特許 7520386 持続性感染または癌の予防または治療における医薬組成物、ワクチン及びそれらの使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-07-12

(45)【発行日】2024-07-23

(54)【発明の名称】持続性感染または癌の予防または治療における医薬組成物、ワクチン及びそれらの使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/00 20060101AFI20240716BHJP

   A61K 31/122 20060101ALI20240716BHJP

   A61K 31/4745 20060101ALI20240716BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240716BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20240716BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20240716BHJP

   A61P 31/10 20060101ALI20240716BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240716BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20240716BHJP

【ＦＩ】

A61K39/00 H ZNA

A61K31/122

A61K31/4745

A61P43/00 121

A61P31/12

A61P31/04

A61P31/10

A61P35/00

A61K39/39

【請求項の数】 14

(21)【出願番号】P 2021523181

(86)(22)【出願日】2019-10-31

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-01-17

(86)【国際出願番号】 EP2019079821

(87)【国際公開番号】W WO2020094496

(87)【国際公開日】2020-05-14

【審査請求日】2022-08-29

(31)【優先権主張番号】18204287.9

(32)【優先日】2018-11-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】520363878

【氏名又は名称】ユニバーシタッツメディズィン デア ヨハネス グーテンベルク－ユニバーシタット マインツ

(74)【代理人】

【識別番号】100091683

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼川 俊雄

(74)【代理人】

【識別番号】100179316

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 寛奈

(72)【発明者】

【氏名】ラドサック，マルクス

(72)【発明者】

【氏名】ソール，ユリアン

(72)【発明者】

【氏名】スタッセン，マイケル

(72)【発明者】

【氏名】ハルトマン，アン－カトリン

【審査官】佐々木 大輔

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０１７／０１００４７７（ＵＳ，Ａ１）

【文献】Journal of Dermatological Science，2017年，Vol.87，pp.260-267，http://dx.doi.org/10.1016/j.jdermsci.2017.07.018

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３９／００－３９／４４

Ａ６１Ｋ ３１／００－３３／４４

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも以下の成分：
（ａ）ジスラノール（アントラリン、シグノリン）、
（ｂ）イミキモド（Ｒ８３７）、
（ｃ）少なくとも１つのペプチド抗原、を含む医薬組成物。

【請求項2】

前記少なくとも１つのペプチド抗原が、（ｉ）主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ（ＭＨＣＩ）リガンド、（ｉｉ）主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）リガンド、または、（ｉｉｉ）前記ＭＨＣＩ及び／またはＭＨＣＩＩリガンドのうちの１つ以上を含むペプチドからなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

前記少なくとも１つのペプチド抗原が、配列番号１（ＰＬＤＧＥＹＦＴＬ）、配列番号２（ＹＭＮＧＴＭＳＱＶ），配列番号３（ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ）、配列番号４（ＶＬＲＥＮＴＳＰＫ）、配列番号５（ＳＰＳＳＮＲＩＲＮＴ）、配列番号６（ＲＬＶＴＬＫＤＩＶ）、配列番号７（ＡＶＦＤＲＫＳＤＡＫ）、配列番号８（ＧＬＳＰＴＶＷＬＳＶ）、配列番号９（ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ）、配列番号１０（ＫＩＲＬＲＰＧＧＫ）、配列番号１１（ＴＰＧＰＧＶＲＹＰＬ）、配列番号１２（ＩＬＧＦＶＦＴＬＴＶ）、配列番号１３（ＶＬＴＤＧＮＰＰＥＶ）、配列番号１４（ＴＱＨＦＶＱＥＮＹＬＥＹ）、配列番号１５（ＷＲＲＡＰＡＰＧＡＫＡＭＡＰＧ）、配列番号１６（ＦＲＫＱＮＰＤＩＶＩＱＹＭＤＤＬＹＶＧ）、配列番号１７（ＲＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴＴＫＮＩＩＧＴＩ）、配列番号１８（ＰＧＰＬＲＥＳＩＶＣＹＦＭＶＦＬＱＴＨＩ）、配列番号１９（ＰＹＹＴＧＥＨＡＫＡＩＧＮ）、配列番号２０，（ＩＡＦＮＳＧＭＥＰＧＶＶＡＥＫＶ）、配列番号２１（ＫＱＥＥＬＥＲＤＬＲＫＴＫＫＫＩ）、配列番号２２（ＧＲＤＩＫＶＱＦＱＳＧＧＮＮＳＰＡＶ）、配列番号２３（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）、配列番号２４（ＳＩＩＱＦＥＨＬ）、配列番号２５（ＳＧＰＳＮＴＰＰＥＩ）、及び前記アミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸が化学基、好ましくはＮＨ_２またはＣＨ_３に連結されているその修飾形態のアミノ酸配列を含む合成ペプチドまたは単離された天然に存在するペプチドである、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項4】

前記組成物が、０．３１２５重量％～４重量％のジスラノール（アントラリン、シグノリン）、０．１重量％～１０重量％のイミキモド（Ｒ８３７）、及び０．０１重量％～３０重量％の少なくとも１つのペプチド抗原、を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項5】

前記組成物の前記３つの成分が、無傷のまたは病変の皮膚領域への局所投与に適合した形態で存在する、請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項6】

前記組成物が、薬学的に許容されるビヒクル、希釈剤、アジュバントまたは賦形剤をさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項7】

前記組成物がワクチンの形態で提供される、請求項１～６のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項8】

持続性のウイルス感染症、細菌感染症または真菌感染症の予防または治療に使用するための、請求項１～７のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項9】

癌の予防または治療に使用するための、請求項１～７のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項10】

少なくとも以下の成分：
（ａ）ジスラノール（アントラリン、シグノリン）、
（ｂ）イミキモド（Ｒ８３７）、
（ｃ）少なくとも１つのペプチド抗原を含む医薬併用調製物であって、
成分（ａ）及び成分（ｂ）及び（ｃ）が、少なくとも２つの別個の製剤で存在する、調製物。

【請求項11】

前記製剤中の成分（ａ）、成分（ｂ）及び成分（ｃ）が、請求項１～７のいずれか一項に記載のとおり定義される、請求項９に記載の医薬併用調製物。

【請求項12】

成分（ａ）の前記製剤が、成分（ｂ）及び前記成分（ｃ）の製剤と同時にまたは連続してヒトまたは動物の身体に適用されるように適合されている、請求項１０または請求項１１に記載の医薬併用調製物。

【請求項13】

持続性のウイルス感染症、細菌感染症または真菌感染症の予防または治療に使用するための、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の医薬併用調製物。

【請求項14】

癌の予防または治療に使用するための、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の医薬併用調製物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ジスラノール（アントラリン、シグノリン）、または他のアントロンまたはヒドロキシアントラセン、少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体７（ＴＬＲ７）リガンド、及び少なくとも１つのペプチド抗原からなる群から選択される少なくとも１つの酸化ストレッサーを含む医薬組成物に関する。本発明は、これらの成分を含む医薬併用調製物、及び持続性ウイルス感染症、細菌感染症もしくは真菌感染症、または癌の予防もしくは治療に使用するためのそのような医薬組成物または併用調製物の使用にさらに関する。本発明の医薬組成物または併用調製物は、ヒトまたは動物の身体の皮膚への局所適用に特に有用である。

【背景技術】

【0002】

自然免疫系の活性化は、適応免疫応答を開始するための前提条件である。これらの応答を誘発する主要経路のうちの１つは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）を介した異物の認識であり、その結果として、抗原提示細胞（ＡＰＣ）が活性化され、様々な炎症誘発性メディエーターが産生される（Ｔａｋｅｄａ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００３），Ｖｏｌ．２１：３３５－３７６）。

【0003】

ＴＬＲは、様々な外因性及び内因性リガンドを認識し、天然及び合成ＴＬＲリガンドがＴＬＲへ結合することにより、複数のサイトカインの産生が誘導され、その結果として自然免疫及び獲得免疫が強化される（Ｖａｓｉｌａｋｏｓ ＪＰ，Ｔｏｍａｉ ＭＡ．Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ７／８ ａｇｏｎｉｓｔｓ ａｓ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔｓ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ．２０１３；１２：８０９－１９；Ａｒａｎｄａ Ｆ，Ｖａｃｃｈｅｌｌｉ Ｅ，Ｏｂｒｉｓｔ Ｆ，Ｅｇｇｅｒｍｏｎｔ Ａ，Ｇａｌｏｎ Ｊ，Ｓａｕｔｅｓ－Ｆｒｉｄｍａｎ Ｃ，Ｃｒｅｍｅｒ Ｉ，Ｈｅｎｒｉｋ Ｔｅｒ Ｍｅｕｌｅｎ Ｊ，Ｚｉｔｖｏｇｅｌ Ｌ，Ｋｒｏｅｍｅｒ Ｇ，Ｇａｌｌｕｚｚｉ Ｌ．Ｔｒｉａｌ Ｗａｔｃｈ：Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｇｏｎｉｓｔｓ ｉｎ ｏｎｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１４；３：ｅ２９１７９；Ｄｏｗｌｉｎｇ ＪＫ，Ｍａｎｓｅｌｌ Ａ．Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｔｈｅ ｓｗｉｓｓ ａｒｍｙ ｋｎｉｆｅ ｏｆ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｃｌｉｎ Ｔｒａｎｓｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１６；５：ｅ８５）。ＴＬＲに結合するように設計された小さい化合物は、感染症及び癌のワクチン及びアジュバントの潜在的な薬物である。エンドソームで発現するＴＬＲ７及びＴＬＲ８は、構造的類似性を有しており、微生物の一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を認識する。合成ｓｓＲＮＡのイミダゾキノリン化合物であるイミキモド（Ｒ８３７）及びレシキモド（Ｒ８４８）は、ＴＬＲ７のみ、及びＴＬＲ７とＴＬＲ８の両方にそれぞれ結合する（Ｄｏｃｋｒｅｌｌ ＤＨ，Ｋｉｎｇｈｏｒｎ ＧＲ．Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ ａｎｄ ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ ａｓ ｎｏｖｅｌ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ．Ｊ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００１；４８：７５１－５；Ｓｃｈｏｎ ＭＰ，Ｓｃｈｏｎ Ｍ．ＴＬＲ７ ａｎｄ ＴＬＲ８ ａｓ ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００８；２７：１９０－９）。しかし、レシキモドはマウスＴＬＲ８媒介活性化を発揮することはない。ＴＬＲ７／８媒介シグナル伝達は、ＡＰＣによるＮＦ－ｋＢ媒介炎症性サイトカイン及びケモカイン、ならびにＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）の産生を誘導し、エフェクターＴ細胞の増強をもたらす（Ｖａｓｉｌａｋｏｓ ＪＰ，Ｔｏｍａｉ ＭＡ．Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ７／８ ａｇｏｎｉｓｔｓ ａｓ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔｓ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ．２０１３；１２：８０９－１９；Ｓｍｉｔｓ ＥＬ，Ｐｏｎｓａｅｒｔｓ Ｐ，Ｂｅｒｎｅｍａｎ ＺＮ， Ｖａｎ Ｔｅｎｄｅｌｏｏ ＶＦ．Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ＴＬＲ７ ａｎｄ ＴＬＲ８ ｌｉｇａｎｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ．２００８；１３：８５９－７５；Ｍｅｙｅｒ Ｔ，Ｓｕｒｂｅｒ Ｃ，Ｆｒｅｎｃｈ ＬＥ，Ｓｔｏｃｋｆｌｅｔｈ Ｅ．Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ，ａ ｔｏｐｉｃａｌ ｄｒｕｇ ｆｏｒ ｖｉｒａｌ ｓｋｉｎ ｌｅｓｉｏｎｓ ａｎｄ ｓｋｉｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ．２０１３；２２：１４９－５９）。

【0004】

一部のイミダゾキノリンは、ＴＬＲ耐性ならびに炎症誘発性及びアポトーシス促進性の悪影響を回避するために、非黒色腫皮膚癌及びウイルス性皮膚病変の治療のための局所投与薬として臨床現場で適用されている（Ｈａｙａｓｈｉ Ｔ，Ｇｒａｙ ＣＳ，Ｃｈａｎ Ｍ，Ｔａｗａｔａｏ Ｒｌ，Ｒｏｎａｃｈｅｒ Ｌ，ＭｃＧａｒｇｉｌｌ ＭＡ，Ｄａｔｔａ ＳＫ，Ｃａｒｓｏｎ ＤＡ，Ｃｏｒｒ Ｍ．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｂｙ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ７．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００９；１０６：２７６４－９；Ｍｉｃａｌｉ Ｇ，Ｌａｃａｒｒｕｂｂａ Ｆ，Ｎａｓｃａ ＭＲ，Ｓｃｈｗａｒｔｚ ＲＡ．Ｔｏｐｉｃａｌ ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｓｋｉｎ ｃａｎｃｅｒ：ｐａｒｔ Ｉ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．Ｊ Ａｍ Ａｃａｄ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２０１４；７０：９６５．ｅ１ －１２；ｑｕｉｚ ７７－８；Ｍａｒｋ ＫＥ，Ｓｐｒｕａｎｃｅ Ｓ，Ｋｉｎｇｈｏｒｎ ＧＲ，Ｓａｃｋｓ ＳＬ，Ｓｌａｄｅ ＨＢ，Ｍｅｎｇ ＴＣ，Ｓｅｌｋｅ Ｓ，Ｍａｇａｒｅｔ Ａ，Ｗａｌｄ Ａ．Ｔｈｒｅｅ ｐｈａｓｅ ＩＩＩ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌｓ ｏｆ ｔｏｐｉｃａｌ ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ ０．０１ －ｐｅｒｃｅｎｔ ｇｅｌ ｔｏ ｒｅｄｕｃｅ ａｎｏｇｅｎｉｔａｌ ｈｅｒｐｅｓ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅｓ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２０１４；５８：５０１６－２３；Ｒｏｏｋ ＡＨ，Ｇｅｌｆａｎｄ ＪＭ，Ｗｙｓｏｃｋａ Ｍ，Ｔｒｏｘｅｌ ＡＢ，Ｂｅｎｏｉｔ Ｂ，Ｓｕｒｂｅｒ Ｃ，Ｅｌｅｎｉｔｓａｓ Ｒ，Ｂｕｃｈａｎａｎ ＭＡ，Ｌｅａｈｙ ＤＳ，Ｗａｔａｎａｂｅ Ｒ，Ｋｉｒｓｃｈ ＩＲ，Ｋｉｍ ＥＪ，Ｃｌａｒｋ ＲＡ．Ｔｏｐｉｃａｌ ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ ｃａｎ ｉｎｄｕｃｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｔ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ．２０１５；１２６：１４５２－６１）。

【0005】

近年では、レシキモド及びその関連コンジュゲートなどのＴＬＲ７アゴニストの全身投与または腫瘍内投与は、マウス腫瘍モデルにおいてＴＡＭまたはＭＤＳＣ媒介免疫抑制を阻害することにより効率的な腫瘍退縮を誘導することが示された（Ｓｐｉｎｅｔｔｉ Ｔ，Ｓｐａｇｎｕｏｌｏ Ｌ，Ｍｏｔｔａｓ Ｉ，Ｓｅｃｏｎｄｉｎｉ Ｃ，Ｔｒｅｉｎｉｅｓ Ｍ，Ｒｕｅｇｇ Ｃ，Ｈｏｔｚ Ｃ，Ｂｏｕｒｑｕｉｎ Ｃ．ＴＬＲ７－ｂａｓｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ ｍｙｅｌｏｉｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｂｌｏｃｋｓ ｔｈｅｉｒ ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１６；５：ｅ１２３０５７８；Ｓａｔｏ－Ｋａｎｅｋｏ Ｆ，Ｙａｏ Ｓ，Ａｈｍａｄｉ Ａ，Ｚｈａｎｇ ＳＳ，Ｈｏｓｏｙａ Ｔ，Ｋａｎｅｄａ ＭＭ，Ｖａｒｎｅｒ ＪＡ，Ｐｕ Ｍ，Ｍｅｓｓｅｒ ＫＳ，Ｇｕｉｄｕｃｃｉ Ｃ，Ｃｏｆｆｍａｎ ＲＬ，Ｋｉｔａｕｒａ Ｋ，Ｍａｔｓｕｔａｎｉ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ＴＬＲ ａｇｏｎｉｓｔｓ ａｎｄ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ．ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ．２０１７；２：ｅ９３３９７）。ＨＮＣなどのＰＤ－１遮断療法抵抗性及び免疫抑制性腫瘍では、ＴＬＲ７アゴニストとＰＤ－１遮断との併用治療が効果的な癌免疫療法となり得る。この研究では、２つのＰＤ－Ｌ１遮断抵抗性腫瘍モデルにおいて、全身性低用量レシキモドの単剤療法と抗ＰＤ－Ｌ１治療との併用療法の効果を調べた。

【0006】

細胞傷害性Ｔ細胞は、細胞内病原体または腫瘍細胞を排除するための直接的または間接的な臨床標的である。近年の免疫戦略では、Ｔ細胞、特に細胞傷害性Ｔ細胞を活性化する試みを行うが、この方法には、長期的効果を有する効率的なＴ細胞応答を生成する能力がない。通常、そのような応答は、持続可能な免疫応答を開始するために、免疫系のメモリー細胞によって媒介される。

【0007】

米国特許第９０１７６５４号明細書では、少なくとも１つのＴＬＲ７リガンド及びＭＨＣクラスＩ分子及びＭＨＣクラスＩＩ分子のうちの少なくとも１つによって提示される能力を有するＭＨＣＩリガンドまたはＭＨＣＩＩリガンドとして適格であるペプチドを含む医薬調製物について記載している。医薬調製物は、ウイルス、細菌、または真菌によって引き起こされる疾患に利用される。しかし、この調製物は効率的な治療的免疫応答を引き出すことができず、その根本的な問題は、誘導された免疫応答が持続可能なメモリー免疫応答、特に治療的に有効なメモリーＴ細胞応答を引き起こすことができないことである。

【0008】

別のアプローチでは、異なるＴＩＬプロファイルを呈する２つのＰＨＴＬ１遮断抵抗性腫瘍モデルにおける全身レシキモド投与免疫療法及びＰＤ－Ｌ１遮断との併用治療を示唆している（Ｎｉｓｈｉｉ Ｎ ｅｔ ａｌ．，ｏｎｃｏ－ｔａｒｇｅｔ（２０１８），Ｖｏｌ．９：１３３０１－１３１２）。ここでも、このアプローチは、メモリーＴ細胞応答を引き起こすことなく、その結果、ウイルス誘発細胞または腫瘍細胞の認識及び破壊をもたらす。

【0009】

代替アプローチは、有効量の抗原またはワクチンと併用したインフルエンザワクチン接種のアジュバントとしてのアントラリンを記載している米国特許公開第２０１７／０１００４７７（Ａ１）号に開示されている。ワクチンと併用したイミキモドは、ワクチン単独と比較した場合にマウスの生存を改善するためのアジュバント効果のために使用された。

【0010】

９－フェナントロールが、マウスにおけるイミキモドによる経皮免疫後のＣＤ８＋Ｔ細胞応答の生成を増強することも示唆された（Ｈａｒｔｍａｎｎ Ａｎｎ－Ｋａｔｈｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，「９－Ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ＣＤ８＋Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ ｉｎ ｍｉｃｅ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．８７，ｉｓｓｕｅ ３，１２ Ａｕｇｕｓｔ ２０１７）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0011】

【文献】米国特許第９０１７６５４号明細書

【非特許文献】

【0012】

【文献】Ｔａｋｅｄａ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００３），Ｖｏｌ．２１：３３５－３７６

【文献】Ｖａｓｉｌａｋｏｓ ＪＰ，Ｔｏｍａｉ ＭＡ．Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ７／８ ａｇｏｎｉｓｔｓ ａｓ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔｓ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ．２０１３；１２：８０９－１９；Ａｒａｎｄａ Ｆ，Ｖａｃｃｈｅｌｌｉ Ｅ，Ｏｂｒｉｓｔ Ｆ，Ｅｇｇｅｒｍｏｎｔ Ａ，Ｇａｌｏｎ Ｊ，Ｓａｕｔｅｓ－Ｆｒｉｄｍａｎ Ｃ，Ｃｒｅｍｅｒ Ｉ，Ｈｅｎｒｉｋ Ｔｅｒ Ｍｅｕｌｅｎ Ｊ，Ｚｉｔｖｏｇｅｌ Ｌ，Ｋｒｏｅｍｅｒ Ｇ，Ｇａｌｌｕｚｚｉ Ｌ．Ｔｒｉａｌ Ｗａｔｃｈ：Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｇｏｎｉｓｔｓ ｉｎ ｏｎｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１４；３：ｅ２９１７９；Ｄｏｗｌｉｎｇ ＪＫ，Ｍａｎｓｅｌｌ Ａ．Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｔｈｅ ｓｗｉｓｓ ａｒｍｙ ｋｎｉｆｅ ｏｆ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｃｌｉｎ Ｔｒａｎｓｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１６；５：ｅ８５

【文献】Ｄｏｃｋｒｅｌｌ ＤＨ，Ｋｉｎｇｈｏｒｎ ＧＲ．Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ ａｎｄ ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ ａｓ ｎｏｖｅｌ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ．Ｊ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００１；４８：７５１－５；Ｓｃｈｏｎ ＭＰ，Ｓｃｈｏｎ Ｍ．ＴＬＲ７ ａｎｄ ＴＬＲ８ ａｓ ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００８；２７：１９０－９

【文献】Ｖａｓｉｌａｋｏｓ ＪＰ，Ｔｏｍａｉ ＭＡ．Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ７／８ ａｇｏｎｉｓｔｓ ａｓ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔｓ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ．２０１３；１２：８０９－１９；Ｓｍｉｔｓ ＥＬ，Ｐｏｎｓａｅｒｔｓ Ｐ，Ｂｅｒｎｅｍａｎ ＺＮ， Ｖａｎ Ｔｅｎｄｅｌｏｏ ＶＦ．Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ＴＬＲ７ ａｎｄ ＴＬＲ８ ｌｉｇａｎｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ．２００８；１３：８５９－７５；Ｍｅｙｅｒ Ｔ，Ｓｕｒｂｅｒ Ｃ，Ｆｒｅｎｃｈ ＬＥ，Ｓｔｏｃｋｆｌｅｔｈ Ｅ．Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ，ａ ｔｏｐｉｃａｌ ｄｒｕｇ ｆｏｒ ｖｉｒａｌ ｓｋｉｎ ｌｅｓｉｏｎｓ ａｎｄ ｓｋｉｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ．２０１３；２２：１４９－５９

【文献】Ｈａｙａｓｈｉ Ｔ，Ｇｒａｙ ＣＳ，Ｃｈａｎ Ｍ，Ｔａｗａｔａｏ Ｒｌ，Ｒｏｎａｃｈｅｒ Ｌ，ＭｃＧａｒｇｉｌｌ ＭＡ，Ｄａｔｔａ ＳＫ，Ｃａｒｓｏｎ ＤＡ，Ｃｏｒｒ Ｍ．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｂｙ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ７．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００９；１０６：２７６４－９；Ｍｉｃａｌｉ Ｇ，Ｌａｃａｒｒｕｂｂａ Ｆ，Ｎａｓｃａ ＭＲ，Ｓｃｈｗａｒｔｚ ＲＡ．Ｔｏｐｉｃａｌ ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｓｋｉｎ ｃａｎｃｅｒ：ｐａｒｔ Ｉ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．Ｊ Ａｍ Ａｃａｄ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２０１４；７０：９６５．ｅ１ －１２；ｑｕｉｚ ７７－８；Ｍａｒｋ ＫＥ，Ｓｐｒｕａｎｃｅ Ｓ，Ｋｉｎｇｈｏｒｎ ＧＲ，Ｓａｃｋｓ ＳＬ，Ｓｌａｄｅ ＨＢ，Ｍｅｎｇ ＴＣ，Ｓｅｌｋｅ Ｓ，Ｍａｇａｒｅｔ Ａ，Ｗａｌｄ Ａ．Ｔｈｒｅｅ ｐｈａｓｅ ＩＩＩ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌｓ ｏｆ ｔｏｐｉｃａｌ ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ ０．０１ －ｐｅｒｃｅｎｔ ｇｅｌ ｔｏ ｒｅｄｕｃｅ ａｎｏｇｅｎｉｔａｌ ｈｅｒｐｅｓ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅｓ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２０１４；５８：５０１６－２３；Ｒｏｏｋ ＡＨ，Ｇｅｌｆａｎｄ ＪＭ，Ｗｙｓｏｃｋａ Ｍ，Ｔｒｏｘｅｌ ＡＢ，Ｂｅｎｏｉｔ Ｂ，Ｓｕｒｂｅｒ Ｃ，Ｅｌｅｎｉｔｓａｓ Ｒ，Ｂｕｃｈａｎａｎ ＭＡ，Ｌｅａｈｙ ＤＳ，Ｗａｔａｎａｂｅ Ｒ，Ｋｉｒｓｃｈ ＩＲ，Ｋｉｍ ＥＪ，Ｃｌａｒｋ ＲＡ．Ｔｏｐｉｃａｌ ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ ｃａｎ ｉｎｄｕｃｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｔ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ．２０１５；１２６：１４５２－６１

【文献】Ｓｐｉｎｅｔｔｉ Ｔ，Ｓｐａｇｎｕｏｌｏ Ｌ，Ｍｏｔｔａｓ Ｉ，Ｓｅｃｏｎｄｉｎｉ Ｃ，Ｔｒｅｉｎｉｅｓ Ｍ，Ｒｕｅｇｇ Ｃ，Ｈｏｔｚ Ｃ，Ｂｏｕｒｑｕｉｎ Ｃ．ＴＬＲ７－ｂａｓｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ ｍｙｅｌｏｉｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｂｌｏｃｋｓ ｔｈｅｉｒ ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１６；５：ｅ１２３０５７８；Ｓａｔｏ－Ｋａｎｅｋｏ Ｆ，Ｙａｏ Ｓ，Ａｈｍａｄｉ Ａ，Ｚｈａｎｇ ＳＳ，Ｈｏｓｏｙａ Ｔ，Ｋａｎｅｄａ ＭＭ，Ｖａｒｎｅｒ ＪＡ，Ｐｕ Ｍ，Ｍｅｓｓｅｒ ＫＳ，Ｇｕｉｄｕｃｃｉ Ｃ，Ｃｏｆｆｍａｎ ＲＬ，Ｋｉｔａｕｒａ Ｋ，Ｍａｔｓｕｔａｎｉ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ＴＬＲ ａｇｏｎｉｓｔｓ ａｎｄ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ．ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ．２０１７；２：ｅ９３３９７

【文献】Ｎｉｓｈｉｉ Ｎ ｅｔ ａｌ．，ｏｎｃｏ－ｔａｒｇｅｔ（２０１８），Ｖｏｌ．９：１３３０１－１３１２

【文献】Ｈａｒｔｍａｎｎ Ａｎｎ－Ｋａｔｈｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，「９－Ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ＣＤ８＋Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ ｉｎ ｍｉｃｅ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．８７，ｉｓｓｕｅ ３，１２ Ａｕｇｕｓｔ ２０１７

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

したがって、本発明の目的は、持続性ウイルス、細菌感染症もしくは真菌感染症または癌などの新生物性疾患を予防または治療するために、治療的に有効なメモリーＴ細胞応答を誘導する能力を有する医薬組成物及び併用調製物を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0014】

この目的は、少なくとも以下の成分：（ａ）ジスラノール（アントラリン、シグノリン）、または他のアントロンまたはヒドロキシアントラセンからなる群から選択される少なくとも１つの酸化ストレッサー、（ｂ）少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体７（ＴＬＲ７）リガンド、及び（ｃ）少なくとも１つのペプチド抗原、を含む医薬組成物または医薬併用調製物によって解決される。

【0015】

酸化ストレッサーは、酸化ストレス（＝酸化ストレス物質）を引き起こす物質または剤である。

【0016】

驚くべきことに、ジスラノールなどの酸化ストレッサーの同時または連続投与は、少なくとも１つのＴＬＲ７リガンド及びＴエフェクター細胞によって認識される抗原エピトープを含むペプチド抗原と併用して投与された場合、細胞傷害性Ｔ細胞の相乗的活性化を強化するであろうことが見出された。相乗的併用は、改善された全身性Ｔ細胞付与免疫応答を引き起こし、その後メモリーＴ細胞応答を活性化し、これにより、病原体及び腫瘍細胞の認識及び破壊をより効率的にする。したがって、本発明の調製物は、ジスラノールなどの酸化的ストレッサーを適用せずに、ＴＬＲ７リガンドとペプチド抗原のみの併用と比較してより効率的である。本発明で使用されるジスラノールは、ヒドロキシアントロン、アントラセン誘導体、好ましくは１，８－ジヒドロキシ－９－アントロンである化合物である。

【0017】

３つの化合物の相乗効果及び医薬薬物としてのそれらの適用は、医薬組成物及び調製物を、進行性腫瘍疾患またはシステム病原体感染症、特にウイルス感染症に罹患する患者の治療に好適となるものとする。本発明の医薬組成物及び調製物は、好ましくは、経皮ワクチン接種によって媒介される患者（ヒトまたは動物）の皮膚への局所投与に好適である。

【0018】

好ましい実施形態では、本発明の組成物または併用調製物のＴＬＲ７リガンドは、イミキモド（Ｒ８３７）、ロキソリビン及び／またはレシキモド（Ｒ８４８）である。本発明はまた、同じまたは同様の治療効果をもたらす、同じ生物学的または薬学的活性を有するイミキモド、ロキソリビン及び／またはレシキモドの類似体または修飾形態を包含する。本発明の組成物のＴＬＲ７リガンドは、ＴＬＲ７受容体によって認識され、１つ以上のシグナルをトリガーして免疫応答を促進できる能力を有する限り、任意の起源、すなわち天然及び／または合成起源であり得る。したがって、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、ポリ－（Ｉ：Ｃ）またはＣｐＧ－ＤＮＡなどの他のＴＬＲ７リガンドも、本発明による組成物及び併用調製物中で使用するのに好適である化合物である。

【0019】

好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物の少なくとも１つのペプチド抗原は、（ｉ）主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ（ＭＨＣＩ）リガンド、（ｉｉ）主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）リガンド、または（ｉｉｉ）ＭＨＣＩ及び／またはＭＨＣＩＩリガンドのうちの１つ以上を含むペプチドからなる群から選択される。ペプチド抗原は、細胞傷害性Ｔ細胞によって認識される能力を有し、好ましくは、ウイルス、真菌、または細菌源のペプチドである。あるいは、ＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示される腫瘍特異的ペプチドまたは腫瘍関連ペプチドは、本発明に含まれる。

【0020】

本発明による「ペプチド抗原」という用語は、ペプチドのみでなく、ポリペプチド、及びタンパク質も指す。

【0021】

好適なペプチド抗原は、以下のアミノ酸配列のうちの１つを含むか、または以下のアミノ酸配列のうちの１つからなる、任意の合成ペプチドまたは単離された天然に存在するペプチドであり得る：配列番号１（ＰＬＤＧＥＹＦＴＬ）、配列番号２（ＹＭＮＧＴＭＳＱＶ），配列番号３（ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ）、配列番号４（ＶＬＲＥＮＴＳＰＫ）、配列番号５（ＳＰＳＳＮＲＩＲＮＴ）、配列番号６（ＲＬＶＴＬＫＤＩＶ）、配列番号７（ＡＶＦＤＲＫＳＤＡＫ）、配列番号８（ＧＬＳＰＴＶＷＬＳＶ）、配列番号９（ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ）、配列番号１０（ＫＩＲＬＲＰＧＧＫ）、配列番号１１（ＴＰＧＰＧＶＲＹＰＬ）、配列番号１２（ＩＬＧＦＶＦＴＬＴＶ）、配列番号１３（ＶＬＴＤＧＮＰＰＥＶ）、配列番号１４（ＴＱＨＦＶＱＥＮＹＬＥＹ）、配列番号１５（ＷＲＲＡＰＡＰＧＡＫＡＭＡＰＧ）、配列番号１６（ＦＲＫＱＮＰＤＩＶＩＱＹＭＤＤＬＹＶＧ）、配列番号１７（ＲＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴＴＫＮＩＩＧＴＩ）、配列番号１８（ＰＧＰＬＲＥＳＩＶＣＹＦＭＶＦＬＱＴＨＩ）、配列番号１９（ＰＹＹＴＧＥＨＡＫＡＩＧＮ）、配列番号２０，（ＩＡＦＮＳＧＭＥＰＧＶＶＡＥＫＶ）、配列番号２１（ＫＱＥＥＬＥＲＤＬＲＫＴＫＫＫＩ）、配列番号２２（ＧＲＤＩＫＶＱＦＱＳＧＧＮＮＳＰＡＶ）、配列番号２３（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）、配列番号２４（ＳＩＩＱＦＥＨＬ）、配列番号２５（ＳＧＰＳＮＴＰＰＥＩ）、及び上記アミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸が化学基、好ましくはＮＨ_２またはＣＨ_３に連結されているその修飾形態。

【0022】

好ましい実施形態では、ペプチド抗原は、配列番号１～配列番号２５のアミノ酸配列のいずれかからなる。本発明はまた、これらのアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸が、ＮＨ_２またはＣＨ_３などの１つ以上の化学基に連結されている、上記ペプチド抗原の改変形態をカバーする。さらに、本発明はまた、アミノ酸配列内の１つ以上のアミノ酸の欠失、付加または置換を有する配列番号１～配列番号２５のアミノ酸配列に基づくアミノ酸配列をカバーする。

【0023】

本発明の医薬組成物内の個々の成分は、とりわけ、製剤の種類及び形態、意図される投与形態、治療される疾患またはワクチン接種の種類に依存する、様々な量で存在し得る。本発明の医薬組成物は、これらに限定されないが、腹腔内投与、鼻腔内投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、経口投与、直腸内投与、眼内投与、皮内投与などのために、溶液、懸濁液、クリーム、軟膏、粉末として使用され得る。特定の好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、哺乳動物体の皮膚、特に無傷または病変の皮膚領域への局所適用に適合されている。

【0024】

本発明の好ましい実施形態では、医薬組成物は、０．０３２１重量％～４重量％のジスラノール、または他のアントロンまたはヒドロキシアントレセンなどの少なくとも１つの酸化ストレッサー、０．１重量％～１０重量％の少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体７（ＴＬＲ７）リガンド及び０．０１重量％～３０重量％の少なくとも１つのペプチド抗原、を含む。

【0025】

特に好ましい実施形態では、医薬組成物の成分の濃度は以下のとおりである：ジスラノール、または他のアントロンまたはヒドロキシアントレセンなどの少なくとも１つの酸化ストレッサーが０．０６２５重量％～０．５重量％、少なくとも１つのＴｏｌｌ様受容体７（ＴＬＲ７）リガンドが３重量％～５重量％、少なくとも１つのペプチド抗原が０．１重量％～０．４重量％。

【0026】

医薬組成物は、それぞれの投与形態に適合した、薬学的に許容されるビヒクル、希釈剤、アジュバントまたは賦形剤を含み得る。したがって、任意の希釈剤、アジュバントまたは賦形剤、例えば、精製水、ベンジルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、ポリソルベート８０^Ｒ、ステアリン酸ソルビタン、グリセロール、メチル－４－ヒドロキシベンゾエート、プロピル－４－ヒドロベンゾエート、イソステアリン酸、キサンタンガムを使用することができる。また、担体、アジュバントまたは添加剤は、親水性溶媒または親油性溶媒、可溶化剤、乳化剤、粘度調整剤、ｐＨ調整剤、キレート剤、防腐剤、及び／または局所適用の基礎を提供するための剤、または皮膚浸透能力を高めるための剤などの医薬組成物の一部であり得る。

【0027】

本発明の医薬組成物は、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、または悪性腫瘍に対するワクチン接種戦略に使用するのに特に好適であり、したがって、好ましくはワクチンの形態で提供される。特に好ましいのは、特に局所投与による経皮免疫である。局所投与の１つの利点は、患者、特に先端恐怖症を患っている患者のコンプライアンスの改善である。そのため、局所投与形態は、小児または高齢の患者の治療に特に有用である。さらなる利点は、局所投与は通常、皮膚に医薬品を適用するために医学的に資格のある人員を必要としないことである。局所形態で投与される医薬組成物または併用調製物の能力により、例えば、インフルエンザなどの流行性ウイルス感染の予防または治療のために、ヒトまたは動物の両方の大量ワクチン接種または免疫化が可能になる。獣医学において、集約的畜産で発生する豚インフルエンザなどの経済的に破壊的な感染症は、本発明の医薬組成物または併用調製物の好適な標的である。治療される動物の例は、ウシ、ヒツジ及びブタ（ｐｉｇ）、ブタ（ｈｏｇ）、ヤギ、トリ、または雄七面鳥などの家畜である。さらに、本発明の調製物はまた、気腫疽（気腫疽菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｈａｕｖｏｅｉ）によって引き起こされる黒脚）、口蹄疫（アフトウイルスによって引き起こされる）、狂犬病（リッサウイルスによって引き起こされる）、ブルータング（ブルータングウイルスによって引き起こされる）、痘瘡、ブルセロシス、リステリア症、カンピロバクター流産、結核及びパラ結核（ヨーネ病）、牛流行熱（牛流行熱ウイルス、ＢＥＦＶによって引き起こされる）、牛鼻気管炎（牛ヘルペスウイルス－１によって引き起こされる）、ＰＰＲ（ヤギ疫病、モルビリウイルスによって引き起こされる）、バベシア症（バベシア属によって引き起こされる）、アフリカ豚熱及び豚熱、鳥インフルエンザ、シュマレンベルク ウイルスの治療に使用され得る。

【0028】

本発明によって治療することができる好ましい癌は、黒色腫及び非黒色腫皮膚癌、胃腸管（結腸、膵臓、肝臓など）、肺癌、悪性リンパ腫、急性及び慢性白血病、ならびに他の癌である。

【0029】

本発明の調製物の３つの成分の相乗効果により、持続性病原体感染または腫瘍疾患を治療できるようにするために、明確に定義されたペプチド抗原に対する特定の免疫応答が可能になる。３つの成分すべてが、予想外で驚くべき誘導された免疫応答に関連して、この相乗効果に寄与する。イミキモドなどのＴＬＲ７リガンドとペプチド抗原の唯一の併用は、治療目的に好適である満足のいく持続的免疫応答を誘導するのには十分ではない。本発明に示されるように、ジスラノール（または他のアントロンもしくはヒドロキシアントラセン化合物）が存在することまたは同時投与することは、ＴＬＲ７リガンド及びペプチド抗原のみの適用と比較して、はるかに持続的であり、かつ長期の免疫応答をもたらす相乗効果となる。特に、本発明の３成分組成物は、所望の治療的免疫応答の誘導に必要な細胞傷害性Ｔ細胞及びメモリーＴ細胞を刺激することにより、適応免疫応答の強力な刺激をもたらす。

【0030】

さらなる態様では、本発明はまた、上記の少なくとも１つの酸化ストレッサー、少なくとも１つのＴＬＲ７リガンド及び少なくとも１つのペプチド抗原を含む医薬併用調製物に関する。医薬組成物に関して記載されていることはいずれも、併用調製物にも適用され、逆もまた同様である。

【0031】

酸化ストレッサーは、ＴＬＲ７リガンド及び／またはペプチド抗原と同時にまたは連続して投与することができ、これは、治療する疾患の種類、ワクチン接種の種類、及び医薬品またはワクチンの処方に影響を与える他のパラメータまたは因子によって異なる。好ましい実施形態では、少なくとも１つの酸化ストレッサーは、別個の製剤内に存在し、少なくとも１つのＴＬＲ７リガンド及び／または少なくとも１つのペプチド抗原は、１つ以上の別個の製剤中に提供される。好ましい実施形態では、少なくとも１つのＴＬＲ７リガンド及び少なくとも１つのペプチド抗原は、単一の製剤で提供される。代替的実施形態では、ＴＬＲ７リガンド及びペプチド抗原は、２つの別個の製剤で提供される。

【0032】

本発明はまた、ヒトまたは動物の身体に同時にまたは連続的に適用されるそのような医薬併用調製物の使用に関する。この実施形態では、少なくとも１つの酸化ストレッサーの製剤は、ＴＬＲ７リガンド及び／またはペプチド抗原の１つ以上の製剤と同時にまたは連続して、ヒトまたは動物の皮膚に適用されるように適合されている。治療は、１回の治療として、またはそれぞれの製剤の同一の用量または異なる用量でのいくつかの連続治療として実施できる。

【0033】

好ましい実施形態では、医薬併用調製物は、患者の皮膚への局所投与に適合している。ジスラノールなどの酸化ストレッサーの局所投与は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）が抗原エピトープを保有する投与されたペプチド抗原を免疫系、特にＣＤ８＋Ｔ細胞に提示することが可能になる酸化メカニズムによって、炎症環境を誘発する。このメカニズムは、製剤中に存在する少なくとも１つのＴＬＲ７リガンドによって引き起こされる。驚くべきことに、調製物の３つの成分の同時投与は、１回の適用後にすでにメモリー応答などの強力な一次細胞傷害性Ｔ細胞応答をもたらす。本発明によって示されるように、免疫応答は、メモリーＴ細胞が関与するために長期的な効果を有し、したがって、罹患患者からの細菌、ウイルスまたは真菌などの病原体の除去において非常に効率的である。同じ戦略は、ペプチド抗原として提示され得るような標的抗原エピトープが知られている悪性腫瘍の治療または予防にも適用することができる。好ましくは、本発明のペプチド抗原は、細胞傷害性Ｔ細胞応答及びメモリーＴ細胞応答を誘発するためにＡＰＣに提示されるペプチドエピトープを保有する。

【0034】

医薬併用調製物の製剤の個々の成分の量は、当業者によって選択され得、治療の種類、成分の形態及び濃度、ならびに活性剤の治療効果に影響を与える他のパラメータまたは因子に従って適合させることができる。治療は、１回の治療として実施することも、異なるまたは同じ量のそれぞれの製剤を使用して数回繰り返すこともできる。

【図面の簡単な説明】

【0035】

【図1】ジスラノール（アントラリン）により、イミキモドベースの経皮免疫後のＴ細胞応答（一次Ｔ細胞応答）が増強されることを示す図である。

【図2】ジスラノール（アントラリン）とイミキモドベースの経皮免疫との併用が、メモリー免疫応答（二次Ｔ細胞応答）を誘発することを示す図である。

【図3】ダントロンではなくジスラノール（アントラリン）が、イミキモドベースの経皮免疫後、Ｔ細胞応答（一次Ｔ細胞応答）を増強することを示す図である。

【図4】α－トコフェロールが、ＣＴＬ頻度に影響を与えることなく、ジスラノール（アントラリン）ＴＣＩによって誘導される細胞溶解活性の増強に拮抗することを示す図である。

【図5】アントラリン（ジスラノール）が、脾臓樹状細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴＬＲ７媒介活性化を阻害することを示す図である。

【図6】Ｔ細胞応答（一次Ｔ細胞応答）を増強するには、同じ場所にジスラノール（アントラリン）及びＴＣＩを必要とすることを示す図である。

【図7】骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭ）が、アントラリン／Ｒ８４８またはアントラリン／イミキモド刺激後のＣＤ８０／ＣＤ８６発現を上方制御することを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0036】

本発明は、以下の実施例によってより詳細に説明される。実施例は、例示のみを目的としており、本発明をそれに限定するものではない。

【実施例】

【0037】

本発明の医薬調製物の治療的効果及び予防的効果を示すために実験を行った。

【0038】

図１は、ジスラノール（アントラリン）により、イミキモドベースの経皮免疫後のＴ細胞応答（一次Ｔ細胞応答）が増強されることを示す図である。

【0039】

Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝４～１２／群）は、Ｌｏｐｅｚ Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０１７）の説明に従って、ＤＭＳＯに溶解し、ｃｒｅｍｏｒ ｂａｓａｌｉｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓと混合した５０ｍｇのＩＭＩ－Ｓｏｌと共に１００μｇの合成ペプチドＯＶＡ_{２５７２６４}（ＳＩＩＮＦＥＫＬ；配列番号２３）、及びＯＶＡ_{２２３－２３７}（ＳＩＩＱＦＥＨＬ；配列番号２４；ｐｅｐｔｉｄｅｓ＆ｅｌｅｐｈａｎｔｓ，Ｐｏｔｓｄａｍ，Ｇｅｒｍａｎｙから得た）を使用して、経皮免疫（ＴＣＩ）によって免疫した（Ｐａｍｅｌａ Ａｒａｎｄａ Ｌｏｐｅｚ ｅｔ ａｌ．，「Ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ Ｎａｎｏｅｍｕｌｓｉｏｎ Ｉｎｄｕｃｅｓ Ｓｕｐｅｒｉｏｒ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｎｄ Ｖｉｒｕｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ８７，ｎｏ．３（２０１７年９月）：２５２－５９、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｄｅｒｍｓｃｉ．２０１７．０６．０１２）。ＴＣＩ治療は１日目に耳の皮膚を介して適用した。

【0040】

示されている場合、２４時間前にジスラノール（＝ワセリン中０．０６２５％のアントラリン）を耳の皮膚に適用した。（Ａ）ペプチド特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の頻度は、フローサイトメトリーにより７日目に評価した。（Ｂ）Ｉｎ ｖｉｖｏ細胞溶解活性は、ペプチドをロードした脾細胞の移入の２０時間後の７日目に分析した。（Ｃ）示された治療後７日目の脾細胞のＩＦＮ－γ産生。脾細胞は、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにより採取し、分析する前に、示されたペプチドで２４時間再刺激した。（Ｄ）Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５／群）は（Ａ）のように免疫化し、７日後ＯＶＡトランスジェニックワクシニアウイルスに感染させた（ＶＶ－ＯＶＡ、２ｘ１０^６ｐｆｕ ｉ．ｐ．。感染の５日後、マウスを屠殺し、卵巣ウイルス量をＢＳＣ－４０プラークアッセイによって判定した。
＊ボンフェローニ事後検定分析による一元配置分散分析による有意性；ｐ＜０，０５（＊）。

【0041】

結論：
結果は、ＴＣＩと併用した皮膚のジスラノール治療がＣＤ８陽性及びＣＤ４陽性Ｔ細胞のＴ細胞活性化に相乗効果を有することを示している。アントラリン／ＴＣＩの併用のみが、ＶＶ－ＯＶＡに対する防御免疫応答をもたらす。

【0042】

図２は、ジスラノール（アントラリン）とイミキモドベースの経皮免疫との併用が、メモリー免疫応答（二次Ｔ細胞応答）を誘発することを示す図である。

【0043】

Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝３～８／群）をＴＣＩで免疫し、図１（Ａ）に記載のとおり実施した。ペプチド特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の頻度は、３５日目にフローサイトメトリーにより評価した。（Ｂ）Ｉｎ ｖｉｖｏ細胞溶解活性は、ペプチドをロードした脾細胞を移入後２０時間での３５日目に分析した。（Ｃ）示された治療後３５日目の脾細胞のＩＦＮ－γ産生。脾細胞は、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにより採取し、分析する前に、示されたペプチドで２４時間再刺激した。＊ボンフェローニ事後検定分析による一元配置分散分析による有意性；ｐ＜０，０５（＊）。

【0044】

結論：
結果は、ＴＣＩと併用した皮膚のジスラノール治療が、メモリーＴ細胞の形成など、ＣＤ８陽性及びＣＤ４陽性Ｔ細胞のＴ細胞活性化に相乗効果を有することを示している。

【0045】

図３は、ダントロンではなくジスラノール（アントラリン）が、イミキモドベースの経皮免疫後、Ｔ細胞応答（一次Ｔ細胞応答）を増強することを示す図である。

【0046】

Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５／群、未治療ｎ＝２）は、図１に記載のとおり実行されたＴＣＩによって免疫化した。ＴＣＩ治療は１日目に耳の皮膚を介して適用した。示されている場合、ダントロン（ワセリン中０．０６２５％）またはジスラノール（＝ワセリン中０．０６２５％のアントラリン）を２４時間前に耳の皮膚に適用した。（Ａ）ペプチド特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の頻度は、フローサイトメトリーにより７日目に評価した。（Ｂ）Ｉｎ ｖｉｖｏ細胞溶解活性は、ペプチドをロードした脾細胞の移入の２０時間後の７日目に分析した。＊ボンフェローニ事後検定分析による一元配置分散分析による有意性；ｐ＜０，０５（＊）。

【0047】

結論：
結果は、ＴＣＩと併用した皮膚のジスラノール治療がＴ細胞活性化に相乗効果を有することを示している。酸化された類似体ダントロンは、Ｔ細胞の活性化に対する影響を有さず、これは、アントラリンが酸化メカニズムによって作用することを示唆するものである。

【0048】

図４は、α－トコフェロールが、ＣＴＬ頻度に影響を与えることなく、ジスラノール（アントラリン）ＴＣＩによって誘導される細胞溶解活性の増強に拮抗することを示す図である。

【0049】

Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝４～１０／群）は、図１に記載のとおり実行されたＴＣＩによって免疫化した。示されているように、ＴＣＩ治療は、１日目に両耳のいずれかに耳の皮膚を介して適用した。示されている場合、アントラリン及び／またはＴＣＩを適用する１時間前に、抗酸化剤としてα－トコフェロール（６００Ｕ／ｋｇ）を腹腔内注射した。（Ａ）ペプチド特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の頻度は、フローサイトメトリーにより７日目に評価した。（Ｂ）Ｉｎ ｖｉｖｏ細胞溶解活性は、ペプチドをロードした脾細胞の移入の２０時間後の７日目に分析した。（Ｃ）示された治療後７日目の脾細胞のＩＦＮ－γ産生。
＊ボンフェローニ事後検定分析による一元配置分散分析による有意性；ｐ＜０，０５（＊）。

【0050】

結論：
ＴＣＩに対するアントラリンのアジュバント効果は、酸化メカニズムに依存する。

【0051】

図５は、アントラリン（ジスラノール）が、脾臓樹状細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴＬＲ７媒介活性化を阻害することを示す図である。

【0052】

ＣＤ１ １ｃ陽性樹状細胞（ＤＣ）は、Ｗｅｂｅｒ Ｍ ｅｔ ａｌ．（２０１４）に記載のとおり、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾臓から精製され、ＴＬＲ７／８アゴニストＲ－８４８（１０μｇ／ｍｌ）、アントラリン（ジスラノール）、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ ５ｍＭ）で示されるように活性化させるか、またはＩｓｃｏｖｅｓ培地＋５％ＦＣＳで未治療のままであった（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，「Ｄｏｎｏｒ ａｎｄ Ｈｏｓｔ Ｂ Ｃｅｌｌ－Ｄｅｒｉｖｅｄ ＩＬ－１０ Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｇｒａｆｔ－Ｖｅｒｓｕｓ－Ｈｏｓｔ Ｄｉｓｅａｓｅ．，」Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４４，ｎｏ．６（Ｊｕｎｅ ２０１４）：１８５７－６５，ｄｏｉ：１０．１００２／ｅｊｉ．２０１３４４０８１）。

【0053】

２４時間のインキュベーション後、細胞を採取し、特定のｍＡｂで標識し、フローサイトメトリーで活性化マーカーＣＤ４０、ＣＤ８０、及びＣＤ８６のライブでのゲーティング（ヨウ化プロピジウム陰性、ＣＤ１ １ｃ／ＭＨＣクラスＩＩ陽性ＤＣ）を分析した。

【0054】

結論：
アントラリンは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＤＣのＴＬＲ７媒介活性化を抑制する。活性化表現型は、抗酸化剤としてＮＡＣを追加することによって復元される。したがって、ｉｎ ｖｉｖｏでのＴ細胞活性化に対するアントラリンの相乗効果は驚くべきものであり、予想外である。ＮＡＣの存在下においてＤＣ活性化が回復することは、アントラリンが酸化メカニズムによって作用することを示している。

【0055】

図６は、Ｔ細胞応答（一次Ｔ細胞応答）を増強するには、同じ場所にジスラノール（アントラリン）及びＴＣＩを必要とすることを示す図である。

【0056】

Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝２～９／群）は、図１に記載のとおり実行されたＴＣＩによって免疫化した。ＴＣＩ治療は、示されているとおり、１日目に両耳または片方のみの耳のいずれかに耳の皮膚を介して適用した。（Ａ）ペプチド特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の頻度は、フローサイトメトリーにより７日目に評価した。（Ｂ）Ｉｎ ｖｉｖｏ細胞溶解活性は、ペプチドをロードした脾細胞の移入の２０時間後の７日目に分析した。
＊ボンフェローニ事後検定分析による一元配置分散分析による有意性；ｐ＜０，０５（＊）。

【0057】

結論：
アントラリン及びＴＣＩは、Ｔ細胞の相乗的な活性化を媒介するために同じ部位（耳）に必要である。アントラリン／ＴＣＩにおける誘導されたＴ細胞応答の大きさは、治療領域と相関する（用量応答関係）。したがって、ｉｎ ｖｉｖｏでのＴ細胞活性化に対するアントラリンの相乗効果は、免疫細胞の局所的活性化によって開始される。

【0058】

図７は、骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭ）が、アントラリン／Ｒ８４８またはアントラリン／イミキモド刺激後のＣＤ８０／ＣＤ８６発現を上方制御することを示す図である。

【0059】

ＢＭＭ前駆細胞を骨髄から分離し、１０％ＦＣＳ及び１０％Ｌ９２９線維芽細胞培養上清（Ｍ－ＣＳＦを含む）を添加した培地で分化させた。６日目にマクロファージをセルスクレーパーで採取し、２．５ｘ１０^５ＢＭＭを９６Ｕウェルに播種した。次に、ＢＭＭをアントラリン単独（０．２５～１μＭの範囲）、ＴＬＲ７リガンドであるレシキモド（Ｒ８４８、１０μｇ／ｍｌ）及びイミキモド（１０μｇ／ｍｌ）、またはアントラリンとＴＬＲ７ライゲーションの両方の併用で刺激した。刺激の２４時間後、ＢＭＭを採取し、生きているＭＨＣＩＩ^＋Ｆ４／８０^＋ＣＤ１ １ｂ^＋ＢＭＭの活性化状態を、共刺激表面マーカーＣＤ８０及びＣＤ８６のＦＡＣＳ分析によって評価した。さらに、刺激させたＢＭＭの上清を２４時間後に収集し、その後ＩＬ－６ＥＬＩＳＡを実施した。

【0060】

結論：
実験は、ＴＬＲ７リガンドとしてイミキモド（Ｒ８３７）またはレシキモド（Ｒ８４８）をジスラノール（アントラリン）及びペプチド抗原と共に使用した本発明の併用の結果を要約している。示されているように、ジスラノール（アントラリン）、ＴＬＲ７リガンド、及びペプチド抗原の適用は、ＢＭＭ細胞の協調的活性化をもたらし、これは、アントラリン及び／またはペプチド抗原のみを適用した場合と比較して有意に効果的である。

【0061】

材料及び方法
マウス
６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６（野生型）マウスをワクチン接種実験に使用し、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｉｎｚ（ＴＡＲＣ）またはＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの動物施設から購入した。すべての動物の手順は、施設のガイドラインに従って実施し、地元の動物福祉担当官（（Ｐｒｏｆ．Ｄｒ．Ｏ．Ｋｅｍｐｓｋｉ）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｍａｉｎｚ，Ｇｅｒｍａｎｙ））が率いる施設の審査委員会によって審査され、確認された。すべてのアッセイは、責任ある当局によって承認された（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ Ｏｆｆｉｃｅ Ｒｈｅｉｎｌａｎｄ－Ｐｆａｌｚ，Ｋｏｂｌｅｎｚ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。この機関によって割り当てられた承認ＩＤ：ＡＺ ２３ １７７－０７／Ｇ１３－１－０１２。

【0062】

経皮免疫
経皮免疫は、５０ｍｇのＩＭＩ－Ｓｏｌ（自社生産）と１００μｇの合成ペプチドＯＶＡ_{２５７－２６４}（ＳＩＩＮＦＥＫＬ；配列番号２３）及びＯＶＡ_{２２３－２３７}（ＳＩＩＱＦＥＨＬ；配列番号２４；ｐｅｐｔｉｄｅｓ＆ｅｌｅｐｈａｎｔｓ Ｐｏｔｓｄａｍ，Ｇｅｒｍａｎｙから得た））を使用して、ＤＭＳＯに溶解し、ｃｒｅｍｏｒ ｂａｓａｌｉｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓと混合して、以前に記載されているように（Ｌｏｐｅｚ ｅｔ ａｌ．２０１７）実施した。ＴＣＩ治療は１日目に耳の皮膚を介して適用した。

【0063】

ＴＣＩに先立ち、示されているとおり、０日目に耳を２５ｍｇのアントラリンまたはダントロン含有（１／１６％）ワセリンクリームで前処理した。α－トコフェロールは、アントラリン及び／またはＴＣＩを適用する１時間前に、体重調整投与量（６００Ｕ／ｋｇ体重、ｉ．ｐ．）で投与した。体重調整投与量でケタミン／ロンプンの希釈液を使用して、すべての手順の前にマウスを麻酔した。

【0064】

フローサイトメトリー分析及びｉｎ ｖｉｖｏ細胞障害性アッセイ
フローサイトメトリー分析及びｉｎ ｖｉｖｏ細胞障害性の評価は、以前に記載されているように実施した（Ｌｏｐｅｚ ｅｔ ａｌ．２０１７）。血液サンプルは、尾静脈切開により収集し、低張溶解に供され、示されたとおり特定のｍＡｂと共にインキュベートした。ＦＡＣＳ分析に使用した抗体は、ＰＢコンジュゲート抗ＣＤ８（クローン５３－６．７；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ６２Ｌ（クローン１７Ａ２；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）、及びＡＰＣコンジュゲート抗ＣＤ４４（クローンＧＫ１．５；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）であった。ペプチド特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の頻度を測定するために、血液サンプルをＰＥコンジュゲートＯＶＡ_{２５７－２６４} Ｈ２－Ｋ^ｂ（四量体標識、自社生産）で染色した。

【0065】

Ｉｎ ｖｉｖｏの細胞溶解活性を検出するために、同系野生型マウスの脾細胞を異なる量の５，６－カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＵＳＡ）で標識し、その結果、ＣＦＳＥ^ｌｏｗ及びＣＦＳＥ^ｈｉｇｈ集団をもたらした。ＣＦＳＥ^ｌｏｗで標識した細胞は、１μＭのＯＶＡ_{２５７－２６４}でさらに標識した。免疫及び未処理のマウスへの１：１の比率（ＣＦＳＥ^ｌｏｗ：ＣＦＳＥ^ｈｉｇｈ）での３ｘ１０^７細胞の養子移入は、尾静脈への静脈内注射によって行われた。一次応答中の細胞溶解活性を評価するために、血液を採取し、免疫後７日目、標的細胞の移入から２０時間後にフローサイトメトリーにかけた。特異的溶解は以下のように評価した：特異的溶解（％）＝１００ｘ（１－（免疫化されたマウスのＣＦＳＥ^ｌｏｗ／未処理の対照のＣＦＳＥ^ｌｏｗ）。すべての分析は、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター及びＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを使用して実行した（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＵＳＡ）。

【0066】

ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
９６ウェルプレート（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎＨＴＳ ＩＰ、０．４５ｍｍ、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、マウスＩＦＮγ ＡＮ１８抗体（１０ｍｇ／ｍｌ、Ｍａｂｔｅｃｈ、Ｎａｃｋａ Ｓｔｒａｎｄ、Ｓｗｅｄｅｎ）で４℃で一晩コーティングした。ブロッキングステップ後、５ｘ１０^５個の細胞を追加した。したがって、脾細胞を溶解し、１ｍＭ ＯＶＡ_{２５７－２６４}、１ｍＭ ＯＶＡ_{３２３－３３７}をロードするか、培地に残した。３７℃で一晩インキュベートした後、プレートを洗浄し、ビオチン化ＩＦＮγ Ｒ４－６Ａ２抗体（２ｍｇ／ｍｌ、Ｍａｂｔｅｃｈ、２時間、３７℃）で染色した。その後、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣ Ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＵＳＡ）／ＡＥＣ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）複合体を、製造業者の指示に従って追加した。スポットが目で確認された後、プレートを水で洗浄し、一晩乾燥させた。分析は、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ Ａｎａｌｙｚｅｒによって実行した（Ｃ．Ｔ．Ｌ．Ｅｕｒｏｐｅ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。

【0067】

樹状細胞の単離、培養及び活性化マーカーの評価
Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ野生型マウスの脾臓を採取し、取り、２型コラゲナーゼ（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、Ｐａｐｐｅｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙから５０Ｕ／ｍｌ）で４５分間消化させ、２ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加して停止させた。低張溶解ステップ後、ＣＤ１ １ ｃ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ ＵｌｔｒａＰｕｒｅ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造業者の指示に従って使用して、ＤＣを単離した。２ｘ１０^５ ＣＤ１ １ ｃ^＋ＤＣ／ウェルを９６ウェルプレートにプレーティングし、ＴＬＲ７リガンドＲ－８４８（１０ｕｇ／ｍｌ）及び／または異なる濃度のアントラリン（ＤＭＳＯに溶解）の存在下で２４時間または４８時間培養した。その後、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ分析のために以下の抗体で染色した：ＣＤ１９－ＰｅｒＣＰ、ＣＤ９０．２－ＰｅｒＣＰ、ＣＤ１ １ｃ－ＡＰＣまたはＰＥ－Ｃｙ７、ＭＨＣＩＩ－ＢＶ２４１、ＣＤ８６－ＰＥ、ＣＤ８０－ＦＩＴＣまたはＢＶ６０５、ＣＤ４０－ＡＰＣ。さらに、２４時間または４８時間後のＤＣ培養の上清を収集し、サイトカインビーズアレイ（ＣＢＡ）分析に使用した。以下のサイトカインは、ＣＢＡ技術を使用して定量化した：ＩＬ－１ｂ；ＩＬ－６；ＩＬ－１０；ＩＬ－１２；ＩＬ－２３、ＴＮＦ－α。

【0068】

プラークアッセイによるウイルス防御の評価
感染前に、雌のＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスを上記のとおり免疫した。７日目に、効果的な免疫化が四量体染色によって確認された。その後、２ｘ１０^６ ｐｆｕのワクシニアＯＶＡウイルス（ＶＶ ＯＶＡ）を２００μｌの培地に再懸濁し、腹腔内注射で適用した。感染の５日後、マウスを屠殺し、卵巣を摘出し、細かく切り刻んだ。異なる濃度のこれらのウイルス含有サンプルをＢＳＣ－４０細胞の層に加えた。続いて、プレートを３７℃で２４時間インキュベートした。このインキュベーション後、光学顕微鏡での検査により、細胞層内のプラークの出現が明らかになった。続いて、残りのＢＳＣ－４０細胞をクリスタルバイオレット溶液で染色し、ライトボックスでプラークの数を数えた。数を数えたプラークに適切なウェルの希釈係数を掛けて、ｐｆｕ／卵巣を推定した。

【0069】

腫瘍拒絶アッセイ
ＭＣ３８結腸腺癌細胞は、Ｈ．Ｃ．Ｐｒｏｂｓｔ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｍａｉｎｚ）によって提供を受けた。接種前に、ＭＣ３８細胞を１％ペニシリン－ストレプトマイシン、１０％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン及び１ｍＭピルビン酸ナトリウムを添加したＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で１週間培養した。麻酔をかけた動物の左下腹部に腫瘍細胞を皮下注射した。治療は、腫瘍サイズ約２５ｍｍ^２で開始した（接種後５～７日）。腫瘍の成長は、キャリパーを使用して週に３回、２次元で腫瘍直径を測定することによって追跡した。腫瘍サイズが直径４００ｍｍ^２を超えたとき、または出血性潰瘍が発生したときに、マウスを屠殺した。死の時点は屠殺の翌日として記録した。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

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