特許 7519698 抗炎症及び免疫調節特性を有する臍帯血単核細胞に由来する小型細胞外小胞を含む組成物及びそれらを得るためのプロセス

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-07-11

(45)【発行日】2024-07-22

(54)【発明の名称】抗炎症及び免疫調節特性を有する臍帯血単核細胞に由来する小型細胞外小胞を含む組成物及びそれらを得るためのプロセス

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/071 20100101AFI20240712BHJP

   A61K 35/51 20150101ALI20240712BHJP

   A61K 38/06 20060101ALI20240712BHJP

   A61K 9/19 20060101ALI20240712BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20240712BHJP

【ＦＩ】

C12N5/071

A61K35/51

A61K38/06

A61K9/19

C12N15/113 Z

【請求項の数】 11

(21)【出願番号】P 2021543602

(86)(22)【出願日】2019-10-04

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-07

(86)【国際出願番号】 IB2019058462

(87)【国際公開番号】W WO2020070700

(87)【国際公開日】2020-04-09

【審査請求日】2022-08-04

(31)【優先権主張番号】115057

(32)【優先日】2018-10-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】PT

(73)【特許権者】

【識別番号】521141017

【氏名又は名称】エクサオゲンウス セラペウティクス，エスエー

(74)【代理人】

【識別番号】100139723

【弁理士】

【氏名又は名称】樋口 洋

(74)【代理人】

【識別番号】100091683

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼川 俊雄

(74)【代理人】

【識別番号】100179316

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 寛奈

(72)【発明者】

【氏名】コルレイア，ジョアナ

(72)【発明者】

【氏名】カードソ，レナト

(72)【発明者】

【氏名】ロドリグエス，シルヴィア

【審査官】藤井 美穂

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１７／２１８９６４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１７／０５４０８５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１７／１６３１３２（ＷＯ，Ａ２）

【文献】Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine，2015年，Vol.11，pp.879-883

【文献】Scientific Reports，2017年，Vol.7, Article number 15297，pp.1-13

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／００ － ７／０８

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

臍帯血単核細胞（ＵＣＢＭＮＣ）から得られる小型細胞外小胞（ＳＥＶ）を単離するためのインビトロで行われる方法（ＵＦ－ＳＥＣ）であって、前記方法は、
ｉ）前記臍帯血単核細胞（ＵＣＢＭＮＣ）を無血清細胞培養培地により培養した馴化培地の連続遠心分離を行う第１のステップと、
ｉｉ）限外ろ過（ＵＦ）と組み合わせた精密ろ過（ＭＦ）を行う第２ステップと、
ｉｉｉ）サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を行う第３ステップと、を含み：
前記ステップは、以下のように実行される：
ａ）最初に低速（２００ｇ～４００ｇ、１０～２０分）で２ラウンドの連続遠心分離を行い、次に低温（４～１０℃）で平均速度（１５００ｇ～２５００ｇ、２０～３０分）を実施する、
ｂ）孔径８００ｎｍ～４５０ｎｍを有する第１のフィルタ及び孔径２５０ｎｍ～２００ｎｍを有する第２のフィルタを連続使用することにより（ａ）の清澄化された上清をろ過する、
ｃ）１００～２００ｒｐｍの安定した撹拌条件下で、適切な一定圧力で、１００ＫＤａの分子サイズカットオフを使用することによる（ｂ）で得られた溶液を限外ろ過して、１００ＫＤａより大きく２００ｎｍより小さい粒子の溶液を得る、
ｄ）（ｃ）のろ液の初期容量の最大１０分の１に濃縮する、
ｅ）ＳＥＶを検出するために２８０ｎｍの吸光度シグナルを使用して、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による前記（ｄ）の溶液に含まれる可溶性タンパク質からＳＥＶを単離する、及び
ｆ）２８０ｎｍでの前記溶液の前記吸光度が第１のピークにおいて増加するときから、そのピークの２８０ｎｍでの前記吸光度がゼロまで低下するまで、４～１０℃の安定温度で、前記（ｅ）で得られた溶液からＳＥＶ画分を収集する
ことを特徴とする、方法。

【請求項2】

ステップ（ｂ）の前記ろ液を水、または中性ｐＨの緩衝液で希釈するステップ、かつ／または（ｃ）の前記溶液を水、または中性ｐＨの緩衝液で洗浄するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ＵＣＢＭＮＣがリンパ球、単球、好中球、好酸球、及び／または好塩基球を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記ＵＣＢＭＮＣがリンパ球、単球、好中球、好酸球、及び／または好塩基球からなる、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記ＵＣＢＭＮＣが、１０～１０００ｎｇ／ｍｌのＦＭＳ様チロシンキナーゼ－３（Ｆｌｔ－３）及び１０～１０００ｎｇ／ｍｌ幹細胞因子（ＳＴＦ）を補充された、または０．５％Ｏ_２及び５％ＣＯ_２の虚血条件下で、３７℃で１８時間無血清細胞培養培地中で培養される、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

孔径１０ＫＤａのフィルタを使用することによるＳＥＶ画分の濃縮ステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

凍結乾燥ステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、パルミトイル化トリペプチド、ペプチド、ＤＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、成長因子、アミノ酸、糖、脂溶性分子、脂肪酸及びそれらの誘導体及び／又は脂質修飾分子を添加することによってＳＥＶ組成物を濃縮することによるＳＥＶ修飾ステップをさらに含み、前記修飾は、
ａ）前記単離方法の最初のステップの前、請求項４に記載のＵＣＢＭＮＣの培養中、
ｂ）請求項１に記載のステップｆ）の後の前記単離方法の製造後段階において、または
ｃ）請求項７に記載の凍結乾燥ステップ後に、
行われる、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

生物学的活性分子、すなわち、ｍｉＲＮＡまたは脂溶性分子の添加によって、ＳＥＶ組成物が濃縮される、請求項１に記載の方法であって、
ａ）濃縮されるＳＥＶの脱水または凍結乾燥粉末組成物を提供するステップと、
ｂ）
（ｉ）１ｘ１０^９～１ｘ１０^１１粒子／ｍＬを有するＳＥＶ組成物と、同量の選択されたｍｉＲＮＡの溶液と共に、約３７℃で約２分間、３サイクルインキュベートすることであって、前記ｍｉＲＮＡの溶液は、水または中性ｐＨの緩衝液中で、０．２～１０μＭの量のｍｉＲＮＡを含み、各サイクルの後ボルテックスを行うインキュベーション、
（ｉｉ）１ｘ１０^９～１ｘ１０^１１粒子／ｍＬを有するＳＥＶ組成物と、同量の選択された脂溶性分子溶液の溶液と共にインキュベートすることであって、前記脂溶性分子は、水または中性ｐＨの緩衝液中で１０～６０μＭの濃度を含むパルミトイル化トリペプチドである、インキュベーションによって、選択された生物学的活性分子組成物の溶液により前記ＳＥＶ組成物を直接水和するステップであって、
任意により、１０～１００ｋＤａの分子カットオフで実施されるろ過ステップと、をさらに含み、その後、水または中性ｐＨの緩衝液で３ラウンド洗浄し、高速、１４０００ｇ、４℃、４～１０分間の遠心分離により、中性ｐＨの緩衝液に再懸濁する、方法。

【請求項10】

前記ＳＥＶの凍結乾燥粉末組成物を０．２～１０μＭのｍｉＲＮＡ溶液で直接水和することにより、ＳＥＶ組成物を選択したｍｉＲＮＡを添加することによって濃縮する、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記ＳＥＶの凍結乾燥粉末組成物を、パルミトイル化トリペプチドを添加することによって、３７℃で約１時間、２０μＭ～６０μＭの範囲で変化する様々な濃度の溶液により直接水和することにより、濃縮する、請求項９に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、臍帯血単核細胞（ＵＣＢＭＮＣ）によって分泌される小型細胞外小胞（ＳＥＶ）及びＳＥＶを含む組成物を単離するためのプロセスに関するものであり、これらは、自己免疫疾患の治療法または予防及び免疫系に関連する他の疾患、また美容目的のために適用するのに有用である。

【0002】

したがって、本発明は、医薬品、医学、化粧品、細胞生物学及びそれらの器具における研究開発の技術領域にある。

【背景技術】

【0003】

自己免疫疾患（ＡＤ）は、最も一般的な疾患群の１つであり、米国のみで患者は５，０００万人である。これらの疾患は慢性であり、多くの場合生命を脅かすものであり、ＡＡＲＤＡ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）によれば、女児及び６４歳以下のすべての年齢群の女性の死因のトップ１０の１つである（「Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ－ＡＡＲＤ」ｎ．ｄ．）。

【0004】

現在までに確認された約１００の異なるＡＤの中には、乾癬、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、アトピー性皮膚炎、または湿疹などの強い皮膚症状を伴うものがある。これらの炎症性皮膚疾患は、生命を脅かすものではないが、患者の日常生活において大きい不快感を引き起こし、高い頻度で精神障害を伴う。これらの疾患は、皮膚のかゆみ及び発赤を伴う時折の発疹から、皮膚炎、しゅさ、脂漏性皮膚炎、及び乾癬などの慢性疾患まで、多くの形態で現れる。

【0005】

炎症性／自己免疫性皮膚疾患の発症時に、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）とエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）との間に免疫の不均衡があり、自己免疫の主要なドライバーとして広く認識されている。

【0006】

炎症性皮膚疾患はまた、不適切であり、持続的炎症応答を特徴とする。急性炎症応答は、皮膚の損傷を解消する傾向があるが、持続的な炎症刺激または炎症メカニズムの調節不全は慢性炎症を引き起こし得、皮膚症状を伴う様々な慢性炎症性疾患、すなわちアトピー性皮膚炎及び乾癬に寄与し得る。

【0007】

尋常性乾癬は、Ｔ細胞及び樹状細胞による病理である。Ｔヘルパー細胞及び表皮ＣＤ８Ｔ細胞の様々なサブセットが、乾癬の病因における主要なプレーヤーとして報告されている。さらに、乾癬の病因は、リンパ節内のエフェクターＴ細胞の蓄積、及びその後の血液系を介した皮膚への移動を伴うことが一般的に認められている。

【0008】

ＡＤの最も進んだ治療法では、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）またはインターロイキン（ＩＬ）－１２／２３及びＩＬ－１７Ａなどの特定の生体分子を標的とし、強力な免疫抑制効果を介して、悪化した免疫応答を遮断する。多くの場合、これらの治療法はＡＤを効率的に制御するが、すなわち、感染症などの他の日和見感染症に患者をさらすため、強力な二次的効果作用を有する。

【0009】

したがって、免疫系の主な機能を強く抑制することなく、免疫系の耐性を高め、その結果、二次的副作用を減少させる他の治療選択肢を開発する必要がある。

【0010】

好適なアプローチは、自己免疫疾患の治療選択肢として、ＵＣＢＭＮＣなどの原始的な免疫系を備えた未成熟なヒト組織に由来するＳＥＶを使用することである。これにより、安全性及び忍容性のプロファイルが良好になり、遺伝子発現を直接調節することにより、より複雑な応答を調整できる。

【0011】

ＳＥＶは、ほとんどの生細胞から分泌されるリポソーム様小胞であり、約３０～２００ｎｍである。これらのＳＥＶは、異なる細胞型間の通信の主要なメディエータとして、すなわち、低分子ＲＮＡの調節及び輸送を介して作用する。ＵＣＢＭＮＣ及び間葉系細胞などの損傷組織の再生に一般的に使用される細胞型は、ＳＥＶの豊富な供給源である。これらの幹細胞由来のＳＥＶは、細胞ベースの治療法にうまく取って代わり、様々な動物の傷害モデルにおいて損傷した器官の機能を改善し、また免疫系を調節することが実証されている。

【0012】

ＳＥＶの単離は、文献で広く議論されている主題であり、すでにいくつかのアプローチが利用可能である。

【0013】

国際公開第２０１７１６３１３２号は、ＵＣＢＭＮＣ及びＵＣＢＭＮＣによって分泌される小胞を含むいくつかの組成物からＳＥＶを単離するための方法、及び組織修復、特に創傷治癒を促進するためのそれらの使用を開示している。

【0014】

国際公開第２０１７１６３１３２号に記載されている組成物は、ＵＣＢＭＮＣから分泌されたＳＥＶを単離し、精製するために、分画遠心分離技術をベースとした精製方法によって得られる。良好な収率の単離された小胞をもたらすにもかかわらず、この方法は、ヒトの操作により大きい影響を受け、時間を要し、かつ主要なサンプルの損失をもたし得るいくつかのステップを含み、その結果、かなりの量の汚染物質（リポタンパク質及び他の可溶性タンパク質など）を保持することとなる。

【0015】

国際公開際２０１７１６３１３２号はまた、ＵＣＢＭＮＣ由来のＳＥＶを含む組成物を開示しており、小型細胞外小胞は、１つ以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含み、最も好ましい組成物は、少なくともｍｉＲＮＡｈｓａ－ｍｉＲ－１５０－５ｐを含む小型細胞外小胞を含むものである。これらの組成物は、分泌細胞（ｆｉｃｏｌｌ勾配によって単離された単核細胞）の亜集団、及び精製方法（超遠心分離をベースとする）からの累積的な結果である、低分子ＲＮＡにおける特定の組成を有する。これにより、それらの治療的可能性が制限され、組織修復、より具体的には皮膚創傷の治癒を促進することが知られているｍｉＲ－２２－３ｐなどの他の低分子ＲＮＡを含む場合に増強され得る。さらに、これらの組成物は、組織修復に重要な炎症及び免疫細胞の調節に限定的な影響を有することが予想される。炎症を制御する、例えば、ｌｅｔ－７ｃ－５ｐまたはｍｉＲ－２７ａ－３ｐを含む組成物は、失速した慢性創傷の長期の炎症状態を改善し、かつ創傷治癒を刺激することができる。

【0016】

したがって、皮膚病変などの組織修復の治療法、ならびに炎症及び免疫系の重要な寄与を伴う他の疾患の治療法として適用される可能性がより高いそのような組成物を産生するための組成物及び方法を開発する必要がある。

【0017】

本発明は、ＵＣＢＭＮＣによって本質的に分泌されるＳＥＶを単離するためのより速くより効率的な方法を提唱することによってこれらの問題を解決し、この方法は、自動臍帯血（ＵＣＢ）処理ステップ及び標準化され部分的に自動化されたＳＥＶ精製プロセスを含み得、これにより、より高いＳＥＶ収率、再現性のある方法で、より高い純度で得ることができる。

【0018】

本発明の別の目的は、特定の再生促進性、抗炎症性及び免疫調節性を有する特定の種類の小型細胞外小胞を含む組成物を得ることであり、これらは、皮膚症状の有無にかかわらず、炎症性及び自己免疫疾患の状況において治療法として使用するため、または予防的及び美容的使用のための有望なツールである。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0019】

【文献】国際公開第２０１７１６３１３２号

【非特許文献】

【0020】

【文献】“Autoimmune Disease Statistics - AARDA.” n.d. Accessed September 5, 2019. https://www.aarda.org/news-information/statistics/.

【文献】Fits, L. van der, S. Mourits, J. S. A. Voerman, M. Kant, L. Boon, J. D. Laman, F. Cornelissen, et al. 2009. “Imiquimod-Induced Psoriasis-Like Skin Inflammation in Mice Is Mediated via the IL-23/IL-17 Axis.” The Journal of Immunology 182 (9): 5836-45. https://doi.org/10.4049/jimmunol.0802999.

【文献】Martinez, Fernando O, and Siamon Gordon. 2014. “The M1 and M2 Paradigm of Macrophage Activation: Time for Reassessment.” F1000prime Reports 6: 13. https://doi.org/10.12703/P6-13.

【文献】Martinsson, Hanna, Maria Yhr, and Charlotta Enerback. 2005. “Expression Patterns of S100A7 (Psoriasin) and S100A9 (Calgranulin-B) in Keratinocyte Differentiation.” Experimental Dermatology 14 (3): 161-68. https://doi.org/10.1111/j.0906-6705.2005.00239.x.

【文献】Navegantes, Kely Campos, Rafaelli de Souza Gomes, Priscilla Aparecida Trtari Pereira, Paula Giselle Czaikoski, Carolina Heitmann Mares Azevedo, and Marta Chagas Monteiro. 2017. “Immune Modulation of Some Autoimmune Diseases: The Critical Role of Macrophages and Neutrophils in the Innate and Adaptive Immunity.” Journal of Translational Medicine 15. https://doi.org/10.1186/S12967-017-1141-8.

【文献】Rosenblum, Michael D, Kelly A Remedios, and Abul K Abbas. 2015. “Mechanisms of Human Autoimmunity.” The Journal of Clinical Investigation 125 (6): 2228-33. https://doi.org/10.1172/JCI78088.

【文献】Shanmugam, Narkunaraja, Marpadga A. Reddy, and Rama Natarajan. 2008. “Distinct Roles of Heterogeneous Nuclear Ribonuclear Protein K and MicroRNA-16 in Cyclooxygenase-2 RNA Stability Induced by S100b, a Ligand of the Receptor for Advanced Glycation End Products.” Journal of Biological Chemistry 283 (52): 36221-33. https://doi.org/10.1074/jbc.M806322200.

【文献】Siegel, Jay P. 1988. “Effects of Interferon-γ on the Activation of Human T Lymphocytes.” Cellular Immunology 111 (2): 461-72. https://doi.org/10.1016/0008-8749(88)90109-8.

【文献】Zhu, Jinfang, Hidehiro Yamane, and William E Paul. 2010. “Differentiation of Effector CD4 T Cell Populations (*).” Annual Review of Immunology 28: 445-89. https://doi.org/10.1146/annurev-immunol-030409-101212.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0021】

本発明は、臍帯血単核細胞（ＵＣＢＭＮＣ）によって分泌される小型細胞外小胞を単離するためのプロセス及び小型細胞外小胞を含む組成物に関するものであり、これらは、炎症性、自己免疫及び／または免疫系疾患の治療法もしくは予防、及び／または美容目的に適用するのに有用である。

【0022】

したがって、本発明の第１の実施形態では、請求項１に従って、臍帯血単核細胞（ＵＣＢＭＮＣ）によって分泌される小型細胞外小胞を単離するためのプロセスが提唱される。

【0023】

このプロセスにより、高純度の小型細胞外小胞（精製サンプルの７５％を超える５０～２００ｎｍの小胞）及び高収率が得られる（各ｍＬの馴化培地から少なくとも４ｘ１０^９の小型細胞外小胞が得られる）。さらに、適正製造基準（ＧＭＰ）下で、容易に標準化し、かつアップスケールできる。この方法のもう１つの利点は、部分的に自動化できるため、結果の再現性が高く、かつより高速な方法で得られることである。

【0024】

本発明の第２の実施形態は、請求項１２に記載の本発明のプロセスによって得ることができる小型細胞外小胞を含む組成物に関する。

【0025】

これらの組成物は、生物学的活性を有するこれらの分子群、特に特定のタンパク質、低分子ＲＮＡ及びｍｉＲＮＡなどのＲＮＡ、すなわち２０の排他的ｍｉＲＮＡ、及び脂質を提示する。

【0026】

したがって、本発明の第３の実施形態は、請求項１８に記載の、化粧品として、医薬品として、または予防として使用される小型細胞外小胞を含む医薬組成物に関する。

【0027】

本発明の第４の実施形態は、請求項２０に記載の炎症性、自己免疫または他の免疫系疾患の治療法及び／または予防において使用するための小型細胞外小胞を含む医薬組成物に関する。

【0028】

本発明による単離されたＳＥＶを含む医薬組成物は、抗炎症特性及び末梢血単核細胞（ＰＢＭＮＣ）に対する免疫調節効果などの生物学的活性を有し、化粧品、医薬品、または予防剤としての適用、すなわち炎症性、自己免疫性または他の免疫系疾患の治療法または予防に有用となることが明らかになった。

【0029】

本発明の第５の実施形態は、請求項２４に記載の組織修復に使用するための医薬組成物に関する。

【0030】

本発明による単離されたＳＥＶを含む医薬組成物は、組織修復、皮膚組織修復、皮膚開放創、皮膚熱傷療法のほか、にきび、乾癬、しゅさ、皮膚炎、湿疹、伝染性膿痂疹、間擦疹、または毛包炎などの皮膚状態もしくは疾患、ならびに動脈性潰瘍、静脈性潰瘍、糖尿病性潰瘍及び圧迫性潰瘍、術後潰瘍、外傷性潰瘍、口内潰瘍、糖尿病性足潰瘍または角膜潰瘍などの創傷の予防の治療において、生物学的活性を有することが明らかになった。

【0031】

本発明の第６の実施形態は、小型細胞外小胞を含む医薬組成物を含む医療デバイスに関し、ここで、組成物は、請求項２９に記載の天然または合成ポリマーマトリックスなどの担体、パッチ、または別の好適な医薬担体によって支持される。

【0032】

請求項３０は、ＳＥＶを生物学的活性分子で濃縮することによってＳＥＶを修飾する方法に関する本発明の別の実施形態に関する。

【図面の簡単な説明】

【0033】

【図1】（左パネル）先行技術プロセス（ＵＣ）及び（右パネル）実装されたＧＭＰ準拠の方法（ＵＦ／ＳＥＣ）の詳細な方法論を示す図である。

【図2】本発明の好ましい実施形態の１つによる、従来技術のプロセス（ＵＣ）及び最適化された方法（ＵＦ／ＳＥＣ）によって単離されたＳＥＶの特徴を明らかにした図である：Ａ．ＸＫ２６／７０（破線）及びＳｕｐｅｒｏｓｅ１０／３００ＧＥ（実線）を使用したＳＥＶ精製のクロマトグラムである。Ｂ．ＵＦ／ＳＥＣで収集された画分のナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）粒子分布及びタンパク質濃度を表す。Ｃ．両方の方法におけるＳＥＶ組成物－汚染物質のＨＰＬＣによる特徴を表す。Ｄ．両方の方法におけるＳＥＶ組成物－汚染物質のＨＰＬＣによる特徴を表す。Ｅ．ＮＴＡによるＵＣ及びＵＦ／ＳＥＣでのＳＥＶのサイズ分布を表す；Ｆ．ＵＣ及びＵＦ／ＳＥＣによって単離されたＳＥＶについてＮＴＡで得られた集団の分布を表す。Ｇ．ＮＴＡによって得られたＳＥＶのモーダルサイズを表す。

【図3】ＵＣまたはＵＦ／ＳＥＣによって単離されたＳＥＶの収率を表す図である。Ａ．ＵＣ及びＵＦ／ＳＥＣによって単離されたＳＥＶ中の馴化培地１ｍＬあたりの細胞外細胞の数を表す。Ｂ．ＵＣ及びＵＦ／ＳＥＣによって単離された単核細胞１００万個あたりの単離されたＳＥＶの数を表す。Ｃ．ＵＣ及びＵＦ／ＳＥＣによって単離された総有核細胞１００万個あたりの単離されたＳＥＶの数を表す。エラーバーは、ＳＥＭを表す。実施した統計的検定は、一元配置分散分析であり、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１であった。

【図4】蛍光ｍｉＲＮＡによるＳＥＶの修飾を示す図である。Ａ．ｍｉＲＮＡを用いてＳＥＶを修飾するための概略ワークフロー。Ｂ．１－ＳＥＶを含む（灰色）及び含まない（黒色）蛍光ｍｉＲＮＡ模倣物を含む溶液の蛍光スペクトル。Ｂ．２－１μＭのｍｉＲを含み、ＳＥＶを含まない溶液を１回遠心分離した後の、上部コンパートメント（フィルタ）の蛍光。Ｂ．３、Ｂ．４－１μＭの蛍光ｍｉＲ及び１ｘ１０^１１部／ｍＬ ＳＥＶを含む溶液の３回の遠心分離ステップ後の上部コンパートメント（フィルタ）の蛍光。３回の遠心分離後、残りの蛍光は、ＳＥＶに組み込まれたｍｉＲに対応する。

【図5】蛍光パルミトイル化ペプチド（ＭＴＫ）によるＳＥＶの修飾を示す図である。Ａ．ＭＴＫを用いてＳＥＶを修飾するための概略ワークフロー。Ｂ．１－蛍光ＭＴＫ ＳＥＶを含む溶液の吸収スペクトル。Ｂ．２－ＭＴＫで修飾されたＳＥＶの蛍光。

【図6】ＴＨＰ－１由来のマクロファージに対するＳＥＶの抗炎症効果を示す図である。Ａ．実験計画の概略図。ＴＨＰ－１細胞をＰＭＡ（２５ｎＭ）処理によりマクロファージに分化させた後、マクロファージをＳＥＶ（１ｘ１０^１０部／ｍＬ）で刺激した。陽性対照としてのＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）。ＳＥＶ投与の２４時間後、ＴＨＰ－１マクロファージＲＮＡを抽出し、細胞をフローサイトメトリーに使用した。Ｂ．Ｍ１／Ｍ２マクロファージ比はフローサイトメトリーによって評価した。Ｍ１マクロファージはＣＤ１４^＋ＣＤ８６^＋として定義し、Ｍ２マクロファージはＣＤ１４^＋ＣＤ１６３^＋として定義した。結果は統計的に有意ではないが、ＳＥＶ治療により、この割合を減少させることができた。Ｃ．炎症誘導性サイトカインｍＲＮＡ発現は、ｑＲＴ－ＰＣＲによって評価した。（Ｃ１）ＩＬ１β、（Ｃ２）ＴＮＦα、（Ｃ３）ＩＦＮγ、及び（Ｃ４）Ｃｏｘ－２の発現は、ＳＥＶ治療により減少した。エラーバーは、ＳＥＭを表す。実行した統計的検定は、一元配置分散分析であり、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１である。

【図7】ＴＨＰ－１由来のマクロファージに対するＳＥＶの効果は、炎症誘導性刺激を打ち消すことができる。Ａ．実験計画の概略図。ＰＭＡ（２５ｎＭ）治療によりＴＨＰ－１細胞をマクロファージに分化させた後、ＴＨＰ－１由来マクロファージをＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）及びＳＥＶ（１ｘ１０^１０部／ｍＬ）により同時に刺激した。ＳＥＶ投与の２４時間後、ＴＨＰ－１マクロファージＲＮＡを抽出し、細胞をフローサイトメトリーに使用した。Ｂ．Ｍ１／Ｍ２マクロファージ比はフローサイトメトリーによって評価した。Ｍ１マクロファージはＣＤ１４^＋ＣＤ８６^＋として定義し、Ｍ２マクロファージはＣＤ１４^＋ＣＤ１６３^＋として定義した。ＳＥＶ治療は、この割合を大幅に減らすことができた。Ｃ．炎症誘導性サイトカインｍＲＮＡ発現は、ｑＲＴ－ＰＣＲによって評価した。（Ｃ１）ＩＬ１β、（Ｃ２）ＴＮＦα、（Ｃ３）ＩＦＮγ、及び（Ｃ４）Ｃｏｘ－２の発現は、ＳＥＶ治療により減少した。エラーバーは、ＳＥＭを表す。実行した統計的検定は、一元配置分散分析であり、＊＊はｐ＜０．０１の場合、＊＊＊はｐ＜０．００１の場合である。

【図8】ＳＥＶにより、Ｔ細胞の増殖能が低下することを示す図である。ＰＢＭＮＣは、ＰＨＡ及びＳＥＶまたはビヒクルと共に６日間インキュベートした。陰性対照として、ＰＢＭＮＣはマイトジェンで刺激されず（ＮＳ）、陽性対照として、未処理ＰＢＭＮＣを使用した（ＮＴ）。ＣＦＳＥ強度によって測定された増殖指数：Ａ．全体的なＴ細胞増殖（ＣＤ３^＋細胞）；Ｂ．ヘルパーＴ細胞（ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋）；Ｃ．細胞傷害性Ｔ細胞サブセット（ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋）；Ｄ．全Ｔ細胞の生存率。７－ＡＡＤの内在化を使用して死細胞を染色した。結果は平均±ＳＥＭとして表す（ＳＥＶは、ｎ＝６、ＰＢＭＮＣドナーは、ｎ＝１）。一元配置分散分析を使用して統計分析を実行した。＊は、ｐ＜０．０５；＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１である。

【図9】制御性Ｔ細胞の分化に対するＳＥＶの生物活性を示す図である。健康な血液ドナーのＰＢＭＮＣをＳＥＶ（１ｘ１０^１０部／ｍＬ）またはビヒクルと共に６日間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ分析のために染色した。Ａ．各条件の代表的なフローサイトメトリードットプロット。Ｂ．６日間のインキュベーション後の制御性Ｔ細胞の割合。制御性Ｔ細胞は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、及びＦｏｘＰ３の同時発現によって同定された。Ｃ．結果は平均±ＳＥＭとして表す（ＳＥＶは、ｎ＝６、ＰＢＭＮＣドナーは、ｎ＝２）。一元配置分散分析を使用して統計分析を実行した。＊は、ｐ＜０．０５；＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１である。

【図10】ＳＥＶの免疫調節活性を示す図である。抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８で活性化した後、健康な血液ドナーのＰＢＭＮＣをＳＥＶ（１ｘ１０^１０部／ｍＬ）またはビヒクルと共に６日間インキュベートした。ＦＡＣＳ分析のために細胞を洗浄し、染色した。陽性対照（Ｃ＋）の場合、ＰＢＭＮＣをＩＬ－２（１００ＩＵ／ｍｌ）及びＴＧＦ－β（５ｎｇ／ｍＬ）でさらに刺激した。Ａ．６日間のインキュベーション後の制御性Ｔ細胞の割合。Ｔｒｅｇは、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ１２７^－として同定した。Ｂ．６日間のインキュベーション後のエフェクターＴ細胞の割合。Ｔ_ｅｆｆは、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^－ＣＤ１２７^＋として同定した。Ｃ．Ｔｒｅｇ／Ｔｅｆｆ比。結果は平均±ＳＥＭとして表す（ＳＥＶは、ｎ＝６、ＰＢＭＮＣドナーは、ｎ＝１）。一元配置分散分析を使用して統計分析を実行した。＊は、ｐ＜０．０５；＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１である。

【図11】ＳＥＶが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激されたＴ細胞のＩＦＮ－γの産生を阻害することを示す図である。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８で活性化した後、ＰＢＭＣをＳＥＶまたはビヒクルと共に６日間インキュベートした。陰性対照として、ＰＢＭＮＣは活性化されず（ＮＳ）、陽性対照として、未処理のＰＢＭＮＣを使用した（ＮＴ）。グラフは、（Ａ）ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋及び（Ｂ）ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞サブセット内の各条件におけるＩＦＮ－γ産生細胞の全体的な割合を示した。結果は平均±ＳＥＭとして表す（ＳＥＶは、ｎ＝６、ＰＢＭＮＣドナーは、ｎ＝１）。一元配置分散分析を使用して統計分析を実行した。＊は、ｐ＜０．０５；＊＊はｐ＜０．０１；＊＊＊は、ｐ＜０．００１、＊＊＊＊は、ｐ＜０．０００１である。

【図12】ＳＥＶは、マスター転写Ｔ細胞因子の発現に異なる影響を及ぼす。健康な血液ドナーのＰＢＭＮＣをＳＥＶ（１ｘ１０^１０部／ｍＬ）またはビヒクル（ＰＢＳ）と２日間及び６日間インキュベートし、リンパ球コンパートメントを形態学的特徴（ＦＳＣ及びＳＳＣ）及びＣＤ３^＋ＣＤ４^＋染色に基づいて選別した。次いで、トータルＲＮＡを抽出し、β－アクチンを参照遺伝子として遺伝子発現解析を行った。正規化発現レベルは、２^{－ΔΔＣｔ}に基づいて計算した。Ａ．Ｔ_Ｈ１マスター転写因子ｔ－ｂｅｔのｍＲＮＡ発現；Ｂ．Ｔ_Ｈ２マスター転写因子Ｇａｔａ３のｍＲＮＡ発現；Ｃ．Ｔ_Ｈ１７マスター転写因子ＲＯＲγＴのｍＲＮＡ発現；Ｄ．Ｔ_ｒｅｇマスター転写因子ＦＯＸＰ３のｍＲＮＡ発現。結果は平均±ＳＥＭとして表す（ＳＥＶは、ｎ＝６、ＰＢＭＮＣドナーは、ｎ＝２）。一元配置分散分析を使用して統計分析を実行した。＊は、ｐ＜０．０５；＊＊はｐ＜０．０１；＊＊＊は、ｐ＜０．００１、＊＊＊＊は、ｐ＜０．０００１である。

【図13】ＳＥＶＳにより、炎症誘発性サイトカインの分泌が減少することを示す図である。ＰＢＭＮＣをＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）及びＥｘｏ－１０１（１ｘ１０^１０部／ｍＬ）と２４時間共培養した。この後、上清を収集し、ＥＬＩＳＡによって分析した。Ａ．ＰＢＭＮＣによるヒトＴＮＦ－α分泌；Ｂ．ＰＢＭＮＣによるヒトＣＣＬ２０分泌。結果は平均±ＳＥＭとして表す（ＳＥＶは、ｎ＝３、ＰＢＭＮＣドナーは、ｎ＝１）。一元配置分散分析を使用して統計分析を実行した。＊は、ｐ＜０．０５；＊＊はｐ＜０．０１；＊＊＊は、ｐ＜０．００１、＊＊＊＊は、ｐ＜０．０００１である。

【図14】リンパ球発現プロファイルに対するｍｉＲ－１５０－５ｐ及びｍｉＲ－１４６－５ｐの影響を示す図である。健康な血液ドナーのＰＢＭＮＣは、ＶｉｒｏｍｅｒＢｌｕｅを使用して両方のｍｉＲでトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、リンパ球コンパートメントを形態学的特徴（ＦＳＣ及びＳＳＣ）に基づいて分類し、トータルＲＮＡを抽出した。遺伝子発現解析は、参照遺伝子としてβ－アクチンを使用して実行した。正規化発現レベルは、２^{－ΔΔＣｔ}に基づいて計算した。Ａ．Ｔ_Ｈ１マスター転写因子ｔ－ｂｅｔのｍＲＮＡ発現；Ｂ．Ｔ_Ｈ２マスター転写因子Ｇａｔａ３のｍＲＮＡ発現；Ｃ．Ｔ_Ｈ１７マスター転写因子ＲＯＲγＴのｍＲＮＡ発現；Ｄ．Ｔ_ｒｅｇマスター転写因子ＦＯＸＰ３のｍＲＮＡ発現。Ｅ．ＰＢＭＮＣトランスフェクション６日後の制御性Ｔ細胞の割合。Ｔｒｅｇは、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋として同定した。Ｆ．ＰＢＭＮＣトランスフェクション６日後のＴ_Ｈ１７の割合。ＴＨ１７は、ＩＬ１７Ａ発現細胞として同定した。結果は平均±ＳＥＭとして表す（ＳＥＶは、ｎ＝３、ＰＢＭＮＣドナーは、ｎ＝１）。一元配置分散分析を使用して統計分析を実行した。＊は、ｐ＜０．０５；＊＊はｐ＜０．０１；＊＊＊は、ｐ＜０．００１、＊＊＊＊は、ｐ＜０．０００１である。

【図15】乾癬様ＮＨＥＫ細胞モデルに及ぼすＳＥＶの効果を示す図である。ＮＨＥＫは、２ｍＭのＣａＣｌ_２で３日間最終分化させた。次に、炎症誘発性の表現型を増強するために、ＩＭＱを３時間追加した。最後に、ＩＭＱとの共インキュベーションで３時間処理を行い、ＲＮＡ抽出のために細胞を収集した。５００ｎｇのＲＮＡを逆転写反応に使用した。ｍＲＮＡ発現は、β－アクチン発現遺伝子によって正規化した。（Ａ）ＶＥＧＦ－Ａ、（Ｂ）ＴＮＦ－α；（Ｃ）ＴＧＦ－β１及び（Ｄ）ＩＬ－６について遺伝子発現を評価した。結果は平均±ＳＥＭとして表す（ＳＥＶについてはｎ＝３）。統計分析は、スチューデントのｔ検定を使用して実行した。＊は、ｐ＜０．０５；＊＊はｐ＜０．０１である。

【図16】三次元表皮乾癬様モデルでのＳＥＶの生物活性を示す図である。５日間の治療後（ＳＥＶ（２．５ｘ１０^９部／ｍＬ）で１日２回）、ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、製造業者の推奨に従って抽出した。５００ｎｇのＲＮＡを逆転写反応に使用した。ｍＲＮＡ発現は、β－アクチン発現遺伝子によって正規化した（各条件でｎ＝３）。Ａ．炎症誘発性メディエータの遺伝子発現プロファイル：（Ａ１）ＩＬ６；（Ａ２）ＩＬ８；（Ａ３）Ｇｒｏ－α；（Ａ４）ＩＦＮγ；（Ａ５）ＣＸＣＬ１０及び（Ａ６）ＴＮＦ－α。Ｂ．抗菌ペプチドの遺伝子発現プロファイル：（Ｂ１）ＩＬ６；（Ｂ２）ＩＬ８；Ｃ．遺伝子発現プロファイル（Ｃ１）ＫＲＴ５及び（Ｃ２）Ｃｏｘ－２。Ｄ．ＥＬＩＳＡによって表皮乾癬様ケラチノサイトのＣＭ中で測定したタンパク質分泌：（Ｄ１）ＴＮＦ－α、（Ｄ２）ＣＣＬ２０及び（Ｄ３）ＩＬ１７Ａ。結果は平均±ＳＥＭとして表す（ＳＥＶについてはｎ＝３）。統計分析は、スチューデントのｔ検定を使用して実行した。＊は、ｐ＜０．０５；＊＊はｐ＜０．０１である。

【図17】局所－ＳＥＶが、乾癬様皮膚炎症マウスモデルの乾癬特性を改善したことを示す図である。Ａ．Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを使用した。乾癬様特徴は、５％ＩＭＱを含むクリーム製剤であるＡｌｄａｒａを毎日局所塗布することによって誘導した。Ａｌｄａｒａの塗布から１時間後、ＳＥＶ治療は、毎日局所製剤で塗布した。６日後、さらなる分析のために皮膚及びリンパ節生検片を収集した。Ｂ．局所治療６日後のマウスの背中の剃毛皮膚の代表的な写真。Ｃ．臨床スコアリングは、紅斑の重症度（０～４までの発赤）、患部（０～３）、及び落屑（０～２からのスケール）をランク付けすることによって実行した。Ｄ．表皮の厚さは、局所治療６日後のＨＥ染色で測定した。

【図18】乾癬様皮膚炎症マウスモデルの皮膚細胞に対する局所－ＳＥＶの生物活性を示す図である。Ａ．（Ａ．１）ＣＤ４５^＋ＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ６４^＋Ｌｙ６Ｃ^＋として定義された炎症性マクロファージ、（Ａ．２）好中球（ＣＤ４５^＋ＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ６４^－Ｌｙ６Ｇ^＋）（Ａ．３）成熟Ｔ細胞（ＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ＴＣＲαβ^＋）及び（Ａ．４）細胞傷害性Ｔ細胞ＣＤ４５^＋ＴＣＲαβ^＋ＣＤ４^－）のフローサイトメトリー分析である。この分析は、皮膚生検の酵素消化後に実施した。Ｂ．（Ｂ．１）ＲＯＲγＴ、（Ｂ．２）ＣＣＬ２０、（Ｂ．３）ｉＮｏｓ及び（Ｂ．４）アルギナーゼの正規化ｍＲＮＡ発現。皮膚消化後、ＲＴ－ＰＣＲ分析のために皮膚細胞ＲＮＡを抽出した。結果は平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）として表す。一元配置分散分析を使用して統計分析を実行した。＊は、ｐ＜０．０５；＊＊はｐ＜０．０１である。

【図19】乾癬様皮膚炎症マウスモデルのリンパ節細胞に対する局所－ＳＥＶの生物活性を示す図である。Ａ．（Ａ．１）細胞傷害性Ｔ細胞の数（ＣＤ３^＋ＣＤ４^－）、（Ａ．２）メモリーＴ細胞の数（ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ４４^＋ＣＤ６２Ｌ^－）、（Ａ．３）ＴＨ１７の割合（ＣＤ４^＋ＴＣＲαβ^＋ＣＣＲ６^＋）及び（Ａ．４）リンパ節に存在するγδＴ細胞（ＣＤ３^＋ＧＬ３^＋）の割合のフローサイトメトリー分析。この分析は、リンパ節組織の解離後に実施した。Ｂ．（Ｂ．１）ＴＮＦ－α、（Ｂ．２）ＩＦＮγ、（Ｂ．３）ＲＯＲγＴ、及び（Ｂ．４）ＦＯＸＰ３の正規化ｍＲＮＡ発現をリンパ節で評価した。組織解離後、ＲＴ－ＰＣＲ分析のためにリンパ節ＲＮＡを抽出した。結果は平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）として表す。一元配置分散分析を使用して統計分析を実行した。＊は、ｐ＜０．０５；＊＊はｐ＜０．０１である。

【図20】本発明の方法によって単離されたＳＥＶは、糖尿病マウスモデルにおいて創傷治癒を加速させることを示す図である。ＳＴＺ（５０ｍｇ／ｋｇ）で５０日間誘導した後、１６匹の化学的に糖尿病を誘導されたＣ５７ＢＬ／６マウスの皮膚に全層切除創を行った。各マウスは、各治療群：発明的方法または先行技術的方法に無作為に割り当てた。ＳＥＶ治療は１日２回１５日間局所的に適用した。（Ａ）０日目、３日目、及び１０日目の各状態の代表的な創傷顕微鏡写真。スケールバー：０．５ｃｍ。（Ｂ）各時点（毎日）でのすべてのマウスの創傷サイズの割合の算術平均及びＳＥＭ（ｎ≧１２）。＊ｐ≦０．０５、＊ｐ≦０．０１、＊ｐ≦０．０００１。

【発明を実施するための形態】

【0034】

本発明は、臍帯血単核細胞（ＵＣＢＭＮＣ）によって分泌される小型細胞外小胞を単離するためのプロセス、ならびに自己免疫及び／もしくは免疫系疾患の治療法、または予防及び／もしくは美容目的に適用するのに有用である、細胞を処理することによって得られる小型細胞外小胞を含む組成物に関する。

【0035】

１．単核細胞臍帯血小型細胞外小胞を単離するためのプロセス
本発明のプロセスは、臍帯血単核細胞（ＵＣＢＭＮＣ）によって分泌される小型細胞外小胞を単離するために適用することができる。このプロセスは、高純度の小型細胞外小胞をより高い収率で達成することを目的としている。

【0036】

これは、ｉ）連続遠心分離を行う第１のステップ、ｉｉ）限外ろ過（ＵＦ）と組み合わせた精密ろ過を行う第２のステップ、及びｉｉｉ）サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を行う最終ステップで構成される。

【0037】

一般に、本発明のプロセスは、以下に従って実施することができる：

【0038】

１．１ＵＣＢＭＮＣの収集及び処理
ヒト臍帯血サンプルは、インフォームドコンセントを提供した後、健康なボランティアドナーから入手できる。次に、血球は勾配遠心分離によって単離される。例えば、自動臍帯血処理システムによって自動的に処理される。遠心分離中に、成分の層化及び分離が生じ、臍帯血成分（バフィーコート、血漿、赤血球）を別々の滅菌バッグに配向できる。

【0039】

要約すると、赤血球（ＲＢＣ）は、血漿が処理バッグに残留している間に、別の滅菌凍結バッグに送達できる単核細胞（ＭＮＣ）リッチ層を含む別の滅菌バッグであるバフィーコートに移される。ＵＣＢＭＮＣは、リンパ球、単球、好中球、好酸球、及び／または好塩基球を含む。

【0040】

この自動化プロセスは、ユーザ間の技術的変動性及び処理時間及び費用の非効率性など、手動処理の制限を克服することが当技術分野において公知である。さらに重要なことに、このプロセスは、細胞の生存率及び効力を損なうことはない。

【0041】

１．２ＵＣＢ細胞培養
細胞は、虚血の有無にかかわらず、約１８時間の最小期間培養できる。ＵＣＢＭＮＣは、好ましくは１０～１０００ｎｇ／ｍｌのＦＭＳ様チロシンキナーゼ－３（Ｆｌｔ－３）及び１０～１０００ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子（ＳＣＦ）が補充された無血清細胞培養培地で、虚血なく、または好ましくは虚血状態、例えば、０．５％Ｏ_２及び５％ＣＯ_２、３７℃で１８時間、培養される。

【0042】

虚血状態（Ｏ_２＜２％）にさらされた細胞によって分泌される小型細胞外小胞は、虚血状態にさらされていないときに細胞によって分泌される小型細胞外小胞よりも組織修復を誘導するのにより効果的である（特に局所虚血によって損傷が永続する場合）。これは特に、血管新生を促進する生体分子が豊富に含まれているためである。したがって、本発明の好ましい実施形態では、細胞は虚血条件下で培養される。

【0043】

１．３ＳＥＶの単離
臍帯血単核細胞（ＵＣＢＭＮＣ）によって分泌される小型細胞外小胞（ＳＥＶ）は、ＵＣＢ自動処理から直接得られるバフィーコートであり、本発明によれば、以下の３ステップのプロセスを使用して精製（単離）される。ｉ）２ラウンドの連続遠心分離を使用して、培地から大きい粒子及び細胞破片を除去する、ｉｉ）除去された上清は、連続的なマイクロ（ＭＦ）及び限外ろ過（ＵＦ）技術にかけて、２００ｎｍより大きく１００ｋＤａ未満のサイズの小胞及び他の粒子を除去する；ならびにｉｉｉ）単離されたＳＥＶをさらに分離し、小型可溶性タンパク質を除去する高性能排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による最終分離ステップ。本発明のプロセスの好ましい実施形態は、ＳＥＶ単離に使用される従来技術の方法（超遠心分離、ＵＣ）との比較も含めて、図１に記載されている。

【0044】

最初に、典型的には、最初に低速（２００ｇ～４００ｇ、１０～２０分）で、次に平均速度（１５００ｇ～２５００ｇ、２０～３０分）で実行される２ラウンドの連続遠心分離を使用して、低温（４～１０℃）で培地から大きい粒子及び細胞破片を除去し、その結果、馴化培地が透明となる。

【0045】

その後、収集された馴化培地は、手動で、または蠕動ポンプ（＜１バール）などの自動システムのいずれかを用いて、８００ｎｍ～４５０ｎｍの細孔フィルタを備えた第１のフィルタを使用し連続ろ過し、その後２５０ｎｍ～２００ｎｍの細孔フィルタを備えた第２の小型フィルタを使用して、別のろ過を行うことによってマイクロフィルタ処理される。このろ過ステップはまた、上記の両方のフィルタを組み合わせた装置によって実施することができる。

【0046】

次に、このろ過溶液は、好ましくは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で少なくとも１：１の比率で希釈される。

【0047】

次に、得られた溶液を限外ろ過ステップにかける。これは、Ｖｉｖａｃｅｌｌ（登録商標）２５０システムを使用して、２～４バール、好ましくは３～３．５バールの圧力、及び１００～２００ｒｐｍの一定の撹拌条件で行うことができる。１００ＫＤａの分子サイズカットオフを使用するタンジェンシャルフィールドフローシステムも、上記の目的に適している。

【0048】

これにより、ＳＥＶなど、１００ＫＤａより大きく２００ｎｍより小さい粒子の濃縮溶液が得られる。

【0049】

次に、濃縮溶液を、好ましくは、それぞれ少なくとも１：４の比率のＰＢＳ溶液で１回洗浄し、次いで以下の精製ステップに適合する最小容量、好ましくは初期容量の少なくとも１０倍未満に再度濃縮する。

【0050】

最終単離ステップでは、高性能サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用する。

【0051】

このステップは、ＦＰＬＣ－Ａｋｔａ Ａｖａｎｔクロマトグラフィーシステムなど、ＳＥＣに好適であるか、同等の機器で実行できる。使用するＳＥＣカラムに従って、ろ過したＰＢＳ溶液を適合流量において溶出バッファーとして使用する（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６ １０／３００ＧＥでは０．５ｍＬ／分、ＸＫ２６／７０では３ｍＬ／分）。

【0052】

ＵＶ吸光度は、３つの異なる波長（２２０ｎｍ、２６０ｎｍ、及び２８０ｎｍ）で検出したが、２８０ｎｍがＳＥＶ検出の好ましい信号として使用される。

【0053】

クロマトグラムでは２つの個別のピークが観察され、ＳＥＶは、最初に溶出されたピーク（粒子のサイズが大きい）に存在する。検出された第２のピークは、注入された溶液に依然として存在するより小さい可溶性タンパク質に対応する。

【0054】

ＳＥＶは、第１のピークで２８０ｎｍでの吸光度が増加したときに収集が開始され、そのピークの２８０ｎｍでの吸光度がゼロまで低下したときに収集を終了する。

【0055】

したがって、ＳＥＶの画分は、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ＧＥ １００／３００では８～１０ｍｌ、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ＧＥ ＸＫ２６／７０では１００～１２０ｍｌの溶出容量に対応する（図２Ａ）。ＳＥＶは、機器と組み合わせた冷蔵（４～１０℃）自動フラクションコレクターを使用して収集できる。

【0056】

ナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ）による収集された画分の分析及びタンパク質濃度の測定は、単離されたサンプル中のＳＥＶの存在を確認するために使用される。ＳＥＶは、タンパク質濃度が低く、ナノサイズ粒子の数が多いことに対応し、第２のピークの汚染物質可溶性タンパク質は、タンパク質濃度が高く、ナノサイズ粒子の数が少ないことに対応する（図２Ｂ）。

【0057】

本発明の最適化された方法論（ＵＦ－ＳＥＣ）に従って単離されたＳＥＶは、記載された従来技術のプロセス（ＵＣ）に従って単離されたＳＥＶと比較した場合、同様の形態学的特徴を有する。

【0058】

ＳＥＶは、得られた組成物、すなわちＳＥＶ種におけるそれらの個々の量及び種類に対応させてＦＰＬＣ技術によって評価し、可溶性タンパク質による汚染は２０％未満であることが観察され、これは従来技術のＵＣ方法論と非常に類似している（図２Ｃ及び図２Ｄ）。これらの結果は、汚染物質可溶性タンパク質の保持に関して、本発明のプロセス（ＵＦ－ＳＥＣ）が従来技術（ＵＣ）のプロセスと同程度に良好であることを示している。

【0059】

ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ技術）は、単離されたＳＥＶのサイズ分布を分析するために使用される。曲線のプロファイルは、２００ｎｍ未満のサイズに集中しており、得られた平均サイズは１５０ｎｍに近い（図２Ｅ）。これらの結果は、文献で５０～２００ｎｍ以内であると報告されているＳＥＶの予想サイズに適合する。これらの結果は、単離されたＳＥＶのサイズに関して、本発明のプロセス（ＵＦ－ＳＥＣ）が従来技術（ＵＣ）のプロセスと同程度に良好であることを示している。

【0060】

単離されたＳＥＶ画分における微小胞（２００～４００ｎｍ）の存在は、５～２５％以内である（図２Ｆ）が、より大きい粒子（＞４００ｎｍ）は、５％未満である。ＳＥＶのモーダルサイズは、最適化された方法論（ＵＦ－ＳＥＣ）または従来技術の方法（ＵＣ）を使用して約１５０ｎｍである（図２Ｇ）。これらの結果は、単離されたＳＥＶのサイズに関して、本発明のプロセス（ＵＦ－ＳＥＣ）が従来技術（ＵＣ）のプロセスと同程度に良好であることを示している。

【0061】

本発明の最適化された方法論（ＵＦ－ＳＥＣ）を使用する場合、使用される正規化とは関係なく、従来技術の方法（ＵＣ）と比較して、（ｉ）使用した馴化培地１ミリリットルあたり（図３Ａ）、（ｉｉ）単核細胞（ＭＮＣ）の数あたり（図３Ｂ）、または（ｉｉｉ）有核細胞の総数あたり（図３Ｃ）の単離されたＳＥＶの数の収率が高い。

【0062】

これらの結果は、ＳＥＶ収率に関して、本発明のプロセス（ＵＦ－ＳＥＣ）が従来技術（ＵＣ）のプロセスよりも優れていることを示している。

【0063】

１．４ＳＥＶのプール
小型細胞外小胞は、複数の血液ドナーからプールされ、最適化された技術及び基準に従って特徴が明らかにされる。プールは、細胞培養馴化培地を使用して、または小型細胞外小胞の精製後に、少なくとも５名の異なるドナーから行うことができる。この戦略を使用することで、それらの生物活性特性に影響を与えることなく、精製された小型細胞外小胞間の均一性を高めることができる。

【0064】

１．５凍結乾燥
保管可能な生成物を産生するため、及び／または後の場合に使用できる組成物を産生するために、凍結乾燥ステップを一般的なプロセスに加えてもよい。

【0065】

凍結乾燥は、昇華プロセスを介する脱水プロセスである。この制御された乾燥プロセスにより水分が除去され、生成物の分子構造は無傷のままである。所望の最終生成物が凍結乾燥製剤であり得ることを考慮して、凍結乾燥がＳＥＶ組成物または画分の安定性及び生化学的／生物物理学的特性に影響を及ぼし得るか否かにアクセスするための試験を実施した。凍結乾燥は、容量に応じて、圧力＜０．４ミリバール、温度約－５０℃で約１２～２４時間実行できる。

【0066】

凍結乾燥後の細胞外小胞組成物の形態学的特徴に関して、それぞれが５つの異なるドナーを含む５つのプールの試験を行った。凍結乾燥の影響はごくわずかであることが観察された。モーダルサイズ及び濃度は、両方とも凍結乾燥手順の影響を受けていないと考えられ、プロセス内で安定して維持され、溶媒によって十分に水和されていることを示している。表面マーカーの相対的発現も凍結乾燥の影響を大きく受けることはなく、表面特性が全手順で保存されていることを示している。

【0067】

２．小型細胞外小胞（ＳＥＶ）修飾の方法
単離された小型細胞外小胞（ＳＥＶ）は、生物活性効率を高めるために修飾することができる。

【0068】

これらの修飾は、分泌細胞（ＵＣＢＭＮＣ）を特定の刺激で、または本発明のプロセス（ＵＦ－ＳＥＣ）で単離した後、ＳＥＶ組成物において直接前処理することによって行ってもよい。

【0069】

本発明では、単離後の修飾が好ましい。この目的のために、ＵＦ－ＳＥＣ方法論によって得られたＳＥＶ組成物は、炎症性疾患及び自己免疫疾患などの特定の疾患の治療及び／もしくは予防のプロセス、または化粧品用途に関与するかまたは伴う、選択されたｍｉＲＮＡなどの特定の分子により濃縮される。

【0070】

得られたＳＥＶ組成物は、液体または粉末のいずれかの形態で提示され得る。

【0071】

本発明の好ましい実施形態では、ＳＥＶは、ｍｉＲＮＡ溶液によりＳＥＶ凍結乾燥粉末組成物を直接水和することにより、選択された種類のｍｉＲＮＡで修飾される（図４）。

【0072】

１ｘ１０^９～１ｘ１０^１１粒子／ｍＬ、好ましくは１ｘ１０^１１を有する凍結乾燥ＳＥＶ組成物は、水中、またはＰＢＳなどの中性ｐＨの緩衝液中で、０．２～１０μＭ、好ましくは０．２５～５．０μＭ、より好ましくは０．５～１μＭの同じ容量のｍｉＲＮＡ溶液で直接再水和し、３７℃で２分間のインキュベーションを３サイクル行い、各サイクルの後にボルテックスを行う。

【0073】

したがって、ｍｉＲＮＡ分子を用いたＳＥＶ修飾の方法は、以下のステップで構成される：
ａ）修飾されるＳＥＶの粉末組成物を提供すること；
ｂ）水中またはＰＢＳなどの中性ｐＨの緩衝液において０．２～１０μＭ、好ましくは０．２５～５．０μＭ、より好ましくは０．５～１μＭのｍｉＲＮＡの量を含む選択されたｍｉＲＮＡの溶液によりＳＥＶ組成物を直接水和すること、
ｃ）混合物を約３７℃で約２分間３サイクルでインキュベートし、各サイクルの後にボルテックスを行うこと。

【0074】

任意により、ろ過ステップを、１０～１００ｋＤａ、好ましくは２０～７０ｋＤａ、より好ましくは４０～５０ｋＤａの分子カットオフで実施する上記の方法に加えて、組み込まれていないｍｉＲＮＡを分離し、水または中性ｐＨの緩衝液、好ましくはＰＢＳにより３ラウンドの洗浄を実施し、典型的には、中性ｐＨの緩衝液、好ましくはＰＢＳに再懸濁し、１４０００ｇ、４℃で、４分間遠心分離する。次に、修飾ＳＥＶは、当技術分野において公知である方法によって収集できる。

【0075】

小型細胞外小胞を濃縮する別のアプローチは、ＳＥＶ組成物にマトリキン（ＭＴＫ）などのパルミトイル化トリペプチドを組み込むことによって試験を行った（図５）。

【0076】

ＭＴＫなどのパルミトイル化トリペプチドが脂溶性分子とすると、上記の修飾方法を用いる必要があった。

【0077】

したがって、パルミトイル化トリペプチド分子によるＳＥＶ修飾のための方法は、以下のステップを含む：
ａ）修飾されるＳＥＶ粉末組成物を提供すること；
ｂ）水またはＰＢＳなどの中性ｐＨの緩衝液中において濃度１０～６０μＭを選択されたパルミトイル化トリペプチドの溶液によりＳＥＶ組成物を直接水和すること；
ｃ）混合物を３７℃で１時間インキュベートすること。

【0078】

組み込まれていないパルミトイル化－トリペプチドは、１０～１００ｋＤａ、好ましくは２０～７０ｋＤａ、より好ましくは４０～５０ｋＤａの分子カットオフによるろ過ステップによって除去され、組み込まれていないパルミトイル化トリペプチドを分離し、上記のように、ＰＢＳにより３ラウンド洗浄することができる（ＰＢＳに再懸濁し、４℃、４分で１４０００ｇで遠心分離する）。

【0079】

３．ＳＥＶ修飾の分析
記載されているＳＥＶ修飾戦略の有効性にアクセスするために、蛍光ｍｉＲＮＡ及び蛍光ＭＴＫをＳＥＶ粉末組成物に組み込んだ。

【0080】

ＳＥＶは、蛍光ｍｉＲＮＡ溶液を用いて、上記のように直接水和によって修飾した。参照溶液（組み込まれた遊離蛍光ｍｉＲＮＡを含む）では、最初の遠心分離後、蛍光はフィルタによって保持されなかった（上部コンパートメントの蛍光はゼロになる）が、ＳＥＶ組成物中の蛍光は、初期値の約２０％に維持された（図４Ｂ３及び図４Ｂ４）。

【0081】

ろ過ステップの洗浄において、蛍光ＳＥＶは、各洗浄ステップ後に遠心分離によって回収された。３回の洗浄後、蛍光は２０％に維持され、これは、蛍光ｍｉＲＮＡがＳＥＶへ効率的に取り込まれていることを示している。ｍｉＲＮＡによる修飾の有効性をさらに評価するために、リアルタイムＰＣＲを使用して、修飾戦略の前及び後のｍｉＲＮＡの量を評価する。

【0082】

パルミトイル化トリペプチドの取り込みを検証するために、ｍｉＲＮＡ検証方法と同様に、蛍光修飾されたパルミトイル化トリペプチド、ＭＴＫをＳＥＶ組成物に正常に組み込んだ。

【0083】

したがって、本発明の別の実施形態では、ＳＥＶ組成物は、上記の方法に従ってこれらの生物学的活性分子のいずれか、ならびに脂溶性分子及び非脂溶性分子のそれぞれの適応によって濃縮される。

【0084】

４．ＵＣＢＭＮＣによって分泌される小型細胞外小胞を含む組成物
本発明のプロセス（ＵＦ－ＳＥＣ）によって単離された小型細胞外小胞（ＳＥＶ）を含む組成物は、その中に含まれる関連要素、特にタンパク質、ＲＮＡ及び脂質の群に従って分析され、特徴を明らかにした。

【0085】

１．１タンパク質
ＳＥＶ組成物は、質量分析によって分析し、タンパク質含有量の特徴を明らかにした。これらの組成物のタンパク質濃度は、マイクロビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ）プロテインアッセイキットによって決定され、全ペプチド材料は、タンデム質量分析と組み合わせたナノスケール液体クロマトグラフィー（ｎａｎｏＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を使用して分析した。簡潔に言えば、サンプルを溶解し、（ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル）に装填した。得られたゲルレーンを洗浄し、アルキル化の前にタンパク質をジチオスレイトールＤＴＴで還元した。洗浄後、トリプシンを使用してゲル内消化を行い、ペプチドを液体クロマトグラフィーによって分離し、ＭＳによって同定した。

【0086】

本発明の方法に従って単離された小型細胞外小胞において、合計１７０のタンパク質が同定された（表１，２を参照のこと）。従来技術の方法（ＵＣ）では、タンパク質が低い割合であることがこれらの生物学的プロセスに関連しているため（表１３を参照されたい）、免疫系の調節及び炎症応答に関連する生物学的プロセスの点で、新しい組成物よりも優れている（表１３）。

【0087】

関連する生物学的経路及び分子機能など、これら１７０のタンパク質の生物学的関連性を理解するために、Ｆｕｎｒｉｃｈソフトウェアを使用してＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤを導入し、Ｆｕｎｒｉｃｈデータベースを使用して分析した。表３には、同定されたタンパク質の完全なリストに関連する各群の割合をまとめる。これらの結果は、ＳＥＶ組成物に含まれるタンパク質が、創傷治癒及び免疫調節に関連する生物学的プロセスにおいて強力な予測効果を有することを示している。

【0088】

タンパク質は、それらが影響を与える生物学的プロセスに従ってグループ化され、表３では、同定されたタンパク質をそれらの生物学的活性と関連付けている。例えば、Ｆｕｎｒｉｃｈソフトウェアは、Ｓｐ１をＡＮＸＡ７、ＳＴＯＭ、ＳＬＣ２Ａ１、ＤＳＰ、ＪＵＰ、ＡＮＸＡ１１、ＵＢＡ５２、及びＧＡＰＤＨの影響を受ける転写因子として予測した。これらはすべて、ＳＥＶ組成物に含まれている。この転写因子は、活性化されたときにＦｏｘｐ３発現の強力かつ安定した誘導に関連しており、ＳＥＶ組成物の免疫調節効果の可能性を強化する。

【0089】

【表1】

【0090】

【表2】

【0091】

【表3】

【0092】

【表4】

【0093】

【表5】

【0094】

【表6】

【0095】

プロテオミクス分析を改良するために、ＳＥＶサンプルを３つの画分に分割し、ＭＳ分析のダイナミックレンジを拡大して、存在量の少ないペプチドを特定した。上記のタンパク質に加えて、本発明のプロセス（ＵＦ－ＳＥＣ）によって精製されたＳＥＶは、ＣＤ９、ＣＤ６３及びＣＤ８２のようなテトラスパニン、インテグリン（インテグリンα－２；インテグリンα－ＩＩｂ；インテグリンα－４；インテグリンα－Ｍ；インテグリンβ－１；インテグリンβ－２及びインテグリンβ－３）及びＲａｂタンパク質として、古典的なＳＥＶマーカーによっても構成されている。

【0096】

２．２ＲＮＡ
ＲＮＡシーケンシングを使用して、ＳＥＶ組成物の低分子ＲＮＡ含有量を同定した。ＥＸＩＱＯＮ ｍｉＲＣＵＲＹＴＭ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキット（Ｃｅｌｌ＆Ｐｌａｎｔｓ）を使用してＳＥＶ ＲＮＡを単離し、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００で低分子ＲＮＡの品質及び定量を行った。

【0097】

本発明の範囲において、「低分子ＲＮＡ含有量」という表現は、長さが２００ヌクレオチド未満のＲＮＡ分子を含む組成物を意味し、「ｍｉＲＮＡ」、「マイクロＲＮＡ」または「ｍｉＲ」は、約２１～２５ヌクレオチドを有するＲＮＡ分子を意味する。

【0098】

Ｉｏｎ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ－Ｓｅｑ Ｋｉｔ ｖ２プロトコルに従って、低分子ＲＮＡを使用して小さいライブラリーを構築した。プールされたライブラリーは、ＩｏｎＣｈｅｆ（商標）システムでさらに処理され、得られた５３０（商標）チップは、ＩｏｎＳ５（登録商標）システムで配列決定した。Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓツールは、各サンプル中の各遺伝子の相対的な存在量の注釈及び推定に使用した。

【0099】

結果は、本発明のプロセスに従って単離されたＳＥＶが異なる種の低分子ＲＮＡを有し、転移ＲＮＡが存在量が最も高いＲＮＡ種であり、平均して５７％であることを示している。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、２番目に優勢な種（約２７％）であり、その後リボソームＲＮＡ（約６％）及び他の少ないカテゴリーである。表７は、ＳＥＶ組成物中で同定された低分子ＲＮＡと、注釈付きＲＮＡ配列の合計に関するそれらの対応する寄与を示している。

【0100】

【表7】

【0101】

分析された６つのサンプルの中で、ＲＮＡ種に大きな差はない。したがって、ｍｉＲＮＡの範囲は表７に示すように定義できる。ＳＥＶ組成物では、少なくとも５つの異なるサンプル中で２２７のＲＮＡが検出され、そのうち４４はｍｉＲＮＡである。興味深いことに、同定されたｍｉＲＮＡのうちの２０は、新規発明の方法により単離されたＳＥＶを除く（表７の太字のｍｉＲＮＡ）。

【0102】

【表8】

【0103】

１．３脂質
小型細胞外小胞が脂質二重層に囲まれていることを考えると、それらは小型細胞外小胞の重要な構造成分であるのみでなく、レシピエント細胞との小型細胞外小胞の相互作用を調節することも期待されている。本発明の組成物の脂質含有量に関するいくつかの洞察を得るために、質量分析を使用して、それらの脂質プロファイルを測定し、同定した。Ｓａｍｐａｉｏ ＪＬ、ＰＮＡＳ ２０１１の方法論に従って、クロロホルム及びメタノールを使用して脂質を抽出した。

【0104】

抽出前に、脂質クラス固有の内部標準をサンプルに添加した。乾燥し、質量分析取得混合物に再懸濁した後、脂質抽出物を質量分析にかけた。質量スペクトルは、正イオンモード及び負イオンモードの両方で自動ナノフローエレクトロスプレーイオン源を備えたハイブリッド四重極／Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計で取得した。

【0105】

総脂質量に関して、組成物は約１２０００ｐｍｏｌであり、サンプル間で変動が２５％であり、表９に示すとおり、主要脂質クラス（約６０％）としてホスファチジルコリン（ＰＣ）及びホスファチジルセリン（ＰＳ）、その後スフィンゴミエリン（ＳＭ、２０％）が観察された。

【0106】

【表9】

【0107】

トリアシルグリセリド（ＴＡＧ）及びジアシルグリセリド（ＤＡＧ）のレベルは低く、これは、新しい本発明のプロセスにより単離されたＳＥＶ組成物が本質的にリポタンパク質で汚染されていないことを示している。

【0108】

これらの組成物にはコリン基を含むＰＣ及びＳＭが大量に含まれていることを考慮して（約５０％）、コリンの定量化もＳＥＶの特性評価に含まれている。この目的のために、コリンに対する感受性の高い市販のキットを使用することができる。本発明の場合、リン脂質アッセイキット（登録商標）ＭＡＫ１２２－１ＫＴ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用した。

【0109】

質量分析によって評価された対応する割合を考慮すると、ＳＥＶ組成物中のコリンの平均濃度は２５μＭであり、これはＰＣ約１５μＭ及びＳＭ１０μＭに対応することが観察された（表９）。これらの結果は、本発明の方法で単離されたＳＥＶが、従来技術の方法によって単離されたＳＥＶについての文献に記載されているものに従った脂質組成物を有することを示している。

【0110】

結果として、この定量化方法論は、それらの脂質含有量と対応させて組成物の品質の尺度として機能し得ることが認められている。

【0111】

したがって、別の実施形態では、本発明は、脂質含有量に対応させて組成物の品質を測定するための、コリンに対して高感度である上記のリン脂質アッセイキット（登録商標）ＭＡＫ１２２－１ＫＴまたは同様のものなどの使用を指す。

【0112】

本発明の別の実施形態は、本発明のプロセスによって単離されたＳＥＶを含む組成物、特に、生物学的活性を有するこれらの３つのグループの分子を含むＳＥＶ組成物に関する。

【0113】

好ましい実施形態では、ＳＥＶ組成物は、表１に列挙した１７０のタンパク質、特に、ＡＮＸＡ２、ＡＮＫ１、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ９及びＣＤ１５を含む。

【0114】

別の好ましい実施形態では、ＳＥＶ組成物中のタンパク質は、本質的に、表１に列挙された１７０のタンパク質の群から選択される１つ以上、特に、ＡＮＸＡ２、ＡＮＫ１、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ９及びＣＤ１５の群から選択されるタンパク質のうちの少なくとも１つからなる。

【0115】

より好ましい実施形態では、以下のタンパク質のうちの少なくとも１つが、マイクロビーズに結合したＳＥＶをフローサイトメトリーによって測定したときに、ＣＤ８１≧１％、ＣＤ９≧１％、ＣＤ６３≧４０％、ＣＤ１５≧２０％の量の陽性事象、
または、ＥＬＩＳＡによって測定したときに、精製ＳＥＶ中のＣＤ６３≧５ｐｇ／ｍＬまたはＡＮＸＡ２≧０．３ｎｇ／ｍＬの数量で、ＳＥＶ組成物中に存在する。

【0116】

別の実施形態では、ＳＥＶ組成物は、表４に示すマイクロＲＮＡ、好ましくはｍｉＲ－１５０－５ｐ、ｍｉＲ－２２３－３ｐ、ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１９ｂを含む。

【0117】

別の好ましい実施形態では、ＳＥＶ組成物中に存在するマイクロＲＮＡは、表４に示されるような少なくとも１つのマイクロＲＮＡからなり、より好ましくは、ｍｉＲ－１５０－５ｐ、ｍｉＲ－２２３－３ｐ、ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１９ｂの群から選択される１つ以上のマイクロＲＮＡからなる。

【0118】

別の好ましい実施形態では、ＳＥＶ組成物は、直接定量で測定したとき、以下のマイクロＲＮＡのうちの少なくとも１つをそれぞれの量で含む：ｍｉＲ－１５０－５ｐ＞１．３ｐｇ／１０^９部、ｍｉＲ－２２３－３ｐ＞１．２ｐｇ／１０^９部、ｍｉＲ－１６－５ｐ＞０．５ｐｇ／１０^９部、ｍｉＲ－１４２－３ｐ＞０．４ｐｇ／１０^９部、ｍｉＲ－１９ｂ＞０．２ｐｇ／１０^９部。

【0119】

別の好ましい実施形態では、直接定量で測定したとき、ＳＥＶ組成物中に存在するマイクロＲＮＡは、以下の群から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡ及びそれぞれの量からなる：ｍｉＲ－１５０－５ｐ＞１．３ｐｇ／１０^９部、ｍｉＲ－２２３－３ｐ＞１．２ｐｇ／１０^９部、ｍｉＲ－１６－５ｐ＞０．５ｐｇ／１０^９部、ｍｉＲ－１４２－３ｐ＞０．４ｐｇ／１０^９部、ｍｉＲ－１９ｂ＞０．２ｐｇ／１０^９部。

【0120】

別の実施形態では、ＳＥＶ組成物中の脂質は、本質的に、表９に列挙された脂質、すなわち、ＣＥ、ＤＡＧ、ＰＡ、ＰＣ、ＰＥ、ＰＧ、ＰＩ、ＰＳ、ＳＭ、ＴＡＧの群から選択される１つ以上からなる。

【0121】

別の実施形態では、脂質は、表９に列挙されるとおり、総脂質濃度に対してそれぞれの割合でＳＥＶ組成物中に存在する、すなわち、ＣＥ≧０．０５±０．０５、ＤＡＧ≧１．３±０．４、ＰＡ≧３．１８±０．６、ＰＣ≧３０．９±３．３、ＰＥ≧１３．０±０．５、ＰＧ≧０．２５±０．１、ＰＩ≧３．８±０．３、ＰＳ≧２９．４±３．７、ＳＭ≧１８．０±１．６、ＴＡＧ≧０．０７４±０．１３である。

【0122】

好ましい実施形態では、ＳＥＶ組成物は、上記の３つの分子群のそれぞれを含むかまたはそれぞれからなり、以下において生物学的活性を有する：
－表１及び３の同定されたタンパク質及びそれぞれの量；
－表４及び５の同定されたＲＮＡ及びそれぞれの量；
－表１０の脂質。

【0123】

別の好ましい実施形態では、ＳＥＶ組成物は、上記の３つの分子群のそれぞれを含むかまたはそれぞれからなり、以下のうちの少なくとも１つの組み合わせにおいて、生物学的活性を有する：
－タンパク質：ＡＮＸＡ２、ＡＮＫ１、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ９及びＣＤ１５；
－ＲＮＡ：好ましくは、ｍｉＲ－１５０－５ｐ、ｍｉＲ－２２３－３ｐ、ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１９ｂ、及び
－表１０の脂質、すなわち、ＣＥ、ＤＡＧ、ＰＡ、ＰＣ、ＰＥ、ＰＧ、ＰＩ、ＰＳ、ＳＭ、ＴＡＧ。

【0124】

５．組成物の生物学的効果
５．１マクロファージに対するｉｎ ｖｉｔｒｏ抗炎症の影響
単球及びマクロファージは、幅広い免疫調節、炎症、及び組織修復能力を有しており、多くの自己免疫及び疾患の発症に積極的に関与している。実際に、これらの細胞の浸潤及び誇張された活性化は、多くの自己免疫疾患、ならびに１型糖尿病、関節リウマチなどの炎症性疾患でも一般的に観察される。

【0125】

炎症に対するＳＥＶの生物学的効果は、化合物であるホルボール１２－ミリステート－１３－アセテート（ＰＭＡ）の作用によって単球細胞株（ＴＨＰ－１）から分化したマクロファージで構成されるｉｎ ｖｉｔｒｏモデルで評価した。

【0126】

分化したマクロファージを１ｘ１０^１０部／ｍＬのＳＥＶとインキュベートし、２４時間後、それらの表現型を評価し、炎症誘発性プロセスに関与する３つの主要なサイトカインのｍＲＮＡレベルを評価した（図６Ａ）。陽性対照として、マクロファージをＬＰＳとインキュベートした。これは、強い炎症反応を誘発する。

【0127】

マクロファージは、異なる刺激に応答して、２つの異なる主要な表現型：Ｍ１（炎症誘発性）及びＭ２（抗炎症性）を獲得することができる。古典的に活性化されたかまたはＭ１マクロファージ表現型は、ＴＮＦ－αなどの炎症性サイトカインを産生し、急性炎症を引き起こすが、代替的に活性化されたＭ２表現型は抗炎症性であり、組織及び創傷修復に重要な役割を果たすことが判明している。

【0128】

本発明において、ＣＤ８６及びＣＤ１６３染色は、Ｍａｒｔｉｎｅｚ ａｎｄ Ｇｏｒｄｏｎ（２０１４）によって記載されたとおり、それぞれ、Ｍ１及びＭ２表現型を区別するために使用した。本発明のプロセスによって単離されたＳＥＶで処理されたマクロファージ（ＣＤ１４^＋）におけるＭ１／Ｍ２比の減少が観察され、抗炎症性マクロファージのより高い有病率を示している（図６Ｂ）。

【0129】

ビヒクル（ＰＢＳ）と比較して、ＳＥＶはマクロファージにおけるＩＦＮ－γ、ＩＬ１β、ＴＮＦ－α、及びＣＯＸ－２のｍＲＮＡ発現を減少させたが（図６Ｃ）、その差は統計的に有意ではなかった。

【0130】

次に、ＳＥＶが慢性炎症状態への進行を打ち消すことができるかを評価することを決定した。そのために、ＬＰＳにより刺激され、ＳＥＶと共インキュベートされたＴＨＰ－１由来のマクロファージを使用した（図７Ａ）。

【0131】

このモデルでは、ＳＥＶは、以前のモデルよりも大きい影響を有し、Ｍ１／Ｍ２比を低下させることができた（図７Ｂ）。付随して、異なる炎症誘発性サイトカインのｍＲＮＡ発現は、ＳＥＶ治療により有意に減少した（図７Ｃ）。

【0132】

さらに、ＴＨＰ－１由来のマクロファージにおけるＴＮＦ－α分泌の有意な減少を観察し、これは、この細胞モデルの炎症が少なくなることを示している。

【0133】

これらの結果は、ＳＥＶが炎症期の解消を誘導し得ることを示している。炎症期の解消は、皮膚の炎症性疾患のみでなく、病原性が慢性炎症に集中している他の全身性疾患にも利益をもたらす。

【0134】

５．２末梢血単核細胞（ＰＢＭＮＣ）に対するＳＥＶのｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫調節効果
本発明の組成物の免疫調節能を評価する目的で、本発明のＳＥＶ組成物を有する健康なヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＮＣ）のサンプルを分析し、Ｔ細胞の増殖及び分極を評価した。

【0135】

セクション１に記載されるように、ＳＥＶを含み、本発明の方法に従って得た組成物を、１ｘ１０^１０部／ｍＬの濃度でＰＢＭＮＣの３つのドナーサンプルに適用した。ウェルあたり１０^６のＰＢＭＮＣを、枯渇ＲＰＭＩ １６４０完全培地を含む２４ウェルプレートで培養し、６日間インキュベーションした後、Ｔ細胞増殖及びＴｒｅｇの有病率（ＣＤ２５及びＦｏｘＰ３陽性）をフローサイトメトリーによってＴ細胞亜集団内で評価した。抗体染色の前に、細胞を洗浄し、固定し、透過処理した。

【0136】

ＳＥＶ組成物での処理時に、Ｔリンパ球集団全体（ＣＤ３^＋細胞）の減少－５８．７±３．８％対３８．９±６．６％－及びＣＤ４＋Ｔリンパ球サブセット－４２．９±２．１％対２８．９±６．５％－及びＣＤ８＋Ｔ細胞－６６．２±４．１％対４１．５４±１４．０％が観察された（図８Ａ～Ｃ）。それにもかかわらず、細胞生存率への影響は示されなかった（図８Ｄ）。

【0137】

さらに、ＳＥＶ組成物は、培養サンプル中のＴｒｅｇの割合を有意に増加させることができた（ＳＥＶ組成物を含まない培養での対照の５．２４±２．５３％に対して、治療した場合は９．６８±１．８９％）（図９）。これらの結果は、組成物がＴｒｅｇ細胞に対するＴ細胞分極を増強することができ、それが免疫寛容及びＴｒｅｇ／Ｔｅｆ比のリバランスを増大させることを示している。

【0138】

Ｔｒｅｇ／Ｔｅｆｆ比のリバランスの考えを強化するために、ＩＬ－７受容体α（ＣＤ１２７）は、その発現がＦｏｘＰ３活性と逆相関しており、このことがエフェクター及びメモリーＴ細胞の大部分で報告されているため、Ｔｒｅｇの陰性マーカーとして使用した。この実験では、ＳＥＶはＣＤ４^＋細胞内のＴｒｅｇ集団を増加させ、エフェクターＴ細胞の割合を減少させることができた（図１０Ａ及び図１０Ｂ）。最後に、これらの差により、ＰＢＭＮＣ混合物のＴｒｅｇ／Ｔｅｆｆ比が高くなる（図１０Ｃ）。Ｔｒｅｇの集団が増加することにより抗腫瘍免疫を損なうが、自己免疫疾患の状況では、Ｔｒｅｇの存在は、自己寛容及び組織恒常性の維持の中心である。さらに、ＳＥＶはエフェクター表現型への細胞分化において阻害効果を有すると考えられる。

【0139】

ＩＦＮ－γ分泌とＴ細胞活性化のレベルとの間には直接的な相関関係がある。Ｔ細胞の分泌ＩＦＮ－γ応答に対するＳＥＶの効果を決定するために、ＰＢＭＮＣをＳＥＶの存在下及び非存在下で６日間培養し、ＩＦＮ－γの細胞内レベルをＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞サブセットで決定した。これらの結果は、６日目に、両方のＴ細胞サブセットにおいて、陽性対照と比較して、ＰＢＭＮＣをＳＥＶと共に培養した場合に細胞内ＩＦＮ－γの割合が減少したことを示している。しかし、この減少は、ゲートＣＤ４^＋Ｔ細胞でのみ統計的に有意であった（図１１Ａ）。これらの結果は、本発明の革新的な方法論によって単離されたＳＥＶがリンパ球ＩＦＮ－γ分泌を損なうことを示した。

【0140】

さらに、Ｔヘルパー細胞の分極は、ＳＥＶ投与後２日目及び６日目のリンパ球サブセットにおける系統遺伝子の発現を定量化することによって評価した。ＰＢＭＮＣ混合物から、リンパ球をそのサイズ及び複雑さに基づいて選別し、トータルＲＮＡを抽出し、相補ＤＮＡに変換し、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により最終的に分析した。この目的のために、Ｚｈｕ，Ｙａｍａｎｅ，ａｎｄ Ｐａｕｌ（２０１０）に記載の方法に従って、各系統についてマスター転写因子（Ｔｈ２についてはＧＡＴＡ３、Ｔｈ１についてはＴ－ｂｅｔ、Ｔｒｅｇについては、Ｆｏｘｐ３、及びＴｈ１７についてはＲＯＲγＴ）を評価した。

【0141】

ＰＢＭＮＣをＳＥＶ組成物と共に１ｘ１０^１０部／ｍＬでインキュベートし、６日目（０日目は投与日）にいくつかの転写因子の発現を定量化した（図１２）。Ｔ－ｂｅｔ及びＧａｔａ３のｍＲＮＡレベルから観察されるとおり、ＳＥＶ組成物は、ＳＥＶ投与後６日目にＴｈ１及びＴｈ２ Ｔ細胞サブセットに実質的に影響を与えることはないと考えられる（図１２Ａ及び図１２Ｂ）。しかし、これらの転写因子を下方制御する傾向が、４８時間後に観察される。

【0142】

ＳＥＶがＴｒｅｇ表現型への分化を誘導し、ＦｏｘＰ３の発現が増加することが観察された（図１２Ｄ）。

【0143】

驚くべきことに、ＲＯＲγＴの有意な阻害が観察され、これは、ＳＥＶ組成物で治療したときに、Ｔｈ１７細胞の拡張が減少することを示唆している（図１２Ｃ）。したがって、Ｔリンパ球を本発明のＳＥＶ組成物に曝露させると、Ｔｒｅｇ細胞の集団が増加する一方で、Ｔｈ１７ Ｔ細胞サブセットが制限される。これらの結果は、乾癬のマウスモデルで行われたＰＯＣによって裏付けられている。

【0144】

最後に、サイトカインの分泌についてＳＥＶの可能性を評価した。いかなる刺激もない場合に、任意の小分子の分泌も検出することはできなかった。しかし、リポ多糖（ＬＰＳ）刺激は、分泌を非常に増加させた。このように、ＬＰＳ及びＳＥＶと同時に刺激すると、ＰＢＭＮＣ混合物はＴＮＦ－α分泌を大幅に減少させる。ＴＮＦ－αは、ヒトの免疫及びいくつかの炎症性疾患の調節に関与する炎症誘発性サイトカインである。このサイトカインは、自己免疫性炎症性疾患の病因において重要な役割を果たすため、現在の生物学的療法はその生物学的機能を遮断するように設計されている。システム内のＴｒｅｇを増加させるＳＥＶの可能性に加えて、ＴＮＦ－α分泌の減少は、ＳＥＶの免疫調節効果及び今後の自己免疫療法の別の指標である。

【0145】

さらに、ＣＣＬ２０分泌の試験も行った。ＣＣＬ２０の主要効果のうちの１つは、ＣＣＲ６^＋リンパ球の動員を促進することである。ＣＣＲ６は、自然免疫系及び／または適応免疫系の様々な細胞、特にＴヘルパー１７（Ｔｈ１７）細胞によって発現され、多くの慢性炎症性疾患においてサイトカインＩＬ－１７Ａの放出を介して複数の機能を発揮する。この場合も、このケモカインのｉｎ ｖｉｔｒｏ産生の減少は、ＳＥＶの免疫調節能力に寄与する。

【0146】

本発明のＳＥＶ組成物が免疫寛容特性を示す、すなわち、調節表現型へのＴ細胞分化を介するというエビデンスが示された。

【0147】

これらの組成物の作用機序をさらに理解するために、２つの異なるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）をＰＢＭＮＣ混合物に直接トランスフェクトした。ｍｉＲ－１４６－５ｐは制御性Ｔ細胞で高度に発現している。その消失は、様々な器官でのＩＦＮγ依存性免疫介在性病変内に現れる免疫寛容の崩壊となるため、免疫抑制機能にとっては必須である。ｍｉＲ－１５０－５ｐは、他のｍｉＲとの結合におけるＴｒｅｇ分化ドライバーとして報告されているが、その役割はＣＤ８^＋エフェクター細胞の誘導及び増殖によって示されている。

【0148】

ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐに関して、これらの結果はＴ－ｂｅｔ及びＦｏｘＰ３発現の有意な増加を示した（図１４）。ＦｏｘＰ３の優れた発現は、ｍｉＲ－１４６－５ｐの主要な役割がＴ細胞をＴｒｅｇに分化させ得ることを示している。ｍｉＲ－１４６－５ｐによるＴｈ１細胞への優先的な分化は、このｍｉＲの濃度の増加がＴ－ｂｅｔ経路の過剰発現につながるアテローム性動脈硬化症においてすでに実証されている。

【0149】

驚いたことに、ｍｉＲ－１５０－５ｐトランスフェクションは、ＲＯＲγＴ及びＦｏｘＰ３の過剰発現をもたらした。これは、このｍｉＲが、Ｔｈ１７分化を抑制でき、自己免疫を制御できるＴ制御性１７ ＦｏｘＰ３^＋ＲＯＲγｔ^＋として近年記述された新しい制御性Ｔ細胞サブタイプへの分化を誘導することを示している。

【0150】

遺伝子発現解析と並行して、フローサイトメトリーによってＴｒｅｇ細胞の割合を定量化し、両方のｍｉＲでトランスフェクトされたＰＢＭＮＣで制御性Ｔ細胞サブセットの増加が観察された（図１４Ｅ）。対照（トランスフェクション剤：ＶｉｒＢ）に対して、ｍｉＲ－１４６－５ｐは、ＩＬ１７Ａ発現細胞を減少させることもできた（図１４Ｆ）。

【0151】

要するに、ＳＥＶ組成物は、以下であることが実証された：
－Ｔ細胞の増殖を減少／減衰させる；
－制御性Ｔ細胞の分化を誘導する；
－リンパ球のｍＲＮＡ発現に異なる影響を及ぼす；
－ＰＢＭＮＣにおけるＦｏｘＰ３ ｍＲＮＡの発現に異なる影響を及ぼす；
－炎症誘発性サイトカインの分泌を減少させる；
－ｍｉＲ－１５０－５ｐ及びｍｉＲ－１４６－５ｐは、リンパ球の発現プロファイルに実質的な影響を示す；
－ｍｉＲ－１５０－５ｐ及びｍｉＲ－１４６－５ｐは、リンパ球の表現型に実質的な影響を示す。

【0152】

これらの結果は、本発明のＳＥＶ組成物が免疫細胞に有利な効果を有することを示し、したがって、本組成物は、免疫系の不均衡または過剰反応に関連する疾患を治療または予防するために適用するのに有用である。

【0153】

５．３乾癬への影響－ｉｎ ｖｉｔｒｏ
ＳＥＶ組成物がＴｒｅｇの数を増加させるのみでなく、Ｔｈ１７ Ｔ細胞系統のマスター転写因子であるＲＯＲγＴの発現を減少させることができることを実証した上記のこれまでの結果に基づいて、乾癬表皮モデルにおける組成物の影響を調査した。

【0154】

その目的のために、最初にケラチノサイトをＣａ２^＋で分化させて表皮の最外層を模倣し、炎症誘発性の特性を通じて、乾癬の表現型のほとんどに類似していることが記載されている化合物である、５％イミキモド（ＩＭＱ）を適用した。

【0155】

３時間の同時インキュベーション（ＳＥＶ組成物及びＩＭＱ）後、ＳＥＶ組成物の適用に応答して、ＴＮＦ－ｃｘの発現の減少及びＶＥＧＦ－ａ及びＴＧＦ－β１の発現の増加が観察された（図１５）。

【0156】

ＴＮＦ－αは炎症誘発性サイトカインであり、いくつかの異なる経路（血管内皮細胞への接着分子の誘導を通じて、病変皮膚への炎症細胞の侵入を促進する；他の炎症誘発性メディエータのケラチノサイト産生を刺激し、皮膚マクロファージ及び樹状細胞を活性化する）を介して炎症を増幅する。したがって、ＳＥＶ組成物によって促進されるその阻害は、樹状細胞の悪意のある活性化サイクルを遮断することによって乾癬の病態生理学を改善することができる。

【0157】

一方で、これらの組成物は、ＶＥＧＦＡ及びＴＧＦβ１の発現を刺激した。ＶＥＧＦＡは、樹状細胞の成熟を阻害し、Ｔｒｅｇの増殖を刺激するため、免疫抑制性腫瘍微小環境の確立に重要な役割を果たす。

【0158】

また、ＴＧＦ－β１は、自己応答性Ｔ細胞の直接的及び間接的な調節により、炎症を制限し、末梢性免疫寛容を制御することが示されている。ＴＧＦ－βはＴ細胞耐性に必須であるが、近年、ＴＧＦ－βシグナル伝達の喪失のみでは自己免疫を誘導するには不十分であることが提唱されている。

【0159】

同様のモデルでは、ＳＥＶ組成物の刺激により、ビヒクルと比較した場合、ＩＬ－６発現の下方制御が増強した（図１５Ｄ）。ＩＬ－６は、Ｔｒｅｇ及びＴｈ１７のバランスを制御できるサイトカインであるため、この結果は、自己免疫疾患の状況にとって特に重要である。ＣＤ４^＋Ｔ細胞の分化では、Ｔｒｅｇ及びＴｈ１７は双方ともＴＧＦβに依存するが、Ｔｈ１７は、さらにＩＬ－６を必要とする。ＩＬ－６の発現を減少させることは、自己免疫疾患、すなわち乾癬の制御に寄与し得る。

【0160】

これらの結果は、ＳＥＶ組成物が、
－乾癬様ＮＨＥＫモデルにおいてＴＮＦ－α及びＩＬ－６などの炎症誘発性分子の発現を減少させる；
－乾癬様ＮＨＥＫモデルにおいてＶＥＧＦＡ及びＴＧＦβ１の発現を増強する。

【0161】

したがって、本発明のＳＥＶ組成物が乾癬の治療または予防に適用するのに有用であることも実証された。

【0162】

５．４乾癬様表皮への効果
皮膚における潜在的な抗乾癬効果を確認するために、市販の三次元表皮モデル（ＰＳＯＲＩＡＳＩＳ ＬＩＫＥ ＥＰＩＤＥＲＭＩＳ、Ｓｔｅｒｌａｂ）を使用した。モデルは、毎日、ＳＥＶ組成物の単回投与により５日間治療された。実験の最後に、ＲＮＡ分析のために細胞を収集し、タンパク質分泌の定量化のために上清を収集した。

【0163】

これらの結果は、ＳＥＶ組成物が、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γなどのいくつかのサイトカインのｍＲＮＡ発現を下方制御することを示しており（図１６Ａ）、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＩＭＱ治療ケラチノサイトモデルで得られたデータを裏付けるものである。

【0164】

さらに、抗菌ペプチド（Ｓ１００Ａ７及びＤＥＦＢ４）の発現を分析し、両方の一貫した下方制御が見られた（図１６Ｂ．１及び図１６Ｂ．２）。これらのペプチドは主に乾癬の表皮で発現し、乾癬の特徴であるケラチノサイト分化の調節不全の原因である。

【0165】

さらに、これらの抗菌ペプチドは、好中球及びＴ細胞の走化性に寄与し、乾癬の表現型を悪化させる。これらのペプチドの発現を減少させることは、乾癬の病態生理学を改善することに大きく寄与する。

【0166】

さらに、ＳＥＶ組成物は、ＫＲＴ５でいかなる差も認められなかったため、ケラチノサイトの分化段階に影響を与えないと考えられる（図１６Ｃ．１）。興味深いことに、Ｃｏｘ－２の発現は治療群において下方制御されており、炎症の抑制に寄与することが期待されている（図１６Ｃ．２）。次に、この酵素は、ＳＥＶ組成物において最も豊富なマイクロＲＮＡ種のうちの１つであるｍｉＲ－１６－５ｐによって下方制御され、作用機序がｍｉＲ－１６に依存し得ることが示唆されている。

【0167】

タンパク質の分泌を分析する場合、ＳＥＶ組成物の適用により、乾癬の病状に関与する２つのサイトカインであるＣＣＬ２０及びＴＮＦ－αが減少することが観察された（図１６Ｄ）。

【0168】

これらの結果は、本発明に記載のＳＥＶが、乾癬及び他の自己免疫疾患を持続するいくつかの分子経路に影響を与えることによって、強力な抗乾癬効果を促進することを示している。これらの結果は、ＳＥＶが表皮が関与するヒトの疾患の抗炎症剤として使用され得ることを示唆している。

【0169】

５．５乾癬への効果－ｉｎ ｖｉｖｏ
乾癬のｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいてＳＥＶ組成物の有効性にアクセスするために、ｖａｎ ｄｅｒ Ｆｉｔｓ ｅｔ ａｌ．（２００９）に記載されている方法に従って、表現型がマウスの乾癬に似ているモデルとして、ＩＭＱ誘発性皮膚炎症を選択した。

【0170】

モデルは、５％ ＩＭＱを含むクリーム製剤であるＡｌｄａｒａ（登録商標）を５日間毎日局所塗布することによって誘導した。ＩＭＱは、ｔｏｌｌ様受容体ＴＬＲ７及びＴＬＲ８のリガンドであり、局所治療部位及び遠隔部位の両方において乾癬を悪化させる。ＴＬＲ７及びＴＬＲ８は、単球、マクロファージ、及び樹状細胞によって発現され、活性化されたときに炎症誘発性サイトカイン及びケモカインの産生を引き起こす。Ａｌｄａｒａ（登録商標）をマウスの無毛の背中に塗布することにより、塗布後５日以内に乾癬様病変が発生し、様々な細胞の流入及び表皮の過形成によって支持される。

【0171】

ＳＥＶ組成物による６日間の連続局所治療の間、マウスの皮膚の臨床スコアを監視した。最終値は、３つのパラメーター：紅斑の重症度（０～４までの発赤）、患部（０～３）、及び落屑（０～２からのスケール）の合計とした。本発明のＳＥＶ組成物の局所適用は、乾癬の特徴の出現を遅らせ、時間と共にそれらの特徴を弱めた（図１７Ｃ）。表現型の外部特性は、ＳＥＶで治療されたマウスにおいて観察される表皮の厚さの減少によって裏付けられる（図１７Ｄ）。

【0172】

さらに、本組成物による局所治療は、皮膚浸潤性好中球（ＣＤ４５^＋ＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋ＣＤ６４^－）及び成熟Ｔリンパ球（ＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ＴＣＲαβ^＋）の数を有意に減少させる（図１８Ａ．２及び図１８Ａ．３）。好中球及びＴ細胞の両方が、乾癬の病因の主要な因子である。

【0173】

活性化Ｔ細胞は、ＩＬ－１７、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ、及びＩＬ－２２などの豊富なサイトカインを産生し、好中球はＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、及びＣＸＣＬ８／ＩＬ－８などのケモカインを分泌する。サイトカイン及びケモカインが両方とも、新たにＴｈ１及びＴｈ１７免疫細胞を分極し、ケラチノサイトの過剰増殖を活性化することにより、乾癬の悪循環に寄与する。炎症性マクロファージの存在が減少する傾向があり（図１８Ａ．１）、これは皮膚生検におけるｉＮＯＳの発現の減少（図１８Ｂ．３）によって強化される。この場合も、皮膚において浸潤炎症細胞が減少することにより、乾癬の症状が改善されるであろう。

【0174】

さらに、乾癬の病因は、リンパ節内のエフェクターＴ細胞の蓄積、及びその後の血液系を介した皮膚への移動を伴うことが一般的に認められている。

【0175】

これらの結果は、Ｔｈ１７細胞及びガンマデルタ発現細胞がＳＥＶ組成物で治療されたマウスリンパ節で有意に減少したことを示している（図１９Ａ．３及び図１９Ａ．４）。これらの細胞サブセットは、主要なＩＬ１７Ａ産生細胞であり、それらが減少することは、乾癬の病態生理学の有意な改善に寄与する。

【0176】

Ｔｈ１７細胞の減少に加えて、ＳＥＶで治療された動物のリンパ節サンプルでもｍＲＮＡ ＲＯＲγｔレベルが減少した（図１９Ｂ．３）。リンパ節でのＩＬ－１７産生細胞の減少は、マウスの皮膚へのさらなる浸潤を減少させ、乾癬を軽減できる。この効果は、微小環境内のサイトカイン／ケモカインの量を減少させ、より多くのヘルパーＴ細胞の動員を妨げる好中球数の減少によっても増強され得る。

【0177】

さらに、乾癬は、ＣＤ８によって引き起こされる疾患であるため、本明細書に記載されているＳＥＶ組成物で治療された動物においては、皮膚（図１８Ａ．４）及びリンパ節（図１９Ａ．１）の両方においてこれらの細胞の存在量が減少することにより、悪化した免疫応答の解消への影響は明白となる。

【0178】

したがって、本発明のＳＥＶ組成物は、ｉｎ－ｖｉｖｏモデルにおいて乾癬様皮膚炎症を改善することができる。
６．Ｉｎ ｖｉｖｏでの組織修復－創傷治癒における効果
本発明者らは、ＳＥＶを単離する本発明のプロセスが、それらの生物活性及び皮膚創傷を治療する可能性に影響を有するかを検証することを決定した。

【0179】

これらの結果は、従来技術の方法（ＵＣ－超遠心分離）で単離されたＳＥＶは、本発明の方法ＵＦ－ＳＥＣで単離されたものよりも生物活性が低いことを示している（図２０Ｂ）。本発明の方法は、実験で使用されたすべての動物において創傷閉鎖を有意に加速させた。さらに、図２０Ｂでは、治癒の最初の７日間に差が集中していることが観察される。３日目に、本発明の方法で単離されたＳＥＶにより治療された動物は、創傷サイズの２０％の減少を示し、１０日目に、この差は依然として有意であった（図２０Ｂ）。

【0180】

結論として、本発明は、臍帯血単核細胞（ＵＣＢＭＮＣ）からの小型細胞外小胞の単離など、臍帯血細胞（ＵＣＢＣ）によって分泌される小型細胞外小胞を単離するためのプロセス、及びＵＣＢ画分を処理することによって得られる小型細胞外小胞を含む組成物に関し、これは、炎症性または自己免疫性疾患の治療もしくは予防及び／または美容目的に適用するのに有用である。

【0181】

したがって、本発明はまた、治療法、化粧品、及び／または予防方法に適用するのに有用である小型細胞外小胞医薬組成物に関する。

【0182】

したがって、本発明の一実施形態では、上記のＳＥＶを使用して、化粧品として、医薬品として、及び／または予防剤として適用される医薬組成物を製造する。

【0183】

別の実施形態では、上記のＳＥＶは、皮膚自己免疫疾患治療法など自己免疫疾患治療法に適用される医薬組成物を生成するために使用される。

【0184】

別の実施形態では、上記のＳＥＶは、皮膚組織修復などの組織修復のほか、切開、裂傷（ｌａｃｅｒａｔｉｏｎ）、裂傷（ｔｅａｒ）、擦過傷、剥離または外科的創傷などの皮膚開放創治療、熱傷、化学熱傷または放射線熱傷などの皮膚熱傷療法、及び／またはにきび、乾癬、しゅさ、皮膚炎、湿疹、伝染性膿痂疹、間擦疹、もしくは毛包炎などの皮膚状態もしくは疾患、動脈性潰瘍、静脈性潰瘍、糖尿病性潰瘍及び圧迫性潰瘍、術後潰瘍、外傷性潰瘍、口内潰瘍、糖尿病性足潰瘍もしくは角膜潰瘍などの創傷治療において、医薬品として適用される医薬組成物を生成するために使用される。

【0185】

別の実施形態では、上記のＳＥＶは、液体形態、スプレー形態、クリーム形態、ゲル形態のほか、食用溶液、外部塗布可能溶液、内部塗布可能溶液または注射可能溶液としての液体形態である組成物を生成するために使用される。

【0186】

別の実施形態では、上記のＳＥＶは、天然または合成ポリマーマトリックス、パッチ、または別の好適な医療用担体などの担体によって支持される組成物を生成するために使用される。

【実施例】

【0187】

実施例１．ＰＢＭＮＣの収集及び処理
ヒトの血液サンプルは、Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｒｉｏ ｄｅ Ｃｏｉｍｂｒａから入手し、インフォームドコンセントを提供した後、健康なボランティアから献血を受けた。ＰＢＭＮＣは、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（登録商標）勾配遠心分離によって単離した。ＰＢＭＮＣは液体窒素で凍結し、保管した。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験では、細胞アリコートを３７℃で解凍し、１０ｍＬのＲＰＭＩ１６４０に添加し、３００ｇで５分間遠心分離して、ＤＭＳＯを除去した。ペレットは、１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０に再懸濁した。ＰＢＭＣを９６ウェル平底培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ－Ｃｏｓｔａｒ、Ｃｅｌｂｉｏ、Ｍｉｌａｎ、Ｉｔａｌｙ）に２～３ｘ１０^５細胞／ウェルの密度で播種し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。

【0188】

実施例２．遺伝子発現解析
ＲＮＡサンプルは、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）によって製造業者の推奨に従って抽出した。ＲＮＡ濃度は、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ）のトータルＲＮＡチップで定量した。すべてのＲＮＡサンプルは－８０℃で保管した。ＲＮＡは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ ＶＩＬＯ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の製造業者の指示に従って逆転写した。逆転写後、ｃＤＮＡはすぐにｑＰＣＲに使用されるか、－２０℃で保存した。ｑＰＣＲは、ＮＺＹＳｐｅｅｄｙ ｑＰＣＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（２ｘ）、ＣＦＸ９６Ｔｏｕｃｈ（登録商標）リアルタイムＰＣＲ検出システム（ＢｉｏＲａｄ）の９６ウェルフォーマットのＲＯＸを使用して実施した。

【0189】

以下の条件、９５℃で２分間、その後９５℃で５秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で２０秒間（蛍光測定）を４０サイクルｑＰＣＲのために使用した。少なくとも３つの生物学的複製を使用した。β－アクチン（ＡＣＴＢ）は、各サンプルを正規化するための内因性対照として使用した。得られたデータは、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアを使用して分析した。目的の遺伝子の相対的発現を２^{－ΔΔＣｔ}法に従って分析した。

【0190】

実施例３．フローサイトメトリー
ＰＢＭＮＣを収集し、赤血球を赤血球溶解バッファーで浸透圧溶解した。細胞表面染色では、単細胞懸濁液を飽和濃度のｍＡｂと共に３０分間インキュベートした。細胞を上記で同定した細胞表面マーカーで染色し、４℃で３０分間固定し、抗ＣＤ１６／ＣＤ３２（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の存在下でＦｏｘｐ３／転写因子染色バッファーセット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で、４℃で１５分間透過処理し、最後に、透過化バッファー中の上記で同定された抗体と共に４℃で１時間インキュベートした。サンプルは、ＢＤ ａｃｃｕｒｉ Ｃ６（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して得た。データは、ＦｌｏｗＪｏ７．０．０ソフトウェアを使用して分析した。

【0191】

実施例４．ＵＣＢＭＮＣ培養
ＰＢＭＮＣを収集し、赤血球を赤血球溶解バッファーで浸透圧溶解した。細胞表面染色では、単細胞懸濁液を飽和濃度のｍＡｂと共に３０分間インキュベートした（表３）。細胞を上記で同定した細胞表面マーカーで染色し、４℃で３０分間固定し、Ｆｏｘｐ３／転写因子染色バッファーセット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で、４℃で１５分間透過処理し、最後に、透過化バッファー中の上記で同定された抗体と共に４℃で１時間インキュベートした。サンプルは、ＢＤ ａｃｃｕｒｉ Ｃ６（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して得た。データは、ＦｌｏｗＪｏ７．０．０ソフトウェアを使用して分析した。

【0192】

実施例５．ＰＢＭＮＣのトランスフェクション
ＰＢＭＮＣをｍｉＲＮＡでトランスフェクトするために、Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｃａｌｙｘ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）Ｂｌｕｅ及びＶｉｒｏｍｅｒ（登録商標）Ｇｒｅｅｎは、膜融合のウイルスメカニズムを特徴とするポリマーベースのトランスフェクション試薬である。それらは、数百ナノメートルのサイズの低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）とトランスフェクション複合体を形成する。Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）：ＲＮＡ複合体は、酸性コンパートメントの形成を伴うプロセスであるエンドサイトーシスによって取り込まれる。後期エンドソームでの低ｐＨは、Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）表面を疎水性にし、膜通過を促進する化学スイッチとして作用する。この「能動的エンドソームエスケープ」技術は安全であり、かつ自然な取り込み経路を使用しているため、トランスフェクション効率が最大化される。細胞質に到達すると、Ｖｉｒｏｍｅｒ複合体は分解し、ＲＮＡまたはＤＮＡを放出する。革新的なＶｉｒｏｍｅｒ（登録商標）複合体は非荷電であり、ウシ胎児血清または他の細胞培養培地サプリメントに含まれるタンパク質との凝集を防ぐ。これは、Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）が細胞に非常に穏やかであり、血清、抗生物質、及び分化因子と互換性があるという大きな利点となる。

【0193】

Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）Ｂｌｕｅ及びＶｉｒｏｍｅｒ（登録商標）Ｇｒｅｅｎは、ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション用に最適化されている。これらは、浮遊細胞、幹細胞、及び初代細胞など、広範囲の標準細胞及びトランスフェクションが困難な細胞に非常に効果的である。

【0194】

トランスフェクションは、製造業者の推奨に従って実行した。簡潔に説明すると、ＰＢＭＮＣを１ｘ１０^６細胞／ｍｌの濃度で１２ウェルプレートにプレプレートした（ＲＰＭＩ培地、血清非含有、抗生物質非含有）。次に、Ｖｉｒｏｍｅｒバッファーで１０μＭ ｍｉＲ－ｍｉｍｉｃの希釈液を調製し、Ｖｉｒｏｍｅｒトランスフェクション試薬と混合した。室温で１５分後、トランスフェクション複合体を細胞に添加し、さらに６日間インキュベートした（ｍｉＲ－ｍｉｍｉｃ最終濃度は１００ｎＭであった）。

【0195】

実施例６．統計分析
棒グラフは、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として示す。統計的有意性は、必要に応じて、両側の対応のないスチューデントのｔ検定、Ｔｕｋｅｙの多重比較を使用した一元配置分散分析、またはＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ多重比較事後検定を使用した二元配置分散分析によって評価した。すべての分析は、ＧｒａｐＰｈａｄソフトウェアを使用して実行した。差はｐ＜０．０５で有意であると見なした。

【0196】

実施例７．小型細胞外小胞（ＳＥＶ）の単離
ＵＣＢユニットは、製造業者の推奨に従って、自動システムＡＸＰを使用して自動的に処理した。簡潔に説明すると、臍帯血はＡＸＰデバイスに配置された処理バッグセットに移され、遠心分離される。ＡＸＰデバイスは、ほとんどの標準的な血液バンク遠心分離バケットに適合し、最大６つのサンプルを同時に処理できる。遠心分離中に、成分の層化及び単離が生じる。ＲＢＣは別の滅菌バッグに移し、血漿が処理バッグ内に残っている間、ＭＮＣリッチ層を含むバフィーコートが別の滅菌凍結バッグに送られる（http://cescatherapeutics.com/blood-marrow-processing/axp -autoxpress/）。

【0197】

臍帯血（２．０００．０００細胞／ｍＬ）から得られたＭＮＣは、虚血（０．５％Ｏ２）条件下において、０．５μｇ／ｍＬのＦＭＳ様チロシンキナーゼ－３及び０．５μｇｍＬの幹細胞因子を補充したＸ－ＶＩＶＯ１５無血清細胞培養培地（Ｌｏｎｚａ Ｇｒｏｕｐ Ｌｔｄ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で培養した。

【0198】

１８時間の分泌後、馴化培地を注意深くｆａｌｃｏｎに移し、ＳＥＶの精製を進めた。
馴化培地は、３００ｇ（１０分）及び２０００ｇ（２０分）の２つの連続遠心分離ステップによって除去した。これらのステップの後、上清を収集し、シリンジを使用して２つのろ過ステップにさらして、最初に０．４５μＭフィルタを使用し、その後０．２２μｍを使用した。この最初のクリアランスの後、媒体は、圧力制御装置（ＶｉｖａＣｅｌｌ ２５０）を使用して最後の限外ろ過ステップにさらした。

【0199】

上清をＶｉｖａｃｅｌｌ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）デバイスの１００ＫＤａフィルタを通して３バールの圧力にさらし、ＳＥＶを含む上清を、ろ過したＰＢＳで洗浄した後、上部コンパートメントに回収した。次に、１３～１５ｍＬの濃縮溶液を、ＦＰＬＣ－Ａｋｔａ ＡｖａｎｔクロマトグラフィーシステムでそれぞれＳｕｐｅｒｏｓｅ６プレパックＸＫ２６／７０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用したサイズ排除クロマトグラフィーにかけた。ろ過したＰＢＳ溶液を流速３ｍＬ／分（ＸＫ２６／７０）で溶出バッファーとして使用し、３つの波長２２０ｎｍ、２６０ｎｍ、及び２８０ｎｍでＵＶ吸光度を検出した。ＮＴＡ及びＭｉｃｒｏＢＣＡによる分析のために、装置と組み合わせた自動フラクションコレクターを使用して、５ｍＬ（ＸＫ２６／７０）の画分を収集した。

【0200】

実施例８．小型細胞外小胞（ＳＥＶ）の特性評価
８．１．タンパク質の特性評価
本明細書においてＵＦまたはＩＮＶプロセスと呼ばれる、本発明のプロセスによって単離されたＳＥＶを、それらのタンパク質含有量の特徴を明らかにするために質量分析によって分析した。タンパク質濃度は、マイクロＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｓ（登録商標））によって測定し、タンデム質量分析と組み合わせたナノスケール液体クロマトグラフィー（ｎａｎｏＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を使用して約０．５μｇの総ペプチド材料を分析した。簡潔に言えば、サンプルを溶解し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに装填した。得られたゲルレーンを洗浄し、アルキル化の前にタンパク質をＤＴＴで還元した。洗浄後、トリプシンを使用してゲル内消化を行い、ペプチドを液体クロマトグラフィーによって分離し、ＭＳによって同定した。これらのタンパク質は、説明セクションの表１，２及び表３に列挙している。

【0201】

ＵＦ－ＳＥＣによって単離されたＳＥＶの３つの分析プール（各プールは５ＵＣＢから得て、合計１５ＵＣＢ）から、３１のタンパク質がプール間で共通であると同定され、これは、同定されたタンパク質含有量全体の平均６１％である。このグループ内では、アルブミン及び様々なヘモグロビンサブユニットが、最も多くの数の同定されたペプチド、その後バンド３の陰イオン輸送タンパク質及びハプトグロビンを有する。

【0202】

これらのタンパク質は、ヒト臍帯血の必須成分であり、それらの機能は赤血球による酸素供給に関連している。ＭＳは非常に強力なツールであり、１回の実行で多数のタンパク質を検出するが、その感度はサンプルのダイナミックレンジによって定義され、発現の低いタンパク質は検出されない場合がある。本発明者らは、Ｖｅｓｉｃｌｅｐｅｄｉａによると、これが、検出されたタンパク質の２２．５％（３１のうち７）のみがＳＥＶの特徴である理由であると考えている（http://www.microvesicles.org/）。

【0203】

８．２ＲＮＡの特性評価
ＲＮＡシーケンシング技術を使用して、ＳＥＶ組成物の低分子ＲＮＡ含有量を同定した。ＥＸＩＱＯＮ ｍｉＲＣＵＲＹＴＭ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキット（Ｃｅｌｌ＆Ｐｌａｎｔｓ）を使用してＲＮＡを単離し、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００で低分子ＲＮＡの品質及び定量を行った。Ｉｏｎ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ－Ｓｅｑ Ｋｉｔ ｖ２プロトコルに従って、１．５ｎｇの低分子ＲＮＡをスモールライブラリーの構築に使用した。プールされたライブラリーは、ＩｏｎＣｈｅｆ（登録商標）システムでさらに処理され、得られた５３０（商標）チップは、ＩｏｎＳ５（商標）システムで配列決定した。Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓツールは、各サンプル中の各遺伝子の相対的な存在量の注釈及び推定に使用した。

【0204】

本発明のプロセス（ＩＮＶ）で単離されたＳＥＶは、異なる種の低分子ＲＮＡを有し、転移ＲＮＡが最も豊富なＲＮＡ種であり、平均して５７％である。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）は２番目に優勢な種（約２７％）であり、リボソームＲＮＡ（約６％）及び他の少ないカテゴリーがそれに続く。サンプル間では、ＲＮＡ種に大きい差はない。この場合も、試験にはさらに多くのサンプルが必要であるが、表４及び表５に示すとおりｍｉＲの範囲を定義できる。

【0205】

８．３．脂質の特性評価

【0206】

【表10】

【0207】

実施例９．比較試験
国際公開第２０１７１６３１３２号（ＣＯＭＰ比較プロセス）に開示されているＳＥＶ単離の標準プロセスの性能と本発明のプロセス（ＩＮＶ発明プロセス）との比較目的のために、ＵＣＢのいくつかの等しいサンプルからの小型細胞外小胞を単離し、分析した。以下の表に結果を示す。

【0208】

本発明の方法は、実施例１から８に記載されているものに従って実施した。
虚血状態下

【0209】

虚血前は、自動ＵＣＢ処理から得られた細胞の特性評価には、手動で処理されたサンプルよりも大量のＲＢＣが含まれている。それにもかかわらず、各グループでのリンパ球／単球の比率は維持されており、２つのＵＣＢ処理方法間で統計的に異ならない。さらに重要なことに、自動ＵＣＢ処理サンプルは、手動処理（約８％）と比較した場合、細胞死の割合が低い（約２％）ことからわかるように、より多くの生存細胞を有する。

【0210】

虚血プロトコル（１８時間、０．５％Ｏ２及び５％ＣＯ２下で３７℃）の後、各集団は代表性を維持した。すなわち、リンパ球／単球比を維持した。予想とおり、極端な条件のため、細胞死は両方のグループで増加する。

【0211】

表１２は、ＣＯＭＰプロセス及びＩＮＶプロセスによって単離されたタンパク質の比較を示し、表１３は、生物学的機能によってグループ化された両方のプロセスによって単離されたタンパク質の比較を示している。
さらに、ＣＯＭＰ及びＩＮＶプロセスによって単離された小型細胞外小胞中の低分子ＲＮＡ種の割合も評価し、表１４に示される一方で、表１０は、ＩＮＶプロセス及びＣＯＭＰプロセスによって単離された小型細胞外小胞で同定されたマイクロＲＮＡを列挙している。

【0212】

【表11】

【0213】

【表12】

【0214】

【表13】

【0215】

【表14】

【0216】

小型細胞外小胞の収率に関して（図３）、ＩＮＶ方法論では、馴化培地（ＣＭ）１ｍｌあたりより多くの数の小型細胞外小胞が生成されることが観察された。さらに、開発されたＩＮＶ方法では、細胞培養に存在する主要な分泌細胞を考慮すると、かなり高い収率の小型細胞外小胞を生成した。

【0217】

要約すると、この新しいプロセスでは、馴化培地から単離された小型細胞外小胞の数量を増やすことが可能であり、これはＳＥＶの生産において非常に重要である。

【0218】

さらに、このＧＭＰ準拠の最適化された方法論を使用すると、従来技術のプロセス（ＣＯＭＰ）と比較した場合に非常に類似した生物物理学的特性を有するＳＥＶを生成することも可能である。

【0219】

実施例１０．免疫細胞におけるＳＥＶの効果
１０．１ＰＢＭＮＣ
制御性Ｔ細胞の分化
健康な血液ドナーのＰＢＭＮＣは、ＳＥＶ組成物（１ｘ１０^１０部／ｍＬ）またはビヒクルと共に６日間インキュベートした。細胞は、ＦＡＣＳ分析のために洗浄し、染色した。結果は平均±ＳＤ（ｎ＝５）として表す。

【0220】

統計分析は、スチューデントのｔ検定を使用して実行した。ＳＥＶ組成物の免疫調節能を評価するために、本発明のＳＥＶ組成物の存在の有無にかかわらず、健康なヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＮＣ）で試験を実施し、Ｔ細胞分極を評価した。

【0221】

ＳＥＶ組成物の１回の適用後、及び６日間のインキュベーション後、Ｔ細胞亜集団内のＴｒｅｇ（ＣＤ２５及びＦｏｘＰ３陽性）の有病率を評価した。ＳＥＶ組成物は、培養中のＴｒｅｇの割合を有意に増加させることができた（治療群では９．６８±１．８９％、対照群では５．２４±２．５３％）（図９）。これらの結果は、ＳＥＶ組成物がＴｒｅｇ細胞に対するＴ細胞分極を増強することができ、それが免疫寛容及びＴｒｅｇ／Ｔｅｆ比のリバランスを増大させることを示している。

【0222】

リンパ球のｍＲＮＡ発現に異なる影響を与える。

【0223】

さらに、Ｔヘルパー細胞の分極は、リンパ球サブセットにおける系統遺伝子の発現を経時的に定量化することによって評価した。各系統を評価するためにマスター転写因子を選択した。Ｔｈ２についてはＧＡＴＡ３；Ｔｈ１についてはＴ－ｂｅｔ；ＴｒｅｇについてはＦｏｘｐ３；Ｔｈ１７についてはＲＯＲγＴ。

【0224】

分析を補完するために、ＣＤ８Ｔ細胞に対するＩＦＮ－γの発現も評価した。

【0225】

ＳＥＶとの２４時間のインキュベーション後、分析された転写因子に有意差はない。４８時間後、治療群と非治療群の差が強調され始め、６日目に転写プロファイルはＴｒｅｇ表現型への分化を示し、ＦｏｘＰ３及びＴＧＦ－β１の発現が増加した。

【0226】

Ｔ－ｂｅｔ及びＧａｔａ３のｍＲＮＡレベルから観察されるとおり、ＳＥＶはＴｈ１及びＴｈ２Ｔ細胞サブセットに影響を与えないと考えられる。興味深いことに、ＲＯＲγＴの有意な阻害が観察され、これは、ＳＥＶ治療時にＴｈ１７細胞の拡張が減少していることを示唆している（図１２）。

【0227】

以前の報告では、この転写因子を発現する活性化Ｔ細胞の約５０％が、乾癬の病態生理学における重要なサイトカインであるＩＬ－１７Ａを産生することが示されていた。

【0228】

これらの結果に基づいて、Ｔリンパ球をＳＥＶに曝露することにより、Ｔｈ１７ Ｔ細胞サブセットを制限しながら、Ｔｒｅｇ細胞の集団が増加すると仮定する。

【0229】

これらの結果は、乾癬のマウスモデルで行われたＰＯＣによって裏付けられている。

【0230】

さらに、ＩＦＮ－γが免疫応答中のＣＤ８Ｔ細胞の拡大及び収縮の制御において重要な役割を果たすことはよく認識されている。このＴ細胞サブセットは、ＩＦＮγ及びＴＮＦα、細胞毒性顆粒の放出、及び感染細胞の破壊に関与している。ＳＥＶはＩＦＮγ発現の下方制御を誘導しており、これは、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の数が少なく、その結果として抗炎症効果があることを示唆している（図１１）。

【0231】

ＰＢＭＮＣにおけるＦｏｘＰ３ ｍＲＮＡの発現に異なる影響を及ぼす

【0232】

健康な血液ドナーのＰＢＭＮＣをＳＥＶ（１ｘ１０^１０部／ｍＬ）またはビヒクルと共に６日間インキュベートした。トータルＲＮＡを抽出し、β－アクチンを参照遺伝子として遺伝子発現解析を行った。正規化発現レベルは、２^{－ΔΔＣｔ}に基づいて計算した。一元配置分散分析（ｎ＝３）を使用して統計分析を実行した。

【0233】

ＳＥＶで処理したときには、Ｔ細胞の分極を分析するために別の戦略を使用した。トータルＲＮＡは、リンパ球サブセットの代わりにトータルＰＢＭＮＣ混合物から抽出した。これまでの差のいくつかは、おそらくｍＲＮＡの不均一性の増加が原因で希釈された。それにもかかわらず、ＦｏｘＰ３転写因子発現の増加が再び観察された。ＳＥＶの免疫調節効果は、微小環境におけるＴｒｅｇの濃縮に対して示され、これにより、免疫寛容が強化される。他の分析された因子は、Ｇａｔａ３の発現を除いて、ＳＥＶによる大幅な変更はなかった。排他的ではないが、Ｇａｔａ３の活性は、Ｔｈ２分化及びサイトカイン分泌を調節する。この減少は、喘息及びアレルギー性疾患の治療において特に重要であり得る。

【0234】

４８時間後のリンパ球発現プロファイルに対するｍｉＲ－１５０－５ｐ及びｍｉＲ－１４６－５ｐの影響

【0235】

健康な血液ドナーのＰＢＭＮＣは、ＶｉｒｏｍｅｒＢｌｕｅを使用して両方のｍｉＲによりトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、リンパ球コンパートメントを形態学的特徴（ＦＳＣ及びＳＳＣ）に基づいて選別し、トータルＲＮＡを抽出した。遺伝子発現解析は、参照遺伝子としてβ－アクチンを使用して実行した。正規化発現レベルは、２^{－ΔΔＣｔ}に基づいて計算した。統計分析は、スチューデントのｔ検定を使用して実行した（＝３）。

【0236】

トランスフェクションの６日後のリンパ球表現型に対するｍｉＲ－１５０－５ｐ及びｍｉＲ－１４６－５ｐの影響。

【0237】

健康な血液ドナーのＰＢＭＮＣは、ＶｉｒｏｍｅｒＢｌｕｅを使用して両方のｍｉＲによりトランスフェクトした。トランスフェクションの６日後、Ｔｒｅｇ（ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋）及びＴｈ１７（ＣＤ４^＋ＩＬ１７Ａ^＋ＩＦＮ^－）の割合をフローサイトメトリーで分析した。一元配置分散分析（ｎ＝３）を使用して統計分析を実行した。

【0238】

この時点で、ＳＥＶが免疫寛容特性を有する、すなわち、調節表現型に対するＴ細胞の分化による、いくつかのエビデンスを有していた。本発明の生物学的産物の作用機序をさらに理解するために、ＳＥＶ内に存在する２つの異なるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）をＰＢＭＮＣ混合物に直接トランスフェクトした。ｍｉＲ－１４６－５ｐは、制御性Ｔ細胞で高度に発現する。その消失は、様々な器官でのＩＦＮγ依存性免疫介在性病変内に現れる免疫寛容の崩壊となるなど、免疫抑制機能にとっては必須である。ｍｉＲ－１５０－５ｐは、他のｍｉＲとの結合におけるＴｒｅｇ分化ドライバーとして報告されているが、その役割はＣＤ８^＋エフェクター細胞の誘導及び増殖によって示されている。

【0239】

ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐに関して、本発明の結果はＦｏｘＰ３発現の有意な増加を示した（図１４）。ＦｏｘＰ３の優れた発現は、ｍｉＲ－１４６－５ｐの主要な役割がＴ細胞をＴｒｅｇに分化させ得ることを示している。

【0240】

興味深いことに、ｍｉＲ－１５０－５ｐトランスフェクションは、ＲＯＲγＴ及びＦｏｘＰ３の過剰発現をもたらした。これは、このｍｉＲが、Ｔｈ１７分化を抑制でき、自己免疫を制御できるＴ制御性１７ ＦｏｘＰ３^＋ＲＯＲγｔ^＋として近年記述された新しい制御性Ｔ細胞サブタイプへの分化を誘導し得ることを示している。

【0241】

遺伝子発現解析と並行して、フローサイトメトリーデータは、両方のｍｉＲによりトランスフェクトされたＰＢＭＮＣ中の制御性Ｔ細胞サブセットの増加も示した（図１４）。対照（トランスフェクション剤：ＶｉｒＢ）に対して、ｍｉＲ－１５０－５ｐは、ＩＬ１７Ａ発現細胞を減少させることもできた（図１４）。

【0242】

これらの結果は、これらのｍｉＲによる濃縮の可能性が、ＳＥＶの免疫調節能を増強し得、これにより生成物の改良版を生成することを示している。

【0243】

実施例１１．乾癬への効果－ｉｎ ｖｉｔｒｏ

【0244】

１１．１．イミキモド誘導乾癬モデル
ＳＥＶはＴＮＦ－αの発現を減少させ、乾癬様ＮＨＥＫモデルではＶＥＧＦＡ及びＴＧＦβ１の発現を増強する。

【0245】

ＮＨＥＫは、２ｍＭのＣａＣｌ_２で３日間最終分化させた。次に、炎症誘発性の表現型を増強するために、ＩＭＱを３時間追加した。最後に、ＩＭＱとの共インキュベーションで３時間治療を行い、ＲＮＡ抽出のために細胞を収集した。５００ｎｇのＲＮＡを逆転写反応に使用した。ｍＲＮＡ発現は、β－アクチン発現遺伝子によって正規化した（各条件でｎ＝３）。

【0246】

ＳＥＶがＴｒｅｇの数を増加させるのみでなく、Ｔｈ１７ Ｔ細胞系統のマスター転写因子であるＲＯＲγＴの発現を減少させることができることを示した以前の結果に基づいて、乾癬表皮のモデルにおけるＳＥＶの影響を研究することを決定した。

【0247】

そのために、最初にケラチノサイトをＣａ^２＋で分化させて表皮の最外層を模倣し、炎症誘発性の特性を通じて、乾癬の表現型のほとんどに類似していることが記載されている化合物である５％ＩＭＱを適用した。

【0248】

３時間の同時インキュベーション（ＳＥＶ及びＩＭＱ）後、ＳＥＶに応答してＴＮＦ－αの発現が減少し、ＶＥＧＦ－ａ及びＴＧＦ－β１の発現が増加することが観察された（図１５）。

【0249】

ＴＮＦ－αは炎症誘発性サイトカインであり、いくつかの異なる経路（血管内皮細胞への接着分子の誘導を通じて、病変皮膚への炎症細胞の侵入を促進する；他の炎症誘発性メディエータのケラチノサイト産生を刺激し、皮膚マクロファージ及び樹状細胞を活性化する）を介して炎症を増幅する。したがって、ＳＥＶ組成物によって促進されるその阻害は、樹状細胞の悪意のある活性化サイクルを遮断することによって乾癬の病態生理学を改善することができる。

【0250】

一方、ＳＥＶはＶＥＧＦＡ及びＴＧＦβ１の発現を刺激した。ＶＥＧＦＡは、樹状細胞の成熟を阻害し、Ｔｒｅｇの増殖を刺激するため、免疫抑制性腫瘍微小環境の確立に重要な役割を果たす。

【0251】

また、ＴＧＦ－β１は、自己応答性Ｔ細胞の直接的及び間接的の両方の調節により、炎症を制限し、末梢性免疫寛容を制御することが示されている。ＴＧＦ－βはＴ細胞耐性に必須であるが、近年、ＴＧＦ－βシグナル伝達の喪失のみでは自己免疫を誘導するには不十分であることが提唱されている。

【0252】

３日間のＳＥＶ治療後の乾癬様ＮＨＥＫにおける炎症性サイトカイン発現

【0253】

ＮＨＥＫは、２ｍＭのＣａＣｌ_２で６時間最終分化させた。次に、ＣａＣｌ及びＩＭＱを１８時間添加して、炎症誘発性の表現型及び分化を増強した。最後に、ＳＥＶによる治療（１ｘ１０^１０部／ｍＬ）をＩＭＱとの共インキュベーションで３日間投与した。ＲＮＡ抽出のために細胞を収集し、ＥＬＩＳＡのために上清も収集した。１μｇのＲＮＡを逆転写反応に使用した。ｍＲＮＡ発現は、β－アクチン発現遺伝子によって正規化した（各条件でｎ＝３）。

【0254】

同様のモデルでは、ＳＥＶの刺激により、ビヒクルと比較した場合、ＩＬ６発現の下方制御が増強した（図１５）。ＩＬ６は、Ｔｒｅｇ及びＴｈ１７のバランスを制御できるサイトカインであるため、この結果は、自己免疫疾患にとって特に重要である。ＣＤ４^＋Ｔ細胞の分化では、Ｔｒｅｇ及びＴｈ１７は双方ともＴＧＦβに依存するが、Ｔｈ１７は、さらにＩＬ６を必要とする。ＩＬ６の発現を減少させることは、自己免疫疾患、すなわち乾癬の制御に寄与し得る。

【0255】

１１．２．乾癬様表皮
５日間のＳＥＶ治療後の三次元表皮様乾癬モデルにおける遺伝子発現プロファイル
ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、製造業者の推奨に従って抽出した。５００ｎｇのＲＮＡを逆転写反応に使用した。ｍＲＮＡ発現は、β－アクチン発現遺伝子によって正規化した（各条件でｎ＝３）。

【0256】

皮膚における潜在的な抗乾癬効果を確認するために、市販の三次元表皮モデル（ＰＳＯＲＩＡＳＩＳ ＬＩＫＥ ＥＰＩＤＥＲＭＩＳ、Ｓｔｅｒｌａｂ）を使用した。モデルは、毎日、ＳＥＶの単回投与により５日間治療された。実験の最後に、ＲＮＡ分析のために細胞を収集し、タンパク質分泌の定量化のために上清を収集した。

【0257】

SEVは、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γなどのいくつかのサイトカインのｍＲＮＡ発現を下方制御し（図１６）、これはｉｎ ｖｉｔｒｏＩＭＱ治療ケラチノサイトモデルにより得たデータを裏付けるものである。

【0258】

さらに、抗菌ペプチド（Ｓ１００Ａ７及びＤＥＦＢ４）の発現を分析し、両方の一貫した下方制御を見出した（図１６）。これらのペプチドは主に乾癬の表皮で発現し、乾癬の特徴であるケラチノサイト分化の調節不全の原因である（Ｍａｒｔｉｎｓｓｏｎ，Ｙｈｒ，ａｎｄ Ｅｎｅｒｂａｃｋ ２００５）。

【0259】

さらに、これらの抗菌ペプチドは、好中球及びＴ細胞の走化性に寄与し、乾癬の表現型を悪化させる。これらのペプチドの発現を減少させることは、乾癬の病態生理学を改善することに大きく寄与し得る。

【0260】

さらに、ＫＲＴ５では差が見られなかったため、ＳＥＶはケラチノサイトの分化段階に影響を与えないと考えられる。興味深いことに、Ｃｏｘ－２の発現はＳＥＶ治療群において下方制御されており、炎症の抑制に寄与することが期待されている。次に、この酵素は、ＳＥＶにおいて最も豊富なマイクロＲＮＡ種のうちの１つであるｍｉＲ－１６－５ｐによって下方制御され（Ｓｈａｎｍｕｇａｍ，Ｒｅｄｄｙ，ａｎｄ Ｎａｔａｒａｊａｎ ２００８）、作用機序がｍｉＲ－１６に依存し得ることが示唆されている。

【0261】

５日間のＳＥＶ治療後の三次元表皮様乾癬モデルにおけるタンパク質分泌。培養５日後、上清を収集し、ＥＬＩＳＡによって分析した（各条件ｎ＝３）。タンパク質分泌を分析したときに、ＳＥＶが乾癬の病態に関与する２つのサイトカインであるＣＣＬ２０及びＴＮＦ－αを減少させることを見出した（図１６）。

【0262】

実施例１２．乾癬への影響－ｉｎ ｖｉｖｏ
局所－ＳＥＶは、マウスの乾癬様皮膚の炎症を改善する。

【0263】

マウスの背中の剃毛皮膚の写真は、局所治療６日後に撮影した。臨床スコアリングは、紅斑の重症度（０～４までの発赤）、患部（０～３）、及び落屑（０～２からのスケール）をランク付けすることによって実行した。炎症細胞によるＩＭＱ治療された背部皮膚の浸潤は、顆粒球（Ｌｙ６Ｇ）（Ｂ）及びＴＣＲａｂ＋（Ｃ）マーカーを使用したフローサイトメトリーによって明らかにした。リンパ節Ｔ細胞の表現型は、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＧＬ３ Ｔ細胞マーカー、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ（メモリー関連マーカー）、及びＣＣＲ６、Ｔｈ１７マーカーを使用したフローサイトメトリーによって実行した。データは、ｎ＝６匹／群のマウスの平均±ＳＥＭを表す。Ｐ値はスチューデントのｔ検定によって計算した。

【0264】

乾癬のｉｎ ｖｉｖｏモデルでＳＥＶの有効性にアクセスするために、表現型がマウスでの乾癬に似ているモデルとしてＩＭＱ誘導皮膚炎症を選択した。このモデルは、５％ＩＭＱを含むクリーム製剤であるＡｌｄａｒａを毎日局所塗布することによって誘導させた。ＩＭＱは、ｔｏｌｌ様受容体ＴＬＲ７及びＴＬＲ８のリガンドであり、局所治療部位及び遠隔部位の両方において乾癬を悪化させる。ＴＬＲ７及びＴＬＲ８は、単球、マクロファージ、及び樹状細胞によって発現され、活性化されたときに炎症誘発性サイトカイン及びケモカインの産生を引き起こす。Ａｌｄａｒａをマウスの無毛の背中に塗布することにより、塗布後５日以内に乾癬様病変が発生し、様々な細胞の流入及び表皮の過形成によって支持される。

【0265】

ＳＥＶによる６日間の連続局所治療の間、マウスの皮膚の臨床スコアを監視した。最終値は、３つのパラメーター：紅斑の重症度（０～４までの発赤）、患部（０～３）、及び落屑（０～２からのスケール）の合計とした。ＳＥＶの局所塗布により、乾癬の特徴の出現が遅れ、時間の経過と共にそれらを弱めた（図１７）。

【0266】

さらに、ＳＥＶによる局所治療は、皮膚浸潤性好中球（ＣＤ４５^＋ＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋ＣＤ６４^－）及び成熟Ｔリンパ球（ＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ＴＣＲαβ^＋）の数を有意に減少させる（図１８）。好中球及びＴ細胞の両方が、乾癬の病因の主要な因子である。活性化Ｔ細胞は、ＩＬ－１７、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ、及びＩＬ－２２などの豊富なサイトカインを産生し、好中球はＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、及びＣＸＣＬ８／ＩＬ－８などのケモカインを分泌する。サイトカイン及びケモカインが両方とも、新たにＴｈ１及びＴｈ１７免疫細胞を分極し、ケラチノサイトの過剰増殖を活性化することにより、乾癬の悪循環に寄与する。

【0267】

さらに、乾癬の病因は、リンパ節内のエフェクターＴ細胞の蓄積、及びその後の血液系を介した皮膚への移動を伴うことが一般的に認められている。

【0268】

本発明者らの実験では、ＳＥＶ治療したマウスのリンパ節においてＴｈ１７細胞及びγδ発現細胞が有意に減少していることが観察された（図１９）。これらの細胞サブセットは、主要なＩＬ１７Ａ産生細胞であり、それらが減少することは、乾癬の病態生理学の有意な改善に寄与する。

【0269】

リンパ節においてＩＬ－１７産生細胞が減少することにより、マウス皮膚へのさらなる浸潤が減少し、乾癬を軽減すると考えていた。この効果は、微小環境内のサイトカイン／ケモカインの量を減少させ、より多くのヘルパーＴ細胞の動員を妨げる好中球数の減少によっても増強されるであろう。

【0270】

実施例１３．本発明のプロセスの拡大
ＳＥＶの精製は、マイクロ及び限外ろ過（ＵＦ）用のタンジェンシャルフィールドフロー（ＴＦＦ）を使用して、ＧＭＰユニットで使用される条件を模倣する条件で試験を行った。これらの結果は、ラボスケールのＵＦ／ＳＥＣ法と比較した。この考えは、ＴＦＦが今後のＳＥＶの単離方法として使用できるか否かを、ＳＥＶの生物物理学的特性によって観察することであった。

【0271】

実施例１４：ＳＥＶはｉｎ ｖｉｖｏでの創傷治癒を促進する

【0272】

本発明者らは、ＳＥＶを単離する本発明のプロセスが、それらの生物活性及び皮膚創傷を治療する可能性に影響を有するかを検証することを決定した。

【0273】

簡潔に言えば、２つの切除創を背部ＳＴＺ誘導性糖尿病マウスモデルで実施し、ＳＥＶを含む溶液（２．５ｘ１０^８粒子）を１日２回局所塗布した。創傷治癒動態におけるＳＥＶの有効性を評価するために、実験中に創傷面積を測定した。これらの結果は、従来技術の方法（ＵＣ－超遠心分離）で単離されたＳＥＶは、本発明の方法ＵＦ－ＳＥＣで単離されたものよりも生物活性が低いことを示している（図２０Ｂ）。本発明の方法は、実験で使用されたすべての動物において創傷閉鎖を有意に加速させた。さらに、図２０Ｂでは、治癒の最初の７日間に差が集中していることが観察される。３日目に、本発明の方法で単離されたＳＥＶにより治療された動物は、創傷サイズの２０％の減少を示し、１０日目に、この差は依然として有意であった（図２０Ｂ）。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】