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特許7519716リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１を含む皮膚保護またはシワ改善用組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-07-11
(45)【発行日】2024-07-22
(54)【発明の名称】リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１を含む皮膚保護またはシワ改善用組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 8/64 20060101AFI20240712BHJP
A61Q 19/00 20060101ALI20240712BHJP
A61Q 19/08 20060101ALI20240712BHJP
A61K 38/08 20190101ALI20240712BHJP
A61K 38/10 20060101ALI20240712BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20240712BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20240712BHJP
【ＦＩ】
A61K8/64 ZNA
A61Q19/00
A61Q19/08
A61K38/08
A61K38/10
A61P17/00
A61P17/02
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2022575793
(86)(22)【出願日】2021-06-08
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-11
(86)【国際出願番号】 KR2021007163
(87)【国際公開番号】W WO2021251730
(87)【国際公開日】2021-12-16
【審査請求日】2022-12-07
(31)【優先権主張番号】10-2020-0068976
(32)【優先日】2020-06-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】522477481
【氏名又は名称】ナインバイオファーム、カンパニー、リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＮＩＮＥＢＩＯＰＨＡＲＭ ＣＯ．， ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】100120031
【弁理士】
【氏名又は名称】宮嶋 学
(74)【代理人】
【識別番号】100120617
【弁理士】
【氏名又は名称】浅野 真理
(74)【代理人】
【識別番号】100126099
【弁理士】
【氏名又は名称】反町 洋
(72)【発明者】
【氏名】キム、ジェファン
(72)【発明者】
【氏名】イム、ジホン
(72)【発明者】
【氏名】リー、リラ
(72)【発明者】
【氏名】アン、ヘイン
【審査官】田中 雅之
(56)【参考文献】
【文献】特表２０２０－５３１５５８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１９－０７３５２４（ＪＰ，Ａ）
【文献】韓国公開特許第１０－２０１８－００１９９６２（ＫＲ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ８／００－ ８／９９
Ａ６１Ｑ １／００－９０／００
Ａ６１Ｋ ３８／００－３８／５８
Ａ６１Ｋ ４１／００－４５／０８
Ａ６１Ｋ ４８／００
Ａ６１Ｋ ５０／００－５１／１２
Ａ２３Ｇ １／００－ ９／５２
Ａ２３Ｌ ５／４０－ ５／４９
Ａ２３Ｌ ３１／００－３３／２９
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＫＯＳＭＥＴ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
Ｗｉｌｅｙ Ｏｎｌｉｎｅ Ｌｉｂｒａｒｙ
Ｍｉｎｔｅｌ ＧＮＰＤ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号３のアミノ酸配列で表されるペプチドと、配列番号４のアミノ酸配列で表されるペプチドとを含む皮膚状態改善用化粧料組成物であって、
前記皮膚状態の改善は、皮膚老化の改善、皮膚の再生、皮膚弾力の改善、皮膚シワの防止、皮膚シワの改善及び皮膚傷の再生からなる群から選ばれる１種以上である、化粧料組成物。
【請求項2】
前記皮膚老化は、光老化または自然老化である、請求項１に記載の皮膚状態改善用化粧料組成物。
【請求項3】
前記ペプチドは、濃度が０．１～１０００μＭである、請求項１に記載の皮膚状態改善用化粧料組成物。
【請求項4】
前記化粧料組成物は、フィラーで剤形化されたものである、請求項１に記載の皮膚状態改善用化粧料組成物。
【請求項5】
配列番号３のアミノ酸配列で表されるペプチドと、配列番号４のアミノ酸配列で表されるペプチドとを含む皮膚状態改善用医薬外品組成物であって、
前記皮膚状態の改善は、皮膚老化の改善、皮膚再生、皮膚弾力の改善、皮膚シワの防止、皮膚シワの改善及び皮膚傷の再生からなる群から選ばれる１種以上である、医薬外品組成物。
【請求項6】
配列番号３のアミノ酸配列で表されるペプチドと、配列番号４のアミノ酸配列で表されるペプチドとを含む皮膚状態改善用フィラー組成物であって、
前記皮膚状態の改善は、皮膚老化の改善、皮膚再生、皮膚弾力の改善、皮膚シワの防止、皮膚シワの改善及び皮膚傷の再生からなる群から選ばれる１種以上である、フィラー組成物。
【請求項7】
配列番号３のアミノ酸配列で表されるペプチドと、配列番号４のアミノ酸配列で表されるペプチドとを含む皮膚注入用フィラー。
【請求項8】
前記フィラーは、皮膚状態改善用であり、前記皮膚状態の改善は、皮膚老化の改善、皮膚再生、皮膚弾力の改善、皮膚シワの防止、皮膚シワの改善及び皮膚傷の再生からなる群から選ばれる１種以上である、請求項７に記載の皮膚注入用フィラー。
【請求項9】
前記フィラーは注射用である、請求項７に記載の皮膚注入用フィラー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１に関するもので、さらに詳しくは、前記リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１の混合物の皮膚状態改善用途に関するものである。
【背景技術】
【0002】
皮膚は、大きく表皮、陳皮、皮下組織に区分される。陳皮には、血管、リンパシステム、毛穴、線維芽細胞などの皮膚の重要な付属器官があり、表皮厚さの１５～４０倍にあたる厚い層で皮膚の大部分を占める。陳皮組織は、架橋繊維であるコラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）と弾力繊維であるエラスチン（ｅｌａｓｔｉｎ）からなるが、これらは線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）で合成される。コラーゲンは、長い繊維で、体の支え、結合、境界面を作る役割をする。コラーゲンは、皮膚に加えられる圧力や外部の力に対して抵抗する役割をする。一方、エラスチンは、ばねのように皮膚の弾力性を維持する役割をする。コラーゲンとエラスチンが網構造を形成して、皮膚の弾力性を維持させる。
【0003】
皮膚が老化することによりシワが表れ、年をとることによりその数や深さ、範囲が増加していく。老化は、内因性及び外因性に区分されるが、内因性老化は、年を取りながら皮膚の構造と生理的機能が継続的な減退を起こすものである。外的要因による老化は、長期間にわたる紫外線への露出などが原因として表れる。
【0004】
コラーゲンは、年齢及び紫外線の照射による光老化によって減少し、これは、皮膚のシワ形成と密接な連関があると知られている。また、コラーゲンは、傷治癒において重要な役割を担当し、損傷された上皮でコラーゲンの合成を促進させて、傷を迅速に傷跡なく回復させることができる。コラーゲンの主な機能は、皮膚の堅固性、組織の抵抗力と結合力、細胞接着の支えなどが知られている。このようなコラーゲンは、高令化及び紫外線の照射による光老化によって、皮膚の厚さが薄くなり、このような現象は、皮膚のシワ形成に密接な関連があると知られている。
【0005】
線維芽細胞で生成されるエラスターゼが皮膚弾性繊維の３次元的な捻れに重要な役割をすると報告されており、エラスターゼの活性増加は、皮膚のエラスチン及びコラーゲンを減少させて皮膚シワの形成に寄与する。紫外線の照射後にエラスターゼの活性が増加するため、エラスターゼの活性変化は、紫外線による皮膚弾性度の減少及びシワ生成の主要原因として知られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
そこで、本発明者らは、新規な皮膚改善用物質を探索する中、ペプチドリゼンタイド－０３４及び０４１を開発し、この混合物が皮膚改善効果に優れるということを確認することで本発明を完成した。
【0007】
したがって、本発明の目的は、配列番号１のアミノ酸配列で表されるペプチドと、配列番号２のアミノ酸配列で表されるペプチドとを含む皮膚状態改善用組成物を提供することにある。
【0008】
本発明の他の目的は、配列番号１のアミノ酸配列で表されるペプチドと、配列番号２のアミノ酸配列で表されるペプチドとをこれを要する個体に投与する段階を含む、傷治療方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0009】
上記目的を達成するために、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列で表されるペプチドと、配列番号２のアミノ酸配列で表されるペプチドとを含む皮膚状態改善用化粧料組成物を提供する。
【0010】
また本発明は、配列番号１のアミノ酸配列で表されるペプチドと、配列番号２のアミノ酸配列で表されるペプチドとを含む皮膚状態改善用医薬外品組成物を提供する。
【0011】
また本発明は、配列番号１のアミノ酸配列で表されるペプチドと、配列番号２のアミノ酸配列で表されるペプチドとを含む皮膚状態改善用食品組成物を提供する。
【0012】
また本発明は、配列番号１のアミノ酸配列で表されるペプチドと、配列番号２のアミノ酸配列で表されるペプチドとを含む皮膚状態改善用健康機能食品組成物を提供する。
【0013】
また本発明は、配列番号１のアミノ酸配列で表されるペプチドと、配列番号２のアミノ酸配列で表されるペプチドとを含む皮膚状態改善用フィラー組成物を提供する。
【0014】
また本発明は、配列番号１のアミノ酸配列で表されるペプチドと、配列番号２のアミノ酸配列で表されるペプチドとを含む皮膚注入用フィラーを提供する。
【0015】
また本発明は、配列番号１のアミノ酸配列で表されるペプチドと、配列番号２のアミノ酸配列で表されるペプチドとを含む傷治療用薬学的組成物を提供する。
【0016】
また本発明は、配列番号１のアミノ酸配列で表されるペプチドと、配列番号２のアミノ酸配列で表されるペプチドとをこれを要する個体に投与する段階を含む、傷治療方法を提供する。
【発明の効果】
【0017】
本発明によるリゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１の混合物は、細胞毒性がないだけでなく、顕著な細胞増殖の促進、コラーゲン合成の促進、エラスターゼ活性の阻害及び紫外線による細胞死滅の抑制効果を有しているため、薬学、医薬物、化粧料及び食品分野で多様に活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】本発明によるリゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物の細胞毒性を確認した結果を示した図面である。
【図2】本発明によるリゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物の光老化によるコラーゲン生合成能減少改善効果を確認した結果を示した図面である。
【図3】本発明によるリゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物の自然老化によるコラーゲン生合成能減少改善効果を確認した結果を示した図面である。
【図4】本発明によるリゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物のエラスチン分解酵素活性抑制能を確認した結果を示した図面である。
【図5】本発明によるリゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物の表皮角質細胞の成長促進効能を確認した結果を示した図面である。
【図6】本発明によるリゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物の線維芽細胞の成長促進効能を確認した結果を示した図面である。
【図7】本発明によるリゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物の表皮角質細胞に対する傷回復効果を確認した結果を示した図面である。
【図8】本発明によるリゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物の線維芽細胞に対する傷回復効果を確認した結果を示した図面である。
【図9】動物モデルにおいて、本発明によるリゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物の光老化によるシワ改善効果を確認した結果を示した図面である。
【図10】動物モデルにおいて、本発明によるリゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物のコラーゲン及びエラスチン発現量を確認した結果を示した図面である。
【発明を実施するための形態】
【0019】
以下、本発明を詳しく説明する。
【0020】
本発明の様態によると、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列で表されるペプチドと、配列番号２のアミノ酸配列で表されるペプチドとを含む皮膚状態改善用組成物を提供する。
【0021】
本発明において、ペプチドは、ペプチド結合によりアミノ酸残基が互いに結合して形成された線形の分子を意味する。前記ペプチドは、当業界に公知された化学的合成方法によって製造されることができ、好ましくは、固相合成技術によって製造されることができるが、これに限定されない。
【0022】
本発明の具体例において、配列番号１または２のアミノ酸配列で表されるペプチドは、Ｃ－末端にアミン基（ａｍｉｎｅ ｇｒｏｕｐ、－ＮＨ２）が接合されたものが好ましく、アミン基が接合されたペプチドをそれぞれ「リゼンタイド－０３４」及び「リゼンタイド－０４１」と命名した。前記リゼンタイド－０３４は、配列番号３のアミノ酸で表されることができ、前記リゼンタイド－０４１は、配列番号４のアミノ酸配列で表されることができる。前記リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１は、配列番号１または２のアミノ酸配列で表されるペプチドのＣ－末端にアミン基が接合されたもので、組織内の安定性が顕著に改善されることができる。
【0023】
本発明の具体例において、前記配列番号１のアミノ酸配列で表されるペプチドと、配列番号２のアミノ酸配列で表されるペプチドとは、表皮角質細胞及び線維芽細胞に対する細胞毒性がなく、顕著な細胞増殖の促進、コラーゲン合成の促進及び細胞移動の促進効果があることを実験を通じて確認した。
【0024】
本発明の範囲には、配列番号１のアミノ酸配列で表されるペプチドと、配列番号２のアミノ酸配列で表されるペプチドとの機能的同等物を含む。
【0025】
本発明において、機能的同等物は、アミノ酸の付加、置換または欠失の結果、前記配列番号１または２で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の、好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の配列相同性（すなわち、同一性）を有するもので、例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の配列相同性を有するものを含み、配列番号１のアミノ酸配列で表されるペプチドと、配列番号２のアミノ酸配列で表されるペプチドと実質的に同質の生理活性を表すペプチドをいう。また、本発明の配列番号１のアミノ酸配列で表されるペプチドと、配列番号２のアミノ酸配列で表されるペプチドとには、この天然型アミノ酸配列を有するタンパク質だけでなく、該アミノ酸配列変異体も本発明の範囲に含まれる。配列番号１のアミノ酸配列で表されるペプチドと、配列番号２のアミノ酸配列で表されるペプチドとの変異体とは、前記ペプチドの天然アミノ酸配列と一つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保全的または保全的置換またはこれらの組み合わせによって異なる配列を有するペプチドを意味する。分子の活性を全体的に変更させないタンパク質及びペプチドにおけるアミノ酸交換は、当該分野に公知されている。前記配列番号１のアミノ酸配列で表されるペプチドまたはこの変異体は、天然で抽出するか合成またはＤＮＡ配列を基本とする遺伝子組換え方法によって製造されることができる。
【0026】
また、前記配列相同性は、ペプチドを構成するアミノ酸配列の類似した部分を比較するために使用される一般的な標準方法によって決定されることができる。ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡのようなコンピュータプログラムは、二つ以上のタンパク質をそれぞれ構成するアミノ酸が最適でマッチング（ｍａｔｃｈｉｎｇ）されるように整列する（一つまたは二つの配列の全長さ配列に沿って一つまたは二つの配列の予測された部分に沿って）。前記プログラムは、デフォルトオープニングペナルティ（ｄｅｆａｕｌｔ ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ）及びデフォルトギャップペナルティ（ｄｅｆａｕｌｔ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ）を提供し、コンピュータプログラムと共に連携して使用可能なＰＡＭ２５０（標準スコアリングマトリックス）のようなスコアリングマトリックスを提供する。例えば、百分率で表される配列相同性は、次のように計算することができる。一致する配列（ｉｎｄｅｎｔｉｃａｌ ｍａｔｃｈｅｓ）の総数に１００を掛けた上で、対応するスパン（ｍａｃｈｔｅｄ ｓｐａｎ）内のより長い配列の長さと二つの配列を整列するためにより長い配列内に導入したギャップ（ｇａｐｓ）の数の和で分ける。
【0027】
本発明において、実質的に同質の生理活性は、皮膚状態の改善活性を意味し、さらに詳しくは、皮膚老化の改善、皮膚再生、皮膚弾力の改善、皮膚シワの防止、皮膚シワの改善及び皮膚傷の再生からなる群から選ばれる１種以上の活性を意味する。
【0028】
また、前記機能的同等物の範囲には、配列番号１のアミノ酸配列で表されるペプチドの基本骨格と皮膚状態の改善活性を維持しながら構成するアミノ酸の一部化学構造が変形された誘導体が含まれる。例えば、タンパク質の安定性、貯蔵性、揮発性または溶解度などを変更させるための構造変更がこれに含まれる。
【0029】
本発明において、「改善」は、状態の緩和または治療と関連したパラメータ、例えば症状の程度を少なくとも減少させる全ての行為を意味する。
【0030】
本発明において、「皮膚状態の改善」は、皮膚老化の改善、皮膚再生、皮膚弾力の改善、皮膚シワの防止、皮膚シワの改善及び皮膚傷の再生からなる群から選ばれる１種以上の活性であることができる。
【0031】
本発明において、「皮膚老化」は、活性酸素の増加により誘発される全ての疾患を意味し、前記皮膚老化の非制限的な例としてシワ、皮膚のたるみ、弾力性の減少などが挙げられる。
【0032】
本発明において、「皮膚再生」、「皮膚弾力の改善」または「皮膚シワの防止または改善」は、コラゲナーゼ活性を抑制してコラーゲン総量を増加させる全ての作用を意味する。
【0033】
本発明において、「皮膚傷の再生」は、創傷などで損傷された皮膚を皮膚細胞数の増加及び皮膚細胞移動能の促進を通じて再生させる全ての作用を意味する。
【0034】
本発明の具体例において、前記皮膚老化は、光老化または自然老化であるが、皮膚老化の原因により本発明の範囲が制限されない。
【0035】
本発明の具体例において、前記ペプチドは、濃度が０．１～１０００μＭであることが好ましい。
【0036】
本発明の具体例において、前記配列番号１のアミノ酸配列で表されるペプチドと、配列番号２のアミノ酸配列で表されるペプチドとは、濃度比１：０．１～１０で混合することが好ましく、さらに好ましくは、濃度比１：１で混合することができる。
【0037】
本発明の具体例において、前記化粧料組成物は、フィラーで剤形化されることが好ましいが、これに制限されない。
【0038】
本発明による皮膚状態改善用組成物は、化粧料組成物、医薬外品組成物、食品組成物、健康機能食品組成物またはフィラー組成物であることができる。
【0039】
本発明による皮膚状態改善用組成物が化粧料組成物の場合、本発明の化粧料組成物は、前記有効成分以外に化粧料組成物に通常使用される抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料、香料などのような通常の補助剤及び担体がさらに含まれることができる。例えば、前記化粧料組成物には、グリセリン、ブチレングリコール、ポリオキシエチレン硬化ひまし油、トコフェリルアセテート、クエン酸、パンテノール、スクアラン、クエン酸ナトリウム、アラトインなどの補助成分がさらに含まれることができる。
【0040】
本発明の化粧料組成物は、基本的に皮膚に適用されるものであるため、当業界の化粧料組成物を参照して通常製造されるいかなる剤形でも製造されることができる。例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤含有クレンジング、オイル、粉末ファウンデーション、乳濁液ファウンデーション、ワックスファウンデーション及びスプレーなどで剤形化されることができるが、これに限定されるものではない。さらに詳しくは、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、マスクパック、スプレーまたはパウダーの剤形で製造されることができる。
【0041】
本発明の剤形がペースト、クリームまたはゲルの場合は、担体成分として、動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、シリカ、タルク、酸化亜鉛などが含まれることができる。
【0042】
本発明の剤形がパウダーまたはスプレーの場合は、担体成分として、ラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケート、ポリアミドパウダーなどが含まれることができ、特にスプレーの場合は、追加的にクロロフルオロヒドロカーボン、プロパン／ブタン、ジメチルエーテルなどの推進体を含むことができる。
【0043】
本発明の剤形が溶液または乳濁液の場合は、担体成分として溶媒、溶解化剤、乳濁化剤などが含まれることができ、具体的に、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３－ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール、ソルビタンの脂肪酸エステルなどが含まれることができる。
【0044】
本発明の剤形が懸濁液の場合は、担体成分として、水、エタノール、プロピレングリコールなどの液相希釈剤；エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル、ポリオキシエチレンソルビタンエステル等の懸濁剤；微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガ、トラガカント等が含まれることができる。
【0045】
本発明の剤形が界面活性剤含有クレンジングの場合は、担体成分として、脂肪族アルコールサルフェート、脂肪族アルコールエーテルサルフェート、スルホコハク酸モノエステル、イセチオネート、イミダゾリニウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルサルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体、エトキシル化グリセロール脂肪酸エステル等が含まれることができる。
【0046】
本発明による皮膚状態改善用組成物は、医薬外品組成物であることができる。
【0047】
本発明において、医薬外品は、人や動物の疾病を診断、治療、改善、軽減、処置または予防する目的で使用される物品の中で医薬品より作用が軽微な物品を意味するもので、例えば、薬事法によると、医薬外品とは、医薬品の用途で使用される物品を除外したもので、人・動物の疾病治療や予防に使用される製品、人体に対する作用が軽微であるか直接作用しない製品等が含まれる。
【0048】
本発明の上記医薬外品組成物は、ボディークレンザー、フォーム、石鹸、マスク、軟膏剤、クリーム、ローション、エッセンス及びスプレーからなる群から選ばれて製造することができるが、これに制限されるものではない。
【0049】
本発明の上記医薬外品組成物において、配列番号１のアミノ酸配列で表されるペプチドに関する説明、皮膚再生、皮膚弾力の改善、皮膚シワの防止または改善、皮膚老化の防止または改善、皮膚炎症の改善及び皮膚美白改善に関する説明は、上記化粧料組成物と関連して上記で説明したものと同一である。
【0050】
本発明による皮膚状態改善用食品組成物は、健康機能食品、食品添加剤または食餌補助剤として使用されることができる。
【0051】
前記配列番号１のアミノ酸配列で表されるペプチドと、配列番号２のアミノ酸配列で表されるペプチドとを食品添加剤として使用する場合、前記混合物をそのまま添加するか、他の食品または食品成分と共に混合して使用されるなど、通常の方法によって適切に使用されることができる。
【0052】
また、前記配列番号１のアミノ酸配列で表されるペプチドと、配列番号２のアミノ酸配列で表されるペプチドとの混合量は、使用目的（予防、健康または治療的処置）によって適合に変更可能なことは言うまでもなく、食品組成物の総重量に対して０．０１～９５重量％で含まれることが好ましく、さらに好ましくは１～８０重量％で含まれる。その含量が０．０１重量％未満の場合は、抗酸化または抗炎症効果が少ないおそれがあり、９５重量％を超える場合、使用量に対する効果上昇率が低く非経済的であるおそれがある。
【0053】
具体的な例として、食品または飲料の製造時は、本発明の配列番号１のアミノ酸配列で表されるペプチドと、配列番号２のアミノ酸配列で表されるペプチドとは、原料に対して１５重量％以下、好ましくは１０重量％以下の量で添加される。しかし、健康及び衛生を目的とするか、または健康調節を目的として長期間摂取する場合は、上記範囲以下の量で添加されることができ、安全性の面で何らの問題がないため、有効成分は上記範囲以上の量でも使用されることができる。
【0054】
上記食品の種類に特に制限はないが、本発明の配列番号１のアミノ酸配列で表されるペプチドと、配列番号２のアミノ酸配列で表されるペプチドとを添加することができる食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディ類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種のスープ、飲料水、茶、ドリンク剤、アルコール飲料、ビタミン複合剤などがあり、通常の意味における健康食品をいずれも含む。
【0055】
本発明の食品組成物が飲料として製造される場合、通常の飲料のように様々な香味剤または天然炭水化物などの追加成分を含むことができる。前記天然炭水化物としては、ブドウ糖、果糖などのモノサカライド；マルトース、スクロースなどのジサカライド；デキストリン、シクロデキストリンなどの天然甘味剤；サッカリン、アスパルテーム等の合成甘味剤などが使用されることができる。前記天然炭水化物は、本発明の食品組成物の総重量に対して０．０１～１０重量％、好ましくは０．０１～０．１重量％で含まれる。
【0056】
本発明の食品組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含むことができ、天然フルーツジュース、フルーツジュース飲料及び野菜飲料の製造のための果肉を含むことができるが、これに制限されない。かかる成分は、独立してまたは組み合わせて使用することができる。上記の添加剤の割合は大きく制限されないが、本発明の食品組成物の総重量に対して０．０１～０．１重量％範囲内で含まれることが好ましい。
【0057】
健康及び衛生を目的とするか健康調節を目的とする長期間の摂取の場合、本発明の食品組成物は、安全性の面で何らの問題がないため、長期間服用が可能である。
【0058】
本発明による皮膚状態改善用組成物は、フィラー組成物であることができる。
【0059】
本発明において、フィラー（ｆｉｌｌｅｒ）は、生体適合な材料を皮内または皮下に注入してシワを改善し、美観上ボリュームを回復させるなどの皮膚組織を補充する注射可能な物質を意味する。最近、フィラーは、皮膚と類似した物質だけでなく、皮膚内細胞の増殖を促進する物質、コラーゲンなどの生成を促進する物質などを含む。フィラー手術を受けると、短時間でシワが取れ、薄い唇が厚目になり、凹んだ傷跡が治される等の効果が表れる。現在、ＦＤＡまたはＭＦＤＳで承認したフィラー製造用の物質として、コラーゲン、ヒアルロン酸、カルシウムヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸などがある。
【0060】
本発明の好ましい例として、本発明のフィラー組成物は、コラーゲン、ヒアルロン酸、カルシウムヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸を含むことができる。
【0061】
また、本発明のフィラー組成物は、使用便宜性及び保管安定性を提供するために、パウダー形態、より具体的に凍結乾燥したパウダー形態で剤形化することができる。一方、上記のフィラー組成物は、皮膚に注射する前、ＰＢＳのような水性媒質に溶解させて可溶化させる前処理段階を必要とするが、保管及び剤形状態によって溶液化されたフィラー組成物の直接的な適用も可能である。
【0062】
本発明の具体例において、効果的な皮膚再生効果を付与するために、本発明のフィラー組成物は、細胞成長因子またはビタミンをさらに含むことができる。上記細胞成長因子は、細胞の分裂、成長、及び分化を促進するポリペプチドを総称するもので、好ましく、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、形質転換成長因子アルファ（ＴＧＦ－α）、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ－β）、顆粒球形成刺激因子（ＧＣＳＦ）、インシュリン類似成長因子（ＩＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、血小板由来成長因子ＢＢ（ＰＤＧＦＢＢ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、及び膠細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）からなる群より選ばれることができ、上記細胞成長因子は、２０ｎｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌの濃度で含有されることができるが、これに制限されるものではない。
【0063】
注入過程における痛症を緩和するために、本発明のフィラー組成物は、局所麻酔剤をさらに含むことができる。前記局所麻酔剤は、アムブカイン（ａｍｂｕｃａｉｎｅ）、アモラノン（ａｍｏｌａｎｏｎｅ）、アミロカイン（ａｍｙｌｏｃａｉｎｅ）、ベノキシネート（ｂｅｎｏｘｉｎａｔｅ）、ベンゾカイン（ｂｅｎｚｏｃａｉｎｅ）、ベトキシカイン（ｂｅｔｏｘｙｃａｉｎｅ）、ビフェンアミン（ｂｉｐｈｅｎａｍｉｎｅ）、ブピバカイン（ｂｕｐｉｖａｃａｉｎｅ）、ブタカイン（ｂｕｔａｃａｉｎｅ）、ブタムベン（ｂｕｔａｍｂｅｎ）、ブタニリカイン（ｂｕｔａｎｉｌｉｃａｉｎｅ）、ブテタミン（ｂｕｔｅｔｈａｍｉｎｅ）、ブトキシカイン（ｂｕｔｏｘｙｃａｉｎｅ）、カルチカイン（ｃａｒｔｉｃａｉｎｅ）、クロロプロカイン、コカエチレン、コカイン、シクロメチカイン、ジブカイン、ジメチソキン、ジメトカイン、ジフェロドン、ジシクロニン、エクゴニジン、エクゴニン、塩化エチル、エチドカイン、ベータ－ユーカイン、ユープロシン、フェナルコミン、フォルモカイン、ヘキシルカイン、ヒドロキシテトラカイン、ｐ－アミノ安息香酸イソブチル、メシル酸ロイシノカイン、レボキサドロール、リドカイン、メピバカイン、メプリルカイン、メタブトキシカイン、塩化メチル、ミルテカイン、ナエパイン、オクタカイン、オルソカイン、オキセサゼイン、パルエトキシカイン、フェナカイン、フェノール、ピペロカイン、ピリドカイン、ポリドカノール、プラモキシン、プリロカイン、プロカイン、プロパノカイン、プロパラカイン、プロピコカイン、プロポキシカイン、シュードコカイン、ピロカイン（ｐｙｒｒｏｃａｉｎｅ）、ロピバカイン、ブピバカイン、サリチルアルコール、テトラカイン、トリカイン、トリメカイン、ゾラミン及びこれらの塩からなる群より選ばれることができ、上記麻酔剤の量は、全体フィラー組成物の重量に対して好ましくは０．１重量％～５．０重量％、より好ましくは０．２重量％～１．０％重量％で含有されることができるが、これに制限されるものではない。
【0064】
体内でゲル化して生成されたヒドロゲルの酸化及び分解を防ぐために、本発明のフィラー組成物は、抗酸化剤をさらに含むことができる。前記抗酸化剤は、ポリオール、マンニトール、及びソルビトールからなる群より選ばれることができ、前記抗酸化剤の量は、全体フィラー組成物の重量に対して好ましく０．１重量％～５．０重量％、より好ましくは、０．２重量％～１．０％重量％で含有されることができるが、これに制限されるものではない。
【0065】
本発明のまた他の様態によると、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列で表されるペプチドと、配列番号２のアミノ酸配列で表されるペプチドとを含む皮膚注入用フィラーを提供する。
【0066】
本発明の具体例において、配列番号１または２のアミノ酸配列で表されるペプチドは、Ｃ－末端にアミン基（ａｍｉｎｅ ｇｒｏｕｐ、－ＮＨ２）が接合されたものが好ましく、アミン基が接合されたペプチドをそれぞれ「リゼンタイド－０３４」及び「リゼンタイド－０４１」と命名した。前記リゼンタイド－０３４は、配列番号３のアミノ酸で表されることができ、前記リゼンタイド－０４１は、配列番号４のアミノ酸配列で表されることができる。前記リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１は、配列番号１または２のアミノ酸配列で表されるペプチドのＣ－末端にアミン基が接合されたもので、組織内の安定性が顕著に改善されることができる。
【0067】
本発明の具体例において、前記フィラーは、皮膚状態改善用であり、これは、皮膚老化の改善、皮膚再生、皮膚弾力の改善、皮膚シワの防止、皮膚シワの改善及び皮膚傷の再生からなる群から選ばれる１種以上であることが好ましいが、これに制限されない。
【0068】
本発明の具体例において、前記フィラーは注射用であることが好ましいが、これに本発明の範囲が制限されるものではない。
【0069】
本発明のまた他の様態によると、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列で表されるペプチドと、配列番号２のアミノ酸配列で表されるペプチドとを含む傷治療用薬学的組成物を提供する。
【0070】
本発明の具体例において、配列番号１または２のアミノ酸配列で表されるペプチドは、Ｃ－末端にアミン基（ａｍｉｎｅ ｇｒｏｕｐ、－ＮＨ２）が接合されたものが好ましく、アミン基が接合されたペプチドをそれぞれ「リゼンタイド－０３４」及び「リゼンタイド－０４１」と命名した。前記リゼンタイド－０３４は、配列番号３のアミノ酸で表されることができ、前記リゼンタイド－０４１は、配列番号４のアミノ酸配列で表されることができる。前記リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１は、配列番号１または２のアミノ酸配列で表されるペプチドのＣ－末端にアミン基が接合されたもので、組織内の安定性が顕著に改善することができる。
【0071】
本発明において、「傷治療」は、創傷などで損傷された部位を細胞数の増加及び細胞移動能の促進を通じて損傷部位（すなわち、傷）を治療する作用を意味する。
【0072】
本発明の傷治療用薬学的組成物は、それぞれ通常の方法によって多様な形態で剤形化して使用されることができる。例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップなどの経口型剤形で剤形化することができ、外用剤、坐剤及び滅菌注射溶液の形態で剤形化して使用されることができる。但し、本発明の組成物は、皮膚外用剤の形態で提供されることが最も好ましいことができる。具体的に、液剤、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、スプレー剤、パッチ剤、ゲル剤またはエアロゾル剤などの形態で使用されることができる。
【0073】
また、それぞれの剤形によって薬学的に許容可能な担体、賦形剤及び希釈剤をさらに含むことができる。また、通常の方法によって、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの外用剤及び滅菌注射溶液の形態で剤形化して使用されることができ、好ましくは、クリーム、ゲル、パッチ、噴霧剤、軟膏剤、経口剤、ローション剤、リニメント剤、パスタ剤またはカタプラズマ剤の剤形を有することができる。例えば、当該部位に局所的に使用される皮膚外用剤の場合は、通常の添加剤、例えば保存剤、医薬浸透を補助する溶媒、軟膏及びクリームの場合、軟化剤などを含むことができ、エタノールまたはオレイルアルコールのような通常的担体を含有することができる。当該技術分野に知られた適合な製剤は、文献（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、最近、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ）に開示されているものを使用することが好ましいが、これに制限されない。
【0074】
上記担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、オリゴ糖、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、未晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレート、鉱物油などがある。前記薬学的組成物を製剤化や剤形化する場合は、普通使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調剤される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、上記組成物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、カルシウムカーボネート（ｃａｌｃｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）、ラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤以外にマグネシウムシトレートタルクのような潤滑剤も使用される。経口のための液相製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれることができる。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤などが含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステルなどが使用されることができる。坐剤の基剤としては、ウィテプソル（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチン等が使用されることができる。上記成分は、有効成分、すなわち、薬学的組成物に独立してまたは組み合わせて加えられることができる。
【0075】
本発明において、投与は任意の適切な方法で個体に本発明の薬学的組成物を提供することを意味する。
【0076】
本発明の薬学的組成物は、研究者、獣医、医者またはその他の臨床によって考えられる組織系、動物または人間で生物学的または医学的反応を誘導する有効成分または薬学的組成物の量、すなわち、治療される疾患または障害の症状の緩和を誘導する量である治療上有効量で投与することができる。本発明の薬学的組成物に対する治療上有効投与量及び投与回数は、所望の効果によって変化されることは当業者に自明である。従って、投与される最適な投与量は、当業者によって容易に決定されることができ、疾患の種類、疾患の重症度、組成物に含有された有効成分及び他の成分の含量、剤形の種類、患者の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食餌、投与時間、投与経路及び組成物の分泌率、治療期間、同時に使用される薬物を含む多様な因子などによって調節されることができる。
【0077】
本発明の薬学的組成物は、１～１０，０００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは１～２００ｍｇ／ｋｇ／日の量で投与することができ、一日に一回投与してもよく、数回に分けて投与してもよい。
【0078】
本発明の他の様態によると、配列番号１のアミノ酸配列で表されるペプチドと、配列番号２のアミノ酸配列で表されるペプチドとをこれを要する個体に投与する段階を含む、傷治療方法を提供する。
【0079】
本発明の具体例において、前記個体は、傷（ｓｃａｒ）が発生した個体、または傷が回復した個体であることができるが、これに制限されない。
【0080】
重複する内容は、本明細書の複雑性を考慮して省略し、本明細書で他に定義されない用語は、本発明が属する技術分野で通常使用される意味を有するものである。
【実施例】
【0081】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。これらの実施例は、単に本発明を例示するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈されないことは、当業界で通常の知識を有する者において自明である。
【0082】
実施例１．ペプチド合成
皮膚保護及びシワ改善のためのペプチドを合成した。合成されたペプチドは、それぞれ配列番号１または２のアミノ酸配列で表され、組織内の安全性のために各ペプチドのＣ－末端にアミン基（－ＮＨ２）を接合した。Ｃ－末端にアミン基が接合されたペプチドは、それぞれ配列番号３または４のアミノ酸配列で表され、Ｃ－末端にアミン基が接合されたペプチドは、それぞれ「リゼンタイド－０３４」及び「リゼンタイド－０４１」と命名した。
皮膚保護及びシワ改善のためのペプチドを合成した。合成されたペプチドは、それぞれ配列番号１または２のアミノ酸配列で表され、組織内の安全性のために各ペプチドのＣ－末端にアミン基（－ＮＨ２）を接合した。Ｃ－末端にアミン基が接合されたペプチドは、それぞれ配列番号３または４のアミノ酸配列で表され、Ｃ－末端にアミン基が接合されたペプチドは、それぞれ「リゼンタイド－０３４」及び「リゼンタイド－０４１」と命名した。
【表1】
【0083】
後述する実施例では、リゼンタイド－０３４（配列番号３）及び－０４１（配列番号４）を濃度比１：１で混合した混合物を利用して実験した。
【0084】
実施例２．リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物の細胞毒性の評価
リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物の細胞毒性を確認するために、ヒトの表皮角質細胞であるＨａＣａＴ細胞とヒトの線維芽細胞であるＣＣＤ－９８６Ｓｋで細胞毒性を測定した。９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに角質細胞は３×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで、線維芽細胞は５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注した後、１０％ＦＢＳが含まれた培地で２４時間の間細胞培養条件で培養した。培養後、ＦＢＳのない培地にリゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物を５μＭまたは１０μＭを添加し、これを４８時間の間培養した。以後、ＣＣＫ８反応液（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｋｕｍａｍｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）をｗｅｌｌ当たり１０μｌずつ処理して４時間反応させた後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。各試料群に対する平均吸光度値を求め、対照群としては、リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物を処理していない細胞の吸光度値と比べて細胞生存率を評価した。細胞生存率の評価結果は、図１に示した。
リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物の細胞毒性を確認するために、ヒトの表皮角質細胞であるＨａＣａＴ細胞とヒトの線維芽細胞であるＣＣＤ－９８６Ｓｋで細胞毒性を測定した。９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに角質細胞は３×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで、線維芽細胞は５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注した後、１０％ＦＢＳが含まれた培地で２４時間の間細胞培養条件で培養した。培養後、ＦＢＳのない培地にリゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物を５μＭまたは１０μＭを添加し、これを４８時間の間培養した。以後、ＣＣＫ８反応液（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｋｕｍａｍｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）をｗｅｌｌ当たり１０μｌずつ処理して４時間反応させた後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。各試料群に対する平均吸光度値を求め、対照群としては、リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物を処理していない細胞の吸光度値と比べて細胞生存率を評価した。細胞生存率の評価結果は、図１に示した。
【0085】
図１に示すように、リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物は、細胞毒性がないことを確認した。
【0086】
実施例３．リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物のコラーゲン合成効果の確認
３－１．光老化によるコラーゲン生合成能の減少改善
リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物の光老化によるコラーゲン生合成能減少改善の効果を調べるために、線維芽細胞であるＣＣＤ－９８６Ｓｋを６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注した後、１０％ＦＢＳが含まれた培地で２４時間の間細胞培養条件で培養した。以後、培地を捨てて１×ＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で洗浄した後、１×ＤＰＢＳを５００μｌずつ入れた後、実験群に２５ｍＪ／ｃｍ２のＵＶＢを照射した。以後、ＦＢＳのない培地にリゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物を多様な濃度（０、０．１、０．２、０．５μＭ）で培地に添加して２４時間の間細胞培養条件で培養した。各時間帯別に培養した培地を回収した後、プロコラーゲンのＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）を利用して培地に分泌されたプロコラーゲンの分泌量を４５０ｎｍの吸光度で測定して量を算定した。リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物の光老化によるコラーゲン生合成能減少改善の効果を確認した結果は、図２に示した。
３－１．光老化によるコラーゲン生合成能の減少改善
リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物の光老化によるコラーゲン生合成能減少改善の効果を調べるために、線維芽細胞であるＣＣＤ－９８６Ｓｋを６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注した後、１０％ＦＢＳが含まれた培地で２４時間の間細胞培養条件で培養した。以後、培地を捨てて１×ＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で洗浄した後、１×ＤＰＢＳを５００μｌずつ入れた後、実験群に２５ｍＪ／ｃｍ２のＵＶＢを照射した。以後、ＦＢＳのない培地にリゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物を多様な濃度（０、０．１、０．２、０．５μＭ）で培地に添加して２４時間の間細胞培養条件で培養した。各時間帯別に培養した培地を回収した後、プロコラーゲンのＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）を利用して培地に分泌されたプロコラーゲンの分泌量を４５０ｎｍの吸光度で測定して量を算定した。リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物の光老化によるコラーゲン生合成能減少改善の効果を確認した結果は、図２に示した。
【0087】
図２に示すように、リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物を処理して２４時間後、ＵＶＢを処理した群でコラーゲン合成能が８０％減少することを確認した。また、リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物を処理すると、ＵＶＢによって減少されたコラーゲン合成能がＵＶＢのみ処理した群に比べてリゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物を処理した全ての群でコラーゲン合成能が増加することを確認した。特に、リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物０．２μＭを処理した群においてコラーゲン合成効能が対照群に比べて６４．９％増加したことを確認した。
【0088】
３－２．自然老化によるコラーゲン生合成能の減少改善
リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物の自然老化によるコラーゲン生合成能減少改善効果を調べるために、線維芽細胞であるＣＣＤ－９８６Ｓｋを継代培養してｐａｓｓａｇｅ１５とｐａｓｓａｇｅ２０細胞を６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注した後、１０％ＦＢＳが含まれた培地で２４時間の間細胞培養条件で培養した。以後、培地を捨てて１×ＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で洗浄した後、ＦＢＳのない培地にリゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－４１混合物を多様な濃度（０、０．１、０．２、０．５μＭ）で培地に添加して２４時間の間細胞培養条件で培養した。各時間帯別に培養した培地を回収した後、プロコラーゲンのＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）を利用して培地に分泌されたプロコラーゲンの分泌量を４５０ｎｍの吸光度で測定して量を算定した。リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物の自然老化によるコラーゲン生合成能減少改善効果を確認した結果は、図３に示した。
リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物の自然老化によるコラーゲン生合成能減少改善効果を調べるために、線維芽細胞であるＣＣＤ－９８６Ｓｋを継代培養してｐａｓｓａｇｅ１５とｐａｓｓａｇｅ２０細胞を６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注した後、１０％ＦＢＳが含まれた培地で２４時間の間細胞培養条件で培養した。以後、培地を捨てて１×ＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で洗浄した後、ＦＢＳのない培地にリゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－４１混合物を多様な濃度（０、０．１、０．２、０．５μＭ）で培地に添加して２４時間の間細胞培養条件で培養した。各時間帯別に培養した培地を回収した後、プロコラーゲンのＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）を利用して培地に分泌されたプロコラーゲンの分泌量を４５０ｎｍの吸光度で測定して量を算定した。リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物の自然老化によるコラーゲン生合成能減少改善効果を確認した結果は、図３に示した。
【0089】
図３に示したように、リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－４１混合物を処理して２４時間後、リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物を処理していない群に比べてリゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物を処理した全ての群でコラーゲン合成能が増加したことを確認した。特に、リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物０．２μＭ処理群は、コラーゲン合成効能が１７．５％増加したことを確認した。
【0090】
実施例４．リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物のエラスチン分解酵素活性の抑制効果
リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物のエラスチン分解酵素活性抑制能を確認するために、Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ Ｅｌａｓｔａｓｅ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ方法を使用して（ＢＭＬ－ＡＫ４９７－００１、Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、ＵＳＡ）測定した。先ず、ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒをＤ．Ｗ．と１：１に希釈した後、エラスチン分解酵素試薬と基質試薬を最終濃度がそれぞれ２．２μＵ／ｍｌ及び１００μＭとなるように希釈した。そして、リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１を７５μＭずつ混合して最終濃度が１５０μＭとなるように希釈した。Ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎは、Ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒと、エラスチン分解酵素試薬と、リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物とを混合して製造した。上記ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎを９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに９５μＭずつ入れて３７℃で５分間反応した。次に、基質試薬５μＭを入れてＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｅｐｏｃｈ ２ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ．Ｂｉｏｔｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ、ＵＳＡ）で吸光度４０５ｎｍで１５分間吸光度を測定した。エラスチン分解酵素活性の抑制効果を確認した結果は、図４に示した。
リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物のエラスチン分解酵素活性抑制能を確認するために、Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ Ｅｌａｓｔａｓｅ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ方法を使用して（ＢＭＬ－ＡＫ４９７－００１、Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、ＵＳＡ）測定した。先ず、ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒをＤ．Ｗ．と１：１に希釈した後、エラスチン分解酵素試薬と基質試薬を最終濃度がそれぞれ２．２μＵ／ｍｌ及び１００μＭとなるように希釈した。そして、リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１を７５μＭずつ混合して最終濃度が１５０μＭとなるように希釈した。Ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎは、Ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒと、エラスチン分解酵素試薬と、リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物とを混合して製造した。上記ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎを９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに９５μＭずつ入れて３７℃で５分間反応した。次に、基質試薬５μＭを入れてＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｅｐｏｃｈ ２ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ．Ｂｉｏｔｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ、ＵＳＡ）で吸光度４０５ｎｍで１５分間吸光度を測定した。エラスチン分解酵素活性の抑制効果を確認した結果は、図４に示した。
【0091】
図４に示したように、リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物は、エラスチン分解酵素の抑制効能に優れることを確認した。さらに詳しくは、リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物処理群は、エラスチン分解酵素活性抑制能が３６．４±２．９５％であることを確認した。
【0092】
実施例５．リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物の細胞成長促進効能
５－１．表皮角質細胞の成長促進効能
リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物の細胞増殖能を確認するために、表皮角質細胞であるＨａＣａＴ ｃｅｌｌを６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注した後、１０％ＦＢＳが含まれた培地で６時間の間細胞培養条件で培養した。以後、リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物を多様な濃度（１００、２００、５００ｎＭ）で添加して８日間培養した。リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物が多様な濃度で含まれた培地に毎日交替し、二日間隔で細胞数を測定した。細胞数の測定結果は、図５に示した。
５－１．表皮角質細胞の成長促進効能
リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物の細胞増殖能を確認するために、表皮角質細胞であるＨａＣａＴ ｃｅｌｌを６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注した後、１０％ＦＢＳが含まれた培地で６時間の間細胞培養条件で培養した。以後、リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物を多様な濃度（１００、２００、５００ｎＭ）で添加して８日間培養した。リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物が多様な濃度で含まれた培地に毎日交替し、二日間隔で細胞数を測定した。細胞数の測定結果は、図５に示した。
【0093】
図５に示したように、リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物処理群は、濃度及び時間依存的に表皮角質細胞の成長を促進することを確認した。特に、リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物を処理して８日後、混合物を５００ｎＭ処理した群は細胞成長率が対照群と比べて約２０．７％高いことを確認した。
【0094】
５－２．線維芽細胞の成長促進効能
リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物の細胞増殖能を確認するために線維芽細胞であるＣＣＤ９８６Ｓｋ ｃｅｌｌを６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注した後、１０％ＦＢＳが含まれた培地で６時間の間細胞培養条件で培養した。以後、リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物を多様な濃度（１００、２００、５００ｎＭ）で添加して８日間培養した。リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物が多様な濃度で含まれた培地に毎日交替し、二日間隔で細胞数を測定した。細胞数測定結果は、図６に示した。
リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物の細胞増殖能を確認するために線維芽細胞であるＣＣＤ９８６Ｓｋ ｃｅｌｌを６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注した後、１０％ＦＢＳが含まれた培地で６時間の間細胞培養条件で培養した。以後、リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物を多様な濃度（１００、２００、５００ｎＭ）で添加して８日間培養した。リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物が多様な濃度で含まれた培地に毎日交替し、二日間隔で細胞数を測定した。細胞数測定結果は、図６に示した。
【0095】
図６に示したように、リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物処理群は、濃度及び時間依存的に線維芽細胞の成長を促進することを確認した。リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物を処理して８日後、混合物を５００ｎＭ処理した群は細胞成長率が対照群と比べて約２５％高いことを確認した。
【0096】
実施例６．リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物の傷回復効果の確認
６－１．表皮角質細胞の傷回復効果の確認
リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物の傷回復効果を確認するために、表皮角質細胞であるＨａＣａＴ ｃｅｌｌを６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに接着性のあるインサート（Ｉｎｓｅｒｔ、Ｉｂｉｄｉ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ）を付着した。インサートの各ｗｅｌｌに６×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注した後、２％ＦＢＳが含まれた培地で２４時間の間細胞培養条件で培養した。以後、インサートを除去して１×ＤＰＢＳを使用して一回洗浄した。ＦＢＳのない培地にリゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物を多様な濃度（０、１、２．５μＭ）で培地に添加して１６、４０時間後、顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ１００、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を使用して１００倍で細胞イメージを撮影した。撮影された顕微鏡写真は、図７に示した。
６－１．表皮角質細胞の傷回復効果の確認
リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物の傷回復効果を確認するために、表皮角質細胞であるＨａＣａＴ ｃｅｌｌを６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに接着性のあるインサート（Ｉｎｓｅｒｔ、Ｉｂｉｄｉ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ）を付着した。インサートの各ｗｅｌｌに６×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注した後、２％ＦＢＳが含まれた培地で２４時間の間細胞培養条件で培養した。以後、インサートを除去して１×ＤＰＢＳを使用して一回洗浄した。ＦＢＳのない培地にリゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物を多様な濃度（０、１、２．５μＭ）で培地に添加して１６、４０時間後、顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ１００、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を使用して１００倍で細胞イメージを撮影した。撮影された顕微鏡写真は、図７に示した。
【0097】
図７に示したように、リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物を処理した群は、いずれも表皮角質細胞の細胞数及び細胞移動能が増加したことを確認した。
【0098】
６－２．線維芽細胞の傷回復の効果
リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物の傷回復効果を確認するために、陳皮細胞であるＣＣＤ－９８６ｓｋを６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに接着性のあるインサート（Ｉｎｓｅｒｔ、Ｉｂｉｄｉ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ）を付着した。インサートの各ｗｅｌｌに６×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注した後、２％ＦＢＳが含まれた培地で２４時間の間細胞培養条件で培養した。以後、インサートを除去して１×ＤＰＢＳを使用して一回洗浄した。ＦＢＳのない培地にリゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物を多様な濃度（０、１、２．５μＭ）で培地に添加して１６、４０時間後、顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ１００、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を使用して１００倍で細胞イメージを測定した。撮影された顕微鏡写真は、図８に示した。
リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物の傷回復効果を確認するために、陳皮細胞であるＣＣＤ－９８６ｓｋを６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに接着性のあるインサート（Ｉｎｓｅｒｔ、Ｉｂｉｄｉ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ）を付着した。インサートの各ｗｅｌｌに６×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注した後、２％ＦＢＳが含まれた培地で２４時間の間細胞培養条件で培養した。以後、インサートを除去して１×ＤＰＢＳを使用して一回洗浄した。ＦＢＳのない培地にリゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物を多様な濃度（０、１、２．５μＭ）で培地に添加して１６、４０時間後、顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ１００、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を使用して１００倍で細胞イメージを測定した。撮影された顕微鏡写真は、図８に示した。
【0099】
図８に示したように、リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物を処理した群は、いずれも線維芽細胞の細胞数及び細胞移動能が増加したことを確認した。
【0100】
上記結果からリゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物は、皮膚細胞の細胞数を増加させ、細胞移動能を増加させることを確認したところ、創傷のような傷回復をより速く誘導可能なことを意味する。
【0101】
実施例７．動物モデルでリゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物の光老化によるシワ改善効果の確認
リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物の光老化によるシワ改善効果の測定のために、６週齢の雌ｈａｉｒｌｅｓｓ ｍｏｕｓｅ（ＳＫＨ、ＨＲ－１）をオリエントバイオで購入して使用した。全てのｍｏｕｓｅは、温度２４±２℃、湿度５０±１０％と最適な環境条件を維持させた実験室で１２ｈｒ／ｄａｙ明暗周期で飼育し、餌は自由に食べさせた。実験前の最小１週間の安定化期間をおき順化させた後、実験を始めた。本評価は、中央大学の医科大学で運営する動物実験倫理委員会の承認（Ｎｏ．２０２００００５８）を得た後、行った。図９に示すように、光老化モデルの製作のために実験動物などの部位に光老化による浅いシワを誘発するために、ＢＩＯ－ＳＰＥＣＴＲＡ（Ｖｉｒｂｅｒ Ｒｏｕｒｍａｔ、Ｆｒａｎｃｅ）を利用して週２～３回、２４週間ＵＶＢを照射した。以後、実験動物を麻酔（Ｚｏｌｅｔｉｌ：Ｒｏｍｐｕｎ＝３：１）した後、リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１の混合物を１：１で総１０ｐｐｍ、２０ｐｐｍ、１００ｐｐｍとヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ、ＨＡ）を混合した群、そしてヒアルロン酸が含まれていないリゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１を１：１で総１００ｐｐｍ使用した試験群をｍｏｕｓｅなどの部位に注入した。全ての試験群は、皮下に２００ｕｌをシワにｌｉｎｅａｒに注入した。注入後、０時間、１週間、２週間、４週間の経過につれて投与された群のシワ改善程度を評価した。群当たり１３匹を使用し、持続性評価用として５匹、組織染色用として８匹を使用した。シワ変化量は、ＰＲＩＭＯＳＬＩＴＥ（ＧＦＭｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を利用して分析した。分析プログラムは、Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＰＲＩＭＯＳ ５．８を利用し、本評価を通じてシワ変化を確認することができる粗さ（Ｒｏｕｇｈｎｅｓｓ ｐａｒａｍｅｔｅｒ、Ｒｍａｘ）を活用してシワ誘発後、リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物及びヒアルロン酸処理群、またはヒアルロン酸無処理群を進行後に４週間経過後のシワ変化に対する粗さを測定した。光老化によるシワ改善効果を確認した結果は、図９Ａ及びＢに示した。
リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物の光老化によるシワ改善効果の測定のために、６週齢の雌ｈａｉｒｌｅｓｓ ｍｏｕｓｅ（ＳＫＨ、ＨＲ－１）をオリエントバイオで購入して使用した。全てのｍｏｕｓｅは、温度２４±２℃、湿度５０±１０％と最適な環境条件を維持させた実験室で１２ｈｒ／ｄａｙ明暗周期で飼育し、餌は自由に食べさせた。実験前の最小１週間の安定化期間をおき順化させた後、実験を始めた。本評価は、中央大学の医科大学で運営する動物実験倫理委員会の承認（Ｎｏ．２０２００００５８）を得た後、行った。図９に示すように、光老化モデルの製作のために実験動物などの部位に光老化による浅いシワを誘発するために、ＢＩＯ－ＳＰＥＣＴＲＡ（Ｖｉｒｂｅｒ Ｒｏｕｒｍａｔ、Ｆｒａｎｃｅ）を利用して週２～３回、２４週間ＵＶＢを照射した。以後、実験動物を麻酔（Ｚｏｌｅｔｉｌ：Ｒｏｍｐｕｎ＝３：１）した後、リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１の混合物を１：１で総１０ｐｐｍ、２０ｐｐｍ、１００ｐｐｍとヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ、ＨＡ）を混合した群、そしてヒアルロン酸が含まれていないリゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１を１：１で総１００ｐｐｍ使用した試験群をｍｏｕｓｅなどの部位に注入した。全ての試験群は、皮下に２００ｕｌをシワにｌｉｎｅａｒに注入した。注入後、０時間、１週間、２週間、４週間の経過につれて投与された群のシワ改善程度を評価した。群当たり１３匹を使用し、持続性評価用として５匹、組織染色用として８匹を使用した。シワ変化量は、ＰＲＩＭＯＳＬＩＴＥ（ＧＦＭｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を利用して分析した。分析プログラムは、Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＰＲＩＭＯＳ ５．８を利用し、本評価を通じてシワ変化を確認することができる粗さ（Ｒｏｕｇｈｎｅｓｓ ｐａｒａｍｅｔｅｒ、Ｒｍａｘ）を活用してシワ誘発後、リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物及びヒアルロン酸処理群、またはヒアルロン酸無処理群を進行後に４週間経過後のシワ変化に対する粗さを測定した。光老化によるシワ改善効果を確認した結果は、図９Ａ及びＢに示した。
【0102】
図９Ａに示したように、比較群１（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて比較群２（ＵＶＢ）の紫外線を照射した群は、皮膚シワが多く生成されたことを確認した。一方、試験群１（Ｒｅｇｅｎｔｉｄｅ－０３４＿５ｐｐｍ＋Ｒｅｇｅｎｔｉｄｅ－０４１＿５ｐｐｍ＋ＨＡ）、試験群２（Ｒｅｇｅｎｔｉｄｅ－０３４＿１０ｐｐｍ＋Ｒｅｇｅｎｔｉｄｅ－０４１＿１０ｐｐｍ＋ＨＡ）、試験群３（Ｒｅｇｅｎｔｉｄｅ－０３４＿５０ｐｐｍ＋Ｒｅｇｅｎｔｉｄｅ－０４１＿５０ｐｐｍ＋ＨＡ）、試験群４（Ｒｅｇｅｎｔｉｄｅ－０３４＿５０ｐｐｍ＋Ｒｅｇｅｎｔｉｄｅ－０４１＿５０ｐｐｍ）では、比較群２（ＵＶＢ）の紫外線を照射した群に比べてシワ生成が少ないことを確認した。
【0103】
図９Ｂに示したように、ＰＲＩＭＯＳＬＩＴＥ（ＧＦＭｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を通じてシワ変化を確認することができる粗さ（Ｒｏｕｇｈｎｅｓｓ ｐａｒａｍｅｔｅｒ、Ｒ ｍａｘ）を確認した結果、比較群１（Ｃｏｎｔｒｏ）に比べて比較群２（ＵＶＢ）の紫外線を照射した群でシワ生成が約５０％増加したことを確認した。試験群１（ＵＶＢ＋Ｒｅｇｅｎｔｉｄｅ－０３４＿５ｐｐｍ＋Ｒｅｇｅｎｔｉｄｅ－０４１＿５ｐｐｍ＋ＨＡ）の場合、比較群２（ＵＶＢ）の紫外線のみ照射した群に比べて２９％、試験群２（ＵＶＢ＋Ｒｅｇｅｎｔｉｄｅ－０３４＿１０ｐｐｍ＋Ｒｅｇｅｎｔｉｄｅ－０４１＿１０ｐｐｍ＋ＨＡ）は３０％、試験群３（ＵＶＢ＋Ｒｅｇｅｎｔｉｄｅ－０３４＿５０ｐｐｍ＋Ｒｅｇｅｎｔｉｄｅ－０４１＿５０ｐｐｍ＋ＨＡ）は３１％と、リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物及びヒアルロン酸が含まれた試験群では約３０％程度のシワ改善効果を確認することができ、統計的有意性（＊＊、ｐ＜０．００１）があることを確認した。また、ヒアルロン酸を除いた試験群４（ＵＶＢ＋Ｒｅｇｅｎｔｉｄｅ－０３４＿５０ｐｐｍ＋Ｒｅｇｅｎｔｉｄｅ－０４１＿５０ｐｐｍ）であるＲｅｇｅｎｔｉｄｅ－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物のみ処理した試験群の場合も、比較群２（ＵＶＢ）の紫外線を照射した群に比べて１７％増加したことを確認し、統計的有意性（＊、ｐ＜０．００１）があることを確認した。これを通じてリゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物が紫外線により誘発された皮膚シワを改善させる効果を有するということを確認した。
【0104】
上記結果は、フィラーに使用されるヒアルロン酸とリゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１の混合物を混合して使用時に紫外線により誘発された皮膚シワ改善能が向上することを確認したところ、フィラー素材として活用されることができる。
【0105】
実施例８．シワ動物モデルでリゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物のコラーゲン発現量及びエラスチン発現量の確認
光老化によるシワ動物モデルにおいて、リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物によるコラーゲン発現量及びエラスチン発現量を確認するために、前記実施例７の比較群１、比較群２、試験群１～４の総６群の実験動物を犠牲させ、試験群を注入した皮膚組織を摘出して１０％ｎｅｕｔｒａｌ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｆｏｒｍａｌｉｎ溶液に固定した。その後、ｐａｒａｆｆｉｎに包埋して固め５ｕｍ切片を製作し、Ｍａｓｓｏｎ’ｓ ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ（ＭＴ） ｓｔａｉｎでコラーゲン生成量、Ｖｅｒｈｏｅｆｆ－Ｖａｎ Ｇｉｅｓｏｎ（ＶＶＧ） ｓｔａｉｎでエラスチン生成量を確認した。組織スライドスキャナ（Ｌｅｉｃａ、Ａｐｅｒｉｏ ＣＳ２、ＵＳＡ）を利用して組織スライドを２００倍率で観察した後、各スライド別に主要組織学的特徴を読取り、組織におけるコラーゲン及びエラスチン生成量に対する発現量を評価した。コラーゲン及びエラスチン生成量に対する発現量を確認した結果は、それぞれ図１０Ａ及びＢに示した。
光老化によるシワ動物モデルにおいて、リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１混合物によるコラーゲン発現量及びエラスチン発現量を確認するために、前記実施例７の比較群１、比較群２、試験群１～４の総６群の実験動物を犠牲させ、試験群を注入した皮膚組織を摘出して１０％ｎｅｕｔｒａｌ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｆｏｒｍａｌｉｎ溶液に固定した。その後、ｐａｒａｆｆｉｎに包埋して固め５ｕｍ切片を製作し、Ｍａｓｓｏｎ’ｓ ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ（ＭＴ） ｓｔａｉｎでコラーゲン生成量、Ｖｅｒｈｏｅｆｆ－Ｖａｎ Ｇｉｅｓｏｎ（ＶＶＧ） ｓｔａｉｎでエラスチン生成量を確認した。組織スライドスキャナ（Ｌｅｉｃａ、Ａｐｅｒｉｏ ＣＳ２、ＵＳＡ）を利用して組織スライドを２００倍率で観察した後、各スライド別に主要組織学的特徴を読取り、組織におけるコラーゲン及びエラスチン生成量に対する発現量を評価した。コラーゲン及びエラスチン生成量に対する発現量を確認した結果は、それぞれ図１０Ａ及びＢに示した。
【0106】
図１０Ａに示したように、コラーゲン発現量を比較した結果、比較群１（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較群２（ＵＶＢ）に比べて試験群１（Ｒｅｇｅｎｔｉｄｅ－０３４＿５ｐｐｍ＋Ｒｅｇｅｎｔｉｄｅ－０４１＿５ｐｐｍ＋ＨＡ）、試験群２（Ｒｅｇｅｎｔｉｄｅ－０３４＿１０ｐｐｍ＋Ｒｅｇｅｎｔｉｄｅ－０４１＿１０ｐｐｍ＋ＨＡ）、試験群３（Ｒｅｇｅｎｔｉｄｅ－０３４＿５０ｐｐｍ＋Ｒｅｇｅｎｔｉｄｅ－０４１＿５０ｐｐｍ＋ＨＡ）、試験群４（Ｒｅｇｅｎｔｉｄｅ－０３４＿５０ｐｐｍ＋Ｒｅｇｅｎｔｉｄｅ－０４１＿５０ｐｐｍ）のいずれもコラーゲン発現量が増加することを確認した。
【0107】
図１０Ｂに示したように、エラスチン発現量を比較した結果、比較群１（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較群２（ＵＶＢ）に比べて試験群１（Ｒｅｇｅｎｔｉｄｅ－０３４＿５ｐｐｍ＋Ｒｅｇｅｎｔｉｄｅ－０４１＿５ｐｐｍ＋ＨＡ）、試験群２（Ｒｅｇｅｎｔｉｄｅ－０３４＿１０ｐｐｍ＋Ｒｅｇｅｎｔｉｄｅ－０４１＿１０ｐｐｍ＋ＨＡ）、試験群３（Ｒｅｇｅｎｔｉｄｅ－０３４＿５０ｐｐｍ＋Ｒｅｇｅｎｔｉｄｅ－０４１＿５０ｐｐｍ＋ＨＡ）、試験群４（Ｒｅｇｅｎｔｉｄｅ－０３４＿５０ｐｐｍ＋Ｒｅｇｅｎｔｉｄｅ－０４１＿５０ｐｐｍ）のいずれもエラスチン発現量が増加することを確認した。
【0108】
上記結果は、リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１の混合物が皮膚内のコラーゲン及びエラスチン発現量を増加させることで、紫外線により誘発された皮膚シワを改善させる効果があることを意味する。
【0109】
以下、製剤例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。製剤例は、単に本発明を例示するためのもので、本発明の範囲が製剤例により制限されると解釈されない。
【0110】
製剤例１．化粧料製剤の製造
１－１．柔軟化粧水の製造
リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１の混合物０．１重量％、１，３－ブチレングリコール５．２重量％、オレイルアルコール１．５重量％、エタノール３．２重量％、ポリソルベート２０ ３．２重量％、ベンゾフェノン９ ２．０重量％、カルボキシルビニルポリマー１．０重量％、グリセリン３．５重量％、微量の香、微量の防腐剤及び残量の精製水を混合して通常の方法で柔軟化粧水を製造した。
１－１．柔軟化粧水の製造
リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１の混合物０．１重量％、１，３－ブチレングリコール５．２重量％、オレイルアルコール１．５重量％、エタノール３．２重量％、ポリソルベート２０ ３．２重量％、ベンゾフェノン９ ２．０重量％、カルボキシルビニルポリマー１．０重量％、グリセリン３．５重量％、微量の香、微量の防腐剤及び残量の精製水を混合して通常の方法で柔軟化粧水を製造した。
【0111】
１－２．ミルクローションの製造
リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１の混合物０．１重量％、グリセリン５．１重量％、プロピレングリコール４．２重量％、トコフェリルアセテート３．０重量％、流動パラフィン４．６重量％、トリエタノールアミン１．０重量％、スクアラン３．１重量％、マカデミアナッツオイル２．５重量％、ポリソルベート６０ １．６重量％、セスキオレイン酸ソルビタン１．６重量％、プロピルパラベン０．６重量％、カルボキシルビニルポリマー１．５重量％、微量の香、微量の防腐剤、残量の精製水を混合して通常の方法でミルクローションを製造した。
リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１の混合物０．１重量％、グリセリン５．１重量％、プロピレングリコール４．２重量％、トコフェリルアセテート３．０重量％、流動パラフィン４．６重量％、トリエタノールアミン１．０重量％、スクアラン３．１重量％、マカデミアナッツオイル２．５重量％、ポリソルベート６０ １．６重量％、セスキオレイン酸ソルビタン１．６重量％、プロピルパラベン０．６重量％、カルボキシルビニルポリマー１．５重量％、微量の香、微量の防腐剤、残量の精製水を混合して通常の方法でミルクローションを製造した。
【0112】
１－３．栄養クリームの製造
リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１の混合物０．５重量％、グリセリン４．０重量％、ワセリン３．５重量％、トリエタノールアミン２．１重量％、流動パラフィン５．３重量％、スクアラン３．０重量％、ミツロウ２．６重量％、トコフェリルアセテート５．４重量％、ポリソルベート６０ ３．２重量％、カルボキシルビニルポリマー１．０重量％、セスキオレイン酸ソルビタン３．１重量％、微量の香、微量の防腐剤及び残量の精製水を混合して通常の方法で栄養クリームを製造した。
リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１の混合物０．５重量％、グリセリン４．０重量％、ワセリン３．５重量％、トリエタノールアミン２．１重量％、流動パラフィン５．３重量％、スクアラン３．０重量％、ミツロウ２．６重量％、トコフェリルアセテート５．４重量％、ポリソルベート６０ ３．２重量％、カルボキシルビニルポリマー１．０重量％、セスキオレイン酸ソルビタン３．１重量％、微量の香、微量の防腐剤及び残量の精製水を混合して通常の方法で栄養クリームを製造した。
【0113】
１－４．マッサージクリームの製造
リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１の混合物０．５重量％、グリセリン４．０重量％、ワセリン３．５重量％、トリエタノールアミン０．５重量％、流動パラフィン２４．０重量％、スクアラン３．０重量％、ミツロウ２．１重量％、トコフェリルアセテート０．１重量％、ポリソルベート６０ ２．４重量％、カルボキシルビニルポリマー１．０重量％、セスキオレイン酸ソルビタン２．３重量％、微量の香、微量の防腐剤及び残量の精製水を混合して通常の方法でマッサージクリームを製造した。
リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１の混合物０．５重量％、グリセリン４．０重量％、ワセリン３．５重量％、トリエタノールアミン０．５重量％、流動パラフィン２４．０重量％、スクアラン３．０重量％、ミツロウ２．１重量％、トコフェリルアセテート０．１重量％、ポリソルベート６０ ２．４重量％、カルボキシルビニルポリマー１．０重量％、セスキオレイン酸ソルビタン２．３重量％、微量の香、微量の防腐剤及び残量の精製水を混合して通常の方法でマッサージクリームを製造した。
【0114】
１－５．洗浄用ボディークレンザーの製造
リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１の混合物１ｇ、陰イオン界面活性剤１８ｇ、非イオン界面活性剤５ｇ、グリセリン７ｇ、塩化ナトリウム３ｇ、天然オリーブ液相石鹸１．５ｇ、香料１ｇ及び水１００ｇを混合して通常の方法で洗浄用ボディークレンザーを製造した。
リゼンタイド－０３４及びリゼンタイド－０４１の混合物１ｇ、陰イオン界面活性剤１８ｇ、非イオン界面活性剤５ｇ、グリセリン７ｇ、塩化ナトリウム３ｇ、天然オリーブ液相石鹸１．５ｇ、香料１ｇ及び水１００ｇを混合して通常の方法で洗浄用ボディークレンザーを製造した。
【0115】
以上、本発明内容の特定の部分を詳しく記述したところ、当業界の通常の知識を有する者において、このような具体的な技術は単に好ましい実施様態であるだけであり、これにより本発明の範囲が制限されるものではない点は明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付された請求項とそれらの等価物によって定義されるといえる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】