特許 7520848 癌および他の疾患の治療のための、クローディン１８．２に特異的な結合分子、その組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-07-12

(45)【発行日】2024-07-23

(54)【発明の名称】癌および他の疾患の治療のための、クローディン１８．２に特異的な結合分子、その組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20240716BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240716BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240716BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28 ZNA

A61K39/395 T

A61P35/00

【請求項の数】 11

(21)【出願番号】P 2021538136

(86)(22)【出願日】2019-12-26

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-28

(86)【国際出願番号】 US2019068591

(87)【国際公開番号】W WO2020139956

(87)【国際公開日】2020-07-02

【審査請求日】2022-12-23

(31)【優先権主張番号】62/786,012

(32)【優先日】2018-12-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】521282099

【氏名又は名称】スパークス・セラピューティクス・インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】グイドン・ジュ

(72)【発明者】

【氏名】ジンドン・イェ

(72)【発明者】

【氏名】ジンドン・チン

(72)【発明者】

【氏名】ジチュン・マ

【審査官】福間 信子

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１５－５１８８３８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１５－５１７４７６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００９－５１７３５４（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

単離された抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
前記抗ＣＬＤＮ１８．２抗体または抗原結合フラグメントは、軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）および重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）を含み、
ここで、前記軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０で示されるＶ_Ｌ－ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３２で示されるＶ_Ｌ－ＣＤＲ２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６１で示されるＶ_Ｌ－ＣＤＲ３を有し、ならびに
前記重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５６で示されるＶ_Ｈ－ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４で示されるＶ_Ｈ－ＣＤＲ２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３５で示されるＶ_Ｈ－ＣＤＲ３を有する
単離された抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項2】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６０で示される軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６２で示される重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）を含む、請求項１に記載の単離された抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項3】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５４で示される軽鎖およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５５で示される重鎖を含む、請求項１に記載の単離された抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項4】

前記単離された抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合フラグメントが、ＥＵスキームに従って番号付けされた、Ｆｃドメインの３５６位のアスパラギン酸（Ｄ）のグルタミン酸（Ｅ）への置換（Ｄ３５６Ｅ）および３５８位のロイシン（Ｌ）のメチオニン（Ｍ）への置換（Ｌ３５８Ｍ）を含む重鎖定常領域を含む、請求項１に記載の単離された抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項5】

前記抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合フラグメントは、
ａ）免疫グロブリンＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤもしくはＩｇＥ分子、または
ｂ）Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ′）_２フラグメントもしくは一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）であり、ここで、前記ｓｃＦｖは、１０～２５個のアミノ酸の短いリンカーペプチドで結合したＶ_ＨおよびＶ_Ｌを含む、
請求項１に記載の単離された抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項6】

ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞の増殖を阻害するか、および／またはＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞を死滅するための薬物製剤であって、
有効量の請求項１～５のいずれか１項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、薬物製剤。

【請求項7】

被験者におけるＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞に関する疾患または病症を治療または予防するための薬物製剤であって、
有効量の請求項１～５のいずれか１項に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、薬物製剤。

【請求項8】

前記疾患または病症は、胃がん、食道がん、膵臓がん、肺がん、卵巣がん、結腸がん、肝臓がん、頭頚部がんおよび胆嚢がんから選択される腫瘍に関連する疾患または病症である、
請求項７に記載の薬物製剤。

【請求項9】

前記被験者は、抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１または抗ＣＴＬＡ４治療法を受けている、受けた、または受ける予定であり、かつ
前記抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１または抗ＣＴＬＡ４治療法は、抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１もしくは抗ＣＴＬＡ４抗体、またはそれぞれの抗原結合フラグメントを投与するステップを含む、
請求項７に記載の薬物製剤。

【請求項10】

前記抗ＰＤ－１抗体は、ペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）、ランブリズマブ（ｌａｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ＭＫ－３４７５）、ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＡ（登録商標）、ＢＭＳ－９３６５５８、ＭＤＸ－１１０６、ＯＮＯ－４５３８）、ＡＭＰ－２２４、またはそれぞれの抗原結合フラグメントである、あるいは
前記抗ＣＴＬＡ４抗体は、イピリムマブ、トレメリムマブ（チシリムマブ（ｔｉｃｉｌｉｍｕｍａｂ）、ＣＰ－６７５，２０６）、またはそれぞれの抗原結合フラグメントである、
請求項９に記載の薬物製剤。

【請求項11】

有効量の抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合フラグメントをさらに含む、請求項７に記載の薬物製剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

〔関連出願の相互参照〕
本特許文書は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づいて２０１８年１２月２８日に提出した仮米国特許出願第６２／７８６０１２号の出願日の権益を要求し、これは、参照により本明細書に引用される。
〔ＥＦＳ－ＷＥＢを介して提出された配列表を参照〕

【0002】

本発明は、ＥＦＳ－Ｗｅｂで電子的に提出され、かつ「．ｔｘｔ」フォーマットで電子的に提出された配列表を含む。当該「．ｔｘｔ」ファイルには、タイトルが「１６５６５＿４＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ」である配列表を含まれ、２０１９年１２月２６日に作成され、大きさは、５２９ＫＢ（５４２５４５バイト）である。当該「．ｔｘｔ」ファイルに含まれる配列表は、明細書の一部であり、その全内容は、参照により本明細書に引用される。

【背景技術】

【0003】

胃がんは、世界で最も一般的な癌の一つであり、先進国では、これは、それぞれ男性と女性の癌関連死亡の最大の原因の４番目と５番目である（Ｒａｗｌａ Ｐ．ら、Ｐｒｚｅｇｌａｄ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｉｃｚｎｙ、２０１９、１４：２６）。２０１７年には、推定１２２万人の新しい胃がん病例および８８５０００人の死亡が発生し、これは、アンメットメディカルニーズの高い悪性腫瘍になった（Ｅｔｅｍａｄｉ Ａ．ら、Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ＆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２０１９年１０月２１日（ＤＯＩ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／Ｓ２４６８－１２５３（１９）３０３２８－０））。胃がんは、世界で３番目の癌による死亡の最大の原因である。食道がんの発生率は、増加しており、食道腺がんを主な形態として、組織型と原発腫瘍との位置が変化している。いくつかの化学治療法が承認されたという事実にもかかわらず、転移性胃がんの５年全生存率は、約５％である。

【0004】

局所進行性または転移性疾患があるほとんどの患者は、第３の化合物（例えば、タキサンまたはアントラサイクリン系）と併用する、プラチナおよびフルオロピリミジン誘導体骨格に基づく化学治療法を受ける。これらの標準治療プログラム（ＳＯＣ）を使用すると、無増悪生存期間の中央値は、５～７か月と予想され、全体的な生存期間の中央値は、９～１１か月である。最近、さらにいくつかの標的治療法が登場した。例えば、トラスツズマブは、ＨＥＲ２陽性胃食道がんに使用されるように承認された。ペムブロリズマブは、ＰＤ－Ｌ１陽性および高マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）またはミスマッチ修復欠損（ｄＭＭＲ）胃食道がんに使用されるように承認された。しかしながら、一部の患者のみがこれらの標的を発現し、ほとんどの患者は、これらの狭い標的治療法の恩恵を受けることができない。

【0005】

クローディンタンパク質ファミリーは、哺乳動物において少なくとも２７個のメンバー分子を有する（Ｆｕｒｕｓｅ Ｍ．ら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１９９８、１４１、１５３９）。これらの密着結合分子は、脊椎動物の上皮細胞シート中の傍細胞バリアに不可欠である。クローディン１８分子は、四つの膜貫通疎水性領域および二つの細胞外ループを含む、完全な膜貫通タンパク質である。クローディン１８は、二つの異なるスプライス変異体で存在する。アイソタイプ１（クローディン１８．１またはＣＬＤＮ１８．１）は、正常な肺細胞で選択的に発現し、アイソタイプ２（クローディン１８．２またはＣＬＤＮ１８．２）は、癌に関連するスプライス変異体であると考えられる（Ｓａｎａｄａ Ｙ．ら、Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．、２００６、２０８、６３３）。

【0006】

クローディン１８．２は、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ、２５％）、胃がん（７０％）、膵臓がん（５０％）および食道がん（３０％）で過剰発現している、ＣＤ２０様分化タンパク質である。当該タンパク質の発現は、民族的背景の影響を受け、日本人患者で観察された発現レベルは、白人患者よりも高い。クローディン１８．２は、卵巣がん、乳がんおよび頭頚部腫瘍でも異所性に発現する（Ｓａｈｉｎ Ｕ．ら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００８、１４、７６２４）。リンパ節および胃がんの遠隔転移でクローディン１８．２を検出することができる。正常な組織での発現は、胃粘膜の一過性に分化した上皮細胞に厳密に限定される。

【0007】

クローディン１８．２は、腫瘍形成および腫瘍微小環境の維持に複雑な役割を果たしている可能性がある。ＥＧＦＲ／ＥＲＫシグナル伝達は、インビボでの細胞増殖、浸潤および腫瘍形成に関与する、胆管腫瘍に関連するクローディン１８の発現を誘導することが見出された（Ｋｕｍｉ Ｔ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．、２０１７、４０３、６６）。クローディン－１８は、ＰＩ３Ｋ／ＰＤＫ１／ＡＫＴシグナル伝達経路を阻害することによって媒介される肺上皮細胞の異常な増殖および運動を阻害することも報告された（Ｓｈｕｎ Ｓ．ら、Ｂｉｏ Ｂｉｏｐｈ Ａｃｔａ（ＢＢＡ）－Ｍｏｌｅ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ、２０１６、１８６３、１１７０）。クローディン１８．２ノックアウトマウスにおいて、傍細胞バリアが損なわれて、壁細胞から分泌されたＨ＋イオンが胃上皮を通じて胃腔に浸透し、その後胃のｐＨ値を低下させる。ノックアウトマウス中の慢性胃炎は、高レベルの炎症細胞および鎮痙性ポリペプチドを発現する化生（ＳＰＥＭ）細胞を生成する。炎症細胞の炎症は、様々な炎症前マーカー（例えば、ＩＬ－１βおよびＴＮＦ－α）の高発現を特徴としている（Ｈａｙａｓｈｉ Ｄ．、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、２０１２、１４２、２９２）。

【0008】

腫瘍形成および腫瘍微小環境におけるクローディン１８．２の生物学的機能は未だに不明ですが、クローディン１８．２の発現は、胃がんの形質転換において保持されかつ食道がん、膵臓腺がんおよび胆管がん等を含む様々な新生物で異常に活性化されることは明らかである（Ｍｉｃｋｅ Ｐ．ら、Ｉｎｔｌ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ、２０１４、１３５、２２０６）。クローディン１８．２の露出した細胞外ループは、モノクローナル抗体の結合に使用することができ、腫瘍細胞の表面にあるクローディン１８．２に結合する適切な抗体は、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）効果を通じて腫瘍細胞を死滅することができる。抗クローディン１８．２化合物は、アポトーシスを誘導しかつ細胞増殖を阻害することもできる。化学治療法と併用する場合、それらは、Ｔ細胞の浸潤を増強かつ炎症性サイトカインを誘導することができる。

【0009】

従って、クローディン１８．２は、例えば、胃がん、食道がん、膵臓がん、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、卵巣がん、結腸がん、肝臓がん、頭頚部がんおよび胆嚢がんとその転移等のいくつかの原発性腫瘍、特に、例えば、クルケンベルグ腫瘍（Ｋｒｕｋｅｎｂｅｒｇ ｔｕｍｏｒｓ）、腹膜転移およびリンパ節転移等の胃がん転移を予防および／または治療するための有用な標的である。

【0010】

ＩＭＡＢ３６２（クローデキシマブ、ゾルベツキシマブ（Ｚｏｌｂｅｔｕｘｉｍａｂ））は、クローディン１８．２の１番目の細胞外ドメインを選択的に標的化しかつクローディン１８の密接に関連するスプライス変異体１に対して最小限の活性を有する、ＩｇＧ１サブタイプのキメラモノクローナル抗体である（米国特許第８１６８４２７号）。クローディン１８．２を発現するヒト異種移植片において、ＩＭＡＢ３６２の投与後、マウスで延命効果および腫瘍退縮が観察された。投与量決定の第Ｉ相試験において、単回投与量が最大１０００ｍｇ／ｍ^２に達する場合、投与量制限毒性は観察されなかった。ＩＩａ相試験において、ＩＭＡＢ３６２は、１０％の応答率および３０％の病勢コントロール率を示し、かつすべての有害事象は、グレード１～３である。その後のＩＩｂ相臨床試験において、ＥＯＸ単独（中央値７．９ｖｓ４．８か月、ＨＲ０．４７、ｐ＝０．０００１）と比較して、ＩＭＡＢ３６２とＥＯＸ（エピルビシン５０ｍｇ／ｍ^２、オキサリプラチン１３０ｍｇ／ｍ^２ｄ１およびカペシタビン６２５ｍｇ／ｍ^２ｂｉｄ、ｄ１～２１、２１日ごと）との併用により、無増悪生存期間（ＰＦＳ）が大幅に改善され、試験の主要終了点に到達した。ＥＯＸ単独と比較して、当該治療法は、全生存期間（ＯＳ、中央値１３．３ｖｓ８．４か月、ＨＲ０．５１、ｐ＜０．００１）も改善した。クローディン１８．２の発現が非常に高い患者のサブグループ分析（≧７０％の腫瘍細胞で≧２＋強度）は、より明白な結果を示した（ＰＦＳ、７．２ｖｓ５．６か月、ＨＲ０．３６、ｐ＝０．０００５、ＯＳ、１６．７ｖｓ９．０か月、ＨＲ０．４５、ｐ＜０．０００５）。ＩＭＡＢ３６２が投与された患者は、ＥＯＸグループの２５％（Ｐｒａｂｈｓｉｍｒａｎｊｏｔ Ｓ．ら、Ｊ．Ｈｅｍ．Ｏｎｃ．、２０１７、１０５）と比較して、３９％というより高い客観的応答率（ＯＲＲ）をさらに示した。

【0011】

レンチウイルスベクターの形質導入を介して、ヒト化クローディン１８．２に特異的なｈｕ８Ｅ５およびｈｕ８Ｅ５－２Ｉ一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）をキメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ Ｔ）細胞に組み込む。これらのＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＤ２８共刺激ドメインを含み、癌細胞株の異種移植マウスモデルにおける腫瘍増殖を効果的に阻害する。ｈｕ８Ｅ５－２Ｉ－２８Ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞で治療されたクローディン１８．２陽性胃がんＰＤＸモデルにおいて、部分的または完全な腫瘍除去が観察され、前記ｈｕ８Ｅ５－２Ｉ－２８Ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞は、体内によく存在し、かつ腫瘍組織に効果的に浸潤される。有効量下のマウスにおいて、胃組織を含む正常な臓器への明らかな有害作用（Ｈｕａ Ｊ．ら、Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．、２０１９、１１１）は観察されなかった。

【0012】

ほとんどの癌の病因は、複数の異なる遺伝的変異、後成遺伝学的変化および分子シグナル伝達経路の機能不全に関連する。同様に、癌は、代替メカニズムを得ることによってほとんどすべての治療に対する耐性を発達させる。従って、癌の誘発または細胞の維持の経路を特異的に標的とする二つまたはそれ以上の治療法の組み合わせは、癌治療の基礎である。標的治療法の現代的組み合わせは、活発に増殖している細胞を非選択的に標的とする従来の単剤治療法技術とは異なり、後者は、最終的に健康な細胞および癌細胞の破壊を引き起こす。理想的には、組み合わせは、使用される個々の薬物のそれぞれよりも低い治療用量で相乗的または相加的に機能する。例えば、ヒト上皮増殖因子受容体２型（ＨＥＲ２）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、インスリン様増殖因子受容体、ホスファチジルイノミトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／タンパク質キナーゼＢ（ＡＫＴ）／哺乳動物ラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）経路、ｃ－ＭＥＴ、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）、ポリ［アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）］－リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）および免疫チェックポイント等の阻害剤のような胃がんの治療剤として、様々な発癌経路を標的とするいくつかの標的治療法が研究されている。

【0013】

近年、免疫治療法は、転移性癌の治療を完全に変え、かつ抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＣＴＬＡ４抗体、ＣＡＲ－Ｔ治療、腫瘍溶解性ウイルスおよびＴ細胞エンゲージャー等を含む、いくつかのタイプの免疫治療法が承認された。これらの承認は、細胞毒性Ｔ細胞が免疫系の最も効果的なエフェクター細胞であるという臨床的検証を提供する。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0014】

従って、本発明の目的は、膜タンパク質クローディン１８．２に特異的に結合しかつクローディン１８．２を発現する、例えば、胃がん、食道がん、膵臓がん、肺がん、卵巣がん、結腸がん、肝臓がん、頭頚部がんおよび胆嚢がん等の腫瘍関連疾患を含む、細胞関連疾患を治療および／または予防する治療剤として使用されることができる抗体または抗体フラグメントを提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0015】

本発明の一態様は、抗クローディン１８．２分子を様々な発癌経路阻害剤と組み合わせることである。
本発明の別の態様において、前記ＣＬＤＮ１８．２－結合分子（例えば、抗体）またはその抗原結合フラグメントを使用することであり、ここで、被験者は、抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１または抗ＣＴＬＡ４治療法を含む免疫治療法を受けている、受けたまたは受ける予定である。

【0016】

従って、一実施形態は、抗体軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）および抗体重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）を含む、クローディン１８．２に結合する単離された抗体またはその抗体フラグメントに関し、ここで、軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）は、
［ＦＷ１］Ｘ_１Ｘ_２ＳＸ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｘ_１１Ｘ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４Ｘ_１５Ｘ_１６［ＦＷ２］Ｘ_１７Ｘ_１８Ｘ_１９Ｘ_２０Ｘ_２１Ｘ_２２Ｘ_２３［ＦＷ３］Ｘ_２４Ｘ_２５Ｘ_２６Ｘ_２７Ｘ_２８Ｘ_２９ＰＸ_３０Ｔ［ＦＷ４］（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ３６２：）のアミノ酸配列を含み、ここで、［ＦＷ１］、［ＦＷ２］、［ＦＷ３］および［ＦＷ４］は、ＶＬフレームワーク領域を表し、ここで、
Ｘ_１は、アミノ酸残基であるイソロイシン（Ｉ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）またはリジン（Ｋ）を表し、ここで、リジン（Ｋ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_２は、アミノ酸残基であるスレオニン（Ｔ）、アラニン（Ａ）またはセリン（Ｓ）を表し、ここで、セリン（Ｓ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_３は、アミノ酸残基であるスレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）またはグルタミン（Ｑ）を表し、ここで、グルタミン（Ｑ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_４は、アミノ酸残基であるアスパラギン酸（Ｄ）、セリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）を表し、ここで、セリン（Ｓ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_５は、アミノ酸残基であるイソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）またはロイシンを表し、ここで、ロイシン（Ｌ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_６は、結合、またはバリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）またはフェニルアラニン（Ｆ）を含むアミノ酸残基を表し、ここで、ロイシン（Ｌ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_７は、結合、またはヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン（Ｎ）を含むアミノ酸残基を表し、ここで、アスパラギン（Ｎ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_８は、結合、またはセリン（Ｓ）、トリプトファン（Ｗ）またはグリシン（Ｇ）を含むアミノ酸残基を表し、ここで、セリン（Ｓ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_９は、結合、またはグリシン（Ｇ）を含むアミノ酸残基を表し、ここで、グリシン（Ｇ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Χ_１０は、結合、またはアスパラギン（Ｎ）を含むアミノ酸残基を表し、ここで、アスパラギン（Ｎ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Χ_１１は、結合、またはグリシン（Ｇ）、グルタミン（Ｑ）またはロイシン（Ｌ）を含むアミノ酸残基を表し、ここで、グルタミン（Ｑ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_１２は、結合、またはアスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）を含むアミノ酸残基を表し、ここで、リジン（Ｋ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_１３は、アミノ酸残基であるアスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）を表し、ここで、セリン（Ｓ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_１４は、アミノ酸残基であるアスパラギン酸（Ｄ）またはチロシン（Ｙ）を表し、ここで、チロシン（Ｙ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_１５は、アミノ酸残基であるメチオニン（Ｍ）またはロイシン（Ｌ）を表し、ここで、ロイシン（Ｌ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_１６は、アミノ酸残基であるアスパラギン（Ｎ）、チロシン（Ｙ）、ヒスチジン（Ｈ）、グルタミン（Ｑ）、スレオニン（Ｔ）またはアラニン（Ａ）を表し、ここで、スレオニン（Ｔ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_１７は、アミノ酸残基であるグルタミン酸（Ｅ）、チロシン（Ｙ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グリシン（Ｇ）、リジン（Ｋ）またはトリプトファン（Ｗ）を表し、ここで、トリプトファン（Ｗ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_１８は、アミノ酸残基であるグリシン（Ｇ）、スレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）またはアラニン（Ａ）を表し、ここで、アラニン（Ａ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_１９は、アミノ酸残基であるアスパラギン（Ｎ）またはセリン（Ｓ）を表し、ここで、セリン（Ｓ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_２０は、アミノ酸残基であるスレオニン（Ｔ）またはアスパラギン（Ｎ）を表し、ここで、スレオニン（Ｔ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_２１は、アミノ酸残基であるロイシン（Ｌ）またはアルギニン（Ｒ）を表し、ここで、ロイシン（Ｌ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_２２は、アミノ酸残基であるアルギニン（Ｒ）、アラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）を表し、ここで、グルタミン酸（Ｅ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_２３は、アミノ酸残基であるプロリン（Ｐ）またはセリン（Ｓ）を表し、ここで、セリン（Ｓ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_２４は、アミノ酸残基であるロイシン（Ｌ）、グルタミン（Ｑ）、ヒスチジン（Ｈ）またはフェニルアラニン（Ｆ）を表し、ここで、グルタミン（Ｑ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Χ_２５は、アミノ酸残基であるグルタミン（Ｑ）またはアスパラギン（Ｎ）を表し、ここで、アスパラギン（Ｎ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Χ_２６は、アミノ酸残基であるセリン（Ｓ）、フェニルアラニン（Ｆ）、アルギニン（Ｒ）、トリプトファン（Ｗ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）またはバリン（Ｖ）を表し、ここで、アラニン（Ａ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_２７は、アミノ酸残基であるアスパラギン酸（Ｄ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）またはチロシン（Ｙ）を表し、ここで、チロシン（Ｙ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_２８は、アミノ酸残基であるアスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、ヒスチジン（Ｈ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン酸（Ｅ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、フェニルアラニン（Ｆ）、アラニン（Ａ）、イソロイシン（Ｉ）を表し、ここで、セリン（Ｓ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_２９は、アミノ酸残基であるロイシン（Ｌ）、セリン（Ｓ）、チロシン（Ｙ）、アスパラギン（Ｎ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）を表し、ここで、フェニルアラニン（Ｆ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_３０は、結合、またはトリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、ロイシン（Ｌ）またはフェニルアラニン（Ｆ）を含むアミノ酸残基を表し、ここで、フェニルアラニン（Ｆ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、および
ここで、重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）は、
［ＦＷ１］Ｘ_３１Ｘ_３２Ｘ_３３Ｘ_３４Ｘ_３５Ｘ_３６Ｘ_３７Ｘ_３８Ｘ_３９Ｘ_４０Ｘ_４１［ＦＷ２］Ｘ_４２ＩＸ_４３Ｘ_４４Ｘ_４５Ｘ_４６Ｘ_４７Ｘ_４８Ｘ_４９Ｘ_５０Ｘ_５１Ｘ_５２Ｘ_５３Ｘ_５４Ｘ_５５Ｘ_５６Ｘ_５７［ＦＷ３］Ｘ_５８Ｘ_５９Ｘ_６０Ｘ_６１Ｘ_６２Ｘ_６３Ｘ_６４Ｘ_６５Ｘ_６６Ｘ_６７Ｘ_６８［ＦＷ４］（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ３６３：）のアミノ酸配列を含み、ここで、［ＦＷ１］、［ＦＷ２］、［ＦＷ３］および［ＦＷ４］は、ＶＨフレームワーク領域を表し、ここで、
Ｘ_３１は、アミノ酸残基であるアスパラギン酸（Ｄ）、グリシン（Ｇ）、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）を表し、ここで、グリシン（Ｇ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_３２は、アミノ酸残基であるチロシン（Ｙ）またはフェニルアラニン（Ｆ）を表し、ここで、チロシン（Ｙ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_３３は、アミノ酸残基であるセリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）またはアラニン（Ａ）を表し、ここで、スレオニン（Ｔ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_３４は、アミノ酸残基であるイソロイシン（Ｉ）またはフェニルアラニン（Ｆ）を表し、ここで、フェニルアラニン（Ｆ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_３５は、アミノ酸残基であるスレオニン（Ｔ）またはセリン（Ｓ）を表し、ここで、セリン（Ｓ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_３６は、結合、またはアルギニン（Ｒ）を含むアミノ酸残基を表し、ここで、結合は、いくつかの実施形態において好ましいものであり、
Ｘ_３７は、結合、またはグリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、セリン（Ｓ）またはアスパラギン（Ｎ）を含むアミノ酸残基を表し、ここで、結合は、いくつかの実施形態において好ましいものであり、
Ｘ_３８は、結合、またはフェニルアラニン（Ｆ）またはチロシン（Ｙ）を含むアミノ酸残基を表し、ここで、結合は、いくつかの実施形態において好ましいものであり、
Ｘ_３９は、結合、またはアスパラギン（Ｎ）、リジン（Ｋ）、トリプトファン（Ｗ）、ロイシン（Ｌ）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）またはアラニン（Ａ）を含むアミノ酸残基を表し、ここで、結合は、いくつかの実施形態において好ましいものであり、
Χ_４０は、アミノ酸残基であるトリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）またはイソロイシン（Ｉ）を表し、ここで、メチオニン（Ｍ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Χ_４１は、アミノ酸残基であるヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）またはアスパラギン（Ｎ）を表し、ここで、アスパラギン（Ｎ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_４２は、アミノ酸残基であるチロシン（Ｙ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、セリン（Ｓ）またはトリプトファン（Ｗ）を表し、ここで、トリプトファン（Ｗ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_４３は、アミノ酸残基であるヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン（Ｎ）、ロイシン（Ｌ）またはセリン（Ｓ）を表し、ここで、アスパラギン（Ｎ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_４４は、結合、またはプロリン（Ｐ）、アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、メチオニン（Ｍ）またはスレオニン（Ｔ）を含むアミノ酸残基を表し、ここで、メチオニン（Ｍ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_４５は、アミノ酸残基であるチロシン（Ｙ）、アスパラギン（Ｎ）、グリシン（Ｇ）またはロイシン（Ｌ）を表し、ここで、チロシン（Ｙ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_４６は、結合、またはセリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）またはスレオニン（Ｔ）を含むアミノ酸残基を表し、ここで、スレオニン（Ｔ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_４７は、アミノ酸残基であるグリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、チロシン（Ｙ）またはセリン（Ｓ）を表し、ここで、グリシン（Ｇ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_４８は、アミノ酸残基であるセリン（Ｓ）、グリシン（Ｇ）、プロリン（Ｐ）、スレオニン（Ｔ）、アラニン（Ａ）またはグルタミン酸（Ｅ）を表し、ここで、グルタミン酸（Ｅ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_４９は、アミノ酸残基であるスレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）またはグルタミン（Ｑ）を表し、ここで、プロリン（Ｐ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_５０は、アミノ酸残基であるアスパラギン（Ｎ）、イソロイシン（Ｉ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、チロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）、スレオニン（Ｔ）を表し、ここで、スレオニン（Ｔ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_５１は、アミノ酸残基であるチロシン（Ｙ）またはセリンを表し、ここで、チロシン（Ｙ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_５２は、アミノ酸残基であるアスパラギン（Ｎ）、スレオニン（Ｔ）、アラニン（Ａ）またはプロリン（Ｐ）を表し、ここで、アラニン（Ａ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_５３は、アミノ酸残基であるプロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）を表し、ここで、アスパラギン酸（Ｄ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_５４は、アミノ酸残基であるセリン（Ｓ）、リジン（Ｋ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）を表し、ここで、アスパラギン酸（Ｄ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_５５は、アミノ酸残基であるロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）またはバリン（Ｖ）を表し、ここで、フェニルアラニン（Ｆ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_５６は、アミノ酸残基であるリジン（Ｋ）またはスレオニン（Ｔ）を表し、ここで、リジン（Ｋ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Χ_５７は、アミノ酸残基であるセリン（Ｓ）、グリシン（Ｇ）またはバリン（Ｖ）を表し、ここで、グリシン（Ｇ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Χ_５８は、アミノ酸残基であるアスパラギン酸（Ｄ）、セリン（Ｓ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、アスパラギン（Ｎ）、ヒスチジン（Ｈ）、フェニルアラニン（Ｆ）、ロイシン（Ｌ）、スレオニン（Ｔ）、アルギニン（Ｒ）、アラニン（Ａ）またはメチオニン（Ｍ）を表し、ここで、ロイシン（Ｌ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_５９は、アミノ酸残基であるチロシン（Ｙ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）、フェニルアラニン（Ｆ）、スレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）またはメチオニン（Ｍ）を表し、ここで、チロシン（Ｙ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_６０は、結合、またはチロシン（Ｙ）またはスレオニン（Ｔ）を含むアミノ酸残基を表し、ここで、結合は、いくつかの実施形態において好ましいものであり、
Ｘ_６１は、アミノ酸残基であるチロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）、アスパラギン（Ｎ）、アルギニン（Ｒ）、スレオニン（Ｔ）、プロリン（Ｐ）、リジン（Ｋ）、アラニン（Ａ）またはメチオニン（Ｍ）を表し、ここで、アスパラギン（Ｎ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_６２は、アミノ酸残基であるグリシン（Ｇ）、チロシン（Ｙ）またはアスパラギン酸（Ｄ）を表し、ここで、グリシン（Ｇ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_６３は、結合、またはチロシン（Ｙ）を含むアミノ酸残基を表し、ここで、結合は、いくつかの実施形態において好ましいものであり、
Ｘ_６４は、結合、またはアスパラギン（Ｎ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン酸（Ｄ）またはバリン（Ｖ）を含むアミノ酸残基を表し、ここで、アスパラギン（Ｎ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_６５は、結合、またはセリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）、スレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）またはグリシン（Ｇ）を含むアミノ酸残基を表し、ここで、セリン（Ｓ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_６６は、結合、またはフェニルアラニン（Ｆ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）またはイソロイシン（Ｉ）を含むアミノ酸残基を表し、ここで、ロイシン（Ｌ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_６７は、結合、またはアラニン（Ａ）またはアスパラギン酸（Ｄ）を含むアミノ酸残基を表し、ここで、アスパラギン酸（Ｄ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基であり、
Ｘ_６８は、アミノ酸残基であるチロシン（Ｙ）またはアスパラギン酸（Ｄ）を表し、ここで、チロシン（Ｙ）は、いくつかの実施形態において最も保存的で好ましい残基である。

【0017】

別の実施形態は、ａ）免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｇ_１－４、ＩｇＭ、ＩｇＡ_１－２、ＩｇＤもしくはＩｇＥ分子、またはｂ）一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ′）_２フラグメントおよび一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）であり、ここで、免疫グロブリンの重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）および軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）は、１０～約２５個のアミノ酸の短いリンカーペプチドに結合する、抗体または抗体フラグメントに関する。

【0018】

別の実施形態は、ＣＬＤＮ１８．２に結合しかつＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞の死滅を媒介することができる、抗体または抗体フラグメントに関する。

【0019】

別の実施形態は、単離された抗体またはその抗体フラグメントに関し、ここで、死滅細胞は、前記単離された抗体またはその抗体フラグメントが細胞で発現されるＣＬＤＮ１８．２に結合されることにより誘導される。

【0020】

別の実施形態は、単離された抗体またはその抗体フラグメントに関し、ここで、前記抗体またはその抗体フラグメントは、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）媒介性溶解、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）媒介性溶解、アポトーシス、ホモタイプ接着または食作用中の少なくとも一つを誘導することにより細胞の死滅を媒介する。

【0021】

さらに別の実施形態は、ＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する単離された抗体またはその抗体フラグメントに関し、ＶＬおよびＶＨを含み、前記ＶＬおよびＶＨは、ＶＬ－ＣＤＲ１、ＶＬ－ＣＲＤ２、ＶＬ－ＣＤＲ３、ＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２およびＶＨ－ＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、前記ＶＬ－ＣＤＲ１、ＶＬ－ＣＲＤ２、ＶＬ－ＣＤＲ３、ＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２およびＶＨ－ＣＤＲ３アミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、８、９、１１、１２および１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、１６、１７、１９、２０および２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、１６、２４、２６、２７および２８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、１６、３１、３３、３４および３５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４、４５、４６、４８、４９および５０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２、４５、５３、５５、５６および５０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８、５９、６０、３３、６２および６３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５、６６、６７、６９、７０および７１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３、７４、７５、４８、７７および５０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９、８０、８１、８３、８４および８５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７、４５、８８、９０、９１および９２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４、４５、９５、９７、９８および９９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７、４５、１０１、１０３、１０４および１０５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７、４５、１０８、９０、９１および９２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１、４５、１１２、１１４、１１５および１１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８、１１９、１２０、１２２、１２３および１２４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、４５、１２６、９０、１２８および１２９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、１３２、１３３、３３、３４および１３５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、１３２、１３３、１５６、３４および１３５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、１３２、１５８、１５６、３４および１３５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、１３２、１６１、１５６、３４および１３５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、１３２、１６４、１５６、３４および１３５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、１３２、１６７、１５６、３４および１３５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、１３２、１７０、１５６、３４および１３５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、１３２、１７３、１５６、３４および１３５、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：３０、１３２、１７３、１５６、３４および１７７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、１３２、１５８、１５６、３４および１７７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、１３２、１７３、１５６、３４および１８２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、１３２、１６１、１５６、３４および１８５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、１３２、１３３、１５６、３４および１８８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、１３２、１３３、１５６、３４および１９０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、１３２、１３３、１５６、３４および１９２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、１３２、１３３、１５６、３４および１９４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、１３２、１３３、１５６、３４および１９６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、１３２、１３３、１５６、３４および１９８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、１３２、１３３、１５６、３４および２００、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、１３２、１３３、１５６、３４および２０２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、１３２、１３３、１５６、３４および２０４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、１３２、１３３、１５６、３４および２０６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、１３２、１３３、１５６、３４および２０８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、１３２、１３３、１５６、３４および２１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、１３２、１３３、１５６、３４および２１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、１３２、１３３、１５６、３４および２１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、１３２、１３３、１５６、３４および２１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、１３２、１３３、１５６、３４および２１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、１３２、１３３、１５６、３４および２２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、１３２、１５６、１５６、３４および１３５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、１３２、１５６、１５６、３４および１７７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、１３２、１６１、１５６、３４および１７７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、１３２、１５６、１５６、３４および２２７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、１３２、１３３、１５６、３４および２３０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、１３２、１３３、１５６、３４および２３３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、１３２、１３３、１５６、３４および２３６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３８、２３９、１３３、１５６、２４１および１３５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３８、２４
３、１３３、１５６、２４５および１３５、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３８、２４７、１３３、１５６、２４９および１３５と一致するか、あるいは一つまたは複数のＣＤＲ中の三つ、二つまたは一つのアミノ酸での置換を除いて一致する。

【0022】

別の実施形態は、ＣＬＤＮ１８．２に結合する単離された抗体またはそのフラグメントに関し、少なくとも一つの軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）および少なくとも一つの重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）を含み、ここで、軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、１４、２２、２９、４３、５１、５７、６４、７２、７８、８６、９３、１００、１０６、１１０、１１７、１２５、１３０、１３１、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５７、１６０、１６３、１６６、１６９、１７２、１７５、１７８、１８０、１８３、１８６、２２１、２２４、２２８、２３１、２３４、２３７、２４２または２４６のアミノ酸配列を含み、ここで、重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、１８、２５、３２、４７、５４、６１、６８、７６、８２、８９、９６、１０２、１０９、１１３、１２１、１２７、１３４、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５９、１６２、１６５、１６８、１７１、１７４、１７６、１７９、１８１、１８４、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２２、２２３、２２５、２２６、２２９、２３２、２３５、２４０、２４４または２４８から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0023】

別の実施形態は、ＣＬＤＮ１８．２に結合する単離された抗体に関し、実質的に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５０および２５１、２５２および２５３、２５４および２５５、２５６および２５７、２５８および２５９、２６０および２６１、２６２および２６３、２６４および２６５、２６６および２６７、２６８および２６９、２７０および２７１、２７２および２７３、２７４および２７５、２７６および２７７、２７８および２７９、２８０および２８１、２８２および２８３、２８４および２８５、２８６および２８７、２８８および２８９、２９０および２９１、２９２および２９３、２９４および２９５、２９６および２９７、２９８および２９９、３００および３０１、３０２および３０３、３０４および３０５、３０６および３０７、３０８および３０９、３１０および３１１、３１２および３１３、３１４および３１５、３１６および３１７、３１８および３１９、３２０および３２１、３２２および３２３、３２４および３２５、３２６および３２７、３２８および３２９、３３０および３３１、３３２および３３３、３３４および３３５、３３６および３３７、３３８および３３９、３４０および３４１、３４２および３４３、３４４および３４５、３４６および３４７、３４８および３４９、３５０および３５１、３５２および３５３、３５４および３５５、３５６および３５７、３５８および３５９、３６０および３６１のアミノ酸配列からなる軽鎖および重鎖を含む。

【0024】

一態様において、抗体またはその抗体フラグメントを説明し、ここで、抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、アミノ酸配列を有し、前記アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、１４、２２、２９、４３、５１、５７、６４、７２、７８、８６、９３、１００、１０６、１１０、１１７、１２５、１３０、１３１、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５７、１６０、１６３、１６６、１６９、１７２、１７５、１７８、１８０、１８３、１８６、２２１、２２４、２２８、２３１、２３４、２３７、２４２または２４６から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも約９０％～約１００％の同一性を有する。

【0025】

別の態様において、単離された結合分子（例えば、抗体）またはその抗原結合フラグメントを説明し、ここで、抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）は、アミノ酸配列を有し、前記アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、１８、２５、３２、４７、５４、６１、６８、７６、８２、８９、９６、１０２、１０９、１１３、１２１、１２７、１３４、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５９、１６２、１６５、１６８、１７１、１７４、１７６、１７９、１８１、１８４、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２２、２２３、２２５、２２６、２２９、２３２、２３５、２４０、２４４または２４８から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも約９０％～約１００％の同一性を有する。

【0026】

別の態様において、ＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントを説明し、ここで、抗体または抗原結合フラグメントは、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を有し、前記軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、１４、２２、２９、４３、５１、５７、６４、７２、７８、８６、９３、１００、１０６、１１０、１１７、１２５、１３０、１３１、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５７、１６０、１６３、１６６、１６９、１７２、１７５、１７８、１８０、１８３、１８６、２２１、２２４、２２８、２３１、２３４、２３７、２４２または２４６から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも約９０％～約１００％一致する配列を有し、ここで、抗体または抗原結合フラグメントは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を有し、前記重鎖可変ドメイン（ＶＨ）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、１８、２５、３２、４７、５４、６１、６８、７６、８２、８９、９６、１０２、１０９、１１３、１２１、１２７、１３４、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５９、１６２、１６５、１６８、１７１、１７４、１７６、１７９、１８１、１８４、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２２、２２３、２２５、２２６、２２９、２３２、２３５、２４０、２４４または２４８から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも約９０％～約１００％一致する配列を有する。

【0027】

別の態様において、抗体またはその抗体フラグメントを説明し、実質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５４からなる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、および実質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５５からなる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を有する。

【0028】

別の態様において、抗体またはその抗体フラグメントを説明し、実質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６０からなる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、および実質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６２からなる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を有する。

【0029】

別の態様において、抗体またはその抗体フラグメントを説明し、実質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３１からなる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、および実質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３２からなる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を有する。

【0030】

別の態様において、抗体またはその抗体フラグメントを説明し、実質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３７からなる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、および実質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４０からなる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を有する。

【0031】

別の態様において、抗体またはその抗体フラグメントを説明し、実質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４２からなる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、および実質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４４からなる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を有する。

【0032】

別の態様において、本明細書に記載の抗体またはその抗体フラグメントおよびキャリアを含む組成物を説明する。別の態様において、本明細書に記載の抗体またはその抗体フラグメントをコードする配列を含む核酸を説明する。

【0033】

別の態様において、本発明による核酸を含む組成物を説明する。

【0034】

別の態様において、本明細書に記載の核酸を含むベクターを説明する。

【0035】

別の態様において、核酸配列、組成物またはベクターを含む宿主細胞を説明する。

【0036】

別の態様において、本明細書は、ＣＬＤＮ１８．２抗原および／またはＣＬＤＮ１８．２を発現する核酸および／または細胞またはそのペプチドフラグメントの精製または濃縮された製剤を説明する。

【0037】

別の態様において、本明細書に記載の抗体またはその抗体フラグメントを調製する方法を説明し、本明細書に記載の核酸配列、組成物またはベクターを含む細胞、および本明細書に記載の抗体またはその抗体フラグメントを培養するステップを含む。

【0038】

一態様において、前記抗体またはその抗体フラグメントは、モノクローナル、キメラまたはヒト抗体であり、かつＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡｌ、ＩｇＡ２、分泌性ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ抗体から選択されることができる。

【0039】

別の態様において、ＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合するが、ＣＬＤＮ１８．１には結合しない単離された抗体またはその抗体フラグメントを説明する。

【0040】

一実施形態において、本明細書に記載の単離された抗体またはその抗体フラグメントを説明し、ＣＬＤＮ１８．２に結合しかつクローディン１８．２を発現する、例えば、胃がん、食道がん、膵臓がん、肺がん、卵巣がん、結腸がん、肝臓がん、頭頚部がんおよび胆嚢がん等の腫瘍関連疾患を含む、細胞関連疾患を治療および／または予防する治療剤として使用されることができる。具体的な実施形態において、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、胃がんを治療および／または予防するために使用される有用な治療剤である。いくつかの別の実施形態において、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体および癌免疫サイクルを標的とする他の試薬（例えば、抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１抗体）を特徴とする治療の組み合わせおよび前記腫瘍関連疾患を治療することができるそのような組み合わせを使用する方法も提供する。

【0041】

一態様において、ＣＬＤＮ１８を発現する細胞に抗体を結合することによって、またはＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞に抗体を結合することによって、前記抗体が細胞を死滅するように誘導することができる。別の態様において、ＣＬＤＮ１８．１を発現する細胞に対する結合は、前記細胞の死滅を誘導しない。ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞は、癌細胞であり得、特に、腫瘍形成性胃がん細胞、食道がん細胞、膵臓がん細胞、肺がん細胞、卵巣がん細胞、結腸がん細胞、肝臓がん細胞、頭頚部がん細胞および胆嚢がん細胞から選択されることができる。

【0042】

別の態様において、抗体またはその抗体フラグメントを説明し、ＣＬＤＮ１８．２に結合しかつＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞の死滅を媒介する能力を有する。好ましくは、抗体は、ＣＬＤＮ１８．１およびＣＬＤＮ１８．２に結合し、より好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２に結合するが、ＣＬＤＮ１８．１には結合しない。好ましくは、前記細胞で発現されるＣＬＤＮ１８．２に抗体を結合することによって、本明細書に記載の前記抗体が細胞を死滅するように誘導する。ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞は、好ましくは、癌細胞であり、いくつかの実施形態において、発癌性胃がん細胞、食道がん細胞、膵臓がん細胞、肺がん細胞、卵巣がん細胞、結腸がん細胞、肝臓がん細胞、頭頚部がん細胞および胆嚢がん細胞から選択される。

【0043】

いくつかの実施形態において、前記抗体は、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）媒介性溶解、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）媒介性溶解、アポトーシス、ホモタイプ接着および／または食作用を誘導し、好ましくは、ＣＤＣ媒介性溶解および／またはＡＤＣＣ媒介性溶解を誘導して細胞の死滅を媒介する。

【0044】

いくつかの別の実施形態において、単核球、単核細胞、ＮＫ細胞およびＰＭＮから選択されるエフェクター細胞の存在下で、ＡＤＣＣ媒介細胞の溶解が発生し、食作用は、マクロファージによって行われる。

【0045】

本明細書に記載のすべての態様によれば、ＣＬＤＮ１８．２は、好ましくは、ヒトＣＬＤＮ１８．２であり、好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を有する。

【0046】

いくつかの実施形態において、前記抗体は、生細胞表面に存在するＣＬＤＮ１８．２の天然のエピトープに結合する。別の実施形態において、前記抗体は、癌細胞、好ましくは、胃がん細胞に特異的である。

【0047】

一態様において、前記抗体は、次のようなステップを含む方法で得ることができる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２または３から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはペプチドまたはその免疫原性フラグメント、または前記タンパク質もしくはペプチドを発現する核酸または宿主細胞またはその免疫原性フラグメントで動物を免疫させる。好ましくは、前記抗体は、前記タンパク質、ペプチドまたはその免疫原性フラグメントに対して特異性を有する。前記抗体は、本明細書では、５Ｃ９等の抗体を生成するクーロンを指すことによって示される。

【0048】

別の態様において、大規模な抗体ライブラリーからのファージ表示選択によって前項抗体を得ることができる。好ましくは、前記抗体は、次のような方法で得ることができる。ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２または３から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはペプチドを使用して、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）または抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）またはＦ（ａｂ’）_２フラグメントのヒト組換え変異体に対してファージ表示スクリーニングする。

【0049】

別の態様において、ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞の増殖を阻害するための、および／またはＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞を死滅するための方法を説明し、当該方法は、細胞を有効量の前記抗体と接触させるステップを含む。いくつかの実施形態において、ＣＬＤＮ１８．２は、細胞表面上に発現される。

【0050】

別の態様において、ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞に関する疾患または病症を治療または予防する的方法を説明し、当該方法は、本明細書に記載の抗体を被験者に投与するステップを含む。好ましくは、疾患または病症は、腫瘍関連疾患であり、前記具体的な実施形態において、胃がん、食道がん、膵臓がん、肺がん、卵巣がん、結腸がん、肝臓がん、頭頚部がんおよび胆嚢がんから選択される。いくつかの実施形態において、ＣＬＤＮ１８．２は、細胞表面に発現される。

【0051】

好ましい実施形態において、本明細書に記載の抗体は、ＣＬＤＮ１８．２に結合する能力を有するが、ＣＬＤＮ１８．１変異体には結合しないか、またはＣＬＤＮ１８．２に対する結合親和性よりも低い親和性でＣＬＤＮ１８．１に結合する。

【0052】

「結合」という用語は、一つの分子または試薬と別の分子との間の特異的結合を指す。「特異的に結合する」という用語は、分子または試薬（抗体等）が標的（エピトープ等）により強く結合し、別の標的への結合と比較して、当該エピトープに特異的であることを意味する。試薬が第２の標的の解離定数よりも低い「解離定数」または「ＫＤ」で第１の標的に結合する場合、第１の標的への試薬の結合は、第２の標的の結合よりも強い。好ましくは、試薬が特異的に結合する標的の解離定数（Ｋ_Ｄ）は、試薬が特異的に結合しない標的の解離定数（Ｋ_Ｄ）の１／１０未満であり、好ましくは、１／２０未満であり、より好ましくは、１／５０未満であり、さらに好ましくは、１／１００、１／２００、１／５００または１／１０００未満である。

【0053】

本明細書に記載の抗体は、ＣＬＤＮ１８．２（好ましくは、これらの細胞の表面で発現する）を発現する細胞の死滅を媒介する。

【0054】

一実施形態において、本明細書に記載の抗体は、例えば、少なくとも約２０％のＣＤＣ媒介性溶解、代替可能に、少なくとも約２０～４０％のＣＤＣ媒介性溶解、代替可能に、約４０～５０％のＣＤＣ媒介性溶解、および代替可能に、５０％を超えるＣＤＣ媒介ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞の溶解等の補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を誘導する。これらの抗体の例としては、１５Ｇ１１、９Ａ１、５Ｃ９、５Ｈ１、１Ｄ５、８Ｃ５、９Ｆ１、７Ａ１０、８Ｃ１２、１４Ｄ７、５Ｈ７、５Ｇ７、４Ｇ３、１４Ｂ７、７Ｈ１、５Ｈ１、１５Ｂ５またはそのキメラまたはヒト化形態（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｖｅｒｓｉｏｎ）等の抗体を含み、実質的に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５０および２５１、２５２および２５３、２５４および２５５、２５６および２５７、２５８および２５９、２６０および２６１、２６２および２６３、２６４および２６５、２６６および２６７、２６８および２６９、２７０および２７１、２７２および２７３、２７４および２７５、２７６および２７７、２７８および２７９、２８０および２８１、２８２および２８３、２８４および２８５、２８６および２８７、２８８および２８９、２９０および２９１、２９２および２９３、２９４および２９５、２９６および２９７、２９８および２９９、３００および３０１、３０２および３０３、３０４および３０５、３０６および３０７、３０８および３０９、３１０および３１１、３１２および３１３、３１４および３１５、３１６および３１７、３１８および３１９、３２０および３２１、３２２および３２３、３２４および３２５、３２６および３２７、３２８および３２９、３３０および３３１、３３２および３３３、３３４および３３５、３３６および３３７、３３８および３３９、３４０および３４１、３４２および３４３、３４４および３４５、３４６および３４７、３４８および３４９、３５０および３５１、３５２および３５３、３５４および３５５、３５６および３５７、３５８および３５９、３６０および３６１ののアミノ酸配列からなる軽鎖と重鎖を含む。

【0055】

代替可能に、またはＣＤＣを誘導することに加えて、本明細書に記載の抗体は、エフェクター細胞（例えば、単球、単核細胞、ＮＫ細胞およびＰＭＮ）の存在下でＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞の抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘導することができる。これらの抗体の例としては、１５Ｇ１１、９Ａ１、５Ｃ９、５Ｈ１、１Ｄ５、８Ｃ５、９Ｆ１、７Ａ１０、８Ｃ１２、１４Ｄ７、５Ｈ７、５Ｇ７、４Ｇ３、１４Ｂ７、７Ｈ１、５Ｈ１、１５Ｂ５またはそのキメラまたはヒト化形態等の抗体を含み、実質的に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５０および２５１、２５２および２５３、２５４および２５５、２５６および２５７、２５８および２５９、２６０および２６１、２６２および２６３、２６４および２６５、２６６および２６７、２６８および２６９、２７０および２７１、２７２および２７３、２７４および２７５、２７６および２７７、２７８および２７９、２８０および２８１、２８２および２８３、２８４および２８５、２８６および２８７、２８８および２８９、２９０および２９１、２９２および２９３、２９４および２９５、２９６および２９７、２９８および２９９、３００および３０１、３０２および３０３、３０４および３０５、３０６および３０７、３０８および３０９、３１０および３１１、３１２および３１３、３１４および３１５、３１６および３１７、３１８および３１９、３２０および３２１、３２２および３２３、３２４および３２５、３２６および３２７、３２８および３２９、３３０および３３１、３３２および３３３、３３４および３３５、３３６および３３７、３３８および３３９、３４０および３４１、３４２および３４３、３４４および３４５、３４６および３４７、３４８および３４９、３５０および３５１、３５２および３５３、３５４および３５５、３５６および３５７、３５８および３５９、３６０および３６１のアミノ酸配列からなる軽鎖と重鎖を含む。

【0056】

前記抗体は、ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞のアポトーシスを誘導し、ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞のホモタイプ接着を誘導し、および／またはマクロファージの存在下でＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞の食作用を誘導する能力を有することができる。本明細書に記載の抗体は、前述機能特性の中の一つまたは複数を有することができる。いくつかの実施形態において、好ましくは、前記抗体は、ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞のＣＤＣ媒介性溶解およびＡＤＣＣ媒介性溶解、より好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞のＡＤＣＣ媒介性溶解を誘導するが、前記細胞のＣＤＣ媒介性溶解を誘導しない。本明細書に記載の抗体の例示的な標的細胞は、例えば、腫瘍形成性胃がん細胞、膵臓がん細胞、食道がん細胞および肺がん細胞等の、ＣＬＤＮ１８．２を発現する癌細胞を含むが、これらに限定されない。具体的な好ましい実施形態において、本明細書に記載の抗体媒介細胞の死滅は、ＣＬＤＮ１８．２に特異的あり、即ち、本明細書に記載の抗体は、ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞の死滅（好ましくは、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ媒介細胞溶解）を媒介するが、ＣＬＤＮ１８．１を発現するが、ＣＬＤＮ１８．２を発現しない細胞の死滅は媒介しない。本明細書に記載の抗体は、腫瘍細胞の死滅を媒介して、例えば、胃がん、食道がん、膵臓がん、肺がん、卵巣がん、結腸がん、肝臓がん、頭頚部がんおよび胆嚢がん等の癌の治療または予防するために使用されることができる。

【0057】

一態様において、本明細書に記載の抗体は、異なる種に由来することができ、マウス、ラット、ウサギ、モルモットおよびヒトを含むが、これらに限定されない。

【0058】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体は、キメラ分子をさらに含み、ここで、一つの種、好ましくは、ヒトに由来する抗体定常領域が、別の種に由来する抗原結合部位と組み合わされる。

【0059】

さらに、いくつかの別の実施形態において、本明細書に記載の抗体は、ヒト化分子を含み、ここで、非ヒト種に由来する抗体の抗原結合部位は、ヒト起源の定常領域およびフレームワーク領域に結合する。

【0060】

本明細書に記載の抗体は、好ましくは、約０．１～１０００ｎＭまたはより小さい解離平衡定数（ＫＤ）でＣＬＤＮ１８．２から解離する。

【0061】

好ましくは、本明細書に記載の抗体は、関連細胞表面抗原と交差反応せず、従って、そのその阻害を阻害しなる。

【0062】

さらに別の態様において、薬物および診断用組成物／キット等の組成物を説明し、本明細書に記載の抗体の一つまたは組み合わせで調製された薬学的に許容されるキャリアを含む。具体的な実施形態において、組成物は、抗体の組み合わせを含み、前記抗体は、異なるエピトープに結合するか、またはＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣの誘導やアポトーシスの誘導等、異なる機能特徴を有する。当該実施形態において、抗体は、例えば、二つまたは複数の抗ＣＬＤＮ１８．２モノクローナル抗体を含む医薬組成物として、組み合わせて使用することができる。例えば、異なるが相補的な活性を有する抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、所望の治療効果を達成するために、単剤治療法に組み合わせることができる。一実施形態において、組成物は、アポトーシスを誘導する別の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体と組み合わせて、ＣＤＣを媒介する抗ＣＬＤＮ１８．２抗体を含む。別の実施形態において、組成物は、ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞の増殖を阻害する別の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体と組み合わせて、エフェクター細胞の存在下で標的細胞の高効率死滅を媒介する抗ＣＬＤＮ１８．２抗体を含む。

【0063】

さらに、本明細書に記載の二つまたは複数の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の同時または順に投与を含み、ここで、少なくとも一つの抗体は、キメラ抗ＣＬＤＮ１８．２抗体であり、少なくとも一つの他の抗体は、ヒト抗ＣＬＤＮ１８．２抗体であり、前記抗体は、ＣＬＤＮ１８．２の同じまたは異なるエピトープに結合する。好ましくは、まず、本明細書に記載のキメラＣＬＤＮ１８．２抗体を投与し、次に本明細書に記載のヒト抗ＣＬＤＮ１８．２抗体を投与し、ここで、いくつかの好ましい実施形態において、ヒト抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、維持治療法などの延長された期間内に投与される。

【0064】

従って、本明細書に記載の抗体は、このような疾患を有する抗体を投与することにより、ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞に関する様々な疾患の治療および／または予防に使用されることができる。治療（例えば、改善）または予防することができる定時的な疾患は、腫瘍形成性疾患を含むが、これらに限定されない。予防および／または治療することができる腫瘍形成性疾患の例としては、胃がん、膵臓がん、食道がん、肺がん、卵巣がん、結腸直腸がん、肝臓がん、頭頚部がんおよび胆嚢がんを含む。

【0065】

いくつかの別の実施形態は、別の治療プロトコルと組み合わせて本明細書に記載の抗体を含む、併用治療法を含む。例えば、具体的な実施形態において、本明細書に記載の抗体が投与された被験者は、化学治療剤、放射線または（例えば、増強または阻害）Ｆｃ受容体（例えば、Ｆｃγ受容体）の発現または活性を調節する試薬（例えば、サイトカイン）でさらに治療される。治療中に投与される典型的なサイトカインは、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含む。例示的な治療剤は、特に、例えば、ドキソルビシン、シスプラチン、タキソテール、５－フルオロウラシル、メトトレキサート、ゲムシタビンおよびシクロホスファミド等の、抗腫瘍剤を含む。

【0066】

さらに別の態様において、ヒトＣＬＤＮ１８．２またはそのペプチドフラグメント、好ましくは、ＣＬＤＮ１８．２またはそのペプチドフラグメントを使用して、マウス等の非ヒト動物を免疫化して、抗体を得る、免疫戦略を説明する。免疫に使用される例示的なペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２または３から選択されるものである。従って、いくつかの好ましい実施形態において、本明細書に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２および３から選択されるペプチドを使用する免疫化によって得られたものである。類似的に、トランスジェニックマウス等のトランスジェニック非ヒト動物でＣＬＤＮ１８．２に対する抗体を生成することができる。トランスジェニック非ヒト動物は、抗体をコードする重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子の全部または一部を含む、ゲノムを有するトランスジェニックマウスであり得る。

【0067】

野生型およびトランスジェニック非ヒト動物は、ＣＬＤＮ１８．２抗原および／またはＣＬＤＮ１８．２を発現する核酸および／または細胞またはそのペプチドフラグメントの精製または濃縮された製剤で免疫化されることができる。好ましくは、非ヒト動物は、Ｖ－Ｄ－Ｊ組換えおよびアイソタイプスイッチングを介して、ＣＬＤＮ１８．２に対するヒトモノクローナル抗体の複数のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡおよび／またはＩｇＭ）を生成することができる。アイソタイプスイッチングは、例えば、古典的または非古典的なアイソタイプスイッチングによって発生することができる。

【0068】

従って、さらに別の態様において、上記のように非ヒト動物から単離されたＢ細胞を説明する。単離されたＢ細胞は、不死化細胞との融合によって不死化されて、前記抗体の供給源（例えば、ハイブリドーマ）を提供することができる。このように行う方法は、当業者に知られている。このようなハイブリドーマ（即ち、本明細書に記載の抗体を生成する）もまた本明細書に含まれる。

【0069】

本明細書に例示されるように、前記抗体は、抗体を発現するハイブリドーマから直接得ることができるか、または宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞またはリンパ球）においてクローニングされかつ組換え発現されることができる。宿主細胞のさらなる例は、大腸菌などの微生物、および酵母などの真菌である。代替可能に、それらは、トランスジェニック非ヒト動物または植物において、組換え的に生成することができる。

【0070】

上記で使用される「フラグメント」または「アミノ酸配列のフラグメント」という用語は、抗体配列の一部、即ち、Ｎ－および／またはＣ－末端で短縮される抗体配列を表す配列に関し、これが抗体の前記抗体配列を代替する場合、ＣＬＤＮ１８．２への抗体の結合は保持され、好ましくは、ＣＤＣ媒介性溶解またはＡＤＣＣ媒介性溶解等の本明細書に記載の抗体の機能が保持される。好ましくは、アミノ酸配列のフラグメントは、前記アミノ酸配列から由来される少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸残基または提供される例示的パーセンテージの間の任意のパーセンテージのアミノ酸残基を含む。本明細書に記載のアミノ酸配列のフラグメントは、前記アミノ酸配列をコードする核酸配列に対応するフラグメントによってコードされることができる。

【0071】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および重鎖可変ドメイン（ＶＨ）の組み合わせを含み、ここで、軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、２２、２９、４３、５１、５７、６４、７２、７８、８６、９３、１００、１０６、１１０、１１７、１２５、１３０、１３１、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５７、１６０、１６３、１６６、１６９、１７２、１７５、１７８、１８０、１８３、１８６、２２１、２２４、２２８、２３１、２３４、２３７、２４２または２４６中のいずれか一つのアミノ酸配列を含み、および、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、２５、３２、４７、５４、６１、６８、７６、８２、８９、９６、１０２、１０９、１１３、１２１、１２７、１３４、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５９、１６２、１６５、１６８、１７１、１７４、１７６、１７９、１８１、１８４、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２２、２２３、２２５、２２６、２２９、２３２、２３５、２４０、２４４または２４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0072】

好ましい実施形態において、本明細書に記載の抗体は、以下の可能性（ｉ）～（ｖｉ）から選択される軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および重鎖可変ドメイン（ＶＨ）の組み合わせを含み、
（ｉ） ＶＬは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５４のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、およびＶＨは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５５のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、
（ｉｉ） ＶＬは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６０のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、およびＶＨは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６２のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、
（ｉｉｉ） ＶＬは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２４のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、およびＶＨは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、
（ｉｖ） ＶＬは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３１のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、およびＶＨは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３２のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、
（ｖ） ＶＬは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３７のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、およびＶＨは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４０のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、
（ｖｉ） ＶＬは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４２のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、およびＶＨは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４４のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む。

【0073】

別の実施形態において、本明細書に記載の抗体は、再表面化またはヒト化形態を含み、ここで、抗体またはそのフラグメントの表面に露出された残基は、軽鎖と重鎖の両方で置換されて、既知のヒト抗体の表面により類似している。マウス抗体またはキメラ抗体と比較して、このようなヒト抗体は、治療剤または診断剤としての效用を向上させることができる。本明細書は、軽鎖と重鎖可変領域のそれぞれのアミノ酸配列、軽鎖と重鎖可変領域の遺伝子のＤＮＡ配列、ＣＤＲの同定、その表面アミノ酸の同定および組換え形態でそれらを発現する方法に対する開示された内容にしたがって、抗体のヒト化形態を特徴づける。

【0074】

好ましい態様において、本明細書に記載の抗体または抗体フラグメントは、改善された性質を有する。例えば、本明細書は、ＣＬＤＮ１８．２に対する親和性が改善された抗体または抗体フラグメントを調製しかつ説明する。

【0075】

本明細書で言及される「その重鎖に関して特定の鎖または特定の領域または配列を含む抗体」は、好ましくは、抗体のすべての重鎖が特定の鎖、領域または配列を含む場合に関する。これは、抗体の軽鎖に対応して適用される。

【0076】

他の実施形態は、本明細書に記載の抗体またはその一部（例えば、抗体鎖）をコードする遺伝子または核酸配列を含む核酸に関する。核酸は、プラスミド、コスミド、ウイルス、ファージまたは遺伝子工学で一般に使用される別のベクター等のベクターに含まれることができる。ベクターは、適切な宿主細胞において適切な条件下でベクターの選択を可能にする、マーカー遺伝子等の、別の遺伝子を含むことができる。さらに、ベクターは、コード領域が適切な宿主において正しく発現されることを可能にする、発現制御要素を含むことができる。このような制御要素は、当業者に知られており、プロモーター、スプライスカセットおよび翻訳開始コドンを含むことができる。

【0077】

いくつかの実施形態において、前記核酸は、発現制御配列に作動可能に付着させることができることにより、真核細胞または原核細胞での発現を可能にする。真核細胞または原核細胞での発現を確実にする制御要素は、当業者に知られている。

【0078】

前記核酸分子を構築するために方法、前記核酸分子を含むベクターを構築するための方法、ベクターを適切に選択された宿主細胞に導入するための方法、発現を誘導または実現するための方法は、当技術分野でよく知られている。

【0079】

別の実施形態は、本明細書に開示された核酸またはベクターを含む宿主細胞に関する。

【発明の効果】

【0080】

本明細書に記載の実施形態の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0081】

【図1】ＧＦＰにカップリングされたＣＬＤ１８．２トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の蛍光分析の写真を示し、かつ細胞膜上の融合タンパク質の発現を証明する図である。

【図2】ＣＬＤ１８．２でトランスフェクトされかつ細胞膜上でモノクローナル抗体３Ｂ８ト反応したＨＥＫ２９３細胞の免疫蛍光分析の写真である。

【図3】フローサイトメトリーによって分析されたモノクローナル抗体３Ｂ８トＧＦＰおよびヒトＣＬＤ１８．２で一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞との結合を示す図である。

【図4】ＥＬＩＳＡベースの測定によるモノクローナル抗体３Ｂ８とＧＦＰおよびヒトＣＬＤ１８．２で一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞との結合の棒グラフを示す。

【図5】フローサイトメトリーによって分析されたモノクローナル抗体３Ｂ８とＧＦＰおよびヒトＣＬＤ１８．２で一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞との結合親和性評価の図である。様々な濃度のモノクローナル抗体（０．０１、０．１、１、２、１０μｇ／ｍｌ）が使用され、抗体３Ｂ８の結合ＥＣ５０は、１～２μｇ／ｍｌである。

【図6】ＨＥＫ２９３－Ｔ、ＨＥＫ２９３－ＣＬＤＮ１８．２およびＨＥＫ２９３－ＣＬＤＮ１８．１細胞に対する抗ＣＬＤＮ１８．２－１５Ｇ１１のフローサイトメトリー分析を示す図である。データーは、モノクローナル抗体１５Ｇ１１がＣＬＤＮ１８．２に結合するが、ＣＬＤＮ１８．１には結合しないことを示す。

【図7】ＨＥＫ２９３－Ｔ、ＨＥＫ２９３－ＣＬＤＮ１８．２およびＨＥＫ２９３－ＣＬＤＮ１８．１細胞に対する抗ＣＬＤＮ１８．２－９Ａ１のフローサイトメトリー分析を示す図である。データーは、モノクローナル抗体９Ａ１がＣＬＤＮ１８．２に結合するが、ＣＬＤＮ１８．１には結合しないことを示す。

【図8】ＨＥＫ２９３－Ｔ、ＨＥＫ２９３－ＣＬＤＮ１８．２およびＨＥＫ２９３－ＣＬＤＮ１８．１細胞に対する抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９のフローサイトメトリー分析を示す図である。データーは、モノクローナル抗体５Ｃ９がＣＬＤＮ１８．２に結合するが、ＣＬＤＮ１８．１には結合しないことを示す。

【図9】Ｅｌｉｓａベースの分析によるクローディン１８．２に対する抗ＣＬＤＮ１８．２－１５Ｇ１１の結合親和性の図である。

【図10】Ｅｌｉｓａベースの分析によるクローディン１８．２に対する抗ＣＬＤＮ１８．２－９Ａ１の結合親和性の図である。

【図11】Ｅｌｉｓａベースの分析によるクローディン１８．２に対する抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９の結合親和性の図である。

【図12】Ｅｌｉｓａベースの分析によるマウスモノクローナル抗ＣＬＤＮ１８．２抗体５Ｃ９、１５Ｇ１１、９Ａ１、１Ｄ５、７Ａ１０および８Ｃ１２の結合親和性測定の図である。

【図13】Ｅｌｉｓａベースの分析によるマウスモノクローナル抗ＣＬＤＮ１８．２抗体１４Ｄ７、４Ｇ３、５Ｈ７、５Ｈ８、１４Ｂ７、５Ｈ１－２、１５Ｂ５、５Ｇ７の結合親和性測定の図である。

【図14】Ｅｌｉｓａベースの分析によるヒト化モノクローナル抗ＣＬＤＮ１８．２抗体ｈ５Ｃ９ｏ、ｈ５Ｃ９ａ、ｈ５Ｃ９ｎの結合親和性測定の図である。

【図15】Ｅｌｉｓａベースの分析によるヒト化モノクローナル抗ＣＬＤＮ１８．２抗体ｈ５Ｃ９ｏ、ｈ５Ｃ９ｏ Ｆｃ ｍｕ、ｈ５Ｃ９ｏｂ、ｈ５Ｃ９ｏａｅ、ｈ５Ｃ９ｏａｎ、ｈ５Ｃ９ｏａｏの結合親和性測定の図である。

【図16】Ｅｌｉｓａベースの分析によるヒト化モノクローナル抗ＣＬＤＮ１８．２抗体ｈ５Ｃ９ｏａ、ｈ５Ｃ９ｏｂ、ｈ５Ｃ９ｏｃ、ｈ５Ｃ９ｏｄ、ｈ５Ｃ９ｏｅ、ｈ５Ｃ９ｏｆ、ｈ５Ｃ９ｏｇ、ｈ５Ｃ９ｏｈ、ｈ５Ｃ９ｏｉ、ｈ５Ｃ９ｏｊ、ｈ５Ｃ９ｏの結合親和性測定の図である。

【図17】Ｅｌｉｓａベースの分析によるヒト化モノクローナル抗ＣＬＤＮ１８．２抗体ｈ５Ｃ９ｏｋ、ｈ５Ｃ９ｏｌ、ｈ５Ｃ９ｏｍ、ｈ５Ｃ９ｏｎ、ｈ５Ｃ９ｏｏ、ｈ５Ｃ９ｏｐ、ｈ５Ｃ９ｏｑ、ｈ５Ｃ９ｏｓの結合親和性測定の図である。

【図18】Ｅｌｉｓａベースの分析によるヒト化モノクローナル抗ＣＬＤＮ１８．２抗体ｈ５Ｃ９ｏｒ、ｈ５Ｃ９ｏｔ、ｈ５Ｃ９ｏｕ、ｈ５Ｃ９ｏｖ、ｈ５Ｃ９ｏｗ、ｈ５Ｃ９ｏｘ、ｈ５Ｃ９ｏｙ、ｈ５Ｃ９ｏｚ、ｈ５Ｃ９ｏａａの結合親和性測定の図である。

【図19】Ｅｌｉｓａベースの分析によるヒト化モノクローナル抗ＣＬＤＮ１８．２抗体 ｈ５Ｃ９ｏｂ、ｈ５Ｃ９ｏａｂ、ｈ５Ｃ９ｏａｄ、ｈ５Ｃ９ｏａｆ、ｈ５Ｃ９ｏａｊ、ｈ５Ｃ９ｏａｋ、ｈ５Ｃ９ｏａｌ、ｈ５Ｃ９ｏａｍの結合親和性測定の図である。

【図20】Ｅｌｉｓａベースの分析によるヒト化モノクローナル抗ＣＬＤＮ１８．２抗体ｈ５Ｃ９ｏｂ、ｈ５Ｃ９ｏｈ、ｈ５Ｃ９ｏｉ、ｈ５Ｃ９ｏｊ、ｈ５Ｃ９ｏａｅ、ｈ５Ｃ９ｏａｇ、ｈ５Ｃ９ｏａｈ、ｈ５Ｃ９ｏａｉの結合親和性測定の図である。

【図21】Ｅｌｉｓａベースの分析によるヒト化モノクローナル抗ＣＬＤＮ１８．２抗体ｈ５Ｃ９ｏ Ｆｃ ｍｕ、ｈ５Ｃ９ｏｂ、ｈ５Ｃ９ｏａｐ、ｈ５Ｃ９ｏａｑ、ｈ５Ｃ９ｏａｏ、ｈ５Ｃ９ｏａｅの結合親和性測定の図である。

【図22】Ｅｌｉｓａベースの分析によるヒト化モノクローナル抗ＣＬＤＮ１８．２抗体ｈ５Ｃ９ｏ Ｆｃ ｍｕ、ｈ５Ｃ９ｏｂ、ｈ５Ｃ９ｏａｐ、ｈ５Ｃ９ｏａｑ、ｈ５Ｃ９ｏａｏ、ｈ５Ｃ９ｏａｅ、ｈ５Ｃ９ｏａｒの結合親和性測定の図である。

【図23】ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動によるマウスモノクローナル抗ＣＬＤＮ１８．２抗体５Ｃ９、１５Ｇ１１、９Ａ１、１Ｄ５、７Ａ１０および８Ｃ１２の純度分析の写真である。

【図24】ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動によるマウスモノクローナル抗ＣＬＤＮ１８．２抗体１４Ｄ７、４Ｇ３、５Ｈ７、５Ｇ７、５Ｈ８、１４Ｂ７、５Ｈ１－１、１５Ｂ５の純度分析の写真である。

【図25】クローディン１８．２およびクローディン１８．１に対するマウスモノクローナル抗ＣＬＤＮ１８．２抗体７Ｈ１の結合親和性および選択性分析の図である。

【図26】クローディン１８．２およびクローディン１８．１、ヒトＩｇＧ（対照として）に対するキメラ抗ＣＬＤＮ１８．２抗体ｃｈ５Ｃ９、ｃｈ１５Ｇ１１およびｃｈ９Ａ１の結合親和性および選択性分析の図である。

【図27】クローディン１８．２およびクローディン１８．１に対するヒト化抗ＣＬＤＮ１８．２抗体ｃｈ５Ｃ９ｏの結合親和性および選択性分析の図である。

【図28】細胞ベースのＥｌｉｓａ分析によるＨＥＫ＿ＣＬＤＮ１８．２細胞に結合するが、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞には結合しない、クローディン１８．２エピトープのヒト化抗クローディン１８．２抗体ｈ５Ｃ９ｏを示す図である。

【図29】細胞ベースのＥｌｉｓａ分析によるＨＥＫ＿ＣＬＤＮ１８．２細胞上のクローディン１８．２エピトープに結合するヒト化抗クローディン１８．２抗体ｈ５Ｃ９ｏ、ｈ５Ｃ９ｏ Ｆｃ ｍｕ、ｈ５Ｃ９ｏｂ、ｈ５Ｃ９ｏａｅ、ｈ５Ｃ９ｏａｎ、ｈ５Ｃ９ｏａｏを示す図である。

【図30】細胞ベースのＥｌｉｓａ分析によるＨＥＫ＿ＣＬＤＮ１８．２細胞上のクローディン１８．２エピトープに結合するヒト化抗クローディン１８．２抗体ｈ５Ｃ９ｏ Ｆｃ ｍｕ、ｈ５Ｃ９ｏｂ、ｈ５Ｃ９ｏａｅ、ｈ５Ｃ９ｏａｇ、ｈ５Ｃ９ｏａｉ、ｈ５Ｃ９ｏａｎ、ｈ５Ｃ９ｏａｏを示す図である。

【図31】Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識分析によるヒト抗体ｈ５Ｃ９ｏ内在化測定の写真である。

【図32】キメラ抗クローディン１８．２抗体ｃｈ５Ｃ９、ｃｈ１５Ｇ１１およびｃｈ９Ａ１媒介補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を比較する図を示す。

【図33】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞ではない、クローディン１８．２を発現するＨＥＫ２９３細胞でキメラ抗クローディン１８．２抗体ｃｈ５Ｃ９媒介ＣＤＣ効果を示す図である。

【図34】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞ではない、クローディン１８．２を発現するＨＥＫ２９３細胞でヒト化抗クローディン１８．２抗体ｈ５Ｃ９ｏ媒介ＣＤＣ効果を示す図である。

【図35】クローディン１８．２を発現するＨＥＫ２９３細胞に対するヒト化抗クローディン１８．２抗体ｈ５Ｃ９ｏ Ｆｃ ｍｕ、ｈ５Ｃ９ｏｂ、ｈ５Ｃ９ｏａｐ、ｈ５Ｃ９ｏａｑ、ｈ５Ｃ９ｏａｏ、ｈ５Ｃ９ｏａｅ、ｈ５Ｃ９ｏａｒ媒介ＣＤＣ効果を示す。

【図36】クローディン１８．２を発現するＨＥＫ２９３細胞に対するヒト化抗クローディン１８．２抗体ｈ５Ｃ９ｏ Ｆｃ ｍｕ、ｈ５Ｃ９ｏｂ、ｈ５Ｃ９ｏａｐ、ｈ５Ｃ９ｏａｑ、ｈ５Ｃ９ｏａｏ、ｈ５Ｃ９ｏａｅ媒介ＣＤＣ効果を示す図である。

【図37】ＣＬＤＮ１８．２を一時的に発現するＨＥＫ＿ＣＬＤＮ１８．２細胞に対するキメラ抗クローディン１８．２抗体ｃｈ５Ｃ９、ｃｈ１５Ｇ１１およびｃｈ９Ａ１媒介ＡＤＣＣ効果を示す図である。

【図38】ＣＬＤＮ１８．２を安定的に発現するＨＥＫ＿ＣＬＤＮ１８．２細胞に対するキメラ抗クローディン１８．２抗体ｃｈ５Ｃ９、ｃｈ７Ｈ１媒介ＡＤＣＣ効果を示す図である。

【図39】ＣＬＤＮ１８．２を発現するＮＵＧＣ４細胞に対するキメラ抗クローディン１８．２抗体ｃｈ７Ｈ１媒介ＡＤＣＣ効果を示す図である。

【図40】ＣＬＤＮ１８．２を発現するＫＡＴＯ ＩＩＩ細胞に対するキメラ抗クローディン１８．２抗体ｃｈ５Ｃ９媒介ＡＤＣＣ効果を示す図である。

【図41】ＣＬＤＮ１８．２を発現するＫＡＴＯ ＩＩＩ細胞に対するヒト化抗クローディン１８．２抗体ｈ５Ｃ９ｏ媒介ＡＤＣＣ効果を示す図である。

【図42】ＣＬＤＮ１８．２を安定的に発現するＨＥＫ＿ＣＬＤＮ１８．２細胞に対するヒト化抗クローディン１８．２抗体ｈ５Ｃ９ｏａｂ、ｈ５Ｃ９ｏａｆ、ｈ５Ｃ９ｏａｇ、ｈ５Ｃ９ｏａｊ、ｈ５Ｃ９ｏａｋ、ｈ５Ｃ９ｏａｍ媒介ＡＤＣＣ効果を示す図である。

【図43】ＣＬＤＮ１８．２を安定的に発現する的ＨＥＫ＿ＣＬＤＮ１８．２細胞に対するヒト化抗クローディン１８．２抗体ｈ５Ｃ９ｏａｂ、ｈ５Ｃ９ｏａｆ、ｈ５Ｃ９ｏａｇ、ｈ５Ｃ９ｏａｊ、ｈ５Ｃ９ｏａｎおよびｈ５Ｃ９ｏｈ媒介ＡＤＣＣ効果を示す図である。

【図44】ＣＬＤＮ１８．２を安定的に発現するＨＥＫ＿ＣＬＤＮ１８．２細胞に対するヒト化抗クローディン１８．２抗体ｈ５Ｃ９ｏａｏ、ｈ５Ｃ９ｏａｑ、ｈ５Ｃ９ｏａｒ、ｈ５Ｃ９ｏａｉ、ｈ５Ｃ９ｏａｅ媒介ＡＤＣＣ効果を示す図である。

【図45】ＣＬＤＮ１８．２を安定的に発現するＨＥＫ＿ＣＬＤＮ１８．２細胞に対するヒト化抗クローディン１８．２抗体ｈ５Ｃ９ｏＦｃ、ｈ５Ｃ９ｏａｏ、ｈ５Ｃ９ｏａｅ、ｈ５Ｃ９ｏｂ、ｈ５Ｃ９ｏａｐ、ｈ５Ｃ９ｏａｑ媒介ＡＤＣＣ効果を示す図である。

【図46】ＣＤ１マウスにおけるヒト化抗クローディン１８．２抗体ｈ５Ｃ９ｏの薬物動態研究の結果を示す図である。

【図47】ヌードマウスで腫瘍細胞異種移植片上のＣＬＤＮ１８．２－陽性腫瘍にｈ５Ｃ９ｏを標的化することにより、腫瘍の形成および増殖の阻害を示す図である。

【図48】インビボで腫瘍異種移植片を有するｈ５Ｃ９ｏ治療されたマウスの延命効果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0082】

本明細書は、細胞表面上の膜タンパク質クローディン１８．２に特異的に結合する、新しく改良された抗体の発見を説明する。ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞への抗体またはその抗体フラグメント結合は、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）媒介性溶解、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）媒介性溶解、アポトーシス、ホモタイプ接着または食作用中の少なくとも一つを誘導して、ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞の死滅を媒介する。本明細書に記載の抗体または抗体フラグメントは、以前に知られている抗クローディン１８．２抗体よりも改善された特性（改善されたクローディン１８．２への結合親和性または安定性を含む）または薬物動態特性を有する。前記抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗体フラグメントを含む関連するポリヌクレオチド、ベクター、医薬組成物をさらに提供する。さらに、本明細書に開示される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体および抗体フラグメントを調製する方法、ならびに本明細書に開示される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体および抗体フラグメントを使用する方法は、例えば、被験者の癌を診断する方法および治療する方法（直接治療法、補助治療法および／または併用治療法）において提供される。さらに、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体（例えば、５Ｃ９）および癌免疫循環の別の態様を標的とする一つまたは複数の試薬（例えば、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体）を特徴とする治療の組み合わせ、ならびに腫瘍媒介性免疫阻害を減少させるためにそのような組み合わせを使用する方法をさらに説明する。

【0083】

いくつかの態様において、単離されたモノクローナル抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＧ_１－４、ＩｇＥ、ＩｇＭおよびＩｇＤ抗体を含む。一実施形態において、抗体は、ＩｇＧ１抗体であり、さらに特に、ＩｇＧｌ、κまたはＩｇＧｌ、λアイソタイプである。別の実施形態において、抗体は、ＩｇＧ３抗体であり、さらに特に、ＩｇＧ３、κまたはＩｇＧ３、λアイソタイプである。さらに別の実施形態において、抗体は、ＩｇＧ４抗体であり、さらに特に、ＩｇＧ４、κまたはＩｇＧ４、λアイソタイプである。さらに別の実施形態において、抗体は、ＩｇＡｌまたはＩｇＡ２抗体である。さらに別の実施形態において、抗体は、ＩｇＭ抗体である。

【0084】

一実施形態において、ＣＬＤＮ１８を発現する細胞に特異的に結合し、好ましくは、（ｉ）ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞に結合し、（ｉｉ）発現ＣＬＤＮ１８．２を発現しないがＣＬＤＮ１８．１を発現する細胞に結合しない、単離された抗体またはその抗体フラグメントを説明する。前記単離された抗体またはその抗体フラグメントは、好ましくは、（ｉ）ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞の死滅を媒介し、（ｉｉ）ＣＬＤＮ１８．２を発現しないがＣＬＤＮ１８．１を発現する細胞の死滅を媒介しない。

【0085】

別の実施形態において、（ｉ）ＣＬＤＮ１８を発現する腫瘍細胞に結合し、（ｉｉ）ＣＬＤＮ１８を発現する正常胃粘膜細胞に結合しなく、および／または（ｉｉｉ）発現ＣＬＤＮ１８を発現する非癌性肺組織細胞に結合しない、単離された抗体またはその抗体フラグメントを説明する。（ｉ）ＣＬＤＮ１８を発現する腫瘍細胞の死滅を媒介し、（ｉｉ）ＣＬＤＮ１８を発現する正常胃粘膜細胞の死滅を媒介しなく、および／または（ｉｉｉ）ＣＬＤＮ１８を発現する非癌性肺組織細胞の死滅を媒介しない、単離された抗体またはその抗体フラグメントをさらに含む。

【0086】

ＣＬＤＮ１８．２抗原への前記単離された抗体またはその抗体フラグメントの結合は、例えば、補体系を活性化することによって、ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞の死滅を媒介することができる。理論に拘束されることなく、ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞の死滅は、ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞の補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞のアポトーシス、ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞のエフェクター細胞食作用、またはＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞のエフェクター細胞抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）の、一つまたは複数のメカニズムによって発生されると考えられる。

【0087】

いくつかの実施形態において、前記単離された抗体またはその抗体フラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および２等のＣＬＤＮ１８．１には存在しない、ＣＬＤＮ１８．２上のエピトープに結合する。他の実施形態において、前記単離された抗体またはその抗体フラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１等のＣＬＤＮ１８．２－ループｌには存在しないエピトープに結合する。好ましい実施形態において、単離された抗体またはその抗体フラグメントは、ＣＬＤＮ１８．１には存在しない、ＣＬＤＮ１８．２上のエピトープに結合する。

【0088】

一実施形態において、本明細書に記載の抗体は、再表面化またはヒト化された形態を含み、ここで、抗体またはそのフラグメントの表面に露出した残基は、軽鎖と重鎖の両方で置換されて、既知のヒト抗体の表面より類似する。マウス抗体またはキメラ抗体と比較して、このようなヒト抗体は、治療剤または診断剤としての一層の活用に有用である。

【0089】

前記抗体は、完全ヒト抗体も含む。いくつかの例示的な実施形態において、このような抗体は、非ヒトトランスジェニック動物、例えば、Ｖ－Ｄ－Ｊ組換えおよびアイソタイプスイッチングを介してＣＬＤＮ１８．２に対するヒトモノクローナル抗体の様々なアイソタイプを生成することができるトランスジェニックマウスで生成することができる。このようなトランスジェニック動物は、例えば、米国公開第２００３／００１７５３４に開示されかつその全体が本明細書に引用される、ポリクローナル抗体を生成するために使用されるトランスジェニックウサギであり得る。

【0090】

Ｉ．一般用語（用語の定義）

【0091】

本発明は、変化することができるため、特定の組成物またはプロセスステップに限定されないことを理解されたい。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、文脈上明確に別に指定しない限り、単数形「一種」、「一つ」および「当該」という用語は、複数の指示対象を含む。「一種」（または「一つ」）という用語および「一つまたは複数」という用語および「少なくとも一つ」という用語は、本明細書で交換可能に使用することができる。

【0092】

さらに、本明細書で使用される場合、「および／または」は、二つの指定された特徴または構成要素のそれぞれが別の具体的な開示を有するか、または有さないと解釈されるべきである。従って、本明細書の句（例えば、「Ａおよび／またはＢ」）で使用される「および／または」という用語は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）および「Ｂ」（単独）を含むことを意図している。類似的に、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」等の句で使用される「および／または」という用語は、Ａ、ＢおよびＣ、Ａ、ＢまたはＣ、ＡまたはＣ、ＡまたはＢ、ＢまたはＣ、ＡおよびＣ、ＡおよびＢ、ＢおよびＣ、Ａ（単独）、Ｂ（単独）、およびＣ（単独）のそれぞれを含むことを意図している。

【0093】

別に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。例えば、生物医学および分子生物学の簡潔な辞書（Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｊｕｏ、Ｐｅｉ－Ｓｈｏｗ、第２版、２００２年、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、細胞および分子生物学の辞書（Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第３版、１９９９年、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、および生化学および分子生物学のオックスフォード辞書（Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）２０００年改訂、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓは、本開示で使用される多くの用語の一般的な辞書を技術者に提供する。

【0094】

単位、接頭辞および記号は、国際単位系（ＳＩ）で公認される形態で表される。数値範囲は、範囲を定義する数値を含む。別に説明されない限り、アミノ酸配列は、アミノ基からカルボキシル基への方向で左から右に書かれる。本明細書で提供される見出しは、すべての態様を限定するものではなく、明細書全体を参照することで得ることができる。相応的に、明細書全体を参照することにより、以下の直接定義された用語をより完全に定義される。

【0095】

本明細書に「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉で説明される態様を提供しているが、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」および／または「実質的に…からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という言葉で説明されるそれ以外の類似の態様をも提供することが理解すべきである。

【0096】

本明細書において、アミノ酸は、一般に知られている３文字の記号またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化命名委員会が推奨する１文字の記号で示される。同様に、ヌクレオチドは、一般に受け入れられる１文字のコードで示される。

【0097】

本明細書で使用される「ＣＬＤＮ１８．２」または「ＣＬＤＮ１８．２ポリペプチド」という用語は、密着結合分子クローディン－１８タンパク質のアイソタイプ２を指す。ＵｎｉｐｒｏｔデーターベースでＣＬＤＮ１８．２のヒト形態およびマウス形態に対応する配列を得ることができる。任意のＣＬＤＮ１８．２抗体エピトープを定義する場合、使用されるアミノ酸番号は、シグナル配列残基を含まない成熟ＣＬＤＮ１８．２タンパク質のアミノ酸残基を表す。例示的なＣＬＤＮ１８．２ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２で提供される。

【0098】

「ＣＬＤＮ１８．２」という用語は、細胞によって天然に発現されるか、またはＣＬＤＮ１８．２遺伝子でトランスフェクトされた細胞上で発現される、ヒトＣＬＤＮ１８．２の翻訳後修飾変異体、アイソタイプおよび種相同体を含む。

【0099】

「ＣＬＤＮ１８変異体」という用語は、（ｉ）ＣＬＤＮ１８スプライス変異体、（ｉｉ）ＣＬＤＮ１８－翻訳後修飾変異体、特に異なるＮ－グリコシル化状態を有する変異体を含み、（ｉｉｉ）ＣＬＤＮ１８コンフォメーション変異体、特にＣＬＤＮ１８－コンフォメーション－１、ＣＬＤＮ１８－コンフォメーション－２およびＣＬＤＮ１８－コンフォメーション－３を含み、（ｉｖ）細胞間の緊密結合に位置する無ＣＬＤＮ１８およびＣＬＤＮ１８ホモタイプ／あろタイプ関連変異体、（ｖ）ＣＬＤＮ１８癌関連およびＣＬＤＮ１８非癌関連の変異体含むべきである。

【0100】

「阻害」、「遮断」、「抑制」という用語およびそれらの文法的な変異体は、本明細書で交換可能に使用され、活性の完全な遮断を含む、生物学的活性の統計的に有意な減少を指す。例えば、「阻害」は、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％（それらの間のパーセンテージを含む）の生物活性の減少を指すことができる。従って、「阻害」または「抑制」という用語を使用してＣＬＤＮ１８．２の酵素活性に対する効果を説明する場合、当該用語は、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合フラグメントが、未処理（対照）細胞におけるＣＬＤＮ１８．２－媒介活性と比較して、統計学的にＣＬＤＮ１８．２活性を有意に低下させる能力を指す。ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞は、天然に存在する細胞または細胞株（例えば、癌細胞）であり得るか、または可以ＣＬＤＮ１８．２をコードする核酸を宿主細胞に導入することによって組換え的に生成することができる。いくつかの態様において、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合フラグメントは、生物で気体の可溶性ＣＬＤＮ１８．２の活性を統計学的かつ有意に低下させることができる。一態様において、抗体またはその抗原結合フラグメント等の抗ＣＬＤＮ１８．２結合分子は、ＣＬＤＮ１８．２－媒介活性を少なくとも１０％、少なくとも１５％、または少なくとも２０％、少なくとも２５％、または少なくとも３０％、少なくとも３５％、または少なくとも４０％、少なくとも４５％、または少なくとも５０％、少なくとも５５％、または少なくとも６０％、少なくとも６５％、または少なくとも７０％、少なくとも７５％、または少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％を阻害し、例えば、以下の実施例に記載の方法および／または当技術分野で知られている方法によって測定される。

【0101】

本明細書で使用されるように、「ＣＬＤＮ１８．２活性を阻害」という用語は、ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞またはＣＬＤＮ１８．２を含むサンプルにおいて、ＣＬＤＮ１８．２－依存性活性を統計学的かつ有意に低下させる、抗ＣＬＤＮ１８．２結合分子（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント）の能力を指す。いくつかの態様において、細胞またはサンプルを抗ＣＬＤＮ１８．２結合分子（例えば、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント）と接触させる場合、抗ＣＬＤＮ１８．２結合分子（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント）の非存在下（対照条件）で測定されたＣＬＤＮ１８．２活性と比較して、ＣＬＤＮ１８．２活性の阻害は、少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％、または少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも１００％減少させることができる。

【0102】

本明細書で交換的に使用される場合、「抗体」または「免疫グロブリン」という用語は、抗体全体およびその任意の抗原結合フラグメントまたは一本鎖を含む。典型的な抗体は、ジスルフィド結合によって互いに接続された少なくとも２本の重鎖（本明細書において、「ＨＣ」と略す）および２本の軽鎖（本明細書において、「ＬＣ」と略す）を含む。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（または重鎖可変ドメイン、本明細書において「ＶＨ」または「Ｖ_Ｈ」と略す）および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、三つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３で構成される。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（または軽鎖可変ドメイン、本明細書において、「ＶＬ」または「Ｖ_Ｌ」と略す）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、一つのドメインＣＬで構成される。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、超可変領域にさらに細分化されることができ、フレームワーク領域（ＦＷ）と呼ばれるより保存的な領域が点在する。それぞれのＶＨおよびＶＬは、三つのＣＤＲおよび四つのＦＷで構成され、アミノ基末端からカルボキシル基末端の順に、ＦＷ１、ＣＤＲ１、ＦＷ２、ＣＤＲ２、ＦＷ３、ＣＤＲ３およびＦＷ４のように配置される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。本開示の例示的な抗体は、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体（元のおよび生殖系の）、親和性最適化クローン、ＡＤＣＣを欠く最適化抗体および他の最適化抗体（例えば、ＹＴＥ突然変異を含む、血中半減期（ｓｅｒｕｍ ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ）最適化抗体、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：２３５１４－２４（２００６）および米国特許第７０８３７８４号を参照し、参照によりその全体が引用される）を含む。

【0103】

抗体は、重鎖定常ドメイン（それぞれα、δ、ε、γおよびμと呼ばれる）に基づく免疫グロブリンの五つの主要なクラスであるＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭまたはそのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）であり得る。異なるタイプの免疫グロブリンは、異なりかつ周知のサブユニット構造および三次元立体配置を有する。

【0104】

「遮断抗体」または「アンタゴニスト抗体」は、結合する抗原、例えば、ＣＬＤＮ１８．２の生物学的活性を阻害または低下させる抗体である。特定の態様において、遮断抗体またはアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を実質的にまたは完全に阻害する。望ましくは、生物学的活性は、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはさらに１００％低下または遮断される。

【0105】

「ＣＬＤＮ１８．２抗体」、「ＣＬＤＮ１８．２に結合する抗体」または「抗ＣＬＤＮ１８．２」という用語は、当該分子がＣＬＤＮ１８．２を標的とする治療剤または診断剤として使用されることができるように、十分な親和性でＣＬＤＮ１８．２に結合することができる抗体またはその抗原結合フラグメントを指す。例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＢＩＡＣＯＲＥ^ＴＭ（組換えＣＬＤＮ１８．２を分析物として使用され、逆も同様である）または当技術分野で知られている他の結合測定によって測定されるように、無関係の非－ＣＬＤＮ１８．２タンパク質への抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の結合の程度は、ＣＬＤＮ１８．２への抗体の結合の約１０％未満である。いくつかの態様において、ＣＬＤＮ１８．２に結合する抗体は、＜１μＭ、＜１００ｎＭ、＜１０ｎＭ、＜１ｎＭ、＜０．１ｎＭ、＜１０ｐＭ、＜１ｐＭまたは＜０．１ｐＭの解離定数（Ｋ_Ｄ）を有する。「抗ＣＬＤＮ１８．２」という用語は、足場に組み込まれたものとして本明細書に開示される抗体のＣＤＲを含む分子を広く含む。従って、「ＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する単離された結合分子またはその抗原結合フラグメント」という句は、抗体およびその抗原結合フラグメントだけでなく、例えば、本明細書に開示される抗体のＣＤＲに組み込まれた一つまたは複数の足場を含む分子も指す。例えば、米国特許公開第２０１５００９８９５５を参照し、参照によりその全体が本明細書に引用される。

【0106】

「ＣＴＬＡ４ポリペプチド」とは、Ｔ細胞阻害活性を有する与ＧｅｎＢａｎｋアクセッション（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）ＡＡＬ０７４７３．１と少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドまたはそのフラグメントを意味する。以下は、ＡＡＬ０７４７３．１の配列を提供する。
ＣＴＬＡ４ポリペプチド配列：
ＭＡＣＬＧＦＱＲＨＫＡＱＬＮＬＡＴＲＴＷＰＣＴＬＬＦＦＬＬＦＩＰＶＦＣＫＡＭＨＶＡＱＰＡＶＶＬＡＳＳＲＧＩＡＳＦＶＣＥＹＡＳＰＧＫＡＴＥＶＲＶＴＶＬＲＱＡＤＳＱＶＴＥＶＣＡＡＴＹＭＭＧＮＥＬＴＦＬＤＤＳＩＣＴＧＴＳＳＧＮＱＶＮＬＴＩＱＧＬＲＡＭＤＴＧＬＹＩＣＫＶＥＬＭＹＰＰＰＹＹＬＧＩＧＮＧＴＱＩＹＶＩＤＰＥＰＣＰＤＳＤＦＬＬＷＩＬＡＡＶＳＳＧＬＦＦＹＳＦＬＬＴＡＶＳＬＳＫＭＬＫＫＲＳＰＬＴＴＧＶＹＶＫＭＰＰＴＥＰＥＣＥＫＱＦＱＰＹＦＩＰＩＮ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４０）

【0107】

「ＣＴＬＡ４核酸分子」とは、ＣＴＬＡ４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なＣＴＬＡ４核酸分子配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション第ＡＡＬ０７４７３の下で提供される。

【0108】

「抗ＣＴＬＡ４抗体」とは、ＣＴＬＡ４ポリペプチドに選択的に結合する抗体を意味する。例示的な抗ＣＴＬＡ４抗体は、例えば、米国特許第６６８２７３６号、第７１０９００３号、第７１２３２８１号、第７４１１０５７号、第７８２４６７９号、第８１４３３７９号、第７８０７７９７号、および第８４９１８９５号（トレメリムマブは、１１．２．１である）に記載され、参照によりその全体が本明細書に引用される。トレメリムマブは、例示的な抗ＣＴＬＡ４抗体である。

【0109】

「ＰＤ－１ポリペプチド」とは、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００５００９と少なくとも約８５％アミノ酸同一性を有し、かつＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２結合活性を有するポリペプチドまたはそのフラグメントを意味する。以下は、ＮＰ＿００５００９の配列を提供する。
ＰＤ－１ポリペプチド配列（ＮＣＢＩアクセッション第ＮＰ＿００５００９）：
ＭＱＩＰＱＡＰＷＰＶ ＶＷＡＶＬＱＬＧＷＲ ＰＧＷＦＬＤＳＰＤＲ ＰＷＮＰＰＴＦＳＰＡＬＬＶＶＴＥＧＤＮＡ ＴＦＴＣＳＦＳＮＴＳＥＳＦＶＩＮＷＹＲＭ ＳＰＳＮＱＴＤＫＬＡ ＡＦＰＥＤＲＳＱＰＧ ＱＤＣＲＦＲＶＴＱＬ ＰＮＧＲＤＦＨＭＳＶ ＶＲＡＲＲＮＤＳＧＴＹＬＣＧＡＩＳＬＡＰ ＫＡＱＩＫＥＳＬＲＡ ＥＬＲＶＴＥＲＲＡＥ ＶＰＴＡＨＰＳＰＳＰ ＲＰＡＧＱＦＱＴＩＶ ＶＧＶＶＧＧＬＬＧＳＬＶＬＬＶＷＶＬＡＶ ＩＣＳＲＡＡＲＧＴＩ ＧＡＲＲＴＧＱＰＬＫ ＥＤＰＳＡＶＰＶＦＳ ＶＤＹＧＥＬＤＦＱＷ ＲＥＫＴＰＥＰＰＶＰ ＣＶＰＥＱＴＥＹＡＴ ＩＶＦＰＳＧＭＧＴＳ ＳＰＡＲＲＧＳＡＤＧ ＰＲＳＡＧＰＬＲＰＥ ＤＧＨＣＳＷＰＬ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４１）

【0110】

「ＰＤ－１核酸分子」とは、ＰＤ－１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なＰＤ－１核酸分子配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００５０１８で提供される。「抗ＰＤ－１抗体」とは、ＰＤ－１ポリペプチドに選択的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを意味する。例示的な抗ＰＤ－１抗体は、例えば、ペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）、ランブリズマブ（ｌａｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ＭＫ－３４７５）、ニボルマブ（ＯＰＤＩｖＡ（登録商標）、ＢＭＳ－９３６５５８、ＭＤＸ－１１０６、ＯＮＯ－４５３８）またはＡＭＰ－２２４を含む。

【0111】

「ＰＤ－Ｌ１ポリペプチド」とは、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１２５４６３５と少なくとも約８５％、９５％または１００％のアミノ酸同一性を有し、かつＰＤ－１およびＣＤ８０結合活性を有するポリペプチドまたはそのフラグメントを意味する。以下は、ＮＰ＿００１２５４６３５の配列を提供する。
ＰＤ－Ｌ１ポリペプチド配列（ＮＣＢＩアクセッション第ＮＰ＿００１２５４６３５）：
ＭＲＩＦＡＶＦＩＦＭＴＹＷＨＬＬＮＡＰＹＮＫＩＮＧＲＩＬＶＶＤＰＶＴＳＥＨＥＬＴＣＱＬＡＥＧＹＰＫＡＥＶＩＷＴＳＳＤＨＱＶＬＳＧＫＴＴＴＴＮＳＫＲＥＥＫＬＦＮＶＴＳＴＬＲＩＮＴＴＴＮＥＩＦＹＣＴＦＲＲＬＤＰＥＥＮＨＴＡＥＬＶＩＰＥＬＰＬＡＨＰＰＮＥＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧ ＲＭＭＤＶＫＫＣＧＩ ＱＤＴＮＳＫＫＧＳＤ ＴＨＬＥＥＴ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４２）

【0112】

「ＰＤ－Ｌｌ核酸分子」とは、ＰＤ－Ｌｌポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的なＰＤ－Ｌ１核酸分子配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１２６７７０６で提供される。

【0113】

「抗ＰＤ－Ｌｌ抗体」とは、ＰＤ－Ｌ１ポリペプチドに選択的に結合抗体またはその抗原結合フラグメントを意味する。例示的な抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、例えば、米国特許公開第ＵＳ２０１３／００３４５５９号（米国特許第８７７９１０８号）およびＵ．Ｓ．２０１４／０３５６３５３に記載され、参照によりその全体が本明細書に引用される。

【0114】

「抗原結合フラグメント」という用語は、抗体全体の一部を含む分子を指し、特に、抗体全体の抗原决定可変領域を含む分子を指す。当技術分野で知られている抗体の抗原結合機能は、完全長抗体のフラグメントによって実行されることができる。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２およびＦｖフラグメント、線状抗体、一本鎖抗体および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体を含むが、これらに限定されない。

【0115】

「モノクローナル抗体」とは、単一抗原決定基またはエピトープへの非常に特異的な認識および結合に関する相同抗体のグループを指す。これは、通常、異なる抗原決定基に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体と異なる。

【0116】

「モノクローナル抗体」という用語は、抗体全体および完全長のモノクローナル抗体の両方、ならびに抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ）、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、抗体部分を含む融合タンパク質および抗原識別部位を含む任意の他の修飾免疫グロブリン分子を含む。さらに、「モノクローナル抗体」とは、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現およびトランスジェニック動物（例えば、トランスジェニックマウスにおけるヒト抗体の発現）を含むがこれらに限定されない、任意の数の方法で調製されたそのような抗体を指す。

【0117】

「ヒト抗体」という用語は、最小限の非ヒト（例えば、マウス）配列を含むように遺伝子操作された非ヒト（例えば、マウス）免疫グロブリンに由来する抗体を指す。通常、ヒト抗体は、ＣＤＲに由来する残基が必要な特異性、親和性および能力を有する非ヒト種（例えば、マウス、ラット、ウサギまたはハムスター）のＣＤＲからの残基に置換される、ヒト免疫グロブリンである（Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２５２５、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３－３２７、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４－１５３６）。いくつかの実施形態において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク（ＦＷ）アミノ酸残基は、所望の特異性および／または親和性および／または能力を有する非ヒトに由来する抗体の対応する残基によって置換される。

【0118】

ヒト抗体は、抗体の特異性、親和性および／または能力を精製および最適化するために、Ｆｖフレームワーク領域（ＦＷ）および／または置換された非ヒト残基の別の残基によってさらに修飾されることができる。通常、ヒト抗体は、実質的に少なくとも一つ、および通常は二つまたは三つの可変ドメインのすべてを含み、前記可変ドメインは、非ヒト免疫グロブリンに対応するＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてを含み、ＦＷ領域のすべてまたは実質的にすべては、ヒト免疫グロブリン共通配列のＦＷ領域である。ヒト抗体は、免疫グロブリン（通常はヒト免疫グロブリンである）定常領域またはドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部を含む。ヒト抗体を生成するための方法の実例としては、米国特許第５２２５５３９号または第５６３９６４１号に記載され、その全体が本明細書に引用される。

【0119】

抗体の「可変領域」とは、単独または組み合わせて、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を指す。重鎖および軽鎖の可変領域は、それぞれ三つのＣＤＲ領域によって接続された四つのＦＷ領域で構成される。各鎖のＣＤＲは、ＦＷ領域の近接性によって一緒に保持され、他の鎖のＣＤＲと一緒になって、抗体の抗原結合部位を形成するのに役立つ。ＣＤＲを決定するための少なくとも二つの技術を有する。（１）異種間配列変動に基づく方法（即ち、Ｋａｂａｔら、免疫学的に関心のあるタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、第５版、１９９１、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ．））、および（２）抗原－抗体複合体の結晶学的研究に基づく方法（Ａｌ－ｌａｚｉｋａｎｉら、（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．、２７３：９２７－９４８））。さらに、当技術分野では、これらの二つの方法の組み合わせを使用して、ＣＤＲを決定することができる。

【0120】

可変ドメインの残基を参照する場合、通常、Ｋａｂａｔ番号付けシステムが用いられる（例えば、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓt、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１））。一貫性を保つために、本明細書で説明されるすべての抗体は、最新の出版物に記載されているように、Ｋａｂａｔシステムによって番号付けられ（Ｍａｔｈｉｅｕ Ｄｏｎｄｅｌｉｎｇｅｒら、Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ａｎｄ Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ａｎｔｉｇｅｎ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｕｒｆａｃｅ／Ｒｅｓｉｄｕｅ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９、２２７８（２０１８））、しかしながら、ＣＤＲのＫａｂａｔ定義に欠陥があるため、ＡｂＭシステムを選択してＣＤＲを定義する。

【0121】

「Ｋａｂａｔのアミノ酸位置番号付け」、「Ｋａｂａｔ位置」、「Ｋａｂａｔ番号付けスキーム」、「Ｋａｂａｔ番号付けシステム」という句およびそれらの文法的変異体は、抗体の編集に使用される重鎖可変ドメイン、軽鎖可変ドメイン、重鎖または軽鎖の番号付けシステムを指す（Ｍａｔｈｉｅｕ Ｄｏｎｄｅｌｉｎｇｅｒら、Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ａｎｄ Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ａｎｔｉｇｅｎ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｕｒｆａｃｅ／Ｒｅｓｉｄｕｅ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９、２２７８（２０１８））。当該番号付けシステムを使用すると、実際の線状アミノ酸配列は、本明細書に記載の前記抗体の可変ドメインのＦＷまたはＣＤＲまたはＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３の短縮または挿入に対応する、より少ないまたは別のアミノ酸を含むことができる。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２残基５２の後に単一のアミノ酸挿入フラグメント（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）を含むことができ、および重鎖ＦＷ残基８２の後に挿入された残基を含むことができる（Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂおよび８２ｃ等）。

【0122】

本明細書全体で使用されるように、説明されたＶＨ ＣＤＲ配列は、古典的なＫａｂａｔ番号付け位置に対応し、即ち、Ｋａｂａｔ ＶＨ－ＣＤＲ１は、位置２６～３５Ｂにあり、ＶＨ－ＣＤＲ２は、位置５０～６５にあり、およびＶＨ－ＣＤＲ３は、位置９５～１０２にある。ＶＬ－ＣＤＲ１、ＶＬ－ＣＤＲ２およびＶＬ－ＣＤＲ３は、古典的なＫａｂａｔ番号付け位置、即ち、それぞれ位置２４～３４、５０～５６および８９～９７にも対応する。

【0123】

本明細書で使用されるように、Ｆｃ領域は、第１の定常領域免疫グロブリンドメイン以外の抗体の定常領域を含むポリペプチドを含む。従って、Ｆｃとは、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧの最後の二つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ＩｇＥおよびＩｇＭの最後の三つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにこれらのドメインのＮ末端柔軟性ヒンジを指す。ＩｇＡおよびＩｇＭの場合、Ｆｃは、Ｊ鎖を含むことができる。ＩｇＧの場合、Ｆｃは、免疫グロブリンドメインＣγ２およびＣγ３（Ｃｙ２およびＣｙ３）とＣγ１（Ｃ７１）およびＣγ２（Ｃｙ２）との間のヒンジを含む。

【0124】

Ｆｃ領域の境界が変化することができるが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、通常、カルボキシル基末端に残基Ｃ２２６またはＰ２３０を含むものとして定義され、ここで、番号付けはＥＵ番号付けに基づく（Ｅｄｅｌｍａｎ、Ｇ．Ｍ．ら、γＧ免疫グロブリン分子全体の共有結合構造（Ｔｈｅ ｃｏｖａｌｅｎｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａｎ ｅｎｔｉｒｅ ｇａｍｍａＧ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．、ＵＳＡ、６３、７８－８５（１９６９））。Ｆｃは、または抗体、抗体フラグメントまたはＦｃ融合タンパク質との文脈上で単独で当該区域を指すことができる。ＥＵインデックスによって番号が付けられた位置２７０、２７２、３１２、３１５、３５６および３５８を含むがこれらに限定されない多くの異なるＦｃ位置で多型が観察されるため、提示された配列と従来技術の配列との間のわずかな違いがある。

【0125】

「ヒト抗体」という用語は、ヒトによって生成される抗体またはヒトによって生成される抗体に対応するアミノ酸配列を有する、当技術分野で知られている任意の技術を使用して作成される抗体を意味する（例えば、培養細胞での組換え発現またはトランスジェニック動物での発現）。従って、ヒト抗体という用語は、もともとヒトによって生成されたが非ヒト系で発現（例えば、化学合成によって生成され、微生物、哺乳動物または昆虫細胞で組換え発現され、または動物被験者で発現される）された抗体（または遺伝子操作されたその変異体または誘導体）に対応するアミノ酸配列を有する抗体を含む。従って、ヒト被験者またはヒト細胞（例えば、組換え抗体またはそのフラグメントを発現するハイブリドーマまたは細胞株）から得られかつその後のマウス等の動物で発現される抗体は、ヒト抗体と見なされる。ヒト抗体の当該定義には、無傷抗体（ｉｎｔａｃｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ）または完全長抗体（ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、そのフラグメントおよび／または少なくとも一つのヒト重鎖および／または軽鎖ポリペプチドを含む抗体、例えば、マウス軽鎖およびヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体が含まれている。

【0126】

「キメラ抗体」という用語は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が二つまたは複数の種に由来する抗体を指す。一般に、軽鎖と重鎖との両方の可変領域は、所望の特異性および／または親和性および／または能力を有する哺乳動物種（例えば、マウス、ラット、ウサギ等）に由来する抗体の可変領域に対応し、定常領域は、別の種（通常はヒトである）に由来する抗体の配列と相同であるため、この種で免疫応答を引き起こすことを避ける。本明細書で使用される「エピトープ」という用語は、本明細書に開示されるＣＬＤＮ１８．２抗体またはＣＬＤＮ１８．２結合分子に結合することができる抗原タンパク質決定基を指す。エピトープは、通常、アミノ酸や糖側鎖等の化学的に活性な分子の表面グループで構成され、通常、特定の３次元構造特性および特定の電荷特徴を有する。エピトープを識別する抗体または結合分子の部分は、「パラトープ」と呼ばれる。タンパク質抗原のエピトープは、その構造およびパラトープとの相互作用に応じて、コンフォメーションエピトープおよび線状エピトープに分類される。コンフォメーションエピトープは、抗原のアミノ酸配列の個別の部分で構成される。これらのエピトープは、抗原の３－Ｄ表面特徴および形状または三次構造に基づいてパラトープと相互作用する。一方、線状エピトープは、その主な構造に基づいてパラトープと相互作用する。線状エピトープは、抗原に由来する連続したアミノ酸配列によって形成される。

【0127】

「抗体結合部位」という用語は、相補的抗体が特異的に結合する連続または不連続部位（即ち、エピトープ）を含む抗原（例えば、ＣＬＤＮ１８．２）中の領域を指す。従って、抗体結合部位は、抗原のエピトープ以外に、結合親和性および／または安定性等の特性を決定するか、または抗原酵素活性または二量体か等の特性に影響を与える別の領域を抗原に含むことができる。従って、二つの抗体が抗原内の同じエピトープに結合する場合でも、抗体分子がエピトープ以外のアミノ酸と異なる分子間接触を確立する場合、そのような抗体は異なる抗体結合部位に結合すると考えられる。

【0128】

「結合親和性」という用語は、通常、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有相互作用の合計強度を指す。別に説明されない限り、本明細書で使用されるように、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体および抗原）間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのパートナーＹへの親和性は、通常、解離定数（Ｋ_Ｄ）で表すことができる。親和性は、本明細書に記載されるものを含む、当技術分野で知られている従来の方法によって測定することができる。低親和性抗体は、通常、抗原にゆっくりと結合し、かつ容易に解離するが、高親和性抗体は、通常、抗原に速く結合し、かつより長く結合したままになる傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法は、当技術分野で知られており、それらのいずれも本開示の目的のために使用することができる。

【0129】

別に説明されない限り、「效力」という用語は、通常、ｎＭで計算されるＩＣ_５０値を表す。ＩＣ_５０は、抗原結合分子の中間阻害濃度である。機能測定において、ＩＣ_５０は、生物学的応答を最大値の５０％低下させる濃度である。リガンド結合研究において、ＩＣ_５０は、受容体結合を最大特異的結合レベルの５０％を低下させる濃度である。ＩＣ_５０は、当技術分野で知られている任意の数の方法で計算することができる。效力の改善は、親抗体（例えば、生殖系列化される前の親抗体または親和性最適化の前の親抗体）に対して測定することによって決定されることができる。

【0130】

「生殖系列化される」という用語は、抗体の特定の位置にあるアミノ酸が変異して生殖系列に戻されるものを指す。

【0131】

親抗体と比較して、本開示の抗体またはポリペプチドの效力の改善倍数は、少なくとも約２倍、少なくとも約４倍、少なくとも約６倍、少なくとも約８倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１１０倍、少なくとも約１２０倍、少なくとも約１３０倍、少なくとも約１４０倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約１６０倍、少なくとも約１７０倍、または少なくとも約１８０倍またはそれ以上であり得る。

【0132】

「抗体依存性細胞媒介性細胞毒性」または「ＡＤＣＣ」という用語は、細胞毒性の一形態を指し、ここで、特定の細胞毒性細胞（例えば、天然死滅（ＮＫ）細胞、好中球およびマクロファージ）に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合する分泌免疫グロブリンは、これらの細胞毒性エフェクター細胞が抗原を持つ標的細胞に特異的に結合し、かつ続いて細胞毒素で標的細胞を死滅させることを可能にする。標的細胞の表面に向けられた特定の高親和性ＩｇＧ抗体は、細胞毒性細胞を「武装」させ、そのような死滅には絶対に必要である。標的細胞の溶解は、細胞外であり、直接の細胞間接触を必要とし、補体には関しない。抗体に加えて、Ｆｃ領域を含む他のタンパク質、特に抗原を持つ標的細胞に特異的に結合能力を有するＦｃ融合タンパク質は、細胞媒介性細胞毒性を達成することができると考えられる。簡単にするために、Ｆｃ融合タンパク質の活性によって引き起こされる細胞媒介性細胞毒性は、本明細書ではＡＤＣＣ活性とも呼ばれる。

【0133】

「単離された」ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または組成物は、それぞれ天然界には存在しない形態のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または組成物である。単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または組成物は、天然界で発生する形態ではなくなった程度または精製されたそれらを含む。いくつかの態様において、単離された抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または組成物は、実質的に純粋である。

【0134】

「被験者」という用語は、特定の治療を受ける、ヒト、非ヒト霊長類動物、げっ歯類動物等を含むがこれらに限定されない、任意の動物（例えば、哺乳動物）を指す。一般に、ヒト被験者について、「被験者」および「患者」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。

【0135】

「医薬組成物」という用語は、活性成分（例えば、本明細書で開示された抗ＣＬＤＮ１８．２結合分子）の生物学的活性が効果的であることを可能にし、かつ組成物が投与される被験者に対して許容できない毒性を有する別の成分を含まない形態の製剤を指す。そのような組成物は、無菌であり得る。

【0136】

本明細書に開示されるような抗ＣＬＤＮ１８．２結合分子の「有効量」は、説明された目的を達成するのに十分な量である。「有効量」は、前記目的に関して経験的かつ従来の方法で決定することができる。

【0137】

「治療有効量」という用語は、本明細書に開示された抗ＣＬＤＮ１８．２結合分子または他の薬物が被験者または哺乳動物の疾患または病症を「治療」するのに効果的な量を指す。

【0138】

「治療」または「処理」または「治療される」または「緩和」または「緩和される」等の用語は、（１）診断された病的疾患または病症を治愈、減速、軽減するための、および／または診断された病的疾患または病症の進行を停止するための治療的処置、および（２）標的された病的状況または障害の進行を防止および／または遅延させるための予防的または防備的処置を指す。従って、治療を必要とする人は、すでに病気にかかった人、病気にかかりやすい人、および病気を予防したい人を含む。いくつかの態様において、患者が特定のタイプの癌などの完全、部分的または一時的な緩和を示す場合、本明細書に開示される方法は、被験者の癌を成功的に「治療」する。

【0139】

「癌」、「腫瘍」、「癌性」および「悪性」という用語は、通常、哺乳動物において、無秩序な細胞増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的状態を指すか、または説明する。癌の例としては、腺がん、リンパ腫、芽細胞腫、黒色腫、肉腫および白血病を含む、癌を含むが、これらに限定されない。そのような癌のより具体的な例としては、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胃腸がん、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ａｎｄ ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、膵臓がん、神経膠芽細胞腫、神経膠腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝がんおよび肝細胞腫瘍等の肝臓がん、膀胱がん、乳がん（ホルモン媒介性乳がんを含み、Ｉｎｎｅｓら、（２００６）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ９４：１０５７－１０６５を参照）、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、骨髄腫瘍（例えば、多発性骨髄腫瘍）、唾液腺がん、腎臓がん（例えば、腎細胞がんおよびウイルムス腫瘍（Ｗｉｌｍｓ’ ｔｕｍｏｒｓ））、基質細胞がん、黒色腫、前列腺がん、外陰がん、甲状腺がん、精巣がん、食道がん、様々な種類の頭頚部がんおよび粘液性卵巣がん等の粘液由来のがん、（肝）胆管がんおよび腎乳頭状がんを含む。いくつかの態様において、本明細書で使用される癌という用語は、具体的には、ＣＬＤＮ１８．２を発現する癌を指す。いくつかの特定の態様において、癌という用語は、低レベルのＣＬＤＮ１８．２を発現する癌を指す。いくつかの態様において、本明細書で使用される癌という用語は、特に、ＣＬＤＮ１８．２を発現する癌（例えば、胃がん、食道がん、膵臓がん、肺がん、卵巣がん、結腸がん、肝臓がん、頭頚部がんおよび胆嚢がん）を指す。

【0140】

本明細書で交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、かつＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドまたは塩基、および／またはその類似体、またはＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼによってポリマーに組み込むことができる任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびその類似体等の修飾ヌクレオチドを含むことができる。前述の説明は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む、本明細書で言及されるすべてのポリヌクレオチドに適用される。

【0141】

「ベクター」という用語は、宿主細胞において一つまたは複数の標的遺伝子または配列を送達し、いくつかの態様において発現することができる構築物を意味する。ベクターの例としては、ウイルスベクター、ヌードＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、陽イオン縮合剤に結合されるＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソームにカプセル化されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクターおよびプロデューサー細胞等の真核細胞を含むが、これらに限定されない。

【0142】

「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、任意の長さのアミノ酸ポリマーを指す。ポリマーは、直鎖または分岐鎖であり得、修飾されたアミノ酸を含むことができ、非アミノ酸が散在することができる。用語は、天然にまたは介入によって修飾されたアミノ酸ポリマー、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または標識成分との結合等の任意の他の遺伝子操作または修飾を含む。当該定義には、例えば、アミノ酸の一つまたは複数の類似体（例えば、非天然アミノ酸等を含む）および当技術分野で知られている他の修飾を含むポリペプチドも含む。本開示のポリペプチドは、抗体ベースであるため、いくつかの態様において、当該ポリペプチドは、一本鎖または結合鎖として存在することができることを理解されたい。

【0143】

「組換え」ポリペプチドまたはタンパク質は、組換えＤＮＡ技術によって生成されるポリペプチドまたはタンパク質を指す。遺伝子操作された宿主細胞で発現される組換え生成ポリペプチドおよびタンパク質は、単離されたと見なされ、任意の適切な技術によって単離、分画または部分的または実質的に精製された天然または組換えポリペプチドであると見なされる。当技術分野で知られたいる方法を使用して、本明細書に開示されるポリペプチドを組換え的に生成することができる。代替可能に、本明細書に開示されるタンパク質およびペプチドを化学合成することができる。

【0144】

「アミノ酸置換」という用語は、親配列に存在するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基に置換することを指す。アミノ酸は、例えば、化学的ペプチド合成を介して、または当技術分野で知られている組換え方法を介して、親配列において置換されることができる。従って、「位置Ｘでの置換」または「位置Ｘでの置換」への言及は、位置Ｘに存在するアミノ酸の代替アミノ酸残基での置換を指す。いくつかの態様において、スキームＡＸＹに従って置換パターンを説明することができ、ここで、Ａは、位置Ｘに天然に存在するアミノ酸に対応する１文字のコードであり、Ｙは、置換アミノ酸残基である。別の態様において、置換パターンは、スキームＸＹに従って説明することができ、ここで、Ｙは、位置Ｘで天然に存在するアミノ酸を置換するアミノ酸残基に対応する１文字のコードである。

【0145】

「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基によって代替することができる。塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β－分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で確立されている。従って、ポリペプチドのアミノ酸が同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸によって置換される場合、当該置換は、保存的であると見なされる。別の態様において、アミノ酸リングは、代替的に、構造的に類似のストリングおよび／または異なる順序の側鎖ファミリーメンバーの組成物によって置換されることができる。

【0146】

「非保存的置換」は、（ｉ）電気陽性側鎖を有する残基（例えば、Ａｒｇ、ＨｉｓまたはＬｙｓ）が、電気陰性残基（例えば、ＧｌｕまたはＡｓｐ）に置換されるか、または電気陰性残基（例えば、ＧｌｕまたはＡｓｐ）によって置換され、（ｉｉ）親水性残基（例えば、ＳｅｒまたはＴｈｒ）が、疎水性残基（例えば、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＰｈｅまたはＶａｌ）に置換されるか、または疎水性残基（例えば、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＰｈｅまたはＶａｌ）によって置換され、（ｉｉｉ）システインまたはプロリンが、任意の他の残基に置換されるか、または任意の他の残基によって置換され、または（ｉｖ）膨大な疏水性または芳香族側鎖（例えば、Ｖａｌ、Ｈｉｓ、ＩｌｅまたはＴｒｐ）を有する残基が、より小さな側鎖（例えば、Ａｌａ、Ｓｅｒ）を有するか、または側鎖（例えば、Ｇｌｙ）がない残基に置換されるか、またはより小さい側鎖（例えば、Ａｌａ、Ｓｅｒ）を有するか、または側鎖（例えば、Ｇｌｙ）がない残基によって置換されることを含む。

【0147】

当業者は、他の置換を容易に決定することができる。例えば、アミノ酸アラニンの場合、Ｄ－アラニン、グリシン、β－アラニン、Ｌ－システインおよびＤ－システインのいずれかから置換を行うことができる。リジンの場合、代替物は、Ｄ－リジン、アルギニン、Ｄ－アルギニン、高アルギニン、メチオニン、Ｄ－メチオニン、オルニチンまたはＤ－オルニチン中のいずれか一つであり得る。通常、単離されたポリペプチドの性質変化を誘導することを予期できる機能的に重要な領域での置換は、（ｉ）極性残基（例えば、セリンまたはスレオニン）が、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンまたはアラニン等の疎水性残基に置換（または疎水性残基によって置換）されること、（ｉｉ）システイン残基が任意の他の残基に置換（または任意の他の残基によって置換）されること、（ｉｉｉ）電気陽性側鎖を有する残基（例えば、リジン、アルギニンまたはヒスチジン）が、グルタミン酸またはアスパラギン酸等の電気陰性側鎖を有する残基に置換（または電気陰性側鎖の残基によって置換）されること、または（ｉｖ）膨大な側鎖を有する残基（例えば、フェニルアラニン）が、グリシン等のような側鎖を有さない残基に置換（またはそのような側鎖を有さない残基によって置換）されることである。前述非保存的置換のいずれかがタンパク質の機能特性を変更させる可能性は、タンパク質の機能的に重要な領域に対する当該置換の位置にも関するため、いくつかの非保存的置換は、生物学的性質にほとんどまたは全く影響を与えない場合がある。

【0148】

「アミノ酸挿入」という用語は、親配列に存在する二つのアミノ酸残基の間に新しいアミノ酸残基を導入することを指す。例えば、化学的ペプチド合成または当技術分野で知られている組換え方法によって、アミノ酸を親配列に挿入することができる。従って、本明細書で使用されるように、「位置ＸとＹとの間の挿入」または「Ｋａｂａｔ位置ＸとＹとの間の挿入」という句は、ＸとＹとがアミノ酸位置（例えば、２３９と２４０との間のシステインアミノ酸挿入）に対応し、位置ＸとＹとの間にアミノ酸を挿入することを指し、位置ＸとＹとでアミノ酸をコードするコドンの間にアミノ酸をコードするコドンの核酸配列に挿入することが指す。スキームＡＸｉｎｓに従って挿入パターンを説明することができ、ここで、Ａは、挿入されるアミノ酸に対応する１文字のコードであり、Ｘは、挿入前の位置である。

【0149】

二つのポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の「配列同一性のパーセンテージ」という用語は、二つの配列を最適にアラインメントするために導入する必要のある追加または欠失（即ち、ギャップ）を考慮して、比較ウインドウ内の配列によって共有される同一のマッチング位置の数を指す。マッチング位置は、標的配列および参照配列の両方に同じヌクレオチドまたはアミノ酸が存在する任意の位置である。ギャップは、ヌクレオチドまたはアミノ酸ではないため、標的配列のギャップはカウントされない。同様に、参照配列のヌクレオチドまたはアミノ酸の代わりに、標的配列のヌクレオチドまたはアミノ酸がカウントされるため、参照配列のギャップはカウントされない。

【0150】

配列同一性パーセンテージは、次のとおりに計算することができる。マッチングされる位置の数を得るために、二つの配列に出現する同じアミノ酸残基または核酸塩基の位置の数を決定し、マッチングされる位置の数を比較ウインドウの位置の総数で割り、結果に１００をかけて、配列同一性パーセンテージを得る。二つの配列間の配列比較および配列同一性パーセンテージの決定は、すぐに利用できるオンライン使用およびダウンロードソフトウェアを使用して行うことができる。適切なソフトウェアプログラムは、様々なソースから入手でき、タンパク質およびヌクレオチド配列の両方のアラインメントに使用される。配列同一性パーセンテージを決定するための適切なプログラムは、ＢＬＡＳＴプログラムスイートの一部であるｂｌ２ｓｅｑであり、当該プログラムは、米国政府の国立バイオテクノロジー情報センター（Ｕ．Ｓ．ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ’ｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＢＬＡＳＴウェブサイト（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から入手することができる。Ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを使用して二つの配列を比較する。ＢＬＡＳＴＮは、核酸配列と比較するために使用され、ＢＬＡＳＴＰは、アミノ酸配列と比較するために使用される。他の適切なプログラムは、例えば、ＥＭＢＯＳＳバイオインフォマティクスプログラムスイートの一部であり、かつｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｌｄＴｏｏｌｓ／ｐｓａの欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＥＢＩ）からも入手できる、Ｎｅｅｄｌｅ、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ、ＷａｔｅｒまたはＭａｔｃｈｅｒである。

【0151】

ポリヌクレオチドまたはポリペプチド参照配列と整列した単一のポリヌクレオチドまたはポリペプチド標的配列内の異なる領域は、それぞれそれらの配列同一性パーセンテージを有することができる。配列同一性パーセンテージ値は、最も近い１０分の１に丸められることに注意されたい。例えば、８０．１１、８０．１２、８０．１３および８０．１４は、８０．１に丸められ、８０．１５、８０．１６、８０．１７、８０．１８および８０．１９は、８０．２に丸められる。長さの値は、常に整数になることに注意されたい。

【0152】

いくつかの態様において、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列の間の同一性パーセンテージ「Ｘ」は、１００ ｘ（Ｙ／Ｚ）として計算され、ここで、Ｙは、第１および第２の配列のアラインメントで同じマッチングとしてカウントされるアミノ酸残基の数（例えば、目視検査または特定の配列比較プログラムを介してアラインメントする）であり、かつＺは、２番目配列の残基の総数である。第１の配列の長さが、第２の配列の長さよりも大きい場合、第１の配列と第２の配列との間の同一性パーセンテージは、第２の配列と第１の配列との間の同一性パーセンテージよりも高くなる。

【0153】

当業者は、配列同一性パーセンテージを計算するための配列アラインメントの生成が、一次配列データーによってのみ駆動されるバイナリー配列－配列比較に限定されないことを理解されたい。配列アラインメントは、複数の配列アラインメント柄導き出すことができる。複数の配列アラインメントを生成するための適切なプログラムは、ｗｗｗ．ｃｌｕｓｔａｌ．ｏｒｇから入手できるＣｌｕｓｔａｌＷ２である。別の適切なプログラムは、ｗｗｗ．ｄｒｉｖｅ５．ｃｏｍ／ｍｕｓｃｌｅから入手できるＭＵＳＣＬＥである。ＣｌｕｓｔａｌＷ２およびＭＵＳＣＬＥは、ＥＢＩ等から代替可能に入手することができる。

【0154】

配列データーを異種供給源からのデーター（例えば、構造データー（例えば、結晶学的タンパク質構造）、機能データー（例えば、突然変異位置）または系統発生データー）と統合することによって、配列アラインメントを生成することができることも理解されたい。異種データーを統合して複数の配列アラインメントを生成するための適切なプログラムは、ｗｗｗ．ｔｃｏｆｆｅｅ．ｏｒｇから入手できるＴ－Ｃｏｆｆｅｅであるか、またはＥＢＩ等から代替可能に入手することができる。配列同一性パーセンテージを計算するために使用される最終的なアラインメントは、自動または手動で支援できることも理解されたい。

【0155】

軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）の可変領域に関して本明細書で使用される「共通配列」という用語は、ＶＬまたはＶＨ鎖のどのアミノ酸残基が抗原結合を損なうことなく容易に修飾されるかについての情報に基づいて定義される複合または普遍的なＶＬまたはＶＨ配列を指す。従って、ＶＬまたはＶＨ佐野「共通配列」において、特定のアミノ酸位置は、その位置にあるいくつかの可能なアミノ酸残基の一つによって占められる。例えば、アルギニン（Ｒ）またはセリン（Ｓ）が特定の位置に出現する場合、共通配列内のこの特定の位置は、アルギニンまたはセリン（ＲまたはＳ）であり得る。ＶＨおよびＶＬ鎖の共通配列は、例えば、インビトロ親和性成熟（例えば、縮重エンコーディングプライマーを使用して特定のＣＤＲの各アミノ酸位置をランダム化する）、抗体ＣＤＲのアミノ酸残基の突然変異誘発（例えば、アラニンスキャニング誘発）または当技術分野で知られている任意の方法等の方法によって定義されることができ、抗原に対する突然変異体の結合を評価して、突然変異されたアミノ酸位置が抗原結合に影響を与えるかどうかを決定する。いくつかの態様において、突然変異は、ＣＤＲ領域に導入される。別の態様において、突然変異は、フレームワーク領域に導入される。いくつかの他の態様において、突然変異は、ＣＤＲおよびフレームワーク領域に導入される。

【0156】

ＩＩ．ＣＬＤＮ１８．２－結合分子およびその作用メカニズム

【0157】

（ｉ）．ＣＬＤＮ１８．２－結合分子の作用メカニズム

【0158】

以下、本明細書に係る抗体またはその抗体フラグメントの治療効果に基づく潜在的なメカニズムを提供するが、それらは、決して制限的であると見なされるべきではない。

【0159】

本明細書に記載の単離された抗体またはその抗体フラグメントは、好ましくは、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を介して免疫系の構成要素と相互作用する。

【0160】

ＡＤＣＣは、本明細書に記載されるように、エフェクター細胞、特に、リンパ球の細胞死滅能力を記載し、好ましくは、標的細胞が、単離された結合分子（例えば、抗体）またはその抗原結合フラグメントによって標識されることを必要とする。ＡＤＣＣは、好ましくは、単離された結合分子（例えば、抗体）またはその抗原結合フラグメントが腫瘍細胞上の抗原に結合しかつＦｃドメインが免疫エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）と結合する場合に発生する。複数のＦｃ受容体ファミリーが同定され、特定の細胞集団は限定されたＦｃ受容体を特徴的に発現する。ＡＤＣＣは、様々な程度の即時腫瘍破壊を直接誘発するメカニズムと見なすことができ、これにより、抗原提示が引き起こされ、腫瘍に向けられたＴ細胞応答が誘導される。好ましくは、ＡＤＣＣのインビボ誘導は、腫瘍に向けられたＴ細胞応答および宿主由来の抗体応答をもたらすであろう。

【0161】

ＣＤＣは、抗体によって向けられることができる細胞死滅の別の方法である。好ましくは、当該カスケードにおいて、抗原－抗体複合体の形成により、ＩｇＧ分子等の関与する抗体分子のＣＨ２ドメインに直接隣接する複数のＣ１ｑ結合部位のブロック（Ｃ１ｑは、補体Ｃ１の三つのサブ成分の一つ）が解除される。好ましくは、これらのブロックが解除されたＣ１ｑ結合部位は、以前の低親和性Ｃ１ｑ－ＩｇＧ相互作用を高親和性の一つに形質転換し、これは、一連の他の補体タンパク質が関与するカスケードイベントを引き起こし、かつエフェクター細胞ケモカイン／アクチベーターＣ３ａおよびＣ５ａのタンパク質の分解・放出を引き起こす。好ましくは、補体カスケードは、膜攻撃複合体の形成で終了し、当該膜攻撃複合体は、細胞膜に細ウェルを形成し、当該細ウェルは、水および溶質を細胞に自由に出入りするのを促進する。

【0162】

（ｉｉ）．ＣＬＤＮ１８．２－結合分子

【0163】

いくつかの実施形態は、ヒトＣＬＤＮ１８．２等のＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合するＣＬＤＮ１８．２結合分子、例えば、抗体およびその抗原結合フラグメントを提供する。ＣＬＤＮ１８．２の完全長アミノ酸（ａａ）およびヌクレオチド（ｎｔ）配列は、当技術分野で知られている。いくつかの態様において、抗ＣＬＤＮ１８．２結合分子は、ヒト抗体である。いくつかの態様において、ＣＬＤＮ１８．２結合分子は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。

【0164】

いくつかの態様において、ＣＬＤＮ１８．２結合分子は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、一本鎖ＦｖまたはｓｃＦｖ、ジスルフィド結合によって連結されるＦｖ、Ｖ－ＮＡＲドメイン、ＩｇＮａｒ、イントラボディ、ＩｇＧＣＨ２、ミニボディ、Ｆ（ａｂ）_３、テトラボディ、トリボディ、ダイアボディ、シングルドメイン抗体、ＤＶＤ－Ｉｇ、Ｆｃａｂ、ｍＡｂ^２、（ｓｃＦｖ）_２またはｓｃＦｖ－Ｆｃ等を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントである。いくつかの態様において、抗体は、ＩｇＧ１タイプ等のＩｇＧタイプである。

【0165】

いくつかの態様において、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合フラグメントは、重鎖定常領域またはそのフラグメントを含む。いくつかの特定的態様において、重鎖定常領域は、ＩｇＧ定常領域である。ＩｇＧ定常領域は、κ定常領域およびλ定常領域から選択される軽鎖定常領域を含むことができる。

【0166】

いくつかの態様において、マウス抗体は、ＣＬＤＮ１８．２－１５Ｇ１１、ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９、ＣＬＤＮ１８．２－９Ａ１、ＣＬＤＮ１８．２－５Ｈ１、ＣＬＤＮ１８．２－１Ｄ５、ＣＬＤＮ１８．２－８Ｃ５、ＣＬＤＮ１８．２－９Ｆ１、ＣＬＤＮ１８．２－７Ａ１０、ＣＬＤＮ１８．２－８Ｃ１２、ＣＬＤＮ１８．２－１４Ｄ７、ＣＬＤＮ１８．２－５Ｈ７、ＣＬＤＮ１８．２－５Ｇ７、ＣＬＤＮ１８．２－４Ｇ３、ＣＬＤＮ１８．２－１４Ｂ７、ＣＬＤＮ１８．２－７Ｈ１、ＣＬＤＮ１８．２－５Ｈ１、ＣＬＤＮ１８．２－１５Ｂ５およびＣＬＤＮ１８．２－ｈ５Ｃ９ｏ、ＣＬＤＮ１８．２－ｈ５Ｃ９ｏｂまたはＣＬＤＮ１８．２－ｈ５Ｃ９ｏａｐ等のヒト化形態である。別の態様において、本明細書に開示される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合フラグメントは、マウス抗体と比較して修飾される。マウス抗体と比較して、修飾はＣＤＲ領域および／またはＦＷ領域の突然変異を含むことができる。

【0167】

「ＣＬＤＮ１８．２－１５Ｇ１１抗体」という句は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含むＩｇＧを指す。

【0168】

「ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９抗体」という句は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含むＩｇＧを指す。

【0169】

「ＣＬＤＮ１８．２－９Ａ１抗体」という句は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含むＩｇＧを指す。

【0170】

「ＣＬＤＮ１８．２－５Ｈ１抗体」という句は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含むＩｇＧを指す。

【0171】

「ＣＬＤＮ１８．２－１Ｄ５抗体」という句は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含むＩｇＧを指す。

【0172】

「ＣＬＤＮ１８．２－８Ｃ５抗体」という句は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含むＩｇＧを指す。

【0173】

「ＣＬＤＮ１８．２－９Ｆ１抗体」という句は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含むＩｇＧを指す。

【0174】

「ＣＬＤＮ１８．２－７Ａ１０抗体」という句は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含むＩｇＧを指す。

【0175】

「ＣＬＤＮ１８．２－８Ｃ１２抗体」という句は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含むＩｇＧを指す。

【0176】

「ＣＬＤＮ１８．２－１４Ｄ７抗体」という句は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含むＩｇＧを指す。

【0177】

「ＣＬＤＮ１８．２－５Ｈ７抗体」という句は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含むＩｇＧを指す。

【0178】

「ＣＬＤＮ１８．２－５Ｇ７抗体」という句は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含むＩｇＧを指す。

【0179】

「ＣＬＤＮ１８．２－４Ｇ３抗体」という句は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０６のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含むＩｇＧを指す。

【0180】

「ＣＬＤＮ１８．２－１４Ｂ７抗体」という句は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含むＩｇＧを指す。

【0181】

「ＣＬＤＮ１８．２－７Ｈ１抗体」という句は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含むＩｇＧを指す。

【0182】

「ＣＬＤＮ１８．２－ｈ５Ｃ９ｏ抗体」という句は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５４のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５５のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含むＩｇＧを指す。

【0183】

「ＣＬＤＮ１８．２－ｈ５Ｃ９ｏｂ抗体」という句は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６０のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６２のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含むＩｇＧを指す。

【0184】

「ＣＬＤＮ１８．２－ｈ５Ｃ９ｏａｐ抗体」という句は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３７のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４０のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含むＩｇＧを指す。

【0185】

（ｉｉｉ）．ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９－由来の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体

【0186】

いくつかの態様において、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３に対する修飾を含み、これは、共通配列ＫＳＳＱＳＬＬＮＸ_１ＧＮＱＫＳＹＬＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６４）を含み、ここで、Ｘ_１は、アミノ酸残基であるセリン（Ｓ）またはトリプトファン（Ｗ）を表す軽鎖ＣＤＲ１、および／または

【0187】

共通配列ＷＡＳＴＸ_２ＥＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６５）を含み、ここで、Ｘ_２は、アミノ酸残基であるロイシン（Ｌ）またはアルギニン（Ｒ）を表す軽鎖ＣＤＲ２、および／または

【0188】

共通配列ＱＮＸ_３ＹＸ_４ＦＰＦＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６６）を含み、ここで、Ｘ_３は、アミノ酸残基であるアスパラギン（Ν）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）を表し、Ｘ_４は、アミノ酸残基であるセリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）を表す軽鎖ＣＤＲ３を含むが、これらに限定されない。

【0189】

いくつかの他の実施形態において、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９抗体の可変重鎖のＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３に対する修飾を含み、これは、

【0190】

共通配列ＧＹＴＦＸ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８ＭＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６７）を含み、ここで、Ｘ_５は、アミノ酸残基であるセリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）を表し、Χ_６は、アミノ酸残基であるアスパラギン（Ｎ）または結合を表し、Χ_７は、アミノ酸残基であるチロシン（Ｙ）または結合を表し、Ｘ_８は、アミノ酸残基であるグリシン（Ｇ）または結合を表す重鎖ＣＤＲ１、および／または、

【0191】

共通配列ＷＩＮＭＹＴＧＥＸ_９Ｘ_１０ＹＡＤＤＦＫＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６８）を含み、ここで、Ｘ_９は、アミノ酸残基であるプロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）またはグルタミン（Ｑ）を表し、Ｘ_１０は、アミノ酸残基であるスレオニン（Ｔ）またはアスパラギン（Ｎ）を表す重鎖ＣＤＲ２、および／または、

【0192】

共通配列Ｘ_１１Ｘ_１２Ｘ_１３ＧＮＸ_１４Ｘ_１５ＤＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６９）を含み、ここで、Ｘ_１１は、アミノ酸残基であるロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）またはアラニン（Ａ）を表し、Ｘ_１２は、アミノ酸残基であるチロシン（Ｙ）、スレオニン（Ｔ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、バリン（Ｖ）、アスパラギン（Ｎ）またはフェニルアラニン（Ｆ）を表し、Ｘ_１３は、アミノ酸残基であるアスパラギン（Ｎ）、アルギニン（Ｒ）、プロリン（Ｐ）、スレオニン（Ｔ）、メチオニン（Ｍ）、リジン（Ｋ）またはヒスチジン（Ｈ）を表し、Ｘ_１４は、アミノ酸残基であるセリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、グリシン（Ｇ）、スレオニン（Ｔ）を表し、Ｘ_１５は、アミノ酸残基であるロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、メチオニン（Ｍ）またはイソロイシン（Ｉ）を表す重鎖ＣＤＲ３を含むが、これらに限定されない。

【0193】

別の実施形態において、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＶＬ領域を含み、前記ＶＬ領域は、
［ＦＷ１］ＫＳＳＱＳＬＬＮＸ_１ＧＮＱＫＳＹＬＴ［ＦＷ２］ＷＡＳＴＸ_２ＥＳ［ＦＷ３］ＱＮＸ_３ＹＸ_４ＦＰＦＴ［ＦＷ４］（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７０）の共通アミノ酸配列を含み、ここで、［ＦＷ１］、［ＦＷ２］、［ＦＷ３］および［ＦＷ４］は、ＶＬフレームワーク領域を表し、ここで、
Ｘ_１は、アミノ酸残基であるセリン（Ｓ）またはトリプトファン（Ｗ）を表し、
Ｘ_２は、アミノ酸残基であるロイシン（Ｌ）またはアルギニン（Ｒ）を表し、
Ｘ_３は、アミノ酸残基であるアスパラギン（Ν）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）を表し、
Ｘ_４は、アミノ酸残基であるセリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン酸（Ｅ）およびチロシン（Ｙ）を表し、

【0194】

別の実施形態において、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＶＨ領域を含み、前記ＶＨ領域は、
［ＦＷ５］ＧＹＴＦＸ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８ＭＮ［ＦＷ６］ＷＩＮＭＹＴＧＥＸ_９Ｘ_１０ＹＡＤＤＦＫＧ［ＦＷ７］Ｘ_１１Ｘ_１２Ｘ_１３ＧＮＸ_１４Ｘ_１５ＤＹ［ＦＷ８］（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７１）の共通アミノ酸配列を含み、ここで、［ＦＷ５］、［ＦＷ６］、［ＦＷ７］および［ＦＷ８］は、ＶＨフレームワーク領域を表し、ここで、
Ｘ_５は、アミノ酸残基であるセリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）を表し、
Χ_６は、アミノ酸残基であるアスパラギン（Ｎ）または結合を表し、
Χ_７は、アミノ酸残基であるチロシン（Ｙ）または結合を表し、
Ｘ_８は、アミノ酸残基であるグリシン（Ｇ）または結合を表し、
Ｘ_９は、アミノ酸残基であるプロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）またはグルタミン（Ｑ）を表し、
Ｘ_１０は、アミノ酸残基であるスレオニン（Ｔ）またはアスパラギン（Ｎ）を表し、
Ｘ_１１は、アミノ酸残基であるロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）またはアラニン（Ａ）を表し、
Ｘ_１２は、アミノ酸残基であるチロシン（Ｙ）、スレオニン（Ｔ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、バリン（Ｖ）、アスパラギン（Ｎ）またはフェニルアラニン（Ｆ）を表し、
Ｘ_１３は、アミノ酸残基であるアスパラギン（Ｎ）、アルギニン（Ｒ）、プロリン（Ｐ）、スレオニン（Ｔ）、メチオニン（Ｍ）、リジン（Ｋ）またはヒスチジン（Ｈ）を表し、
Ｘ_１４は、アミノ酸残基であるセリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、グリシン（Ｇ）、スレオニン（Ｔ）を表し、
Ｘ_１５は、アミノ酸残基であるロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、メチオニン（Ｍ）またはイソロイシン（Ｉ）を表し、

【0195】

別の実施形態において、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗体軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）および抗体重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）を含み、ここで、ＶＬ領域は、
［ＦＷ１］ＫＳＳＱＳＬＬＮＸ_１ＧＮＱＫＳＹＬＴ［ＦＷ２］ＷＡＳＴＸ_２ＥＳ［ＦＷ３］ＱＮＸ_３ＹＸ_４ＦＰＦＴ［ＦＷ４］（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７０）の共通アミノ酸配列を含み、ここで、［ＦＷ１］、［ＦＷ２］、［ＦＷ３］および［ＦＷ４］は、ＶＬフレームワーク領域を表し、ここで、
Ｘ_１は、アミノ酸残基であるセリン（Ｓ）またはトリプトファン（Ｗ）を表し、
Ｘ_２は、アミノ酸残基であるロイシン（Ｌ）またはアルギニン（Ｒ）を表し、
Ｘ_３は、アミノ酸残基であるアスパラギン（Ν）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）を表し、
Ｘ_４は、アミノ酸残基であるセリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン酸（Ｅ）およびチロシン（Ｙ）を表し、および
ＶＨ領域は、
［ＦＷ５］ＧＹＴＦＸ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８ＭＮ［ＦＷ６］ＷＩＮＭＹＴＧＥＸ_９Ｘ_１０ＹＡＤＤＦＫＧ［ＦＷ７］Ｘ_１１Ｘ_１２Ｘ_１３ＧＮＸ_１４Ｘ_１５ＤＹ［ＦＷ８］（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７１）の共通アミノ酸配列を含み、ここで、［ＦＷ５］、［ＦＷ６］、［ＦＷ７］および［ＦＷ８］は、ＶＨフレームワーク領域を表し、ここで、
Ｘ_５は、アミノ酸残基であるセリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）を表し、
Χ_６は、アミノ酸残基であるアスパラギン（Ｎ）または結合を表し、
Χ_７は、アミノ酸残基であるチロシン（Ｙ）または結合を表し、
Ｘ_８は、アミノ酸残基であるグリシン（Ｇ）または結合を表し、
Ｘ_９は、アミノ酸残基であるプロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）またはグルタミン（Ｑ）を表し、
Ｘ_１０は、アミノ酸残基であるスレオニン（Ｔ）またはアスパラギン（Ｎ）を表し、
Ｘ_１１は、アミノ酸残基であるロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）またはアラニン（Ａ）を表し、
Ｘ_１２は、アミノ酸残基であるチロシン（Ｙ）、スレオニン（Ｔ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、バリン（Ｖ）、アスパラギン（Ｎ）またはフェニルアラニン（Ｆ）を表し、
Ｘ_１３は、アミノ酸残基であるアスパラギン（Ｎ）、アルギニン（Ｒ）、プロリン（Ｐ）、スレオニン（Ｔ）、メチオニン（Ｍ）、リジン（Ｋ）またはヒスチジン（Ｈ）を表し、
Ｘ_１４は、アミノ酸残基であるセリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、グリシン（Ｇ）、スレオニン（Ｔ）を表し、
Ｘ_１５は、アミノ酸残基であるロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、メチオニン（Ｍ）またはイソロイシン（Ｉ）を表す。

【0196】

（ｉｖ）．突然変異抗ＣＬＤＮ１８．２抗体

【0197】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体（例えば、ＣＬＤＮ１８．２－１５Ｇ１１、ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９またはＣＬＤＮ１８．２－９Ａ１ ＣＬＤＮ１８．２－５Ｈ１、ＣＬＤＮ１８．２－１Ｄ５、ＣＬＤＮ１８．２－８Ｃ５、ＣＬＤＮ１８．２－９Ｆ１、ＣＬＤＮ１８．２－７Ａ１０、ＣＬＤＮ１８．２－８Ｃ１２、ＣＬＤＮ１８．２－１４Ｄ７、ＣＬＤＮ１８．２－５Ｈ７、ＣＬＤＮ１８．２－５Ｇ７、ＣＬＤＮ１８．２－４Ｇ３、ＣＬＤＮ１８．２－１４Ｂ７、ＣＬＤＮ１８．２－７Ｈ１、ＣＬＤＮ１８．２－５Ｈ１、ＣＬＤＮ１８．２－１５Ｂ５および例えば、ＣＬＤＮ１８．２－ｈ５Ｃ９ｏ、ＣＬＤＮ１８．２－ｈ５Ｃ９ｏｂまたはＣＬＤＮ１８．２－ｈ５Ｃ９ｏａｐ抗体等のそのヒト化形態）またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＦｃＲｎへの結合を改善し、前記抗体の免疫原性を改善しかつ抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合フラグメントの半減期を改善する突然変異を含む。

【0198】

例えば、いくつかの実施形態において、そのような突然変異は、ＥＵ番号付けスキームに従って、ＩｇＧｌの定常ドメインに導入される位置２５２にメチオニン（Ｍ）からチロシン（Ｙ）への突然変異、位置２５４にセリン（Ｓ）からスレオニン（Ｔ）への突然変異、および位置２５６にスレオニン（Ｔ）からグルタミン酸（Ｅ）への突然変異である。例えば、米国特許第７６５８９２１号を参照し、参照により本明細書に引用される。こんなタイプの突然変異ＩｇＧは、「ＹＴＥ突然変異」と呼ばれ、同じ抗体の野生型と比較して、半減期が約４倍（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８１：２３５１４－２４（２００６））に増加することが示される。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ定常ドメインを含む抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＥＵ番号付けスキームに従って、位置２５１～２５７、２８５～２９０、３０８～３１４、３８５～３８９および４２８～４３６に、アミノ酸残基の一つまたは複数のアミノ酸置換を含み、ここで、そのような突然変異は、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合フラグメントの血中半減期を増加させる。

【0199】

別の実施形態において、ＹＴＥ突変異体は、ＥＵ番号付けスキームに従って、ＩｇＧ定常ドメインの位置４３４に、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、チロシン（Ｙ）およびセリン（Ｓ）から選択されるアミノ酸による置換をさらに含む。

【0200】

代替可能な実施形態において、ＹＴＥ突変異体は、ＥＵ番号付けスキームに従って、ＩｇＧ定常ドメインの位置４３４に、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、チロシン（Ｙ）およびセリン（Ｓ）から選択されるアミノ酸による置換、およびＥＵ番号付けスキームに従って、位置４２８に、スレオニン（Ｔ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）およびセリン（Ｓ）から選択されるアミノ酸による置換をさらに含む。

【0201】

さらに別の実施形態において、ＹＴＥ突変異体は、ＥＵスキームに従って番号付けられたＩｇＧ定常ドメインの位置４３４にチロシン（Ｙ）による置換、およびＥＵスキームに従って番号付けられたＩｇＧ定常ドメインの位置２５７にロイシン（Ｌ）による置換をさらに含む。いくつかの態様において、ＹＴＥ突変異体は、ＥＵスキームに従って番号付けられたＩｇＧ定常ドメインの位置４３４にセリン（Ｓ）による置換、およびＥＵスキームに従って番号付けられたＩｇＧ定常ドメインの位置４２８にロイシン（Ｌ）による置換をさらに含む。

【0202】

さらに別の実施形態において、本発明のＹＴＥ突変異体は、ＥＵスキームに従って番号付けられたＣＨ１ドメインに位置２１４にアルギニン（Ｒ）でのリジン（Ｋ）の置換（Ｋ２１４Ｒ）、およびＥＵ方スキームに従って番号付けられたＦｃドメインの位置３５６にグルタミン酸（Ｅ）でのアスパラギン酸（Ｄ）の置換（Ｄ３５６Ｅ）、およびＥＵスキームに従って番号付けられたＦｃドメインの位置３５８にメチオニン（Ｍ）でのロイシン（Ｌ）の置換（Ｌ３５８Ｍ）を含む。ＣＨ１ドメインのＫ２１４Ｒの突然変異およびＦｃドメインのＤ３５６ＥおよびＬ３５８Ｍの突然変異は、前記抗体またはそのフラグメントの免疫原性を改善すると考えられる。

【0203】

一実施形態において、本明細書に開示される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体（例えば、ＣＬＤＮ１８．２－１５Ｇ１１、ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９またはＣＬＤＮ１８．２－９Ａ１、ＣＬＤＮ１８．２－５Ｈ１、ＣＬＤＮ１８．２－１Ｄ５、ＣＬＤＮ１８．２－８Ｃ５、ＣＬＤＮ１８．２－９Ｆ１、ＣＬＤＮ１８．２－７Ａ１０、ＣＬＤＮ１８．２－８Ｃ１２、ＣＬＤＮ１８．２－１４Ｄ７、ＣＬＤＮ１８．２－５Ｈ７、ＣＬＤＮ１８．２－５Ｇ７、ＣＬＤＮ１８．２－４Ｇ３、ＣＬＤＮ１８．２－１４Ｂ７、ＣＬＤＮ１８．２－７Ｈ１、ＣＬＤＮ１８．２－５Ｈ１、ＣＬＤＮ１８．２－１５Ｂ５およびそれらのヒト化形態、例えば、ＣＬＤＮ１８．２－ｈ５Ｃ９ｏ、ＣＬＤＮ１８．２－ｈ５Ｃ９ｏｂまたはＣＬＤＮ１８．２－ｈ５Ｃ９ｏａｐ抗体）またはその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１定常ドメインを含み、ＩｇＧ１定常ドメインは、ＥＵ番号付けスキームに従って、ＩｇＧ１定常ドメインの位置２５２に、メチオニン（Ｍ）からチロシン（Ｙ）への突然変異、位置２５４にセリン（Ｓ）からスレオニン（Ｔ）への突然変異および位置２５６にスレオニン（Ｔ）からグルタミン酸（Ｅ）への突然変異を含む。

【0204】

いくつかの別の実施形態において、本明細書に開示される的抗ＣＬＤＮ１８．２抗体（例えば、ＣＬＤＮ１８．２－１５Ｇ１１、ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９またはＣＬＤＮ１８．２－９Ａ１、ＣＬＤＮ１８．２－５Ｈ１、ＣＬＤＮ１８．２－１Ｄ５、ＣＬＤＮ１８．２－８Ｃ５、ＣＬＤＮ１８．２－９Ｆ１、ＣＬＤＮ１８．２－７Ａ１０、ＣＬＤＮ１８．２－８Ｃ１２、ＣＬＤＮ１８．２－１４Ｄ７、ＣＬＤＮ１８．２－５Ｈ７、ＣＬＤＮ１８．２－５Ｇ７、ＣＬＤＮ１８．２－４Ｇ３、ＣＬＤＮ１８．２－１４Ｂ７、ＣＬＤＮ１８．２－７Ｈ１、ＣＬＤＮ１８．２－５Ｈ１、ＣＬＤＮ１８．２－１５Ｂ５および例えば、ＣＬＤＮ１８．２－ｈ５Ｃ９ｏ、ＣＬＤＮ１８．２－ｈ５Ｃ９ｏｂまたはＣＬＤＮ１８．２－ｈ５Ｃ９ｏａｐ抗体等のそのヒト化形態）またはその抗原結合フラグメントは、

【0205】

（ａ）位置２５２のアミノ酸をチロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）またはスレオニン（Ｔ）で置換すること、

【0206】

（ｂ）位置２５４のアミノ酸をスレオニン（Ｔ）で置換すること、

【0207】

（ｃ）位置２５６のアミノ酸をセリン（Ｓ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）またはスレオニン（Ｔ）で置換すること、

【0208】

（ｄ）位置２５７のアミノ酸をロイシン（Ｌ）で置換すること、

【0209】

（ｅ）位置３０９のアミノ酸をプロリン（Ｐ）で置換すること、

【0210】

（ｆ）位置３１１のアミノ酸をセリン（Ｓ）で置換すること、

【0211】

（ｇ）位置４２８のアミノ酸をスレオニン（Ｔ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）またはセリン（Ｓ）で置換すること、

【0212】

（ｈ）位置４３３のアミノ酸をアルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）またはグルタミン（Ｑ）で置換すること、

【0213】

（ｉ）位置４３４のアミノ酸をトリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、セリン（Ｓ）、ヒスチジン（Ｈ）、フェニルアラニン（Ｆ）またはチロシンで置換すること、および

【0214】

（ｊ）前記置換の二つまたは複数の組み合わせから選択される少なくとも一つのＩｇＧ定常ドメインアミノ酸置換を含み、

【0215】

ここで、ＥＵ番号付けスキームに従って、位置に番号付け、ここで、野生型ＩｇＧ定常ドメインを有するＩｇＧの血中半減期と比較して、修飾されたＩｇＧは、増加された血中半減期を有する。

【0216】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体（例えば、ＣＬＤＮ１８．２－１５Ｇ１１、ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９またはＣＬＤＮ１８．２－９Ａ１ ＣＬＤＮ１８．２－５Ｈ１、ＣＬＤＮ１８．２－１Ｄ５、ＣＬＤＮ１８．２－８Ｃ５、ＣＬＤＮ１８．２－９Ｆ１、ＣＬＤＮ１８．２－７Ａ１０、ＣＬＤＮ１８．２－８Ｃ１２、ＣＬＤＮ１８．２－１４Ｄ７、ＣＬＤＮ１８．２－５Ｈ７、ＣＬＤＮ１８．２－５Ｇ７、ＣＬＤＮ１８．２－４Ｇ３、ＣＬＤＮ１８．２－１４Ｂ７、ＣＬＤＮ１８．２－７Ｈ１、ＣＬＤＮ１８．２－５Ｈ１、ＣＬＤＮ１８．２－１５Ｂ５抗体）またはその抗原結合フラグメントのＶＨおよび／またはＶＬアミノ酸配列は、示されるＶＨおよびＶＬ配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％類似することができ、１、２、３、４またはそれ以上の保存的な置換を含む。それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、２５、３２、４７、５４、６１、６８、７６、８２、８９、９６、１０２、１０９、１１３、１２１、１２７、１３４、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５９、１６２、１６５、１６８、１７１、１７４、１７６、１７９、１８１、１８４、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２２、２２３、２２５、２２６、２２９、２３２、２３５、２４０、２４４または２４８のＶＨ領域および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、２２、２９、４３、５１、５７、６４、７２、７８、８６、９３、１００、１０６、１１０、１１７、１２５、１３０、１３１、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５７、１６０、１６３、１６６、１６９、１７２、１７５、１７８、１８０、１８３、１８６、２２１、２２４、２２８、２３１、２３４、２３７、２４２または２４６のＶＬ領域と高い（即ち、９０％またはそれ以上）配列類似性または配列同一性を有するＶＨ領域およびＶＬ領域のＣＬＤＮ１８．２抗体は、前記抗体をコードする核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位指定またはＰＣＲ－媒介突然変異誘発）、次いで、本明細書に記載
の機能測定を使用して、コードされた改変抗体の保持された機能を試験することによって得ることができる。

【0217】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体のＦｃドメインまたは本明細書に開示される抗体のＣＬＤＮ１８．２結合フラグメントの融合タンパク質のＦｃドメインは、例えば、ＡＤＣＣ等を介して細胞毒性を低下させるために減少されたＦｃ受容体に対する結合を有する。代替可能に、いくつかの態様において、抗体またはＦｃ融合タンパク質ｃａｂのＦｃドメインは、例えば、ＡＤＣＣを介して細胞毒性を増加させるために増加されたＦｃ受容体に対する結合を有する。いくつかの態様において、抗体またはＦｃ融合タンパク質のＦｃドメインは、一つまたは複数の位置に天然に存在しないＡＤＣＣ還元アミノ酸残基を含む。

【0218】

抗体のＡＤＣＣ活性を低下させることができる多くの特異的突然変異は、当技術分野で知られている。例えば、以前の米国特許第５６２４，８２１号、第５６４８２６０号、第７５９７８８９号、第８，９６１，９６７号、第７３７１８２６号、第７７８５７９１号、第７７９０８５８号、米国特許公開第２０１４／０３７８６６３号、第２０１３／００７１３９０号、第２０１１／０２１２０８７号、第２０１５／０１１８２２７号、第２００６／０１９４２９０号、第２００６／０１９４２９１号、第２００８／０２７４１０５号、第２００８／０２７４５０６号、第２０１３／００８９５４１号および第２０１３／０１０８６２３号に例示的な突然変異が説明され、参照によりその全体が本明細書に引用される。ＡＤＣＣエフェクター機能が低下した抗体は、ＥＵ番号付けシステムに従って、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７および３２９の一つまたは複数が置換される抗体をさらに含む（例えば、米国特許第６７３７０５６号を参照し、その全体が本明細書に引用される）。そのようなＦｃ突変異体は、二つまたは複数のアミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７および３２７に置換を有するＦｃ突変異体を含み、アラニンいへの残基２６５および２９７の置換を有するＦｃ突変異体を含む（米国特許第７３３２５８１号を参照し、その全体が本明細書に引用される）。任意選択的に、ＡＤＣＣとＣＤＣとの両方を低下させる突然変異を組み込むことができる。

【0219】

一態様において、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体を説明し、ここで、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ３であり、かつＥＵ番号付けスキームによって番号付けられた２３４、２３５および３３１から選択される一つまたは複数の位置に、少なくとも一つの修飾を含む。さらに別の特定の態様において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ３Ｆｃ領域であり、天然に存在しないアミノ酸は、ＥＵ番号付けスキームによって番号付けられた２３４Ｆ、２３５Ｅ、２３５Ｆ、２３５Ｑ（または２３５Ｙ）、２３９Ａ、３３２Ｑ、３３１Ｓ、３３２Ｑから選択される。

【0220】

別の実施形態において、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、本明細書に説明され、ここで、抗体は、ＩｇＧ４であり、かつＥＵ番号付けスキームによって番号付けられた２２８および２３５から選択された一つまたは複数の位置に少なくとも一つの修飾を含む。さらに別の特定の態様において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４Ｆｃ領域であり、天然に存在しないアミノ酸は、ＥＵ番号付けスキームによって番号付けられた２２８Ｐ、２３５Ｅおよび２３５Ｙから選択される。特定の態様において、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、本明細書に説明され、ここで、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ３であり、かつ位置（ｉ）２３４Ｆ、２３５Ｅおよび３３１Ｓ、（ｉｉ）２３４Ｆ、２３５Ｆおよび３３１Ｓ、（ｉｉｉ）２３４Ｆ、２３５Ｑおよび３２２Ｑに修飾を含む。別の具体的な態様において、本明細書は、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体を説明し、ここで、抗体は、ＩｇＧ４であり、かつ修飾２２８Ｐおよび２３５Ｅを含む。

【0221】

ＩＩＩ．抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の機能的特徴

【0222】

抗原に対する抗体の親和性または結合力は、フローサイトメトリー、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または動力学（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ分析）等の当技術分野で知られたいる任意の適切な方法を使用して実験的に決定することができる。直接結合アッセイおよび競合結合アッセイ形態を簡単に使用することができる（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙら、基本免疫学での抗体―抗原相互作用（「Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」、Ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、Ｐａｕｌ、Ｗ．Ｅ．編集、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、Ｎ．Ｙ．（１９８４）、Ｋｕｂｙ、免疫学（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、Ｎ．Ｙ．（１９９２）、および本明細書に記載の方法）。様々な条件下（例えば、塩濃度、ｐＨ、温度）で測定する場合、具体的な抗体－抗原の相互作用が測定された親和性は、変化することができる。従って、親和性および他の抗原結合パラメーター（例えば、ＫＤまたはＫｄ、Ｋ_ｏｆｆ／Ｋ_ｏｎ）の測定は、抗体および抗原の標準化された溶液および当技術分野で知られているしかつ本明細書に記載の緩衝液が標準化された緩衝液を使用して行われる。

【0223】

当技術分野では、表面プラズモン共鳴分析（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ^ＴＭ）を使用して測定された親和性は、どの反応物がチップに結合するかによって変化することができることも知られている。これに関して、標的抗体（例えば、クローン５Ｃ９抗体）がチップに固定化されているフォーマット（「ＩｇＧ下（ＩｇＧ ｄｏｗｎ）」フォーマットと呼ばれる）または標的タンパク質（例えば、ＣＬＤＮ１８．２）がチップに固定化される（「ＣＬＤＮ１８．２下（ＣＬＤＮ１８．２ ｄｏｗｎ）」フォーマットと呼ばれる）ことによって、親和性を測定することができる。

【0224】

一実施形態において、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体（例えば、クローン５Ｃ９抗体）またはその抗体フラグメントは、１０^－６Ｍ未満、または１０^－７Ｍ未満、または１０^－８Ｍ未満、または１０^－９Ｍ未満、または１０^－１０Ｍ未満、または１０^－１１Ｍ未満、または１０^－１２Ｍ未満、または１０^－１３Ｍ未満の解離定数またはｋｄ（ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ）でＣＬＤＮ１８．２および／またはその抗原性フラグメントに特異的に結合される。

【0225】

別の実施形態において、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９またはクローン５Ｃ９抗体）またはその抗体フラグメントは、１×１０^－３ｓ^－１未満または２×１０^－３ｓ^－１未満のＫ_ｏｆｆでＣＬＤＮ１８．２および／またはその抗原性フラグメントに結合される。別の態様において、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合フラグメントは、１０^－３ｓ^－１未満、５×１０^－３ｓ^－１未満、１０^－４ｓ^－１未満、５×１０^－４ｓ^－１未満、１０^－５ｓ^－１未満、５×１０^－５ｓ^－１未満、１０^－６ｓ^－１未満、５×１０^－６ｓ^－１未満、５×１０^－７ｓ^－１未満、１０^－８ｓ^－１未満、５×１０^－８ｓ^－１未満、１０^－９ｓ^－１未満、５×１０^－９ｓ^－１未満または１０^－１０ｓ^－１未満のＫ_ｏｆｆでＣＬＤＮ１８．２およびその抗原性フラグメントに結合される。別の態様において、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２またはクローン５Ｃ９抗体）またはその抗原結合フラグメントは、少なくとも１０^５Ｍ^－１ｓ^－１、少なくとも５×１０^５Ｍ^－１ｓ^－１、少なくとも１０^６Ｍ^－１ｓ^－１、少なくとも５×１０^６Ｍ^－１ｓ^－１、少なくとも１０^７Ｍ^－１ｓ^－１、少なくとも５×１０^７Ｍ^－１ｓ^－１、または少なくとも１０^８Ｍ^－１ｓ^－１、または少なくとも１０^９Ｍ^－１ｓ^－１の会合速度（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｒａｔｅ）定数またはｋ_ｏｎ速度でＣＬＤＮ１８．２および／またはその抗原性フラグメントに結合される。

【0226】

いくつかの実施形態において、例えば、フローサイトメトリーを介して測定する場合、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２またはクローン５Ｃ９抗体）またはその抗原結合フラグメントは、少なくとも約１ｎＭ、少なくとも約１０ｎＭ、少なくとも約５０ｎＭ、少なくとも約８０ｎＭ、少なくとも約９０ｎＭ、少なくとも約１００ｎＭ、少なくとも約１１０ｎＭ、少なくとも約１２０ｎＭ、少なくとも約１３０ｎＭ、少なくとも約１４０ｎＭ、少なくとも約１５０ｎＭ、少なくとも約１６０ｎＭまたは少なくとも約１７０ｎｍのＫＤでＮＵＧＣ－４細胞表面上のＣＬＤＮ１８．２に結合される。

【0227】

いくつかの別の実施形態において、例えば、フローサイトメトリーを介して測定する場合、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２またはクローン５Ｃ９抗体）またはその抗体フラグメントは、少なくとも約１ｎＭ、少なくとも約１０ｎＭ、少なくとも約５０ｎＭ、少なくとも約８０ｎＭ、少なくとも約９０ｎＭ、少なくとも約１００ｎＭ、少なくとも約１１０ｎＭ、少なくとも約１２０ｎＭ、少なくとも約１３０ｎＭ、少なくとも約１４０ｎＭ、少なくとも約１５０ｎＭ、少なくとも約１６０ｎＭ、または少なくとも約１７０ｎｍのＫＤでＣＬＤＮ１８．２を過剰発現する細胞（例えば、ＣＬＤＮ１８．２－２９３Ｔ細胞（Ｈ４））の表面のＣＬＤＮ１８．２に結合される。

【0228】

ＩＶ．抗ＣＬＤＮ１８．２抗体および抗原結合フラグメントの調製

【0229】

モノクローナル抗ＣＬＤＮ１８．２抗体（例えば、ＣＬＤＮ１８．２－１５Ｇ１１、ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９、ＣＬＤＮ１８．２－９Ａ、ＣＬＤＮ１８．２－５Ｈ１、ＣＬＤＮ１８．２－１Ｄ５、ＣＬＤＮ１８．２－８Ｃ５、ＣＬＤＮ１８．２－９Ｆ１、ＣＬＤＮ１８．２－７Ａ１０、ＣＬＤＮ１８．２－８Ｃ１２、ＣＬＤＮ１８．２－１４Ｄ７、ＣＬＤＮ１８．２－５Ｈ７、ＣＬＤＮ１８．２－５Ｇ７、ＣＬＤＮ１８．２－４Ｇ３、ＣＬＤＮ１８．２－１４Ｂ７、ＣＬＤＮ１８．２－７Ｈ１、ＣＬＤＮ１８．２－５Ｈ１、ＣＬＤＮ１８．２－１５Ｂ５抗体）およびその抗原結合フラグメントは、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５に記載されるようなハイブリドーマ法を使用して調製することができる。前記Ｋｏｈｌｅｒ参照文献に記載されるようなハイブリドーマ法を使用して、マウス、ハムスターまたは他の適切な宿主動物を免疫させて、リンパ球による免疫抗原に特異的に結合する抗体を生成を誘導する。

【0230】

免疫させた後、リンパ球を単離し、例えば、ポリエチレングリコールを使用して、適切な骨髄腫瘍細胞株と融合することにより、融合しないリンパ球および骨髄腫瘍細胞から選択されることができるハイブリドーマ細胞を形成する。次に、標準方法（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８６）使用して、ハイブリドーマをインビトロで増殖させるか、または動物の腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができ、前記ハイブリドーマは、免疫沈降、免疫プロッティングまたはインビトロ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ））によって決定されるように、選択された抗原に特異的なモノクローナル抗体を生成する。具着に、前記ポリクローナル抗体について、上記したように、培地または腹水からモノクローナル抗体を精製することができる。

【0231】

代替可能に、抗ＣＬＤＮ１８．２モノクローナル抗体（例えば、ＣＬＤＮ１８．２－１５Ｇ１１、ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９、ＣＬＤＮ１８．２－９Ａ、ＣＬＤＮ１８．２－５Ｈ１、ＣＬＤＮ１８．２－１Ｄ５、ＣＬＤＮ１８．２－８Ｃ５、ＣＬＤＮ１８．２－９Ｆ１、ＣＬＤＮ１８．２－７Ａ１０、ＣＬＤＮ１８．２－８Ｃ１２、ＣＬＤＮ１８．２－１４Ｄ７、ＣＬＤＮ１８．２－５Ｈ７、ＣＬＤＮ１８．２－５Ｇ７、ＣＬＤＮ１８．２－４Ｇ３、ＣＬＤＮ１８．２－１４Ｂ７、ＣＬＤＮ１８．２－７Ｈ１、ＣＬＤＮ１８．２－５Ｈ１、ＣＬＤＮ１８．２－１５Ｂ５抗体）およびその抗原結合フラグメントは、例えば、米国特許第４８１６５６７号に記載されている組換えＤＮＡ法を使用して調製することができ、参照によりその全体が本明細書に引用される。モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増殖することができるオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、例えば、ＲＴ－ＰＣＲによって成熟Ｂ細胞またはハイブリドーマ細胞から前記モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを単離し、従来法を使用してその配列を決定する。次に、単離された重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチドを適切な発現ベクターにクローニングし、当該発現ベクターを大腸菌、類人猿ＣＯＳ細胞、中国ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または他の方式で免疫グロブリンタンパク質を生成しない骨髄腫瘍細胞等の宿主細胞にトランスフェクトされル場合、宿主細胞によってモノクローナル抗体が生成される。

【0232】

抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする一つまたは複数のポリヌクレオチド（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９または５Ｃ９のクローン）は、組換えＤＮＡ技術を使用して、様々な異なる方式でさらに修飾されて、代替抗体を生成することができる。いくつかの態様において、例えば、マウスモノクローナル抗体の軽鎖と重鎖の定常領域を、（１）例えば、キメラ抗体を生成するヒト抗体のそのような領域、または（２）融合抗体を生成する非免疫グロブリンポリペプチドで置換することができる。いくつかの態様において、モノクローナル抗体の所望な抗体フラグメントを生成するために、定常領域を切断または除去される。可変領域の部位指定突然変異誘発または高密度突然変異誘発を使用して、モノクローナル抗体の特異性、親和性等を最適化することができる。

【0233】

いくつかの態様において、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９または５Ｃ９のクローン）またはその抗原結合フラグメントは、ヒト抗体またはその抗原結合フラグメントである。当技術分野で知られている様々な技術を使用して、ヒト抗体を直接調製することができる。インビトロで免疫された不死化ヒトＢリンパ球または標的抗原に対する抗体を生成する免疫された個体から単離された不死化ヒトＢリンパ球を生成することができる（例えば、Ｃｏｌｅら、モノクローナル抗体と癌治療（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ）、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、ｐ．７７（１９８５）、Ｂｏｅｍｅｒら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７（１）：８６－９５、および米国特許第５７５０３７３号を参照し、その全体が本明細書に引用される）。

【0234】

さらに、抗ＣＬＤＮ１８．２ヒト抗体（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９または５Ｃ９のクローン）またはその抗原結合フラグメントは、ファージライブラリーから選択されることができ、ここで、前記ファージライブラリーは、ヒト抗体を発現する（例えば、Ｖａｕｇｈａｎら、１９９６、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１４：３０９－３１４、Ｓｈｅｅｔｓら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９５：６１５７－６１６２、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１、およびＭａｒｋｓら、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１を参照）。抗体ファージライブラリーの生成および使用に対する技術は、米国特許第５９６９１０８号、第６１７２１９７号、第５８８５７９３号、第６５２１４０４号、第６５４４７３１号、第６５５５３１３号、第６５８２９１５号、第６５９３０８１号、第６３０００６４号、第６６５３０６８号、第６７０６４８４号、および第７２６４９６３号、ならびにＲｏｔｈｅら、２００７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｍｂ．２００７．１２．０１８にさらに説明される（それぞれ参照によりその全体が本明細書に引用される）。抗体ファージ表示法は、モノクローナル抗体を生成するためのハイブリドーマ技術の有力な代替手段となっている（Ａ．Ｓ．Ｋａｎｇら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｉｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８、４３６３、Ｓｉｄｈｕ、Ｓ．Ｓ．およびＦｅｌｌｏｕｓｅ、Ｆ．Ａ．（２００６）Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２、６８２、Ｗｉｎｔｅｒ、Ｇ．（１９９８）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４３０、９２－９４、Ｌｅｒｎｅｒ、Ｒ．Ａ．（２００６）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．４８、８１０６－８１２５）。現在、合成ＤＮＡによってコードされるカスタマイズされた多様性要素を有するファージライブラリーおよび／または非免疫ヒトドナーからの天然抗体遺伝子を含むライブラリーからほぼすべての抗原に対する高親和性抗体を選択することができる（Ｆｅｌｌｏｕｓｅ、Ｆ．Ａ．ら、（２００７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７３、９２４－９４０、Ｆｅｌｌｏｕｓｅ、Ｆ．Ａ．ら、（２００５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４８、１１５３－１１６２、Ｌｉｕ Ｙ．ら、（２０１１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．４１３、６１１－６１５、Ｙｅ Ｊ．Ｄ．ら、（２００８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０５、８２－８７、Ｇａｏ Ｊ．ら、Ｓｉｄｈｕ Ｓ．Ｓ．およびＷｅｌｌｓ Ｊ．Ａ．ら、（２００９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０６、３０７１－３０７６、Ｌｅｒｎｅｒ Ｒ．Ａ．ら、（２００６）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．４８、８１０６－８１２５）。こんな方法ｈあ、ヒトまたは動物に対する免疫の必要性を回避することにより、人件費および抗体生産コストを大幅に削減する。制御された条件下でのファージ抗体ライブラリーからの高親和性結合物の選択的濃縮は、出力抗体の信頼性を高め、ユーザーが指定したストリンジェンシーでの結合の選択を可能にする（Ｇａｏ Ｊ．、Ｓｉｄｈｕ Ｓ．Ｓ．およびＷｅｌｌｓ Ｊ．Ａ．ら、（２００９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０６、３０７１－３０７６）。

【0235】

親和性成熟戦略および鎖シャッフリング戦略（Ｍａｒｋｓら、１９９２、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：７７９－７８３、参照によりその全体が組み込まれる）は、当技術分野で知られており、本明細書に記載の高親和性ヒト抗体またはその抗原結合フラグメントを生成するために使用することができる。

【0236】

いくつかの態様において、抗ＣＬＤＮ１８．２モノクローナル抗体（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９または５Ｃ９のクローン）は、ヒト抗体であり得る。非ヒトまたはヒト抗体を遺伝子操作し、ヒト化または再表面化する方法使用することができ、前記方法は、当技術分野で知られている。ヒト化、再表面化または類似の遺伝子操作される抗体は、非ヒト（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類動物または他の哺乳動物に限定されない非ヒト）に由来する一つまたは複数のアミノ酸残基を有することができる。これらの非ヒトアミノ酸残基は、通常、「導入」残基と呼ばれる残基によって代替され、通常、既知のヒト配列の「導入」可変、定常または他のドメインから取られる。そのような導入された配列は、免疫原性を低下させるか、または結合、親和性、結合速率、解離速率、結合力、特異性、半減期または当技術分野で知られている他の任意の適切な特徴を減少、増強または修飾するために使用することができる。通常、ＣＤＲ残基は、ＣＬＤＮ１８．２結合への影響に直接かつ最も実質的に関与する。従って、非ヒトまたはヒトＣＤＲ配列の一部または全部が維持され、可変領域および定常領域の非ヒト配列をヒトまたは他のアミノ酸によって代替されることができる。

【0237】

抗体は、任意選択的に、ヒト化、再表面化、遺伝子操作することができ、またはヒト抗体はＣＬＤＮ１８．２抗原に対する高親和性および他の有利な生物学的特性を保持するように遺伝子操作することができる。当該目標を達成するために、親・遺伝子操作・ヒト化配列の３次元モデルを使用して、親配列および様々な概念的ヒト化および遺伝子操作の生成物に対する分析過程を通じて、ヒト化（またはヒト）または遺伝子操作された抗ＣＬＤＮ１８．２抗体および再表面化抗体（ｒｅｓｕｒｆａｃｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を選択的に調製することができる。３次元免疫グロブリンモデルは、一般的に使用することができ、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の可能な３次元コンフォメーション構造を例示および表示するコンピュータープログラムを使用することができる。これらの表示を調べることにより、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能な役割の分析、即ち、ＣＬＤＮ１８．２等のその抗原に結合する候補免疫グロブリンの能力に影響を与える残基の分析が可能になる。このような方式で、共通配列および導入された配列からフレームワーク（ＦＷ）残基を選択して組み合わせることにより、一つまたは複数の標的抗原に対する増加された親和性等の所望の抗体特徴を得ることができる。

【0238】

抗ＣＬＤＮ１８．２抗体（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９または５Ｃ９のクローン）またはその抗原結合フラグメントのヒト化、再表面化または遺伝子操作は、任意の知られている方法を使用して実行することができ、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ３２１：５２２（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：１５３４（１９８８））、Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）、ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７）、Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：４２８５（１９９２）、Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌに記載された方法と同じであるが、これらに限定されなく、それぞれ参照によりその全体が本明細書に引用され、引用される参照文献を含む。

【0239】

いくつかの実施形態において、抗ＣＬＤＮ１８．２ヒト抗体およびその抗原結合フラグメントは、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むトランスジェニックマウスでも調製されることができ、前記マウスは、内因性免疫グロブリン生成の存在しない状況で免疫された後ヒト抗体の完全なライブラリーを生成するすることができる。当該方法は、既存の米国特許第５５４５８０７号、第５５４５８０６号、第５５６９８２５号、第５６２５１２６号、第５６３３４２５号、および第５６６１０１６号に記載され、その全体が本明細書に引用される。

【0240】

いくつかの実施形態において、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体フラグメントを提供する（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９または５Ｃ９のクローンに由来するフラグメント）。抗体フラグメントを生成するための様々な技術が知られている。伝統的に、これらのフラグメントは、抗体全体のタンパク質水解消化によって誘導される（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、１９９３、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７－１１７、Ｂｒｅｎｎａｎら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：８１）。いくつかの態様において、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体フラグメントを組換え的に生成する。Ｆａｂ、ＦｖおよびｓｃＦｖ抗体フラグメントは、すべて大腸菌または他の宿主細胞で発現および分泌されることができ、そのようなフラグメントを大量に生成することができ。そのような抗ＣＬＤＮ１８．２抗体フラグメントも、前記議論された抗体ファージライブラリーから単離されることができる。抗ＣＬＤＮ１８．２抗体フラグメントは、例えば、米国特許第５６４１８７０号に記載の線状抗体であり得、その全体が本明細書に引用される。抗体フラグメントを生成するための他の技術、例えば、化学的合成は、熟練した当業者には明らかであろう。

【0241】

本開示によると、技術は、ＣＬＤＮ１８．２に特異的な一本鎖抗体の生成に適用されることができる（例えば、米国特許第４９４６７７８号を参照し、その全体が本明細書に引用される）。さらに、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築に適切な方法（Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：１２７５－１２８１（１９８９））を使用して、ＣＬＤＮ１８．２に対して所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントまたはその誘導体、フラグメント、類似体または相同体を迅速かつ効果的に同定することができる。（ａ）抗体分子のペプシン消化によって生成されるＦ（ａｂ’）_２フラグメント、（ｂ）Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントのジスルフィド結合を還元して生成されるＦａｂフラグメント、（ｃ）パパインおよび還元剤で処理して抗体分子を生成するＦａｂフラグメント、および（ｄ）Ｆｖフラグメントを含むが、これらに限定されない抗体フラグメントを生成することができる。

【0242】

本明細書に開示される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９または５Ｃ９のクローン）またはその抗原結合フラグメントは、その血中半減期を増加させるように修飾されることができる。これは、例えば、抗体または抗体フラグメントで積雪な領域の突然変異によってサルベージ受容体結合エピトープを抗体または抗体フラグメントに組み込まれるか、またはエピトープをペプチドタグに組み込まれ、次に、ペプチドタグを抗体または抗体フラグメントの任意の末端または中間に融合させるか（例えば、ＤＮＡまたはペプチドによって合成）、またはＹＴＥ突然変異によって実現することができる。抗体またはその抗原結合フラグメントの血中半減期を増加させる他の方法、例えば、ＰＥＧ等の異種分子に接合するのは、当技術分野で知られている。

【0243】

本開示の目的のため、修飾された抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＣＬＤＮ１８．２に対する抗体またはポリペプチドの結合を提供する任意のタイプの可変領域を含むことができることを理解されたい。この態様において、可変領域は、任意のタイプの哺乳動物を含むか、またはそれに由来されることができ、前記哺乳動物は、体液反応を強化し、所望の腫瘍関連抗原に対する免疫グロブリンを生成するように誘導することができる。従って、修飾された抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合フラグメントの可変領域は、例えば、ヒト、マウス、非ヒト霊長類動物（例えば、カニクイザル、アカゲザル等）またはルピナス（ｌｕｐｉｎｅ）に由来されることができる。いくつかの実施形態において、修飾された抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合フラグメントの可変領域および定常領域の両方は、ヒトである。他の実施形態において、適合性抗体（一般に非ヒト供給源に由来する）の可変領域は、遺伝子操作されるか、または特異的に改変され当該分子の結合特性を改善するか、または当該分子の免疫原性を低下させることができる。この態様において、入力されたアミノ酸配列を含むことにより、可変領域をヒト化するか、または他の方式で改変させることができる。

【0244】

いくつかの態様において、本明細書に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９または５Ｃ９のクローン）またはその抗原結合フラグメントの重鎖および軽鎖の両方の可変ドメインは、すべて一つまたは複数のＣＤＲの少なくとも部分的置換および必要時一部のフレームワーク領域の置換および配列改変を介して改変されることができる。ＣＤＲは、フレームワーク領域が由来する抗体のクラスまたはさらにサブクラスと同じ抗体に由来することができるが、ＣＤＲは、異なるクラスの抗体に由来され、特定の態様において異なる種の抗体に由来すると考えられる。一つの可変ドメインの抗原結合能力を別の可変ドメインに転移するために、すべてのＣＤＲをドナー可変領域に由来する完全ＣＤＲで置換する必要はない。むしろ、抗原結合部位の活性を維持するために必要な残基のみが移される。米国特許第５５８５０８９号、第５６９３７６１号および第５６９３７６２号（その全体が本明細書に引用される）に記載された説明を考慮すると、日常的な実験または試行錯誤試験を通じて、免疫原性が低下した機能的抗体を得ることは、完全に当業者の能力の範囲内である。

【0245】

可変領域の変化にもかかわらず、当業者は、修飾された抗ＣＬＤＮ１８．２抗体（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９または５Ｃ９のクローン）またはその抗原結合フラグメントが抗体（例えば、完全長抗体またはその免疫反応フラグメント）を含み、ここで、一つまたは複数の定常領域ドメインの少なくとも一部が欠失されるか、または以他の方式で改変され、天然または改変されない定常領域を含むほぼ同じ免疫原性を有する抗体と比較する場合、所望する生化学的特性、例えば、増加された腫瘍局在または低下された血中半減期を提供することを理解されたい。いくつかの実施形態において、修飾された抗体の定常領域は、ヒト定常領域を含む。本明細書に開示される当該抗ＣＬＤＮ１８．２分子と互換性のある定常領域に対する修飾は、一つまたは複数のドメインで一つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失または置換を含む。即ち、本明細書に開示される修飾された抗体は、三つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）の一つまたは複数および／または軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）に対する改変または修飾を含むことができる。いくつかの態様において、一つまたは複数のドメインが部分的または全部欠失された修飾定常領域が考えられる。いくつかの実施形態において、修飾された抗体は、ドメインが欠失された構築物または変異体を含み、ここで、ＣＨ２ドメイン全体が削除された（ＡＣＨ２構築物）。いくつかの態様において、省略された定常領域は、通常、欠失定常領域によって与えられる特定の分子柔軟性を提供することができる短いアミノ酸スペーサー（ｓｐａｃｅｒ）（例えば、１０個の残基）によって置換される。

【0246】

これらの立体配置に加えて、定常領域が複数のエフェクター機能を媒介することが当技術分野で知られている。例えば、補体のＣ１成分が抗体に結合すると、補体系が活性化される。補体の活性化は、細胞病原体のソプソニンおよび溶解にとって重要である。補体の活性化は、炎症性応答を刺激し、自己免疫過敏性にも関与することができる。さらに、抗体は、Ｆｃ領域によって細胞に結合し、抗体Ｆｃ領域のＦｃ受容体部位は、細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合する。ＩｇＧ（γ受容体）、ＩｇＥ（η受容体）、ＩｇＡ（α受容体）およびＩｇＭ（μ受容体）を含む異なるクラスの抗体に特異的な大量のＦｃ受容体をある。細胞表面上のＦｃ受容体に対する抗体の結合は、抗体コーティング粒子の食作用、破壊、免疫複合体の除去、死滅細胞による抗体コーティング標的細胞の溶解（抗体依存性細胞媒介性細胞毒性またはＡＤＣＣト呼ばれる）、炎症性媒介対の放出、胎盤転移および免疫グロブリン生成をの制御を含んで、多数の重要で様々な生物学的反応を引き起こす。

【0247】

いくつかの実施形態において、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９または５Ｃ９のクローン）またはその抗原結合フラグメントは、改変されたエフェクター機能を提供して、投与された抗体またはその抗原結合フラグメントの生物学的特性に影響を与える。例えば、定常領域ドメインの欠失または不活性化（点突然変異または他の方式による）は、循環する修飾された抗体のＦｃ受容体結合を減少させることにより、腫瘍の局在化を増加させることができる。他の情况下で、本開示と一致する定常領域修飾は、適切な補体結合であり得、かつ従って、血中半減期を減少させることができる。定常領域の他の修飾は、増加された抗原特異性または抗体柔軟性により増強された局在化を許容される、ジスルフィド結合またはオリゴ糖部分を除去するために使用されることができる。類似的に、完全に当業者の能力の範囲内である周知の生化学的または分子工学技術を使用して、本開示に係る定常領域に対する修飾を容易に実行することができる。

【0248】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＣＬＤＮ１８．２－結合分子は、抗体（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９または５Ｃ９のクローン）またはその抗原結合フラグメントであり、一つまたは複数のエフェクター機能を有さない。例えば、いくつかの態様において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）活性および／または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）活性を有さない。いくつかの態様において、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｆｃ受容体および／または補体因子に結合しない。いくつかの態様において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、エフェクター機能を有さない。

【0249】

いくつかの実施形態において、抗ＣＬＤＮ１８．２修飾抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＣＨ３ドメインを対応する修飾された抗体またはそのフラグメントのヒンジ領域に直接融合するように遺伝子操作することができることに留意されたい。他の構築物において、ヒンジ領域と修飾されたＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインとの間にペプチドスペーサーを提供する必要がある。例えば、互換性のある構築物を発現することができ、ここで、ＣＨ２ドメインは、欠失され、かつ残りのＣＨ３ドメイン（修飾または非修飾）は、５～２０個のアミノ酸スペーサーを介してヒンジ領域に接続される。例えば、定常ドメインの調節要素が遊離されかつ接近可能な状態で維持されるか、またはヒンジ領域が柔軟性を維持するように確実にするためにそのようなスペーサーを追加することができる。しかしながら、いくつかの状況において、アミノ酸スペーサーが免疫原性を有することが証明され、かつ構築物に対して望ましくない免疫応答を誘発することができることに留意されたい。従って、いくつかの態様において、修飾された抗体の所望の生化学的特性を維持するために、構築物に添加される任意のスペーサーは、比較的非免疫原性であるか、またはさらに一緒に完全に省略されるべきである。

【0250】

定常領域ドメイン全体を欠失させることに加えて、本開示の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体およびその抗原結合フラグメントは、いくつかのまたは単一のアミノ酸の部分的欠失または置換によって提供されることができることを理解されるべきである。例えば、ＣＨ２ドメインの選択された領域における単一のアミノ酸突然変異は、Ｆｃ結合を有意に減少させ、かつそれによって腫瘍の局在化を増加させるのに十分である可能性がある。類似的に、偏重されるエフェクター機能を制御する一つまたは複数の定常領域ドメインのこの部分を単に欠失させることが望ましい場合がある。定常領域のそのような部分的欠失は、抗体またはその抗原結合フラグメントの選択された特性（例えば、血中半減期）を改善する同時に対象の定常領域ドメインに関連する他の所望の機能の完全性を保持することができる。さらに、上で示唆されるように、開示された抗ＣＬＤＮ１８．２抗体およびその抗原結合フラグメントの定常領域は、得られた構築物の特性を増強する一つまたは複数のアミノ酸の突然変異または置換によって修飾されることができる。この態様において、保存的結合部位によって提供される活性（例えば、Ｆｃ結合）を破壊する同時に修飾された抗体またはその抗原結合フラグメントの立体配置および免疫原性特性を実質的に維持することができる。いくつかの実施形態は、エフェクター機能の減少または増加等の所望の特性を増強させるか、またはより多い細胞毒素または炭水化物付着を提供するために、定常領域に一つまたは複数のアミノ酸を添加することを含むことができる。そのような態様において、選択された定常領域ドメインに由来する特定の配列挿入または複製することが必要がある可能性がある。

【0251】

本明細書は、本明細書に示されるキメラ、ヒト化およびヒト抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合フラグメントに実質的に相同である変異体および同等物を説明する。これらは、例えば、保存的置換突然変異、即ち、一つまたは複数のアミノ酸が類似のアミノ酸によって置換されることを含むことができる。例えば、保存的置換は、同じ一般的なカテゴリー内の別のアミノ酸によってアミノ酸を置換することを指し、例えば、一つの酸性アミノ酸が別の酸性アミノ酸によって置換され、一つの塩基性アミノ酸が別の塩基性アミノ酸によって置換されるか、または一つの中性アミノ酸が別の中性アミノ酸によって置換される。保存的アミノ酸置換の意図は、当技術分野でよく知られている。

【0252】

Ｖ．ＣＬＤＮ１８．２－結合分子をコードするポリヌクレオチド

【0253】

いくつかの態様において、本明細書は、ＣＬＤＮ１８．２またはその抗原結合フラグメントに特異的に結合するポリペプチドコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む。例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９または５Ｃ９のクローン）をコードするか、またはそのような抗体の抗原結合フラグメントをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。前記ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ形態またはＤＮＡ形態であり得る。ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡを含み、二本鎖または一本鎖であり得、一本鎖の場合、コード鎖または非コード鎖（アンチ鎖）であり得る。

【0254】

いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、単離される。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、実質的に純粋である。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドのコード配列を含み、当該コード配列は、同じリーディングフレームで、例えば、宿主細胞においてポリペプチドの発現および分泌を促進するポリヌクレオチド（例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御する分泌配列のリーダー配列として使用される）に融合される。リーダー配列を有するポリペプチドは、前駆体タンパク質であり、リーダー配列は、宿主細胞によって切断されて、ポリペプチドの成熟形態を形成することができる。ポリヌクレオチドは、成熟タンパク質に使の５’アミノ酸残基を加えた、ＣＬＤＮ１８．２－結合前駆体タンパク質をコードするすることもできる。

【0255】

いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、同じリーディングフレームで、例えば、コードされたポリペプチドの精製を可能にする標識配列に融合された成熟ＣＬＤＮ１８．２－結合ポリペプチド（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９または５Ｃ９のクローン）またはその抗原結合フラグメント）に対するコード配列を含む。例えば、細菌宿主の場合、標識配列は、前記標識に融合された成熟ポリペプチドの精製を提供するためにｐＱＥ－９ベクターによって提供されるヘキサヒスチジンタグであり得るか、または哺乳動物宿主（例えば、ＣＯＳ－７細胞）を使用する場合、標識配列は、インフルエンザ血球凝集素タンパク質に由来する血球凝集素（ＨＡ）タグであり得る。

【0256】

いくつかの別の実施形態において、本明細書に開示されるＣＬＤＮ１８．２－結合分子（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９または５Ｃ９のクローン）のＣＬＤＮ１８．２－結合フラグメント、類似体および誘導体をコードする前記ポリヌクレオチドの変異体を説明する。

【0257】

ポリヌクレオチド変異体は、コード領域、非コード領域またはその両方の変化を含む。いくつかの態様において、ポリヌクレオチド変異体は、サイレント置換、付加または欠失を生成する変化を含むが、コードされたポリペプチドの性質または活性を変化させない。いくつかの態様において、ポリヌクレオチド変異体は、遺伝コドンの縮重によるサイレント置換によって生成される。様々な理由でポリヌクレオチド変異体を生成するすることができ、例えば、特定の宿主に対するコドン発現（ヒトｍＲＮＡのコドンを、例えば、大腸菌などの細菌宿主が好むコドンに変化する）を最適化するためであり得る。本明細書に係るポリヌクレオチドを含むベクターおよび細胞をさらに提供する。

【0258】

いくつかの態様において、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９または５Ｃ９のクローン）等のＣＬＤＮ１８．２－結合分子またはその抗原結合フラグメントのＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチドシンセサイザーを使用して、科学的合成によって構築されることができる。所望のポリペプチドのアミノ酸配列および目的の組換えポリペプチドを生成する宿主細胞において好ましいそれらのコドンの選択に基づいて、そのようなオリゴヌクレオチドを設計することができる。標準的な方法を適用して、目的の単離されたポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列を合成することができる。例えば、完全なアミノ酸配列は、逆翻訳（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）された遺伝子を構築することができる。さらに、特定の単離されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡオリゴマーを合成することができる。例えば、所望のポリペプチドの一部をコードするいくつかの小さなオリゴヌクレオチドを合成しかつライゲーションさせることができる。各オリゴヌクレオチドは、通常、相互的集合のために、５’または３’のオーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を含む。

【0259】

組み立てられると（合成、部位指向突然変異誘発または別の方法によって）、特定の単離された目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、かつ所望の宿主において、タンパク質の発現に適切な制御配列に動作可能なようにリンクされることができる。ヌクレオチドシーケンシング、制限マッピングおよび適切な宿主において生物学的活性ポリペプチドの発現によって適切な組み立てを確認することができる。当技術分野でよく知られているように、宿主においてトランスフェクトされた遺伝子の高い発現レベルを得るために、当該遺伝子を選択された発現宿主において機能のある転写および翻訳発現制御配列に作動可能に連結されるべきである。

【0260】

いくつかの態様において、組換え発現ベクターは、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９または５Ｃ９のクローン）またはその抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡの増幅および発現に使用される。組換え発現ベクターは、複製可能なＤＮＡ構築物であり、前記ＤＮＡ構築物は、哺乳動物、微生物、ウイルスまたは昆虫遺伝子に由来する適切な転写または翻訳調節要素に動作可能なようにリンクされた抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合フラグメントのポリペプチド鎖をコードする合成またはｃＤＮＡ－由来ＤＮＡフラグメントを有する。

【0261】

転写ユニットは、通常、（１）遺伝子発現に調節役割を有する一つまたは複数の遺伝要素、例えば、転写プロモーターまたはエンハンサー、（２）ｍＲＮＡに転写されかつタンパク質に翻訳される構造的またはコード配列、および（３）以下に詳述するように、適切な転写および翻訳開始および終了配列等の物質の集合体を含む。そのような調節要素は、転写を制御するオペレーター配列を含むことができる。宿主で複製する能力は、通常、複製起点によって付与され、形質転換体の同定を容易にする選択遺伝子をさらに組み込むことができる。ＤＮＡ領域が互いに機能的に関連している場合、それらは動作可能なようにリンクされている。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー配列）のＤＮＡ発現がポリペプチド分泌に関与する前駆体として発現される場合、シグナルペプチド（分泌リーダー配列）のＤＮＡは、ポリペプチドに対するＤＮＡに作動可能に連結されるか、プロモーターがコード配列の転写を制御する場合、プロモーターは、コード配列作動可能に連結されるか、またはリボソーム結合部位が翻訳を可能にするように配置される場合、リボソーム結合部位は、コード配列に動作可能なようにリンクされる。酵母発現系での使用を目的とした構造要素は、宿主細胞が翻訳されたタンパク質を細胞外に分泌することを可能にするリーダー配列を含む。代替可能に、組換えタンパク質がリーダー配列またはトランジット配列なしで発現される場合、Ｎ－末端メチオニン残基を含むことができる。任意選択的に、その後、発現された組換えタンパク質から切断されて、最終生成物を提供することができる。

【0262】

発現制御配列および発現ベクターの選択は、宿主の選択に依存する。様々な発現宿主／ベクターの組み合わせを使用することができる。真核宿主に有用な発現ベクターは、例えば、ＳＶ４０、ウシ乳頭腫ウイルス、アデノウイルスおよびサイトメガロウイルスからの発現制御配列を含むベクターを含む。細菌宿主に有用な発現ベクターは、既知の細菌プラスミド、例えば、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９およびその誘導体を含む大腸菌に由来されるプラスミド、より広い宿主範囲のプラスミド、例えば、Ｍ１３および繊維状一本鎖ＤＮＡファージを含む。

【0263】

例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９または５Ｃ９のクローン）等のＣＬＤＮ１８．２－結合分子を発現するための適切な宿主細胞は、適切なプロモーターの制御下にある原核生物、酵母、昆虫または高等真核細胞を含む。原核生物は、Ｅｓｃｈｅｉｒｃｈｉａｃｏｌｉやｂａｃｉｌｌｕｓ等のグラム陰性菌またはグラム陽性菌を含む。高等真核細胞は、以下に説明するように、哺乳動物起源の確立された細胞株を含む。無細胞翻訳システムも使用することができる。細菌、真菌、酵母および哺乳動物細胞宿主で一緒に使用される適切なクローンおよび発現ベクターは、Ｐｏｕｗｅｌｓら、（クローニングベクター：実験マニュアル（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８５）に記載され、開示された内容は、参照として本明細書に引用される。タンパク質の生産方法（抗体生産を含む）に関する他の情報は、例えば、米国特許公開第２００８／０１８７９５４号、米国特許第６４１３７４６号、第６６６０５０１号および第７９３２０８７号を参照することができ、それぞれ参照として、その全体が本明細書に引用される。

【0264】

様々な哺乳動物または昆虫細胞培養システムを使用して、組換えＣＬＤＮ１８．２－結合分子、例えば抗ＣＬＤＮ１８．２抗体（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９または５Ｃ９のクローン）またはその抗原結合フラグメントを発現することができる。哺乳動物細胞での組換えタンパク質の発現が実行されることができ、その理由は、前記タンパク質が一般に正しく折りたたまれ、適切に修飾され、完全な機能を有する。

【0265】

適切な哺乳動物宿主細胞株の例としては、ＨＥＫ－２９３およびＨＥＫ－２９３Ｔ、Ｇｌｕｚｍａｎ（Ｃｅｌｌ２３：１７５、１９８１）に記載のＣＯＳ－７サル腎臓細胞株、および例えば、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、中国ハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＮＳＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞株を含む、他の細胞株を含む。哺乳動物発現ベクターは、発現される遺伝子に連結される複製原点、適切なプロモーターおよびエンハンサー等の非転写要素および他の５’または３’隣接非転写配列、ならびに必要とするリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよび受容体部位および転写終了配列等の５’または３’非翻訳配列を含むことができる。昆虫細胞で異種タンパク質を生成するためのバキュロウイルスシステムは、ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：４７（１９８８）によってレビューされる。

【0266】

形質転換された宿主によって生成されたＣＬＤＮ１８．２－結合分子、例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９または５Ｃ９のクローン）またはその抗原結合フラグメントは、任意の適切な方法によって精製される。そのような標準的方法は、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーおよびサイジングカラムクロマトグラフィー（ｓｉｚｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ））、遠心分離、溶解度の差またはタンパク質精製のための他の標準的な技術を含む。例えば、ヘキサポリヒスチジン、マルトース結合ドメイン、インフルエンザウイルスコート配列およびグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼの親和性タグは、タンパク質に付着することにより、適切な親和性カラムをによる簡単な精製が容易になる。タンパク質分解、核磁気共鳴およびｘ線結晶学を使用して単離されたタンパク質の物理的特性評価実行することもできる。

【0267】

例えば、まず商業的に入手可能なタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡＭＩＣＯＮ（登録商標）またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＰＥＬＬＩＣＯＮ（登録商標）限外ろ過装置等を使用して、培地に組換えタンパク質を分泌するシステム由来の上清液を濃縮することができる。濃縮ステップの後、濃縮物を適切な精製マトリックスに適用することができる。代替可能に、ペンダントジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックスまたは基質等の、陰イオン交換樹脂を使用することができる。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたはタンパク質精製で一般的に使用される他のタイプにすることができる。代替可能に、陽イオン交換ステップを使用することができる。適切な陽イオン交換器は、スルホプロピル基またはカルボキシメチル基を含む様々な不溶性マトリックスを含む。最後に、疎水性ＲＰ－ＨＰＬＣ媒体（例えば、ペンダントメチル基または他の脂肪族基を有するシリカゲル等）を使用する一つまたは複数の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）ステップを使用して、ＣＬＤＮ１８．２－結合分子（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９または５Ｃ９のクローン）をさらに精製することができる。前記生成ステップの一部またはすべてを様々な組み合わせで使用して、均一な組換えタンパク質を提供することもできる。

【0268】

組換えＣＬＤＮ１８．２－結合タンパク質、例えば、細菌培養物で生成される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９または５Ｃ９のクローン）またはその抗原結合フラグメントは、例えば、細胞ペレットから予備に抽出され、その後、一つまたは複数の濃縮、塩析、水性イオン交換、またはサイズ排除クロマトグラフィーステップによって単離することができる。最後の精製ステップは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用することができる。組換えタンパク質の発現に使用される微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊または細胞溶解剤の使用を含む、従来の方法で破壊することができる。

【0269】

当技術分野で知られている抗体および他のタンパク質の精製方法は、例えば、米国特許公開第２００８／０３１２４２５号、第２００８／０１７７０４８号および第２００９／０１８７００５号に記載される方法も含み、それぞれ参照としてその全体が本明細書に引用される。

【0270】

いくつかの態様において、ＣＬＤＮ１８．２－結合分子は、抗体ではないポリペプチドである。高い親和性でタンパク質標的に結合する非抗体ポリペプチドを同定および生成するための様々な方法は、当技術分野で知られている。例えば、Ｓｋｅｒｒａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１８：２９５３０４（２００７）、Ｈｏｓｓｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１５：１４－２７（２００６）、Ｇｉｌｌら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１７：６５３－６５８（２００６）、Ｎｙｇｒｅｎ、ＦＥＢＳ Ｊ．、２７５：２６６８－７６（２００８）、およびＳｋｅｒｒａ、ＦＥＢＳ Ｊ．、２７５：２６７７－８３（２００８）を参照し、それぞれ参照として、その全体が本明細書に引用される。いくつかの態様において、ファージ表示技術は、ＣＬＤＮ１８．２－結合ポリペプチドを同定／生成するために使用されることができる。

【0271】

ＶＩ．治療用抗ＣＬＤＮ１８．２抗体を使用する治療法

【0272】

さらに、ＣＬＤＮ１８．２発現またはＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞関連疾患（例えば、癌）に苦しむ患者を治療するために、抗ＣＬＤＮ１８．２結合分子（例えば、その抗原結合フラグメント、変異体および誘導体（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９または５Ｃ９のクローン）を含む抗体）を使用するための方法を提供する。いくつかの特定の態様において、そのような癌は、胃がん、食道がん、膵臓がん、肺がん、卵巣がん、結腸がん、肝臓がん、頭頚部がんおよび胆嚢がんである。他の種類の癌も考えられる。

【0273】

「ＣＬＤＮ１８．２－発現細胞」とは、ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞を指す。ＣＬＤＮ１８．２は、グリコシルホスファチジルイノミトールアンカーを介して膜結合することができ、可溶性タンパク質として存在することもできる。細胞および他の適切なサンプルにおけるＣＬＤＮ１８．２発現を検出するための方法は、当技術分野で周知であり、免疫組織化学、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ等を含むが、これらに限定されない。

【0274】

以下の議論は、本開示のＣＬＤＮ１８．２－結合分子（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９または５Ｃ９抗体的クローン）を使用する様々な疾患および病症の診断方法および治療に関するが、本明細書に記載の方法は、任意の他の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体、および例えば、ＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合することができる、本明細書に開示された抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の所望の特性を維持する、これらの抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の抗原結合フラグメントおよび変異体に適用されることもできる。いくつかの態様において、ＣＬＤＮ１８．２－結合分子は、ヒトＡＤＣＣを媒介しないヒトまたはヒト抗体であるか、またはＡＤＣＣを媒介しないように遺伝子操作された抗ＣＬＤＮ１８．２抗体である。

【0275】

いくつかの実施形態において、ＣＬＤＮ１８．２－結合分子は、例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９またはその抗原結合フラグメント、または抗ＣＬＤＮ１８．２－９Ａ１またはその抗原結合フラグメントである。他の実施形態において、ＣＬＤＮ１８．２－結合分子は、クローン突然変異抗体である。いくつかの態様において、ＣＬＤＮ１８．２－結合分子は、クローン化されたモノクローナル抗体である。いくつかの態様において、ＣＬＤＮ１８．２－結合分子は、血中半減期を延長するように設計されたクローン化モノクローナル抗体である。別の態様において、ＣＬＤＮ１８．２結合分子は、クローン化されたＹＴＥ突然変異抗体である。

【0276】

一実施形態において、治療は、被験者または患者に抗ＣＬＤＮ１８．２結合分子（例えば、本開示の抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体）を適用または投与するか、または被験者または患者から単離された組織または細胞株に抗ＣＬＤＮ１８．２結合分子を適用または投与することを含み、ここで、被験者または患者は、疾患、疾患症状に苦しんでいるか、または疾患にかかりやすい。別の実施形態において、治療は、被験者または患者に抗ＣＬＤＮ１８．２結合分子（例えば、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体）を含む医薬組成物を適用または投与するか、または被験者または患者から単離された組織または細胞株に抗ＣＬＤＮ１８．２結合分子を含む医薬組成物を適用または投与ことを含むように意図し、前記被験者または患者は、疾患、疾患症状に苦しんでいるか、または疾患にかかりやすい。

【0277】

抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体などの本開示の抗ＣＬＤＮ１８．２結合分子は、様々な癌を治療するために使用されることができる。一態様において、特に、胃がん、食道がん、膵臓がん、肺がん、卵巣がん、結腸がん、肝臓がん、頭頚部がんおよび胆嚢がんを含む、癌を治療または予防するための医薬として使用される、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体などの抗ＣＬＤＮ１８．２結合分子を説明する。

【0278】

前記方法によれば、少なくとも一つの抗ＣＬＤＮ１８．２結合分子、例えば、本明細書の他で定義された抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９またはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体を使用して、癌に関する陽性治療反応を促進する。癌治療に関する「陽性治療反応」という用語は、これらの抗ＣＬＤＮ１８．２結合分子（例えば、抗体または抗原結合フラグメント、その変異体または誘導体）の活性に関連する疾患の改善、および／または疾患に関連する症状の改善を指す。従って、例えば、疾患の改善は、完全な反応として特徴づけることができる。「完全な反応」とは、臨床的に検出可能な疾患がなく、以前の監査結果を正常化する必要があることを意味する。代替可能に、疾患の改善は、部分的反応として分類することができる。「陽性治療反応」は、癌の発生および／または持続時間の減少または阻害、癌の重症度の減少または改善、および／または本明細書に開示される一つまたは複数の抗ＣＬＤＮ１８．２結合分子の症状の改善を含む。

【0279】

特定の態様において、そのような用語は、本明細書に開示される抗ＣＬＤＮ１８．２結合分子を投与した後、（１）癌細胞集団の安定化、減少または除去、（２）癌増殖の安定化または減少、（３）癌形成障害、（４）原発性、局所性および／または転移性癌の根絶、去除または制御、（５）死亡率の低下、（６）無病、再発なし、無増悪および／または全生存率、持続時間または発生率の増加、（７）応答率、応答持続時間または応答または緩和された患者数の増加、（８）入院率の減少、（９）入院期間の減少、（１０）癌のサイズが維持され、かつ増加しないか、１０％未満、好ましくは、５％未満、好ましくは、４％未満、好ましくは、２％未満の増加、および（１２）緩和された患者数の増加のうち、一つ、二つまたは三つまたはそれ以上を引き起こすことを指す。

【0280】

臨床反応は、例えば、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）スキャン、Ｘ－線撮影画像法、コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャン、フローサイトメトリーまたは蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）分析、組織学、マクロ病理学および血液化学などのスクリーニング技術を使用することがてき、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、クロマトグラフィー等によって検出可能な変化を含むが、これらに限定されない。これらの陽性治療反応に加えて、抗ＣＬＤＮ１８．２結合分子（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体）治療法を受けた被験者は、疾患に関連する症状が改善される有益な効果を経験することもできる。

【0281】

いくつかの実施形態において、例えば、本明細書に開示される抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９またはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体等の、抗ＣＬＤＮ１８．２結合分子は、任意の既知の癌治療と組み合わせて使用することができ、これは、癌（例えば、胃がん、食道がん、膵臓がん、肺がん、卵巣がん、結腸がん、肝臓がん、頭頚部がんおよび胆嚢がん）の治療に有益であることが知られているか、または使用されたか、または現在源を治療するために使用されている、任意の薬剤または薬剤の組み合わせを含む。薬物組み合わせ製剤または投与スキームの第２の薬剤または薬剤の組み合わせは、いくつかの実施形態において本明細書に係る抗体またはポリペプチドに対する相補的な活性を有し、互いに悪影響を及ぼさないようにする。

【0282】

抗がん剤は、癌性増殖等の悪性腫瘍の治療に使用される薬物を含む。薬物治療法は、単独で使用するか、または他の治療（例えば、手術または放射線治療法）と組み合わせて使用することもできる。関与する臓器の性質に応じて、いくつかのタイプの薬物は、癌の治療に使用されることができる。特定の態様において、例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９またはその抗原結合フラグメント等の、本明細書に開示されるＣＬＤＮ１８．２－結合分子は、例えば、ＰＤ－１（プログラムされた死滅１タンパク質）、その二つのリガンドＰＤ－Ｌ１（プログラム性死滅リガンド１）および／またはＰＤ－Ｌ２またはＣＴＬＡ－４（細胞毒性Ｔリンパ球抗原４タンパク質）等を標的とする抗体または抗体フラグメントと組み合わせて投与されることができる。例えば、Ｓｔａｇｇら、ＰＮＡＳ１０７：１５４７１５５２（２０１０）、Ｊｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７０（６）：（２０１０）、Ａｌｌａｒｄら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９：５６２６（２０１３）を参照し、参照によりその全体が本明細書に引用される。いくつかの態様において、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、イピリムマブまたはその抗原結合フラグメントである。別の態様において、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、トレメリムマブ（チシリムマブ（ｔｉｃｉｌｉｍｕｍａｂ）、ＣＰ－６７５，２０６）またはその抗原結合フラグメントである。いくつかの態様において、抗ＰＤ－１抗体は、ペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）、以前は、ランブリズマブ（ｌａｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）であり、ＭＫ－３４７５と呼ばれる）またはその抗原結合フラグメントである。いくつかの態様において、抗ＰＤ－１抗体は、ニボルマブ（ＢＭＳ－９３６５５８、ＭＤＸ－１１０６、ＯＮＯ－４５３８、ＯＰＤｉｖＡ０）またはその抗原結合フラグメントである。いくつかの態様において、抗ＰＤ－Ｌｌ抗体は、ＢＭＳ－９３６５５９またはその抗原結合フラグメントである。別の態様において、抗ＰＤ－Ｌｌ抗体は、ＭＰＤＬ３２８０Ａである。別の態様において、抗ＰＤ－１抗体は、ＡＭＰ－２２４（抗ＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質）またはその抗原結合フラグメントである。

【0283】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＣＬＤＮ１８．２－結合分子（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９）は、抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－１抗体と組み合わせて投与されることができる。様々な実施形態において、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１１ｍｇ／ｋｇ、約１２ｍｇ／ｋｇ、約１３ｍｇ／ｋｇ、約１４ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約１６ｍｇ／ｋｇ、約１７ｍｇ／ｋｇ、約１８ｍｇ／ｋｇ、約１９ｍｇ／ｋｇまたは約２０ｍｇ／ｋｇの濃度で投与される。他の濃度も考慮される。

【0284】

いくつかの実施形態において、本明細書開示されるＣＬＤＮ１８．２－結合分子（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９）は、抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１または抗ＣＴＬＡ４抗体と組み合わせて投与されることができ、ここで、抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１または抗ＣＴＬＡ４抗体は、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１１ｍｇ／ｋｇ、約１２ｍｇ／ｋｇ、約１３ｍｇ／ｋｇ、約１４ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約１６ｍｇ／ｋｇ、約１７ｍｇ／ｋｇ、約１８ｍｇ／ｋｇ、約１９ｍｇ／ｋｇまたは約２０ｍｇ／ｋｇの濃度で投与される。他の濃度も考慮される。

【0285】

いくつかの他の的実施形態において、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体および抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１または抗ＣＴＬＡ４は、約１：１、１：２、１：３または１：４の比率で投与されることができる。他の比率も考慮される。例えば、いくつかの実施形態において、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体および抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１または抗ＣＴＬＡ４抗体は、約１：２の比率で投与される。一つも例示的な実施形態において、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９）の濃度は、約１０ｍｇ／ｋｇであり、抗ＰＤ－１抗体の濃度は、約２０ｍｇ／ｋｇである。

【0286】

一つの代替可能な実施形態において、本明細書に開示されるＣＬＤＮ１８．２－結合分子（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９）は、抗ＰＤ－１抗体と組み合わせて投与される。

【0287】

いくつかの態様において、未治療の被験者または単剤治療法（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体を含まない抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１または抗ＣＴＬＡ４抗体）で治療された被験者と比較して、抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１または抗ＣＴＬＡ４抗体と組み合わせる本明細書に開示されるＣＬＤＮ１８．２結合分子（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９）を含む組み合わせ治療は、生存率を少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約１００％増加させることができる。

【0288】

いくつかの実施形態において、未治療の被験者または単剤治療法（例えば、无抗ＣＬＤＮ１８．２抗体を含まない抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１または抗ＣＴＬＡ４抗体）で治療された被験者と比較して、本明細書に開示されるＣＬＤＮ１８．２－結合分子（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９）と抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１または抗ＣＴＬＡ４抗体の組み合わせを含む組み合わせ治療で投与すれば、生存率を少なくとも約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍または約１０倍を高めることができる。

【0289】

併用治療法が抗ＣＬＤＮ１８．２結合分子の投与と別の治療剤（例えば、抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１または抗ＣＴＬＡ４抗体）の投与との組み合わせを含む場合、本明細書に開示される方法は、別個の製剤または単一の薬物製剤（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ、薬学的処方とも言い）を使用する同時投与、およびいずれかの順序での連続投与を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９）は、他の薬物と組み合わせて投与され、ここで、抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体は、一つまたは複数の治療剤と任意の順序で順次にまたは同時（即ち、同時にまたは同じ時間範囲内で）に投与されることができる。

【0290】

併用治療法は、「相乗効果」をもたらしかつ「相乗的」を証明することができ、即ち、活性成分を一緒に使用される場合に得られる効果は、化合物を単独で使用される場合に得られる効果の合計よりも多くななる。活性成分が、（１）組み合わせた単位投与量製剤で共製剤化されかつ同時に投与または送達、（２）単独製剤で交互にまたは同時に送達、または（３）他のいくつかのスキーム等のように処理される場合に、相乗効果を得ることができる。交互治療法で送達される場合、化合物が、例えば、別々の注射器で異なる注射によって順次に投与されるか、または送達される場合、相乗効果を得ることができる。通常、交互治療法期間において、各活性成分の有効量を順次に、つまり順次に投与し、併用治療法において、有効量の二つまたは複数の活性成分を一緒に投与する。

【0291】

別の態様において、本明細書に開示されるＣＬＤＮ１８．２－結合分子（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９）は、チロシンキナーゼ阻害剤と組み合わせて投与されることができる。いくつかの他の特定の態様において、本明細書に開示されるＣＬＤＮ１８．２－結合分子は、ＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ２／ｎｅｕに関連するチロシンキナーゼ活性の阻害剤（例えば、ラパチニブ）と組み合わせて投与されることができる。いくつかの態様において、本明細書に開示されるＣＬＤＮ１８．２－結合分子は、抗有糸分裂剤と組み合わせて使用されることができる。いくつかの特定の態様において、本明細書に開示されるＣＬＤＮ１８．２結合分子は、有糸分裂紡錘体の微小管集合を安定化する試薬（例えば、パクリタキセルまたはドセタキセル）と組み合わせて投与されることができる。

【0292】

別の実施形態は、所与の治療手段の有効性を決定するための臨床試験プログラムの一部として、組織中のタンパク質レベルを診断モニタリングのための、例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９）等の抗ＣＬＤＮ１８．２結合分子に関する。例えば、抗体を検出可能な物質にカップリングして、検出を促進することができる。

【0293】

検出可能な物質の例としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料および放射性材料を含む。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、１３－ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼを含み、適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを含み、適切な蛍光材料の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジンアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンを含み、発光材料の例としては、ルミノールを含み、生物発光材料の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンを含み、および適切な放射性材料の例としては、１２５１、１３１－、１^３５Ｓまたは^３Ｈを含む。

【0294】

ＶＩＩ．抗ＣＬＤＮ１８．２抗体治療的組み合わせおよび共同治療法

【0295】

いくつかの別の実施形態は、癌（胃がん、食道がん、膵臓がん、肺がん、卵巣がん、結腸がん、肝臓がん、頭頚部がんおよび胆嚢がんを含む）を患う患者を治療するための抗ＣＬＤＮ１８．２結合分子（例えば、抗原結合フラグメント、変異体およびその誘導体（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９抗体）を含む抗体）を含む治療的組み合わせの使用に向けられた方法に関する。以下の議論は、以下の議論は、本明細書に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９抗体）を特徴とする治療的組み合わせに言及するが、本明細書に記載の方法は、他の任意の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体にも適用可能であり、これらの抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の抗原結合フラグメント、変異体および誘導体（例えば、融合タンパク質またはコンジュゲート）は、本明細書に開示される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の所望の特性を保持している。いくつかの態様において、ＣＬＤＮ１８．２－結合分子は、ヒトＡＤＣＣを媒介しないヒトまたはヒト抗体、またはＡＤＣＣを媒介しないように遺伝子操作された抗ＣＬＤＮ１８．２抗体である。

【0296】

本明細書に記載の併用治療法（例えば、抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１または抗ＣＴＬＡ４抗体と組み合わせた抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合フラグメント）を使用する固形腫瘍の患者に対する治療は、累積効果または相乗効果をもたらすことができる。本明細書で使用されるように、「相乗的」という用語は、単剤治療法の累積効果よりも効果的な治療法の組み合わせ（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９抗体と抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１または抗ＣＴＬＡ４抗体との組み合わせ等の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体等）を指す。

【0297】

治療法の組み合わせ（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体と抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１または抗ＣＴＬＡ４抗体との組み合わせ）の相乗効果により、低投与量の一つまたは複数の治療剤の使用、および／または固形腫瘍の患者への前記治療剤のより少ない頻度の投与が可能になる。より低投与量の治療剤を使用する能力、および／またはより少ない頻度で治療を投与する能力は、固形腫瘍の治療における治療の有効性を低下させることなく、対象への治療の投与に関連する毒性を低減する。さらに、相乗効果は、固形腫瘍の管理、治療または改善における治療剤の有効性を増加につながる可能性がある。治療剤の組み合わせの相乗効果は、任意の単剤治療法の使用に関連する望ましくないまたは望ましくない副作用を回避または低減することができる。

【0298】

共同治療法において、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９抗体）またはその抗原結合フラグメントと抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１または抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合フラグメントとの組み合わせは、任意選択で同じ医薬組成物に含まれることができるか、または別個の医薬組成物に含まれることができる。後者の場合、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９抗体）またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物は、抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１または抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物の投与の前、同時、または後に投与するのに適用する。いくつかの状況下で、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９抗体）またはその抗原結合フラグメントおよび抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１または抗ＣＴＬＡ４抗体は、重複する時間に別々の組成物で投与される。

【0299】

抗ＣＬＤＮ１８．２抗体（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９抗体）またはその抗原結合フラグメントおよび抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１または抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合フラグメントは、患者に依然に利益をもたらしながら、一度だけまたはまれに投与することができる。別の実施形態において、患者に追加の後続投与量を投与することができる。患者の年齢、体重、臨床評価、腫瘍量および／または他の要因（主治医の判断を含む）に応じて、異なる時間間隔で投与することができる。例えば、後続投与量は、患者に初期投与量を投与した後、１週間、２週間、３週間等、１か月、２か月、３か月、６か月等、１年、２年、３年等で投与されることができる。

【0300】

本明細書で提供される方法は、腫瘍の増殖を減少または遅延させることができる。いくつかの態様において、減少または遅延は、統計的に有意である可能性がある。腫瘍増殖の減少は、ベースラインで患者の腫瘍増殖、予想される腫瘍増殖、大規模な患者群体に基づく予想される腫瘍増殖または対照集団における腫瘍増殖と比較して測定することができる。他の実施形態において、前記方法は、生存率の増加をもたらす。

【0301】

ＶＩＩＩ．医薬組成物および投与方法

【0302】

例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９抗体）等の抗ＣＬＤＮ１８．２結合分子の調製および投与必要とする被験者への投与は、周知であるか、または当業者によって容易に決定される。抗ＣＬＤＮ１８．２結合分子（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体）の投与経路は、経口、非経口、吸入または局所であり得る。本明細書で使用される非経口という用語は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸または膣内投与等の投与を含む。しかしながら、本明細書の教示と互換性のある他の方法において、例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体等の本開示の抗ＣＬＤＮ１８．２結合分子は、有害な細胞集団の部位に直接送達され、治療薬への病変組織の曝露を増加させることができる。

【0303】

本明細書で論じられるように、例えば、本開示の抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９抗体）等の抗ＣＬＤＮ１８．２結合分子は、特定の種類の癌等、ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞媒介性疾患のインビボ治療による薬学的有効量で投与されることができる。

【0304】

抗ＣＬＤＮ１８．２結合分子（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体）（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９抗体）と抗ＰＤ－１、抗ＰＤＬ１および／または抗ＣＴＬＡ４抗またはその抗原結合フラグメントとの組み合わせを含む治療的組み合わせで調製し、かつ必要とする被験者に投与する方法は、当業者に周知であるか、同業者によって容易に決定される。その組み合わせの投与経路は、例えば、経口、非経口、吸入または局所であり得る。本明細書で使用される非経口という用語は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸または膣内投与等の投与を含む。しかしながら、本明細書の教示と互換性のある他の方法において、本明細書に記載の組み合わせは、有害な細胞集団の部位に直接送達され、治療薬への病変組織の曝露を増加させることができる。本明細書に論じられるように、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９抗体）と抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１および／または抗ＣＴＬＡ４抗体との組み合わせは、特定の種類の癌（例えば、胃がん）等、ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞媒介性疾患のインビボ治療による薬学的有効量で投与されることができる。

【0305】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の医薬組成物は、例えば、水、イオン交換剤、タンパク質、緩衝物質および塩を含む、薬学的に許容されるキャリアをさらに含むことができる。防腐剤および他の添加剤は、いくつかの代替実施形態に存在することもできる。ベクターは、溶媒または分散媒体であり得る。本明細書に開示される治療法に適した製剤は、以前にレミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．）第１６版（１９８０））に記載されている。

【0306】

本明細書に記載の実施形態のいずれかによれば、滅菌注射可能な溶液は、活性化合物（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体、例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９抗体、自体または活性化剤との他の組み合わせ）の前記治療用の組み合わせを必要な量で溶媒に組み込んだ後、フィルター滅菌することによって調製することができる。さらに、製剤を包装してキットの形態で販売することができる。そのような製品は、疾患または病症に罹患しているか、または罹患しやすい対象を治療するための関連する組成物を示すタグまたは包装挿入物を有することができる。

【0307】

非経口製剤は、単回一時投与量、注入またはロード一時投与量、その後の維持投与量であり得る。これらの組成物は、特定の固定または可変間隔で、例えば、１日１回、または「必要に応じて」ベースで投与されることができる。

【0308】

組成物は、単回投与量、複数投与量または決定された注入期間内に投与されることができる。最も好ましい反応（例えば、治療または予防反応）を提供するように投与量スキームを調整することができる。

【0309】

ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞媒介疾患（例えば、胃がん、食道がん、膵臓がん、肺がん、卵巣がん、結腸がん、肝臓がん、頭頚部がんおよび胆嚢がんを含む、特定のタイプの癌）の治療に使用される本明細書に記載の組成物の治療有効量は、投与方式、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与された他の薬物および治療が予防的であるか治療的であるか等、複数の異なる要因によって異なる。通常、患者は、非ヒト哺乳動物（治療も可能なトランスジェニック哺乳動物を含む）ではなくヒトである。治療容量は、安全性予備用構成を最適化するために当業者に知られている従来の方法を使用して滴定されることができる。

【0310】

投与される本発明の抗体または其結合フラグメント、変異体または誘導体（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９抗体）または治療的組み合わせ等の少なくとも櫃との抗ＣＬＤＮ１８．２結合分子の量は、本開示に基づく過度の実験なしに、当業者によって容易に決定される。少なくとも一つの抗ＣＬＤＮ１８．２結合分子（例えば、本発明の抗体、その抗原結合フラグメント、変異体または誘導体または治療的組み合わせ）の投与方式およびそれぞれの投与量に影響を与える要因は、治療を受ける個体の疾患の重症度、疾患の病歴および年齢、身長、体重、健康状况および身体状况を含むが、これらに限定されない。類似的に、投与される本明細書に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２結合分子（例えば、抗体またはそのフラグメント、変異体または誘導体または治療的組み合わせ）の量は、投与方式および被験者が当該薬剤の単回投与または複数投与のどちらを経験するかによって異なる。

【0311】

別の実施形態は、一つのタイプの癌（胃がん、食道がん、膵臓がん、肺がん、結腸がん、頭頚部がんおよび胆嚢がんを含む）の治療のための薬剤の調製における抗ＣＬＤＮ１８．２結合分子（例えば、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９抗体）または治療的組み合わせ）の用途に関する。他のタイプの癌も考慮される。

【0312】

さらに別の実施形態は、被験者を治療するための、および一つのタイプの癌を治療するための薬剤の調製における抗ＣＬＤＮ１８．２結合分子（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９抗体））の用途に関する。いくつかの態様において、薬物は、少なくとも一つの他の治療法で前治療された被験者において使用される。

【0313】

「前治療された」または「前治療」という用語は、被験者が、抗ＣＬＤＮ１８．２結合分子（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９抗体））を含む薬物を受ける前に、一つまたは複数他の治療法（例えば、被験者は、少なくとも一つの他の抗癌治療法で治療された）を受けたことを指す。被験者は、一つまたは複数の以前の治療法の全処理に対する反応者である必要はない。従って、抗ＣＬＤＮ１８．２結合分子（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体）を含む薬物を投与されている被験者は、以前の治療あるいは一つまたは複数の以前の治療の前治療（ここで、前治療は、様々な治療法を含む）に反応したか、または反応しなかった可能性がある。

【0314】

さらに別の実施形態は、抗ＣＬＤＮ１８．２結合分子（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９抗体））と少なくとも一つの他の治療法との同時投与を含む。抗ＣＬＤＮ１８．２抗体および少なくとも一つの他の治療法は、単一の組成物で一緒に同時投与するか、または別個の組成物に同時にまたは重複する時間で一緒に共同投与されることができる。いくつかの態様において、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、例えば、ＰＤ－１（プログラム性死滅１タンパク質）を標的とする抗体と共同投与されることができる。別の実施形態は、被験者の癌を治療するための薬物の調製における抗ＣＬＤＮ１８．２結合分子（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９抗体））の用途に関し、ここで、抗ＣＬＤＮ１８．２結合分子は、被験者が少なくとも一つの他の治療法で治療される前に投与される。

【0315】

ＩＸ．診断

【0316】

さらに別の実施形態は、例えば、特定のタイプの癌等のＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞媒介疾患の診断に有用な診断方法に関し、個体からの組織または他の細胞または体液におけるＣＬＤＮ１８．２タンパク質の発現レベルを測定することを含み、測定された発現レベルは、正常組織または体液における標準のＣＬＤＮ１８．２発現レベルト比較することにより、標準値と比較した発現レベルの増加で疾患を示す。

【0317】

本明細書に開示される抗ＣＬＤＮ１８．２抗体およびその抗原結合フラグメント、変異体および誘導体（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９抗または抗ＣＬＤＮ１８．２－１Ｄ５抗体）は、当業者に知られている古典的な免疫組織学的方法を使用して、生物学的サンプル中のＣＬＤＮ１８．２タンパク質レベルを決定するために使用されることができる（例えば、Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６－９８５（１９８５）、Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７－３０９６（１９８７））。ＣＬＤＮ１８．２タンパク質の発現を検出するために使用できる他の抗体ベースの方法は、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降またはウエスタンブロット等の免疫測定を含む。適切なアッセイは、本明細書の他で詳しく説明する。

【0318】

「ＣＬＤＮ１８．２ポリペプチドの発現レベルを測定」という句は、第１の生物学的サンプル中のＣＬＤＮ１８．２ポリペプチドのレベルを直接的（例えば、絶対タンパク質レベルを決定または推定することによって）または比較的（例えば、第２の生物学的サンプル中の疾患関連ポリペプチドレベルとの比較によって）定性的または定量的に測定または推定することを意味する。第１の生物学的サンプルにおけるＣＬＤＮ１８．２ポリペプチド発現レベルを測定または推定し、標準のＣＬＤＮ１８．２ポリペプチドレベルト比較することができ、当該標準値は、病症のない個体から得られた第２の生物学サンプルから取るか、または病症のない個体集団の平均レベルによって決定されることができる。当技術分野で理解されるように、「標準的な」ＣＬＤＮ１８．２ポリペプチドレベルが知られると、比較の標準として再利用することができる。

【0319】

「生物学的サンプル」という用語は、ＣＬＤＮ１８．２を発現する可能性のある個体、細胞株、組織培養物または他の細胞源から得られた任意の生物学的サンプルを指す。哺乳動物から生検組織および体液を得るための方法は、当技術分野で知られている。

【0320】

Ｘ．ＣＬＤＮ１８．２－結合分子を含むキット

【0321】

別の実施形態は、本明細書に記載の方法を実施するために使用されることができる、例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合フラグメント、本明細書に開示される分子の変異体または誘導体（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９抗体または抗ＣＬＤＮ１８．２－１Ｄ５抗体）等の、本明細書に記載のＣＬＤＮ１８．２－結合分子の少なくとも一つを含む、キットに関する。いくつかの実施形態において、キットは、一つまたは複数の容器に少なくとも一つの精製された抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合フラグメントが含まれる。いくつかの他の実施形態において、キットは、すべての対照、試験の実行手順、および結果の分析と表示に必要なソフトウェアを含む、試験の実行に必要および／または十分なすべての構成要素を含む。当業者は、例えば、本明細書に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９抗体または抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９抗体）等の開示されるＣＬＤＮ１８．２－結合分子が、当技術分野で周知の構築されたキットフォーマットに容易に統合されることができることを容易に知ることができる。

【0322】

ＸＩ．免疫測定

【0323】

例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合フラグメント、本明細書に開示される分子の変異体または誘導体（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９抗体）等の、本明細書に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２結合分子の免疫特異的結合は、当技術分野で知られている任意の方法によって決定されることができる。使用できる例示的免疫測定は、例えば、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫測定、免疫沈降アッセイ、沈殿タンパク質反応、ゲル拡散、沈殿タンパク質反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定アッセイ、免疫放射アッセイ、蛍光イムノアッセイ、タンパク質Ａイムノアッセイ等の技術を使用する競争的および非競争的測定システムを含むが、これらに限定されない。そのような測定は、日常的であり、当技術分野でよく知られている（Ａｕｓｕｂｅｌら、編集、（１９９４）分子生物学の現在のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、ＮＹ）第１卷を参照、参照によりその全体が本明細書に引用される）。

【0324】

いくつかの実施形態において、例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合フラグメント、およびそれらの変異体または誘導体（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９抗体）等のＣＬＤＮ１８．２－結合分子は、ＣＬＤＮ１８．２またはその保存的変異体またはペプチドフラグメントのインサイチュ（ｉｎｓｉｔｕ）検出のために、免疫蛍光、免疫電子顕微鏡法、または非免疫測定等の組織学的に使用されることができる。インサイチュ検出は、患者から組織学的標本を取り出し、かつそれに標識されたＣＬＤＮ１８．２－結合分子（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体）（好ましくは、標識されたＣＬＤＮ１８．２－結合分子を生物サンプルに覆うことにより適用される）を適用することによって行われることができる。そのようなプログラムを使用することにより、ＣＬＤＮ１８．２または保存的変異体またはペプチドフラグメントの存在だけでなく、検査された組織におけるその分布も決定することができる。本開示を使用して、当業者は、そのようなインサイチュ検出を達成するために、様々な組織学的方法（例えば、染色手順）のいずれかを変更できることを容易に認識するであろう。

【0325】

周知の方法に従って、ＣＬＤＮ１８．２－結合分子（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９抗体）またはその抗原結合フラグメント、変異体または誘導体）の所与のバッチの結合活性を決定することができる。当業者は、日常的な実験を使用することにより、各測定の動作および最適な測定条件を決定することができるであろう。

【0326】

抗ＣＬＤＮ１８．２抗体（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９抗体）またはその抗原結合フラグメント、変異体または改変／突然変異誘導体等の単離されたＣＬＤＮ１８．２－結合分子を決定するのに適した方法および試薬は、当技術分野で知られており、および／または市販されている。この動力学的分析のために設計された機器およびソフトウェアは、市販されていることができる（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＫｉｎＥｘａ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ等）。

【0327】

別に説明されない限り、当技術分野の技術の範囲内で、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の従来の技術が使用される。そのような技術は、文献で十分に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、編集（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、編集（１９９２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮＹ）、Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編集、（１９８５）ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第ＩおよびＩＩ卷、Ｇａｉｔ、編集（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許Ｎｏ．４６８３１９５、ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ、編集（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ、編集（１９８４）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９８７）Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓら、Ｉｎｃ．）、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）（１９８６）、Ｐｅｒｂａｌ（１９８４）Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．）、Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ編集（１９８７）Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｗｕら、編集、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５４および１５５卷、ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ、編集（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）、ＷｅｉｒおよびＢｌａｃｋｗｅｌｌ、編集、（１９８６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘ
ｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第Ｉ－ＩＶ卷、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、（１９８６）、およびＡｕｓｕｂｅｌら、（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍｄ．）を参照する。

【0328】

抗体工学の一般的な原則は、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ、編集（１９９５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（第２版、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ）に示される。タンパク質工学の一般的な原則は、Ｒｉｃｋｗｏｏｄら、編集（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇ．）に示される。抗体および抗体－ハプテンの一般的な原則は、Ｎｉｓｏｎｏｆｆ（１９８４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第２版、Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、Ｍａｓｓ．）、およびＳｔｅｗａｒｄ（１９８４）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｔｈｅｉｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（ＣｈａｐｍａｎおよびＨａｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．）に示される。さらに、当技術分野で知られており、かつ具体的に記載されていない免疫学標準方法は、通常、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｓｔｉｔｅｓら、編集（１９９４）Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第８版、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ、Ｃｏｎｎ．）ならびにＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ（編集）（１９８０）Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、ＮＹ）に従う。

【0329】

免疫学の一般的な原則を明確にする標準的な参照文献は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｋｌｅｉｎ（１９８２）Ｊ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｓｅｌｆ－Ｎｏｎｓｅｌｆ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ）、Ｋｅｎｎｅｔｔら、編集（１９８０）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ）、Ｃａｍｐｂｅｌｌ（１９８４）「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」 ｉｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂｕｒｄｅｎら、編集、（Ｅｌｓｅｖｅｒｅ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）、Ｇｏｌｄｓｂｙら、編集（２０００）Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｎｏｌｏｇｙ（第４版、Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎｄ＆Ｃｏ．）、Ｒｏｉｔｔら、（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第６版、Ｌｏｎｄｏｎ：Ｍｏｓｂｙ）、Ａｂｂａｓら、（２００５）Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第５版、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）、ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ（２００１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｎ）、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）、Ｌｅｗｉｎ（２００３）Ｇｅｎｅｓ ＶＩＩＩ（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌ１２００３）、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）、ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒ（２００３）ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）を含む。

【0330】

上で引用されたすべての参照文献および本明細書で引用されたすべての参照文献は、参照によりその全体が本明細書に引用される。

【0331】

以下の実施例は、限定ではなく例示として提供される。

【0332】

以下の非限定的な例は、本明細書に記載の特定の抗体の調製および抗体を使用する方法を詳細に説明する。本開示の範囲から逸脱することなく、材料および方法の両方に多くの修正を加えることができることは当業者には明らかであろう。

【実施例】

【0333】

クローディンは、１９９８年に最初に記載されたタンパク質ファミリーであり、密接な細胞接合の重要な構成要素を形成する。クローディンは、細胞間の分子の流れを制御する、傍細胞バリアを確立する。異なるクローディンは、異なる組織で発現され、それらの改変した機能は、各組織での癌の形成に関連する。クローディン－１発現は、結腸がんで予後的価値があることが示され、クローディン－１８は、胃がんで予後的価値があり、クローディン－１０は、肝細胞がんで予後的価値がある。表面タンパク質としてのクローディンは、様々な治療戦略の有用な標的を表す。Ｕｇｕｒ Ｓａｈｉｎらは、密接接合（ｔｉｇｈｔ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）分子クローディン－１８（ＣＬＤＮ１８．２）のアイソタイプ２を高度に選択的な細胞系統マーカーとして同定される。それらは、正常組織でのその発現が胃粘膜から分化した上皮細胞に厳密に限定されていることを観察したが、胃幹細胞の領域には存在しない。クローディン１８．２は、悪性形質転換を続けており、ほとんどの原発性胃がんおよびその転移で発現する。クローディン１８．２の異所性活性化は、膵臓腫瘍、食道腫瘍、卵巣腫瘍および肺腫瘍によくみられる。研究によると、ＣＬＤＮ１８．２は、正常組織での発現パターンが非常に制限され、様々なヒトの癌で頻繁に異所性の活性化がみられる。

【0334】

クローディン１８（ＣＬＤＮ１８）分子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：スプライス変異体１（ＣＬＤＮ１８．１）：ＮＰ＿０５７４５３、ＮＭ＿０１６３６９およびスプライス変異体２（ＣＬＤＮ１８．２）：ＮＭ＿００１００２０２６、ＮＰ００１００２０２６）の分子量は、約２７．９／２７．７２ｋＤである。特定の癌および隣接する正常組織において、タンパク質の分子量は、異なる。組織溶解物を脱グリコシル化された化合物ペプチドＮ－グリコシダーゼで処理することにより、健康な組織で観察された高分子量タンパク質を、癌で観察されたのと同じ分子量分子に移すことができる。これは、正常組織の対応物と比較して、ＣＬＤＮ１８が癌におけるＮ－グリコシル化の程度が低いことを示す。こんな構造の違いにより、エピトープが改変することができる。ＣＬＤＮ１８．１は、正常な肺および胃の上皮細胞で選択的に発現するが、ＣＬＤＮ１８．２は、胃の細胞でのみ発現する（Ｎｉｉｍｉ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１：７３８０－９０、２００１）。最も重要なことは、ＣＬＤＮ１８．２は、胃の上皮細胞の分化した短命の細胞に限定されるが、胃幹細胞の領域に由来するものではない。クローディン１８．２は、腫瘍の発生および発達に関与しており、細胞膜の外側に位置する。細胞外ループが露出しており、モノクローナル抗体の結合に使用されることができる。これらの生物学的特徴は、それが標的治療法にとって理想的な分子であり、かつＣＬＤＮ１８．２－結合分子（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗原結合フラグメントおよびそれらの変異体または誘導体（例えば、抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９抗体））のさらなる開発につながったことを示す。

【0335】

本明細書に記載の抗体は、ＣＬＤＮ１８に存在するエピトープに特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体であり得る。本発明に含まれる単離されたモノクローナル抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＧ１－４、ＩｇＥ、ＩｇＭおよびＩｇＤ抗体を含む。

【0336】

本明細書に記載の単離された結合分子（例えば、抗体）またはその抗原結合フラグメントは、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの従来のハイブリドーマ技術（Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５（１９７５）を含む、様々な技術によって生成されることができる。本発明においてハイブリドーマ手順が好ましいが、原則として、例えば、Ｂリンパ球のウイルスまたは発癌性形質転換または抗体遺伝子ライブラリーを使用するファージ表示技術等、モノクローナル抗体を生成するするための他の技術を使用することができる。

【0337】

モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製するための好ましい動物系は、マウス系である。マウスにおけるハイブリドーマの生成は、非常によく確立された方法である。融合のために免疫された脾臓細胞を単離するための免疫化プロトコルおよび技術は、当技術分野で知られている。融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫瘍瘍細胞）および融合手順も知られている。

【0338】

さらに別の好ましい実施形態において、マウスシステムの代わりにヒト免疫システムの一部を運ぶトランスジェニックまたはトランスフェクトされた染色体マウスを使用して、ＣＬＤＮ１８．２に対するヒトモノクローナル抗体を生成することができる。これらのトランスジェニックおよびトランスフェクトされた染色体マウスは、それぞれ、ＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスと呼ばれるマウスを含み、本明細書では、まとめて「トランスジェニックマウス」と呼ばれる。ＷＯ２００４０３５６０７のＣＤ２０について詳細に説明されるように、そのようなトランスジェニックマウスでヒト抗体を生成することができる。

【0339】

モノクローナル抗体を生成するための別の戦略は、戦略を定義する抗体を生成するリンパ球から抗体をコードする遺伝子を直接単離することができ、例えば、Ｊ Ｓ Ｂａｂｃｏｃｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３（１５）、７８４３（１９９６）を参照する。組換え抗体工学的詳細については、ＷｅｌｓｃｈｏｆおよびＫｒａｕｓ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ ＩＳＢＮ－０－８９６０３－９１８－８およびＢｅｎｎｙ Ｋ．Ｃ．Ｌｏ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＩＳＢＮ １－５８８２９－０９２－１をさらに参照する。

【0340】

一般的な方法

【0341】

免疫

【0342】

抗ＣＬＤＮ１８．２に対する抗体を生成するために、タンパク質またはＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞を抗原として使用するか、または完全長ＣＬＤＮ１８．２をコードするｃＤＮＡを保持するプラスミドで雌Ｂａｌｂ／Ｃマウスを免疫させる。抗原をベクタータンパク質にカップリングされるペプチドに調製するか、または原核または真核発現系で発現されるタンパク質に調製する。例えば、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１のペプチドを合成し、かつキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）タンパク質に科学的にカップリングする。ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３６、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３７、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３８およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３９を有するペプチドを合成し、かつウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）にカップリングする。ＣＬＤＮ１８．２の細胞外ループ１（ＥＣＬ１）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１）は、チオレドキシン（Ｔｒｘ）との融合タンパク質として大腸菌でも発現される。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から完全長ＣＬＤＮ１８．２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２）を発現および精製する。完全長ＣＬＤＮ１８．２を発現する３Ｔ３細胞株またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞株も抗原として使用される。

【0343】

ＤＮＡ免疫化のために、完全長ＣＬＤＮ１８．２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２）をコードするプラスミドをアジュバントと一緒にマウスに静脈内注射する。３週間の間隔で３回注射する。最後のＤＮＡ注射時または注射過程において、マウスに３００万～５００万個の完全長ＣＬＤＮ１８．２を発現する２９３Ｔ細胞または３Ｔ３細胞も静脈内注射する。当該強化が行われた後、３～４日後、マウスを安楽死させ、脾臓を収集し、融合を実行する。免疫化プロトコルは、以下の表１に示される。

【0344】

【表1】

【0345】

ハイブリドーマ生成

【0346】

モノクローナルハイブリドーマを生成するために、マウス骨髄腫瘍細胞Ｓｐ２／０を対数増殖期まで増殖させ、ポリエチレングリコール／ジメチルスルホキシド（ＰＥＧ／ＤＭＳＯ、４５％／５％）溶液（Ｈｙｂｒｉ－ｍａｘ、Ｓｉｇｍａ、Ｐ７１８１、Ｄ２６５０）の存在下で、免疫された脾臓細胞と１：２または１：３の比率で融合させる。ヒポキサンチン－アミノプテリン－チミジン（ＨＡＴ）（Ｓｉｇｍａ、Ｈ０２６２）培地で７日間ハイブリドーマ細胞を選択する。ＨＴを含む培地を加えて、ハイブリドーマ細胞をさらに７～１０日間インキュベートする。２～３週間融合した後、ハイブリドーマは、最初に抗体生成についてスクリーニングし、２週間後に再度スクリーニングする。ハイブリドーマをさらに３回クローンし、０．５細胞／ウェルのプレーティング密度から選択する。

【0347】

陽性クローンの選択

【0348】

完全長ＣＬＤＮ１８．２を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用して、ＥＬＩＳＡアッセイによって、ＣＬＤＮ１８．２に対する抗体を分泌するクローンをスクリーニングする。天然ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を対照として使用する。ＨＥＫ２９３Ｔ－ＣＬＤＮ１８．２に結合するが、ＨＥＫ２９３Ｔには結合しない抗体を分泌するクローンが選択される。次に、ＨＥＫ２９３－ＣＬＤＮ１８．２細胞およびＨＥＫ２９３－ＣＬＤＮ１８．１細胞を使用して、選択されたクローンを２回スクリーニングする。ＨＥＫ２９３Ｔ－ＣＬＤＮ１８．２に結合するが、ＨＥＫ２９３Ｔ－ＣＬＤＮ１８．１には結合しない抗体を分泌するクローンは、すべてのサブシングルクローンがＨＥＫ２９３Ｔ－ＣＬＤＮ１８．２に対して特異的に陽性になるまで、サブクローニングのために選択される。

【0349】

マウス抗体の調製

【0350】

特性化するためのモノクローナル抗体を生成するために、選択されたモノクローナルハイブリドーマ細胞をＢａｌｂ／Ｃマウスの腹腔に注射して、腹水でモノクローナル抗体を生成する。タンパク質Ａ／Ｇアフィニティークロマトグラフィーを使用して抗体を精製する。

【0351】

インビトロおよびインビボでの特性化のための抗ＣＬＤＮ１８．２に対する組換え抗体の生成

【0352】

ＰＣＲ技術を使用して、抗体ヒト化および成熟のために、ファージ表示スクリーニングから選択されるファージミドから、重鎖および軽鎖の可変ドメインをコードするｃＤＮＡを増幅させる。例えば、リーダー配列ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７２）等のシグナルペプチドをコードする追加の配列をＰＣＲによってこれらのヌクレオチドの５’末端に付加する。完整ＩｇＧを発現するプラスミドの構築のため、リーディングフレームで前記フラグメントを重鎖または軽鎖のヒトＩｇＧ１定常ドメインをコードするｃＤＮＡフラグメントに連結し、ｐＣＤＮＡ３．４等の哺乳動物発現ベクターに挿入して、ｐＣＤＮＡ３．４－ＨＣおよびｐＣＤＮＡ３．４－ＬＣを構築する。

【0353】

抗体を一過性に発現させるために、１μｇのｐＣＤＮＡ３．４－ＨＣおよびｐＣＤＮＡ３．４－ＬＣ混合物のプラスミドを使用して、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞をトランスフェクトさせることができる。タンパク質Ａ－樹脂を使用して、親和性クロマトグラフィーによって培地から発現されたＩｇＧを精製することができる。溶出されたＩｇＧは、ゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーで検査して純度を保証する。緩衝溶液をＰＢＳに置き換えることができ、濃度は、ＯＤ２８０によって、１．４吸光係数を使用して決定されることができる。モノクローナル抗体は、分注して－８０℃で保存することができる。

【0354】

抗体ファージ表示の選択

【0355】

公開されたプロトコルから変更された手順に従って、ライブラリーソートされる（Ｍｉｌｌｅｒら、ＰＬＯＳ ｏｎｅ、７：ｅ４３７４６（２０１２）、Ｆｅｌｌｏｕｓｅ Ｆ．Ａ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７３、９２４（２００７）、Ｓｈｅｒｍａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２６、２１４５（２０１４））。第１のラウンドの典型的な手順において、０．１～０．５ｎｍｏｌのビオチン化ＣＬＤＮ１８．２をストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズに固定し、ビオチンで遮断し、１ｍＬの結合緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．５％ＢＳＡが補充されたＰＢＳ緩衝液）でファージライブラリーと一緒に１５分間インキュベートする。次に、ビーズを磁石で溶液から分離し、結合緩衝液で２回洗浄し、ＸＬ１－ｂｌｕｅ細胞を形質導入してファージを増幅するのに直接使用する。後続のラウンドにおいて、まず、精製されたファージトストレプトアビジンビーズを結合緩衝液で３０分間インキュベートして、ビーズ結合物を除去し、次に、上清液を使用して、０．５μＭのＣＬＤＮ１８．１が補充された１００μＬの結合緩衝液で、５０ｎＭのビオチン化されたＣＬＤＮ１８．２と一緒に１５分間インキュベートする。次に、ストレプトアビジン磁気ビーズを溶液に１５分間添加して、結合されたファージト一緒にＲＮＡ標的複合体を捕獲するようにする。次に、次に、１００ｍＭのＤＴＴまたは０．１ＭのＧｌｙ－ＨＣｌ（ｐＨ２．１）緩衝液でビーズを溶出した後、１ＭのＴｒｉｓ－Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８）で中和する。

【0356】

ファージＥＬＩＳＡスクリーニング

【0357】

３～５ラウンドの選択後、ファージＥＬＩＳＡによって単一のクローンを分析する。新鮮なＬＢ／Ａｍｐプレートから４８個またはそれ以上の単一のコロニーを選択し、９６ウェルディープウェルプレートに１００μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび１０^１０ＰＦＵ／ｍＬのＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージを含む４００ μＬの２ＹＴ培地に接種し、３７℃で一晩振とうしながら増殖させる。次に、ディープウェルプレートを３５００ｒｐｍで１５分間遠心分離して細胞をペレット化する。上清液を３倍に希釈して、結合緩衝液中のファージ溶液を調製する。９６－ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレートを、１００ｍＭの重炭酸ナトリウムコーティング緩衝液（ｐＨ９．６）中の２μｇ／ｍＬの中性アビジン１００μＬで４℃で一晩コーティングする。コーティング溶液を除去し、Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを２００μＬ／ウェルの１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳで１時間ブロックする。ブロッキング溶液を除去した後、０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳでＭａｘｉｓｏｒｐプレートを洗浄し、室温下で１００μＬ／ウェルの２５ｎＭＣＬＤＮ１８．２と一緒に結合緩衝液で３０分間インキュベートする。ＣＬＤＮ１８．２標的を含むそれぞれのウェルについて、ＣＬＤＮ１８．１を有する対照ウェルを並行して調製する。次に、結合緩衝液でＭａｘｉｓｏｒｐプレートを洗浄し、室温下で１００μＬ／ウェルのファージ溶液と３０分間インキュベートする。結合緩衝液で洗浄した後、Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを１００μＬ／ウェルの抗Ｍ１３／西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（結合緩衝液で５０００ｘ希釈）と一緒に室温下で３０分間インキュベートする。結合緩衝液で別の洗浄ステップを実行した後、Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを１００μＬ／ウェルのＵｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質と一緒に５～１０分間インキュベートし、１００μＬ／ウェルの１Ｍリン酸でクエンチし、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍで分光光度法で読み取る。

【0358】

フローサイトメトリー分析

【0359】

フローサイトメトリーは、モノクローナル抗体がＣＬＤＮ１８．２を発現する生細胞への結合を決定するのに使用される。ＣＬＤＮ１８．２を天然発現またはトランスフェクトした後発現する細胞株およびＣＬＤＮ１８．２発現が欠如した陰性対照（標準増殖条件下で増殖）を３％のＢＳＡを含むＰＢＳで様々な濃度のモノクローナル抗体と混合し、暗所で４℃で６０分間インキュベートする。３回洗浄した後、一次抗体染色と同じ条件下で、ＤｙＬｉｇｈｔ６５０－標識された二次抗ＩｇＧ抗体をＣＬＤＮ１８．２－結合モノクローナル抗体に結合する。光および側方散乱特性を使用して個々の生細胞のゲートを介して、ＦＡＣＳ機器（ＢＤ、Ａｃｃｕｒｉ（商標） Ｃ６ Ｐｌｕｓ）を使用して、フローサイトメトリーによってサンプルを分析する。１回の測定でＣＬＤＮ１８．２－特異的モノクローナル抗体を非特異的結合剤と区別するために、共同トランスフェクション法を使用する。上記のように、ＣＬＤＮ１８．２をコードするプラスミドおよび蛍光マーカーで一過性にトランスフェクトされた細胞を染色する。ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６ Ｐｌｕｓを使用して、フローサイトメトリーによって結合を評価し、抗体染色された細胞と異なる蛍光チャネルでトランスフェクトされた細胞を検出した。縦軸での抗体結合の場合、横軸で蛍光マーカーの発現をブロットした。ほとんどのトランスフェクトされた細胞は、すべて二つの転移遺伝子を発現するため、ＣＬＤＮ１８－特異的モノクローナル抗体は、蛍光マーカーを発現する細胞と優先的に結合する。

【0360】

フローサイトメトリーアッセイに加えて、またはフローサイトメトリーアッセイの代わりに、蛍光顕微鏡を使用した代替アッセイを使用することができる。上記のように、細胞を正確に染色し、蛍光顕微鏡で検査することができる。細胞と特に付着細胞の隣接細胞の接触が、例えば、細胞剥離のために失われる場合、クローディンが内在化される傾向がある。ＣＬＤＮ１８の細胞表面発現は、ａ）例えば、穏やかな剥離（例えば、２ｍＭのＥＤＴＡ／ＰＢＳまたはａｃｃｕｔａｓｅ）を使用して、標準方式でより高い密度で培養し、室温下で処理し、エンドサイトーシス阻害剤（例えば、アジ化ナトリウム）またはＣＬＤＮ１８転写または翻訳活性化剤の添加等の培養条件の調節、およびｂ）細胞表面で高いレベルにＣＬＤＮ１８を維持する細胞の選択およびクローニング、例えば、トランスフェクトされた細胞に従って、抗生物質を選択し、免疫磁気またはＦＡＣＳ細胞ソーティングおよび制限された希釈クローニング等の方式で最適化されることができる。

【0361】

フローサイトメトリーによるヒトＣＬＤＮ１８．２対ＣＬＤＮ１８．１トランスフェクト細胞への抗体結合の比較

【0362】

ＣＬＤＮ１８．２アイソタイプに対する同定されたモノクローナル抗体の結合特異性は、フローサイトメトリーによって分析される。ヒトＣＬＤＮ１８．２を一過性敵に発現するＨＥＫ２９３細胞（Ｏｒｉｇｅｎｅに由来するＨＥＫ２９３－ＣＬＤＮ１８．２）およびヒトＣＬＤＮ１８．１を一過性的に発現するＨＥＫ２９３細胞（Ｏｒｉｇｅｎｅに由来するＨＥＫ２９３－ＣＬＤＮ１８．１）をモノクローナル抗体と一緒に４℃で６０分間インキュベートし、次に、Ｄｙｌｉｇｈｔ６５０－接合された抗マウスＩｇＧ二次抗体と一緒にインキュベートする。ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ（商標） Ｃ６ Ｐｌｕｓを使用してフローサイトメトリーによって結合を評価する。

【0363】

酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）

【0364】

組換えタンパク質クローディン１８．２を炭酸塩緩衝液で最終濃度１０μｇ／ｍＬに希釈し、４℃でＥｌｉｓａプレートに一晩コーティングする。次に、コーティング溶液を除去し、２００μＬのＴＢＳＴでウェルを充填し、プレートを３回洗浄する。必要に応じて、追加のブロッキングステップ（３０分間、５％のＢＳＡ－ＰＢＳ）を適用することができる。希釈されたモノクローナル抗ＣＬＤＮ１８．２抗体をそれぞれのウェルに添加し、室温下で２時間インキュベートする。陰性対照は、ＴＢＳＴで希釈された種－およびアイソタイプ－マッチングされた非特異的免疫グロブリンでなければならない。２００μＬのＴＢＳＴでウェルを充填し、プレートを３回洗浄し、酵素―接合された二次抗体を添加し、室温下で２時間インキュベートする。次に、プレートを３回洗浄し、ＴＭＢ基質溶液をそれぞれのウェルに添加する。プレートを１５～３０分間インキュベートし、等量の停止液（２ＭのＨ_２ＳＯ_４、選択可能）を添加し、３７０または４５０ｎｍ下で光学密度を読み取る。

【0365】

免疫蛍光顕微鏡法

【0366】

標準的な増殖条件下で、自発的にまたはトランスフェクトされた後にＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞株およびＣＬＤＮ１８発現が欠如された陰性対照をチャンバースライドで１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭのＬ－グルタミン、１００ＩＵ／ｍＬのペニシリンおよび１００ｐｇ／ｍＬのストレプトマイシンの補充されたＤＭＥＭ培地で増殖させる。次に、細胞をメタノールまたは４％のパラホルムアルデヒドで固定するか、または未処理のままにする。次に、細胞とＣＬＤＮ１８に対するモノクローナル抗体を２５℃で２時間反応させる。洗浄後、同じ条件下で細胞をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８抗マウスＩｇＧ抗体標識された抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と反応させる。次に、蛍光顕微鏡法で細胞を検査する。細胞を４％のパラホルムアルデヒドで固定し、かつＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で透過する場合、細胞中の総ＣＬＤＮ１８レベルが観察された。生細胞および未透過された４％のパラホルムアルデヒドで固定された細胞において、ＣＬＤＮ１８の表面局在化を検査する。

【0367】

免疫沈降（ＩＰ）／ウエスタンブロット

【0368】

ＣＬＤＮ１８．２アイソタイプに対する単離されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降（ＩＰ）／ウエスタンブロットによって分析されることができる。

【0369】

ヒトＣＬＤＮ１８．２およびヒトＣＬＤＮ１８．１を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を回収し、溶解手順により総タンパク質を抽出する。要するに、細胞培養皿を氷に置き、氷冷ＰＢＳで細胞を洗浄する。ＰＢＳを排出し、次に、氷冷溶解緩衝液を加え、冷たいプラスチックセルスクレーパー（ｃｅｌｌ ｓｃｒａｐｅｒ）で培養皿から付着細胞をこすり取り、次に、細胞懸濁液を予冷したマイクロ遠心チューブに静かに移す。４℃でマイクロ遠心機で遠心分離し、上清液を吸引し、氷上に保存された新しいチューブに入れ、総タンパク質を抗体免疫沈降に使用する。氷上のマイクロ遠心チューブで１０～５０μｇの細胞溶解物とハイブリドーマ上清液を検出された抗体と混合し、４℃で穏やかに回転させながらサンプルを抗体と１～１２時間インキュベートする。タンパク質Ｇ－カップリングされたアガロースビーズをサンプルに加え、溶解物ビーズ混合物を４℃で回転攪拌しながら４時間インキュベートする。当該チューブを遠心分離し、ビーズから上清液を除去しかつ廃棄する。標的タンパク質は、ビーズをコーティングする抗体に特異的に結合される。５０℃で、１０分間５０μＬのＤＴＴを含まない２ｘＳＤＳロード緩衝液で加熱し、ビーズを洗浄し、かつ５０μＬのビーズを溶出する。溶出されたサンプルを５分間煮沸し、ウエスタンブロットでサンプルを分析する。要するに、ＩＰからのサンプルに対してドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかける。電気泳動後、単離されたタンパク質をニトロセルロース膜に転写し、ブロックし、かつ市販のＣＬＤＮ１８抗体でプローブする。抗ＣＬＤＮ１８抗体の二次抗体を使用して特異的結合を検出し、ＥＣＬ基質で視覚化する。

【0370】

抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）

【0371】

Ｆｉｃｏｌｌ Ｈｙｐａｑｕｅ密度遠心分離し、次に、汚染された赤血球を溶解して、エフェクター細胞、および健康なドナーに由来するリンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）および単球を含む末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を精製する。洗浄されたエフェクター細胞を１０％の熱不活性化ウシ胎児血清または代替可能に５％の熱不活性化ヒト血清が補充されたＲＰＭＩに懸濁し、エフェクター細胞と標的細胞の様々な比率でＣＬＤＮ１８．２を発現する標的細胞と混合する。ＭｕｌｔｉＴｏｘ－Ｇｌｏ多重細胞特性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によってＡＤＣＣを検出する。

【0372】

または、蛍光増強リガンド（ＢＡＴＤＡ）で標的細胞を標識することができる。蛍光計で死んだ細胞から放出される増強されたリガンドを有する高蛍光キレートを測定する。

【0373】

別の代替可能な測定は、ＡＤＣＣレポーター生物アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用することができる。次に、生成された抗ＣＬＤＮ１８．２ＩｇＧを様々な濃度で添加する。無関係のヒトＩｇＧを陰性対照として使用される。使用されるエフェクター細胞タイプに従って、３７℃で４～２０時間測定する。培養上清液で死んだ細胞タンパク質酵素の放出またはＥｕＴＤＡキレートの存在を測定して、サンプルの細胞溶解を測定する。ＡＤＣＣレポーター生物アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に対して、発光シグナルは、ルシフェラーゼの発現を駆動するＮＦＡＦ（Ｔ細胞を活性化する核因子）反応要素によって生成される。抗ＣＬＤＮ１８．２モノクローナル抗体は、様々なモノクローナル抗体が細胞溶解を増強することができるかどうかを判断するために、様々な組み合わせで試験する。

【0374】

補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）

【0375】

様々な既知の技術を使用して、ＣＤＣを媒介するモノクローナル抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の能力を試験する。ｍＡｂのＣＤＣ活性を決定するために、異なる方法を使用することができる。

【0376】

例えば、ＣｙｔｏＴｏｘ－Ｇｌｏ細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって、安定的「グロータイプ」発光シグナルを測定するか、または臭化エチジウムアッセイによって増加された膜の透過性を評価することができる。トリプシン処理によってトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞（発現ヒトＣＬＤＮ１８．２）、ＮＵＧＣ－４およびＫＡＴＯ ＩＩＩ細胞を収集し、洗浄し、１～５×１０^５／ｍｌを様々な濃度のｍＡｂと一緒に室温または３７℃で６０分間インキュベートすることができる。次に、ヒト血清または血漿（補体を有する）を２５％（ｖ／ｖ）の最終濃度に添加し、細胞を３７℃で３～４時間インキュベートすることができる。Ｃｙｔｏ－Ｇｌｏ細胞毒性測定試薬を添加し、発光シグナルを測定することができる。

【0377】

代替可能なアッセイにおいて、測定２４時間前に、３×１０^４／ウェルの密度で細胞を組織培養平底マイクロタイタープレートに接種することができる。翌日、増殖培地を除去し、細胞を抗体と一緒に３回インキュベートする。対照細胞を増殖培地または０．２％のサポニンを含む増殖培地と一緒にインキュベートして、バックグラウンド溶解および最大溶解を測定することができる。室温下で６０分間インキュベートした後、上清液を除去することができ、ＤＭＥＭ（３７℃に予熱）中２５％（ｖ／ｖ）のヒト血漿または血清を細胞に添加することができ、３７℃で３～４時間インキュベートする。次に、２．５ｐｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含むＰＢＳで上清液を交換し、５２０ｎｍで励起した後、蛍光放出をＢｉｏ－Ｔｅｋプレートリーダーで６００ｎｍで測定することができる。特異的溶解のパーセンテージは、以下の式で計算されることができる。特異的溶解％＝（蛍光サンプル蛍光バックグラウンド）／（蛍光最大溶解－蛍光バックグラウンド）×１００。

【0378】

モノクローナル抗体による細胞増殖の阻害

【0379】

アポトーシスを開始する能力を試験するために、モノクローナル抗ＣＬＤＮ１８．２抗体を、例えば、ＣＬＤＮ１８．２陽性腫瘍細胞（例えば、ＮＵＧＣ－４、ＫＡＴＯ－ＩＩＩまたはＣＬＤＮ１８．２トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞）と３７℃で約２０～９６時間インキュベートする。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光細胞生存力キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、モノクローナル抗体による細胞増殖の一般的な阻害を検出することができる。当該測定は、存在するＡＴＰに対する定量に基づき、ＡＴＰは、代謝活性細胞の指示剤である。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイ法で測定された発光ト培養細胞数の間には、直接的な関係がある。

【0380】

要するに、試験モノクローナル抗ＣＬＤＮ１８．２抗体を実験ウェルに添加し、培養プロトコルに従ってインキュベートすることができる。インキュベートした後、プレートおよびその内容物を室温下で約３０分間平衡化し、次に、各ウェルに存在する細胞培地の量に等しい量のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬を加えることができる。当該プレートを室温下で１０分間インキュベートして、発光シグナルを安定化させ、発光を記録することができる。

【0381】

代替可能なアッセイにおいて、処理された細胞を収集し、アネキシン－Ｖ結合緩衝液（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で洗浄し、暗所でＦＩＴＣまたはＡＰＣト接合したアネキシンＶ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と一緒に１５分間インキュベートすることができる。各サンプルのすべての細胞をＦＡＣＳチューブのＰＩ溶液（ＰＢＳ中１０ｐｇ／ｍｌである）に加え、フローサイトメトリーですぐに評価することができる（例えば、上記のごとく）。

【0382】

実施例１：抗ＣＬＤＮ１８．２－３Ｂ８

【0383】

実施例１に記載の抗体は、上記の一般的な方法に従って生成する。実施例１に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0384】

実施例１の結合特徴

【0385】

ｉ）ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞の生成および実施例１に対する結合特徴

【0386】

ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞を生成するために、単独でＣＬＤＮ１８．２および融合タンパク質ＣＬＤＮ１８．２－ＧＦＰレポータータンパク質をコードする核酸でＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトする。ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトし、かつチャンバースライド上で４８時間増殖する。図１は、細胞膜上にＣＬＤＮ１８．２およびＧＦＰを発現するトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞、以及トランスフェクトされていない細胞を示す。ＣＬＤＮ１８．２のみをコードするＨＥＫ２９３細胞を４％のパラホルムアルデヒドで固定し、２５℃で抗ＣＬＤＮ１８．２のモノクローナル抗体３Ｂ８で６０分間染色する。洗浄後、細胞をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８標識された抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色し、蛍光顕微鏡法で評価する。図２は、細胞膜上でＣＬＤＮ１８．２トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞に結合するモノクローナル抗体３Ｂ８を示す。これらの異種ＣＬＤＮ１８．２発現細胞は、抗体結合の特異性を試験するために次のアッセイで使用される。

【0387】

ｉｉ）ＣＬＤＮ１８．２に結合するモノクローナル抗体３Ｂ８のフローサイトメトリーによる分析：

【0388】

測定４８時間前に、ＨＥＫ２９３細胞をヒトＣＬＤＮ１８．２および蛍光レポータータンパク質ＧＦＰをコードする発現ベクターと一緒に４８時間トランスフェクトするか、または代替可能にヒトＣＬＤＮ１８．２を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３－ＣＬＤ１８．２）を使用する。２ｍＭのＥＤＴＡ／ＰＢＳで細胞を分離した後、完全増殖培地で細胞を洗浄し、約１～５×１０^５細胞／ウェルでＵ型底部マイクロタイタープレートにプレーティングする。細胞をモノクローナル抗体３Ｂ８と一緒に４℃で１分間インキュベートし、次に、氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、最後に、Ｄｙｌｉｇｈｔ６５０－接合された二次抗ＩｇＧ抗体と一緒にインキュベートする。ＢＤ、Ａｃｃｕｒｉ（商標） Ｃ６ Ｐｌｕｓを使用してフローサイトメトリー二って結合を評価する。縦軸に抗体結合の場合、横軸に蛍光マーカーの発現をプロットする。マウス抗体３Ｂ８がＨＥＫ２９３細胞を発現する蛍光マーカーの表面に特異的に結合することを検出した（図３、Ｑ５－ＵＲ中の細胞）。

【0389】

ｉｉｉ）ＥＬＩＳＡアッセイによってＣＬＤＮ１８．２に結合するモノクローナル抗体３Ｂ８を分析：

【0390】

組換えタンパク質クローディン１８．２（またはクローディン１８．１）を炭酸塩緩衝液で最終濃度４．５μｇ／ｍＬに希釈する。Ｅｌｉｓａプレートを４℃で一晩コーティングする。次に、コーティング溶液を除去し、ウェルに２００μｌのＴＢＳＴを充填することによりプレートを３回洗浄する。塚野ブロッキングステップ（３０分間、５％ＢＳＡ－ＰＢＳ）を適用することができる。希釈されたモノクローナル抗体３Ｂ８を各ウェルに加え、室温で２時間インキュベートする。非特異的陰性対照マウスＩｇＧをＴＢＳＴで希釈する。ウェルに２００μｌのＴＢＳＴを充填することにより、プレートを３回洗浄し、ＨＲＰ－接合された二次抗体を添加し、室温で２時間インキュベートする。プレートを再度３回洗浄し、ＴＭＢ基質溶液を各ウェルに添加し、１５～３０分間インキュベートし、等量の停止液（２ＭのＨ_２ＳＯ_４、選択可能）を加え、３７０または４５０ｎｍで光学密度を読み取る（図４）。

【0391】

ｉｖ）フローサイトメトリーによるモノクローナル抗体３Ｂ８の結合親和性の評価：

【0392】

様々な濃度（０．０１、０．１、１、２、１０μｇ／ｍＬ）のモノクローナル抗体３Ｂ８をヒトＣＬＤＮ１８．２およびＧＦＰを発現するトランスフェクトされた細胞と混合し、操作は一般的な説明と同じである。縦軸に抗体結合の場合、横軸に蛍光マーカーの発現をプロットする。抗体３Ｂ８の結合特徴は、図５に示される。

【0393】

実施例２：抗ＣＬＤＮ１８．２－１５Ｇ１１

【0394】

実施例２に記載の抗体は、上記の一般的な方法に従って生成される。実施例２に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８を含む二つのアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0395】

実施例２に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図６および図９に示される。

【0396】

実施例３：抗ＣＬＤＮ１８．２－９Ａ１

【0397】

実施例３に記載の抗体は、上記の一般的な方法に従って生成される。実施例３に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0398】

実施例３に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図７および図１０に示される。

【0399】

実施例４：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９

【0400】

実施例４に記載の抗体は、上記の一般的な方法に従って生成される。実施例４に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0401】

実施例４に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図８、図１１および図１２に示される。

【0402】

実施例５：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｈ１

【0403】

実施例５に記載の抗体は、上記の一般的な方法に従って生成される。実施例５に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0404】

実施例５に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施され、そのＫｄは、０．３２ｎＭである。

【0405】

実施例６：抗ＣＬＤＮ１８．２－１Ｄ５

【0406】

実施例６に記載の抗体は、上記の一般的な方法に従って生成される。実施例６に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0407】

実施例６に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図１２に示される。

【0408】

実施例７：抗ＣＬＤＮ１８．２－８Ｃ５

【0409】

実施例７に記載の抗体は、上記の一般的な方法に従って生成される。実施例７に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0410】

実施例７に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。抗ＣＬＤＮ１８．２－８Ｃ５抗体は、ＣＬＤＮ１８．１と１８．２との両方に結合する（結果は示していない）。

【0411】

実施例８：抗ＣＬＤＮ１８．２－９Ｆ１

【0412】

実施例８に記載の抗体は、上記の一般的な方法に従って生成される。実施例８に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0413】

実施例８に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。抗ＣＬＤＮ１８．２－９Ｆ１抗体は、ＣＬＤＮ１８．１と１８．２との両方に結合する（結果は示していない）。

【0414】

実施例９：抗ＣＬＤＮ１８．２－７Ａ１０

【0415】

実施例９に記載の抗体は、上記の一般的な方法に従って生成される。実施例９に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0416】

実施例９に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図１２に示される。

【0417】

実施例１０：抗ＣＬＤＮ１８．２－８Ｃ１２

【0418】

実施例１０に記載の抗体は、上記の一般的な方法に従って生成される。実施例１０に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0419】

実施例１０に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図１２に示される。

【0420】

実施例１１：抗ＣＬＤＮ１８．２－１４Ｄ７

【0421】

実施例１１に記載の抗体は、上記の一般的な方法に従って生成される。実施例１１に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0422】

実施例１１に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図１３に示される。

【0423】

実施例１２：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｈ７

【0424】

実施例１２に記載の抗体は、上記の一般的な方法に従って生成される。実施例１２に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0425】

実施例１２に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図１３に示される。

【0426】

実施例１３：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｇ７

【0427】

実施例１３に記載の抗体は、上記の一般的な方法に従って生成される。実施例１３に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0428】

実施例１３に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図１３に示される。

【0429】

実施例１４：抗ＣＬＤＮ１８．２－４Ｇ３

【0430】

実施例１４に記載の抗体は、上記の一般的な方法に従って生成される。実施例１４に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０６のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0431】

実施例１４に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図１３に示される。

【0432】

実施例１５：抗ＣＬＤＮ１８．２－１４Ｂ７

【0433】

実施例１５に記載の抗体は、上記の一般的な方法に従って生成される。実施例１５に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0434】

実施例１５に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図１３に示される。

【0435】

実施例１６：抗ＣＬＤＮ１８．２－７Ｈ１

【0436】

実施例１６に記載の抗体は、上記の一般的な方法に従って生成される。実施例１６に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0437】

実施例１６に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施され、Ｋｄが０．２６７ｎＭであることを示す。

【0438】

実施例１７：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｈ１２

【0439】

実施例１７に記載の抗体は、上記の一般的な方法に従って生成される。実施例１７に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２７のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0440】

実施例１７に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図１３に示される。

【0441】

実施例１８：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ａ

【0442】

抗ＣＬＤＮ１８．２抗体ヒト化のための一般的にな方法

【0443】

実施例１８Ａ：フレームワーク。

【0444】

最も売られる抗体治療薬ハーセプチン（トラスツズマブ）およびヒュミラ（アダリムマブ）の成功に基づいて、重鎖サブグループｌｌＩ（ｈｕｍｌｌｌ）および軽鎖κサブグループＩ（ｈｕｍκＩ）のヒト共同配列フレームワーク（Ｃａｒｔｅｒ Ｐ、Ｐｒｅｓｔａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９、４２８５－４２８９（１９９２）、Ｐｒｅｓｔａ ＬＧら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ１５１、２６２３－２６３２（１９９３）、Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．ら、免疫学的に関心のあるタンパク質の配列、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１））を選択して、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体のヒト化に使用する。

【0445】

将来のＣＤＲ交換用のテンプレートｐＳＹ１を生成するために、ｈｕｍＩＩＩおよびｈｕｍκＩ遺伝子を、Ｍ１３ファージの表面にヒトＦａｂを表示するように設計されたファージミドに挿入する。二つのオープンリーディングフレームを使用して、それぞれｐｈｏＡプロモーターの制御下で二つのＦａｂ鎖を下コードする。第１のオープンリーディングフレームは、軽鎖をコードし、第２のオープンリーディングフレームは、Ｍ１３マイナーコートタンパク質Ｐ３のＣ末端ドメインに融合する重鎖をコードする。二つのペプチド鎖は、Ｎ末端のｓｔＩＩシグナル配列によって一定方向に分泌される。

【0446】

実施例１８Ｂ：一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）テンプレート。

【0447】

次に、ｐＳＹ１をマイクロパルスエレクトロポレーター（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）でＣＪ２３６細胞（ウラシルでグリコシダーゼを欠陥）にエレクトロポレーションする。単一のコロニーを使用して、１ｍＬの２ＹＴ開始培養物に１００μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび１０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを接種し、得られた培養物を３７℃で６時間振とうする。Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（～１０^１０ｐｆｕ）を加え、３７℃で１０分間振とうした後、３００μＬの混合物を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび０．２５ｍｇ／ｍＬのウリジンを含む３０μＬの２ＹＴに移す。３７℃で１８時間増殖した後、ファージを精製し、Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．（登録商標）Ｍ１３ＤＮＡｍｉｎｉキット（Ｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｋ Ｉｎｃ）を使用してウラシルを含むｓｓＤＮＡを単離する。

【0448】

実施例１８Ｃ：ヒト化ｈ５Ｃ９ａを生成するためのＣＤＲ交換

【0449】

Ｋｕｎｋｅｌ突然変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ Ｔ．Ａ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２、４８８－９２（１９８５）、Ｓｉｄｈｕ Ｓ．Ｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ３２８、３３３－６３（２０００））を使用して、ヒト化抗ＣＬＤＮ１８．２抗体ｈ５Ｃ９ａのＣＤＲ交換形態を構築する。５Ｃ９抗体のＣＤＲをｐＳＹ１に交換するように、以下のようなプライマーを設計する：
ＡＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＡＡＡＧＣＡＧＴＣＡＧＡＧＴＣＴＧＣＴＣＡＡＣＡＧＴＧＧＣＡＡＣＣＡＧＡＡＡＡＧＣＴＡＴＣＴＧＡＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＡ（ＣＤＲ－Ｌ１に使用される）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７３）、
ＧＣＴＣＣＧＡＡＧＣＴＴＣＴＧＡＴＴＴＡＴＴＧＧＧＣＡＴＣＴＡＣＣＣＴＣＧＡＡＡＧＣＧＧＡＧＴＣＣＣＴＴＣＴＣＧＣＴＴＣ（ＣＤＲ－Ｌ２に使用される）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７４）、
ＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＡＡＣＧＣＧＴＡＴＴＣＴＴＴＴＣＣＧＴＴＴＡＣＧＴＴＣＧＧＡＣＡＧＧＧＴＡＣＣ（ＣＤＲ－Ｌ３に使用される）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７５）、
ＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＴＡＣＣＡＡＣＴＡＴＧＧＴＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＴＣＡＧＧＣＣＣＣＧ（ＣＤＲ－Ｈ１に使用される）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７６）、
ＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＴＧＣＡＴＧＧＡＴＴＡＡＣＡＴＧＴＡＴＡＣＣＧＧＣＧＡＡＣＣＧＡＣＣＴＡＴＧＣＣＧＡＴＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＧＣＣＧＴＴＴＣＡＣＴＡＴＡＡＧＣＣＧＴ（ＣＤＲ－Ｈ２に使用される）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７７）、
ＧＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＴＣＧＣＣＴＧＴＡＴＡＡＣＧＧＣＡＡＣＴＣＴＣＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡ（ＣＤＲ－Ｈ３に使用される）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７８）。

【0450】

ＣＤＲ領域には下線が引かれている。

【0451】

Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）を使用して、３７℃で六つのプライマーをそれぞれ１時間リン酸化する。リン酸化されたプライマーを９０℃で１分間ウラシルを含むｓｓＤＮＡテンプレートにアニーリングし、５０℃で３分間アニーリングし、次に、氷に置く。Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼでオリゴヌクレオチド伸長し、３７℃でＴ４ ＤＮＡリガーゼで１．５時間連結して、共有結合性閉環状ＤＮＡを形成する。ＤＮＡをＱｉａｇｅｎ ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＤＮＡ精製キットで脱塩および親和性精製し、熱ショック形質転換によりＸＬ－１ｂｌｕｅ細胞（ウラシルグリコシダーゼを含む株）に形質転換する。Ｑｉａｇｅｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐキットで小規模ＤＮＡを精製し、配列を確認するためにシーケンシングを送信する。次に、ヒト化ライブラリーを構築するように、プラスミドｈ５Ｃ９ａをウラシルを含むｓｓＤＮＡの調製に使用される。

【0452】

実施例１８Ｄ：ヒト化ライブラリーの構築

【0453】

公開された作業（Ｂａｃａ Ｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２、１０６７８－１０６８４（１９９７））に基づいて、トラスツズマブ等の市販知よう的抗体を参照して、ＶＬ：Ｍ４（ＭＴＧ）、Ｆ７１（ＴＷＣ）、Ｆ８３（ＹＴＣ）；ＶＨ：Ａ２４（ＲＹＣ）、Ｖ３７（ＲＴＣ）、Ｆ６７（ＮＹＣ）、Ｉ６９（ＷＴＣ）、Ｒ７１（ＣＫＣ）、Ｄ７３（ＲＭＣ）、Ｋ７５（ＲＭＧ）、Ｎ７６（ＡＲＣ）、Ｌ７８（ＳＹＧ）、Ａ９３（ＤＹＧ）、Ｒ９４（ＡＲＧ）等のような部位でマウスおよびよく知られるヒトアミノ酸構成要素を含むようにライブラリー構築する。各部位で使用される縮重コドンは、括弧内に示される。Ｍ＝ＡまたはＣ、Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｙ＝ＣまたはＴ、Ｎ＝Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ、Ｋ＝ＧまたはＴ、Ｓ＝ＧまたはＣ、およびＤ＝Ａ、ＧまたはＴである。Ｋｕｎｋｅｌ突然変異誘発を介してこれらの縮重コドンを所望の部位に導入するように、次のようなプライマーを設計する：
ＧＣＣＴＡＴＧＣＡＴＣＣＧＡＴＡＴＣＣＡＧＭＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＧＡＧＣＴＣＣ（ｈＬｉｂＬ１）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７９）、
ＧＧＴＡＧＣＧＧＴＴＣＣＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＷＣＡＣＴＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＧＣＣＧＧＡＡＧＡＣＹＴＣＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧ（ｈＬｉｂＬ２）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８０）、
ＣＴＣＣＧＴＴＴＧＴＣＣＴＧＴＧＣＡＲＹＣＴＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＴＡＣＣＡＡＣＴＡＴＧＧＴＡＴＧＡＡＣＴＧＧＲＴＣＣＧＴＣＡＧＧＣＣＣＣＧＧＧＴＡＡＧ（ｈＬｉｂＨ１）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８１）、
ＧＡＴＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＧＣＣＧＴＮＹＣＡＣＴＷＴＣＡＧＣＣＫＣＧＡＣＲＭＣＴＣＣＲＭＧＡＲＣＡＣＡＳＹＧＴＡＣＣＴＡＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣ（ｈＬｉｂＨ２）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８２）、
ＧＡＣＡＣＴＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＴＤＹＧＡＲＧＣＴＧＴＡＴＡＡＣＧＧＣＡＡＣＴＣＴ（ｈＬｉｂＨ３）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８３）。

【0454】

縮重コドンには、下線が引かれる。

【0455】

前記プライマーのリン酸化およびＫｕｎｋｅｌ突然変異誘発（Ｓｉｄｈｕ Ｓ．Ｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ３２８、３３３－６３（２０００））は、説明されるように実施される。得られた共有結合性閉環状ＤＮＡをエレクトロコンピテントＳＳ３２０細胞にエレクトロポレーションして、説明されるようにｈ５Ｃ９ヒト化Ｆａｂライブラリーを調製する（Ｓｉｄｈｕら、２０００）。滴定の見掛けの多様性は、１．９×１０^９であり、設計された理論上の多様性３．２×１０^６よりも大きくなる。

【0456】

実施例１８Ｅ：ヒト化ｈ５Ｃ９クローンの選択

【0457】

前のものと同様に行われた（Ｙｅ Ｊ．Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０５、８２－８７（２００８））。ビオチン化された完全長ＣＬＤＮ１８．２を抗原として使用する。第１のラウンドにおいて、０．５ｎｍｏｌのビオチン化ＣＬＤＮ１８．２を磁気ビーズ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に固定し、１０^{１２～１３}ｃｆｕのファージト一緒に１ｍｌの０．４％ＢＳＡおよび０．２ｍｇ／ｍＬのストレプトアビジンの補充されたＰＤ（１ｘＰＢＳ、０．１％のＤＤＭを含む）で１５分間インキュベートする。次に、溶液を除去し、ビーズをＰＤで２回洗浄し、後続ラウンドの選択のために増幅させる。後続のラウンドにおいて、まず、精製されたファージプールをストレプトアビジンビーズと一緒に１５分間インキュベートし、上清液をＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ磁性粒子プロセッサー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で後続の選択に使用する。ファージ（１０^{１０～１１}ｃｆｕ）を、低濃度のビオチン化ＣＬＤＮ１８．２（２０～０．１ｎＭ）および高濃度のＣＬＤＮ１８．１（４００～８００ｎＭ）と一緒に１５分間インキュベートする。次に、ストレプトアビジン磁気ビーズを溶液に１５分間添加して、ビオチン化ＣＬＤＮ１８．２および結合されたファージを捕捉する。ビーズをＰＤで５回洗浄し、１００ｍＭのＤＴＴで１５分間溶出する。各ラウンドの選択後、回収されたファージは、記載されるように増幅された（Ｓｉｄｈｕ Ｓ．Ｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ３２８、３３３－６３（２０００））。５ラウンドの選択後、ファージＥＬＩＳＡを実行して、陽性クローンを同定し、シーケンシングを実行する。

【0458】

実施例１８に記載された抗体を生成し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３１のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３４のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）含む。

【0459】

実施例１８に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図１４に示される。

【0460】

実施例１９：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｂ

【0461】

実施例１９に記載の抗体は、実施例１８に記載の上記の一般的な方法に従って生成される。実施例１９に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３７のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0462】

実施例２０：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｃ

【0463】

実施例２０に記載の抗体は、実施例１８に記載の上記の一般的な方法に従って生成される。実施例２０に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３９のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0464】

実施例２１：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｆ

【0465】

実施例２１に記載の抗体は、実施例１８に記載の上記の一般的な方法に従って生成される。実施例２１に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４０のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４１のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0466】

実施例２２：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｇ

【0467】

実施例２２に記載の抗体は、実施例１８に記載の上記の一般的な方法に従って生成される。実施例２２に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４３のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0468】

実施例２３：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｉ

【0469】

実施例２３に記載の抗体は、実施例１８に記載の上記の一般的な方法に従って生成される。実施例２３に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４４のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４５のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0470】

実施例２４：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｊ

【0471】

実施例２４に記載の抗体は、実施例１８に記載の上記の一般的な方法に従って生成される。実施例２４に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４６のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４７のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0472】

実施例２５：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｌ

【0473】

実施例２５に記載の抗体は、実施例１８に記載の上記の一般的な方法に従って生成される。実施例２５に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４８のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４９のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0474】

実施例２６：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｍ

【0475】

実施例２６に記載の抗体は、実施例１８に記載の上記の一般的な方法に従って生成される。実施例２６に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５０のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５１のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0476】

実施例２７：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｎ

【0477】

実施例２７に記載の抗体は、実施例１８に記載の上記の一般的な方法に従って生成される。実施例２７に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５２のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５３のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0478】

実施例２７に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図１４に示される。

【0479】

実施例２８：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｏ

【0480】

実施例２８に記載の抗体は、実施例１８に記載の上記の一般的な方法に従って生成される。実施例２８に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５４のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５５のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0481】

実施例２８に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図１４、図１５および図１６に示される。

【0482】

実施例２９：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｏａ

【0483】

抗ＣＬＤＮ１８．２抗体の親和性成熟のための一般的な方法

【0484】

実施例２９Ａ：ｈ５Ｃ９ｏＡＭＨ９＿１２ライブラリーの構築

【0485】

第１のライブラリーは、ＣＤＲ－Ｈ３に焦点を合わせる。九つのＣＤＲ残基において、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによる位置１０１および１０２は、通常、重要な構造的役割を果たしていると考えられているため、ここでは、ランダム化されていない。１０１のすぐ上流の位置（現在のＣＤＲ中の１００ａ）は、様々な一般的な四つのアミノ酸：ＦＩＬＭが与えられている。カスタマイズコドンＸＹＺ、即ち、Ｘ＝Ｇ（０．４５）、Ａ（０．２３）、Ｔ（０．１１）、Ｃ（０．２１）、Ｙ＝Ｇ（０．３１）、Ａ（０．３４）、Ｔ（０．１７）、Ｃ（０．１８）、Ｚ＝Ｇ（０．２４）、Ｃ（０．７６）を使用して、位置９５～１００をランダム化する。当該コドンは、ＣＤＲ Ｈ３の９５～１００ａ＿ｚの位置で天然ＡＡからなるコドン（Ｌｅｅ Ｃ．Ｖ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０、１０７３－１０９３（２００４））を模倣することと類似し、システインおよび停止コドンでのその表現が減少される。ＣＤＲ－Ｈ３の長さは、９～１２個の残基の間で変化させることができ、追加の各残基は、ＸＹＺコドンによってコードされる。ライブラリーの理論上のサイズは、１．５×１０^１４である。ライブラリーの比較的大きいサイズにより希釈された結合クローンを考慮して、ＴＡＡＧＧＣＣＡＡＧＡＣＧＧＣＣＴＡＴＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８４）を使用してＣＤＲ－Ｈ３配列の位置９５～１００ａを代替し、当該新しい構築物を使用してライブラリーの構築に使用されるテンプレートを調製する。これは、親和性成熟ライブラリーから親ｈ５Ｃ９ｏの除去を許容する。Ｋｕｎｋｅｌ突然変異誘発において、次のようなプライマーを使用して、このライブラリーを構築する：
ＧＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＴＣＧＣＸＹＺＸＹＺＸＹＺＸＹＺＸＹＺＸＹＺＷＴＫＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８５）、
ＧＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＴＣＧＣＸＹＺＸＹＺＸＹＺＸＹＺＸＹＺＸＹＺＸＹＺＷＴＫＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８６）、
ＧＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＴＣＧＣＸＹＺＸＹＺＸＹＺＸＹＺＸＹＺＸＹＺＸＹＺＸＹＺＷＴＫＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８７）、
ＧＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＴＣＧＣＸＹＺＸＹＺＸＹＺＸＹＺＸＹＺＸＹＺＸＹＺＸＹＺＸＹＺＷＴＫＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８８）。
上記のようにライブラリーを構築し、見掛けの多様性は、１．５×１０^１０である。

【0486】

抗原結合は、すべてのＣＤＲ領域の接触残基からの直接結合およびフレームワーク残基からの構造的に支持された相乗的作用を必要とする。従って、可能であれば、複数のＣＤＲの残基を同時にスクリーニングすることができると有益である。抗原結合の親和性および特異性を高めることができることに加えて、複数のＣＤＲ配列を同時に空間的にサンプリングできると、よりコンパクトで安定した構造の抗体が得られる可能性が高くなる。最小限の努力で大規模な合成抗体ライブラリーを作成することができるため、同じライブラリーの複数のＣＤＲ配列をスクリーニングすることができる。従って、二つのライブラリーを構築する。

【0487】

実施例２９Ｂ：ｈ５Ｃ９ｏＡＭ＿ＣＤＲＷ＿Ｌ３＿Ｈ３ライブラリーの構築

【0488】

当該ライブラリーにおいて、ＣＤＲ Ｌ３およびＨ３を同時にスクリーニングすることを目的としている。単一のアミノ酸ＣＤＲウォーキング（Ｙａｎｇ Ｗ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４、３９２－４０３（１９９５））は、ＣＤＲ－Ｈ３中の位置９５～１００およびＣＤＲ－Ｌ３中の位置９１～９４のランダム化に使用される（Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従う）。与えられたＣＤＲで、各位置は、縮重コドンＮＮＳを使用して個別にランダム化され、２０個のアミノ酸すべてをコードする。Ｋｕｎｋｅｌ突然変異誘発で次のようなプライマーを使用して、このライブラリーを構築する。

【表2】

【0489】

上記のようにライブラリーを構築し、見掛けの多様性は、１．０×１０^９であり、設計された多様性２．５×１０^４よりも大きい。

【0490】

実施例２９Ｃ：ｈ５Ｃ９ＡＭ＿ＣＤＲＷ＿Ｌ１＿Ｌ２＿Ｈ２ライブラリーの構築

【0491】

当該ライブラリーにおいて、ＣＤＲ Ｌ１、Ｌ２およびＨ２を同時にスクリーニングする。以前のライブラリーと同様に、単一のアミノ酸ＣＤＲウォーキング戦略を使用する（Ｙａｎｇ Ｗ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４、３９２－４０３（１９９５））。ランダム化の位置は、ＣＤＲ－Ｌ１中の２７～３３、ＣＤＲ－Ｌ２中の位置５０、５３および５５、ならびにＣＤＲ－Ｈ２中の５０、５２～５４、５６～５８を含む。与えられたＣＤＲで、各位置は、縮重コドンＮＮＳを使用して個別にランダム化して、２０個のアミノ酸すべてをコードする。Ｋｕｎｋｅｌ突然変異誘発で次のようなプライマーを使用して、このライブラリーを構築する。

【表3】

【0492】

上記のようにライブラリーを構築し、見掛けの多様性は、１．１×１０^１０であり、設計された多様性９．４×１０^６よりも大きい。

【0493】

実施例２９Ｄ：親和性成熟抗体の選択

【0494】

ＣＬＤＮ１８．２を選択する場合、それぞれ上記の三つの親和性成熟ライブラリーを使用する。基本的な手順は、上記の手順と類似するが、以下の変更がある。選択に使用されるビオチン化抗原の濃度範囲は、１ｎＭ～１０ｐＭである。１０ｐＭのビオチン化抗原濃度で、ビーズ上に抗原／抗体複合体を捕捉した後、ビーズをＰＤで洗浄し、＞１０００倍の非ビオチン化抗原をビーズと一緒に室温下で０．５～１時間インキュベートする。次に、上記のように洗浄およびりょしゅつする。このような解離速度は、より遅い解離速度を有する抗体の選択を可能にし、これは、インビボ活性に有益である可能性がある。

【0495】

実施例２９に記載の抗体は、上記の一般的な方法に従って生成される。実施例２９に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５７のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５９のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0496】

実施例２９に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図１６に示される。

【0497】

実施例３０：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｏｂ

【0498】

実施例３０に記載の抗体は、実施例２９に記載の上記の一般的な方法に従って生成される。実施例３０に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６０のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６２のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0499】

実施例３０に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図１６に示される。

【0500】

実施例３１：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｏｃ

【0501】

実施例３１に記載の抗体は、実施例２９に記載の上記の一般的な方法に従って生成される。実施例３１に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６３のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６５のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0502】

実施例３１に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図１６に示される。

【0503】

実施例３２：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｏｄ

【0504】

実施例３２に記載の抗体は、実施例２９に記載の上記の一般的な方法に従って生成される。実施例３２に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６６のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６８のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0505】

実施例３２に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図１６に示される。

【0506】

実施例３３：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｏｅ

【0507】

実施例３３に記載の抗体は、実施例２９に記載の上記の一般的な方法に従って生成される。実施例３３に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６９のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７１のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0508】

実施例３３に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図１６に示される。

【0509】

実施例３４：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｏｆ

【0510】

実施例３４に記載の抗体は、実施例２９に記載の上記の一般的な方法に従って生成される。実施例３４に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７２のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７４のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0511】

実施例３４に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図１６に示される。

【0512】

実施例３５：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｏｇ

【0513】

実施例３５に記載の抗体は、実施例２９に記載の上記の一般的な方法に従って生成される。実施例３５に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７５のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７６のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0514】

実施例３５に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図１６に示される。

【0515】

実施例３６：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｏｈ

【0516】

実施例３６に記載の抗体は、実施例２９に記載の上記の一般的な方法に従って生成される。実施例３６に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７８のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７９のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0517】

実施例３６に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図１６に示される。

【0518】

実施例３７：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｏｉ

【0519】

実施例３７に記載の抗体は、実施例２９に記載の上記の一般的な方法に従って生成される。実施例３７に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８０のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８１のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0520】

実施例３７に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図１６に示される。

【0521】

実施例３８：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｏｊ

【0522】

実施例３８に記載の抗体は、実施例２９に記載の上記の一般的な方法に従って生成される。実施例３８に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８３のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８４のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0523】

実施例３８に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図１６に示される。

【0524】

実施例３９：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｏｋ

【0525】

実施例３９に記載の抗体は、実施例２９に記載の上記の一般的な方法に従って生成される。実施例３９に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８６のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８７のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0526】

実施例３９に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図１７に示される。

【0527】

実施例４０：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｏｌ

【0528】

実施例４０に記載の抗体は、実施例２９に記載の上記の一般的な方法に従って生成される。実施例４０に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８６のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８９のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0529】

実施例４０に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図１７に示される。

【0530】

実施例４１：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｏｍ

【0531】

実施例４１に記載の抗体は、実施例２９に記載の上記の一般的な方法に従って生成される。実施例４１に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８６のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９１のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0532】

実施例４１に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図１７に示される。

【0533】

実施例４２：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｏｎ

【0534】

実施例４２に記載の抗体は、実施例２９に記載の上記の一般的な方法に従って生成される。実施例４２に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８６のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９３のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0535】

実施例４２に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図１７に示される。

【0536】

実施例４３：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｏｏ

【0537】

実施例４３に記載の抗体は、実施例２９に記載の上記の一般的な方法に従って生成される。実施例４３に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８６のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９５のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0538】

実施例４３に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図１７に示される。

【0539】

実施例４４：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｏｐ

【0540】

実施例４４に記載の抗体は、実施例２９に記載の上記の一般的な方法に従って生成される。実施例４４に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８６のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９７のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0541】

実施例４４に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図１７に示される。

【0542】

実施例４５：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｏｑ

【0543】

実施例４５に記載の抗体は、実施例２９に記載の上記の一般的な方法に従って生成される。実施例４５に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８６のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９９のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0544】

実施例４５に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図１７に示される。

【0545】

実施例４６：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｏｒ

【0546】

実施例４６に記載の抗体は、実施例２９に記載の上記の一般的な方法に従って生成される。実施例４６に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８６のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０１のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0547】

実施例４６に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図１８に示される。

【0548】

実施例４７：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｏｓ

【0549】

実施例４７に記載の抗体は、実施例２９に記載の上記の一般的な方法に従って生成される。実施例４７に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８６のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０３のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0550】

実施例４７に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図１７に示される。

【0551】

実施例４８：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｏｔ

【0552】

実施例４８に記載の抗体は、実施例２９に記載の上記の一般的な方法に従って生成される。実施例４８に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８６のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０５のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0553】

実施例４８に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図１８に示される。

【0554】

実施例４９：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｏｕ

【0555】

実施例４９に記載の抗体は、実施例２９に記載の上記の一般的な方法に従って生成される。実施例４９に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８６のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０７のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0556】

実施例４９に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図１８に示される。

【0557】

実施例５０：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｏｖ

【0558】

実施例５０に記載の抗体は、実施例２９に記載の上記の一般的な方法に従って生成される。実施例５０に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８６のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０９のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0559】

実施例５０に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図１８に示される。

【0560】

実施例５１：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｏｗ

【0561】

実施例５１に記載の抗体は、実施例２９に記載の上記の一般的な方法に従って生成される。実施例５１に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８６のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0562】

実施例５１に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図１８に示される。

【0563】

実施例５２：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｏｘ

【0564】

実施例５２に記載の抗体は、実施例２９に記載の上記の一般的な方法に従って生成される。実施例５２に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８６のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0565】

実施例５２に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図１８に示される。

【0566】

実施例５３：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｏｙ

【0567】

実施例５３に記載の抗体は、実施例２９に記載の上記の一般的な方法に従って生成される。実施例５３に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８６のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0568】

実施例５３に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図１８に示される。

【0569】

実施例５４：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｏｚ

【0570】

実施例５４に記載の抗体は、実施例２９に記載の上記の一般的な方法に従って生成される。実施例５４に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８６のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１７のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0571】

実施例５４に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図１８に示される。

【0572】

実施例５５：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｏａａ

【0573】

実施例５５に記載の抗体は、実施例２９に記載の上記の一般的な方法に従って生成される。実施例５５に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８６のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１９のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0574】

実施例５５に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図１８に示される。

【0575】

実施例５６：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｏａｂ

【0576】

実施例５６に記載の抗体は、実施例２９に記載の上記の一般的な方法に従って生成される。実施例５６に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２１のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２２のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0577】

実施例５６に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図１９に示される。

【0578】

実施例５７：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｏａｄ

【0579】

実施例５７に記載の抗体は、実施例２９に記載の上記の一般的な方法に従って生成される。実施例５７に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２１のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２３のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0580】

実施例５７に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図１９に示される。

【0581】

実施例５８：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｏａｅ

【0582】

実施例５８に記載の抗体は、実施例２９に記載の上記の一般的な方法に従って生成される。実施例５８に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２４のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0583】

実施例５８に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図２０に示される。

【0584】

実施例５９：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｏａｆ

【0585】

実施例５９に記載の抗体は、実施例２９に記載の上記の一般的な方法に従って生成される。実施例５９に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２１のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0586】

実施例５９に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図１９に示される。

【0587】

実施例６０：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｏａｇ

【0588】

実施例６０に記載の抗体は、実施例２９に記載の上記の一般的な方法に従って生成される。実施例６０に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２８のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２９のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0589】

実施例６０に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図２０に示される。

【0590】

実施例６１：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｏａｈ

【0591】

実施例６１に記載の抗体は、実施例２９に記載の上記の一般的な方法に従って生成される。実施例６１に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３１のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３２のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0592】

実施例６１に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図２０に示される。

【0593】

実施例６２：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｏａｉ

【0594】

実施例６２に記載の抗体は、実施例２９に記載の上記の一般的な方法に従って生成される。実施例６２に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３４のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３５のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0595】

実施例６２に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図２０に示される。

【0596】

実施例６３：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｏａｐ

【0597】

実施例６３に記載の抗体は、実施例２９に記載の上記の一般的な方法に従って生成される。実施例６３に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３７のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４０のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0598】

実施例６３に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図２１および図２２に示される。

【0599】

実施例６４：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｏａｑ

【0600】

実施例６４に記載の抗体は、実施例２９に記載の上記の一般的な方法に従って生成される。実施例６４に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４２のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４４のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0601】

実施例６４に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図２１および図２２に示される。

【0602】

実施例６５：抗ＣＬＤＮ１８．２－５Ｃ９ｏａｒ

【0603】

実施例６５に記載の抗体は、実施例２９に記載の上記の一般的な方法に従って生成される。実施例６５に記載の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４６のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８のアミノ酸配列を含む二つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。

【0604】

実施例６５に記載の抗体の結合特徴の研究は、実施例１のように実施される。結果は、図２２に示される。

【0605】

実施例６６：モノクローナル抗体の純度

【0606】

マウスモノクローナル抗体の純度は、以下のようにＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動によって評価される。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用のサンプルを含むすべてのマイクロ遠心チューブを加熱ブロック（９５℃に設定）または沸騰水に入れる。サンプルを５分間加熱する。ＭＷ標準品から始めて、５μｇの抗体サンプルをゲルレーンにロードする。チャンバーを覆い、アノードおよびカソードに接続する。電気泳動電源の電圧を１００Ｖの定電圧に設定する。ゲルを４５～９０分間電気泳動させる。ゲルの底から染料フロントを取り除いたら、すぐに電源を切る。電極を外し、プレートからグルを取り除く。続いて、ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ染色を実施する（図２３および図２４を参照）。

【0607】

実施例６７：マウス、キメラおよびヒト抗体の選択性測定

【0608】

組換えタンパク質クローディン１８．２およびクローディン１８．１を、炭酸塩緩衝液で最終濃度４．５μｇ／ｍＬに希釈する。Ｅｌｉｓａプレートを４℃で一晩コーティングする。コーティング溶液を除去し、２００μＬのＴＢＳＴでウェルを充填し、プレートを３回洗浄し、追加のブロッキングステップを適用することができる（３０分間、５％のＢＳＡ－ＰＢＳ）。希釈されたマウスモノクローナル抗体７Ｈ１、キメラ抗体ｃｈ５Ｃ９、ｃｈ１５Ｇ１１、ｃｈ９Ａ１およびヒト抗体ｈ５Ｃ９ｏを各ウェルに加え、室温で２時間インキュベートする。非特異的陰性対照マウスＩｇＧをＴＢＳＴで希釈する。２００μＬのＴＢＳＴでウェルを充填し、プレートを３回洗浄し、ＨＲＰ－接合された二次抗体を加え、室温で２時間インキュベートする。プレートを再度３回洗浄し、ＴＭＢ基質溶液を各ウェルに加え、プレートを１５～３０分間インキュベートし、等量の停止液を加える（２ＭのＨ_２ＳＯ_４、選択可能）。３７０または４５０ｎｍで光学密度を読み取る。当該分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８．０．１によって実行される。試験されたすべての抗体は、すべてクローディン１８．２に対して高い選択性を示すが、クローディン１８．１に対しては高い選択性を示さない（図２５、図２６および図２７）。

【0609】

実施例６８：クローディン１８．２を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞に結合するヒト抗体

【0610】

細胞上のクローディン１８．２のエピトープに対するヒト化抗クローディン１８．２抗体の結合を研究する。１×１０^５／ウェルのＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３＿ＣＬＤＮ１８．２細胞を９６ウェルプレートに一晩接種する。室温で細胞を１０％のホルマリンで１５分間固定し、次に、遮断ステップを２時間実行する。洗浄後、一連の抗体希釈液をプレートのウェルに加え、プレートを室温で２時間インキュベートする。３回洗浄後、ヤギ抗ヒトＩｇＧを加え、かつさらに１時間インキュベートし、次に、ＴＭＢ溶液を加えて結合を証明する。結果は、試験されたすべての抗体－ｈ５Ｃ９ｏ、ｈ５Ｃ９ｏＦｃ突然変異、ｈ５Ｃ９ｏｂ、ｈ５Ｃ９ｏａｅ、ｈ５Ｃ９ｏａｇ、ｈ５Ｃ９ｏａｉ、ｈ５Ｃ９ｏａｎおよびｈ５Ｃ９ｏａｏがＨＥＫ２９３＿ＣＬＤＮ１８．２細胞に結合するが、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞には結合しないことを示す（図２８、図２９および図３０）。

【0611】

実施例６９：ヒト抗体内在化アッセイ

【0612】

クローディン１８．２を自然に発現する胃腫瘍細胞ＮＵＧＣ４に対するヒト化抗クローディン１８．２抗体ｈ５Ｃ９ｏの結合を研究するために、緑色蛍光Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ４８８プローブ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、製造業者のプロトコルに従ってｈ５Ｃ９ｏ抗体を標識する。標識されたｈ５Ｃ９ｏを９６ウェルプレートのＮＵＧＣ４培養物に加え、インキュベーション時間とともに写真を撮る。ＮＵＧＣ４細胞内へのｈ５Ｃ９ｏ内在化は、蛍光顕微鏡法Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ４８８染料でモニタリングされ、最大の励起および放出値は、４９４／５１９ｎｍである（図３１）。

【0613】

実施例７０：ＣＬＤＮ１８．２を一時的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｃｈ５Ｃ９、ｃｈ１５Ｇ１１およびｃｈ９Ａ１の補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）測定

【0614】

２．５×１０^４個／ウェルの２４時間クローディン１８．２を一時的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を組織培養平底マイクロタイタープレートに接種する。翌日、増殖培地を除去し、細胞を１：５シリーズ希釈されたキメラ抗体ｃｈ５Ｃ９、ｃｈ１５Ｇ１１およびｃｈ９Ａ１と一緒に３７℃、５％のＣＯ_２、９０％の湿度で２時間インキュベートする。次に、補体を有するヒト血清または血漿を最終濃度が２５％（ｖ／ｖ）になるように加え、細胞を３７℃で３．５時間インキュベートする。Ｃｙｔｏ－Ｇｌｏ細胞毒性測定試薬を各ウェルに加える。プレートを混合し、かつ室温で１５分間インキュベートする。Ｂｉｏ－Ｔｅｋプレートリーダーｓｙｎｅｒｇｙ４を使用して発光シグナルを測定する。ＥＣ５０は、Ｐｒｉｓｍ Ｇｒａｐｈｐａｄ ８．０．１、非線状回帰アゴニストｖｓ反応変数の傾き（四つのパラメーター）によって計算される。結果は、図３２に示される。

【0615】

実施例７１：ＣＬＤＮ１８．２を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｃｈ５Ｃ９およびｈ５Ｃ９ｏの補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）測定

【0616】

５×１０^４個／ウェルのクローディン１８．２を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞および対照ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を組織培養平底マイクロタイタープレートに接種する。翌日、増殖培地を除去し、細胞を１：３シリーズ希釈されたキメラおよびヒト抗体ｃｈ５Ｃ９およびｈ５Ｃ９ｏと一緒に３７℃、５％のＣＯ_２、９０％の湿度で２時間インキュベートする。次に、補体を有するヒト血清または血漿を最終濃度が２５％（ｖ／ｖ）になるように加え、細胞を３７℃で３時間インキュベートする。Ｃｙｔｏ－Ｇｌｏ細胞毒性測定試薬を各ウェルに加え、混合しかつ室温で１５分間インキュベートする。Ｂｉｏ－Ｔｅｋプレートリーダーｓｙｎｅｒｇｙ４を使用して発光シグナルを測定する。ＥＣ５０は、Ｐｒｉｓｍ Ｇｒａｐｈｐａｄ ８．０．１、非線状回帰アゴニストｖｓ反応変数の傾き（四つのパラメーター）によって計算される。結果は、図３３および図３４に示される。

【0617】

実施例７２：ＣＬＤＮ１８．２を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｈ５Ｃ９ｏ、ｈ５Ｃ９ｏｂ、ｈ５Ｃ９ｏａｐ、ｈ５Ｃ９ｏａｑ、ｈ５Ｃ９ｏａｅおよびｈ５Ｃ９ｏａｒの補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）測定

【0618】

２×１０^４個／ウェルのクローディン１８．２を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を組織培養平底マイクロタイタープレートに接種する。翌日、増殖培地を除去し、細胞を１：３シリーズ希釈されたヒト抗体ｈ５Ｃ９ｏ、ｈ５Ｃ９ｏｂ、ｈ５Ｃ９ｏａｐ、ｈ５Ｃ９ｏａｑ、ｈ５Ｃ９ｏａｅおよびｈ５Ｃ９ｏａｒと一緒に３７℃、５％のＣＯ_２、９０％の湿度で２時間インキュベートする。次に、補体を有するヒト血清または血漿を最終濃度が２５％（ｖ／ｖ）になるように加え、細胞を３７℃で３時間インキュベートする。Ｃｙｔｏ－Ｇｌｏ細胞毒性測定試薬を各ウェルに加え、混合しかつ室温で１５分間インキュベートする。Ｂｉｏ－Ｔｅｋプレートリーダーｓｙｎｅｒｇｙ４を使用して発光シグナルを測定する。ＥＣ５０は、Ｐｒｉｓｍ Ｇｒａｐｈｐａｄ ８．０．１、非線状回帰アゴニストｖｓ反応変数の傾き（四つのパラメーター）によって計算される。結果は、図３５および図３６に示される。

【0619】

実施例７３：キメラ抗体ｃｈ５Ｃ９、ｃｈ１５Ｇ１１およびｃｈ９Ａ１の抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）

【0620】

ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して三つのキメラ抗体ｃｈ５Ｃ９、ｃｈ１５Ｇ１１およびｃｈ９Ａ１に対してＡＤＣＣ測定する。２．５×１０^４個／ウェルのＣＬＤＮ１８．２を一時的に発現する細胞を９６ウェル培養プレートに一晩接種する。翌日、培地を除去し、シリーズ希釈されたキメラ抗ＣＬＤＮ１８．２抗体－ｃｈ５Ｃ９、ｃｈ１５Ｇ１１およびｃｈ９Ａ１を含む５０μＬの４％ＦＢＳ ＲＰＭＩ培地で代替する。２５μＬの遺伝子操作されたＪｕｒｋａｔ細胞をＥ：Ｔ＝６：１の比率で各ウェルに加え、細胞混合物を３７℃、５％のＣＯ_２、９０％の湿度で６時間インキュベートする。Ｂｉｏ－ｔｅｋ ｓｙｎｅｒｇｙ４は、ルシフェラーゼの発現を駆動するＮＦＡＦ（Ｔ細胞を活性化する神経因子）反応要素によって生成される発光シグナルを記録する。ＥＣ５０は、Ｐｒｉｓｍ Ｇｒａｐｈｐａｄ８．０．１、非線状回帰アゴニストｖｓ反応変数の傾き（四つのパラメーター）によって計算される。結果は、図３７に示される。

【0621】

実施例７４：キメラ抗体ｃｈ５Ｃ９およびｃｈ７Ｈ１の抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）

【0622】

ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＡＤＣＣ測定する。２．２×１０^４個／ウェルのＣＬＤＮ１８．２を安定的に発現する細胞ＨＥＫ２９３＿ＣＬＤＮ１８．２を９６ウェル培養プレートに一晩接種する。翌日、培地を除去し、１：５シリーズ希釈されたキメラ抗ＣＬＤＮ１８．２抗体－ｃｈ５Ｃ９およびｃｈ７Ｈ１を含む５０μＬの４％ＦＢＳ ＲＰＭＩ培地で代替する。２５μＬの遺伝子操作されたＪｕｒｋａｔ細胞をＥ：Ｔ＝６：１の比率で各ウェルに加え、細胞混合物を３７℃、５％のＣＯ_２、９０％の湿度で６時間インキュベートする。Ｂｉｏ－ｔｅｋ ｓｙｎｅｒｇｙ４は、ルシフェラーゼの発現を駆動するＮＦＡＦ（Ｔ細胞を活性化する神経因子）反応要素によって生成される発光シグナルを記録する。ＥＣ５０は、Ｐｒｉｓｍ Ｇｒａｐｈｐａｄ８．０．１、非線状回帰アゴニストｖｓ反応変数の傾き（四つのパラメーター）によって計算される。結果は、図３８に示される。

【0623】

実施例７５：ＮＵＧＣ４におけるキメラ抗体ｃｈ７Ｈ１の抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）

【0624】

ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＡＤＣＣ測定する。２．２×１０^４個／ウェルの胃腫瘍細胞ＮＵＧＣ４を９６ウェル培養プレートに一晩接種する。翌日、培地を除去し、１：５シリーズ希釈されたキメラ抗ＣＬＤＮ１８．２抗体ｃｈ７Ｈ１を含む５０ｕｌの４％ＦＢＳ ＲＰＭＩ培地で代替する。２５ｕｌの遺伝子操作されたＪｕｒｋａｔ細胞をＥ：Ｔ＝６：１の比率で各ウェルに加え、細胞混合物を３７℃、５％のＣＯ_２、９０％の湿度で６時間インキュベートする。Ｂｉｏ－ｔｅｋ ｓｙｎｅｒｇｙ４は、ルシフェラーゼの発現を駆動するＮＦＡＦ（Ｔ細胞を活性化する神経因子）反応要素によって生成される発光シグナルを記録する。ＥＣ５０は、Ｐｒｉｓｍ Ｇｒａｐｈｐａｄ８．０．１、非線状回帰アゴニストｖｓ反応変数の傾き（四つのパラメーター）によって計算される。結果は、図３９に示される。

【0625】

実施例７６：胃腫瘍細胞ＫＡＴＯ ＩＩＩにおけるキメラおよびヒト抗体ｃｈ５Ｃ９およびｈ５Ｃ９ｏのＡＤＣＣ効果

【0626】

ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＡＤＣＣ測定する。２．２×１０^４個／ウェルのＣＬＤＮ１８．２を発現する胃腫瘍細胞ＫＡＴＯ ＩＩＩを９６ウェル培養プレートに一晩接種する。翌日、培地を除去し、１：５シリーズ希釈されたキメラ抗ＣＬＤＮ１８．２抗体－ｃｈ５Ｃ９およびｃｈ７Ｈ１を含む５０μＬの４％ＦＢＳ ＲＰＭＩ培地で代替する。２５μＬの遺伝子操作されたＪｕｒｋａｔ細胞をＥ：Ｔ＝６：１の比率で各ウェルに加え、細胞混合物を３７℃、５％のＣＯ_２、９０％の湿度で６時間インキュベートする。Ｂｉｏ－ｔｅｋ ｓｙｎｅｒｇｙ４は、ルシフェラーゼの発現を駆動するＮＦＡＦ（Ｔ細胞を活性化する神経因子）反応要素によって生成される発光シグナルを記録する。ＥＣ５０は、Ｐｒｉｓｍ Ｇｒａｐｈｐａｄ８．０．１、非線状回帰アゴニストｖｓ反応変数の傾き（四つのパラメーター）によって計算される。結果は、図４０および図４１に示される。

【0627】

実施例７７：ＨＥＫ２９３＿ＣＬＤＮ１８．２細胞におけるｈ５Ｃ９ｏａｂ、ｈ５Ｃ９ｏａｆ、ｈ５Ｃ９ｏａｇ、ｈ５Ｃ９ｏａｊ、ｈ５Ｃ９ｏａｋ、ｈ５Ｃ９ｏａｍ、ｈ５Ｃ９ｏａｎおよびｈ５Ｃ９ｏｈのＡＤＣＣ効果

【0628】

ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＡＤＣＣ測定する。１×１０^４個／ウェルのＣＬＤＮ１８．２を安定的に発現する細胞ＨＥＫ２９３＿ＣＬＤＮ１８．２を９６ウェル培養プレートに一晩接種する。翌日、培地を除去し、１：３シリーズ希釈された抗ＣＬＤＮ１８．２抗体ｈ５Ｃ９ｏａｂ、ｈ５Ｃ９ｏａｆ、ｈ５Ｃ９ｏａｇ、ｈ５Ｃ９ｏａｊ、ｈ５Ｃ９ｏａｋ、ｈ５Ｃ９ｏａｍ、ｈ５Ｃ９ｏａｎおよびｈ５Ｃ９ｏｈを含む５０μＬの４％ＦＢＳ ＲＰＭＩ培地で代替する。２５μＬの遺伝子操作されたＪｕｒｋａｔ細胞をＥ：Ｔ＝１０：１の比率で各ウェルに加え、細胞混合物を３７℃、５％のＣＯ_２、９０％の湿度で６時間インキュベートする。Ｂｉｏ－ｔｅｋ ｓｙｎｅｒｇｙ４は、ルシフェラーゼの発現を駆動するＮＦＡＦ（Ｔ細胞を活性化する神経因子）反応要素によって生成される発光シグナルを記録する。ＥＣ５０は、Ｐｒｉｓｍ Ｇｒａｐｈｐａｄ８．０．１、非線状回帰アゴニストｖｓ反応変数の傾き（四つのパラメーター）によって計算される。結果は、図４２および図４３に示される。

【0629】

実施例７８：ＨＥＫ２９３＿ＣＬＤＮ１８．２細胞におけるｈ５Ｃ９ｏａｏ、ｈ５Ｃ９ｏａｑ、ｈ５Ｃ９ｏａｒ、ｈ５Ｃ９ｏａｉ、ｈ５Ｃ９ｏａｅのＡＤＣＣ

【0630】

ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＡＤＣＣ測定する。１×１０^４個／ウェルのＣＬＤＮ１８．２を安定的に発現する細胞ＨＥＫ２９３＿ＣＬＤＮ１８．２を９６ウェル培養プレートに一晩接種する。翌日、培地を除去し、１：３シリーズ希釈された抗ＣＬＤＮ１８．２抗体ｈ５Ｃ９ｏａｏ、ｈ５Ｃ９ｏａｑ、ｈ５Ｃ９ｏａｒ、ｈ５Ｃ９ｏａｉ、ｈ５Ｃ９ｏａｅを含む５０μＬの４％ＦＢＳ ＲＰＭＩ培地で代替する。２５μＬの遺伝子操作されたＪｕｒｋａｔ細胞をＥ：Ｔ＝１０：１の比率で各ウェルに加え、細胞混合物を３７℃、５％のＣＯ_２、９０％の湿度で６時間インキュベートする。Ｂｉｏ－ｔｅｋ ｓｙｎｅｒｇｙ４は、ルシフェラーゼの発現を駆動するＮＦＡＦ（Ｔ細胞を活性化する神経因子）反応要素によって生成される発光シグナルを記録する。ＥＣ５０は、Ｐｒｉｓｍ Ｇｒａｐｈｐａｄ８．０．１、非線状回帰アゴニストｖｓ反応変数の傾き（四つのパラメーター）によって計算される。結果は、図４４に示される。

【0631】

実施例７９：ＨＥＫ２９３＿ＣＬＤＮ１８．２細胞におけるｈ５Ｃ９ｏＦｃ、ｈ５Ｃ９ｏａｏ、ｈ５Ｃ９ｏａｑ、ｈ５Ｃ９ｏｂ、ｈ５Ｃ９ｏａｐおよびｈ５Ｃ９ｏａｅのＡＤＣＣ

【0632】

ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＡＤＣＣ測定する。１×１０^４個／ウェルのＣＬＤＮ１８．２を安定的に発現する細胞ＨＥＫ２９３＿ＣＬＤＮ１８．２を９６ウェル培養プレートに一晩接種する。翌日、培地を除去し、１：３シリーズ希釈された抗ＣＬＤＮ１８．２抗体ｈ５Ｃ９ｏＦｃ、ｈ５Ｃ９ｏａｏ、ｈ５Ｃ９ｏａｑ、ｈ５Ｃ９ｏｂ、ｈ５Ｃ９ｏａｐ、ｈ５Ｃ９ｏａｅを含む５０μＬの４％ＦＢＳ ＲＰＭＩ培地で代替する。２５μＬの遺伝子操作されたＪｕｒｋａｔ細胞をＥ：Ｔ＝１０：１の比率で各ウェルに加え、細胞混合物を３７℃、５％のＣＯ_２、９０％の湿度で６時間インキュベートする。Ｂｉｏ－ｔｅｋ ｓｙｎｅｒｇｙ４は、ルシフェラーゼの発現を駆動するＮＦＡＦ（Ｔ細胞を活性化する神経因子）反応要素によって生成される発光シグナルを記録する。ＥＣ５０は、Ｐｒｉｓｍ Ｇｒａｐｈｐａｄ８．０．１、非線状回帰アゴニストｖｓ反応変数の傾き（四つのパラメーター）によって計算される。結果は、図４５に示される。

【0633】

実施例８０：ＣＤ１マウスにおけるヒト化抗クローディン１８．２抗体ｈ５Ｃ９ｏの薬物動態研究

【0634】

すべてのマウスは、特定の病原体のない条件下で維持され、Ｓｐａｒｘ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｉｎｃの機構動物管理および使用委員会によって確立された動物実験カイドラインに従って、すべての動物手順を実施する。ＣＤ１マウスは、ＰＫ研究において尾静脈を介して１ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇのｈ５Ｃ９ｏの単回ＩＶ投与量を受ける。１５分間、２時間、８時間、第１、２、３、７、１４および２１日等の時点で心臓穿刺を介して、各投与グループの各動物から末端血液サンプル収集し（ｎ＝２／グループ）、血清を処理して、Ｅｌｉｓａ分析によるＰＫ分析を実行する。結果は、図４６に示される。

【0635】

実施例８１：ヌードマウスのＣＬＤＮ１８．２陽性腫瘍細胞異種移植片におけるｈ５Ｃ９ｏのインビボ効力

【0636】

すべてのマウスは、特定の病原体のない条件下で維持され、Ｓｐａｒｘ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｉｎｃの機構動物管理および使用委員会によって確立された動物実験カイドラインに従って、すべての動物手順を実施する。ヌードマウスに１×１０^６個（１：１Ｍａｔｒｉｇｅｌ）ＨＥＫ２９３＿ＣＬＤＮ１８．２細胞を皮下接種する。腫瘍接種５日後に、グループあたり８～１０匹のマウスの処理を開始する。マウスを静脈内投与経路により、２００μｇのｈ５Ｃ９ｏ、ゾロキシマブおよびＰＢＳで週２回６週間処理する。ＰＢＳで治療するグループのすべてのマウスは、５５日内に死亡したが、ｈ５Ｃ９ｏで処理された動物は、腫瘍形成および増殖に対して有意な阻害作用を示しただけでなく（図４７）、ゾロキシマブよりも優れた生存利益を有する（図４８）。

【0637】

全体の明細書において、本発明の好ましいおよび代替的な実施形態に関する様々な指示を提示する。しかしながら、前述の詳細な説明は、限定的ではなく例示的であると見なされるべきであり、本発明は上記実施形態のいずれかにも限定されない。すべての同等物を含む添付の特許請求の範囲は、本発明の精神および範囲を定義することを意図していることを理解されたい。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47】

【図48】

【配列表】

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