【図1】 異なるコドン最適化ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤコード配列のマルチプルアラインメントを示す。成熟コード配列のみが示されている（シグナルペプチド領域は削除されている）。ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを使用した。

【図2】 ＤＮＡドナーテンプレートの非限定的な例示的設計を示す。

【図3】 Ｈｅｐａ１－６細胞におけるｍＡｌｂ ｇＲＮＡ－Ｔ１の切断効率のＴＩＤＥ解析結果を示す。

【図4】 異なる用量のＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｍＡｌｂ ｇＲＮＡ＿Ｔ１、またはＰＢＳコントロールをカプセル化した脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を投与した３日後における、マウスの肝臓および脾臓におけるＩＮＤＥＬ頻度の結果を示す。群あたりＮ＝５マウス、平均値がプロットされている。

【図5】 実施例４で使用したアルブミンイントロン１への標的化された組み込みのためのＤＮＡドナーテンプレートの設計を示す。ＳＡ：スプライスアクセプター配列、ＬＨＡ：左相同性アーム、ＲＨＡ：右相同性アーム、ｐＡ：ポリアデニル化シグナル、ｇＲＮＡ部位：ｇＲＮＡ標的化Ｃａｓ９ヌクレアーゼによる切断を媒介するｇＲＮＡの標的部位、Δフーリン：ＦＶＩＩＩにおけるフーリン部位の欠失、ＦＶＩＩＩ－ＢＤＤ：ＢドメインがＳＱリンクペプチドで置き換えられているＢドメイン欠失（ＢＤＤ）を伴うヒトＦＶＩＩＩのコード配列。

【図6】 ４名のドナーからの初代ヒト肝細胞におけるヒトアルブミンイントロン１を標的化する７つの候補ｇＲＮＡのＩＮＤＥＬ頻度を示す。

【図7】 異なるアルブミンガイドＲＮＡおよびｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡでトランスフェクトした非ヒト霊長類（サル）初代肝細胞におけるＩＮＤＥＬ頻度を示す。

【図8】 例示的なＡＡＶ－ｍＳＥＡＰドナーカセットの概略図を示す。

【図9】 ＡＡＶへのパッケージングに使用される例示的なＦＶＩＩＩドナーカセットの概略図を示す。

【図10】 血友病Ａマウスの血中ＦＶＩＩＩレベルを、ＡＡＶ８－ｐＣＢ０５６の注射、それに続くｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｍＡｌｂＴ１ガイドＲＮＡをカプセル化したＬＮＰの注射後の時間経過で示す。

【図11】 ｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡをカプセル化したＬＮＰを注射した後１０日目および１７日目の血友病ＡマウスのＦＶＩＩＩレベルを示す。ＬＮＰは、ＡＡＶ８－ｐＣＢ００５６の１７日後または４日後に投与した。

【図12】 ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子および異なるポリアデニル化シグナル配列を含む例示的なプラスミドドナーの概略図を示す。

【図13】 ３つの異なるポリＡシグナル、それに続くＬＮＰカプセル化Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびｍＡｌｂＴ１ ｇＲＮＡによるプラスミドドナーの流体力学的注射後の、マウスにおけるＦＶＩＩＩ活性およびＦＶＩＩＩ活性／標的化された組み込み比を示す。群２、３、および４には、それぞれｐＣＢ０６５、ｐＣＢ０７６、およびｐＣＢ０７７が投与された。表は、個々のマウスについて、１０日目のＦＶＩＩＩ活性の値、標的化された組み込み頻度、およびＦＶＩＩＩ活性／ＴＩ比（比）が含まれる。

【図14】 初代ヒト肝細胞における標的化された組み込みを評価するために使用される例示的なＡＡＶドナーカセットの概略図を示す。

【図15】 ｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｈＡＬｂ４ ｇＲＮＡのリポフェクションを伴うか、または伴わずに、ＡＡＶ－ＤＪ－ＳＥＡＰウイルスで形質導入された初代ヒト肝細胞の培地におけるＳＥＡＰ活性を示す。２つの細胞ドナー（ＨＪＫ、ＯＮＲ）を試験し、黒および白のバーで示される。左側の３対のバーは、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡのみ（最初のバーの対）、１００，０００ＭＯＩのＡＡＶ－ＤＪ－ｐＣＢ０１０７（ＳＥＡＰウイルス）単独（２番目のバーの対）、または１００，０００ＭＯＩのＡＡＶ－ＤＪ－ｐＣＢ０１５６（ＦＶＩＩＩウイルス）単独（３番目のバーの対）でトランスフェクトした細胞のコントロール条件でのＳＥＡＰ活性を表す。右側の４対のバーは、様々なＭＩＯのＡＡＶ－ＤＪ－ｐＣＢ０１０７（ＳＥＡＰウイルス）で形質導入され、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびｈＡｌｂＴ４ ｇＲＮＡでトランスフェクトした細胞のウェルにおけるＳＥＡＰ活性を表す。

【図16】 ｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｈＡＬｂ４ ｇＲＮＡのリポフェクションを伴うか、または伴わずに、ＡＡＶ－ＤＪ－ＦＶＩＩＩウイルスで形質導入された初代ヒト肝細胞の培地におけるＦＶＩＩＩ活性を示す。２つの細胞ドナー（ＨＪＫ、ＯＮＲ）を試験し、黒および白のバーで示される。左側の２対のバーは、１００，０００ＭＯＩのＡＡＶ－ＤＪ－ｐＣＢ０１０７（ＳＥＡＰウイルス）単独（１番目のバーの対）、または１００，０００ＭＯＩのＡＡＶ－ＤＪ－ｐＣＢ０１５６（ＦＶＩＩＩウイルス）単独（２番目のバーの対）で形質導入した細胞のコントロール条件でのＦＶＩＩＩ活性を表す。右側の４対のバーは、様々なＭＩＯのＡＡＶ－ＤＪ－ｐＣＢ０１５６（ＦＶＩＩＩウイルス）で形質導入され、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびｈＡｌｂＴ４ ｇＲＮＡでトランスフェクトした細胞のウェルからの培地におけるＦＶＩＩＩ活性を表す。

【図17A】 血液凝固第ＩＸ因子（Ｆ９、ＦＩＸ）のためのコドン最適化配列を含むＤＮＡテンプレートの非限定的な例示的設計を示す。ｈＦＩＸ ＳＡ：ｈＦＩＸスプライスアクセプター、ｓｐＡ＋：シグナルペプチド、スタッファー：ヒトマイクロサテライト配列に由来するスタッファーフラグメント、１８：１８ｂｐのランダム配列。

【図17B】 アルブミン遺伝子座の第１のイントロンにおける、図１７Ａに記載されたドナーＤＮＡテンプレートの標的化された組み込み効率を図にまとめて示す。

【図18A】 ヒトセルピンＧ１／Ｃ１阻害剤遺伝子（ＳＥＲＰＩＮＧ１）のコード配列を含むＤＮＡテンプレートの非限定的な例示的設計を示す。

【図18B】 アルブミン遺伝子座の第１のイントロンへの挿入後、１１日目に図１８Ａに記載されたドナーＤＮＡテンプレートから発現されたＳＥＲＰＩＮＧ１活性を図にまとめて示す。