特許 7520818 腫瘍を治療するためのナチュラルキラー細胞組成物および免疫療法の方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-07-12

(45)【発行日】2024-07-23

(54)【発明の名称】腫瘍を治療するためのナチュラルキラー細胞組成物および免疫療法の方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/17 20150101AFI20240716BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240716BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240716BHJP

   A61P 35/04 20060101ALI20240716BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240716BHJP

   A61K 31/44 20060101ALI20240716BHJP

   A61K 31/506 20060101ALI20240716BHJP

   A61K 31/5377 20060101ALI20240716BHJP

   A61K 31/517 20060101ALI20240716BHJP

   A61K 31/404 20060101ALI20240716BHJP

   A61K 31/19 20060101ALI20240716BHJP

   A61K 33/24 20190101ALI20240716BHJP

   A61K 31/513 20060101ALI20240716BHJP

   A61K 31/704 20060101ALI20240716BHJP

   A61K 31/198 20060101ALI20240716BHJP

   A61K 31/407 20060101ALI20240716BHJP

   A61K 31/7048 20060101ALI20240716BHJP

   A61K 31/69 20060101ALI20240716BHJP

   A61K 31/203 20060101ALI20240716BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20240716BHJP

   C07K 14/705 20060101ALN20240716BHJP

【ＦＩ】

A61K35/17

A61K39/395 N

A61P35/00

A61P35/04

A61P43/00 121

A61P43/00 111

A61K31/44

A61K31/506

A61K31/5377

A61K31/517

A61K31/404

A61K31/19

A61K33/24

A61K31/513

A61K31/704

A61K31/198

A61K31/407

A61K31/7048

A61K31/69

A61K31/203

C07K19/00 ZNA

C07K14/705

【請求項の数】 30

(21)【出願番号】P 2021513959

(86)(22)【出願日】2019-09-11

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-01-04

(86)【国際出願番号】 US2019050679

(87)【国際公開番号】W WO2020056045

(87)【国際公開日】2020-03-19

【審査請求日】2022-09-09

(31)【優先権主張番号】62/730,939

(32)【優先日】2018-09-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/821,360

(32)【優先日】2019-03-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/841,768

(32)【優先日】2019-05-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/875,893

(32)【優先日】2019-07-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】520438914

【氏名又は名称】ンカルタ・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】Ｎｋａｒｔａ， Ｉｎｃ．

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉 真奈美

(72)【発明者】

【氏名】ジェイムズ・バーナビー・トレイガー

(72)【発明者】

【氏名】アンジェラ・ジャン・シェン

【審査官】大島 彰公

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０１８／０１３５０１５（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１８／１２４７６６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１７－５１５５０６（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ、Ａ６１Ｐ、Ｃ０７Ｋ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

肝腫瘍を有する対象の治療のための医薬の製造における組み合わせの使用であって、組み合わせが、
（ｉ）（ａ）配列番号２４の配列によってコードされるアミノ酸配列を含む細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびＯＸ－４０サブドメインおよびＣＤ３ゼータサブドメインを含む細胞傷害性シグナル伝達複合体を含む細胞傷害性受容体複合体；および（ｂ）膜結合型インターロイキン１５（ｍｂＩＬ１５）を発現するように操作されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の集団；および
（ｉｉ）少なくとも１つの追加の抗癌剤、
を含む、使用。

【請求項2】

肝腫瘍が肝細胞癌腫から生じる、請求項１に記載の使用。

【請求項3】

肝腫瘍が結腸直腸癌腫の原発転移である、請求項１に記載の使用。

【請求項4】

ｍｂＩＬ１５が、細胞傷害性受容体複合体もコードするポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用。

【請求項5】

ＯＸ４０サブドメインが、配列番号３５の配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用。

【請求項6】

ＣＤ３ゼータサブドメインが、配列番号３２の配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の使用。

【請求項7】

細胞傷害性受容体複合体およびｍｂＩＬ１５が配列番号８の配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の使用。

【請求項8】

細胞傷害性受容体複合体およびｍｂＩＬ１５が配列番号７の配列によってコードされる、請求項１～７のいずれか一項に記載の使用。

【請求項9】

少なくとも１つの追加の抗癌剤が：
チロシンキナーゼ阻害剤、ここで、チロシンキナーゼ阻害剤はソラフェニブ、ニロチニブ、イマンチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、スニチニブ、アダボセルチブ、ラパチニブ、またはそれらの組み合わせである、
抗体、ここで、抗体はセツキシマブ、ダラツムマブ、リツキシマブ、オビヌツズマブ、トラスツズマブ、またはそれらの組み合わせである、
ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤、ここで、ＨＤＡＣ阻害剤は、バルプロ酸、ＦＲ９０１２２８、ＭＳ－２７５、フェニルブチレート、ＰＤＸ１０１、バルプロ酸ナトリウム、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、またはそれらの組み合わせである、
化学療法剤、ここで、化学療法剤はシスプラチン、ヒドロキシウレア、５－フルオロウラシル、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、エトポシド、またはそれらの組み合わせである、
高線量電離放射線、
プロテアソーム阻害剤、ここで、プロテアソーム阻害剤はボルテゾミブである、
オールトランス型レチノイン酸、酪酸ナトリウム、またはそれらの組み合わせ、
ＮＫチェックポイント阻害剤、ここで、ＮＫチェックポイント阻害剤はＣＤ７３のアンタゴニスト、ＣＤ３９のアンタゴニスト、アデノシン免疫抑制シグナル伝達経路のアンタゴニスト、またはそれらの組み合わせである、
ＴＩＭ３に対する抗体、
ＴＧＦベータ受容体に対する抗体、または
インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼの阻害剤、
である、請求項１～８のいずれか一項に記載の使用。

【請求項10】

少なくとも１つの追加の抗癌剤が、チロシンキナーゼ阻害剤、ここで、チロシンキナーゼ阻害剤はソラフェニブ、ニロチニブ、イマンチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、スニチニブ、アダボセルチブ、ラパチニブ、またはそれらの組み合わせである、請求項１～９のいずれか一項に記載の使用。

【請求項11】

少なくとも１つの追加の抗癌剤が、ソラフェニブである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の使用。

【請求項12】

少なくとも１つの追加の抗癌剤が、化学療法剤、ここで、化学療法剤はシスプラチン、ヒドロキシウレア、５－フルオロウラシル、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、エトポシド、またはそれらの組み合わせである、請求項１～９のいずれか一項に記載の使用。

【請求項13】

少なくとも１つの追加の抗癌剤が、ドキソルビシンである、請求項１～９、１２のいずれか一項に記載の使用。

【請求項14】

操作されたＮＫ細胞の集団が、対象に対して同種である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の使用。

【請求項15】

肝腫瘍を有する対象の治療のための医薬の製造における、細胞傷害性受容体複合体および膜結合型インターロイキン１５（ｍｂＩＬ１５）を発現するように操作されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の集団の使用であって、
集団は、（ａ）配列番号２４の配列によってコードされるアミノ酸配列を含む細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびＯＸ－４０サブドメインおよびＣＤ３ゼータサブドメインを含む細胞傷害性シグナル伝達複合体を含む細胞傷害性受容体；および（ｂ）ｍｂＩＬ１５、を発現するように操作された複数のＮＫ細胞を含み、
操作されたＮＫ細胞の集団は、注入による肝臓への局所経皮投与に適している、
使用。

【請求項16】

医薬が、少なくとも１つの追加の抗癌剤と共に使用される、請求項１５に記載の使用。

【請求項17】

少なくとも１つの追加の抗癌剤が：
チロシンキナーゼ阻害剤、ここで、チロシンキナーゼ阻害剤はソラフェニブ、ニロチニブ、イマンチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、スニチニブ、アダボセルチブ、ラパチニブ、またはそれらの組み合わせである、
抗体、ここで、抗体はセツキシマブ、ダラツムマブ、リツキシマブ、オビヌツズマブ、トラスツズマブ、またはそれらの組み合わせである、
ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤、ここで、ＨＤＡＣ阻害剤は、バルプロ酸、ＦＲ９０１２２８、ＭＳ－２７５、フェニルブチレート、ＰＤＸ１０１、バルプロ酸ナトリウム、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、またはそれらの組み合わせである、
化学療法剤、ここで、化学療法剤はシスプラチン、ヒドロキシウレア、５－フルオロウラシル、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、エトポシド、またはそれらの組み合わせである、
高線量電離放射線、
プロテアソーム阻害剤、ここで、プロテアソーム阻害剤はボルテゾミブである、
オールトランス型レチノイン酸、酪酸ナトリウム、またはそれらの組み合わせ、
ＮＫチェックポイント阻害剤、ここで、ＮＫチェックポイント阻害剤はＣＤ７３のアンタゴニスト、ＣＤ３９のアンタゴニスト、アデノシン免疫抑制シグナル伝達経路のアンタゴニスト、またはそれらの組み合わせである、
ＴＩＭ３に対する抗体、
ＴＧＦベータ受容体に対する抗体、または
インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼの阻害剤、
である、請求項１６に記載の使用。

【請求項18】

少なくとも１つの追加の抗癌剤が、チロシンキナーゼ阻害剤、ここで、チロシンキナーゼ阻害剤はソラフェニブ、ニロチニブ、イマンチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、スニチニブ、アダボセルチブ、ラパチニブ、またはそれらの組み合わせである、請求項１６に記載の使用。

【請求項19】

少なくとも１つの追加の抗癌剤が、ソラフェニブである、請求項１６に記載の使用。

【請求項20】

少なくとも１つの追加の抗癌剤が、化学療法剤、ここで、化学療法剤はシスプラチン、ヒドロキシウレア、５－フルオロウラシル、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、エトポシド、またはそれらの組み合わせである、請求項１６に記載の使用。

【請求項21】

少なくとも１つの追加の抗癌剤が、ドキソルビシンである、請求項１６に記載の使用。

【請求項22】

少なくとも１つの追加の抗癌剤が、ＨＤＡＣ阻害剤である、請求項１６に記載の使用。

【請求項23】

肝腫瘍が肝細胞癌腫から生じる、請求項１５～２２のいずれか一項に記載の使用。

【請求項24】

肝腫瘍が結腸直腸癌腫の原発転移である、請求項１５～２２のいずれか一項に記載の使用。

【請求項25】

ｍｂＩＬ１５が、細胞傷害性受容体複合体もコードするポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１５～２４のいずれか一項に記載の使用。

【請求項26】

ＯＸ４０サブドメインが、配列番号３５の配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１５～２５のいずれか一項に記載の使用。

【請求項27】

ＣＤ３ゼータサブドメインが、配列番号３２の配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１５～２６のいずれか一項に記載の使用。

【請求項28】

細胞傷害性受容体複合体およびｍｂＩＬ１５が配列番号８の配列を含む、請求項１５～２７のいずれか一項に記載の使用。

【請求項29】

細胞傷害性受容体複合体およびｍｂＩＬ１５が配列番号７の配列によってコードされる、請求項１５～２８のいずれか一項に記載の使用。

【請求項30】

操作されたＮＫ細胞の集団が、対象に対して同種である、請求項１５～２９のいずれか一項に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０１８年９月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／７３０，９３９号、２０１９年３月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／８２１，３６０号、２０１９年５月１日に出願された米国仮特許出願第６２／８４１，７６８号、および２０１９年７月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／８７５，８９３号の優先権を主張するものであり、これらの各々の全体は、参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

肝臓癌は、主要な癌のタイプの中で一般的である。肝細胞癌腫は、最も一般的な肝臓癌のタイプの１つである。続発性の（例えば、別の組織で発生して肝臓に移動する）特定の肝臓癌のタイプとは対照的に、肝細胞癌腫は、原発性癌である（例えば、肝臓で発生する）。結腸直腸癌腫からの転移による肝腫瘍などの他の肝臓癌のタイプもまた一般的である。

【0003】

ＡＳＣＩＩテキストファイルにおける資料の参照による組み込み
本出願は、以下のＡＳＣＩＩテキストファイルに含まれる配列表を参照することにより組み込み、ファイル名：ＮＫＴ０２５ＷＯ＿ＳＴ２５として同時に提出され；２０１９年９月１０日に作製され、サイズは９０．０ＫＢである。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

いくつかの実施形態では、本明細書には、腫瘍を治療するための方法および組成物が提供される。特に、いくつかの実施形態では、組成物は、腫瘍に局所的にデリバリーされる。いくつかの実施形態によれば、原発性肝腫瘍を治療するための方法が提供され、本方法は、原発性肝腫瘍を有する患者の肝臓内動脈にアクセスすること、および細胞傷害性受容体複合体を発現するように操作されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の集団を投与することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲまたはキメラ受容体などの操作された受容体を有するＮＫ細胞は、腫瘍細胞上のＮＫリガンドに結合する。次に、細胞傷害性シグナルが生成され、その結果、腫瘍細胞が死滅する。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、癌を治療するための併用療法に関する。いくつかの実施形態は、キメラ受容体またはキメラ抗原受容体を発現する操作された免疫細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞またはＴ細胞）、および別の抗癌剤の組み合わせを用いる。実施形態に応じて、種々の抗癌剤が使用され、例えば、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、キナーゼ（例えば、チロシンキナーゼ）阻害剤、上皮細胞増殖因子受容体シグナル伝達の阻害剤；血管内皮増殖因子受容体シグナル伝達の阻害剤、化学療法剤、プロテアソーム阻害剤、放射線、脱メチル化剤、チロシンキナーゼ阻害剤、オールトランス型レチノイン酸、酪酸ナトリウムなどが含まれる。いくつかの実施形態では、相乗的抗癌効果は、組み合わせから生じる。

【0006】

いくつかの実施形態では、肝腫瘍の治療のための併用療法レジメンが提供され、療法レジメは、（ｉ）細胞傷害性受容体複合体を発現するように操作されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の集団、および（ｉｉ）少なくとも１つの追加の抗癌剤を含む。

【0007】

いくつかの実施形態では、療法レジメンは、ＮＫ細胞の集団が肝腫瘍に局所的に投与されるように構成される。

【0008】

いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、Ｃ型レクチン様受容体の機能的断片であって、Ｃ型レクチン様受容体がナチュラルキラーグループ２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）受容体を含む、Ｃ型レクチン様受容体の機能的断片と、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを含む細胞傷害性シグナル伝達複合体とを含む。いくつかの実施形態では、Ｃ型レクチン様受容体の機能的断片は、配列番号２４、高度の配列同一性（例えば、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性）を有するその断片、またはリガンド結合機能の少なくとも一部を保持するその断片を含む。Ｃ型レクチン様受容体の断片は、配列番号２４を含む。

【0009】

いくつかの実施形態では、療法レジメンによって治療される肝腫瘍は、肝細胞癌腫から生じる。いくつかの実施形態では、肝腫瘍は、異なる位置の腫瘍に続発する。例えば、いくつかの実施形態では、肝腫瘍は、結腸直腸癌腫の原発転移である。

【0010】

いくつかの実施形態では、細胞傷害性シグナル伝達複合体のシグナル伝達ドメインは、ＯＸ４０ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０ドメインは、配列番号３５の配列を有するＯＸ４０ドメインと少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０ドメインは、配列番号３５の配列よりも短い配列に切断され得るが、依然として刺激機能を保持する。いくつかの実施形態では、シグナル伝達コンストラクトは、ＮＫ細胞活性化を有利に増強する２つ、３つ、４つまたはそれを超えるＯＸ４０ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞傷害性シグナル伝達複合体のシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ゼータドメインは、配列番号３２の配列を有するＣＤ３ゼータドメインと少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ゼータドメインは、（例えば、ベクター中の）細胞傷害性受容体複合体のシグナル伝達および／またはパッケージングを増強するために切断または修飾される。例えば、いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、ｈｅｍｉ－ＩＴＡＭドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、ＩＬ１５をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ１５は、膜結合ＩＬ１５（ｍｂＩＬ１５）を含む。いくつかの実施形態では、ｍｂＩＬ１５は、配列番号３９の配列を有するｍｂＩＬ１５と少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態では、ｍｂＩＬ１５は、例えば、操作されたＮＫ細胞の刺激を増強するために、切断および／または突然変異される。いくつかの実施形態では、ｍｂＩＬ１５は、細胞傷害性受容体複合体の残りの部分もコードするポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、ｍｂＩＬ１５は、別個のポリヌクレオチド上に提供され、これは、細胞傷害性受容体複合体をコードするポリヌクレオチドとともにＮＫ細胞に別個に導入される。

【0011】

いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号７の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号７と約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、または約９５％同一である核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号８のアミノ酸配列を含む。実施形態に応じて、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号８と約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、または約９５％同一である。

【0012】

いくつかの実施形態では、レジメンは、少なくとも１つの追加の抗癌剤がＮＫ細胞の集団が投与される前、それと同時、またはその後に投与されるように構成される。いくつかの実施形態では、追加の抗癌剤は、操作されたＮＫ細胞よりも頻繁に投与され、例えば、抗癌剤は毎日投与され、一方、ＮＫ細胞は１週間または数週間の間隔で投与される。いくつかの実施形態では、追加の抗癌剤は、細胞傷害性受容体複合体の受容体部分の１つまたは複数のリガンドの発現を誘導する追加の抗癌剤の結果として、および／またはＮＫ細胞活性もしくは寿命をさらに刺激するために、操作されたＮＫ細胞と相乗的に作用する。

【0013】

いくつかの実施形態では、追加の抗癌剤はチロシンキナーゼ阻害剤である。いくつかの実施形態では、薬剤はソラフェニブである。一部の実施形態では、抗癌剤は、ソラフェニブ、ニロチニブ、イマンチニブ（ｉｍａｎｔｉｎｉｂ）、ゲフィチニブ、エルロチニブ、スニチニブ、アダボセルチブ、ラパチニブ、またはそれらの組み合わせ（例えば、２つ、３つ、４つまたはそれを超えるの組み合わせ）である。

【0014】

いくつかの実施形態では、追加の抗癌剤は抗体である。例えば、いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体、ｓｃＦｖまたは抗体断片である。いくつかの実施形態では、追加の抗癌剤は、セツキシマブ、ダラツムマブ、リツキシマブ、オビヌツズマブ、トラスツズマブ、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、追加の抗癌剤は、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤である。種々のＨＤＡＣ阻害薬を使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は、バルプロ酸、ＦＲ９０１２２８、ＭＳ－２７５、フェニルブチレート、ＰＤＸ１０１、バルプロ酸ナトリウム、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、またはそれらの組み合わせである。

【0015】

実施形態に応じて、より広く使用される抗癌剤を、本明細書に開示される操作されたＮＫ細胞と結合させることができる。いくつかの実施形態では、追加の抗癌剤は化学療法剤である。例えば、いくつかの実施形態では、化学療法剤は、シスプラチン、ヒドロキシウレア、５－フルオロウラシル、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、エトポシド、またはそれらの組み合わせである。一部の実施形態に加えてまたはその代わりに、高線量電離放射線を用いる。いくつかの実施形態では、これは、両方の治療が局部的にデリバリーされるため、操作されたＮＫ細胞の局所デリバリーと組み合わされた場合に特に効果的である。

【0016】

いくつかの実施形態では、追加の抗癌剤はプロテアソーム阻害剤である。いくつかの実施形態では、プロテアソーム阻害剤はボルテゾミブである。いくつかの実施形態では、追加の抗癌剤は、オールトランス型レチノイン酸、酪酸ナトリウム、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、追加の抗癌剤は、ＮＫチェックポイント経路の阻害剤である。このような実施形態では、阻害剤は、ＮＫチェックポイント経路の免疫抑制性をブロックするように作用し、それにより、ＮＫ細胞（内因性と操作されたものの両方）の活性を増強する。いくつかの実施形態では、ＮＫチェックポイント阻害剤は、ＣＤ７３のアンタゴニスト、ＣＤ３９のアンタゴニスト、アデノシン免疫抑制シグナル伝達経路のアンタゴニスト、またはそれらの組み合わせである。同様に、ＴＩＭ３および／またはＴＧＦベータ受容体に対する抗体などのいくつかの実施形態では、ＮＫ細胞活性を増強するために、他のアプローチが使用される。なおさらなる実施形態では、追加の抗癌剤は、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼの阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＮＫチェックポイント阻害剤および操作されたＮＫ細胞と組み合わせた放射線などの追加の薬剤の組み合わせが使用される。このような実施形態では、作用の異なるメカニズムおよび異なるシグナル伝達経路の利用は、標的腫瘍細胞に対する相乗的な細胞傷害性効果をもたらす。一部の実施形態では、以下のうちの２つ以上が組み合わされる：チロシンキナーゼ阻害剤、抗体、化学療法剤、ＨＤＡＣ阻害剤、脱メチル化剤、プロテアソーム阻害剤、チェックポイント阻害剤、および他の抗癌剤または抗増殖剤。

【0017】

いくつかの実施形態では、肝臓癌の治療のための、本明細書に開示される併用療法の使用が提供される。いくつかの実施形態では、肝臓癌の治療のための医薬を調製するための、本明細書に開示される併用療法の使用が提供される。

【0018】

いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、Ｃ型レクチン様受容体の機能的断片と、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを含む細胞傷害性シグナル伝達複合体とを含む。いくつかの実施形態では、Ｃ型レクチン様受容体は、ナチュラルキラーグループ２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）受容体を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ型レクチン様受容体の機能的断片は配列番号２４を含む。

【0019】

いくつかの実施形態では、肝腫瘍を治療するための方法も提供され、本方法は、細胞傷害性受容体複合体を発現するように操作されたＮＫ細胞の集団を含む組成物を肝腫瘍を有する患者に投与することを含み、細胞傷害性受容体複合体は、ナチュラルキラーグループ２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）受容体のリガンドに結合する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを含む細胞傷害性シグナル伝達複合体を含み、投与は患者の肝臓内動脈への注射を含む。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、配列番号２３のポリヌクレオチドの少なくとも一部によってコードされる。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、野生型ＮＫＧ２Ｄ受容体の細胞外ドメインの一部である。驚くべきことに、いくつかの実施形態では、細胞外ドメインの一部は、ＮＫＧ２Ｄ受容体のリガンドに結合する能力を保持する。また、いくつかの実施形態によれば、アクセサリータンパク質は、ＮＫＧ２Ｄ受容体の細胞外ドメインの効率的な発現に必要ではない。例えば、いくつかの実施形態では、ＤＡＰ１０は、効率的なＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメイン発現および／または機能に必要とされない。同様に、いくつかの実施形態では、ＤＡＰ１２は、効率的なＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメイン発現および／または機能に必要とされない。

【0020】

いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄのリガンドは、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、およびそれらの組み合わせから選択される。一部の実施形態では、他の腫瘍関連リガンドを結合することができる。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ受容体はヒトＮＫＧ２Ｄ受容体の断片である。代替の実施形態では、非ヒト配列を使用することができる。

【0021】

いくつかの実施形態では、肝細胞癌腫を治療するための方法が提供され、本方法は、細胞傷害性受容体複合体を発現するように操作されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の集団を含む組成物を肝細胞癌腫を有する患者に投与することを含み、細胞傷害性受容体複合体は、膜貫通ドメインに結合した細胞外ドメインを含み、膜貫通ドメインは、シグナル伝達ドメインにさらに結合し、細胞外ドメインは、ナチュラルキラーグループ２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）受容体の断片を含み、ＮＫＧ２Ｄ受容体の断片は、配列番号２４のポリヌクレオチドによってコードされるＮＫＧ２Ｄ受容体断片と少なくとも９５％相同であり、投与は、患者の肝臓内動脈への注射を含む。

【0022】

いくつかの実施形態では、細胞傷害性シグナル伝達複合体のシグナル伝達ドメインは、ＯＸ４０ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞傷害性シグナル伝達複合体のシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータドメインをさらに含む。実施形態に応じて、ＣＤ３ゼータドメインは、少なくとも１つの免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）モチーフを含む。一部の実施形態では、ＩＴＡＭモチーフは存在しない。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインはＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５は、膜結合ＩＬ－１５としてＮＫ細胞によって発現される。いくつかの実施形態では、膜結合ＩＬ－１５は、分泌型ＩＬ－１５の発現によって補足される。いくつかの実施形態では、代替のインターロイキンを、ＩＬ－１５の代わりに、またはＩＬ－１５に加えて使用することができる。

【0023】

いくつかの実施形態では、細胞傷害性シグナル伝達複合体の膜貫通ドメインは、ＣＤ８アルファに由来する。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、第１および第２のサブドメインを含む。一部のこのような実施形態では、第１のサブドメインは、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメインを含む。一部のこのような実施形態では、第２のサブドメインは、ＣＤ８アルファヒンジを含む。

【0024】

いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号７のポリヌクレオチドによってコードされる細胞傷害性受容体複合体と少なくとも８０％相同である。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号７のポリヌクレオチドによってコードされる細胞傷害性受容体複合体と少なくとも８５％相同である。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号７のポリヌクレオチドによってコードされる細胞傷害性受容体複合体と少なくとも９０％相同である。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号７のポリヌクレオチドによってコードされる細胞傷害性受容体複合体と少なくとも９５％相同である。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号８のアミノ酸配列を有する細胞傷害性受容体複合体と少なくとも８０％相同である。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号８のアミノ酸配列を有する細胞傷害性受容体複合体と少なくとも９０％相同である。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号１、３、５、９、１１、１３、１５、１７、１９、および２１からなる群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされる細胞傷害性受容体複合体と少なくとも８０％相同である。なおさらなる実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、示された配列に対してより少ない相同性を有し得るが、参照受容体複合体と同じ機能性のすべてまたは実質的にすべてを保持する。

【0025】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細胞／組成物は、経皮的に投与される。いくつかの実施形態では、肝臓内動脈は経皮的にアクセスされ、細胞の集団は注入によって投与される。一実施形態では、肝臓は、観血的手術アプローチを用いる代わりに、皮膚の針穿刺を介して標的化される。一実施形態では、カテーテルシステムが使用される。一部の実施形態では、オーバーザワイヤーシステムが使用される。いくつかの実施形態では、腫瘍（例えば、固形腫瘍）または肝臓系外の他の部位が標的化される。

【0026】

一実施形態では、注射針は、皮膚を通じて、動脈または静脈などの血管内に配置される。ガイドワイヤなどのイントロデューサーが血管に導入される。次に、注射針は、イントロデューサーの上方および血管内に前進される導管またはシースと交換される。イントロデューサーを取り外し、本明細書に記載される細胞／組成物をデリバリーするために使用されるカテーテルまたは他の医療機器と交換する。カテーテルは、曲がりくねった血管をうまく通過させるために、部分的または完全に可撓性であり得る。一部の実施形態では、カテーテルは、肝動脈または門脈の形状および大きさに適合させることができる。一実施形態では、細胞／組成物は一定期間にわたってデリバリーされる。別の実施形態では、細胞／組成物は単一ボーラスでデリバリーされる。さらに他の実施形態では、細胞／組成物は基質上にデリバリーされる。一部の実施形態では、デリバリーを容易にするために、画像または他のガイダンスが使用される。一部の実施形態では、細胞／組成物は、少なくとも９５％、９７％、９９％または１００％の細胞／組成物がデリバリーされ、標的位置に残るように、標的化された局所デリバリーのために使用される。一実施形態では、肝動脈のみが標的化され、門脈は標的化されない。いくつかの実施形態では、キメラ受容体を発現するＮＫ細胞は、トランス動脈デリバリー（例えば、肝動脈へのトランス動脈デリバリー）を介して投与される。

【0027】

いくつかの実施形態では、非経皮投与も提供される。一部の実施形態では、細胞および組成物は、静脈内、筋肉内、腹腔内に、動脈を介して、および／または観血的手術アプローチを介してデリバリーされる。一部の実施形態では、肝臓以外の領域に位置する腫瘍が治療される（卵巣、膵臓、腎臓、および他の臓器など）。本明細書にはＮＫ細胞および組成物が記載されているが、ＮＫ細胞（限定されないが、ＣＡＲ Ｔ細胞、抗体、上皮細胞増殖因子受容体阻害剤、抗腫瘍剤など）の代わりに、またはそれに加えて、他の細胞または生物学的製剤／薬物をデリバリーすることができる。一部の実施形態では、セツキシマブ、ダラツムマブ、リツキシマブ、オビヌツズマブ、およびトラスツズマブのうちの１つまたは複数がＮＫ細胞と組み合わせて提供される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のチロシンキナーゼ阻害剤は、本明細書に開示される操作されたＮＫ細胞と組み合わせて提供される。例えば、いくつかの実施形態では、ソラフェニブは、本明細書に開示された操作されたＮＫ細胞と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、スニチニブは、本明細書に開示される操作されたＮＫ細胞と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の化学療法剤が、本明細書に開示される操作されたＮＫ細胞と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、シスプラチン、ヒドロキシウレア、５－フルオロウラシル、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、および／またはエトポシドのうちの１つまたは複数が、本明細書に開示される操作されたＮＫ細胞と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、高線量電離放射線が、本明細書に開示される操作されたＮＫ細胞と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のプロテアソーム阻害剤が、本明細書に開示される操作されたＮＫ細胞と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、ボルテゾミブ（例えば、ベルケイド（登録商標））が、本明細書に開示される操作されたＮＫ細胞と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のＨＤＡＣ阻害剤が、本明細書に開示される操作されたＮＫ細胞と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、レミデプシン（例えば、ＦＲ９０１２２８）、エンチノスタット（例えば、ＭＳ－２７５）、フェニルブチレート、ベリノスタット（例えば、ＰＤＸ１０１）、バルプロ酸ナトリウム、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、および／またはバルプロ酸のうちの１つまたは複数が、本明細書に開示される操作されたＮＫ細胞と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、オールトランス型レチノイン酸および／または酪酸ナトリウムのうちの１つまたは複数が、本明細書に開示される操作されたＮＫ細胞と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の脱メチル化剤が、本明細書に開示される操作されたＮＫ細胞と組み合わせて投与される。例えば、いくつかの実施形態では、アザジチジン（ａｚａｚｙｔｉｄｉｎｅ）および／またはデシタビンが、本明細書に開示される操作されたＮＫ細胞と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、投与される追加の薬剤は、例えば、本明細書に開示される操作された受容体のリガンドの上方制御を誘導することによって、標的腫瘍細胞を、操作されたＮＫ細胞に対してより感受性にする。

【0028】

一部の実施形態では、本明細書に記載される細胞／組成物のデリバリーは、他の診断および／または療法モダリティとともに投与される。例えば、腫瘍アブレーション（例えば、凍結療法）、化学療法、郭清などは、追加の療法として投与することができる。一部の実施形態では、経動脈化学塞栓術、超音波アブレーション、マイクロ波アブレーション、レーザー療法、ガンマナイフ放射線手術、エタノール注射、および／または放射線塞栓術が提供される。一実施形態では、細胞／組成物は、これらの他の療法の有効性を増強し、望ましくない副作用を減少させおよび／または治療時間を短縮する。一部の実施形態では、デリバリー、局在化および／または有効性を増大させる技術が提供され、これには、限定されないが、エレクトロポレーションなどの細胞膜透過性を増大させる技術が含まれる。

【0029】

いくつかの実施形態では、投与されたＮＫ細胞の集団は、患者に対して自家である。代替の実施形態では、投与されたＮＫ細胞の集団は、患者に対して同種である。ＮＫ細胞は、ウイルス感染、損傷、および悪性細胞の自然免疫センサーである。ＮＫは、単一のエピトープに制限されない；それらは、健常な細胞を救出し、疾患細胞を死滅させるために、多種多様な活性化および抑制性シグナルを読み取る。また、ＮＫ細胞増殖シグナル（例えば、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、ＩＬ２、ＩＬ２１に応答する）は、細胞傷害性を駆動するシグナル（例えば、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ１６、ＤＮＡＭ－１、２Ｂ４、ＮＫｐ４４、および／またはＮＫｐ３０を介したシグナル伝達）とは異なる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される実施形態による操作されたＮＫ細胞の使用は、このような操作されたＮＫ細胞が、（ｉ）健常細胞と癌細胞を識別することができ、（ｉｉ）複数の抗原を標的とすることができ、（ｉｉｉ）多数の腫瘍細胞によって過剰発現される天然リガンドを標的化することができ、（ｉｖ）チェックポイント阻害剤を標的化することができ、ならびに／または（ｖ）移植片対宿主疾患のリスクを低減および／もしくは排除することができるために有利である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される実施形態による操作された細胞は、限定された細胞死を伴う凍結保存に耐える能力を有する。いくつかの実施形態では、これは、既製製品を可能にする。なおさらなる実施形態では、投与された集団は、混合した自家／同種集団である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＮＫ細胞と組み合わせてまたはそれに代えて投与される。いくつかの実施形態では、治療方法は、患者にＩＬ－２を投与することをさらに含む。

【0030】

いくつかの実施形態では、本方法は、肝臓内動脈にアクセスする前に、肝臓内動脈の位置をマッピングすることをさらに含む。いくつかの実施形態は、肝臓に血液を供給しない血管を閉塞する工程を用いる。実施形態に応じて、ＮＫ細胞の集団の投与は、１週間ごとに１回、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、または４週間ごとに１回繰り返される。いくつかの実施形態では、投与された組成物は、腫瘍量の少なくとも２５％の減少をもたらす。いくつかの実施形態では、腫瘍量の減少は、肝細胞癌腫瘍量の減少である。いくつかの実施形態では、投与された組成物は、約１０７～約１０１０個のＮＫ細胞を含む。

【0031】

いくつかの実施形態では、細胞傷害性シグナル伝達複合体のシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータドメインを含み、細胞外ドメインは、配列番号２４のポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ゼータドメインは、少なくとも１つの免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）モチーフを含む。いくつかの実施形態では、細胞傷害性シグナル伝達複合体のシグナル伝達ドメインは、ＯＸ４０ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞傷害性シグナル伝達複合体は、４－１ＢＢドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞傷害性シグナル伝達複合体のシグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞傷害性シグナル伝達複合体のシグナル伝達ドメインは、ＮＫｐ８０ドメインをさらに含む。

【0032】

いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号１の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号３の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号４のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号５の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号６のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号７の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号８のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号９の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号１０のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号１１の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号１２のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号１３の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号１４のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号１５の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号１６のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号１７の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号１８のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号１９の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号２０のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号２１の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号２２のアミノ酸配列を有する。

【0033】

上記に要約され、以下でさらに詳細に説明される組成物および関連する方法は、熟練者によって取られる特定の行動を記載する。しかしながら、それらは、別の者によるそれらの行動の指示も含むことができることが理解されるべきである。したがって、「操作されたＮＫ細胞の集団を肝臓に局所的に投与する」などの行動は、「操作されたＮＫ細胞の集団を肝臓に局所的に投与することを指示する」ことを含む。

【図面の簡単な説明】

【0034】

【図1】図１Ａ～１Ｇは、本明細書に開示されるいくつかの実施形態による、ＮＫ細胞における発現のための細胞傷害性受容体複合体コンストラクトの概略図を表す。

【0035】

【図2】図２Ａ～２Ｄは、本明細書に開示されるいくつかの実施形態による、ＮＫ細胞における発現のためのさらなる細胞傷害性受容体複合体コンストラクトの概略図を表す。

【0036】

【図3】図３Ａ～３Ｃは、天然のＮＫ細胞（ＮＴ ＮＫ）または本明細書に開示される実施形態による操作されたＮＫ細胞（ＮＫＸ１０１）と共培養した場合に、培養された肝細胞癌腫細胞によって放出される種々の因子の濃度に関するデータを示す。

【0037】

【図4-1】図４Ａ～４Ｊは、種々のエフェクター：標的比で種々の肝細胞癌腫細胞株と共培養した場合に、天然のＮＫ細胞（ＮＴ ＮＫ）または本明細書に開示される実施形態による操作されたＮＫ細胞（ＮＫＸ１０１）によって誘導される細胞傷害性効果の程度に関するデータを示す。図４Ｊは、１：２のエフェクター対標的比でなおも生存可能な対照細胞のパーセンテージによって測定されるＮＫＸ１０１に対するそれらの抵抗性の観点から細胞株を要約する。図４Ｋ～４Ｓは、種々のエフェクター：標的比で種々の肝細胞癌腫細胞株と共培養した場合に、天然のＮＫ細胞（ドナー数）または本明細書に開示される実施形態による操作されたＮＫ細胞（ＮＫＸ１０１（＋ドナー数））によって誘導される細胞傷害性効果の程度に関連する追加データを示す。図４Ｔ～４ＢＢは、図４Ｆ～４Ｓに示されるそれらのトレースの要約データを反映する。Ｙ軸は、未処理ＨＣＣ細胞数に基づく対照のパーセント（ＰｏＣ）（［（平均実験値）／（対照平均）×１００］として算出される）を示す。

【図4-2】同上

【図4-3】同上

【図4-4】同上

【0038】

【図5】図５は、マウスにおける肝細胞癌腫瘍量を減少させるＮＫＸ１０１のインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）評価のためのプロトコールの概略図を示す。肝細胞癌腫細胞（ホタルルシフェラーゼを有するＳＮＵ４４９細胞）を受けたマウスに、ＨＣＣ投与８日後に３×１０^６個の細胞（非修飾ＮＫまたはＮＫＸ１０１のいずれか）またはＰＢＳをＩＰ投与した。ＮＫＸ１０１形質導入効率は約５７％であったが、残存ＣＤ３＋Ｔ細胞は２％未満であった。

【0039】

【図6】図６Ａ～６Ｆは、ＰＢＳ（ＡおよびＤ）、非修飾ＮＫ（ＢおよびＥ）またはＮＫＸ１０１（ＣおよびＦ）を受けたマウスにおける腫瘍量に関連するデータを示す。Ａ、Ｂ、およびＣに示されるのは、示された細胞（またはＰＢＳ）を受けたマウスの生物発光画像であり、経時的な腫瘍量を示す。Ｄ、Ｅ、およびＦに示されるのは、経時的な腫瘍量を示す対応する線グラフである。

【0040】

【図7】図７Ａ～７Ｅは、単独で使用した場合、または本明細書に提供される操作されたＮＫ細胞と組み合わせて使用した場合、種々の腫瘍細胞株に対するソラフェニブの有効性に関するデータを示す。７Ａは、Ｒａｆ－１、Ｂ－ＲａｆおよびＶＥＧＦＲ－２シグナル伝達経路を阻害する低分子ソラフェニブの種々の用量での示されたＨＣＣ細胞株の生存率に関するデータを示す。図７Ｂは、ＨＣＣ細胞株に対するソラフェニブの表にしたＥＣ５０用量である。図７Ｃ～７Ｅは、チロシンキナーゼ阻害剤（ソラフェニブ）と天然のＮＫ細胞またはＮＫＸ１０１の種々の組み合わせの、示されたエフェクター：標的比での細胞傷害性を示す。

【0041】

【図8】図８Ａ～８Ｉは、バモマブ抗体を用いて測定された、示された肝細胞癌腫細胞型における種々のＮＫＧ２Ｄ受容体リガンドおよび対照マーカーの発現に関するデータを示す。ＮＫＧ２Ｄリガンドは破線の枠で囲まれているが、対照は実線の枠で囲まれている。

【0042】

【図9】図９Ａ～９Ｆは、示されたＮＫＧ２Ｄ受容体リガンドの発現の程度に対する種々のＨＣＣ細胞株の細胞傷害性の程度に関するデータを示す。

【0043】

【図10】図１０Ａ～１０Ｇは、種々のＨＣＣ細胞株におけるＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃの発現の程度（ＡおよびＢ）、およびＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃの発現と示されたＮＫＧ２Ｄ受容体リガンドの間の相関の程度に関するデータを示す。

【0044】

【図11】図１１Ａ～１１Ｂは、ルシフェラーゼを発現するように操作された２つのモデルＨＣＣ細胞株において測定された４時間のエンドポイントにおけるＮＫＸ１０１細胞のインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）細胞傷害性の増強に関するデータを示す（１１ＡはＨｅｐ３ｂ細胞を示し；１１ＢはＳＮＵ４４９細胞を示す）。Ｋ５６２－ｍｂＩＬ１５－４１ＢＢＬ刺激細胞による拡大後２１日目の２人のドナー由来のＮＫＸ１０１および非修飾（ＮＴ ＮＫ）ＮＫ細胞の平均を示す。Ｐｒｉｓｍ ４パラメータ非線形回帰分析を用いて算出したＥＣ５０値。

【0045】

【図12】図１２Ａ～１２Ｉは、ＰＥコンジュゲートされた抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いて測定された、示された肝細胞癌腫細胞型における種々のＮＫＧ２Ｄ受容体リガンドおよび対照マーカーの発現に関するデータを示す。ＮＫＧ２Ｄリガンドは破線の枠で囲まれているが、対照は実線の枠で囲まれている。

【0046】

【図13-1】図１３Ａ～１３Ｉは、図１２のＰＥコンジュゲートされた抗体および図８のＢＡＭＯｍＡｂ抗体を用いて、示された種々の示された肝細胞癌腫細胞株におけるＮＫＧ２Ｄリガンド発現の要約データを示す。データは、ｄＭＦＩ（デルタ平均蛍光強度、検出される標的ＭＦＩ－抗体アイソタイプＭＦＩ（例えば、バックグラウンド）として算出される）として示される。

【図13-2】同上

【0047】

【図14】図１４Ａ～１４Ｆは、ＨＣＣにおける特異的ＮＫＧ２Ｄリガンドの変化の調査に関する。これらのデータは、ＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃによるリガンド対示された特異的ＮＫＧ２Ｄリガンドの結合（Ｘ軸）によって測定される、すべてのＮＫＧ２Ｄリガンドの発現レベル（Ｙ軸）をプロットする。

【0048】

【図15】図１５Ａ～１５Ｃは、ルシフェラーゼを発現するように操作された３つのモデルＨＣＣ細胞株において測定された４時間のエンドポイントにおけるＮＫＸ１０１細胞の細胞傷害性データを示す（１５ＡはＨｅｐ３ｂ細胞を示し、１５ＢはＨｕｈ－７細胞を示し、１５ＣはＳＮＵ４４９細胞を示す）。Ｋ５６２－ｍｂＩＬ１５－４１ＢＢＬ刺激細胞による拡大後２１日目の２人のドナー由来のＮＫＸ１０１および非修飾（ドナー数）ＮＫ細胞の平均を示す。

【0049】

【図16】図１６Ａ～１６Ｇは、ルシフェラーゼを発現するための種々の肝細胞癌腫細胞の操作に関する。細胞株を形質導入するために使用されるベクターは、形質導入された細胞のＭＡＣＳ ＣＤ１９陽性選択を可能にするためのＣＤ１９発現タグを含んだ。図１６Ａ～１６Ｆは、示された細胞株の各々についてのフローサイトメトリーデータを示す。図１６Ｇは、ルシフェラーゼの発現によって測定された、細胞の成功した生成を要約する（相対光単位／１０，０００細胞）。

【0050】

【図17-1】図１７Ａ～１７Ｎは、ソラフェニブ濃度に関連する総ＮＫＧ２ＤリガンドおよびＰＤ－Ｌ１の発現に関する。図１７Ａ～１７Ｆは、種々の濃度のソラフェニブに応答した、示された腫瘍細胞株における総ＮＫＧ２Ｄリガンド発現の変化に関連するフローサイトメトリーデータを示す（総発現はＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃ融合の使用に基づき、したがって、検出は任意のリガンドＮＫＧ２Ｄが結合し得るものである）。図１７Ｇ～１７Ｌは、種々の濃度のソラフェニブに応答した、示された腫瘍細胞株におけるＰＤ－Ｌ１発現の変化に関連するフローサイトメトリーデータを示す。図１７Ｍおよび１７Ｎは、フローサイトメトリーデータを要約する線グラフである。

【図17-2】同上

【図17-3】同上

【0051】

【図18-1】図１８Ａ～１８Ｔは、インターフェロンガンマ（ＩＦＮｇ）濃度に関連する総ＮＫＧ２ＤリガンドおよびＰＤ－Ｌ１の発現に関する。図１８Ａ～１８Ｉは、種々の濃度のＩＦＮｇに応答した、示された腫瘍細胞株における総ＮＫＧ２Ｄリガンド発現の変化に関連するフローサイトメトリーデータを示す（総発現はＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃ融合の使用に基づき、したがって、検出は任意のリガンドＮＫＧ２Ｄが結合し得るものである）。図１８Ｊ～１８Ｓは、種々の濃度のＩＦＮｇに応答した、示された腫瘍細胞株におけるＰＤ－Ｌ１発現の変化に関連するフローサイトメトリーデータを示す。図１８Ｓおよび１８Ｔは、フローサイトメトリーデータを要約する線グラフである。

【図18-2】同上

【図18-3】同上

【図18-4】同上

【0052】

【図19】図１９Ａ～１９Ｄは、キメラ受容体コンストラクトで形質導入されていないＮＫ細胞によるＰＤ－１の発現、またはＮＫＸ１０１細胞によるＰＤ－１の発現に関する。

【0053】

【図20】図２０Ａ～２０Ｅは、操作されたルシフェラーゼ発現結腸直腸癌（ＣＲＣ）細胞株によるＣＤ１９の発現に関する。細胞株を形質導入するために使用されるベクターは、形質導入された細胞のＭＡＣＳ ＣＤ１９陽性選択を可能にするためのＣＤ１９発現タグを含んだ。

【0054】

【図21】図２１Ａ～２１Ｅは、ルシフェラーゼを発現するように操作されたＣＲＣ細胞による種々のＮＫＧ２Ｄリガンドの発現に関する。

【0055】

【図22】図２２Ａ～２２Ｆは、ＣＤ３枯渇前（Ａ～Ｃ）およびＣＤ３枯渇後（Ｄ～Ｆ）のＣＤ５６の３人のドナー由来のＮＫ細胞による発現に関連するフローサイトメトリーデータを示す。

【0056】

【図23】図２３Ａ～２３Ｃは、２人のドナー由来のＮＫ細胞における、操作されたＮＫ細胞（ＮＫＸ１０１）によるＮＫＧ２Ｄ受容体の発現（非形質導入のＮＫ細胞（ＮＴＮＫ）と比較する）に関するフローサイトメトリーデータを示す。

【0057】

【図24】図２４Ａ～２４Ｃは、示されたＣＲＣ細胞株に対する４人の異なるドナー由来のＮＫＸ１０１細胞の細胞傷害性データ、ならびに関連するＥＣ５０値を示す。Ｋ５６２－ｍｂＩＬ１５－４１ＢＢＬ刺激細胞を用いて、拡大後１４～２１日目に回収されたデータを示す。

【0058】

【図25】図２５Ａ～２５Ｆは、２人のドナーに由来し、ＮＫＸ１０１を発現するように操作されたＮＫ細胞の特徴付けに関するフローサイトメトリーデータを示す。図２５Ａ～ＢおよびＤ～Ｅは、ＣＤ３枯渇前（Ａ～Ｂ）およびＣＤ３枯渇後（Ｄ～Ｅ）のＣＤ５６の２人のドナー由来のＮＫ細胞による発現に関する。図２５Ｃおよび２５Ｆは、これら２人のドナー由来のＮＫ細胞におけるＮＫＸ１０１発現（非形質導入のＮＫ細胞（ＮＴＮＫ）と比較した）に関連するフローサイトメトリーデータを示す。

【0059】

【図26】図２６Ａ～２６Ｃは、非形質導入のＮＫ細胞（ＮＴＮＫ）またはＮＫＸ１０１を発現するＮＫ細胞のいずれかに応答した、示されたＣＲＣ細胞株によって放出されたサイトカインの分析を示す。

【0060】

【図27-1】図２７Ａ～２７Ｅは、分析され、図２６Ａ～２６Ｅに要約された各サイトカインの標準曲線を示す。

【図27-2】同上

【0061】

【図28】図２８Ａ～２８Ｂは、拡大中のＮＫ細胞による受容体発現の活性化に関するフローサイトメトリーデータを示す。

【0062】

【図29】図２９Ａ～２９Ｃは、本明細書に開示される実施形態による操作されたＮＫ細胞のインビボ持続性および細胞傷害性に関するデータを示す。図２９Ａは、本明細書に開示される操作されたＮＫ細胞の非限定的な実施形態のインビボ持続性の増強を示す。図２９Ｂは、本明細書に開示される操作されたＮＫ細胞の非限定的な実施形態について増強されたインビボ細胞傷害性データを示す。図２９Ｃは、図２９Ｂのデータの根拠となる生物発光強度イメージングデータを示す。

【0063】

【図30】図３０Ａ～３０Ｂは、ＴＨＰ１ ＡＭＬ異種移植モデルからのデータに関する。図３０Ａは、急性骨髄性白血病細胞に対する、本明細書に開示される実施形態によるＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲの細胞傷害性に関するインビボデータを示す。図３０Ｂは、インビボデータの要約を提供する。

【0064】

【図31】種々の急性骨髄性白血病細胞に対する、本明細書に開示される実施形態によるＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲの細胞傷害性に関する要約データを示す。

【0065】

【図32-1】図３２Ａ～３２Ｋは、本明細書に開示されるＮＫ細胞および操作されたＮＫ細胞のさらなる特徴付けに関する。図３２Ａは、本明細書に開示される操作されたＮＫ細胞および凍結保存に対するそれらの応答を特徴付けるための概略的プロトコールを示す。図３２Ｂは、操作されたＮＫ細胞生存率に関するデータを示す。図３２Ｃは、操作されたＮＫ細胞生存細胞回収に関するデータを示す。図３２Ｄは、操作されたＮＫ細胞の細胞傷害性の保持に関するデータを示す。図３２Ｅは、拡大中の操作されたＮＫ細胞による特定のマーカーの発現に関する要約データを示す。図３２Ｆは、拡大中の操作されたＮＫ細胞による特定のマーカーの発現に関する追加の要約データを示す。図３２Ｇは、拡大中の操作されたＮＫ細胞によるＣＤ１６の発現に関する要約データを示す。図３２Ｈは、拡大中の操作されたＮＫ細胞によるマーカー発現に関する要約データを示す。図３２Ｉは、拡大中の操作されたＮＫ細胞によるマーカー発現の強度に関する要約データを示す。図３２Ｊは、フィーダー細胞単独による拡大中の操作されたＮＫ細胞によるマーカー発現に関する要約データを示す。図３２Ｋは、フィーダー細胞および追加のサイトカインによる拡大中の操作されたＮＫ細胞によるマーカー発現に関する要約データを示す。

【図32-2】同上

【図32-3】同上

【図32-4】同上

【0066】

【図33】図３３Ａ～３３Ｃは、本明細書に開示される実施形態によるかまたは標的細胞（ここでは、Ｒａｊｉ細胞およびＮａｌｍ６細胞）上での操作されたＮＫ細胞による種々の表面マーカーの発現に関する。図３３Ａは、本明細書に開示されるいくつかの実施形態による、ＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲを発現するＮＫ細胞上のＣＤ１６発現を示す。図３３Ｂは、ＲａｊｉおよびＮａｌｍ６腫瘍細胞上のＣＤ１９発現を示す。図３３Ｃは、ＲａｊｉおよびＮａｌｍ６腫瘍細胞上のＣＤ２０発現を示す。

【0067】

【図34】図３４は、ＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲの非限定的な例を発現するＮＫ細胞、ならびに抗ＣＤ２０抗体に曝露した場合のＲａｊｉ細胞増殖の減少に関するデータを示す。

【0068】

【図35】図３５Ａ～３５Ｂは、ＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲの非限定的な例を発現するＮＫ細胞、ならびにＨＤＡＣ阻害剤に曝露した場合のＨＬ６０白血病細胞増殖の阻害に関する。図３５Ａは、示されたコンストラクトによるＨＬ６０細胞増殖を示す。図３５Ｂは、ＨＤＡＣ阻害剤の投与と組み合わせた同じコンストラクトを示す。

【0069】

【図36】図３６は、本明細書に開示されるＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲの非限定的な実施形態を発現する種々の免疫細胞タイプの存在下での細胞増殖の減少に関するデータを示す。

【発明を実施するための形態】

【0070】

治療活性部位への製剤のデリバリーは、薬物の性能および安全性にとって重要な因子である。細胞性免疫療法の場合、エフェクター細胞タイプがしばしば腫瘍微小環境から除外されるため、デリバリーの問題は、効果的な療法に対するさらなるハードルとなり得る。ＮＫ細胞の腫瘍浸潤は、いくつかの腫瘍タイプにおいて良好な予後と関連しているが、ＮＫ細胞はまた、いくつかの腫瘍タイプ（例えば、腎細胞癌腫、結腸直腸癌腫、および黒色腫）に低浸潤であることが観察されている。ＮＫ細胞によって発現されるケモカイン受容体レパートリーのギャップに関連すると考えられる浸潤の欠如は、特定の腫瘍に関連して養子注入されたＮＫ細胞を用いて達成された様々な臨床的結果を説明し得る。

【0071】

一部の療法は、肝臓への治療薬の局所デリバリーから利益を得る。例えば、肝臓内動脈を介した化学療法剤の投与が実証されている。同様に、肝細胞癌腫の治療のために、肝臓へのＣＡＲ Ｔ細胞の領域的デリバリーが行われている。

【0072】

本明細書に開示されるいくつかの実施形態に従えば、ＮＫ細胞を用いる細胞療法は、肝細胞癌腫において使用するための魅力的な選択肢である。ＮＫＧ２Ｄ受容体のリガンドは肝細胞癌腫において発現し、ＮＫＧ２Ｄ受容体の過剰発現はインビトロおよびインビボで肝細胞癌腫由来の細胞株に対するＮＫ細胞細胞傷害性を改善する。さらに、肝細胞癌腫の患者由来のＮＫ細胞は消耗の徴候を示すことがあるが、ＩＬ－１５への曝露はある程度の機能性を回復することができる。一部の実施形態では、ＮＫ細胞の肝臓内デリバリーは、肝細胞癌腫の治療にこれらの細胞を使用するための非常に有効な方法である。いくつかの実施形態では、操作されたＮＫ細胞を使用するＮＫベースの療法は、天然のＮＫ細胞よりもさらに有効性を増加させる。例えば、一部の実施形態によれば、ＮＫ細胞は、ＮＫＧ２Ｄ受容体（またはその一部）を含む細胞傷害性受容体複合体を発現するように操作される。一部の態様によれば、ＮＫ細胞は、ＩＬ－１５を発現するように操作され、一部の実施形態では、分泌型形態を発現するように操作され、一方、一部の実施形態では、ＩＬ－１５は膜結合型である。肝細胞癌腫へのＮＫ浸潤は限定され、腫瘍微小環境によって潜在的に抑制され得るが、このような操作されたＮＫ細胞の肝臓への局所デリバリーは、疾患部位への有効用量のデリバリーを確実にすること、それらが必要とされる解剖学的コンパートメント内に細胞を収容することの両方ができ、したがって、潜在的な標的外傷害性を制限することができる。したがって、以下により詳細に検討されるように、このような組成物、およびこのような操作されたＮＫ細胞を局所的にデリバリーする方法は、ＮＫＧ２Ｄリガンドに対するＮＫの感受性を増強し、腫瘍微小環境の抑制力に抵抗するそれらの能力を改善し、増強された抗癌療法を提供する。

【0073】

免疫療法用の操作されたＮＫ細胞
細胞性免疫療法では、種々の免疫細胞のタイプを用いることができる。一部の実施形態は、Ｔ細胞ベースの組成物（例えば、本明細書に開示されるＮＫＧ２Ｄベースの細胞傷害性受容体複合体を発現するもの）および方法に関する。いくつかの実施態様は、ＮＫ細胞ベースの組成物および方法に関する。いくつかの実施態様によれば、操作されたＮＫ細胞を含む組成物は、特定の有利な特徴を有する。ＮＫ細胞は、自己由来またはドナー由来の同種細胞のいずれかの使用を可能にする。いくつかの実施形態に従えば、操作されたＮＫ細胞は、正常細胞に対して最小の細胞傷害性を有する。この利点は、例えば、肝臓内動脈を介する局所デリバリーと組み合わせる場合にさらに増強される。操作されたＮＫ細胞はまた、既に非常に強力である天然のＮＫ細胞の細胞傷害性効果よりも予期せぬ増加した有意な細胞傷害性効果を有する。

【0074】

いくつかの実施形態によれば、ＮＫ細胞は、１つまたは複数の細胞傷害性受容体複合体を発現するように操作される。複合体は、実施形態に応じて、腫瘍リガンドに結合するドメイン（例えば、細胞外ドメイン）、および膜貫通ドメイン、シグナル伝達ドメイン、および／または共刺激ドメインを含む細胞傷害性シグナル伝達複合体を含む。各ドメインは、１つまたは複数のサブドメインを含み得る。

【0075】

腫瘍リガンドに結合するドメイン
いくつかの実施形態では、操作されたＮＫ細胞は、それらの腫瘍細胞を認識し、破壊する能力のために利用される。ＮＫ細胞は、細胞表面に抑制性受容体と活性化受容体の両方を発現する。抑制性受容体は、健常な細胞の表面に発現する自己分子と結合し（したがって、「自己」細胞に対する免疫応答を妨げる）、一方、活性化受容体は、腫瘍細胞などの異常な細胞上に発現するリガンドと結合する。抑制性受容体と活性化受容体の間のバランスの「チップ」は、活性化受容体に有利に働き、ＮＫ細胞の活性化、および標的（例えば、腫瘍）細胞溶解を導く。ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）は、細胞上に発現される種々のリガンドを認識するＮＫ細胞活性化受容体である。種々のＮＫＧ２Ｄリガンドの表面発現は、一般的に、健常な細胞では低いが、例えば、悪性形質転換によって上方制御される。ＮＫＧ２Ｄによって認識されるリガンドの非限定的な例としては、限定されないが、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＡＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、およびＵＬＢＰ６、ならびにＮＫ細胞の細胞溶解または細胞傷害性機能を制御する標的細胞上に発現される他の分子が挙げられる。

【0076】

いくつかの実施形態では、細胞は、腫瘍細胞（例えば、肝細胞）の表面上のリガンドを認識するための細胞外コンポーネントとしての全長ＮＫＧ２Ｄを含む細胞傷害性受容体複合体を発現するように操作される。一実施形態では、全長ＮＫＧ２Ｄは配列番号２４の核酸配列を有する。

【0077】

いくつかの実施形態では、細胞は、腫瘍細胞（例えば、肝細胞）の表面上のリガンドを認識するための細胞外コンポーネントとしてのＮＫＧ２Ｄの機能的断片を含む細胞傷害性受容体複合体を発現するように操作される。一実施形態では、ＮＫＧ２Ｄの機能的断片は配列番号２４の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄの断片は、全長野生型ＮＫＧ２Ｄと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％相同である。いくつかの実施形態では、断片は、配列番号２４からの１つまたは複数のさらなる突然変異を有することができるが、リガンド結合機能を保持するか、または一部の実施形態では、増強されたリガンド結合機能を有する。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ断片は、二量体、三量体、または他のコンカテマー形式として提供され、このような実施形態は、増強されたリガンド結合活性を提供する。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ断片をコードする配列は、完全にまたは部分的にコドン最適化されてもよい。一実施形態では、コドン最適化されたＮＫＧ２Ｄ断片をコードする配列は、配列番号２５の配列を含む。いくつかの実施形態によれば、有利には、機能的断片は、その天然の膜貫通ドメインまたは細胞内ドメインを欠いているが、そのＮＫＧ２Ｄのリガンドに結合する能力、ならびにリガンド結合時に活性化シグナルを形質導入する能力を保持する。このような断片のさらなる利点は、ＮＫＧ２Ｄを細胞膜に局在化させるためのＤＡＰ１０の発現が必要でないことである。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチドによってコードされる細胞傷害性受容体複合体はＤＡＰ１０を含まない。

【0078】

いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、二量体化するように構成される。二量体化は、実施形態に応じて、ホモ二量体またはヘテロ二量体を含み得る。いくつかの実施形態では、二量体化は、細胞傷害性受容体複合体によるリガンド認識の改善をもたらし（したがって、ＮＫ細胞は受容体を発現する）、その結果、有害な傷害性効果の減少（または欠如）をもたらす。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、内部二量体、または１つもしくは複数のコンポーネントサブユニットの反復を用いる。例えば、いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、第２のＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインに結合した第１のＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメイン、および膜貫通／シグナル伝達領域（または別個のシグナル伝達領域とともに別個の膜貫通領域）を含んでもよい。

【0079】

いくつかの実施形態では、種々のドメイン／サブドメインは、リンカーによって分離され、例えば、ＧＳ３リンカー（配列番号４１）が使用される（またはＧＳｎリンカー）。これにより、受容体複合体の種々のコンポーネント部分をポリヌクレオチドに沿って分離することができ、受容体複合体の発現を増強することができる。

【0080】

細胞傷害性シグナル伝達複合体
本明細書に開示されるように、いくつかの実施形態によれば、提供される細胞傷害性受容体複合体は、標的細胞の表面上のリガンドに結合するドメインを含み、細胞傷害性シグナル伝達複合体も含む。いくつかの実施形態では、細胞傷害性シグナル伝達複合体は、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、少なくとも１つの共刺激ドメイン、および／または少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、１を超えるコンポーネント部分は、所与のドメインを構成する－例えば、共刺激ドメインは、２つのサブドメインを含むことができる。さらに、一部の実施形態では、ドメインは、複数の機能を果たすことができ、例えば、膜貫通ドメインはまた、シグナル伝達機能を提供するのに役立つことができる。

【0081】

膜貫通ドメイン
いくつかの実施形態では、用いられるＮＫＧ２Ｄドメインは、その正常な膜貫通ドメインの少なくとも一部を保持する。しかしながら、いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞とＮＫ細胞の両方に通常発現される膜貫通糖タンパク質であるＣＤ８の少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインはＣＤ８αを含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは「ヒンジ」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、ＣＤ８αの「ヒンジ」は配列番号２６の配列を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤ８αヒンジは切断または修飾され、配列番号２６の配列を有するＣＤ８αと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同である。

【0082】

いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインはＣＤ８α膜貫通領域を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８α膜貫通ドメインは配列番号２７の配列を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤ８αヒンジは切断または修飾され、配列番号２７の配列を有するＣＤ８αと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同である。

【0083】

いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインはＩｇＧ４短鎖ヒンジを含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ４短鎖ヒンジ膜貫通ドメインは配列番号２８の配列を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤ８αヒンジは切断または修飾され、配列番号２８の配列を有するＣＤ８αと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同である。

【0084】

いくつかの実施形態では、細胞傷害性シグナル伝達複合体はＣＤ２８ドメインを含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインはＣＤ２８を含み、一方、いくつかの実施形態では、ＣＤ２８ドメインは細胞内シグナル伝達ドメインであり、一方、いくつかの実施形態では、ＣＤ２８ドメインは膜貫通／細胞内シグナル伝達ドメインである。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８膜貫通ドメインは配列番号２９の配列を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号２９の配列を有するＣＤ２８と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同であるように切断または修飾することができる。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインは配列番号４０の配列を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインは、配列番号４０の配列を有するＣＤ２８と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同であるように切断または修飾することができる。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８は、コンストラクトにおける唯一の膜貫通／シグナル伝達ドメインとして使用されるが、いくつかの実施形態では、ＣＤ２８は１つまたは複数の他のドメインとともに使用され得る。

【0085】

いくつかの実施形態では、ＣＤ２８は、コンストラクトにおける唯一の膜貫通／シグナル伝達ドメインとして使用されるが、いくつかの実施形態では、ＣＤ２８は１つまたは複数の他のドメインとともに使用され得る。例えば、一部の実施形態では、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、および／またはＣＤ３ゼータの組み合わせが使用される。

【0086】

いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞ＣＤ３ Ｔ細胞受容体複合体（ゼータ、アルファ、ベータ、ガンマ、デルタ、およびイプシロンサブユニットからなる）の膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメイン全体が使用されるが、一部の実施形態では、その断片が使用される。一部の実施形態では、１～２０（例えば、１、２、３、４、５、６、８、１０、１５またはそれを超える）細胞外ＣＤ３ゼータ残基は、ＣＤ３ゼータ膜貫通ドメインに直接隣接する。一部の実施形態では、ＣＤ３ゼータ膜貫通ドメインは、配列番号３０の配列を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ゼータ膜貫通ドメインは、配列番号３０の配列を有するＣＤ３ゼータ膜貫通ドメインと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同であるように切断または修飾することができる。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ゼータ膜貫通ドメインへの修飾は、ドメインの長さを増加させるための追加の核酸残基を含む。

【0087】

共刺激ドメイン
いくつかの実施形態では、種々の膜貫通ドメインおよびシグナル伝達ドメイン（および膜貫通ドメイン／シグナル伝達ドメインの組み合わせ）に加えて、追加の共活性化分子を提供することができる。これらは、例えば、免疫細胞の活性をさらに増強する特定の分子であり得る。サイトカインが、一部の実施形態では使用され得る。例えば、非限定的な例として、ＩＬ－２および／またはＩＬ－１５などの特定のインターロイキンが使用される。一部の実施形態では、療法のための免疫細胞は、分泌型形態としてこのような分子を発現するように操作される。さらなる実施形態では、このような共刺激ドメインは、自己分泌刺激分子（または、デリバリーされた隣接細胞へのパラクリン刺激剤としてさえも）として作用する、膜結合型であるように操作される。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、膜結合型インターロイキン１５（ｍｂＩＬ１５）を発現するように操作される。このような実施形態では、ＮＫ上のｍｂＩＬ１５発現は、ＮＫ細胞の増殖および／または寿命を増強することによって、操作されたＮＫ細胞の細胞傷害性効果を増強する。いくつかの実施形態では、ｍｂＩＬ１５は配列番号３９の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ｍｂＩＬ１５は、配列番号３９の配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同であるように切断または修飾することができる。

【0088】

一部の実施形態では、操作された細胞傷害性受容体複合体は、１つまたは複数の細胞質プロテアーゼ切断部位、例えば、Ｔ２Ａ切断部位、Ｐ２Ａ切断部位、Ｅ２Ａ切断部位、および／またはＦ２Ａ切断部位を含むポリヌクレオチドによってコードされる。このような部位は、細胞質プロテアーゼによって認識されおよび切断され、ポリヌクレオチドによってコードされる受容体の種々のコンポーネント部分の分離（および別個の発現）をもたらすことができる。結果として、実施形態に応じて、操作された細胞傷害性受容体複合体の種々の構成部分は、単一のベクターにおいてまたは複数のベクターによりＮＫ細胞にデリバリーされ得る。したがって、図に概略的に示されるように、コンストラクトは、単一のポリヌクレオチドによってコードされ得るが、切断部位も含み、その結果、コンストラクトの下流要素は、別個のタンパク質として細胞によって発現される（ＩＬ－１５を有する一部の実施形態における場合が挙げられる）。いくつかの実施形態では、Ｔ２Ａ切断部位が使用される。いくつかの実施形態では、Ｔ２Ａ切断部位は配列番号３８の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ｍｂＩＬ１５は、配列番号３８の配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同であるように切断または修飾することができる。

【0089】

シグナル伝達ドメイン
いくつかの実施形態では、シグナル伝達は、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７および腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９（ＴＮＦＲＳＦ ９）としても公知である）を介して提供される。本明細書に開示されるように、４－１ＢＢは、活性化Ｔ細胞のための刺激分子としての天然の役割を有する（例えば、４－１ＢＢの架橋は、Ｔ細胞増殖および細胞溶解活性を増強する）が、いくつかの実施形態は、４－１ＢＢ活性のＮＫ細胞との機能を利用する。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢは配列番号３１の配列を有する。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢは、配列番号３１の配列を有する４－１ＢＢと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同であるように切断または修飾することができる。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢは唯一のシグナル伝達ドメインである。しかしながら、いくつかの実施形態では、増強されたシグナル伝達は、その活性が相乗的に作用する複数のシグナル伝達ドメインの使用によって達成される。

【0090】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるいくつかの実施形態による操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ３ Ｔ細胞受容体複合体（またはその断片）の少なくとも１つのサブユニットを含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータサブユニットを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ゼータは配列番号３２の配列を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ゼータは、配列番号３２の配列を有するＣＤ３ゼータと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同であるように切断または修飾することができる。

【0091】

いくつかの実施形態では、ＣＤ３ゼータは、ドメインがもはや標準的な免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）モチーフを含まないように、突然変異がなされる（例えば、アミノ酸の突然変異、挿入または欠失）。一部の実施形態では、得られた操作されたＮＫ細胞は、限定されたかまたは減少された副作用を伴って、標的細胞に対して特に増強された細胞傷害性を示す。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、非ＩＴＡＭ ＣＤ３ゼータサブユニットを含む。いくつかの実施形態では、非ＩＴＡＭ ＣＤ３ゼータは、配列番号３３の配列を有する。いくつかの実施形態では、非ＩＴＡＭ ＣＤ３ゼータは、配列番号３３の配列を有する非ＩＴＡＭ ＣＤ３ゼータと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同であるように切断または修飾することができる。

【0092】

これは、いくつかの実施形態では、所与の実施形態において使用される細胞傷害性受容体複合体の種々の部分の相乗的相互作用から生じる。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢと組み合わせたＣＤ３ゼータは、相乗的刺激効果を提供し、その結果、特に効果的な（例えば、細胞傷害性）ＮＫ細胞がもたらされる。

【0093】

いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインはＯＸ４０ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０ドメインは細胞内シグナル伝達ドメインである。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号３５の配列を有する。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号３５の配列を有するＯＸ４０と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同であるように切断または修飾することができる。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０は、コンストラクトにおける唯一の膜貫通／シグナル伝達ドメインとして使用されるが、いくつかの実施形態では、ＯＸ４０は、１つまたは複数の他のドメインとともに使用することができる。例えば、一部の実施形態では、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、および／またはＣＤ３ゼータの組み合わせが使用される。

【0094】

いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、ＮＫｐ８０ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＮＫｐ８０ドメインは、細胞内シグナル伝達ドメインである。いくつかの実施形態では、ＮＫｐ８０細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号３６の配列を有する。いくつかの実施形態では、ＮＫｐ８０細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号３６の配列を有するＯＸ４０と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同であるように切断または修飾することができる。いくつかの実施形態では、ＮＫｐ８０は、コンストラクトにおける唯一の膜貫通／シグナル伝達ドメインとして使用されるが、いくつかの実施形態では、ＮＫｐ８０は、１つまたは複数の他のドメインとともに使用され得る。例えば、一部の実施形態では、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、および／またはＣＤ３ゼータの組み合わせが使用される。

【0095】

いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１６の断片を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６の断片は、ＣＤ１６の細胞内領域（ＣＤ１６ ＩＣ）である。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６ ＩＣドメインは、細胞内シグナル伝達ドメインである。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６ ＩＣ細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号３７の配列を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６ ＩＣ細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号３７の配列を有するＯＸ４０と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同であるように切断または修飾することができる。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６ ＩＣは、コンストラクトにおける唯一の膜貫通／シグナル伝達ドメインとして使用されるが、いくつかの実施形態では、ＣＤ１６ ＩＣは、１つまたは複数の他のドメインとともに使用され得る。例えば、一部の実施形態では、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、および／またはＣＤ３ゼータの組み合わせが使用される。

【0096】

細胞傷害性受容体複合体コンストラクト
上記に沿って、種々の細胞傷害性受容体複合体（細胞傷害性受容体とも呼ばれる）が本明細書に提供される。ＮＫ細胞におけるこれらの複合体の発現は、特定の標的細胞、例えば、癌性細胞、特に癌性肝細胞の標的化および破壊を可能にする。このような細胞傷害性受容体複合体の非限定的な例が、以下でより詳細に検討される。

【0097】

いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ／４－１ＢＢ／ＣＤ３ｚ細胞傷害性受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図１Ａ、ＮＫ４５－１を参照されたい）。このような受容体複合体は、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するＮＫＧ２Ｄ断片を含む細胞外ドメインを含む。コンストラクトは、ＩｇＧ４ヒンジおよびＣＤ８α膜貫通ドメイン、４－１ＢＢサブドメインおよびＣＤ３ゼータＩＴＡＭサブドメイン（シグナル伝達ドメインとして協調して作用する）、ならびにＩＬ－１５ドメイン（共刺激ドメインとして作用する）をさらに含む。いくつかの実施形態では、この細胞傷害性受容体複合体は、配列番号１の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。概略的に示されるように、コンストラクトはＩＬ－１５を含み、いくつかの実施形態では、このコンストラクトを発現するＮＫ細胞を標的腫瘍細胞に対して特に有効にする。ＩＬ－１５は、いくつかの実施形態に従って、別個のコンストラクト上にコードされ得ることが理解されなければならない。一部の実施形態では、細胞傷害性受容体複合体の配列は、配列番号１から変化し得るが、実施形態に応じて、配列番号１と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の相同性を維持する。さらに、上述されるように、異なる細胞外ドメイン、例えば、配列番号２３または２５のドメインはまた、非限定的な例として使用することができる。

【0098】

いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ／ＣＤ２８／ＣＤ３ｚ細胞傷害性受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図１Ｂ、ＮＫ４５－２を参照されたい）。このような受容体複合体は、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するＮＫＧ２Ｄ断片を含む細胞外ドメインを含む。コンストラクトは、ＣＤ８αヒンジおよびＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８シグナル伝達サブドメインおよびＣＤ３ゼータＩＴＡＭサブドメイン（シグナル伝達ドメインとして協調して作用する）、ならびにＩＬ－１５ドメイン（共刺激ドメインとして作用する）をさらに含む。いくつかの実施形態では、この細胞傷害性受容体複合体は、配列番号３の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。概略的に示されるように、コンストラクトはＩＬ－１５を含み、いくつかの実施形態では、このコンストラクトを発現するＮＫ細胞を標的腫瘍細胞に対して特に有効にする。ＩＬ－１５は、いくつかの実施形態に従って、別個のコンストラクト上にコードされ得ることが理解されなければならない。一部の実施形態では、細胞傷害性受容体複合体の配列は、配列番号３から変化し得るが、実施形態に応じて、配列番号３と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の相同性を維持する。さらに、上述されるように、異なる細胞外ドメイン、例えば、配列番号２３または２５のドメインはまた、非限定的な例として使用することができる。

【0099】

いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ（ＳＨ）／ＣＤ２８／ＣＤ３ｚ細胞傷害性受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図１Ｃ、ＮＫ４５－３を参照されたい）。このような受容体複合体は、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するＮＫＧ２Ｄ断片を含む細胞外ドメインを含む。コンストラクトは、ＩｇＧ４短鎖ヒンジおよびＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８シグナル伝達サブドメインおよびＣＤ３ゼータＩＴＡＭサブドメイン（シグナル伝達ドメインとして協調して作用する）、ならびにＩＬ－１５ドメイン（共刺激ドメインとして作用する）をさらに含む。いくつかの実施形態では、この細胞傷害性受容体複合体は、配列番号５の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号６のアミノ酸配列を含む。概略的に示されるように、コンストラクトはＩＬ－１５を含み、いくつかの実施形態では、このコンストラクトを発現するＮＫ細胞を標的腫瘍細胞に対して特に有効にする。ＩＬ－１５は、いくつかの実施形態に従って、別個のコンストラクト上にコードされ得ることが理解されなければならない。一部の実施形態では、細胞傷害性受容体複合体の配列は、配列番号５から変化し得るが、実施形態に応じて、配列番号５と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の相同性を維持する。さらに、上述されるように、異なる細胞外ドメイン、例えば、配列番号２３または２５のドメインはまた、非限定的な例として使用することができる。

【0100】

いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ／ＯＸ４０／ＣＤ３ｚ細胞傷害性受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図１Ｄ、ＮＫ４５－４を参照されたい）。このような受容体複合体は、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するＮＫＧ２Ｄ断片を含む細胞外ドメインを含む。コンストラクトは、ＣＤ８αヒンジおよびＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＯＸ４０シグナル伝達サブドメインおよびＣＤ３ゼータＩＴＡＭサブドメイン（シグナル伝達ドメインとして協調して作用する）、ならびにＩＬ－１５ドメイン（共刺激ドメインとして作用する）をさらに含む。いくつかの実施形態では、この細胞傷害性受容体複合体は、配列番号７の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号８のアミノ酸配列を含む。概略的に示されるように、コンストラクトはＩＬ－１５を含み、いくつかの実施形態では、このコンストラクトを発現するＮＫ細胞を標的腫瘍細胞に対して特に有効にする。ＩＬ－１５は、いくつかの実施形態に従って、別個のコンストラクト上にコードされ得ることが理解されなければならない。一部の実施形態では、細胞傷害性受容体複合体の配列は、配列番号７から変化し得るが、実施形態に応じて、配列番号７と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の相同性を維持する。さらに、上述されるように、異なる細胞外ドメイン、例えば、配列番号２３または２５のドメインはまた、非限定的な例として使用することができる。

【0101】

いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ（ＳＨ）／ＯＸ４０／ＣＤ３ｚ細胞傷害性受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図１Ｅ、ＮＫ４５－５を参照されたい）。このような受容体複合体は、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するＮＫＧ２Ｄ断片を含む細胞外ドメインを含む。コンストラクトは、ＩｇＧ４短鎖ヒンジおよびＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＯＸ４０シグナル伝達サブドメインおよびＣＤ３ゼータＩＴＡＭサブドメイン（シグナル伝達ドメインとして協調して作用する）、ならびにＩＬ－１５ドメイン（共刺激ドメインとして作用する）をさらに含む。いくつかの実施形態では、この細胞傷害性受容体複合体は、配列番号９の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。概略的に示されるように、コンストラクトはＩＬ－１５を含み、いくつかの実施形態では、このコンストラクトを発現するＮＫ細胞を標的腫瘍細胞に対して特に有効にする。ＩＬ－１５は、いくつかの実施形態に従って、別個のコンストラクト上にコードされ得ることが理解されなければならない。一部の実施形態では、細胞傷害性受容体複合体の配列は、配列番号９から変化し得るが、実施形態に応じて、配列番号９と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の相同性を維持する。さらに、上述されるように、異なる細胞外ドメイン、例えば、配列番号２３または２５のドメインはまた、非限定的な例として使用することができる。

【0102】

いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ／ＣＤ３ＴＭ／ＣＤ２８／ＣＤ３ｚ細胞傷害性受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図１Ｆ、ＮＫ４５－６を参照されたい）。このような受容体複合体は、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するＮＫＧ２Ｄ断片を含む細胞外ドメインを含む。コンストラクトは、ＣＤ８αヒンジおよびＣＤ３膜貫通ドメイン、ＣＤ２８シグナル伝達サブドメインおよびＣＤ３ゼータＩＴＡＭサブドメイン（シグナル伝達ドメインとして協調して作用する）、ならびにＩＬ－１５ドメイン（共刺激ドメインとして作用する）をさらに含む。いくつかの実施形態では、この細胞傷害性受容体複合体は、配列番号１１の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。概略的に示されるように、コンストラクトはＩＬ－１５を含み、いくつかの実施形態では、このコンストラクトを発現するＮＫ細胞を標的腫瘍細胞に対して特に有効にする。ＩＬ－１５は、いくつかの実施形態に従って、別個のコンストラクト上にコードされ得ることが理解されなければならない。一部の実施形態では、細胞傷害性受容体複合体の配列は、配列番号１１から変化し得るが、実施形態に応じて、配列番号１１と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の相同性を維持する。さらに、上述されるように、異なる細胞外ドメイン、例えば、配列番号２３または２５のドメインはまた、非限定的な例として使用することができる。

【0103】

いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ／ＣＤ２８／４－１ＢＢ／ＣＤ３ｚ細胞傷害性受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図１Ｇ、ＮＫ４５－７を参照されたい）。このような受容体複合体は、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するＮＫＧ２Ｄ断片を含む細胞外ドメインを含む。コンストラクトは、ＣＤ８αヒンジおよびＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８シグナル伝達サブドメイン、４－１ＢＢシグナル伝達サブドメインおよびＣＤ３ゼータＩＴＡＭサブドメイン（シグナル伝達ドメインとして協調して作用する）、ならびにＩＬ－１５ドメイン（共刺激ドメインとして作用する）をさらに含む。いくつかの実施形態では、この細胞傷害性受容体複合体は、配列番号１３の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。概略的に示されるように、コンストラクトはＩＬ－１５を含み、いくつかの実施形態では、このコンストラクトを発現するＮＫ細胞を標的腫瘍細胞に対して特に有効にする。ＩＬ－１５は、いくつかの実施形態に従って、別個のコンストラクト上にコードされ得ることが理解されなければならない。一部の実施形態では、細胞傷害性受容体複合体の配列は、配列番号１３から変化し得るが、実施形態に応じて、配列番号１３と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の相同性を維持する。さらに、上述されるように、異なる細胞外ドメイン、例えば、配列番号２３または２５のドメインはまた、非限定的な例として使用することができる。

【0104】

いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ／ＣＤ８ＴＭ／４－１ＢＢ／ＣＤ３ｚ細胞傷害性受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図２Ａ、ＮＫ２６－８を参照されたい）。このような受容体複合体は、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するＮＫＧ２Ｄ断片を含む細胞外ドメインを含む。コンストラクトは、ＣＤ８αヒンジおよびＣＤ８α膜貫通ドメイン、４－１ＢＢシグナル伝達サブドメインおよびＣＤ３ゼータＩＴＡＭサブドメイン（シグナル伝達ドメインとして協調して作用する）、ならびにＩＬ－１５ドメイン（共刺激ドメインとして作用する）をさらに含む。いくつかの実施形態では、この細胞傷害性受容体複合体は、配列番号１５の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。概略的に示されるように、コンストラクトはＩＬ－１５を含み、いくつかの実施形態では、このコンストラクトを発現するＮＫ細胞を標的腫瘍細胞に対して特に有効にする。ＩＬ－１５は、いくつかの実施形態に従って、別個のコンストラクト上にコードされ得ることが理解されなければならない。一部の実施形態では、細胞傷害性受容体複合体の配列は、配列番号１５から変化し得るが、実施形態に応じて、配列番号１５と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の相同性を維持する。さらに、上述されるように、異なる細胞外ドメイン、例えば、配列番号２３または２５のドメインはまた、非限定的な例として使用することができる。

【0105】

いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ／ＣＤ３ＴＭ／４－１ＢＢ／ＣＤ３ｚ（ｎｅｇ）細胞傷害性受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図２Ｂ、ＮＫ３９－５を参照されたい）。このような受容体複合体は、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するＮＫＧ２Ｄ断片を含む細胞外ドメインを含む。コンストラクトは、ＣＤ８αヒンジおよびＣＤ３膜貫通ドメイン、４－１ＢＢシグナル伝達サブドメインおよび非ＩＴＡＭ ＣＤ３ゼータサブドメイン（シグナル伝達ドメインとして協調して作用する）、ならびにＩＬ－１５ドメイン（共刺激ドメインとして作用する）をさらに含む。いくつかの実施形態では、この細胞傷害性受容体複合体は、配列番号１７の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。概略的に示されるように、コンストラクトはＩＬ－１５を含み、いくつかの実施形態では、このコンストラクトを発現するＮＫ細胞を標的腫瘍細胞に対して特に有効にする。ＩＬ－１５は、いくつかの実施形態に従って、別個のコンストラクト上にコードされ得ることが理解されなければならない。一部の実施形態では、細胞傷害性受容体複合体の配列は、配列番号１８から変化し得るが、実施形態に応じて、配列番号１８と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の相同性を維持する。さらに、上述されるように、異なる細胞外ドメイン、例えば、配列番号２３または２５のドメインはまた、非限定的な例として使用することができる。

【0106】

いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ／ＣＤ３ＴＭ／４－１ＢＢ／ＮＫｐ８０細胞傷害性受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図２Ｃ、ＮＫ３９－６を参照されたい）。このような受容体複合体は、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するＮＫＧ２Ｄ断片を含む細胞外ドメインを含む。コンストラクトは、ＣＤ８αヒンジおよびＣＤ３膜貫通ドメイン、４－１ＢＢシグナル伝達サブドメインおよびＮＫｐ８０シグナル伝達サブドメイン（シグナル伝達ドメインとして協調して作用する）、ならびにＩＬ－１５ドメイン（共刺激ドメインとして作用する）をさらに含む。いくつかの実施形態では、この細胞傷害性受容体複合体は、配列番号１９の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。概略的に示されるように、コンストラクトはＩＬ－１５を含み、いくつかの実施形態では、このコンストラクトを発現するＮＫ細胞を標的腫瘍細胞に対して特に有効にする。ＩＬ－１５は、いくつかの実施形態に従って、別個のコンストラクト上にコードされ得ることが理解されなければならない。一部の実施形態では、細胞傷害性受容体複合体の配列は、配列番号１９から変化し得るが、実施形態に応じて、配列番号１９と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の相同性を維持する。さらに、上述されるように、異なる細胞外ドメイン、例えば、配列番号２３または２５のドメインはまた、非限定的な例として使用することができる。

【0107】

いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ／ＣＤ３ＴＭ／ＣＤ１６ＩＣ／４－１ＢＢ細胞傷害性受容体複合体をコードするポリヌクレオチドが提供される（図２Ｄ、ＮＫ３９－１０を参照されたい）。このような受容体複合体は、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するＮＫＧ２Ｄ断片を含む細胞外ドメインを含む。コンストラクトは、さらに、ＣＤ８αヒンジおよびＣＤ３膜貫通ドメイン、ＣＤ１６細胞内シグナル伝達サブドメインおよび４－１ＢＢシグナル伝達サブドメインおよびＮＫｐ８０シグナル伝達サブドメイン（シグナル伝達ドメインとして協調して作用する）、ならびにＩＬ－１５ドメイン（共刺激ドメインとして作用する）をさらに含む。いくつかの実施形態では、この細胞傷害性受容体複合体は、配列番号２１の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。概略的に示されるように、コンストラクトはＩＬ－１５を含み、いくつかの実施形態では、このコンストラクトを発現するＮＫ細胞を標的腫瘍細胞に対して特に有効にする。ＩＬ－１５は、いくつかの実施形態に従って、別個のコンストラクトにコードされ得ることが理解されなければならない。一部の実施形態では、細胞傷害性受容体複合体の配列は、配列番号２１から変化し得るが、実施形態に応じて、配列番号２１と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の相同性を維持する。さらに、上記で示されるように、異なる細胞外ドメイン、例えば、配列番号２３または２５のドメインはまた、非限定的な例として使用することができる。

【0108】

実施形態に応じて、本明細書に開示されるポリヌクレオチドのいずれかはまた、標的細胞に対して細胞傷害性効果を付与する能力を維持しながら、細胞傷害性受容体複合体の１つまたは複数の構成サブユニットの切断および／または変異体をコードしてもよい。さらに、本明細書に開示されるポリヌクレオチドのいずれかはまた、細胞傷害性受容体複合体の種々の構成ドメインの全部または一部のためのコドン最適化ヌクレオチド配列を含んでもよい。本明細書で使用される場合、「断片」および「切断された」という用語は、それらの通常の意味が与えられ、タンパク質のＮ末端およびＣ末端の欠失変異体も含むものとする。

【0109】

本明細書中に記載される細胞傷害性受容体複合体をコードするポリヌクレオチドをベクターに挿入して、ＮＫ細胞における発現を達成することができる。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、細胞傷害性受容体複合体の発現のための少なくとも１つの調節エレメント（例えば、プロモーター）に操作可能に連結される。具体的な実施形態では、転写調節エレメント、例えば、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）またはエンハンサーエレメントを用いて、細胞傷害性受容体複合体の転写を指向する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書で検討されるように、１つまたは複数の細胞質プロテアーゼ切断部位を含む。実施形態に応じて、細胞傷害性受容体複合体の種々の構成部分は、単一または複数のベクターでＮＫ細胞にデリバリーすることができる。使用されるベクターの数にかかわらず、任意のポリヌクレオチドは、タグ配列を含んでもよく、コンストラクトを発現するＮＫ細胞の存在の同定を可能にする。例えば、いくつかの実施形態では、ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ、配列番号４２）が使用される。ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓ－ｔａｇ）（ＨＨＨＨＨＨ、配列番号４３）、ＨＡ－タグまたはｍｙｃ－タグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ；配列番号４４）などの他のタグ配列も利用可能である。あるいは、緑色蛍光タンパク質、または他の蛍光部分が使用される。また、タグタイプの組み合わせを使用して、細胞傷害性受容体複合体のサブコンポーネントを個別に認識することができる。

【0110】

いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体をコードするポリヌクレオチドは、例えば、エレクトロポレーションによってＮＫ細胞に導入され得るｍＲＮＡである。別の実施形態では、ベクターは、ウイルス、好ましくはレトロウイルスであり、形質導入によってＮＫ細胞に導入することができる。いくつかの実施形態では、ベクターは、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）である。さらなる実施形態では、他のベクター、例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスなどを使用することができる。いくつかの実施形態では、非ＨＩＶ由来レトロウイルスが使用される。あるいは、プラスミド、ファージミド、コスミド、ウイルスベクター、ファージ、人工染色体を使用することができる。

【0111】

一実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、ＮＫ細胞において一時的に発現される。別の実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、ＮＫ細胞において安定に発現される。さらなる実施形態では、ＮＫ細胞は自家細胞である。さらに別の実施形態では、ＮＫ細胞はドナー由来（同種）細胞である。

【0112】

投与および用量
さらに、本明細書では、癌、特に肝細胞癌腫を有する対象を治療するための方法が提供され、本明細書に開示されるように細胞傷害性受容体複合体を発現するように操作されたＮＫ細胞を含む組成物を対象に投与することを含む。特定の実施形態では、本明細書に記載される遺伝的に操作された細胞（複数可）による対象の治療は、以下の、例えば、（ｉ）疾患もしくはそれに関連する症状の重症度の低減または軽減；（ｉｉ）疾患に関連する症状の持続期間の短縮；（ｉｉｉ）疾患またはそれに関連する症状の進行に対する防御；（ｉｖ）疾患またはそれに関連する症状の退行；（ｖ）疾患に関連する症状の発症または発生に対する防御；（ｖｉ）疾患に関連する症状の再発に対する防御；（ｖｉｉ）対象の入院の減少；（ｖｉｉｉ）入院期間の短縮；（ｉｘ）疾患を有する対象の生存の増加；（ｘ）疾患に関連する症状数の減少；（ｘｉ）別の療法の予防または治療効果（複数可）の増強、改善、補足、補完、または拡大を含む効果のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれを超えて達成する。

【0113】

投与は、種々の経路によって、例えば、限定されないが、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、肝臓内、腹腔内、および／または患部組織への局所デリバリーによることができる。いくつかの実施形態では、投与は、例えば、肝臓内動脈への注射を介して肝臓に局所的に達成される。さらなる実施形態では、投与は、他の臓器に対する治療を達成するために局所的である。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、卵巣癌を治療するために投与される。一部の実施形態では、このような治療は、腹腔内投与を介して行われる。ＮＫ細胞の用量は、所与の対象について、その体重、病型および状態、ならびに処置の所望の攻撃性に基づいて容易に決定することができるが、実施形態に応じて、約１０^５細胞／ｋｇ～約１０^１２細胞／ｋｇ（例えば、１０^５～１０^７、１０^７～１０^１０、１０^１０～１０^１２、およびその中の重複範囲）の範囲であり得る。一実施形態では、用量漸増レジメンが使用される。いくつかの実施形態では、ある範囲のＮＫ細胞は、例えば、約１×１０^６細胞／ｋｇ～約１×１０^８細胞／ｋｇの間で投与される。用量はまた、少なくとも部分的に、所望のエフェクター：標的比によって決定することができる。いくつかの実施形態では、用量は、約１００：１、約５０：１、約２５：１、約１０：１、約５：１、約３：１、約２：１、約１：１、約１：２、約１：５、約１：１０、約１：２５、約１：５０、約１：１００、またはそれらの間の他の比（終点を含む）のエフェクター：標的比を得ることができる。実施形態に応じて、種々の癌のタイプを治療することができる。いくつかの実施形態では、肝細胞癌腫が治療される。本明細書で提供されるさらなる実施形態は、以下の非限定的な例の癌の治療または予防を含み、限定されないが、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌腫、カポジ肉腫、リンパ腫、消化器癌、虫垂癌、中枢神経系癌、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳腫瘍（例えば、限定されないが、星状細胞腫、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫、神経膠芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、上衣腫、髄芽腫、髄様上皮腫）、乳癌、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、子宮頸癌、結腸癌、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性障害、管癌腫、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、有毛細胞白血病、腎細胞癌、白血病、口腔癌、鼻咽頭癌、肝臓癌、肝臓優勢の転移性結腸直腸癌、胆管癌、肺癌（例えば、限定されないが、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）および小細胞肺癌）、膵臓癌、腸癌、リンパ腫、黒色腫、眼癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、下垂体癌、子宮癌、および膣癌が挙げられる。

【0114】

一部の実施形態では、本明細書ではまた、配列番号１～４４のそれぞれの核酸またはアミノ酸配列と比較して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％（およびその中の範囲）の相同性を有するか、またはそれぞれの配列番号１～４４と比較して、限定されないが、（ｉ）増殖の増大、（ｉｉ）活性化の増大、（ｉｉｉ）核酸配列およびアミノ酸配列によってコードされる受容体を有するＮＫ細胞が結合するリガンドを提示する細胞に対する細胞傷害活性の増大、（ｉｖ）腫瘍または感染部位へのホーミングの増大、（ｖ）標的外の細胞傷害性効果の低減、（ｖｉ）免疫刺激性サイトカインおよびケモカイン（例えば、限定されないが、ＩＦＮｇ、ＴＮＦａ、ＩＬ－２２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、およびＣＣＬ５）の分泌の増大、（ｖｉｉ）さらなる先天性および適応性免疫応答を刺激する能力の増大、ならびに（ｖｉｉｉ）それらの組み合わせを含む機能のうちの１つまたは複数も示す核酸配列およびアミノ酸配列が提供される。

【0115】

さらに、いくつかの実施形態では、核酸コードの縮重を説明する一方で、本明細書に開示される核酸のいずれかに対応するアミノ酸配列が提供される。さらに、本明細書に明示的に開示されるものとは異なるが、機能的類似性または同等性を有する配列（核酸またはアミノ酸のいずれか）はまた、本開示の範囲内であることが企図される。上記には、突然変異体、切断、置換、または他の修飾のタイプが含まれる。

【0116】

いくつかの実施形態では、開示される細胞傷害性受容体複合体をコードするポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、細胞傷害性受容体複合体の発現のための少なくとも１つの調節エレメントに操作可能に連結される。

【0117】

さらに、いくつかの実施形態によれば、本明細書で提供されるポリヌクレオチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを含むベクターが提供され、ポリヌクレオチドが、細胞傷害性受容体複合体の発現のための少なくとも１つの調節エレメントに操作可能に連結されてもよい。いくつかの実施形態では、ベクターはレトロウイルスである。

【0118】

さらに、本明細書では、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、ベクター、または細胞傷害性受容体複合体を含む操作されたナチュラルキラー細胞が提供される。いくつかの実施形態では、これらのＮＫ細胞は、肝細胞癌腫などの疾患の予防の治療のために、肝臓などの腫瘍部位への局所デリバリーに適している。

【0119】

さらに、肝腫瘍を治療するための方法が提供され、本方法は、細胞傷害性受容体複合体を発現するように操作されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の集団を含む組成物を肝腫瘍を有する患者に投与することを含み、細胞傷害性受容体複合体は、ナチュラルキラーグループ２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）受容体のリガンドと結合する細胞外ドメインを含み、ＮＫＧ２Ｄのリガンドは、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、およびそれらの組み合わせから選択され、細胞外ドメインは、配列番号２３のポリヌクレオチドの少なくとも一部によってコードされ、細胞傷害性シグナル伝達複合体は、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを含み、投与は、患者の肝臓内動脈への注射を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、約１０^７～約１０^１０個のＮＫ細胞を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、患者にＩＬ－２を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞傷害性シグナル伝達複合体のシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータドメインを含み、細胞外ドメインは、配列番号２４のポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ゼータドメインは、少なくとも１つの免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）モチーフを含む。いくつかの実施形態では、細胞傷害性シグナル伝達複合体のシグナル伝達ドメインは、ＯＸ４０ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞傷害性シグナル伝達複合体のシグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞傷害性シグナル伝達複合体のシグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞傷害性シグナル伝達複合体のシグナル伝達ドメインは、ＮＫｐ８０ドメインをさらに含む。

【0120】

さらに、肝細胞癌腫を治療するための方法が提供され、本方法は、細胞傷害性受容体複合体を発現するように操作されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の集団を含む組成物を肝細胞癌腫を有する患者に投与することを含み、細胞傷害性受容体複合体は、膜貫通ドメインに連結された細胞外ドメインを含み、膜貫通ドメインはシグナル伝達ドメインにさらに連結され、細胞外ドメインは、ナチュラルキラーグループ２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）受容体の断片を含み、ＮＫＧ２Ｄ受容体の断片は、配列番号２４のポリヌクレオチドによってコードされるＮＫＧ２Ｄ受容体断片と少なくとも９５％の配列同一性を有し、投与は、患者の肝臓内動脈への注射を含む。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号１の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号３の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号４のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号５の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号６のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号７の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号８のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号９の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号１０のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号１１の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号１２のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号１３の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号１４のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号１５の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号１６のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号１７の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号１８のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号１９の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号２０のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号２１の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、細胞傷害性受容体複合体は、配列番号２２のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、患者の肝臓内動脈への注射は経皮的注射である。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、患者に対して自家である。いくつかの実施形態では、本方法は、ＩＬ－２を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、追加の抗癌剤を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、追加の抗癌剤は、チロシンキナーゼ阻害剤である。いくつかの実施形態では、チロシンキナーゼ阻害剤は、ソラフェニブ、ニロチニブ、イマンチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、スニチニブ、アダボセルチブ、ラパチニブ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0121】

さらに、原発性肝腫瘍を治療するための方法が提供され、本方法は、細胞傷害性受容体複合体を発現するように操作されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の集団を含む組成物を肝細胞癌腫を有する患者に投与することであって、細胞傷害性受容体複合体が、膜貫通ドメインに連結された細胞外ドメインを含み、膜貫通ドメインがシグナル伝達ドメインの断片にさらに連結し、細胞外ドメインが、ナチュラルキラーグループ２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）受容体の断片を含み、細胞傷害性受容体複合体が、配列番号８と配列中で少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、投与すること；ＮＫ細胞の集団が投与される前、それと同時、またはその後に少なくとも１つの追加の抗癌剤を投与することであって、追加の抗癌剤が、ソラフェニブ、ニロチニブ、イマンチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、スニチニブ、アダボセルチブ、ラパチニブ、およびそれらの組み合わせである、投与することを含む。

【0122】

さらに、原発性肝腫瘍を治療するための併用療法のシステムであって、細胞傷害性受容体複合体を発現するように操作されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の集団であって、細胞傷害性受容体複合体が、膜貫通ドメインに連結された細胞外ドメインを含み、膜貫通ドメインがシグナル伝達ドメインにさらに連結し、細胞外ドメインが、ナチュラルキラーグループ２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）受容体の断片を含み、細胞傷害性受容体複合体が、配列番号８と配列中で少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、ＮＫ細胞の集団と；少なくとも１つの追加の抗癌剤であって、追加の抗癌剤が、ソラフェニブ、ニロチニブ、イマンチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、スニチニブ、アダボセルチブ、ラパチニブ、およびそれらの組み合わせであり、追加の抗癌剤が、ＮＫ細胞の集団が投与される前、それと同時、またはその後に、原発性肝腫瘍を有する対象に投与するように構成される、追加の抗癌剤とを含む組成物を含む、システムが提供される。

【0123】

さらに、本明細書に記載される実施形態のいずれか１つに従う組成物または治療方法が提供される。

【0124】

さらに、本明細書に記載される実施形態のいずれか１つに従う、肝臓または他の臓器の腫瘍の治療における組成物またはその使用が提供される。

【0125】

さらに、本明細書に記載される実施形態のいずれか１つに従う組成物または治療方法が提供され、操作されたＮＫ細胞が、天然のＮＫ細胞と比較して、細胞傷害性において少なくとも３倍の増加を示す。

【0126】

さらに、本明細書に記載される実施形態のいずれか１つに従い、肝臓または他の臓器の腫瘍の治療における組成物またはその使用が提供され、操作されたＮＫ細胞は、天然のＮＫ細胞と比較して、細胞傷害性の少なくとも３倍の増加を示す。

【0127】

さらに、腫瘍を治療するための方法が提供され、本方法は、血液供給血管を介してその血液供給の少なくとも一部を受ける腫瘍を有する患者の血液供給血管にアクセスすること、ならびに細胞傷害性受容体複合体を発現するように操作されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の集団を投与することであって、細胞傷害性受容体複合体は、Ｃ型レクチン様受容体の機能的断片と、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを含む細胞傷害性シグナル伝達複合体とを含み、Ｃ型レクチン様受容体がナチュラルキラーグループ２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）受容体を含み、Ｃ型レクチン様受容体の機能的断片が配列番号２４を含み、操作されたＮＫ細胞が操作されていないＮＫ細胞と比較して、腫瘍細胞に対する有効性において少なくとも３倍の増加を示す、投与すること；ならびにＮＫ細胞の集団が投与される前、それと同時、またはその後に、少なくとも１つの追加の抗癌剤を投与することを含む。いくつかの実施形態では、追加の抗癌剤はチロシンキナーゼ阻害剤である。いくつかの実施形態では、追加の抗癌剤は、ソラフェニブ、ニロチニブ、イマンチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、スニチニブ、アダボセルチブ、ラパチニブ、およびそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、細胞傷害性シグナル伝達複合体のシグナル伝達ドメインは、ＯＸ４０ドメインを含む。

【実施例】

【0128】

以下に記載される方法および材料は、本明細書に開示される実施形態に従って使用することができる方法および材料の非限定的な例である。

【0129】

肝細胞癌腫
背景：
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、細胞性免疫療法のためのＴ細胞に対して、代替またはいくつかの実施形態では補充を提供し、これは、それらがＨＬＡ制限されておらず、したがって、同種の既製用途に適しているためである。拡大されたＮＫ細胞は、キメラ受容体を発現するように操作され、造血器腫瘍と固形腫瘍の両方に対するそれらの細胞傷害性をさらに改善することができる。健康なヒトでは、肝臓内リンパ球の高い割合がＮＫ細胞であり、肝細胞癌腫（ＨＣＣ）の場合、ＣＤ５６＋ ＮＫ細胞の浸潤は細胞アポトーシスおよび患者生存と正に相関する。ナチュラルキラーグループ２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）受容体の複数のリガンドは、ＨＣＣ組織で高度に発現するが、健常組織では低レベルであり、ＮＫＧ２ＤはＨＣＣを標的とするＮＫ細胞操作の魅力的な候補である。ＮＫＸ１０１と総称される、本明細書に開示されるいくつかの態様による操作されたＮＫ細胞は、ＮＫＧ２Ｄキメラ受容体を発現するように操作され、ＨＣＣ細胞に対するそれらの細胞傷害性を改善し、炎症誘発性サイトカイン応答を増強し、および腫瘍量を制御することができる。結腸直腸癌に従った原発性肝転移に関連した追加実験が行われた。

【0130】

材料および方法：
末梢血単核細胞由来のＮＫ細胞を、照射されたＫ５６２－ｍｂＩＬ１５－４１ＢＢＬ刺激細胞との共培養を用いて拡大させた。このような細胞の非限定的な例は、米国特許第７，４３５，５９６号または同第８，０２６，０９７号に提供され、各々は、参照により本明細書にそれらの全体が組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＳＧ２０１８／０５０１３８号（参照により本明細書にその全体が組み込まれる）に開示されるものなどのさらなる修飾が使用される。ＮＫＸ１０１細胞は、ＮＫＧ２Ｄ、細胞内ＯＸ４０共刺激ドメイン、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、および膜結合ＩＬ－１５をコードする２シストロン性ウイルスを用いた形質導入によって生成され、これは、細胞生存および増殖の延長を支持する。本明細書で検討されるように、ＮＫＸ１０１は、この非限定的な例において利用される特異的コンストラクトだけならず、本明細書に開示される他の細胞傷害性受容体コンストラクトも指す。１：１の比率でＨＣＣ細胞株と２４時間共培養することに応答した、ＮＫＸ１０１ ＮＫ細胞の炎症誘発性サイトカイン放出をＬｕｍｉｎｅｘによって分析した。４、２４および４８時間のエンドポイントにおけるＮＫＸ１０１ ＮＫ細胞のインビトロ細胞傷害性は、ルシフェラーゼを発現するように操作されたＨＣＣ細胞株のパネルを用いて測定された。ＮＫＸ１０１ ＮＫ細胞のインビボ活性は、４×１０^６個のルシフェラーゼを発現するＳＮＵ４４９ ＨＣＣ細胞の腹腔内（ＩＰ）注射の１週間後に、３×１０^６個のＮＫＸ１０１ ＮＫ細胞または非修飾ＮＫ細胞（ＮＴ ＮＫ）をＩＰ投与されたＮＳＧマウス異種移植腫瘍モデルを用いて評価され、腫瘍増殖は、ＩＶＩＳ生物発光イメージングを用いて測定された。ＨＣＣのために承認された薬剤であるキナーゼ阻害剤ソラフェニブ（ここでは追加の抗癌剤の非限定的な例として使用される）のサブＥＣ５０濃度との組み合わせが、４８時間のインビトロでのＮＫＸ１０１ ＮＫ細胞の低いＥ：Ｔ比で相加的な細胞傷害性効果について試験された。ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現をフローサイトメトリーにより評価し、ＨＣＣ細胞株のパネルにわたってＮＫＸ１０１ ＮＫ細胞細胞傷害性と直線的な相関について分析した。

【0131】

結果：
簡単に述べると、結果は、ＮＫＸ１０１ ＮＫ細胞が、インビトロでＨＣＣ細胞株のパネルに対してＮＴ ＮＫ細胞（ＮＴ ＮＫ）と比較して劇的に改善された細胞傷害性を有することを示す。ＮＫＸ１０１ ＮＫ細胞のＨＣＣ細胞株との共培養は、炎症誘発性サイトカイン放出を増強することが示された。インビボでのＮＳＧマウス異種移植ＨＣＣモデルにおいて、ＮＫＸ１０１ ＮＫ細胞は、ＮＴ ＮＫによる安定した制御とは対照的に、４／５マウスにおいて完全な腫瘍クリアランスを提供した。キナーゼ阻害剤ソラフェニブとの組み合わせが、インビトロでＮＫＸ１０１ ＮＫ細胞に相加効果を与えた。ＮＫＧ２Ｄリガンドの高発現はフローサイトメトリーによって観察され、個々のリガンドはＮＫＸ１０１ ＮＫ細胞の細胞傷害性と有意な相関を示さなかったが、いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄリガンド発現を同定し、その発現をＮＫＸ１０１ ＮＫ細胞からの細胞傷害性効果に対する感受性と相関させることができる薬剤が開発される。

【0132】

より詳細には、本明細書に開示される種々の操作されたＮＫ細胞の能力を評価するために、いくつかの実験が、インビボ動物モデルにおいて、肝細胞癌腫細胞株に対するインビトロ設定での細胞の有効性を評価するために行われた。さらなる実験は、ＴＫＩ阻害剤ソラフェニブをこのような薬剤の非限定的な例として、別の抗癌剤と組み合わせて使用した場合に、本明細書に開示される操作されたＮＫ細胞の有効性を評価することに関する。図３Ａ～３Ｂは、本明細書に開示される実施形態による天然のＮＫ細胞または操作されたＮＫ細胞にＨＣＣ細胞を曝露した後の細胞傷害性の種々のインジケーターの発現に関するデータを示す。以下に検討される非限定的な実施例において、ＮＫＸ１０１の名称は、ＮＫＧ２Ｄ受容体のリガンドと結合することができる切断型ＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインを発現する操作されたＮＫ細胞を指す。いくつかの実施形態では、切断型ＮＫＧ２Ｄドメインは、ＣＤ８アルファヒンジおよびＣＤ８アルファＴＭドメインに連結される。いくつかの実施形態では、切断型ＮＫＧ２Ｄドメインは、ＯＸ４０共刺激ドメインおよびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインに連結される。いくつかの実施形態では、コンストラクトは、膜結合型ＩＬ１５をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＮＫＸ１０１は、配列番号７のヌクレオチド配列、または配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する。しかしながら、いくつかの実施形態では、本明細書に開示される他のＮＫＧ２Ｄコンストラクト（すべてのＮＫＧ２Ｄコンストラクトは、ＮＫＸ１０１ ＮＫ細胞と総称される）は、同様のやり方で動作し、以下に検討するものと同様の結果をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるように、配列番号７または８と約８５％、９０％、９５％またはそれを超える配列相同性を有するヌクレオチドまたはアミノ酸配列（または本明細書に開示される任意の他のコンストラクト）は、ＨＣＣ細胞に対して細胞傷害性である。

【0133】

図３に戻ると、パネル３Ａ～３Ｃは、１：１のエフェクター：標的比で、非形質導入ＮＫ細胞（ＮＴ ＮＫ）またはＮＫＸ１０１のいずれかとともに、示されたＨＣＣ細胞株の共培養の上清からの種々のサイトカインの濃度を示す。示されるように、ＨＣＣ細胞とＮＫＸ１０１の共培養は、ＮＫＸ１０１ ＮＫ細胞からの細胞傷害性シグナル伝達を示す種々のサイトカインのより大きな発現を誘導する。例えば、Ｈｅｐ３ｂ細胞とＮＫＸ１０１ ＮＫ細胞の共培養では、ＮＴ ＮＫ細胞と比較して、上清中のＩＦＮｇ濃度がはるかに高い。これは、ＮＫＸ１０１ ＮＫ細胞が免疫刺激性サイトカインおよびケモカインの分泌を増強したことを示す。いくつかの実施形態では、ここで測定されるもの以外のサイトカインおよびケモカインは、より高いレベルで分泌される（例えば、ＩＬ－２２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、および／またはＣＣＬ５）。

【0134】

図４Ａ～４Ｊは、示されたエフェクター：標的比で、９つの異なるＨＣＣ細胞株に対して、本明細書に開示される操作されたＮＫ細胞（ＮＫＸ１０１ ＮＫ細胞）によって誘導される細胞傷害性の程度に関するデータを示す。図４Ａ～４Ｉは、各ＨＣＣ株のデータを細胞傷害性％として示す。例として、図４Ａは、２：１のエフェクター：標的比で、ＮＫＸ１０１ ＮＫ細胞が、共培養においてほぼ１００％のＨｅｐ３ｂ細胞において細胞傷害性を誘導することを示す。Ｅ：Ｔ比が１：１に低下すると、効果は約９０％の細胞傷害性にまで低下し、１：２のＥ：Ｔでは、ＮＫＸ１０１は依然として標的細胞の約７５％を死滅させることができる。Ｅ：Ｔ比の各々において、ＮＫＸ１０１ ＮＫ細胞はＮＴ ＮＫ細胞よりもはるかに多く死滅させ、共培養中のＨｅｐ３ｂ細胞の約２０％において細胞傷害性を誘導する。他のＨＣＣ細胞株の各々は、ほぼすべてのＥ：Ｔ比でＮＴ ＮＫ細胞と比較してＮＫＸ１０１細胞に対してより高い感受性を示した。１：２のＥ：Ｔで、ＨｕＨ－７細胞は、ＮＫＸ１０１ ＮＫ細胞およびＮＴ ＮＫ細胞とほぼ同等に反応する。しかしながら、いくつかの実施形態では、アジュバント剤を使用して、ＮＫＸ１０１の効果を増強することができる（以下に記載される）。図４Ｊは、ＮＫＸ１０１に対するＨＣＣ細胞の抵抗性（感受性の欠如）の要約を示す。これらのデータは、試験した低Ｅ：Ｔでは、ＨＣＣ細胞の大部分が、ある程度のＮＫＸ１０１誘導細胞傷害性を依然として受けていたことを示した。

【0135】

図４Ｋ～４Ｓは、９つの異なる肝細胞癌腫細胞株に対する２人の追加ドナー由来の操作されたＮＫ細胞の細胞傷害性の程度に関連する追加データを示す。本明細書に開示されるように、ＮＫＧ２Ｄキメラ受容体（標識ＮＫＸ１０１＋ドナー数）を発現する操作されたＮＫ細胞、および対応するドナー由来の非形質導入ＮＫ細胞の両方についてのデータが示される。図４Ｋに示されるように、ＮＫＸ１０１を発現するように操作されたＮＫ細胞は、エフェクター：標的比が１：２であっても、Ｈｅｐ３ｂ細胞に対して実質的な細胞傷害性効果を示した。この比率では、両セットの細胞は約７０～７５％の細胞傷害性を達成した。エフェクター細胞対標的細胞の比率が増加すると、対応する細胞傷害性の増加が観察され、約８０％～９０％が１：１の比率で、ほぼ１００％が２：１の比率で細胞傷害性を示した。各エフェクター：標的比における細胞傷害性パーセントは、他の８つの肝細胞癌細胞株にわたって変動したが、データに対する全体的なパターンは、エフェクター：標的比が増加するにつれて、操作されたＮＫ細胞が進行性により高い細胞傷害性を示すことを示す。さらに、これらのデータは、いくつかの実施形態によれば、標的細胞株に対する１００％細胞傷害性が、本明細書に開示されるように、操作されたＮＫ細胞を用いて達成され得ることを示す。図４Ｔ～４ＢＢにおいて異なる方法で示されるように、操作されたＮＫ細胞（および同じドナー由来の形質導入されたＮＫ細胞上の対応するもの）の細胞傷害性効果は、検出された対照ルシフェラーゼシグナルのパーセントとして表され、ルシフェラーゼ検出の減少は、示された細胞株に対する細胞傷害性効果の増加に対応する。これらの図におけるデータは、図４Ｋ～４Ｓに示される２人のドナーの平均値である。これらの要約データは、さらに、本明細書に開示される実施形態による操作されたＮＫ細胞は、種々の癌細胞株に対する細胞傷害性効果の実質的な増加をもたらすことができるという結論を支持する。したがって、いくつかの実施形態によれば、本明細書に開示される操作されたＮＫ細胞は、有効な抗癌療法を提供する。一部の実施形態では、本明細書でより詳細に開示されるように、追加の抗癌剤と組み合わせて操作されたＮＫ細胞を使用することは、標的細胞に相乗的な細胞傷害性インパクトをもたらし、予期せぬことに、腫瘍、特に固形腫瘍、例えば、肝細胞癌腫（または別の肝臓癌）による肝臓の固形腫瘍を、または肝臓の原発転移を有する遠隔腫瘍タイプ（例えば、結腸直腸癌など）でさえも治療する能力をさらに高める。

【0136】

図５は、インビボでの腫瘍モデリング実験のための概略的なタイムラインを示す。マウスは、４×１０^６個のＨＣＣ細胞（特にホタルルシフェラーゼを発現するＳＮＵ４４９細胞）の注射を受けた。８日後、３×１０^６個のＮＫ細胞（ＮＴ ＮＫ細胞またはＮＫＸ１０１ ＮＫ細胞のいずれか）をＩＰ注射によりデリバリーした。その後、７日ごとに生物発光イメージングを行い、腫瘍量を評価した。図６Ａ～６Ｆは、インビボでの腫瘍量実験の結果を示す。図６Ａは、ＰＢＳ対照を受けたマウスの生物発光イメージングを示す。図示されるように、有意な腫瘍量が７日後に存在し、すべての動物においてほぼ一貫した腫瘍増殖が認められた。図６Ｄは、経時的な生物発光イメージングシグナルの強度を示す。図６Ｂは、非修飾ＮＫを投与された動物についての同じデータを示す。ＰＢＳとは対照的に、非修飾ＮＫは、経時的に比較的安定した腫瘍量を保持しているようであり、ＰＢＳ処置された動物に見られる増加は回避されたが、有意な減少は認められなかった（６Ｅもまた参照されたい）。図６Ｆは、ＮＫＸ１０１ ＮＫ細胞で処置された動物についての同じデータを示す。天然のＮＫ細胞とは全く対照的に、腫瘍量は、ＮＫＸ１０１デリバリー後の早くも１４日目に急激に減少した。６Ｃに示される５匹のマウスのうち４匹では、腫瘍量がゼロに近づいた。これらのデータは、同様に図６Ｆに反映される。これらの結果は、ＮＫＸ１０１ ＮＫ細胞によって誘導される有意な抗腫瘍効果を示す。

【0137】

本明細書で検討されるように、いくつかの実施形態によれば、１つまたは複数の追加の抗癌剤は、本明細書に開示される操作されたＮＫ細胞と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、効果を現す作用の複数のメカニズムは、相乗効果（例えば、腫瘍量、腫瘍増殖速度、腫瘍細胞持続性などの減少）をもたらす。換言すれば、いくつかの実施形態では、追加の抗癌剤とともに操作されたＮＫ細胞を使用すると、予想外に増強された抗癌効果が生じる。非限定的な例として、操作されたＮＫ細胞と組み合わせて使用することができる１つのこのような追加の抗癌剤は、チロシンキナーゼ阻害剤である。ソラフェニブは、Ｒａｆ－１、Ｂ－ＲａｆおよびＶＥＧＦＲ－２シグナル伝達経路を阻害する低分子であり、現在、肝細胞癌腫の最先端療法として広く使用されている。図７Ａは、示された肝細胞癌腫細胞株に対するソラフェニブのＥＣ５０を算出するための用量－応答曲線に関連するデータを示す。ＥＣ５０値を図７Ｂに示す。種々の肝細胞癌腫細胞株２ソラフェニブの感受性は異なり、Ｈｕｈ－７が最も感受性が高く、５０％の細胞傷害性を達成するために７．９５５μＭのソラフェニブ濃度を必要とした。一方、ＳＮＵ－３８７細胞は５０％の細胞傷害性を達成するために２９．４５μＭのソラフェニブを必要とした。図７Ｃ～７Ｅは、操作されたＮＫ細胞を用いたソラフェニブの使用に関するデータを示す。示されたＨＣＣ細胞についてのデータが示され、それらは、ＮＫ細胞（ソラフェニブ対照）なしで処理され、ＮＫ細胞のみ、ＴＫＩソラフェニブ、ＮＫＸ１０１ ＮＫ細胞、またはソラフェニブを用いたＮＫＸ１０１ ＮＫ細胞のいずれかで処理された。これらのデータは、上記で検討されたＮＫＸ１０１ ＮＫ細胞の有意な細胞傷害性効果にもかかわらず、ソラフェニブのようなＴＫ阻害剤などの追加の抗癌剤との投与は、依然として細胞傷害性効果を増加させることができることを示す。示されたように、ソラフェニブを用いたＮＫＸ１０１は、ＮＫＸ１０１ ＮＫ細胞と比較して、特に低いＥ：Ｔ比においてさえ、より高い細胞傷害性を可能にした。細胞傷害性効果は、ＮＫ細胞単独よりも大きく（各グラフで最も低いトレース）、ＮＫ細胞＋ソラフェニブで見られたものよりも優れていた。いくつかの実施形態では、このような併用療法は、相乗的な抗癌効果および患者に対する改善された転帰を可能にする。

【0138】

図８Ａ～８ａは、示されたＨＣＣ細胞上の種々のＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を示す。図９は、試験された９つのＨＣＣ株の各々について、示されたＮＫＧ２Ｄのリガンドの発現の程度と対応する対照のパーセント（未処理ＨＣＣ細胞）との間の潜在的な相関に関する。図１０Ａ～１０Ｇは、ＮＫＧ２Ｄリガンドがいつ過剰発現されるかを同定するために機能する試薬を開発するための実験に関する。ＮＫＧ２Ｄ受容体をＩｇＧのＦｃ領域と融合させた。この融合の種々のＨＣＣ細胞への結合を、フローサイトメトリー（図１０Ａ）によって、およびＦｃ領域に対する抗体によっても（１０Ｂ）測定した。このアプローチは、同定されるべきＮＫＧ２Ｄリガンドのうちの１つの高発現を有する細胞のタグ付けを可能にする（融合物のＮＫＧ２Ｄ部分がリガンドに結合し、Ｆｃ部分は融合物が結合される細胞を検出するためのタグとして役立つ）。図１０Ｃ～Ｇは、ＮＫＧ２Ｄ－ＦＣの結合／検出と示されたＮＫＧ２Ｄリガンドとの間の相関を示す。

【0139】

データはまた、天然のＮＫ細胞と比較して、本明細書に開示される実施形態による操作されたＮＫ細胞の増強された効力（例えば、細胞傷害性）を実証するために生じさせた。Ｈｅｐ３ｂ細胞およびＳＮＵ４４９細胞（両方とも腫瘍細胞の非限定的な例）を、ルシフェラーゼを発現するように操作した。２人の別々のドナーを使用し、ＮＫ細胞を回収した。天然のＮＫ細胞は、遺伝的に修飾されなかったが、ＮＫＸ１０１細胞は、本明細書に開示されるＣＡＲを発現するようなＮＫ細胞の修飾によって生じさせた。いくつかの実施態様に開示されるように、この実験では、ＮＫＸ１０１細胞は、ＮＫＧ２Ｄをコードする２シストロン性ウイルス、細胞内ＯＸ４０共刺激ドメイン、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、ならびに細胞生存および増殖の延長を支持する膜結合型ＩＬ－１５での形質導入によって生成された。ＮＫ細胞は、本明細書に開示される他のコンストラクトで修飾することができることが理解されるべきである。両セットの細胞（ＮＫＸ１０１および非修飾（ＮＴ ＮＫ）ＮＫ細胞）をＫ５６２－ｍｂＩＬ１５－４１ＢＢＬ刺激細胞で拡大させた。細胞傷害性は、Ｈｅｐ３ｂまたはＳＮＵ４４９細胞に対する各ＮＫ細胞型について、種々のエフェクター：標的比で評価された。ＥＣ５０値は、ＮＴ ＮＫ細胞およびＮＫＸ１０１の各々について算出された（ＥＣ５０値は、Ｐｒｉｓｍ ４パラメータの非線形回帰分析を用いて算出された）。

【0140】

図１１Ａは、Ｈｅｐ３ｂ細胞に対するＮＴ ＮＫ細胞およびＮＫＸ１０１のＥＣ５０データを示す。これらのデータは、Ｈｅｐ３ｂ標的細胞に対して５０％の細胞傷害性を達成するのに必要な少数のＮＫＸ１０１細胞によるこのアッセイから証明されるように、ＮＫＸ１０１細胞は、非修飾ＮＫ細胞と比較して増強された細胞傷害性を有することを確認する。実際に、このアッセイにおいて、ＮＫＸ１０１細胞は、ＮＴ ＮＫ細胞よりも３．５倍を超える細胞傷害性があった。図１１Ｂは、ＮＴ ＮＫ細胞と比較してＮＫＸ１０１の有意に増強された細胞傷害性を示す同様のデータを示す。ＳＮＵ４４９細胞に対して作用するＮＫＸ１０１は、４．５倍を超えて強力であった。これらのデータは、いくつかの実施形態に従って本明細書に開示されるように、操作されたＮＫ細胞は、操作されていないＮＫ細胞と比較して増強された細胞傷害性を有することを実証する。実施形態に応じて、操作されたＮＫ細胞は、天然のＮＫ細胞と比較して、約２倍～約２０倍、例えば、約２倍、約３倍、約５倍、約８倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、または列挙された範囲のエンドポイントを含むそれらの間の任意の量だけ増強される（例えば、増加した細胞傷害性を示す）。

【0141】

図１２Ａ～１２Ｉは、ＰＥコンジュゲートされた抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ、ＵＳＡ）によって測定した場合、９つの肝細胞癌腫細胞株の各々における種々のＮＫＧ２Ｄリガンドの発現に関連するフローサイトメトリーデータを示す。ＮＫＧ２Ｄリガンド発現は、破線の枠で囲まれて示され、対応するアイソタイプ対照は実線の枠で囲まれて示されている。図１３Ａ～１３Ｉは、図８に示されるデータを生じさせるために使用される抗体と比較して、図１２に示されるデータを生じさせるために使用される抗体間の比較データを示す。データは、平均蛍光強度（ｄＭＦＩ、示された標的についての蛍光シグナルから対応するアイソタイプ対照抗体からのバックグラウンド蛍光を差し引いたものとして算出される）におけるデルタとして示される。強度の変化の絶対値は、どの抗体タイプを使用したかに依存して若干異なったが、９つの肝細胞癌腫株にわたって、どの抗体を使用したかにかかわらず、ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現の一般的パターンは一貫していた。ＳＮＵ－１８２およびＨｕＨ－７などの特定の細胞株は、いくつかのＮＫＧ２Ｄリガンドの有意な発現を示したが、Ｈｅ３ＢおよびＨｅｐＧ２などの他の細胞株は、ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ以外のＮＫＧ２Ｄリガンドの限定的な発現を示した。すべての細胞株にわって、最大の発現はＵＬＢＰ２／５／６およびＭＩＣＡ／ＭＩＣＢと関連しているようであった。

【0142】

いずれかの特異的ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現が優性であるかどうかを決定するために、実験を行って、すべてのＮＫＧ２Ｄリガンドを全体として比較し、各個々のＮＫＧ２Ｄリガンドの発現間の相関を同定した。これは、任意のＮＫＧ２Ｄリガンドを肝細胞癌腫細胞に結合することができるＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃ融合抗体の結合を評価し、ＮＫＧ２Ｄ－リガンド特異的抗体を９タイプの肝細胞癌腫細胞の各々に結合させることと比較することによって達成された。次に、これらのデータを互いにプロットし、回帰分析を行い、相関および発現を同定した。これらのデータを図１４Ａ～１４Ｆに示し、Ｙ軸上に総ＮＫＧ２Ｄリガンドを発現し、Ｘ軸上に特異的に示されたＮＫＧ２Ｄリガンドを示す。６つの特異的ＮＫＧ２Ｄリガンドの各々を通じて、総ＮＫＧ２Ｄリガンド発現と比較したが、有意な相関は同定されなかった。これは、図１２および１３からのｄＭＦＩ値と一致しているようであり、種々の腫瘍細胞タイプ間の比較的高い程度の不均一性を示すようである。しかしながら、有利には、本明細書に開示される操作されたＮＫ細胞は、ＮＫＧ２Ｄリガンドのいずれかに結合することができるＮＫＧ２Ｄリガンド結合ドメインを利用する。したがって、リガンド特異的アプローチとは対照的に、より広範ベースのアプローチは、本明細書に開示される操作されたＮＫ細胞を使用する療法を可能にし、たとえ唯一の特定のマーカーが頑強な様式で発現された場合であっても、または特異な高度に発現されたマーカーがなくても、むしろいくつかのＮＫＧ２Ｄリガンドの発現レベルが低い場合であっても、腫瘍細胞を成功裏に標的化し、排除する。

【0143】

図１５Ａ～１５Ｃは、３つの肝細胞癌腫細胞株（Ｈｅｐ３Ｂ－ｌｕｃ、Ｈｕｈ－７－ｌｕｃ、およびＳＮＵ－４４９－ｌｕｃ）に対する操作されたＮＫ細胞の細胞傷害性に関連するデータを示す。上記で検討されるように、これらの細胞株の各々は、種々の量のＮＫＧ２Ｄリガンドを発現したが、これらの細胞株のいずれも「優性」マーカーを発現することを示す強い相関はなかった。図１５Ａ～１５Ｃのデータ（示されたドナー由来の操作されたＮＫ細胞または対応するドナー由来の非形質導入ＮＫ細胞を使用する。ドナー１６６７および１６６８は、先の図に示された他の以前の実験からのデータを有する。）。図１５Ａ～１５Ｃは、１：１および１：２のＥ：Ｔ比での４時間の細胞傷害性エンドポイントアッセイの結果を示す。図１５Ａ～１５Ｃの各々に示されるように、各ドナー由来の操作されたＮＫ細胞は、対応する非形質導入ＮＫ細胞と比較して、試験された両方のエフェクター：標的比で増強された細胞傷害性を示した。例えば、図１５Ａに示されるように、１：２のＥ：Ｔでは、全３人のドナー由来の非形質導入ＮＫ細胞は、Ｈｅｐ３Ｂ細胞に対して実質的に細胞傷害性効果を示さなかった。１人のドナー由来の操作されたＮＫ細胞は、最大約２０％の細胞傷害性（ＮＫＸ１０１ １６６８）を示したが、他の２人のドナー由来の細胞は、約５０％および約８０％の細胞傷害性（それぞれ、ＮＫＸ１０１ １６６９およびＮＫＸ１０１ １６６７）を示した。１：１のＥ：Ｔ比では、非形質導入ＮＫ細胞は種々の程度の細胞傷害性を示し、最も有効な細胞は約２５％の細胞傷害性を達成した。操作されたＮＫ細胞では、細胞傷害性は少なくとも５０％（ＮＫＸ１０１ １６６８）であり、残りのドナーの１人からの細胞は８５％を超える細胞傷害性（ＮＫＸ１０１ １１６９）を示し、他はほぼ１００％の細胞傷害性（ＮＫＸ １６６７）を示した。同様のデータパターンは、Ｈｕｈ－７細胞株に対するそれぞれのＮＫ細胞の細胞傷害性について示される（図１５Ｂ）。ただし、この場合、操作されたＮＫ細胞の各々は、肝細胞癌腫株に対してほぼ１００％の細胞傷害性を示した。同様に、同様のデータを図１５Ｃに示す。まとめると、肝細胞癌腫細胞株全体で可変ＮＫＧ２Ｄリガンド発現を示す発現データとともに、これらのデータは、本明細書に開示される実施形態による操作されたＮＫ細胞が、標的細胞全体でリガンド発現の可変性にもかかわらず、依然として有意な程度の細胞傷害性を提示することを示す。したがって、これらのデータは、本明細書に開示されるいくつかの実施形態に従った、操作されたＮＫ細胞が、肝細胞癌腫患者集団全体で経験される予測される不均一な腫瘍プロファイルに対して有効であるべきであることを示唆する。

【0144】

図１６Ａ～１６Ｇは、指示された肝細胞癌腫株がルシフェラーゼを発現するように操作された場合に回収されたデータであり、先の図においてデータを回収するために使用される。示された細胞株の各々は、効果的に形質導入された細胞を選択するために用いることができるＣＤ１９マーカーと同様に、ホタルルシフェラーゼ遺伝子をコードするベクターで形質導入された。図１６Ａ～１６Ｆは、磁気活性化細胞選別を用いて形質導入細胞を選択した後の、操作された細胞株の各々のＣＤ１９の発現の程度に関連するフローサイトメトリーデータを示す。図１６Ｇは、ホタルルシフェラーゼを発現するように操作された細胞株の各々について検出された相対光ユニットシグナルに関するデータを示す。

【0145】

ソラフェニブに対する肝細胞癌腫細胞の感受性に関する作用の可能なメカニズムを調査するために、各細胞株におけるＮＫＧ２Ｄリガンドの全集団の発現は、種々の用量のソラフェニブに応答して測定された。ＮＫＧ２Ｄリガンドの全集団は、ＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃキメラ抗体の使用を介して検出された。図１７Ａ～１７Ｆは、ＮＫＧ２Ｄリガンド発現に関連するフローサイトメトリーデータを示す。図１７Ｇ～１７Ｌは、示された肝細胞癌腫細胞によるプログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）の発現のための対応するフローサイトメトリーデータを示す。図１７Ｍおよび１７Ｎは、試験された細胞株の各々における示された用量のソラフェニブに対する用量－応答を示す線プロットである。図１７Ｍに示されるデータは、少なくとも試験された用量および総ＮＫＧ２Ｄ発現のレベルで、ソラフェニブが、ＮＫＧ２Ｄリガンド発現に実質的な影響を及ぼさないようであることを示す。個々のＮＫＧ２Ｄリガンドは、ソラフェニブ治療に対する多かれ少なかれある程度の応答性を有し得るが、この特定のアッセイに基づいて必ずしも同定できるとは限らない。同様に、図１７Ｎは、ソラフェニブに応答するＰＤ－Ｌ１の発現変化の明確なパターンを明らかにしていないが、データは、特定の濃度（例えば、１０μＭのソラフェニブ）では、多くの細胞株がＰＤ－Ｌ１発現の増加を示すことを示唆しているようである。

【0146】

同様の調査が、ＰＤ－Ｌ１と同様にＮＫＧ２Ｄリガンドの全プールの発現におけるインターフェロンガンマの影響の決定に関して実施された。インターフェロンガンマは、一旦活性化されるとＮＫ細胞によって分泌される炎症性サイトカインの１つであり、したがって、標的に対するＮＫ細胞の細胞傷害性効果において役割を果たす。図１８Ａ～１８Ｉは、示された濃度のインターフェロンガンマに曝露された場合の９つの肝細胞癌腫細胞株におけるＮＫＧ２Ｄリガンド発現に関連するフローサイトメトリーデータを示す。図１８Ｊ～１８Ｒは、同じ濃度のインターフェロンガンマについての対応するフローサイトメトリーデータ、およびＰＤ－Ｌ１の発現に対するそれらの影響を示す。図１８Ｓおよび１８Ｔは、ＮＫＧ２Ｄリガンド発現（１８Ｓ）およびＰＤ－Ｌ１発現（１８Ｔ）についてのフローサイトメトリーデータを要約する線グラフである。ソラフェニブ投与後の先の図に示された結果と同様に、ＮＫＧ２Ｄリガンドの全プールの発現におけるインターフェロンガンマの明白な影響はないようである。しかしながら、上述されるように、個々の特異的ＮＫＧ２Ｄリガンドは、インターフェロンガンマ曝露に応答して上方制御（または下方制御）され得る。図１８Ｔは、インターフェロンガンマの増加した用量に対する均一な発現応答パターンを示さないが、いくつかの細胞株は、より高い用量のインターフェロンガンマによりＰＤ－Ｌ１発現が増加する傾向を示すようである。ソラフェニブまたはインターフェロンガンマによるＮＫＧ２ＤリガンドまたはＰＤ－Ｌ１発現の明白な誘導の欠如にもかかわらず、いくつかの実施形態では、ソラフェニブまたは他の薬剤などの追加の抗癌剤と組み合わせて、本明細書に開示されるいくつかの実施形態による操作されたＮＫ細胞（例えば、ＮＫＸ１０１細胞）の併用治療レジメは、相乗的に増強された細胞傷害性効果をもたらす。ソラフェニブおよび／またはＩＦＮｇは、一部の実施形態では、本明細書で研究されたもの以外の他のＮＫ活性化受容体（または下方制御抑制性受容体）を上方制御することができ、これは種々の実施形態において見られる相乗的活性に部分的に関与する。

【0147】

図１９Ａ～１９Ｄは、４人のドナー由来の非形質導入ＮＫ細胞、それらのドナー由来の本明細書に開示される実施形態による操作されたＮＫ細胞、またはアイソタイプ対照シグナルのいずれかによるＰＤ－１の発現に関連するフローサイトメトリーデータを示す。プログラム死受容体１（ＰＤ－１）は活性化Ｔ細胞の表面に発現し、標的細胞上のそのリガンド（ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２）と相互作用する。図１９Ａ～１９Ｄのデータは、非形質導入ＮＫ細胞が、対照と実質的に区別することができないＰＤ－１レベルを発現し、また、本明細書に開示されるキメラ受容体を発現するためのＮＫ細胞（例えば、ＮＫＸ１０１）の操作が、ＰＤ－１の発現を実質的に変化させないことを示す。ＰＤ－１シグナル伝達は一般的に、本質的に抑制性であるため、データは、ＰＤ－１発現の誘導（上記で検討される）は、ＰＤ－１発現が変化しないため、本明細書に開示されたキメラコンストラクトを発現する操作されたＮＫ細胞の活性に対して有害でない可能性が高いことを示唆する。一実施形態では、ＰＤ－Ｌ１誘導は、内因性Ｔ細胞応答を阻害することができ、本明細書に開示されるキメラ受容体を発現する操作されたＮＫ細胞などは、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１経路の阻害剤と組み合わせて投与される。

【0148】

結腸直腸癌
背景：
結腸直腸癌は、米国では男女ともに３番目に多く診断される癌である。米国癌協会は、２０１９年の米国における結腸直腸癌の新規症例数の推定値に、結腸癌１０万人以上、直腸癌４万人以上を含む。肝臓は、結腸直腸癌患者における原発転移の最も一般的な部位の１つである。これは主に、門脈循環を介した腫瘍の播種によるものである。手術は原発性肝転移の治療に成功し得るが、多くの患者は理想的な候補ではない。したがって、本明細書に開示されるように、いくつかの実施形態では、操作されたＮＫ細胞は、一部の実施形態では、肝転移を効果的に治療するために、局部的／局所的に投与することができる。

【0149】

以下の実験は、ヒト結腸直腸癌（ＣＲＣ）細胞株モデルに対する細胞傷害活性に関して、ＮＫＸ１０１を発現するものなどの、本明細書に開示される操作されたＮＫ細胞の調査に関する。これには、ＮＫＸ１０１のインビトロ細胞傷害性および標的ＣＲＣ細胞株との共培養に応答したサイトカイン放出から得られたデータの測定および分析が含まれる。それはまた、ＮＫＸ１０１細胞傷害性との相関の分析のために、ＨＣＣ細胞株上のＮＫＧ２Ｄリガンド発現の染色を含む。ＮＫＧ２Ｄ受容体の複数のリガンドは、ＣＲＣにおいて高度に発現される。

【0150】

方法：
一過性のレトロウイルス上清を２９３Ｔ細胞のトランスフェクションによって調製した。２９３Ｔ細胞は、レトロウイルスベクター（ＮＫＸ１０１コンストラクトをコードするか、またはＣＤ１９タグを有するルシフェラーゼ（ｅｆｆｌｕｃ．ＣＤ１９）のいずれか）とコトランスフェクトされた。後者のベクターは、ＣＤ１９発現のスクリーニングにより、ルシフェラーゼ発現細胞の選択を可能にする。

【0151】

ＮＫ細胞の拡大、形質導入および特徴付けのために、健常ドナーの軟膜血液試料をスタンフォード血液センターから入手した。ＰＢＭＣを精製し、バンクした。ＮＫ細胞は、Ｋ５６２－ｍｂＩＬ１５－４１ＢＢＬフィーダー細胞とともに、１：１のフィーダー：ＰＢＭＣ比で共培養することにより、バンクしたＰＢＭＣから拡大させた。

【0152】

ＥＣ５０細胞傷害性アッセイおよびサイトカイン分析のために、抗ＣＤ３ ＭＡＣＳビーズを用いて、５日目の拡大をＴ細胞枯渇させた。

【0153】

ＮＫ細胞は、上記で検討した修飾されたＫ５６２細胞を用いて拡大させた。培地に４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ２を５日目に２４時間補足し、ＮＫ細胞を６日目に形質導入した。さらなる実施形態では、他の濃度またはタイミングを用いて、ＮＫ細胞を拡大する。いくつかの実施形態では、ＩＬ２は使用されず、一方、他のサイトカインが使用される。

【0154】

形質導入ＮＫ細胞（ＣＤ３－ＣＤ５６＋）上のＮＫＧ２Ｄの表面発現は、形質導入４日後に抗ヒトＮＫＧ２Ｄ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いたフローサイトメトリーにより分析し、ＮＫ細胞培養を４０ＩＵ／ｍＬのＩＬ２で継続した。いくつかの実施形態では、他の濃度のＩＬ２（ＩＬ２なしを含む）が使用される。

【0155】

ＣＲＣ細胞株の形質導入のために、２９３ＦＴ細胞をレトロウイルスベクターｅｆｆｌｕｃ．ＣＤ１９でトランスフェクションし、ウイルス上清を生じさせた。ＡＴＣＣ由来のヒトＨＣＣ細胞株（ＨｅｐＧ２、ＳＮＵ１８２、ＳＮＵ３８７、ＳＮＵ３９８、ＳＮＵ４２３、ＳＮＵ４７５）は、スピノキュレーションによりｅｆｆｌｕｃ．ＣＤ１９ウイルス上清で形質導入し、細胞を６ウェルプレート中２．５×１０^４細胞／ｍｌ（４ｍｌ、１ｅ^５／ウェル）の密度で播種した。形質導入細胞をＭＡＣＳ抗ＣＤ１９ビーズを用いてＣＤ１９細胞表面発現について正に選択し、ＣＤ１９＋純度をフローサイトメトリーにより分析した。

【0156】

ＮＫＸ１０１細胞のインビトロ細胞傷害性は、上記される操作されたＣＲＣ細胞株を発現するルシフェラーゼのパネルに対して測定された。接着性ＣＲＣ標的細胞は、トリプシン－ＥＤＴＡ（０．２５％）を用いて細胞培養フラスコから除去し、計数し、２×１０^５細胞／ｍｌで再懸濁し、１００μｌ（２×１０^４細胞／ウェル）を透明な９６ウェルＵ底組織培養プレートに播種した。ＮＫエフェクター細胞を計数し、ＥＣ５０実験のために連続的に（最大１６：１のＥ：Ｔから）２倍に希釈した。ＮＫ細胞をＣＲＣ細胞とともにウェルに添加し、プレートを３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーション後、１００μｌの各細胞懸濁液を１００μｌ／ウェルＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ試薬（１：１細胞培養容積）を含有する黒壁透明底プレートに移した。相対ルミネセンス単位（ＲＬＵ）をＳｏｆｔＭａｘ ６．２．２ ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅアッセイプロトコールを用いてＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダーで読み出した。

【0157】

ＮＫサイトカイン放出アッセイについては、ＮＴ ＮＫ（非形質導入ＮＫ）またはＮＫＸ１０１細胞を、９６ウェルＵ底部プレートにおいて、総計２００μＬ培地中で１：１（ウェルあたり各１×１０^５細胞タイプ）の比率で２４時間、３７℃でＣＲＣ標的細胞と共培養した。２４時間で、プレートを３００ｇで５分間遠心分離し、上清を回収し、サイトカインレベルがＬｕｍｉｎｅｘにより分析されるまで－８０℃で凍結した。ＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘカスタム５－ｐｌｅｘアッセイは、ｘＰＯＮＥＮＴソフトウェアを使用してＬｕｍｉｎｅｘ ＭＡＧＰＩＸ装置の製造業者プロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って実施された。

【0158】

結果：
図２０Ａ～２０Ｅは、ルシフェラーゼを発現するための種々の結腸直腸癌（ＣＲＣ）細胞株の操作に関連するフローサイトメトリーデータを示す。上記されるように、ホタルルシフェラーゼをコードするベクターはまた、形質導入された細胞のＭＡＣＳ選択を可能にするＣＤ１９マーカーを含む。これらのデータは、ＣＤ１９選択が行われた後に得られたＣＲＣ細胞の染色を示す。データは、使用された抗体についてのアイソタイプ対照（左曲線）と比較して、ＣＤ１９染色（右シフト曲線）を示す。

【0159】

図２１Ａ～２１Ｅは、ＮＫＧ２Ｄリガンドまたはアイソタイプ対照のいずれかについての操作された結腸直腸癌細胞の染色に関するデータを示す。ＮＫＧ２Ｄリガンドは破線の枠で示され、一方、対照は実線の枠で示される。ＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃで標識された列は、存在するすべてのＮＫＧ２Ｄリガンドに結合すべきＮＫＧ２Ｄ－Ｆｃキメラ抗体の使用を示し、したがって、ＮＫＧ２Ｄリガンドの全集団を表す。その後の列は、特異的抗体と結合した、各特異的に示されたＮＫＧ２Ｄリガンドについての染色である。要約すると、これらのデータは、複数のＮＫＧ２ＤリガンドがＣＲＣ細胞によって発現されることを確認する。いくつかの実施形態によれば、ＣＲＣ細胞による種々のＮＫＧ２Ｄリガンドの発現は、本明細書における開示による操作されたＮＫ細胞が、ＣＲＣ細胞、特に肝臓に転移したものを標的化し、死滅することを可能にする。

【0160】

４人のドナー（２２４、６９２、６９９、６５０）由来のＮＫ細胞を上記されるように拡大した。Ｔ細胞は、拡大５日目にＣＤ３ ＭＡＣＳ単離によって枯渇させ、細胞を、ＣＤ３およびＣＤ５６のＣＤ３枯渇前（図２２Ａ～２２Ｃ）およびＣＤ３枯渇後（図２２Ｄ～２２Ｆ）について染色した。上記で検討したように、ＣＤ５６はヒトＮＫ細胞のマーカーである。したがって、図２２Ｄ～２２Ｆのデータは、ＣＤ３枯渇後のＮＫ細胞の結果として生じる集団が、非常に純粋なＮＫ細胞の集団であることを示す。拡大されたＮＫ細胞は、本明細書に開示されるキメラ受容体コンストラクトをコードするポリヌクレオチドを用いて６日目に形質導入された。例として、本実験は、ＮＫＧ２Ｄ／ＯＸ４０／ＣＤ３ｚ細胞傷害性受容体複合体（図１Ｄを参照されたい）を利用したが、本明細書中に開示される他のコンストラクトも同様に使用することができることは理解されるべきである。ＮＫＸ１０１を発現する操作されたＮＫ細胞を、形質導入後の４日目にＮＫＧ２Ｄ発現について染色した（図２３Ａ～２３Ｃ）。見ることができるように、対照ＮＴＮＫ細胞と比較して、ＮＫＧ２Ｄ標的化キメラ受容体を発現するように操作されたＮＫ細胞は、ＮＫＧ２Ｄ受容体発現について有意に高いシグナルを示す。これらのデータは、操作されたＮＫ細胞がキメラ受容体を発現していることを確認する。ＣＲＣ細胞株ＨＣＴ１５、ＨＣＴ１１６およびＨＴ２９に対する細胞傷害性アッセイは、上記されるように、拡大後の１４～２１日目に１６：１から１：１６に下げる範囲のＥ：Ｔ比にわたって行われた。４時間のエンドポイントにてＲＬＵシグナルを読み取り、細胞傷害性パーセントを使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７の４パラメータ非線形回帰分析（図２４Ａ～２４Ｃ）を用いてＥＣ５０値を算出した。示されるように、この実験で試験された各ＣＲＣ細胞に対して、ＮＫＸ１０１キメラ受容体コンストラクトを発現するＮＫ細胞は、ＮＴＮＫ細胞よりも高い細胞傷害性を示した。実際に、ＮＫＸ１０１細胞は、すべてのＥ：Ｔ比において、全３つの細胞株にわたって増強された細胞傷害性を示した（しかし、ＨＣＴ１５細胞における最高のＥ：Ｔで同様の効果であった）（図２４Ａ）。ＮＫＸ１０１の算出されたＥＣ５０は、ＮＴ ＮＫよりも３～４倍低く、したがって、ＮＫＧ２Ｄ指向性キメラ受容体を発現する操作されたＮＫ細胞のいくつかの実施形態は、種々の腫瘍タイプに対して非常に有効であることを補強した。

【0161】

２人のドナー（０９１、１４０）由来のＮＫ細胞を、記載されるように拡大した。Ｔ細胞は、拡大５日目のＣＤ３ ＭＡＣＳ単離によって枯渇させ、細胞を、ＣＤ３およびＣＤ５６のＣＤ３枯渇前（図２５Ａ、２５Ｄ）ならびにＣＤ３枯渇後（図２５Ｂ、２５Ｄ）について染色した。拡大されたＮＫ細胞は、本明細書に開示されるキメラ受容体コンストラクトをコードする６日目のポリヌクレオチド上に形質導入された。例として、本実験は、ＮＫＧ２Ｄ／ＯＸ４０／ＣＤ３ｚ細胞傷害性受容体複合体（図１Ｄを参照されたい）を利用したが、本明細書に開示される他のコンストラクトも同様に使用することができることは理解されるべきである。得られた細胞を、形質導入後の４日目にＮＫＧ２Ｄ発現について染色した（図２５Ｃ、２５Ｆ）。これらのデータは、２人のドナーから拡大したＮＫ細胞が、ＮＴＮＫ細胞と比較して、ＮＫＧ２Ｄの頑強な発現を示すことを示す。拡大２１日目に両ドナー由来のＮＫＸ１０１またはＮＴ ＮＫ細胞を、１：１の比率で２４時間、ＣＲＣ標的細胞とインビトロで共培養し、上清をＬｕｍｉｎｅｘアッセイにより分泌型サイトカインレベルについて分析した。３つの細胞株の各々のサイトカイン放出プロファイルのデータを図２６Ａ～２６Ｃに示す（各分析物の標準曲線を図２７Ａ～２７Ｅに示す）。試験した各細胞株について、ＮＫＸ１０１を発現するＮＫ細胞とＣＲＣを共培養すると、ＮＴ ＮＫに対してＮＫＸ１０１を発現するＮＫ細胞からの炎症誘発性サイトカイン放出が増強した。例えば、ＮＫＸ１０１を発現するＮＫ細胞によるＩＦＮｇ放出は、ＨＣＴ１５群ではほぼ２倍であり、ＨＣＴ１１６およびＨＴ２９群ではさらに顕著なＮＫ細胞サイトカイン放出が誘導された。炎症誘発性サイトカインのこれらの増加した分泌物は、本明細書に開示される操作されたＮＫ細胞の増強された細胞傷害性について、少なくとも一部は、一部の実施形態に関与する。

【0162】

操作されたＮＫ細胞の特定の特徴
背景：
本明細書に開示される操作されたＮＫ細胞の特徴をさらに評価するために、例えば、ＮＫ細胞のマーカープロファイル、本明細書に開示されるキメラ受容体の実施形態を発現する操作されたＮＫ細胞の能力、このような操作されたＮＫ細胞の細胞傷害性、および操作されたＮＫ細胞の他の特徴を評価するために追加の実験を行った。

【0163】

結果：
本明細書で検討されるように、いくつかの実施形態では、ドナーＮＫ細胞の集団は、フィーダーまたは刺激細胞株と関連して拡大されてもよい。いくつかの実施形態では、修飾されたＫ５６２細胞が使用される。このような細胞の例は、米国特許第７，４３５，５９６号または同第８，０２６，０９７号に提供され、これらの各々は、参照により本明細書にそれらの全体が組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＳＧ２０１８／０５０１３８号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されるものなど、さらなる修飾が使用される。拡大されたＮＫ細胞は、いくつかの実施形態では、キメラ受容体および／またはＮＫ細胞の持続性を促進する分子（膜結合型ＩＬ１５など）を発現し、次に、さらに拡大するように操作されてもよい。いくつかの実施形態によれば、次に、細胞を凍結保存することができ、融解後に患者に投与する準備ができる。実施形態に応じて、種々の程度の拡大を行うことができる。例えば、一部の実施形態では、最大約５０人の患者のためのＮＫ細胞は、単一のドナーから生じさせることができる。いくつかの実施形態では、最大約１００人の患者のためのＮＫ細胞は、単一のドナーから生じさせることができる。いくつかの実施形態では、拡大は、さらに大量の拡大、例えば、単一ドナーから最大約２００、約３００、約４００、約５００またはそれを超える患者用量の拡大を可能にする。

【0164】

実験は、本明細書に開示される実施形態による操作されたＮＫ細胞の特徴を決定するために行われた。いくつかの実施形態によれば、本明細書に開示されるＮＫ細胞は、広く活性化された表現型を示す。図２８Ａは、拡大中の３つの時間点（０日目、丸；７日目、四角、および１２日目、三角）におけるＮＫ細胞のフローサイトメトリー発現データを示す。Ｙ軸は、生きたＮＫ細胞（拡大培養物中のＣＤ５６^ｐｏｓ／ＣＤ３^ｎｅｇ細胞）の総数のパーセンテージを表す。ｘ軸は、ＮＫＧ２Ｄ（左群）、ＮＫｐ３０（中央群）、またはＮＫｐ４４（右群）のいずれかを発現するＮＫ細胞（ＣＤ５６^ｐｏｓ）の検出に関する。上記で検討したように、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０およびＮＫｐ４４の各々は、ＮＫ細胞によって発現される活性化受容体である。０日目には、少数のＮＫ細胞のみがＮＫＧ２Ｄ（約２５％未満）またはＮＫｐ４４（ほとんど発現しない～全く発現しない）を発現した。対照的に、ＮＫｐ３０発現はかなり高かった（約８５％）。しかしながら、拡大７日後、ＮＫＧ２Ｄ発現は有意に上方制御され、ＮＫ細胞の平均８０％近くがＮＫＧ２Ｄを発現した。同様に、ＮＫｐ４４は、実質的に同様に上方制御され、ほぼ５０％の細胞がそれを発現した。その高い初期発現レベルにもかかわらず、ＮＫｐ３０発現さえ増加し、ここではほぼ１００％のＮＫ細胞に存在していた。培養１２日目。ＮＫＧ２Ｄ発現は、平均して減少した（依然として６０％を超える）が、２人のドナー由来のＮＫ細胞の８０％では発現したままであった。ＮＫｐ４４発現は増加し続け、ＮＫ細胞の平均６０％がＮＫｐ４４を発現した。ＮＫｐ３０は１２日目に変化せず、ＮＫ細胞のほぼ１００％に依然として存在していた。図２８Ｂは、ＮＫ細胞の総数のパーセンテージとしてのＮＫｐ４６、２Ｂ４、ＣＤ６９ ＣＤ２５およびＤＮＡＭ－１の発現についての対応するデータを示す。ＮＫ細胞は、０日目、ならびに拡大開始後の７日目および１２日目にフローサイトメトリーにより特徴付けられた。ＮＫｐ４６、ＣＤ６９およびＣＤ２５の発現はすべて、０日目で比較的低かった（それぞれ約４０％、約１０％、および約５％）。対照的に、２Ｂ４およびＤＮＡＭ－１は、各々、０日目にＮＫ細胞により高発現した（それぞれ約１００％および９０％）。拡大の７日目に、ＮＫｐ４６、ＣＤ６９、およびＣＤ２５の各々は、ＮＫ細胞上で有意な有病率を示し、各々は、ここでは、ＮＫ細胞の約９０％によって発現された。２Ｂ４発現はＮＫ細胞の約１００％で一定のままであったが、ＤＮＡＭ－１発現はＮＫ細胞の約９５％に増加した。拡大の１２日目に、ＮＫｐ４６レベルは平均して約７５％の発現まで低下し、ＣＤ２５発現は約５０％まで低下した。ＣＤ６９の発現は依然として高く、ＮＫ細胞の８５％近くが平均してそれを発現した。２Ｂ４およびＤＮＡＭ－１はいずれも、ほぼすべてのＮＫ細胞によって発現された。まとめると、これらのデータは、ＮＫ細胞活性化の特定のマーカーおよび種々の活性化受容体が、拡大したＮＫ細胞において広範であり、比較的安定に上方制御されることを示した。いくつかの実施形態によれば、特定のマーカー（複数可）の発現を最大化するために、特定の時間、拡大を行うことができる。いくつかの実施形態では、いくつかの異なる活性化マーカーの広範な発現は、本明細書に開示されるいくつかの実施形態による操作されたＮＫ細胞がこのような有意な細胞傷害性効果を示す理由の少なくとも１つを表す。

【0165】

上記で検討されるように、いくつかの実施形態では、細胞は、ＮＫ細胞の拡大および永続性を増強するために、ＮＫＧ２Ｄ（またはリガンドと結合するその一部）、ならびにＩＬ１５、例えば、膜結合型ＩＬ－１５（ｍｂＩＬ－１５）を発現するように操作される。膜結合型ＩＬ－１５に関する非限定的な情報は、米国特許出願第１５／３０９３６２号に見出され得、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ｍｂＩＬ１５の発現は、操作されたＮＫ細胞の持続性を増強する。これはインビトロ設定で有利であり得るが、本明細書に開示される実施形態によれば、ｍｂＩＬ１５はまた、インビボでの持続性を増強する。図２９Ａは、ｍｂＩＬ１５発現が、操作されたＮＫ細胞の持続性を増強することを示す。フローサイトメトリーを用いて、血液試料中のＮＫＧ２Ｄ^ｐｏｓ／ＣＤ５６^ｐｏｓ／ＣＤ３^ｎｅｇ細胞を測定し、その結果を全検出細胞のパーセントで表した。経時的に循環するＮＫ細胞の総数と比較して測定した場合、キメラ受容体コンストラクトの非限定的な実施形態を発現する結果としてｍｂＩＬ１５を発現するＮＫ細胞のみ（ＧＦＰ細胞または非修飾ＮＫ細胞ではなく）が、７日後に循環中に依然として存在する。２つの対照群は、それらの数のいずれもの増加を示さないが、投与後の少なくとも２８日目まで、ｍｂＩＬ１５を発現するＮＫ細胞は、循環中に依然として存在する。これらのデータは、いくつかの実施形態によれば、本明細書に開示される操作されたＮＫ細胞が、インビボでさえ長期の永続性を示し、それによって、癌免疫療法の治療を必要とする対象において長期の細胞傷害性効果を可能にすることを示す。

【0166】

本明細書に開示される操作されたＮＫ細胞の利点をさらに支持するのは、経時的に改善されるＮＫ細胞の存在だけでなく、それらの活性でもある。図２９Ｂは、ＮＳＧマウスに２×１０^５個のＵ２ＯＳ骨肉腫細胞を腹腔内注射した後に検出された蛍光シグナルに関する要約データを示す。マウスには、ＰＢＳ、ＧＦＰを発現するＮＫ細胞、本明細書に開示されるＮＫＧ２Ｄキメラ受容体を発現するＮＫ細胞（ｍｂＩＬ１５なし）、またはｍｂＩＬ１５も発現するように構成された本明細書に開示されるＮＫＧ２Ｄキメラ受容体を発現するＮＫ細胞をＩＰ注入した（各ＮＫ細胞注入は３×１０^６個の細胞であり、７日目に投与された）。３用量のＩＬ２を投与し、１４日目、２１日目、２８日目、３５日目、４９日目、および６３日目に画像データを回収し、図２９Ｃに示す。示されるように、ＮＫＧ２Ｄキメラ受容体を発現するＮＫ細胞、またはｍｂＩＬ１５とともにＮＫＧ２Ｄキメラ受容体を発現するＮＫ細胞のいずれかを受けたマウスは、６３日間でさえ、有意に少ない腫瘍量を示す。これは、２つの対照群（ＰＢＳおよびＧＦＰを発現するＮＫ細胞）のそれぞれにおいて、経時的に腫瘍量が急速に増加することと対照的である。

【0167】

種々の肝腫瘍タイプまたは骨肉腫細胞に関連して上記で検討した実験からのデータがあるが、本明細書に開示されるいくつかの実施形態による操作されたＮＫ細胞は、他の腫瘍タイプに対しても効果的である。例えば、本明細書に開示されるＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲを発現するＮＫ細胞は、ＡＭＬモデル、ＴＨＰ－１異種移植モデルにおいて用量依存性の腫瘍活性を示す。このモデルにおいて、ラットを、腫瘍注射の２日後にＮＫＧ２Ｄ－ＯＸ４０－ＣＤ３Ｚ－ｍｂＩＬ１５ ＣＡＲを発現するＮＫ細胞の単回用量で処置した。画像データは図３０Ａに示され、要約データは図３０Ｂに示される。上述のＵ２ＯＳ異種移植モデルと同様に、ＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲを発現するＮＫ細胞の投与により、腫瘍量は有意に低かった。さらに、細胞傷害性効果は明白な用量依存的応答を示した（腫瘍量は細胞量の増加に伴って減少する）。

【0168】

本明細書に開示されるＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲの有効性をさらに調査するために、追加のＡＭＬ株を試験した。図３１に示されるように、８つの異なるＡＭＬ細胞株と比較して、本明細書に開示されるキメラ受容体コンストラクトを発現する操作されたＮＫ細胞は、非修飾ＮＫ細胞よりも増加した細胞傷害性効果をもたらした。試験したいくつかの細胞株において、増強効果は腫瘍細胞に対してほぼ９０～９５％の細胞傷害性をもたらしたが、静止ＰＢＭＣを標的としなかった。上述したように、実施形態に応じて、種々の操作された受容体を使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、活性化受容体は、ＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを含むことができる。各ドメインは、複数のサブドメインから構成されてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、活性化受容体は、ＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメイン、ＣＤ８アルファヒンジ領域、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメイン、ＯＸ４０共刺激ドメイン、ＣＤ３ｚシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、このような受容体をコードするポリヌクレオチドは、ｍｂＩＬ１５も発現するように操作される。他の刺激ドメイン、例えば、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ１６、ＮＫｐ８０、２Ｂ４、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、およびそれらの組み合わせを使用することができる。いくつかの実施形態では、グリシン－セリンスペーサーなどの種々のスペーサーを用いて、種々のドメインを分離する。

【0169】

有利には、特に同種投与のために、ＮＫ細胞は、高い生存率で凍結保存することができ、生存細胞回収および細胞傷害活性は融解時に保持される。これは、図３２Ａに概略的に示された実験プロトコールを用いて評価された。

【0170】

凍結保存後、本明細書に開示された実施形態によるＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲを発現するＮＫ細胞の生存率は、培養の１４日後および２７日後の新鮮（非凍結）細胞の生存率と比較された。図３２Ｂは、融解後の生存率に実質的な変化がないこと、換言すれば、操作されたＮＫ細胞は、凍結保存後も依然として生存可能であることを示す。重要なことに、生存細胞のパーセンテージは、融解後に非常に高く、所与の凍結－融解サイクルからの生存細胞の制限された喪失を示し、これは、所与のバッチの拡大された細胞のより大きなパーセンテージが融解後に投与され得ることを意味する。図３２Ｃは、３つの試料からの７５％以上の生存率を示す。凍結保存および融解後であっても、操作されたＮＫ細胞の細胞傷害性は、新鮮な細胞と有意差がない程度に維持された（図３２Ｄを参照されたい）。これは、操作された細胞の抗腫瘍活性を示す能力が保持されるために重要であり、いくつかの実施形態によれば、これは、凍結保存された細胞を効果的に使用する能力を高める。

【0171】

種々の追加マーカーの発現レベルを拡大中に（０日目、７日目、および１２日目にフローサイトメトリーにより特徴付けした低ＩＬ２培地中で）評価した。図３２Ｅは、ＮＫ細胞上の抑制性受容体ＣＤ１５８ｂの発現が、拡大中に有意に変化しなかったことを示す。対照的に、抑制性ＮＫＧ２Ａ受容体を発現するＮＫ細胞のパーセンテージは７日目に増加したが、培養１２日目にはわずかな低下を示した。ＩＬＴ２抑制性受容体の発現は、拡大中に本質的に変化しなかった。ＮＫ細胞消耗の潜在的マーカーであるＰＤ－１は、拡大中に発現を変化させず、本質的に発現されなかった。ＮＫ細胞の成熟のマーカーであるＴＩＧＩＴおよびＴｉｍ３は、拡大が進行するにつれてＮＫ細胞でわずかに多く見られた。有利には、本明細書で検討されるように、特定の抑制性受容体の様々な上方制御にもかかわらず、いくつかの実施形態では、活性化受容体も上方制御され、バランスのとれたＮＫ細胞活性の増強を可能にする。

【0172】

図３２Ｇは、０日目における培養中の生きたＮＫ細胞上のＣＤ５６およびＣＤ１６発現のベースラインの特徴付けに関連するデータを示す。ＮＫ細胞の２つの主要なサブセットはＣＤ５６^ｈｉｇｈ／ＣＤ１６^ｄｉｍおよびＣＤ５６^ｄｉｍ／ＣＤ１６^ｈｉｇｈである。ＣＤ５６の存在／強度は、ＮＫ細胞の増殖能と直接相関しており、すなわち、頑強なＣＤ５６発現は、ＮＫ細胞が増殖するように構成されていることを意味する。このＣＤ５６の発現は、下記で検討するように、細胞傷害活性と関連する、より低いＣＤ１６の発現と関連している。したがって、ＣＤ５６^ｈｉｇｈ／ＣＤ１６^ｄｉｍは、増殖および分化し、より細胞傷害性の高いＣＤ５６^ｄｉｍ／ＣＤ１６^ｈｉｇｈＮＫ細胞を生じると考えられる。図３２Ｇは、培養０日目の生きたＮＫ細胞の大部分が、ＣＤ５６^ｄｉｍ／ＣＤ１６^ｈｉｇｈの細胞傷害性のより強力なＮＫ細胞であることを示す。図３２Ｈは、ＮＫ細胞によるＣＤ１６およびＣＤ５７の発現において、拡大した時間経過で流束が存在し、ＣＤ１６は７日目に一時的に減少し、次に、１２日目に開始レベルに回復することを示す。ＣＤ５７の発現は、拡大を通じて低下する。図３２Ｉは、培養７日目および１２日目のマーカー強度に関連するデータを示し、０日目のマーカー強度の比で表す。これらのデータは、ＣＤ５６発現強度が増加する一方で、ＣＤ１６およびＣＤ５７発現強度は変化しないことを示す。これらのデータは、本明細書に開示される実施形態による拡大が、操作されたＮＫ細胞を「復帰」または増殖促進表現型を採用するように誘発することを示唆する。図３２Ｊおよび３２Ｋは、拡大中の記憶ＮＫ細胞様発現プロファイルの発生に関するものであり、操作されたＮＫ細胞をフィーダー細胞および追加のサイトカインで拡大させた場合、特定の記憶様マーカーの発現が増加する。ＮＫ細胞拡大法に関するさらなる情報は、米国特許第７，４３５，５９６号（２００８年１０月１４日発行）、同第８，０２６，０９７号（２０１１年９月２７日発行）、国際特許出願第ＰＣＴ／ＳＧ２０１８／０５０１３８号（２０１８年３月２７日出願）および米国仮特許出願第６２／８８１，３１１号（２０１９年７月２１日出願）に見出され得、これらのすべては、各々、参照により本明細書に組み込まれる。

【0173】

併用療法
背景：
理論に拘束されることなく、本明細書に開示されるいくつかの実施形態における操作されたＮＫ細胞の細胞傷害性は、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を誘発することによって増強され得る。抗体は、腫瘍細胞の増殖を妨げることにより、直接的に、一方で抗腫瘍効果を媒介する。抗体はまた、免疫媒介性補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）またはＡＤＣＣを誘導することによって間接的に腫瘍に作用し得る。ＡＤＣＣは、特異的免疫グロブリンによって標的細胞表面に発現された抗原を認識することから始まる。次に、これらの抗体のＦｃドメインは、本明細書に開示される操作されたＮＫ細胞などの免疫エフェクター細胞上に発現されるＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）に結合され、次に、標的細胞への細胞傷害性顆粒の放出を誘発するか、または細胞表面上の死受容体発現を上方制御する。

【0174】

結果：
いくつかの実施形態によれば、操作されたＮＫ細胞は、腫瘍細胞表面上のリガンドに結合し、発現されたＣＡＲを介して細胞傷害性を誘導することができるだけでなく、ＡＤＣＣに動員されることによってさらなる細胞傷害性効果を誘導するために動員することもできる。いくつかの実施形態に従う、２つの異なるメカニズムが機能する場合、ＡＤＣＣカスケードを開始することができる抗体と組み合わせて、本明細書に開示される操作されたＮＫ細胞を使用すると、相乗的な抗腫瘍効果がもたらされる。図３３Ａは、本明細書に開示される非限定的な実施形態による、ＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲを発現するＮＫ細胞によるＣＤ１６の発現を示す（本明細書では、使用されたＣＡＲはＮＫＧ２Ｄ－ＯＸ４０－ＣＤ３ｚ－ｍｂＩＬ１５であった）。ＦｃγＲＩＩＩＡであるＣＤ１６は、ＮＫ細胞のＡＤＣＣへの動員に大きく関与している。興味深いことに、図３３Ａに示されるように、ＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲを発現する操作されたＮＫ細胞の９０％はまたＣＤ１６を発現し、これらの操作された細胞がＡＤＣＣに関与するためにプライミングされることを示唆する。図３３Ｂおよび３３Ｃは、ＲａｊｉおよびＮａｌｍ６細胞上のＣＤ１９およびＣＤ２０発現（それぞれ）に関連するデータを示す。Ｒａｊｉ細胞はＢリンパ球細胞株であり、Ｎａｌｍ６細胞は青年期の男性から開始されたＢ細胞前駆体白血病細胞株である。図３３Ｂに示されるように、ＲａｊｉとＮａｌｍ６細胞の両方がＣＤ１９を発現する。図３３Ｃに示されるように、Ｒａｊｉ細胞はＣＤ２０発現が豊富であるが、Ｎａｌｍ６細胞はそうではない。

【0175】

いくつかの実施形態によれば、本明細書に開示される実施形態による、癌を標的とするために使用される抗体＋操作された細胞などの併用療法の使用は、相乗的な細胞傷害性をもたらす。例えば、いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲを発現するＮＫ細胞は、抗ＣＤ２０抗体（非限定的な例として、リツキシマブなど）と同時投与される。他の実施形態は、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＮＹ－ＥＳＯ、ＭＡＧＥＡ４、ＭＡＧＥＡ１、ＰＲＡＭＥ、生存などの他の一般的な腫瘍マーカーに指向される他の抗体を使用する。図３４は、共培養単独、ＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲ＋対照ＩｇＧ１抗体を発現するＮＫ細胞、またはＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲ＋抗ＣＤ２０抗体を発現するＮＫ細胞におけるＲａｊｉ細胞の拡大に関するデータを示す。非限定的な例として、この実施例で使用されるＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲは、ＮＫＧ２Ｄ－ＯＸ４０－ＣＤ３ｚ－ｍｂＩＬ１５であった。標的：エフェクター細胞比は２：１であり、ＮＫ細胞を、ＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲコンストラクトでのそれらの形質導入の１４日後に腫瘍細胞に添加した。示されるように、Ｒａｊｉ細胞単独は、経時的に数が増加する（上段の「標的単独」トレース）。本明細書に開示される実施形態およびＩｇＧ１に従って、Ｒａｊｉ細胞をＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲを発現するＮＫ細胞に曝露した場合、Ｒａｊｉ細胞増殖は有意に妨げられた。４．５日目には増加傾向にあったが、対照と比較して腫瘍増殖は明らかに遅延した。本明細書に開示される実施形態によるＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲを発現するＮＫ細胞と抗ＣＤ２０抗体との組み合わせは、すべてのＲａｊｉ細胞の増殖を妨げるようであった。上記で検討したように、本明細書に開示される操作されたＮＫ細胞の表現型は、ＡＤＣＣにおけるそれらの潜在的関与を示す。この実験に見られるように、およびいくつかの実施形態によれば、ＮＫＧ２Ｄリガンド結合およびＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲシグナル伝達ドメインとＡＤＣＣの攻撃の組み合わせは、予期せぬ増強された細胞傷害性をもたらした。

【0176】

上記で検討されるように、追加の薬剤は、本明細書に開示される操作されたＮＫ細胞と同時に投与することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、ＮＫＧ２Ｄリガンド（またはＣＤ１２３またはＣＤ１９などの他の腫瘍マーカー）を標的とする操作されたＮＫ細胞とともに投与される。白血病細胞株は、対照として単独で増殖させ、ＧＦＰを発現するＮＫ細胞と共培養し、または本明細書に開示されるＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲを発現するＮＫ細胞と共培養した。非限定的な例として、この実施例で使用されるＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲは、ＮＫＧ２Ｄ－ＯＸ４０－ＣＤ３ｚ－ｍｂＩＬ１５であった。図３５Ａは、ＨＬ６０細胞数の増加およびＮＫ ＧＦＰ細胞によるその速度のわずかな減少を示す。ＨＬ６０細胞をＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲを発現するＮＫ細胞で処理した場合、細胞増殖はさらに低下した。図３５Ｂは同じ処理群を示し、培養物にＨＤＡＣ阻害剤バルプロ酸を添加した。示されているように、バルプロ酸の添加は、ＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲを発現するＮＫ細胞と相乗的に相互作用し、ＨＬ－６０細胞増殖を劇的に抑制した。さらなる実施形態によれば、他のＨＤＡＣ阻害剤、例えば、ロミデプシン（例えば、ＦＲ９０１２２８）、エンチノスタット（例えば、ＭＳ－２７５）フェニルブチレート、ベリノスタット（ＰＤＸ１０１）、バルプロ酸ナトリウム、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、またはそれらの組み合わせが使用される。

【0177】

上述したように、一部の実施形態では、ＮＫ細胞が使用される。一部の実施形態では、Ｔ細胞が使用される。なおさらなる実施形態では、ＮＫ細胞およびＴ細胞の組み合わせが使用される。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞およびＴ細胞がＮＫＧ２Ｄ活性化受容体を発現するように操作される、このような組み合わせは相乗的な細胞傷害性をもたらす。

【0178】

ＮＫ、ＴまたはＮＫ＋Ｔ細胞は、本明細書に開示される実施形態によるＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲを発現するＮＫ細胞で形質導入された。非限定的な例として、この実施例で使用されるＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲは、ＮＫＧ２Ｄ－ＯＸ４０－ＣＤ３ｚ－ｍｂＩＬ１５であった。種々のコンストラクトの細胞傷害活性は、１：４のＥ：Ｔ比（ＮＫ：Ｔ＝１：１比）でＨＬ６０ ＡＭＬ株に対して評価された。図３６は、得られたデータを示す。ＨＬ６０細胞は、予想されるように、単独で増殖した場合に数が増加する。ＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲを発現するＮＫ細胞は、ＨＬ６０細胞の増殖を有意に減少させる。同様に、Ｔ細胞はまたＨＬ６０細胞の増殖を減少させる。ＮＫ ＮＫＧＤ ＣＡＲ細胞とＴ ＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲ細胞の両方による有意な減少を考慮すると、ＮＫ＋Ｔ ＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲ細胞の組み合わせが、ＨＬ６０細胞増殖をなおさらに減少させ、効果的にゼロにすることができることは予想外である。ＮＫ細胞は迅速な動態で腫瘍細胞を死滅させるが、Ｅ：Ｔ比が高いと、腫瘍細胞は依然として増殖する。Ｔ細胞は、よりゆっくりとした動態で死滅させるが、培養で拡大されて、より持続的な制御を提供する。いくつかの実施形態によれば、ＮＫ＋Ｔ細胞の組み合わせは、細胞傷害活性の迅速な開始および延長された動態を示し、これは、細胞型単独の既に高い細胞傷害性効果を考えると、驚くほど有利である。いくつかの実施形態に従って、混合されたＮＫ＋Ｔ細胞集団は、腫瘍を治療するために使用される。さらなる実施形態では、ＮＫ＋Ｔ細胞集団が、抗癌抗体、キナーゼ阻害剤、および／またはＨＤＡＣ阻害剤などの追加の薬剤とともに使用される場合、より速い作用および／またはより長い持続効果のいずれかが見られる。

【0179】

上記に開示された実施形態の特定の特徴および態様の種々のコンビネーションまたはサブコンビネーションを作製することができ、１つまたは複数の発明の範囲内になおも入ることができると考えられる。さらに、実施形態に関連する任意の特定の特徴（ｆｅａｔｕｒｅ）、態様、方法、特性、特徴（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）、品質、属性、要素などの本明細書における開示は、本明細書に記載する他のすべての実施形態において使用することができる。したがって、開示された実施形態の種々の特徴および態様は、開示された発明の種々の様式を形成するために、互いに組み合わせることができ、または互いに置き換えることができることが理解されるべきである。したがって、本明細書に開示される本発明の範囲は、上記した特定の開示された実施形態によって制限されるべきではないことが意図される。さらに、本発明は種々の変更、および代替形態に感受性であるが、その具体例を図面に示し、本明細書で詳細に説明する。しかしながら、本発明は、開示された特定の形態または方法に限定されるものではなく、逆に、本発明は、記載された種々の実施形態および添付の請求の範囲の精神および範囲内に入るすべての変更、同等物および代替物をカバーするものであることが理解されるべきである。本明細書に開示された任意の方法は、列挙された順序で実施される必要はない。本明細書に開示された方法は、熟練者によって行われる特定の行為を含むが、しかしながら、それらは、明示的にまたは黙示的に、それらの行為の任意の第三者の指示を含むこともできる。例えば、「操作されたＮＫ細胞の集団を肝臓に局所的に投与する」といった行為は、「操作されたＮＫ細胞の集団を肝臓に局所的に投与することを指示する」ことを含む。さらに、開示の特徴または態様がマーカッシュ群に関して記載されている場合、当業者は、開示がマーカッシュ群のメンバーの任意の個々のメンバーまたはサブグループに関しても記載されていることを認識する。

【0180】

本明細書に開示された範囲はまた、任意のおよびすべての重なり、サブ範囲、およびそれらの組み合わせを包含する。「最大」、「少なくとも」、「より大きい」、「未満」、「間」などの言語は、列挙された数値を含む。「約」または「およそ」などの用語の前にある数字は、列挙された数字を含む。例えば、「約９０％」は、「９０％」を含む。一部の実施形態では、少なくとも９５％相同性は、参照配列と９６％、９７％、９８％、９９％、および１００％相同性を含む。さらに、配列がヌクレオチドまたはアミノ酸配列を「含む」として開示される場合、このような参照は、別段の指示がない限り、配列が、列挙された配列「を含む」、「からなる」または「から本質的になる」ことも含むものとする。

【0181】

本明細書で使用されるタイトルまたは小見出しはいずれも、整理目的であり、本明細書で開示される実施形態の範囲を制限するために使用されるべきではない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図4-3】

【図4-4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13-1】

【図13-2】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17-1】

【図17-2】

【図17-3】

【図18-1】

【図18-2】

【図18-3】

【図18-4】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27-1】

【図27-2】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32-1】

【図32-2】

【図32-3】

【図32-4】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【配列表】

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