および構成、ならびに抗原またはアレルゲンまたは薬物または生物学的物質の投与の方法および期間を含む多くの要因に依存する。免疫応答は多くの面を有し、そのうちのいくつかは免疫系の細胞（例えば、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、マクロファージ、および形質細胞）によって示される。免疫系細胞は、抗原またはアレルゲンまたは免疫系の他の細胞との相互作用、サイトカインの放出およびそれらのサイトカインに対する反応性を介して免疫応答に関与し得る。免疫応答は、一般に、体液性および細胞介在性の２つの主要なカテゴリーに分けられる。免疫応答の体液性成分は、抗原またはアレルゲンまたは薬物または生物学的物質に特異的な抗体の産生を含む。細胞媒介成分は、抗原またはアレルゲンに対する遅延型過敏症および細胞傷害性エフェクタ細胞の生成を含む。
【0037】
免疫系の活性化または刺激は、リンパ球、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）および細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）などの免疫エフェクタ細胞の活性化によって媒介され得る。それは樹状細胞などの抗原提示細胞の活性化および成熟によって媒介され得る。それは、免疫チェックポイント阻害剤を阻害することによるなどの、阻害経路の遮断によって媒介され得る。
【0038】
用語「ＬＭＰ１遺伝子」は、天然エプスタインバーウイルスＬＭＰ１をコードする核酸配列、例えば天然エプスタインバーウイルスＬＭＰ１遺伝子、ＬＭＰ１ ｃＤＮＡが転写され得る配列を有する核酸、および／または前述の対立遺伝子変異体および同族体を意味する。ＬＭＰ１の例示的な核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ５８１５３．１である。この用語は、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、およびＲＮＡを包含する。
【0039】
用語「ＬＭＰ１タンパク質」は、ＬＭＰ１遺伝子の発現産物または少なくとも６５％（しかし好ましくは７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９％）の上記とのアミノ酸配列同一性を共有し、天然のＬＭＰ１タンパク質の機能的活性を示すタンパク質を意味する。タンパク質の「機能的活性」は、タンパク質の生理学的機能に関連した任意の活性である。ＬＭＰ１は、免疫細胞上のＣＤ４０受容体に類似しているＣ末端細胞シグナル伝達領域に連結したＮ末端膜貫通領域からなる。ＬＭＰ１を膜に固定することに加えて、ＬＭＰ１のＮ末端は自己凝集し、そしてＬＭＰ１またはＬＭＰ１のＮ末端ドメインに結合した任意のタンパク質のクラスター化をもたらす。ＬＭＰ１タンパク質の膜貫通（凝集）ドメインは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＡ６６３３０．１に記載されているアミノ酸配列のアミノ酸１～１９０である。
【0040】
潜在性膜タンパク質－１（ＬＭＰ１）は、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）における遺伝子である。そのＮ末端は、タンパク質を膜に固定する６つの隣接する膜貫通ドメインからなる。図１は、膜貫通ドメイン１０１および細胞質内シグナル伝達ドメイン１０２を示すＬＭＰ１タンパク質の構造を示す。ＬＭＰ１は、そのＮ末端膜貫通ドメインが自発的に細胞膜内にクラスターを形成し、それによって単一のポリペプチド鎖としてペプチド結合を介してそれに結合している細胞質内ドメインをクラスター化するので、リガンドまたは抗体を必要としない。この意味で、ＬＭＰ１は「構成的に活性化されている」と言われている。同様に、機能するためにクラスター化を必要とするシグナル伝達ドメインにＮ末端膜貫通ドメインを連結する融合タンパク質もまた「構成的に活性化されている」と言うことができ、もはやそれらが由来する受容体からのリガンドを必要としない。
【0041】
インターフェロンプロモータ刺激因子－１（ＩＰＳ１；ＭＡＶＳ、ＶＩＳＡ、またはＣａｒｄｉｆとも呼ばれる）は、ＳＴＩＮＧ経路に関連する膜貫通型ミトコンドリアタンパク質（「インターフェロン遺伝子の刺激因子」；ＴＭＥＭ１７３、ＭＰＹＳ、ＭＩＴＡ、およびＥＲＩＳとしても知られる）であり、それはサイトゾル中の病原体由来の核酸に対する固有の応答のために重要である。ＩＰＳ１は、タンパク質をミトコンドリアの外膜に固着させるＣ末端膜貫通ドメインを含有し、そこで活性化されるとそれは凝集体（すなわち、多量体）を形成する。ＩＰＳ１はペルオキシソームおよびミトコンドリア関連膜にも存在する。ＩＰＳ１はまた、下流のタンパク質間相互作用に不可欠なカスパーゼ動員ドメイン（ＣＡＲＤ）、および３つのＴＲＡＦ相互作用モチーフ（ＴＩＭ）を含有し、２つはＮ末端プロリン富裕領域に含まれ、３つ目はＣ末端領域に位置する。膜貫通ドメインの除去はＩＰＳ１媒介抗ウイルス応答を阻害するので、ＩＰＳ１の膜局在化はその活性にとって重要であり得る。ＩＰＳ１は、ウイルスＲＮＡの存在について細胞質を巡回するレチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）様受容体（ＲＬＲ）などの病原体認識受容体に対するアダプタータンパク質として機能する。二本鎖ＲＮＡがＲＬＲに結合すると、それらはそれらのＣＡＲＤドメインを介してＩＰＳ１と複合体を形成し、ＩＰＳ１の多量体化および活性化をもたらす。次いで活性化されたＩＰＳ１複合体はＩＫＫおよびＴＢＫ１／ＩＫＫｉ複合体を動員し、それによって転写因子ＮＦ－κＢおよびＩＲＦ３の活性化をもたらすシグナル伝達カスケードを誘発する。ＮＦ－κＢおよびＩＲＦ３はインターフェロンプロモータに結合してこれを活性化し、１型インターフェロンの産生を介して強力な細胞媒介性免疫応答をもたらす。ＲＩＧ－１活性化はまたＳＴＩＮＧ経路を活性化し、ウイルスに対する細胞介在性免疫応答をさらに増強する。本技術において、ＩＰＳ１とＬＭＰ１のＮ末端ドメインとの融合により、ｄｓＲＮＡによる活性化を模倣するＬＭＰ１－ＩＰＳ１のクラスタリングおよび活性化が促進される。
【0042】
本技術のウイルスベクターは、対象において免疫応答を活性化または増強することができる１つ以上の核酸配列をコードする。核酸は、細胞質内ドメインがヒトＩＰＳ１またはＳＴＩＮＧ経路を活性化することができるその変異体によって置換されているエプスタインバーウイルスの潜在性膜タンパク質１（ＬＭＰ１）をコードする。ＬＭＰ１ ＤＮＡ配列はヒト発現のためにコドン最適化されている。ＬＭＰ１－ＩＰＳ１融合タンパク質の発現は、２つ以上のＬＭＰ１タンパク質の凝集（すなわち多量体化）による免疫応答の活性化をもたらす。
【0043】
ウイルスベクターは、発現ベクターまたはプラスミドなどの任意の種類の適切なベクターであり得る。好ましい態様において、ベクターはレンチウイルスベクターである。レンチウイルスベクターは、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ－１またはＨＩＶ－２）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ感染性脳炎ウイルス（ＥＩＡＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）ならびにネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）に由来する修飾レンチウイルスである。修飾レンチウイルスベクターは病原性が低下している。ベクターはまた、有益な治療効果を導入するために修飾され得る。レンチウイルスベクター自体は毒性がなく、そして他のレトロウイルスとは異なり、レンチウイルスは非分裂細胞、特に樹状細胞に形質導入することができ、内因性経路を介した抗原提示を可能にする。
【0044】
レンチウイルスベクターは、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子を含み得る。いくつかの実施態様において、レンチウイルスベクターはプラスミドなどの組換えＤＮＡ分子である。いくつかの実施態様において、レンチウイルスベクターは、粒子を形成するために組み換えＤＮＡ分子ならびに関連するウイルスタンパク質を含む。レンチウイルスベクター粒子は、一本鎖または二本鎖核酸分子を含有し得る。
【0045】
好ましい態様において、レンチウイルスベクターは、形質導入されている細胞のゲノムへの組み込み能力を有する。好ましい態様において、それらは機能的インテグラーゼタンパク質を含有する。非組込みベクター粒子は、宿主ゲノムへの組込みのためのレンチウイルスベクター粒子の能力を妨げる遺伝子変異を示す。用語「形質移入(transfection)」および「形質導入(transduction)」は、それによって外因性ＤＮＡ配列が真核生物宿主細胞に導入されるプロセスを指す。形質移入は核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）の非ウイルス送達であり、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、遺伝子銃送達、レトロウイルス感染、リポフェクション、ポリマー媒介送達などを含む多数の手段のうちのいずれか１つによって達成することができる。形質導入は、核酸がＤＮＡウイルスにとって典型的なＤＮＡであり、ＲＮＡウイルスについてはＲＮＡである、ウイルスまたはウイルスベクターによる核酸の送達を指す。
【0046】
いくつかの実施態様において、レンチウイルスベクターは自己不活性性であり、エンハンサーを含有しない。自己不活性化レンチウイルスベクターは、３‘ＬＴＲのＵ３（△Ｕ３）領域において、ベクターが宿主細胞内で複製できないようにする修飾を有する。Ｕ３領域は、基礎プロモータ活性およびウイルス複製に必須の結合部位をコードし、そしてこれらの結合部位の除去は、ウイルス複製の実質的に完全な不活性化をもたらす。
【0047】
多種多様の要因が、形質導入および場合によっては、いくつか例を挙げると、宿主ゲノムへの組込み、遺伝子発現および翻訳、タンパク質の折り畳み、輸送および代謝回転、細胞間相互作用に成功した後でさえも、ウイルスベクターの有効性に影響を及ぼし得る。これらの因子は、とりわけ、ベクターによってコードされた核酸配列に依存する。本技術を実施するための好ましいＤＮＡ配列は、ウイルスベクターの有効性および効率を増大させることを目的とした天然配列の修飾を含む。これらの修飾には以下が含まれる：ヒト使用のためのコドン最適化、融合タンパク質中のＩＰＳ１配列の最初のメチオニンの除去、ＩＰＳ１膜貫通およびプロリン富裕ドメインの除去、ならびに逆ＩＰＳ１配列の使用。これらの修飾は、転写および／または翻訳の速度に影響を与え、ならびに細胞内のタンパク質の位置およびタンパク質の活性に影響を与え得る。
【0048】
本技術のウイルスベクターは１以上の抗原をコードする。本明細書で使用される「抗原」という用語は、免疫応答を誘発する分子を言う。この免疫応答は、抗体産生もしくは特定の免疫担当細胞の活性化、またはその両方を含み得る。抗原は、生物体、タンパク質／抗原のサブユニット、死滅または不活性化した全細胞または溶解物に由来し得る。したがって、当業者は、事実上すべてのタンパク質またはペプチドを含む任意の高分子が抗原として役立ち得ることに気づいている。さらに、抗原は、組換えＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに由来し得る。当業者は、病原性ゲノムのヌクレオチド配列もしくは部分ヌクレオチド配列、または免疫応答を引き出すタンパク質のための遺伝子もしくは遺伝子の断片を含む任意のＤＮＡが抗原の合成をもたらすことに気付く。さらに、当業者は、本技術が遺伝子またはゲノムの全核酸配列の使用に限定されないことに気付く。本技術は、核酸配列が所望の免疫応答を引き出すためにさまざまな組み合わせで配置されている、２つ以上の遺伝子またはゲノムの部分核酸配列の使用を含むが、これらに限定されない。
【0049】
抗原は、それに対する免疫応答の増強が望ましい任意の抗原であり得る。そのような抗原には、防御免疫応答が引き出され得る感染症を引き起こす病原体由来の抗原が含まれるが、これらに限定されない。例えば、ＨＩＶ由来の抗原には、タンパク質ｇａｇ、ｅｎｖ、ｐｏｌ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、逆転写酵素、および他のＨＩＶ成分が含まれる。ヒトパピローマウイルス由来のＥ６およびＥ７タンパク質も適切な抗原である。さらに、単純ヘルペスウイルス由来のＥＢＮＡ１抗原が適している。この技術で使用するための他のウイルス抗原は、Ｂ型肝炎ウイルスのＳ、Ｍ、およびＬタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスのプレＳ抗原、および他の肝炎、例えばＡ型、Ｂ型、およびＣ型肝炎、Ｃ型肝炎ＲＮＡなどのウイルス成分などの肝炎ウイルス抗原；ヘマググルチニン、ノイラミニダーゼ、核タンパク質、Ｍ２、および他のインフルエンザウイルス成分などのインフルエンザウイルス抗原；麻疹ウイルス融合タンパク質および他の麻疹ウイルス成分などの麻疹ウイルス抗原；タンパク質Ｅ１およびＥ２ならびに他の風疹ウイルス成分などの風疹ウイルス抗原；ＶＰ７ｓｃおよび他のロタウイルス成分などのロタウイルス抗原；エンベロープ糖タンパク質Ｂおよび他のサイトメガロウイルス抗原成分などのサイトメガロウイルス抗原；ＲＳＶ融合タンパク質、Ｍ２タンパク質および他の呼吸器合胞体ウイルス抗原成分などの呼吸器合胞体ウイルス抗原；最初期タンパク質、糖タンパク質Ｄ、および他の単純ヘルペスウイルス抗原成分などの単純ヘルペスウイルス抗原；ｇｐＩ、ｇｐＩＩ、および他の水痘帯状疱疹ウイルス抗原成分などの水痘帯状疱疹ウイルス抗原；タンパク質Ｅ、Ｍ－Ｅ、Ｍ－Ｅ－ＮＳ１、ＮＳ１、ＮＳ１－ＮＳ２Ａ、８０％Ｅ、および他の日本脳炎ウイルス抗原成分のような日本脳炎ウイルス抗原；狂犬病糖タンパク質、狂犬病核タンパク質および他の狂犬病ウイルス抗原成分などの狂犬病ウイルス抗原；西ナイルウイルスのｐｒＭおよびＥタンパク質；エボラエンベロープタンパク質である。ウイルス抗原のさらなる例については、Fundamental Virology, Second Edition, eds. Knipe, D. M. and, Howley P. M. (Lippincott Williams & Wilkins, New York, 2001)を参照されたい。さらに、細菌抗原も開示されている。
【0050】
本技術の組成物および方法で使用できる細菌抗原には、百日咳毒素、糸状赤血球凝集素、百日咳、ＦＩＭ２、ＦＩＭ３、アデニレートシクラーゼおよび他の百日咳細菌抗原成分などの百日咳細菌抗原；ジフテリア毒素またはトキソイドおよび他のジフテリア細菌抗原成分などのジフテリア細菌抗原；破傷風毒素またはトキソイドなどの破傷風細菌抗原および他の破傷風細菌抗原成分；Ｍタンパク質および他の連鎖球菌細菌抗原成分などの連鎖球菌細菌抗原；ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＳｄｒＤ、およびＳｄｒＥなどのブドウ球菌細菌抗原；リポ多糖類、フラジェリン、および他のグラム陰性細菌抗原成分などのグラム陰性杆菌細菌抗原；ミコール酸、熱ショックタンパク質６５（ＨＳＰ６５）、３０ｋＤａ主要分泌タンパク質、抗原８５Ａ、ＥＳＡＴ－６、および他のマイコバクテリア抗原成分などのマイコバクテリア結核菌細菌抗原；ヘリコバクターピロリ細菌抗原成分；ニューモリシン、肺炎球菌莢膜多糖類および他の肺炎球菌細菌抗原成分などの肺炎球菌細菌抗原；莢膜多糖類および他のヘモフィラス・インフルエンザ菌抗原成分などのヘモフィラス・インフルエンザ菌抗原；炭疽菌防御抗原、炭疽菌致死因子、および他の炭疽菌細菌抗原成分などの炭疽菌抗原；Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ由来のＦ１およびＶタンパク質；ロンプおよび他のリケッチア細菌抗原成分などのリケッチア細菌抗原が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に記載の細菌抗原には、他の細菌、マイコバクテリア、マイコプラズマ、リケッチア、またはクラミジア抗原も含まれる。原生動物および他の寄生虫抗原の例には、メロゾイト表面抗原、スポロゾイト表面抗原、スポロゾイト周囲抗原、配偶体細胞／配偶子表面抗原、血球期抗原ｐｆ１ ５５／ＲＥＳＡ、他のマラリア原虫抗原などの熱帯熱マラリア原虫抗原；ＳＡＧ－１、ｐ３０および他のトキソプラズマ抗原成分などのトキソプラズマ抗原；グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、パラミオシン、および他の住血吸虫抗原成分のような住血吸虫抗原；ｇｐ６３、リポホスホグリカンおよびその関連タンパク質ならびに他のリーシュマニア抗原成分などのリーシュマニア主要および他のリーシュマニア抗原；７５～７７ｋＤａ抗原、５６ｋＤａ抗原および他のトリパノソーマ抗原成分などのトリパノソーマクルス抗原が含まれるが、これらに限定されない。真菌抗原の例としては、限定されないが、カンジダ種、アスペルギルス種、ブラストミセス種、ヒストプラズマ種、コクシジオイドミコシス症種、マラセジア・フルフールおよび他の種、エキソフィアラ・ヴェルネキおよび他の種、ピエドレア・ホータイおよび他の種、バイゲル毛芽抱菌種 およびその他の種、ミクロスポラム種、白癬菌種、表皮菌種、スポロトリックスシェンキィおよびその他の種、フォンセカ‐ペドロソイおよびその他の種、ワンギエラデルマチチジスおよびその他の種、シュードアレシェリア・ボイディおよびその他の種、マズレラ－グリセアおよびその他の種、リゾプス種、アブシディア種、ケカビ種からの抗原が含まれる。プリオン病抗原の例には、ＰｒＰ、β－アミロイド、および他のプリオン関連タンパク質が含まれる。
【0051】
上述の感染性および寄生性物質に加えて、非感染性物質に対する望ましい増強された免疫原性のための別の分野は、炎症性および自己免疫性疾患、神経変性疾患、およびがんを含むが限定はされない増殖性疾患の分野であり、ここで、がん抗原を発現する細胞は、望ましくは一団から排除される。本技術の組成物および方法において使用され得る腫瘍抗原には、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、乳房、卵巣、精巣、黒色腫、テロメラーゼ；Ｐ糖タンパク質などの多剤耐性タンパク質；ＭＡＧＥ－１、αフェトプロテイン、がん胎児性抗原、変異型ｐ５３、パピローマウイルス抗原、ガングリオシド、またはメラノーマまたは他の腫瘍細胞の他の炭水化物含有成分を含むがこれらに限定されない。本技術により、任意の種類の腫瘍細胞由来の抗原が本明細書に記載の組成物および方法に使用できることが企図されている。抗原は、がん細胞、または膜タンパク質などのがん細胞から単離された免疫原性物質であり得る。含まれるのは、サバイビンおよびテロメラーゼの普遍的抗原、ならびにがん精巣抗原のＭＡＧＥファミリーである。自己免疫に関与していることが示され、および本技術の方法において寛容性を誘導するために使用することができる抗原としては、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質および多発性硬化症のプロテオリピドタンパク質、ならびに慢性関節リウマチのＣＩＩコラーゲンタンパク質が挙げられる。
【0052】
抗原は、非限定的な例として、ＨＩＶ－１、ＥＢＶ、ＨＢＶ、インフルエンザウイルス、ＳＡＲＳウイルス、ポックスウイルス、マラリア、またはＨＳＶのような感染性病原体の一部であり得、そのために（樹状細胞を介した）強いＴ細胞媒介免疫を動かすワクチンが必要とされる。
【0053】
本明細書で使用される用語「がん」は、その独特の形質－正常な制御の喪失－が無秩序な増殖、分化の欠如、局所組織浸潤、および転移をもたらす細胞の過剰増殖として定義される。例としては、黒色腫、非小細胞肺、小細胞肺、肺、肝癌、白血病、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、膠芽腫、歯肉、舌、神経芽細胞腫、頭、首、乳房、膵臓、前立腺、腎臓、骨、精巣、卵巣、中皮腫、頸部、消化管、リンパ腫、脳、結腸、肉腫または膀胱を含むが、これらに限定されない。
【0054】
「腫瘍」という用語は、組織新形成の形態、特に自発的、自律的かつ不可逆的な、多かれ少なかれ内因性組織の過剰成長の形態の、それは多かれ少なかれ脱抑制された、少なくとも１つの細胞または細胞塊を意味し、その増殖は、原則として、特定の細胞および組織機能の多かれ少なかれ顕著な喪失に関連する。この細胞または細胞塊は、その増殖に関して、それ自体によってまたは黒色腫または癌腫などの宿主生物の調節機構によっては効果的に抑制されない。腫瘍抗原は、悪性細胞自体の中または上に存在する抗原を含むだけでなく、内皮細胞および他の血管成分を含む腫瘍の間質支持組織上に存在する抗原も含む。関連する側面において、「新生物性（neoplastic）」とは異常な新たな増殖をいい、したがって良性または悪性であり得る腫瘍と同じことを意味する。さらに、そのような新生物（neoplasia）は細胞増殖障害を含むであろう。
【0055】
本技術のレンチウイルスベクターは、１つ以上のアジュバントをコードする核酸配列をさらに含む。 好ましいアジュバントは、細胞質内領域を含まない、全長ヒトＩＰＳ１と融合したエプスタインバーウイルス由来のＬＭＰ１を含有する融合タンパク質ＬＭＰ１（デルタ）ｈＩＰＳ１である。融合タンパク質において、ヒトＩＰＳ１の最初のアミノ酸（メチオニン）を取り除いた。融合タンパク質はヒトの使用のためにコドン最適化されている。この融合タンパク質のＤＮＡおよびコードされているアミノ酸配列を以下に示す。
ＤＮＡ配列
配列番号１(SEQ ID NO : 1 )：
ATGGATCTGGATCTCGAAAGAGGACCTCCTGGACCTAGACGGCCTCCTAGAGGACCACCTCTGAGCAGCTCTATTGGACTGGCCCTGCTGCTGCTTCTGCTGGCTCTGCTGTTCTGGCTGTACATCATCATGAGCAACTGGACCGGCGGAGCACTGCTGGTGCTGTATGCCTTTGCTCTGATGCTGGTCATCATCATCCTGATCATCTTCATCTTCCGGCGGGACCTGCTGTGTCCTCTGGGAGCACTTTGTCTGTTGCTGCTGATGATCACCCTCCTGCTGATCGCCCTGTGGAACCTGCATGGACAGGCCCTGTATCTGGGCATCGTGCTGTTCATCTTCGGCTGCCTGCTGGTTCTCGGCCTGTGGATCTACCTGCTGGAAATCCTTTGGAGACTGGGCGCCACCATCTGGCAGCTGCTGGCCTTTTTCCTGGCCTTCTTTCTGGATATCATCCTCCTCATCATTGCCCTGTACCTGCAGCAGAACTGGTGGACCCTGCTGGTGGATCTGCTTTGGCTGCTGCTCTTTCTGGCCATCCTGATTTGGATGTACTACCACGGCCAGCGGCCTTTCGCCGAGGACAAGACCTACAAGTACATCTGCCGGAACTTCAGCAACTTCTGCAACGTGGACGTGGTGGAAATTCTGCCCTACCTGCCTTGCCTGACCGCCAGAGATCAGGACAGACTGAGAGCCACATGTACCCTGAGCGGCAACAGAGACACACTGTGGCACCTGTTCAACACCCTGCAGAGAAGGCCTGGCTGGGTCGAGTACTTTATCGCCGCTCTGAGAGGCTGCGAGCTGGTCGATCTGGCTGATGAAGTGGCCAGCGTGTACCAGAGCTACCAGCCTAGAACCAGCGACCGGCCTCCTGATCCTCTCGAACCTCCATCTCTGCCCGCCGAAAGACCTGGACCTCCTACACCAGCTGCCGCTCACAGCATCCCTTACAACAGCTGCAGAGAGAAAGAACCTAGCTACCCCATGCCTGTGCAAGAGACACAGGCCCCAGAAAGCCCTGGCGAGAATAGCGAACAGGCTCTGCAGACACTGAGCCCCAGAGCCATTCCTAGAAACCCTGATGGCGGCCCTCTGGAAAGCTCTAGTGATCTGGCCGCTCTGTCCCCTCTGACAAGCTCTGGACACCAAGAGCAGGATACCGAGCTGGGCAGCACACATACAGCCGGCGCTACAAGCAGCCTGACACCTTCTAGAGGCCCCGTGTCTCCCAGCGTGTCATTTCAGCCTCTGGCCAGGTCTACCCCTAGGGCTTCTAGACTGCCTGGACCAACAGGCAGCGTGGTGTCTACCGGCACAAGCTTCAGCTCTAGCTCTCCTGGACTGGCTAGTGCCGGTGCCGCTGAGGGAAAACAAGGCGCCGAATCTGATCAGGCCGAGCCTATCATCTGTAGCAGCGGAGCAGAAGCCCCTGCCAATAGCCTGCCTAGCAAGGTGCCAACCACACTGATGCCCGTGAACACAGTGGCCCTGAAGGTGCCAGCTAATCCTGCCTCCGTGTCCACCGTGCCTTCTAAGCTGCCAACCAGCTCTAAGCCACCTGGCGCCGTGCCATCTAACGCCCTGACAAATCCTGCTCCAAGCAAGCTGCCCATCAACTCCACAAGAGCCGGCATGGTGCCCTCTAAGGTGCCCACATCTATGGTGCTGACCAAGGTGTCCGCCAGCACCGTGCCAACAGATGGCAGCTCCAGAAACGAGGAAACCCCTGCCGCTCCTACTCCTGCTGGCGCTACAGGCGGATCTTCTGCTTGGCTGGATAGCAGCAGCGAGAACAGAGGCCTGGGCAGCGAGCTTTCTAAACCTGGCGTGCTGGCTTCCCAGGTGGACAGCCCATTTTCCGGCTGCTTTGAGGACCTGGCTATCAGCGCCTCTACAAGCCTCGGCATGGGACCTTGTCACGGCCCCGAGGAAAACGAGTACAAGAGCGAGGGCACCTTCGGCATCCACGTGGCCGAGAATCCTAGCATCCAACTGCTGGAAGGCAACCCCGGACCTCCAGCTGATCCAGATGGCGGACCAAGACCTCAGGCCGACAGAAAGTTCCAAGAGCGCGAGGTGCCCTGCCACAGACCTTCTCCAGGTGCTCTGTGGCTGCAGGTTGCAGTGACAGGCGTCCTGGTGGTTACACTGCTCGTGGTCCTGTATAGACGGCGGCTGCACTGATGA
タンパク質配列
配列番号２(SEQ ID NO : 2 )：
MDLDLERGPPGPRRPPRGPPLSSSIGLALLLLLLALLFWLYIIMSNWTGGALLVLYAFALMLVIIILIIFIFRRDLLCPLGALCLLLLMITLLLIALWNLHGQALYLGIVLFIFGCLLVLGLWIYLLEILWRLGATIWQLLAFFLAFFLDIILLIIALYLQQNWWTLLVDLLWLLLFLAILIWMYYHGQRPFAEDKTYKYICRNFSNFCNVDVVEILPYLPCLTARDQDRLRATCTLSGNRDTLWHLFNTLQRRPGWVEYFIAALRGCELVDLADEVASVYQSYQPRTSDRPPDPLEPPSLPAERPGPPTPAAAHSIPYNSCREKEPSYPMPVQETQAPESPGENSEQALQTLSPRAIPRNPDGGPLESSSDLAALSPLTSSGHQEQDTELGSTHTAGATSSLTPSRGPVSPSVSFQPLARSTPRASRLPGPTGSVVSTGTSFSSSSPGLASAGAAEGKQGAESDQAEPIICSSGAEAPANSLPSKVPTTLMPVNTVALKVPANPASVSTVPSKLPTSSKPPGAVPSNALTNPAPSKLPINSTRAGMVPSKVPTSMVLTKVSASTVPTDGSSRNEETPAAPTPAGATGGSSAWLDSSSENRGLGSELSKPGVLASQVDSPFSGCFEDLAISASTSLGMGPCHGPEENEYKSEGTFGIHVAENPSIQLLEGNPGPPADPDGGPRPQADRKFQEREVPCHRPSPGALWLQVAVTGVLVVTLLVVLYRRRLH
ＤＮＡ配列
配列番号１(SEQ ID NO : 1 )：
ATGGATCTGGATCTCGAAAGAGGACCTCCTGGACCTAGACGGCCTCCTAGAGGACCACCTCTGAGCAGCTCTATTGGACTGGCCCTGCTGCTGCTTCTGCTGGCTCTGCTGTTCTGGCTGTACATCATCATGAGCAACTGGACCGGCGGAGCACTGCTGGTGCTGTATGCCTTTGCTCTGATGCTGGTCATCATCATCCTGATCATCTTCATCTTCCGGCGGGACCTGCTGTGTCCTCTGGGAGCACTTTGTCTGTTGCTGCTGATGATCACCCTCCTGCTGATCGCCCTGTGGAACCTGCATGGACAGGCCCTGTATCTGGGCATCGTGCTGTTCATCTTCGGCTGCCTGCTGGTTCTCGGCCTGTGGATCTACCTGCTGGAAATCCTTTGGAGACTGGGCGCCACCATCTGGCAGCTGCTGGCCTTTTTCCTGGCCTTCTTTCTGGATATCATCCTCCTCATCATTGCCCTGTACCTGCAGCAGAACTGGTGGACCCTGCTGGTGGATCTGCTTTGGCTGCTGCTCTTTCTGGCCATCCTGATTTGGATGTACTACCACGGCCAGCGGCCTTTCGCCGAGGACAAGACCTACAAGTACATCTGCCGGAACTTCAGCAACTTCTGCAACGTGGACGTGGTGGAAATTCTGCCCTACCTGCCTTGCCTGACCGCCAGAGATCAGGACAGACTGAGAGCCACATGTACCCTGAGCGGCAACAGAGACACACTGTGGCACCTGTTCAACACCCTGCAGAGAAGGCCTGGCTGGGTCGAGTACTTTATCGCCGCTCTGAGAGGCTGCGAGCTGGTCGATCTGGCTGATGAAGTGGCCAGCGTGTACCAGAGCTACCAGCCTAGAACCAGCGACCGGCCTCCTGATCCTCTCGAACCTCCATCTCTGCCCGCCGAAAGACCTGGACCTCCTACACCAGCTGCCGCTCACAGCATCCCTTACAACAGCTGCAGAGAGAAAGAACCTAGCTACCCCATGCCTGTGCAAGAGACACAGGCCCCAGAAAGCCCTGGCGAGAATAGCGAACAGGCTCTGCAGACACTGAGCCCCAGAGCCATTCCTAGAAACCCTGATGGCGGCCCTCTGGAAAGCTCTAGTGATCTGGCCGCTCTGTCCCCTCTGACAAGCTCTGGACACCAAGAGCAGGATACCGAGCTGGGCAGCACACATACAGCCGGCGCTACAAGCAGCCTGACACCTTCTAGAGGCCCCGTGTCTCCCAGCGTGTCATTTCAGCCTCTGGCCAGGTCTACCCCTAGGGCTTCTAGACTGCCTGGACCAACAGGCAGCGTGGTGTCTACCGGCACAAGCTTCAGCTCTAGCTCTCCTGGACTGGCTAGTGCCGGTGCCGCTGAGGGAAAACAAGGCGCCGAATCTGATCAGGCCGAGCCTATCATCTGTAGCAGCGGAGCAGAAGCCCCTGCCAATAGCCTGCCTAGCAAGGTGCCAACCACACTGATGCCCGTGAACACAGTGGCCCTGAAGGTGCCAGCTAATCCTGCCTCCGTGTCCACCGTGCCTTCTAAGCTGCCAACCAGCTCTAAGCCACCTGGCGCCGTGCCATCTAACGCCCTGACAAATCCTGCTCCAAGCAAGCTGCCCATCAACTCCACAAGAGCCGGCATGGTGCCCTCTAAGGTGCCCACATCTATGGTGCTGACCAAGGTGTCCGCCAGCACCGTGCCAACAGATGGCAGCTCCAGAAACGAGGAAACCCCTGCCGCTCCTACTCCTGCTGGCGCTACAGGCGGATCTTCTGCTTGGCTGGATAGCAGCAGCGAGAACAGAGGCCTGGGCAGCGAGCTTTCTAAACCTGGCGTGCTGGCTTCCCAGGTGGACAGCCCATTTTCCGGCTGCTTTGAGGACCTGGCTATCAGCGCCTCTACAAGCCTCGGCATGGGACCTTGTCACGGCCCCGAGGAAAACGAGTACAAGAGCGAGGGCACCTTCGGCATCCACGTGGCCGAGAATCCTAGCATCCAACTGCTGGAAGGCAACCCCGGACCTCCAGCTGATCCAGATGGCGGACCAAGACCTCAGGCCGACAGAAAGTTCCAAGAGCGCGAGGTGCCCTGCCACAGACCTTCTCCAGGTGCTCTGTGGCTGCAGGTTGCAGTGACAGGCGTCCTGGTGGTTACACTGCTCGTGGTCCTGTATAGACGGCGGCTGCACTGATGA
タンパク質配列
配列番号２(SEQ ID NO : 2 )：
MDLDLERGPPGPRRPPRGPPLSSSIGLALLLLLLALLFWLYIIMSNWTGGALLVLYAFALMLVIIILIIFIFRRDLLCPLGALCLLLLMITLLLIALWNLHGQALYLGIVLFIFGCLLVLGLWIYLLEILWRLGATIWQLLAFFLAFFLDIILLIIALYLQQNWWTLLVDLLWLLLFLAILIWMYYHGQRPFAEDKTYKYICRNFSNFCNVDVVEILPYLPCLTARDQDRLRATCTLSGNRDTLWHLFNTLQRRPGWVEYFIAALRGCELVDLADEVASVYQSYQPRTSDRPPDPLEPPSLPAERPGPPTPAAAHSIPYNSCREKEPSYPMPVQETQAPESPGENSEQALQTLSPRAIPRNPDGGPLESSSDLAALSPLTSSGHQEQDTELGSTHTAGATSSLTPSRGPVSPSVSFQPLARSTPRASRLPGPTGSVVSTGTSFSSSSPGLASAGAAEGKQGAESDQAEPIICSSGAEAPANSLPSKVPTTLMPVNTVALKVPANPASVSTVPSKLPTSSKPPGAVPSNALTNPAPSKLPINSTRAGMVPSKVPTSMVLTKVSASTVPTDGSSRNEETPAAPTPAGATGGSSAWLDSSSENRGLGSELSKPGVLASQVDSPFSGCFEDLAISASTSLGMGPCHGPEENEYKSEGTFGIHVAENPSIQLLEGNPGPPADPDGGPRPQADRKFQEREVPCHRPSPGALWLQVAVTGVLVVTLLVVLYRRRLH
【0056】
別の好ましいアジュバントは、その膜貫通領域を含まずに、ヒトＩＰＳ１のアミノ酸２－４３９と融合した、細胞質内領域を含まない、エプスタインバーウイルス由来のＬＭＰ１を含有する融合タンパク質ＬＭＰ１（デルタＩＣ）ｈＩＰＳ１（デルタＴＭ）である。融合タンパク質において、ヒトＩＰＳ１の最初のアミノ酸（メチオニン）を取り除いた。融合タンパク質はヒトの使用ためにコドン最適化されている。この融合タンパク質のＤＮＡおよびコードされているアミノ酸配列を以下に示す。
ＤＮＡ配列
配列番号３(SEQ ID NO : 3 )：
ATGGATCTGGATCTCGAAAGAGGACCTCCTGGACCTAGACGGCCTCCTAGAGGACCACCTCTGAGCAGCTCTATTGGACTGGCCCTGCTGCTGCTTCTGCTGGCTCTGCTGTTCTGGCTGTACATCATCATGAGCAACTGGACCGGCGGAGCACTGCTGGTGCTGTATGCCTTTGCTCTGATGCTGGTCATCATCATCCTGATCATCTTCATCTTCCGGCGGGACCTGCTGTGTCCTCTGGGAGCACTTTGTCTGTTGCTGCTGATGATCACCCTCCTGCTGATCGCCCTGTGGAACCTGCATGGACAGGCCCTGTATCTGGGCATCGTGCTGTTCATCTTCGGCTGCCTGCTGGTTCTCGGCCTGTGGATCTACCTGCTGGAAATCCTTTGGAGACTGGGCGCCACCATCTGGCAGCTGCTGGCCTTTTTCCTGGCCTTCTTTCTGGATATCATCCTCCTCATCATTGCCCTGTACCTGCAGCAGAACTGGTGGACCCTGCTGGTGGATCTGCTTTGGCTGCTGCTCTTTCTGGCCATCCTGATTTGGATGTACTACCACGGCCAGCGGCCTTTCGCCGAGGACAAGACCTACAAGTACATCTGCCGGAACTTCAGCAACTTCTGCAACGTGGACGTGGTGGAAATTCTGCCCTACCTGCCTTGCCTGACCGCCAGAGATCAGGACAGACTGAGAGCCACATGTACCCTGAGCGGCAACAGAGACACACTGTGGCACCTGTTCAACACCCTGCAGAGAAGGCCTGGCTGGGTCGAGTACTTTATCGCCGCTCTGAGAGGCTGCGAGCTGGTCGATCTGGCTGATGAAGTGGCCAGCGTGTACCAGAGCTACCAGCCTAGAACCAGCGACCGGCCTCCTGATCCTCTCGAACCTCCATCTCTGCCCGCCGAAAGACCTGGACCTCCTACACCAGCTGCCGCTCACAGCATCCCTTACAACAGCTGCAGAGAGAAAGAACCTAGCTACCCCATGCCTGTGCAAGAGACACAGGCCCCAGAAAGCCCTGGCGAGAATAGCGAACAGGCTCTGCAGACACTGAGCCCCAGAGCCATTCCTAGAAACCCTGATGGCGGCCCTCTGGAAAGCTCTAGTGATCTGGCCGCTCTGTCCCCTCTGACAAGCTCTGGACACCAAGAGCAGGATACCGAGCTGGGCAGCACACATACAGCCGGCGCTACAAGCAGCCTGACACCTTCTAGAGGCCCCGTGTCTCCCAGCGTGTCATTTCAGCCTCTGGCCAGGTCTACCCCTAGGGCTTCTAGACTGCCTGGACCAACAGGCAGCGTGGTGTCTACCGGCACAAGCTTCAGCTCTAGCTCTCCTGGACTGGCTAGTGCCGGTGCCGCTGAGGGAAAACAAGGCGCCGAATCTGATCAGGCCGAGCCTATCATCTGTAGCAGCGGAGCAGAAGCCCCTGCCAATAGCCTGCCTAGCAAGGTGCCAACCACACTGATGCCCGTGAACACAGTGGCCCTGAAGGTGCCAGCTAATCCTGCCTCCGTGTCCACCGTGCCTTCTAAGCTGCCAACCAGCTCTAAGCCACCTGGCGCCGTGCCATCTAACGCCCTGACAAATCCTGCTCCAAGCAAGCTGCCCATCAACTCCACAAGAGCCGGCATGGTGCCCTCTAAGGTGCCCACATCTATGGTGCTGACCAAGGTGTCCGCCAGCACCGTGCCAACAGATGGCAGCTCCAGAAACGAGGAAACCCCTGCCGCTCCTACTCCTGCTGGCGCTACAGGCGGATCTTCTGCTTGGCTGGATAGCAGCAGCGAGAACAGAGGCCTGGGCAGCGAGCTTTCTAAACCTGGCGTGCTGGCTTCCCAGGTGGACAGCCCATTTTCCGGCTGCTTTGAGGACCTGGCTATCAGCGCCTCTACAAGCCTCGGCATGGGACCTTGTCACGGCCCCGAGGAAAACGAGTACAAGAGCGAGGGCACCTTCGGCATCCACGTGGCCGAGAATCCTAGCATCCAACTGCTGGAAGGCAACCCCGGACCTCCAGCTGATCCAGATGGCGGACCAAGACCTCAGGCCGACAGAAAGTTCCAAGAGCGCGAGGTGCCCTGCCACAGACCTTCTCCA
タンパク質配列
配列番号４(SEQ ID NO : 4 )：
MDLDLERGPPGPRRPPRGPPLSSSIGLALLLLLLALLFWLYIIMSNWTGGALLVLYAFALMLVIIILIIFIFRRDLLCPLGALCLLLLMITLLLIALWNLHGQALYLGIVLFIFGCLLVLGLWIYLLEILWRLGATIWQLLAFFLAFFLDIILLIIALYLQQNWWTLLVDLLWLLLFLAILIWMYYHGQRPFAEDKTYKYICRNFSNFCNVDVVEILPYLPCLTARDQDRLRATCTLSGNRDTLWHLFNTLQRRPGWVEYFIAALRGCELVDLADEVASVYQSYQPRTSDRPPDPLEPPSLPAERPGPPTPAAAHSIPYNSCREKEPSYPMPVQETQAPESPGENSEQALQTLSPRAIPRNPDGGPLESSSDLAALSPLTSSGHQEQDTELGSTHTAGATSSLTPSRGPVSPSVSFQPLARSTPRASRLPGPTGSVVSTGTSFSSSSPGLASAGAAEGKQGAESDQAEPIICSSGAEAPANSLPSKVPTTLMPVNTVALKVPANPASVSTVPSKLPTSSKPPGAVPSNALTNPAPSKLPINSTRAGMVPSKVPTSMVLTKVSASTVPTDGSSRNEETPAAPTPAGATGGSSAWLDSSSENRGLGSELSKPGVLASQVDSPFSGCFEDLAISASTSLGMGPCHGPEENEYKSEGTFGIHVAENPSIQLLEGNPGPPADPDGGPRPQADRKFQEREVPCHRPSP
ＤＮＡ配列
配列番号３(SEQ ID NO : 3 )：
ATGGATCTGGATCTCGAAAGAGGACCTCCTGGACCTAGACGGCCTCCTAGAGGACCACCTCTGAGCAGCTCTATTGGACTGGCCCTGCTGCTGCTTCTGCTGGCTCTGCTGTTCTGGCTGTACATCATCATGAGCAACTGGACCGGCGGAGCACTGCTGGTGCTGTATGCCTTTGCTCTGATGCTGGTCATCATCATCCTGATCATCTTCATCTTCCGGCGGGACCTGCTGTGTCCTCTGGGAGCACTTTGTCTGTTGCTGCTGATGATCACCCTCCTGCTGATCGCCCTGTGGAACCTGCATGGACAGGCCCTGTATCTGGGCATCGTGCTGTTCATCTTCGGCTGCCTGCTGGTTCTCGGCCTGTGGATCTACCTGCTGGAAATCCTTTGGAGACTGGGCGCCACCATCTGGCAGCTGCTGGCCTTTTTCCTGGCCTTCTTTCTGGATATCATCCTCCTCATCATTGCCCTGTACCTGCAGCAGAACTGGTGGACCCTGCTGGTGGATCTGCTTTGGCTGCTGCTCTTTCTGGCCATCCTGATTTGGATGTACTACCACGGCCAGCGGCCTTTCGCCGAGGACAAGACCTACAAGTACATCTGCCGGAACTTCAGCAACTTCTGCAACGTGGACGTGGTGGAAATTCTGCCCTACCTGCCTTGCCTGACCGCCAGAGATCAGGACAGACTGAGAGCCACATGTACCCTGAGCGGCAACAGAGACACACTGTGGCACCTGTTCAACACCCTGCAGAGAAGGCCTGGCTGGGTCGAGTACTTTATCGCCGCTCTGAGAGGCTGCGAGCTGGTCGATCTGGCTGATGAAGTGGCCAGCGTGTACCAGAGCTACCAGCCTAGAACCAGCGACCGGCCTCCTGATCCTCTCGAACCTCCATCTCTGCCCGCCGAAAGACCTGGACCTCCTACACCAGCTGCCGCTCACAGCATCCCTTACAACAGCTGCAGAGAGAAAGAACCTAGCTACCCCATGCCTGTGCAAGAGACACAGGCCCCAGAAAGCCCTGGCGAGAATAGCGAACAGGCTCTGCAGACACTGAGCCCCAGAGCCATTCCTAGAAACCCTGATGGCGGCCCTCTGGAAAGCTCTAGTGATCTGGCCGCTCTGTCCCCTCTGACAAGCTCTGGACACCAAGAGCAGGATACCGAGCTGGGCAGCACACATACAGCCGGCGCTACAAGCAGCCTGACACCTTCTAGAGGCCCCGTGTCTCCCAGCGTGTCATTTCAGCCTCTGGCCAGGTCTACCCCTAGGGCTTCTAGACTGCCTGGACCAACAGGCAGCGTGGTGTCTACCGGCACAAGCTTCAGCTCTAGCTCTCCTGGACTGGCTAGTGCCGGTGCCGCTGAGGGAAAACAAGGCGCCGAATCTGATCAGGCCGAGCCTATCATCTGTAGCAGCGGAGCAGAAGCCCCTGCCAATAGCCTGCCTAGCAAGGTGCCAACCACACTGATGCCCGTGAACACAGTGGCCCTGAAGGTGCCAGCTAATCCTGCCTCCGTGTCCACCGTGCCTTCTAAGCTGCCAACCAGCTCTAAGCCACCTGGCGCCGTGCCATCTAACGCCCTGACAAATCCTGCTCCAAGCAAGCTGCCCATCAACTCCACAAGAGCCGGCATGGTGCCCTCTAAGGTGCCCACATCTATGGTGCTGACCAAGGTGTCCGCCAGCACCGTGCCAACAGATGGCAGCTCCAGAAACGAGGAAACCCCTGCCGCTCCTACTCCTGCTGGCGCTACAGGCGGATCTTCTGCTTGGCTGGATAGCAGCAGCGAGAACAGAGGCCTGGGCAGCGAGCTTTCTAAACCTGGCGTGCTGGCTTCCCAGGTGGACAGCCCATTTTCCGGCTGCTTTGAGGACCTGGCTATCAGCGCCTCTACAAGCCTCGGCATGGGACCTTGTCACGGCCCCGAGGAAAACGAGTACAAGAGCGAGGGCACCTTCGGCATCCACGTGGCCGAGAATCCTAGCATCCAACTGCTGGAAGGCAACCCCGGACCTCCAGCTGATCCAGATGGCGGACCAAGACCTCAGGCCGACAGAAAGTTCCAAGAGCGCGAGGTGCCCTGCCACAGACCTTCTCCA
タンパク質配列
配列番号４(SEQ ID NO : 4 )：
MDLDLERGPPGPRRPPRGPPLSSSIGLALLLLLLALLFWLYIIMSNWTGGALLVLYAFALMLVIIILIIFIFRRDLLCPLGALCLLLLMITLLLIALWNLHGQALYLGIVLFIFGCLLVLGLWIYLLEILWRLGATIWQLLAFFLAFFLDIILLIIALYLQQNWWTLLVDLLWLLLFLAILIWMYYHGQRPFAEDKTYKYICRNFSNFCNVDVVEILPYLPCLTARDQDRLRATCTLSGNRDTLWHLFNTLQRRPGWVEYFIAALRGCELVDLADEVASVYQSYQPRTSDRPPDPLEPPSLPAERPGPPTPAAAHSIPYNSCREKEPSYPMPVQETQAPESPGENSEQALQTLSPRAIPRNPDGGPLESSSDLAALSPLTSSGHQEQDTELGSTHTAGATSSLTPSRGPVSPSVSFQPLARSTPRASRLPGPTGSVVSTGTSFSSSSPGLASAGAAEGKQGAESDQAEPIICSSGAEAPANSLPSKVPTTLMPVNTVALKVPANPASVSTVPSKLPTSSKPPGAVPSNALTNPAPSKLPINSTRAGMVPSKVPTSMVLTKVSASTVPTDGSSRNEETPAAPTPAGATGGSSAWLDSSSENRGLGSELSKPGVLASQVDSPFSGCFEDLAISASTSLGMGPCHGPEENEYKSEGTFGIHVAENPSIQLLEGNPGPPADPDGGPRPQADRKFQEREVPCHRPSP
【0057】
別の好ましいアジュバントは、ヒトＩＰＳ１のアミノ酸２～９３と融合した（Ｃ末端プロリン富裕ドメインおよび膜貫通ドメインを除去した切断型ＩＰＳ１）、細胞質内領域を含まない、エプスタインバーウイルス由来のＬＭＰ１を含有する、融合タンパク質ＬＭＰ１（デルタＩＣ）ｈＩＰＳ１（デルタＴＭデルタプロ）である。融合タンパク質において、ヒトＩＰＳ１の最初のアミノ酸（メチオニン）を取り除いた。融合タンパク質はヒトの使用のためにコドン最適化された。この融合タンパク質のＤＮＡおよびコードされているアミノ酸配列を以下に示す。
ＤＮＡ配列
配列番号５(SEQ ID NO : 5 )：
ATGGATCTGGATCTCGAAAGAGGACCTCCTGGACCTAGACGGCCTCCTAGAGGACCACCTCTGAGCAGCTCTATTGGACTGGCCCTGCTGCTGCTTCTGCTGGCTCTGCTGTTCTGGCTGTACATCATCATGAGCAACTGGACCGGCGGAGCACTGCTGGTGCTGTATGCCTTTGCTCTGATGCTGGTCATCATCATCCTGATCATCTTCATCTTCCGGCGGGACCTGCTGTGTCCTCTGGGAGCACTTTGTCTGTTGCTGCTGATGATCACCCTCCTGCTGATCGCCCTGTGGAACCTGCATGGACAGGCCCTGTATCTGGGCATCGTGCTGTTCATCTTCGGCTGCCTGCTGGTTCTCGGCCTGTGGATCTACCTGCTGGAAATCCTTTGGAGACTGGGCGCCACCATCTGGCAGCTGCTGGCCTTTTTCCTGGCCTTCTTTCTGGATATCATCCTCCTCATCATTGCCCTGTACCTGCAGCAGAACTGGTGGACCCTGCTGGTGGATCTGCTTTGGCTGCTGCTCTTTCTGGCCATCCTGATTTGGATGTACTACCACGGCCAGCGGCCTTTCGCCGAGGACAAGACCTACAAGTACATCTGCCGGAACTTCAGCAACTTCTGCAACGTGGACGTGGTGGAAATTCTGCCCTACCTGCCTTGCCTGACCGCCAGAGATCAGGACAGACTGAGAGCCACATGTACCCTGAGCGGCAACAGAGACACACTGTGGCACCTGTTCAACACCCTGCAGAGAAGGCCTGGCTGGGTCGAGTACTTTATCGCCGCTCTGAGAGGCTGCGAGCTGGTCGATCTGGCTGATGAAGTGGCCAGCGTGTACCAGAGCTACCAGCCTAGAACCAGCGACCGGGGCGAGAATAGCGAACAGGCTCTGCAGACACTGAGCCCCAGAGCCATTCCTAGAAACCCTGATGGCGGCCCTCTGGAAAGCTCTAGTGATCTGGCCGCTCTGTCCCCTCTGACAAGCTCTGGACACCAAGAGCAGGATACCGAGCTGGGCAGCACACATACAGCCGGCGCTACAAGCAGCCTGACACCTTCTAGAGGCCCCGTGTCTCCCAGCGTGTCATTTCAGCCTCTGGCCAGGTCTACCCCTAGGGCTTCTAGACTGCCTGGACCAACAGGCAGCGTGGTGTCTACCGGCACAAGCTTCAGCTCTAGCTCTCCTGGACTGGCTAGTGCCGGTGCCGCTGAGGGAAAACAAGGCGCCGAATCTGATCAGGCCGAGCCTATCATCTGTAGCAGCGGAGCAGAAGCCCCTGCCAATAGCCTGCCTAGCAAGGTGCCAACCACACTGATGCCCGTGAACACAGTGGCCCTGAAGGTGCCAGCTAATCCTGCCTCCGTGTCCACCGTGCCTTCTAAGCTGCCAACCAGCTCTAAGCCACCTGGCGCCGTGCCATCTAACGCCCTGACAAATCCTGCTCCAAGCAAGCTGCCCATCAACTCCACAAGAGCCGGCATGGTGCCCTCTAAGGTGCCCACATCTATGGTGCTGACCAAGGTGTCCGCCAGCACCGTGCCAACAGATGGCAGCTCCAGAAACGAGGAAACCCCTGCCGCTCCTACTCCTGCTGGCGCTACAGGCGGATCTTCTGCTTGGCTGGATAGCAGCAGCGAGAACAGAGGCCTGGGCAGCGAGCTTTCTAAACCTGGCGTGCTGGCTTCCCAGGTGGACAGCCCATTTTCCGGCTGCTTTGAGGACCTGGCTATCAGCGCCTCTACAAGCCTCGGCATGGGACCTTGTCACGGCCCCGAGGAAAACGAGTACAAGAGCGAGGGCACCTTCGGCATCCACGTGGCCGAGAATCCTAGCATCCAACTGCTGGAAGGCAACCCCGGACCTCCAGCTGATCCAGATGGCGGACCAAGACCTCAGGCCGACAGAAAGTTCCAAGAGCGCGAGGTGCCCTGCCACAGACCTTCTCCA
タンパク質配列
配列番号６(SEQ ID NO: 6)：
MDLDLERGPPGPRRPPRGPPLSSSIGLALLLLLLALLFWLYIIMSNWTGGALLVLYAFALMLVIIILIIFIFRRDLLCPLGALCLLLLMITLLLIALWNLHGQALYLGIVLFIFGCLLVLGLWIYLLEILWRLGATIWQLLAFFLAFFLDIILLIIALYLQQNWWTLLVDLLWLLLFLAILIWMYYHGQRPFAEDKTYKYICRNFSNFCNVDVVEILPYLPCLTARDQDRLRATCTLSGNRDTLWHLFNTLQRRPGWVEYFIAALRGCELVDLADEVASVYQSYQPRTSDRGENSEQALQTLSPRAIPRNPDGGPLESSSDLAALSPLTSSGHQEQDTELGSTHTAGATSSLTPSRGPVSPSVSFQPLARSTPRASRLPGPTGSVVSTGTSFSSSSPGLASAGAAEGKQGAESDQAEPIICSSGAEAPANSLPSKVPTTLMPVNTVALKVPANPASVSTVPSKLPTSSKPPGAVPSNALTNPAPSKLPINSTRAGMVPSKVPTSMVLTKVSASTVPTDGSSRNEETPAAPTPAGATGGSSAWLDSSSENRGLGSELSKPGVLASQVDSPFSGCFEDLAISASTSLGMGPCHGPEENEYKSEGTFGIHVAENPSIQLLEGNPGPPADPDGGPRPQADRKFQEREVPCHRPSP
ＤＮＡ配列
配列番号５(SEQ ID NO : 5 )：
ATGGATCTGGATCTCGAAAGAGGACCTCCTGGACCTAGACGGCCTCCTAGAGGACCACCTCTGAGCAGCTCTATTGGACTGGCCCTGCTGCTGCTTCTGCTGGCTCTGCTGTTCTGGCTGTACATCATCATGAGCAACTGGACCGGCGGAGCACTGCTGGTGCTGTATGCCTTTGCTCTGATGCTGGTCATCATCATCCTGATCATCTTCATCTTCCGGCGGGACCTGCTGTGTCCTCTGGGAGCACTTTGTCTGTTGCTGCTGATGATCACCCTCCTGCTGATCGCCCTGTGGAACCTGCATGGACAGGCCCTGTATCTGGGCATCGTGCTGTTCATCTTCGGCTGCCTGCTGGTTCTCGGCCTGTGGATCTACCTGCTGGAAATCCTTTGGAGACTGGGCGCCACCATCTGGCAGCTGCTGGCCTTTTTCCTGGCCTTCTTTCTGGATATCATCCTCCTCATCATTGCCCTGTACCTGCAGCAGAACTGGTGGACCCTGCTGGTGGATCTGCTTTGGCTGCTGCTCTTTCTGGCCATCCTGATTTGGATGTACTACCACGGCCAGCGGCCTTTCGCCGAGGACAAGACCTACAAGTACATCTGCCGGAACTTCAGCAACTTCTGCAACGTGGACGTGGTGGAAATTCTGCCCTACCTGCCTTGCCTGACCGCCAGAGATCAGGACAGACTGAGAGCCACATGTACCCTGAGCGGCAACAGAGACACACTGTGGCACCTGTTCAACACCCTGCAGAGAAGGCCTGGCTGGGTCGAGTACTTTATCGCCGCTCTGAGAGGCTGCGAGCTGGTCGATCTGGCTGATGAAGTGGCCAGCGTGTACCAGAGCTACCAGCCTAGAACCAGCGACCGGGGCGAGAATAGCGAACAGGCTCTGCAGACACTGAGCCCCAGAGCCATTCCTAGAAACCCTGATGGCGGCCCTCTGGAAAGCTCTAGTGATCTGGCCGCTCTGTCCCCTCTGACAAGCTCTGGACACCAAGAGCAGGATACCGAGCTGGGCAGCACACATACAGCCGGCGCTACAAGCAGCCTGACACCTTCTAGAGGCCCCGTGTCTCCCAGCGTGTCATTTCAGCCTCTGGCCAGGTCTACCCCTAGGGCTTCTAGACTGCCTGGACCAACAGGCAGCGTGGTGTCTACCGGCACAAGCTTCAGCTCTAGCTCTCCTGGACTGGCTAGTGCCGGTGCCGCTGAGGGAAAACAAGGCGCCGAATCTGATCAGGCCGAGCCTATCATCTGTAGCAGCGGAGCAGAAGCCCCTGCCAATAGCCTGCCTAGCAAGGTGCCAACCACACTGATGCCCGTGAACACAGTGGCCCTGAAGGTGCCAGCTAATCCTGCCTCCGTGTCCACCGTGCCTTCTAAGCTGCCAACCAGCTCTAAGCCACCTGGCGCCGTGCCATCTAACGCCCTGACAAATCCTGCTCCAAGCAAGCTGCCCATCAACTCCACAAGAGCCGGCATGGTGCCCTCTAAGGTGCCCACATCTATGGTGCTGACCAAGGTGTCCGCCAGCACCGTGCCAACAGATGGCAGCTCCAGAAACGAGGAAACCCCTGCCGCTCCTACTCCTGCTGGCGCTACAGGCGGATCTTCTGCTTGGCTGGATAGCAGCAGCGAGAACAGAGGCCTGGGCAGCGAGCTTTCTAAACCTGGCGTGCTGGCTTCCCAGGTGGACAGCCCATTTTCCGGCTGCTTTGAGGACCTGGCTATCAGCGCCTCTACAAGCCTCGGCATGGGACCTTGTCACGGCCCCGAGGAAAACGAGTACAAGAGCGAGGGCACCTTCGGCATCCACGTGGCCGAGAATCCTAGCATCCAACTGCTGGAAGGCAACCCCGGACCTCCAGCTGATCCAGATGGCGGACCAAGACCTCAGGCCGACAGAAAGTTCCAAGAGCGCGAGGTGCCCTGCCACAGACCTTCTCCA
タンパク質配列
配列番号６(SEQ ID NO: 6)：
MDLDLERGPPGPRRPPRGPPLSSSIGLALLLLLLALLFWLYIIMSNWTGGALLVLYAFALMLVIIILIIFIFRRDLLCPLGALCLLLLMITLLLIALWNLHGQALYLGIVLFIFGCLLVLGLWIYLLEILWRLGATIWQLLAFFLAFFLDIILLIIALYLQQNWWTLLVDLLWLLLFLAILIWMYYHGQRPFAEDKTYKYICRNFSNFCNVDVVEILPYLPCLTARDQDRLRATCTLSGNRDTLWHLFNTLQRRPGWVEYFIAALRGCELVDLADEVASVYQSYQPRTSDRGENSEQALQTLSPRAIPRNPDGGPLESSSDLAALSPLTSSGHQEQDTELGSTHTAGATSSLTPSRGPVSPSVSFQPLARSTPRASRLPGPTGSVVSTGTSFSSSSPGLASAGAAEGKQGAESDQAEPIICSSGAEAPANSLPSKVPTTLMPVNTVALKVPANPASVSTVPSKLPTSSKPPGAVPSNALTNPAPSKLPINSTRAGMVPSKVPTSMVLTKVSASTVPTDGSSRNEETPAAPTPAGATGGSSAWLDSSSENRGLGSELSKPGVLASQVDSPFSGCFEDLAISASTSLGMGPCHGPEENEYKSEGTFGIHVAENPSIQLLEGNPGPPADPDGGPRPQADRKFQEREVPCHRPSP
【0058】
別の好ましいアジュバントは、細胞質内領域を含まない、エプスタインバーウイルス由来のＬＭＰ１を含有する融合タンパク質ＬＭＰ１（デルタＩＣ）ｈＩＰＳ１（デルタＴＭリバース）であり、ヒトＩＰＳ１のアミノ酸２－４３９（膜貫通ドメインが取り除かれ、逆のアミノ酸順、すなわち天然のＩＰＳ１のＣ末端からＮ末端方向の４３９～２に提示された切断型ＩＰＳ１）と融合している。融合タンパク質において、ヒトＩＰＳ１の最初のアミノ酸（メチオニン）を取り除いた。融合タンパク質はヒトの使用のためにコドン最適化されている。この融合タンパク質のＤＮＡおよびコードされているアミノ酸配列を以下に示す。
ＤＮＡ配列
配列番号７(SEQ ID NO: 7)：
ATGGATCTGGATCTCGAAAGAGGACCTCCTGGACCTAGACGGCCTCCTAGAGGACCACCTCTGAGCAGCTCTATTGGACTGGCCCTGCTGCTGCTTCTGCTGGCTCTGCTGTTCTGGCTGTACATCATCATGAGCAACTGGACCGGCGGAGCACTGCTGGTGCTGTATGCCTTTGCTCTGATGCTGGTCATCATCATCCTGATCATCTTCATCTTCCGGCGGGACCTGCTGTGTCCTCTGGGAGCACTTTGTCTGTTGCTGCTGATGATCACCCTCCTGCTGATCGCCCTGTGGAACCTGCATGGACAGGCCCTGTATCTGGGCATCGTGCTGTTCATCTTCGGCTGCCTGCTGGTTCTCGGCCTGTGGATCTACCTGCTGGAAATCCTTTGGAGACTGGGCGCCACCATCTGGCAGCTGCTGGCCTTTTTCCTGGCCTTCTTTCTGGATATCATCCTCCTCATCATTGCCCTGTACCTGCAGCAGAACTGGTGGACCCTGCTGGTGGATCTGCTTTGGCTGCTGCTCTTTCTGGCCATCCTGATTTGGATGTACTACCACGGCCAGCGGCCTTCTCCAAGACACTGCCCAGTGGAAAGAGAGCAGTTCAAGAGGGACGCCCAGCCTAGACCTGGCGGAGATCCTGATGCTCCACCTGGACCAAATGGCGAGCTGCTGCAGATCAGCCCTAATGAGGCCGTGCACATCGGCTTCACCGGCGAGTCTAAGTACGAGAACGAGGAACCCGGCCACTGTCCTGGCATGGGCCTTTCTACATCTGCCTCTATCGCCCTGGACGAGTTCTGCGGCAGCTTTCCATCTGATGTGCAGTCTGCCCTCGTGGGCCCTAAGTCTCTGGAATCTGGCCTGGGCAGAAACGAGAGCAGCTCCGATCTGTGGGCTAGCTCTGGTGGAACAGCTGGCGCTCCTACACCAGCCGCTCCTACCGAAGAGAATAGAAGCAGCGGCGACACCCCTGTGACAAGCGCCTCTGTGAAAACCCTGGTCATGAGCACCCCAGTGAAGTCCCCAGTGATGGGCGCCAGAACCTCCAACATTCCCCTGAAGTCTCCCGCTCCTAACACACTGGCCAACTCTCCAGTGGCTGGCCCTCCTAAGTCTAGCACCCCTCTGAAAAGCCCCGTGACCTCTGTGTCTGCCCCTAACGCTCCTGTGAAACTGGCCGTGACCAACGTGCCCATGCTGACCACACCTGTGAAATCCCCACTGAGCAATGCCCCTGCCGAGGCCGGAAGCTCTTGTATCATTCCCGAGGCTCAGGATAGCGAGGCTGGCCAAAAAGGCGAAGCTGCAGGCGCTTCTGCTCTGGGCCCTAGCTCTAGCTCTTTTAGCACCGGCACCAGCGTGGTGTCTGGCACACCAGGACCTCTGAGAAGCGCCAGACCTACCTCTAGAGCCCTGCCTCAGTTTAGCGTGTCCCCTAGTGTGCCTGGCAGAAGCCCTACACTGTCTAGTACAGCCGGCGCTACACACACCAGCGGACTGGAAACAGACCAAGAACAGCATGGCAGCAGCACCCTGCCTTCTCTGGCTGCCCTTGATTCTAGCAGCGAACTGCCAGGCGGCGACCCCAATAGACCTATCGCTAGACCTAGCCTGACACAGCTGGCCCAAGAGAGCAATGAGGGCCCTTCTGAGCCTGCTCAGACCGAACAGGTGCCAATGCCTTACAGCCCCGAGAAAGAGCGGTGCAGCAACTACCCTATCAGCCATGCCGCTGCTCCCACACCTCCTGGTCCAAGAGAAGCTCCTCTGAGCCCTCCTGAGCTGCCCGATCCTCCAAGAGATAGCACCAGACCTCAGTACTCCCAGTACGTGTCCGCCGTGGAAGATGCCCTGGATGTGCTGGAATGTGGCAGACTGGCCGCCATCTTCTACGAAGTGTGGGGCCCTAGAAGGCAGCTGACCAACTTTCTGCACTGGCTGACCGACAGAAACGGCAGCCTGACATGTACCGCCAGACTGAGAGATCAGGACCGGGCCACACTGTGCCCTCTGTATCCTCTGATCGAGGTGGTGGACGTGAACTGCTTCAACAGCTTCAACCGGTGCATCTACAAGTACACCAAGGACGAGGCTTTCCCTATG
タンパク質配列
配列番号８(SEQ ID NO : 8 )：
MDLDLERGPPGPRRPPRGPPLSSSIGLALLLLLLALLFWLYIIMSNWTGGALLVLYAFALMLVIIILIIFIFRRDLLCPLGALCLLLLMITLLLIALWNLHGQALYLGIVLFIFGCLLVLGLWIYLLEILWRLGATIWQLLAFFLAFFLDIILLIIALYLQQNWWTLLVDLLWLLLFLAILIWMYYHGQRPSPRHCPVEREQFKRDAQPRPGGDPDAPPGPNGELLQISPNEAVHIGFTGESKYENEEPGHCPGMGLSTSASIALDEFCGSFPSDVQSALVGPKSLESGLGRNESSSDLWASSGGTAGAPTPAAPTEENRSSGDTPVTSASVKTLVMSTPVKSPVMGARTSNIPLKSPAPNTLANSPVAGPPKSSTPLKSPVTSVSAPNAPVKLAVTNVPMLTTPVKSPLSNAPAEAGSSCIIPEAQDSEAGQKGEAAGASALGPSSSSFSTGTSVVSGTPGPLRSARPTSRALPQFSVSPSVPGRSPTLSSTAGATHTSGLETDQEQHGSSTLPSLAALDSSSELPGGDPNRPIARPSLTQLAQESNEGPSEPAQTEQVPMPYSPEKERCSNYPISHAAAPTPPGPREAPLSPPELPDPPRDSTRPQYSQYVSAVEDALDVLECGRLAAIFYEVWGPRRQLTNFLHWLTDRNGSLTCTARLRDQDRATLCPLYPLIEVVDVNCFNSFNRCIYKYTKDEAFPM
ＤＮＡ配列
配列番号７(SEQ ID NO: 7)：
ATGGATCTGGATCTCGAAAGAGGACCTCCTGGACCTAGACGGCCTCCTAGAGGACCACCTCTGAGCAGCTCTATTGGACTGGCCCTGCTGCTGCTTCTGCTGGCTCTGCTGTTCTGGCTGTACATCATCATGAGCAACTGGACCGGCGGAGCACTGCTGGTGCTGTATGCCTTTGCTCTGATGCTGGTCATCATCATCCTGATCATCTTCATCTTCCGGCGGGACCTGCTGTGTCCTCTGGGAGCACTTTGTCTGTTGCTGCTGATGATCACCCTCCTGCTGATCGCCCTGTGGAACCTGCATGGACAGGCCCTGTATCTGGGCATCGTGCTGTTCATCTTCGGCTGCCTGCTGGTTCTCGGCCTGTGGATCTACCTGCTGGAAATCCTTTGGAGACTGGGCGCCACCATCTGGCAGCTGCTGGCCTTTTTCCTGGCCTTCTTTCTGGATATCATCCTCCTCATCATTGCCCTGTACCTGCAGCAGAACTGGTGGACCCTGCTGGTGGATCTGCTTTGGCTGCTGCTCTTTCTGGCCATCCTGATTTGGATGTACTACCACGGCCAGCGGCCTTCTCCAAGACACTGCCCAGTGGAAAGAGAGCAGTTCAAGAGGGACGCCCAGCCTAGACCTGGCGGAGATCCTGATGCTCCACCTGGACCAAATGGCGAGCTGCTGCAGATCAGCCCTAATGAGGCCGTGCACATCGGCTTCACCGGCGAGTCTAAGTACGAGAACGAGGAACCCGGCCACTGTCCTGGCATGGGCCTTTCTACATCTGCCTCTATCGCCCTGGACGAGTTCTGCGGCAGCTTTCCATCTGATGTGCAGTCTGCCCTCGTGGGCCCTAAGTCTCTGGAATCTGGCCTGGGCAGAAACGAGAGCAGCTCCGATCTGTGGGCTAGCTCTGGTGGAACAGCTGGCGCTCCTACACCAGCCGCTCCTACCGAAGAGAATAGAAGCAGCGGCGACACCCCTGTGACAAGCGCCTCTGTGAAAACCCTGGTCATGAGCACCCCAGTGAAGTCCCCAGTGATGGGCGCCAGAACCTCCAACATTCCCCTGAAGTCTCCCGCTCCTAACACACTGGCCAACTCTCCAGTGGCTGGCCCTCCTAAGTCTAGCACCCCTCTGAAAAGCCCCGTGACCTCTGTGTCTGCCCCTAACGCTCCTGTGAAACTGGCCGTGACCAACGTGCCCATGCTGACCACACCTGTGAAATCCCCACTGAGCAATGCCCCTGCCGAGGCCGGAAGCTCTTGTATCATTCCCGAGGCTCAGGATAGCGAGGCTGGCCAAAAAGGCGAAGCTGCAGGCGCTTCTGCTCTGGGCCCTAGCTCTAGCTCTTTTAGCACCGGCACCAGCGTGGTGTCTGGCACACCAGGACCTCTGAGAAGCGCCAGACCTACCTCTAGAGCCCTGCCTCAGTTTAGCGTGTCCCCTAGTGTGCCTGGCAGAAGCCCTACACTGTCTAGTACAGCCGGCGCTACACACACCAGCGGACTGGAAACAGACCAAGAACAGCATGGCAGCAGCACCCTGCCTTCTCTGGCTGCCCTTGATTCTAGCAGCGAACTGCCAGGCGGCGACCCCAATAGACCTATCGCTAGACCTAGCCTGACACAGCTGGCCCAAGAGAGCAATGAGGGCCCTTCTGAGCCTGCTCAGACCGAACAGGTGCCAATGCCTTACAGCCCCGAGAAAGAGCGGTGCAGCAACTACCCTATCAGCCATGCCGCTGCTCCCACACCTCCTGGTCCAAGAGAAGCTCCTCTGAGCCCTCCTGAGCTGCCCGATCCTCCAAGAGATAGCACCAGACCTCAGTACTCCCAGTACGTGTCCGCCGTGGAAGATGCCCTGGATGTGCTGGAATGTGGCAGACTGGCCGCCATCTTCTACGAAGTGTGGGGCCCTAGAAGGCAGCTGACCAACTTTCTGCACTGGCTGACCGACAGAAACGGCAGCCTGACATGTACCGCCAGACTGAGAGATCAGGACCGGGCCACACTGTGCCCTCTGTATCCTCTGATCGAGGTGGTGGACGTGAACTGCTTCAACAGCTTCAACCGGTGCATCTACAAGTACACCAAGGACGAGGCTTTCCCTATG
タンパク質配列
配列番号８(SEQ ID NO : 8 )：
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【0059】
好ましい態様において、免疫チェックポイント阻害剤分子はウイルスベクター内にコードされ、腫瘍に対する免疫応答を増強するであろう。免疫チェックポイント阻害剤分子は、抗ＣＴＬＡ－４分子、ＰＤ１遮断薬、およびＰＤＬ１遮断薬であり得るが、これらに限定されない。免疫チェックポイント阻害剤分子は、抗体などのタンパク質、または可溶型の抗チェックポイントであり得る。
【0060】
特定の実施態様において、ウイルスベクターは複数の発現カセットを含み得る。いくつかの実施態様において、ウイルスベクター粒子は、別々にまたは機能的に連結されて送達され得る、２つまたは３つの核酸分子などの複数の核酸分子を含み得る。いくつかの実施態様において、第２の核酸は抗原および／または可溶性免疫チェックポイント阻害剤分子または可溶性免疫モジュレータ分子をコードする。いくつかの実施態様において、第３の核酸は、抗原および／または第２の核酸分子によってコードされるものとは異なる免疫チェックポイント阻害剤分子をコードする。
【0061】
一態様において、本技術は、対象における疾患または容体を予防または処置するための免疫療法処方物である。ワクチンは治療上有効量のウイルスベクターを含む。疾患は、がんまたは感染症などの、行為者に対するワクチン接種が望ましい任意の疾患であり得る。
【0062】
別の態様において、本技術は、対象におけるがんまたは感染症に対する免疫応答を誘導または増強するための方法である。この方法は、治療上有効量のウイルスベクターまたは免疫療法処方物をそれを必要とする対象に投与することを含む。
【実施例】
【0063】
実施例１．分子構築物
ベクターは、以下の遺伝子要素を含有するように構築した：（ａ）プロモータ、好ましくはヒトユビキチンプロモータ；（ｂ）レポーター遺伝子（例えば緑色蛍光タンパク質）、あるいは１つ以上の抗原が単一の導入遺伝子中に融合され、および；（ｃ）ＩＲＥＳとそれに続くアジュバント遺伝子（すなわち、ＬＭＰ１－ＩＰＳ１ＣＯまたはその機能的変異体）。任意にベクターは、（ｄ）ＩＲＥＳとそれに続く可溶性および分泌型免疫チェックポイント阻害剤遺伝子または可溶性免疫モジュレータ遺伝子（図８Ｃを参照）。好ましくは、配列は上記の順序であるが、遺伝子は他の適切な順序でベクター中に位置させることができる。上記の領域の全部ではないがいくつかを有する対照ベクターも構築された。
ベクターは、以下の遺伝子要素を含有するように構築した：（ａ）プロモータ、好ましくはヒトユビキチンプロモータ；（ｂ）レポーター遺伝子（例えば緑色蛍光タンパク質）、あるいは１つ以上の抗原が単一の導入遺伝子中に融合され、および；（ｃ）ＩＲＥＳとそれに続くアジュバント遺伝子（すなわち、ＬＭＰ１－ＩＰＳ１ＣＯまたはその機能的変異体）。任意にベクターは、（ｄ）ＩＲＥＳとそれに続く可溶性および分泌型免疫チェックポイント阻害剤遺伝子または可溶性免疫モジュレータ遺伝子（図８Ｃを参照）。好ましくは、配列は上記の順序であるが、遺伝子は他の適切な順序でベクター中に位置させることができる。上記の領域の全部ではないがいくつかを有する対照ベクターも構築された。
【0064】
実施例２：ウイルスベクターの産生
レンチウイルスベクターは、Ｎａｓｒｉら（２０１４）に記載されているように、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞株の一過性リン酸カルシウムトランスフェクションによって産生された。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を２５０ｍＬの完全培地中の２チャンバーＣｅｌｌ Ｓｔａｃｋ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に１．６×１０８細胞で播種し、３７℃で５％ＣＯ２の加湿雰囲気のインキュベーター内で２４時間維持して接着させた。産生された各ベクターについて、１つの細胞スタックを以下のようにトランスフェクトさせた。レンチウイルス骨格プラスミド（２３５μｇ）、エンベロープコードプラスミド（４７μｇ）、およびパッケージングプラスミド（２３５μｇ）を８．６ｍＬの滅菌蒸留水および３．０ｍＬのＣａＣｌ２と混合した。次いで、ＤＮＡ混合物を、３７℃の予め温めたＨＢＳ ２Ｘ（ｐＨ＝７．１）１２．１ｍＬに一滴ずつ添加し、そして得られた２４．２ｍＬの沈殿物を、室温で３０分間インキュベートした後に細胞の培地に添加した。トランスフェクトした細胞を３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。トランスフェクションの２４時間後に培地を血清およびフェノールレッドを含まない２１０ｍＬの回収培地と交換し、さらに２４時間後にウイルス上清を回収し、２５００ｒｐｍで５分間の遠心分離により清澄化した。回収した清澄化バルク（２１０ｍＬ）をＭｇＣｌ２の存在下でＤＮａｓｅ Ｉで３０分間処理してあらゆる残留ＤＮＡを開裂し、２２０００ｒｐｍ、４℃で１時間の遠心分離により濃縮した。ベクターペレットを７０μｌのトリス－トレハロース（５０ｍＭ）に再懸濁し、１．５ｍＬのマイクロチューブにプールし、５０μＬのアリコートに分け、凍結し、≦－７０℃で保存した。確かにより長いＤＮＡカセットの存在のために、生産収率はＧＦＰベクターと比較してアジュバント添加ベクターでは少し効果的ではなかった。しかしながら、全てのアジュバント化構築物について、力価は少なくとも１０９ＴＵ／ｍＬの範囲内であり、そして異なる生産キャンペーンを通して一貫して得られた。それ故、これらのアジュバント構造の将来の工業的バイオ生産に関する問題は予想される筈はない。
レンチウイルスベクターは、Ｎａｓｒｉら（２０１４）に記載されているように、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞株の一過性リン酸カルシウムトランスフェクションによって産生された。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を２５０ｍＬの完全培地中の２チャンバーＣｅｌｌ Ｓｔａｃｋ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に１．６×１０８細胞で播種し、３７℃で５％ＣＯ２の加湿雰囲気のインキュベーター内で２４時間維持して接着させた。産生された各ベクターについて、１つの細胞スタックを以下のようにトランスフェクトさせた。レンチウイルス骨格プラスミド（２３５μｇ）、エンベロープコードプラスミド（４７μｇ）、およびパッケージングプラスミド（２３５μｇ）を８．６ｍＬの滅菌蒸留水および３．０ｍＬのＣａＣｌ２と混合した。次いで、ＤＮＡ混合物を、３７℃の予め温めたＨＢＳ ２Ｘ（ｐＨ＝７．１）１２．１ｍＬに一滴ずつ添加し、そして得られた２４．２ｍＬの沈殿物を、室温で３０分間インキュベートした後に細胞の培地に添加した。トランスフェクトした細胞を３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。トランスフェクションの２４時間後に培地を血清およびフェノールレッドを含まない２１０ｍＬの回収培地と交換し、さらに２４時間後にウイルス上清を回収し、２５００ｒｐｍで５分間の遠心分離により清澄化した。回収した清澄化バルク（２１０ｍＬ）をＭｇＣｌ２の存在下でＤＮａｓｅ Ｉで３０分間処理してあらゆる残留ＤＮＡを開裂し、２２０００ｒｐｍ、４℃で１時間の遠心分離により濃縮した。ベクターペレットを７０μｌのトリス－トレハロース（５０ｍＭ）に再懸濁し、１．５ｍＬのマイクロチューブにプールし、５０μＬのアリコートに分け、凍結し、≦－７０℃で保存した。確かにより長いＤＮＡカセットの存在のために、生産収率はＧＦＰベクターと比較してアジュバント添加ベクターでは少し効果的ではなかった。しかしながら、全てのアジュバント化構築物について、力価は少なくとも１０９ＴＵ／ｍＬの範囲内であり、そして異なる生産キャンペーンを通して一貫して得られた。それ故、これらのアジュバント構造の将来の工業的バイオ生産に関する問題は予想される筈はない。
【0065】
実施例３：ＬＭＰ１－ＩＰＳ１を発現するレンチウイルスベクターのインビボでの効果
新鮮なヒト樹状細胞およびマクロファージをヒト健康ドナー（白血球錐体）から密度勾配にわたって得た。ＣＤ１４＋単球を、磁気単離キット（ポジティブセレクション）を用いてＰＢＭＣから精製し、そして完全ＲＰＭＩ中で６ウェルプレートにプレーティングした。公表された方法を使用して、単球をＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４を用いて樹状細胞に分化させた。サイトカインを補充するために３日後に１０％の培地交換を行い、そして細胞を非酵素的細胞解離溶液を用いて合計６日の培養後に回収した。次いでＤＣを完全ＲＰＭＩ＋４μｇ／ｍｌのポリブレン＋レンチウイルス構築物（ＭＯＩ １５にて）＋ ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４中に再プレーティングした。２時間後、７００μｌの完全ＲＰＭＩ＋ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＬ－４を添加し、細胞を合計９６時間培養した。活性化マーカー発現の陽性対照として作用するために、追加の対照ウェルをＩＦＮ－ガンマおよびＬＰＳで９６時間刺激した。
新鮮なヒト樹状細胞およびマクロファージをヒト健康ドナー（白血球錐体）から密度勾配にわたって得た。ＣＤ１４＋単球を、磁気単離キット（ポジティブセレクション）を用いてＰＢＭＣから精製し、そして完全ＲＰＭＩ中で６ウェルプレートにプレーティングした。公表された方法を使用して、単球をＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４を用いて樹状細胞に分化させた。サイトカインを補充するために３日後に１０％の培地交換を行い、そして細胞を非酵素的細胞解離溶液を用いて合計６日の培養後に回収した。次いでＤＣを完全ＲＰＭＩ＋４μｇ／ｍｌのポリブレン＋レンチウイルス構築物（ＭＯＩ １５にて）＋ ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４中に再プレーティングした。２時間後、７００μｌの完全ＲＰＭＩ＋ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＬ－４を添加し、細胞を合計９６時間培養した。活性化マーカー発現の陽性対照として作用するために、追加の対照ウェルをＩＦＮ－ガンマおよびＬＰＳで９６時間刺激した。
【0066】
ＣＤ１４＋単球をＧＭ－ＣＳＦ（Ｍ１）またはＭ－ＣＳＦ（Ｍ２）でＭ１またはＭ２マクロファージに分化させた。サイトカインを補充するために３日後に１０％の培地交換を行い、そして細胞を非酵素的細胞解離溶液を用いて合計６日の培養後に回収し、そしてマクロファージを１：１の比でプールした。次いで、Ｍ１／Ｍ２マクロファージを３００μｌの完全ＲＰＭＩ＋４μｇ／ｍｌのポリブレン＋レンチウイルス構築物（ＭＯＩ１５にて）＋Ｍ－ＣＳＦ中に再プレーティングした。２時間後、７００μｌの完全ＲＰＭＩ＋Ｍ－ＣＳＦを添加し、そして細胞を合計９６時間培養した。活性化マーカー発現についての陽性対照として作用するために、追加の対照ウェルをＩＦＮ－γおよびＬＰＳ（Ｍ１）またはＩＬ－１３およびＩＬ－４（Ｍ２）で合計９６時間刺激した。
【0067】
以下に記載するように、ヒトＤＣおよびマクロファージを、発現カセットを含有するレンチウイルスベクターを用いてＭＯＩ １５で形質導入した。
構築物１：ＧＦＰ－ＩＲＥＳ－ＬＭＰ１（ｄＩＣ）ｈＩＰＳ１
構築物２：ＧＦＰ－ＩＲＥＳ－ＬＭＰ１（ｄＩＣ）ｈＩＰＳ１（ｄＴＭ）
構築物３：ＧＦＰ－ＩＲＥＳ－ＬＭＰ１（ｄＩＣ）ｈＩＰＳ１（ｄＴＭｄＰｒｏ）
構築物４：ＧＦＰ－ＩＲＥＳ－ＬＭＰ１（ｄＩＣ）ｈＩＰＳ１（ｄＴＭＲｅｖ）
対照構築物１：ＧＦＰ
対照構築物２：ＧＦＰ＋ＬＭＰ１（ｄＩＣ）
対照構築物３：細胞をＧＦＰとＬＭＰ１（ｄＩＣ）ｈＩＰＳ１で二重形質導入（それぞれＭＯＩ １５にて、分離ベクターにおいて）
対照構築物の説明については図８Ａ、アジュバント化構築物については図８Ｂ参照。
構築物１：ＧＦＰ－ＩＲＥＳ－ＬＭＰ１（ｄＩＣ）ｈＩＰＳ１
構築物２：ＧＦＰ－ＩＲＥＳ－ＬＭＰ１（ｄＩＣ）ｈＩＰＳ１（ｄＴＭ）
構築物３：ＧＦＰ－ＩＲＥＳ－ＬＭＰ１（ｄＩＣ）ｈＩＰＳ１（ｄＴＭｄＰｒｏ）
構築物４：ＧＦＰ－ＩＲＥＳ－ＬＭＰ１（ｄＩＣ）ｈＩＰＳ１（ｄＴＭＲｅｖ）
対照構築物１：ＧＦＰ
対照構築物２：ＧＦＰ＋ＬＭＰ１（ｄＩＣ）
対照構築物３：細胞をＧＦＰとＬＭＰ１（ｄＩＣ）ｈＩＰＳ１で二重形質導入（それぞれＭＯＩ １５にて、分離ベクターにおいて）
対照構築物の説明については図８Ａ、アジュバント化構築物については図８Ｂ参照。
【0068】
樹状細胞およびマクロファージの増殖は、培養２４時間後に定量した。３組の試料を３Ｈ－ＴｄＲでパルスし、一晩培養した後に回収し、放射性チミジンの取り込みを標準シンチレーション・カウントにより決定した。ＧＦＰベクターと比較して、アジュバント添加ベクターでは増殖がわずかに減少したが、これはおそらくより長いＤＮＡカセットの存在によるものであろう。既に述べたように、形質導入細胞の生存率は、固定可能な生存率染料で染色し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ Ｓｙｓｔｅｍフローサイトメータを用いた分析することによって決定した。アジュバント添加ベクター間でわずかな違いが観察されたが、有意な毒性は見られなかった。
【0069】
９６時間培養した後、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメータで蛍光を測定することによって、各構築物で形質導入された細胞についてＧＦＰの発現を決定した。結果を図９Ａ（樹状細胞）および９Ｂ（マクロファージ）に示す。生存細胞およびＧＦＰ陽性細胞の割合は、細胞片を除いた細胞／生存細胞／単一細胞をゲートして決定した。異なるドナーから単離されたＰＢＭＣを用いて３つの独立した実験を実施した。グラフ化されたデータは、代表的な実験の複製の平均を表す。結果は図９Ａ（樹状細胞）および９Ｂ（マクロファージ）に示され、両方の細胞型について、アジュバント添加ベクター間でわずかな差が観察されたが、ＧＦＰ／導入遺伝子の有意な発現が全てのＩＲＥＳ構築物で観察されたことを示す。アジュバント化ベクターの間において、おそらくより短いＤＮＡカセットの存在に起因して、構築物２および３を用いたＧＦＰ／導入遺伝子発現の増加をもたらした。ＩＰＳ１膜貫通ドメインの除去は、ＩＰＳ１ ＣＡＲＤおよびＰＲＯドメインの配向の反転はするが、ＧＦＰ／導入遺伝子の発現の改良をもたらさなかった。
【0070】
レンチウイルスベクターによって誘発された樹状細胞およびマクロファージの活性化および成熟は、表面マーカーの発現を測定し、それらのサイトカインおよびケモカイン放出プロファイルを査定することによって評価した。レンチウイルス組込みおよび樹状細胞／マクロファージ活性化のレベルを決定するために、９６時間の培養後に細胞を回収し、固定可能な生存率染料および以下の表面マーカーを認識する一群の染色抗体；ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＣＤ６９、ＣＤ８０／８６、ＣＤ８３、ＣＣＲ７、ＭＨＣ ＩおよびＭＨＣ ＩＩで染色し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ Ｓｙｓｔｅｍフローサイトメータを使用して分析した。細胞頻度および幾何平均（Ｇｍｅａｎ）マーカー発現値は、細胞片を除去した細胞／生存可能な細胞／単一細胞をゲートすることによって決定された。全ての発現レベルをＧＦＰの発現に対して正規化した。樹状細胞およびマクロファージの両方について、ＳＴＩＮＧ経路の活性化が、ＩＦＮ－αおよびＩＦＮ－β、ならびにハイスループット流体素子を備えたＢｉｏ ｐｌｅｘ ２００システム（ＢｉｏＲａｄ）を用いたＬｕｍｉｎｅｘ分析による免疫刺激性サイトカインＩＬ－８、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、およびＩＬ－１２ｐ７０の培地上澄み中での産生を測定することによって９６時間形質導入後に評価した。免疫抑制性サイトカインＩＬ－１０の産生を対照として測定した。異なる健康なドナーから単離されたＰＢＭＣを用いて３つの独立した実験を実施した。グラフ化されたデータは代表的な実験の複製の平均を表す。結果を図１０Ａ（樹状細胞、サイトカイン）、１０Ｂ（樹状細胞、膜マーカー）、１０Ｃ（マクロファージ、サイトカイン）、および１０Ｄ（マクロファージ、膜マーカー）に示す。
【0071】
形質導入樹状細胞について、ＧＦＰ陽性細胞による表面マーカーの発現の結果は、ＩＲＥＳ構築物が以下の免疫活性化分子の発現をアップレギュレートすることを示した：ＭＨＣＩＩ（構築物１、および２で良好）；ＣＤ４０（４～５倍増加、特に構築物１および４で）；ＣＤ８０／８６（構築物１，２および４）；ＣＤ８３（構築物２および３で３倍～４倍の増加、対照３よりずっと良好）；およびＣＣＲ７移動シグナル（構築物１および２、対象３より高い）。これらの活性化表面マーカーのアップレギュレートと一致して、サイトカイン発現の増加は以下の通りであった；炎症誘発性ＩＬ－６は構築物２および対照３で刺激された；炎症誘発性ＴＮＦ－αは、構築物２および３で有意に増加〈対照２および３より良好〉；ＩＬ－１２は構築物２および４で有意に増加（対照２および３より良好）。抗炎症性ＩＬ－１０レベルは評価された構築物のいずれによっても影響を受けなかった。形質導入樹状細胞についての結果は、ＩＰＳ１膜貫通ドメインの除去がアジュバントの活性を増大させることを示した。ＩＰＳ１膜貫通領域およびプロリン富裕（ＰＲＯ）ドメインの除去はアジュバントの活性をわずかに増加させた。そして、ＩＰＳ１ ＣＡＲＤおよびＰＲＯドメインの方向を逆にしながらＩＰＳ１膜貫通ドメインを除去しても、いかなる免疫刺激効果も示されなかった。
【0072】
形質導入マクロファージにおいて、ＧＦＰ陽性細胞による表面マーカーの発現の結果は、ＩＲＥＳ構築物が以下の免疫活性化分子の発現をアップレギュレートすることを示した。ＣＤ８３は構築物１および３で有意に、対照２より良好に増加した。ＣＤ８０／８６は構築物２で増加し、ＣＤ６９の早期活性マーカーが構築物２および３で対照３より高いレベルで誘導された。樹状細胞で観察された結果と一致して、活性化マーカーの増強された発現は、以下のようにサイトカイン発現の増大と相関した。炎症誘発性ＩＬ－１βは、構築物２および４、ならびに対照３で４倍増加した。炎症誘発性ＩＬ－６は、構築物２および３で４倍増加し、対照３よりも良好であった。炎症誘発性ＴＮＦ－αは構築物２および３で増加した（対照３よりも良好）。抗炎症性ＩＬ－１０のレベルは、評価した構築物のいずれによっても影響を受けなかった。
【0073】
結論として、ＬＭＰ１膜貫通領域とヒトＩＰＳ１タンパク質との融合は、樹状細胞およびマクロファージの両方についてアジュバント効果を増大させる。さらに、構築物の最適化（ＩＰＳ１タンパク質の膜貫通ドメインの除去、図８Ｂ参照）はアジュバント活性を増大させた。
膜貫通ドメインの除去に加えてプロリン富裕領域（ＰＲＯ）が除去された場合、アジュバント効果はわずかに増加しただけであった。ＰＲＯ領域機能は十分に記載されていないが、それはＩＰＳ１タンパク質の立体配座において役割を果たす可能性がある。
ＩＰＳ１ ＣＡＲＤおよびＰＲＯドメインの方向を逆転させながら、ＩＰＳ１膜貫通ドメインを除去すると、免疫刺激効果の減少を示した。この除去は、当該タンパク質の誤った立体配座および活性の損失を導き得る。
膜貫通ドメインの除去に加えてプロリン富裕領域（ＰＲＯ）が除去された場合、アジュバント効果はわずかに増加しただけであった。ＰＲＯ領域機能は十分に記載されていないが、それはＩＰＳ１タンパク質の立体配座において役割を果たす可能性がある。
ＩＰＳ１ ＣＡＲＤおよびＰＲＯドメインの方向を逆転させながら、ＩＰＳ１膜貫通ドメインを除去すると、免疫刺激効果の減少を示した。この除去は、当該タンパク質の誤った立体配座および活性の損失を導き得る。
【0074】
実施例４：単一または複数の抗原で処置した健康なマウスにおけるインビボ免疫原性は、ＬＭＰ１－ＩＰＳ１レンチウイルスベクターを使用して優れた免疫原性を示す。
（ａ）ヒトユビキチンプロモータ、（ｂ）１つの腫瘍抗原、および（ｃ）ＬＭＰ１（ヒト発現にコドン最適化）およびヒトＩＰＳ１、またはそれらの機能的変異体の膜貫通ドメインの融合をコードする、発現カセットを含有する異なるウイルスベクターで健康なマウスが処置される。抗原およびアジュバント（すなわち、ＩＭＰ１ ＩＰＳ１融合）を２回の投与後（プライム＋ブースト）に同じベクターから発現された場合に対して異なるベクターから発現させたときの免疫応答を比較するために実験を実施する。インビボの免疫原性の短期（３週間）および長期（３ヶ月）評価は、抗原特異的免疫細胞、例えばＣＤ４＋、ＣＤ８＋、およびベクター中に存在する抗原を標的とするメモリーＴ細胞の検出および定量化を可能にするマウス血液バイオマーカー（ＩＦＮ－γおよびさまざまなインターロイキン）のＦＡＣＳ分析によって行われる。抗原をコードするレンチウイルスベクターおよびＬＭＰ１－ＩＰＳ１での処置は、ＬＭＰ１－ＩＰＳ１なしで同じレンチウイルスベクターと比較した場合、またはＬＭＰ１の膜ドメインのみを発現した場合に、特異的免疫原性を高めると予想される。さらに、異なるベクターからの発現と比較して、同じベクターから抗原とアジュバントの両方を発現させると、免疫原性のより大きな増加が予想される。
（ａ）ヒトユビキチンプロモータ、（ｂ）１つの腫瘍抗原、および（ｃ）ＬＭＰ１（ヒト発現にコドン最適化）およびヒトＩＰＳ１、またはそれらの機能的変異体の膜貫通ドメインの融合をコードする、発現カセットを含有する異なるウイルスベクターで健康なマウスが処置される。抗原およびアジュバント（すなわち、ＩＭＰ１ ＩＰＳ１融合）を２回の投与後（プライム＋ブースト）に同じベクターから発現された場合に対して異なるベクターから発現させたときの免疫応答を比較するために実験を実施する。インビボの免疫原性の短期（３週間）および長期（３ヶ月）評価は、抗原特異的免疫細胞、例えばＣＤ４＋、ＣＤ８＋、およびベクター中に存在する抗原を標的とするメモリーＴ細胞の検出および定量化を可能にするマウス血液バイオマーカー（ＩＦＮ－γおよびさまざまなインターロイキン）のＦＡＣＳ分析によって行われる。抗原をコードするレンチウイルスベクターおよびＬＭＰ１－ＩＰＳ１での処置は、ＬＭＰ１－ＩＰＳ１なしで同じレンチウイルスベクターと比較した場合、またはＬＭＰ１の膜ドメインのみを発現した場合に、特異的免疫原性を高めると予想される。さらに、異なるベクターからの発現と比較して、同じベクターから抗原とアジュバントの両方を発現させると、免疫原性のより大きな増加が予想される。
【0075】
実施例５：特定の腫瘍のマウスモデルにおけるインビボの免疫原性は、複数の抗原とアジュバントとしてのＬＭＰＩ－ＩＰＳ１の組み合わせを含有するレンチウイルスベクターの優れた有効性を示す。
特定の腫瘍のマウスモデルが、（ａ）プロモータとしてのヒトユビキチン、（ｂ）腫瘍特異的抗原、およびＬＭＰ１（ヒト発現のためにコドン最適化）およびヒトＩＰＳ１、またはそれらの機能的変異体の膜貫通ドメインの融合をコードする、発現カセットを含有するレンチウイルスベクターで処置された。マウスは、ベクタータイプおよび構築物、用量および注射回数によって異なる処置群に分割される。実験群は、以下をコードするベクターと共に投与される（プライム＋ブースト注射）：適応症特異的抗原のみ。ＬＭＰＩ－ＩＰＳ１または適応症特異的抗原、およびＬＭＰ１－ＩＰＳ１（または機能的ＩＰＳ１を有する変異体）のみ。インビボでの有効性および免疫原性は、腫瘍増殖速度、生存、ならびにマウス血液バイオマーカー（ＩＦＮ－γおよび種々のインターロイキン）のＦＡＣＳ分析によるＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびメモリーＴ細胞として特異的な抗原の検出によって評価される。適応症特異的抗原およびＬＭＰ１－ＩＰＳ１融合タンパク質をコードするレンチウイルスベクターは、すべての実験群の中で最も強力で長期にわたる免疫応答を誘導すると予想され、したがって処置群のマウスにおいてより高い生存率および／またはより低い腫瘍増殖を誘導する。
特定の腫瘍のマウスモデルが、（ａ）プロモータとしてのヒトユビキチン、（ｂ）腫瘍特異的抗原、およびＬＭＰ１（ヒト発現のためにコドン最適化）およびヒトＩＰＳ１、またはそれらの機能的変異体の膜貫通ドメインの融合をコードする、発現カセットを含有するレンチウイルスベクターで処置された。マウスは、ベクタータイプおよび構築物、用量および注射回数によって異なる処置群に分割される。実験群は、以下をコードするベクターと共に投与される（プライム＋ブースト注射）：適応症特異的抗原のみ。ＬＭＰＩ－ＩＰＳ１または適応症特異的抗原、およびＬＭＰ１－ＩＰＳ１（または機能的ＩＰＳ１を有する変異体）のみ。インビボでの有効性および免疫原性は、腫瘍増殖速度、生存、ならびにマウス血液バイオマーカー（ＩＦＮ－γおよび種々のインターロイキン）のＦＡＣＳ分析によるＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびメモリーＴ細胞として特異的な抗原の検出によって評価される。適応症特異的抗原およびＬＭＰ１－ＩＰＳ１融合タンパク質をコードするレンチウイルスベクターは、すべての実験群の中で最も強力で長期にわたる免疫応答を誘導すると予想され、したがって処置群のマウスにおいてより高い生存率および／またはより低い腫瘍増殖を誘導する。
【0076】
実施例６：特定の抗チェックポイント感受性腫瘍のマウスモデルにおけるインビボ免疫原性は、複数の抗原、アジュバント、および抗チェックポイントの組み合わせを含有するレンチウイルスベクターの優れた有効性を示す。
特定の腫瘍のマウスモデルは、プロモータとしてヒトユビキチンをコードする発現カセットおよび以下の少なくとも１つを含有するレンチウイルスベクターで処置される：適応症特異的抗原、ＬＭＰ１－ＩＰＳ１、および１つ以上の抗チェックポイント分子の可溶性および分泌型形態。マウスは、ベクター構築物、用量、および注射回数によって異なる処置群に分けられる。実験群は、以下をコードするベクターと共に投与される（プライム＋ブースト注射）：適応症特異的抗原のみ。ＬＭＰ１－ＩＰＳ１のみ。１つ以上の可溶性の分泌型抗チェックポイント分子のみ。適応症特異的抗原およびＬＭＰ１（デルタＩＣ)。適応症特異的抗原およびＬＭＰ１（デルタＩＣ）、ならびに１以上の可溶性および分泌型抗チェックポイント分子。適応症特異的抗原およびＬＭＰ１－ＩＰＳ１（または機能的ＩＰＳ１を有する変異体）。または適応症特異的抗原および１以上の可溶性および分泌抗チェックポイント分子。または適応症特異的抗原、ＬＭＰ１－ＩＰＳ１または機能的ＩＰＳ１を有する変異体）、および１以上の可溶性および分泌型抗チェックポイント分子。インビボでの有効性および免疫原性は、腫瘍増殖速度、生存、ならびにマウス血液バイオマーカー（ＩＦＮ－γおよび種々のインターロイキン）のＦＡＣＳ分析によるＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびメモリーＴ細胞として特異的な抗原の検出によって評価される。適応症特異的抗原、ＬＭＰ１－ＩＰＳ１（または機能性ＩＰＳ１持つ変異体）をコードするレンチウイルスベクターおよび抗チェックポイント分子は、全ての実験群について最も強力で長期持続の免疫応答を誘導することが予想される。
特定の腫瘍のマウスモデルは、プロモータとしてヒトユビキチンをコードする発現カセットおよび以下の少なくとも１つを含有するレンチウイルスベクターで処置される：適応症特異的抗原、ＬＭＰ１－ＩＰＳ１、および１つ以上の抗チェックポイント分子の可溶性および分泌型形態。マウスは、ベクター構築物、用量、および注射回数によって異なる処置群に分けられる。実験群は、以下をコードするベクターと共に投与される（プライム＋ブースト注射）：適応症特異的抗原のみ。ＬＭＰ１－ＩＰＳ１のみ。１つ以上の可溶性の分泌型抗チェックポイント分子のみ。適応症特異的抗原およびＬＭＰ１（デルタＩＣ)。適応症特異的抗原およびＬＭＰ１（デルタＩＣ）、ならびに１以上の可溶性および分泌型抗チェックポイント分子。適応症特異的抗原およびＬＭＰ１－ＩＰＳ１（または機能的ＩＰＳ１を有する変異体）。または適応症特異的抗原および１以上の可溶性および分泌抗チェックポイント分子。または適応症特異的抗原、ＬＭＰ１－ＩＰＳ１または機能的ＩＰＳ１を有する変異体）、および１以上の可溶性および分泌型抗チェックポイント分子。インビボでの有効性および免疫原性は、腫瘍増殖速度、生存、ならびにマウス血液バイオマーカー（ＩＦＮ－γおよび種々のインターロイキン）のＦＡＣＳ分析によるＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびメモリーＴ細胞として特異的な抗原の検出によって評価される。適応症特異的抗原、ＬＭＰ１－ＩＰＳ１（または機能性ＩＰＳ１持つ変異体）をコードするレンチウイルスベクターおよび抗チェックポイント分子は、全ての実験群について最も強力で長期持続の免疫応答を誘導することが予想される。
【0077】
本出願は、２０１６年１１月２８日出願の米国仮出願番号６２／４２６，８５５の優先権を主張し、その全体を参照して本明細書に組み込まれる。
【0078】
本明細書で使用されるとき、「から本質的になる」は、請求項の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない材料またはステップの包含を可能にする。特に組成物の成分の説明または装置の要素の説明における「含む」という用語の本明細書における任意の記載は、「から本質的になる」または「からなる」と交換することができる。
【0079】
参考文献
・Barry, M. et al. Role of endogenous endonucleases and tissue site in transfection and CpG-mediated immune activation after naked DNA injection（裸のＤＮＡ注射後のトランスフェクションおよびＣｐＧ媒介免疫活性化における内因性エンドヌクレアーゼおよび組織部位の役割）
・Hum Gene Ther, 10 (15) (1999), pp. 2461 - 2480
・McNamara, M. et al. RNA-Based Vaccines in Cancer Immunotherapy. J Immunol Res. 2015; 2015: 794528.
・Nasri et al., Production, Purification and Titration of a Lentivirus-Based Vector for Gene Delivery Purposes（遺伝子送達目的のためのレンチウイルスに基づくベクターの産生、精製および滴定）, Cytotechnology 66,1031-8 (2014).
・Barry, M. et al. Role of endogenous endonucleases and tissue site in transfection and CpG-mediated immune activation after naked DNA injection（裸のＤＮＡ注射後のトランスフェクションおよびＣｐＧ媒介免疫活性化における内因性エンドヌクレアーゼおよび組織部位の役割）
・Hum Gene Ther, 10 (15) (1999), pp. 2461 - 2480
・McNamara, M. et al. RNA-Based Vaccines in Cancer Immunotherapy. J Immunol Res. 2015; 2015: 794528.
・Nasri et al., Production, Purification and Titration of a Lentivirus-Based Vector for Gene Delivery Purposes（遺伝子送達目的のためのレンチウイルスに基づくベクターの産生、精製および滴定）, Cytotechnology 66,1031-8 (2014).
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【配列表】