(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-07-12
(45)【発行日】2024-07-23
(54)【発明の名称】ＧＩＰＲアゴニスト化合物
(51)【国際特許分類】
C07K 14/575 20060101AFI20240716BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20240716BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20240716BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20240716BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240716BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20240716BHJP
C12N 15/16 20060101ALN20240716BHJP
【ＦＩ】
C07K14/575 ZNA
A61K38/16
A61P3/04
A61P3/10
A61P43/00 111
A61P3/00
C12N15/16
【請求項の数】
7
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2023021452
(22)【出願日】2023-02-15
(62)【分割の表示】P 2022506052の分割
【原出願日】2020-07-29
(65)【公開番号】P2023062068
(43)【公開日】2023-05-02
【審査請求日】2023-02-15
(31)【優先権主張番号】62/881,685
(32)【優先日】2019-08-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】594197872
【氏名又は名称】イーライ リリー アンド カンパニー
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100126778
【弁理士】
【氏名又は名称】品川 永敏
(74)【代理人】
【識別番号】100162684
【弁理士】
【氏名又は名称】呉 英燦
(72)【発明者】
【氏名】アルシナ－フェルナンデス，ホルヘ
(72)【発明者】
【氏名】ガイザー，アンドレア レネー
(72)【発明者】
【氏名】グオ，リリ
(72)【発明者】
【氏名】カイザー，サマンサ グレイス ライオンズ
(72)【発明者】
【氏名】リー，ジョン
(72)【発明者】
【氏名】ク，ホンチャン
(72)【発明者】
【氏名】ロール，ウィリアム クリストファー
【審査官】山内 達人
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１８－５００２８２（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１９／１２５９２９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１８／０１５５４０７（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１６／１１１９７１（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ
Ａ６１Ｋ
Ａ６１Ｐ
Ｃ１２Ｎ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、および配列番号１１～１２６からなる群から選択される、化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項2】
糖尿病、肥満、およびメタボリックシンドロームからなる群から選択される病気を治療するための医薬組成物であって、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を含む、医薬組成物。
【請求項3】
前記病気が、肥満である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項4】
前記病気が、２型糖尿病である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項5】
インスリン療法を受けている患者における糖尿病を治療するための医薬組成物であって、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を含む、医薬組成物。
【請求項6】
少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤をさらに含む、請求項２～５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項7】
前記化合物またはその薬学的に許容される塩を、それを必要とする患者に投与するように用いられることを特徴とする、請求項２～６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ヒトグルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド（ＧＩＰ）受容体で活性を有する化合物に関する。本発明はまた、ＧＩＰ受容体において、延長された作用持続時間を有する化合物に関する。これらの化合物は、２型糖尿病（「Ｔ２ＤＭ」）の治療に有用であり得る。また、これらの化合物は、肥満の治療に有用であり得る。
【背景技術】
【0002】
過去数十年間、糖尿病の有病率は上昇し続けている。Ｔ２ＤＭは、糖尿病全体の約９０％を占める、糖尿病の最も一般的な形態である。Ｔ２ＤＭは、主にインスリン耐性と関係がある高血糖値を特徴とする。Ｔ２ＤＭの現在の標準治療としては、食事制限および運動、経口薬での治療、ならびにＧＬＰ－１受容体アゴニストなどのインクレチンベースの療法を含む、注射可能な血糖降下薬での治療が挙げられる。Ｔ２ＤＭの治療には、現在様々なＧＬＰ－１受容体アゴニストが利用可能であるが、現在市販されているＧＬＰ－１受容体アゴニストは、吐き気および嘔吐といった胃腸管系の副作用のため、一般的に投与量が制限されている。
【0003】
利用可能なＧＬＰ－１受容体アゴニストの投与経路として、皮下注射が一般的である。経口薬およびインクレチンベースの療法が不十分な場合は、インスリン治療が検討される。今日利用可能な治療の進歩にもかかわらず、多くのＴ２ＤＭ患者は、依然血糖コントロール目標を達成できない。糖尿病は制御できないと、患者の罹患率および死亡率の上昇に関わる各種疾患につながる。
【0004】
より多くのＴ２ＤＭ患者が血糖治療目標を達成できるような治療が必要とされている。
【0005】
肥満は、脂肪組織量の過剰な蓄積につながる複雑な内科的障害である。今日、肥満は、好ましくない健康上の転帰および罹病率に関連する世界的な公衆衛生上の懸念である。肥満の患者の望ましい治療においては、過度の体重が低減され、肥満に関連する併存症が改善され、かつ長期的な減量が維持されるべきである。利用可能な肥満の治療は、重度肥満の患者にとっては特に不十分である。かかる治療を必要とする患者に治療的減量を誘導させるための代替治療の選択肢が必要とされている。
【0006】
ＷＯ２０１６／１１１９７１は、ＧＬＰ－１ＲおよびＧＩＰＲアゴニスト活性を有するとされるペプチドを説明している。また、ＷＯ２０１３／１６４４８３は、ＧＬＰ－１ＲおよびＧＩＰＲ活性を有するとされる化合物を開示している。
【0007】
ＷＯ２０１８／１８１８６４は、ＧＩＰＲアゴニスト活性を有するとされる化合物を開示している。
【0008】
かかる治療を必要とする患者のより大部分に効果的なグルコース制御を提供することができるＴ２ＤＭ治療が必要とされている。効果的なグルコース制御を提供でき、かつ良好な副作用プロファイルを有するＴ２ＤＭ治療がさらに必要とされている。重度の肥満の患者など、かかる治療を必要とする患者に治療的減量を提供するための代替治療の選択肢が必要とされている。患者に優れた血糖結果および／またはより望ましい副作用プロファイルを提供するために、インスリン療法および／またはインクレチン療法と組み合わせることができる糖尿病治療の選択肢が望まれている。
【0009】
化合物の投与頻度を減らすことができるため、ＧＩＰ受容体において延長された作用持続時間を有する化合物が望ましい。
【発明の概要】
【0010】
したがって、実施形態１は、式Ｉ：
Ｚ１Ｘ１Ｘ２ＥＧＴＸ６ＩＳＤＹＳＩＸ１３ＬＤＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＱＸ２０Ｘ２１Ｘ２２ＶＸ２４Ｘ２５Ｘ２６ＬＸ２８Ｘ２９ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＺ２（配列番号４）
［式中、
Ｚ１は、Ｎ末端アミノ基の修飾であり、この修飾はアセチルおよび不存在からなる群から選択され、
Ｘ１は、ＹおよびＤ－Ｔｙｒからなる群から選択され、
Ｘ２は、Ａｉｂ、Ａ、およびＤ－Ａｌａからなる群から選択され、
Ｘ６は、Ｆ、αＭｅＦ、Ｉｖａ、Ｌ、αＭｅＬ、およびαＭｅＦ（２Ｆ）からなる群から選択され、
Ｘ１３は、αＭｅＬ、Ａ、Ｌ、およびＡｉｂからなる群から選択され、
Ｘ１６は、Ｋ、Ｅ、およびＯｒｎからなる群から選択され、
Ｘ１７は、ＩおよびＫ（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γ－Ｇｌｕ）－ＣＯ－（ＣＨ２）ｑ－ＣＯ２Ｈからなる群から選択され、
Ｘ１８は、Ｈ、Ａ、およびＲからなる群から選択され、
Ｘ２０は、ＡｉｂおよびＱからなる群から選択され、
Ｘ２１は、ＤおよびＥからなる群から選択され、
Ｘ２２は、ＦおよびαＭｅＦからなる群から選択され、
Ｘ２４は、Ｅ、Ｎ、Ｑ、およびＤ－Ｇｌｕからなる群から選択され、
Ｘ２５は、Ｙ、４－Ｐａｌ、Ｗ、およびαＭｅＹからなる群から選択され、
Ｘ２６は、ＬおよびＫ（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γ－Ｇｌｕ）－ＣＯ－（ＣＨ２）ｑ－ＣＯ２Ｈからなる群から選択され、
Ｘ２８は、ＥおよびＡからなる群から選択され、
Ｘ２９は、Ｇ、Ａ、Ｑ、およびＴからなる群から選択され、ｑは、１６および１８からなる群から選択され、
Ｚ２は、不存在であるか、またはＣ末端基の修飾であり、この修飾は、アミド化であり、
Ｘ１７およびＸ２６から選択される１つのみが、Ｋ（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γ－Ｇｌｕ）－ＣＯ－（ＣＨ２）ｑ－ＣＯ２Ｈである］
で示される化合物またはその薬学的に許容される塩である。
Ｚ１Ｘ１Ｘ２ＥＧＴＸ６ＩＳＤＹＳＩＸ１３ＬＤＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＱＸ２０Ｘ２１Ｘ２２ＶＸ２４Ｘ２５Ｘ２６ＬＸ２８Ｘ２９ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＺ２（配列番号４）
［式中、
Ｚ１は、Ｎ末端アミノ基の修飾であり、この修飾はアセチルおよび不存在からなる群から選択され、
Ｘ１は、ＹおよびＤ－Ｔｙｒからなる群から選択され、
Ｘ２は、Ａｉｂ、Ａ、およびＤ－Ａｌａからなる群から選択され、
Ｘ６は、Ｆ、αＭｅＦ、Ｉｖａ、Ｌ、αＭｅＬ、およびαＭｅＦ（２Ｆ）からなる群から選択され、
Ｘ１３は、αＭｅＬ、Ａ、Ｌ、およびＡｉｂからなる群から選択され、
Ｘ１６は、Ｋ、Ｅ、およびＯｒｎからなる群から選択され、
Ｘ１７は、ＩおよびＫ（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γ－Ｇｌｕ）－ＣＯ－（ＣＨ２）ｑ－ＣＯ２Ｈからなる群から選択され、
Ｘ１８は、Ｈ、Ａ、およびＲからなる群から選択され、
Ｘ２０は、ＡｉｂおよびＱからなる群から選択され、
Ｘ２１は、ＤおよびＥからなる群から選択され、
Ｘ２２は、ＦおよびαＭｅＦからなる群から選択され、
Ｘ２４は、Ｅ、Ｎ、Ｑ、およびＤ－Ｇｌｕからなる群から選択され、
Ｘ２５は、Ｙ、４－Ｐａｌ、Ｗ、およびαＭｅＹからなる群から選択され、
Ｘ２６は、ＬおよびＫ（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γ－Ｇｌｕ）－ＣＯ－（ＣＨ２）ｑ－ＣＯ２Ｈからなる群から選択され、
Ｘ２８は、ＥおよびＡからなる群から選択され、
Ｘ２９は、Ｇ、Ａ、Ｑ、およびＴからなる群から選択され、ｑは、１６および１８からなる群から選択され、
Ｚ２は、不存在であるか、またはＣ末端基の修飾であり、この修飾は、アミド化であり、
Ｘ１７およびＸ２６から選択される１つのみが、Ｋ（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γ－Ｇｌｕ）－ＣＯ－（ＣＨ２）ｑ－ＣＯ２Ｈである］
で示される化合物またはその薬学的に許容される塩である。
【0011】
実施形態２は、Ｚ１が、不存在であり、Ｘ１が、Ｙである、実施形態１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【0012】
実施形態３は、Ｘ２が、Ａｉｂである、実施形態１または実施形態２に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【0013】
実施形態４は、Ｘ６が、ＦおよびαＭｅＦ（２Ｆ）からなる群から選択される、実施形態１～３のいずれか１つに記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【0014】
実施形態５は、Ｘ１３が、ＬおよびαＭｅＬからなる群から選択される、実施形態１～４のいずれか１つに記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【0015】
実施形態６は、Ｘ１６が、ＫまたはＯｒｎである、実施形態１～５のいずれか１つに記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【0016】
実施形態７は、Ｘ１６が、Ｋである、実施形態６に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【0017】
実施形態８は、Ｘ１８が、Ｈである、実施形態１～７のいずれか１つに記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【0018】
実施形態９は、Ｘ２０が、Ａｉｂであり、Ｘ２２が、Ｆである、実施形態１～８のいずれか１つに記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【0019】
実施形態１０は、Ｘ２１が、Ｄである、実施形態１～９のいずれか１つに記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【0020】
実施形態１１は、Ｘ２５が、４－ＰａｌまたはＹである、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【0021】
実施形態１２は、
Ｘ１７が、Ｋ（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γ－Ｇｌｕ）－ＣＯ－（ＣＨ２）ｑ－ＣＯ２Ｈであり、
Ｘ２６が、Ｌである、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
Ｘ１７が、Ｋ（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γ－Ｇｌｕ）－ＣＯ－（ＣＨ２）ｑ－ＣＯ２Ｈであり、
Ｘ２６が、Ｌである、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【0022】
実施形態１３は、
Ｘ１７が、Ｉであり、
Ｘ２６が、Ｋ（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γ－Ｇｌｕ）－ＣＯ－（ＣＨ２）ｑ－ＣＯ２Ｈである、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
Ｘ１７が、Ｉであり、
Ｘ２６が、Ｋ（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γ－Ｇｌｕ）－ＣＯ－（ＣＨ２）ｑ－ＣＯ２Ｈである、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【0023】
実施形態１４は、ｑが、１６である、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【0024】
実施形態１５は、ｑが、１８である、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【0025】
実施形態１６は、
Ｚ１が不存在であり、
Ｘ１が、Ｙであり、
Ｘ２が、ＡｉｂおよびＤ－Ａｌａからなる群から選択され、Ｘ６が、Ｆであり、
Ｘ１３が、αＭｅＬおよびＬからなる群から選択され、
Ｘ１６が、ＫおよびＯｒｎからなる群から選択され、
Ｘ１８が、ＨおよびＡからなる群から選択され、
Ｘ２０が、Ａｉｂであり、
Ｘ２２が、Ｆであり、
Ｘ２４が、Ｅ、Ｎ、およびＤ－Ｇｌｕからなる群から選択され、
Ｘ２５が、Ｙ、４－Ｐａｌ、およびＷからなる群から選択され、
Ｘ２８が、ＥおよびＡからなる群から選択され、
Ｘ２９が、Ｇ、Ａ、およびＱからなる群から選択され、ｑが、１６および１８からなる群から選択される、実施形態１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
Ｚ１が不存在であり、
Ｘ１が、Ｙであり、
Ｘ２が、ＡｉｂおよびＤ－Ａｌａからなる群から選択され、Ｘ６が、Ｆであり、
Ｘ１３が、αＭｅＬおよびＬからなる群から選択され、
Ｘ１６が、ＫおよびＯｒｎからなる群から選択され、
Ｘ１８が、ＨおよびＡからなる群から選択され、
Ｘ２０が、Ａｉｂであり、
Ｘ２２が、Ｆであり、
Ｘ２４が、Ｅ、Ｎ、およびＤ－Ｇｌｕからなる群から選択され、
Ｘ２５が、Ｙ、４－Ｐａｌ、およびＷからなる群から選択され、
Ｘ２８が、ＥおよびＡからなる群から選択され、
Ｘ２９が、Ｇ、Ａ、およびＱからなる群から選択され、ｑが、１６および１８からなる群から選択される、実施形態１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【0026】
実施形態１７は、
Ｚ１が、不存在であり、
Ｘ２が、Ａｉｂであり、
Ｘ１３が、αＭｅＬであり、
Ｘ１８が、Ｈであり、
Ｘ２４が、ＥおよびＤ－Ｇｌｕからなる群から選択され、
Ｘ２５が、Ｙおよび４－Ｐａｌからなる群から選択され、
Ｘ２８が、Ｅであり、
Ｘ２９が、ＧおよびＡからなる群から選択される、
実施形態１６に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
Ｚ１が、不存在であり、
Ｘ２が、Ａｉｂであり、
Ｘ１３が、αＭｅＬであり、
Ｘ１８が、Ｈであり、
Ｘ２４が、ＥおよびＤ－Ｇｌｕからなる群から選択され、
Ｘ２５が、Ｙおよび４－Ｐａｌからなる群から選択され、
Ｘ２８が、Ｅであり、
Ｘ２９が、ＧおよびＡからなる群から選択される、
実施形態１６に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【0027】
実施形態１８は、Ｘ１７が、Ｋ（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γ－Ｇｌｕ）－ＣＯ－（ＣＨ２）ｑ－ＣＯ２Ｈであり、
Ｘ２６が、Ｌである、実施形態１７に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
Ｘ２６が、Ｌである、実施形態１７に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【0028】
実施形態１９は、Ｘ１７が、Ｉであり、Ｘ２６が、Ｋ（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γ－Ｇｌｕ）－ＣＯ－（ＣＨ２）ｑ－ＣＯ２Ｈである、実施形態１７に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【0029】
実施形態２０は、化合物が、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１からなる群から選択される、実施形態１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【0030】
実施形態２１は、化合物が、配列番号５である、実施形態１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。実施形態２２は、化合物が、配列番号６である、実施形態１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。実施形態２３は、化合物が、配列番号７である、実施形態１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。実施形態２４は、化合物が、配列番号８である、実施形態１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。実施形態２５は、化合物が、配列番号９である、実施形態１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。実施形態２６は、化合物が、配列番号１０である、実施形態１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。実施形態２７は、化合物が、配列番号１１である、実施形態１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【0031】
一実施形態は、糖尿病、肥満、およびメタボリックシンドロームからなる群から選択される病気を治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の実施形態１～２７のいずれか１つに記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む方法を提供する。一実施形態は、Ｔ２ＤＭ、肥満、およびメタボリックシンドロームからなる群から選択される病気を治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む方法を提供する。一実施形態は、治療的減量を提供するための方法であって、それを必要とする対象に、有効量の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む方法を提供する。一実施形態は、Ｔ２ＤＭを治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の実施形態１～２７のいずれか１つに記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む方法である。
【0032】
一実施形態は、療法での使用のための、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。一実施形態は、糖尿病、肥満、およびメタボリックシンドロームからなる群から選択される病気を治療するための療法での使用のための、実施形態１～２７のいずれか１つに記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。一実施形態は、Ｔ２ＤＭ、肥満、およびメタボリックシンドロームからなる群から選択される病気を治療するための療法での使用のための、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。一実施形態において、病気は、Ｔ２ＤＭである。一実施形態において、病気は、肥満である。一実施形態において、病気は、１型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）である。一実施形態において、病気は、インスリン療法を受けている患者における糖尿病である。一実施形態において、病気は、メタボリックシンドロームである。
【0033】
式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩は、様々な症状または障害の治療に有用であり得る。例えば、特定の実施形態は、患者におけるＴ２ＤＭの治療のための方法であって、かかる治療を必要とする対象に、有効量の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む方法を提供する。一実施形態には、患者における肥満の治療のための方法であって、かかる治療を必要とする対象に、有効量の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む方法がある。一実施形態において、方法は、対象における非治療的な減量の誘導であって、かかる治療を必要とする対象に、有効量の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む誘導である。
【0034】
特定の実施形態において、本発明は、患者におけるメタボリックシンドロームの治療のための方法であって、かかる治療を必要とする対象に、有効量の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む方法を提供する。一実施形態において、方法は、インスリン療法を受けている患者における糖尿病の治療であって、かかる治療を必要とする対象に、有効量の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む治療である。本明細書はまた、Ｔ２ＤＭ、肥満、およびメタボリックシンドロームからなる群から選択される病気の治療における、メトホルミン、チアゾリジンジオン、スルホニル尿素、ジペプチジルペプチダーゼ４阻害剤、ナトリウム－グルコース共輸送体－２（ＳＧＬＴ－２）阻害剤、成長分化因子１５モジュレーター（「ＧＤＦ１５」）、ペプチドチロシンチロシンモジュレーター（「ＰＹＹ」）、修飾インスリン、アミリン、デュアルアミリン－カルシトニン受容体アゴニスト、およびオキシントモジュリンアゴニスト（「ＯＸＭ」）から選択される１つ以上の薬剤との同時、個別、または逐次の組み合わせに使用するための本発明の化合物を提供する。本明細書はまた、Ｔ２ＤＭ、肥満、およびメタボリックシンドロームからなる群から選択される病気の治療における、メトホルミン、チアゾリジンジオン、スルホニル尿素、ジペプチジルペプチダーゼ４阻害剤、ナトリウム－グルコース共輸送体－２（ＳＧＬＴ－２）阻害剤、成長分化因子１５モジュレーター（「ＧＤＦ１５」）、ペプチドチロシンチロシンアナログ（「ＰＹＹ」）、修飾インスリン、アミリン受容体アゴニスト、デュアルアミリン－カルシトニン受容体アゴニスト、修飾ウロコルチン２（ＵＣＮ－２）アナログ、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）受容体アゴニスト、グルカゴン受容体アゴニスト、ならびにオキシントモジュリンおよびそのアナログを含むデュアルＧＬＰ－１グルカゴン受容体アゴニストから選択される１つ以上の薬剤との同時、個別、または逐次の組み合わせに使用するための本発明の化合物を提供する。一実施形態では、本発明の化合物は、メトホルミン、チアゾリジンジオン、スルホニル尿素、ジペプチジルペプチダーゼ４阻害剤、ＳＧＬＴ－２阻害剤、ＧＤＦ１５、ＰＹＹ、修飾インスリン、アミリン、デュアルアミリン－カルシトニン受容体アゴニスト、およびＯＸＭから選択される１つ以上の薬剤との、一定投与量の組み合わせで提供される。一実施形態において、本発明の化合物は、メトホルミン、チアゾリジンジオン、スルホニル尿素、ジペプチジルペプチダーゼ４阻害剤、ＳＧＬＴ－２阻害剤、ＧＤＦ１５、ＰＹＹアナログ、修飾インスリン、アミリン受容体アゴニスト、デュアルアミリン－カルシトニン受容体アゴニスト、修飾ウロコルチン２（ＵＣＮ－２）アナログ、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）受容体アゴニスト、グルカゴン受容体アゴニスト、ならびにＯＸＭおよびそのアナログを含むデュアルＧＬＰ－１グルカゴン受容体アゴニストから選択される１つ以上の薬剤との、一定投与量の組み合わせで提供される。一実施形態において、本発明の化合物は、Ｔ２ＤＭおよび肥満からなる群から選択される病気の治療における、メトホルミン、チアゾリジンジオン、スルホニル尿素、ジペプチジルペプチダーゼ４阻害剤、ＳＧＬＴ－２阻害剤、ＧＤＦ１５、ＰＹＹ、修飾インスリン、アミリン、デュアルアミリン－カルシトニン受容体アゴニスト、およびＯＸＭから選択される１つ以上の薬剤との同時、個別、または逐次の組み合わせに使用するための化合物である。一実施形態において、本発明の化合物は、Ｔ２ＤＭおよび肥満からなる群から選択される病気の治療における、メトホルミン、チアゾリジンジオン、スルホニル尿素、ジペプチジルペプチダーゼ４阻害剤、ＳＧＬＴ－２阻害剤、ＧＤＦ１５、ＰＹＹアナログ、修飾インスリン、アミリン受容体アゴニスト、デュアルアミリン－カルシトニン受容体アゴニスト、修飾ウロコルチン－２（ＵＣＮ－２）アナログ、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）受容体アゴニスト、グルカゴン受容体アゴニスト、ならびにＯＸＭおよびそのアナログを含むデュアルＧＬＰ－１グルカゴン受容体アゴニストから選択される１つ以上の薬剤との同時、個別、または逐次の組み合わせに使用するための化合物である。一実施形態において、本発明の化合物は、Ｔ２ＤＭおよび肥満からなる群から選択される病気の治療における、メトホルミン、チアゾリジンジオン、スルホニル尿素、ジペプチジルペプチダーゼ４阻害剤、およびＳＧＬＴ－２阻害剤から選択される１つ以上の薬剤との同時、個別、または逐次の組み合わせに使用するための化合物である。
【0035】
一実施形態には、インスリン療法を受けている患者における糖尿病を治療するための方法であって、それを必要とする患者に、有効量の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む方法がある。一実施形態は、Ｔ１ＤＭのための患者投与インスリン療法で処置されることである。一実施形態は、Ｔ２ＤＭのための患者投与インスリン療法で処置されることである。一実施形態は、週に１回の投薬である。一実施形態は、患者投与インスリン療法で週に１回皮下処置されることである。インスリン療法が基礎インスリン療法を含む一実施形態が存在する。インスリン療法が食事時インスリン療法を含む一実施形態が存在する。インスリン療法が超速効型インスリン療法を含む一実施形態が存在する。式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩の急性注入で投与されるインスリン療法は、低血糖クランプを受けている患者におけるグルカゴンエクスカーションを強化し、低血糖に対する身体の自然な防御を強化し得る。式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩は、使用されるインスリンの種類または使用されるインスリンの投与量とは無関係に、週に１回投与することができる。一実施形態は、使用されるインスリンの種類または使用されるインスリンの投与量とは無関係に、インスリン療法を受けている患者に有効量として投与される、実施形態１～２７のいずれか１つに記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩である。一実施形態は、使用されるインスリンの種類または使用されるインスリンの投与量とは無関係に、インスリン療法を受けている患者に有効量として週に１回投与される、実施形態１～２７のいずれか１つに記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩である。本明細書で使用される場合、「インスリン療法」は、糖尿病の患者を、承認されたインスリン治療を使用して治療することを意味する。そのようなインスリン療法は、熟練した職人および／または臨床医療専門家に知られている。例えば、インスリン療法は、基礎インスリンを使用する治療を含み得る。そのような基礎インスリン「インスリン療法」は、食事時インスリンおよび／または超速効型インスリンを用いた投薬レジメンで使用することができる。本明細書で使用される場合、「食事時インスリン」は、食事と共に投与されるインスリンおよび／または修飾インスリン、例えば、限定されないが、インスリンリスプロを意味する。本明細書で使用される場合、「基礎インスリン」は、例えば、限定されないが、インスリングラルギンなどの、より長い作用持続時間を有する修飾インスリンを意味する。
【0036】
別の実施形態は、Ｔ２ＤＭ、肥満、およびメタボリックシンドロームからなる群から選択される病気の治療のための薬剤の製造における、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。一実施形態は、糖尿病、肥満、およびメタボリックシンドロームからなる群から選択される病気の治療のための薬物の製造における、実施形態１～２７のいずれか１つに記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。一実施形態において、薬剤は、Ｔ２ＤＭの治療用である。一実施形態において、薬剤は、肥満の治療用である。一実施形態において、薬剤は、インスリン療法を受けている患者において糖尿病の治療に使用するためのものである。
【0037】
別の実施形態は、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩と、担体、希釈剤、および賦形剤からなる群から選択される少なくとも１つのものと、を含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、皮下投与用の医薬組成物が提供される。
【発明を実施するための形態】
【0038】
本明細書で使用される場合、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療すること（ｔｏ ｔｒｅａｔ）」という用語には、症状、病気もしくは障害の進行または重症度を制限、減速、停止、または反転させることが含まれる。
【0039】
本発明の特定の化合物は一般に、幅広い投与量範囲にわたって有効である。例えば、週に１回の非経口投薬の投与量は、１人１週間当たり０．０５ｍｇ～約６０ｍｇの範囲内であり得る。
【0040】
式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩は、ＧＩＰ受容体に対して親和性を有し、受容体において所望の効力を有する新規のアミノ酸配列を含む。ＧＩＰは、ＧＬＰ－１と同様にインクレチンとして知られる４２アミノ酸ペプチド（配列番号１）であり、グルコースの存在下で膵臓ベータ細胞からのインスリン分泌を刺激することにより、グルコースの恒常性に生理的役割を果たす。
【0041】
ＧＬＰ－１は３６アミノ酸ペプチドであり、その主要な生物活性フラグメントは、３０アミノ酸のＣ末端アミド化ペプチド（ＧＬＰ－１７－３６）（配列番号２）として生成される。
【0042】
グルカゴンは、膵臓のランゲルハンス島のα細胞で分泌される２９アミノ酸のペプチドホルモン（配列番号３）であり、グルコース恒常性に関与する。
【0043】
本発明の化合物は、ＧＬＰ－１Ｒおよびグルカゴン受容体に対して高度の選択性で、ＧＩＰ受容体において所望の効力を提供する。一実施形態では、化合物は、所望のＧＩＰ受容体活性および延長された作用持続時間を有する。
【0044】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、天然由来アミノ酸、および非天然アミノ酸の両方を意味する。アミノ酸は典型的に、標準的な１文字のコード（例えば、Ｌ＝ロイシン）、および天然アミノ酸のアルファ－メチル置換残基（例えば、α－メチルロイシン、またはαＭｅＬおよびα－メチルフェニルアラニン、またはαＭｅＦ）、ならびにアルファ－アミノイソ酪酸、または「Ａｉｂ」、「４Ｐａｌ」、「Ｏｒｎ」などの、他の特定非天然アミノ酸を使用して示される。これらのアミノ酸の構造を以下に示す。
【化1】
【0045】
本明細書で使用される場合、「Ｏｒｎ」は、Ｌ－オルニチンを意味する。本明細書で使用される場合、「４Ｐａｌ」は、３－（４－ピリジル）－Ｌ－アラニンを意味する。本明細書で使用される場合、「αＭｅＦ（２Ｆ）」は、アルファ－メチル２－フルオロ－Ｌ－フェニルアラニンを意味する。本明細書で使用される場合、「αＭｅＹ」および「αＭｅＬ」は、それぞれ、アルファ－メチル－Ｌ－チロシンおよびアルファ－メチル－Ｌ－ロイシンを意味する。本明細書で使用される場合、「ｅ」および「Ｄ－Ｇｌｕ」は、Ｄ－グルタミン酸を意味する。本明細書で使用される場合、「Ｄ－Ｔｙｒ」および「ｙ」は、それぞれ、Ｄ－チロシンを意味する。本明細書で使用される場合、「Ｄ－Ａｌａ」および「ａ」は、それぞれ、Ｄ－アラニンを意味する。本明細書で使用される場合、「αＭｅＦ」は、アルファ－メチル－Ｆおよびアルファ－メチル－Ｐｈｅを意味する。本明細書で使用される場合、「Ｉｖａ」は、Ｌ－イソバリンを意味する。
【0046】
一実施形態において、コンジュゲーションは、アシル化である。一実施形態において、コンジュゲーションは、Ｋ側鎖のε－アミノ基へのものである。本発明の化合物の一実施形態において、脂肪酸部分は、リンカーを介して１７位のＫにコンジュゲートする。本発明の化合物の一実施形態において、脂肪酸部分は、リンカーを介して２６位のＫにコンジュゲートする。
【0047】
一実施形態において、ｑは、１６および１８からなる群から選択される。一実施形態において、ｑは１６である。一実施形態において、ｑは１８である。
【0048】
本明細書でＧＩＰ受容体に関して使用される場合、「活性」、「活性化する」「活性化」などの用語は、下記に記載されるインビトロアッセイなど、当技術分野で公知のアッセイを使用して測定される化合物、またはその薬学的に許容される塩の、結合能力、および受容体での応答誘導能力を示す。
【0049】
式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩の、ＧＩＰ受容体に対する親和性は、例えば以下の実施例に記載される測定技術が含まれ、一般的にＫｉ値で表される、当技術分野で公知の受容体結合レベルの測定技術を使用して測定することができる。ＧＩＰ受容体における本発明の化合物の活性は、さらに、例えば、以下に記載されるインビトロ活性アッセイを含む、当技術分野で公知の技術を使用して測定してよく、一般的にＥＣ５０値で表され、これは、投与量応答曲線で最大半量のシミュレーションを起こす化合物の濃度である。
【0050】
さらに、ＧＩＰＲに対する本発明の化合物の選択性の程度を実証するために、ＧＬＰ－１およびグルカゴン受容体での活性および親和性についてのデータが各化合物について提供される。
【0051】
一実施形態において、式Ｉの化合物の医薬組成物は、非経口経路による投与に適している（例えば、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、または経皮）。いくつかの医薬組成物およびその調製方法は、当技術分野において周知である。（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｄ．Ｂ．Ｔｒｏｙ，Ｅｄｉｔｏｒ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００６）を参照されたい）。
【0052】
本発明の化合物は、いくつかの無機および有機酸／塩基のうちの任意のものと反応して、薬学的に許容される酸／塩基付加塩を形成し得る。薬学的に許容される塩およびそれらを調製するための一般的な方法は、当技術分野において周知である。（例えば、Ｐ．Ｓｔａｈｌ，ｅｔ ａｌ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ，２ｎｄ Ｒｅｖｉｓｅｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２０１１）を参照されたい）。本発明の薬学的に許容される塩としては、ナトリウム、トリフルオロ酢酸、塩酸塩、アンモニウム、および酢酸塩が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、薬学的に許容される塩は、ナトリウム、塩酸塩、および酢酸塩からなる群から選択される。
【0053】
本発明はまた、本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩の合成に有用な、新規の中間体およびプロセスも包含する。本発明の中間体および化合物は、当技術分野で公知の様々な手順によって調製し得る。特に、以下の実施例では、化学合成を使用したプロセスが説明される。記載される各経路のための具体的な合成ステップは、本発明の化合物を調製するために、異なる方法で組み合わされてもよい。試薬および出発材料は、当業者にとって容易に入手可能である。
【0054】
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、患者に１回または複数回投与されると、診断中または治療中の患者に所望の効果を提供する、本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩の量または投与量を指す。有効量は、公知技術を用いて、および類似の状況下で得られた結果を観察することによって、当業者が判断することができる。対象のための有効量を決定する際には、哺乳動物の種、サイズ、年齢、および健康状態全般、関与する特定の疾患または障害、疾患または障害の程度もしくは関与度もしくは重症度、個々の患者の応答、投与される特定の化合物、投与の様式、投与される製剤の生物学的利用能特性、選択された投与レジメン、併用薬の使用、ならびに他の関連する状況を含むがこれらに限定されない、多数の要因が考慮される。
【0055】
本明細書で使用される場合、「それを必要とする対象」という用語は、治療または療法を必要とする疾患または病気を有する哺乳動物、好ましくはヒトを指し、例えば上記段落に列挙されたものが含まれる。
【0056】
本明細書で使用される場合、「ＥＤＴＡ」は、エチレンジアミン四酢酸を意味する。本明細書で使用される場合、「ＤＭＳＯ」は、ジメチルスルホキシドを意味する。本明細書で使用される場合、「ＣＰＭ」は、１分当たりのカウントを意味する。本明細書で使用される場合、「ＩＢＭＸ」は、３－イソブチル－１－メチルキサンチンを意味する。本明細書で使用される場合、「ＬＣ／ＭＳ」は、液体クロマトグラフィー／質量分析法を意味する。本明細書で使用される場合、「ＨＴＲＦ」は、均一な時間分解蛍光を意味する。本明細書で使用される場合、「ＤＭＦ」は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを指す。本明細書で使用される場合、「ＤＣＭ」は、ジクロロメタンを指す。本明細書で使用される場合、「ＴＦＡ」は、トリフルオロ酢酸を指す。本明細書で使用される場合、「ＴＦＡ塩」は、トリフルオロ酢酸塩を指す。本明細書で使用される場合、「ＲＰ－ＨＰＬＣ」は、逆相高速液体クロマトグラフィーを意味する。
【0057】
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【0058】
ペプチドの合成
実施例１
Ｙ－（Ｄ－Ａｌａ）－ＥＧＴＦＩＳＤＹＳＩＬＬＤＫＫ（（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γ－Ｇｌｕ）－ＣＯ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ２Ｈ）ＡＱ－Ａｉｂ－ＤＦＶＮＷＬＬＡＱＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ－ＮＨ２（配列番号５）
配列番号５の構造を、標準的な１文字のアミノ酸コードを使用して以下に示す。ただし、アミノ酸残基の構造が拡張されている残基Ｄ－Ａｌａ２、Ｋ１７、Ａｉｂ２０、およびＳｅｒ３９は例外とする。
実施例１
Ｙ－（Ｄ－Ａｌａ）－ＥＧＴＦＩＳＤＹＳＩＬＬＤＫＫ（（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γ－Ｇｌｕ）－ＣＯ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ２Ｈ）ＡＱ－Ａｉｂ－ＤＦＶＮＷＬＬＡＱＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ－ＮＨ２（配列番号５）
配列番号５の構造を、標準的な１文字のアミノ酸コードを使用して以下に示す。ただし、アミノ酸残基の構造が拡張されている残基Ｄ－Ａｌａ２、Ｋ１７、Ａｉｂ２０、およびＳｅｒ３９は例外とする。
【化2】
【0059】
実施例１のペプチド主鎖は、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ多重ペプチド合成機（Ｇｙｒｏｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ、３．３．０．１）、ソフトウェアバージョン３．３．０でフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）／ｔｅｒｔ－ブチル（ｔ－Ｂｕ）化学を使用して合成される。
【0060】
樹脂は、０．８ｍｍｏｌ／ｇの置換でリンクアミドリンカー（ポリスチレンＡＭ ＲＡＭ、ＲＡＰＰポリマーＧｍｂＨ、Ｈ４００２３、２００～４００メッシュ）で官能化されたアミノメチルポリスチレンからなる。標準の側鎖保護基が使用されるが、例外として、Ｍｔｔが４－メチルトリチルであるＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）－ＯＨが、１７位のリジンに使用され、Ｂｏｃ－Ｔｙｒ（ｔ－Ｂｕ）－ＯＨが、１位のチロシンに使用される。各カップリングステップ（１０分間×２回）に先立ち、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを使用して、Ｆｍｏｃ基を除去する。標準的なアミノ酸カップリングは、すべてＦｍｏｃアミノ酸（ＤＭＦ中０．３Ｍ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＣＭ中０．９Ｍ）、およびＯｘｙｍａ（ＤＭＦ中０．９Ｍ）の等モル比を使用して、理論上ペプチド負荷に対して９倍のモル過剰で実施される。カップリングは、１．５時間続行されるが、例外として、バリンのカップリング、３時間；Ｃα－メチル化アミノ酸のカップリング、６時間；Ｃα－メチル化アミノ酸へのカップリング、６～１０時間がある。ペプチド主鎖の合成が完了した後、樹脂をＤＣＭで十分に洗浄して、残留ＤＭＦを除去する。１７位のリジンのＭｔｔ保護基は、ＤＣＭ中の３０％ヘキサフルオロイソプロパノール（Ｏａｋｗｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の処理を３回施して（２０分処理×３回）ペプチド樹脂から選択的に除去され、樹脂は、ＤＣＭおよびＤＭＦで十分に洗浄される。
【0061】
脂肪酸リンカー部分のその後の付着は、標準的なカップリングおよび脱保護反応のための上記手順に従って、２－［２－（２－Ｆｍｏｃ－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－酢酸（Ｆｍｏｃ－ＡＥＥＡ－ＯＨ、ＣｈｅｍＰｅｐ，Ｉｎｃ．）およびＦｍｏｃ－グルタミン酸α－ｔ－ブチルエステル（Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ－ＯｔＢｕ、Ａｒｋ Ｐｈａｒｍ，Ｉｎｃ．）をカップリングすることにより達成される。最後のＦｍｏｃ保護基を除去した後、モノ－ＯｔＢｕ－エイコサン二酸（ＷｕＸｉ ＡｐｐＴｅｃ、Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）を、１：１ ＤＣＭ／ＤＭＦ中で４倍過剰量の二酸、ＰｙＢＯＰ、およびジイソプロピルエチルアミン（１：１：１ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ）を使用して１時間カップリングする。
【0062】
合成が完了したら、ペプチド樹脂をＤＣＭで洗浄し、完全に真空乾燥させる。乾燥ペプチド樹脂を切断カクテル（１０ｍＬ ＴＦＡ、０．５ｍＬトリイソプロピルシラン、０．５ｍＬの水、および０．５ｍＬ １，２－エタンジチオール）で、室温で２時間処理する。ペプチド樹脂溶液を５０ｍＬの円錐形遠心分離管にろ過し、５倍過剰量の冷ジエチルエーテル（－２０℃）で処理して、粗ペプチドを沈殿させる。ペプチド／エーテル懸濁液を３０００ｒｃｆで１．５分間遠心分離して固体ペレットを形成し、上澄みをデカントする。ペレットを冷ジエチルエーテルでさらに２回洗浄し、毎回１分間遠心分離し、次いで真空乾燥する。粗ペプチドを２０％の酢酸／８０％の水で可溶化し、１００％のアセトニトリルおよび０．１％のＴＦＡ／水緩衝系の線形勾配（６５分で２５－４５％のアセトニトリル）を有するＳｙｍｍｅｔｒｙＰｒｅｐ ７μｍ Ｃ１８分取カラム（１８×３００ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ）上でＲＰ－ＨＰＬＣによって精製する。ペプチドの純度は分析用ＲＰ－ＨＰＬＣを使用して評価され、プーリング基準は９５％を超える。実施例１の化合物の主なプール純度は、９６．８％であることが分かる。最終主要生成物プールをその後凍結乾燥した結果、凍結乾燥されたペプチドＴＦＡ塩が生成された。分子量はＬＣ／ＭＳによって決定される（実測値：［Ｍ＋３Ｈ］３＋＝１６３８．４、計算値［Ｍ＋３Ｈ］３＋＝１６３８．５３、実測値ＭＷ（平均）＝４９１２．２、計算値ＭＷ（平均）：４９１２．５８）。
【0063】
実施例２
Ｙ－（Ｄ－Ａｌａ）－ＥＧＴＦＩＳＤＹＳＩＬＬＤＫＫ（（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γ－Ｇｌｕ）－ＣＯ－（ＣＨ２）１６－ＣＯ２Ｈ）ＡＱ－Ａｉｂ－ＤＦＶＮＷＬＬＡＱＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ－ＮＨ２（配列番号６）
配列番号６の構造を、標準的な１文字のアミノ酸コードを使用して以下に示す。ただし、アミノ酸残基の構造が拡張されている残基Ｄ－Ａｌａ２、Ｋ１７、Ａｉｂ２０、およびＳｅｒ３９は例外とする。
Ｙ－（Ｄ－Ａｌａ）－ＥＧＴＦＩＳＤＹＳＩＬＬＤＫＫ（（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γ－Ｇｌｕ）－ＣＯ－（ＣＨ２）１６－ＣＯ２Ｈ）ＡＱ－Ａｉｂ－ＤＦＶＮＷＬＬＡＱＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ－ＮＨ２（配列番号６）
配列番号６の構造を、標準的な１文字のアミノ酸コードを使用して以下に示す。ただし、アミノ酸残基の構造が拡張されている残基Ｄ－Ａｌａ２、Ｋ１７、Ａｉｂ２０、およびＳｅｒ３９は例外とする。
【化3】
【0064】
配列番号６による化合物は、実質的に、実施例１の手順で記載されるように調製されるが、保護された二酸は、代わりに、モノ－ＯｔＢｕ－オクタデカン二酸（ＷｕＸｉ ＡｐｐＴｅｃ、Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）である。分子量は、ＬＣ／ＭＳによって決定される（実測値：［Ｍ＋３Ｈ］３＋＝１６２９．１５、計算値［Ｍ＋３Ｈ］３＋＝１６２９．１８、実測値ＭＷ（平均）＝４８８４．４５、計算値ＭＷ（平均）＝４８８４．５３）。
【0065】
実施例３
Ｙ－Ａｉｂ－ＥＧＴＦＩＳＤＹＳＩ－αＭｅＬ－ＬＤＫＫ（（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γ－Ｇｌｕ）－ＣＯ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ２Ｈ）ＨＱ－Ａｉｂ－ＤＦＶＥ－４－Ｐａｌ－ＬＬＥＡＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ－ＮＨ２（配列番号７）
配列番号７の構造を、標準的な１文字のアミノ酸コードを使用して以下に示す。ただし、アミノ酸残基の構造が拡張されている残基Ａｉｂ２、αＭｅＬ１３、Ｋ１７、Ａｉｂ２０、４－Ｐａｌ２５およびＳｅｒ３９は例外とする。
Ｙ－Ａｉｂ－ＥＧＴＦＩＳＤＹＳＩ－αＭｅＬ－ＬＤＫＫ（（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γ－Ｇｌｕ）－ＣＯ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ２Ｈ）ＨＱ－Ａｉｂ－ＤＦＶＥ－４－Ｐａｌ－ＬＬＥＡＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ－ＮＨ２（配列番号７）
配列番号７の構造を、標準的な１文字のアミノ酸コードを使用して以下に示す。ただし、アミノ酸残基の構造が拡張されている残基Ａｉｂ２、αＭｅＬ１３、Ｋ１７、Ａｉｂ２０、４－Ｐａｌ２５およびＳｅｒ３９は例外とする。
【化4】
【0066】
配列番号７による化合物は、実質的に、実施例１の手順で記載されるように調製される。分子量は、ＬＣ／ＭＳによって決定される（実測値：［Ｍ＋３Ｈ］３＋＝１６６２．５２、計算値［Ｍ＋３Ｈ］３＋＝１６６２．５５、実測値ＭＷ（平均）＝４９８４．５５、計算値ＭＷ（平均）＝４９８４．６４）。
【0067】
実施例４
Ｙ－Ａｉｂ－ＥＧＴＦＩＳＤＹＳＩ－αＭｅＬ－ＬＤ－Ｏｒｎ－Ｋ（（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γ－Ｇｌｕ）－ＣＯ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ２Ｈ）ＨＱ－Ａｉｂ－ＤＦＶＥ－４－Ｐａｌ－ＬＬＥＡＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ－ＮＨ２（配列番号８）
配列番号８の構造を、標準的な１文字のアミノ酸コードを使用して以下に示す。ただし、アミノ酸残基の構造が拡張されている残基Ａｉｂ２、αＭｅＬ１３、Ｏｒｎ１６、Ｋ１７、Ａｉｂ２０、４－Ｐａｌ２５、およびＳｅｒ３９は例外とする。
Ｙ－Ａｉｂ－ＥＧＴＦＩＳＤＹＳＩ－αＭｅＬ－ＬＤ－Ｏｒｎ－Ｋ（（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γ－Ｇｌｕ）－ＣＯ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ２Ｈ）ＨＱ－Ａｉｂ－ＤＦＶＥ－４－Ｐａｌ－ＬＬＥＡＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ－ＮＨ２（配列番号８）
配列番号８の構造を、標準的な１文字のアミノ酸コードを使用して以下に示す。ただし、アミノ酸残基の構造が拡張されている残基Ａｉｂ２、αＭｅＬ１３、Ｏｒｎ１６、Ｋ１７、Ａｉｂ２０、４－Ｐａｌ２５、およびＳｅｒ３９は例外とする。
【化5】
【0068】
配列番号８による化合物は、実質的に実施例１の手順で記載されるように調製される。分子量は、ＬＣ／ＭＳによって決定される（実測値：［Ｍ＋３Ｈ］３＋＝１６５７．８２、計算値［Ｍ＋３Ｈ］３＋＝１６５７．８７、実測値ＭＷ（平均）＝４９７０．４６、計算値ＭＷ（平均）＝４９７０．６２）。
【0069】
実施例５
Ｙ－Ａｉｂ－ＥＧＴＦＩＳＤＹＳＩ－αＭｅＬ－ＬＤＫＩＨＱ－Ａｉｂ－ＤＦＶＥＹＫ（（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γ－Ｇｌｕ）－ＣＯ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ２Ｈ）ＬＥＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ－ＮＨ２（配列番号９）
配列番号９の構造を、標準的な１文字のアミノ酸コードを使用して以下に示す。ただし、アミノ酸残基の構造が拡張されている残基Ａｉｂ２、αＭｅＬ１３、Ａｉｂ２０、Ｋ２６、およびＳｅｒ３９は例外とする。
Ｙ－Ａｉｂ－ＥＧＴＦＩＳＤＹＳＩ－αＭｅＬ－ＬＤＫＩＨＱ－Ａｉｂ－ＤＦＶＥＹＫ（（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γ－Ｇｌｕ）－ＣＯ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ２Ｈ）ＬＥＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ－ＮＨ２（配列番号９）
配列番号９の構造を、標準的な１文字のアミノ酸コードを使用して以下に示す。ただし、アミノ酸残基の構造が拡張されている残基Ａｉｂ２、αＭｅＬ１３、Ａｉｂ２０、Ｋ２６、およびＳｅｒ３９は例外とする。
【化6】
【0070】
配列番号９による化合物は、実質的に実施例１の手順で記載されるように調製されるが、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）－ＯＨは、１７位の代わりに２６位でリジンのために使用される。分子量は、ＬＣ／ＭＳによって決定される（実測値：［Ｍ＋３Ｈ］３＋＝１６６２．８、計算値［Ｍ＋３Ｈ］３＋＝１６６２．８８、実測値ＭＷ（平均）＝４９８５．４、計算値ＭＷ（平均）＝４９８５．６３）。
【0071】
実施例６
Ｙ－Ａｉｂ－ＥＧＴＦＩＳＤＹＳＩ－αＭｅＬ－ＬＤ－Ｏｒｎ－ＩＨＱ－Ａｉｂ－ＤＦＶＥＹＫ（（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γ－Ｇｌｕ）－ＣＯ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ２Ｈ）ＬＥＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ－ＮＨ２（配列番号１０）
配列番号１０の構造を、標準的な１文字のアミノ酸コードを使用して以下に示す。ただし、アミノ酸残基の構造が拡張されている残基Ａｉｂ２、αＭｅＬ１３、Ｏｒｎ１６、Ａｉｂ２０、Ｋ２６、およびＳｅｒ３９は例外とする。
Ｙ－Ａｉｂ－ＥＧＴＦＩＳＤＹＳＩ－αＭｅＬ－ＬＤ－Ｏｒｎ－ＩＨＱ－Ａｉｂ－ＤＦＶＥＹＫ（（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γ－Ｇｌｕ）－ＣＯ－（ＣＨ２）１８－ＣＯ２Ｈ）ＬＥＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ－ＮＨ２（配列番号１０）
配列番号１０の構造を、標準的な１文字のアミノ酸コードを使用して以下に示す。ただし、アミノ酸残基の構造が拡張されている残基Ａｉｂ２、αＭｅＬ１３、Ｏｒｎ１６、Ａｉｂ２０、Ｋ２６、およびＳｅｒ３９は例外とする。
【化7】
【0072】
配列番号１０による化合物は、実質的に実施例１の手順で記載されるように調製されるが、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）－ＯＨは、１７位の代わりに２６位でリジンのために使用される。分子量は、ＬＣ／ＭＳによって決定される（実測値：［Ｍ＋３Ｈ］３＋＝１６５８．１、計算値［Ｍ＋３Ｈ］３＋＝１６５８．２０、実測値ＭＷ（平均）＝４９７１．３、計算値ＭＷ（平均）＝４９７１．６）。
【0073】
実施例７
Ｙ－Ａｉｂ－ＥＧＴＦＩＳＤＹＳＩ－αＭｅＬ－ＬＤ－Ｏｒｎ－ＩＨＱ－Ａｉｂ－ＥＦＶ－（Ｄ－Ｇｌｕ）－ＹＫ（（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γ－Ｇｌｕ）－ＣＯ－（ＣＨ２）１６－ＣＯ２Ｈ）ＬＥＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ－ＮＨ２（配列番号１１）
配列番号１１の構造を、標準的な１文字のアミノ酸コードを使用して以下に示す。ただし、アミノ酸残基の構造が拡張されている残基Ａｉｂ２、αＭｅＬ１３、Ｏｒｎ１６、Ａｉｂ２０、Ｄ－Ｇｌｕ２４、Ｋ２６、およびＳｅｒ３９は例外とする。
Ｙ－Ａｉｂ－ＥＧＴＦＩＳＤＹＳＩ－αＭｅＬ－ＬＤ－Ｏｒｎ－ＩＨＱ－Ａｉｂ－ＥＦＶ－（Ｄ－Ｇｌｕ）－ＹＫ（（２－［２－（２－アミノ－エトキシ）－エトキシ］－アセチル）２－（γ－Ｇｌｕ）－ＣＯ－（ＣＨ２）１６－ＣＯ２Ｈ）ＬＥＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ－ＮＨ２（配列番号１１）
配列番号１１の構造を、標準的な１文字のアミノ酸コードを使用して以下に示す。ただし、アミノ酸残基の構造が拡張されている残基Ａｉｂ２、αＭｅＬ１３、Ｏｒｎ１６、Ａｉｂ２０、Ｄ－Ｇｌｕ２４、Ｋ２６、およびＳｅｒ３９は例外とする。
【化8】
【0074】
配列番号１１による化合物は、実質的に実施例１の手順で記載されるように調製されるが、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）－ＯＨは、１７位の代わりに２６位でリジンのために使用され、保護された二酸は、モノ－ＯｔＢｕ－オクタデカン二酸（ＷｕＸｉ ＡｐｐＴｅｃ、Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）である。分子量は、ＬＣ／ＭＳによって決定される（実測値：［Ｍ＋３Ｈ］３＋＝１６５３．４、計算値［Ｍ＋３Ｈ］３＋＝１６５３．５２、実測値ＭＷ（平均）＝４９５７．２、計算値ＭＷ（平均）＝４９５７．５７）。
【0075】
実施例８（配列番号１２）～実施例１２２（配列番号１２６）による化合物は、実質的に実施例１の手順で記載されるように調製される。
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【表1-5】
【表1-6】
【表1-7】
【表1-8】
【表1-9】
【表1-10】
【表1-11】
【0076】
結合アッセイ
グルカゴン（ＧｃｇまたはｈＧｃｇと称される）は、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙで調製された標準試料である。ＧＬＰ－１（７－３６）－ＮＨ２（ＧＬＰ－１またはｈＧＬＰ－１と称される）は、ＣＰＣ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ、純度９７．２％、１００％ＤＭＳＯ中１００μＭアリコート）から入手する。ＧＩＰ（１－４２）－ＮＨ２（ＧＩＰと称される）は、上述のように、ペプチド合成およびＨＰＬＣクロマトグラフィーを使用してＬｉｌｌｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓで調製される（純度＞８０％、１００％ＤＭＳＯ中１００μＭアリコート）。［１２５Ｉ］と放射標識されたＧｃｇ、ＧＬＰ－１、またはＧＩＰは、［１２５Ｉ］－ラクトペルオキシダーゼを使用して調製され、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から入手する。
グルカゴン（ＧｃｇまたはｈＧｃｇと称される）は、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙで調製された標準試料である。ＧＬＰ－１（７－３６）－ＮＨ２（ＧＬＰ－１またはｈＧＬＰ－１と称される）は、ＣＰＣ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ、純度９７．２％、１００％ＤＭＳＯ中１００μＭアリコート）から入手する。ＧＩＰ（１－４２）－ＮＨ２（ＧＩＰと称される）は、上述のように、ペプチド合成およびＨＰＬＣクロマトグラフィーを使用してＬｉｌｌｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓで調製される（純度＞８０％、１００％ＤＭＳＯ中１００μＭアリコート）。［１２５Ｉ］と放射標識されたＧｃｇ、ＧＬＰ－１、またはＧＩＰは、［１２５Ｉ］－ラクトペルオキシダーゼを使用して調製され、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から入手する。
【0077】
安定的にトランスフェクトされた細胞株は、受容体ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３発現プラスミドにサブクローニングし、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３（ｈＧｃｇＲおよびｈＧＬＰ－１Ｒ）またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）（ｈＧＩＰＲ）細胞にトランスフェクトした後、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（ｈＧＬＰ－１ＲおよびｈＧＩＰＲ）またはハイグロマイシンＢ（ｈＧｃｇＲ）で選択することによって調製される。
【0078】
粗細胞膜の調製には２つの方法が使用される。
【0079】
方法１：ｐＨが７．５である５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、およびＥＤＴＡを含むＲｏｃｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤を含有する低張緩衝液中で凍結細胞ペレットを氷上溶解させる。Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）内筒を備えた、ガラス製Ｐｏｔｔｅｒ－Ｅｌｖｅｈｊｅｍホモジナイザーを使用して、細胞懸濁液を２５回撹乱する。ホモジネートを４℃、１１００×ｇで１０分間遠心分離する。上清を収集し、氷上で保存する一方で、ペレットを均質化緩衝液に再懸濁し、上述のように再ホモジナイズする。ホモジネートを１１００×ｇで１０分間、遠心分離する。第２の上清を第１の上清と合わせ、３５０００×ｇ、４℃で１時間遠心分離する。得られた膜ペレットを、プロテアーゼ阻害剤を約１～３ｍｇ／ｍＬで含有する均質化緩衝液に再懸濁し、液体窒素中で急速凍結し、使用するまでアリコートとして－８０℃の冷凍庫内で保存する。
【0080】
方法２：ｐＨが７．５である５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、Ｒｏｃｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）ＥＤＴＡ非含有プロテアーゼ阻害剤、および２５単位／ｍＬのＤＮＡｓｅ Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する低張緩衝液中で、凍結細胞ペレットを氷上溶解させる。Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）内筒を備えたガラス製Ｐｏｔｔｅｒ－Ｅｌｖｅｈｊｅｍホモジナイザーを使用して、細胞懸濁液を２０回～２５回撹乱する。ホモジネートを４℃、１８００×ｇで１５分間遠心分離する。上清を収集し、氷上で保存する一方で、ペレットを均質化緩衝液（ＤＮＡｓｅ Ｉは含まない）に再懸濁し、上述のように再ホモジナイズする。ホモジネートを１８００×ｇで１５分間、遠心分離する。第２の上清を第１の上清と合わせ、さらに１８００×ｇで１５分間、遠心分離する。次に、上清全体を４℃で、２５０００×ｇで３０分間、遠心分離する。得られた膜ペレットを、プロテアーゼ阻害剤を約１～３ｍｇ／ｍＬで含有する均質化緩衝液（ＤＮＡｓｅ Ｉは含まない）に再懸濁し、使用するまでアリコートとして－８０℃の冷凍庫内で保存する。
【0081】
結合判定方法
各種受容体／放射性リガンド相互作用の平衡結合解離定数（Ｋｄ）は、［１２５Ｉ］ストック材料のプロパノール含有量が多いため、飽和結合ではなく、相同競合結合分析から判定される。受容体調製物について判定されたＫｄ値は次のとおりであった：ｈＧｃｇＲ（３．９ｎＭ）、ｈＧＬＰ－１Ｒ（１．２ｎＭ）、およびｈＧＩＰＲ（０．１４ｎＭ）。
各種受容体／放射性リガンド相互作用の平衡結合解離定数（Ｋｄ）は、［１２５Ｉ］ストック材料のプロパノール含有量が多いため、飽和結合ではなく、相同競合結合分析から判定される。受容体調製物について判定されたＫｄ値は次のとおりであった：ｈＧｃｇＲ（３．９ｎＭ）、ｈＧＬＰ－１Ｒ（１．２ｎＭ）、およびｈＧＩＰＲ（０．１４ｎＭ）。
【0082】
［１２５Ｉ］－グルカゴン結合
ヒトＧｃｇ受容体結合アッセイを、小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）ビーズ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いたシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）フォーマットを使用して実施する。結合緩衝液は、ｐＨが７．４である２５ｍＭの４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２．５ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１％（ｗ／ｖ）のバシトラシン（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、０．００３％（ｗ／ｖ）のポリエチレンソルビタンモノラウレート（ＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０）、およびＥＤＴＡを含まないＲｏｃｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤を含有する。ペプチドおよびＧｃｇを解凍し、１００％ＤＭＳＯ中で３倍ずつ段階希釈する（１０ポイント濃度応答曲線）。次に、４５μＬのアッセイ結合緩衝液または未標識のＧｃｇ対照（非特異的結合またはＮＳＢ、１μＭ最終）を含有する、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）３６３２底部透明アッセイプレートに、５μＬの段階希釈した化合物またはＤＭＳＯを移す。次に、５０μＬの［１２５Ｉ］－Ｇｃｇ（０．１５ｎＭ最終）、５０μＬのヒトＧｃｇＲ膜（１．５μｇ／ウェル）、および５０μＬのＷＧＡ ＳＰＡビーズ（８０～１５０μｇ／ウェル）をＢｉｏｔｅｋ Ｍｕｌｔｉｆｌｏディスペンサーで加える。プレートを密封し、プレートシェーカー上で１分間混合し（設定６）、室温で１２時間インキュベート／静置した後、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｔｒｉｌｕｘ ＭｉｃｒｏＢｅｔａ（登録商標）シンチレーション計数器で読み取る。応答曲線で試験されたペプチドの最終アッセイ濃度範囲は、典型的に、１１５０ｎＭ～０．０５８ｎＭであり、対照Ｇｃｇは、１０００ｎＭ～０．０５ｎＭである。
ヒトＧｃｇ受容体結合アッセイを、小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）ビーズ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いたシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）フォーマットを使用して実施する。結合緩衝液は、ｐＨが７．４である２５ｍＭの４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２．５ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１％（ｗ／ｖ）のバシトラシン（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、０．００３％（ｗ／ｖ）のポリエチレンソルビタンモノラウレート（ＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０）、およびＥＤＴＡを含まないＲｏｃｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤を含有する。ペプチドおよびＧｃｇを解凍し、１００％ＤＭＳＯ中で３倍ずつ段階希釈する（１０ポイント濃度応答曲線）。次に、４５μＬのアッセイ結合緩衝液または未標識のＧｃｇ対照（非特異的結合またはＮＳＢ、１μＭ最終）を含有する、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）３６３２底部透明アッセイプレートに、５μＬの段階希釈した化合物またはＤＭＳＯを移す。次に、５０μＬの［１２５Ｉ］－Ｇｃｇ（０．１５ｎＭ最終）、５０μＬのヒトＧｃｇＲ膜（１．５μｇ／ウェル）、および５０μＬのＷＧＡ ＳＰＡビーズ（８０～１５０μｇ／ウェル）をＢｉｏｔｅｋ Ｍｕｌｔｉｆｌｏディスペンサーで加える。プレートを密封し、プレートシェーカー上で１分間混合し（設定６）、室温で１２時間インキュベート／静置した後、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｔｒｉｌｕｘ ＭｉｃｒｏＢｅｔａ（登録商標）シンチレーション計数器で読み取る。応答曲線で試験されたペプチドの最終アッセイ濃度範囲は、典型的に、１１５０ｎＭ～０．０５８ｎＭであり、対照Ｇｃｇは、１０００ｎＭ～０．０５ｎＭである。
【0083】
［１２５Ｉ］－ＧＬＰ－１結合
ヒトＧＬＰ－１受容体結合アッセイは、ＷＧＡビーズを用いたＳＰＡフォーマットを使用して実施される。結合緩衝液は、ｐＨが７．４である２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２．５ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１％（ｗ／ｖ）のバシトラシン、０．００３％（ｗ／ｖ）のＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０、およびＥＤＴＡを含まないＲｏｃｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤を含有する。ペプチドおよびＧＬＰ－１を解凍し、１００％ＤＭＳＯで３倍ずつ段階希釈する（１０ポイント濃度応答曲線）。次に、４５μＬのアッセイ結合緩衝液または未標識のＧＬＰ－１対照（非特異的結合またはＮＳＢ、０．２５μＭ最終）を含有する、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）３６３２底部透明アッセイプレートに、５μＬの段階希釈した化合物またはＤＭＳＯを移す。次に、５０μＬ［１２５Ｉ］－ＧＬＰ－１（０．１５ｎＭ最終）、５０μＬのヒトＧＬＰ－１Ｒ膜（０．５μｇ／ウェル）、および５０μＬのＷＧＡ ＳＰＡビーズ（１００～１５０μｇ／ウェル）をＢｉｏｔｅｋ Ｍｕｌｔｉｆｌｏディスペンサーで加える。プレートを密封し、プレートシェーカー上で１分間混合し（設定６）、室温で５～１２時間インキュベート／静置した後、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｔｒｉｌｕｘ ＭｉｃｒｏＢｅｔａ（登録商標）シンチレーション計数器でプレートを読み取る。応答曲線で試験されたペプチドの最終アッセイ濃度範囲は、典型的に、１１５０ｎＭ～０．０５８ｎＭであり、対照ＧＬＰ－１は２５０ｎＭ～０．０１３ｎＭである。
ヒトＧＬＰ－１受容体結合アッセイは、ＷＧＡビーズを用いたＳＰＡフォーマットを使用して実施される。結合緩衝液は、ｐＨが７．４である２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２．５ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１％（ｗ／ｖ）のバシトラシン、０．００３％（ｗ／ｖ）のＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０、およびＥＤＴＡを含まないＲｏｃｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤を含有する。ペプチドおよびＧＬＰ－１を解凍し、１００％ＤＭＳＯで３倍ずつ段階希釈する（１０ポイント濃度応答曲線）。次に、４５μＬのアッセイ結合緩衝液または未標識のＧＬＰ－１対照（非特異的結合またはＮＳＢ、０．２５μＭ最終）を含有する、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）３６３２底部透明アッセイプレートに、５μＬの段階希釈した化合物またはＤＭＳＯを移す。次に、５０μＬ［１２５Ｉ］－ＧＬＰ－１（０．１５ｎＭ最終）、５０μＬのヒトＧＬＰ－１Ｒ膜（０．５μｇ／ウェル）、および５０μＬのＷＧＡ ＳＰＡビーズ（１００～１５０μｇ／ウェル）をＢｉｏｔｅｋ Ｍｕｌｔｉｆｌｏディスペンサーで加える。プレートを密封し、プレートシェーカー上で１分間混合し（設定６）、室温で５～１２時間インキュベート／静置した後、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｔｒｉｌｕｘ ＭｉｃｒｏＢｅｔａ（登録商標）シンチレーション計数器でプレートを読み取る。応答曲線で試験されたペプチドの最終アッセイ濃度範囲は、典型的に、１１５０ｎＭ～０．０５８ｎＭであり、対照ＧＬＰ－１は２５０ｎＭ～０．０１３ｎＭである。
【0084】
［１２５Ｉ］－ＧＩＰ結合
ヒトＧＩＰ受容体結合アッセイは、ＷＧＡビーズを用いたＳＰＡフォーマットを使用して実施される。結合緩衝液は、ｐＨが７．４である２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２．５ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１％（ｗ／ｖ）のバシトラシン、０．００３％（ｗ／ｖ）のＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０、およびＥＤＴＡを含まないＲｏｃｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤を含有する。ペプチドおよびＧＩＰを解凍し、１００％ＤＭＳＯ中で３倍ずつ段階希釈する（１０ポイント濃度応答曲線）。次に、４５μＬのアッセイ結合緩衝液または未標識のＧＩＰ対照（非特異的結合またはＮＳＢ、０．２５μＭ最終）を含有する、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）３６３２底部透明アッセイプレートに、５μＬの段階希釈した化合物またはＤＭＳＯを移す。次に、５０μＬの［１２５Ｉ］－ＧＩＰ（０．０７５～０．１５ｎＭ最終）、５０μＬのヒトＧＩＰＲ膜（３μｇ／ウェル）、および５０μＬのＷＧＡ ＳＰＡビーズ（１００～１５０μｇ／ウェル）をＢｉｏｔｅｋ Ｍｕｌｔｉｆｌｏディスペンサーで加える。プレートを密封し、プレートシェーカー上で１分間混合し（設定６）、室温で２．５～１２時間インキュベート／静置した後、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｔｒｉｌｕｘ ＭｉｃｒｏＢｅｔａ（登録商標）シンチレーション計数器で読み取る。応答曲線で試験されたペプチドの最終アッセイ濃度範囲は、典型的に、１１５０ｎＭ～０．０５８ｎＭまたは１１５ｎＭ～０．００５８ｎＭであり、対照ＧＩＰは、２５０ｎＭ～０．０１３ｎＭである。
ヒトＧＩＰ受容体結合アッセイは、ＷＧＡビーズを用いたＳＰＡフォーマットを使用して実施される。結合緩衝液は、ｐＨが７．４である２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２．５ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１％（ｗ／ｖ）のバシトラシン、０．００３％（ｗ／ｖ）のＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０、およびＥＤＴＡを含まないＲｏｃｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤を含有する。ペプチドおよびＧＩＰを解凍し、１００％ＤＭＳＯ中で３倍ずつ段階希釈する（１０ポイント濃度応答曲線）。次に、４５μＬのアッセイ結合緩衝液または未標識のＧＩＰ対照（非特異的結合またはＮＳＢ、０．２５μＭ最終）を含有する、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）３６３２底部透明アッセイプレートに、５μＬの段階希釈した化合物またはＤＭＳＯを移す。次に、５０μＬの［１２５Ｉ］－ＧＩＰ（０．０７５～０．１５ｎＭ最終）、５０μＬのヒトＧＩＰＲ膜（３μｇ／ウェル）、および５０μＬのＷＧＡ ＳＰＡビーズ（１００～１５０μｇ／ウェル）をＢｉｏｔｅｋ Ｍｕｌｔｉｆｌｏディスペンサーで加える。プレートを密封し、プレートシェーカー上で１分間混合し（設定６）、室温で２．５～１２時間インキュベート／静置した後、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｔｒｉｌｕｘ ＭｉｃｒｏＢｅｔａ（登録商標）シンチレーション計数器で読み取る。応答曲線で試験されたペプチドの最終アッセイ濃度範囲は、典型的に、１１５０ｎＭ～０．０５８ｎＭまたは１１５ｎＭ～０．００５８ｎＭであり、対照ＧＩＰは、２５０ｎＭ～０．０１３ｎＭである。
【0085】
結合アッセイデータ分析
ペプチド、Ｇｃｇ、ＧＬＰ－１、またはＧＩＰの濃度曲線のＣＰＭ生データを、各ＣＰＭ値から非特異的結合（未標識Ｇｃｇ、ＧＬＰ－１、またはＧＩＰがそれぞれ過剰に存在する場合の結合）を減算し、同じく非特異的結合を減算して補正された総結合シグナルで除算することで、阻害率に変換する。４パラメータ（曲線最大値、曲線最小値、ＩＣ５０、ヒル勾配）非線形回帰ルーチン（Ｇｅｎｅｄａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ、バージョン１２．０．４、Ｇｅｎｅｄａｔａ ＡＧ、Ｂａｓａｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用してデータを分析する。親和性定数（Ｋｉ）は、式Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋Ｄ／Ｋｄ）に基づき絶対ＩＣ５０値から計算される。式中、Ｄは実験で使用された放射性リガンドの濃度であり、ＩＣ５０は結合の５０％阻害を引き起こす濃度であり、Ｋｄは放射性リガンドの平衡結合解離定数である（上述）。Ｋｉ値は幾何平均として報告され、誤差は平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表され、ｎは独立した複製物（異なる日に実施されたアッセイで判定）と等しい。幾何平均は次のように計算される：
幾何平均＝１０（Ｌｏｇ Ｋｉ値の加算平均））
ｎ＝ｙ／ｘは、複製総数（ｘ）のうち、１つの複製物のサブセット（ｙ）のみが平均を表すのに用いられることを意味する。ＳＥＭは、ｙ＝２以上の場合にのみ計算される。平均は、幾何平均として表し、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）および複製物の数（ｎ）は括弧内に示す。
ペプチド、Ｇｃｇ、ＧＬＰ－１、またはＧＩＰの濃度曲線のＣＰＭ生データを、各ＣＰＭ値から非特異的結合（未標識Ｇｃｇ、ＧＬＰ－１、またはＧＩＰがそれぞれ過剰に存在する場合の結合）を減算し、同じく非特異的結合を減算して補正された総結合シグナルで除算することで、阻害率に変換する。４パラメータ（曲線最大値、曲線最小値、ＩＣ５０、ヒル勾配）非線形回帰ルーチン（Ｇｅｎｅｄａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ、バージョン１２．０．４、Ｇｅｎｅｄａｔａ ＡＧ、Ｂａｓａｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用してデータを分析する。親和性定数（Ｋｉ）は、式Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋Ｄ／Ｋｄ）に基づき絶対ＩＣ５０値から計算される。式中、Ｄは実験で使用された放射性リガンドの濃度であり、ＩＣ５０は結合の５０％阻害を引き起こす濃度であり、Ｋｄは放射性リガンドの平衡結合解離定数である（上述）。Ｋｉ値は幾何平均として報告され、誤差は平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表され、ｎは独立した複製物（異なる日に実施されたアッセイで判定）と等しい。幾何平均は次のように計算される：
幾何平均＝１０（Ｌｏｇ Ｋｉ値の加算平均））
ｎ＝ｙ／ｘは、複製総数（ｘ）のうち、１つの複製物のサブセット（ｙ）のみが平均を表すのに用いられることを意味する。ＳＥＭは、ｙ＝２以上の場合にのみ計算される。平均は、幾何平均として表し、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）および複製物の数（ｎ）は括弧内に示す。
【表2-1】
【表2-2】
【表2-3】
【表2-4】
【表2-5】
【0086】
表１に示されるように、本発明の実施例は、ヒトＧＩＰＲの非常に強力な結合剤であり、ＧＬＰ－１ＲおよびＧｃｇＲに対してより低い親和性を有する。
【0087】
０．１％カゼイン存在下でのｃＡＭＰ薬理機能アッセイ
１セットのｃＡＭＰアッセイを、ヒトＧＬＰ－１受容体（ＧＬＰ－１Ｒ）、グルコース依存性インスリン分泌刺激ペプチド受容体（ＧＩＰＲ）、またはグルカゴン受容体（ＧｃｇＲ）を発現するＨＥＫ２９３細胞で実施した。２０μｌのアッセイ体積中、０．１％カゼイン（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｃ４７６５）、２５０μＭのＩＢＭＸ、１Ｘ ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（Ｇｉｂｃｏカタログ番号３５０５０）、および２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ＨｙＣｌｏｎｅカタログ番号ＳＨ３０２３７．０１）を補充した、ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏカタログ番号３１０５３）中の試験ペプチドで、細胞株を過剰発現する各受容体（２０μｌ）を処理する。室温で６０分インキュベートした後、それによって生じた細胞内ｃＡＭＰの増加を、ＣｉｓＢｉｏ ｃＡＭＰ Ｄｙｎａｍｉｃ ２ ＨＴＲＦアッセイキット（６２ＡＭ４ＰＥＪ）を使用して定量的に判定する。次に、ｃＡＭＰ－ｄ２コンジュゲート（２０μｌ）および抗体である抗ｃＡＭＰ－Ｅｕ３＋－クリプテート（２０μｌ）を含有するＬｙｓｉｓ緩衝液を加えて、ｃＡＭＰレベルを判定する。室温で６０分インキュベートした後、ＨＴＲＦシグナルをＥｎｖｉｓｉｏｎ ２１０４プレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で検出する。６２０ｎｍおよび６６５ｎｍで蛍光発光を測定し、６２０ｎｍおよび６６５ｎｍでのその比率を計算した後、ｃＡＭＰ標準曲線を使用してウェル当たりのｎＭ ｃＡＭＰに変換する。化合物の投与量応答曲線を、最小値（緩衝液のみ）および最大値（各対照リガンドの最大濃度）に正規化された刺激のパーセンテージとしてプロットし、可変勾配にフィットさせた４パラメータ非線形回帰（Ｇｅｎｅｄａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ １３）を使用して分析する。ＥＣ５０は、投与量応答曲線で最大半量のシミュレーションを起こす化合物の濃度である。４パラメータロジスティック方程式にフィットさせた、最大応答パーセント対添加ペプチド濃度を使用する非線形回帰分析によって、相対ＥＣ５０値を導く。
１セットのｃＡＭＰアッセイを、ヒトＧＬＰ－１受容体（ＧＬＰ－１Ｒ）、グルコース依存性インスリン分泌刺激ペプチド受容体（ＧＩＰＲ）、またはグルカゴン受容体（ＧｃｇＲ）を発現するＨＥＫ２９３細胞で実施した。２０μｌのアッセイ体積中、０．１％カゼイン（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｃ４７６５）、２５０μＭのＩＢＭＸ、１Ｘ ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（Ｇｉｂｃｏカタログ番号３５０５０）、および２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ＨｙＣｌｏｎｅカタログ番号ＳＨ３０２３７．０１）を補充した、ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏカタログ番号３１０５３）中の試験ペプチドで、細胞株を過剰発現する各受容体（２０μｌ）を処理する。室温で６０分インキュベートした後、それによって生じた細胞内ｃＡＭＰの増加を、ＣｉｓＢｉｏ ｃＡＭＰ Ｄｙｎａｍｉｃ ２ ＨＴＲＦアッセイキット（６２ＡＭ４ＰＥＪ）を使用して定量的に判定する。次に、ｃＡＭＰ－ｄ２コンジュゲート（２０μｌ）および抗体である抗ｃＡＭＰ－Ｅｕ３＋－クリプテート（２０μｌ）を含有するＬｙｓｉｓ緩衝液を加えて、ｃＡＭＰレベルを判定する。室温で６０分インキュベートした後、ＨＴＲＦシグナルをＥｎｖｉｓｉｏｎ ２１０４プレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で検出する。６２０ｎｍおよび６６５ｎｍで蛍光発光を測定し、６２０ｎｍおよび６６５ｎｍでのその比率を計算した後、ｃＡＭＰ標準曲線を使用してウェル当たりのｎＭ ｃＡＭＰに変換する。化合物の投与量応答曲線を、最小値（緩衝液のみ）および最大値（各対照リガンドの最大濃度）に正規化された刺激のパーセンテージとしてプロットし、可変勾配にフィットさせた４パラメータ非線形回帰（Ｇｅｎｅｄａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ １３）を使用して分析する。ＥＣ５０は、投与量応答曲線で最大半量のシミュレーションを起こす化合物の濃度である。４パラメータロジスティック方程式にフィットさせた、最大応答パーセント対添加ペプチド濃度を使用する非線形回帰分析によって、相対ＥＣ５０値を導く。
【0088】
実施例および比較分子の固有の効力を判定するために、ホモジニアス時間分解蛍光測定法を使用してアッセイを実施し、それは、非特異的ブロッカーとして（血清アルブミンの代わりに）カゼインが存在する中で実施され、このカゼインは、分析された分子の脂肪酸部分と相互作用しない。
【0089】
細胞内ｃＡＭＰレベルは、標準曲線を使用して外挿によって判定される。化合物の投与量応答曲線を、最小値（緩衝液のみ）および最大値（各対照リガンドの最大濃度）に正規化された刺激のパーセンテージとしてプロットし、可変勾配にフィットさせた４パラメータ非線形回帰（Ｇｅｎｅｄａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ １３）を使用して分析する。ＥＣ５０は、投与量応答曲線で最大半量のシミュレーションを起こす化合物の濃度である。幾何平均計算値の各相対ＥＣ５０値は、カーブフィッティングから判定される。
【0090】
化合物の濃度応答曲線を、最小値（緩衝液のみ）および最大値（各対照リガンドの最大濃度）に正規化された刺激のパーセンテージとしてプロットし、可変勾配にフィットさせた４パラメータ非線形回帰（Ｇｅｎｅｄａｔａ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ １３）を使用して分析する。ＥＣ５０は、投与量応答曲線で最大半量のシミュレーションを起こす化合物の濃度である。ＥＣ５０要約統計量は次のように計算される：幾何平均：
ＧＭ＝１０（ｌｏｇ１０変換ＥＣ５０値の加算平均）。平均の標準誤差は、次のように報告される：
ＳＥＭ＝幾何平均×（ｌｏｇ１０変換ＥＣ５０値の標準偏差／実行回数の平方根）×１０のｌｏｇｅ。
ＧＭ＝１０（ｌｏｇ１０変換ＥＣ５０値の加算平均）。平均の標準誤差は、次のように報告される：
ＳＥＭ＝幾何平均×（ｌｏｇ１０変換ＥＣ５０値の標準偏差／実行回数の平方根）×１０のｌｏｇｅ。
【0091】
対数変換は、ＥＣ５０値が算術スケールではなく、乗算スケールにあることを説明付ける。
【0092】
アッセイが実施されるたび、試験ペプチド、ならびに天然リガンドＧＩＰ、ＧＬＰ－１、およびグルカゴンが試行され、緩衝液のみがベースライン（最小）として、ならびにＧＩＰ、ＧＬＰ－１、およびグルカゴン標準の最高濃度が、それぞれ、計算の最大値として使用される。例示のために述べると、実施例１で示されるように、ペプチドは、ｈＧＩＰＲ ｃＡＭＰアッセイの８回の試行で試験される。誤解を避けるために、表２のｈＧＩＰアミド、ｈＧＬＰ－１アミドおよびグルカゴンＥＣ５０は、１８の一連のアッセイ値からの幾何平均値を例示し、これらの値は、緩衝液ゼロに対して毎日異なる。したがって、各実施例は、これらの値の幾何平均を使用して実施例アッセイを正規化する。
【表3-1】
【表3-2】
【表3-3】
【表3-4】
【表3-5】
【0093】
表２のデータで示されているように、本発明の実施例の化合物は非常に効力があり、０．１％カゼインの存在下で、ヒトＧＩＰＲからのｃＡＭＰを刺激する。
【0094】
インビボ研究
雄カニクイザルにおける薬物動態
雄カニクイザルに５０ｎｍｏｌ／ｋｇの単回皮下投与を実施した後、選択した実施例の薬物動態を評価する。血液試料を５０４時間にわたって収集し、結果として得られた個々の血漿中濃度を使用して薬物動態パラメータを計算する。ペプチド血漿（Ｋ３ ＥＤＴＡ）濃度は、化合物の無傷の塊を測定する適格なＬＣ／ＭＳ法を使用して判定する。各ペプチドおよび内部標準としてのアナログが、タンパク質沈殿法を使用して、１００％カニクイザル血漿から抽出される。ＬＣ／ＭＳ検出用に機器を組み合わせる。平均薬物動態パラメータを表３に示す。
雄カニクイザルにおける薬物動態
雄カニクイザルに５０ｎｍｏｌ／ｋｇの単回皮下投与を実施した後、選択した実施例の薬物動態を評価する。血液試料を５０４時間にわたって収集し、結果として得られた個々の血漿中濃度を使用して薬物動態パラメータを計算する。ペプチド血漿（Ｋ３ ＥＤＴＡ）濃度は、化合物の無傷の塊を測定する適格なＬＣ／ＭＳ法を使用して判定する。各ペプチドおよび内部標準としてのアナログが、タンパク質沈殿法を使用して、１００％カニクイザル血漿から抽出される。ＬＣ／ＭＳ検出用に機器を組み合わせる。平均薬物動態パラメータを表３に示す。
【表4】
【0095】
略語：Ｔ１／２＝半減期、Ｔｍａｘ＝最大濃度到達時間、Ｃｍａｘ／投与量＝最大血漿濃度を投与量で除した値、ＡＵＣＩｎｆ／投与量＝ＡＵＣＩｎｆを投与量で除した値、ＣＬ／Ｆ＝クリアランス／生物学的利用能。注記：データは平均値で、ｎ＝２／群である。
【0096】
表３が示すとおり、試験した実施例ペプチドについてのこの研究の結果は、拡張された薬物動態プロファイルと整合性がある。
【0097】
皮下投与後の雄スプラーグドーリーラットにおける薬物動態
選択した実施例の薬物動態は、雄スプラーグドーリーラットへの１００ｎｍｏｌ／ｋｇの単回皮下（ＳＣ）投与を実施した後に評価する。血液試料をＳＣ投与後１６８時間にわたって収集する。個々の血漿中濃度を使用して薬物動態パラメータを計算する。実施例の無傷の塊を測定する適格なＬＣ／ＭＳ法を使用して、血漿（Ｋ３ ＥＤＴＡ）濃度を判定する。各ペプチドおよび内部標準としてのアナログが、タンパク質沈殿法を使用して、１００％ラット血漿から抽出される。ＬＣ／ＭＳ検出用に機器を組み合わせる。実施例の平均薬物動態パラメータを、表４に示す。
選択した実施例の薬物動態は、雄スプラーグドーリーラットへの１００ｎｍｏｌ／ｋｇの単回皮下（ＳＣ）投与を実施した後に評価する。血液試料をＳＣ投与後１６８時間にわたって収集する。個々の血漿中濃度を使用して薬物動態パラメータを計算する。実施例の無傷の塊を測定する適格なＬＣ／ＭＳ法を使用して、血漿（Ｋ３ ＥＤＴＡ）濃度を判定する。各ペプチドおよび内部標準としてのアナログが、タンパク質沈殿法を使用して、１００％ラット血漿から抽出される。ＬＣ／ＭＳ検出用に機器を組み合わせる。実施例の平均薬物動態パラメータを、表４に示す。
【表5】
【0098】
略語：Ｔ１／２＝半減期、Ｔｍａｘ＝最大濃度到達時間、Ｃｍａｘ／投与量＝最大血漿濃度を投与量で除した値、ＡＵＣＩｎｆ／投与量＝ＡＵＣＩｎｆを投与量で除した値、ＣＬ／Ｆ＝クリアランス／生物学的利用能。注記：データは平均値であり、ｎ＝３／群だが、実施例３は例外であり、データがｎ＝１の動物に由来する。
【0099】
表４に示すように、これらの実施例ペプチドを使用したこの研究の結果は、拡張された薬物動態プロファイルと整合性がある。
【0100】
雄ウィスターラットのインスリン分泌に対するインビボ効果
大腿動脈および大腿静脈カニューレ（Ｅｎｖｉｇｏ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を有する雄ウィスターラット（２８０～３２０グラム）を、フィルタートップ付きのポリカーボネート製ケージに単体収容する。ラットは、２１℃で１２：１２時間の明暗サイクル（午前６：００に点灯）で維持し、餌および脱イオン水を自由に摂取させた。ラットは、体重によって無作為化し、グルコース投与の１６時間前に０．３、１．０、３、１０、３０、および１００ｎｍｏｌ／ｋｇの投与量で、１．５ｍＬ／ｋｇで皮下（ｓ．ｃ．）投与し、次いで絶食させる。動物の体重を量り、ペントバルビタールナトリウムを腹腔内（ｉ．ｐ．）投与して麻酔をかける（６５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｍＬ）。０時点の血液試料をＥＤＴＡチューブに収集し、その後グルコースを静脈内（ｉ．ｖ．）投与する（０．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍＬ／ｋｇ）。血液試料を、グルコースの静脈内投与後２、４、６、１０、２０、および３０分時点のグルコースおよびインスリンレベルについて収集する。血漿グルコースレベルは、臨床化学分析装置を使用して判定する。血漿インスリンは、電気化学発光アッセイ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して判定する。グルコースおよびインスリンＡＵＣを、ｎ＝５匹／群を有するビヒクル対照と比較して調査する。結果が（ＳＥＭ）（Ｎ）で表示される。
大腿動脈および大腿静脈カニューレ（Ｅｎｖｉｇｏ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を有する雄ウィスターラット（２８０～３２０グラム）を、フィルタートップ付きのポリカーボネート製ケージに単体収容する。ラットは、２１℃で１２：１２時間の明暗サイクル（午前６：００に点灯）で維持し、餌および脱イオン水を自由に摂取させた。ラットは、体重によって無作為化し、グルコース投与の１６時間前に０．３、１．０、３、１０、３０、および１００ｎｍｏｌ／ｋｇの投与量で、１．５ｍＬ／ｋｇで皮下（ｓ．ｃ．）投与し、次いで絶食させる。動物の体重を量り、ペントバルビタールナトリウムを腹腔内（ｉ．ｐ．）投与して麻酔をかける（６５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｍＬ）。０時点の血液試料をＥＤＴＡチューブに収集し、その後グルコースを静脈内（ｉ．ｖ．）投与する（０．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍＬ／ｋｇ）。血液試料を、グルコースの静脈内投与後２、４、６、１０、２０、および３０分時点のグルコースおよびインスリンレベルについて収集する。血漿グルコースレベルは、臨床化学分析装置を使用して判定する。血漿インスリンは、電気化学発光アッセイ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して判定する。グルコースおよびインスリンＡＵＣを、ｎ＝５匹／群を有するビヒクル対照と比較して調査する。結果が（ＳＥＭ）（Ｎ）で表示される。
【表6】
【0101】
表５によって提供されるデータは、インスリン分泌が投与量に依存して増加することを示している。
【表7】
【0102】
表６によって提供されるデータは、インスリン分泌が投与量に依存して増加することを示している。
【0103】
実施例１、２、３、５、および６の化合物の免疫原性評価
この研究の目的は、実施例化合物１、２、３、５、および６の臨床免疫原性の相対的可能性を判定することである。
この研究の目的は、実施例化合物１、２、３、５、および６の臨床免疫原性の相対的可能性を判定することである。
【0104】
方法：
ＣＤ４＋Ｔ細胞アッセイ：ＣＤ４＋Ｔ細胞アッセイを使用して、当技術分野で知られている方法に従ってインビボで免疫応答を誘導する可能性について実施例１、２、３、５、および６の化合物を比較し（例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．２４：５６０－５７２、およびＪｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．３：９９１－１０００を参照されたい）、臨床的に試験されたモノクローナル抗体およびペプチドの評価は、インビトロで観察されたＴ細胞の増殖と診療所での免疫原性との間に、ある程度の相関関係を示した。ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖アッセイで３０％未満の陽性反応を誘導するタンパク質治療薬は、免疫原性のリスクが低いことに関連している。簡潔に述べると、実施例１、２、３、５、および６の化合物に対する臨床免疫原性応答の傾向を評価するために、ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が調製され、多様なヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩＩハプロタイプを有する１０人の健康なドナーのコホートに由来するカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識化される。各ドナーは、２．０ｍＬの培地対照、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ、０．３３μＭ）、および実施例１、２、３、５、および６の化合物（０．３３μＭ）を用いて３連で試験される。培養物をＣＯ２５％、３７℃で７日間インキュベートする。７日目に、試料を、ハイスループットサンプラー（ＨＴＳ）を備えたＢＤ ＬＳＲ ＩＩ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を使用して、フローサイトメトリーによって分析する。データを、ＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ／ＴｒｅｅＳｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を使用して分析する。
ＣＤ４＋Ｔ細胞アッセイ：ＣＤ４＋Ｔ細胞アッセイを使用して、当技術分野で知られている方法に従ってインビボで免疫応答を誘導する可能性について実施例１、２、３、５、および６の化合物を比較し（例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．２４：５６０－５７２、およびＪｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．３：９９１－１０００を参照されたい）、臨床的に試験されたモノクローナル抗体およびペプチドの評価は、インビトロで観察されたＴ細胞の増殖と診療所での免疫原性との間に、ある程度の相関関係を示した。ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖アッセイで３０％未満の陽性反応を誘導するタンパク質治療薬は、免疫原性のリスクが低いことに関連している。簡潔に述べると、実施例１、２、３、５、および６の化合物に対する臨床免疫原性応答の傾向を評価するために、ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が調製され、多様なヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩＩハプロタイプを有する１０人の健康なドナーのコホートに由来するカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識化される。各ドナーは、２．０ｍＬの培地対照、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ、０．３３μＭ）、および実施例１、２、３、５、および６の化合物（０．３３μＭ）を用いて３連で試験される。培養物をＣＯ２５％、３７℃で７日間インキュベートする。７日目に、試料を、ハイスループットサンプラー（ＨＴＳ）を備えたＢＤ ＬＳＲ ＩＩ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を使用して、フローサイトメトリーによって分析する。データを、ＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ／ＴｒｅｅＳｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を使用して分析する。
【0105】
結果および考察
ドナー全員が、ＫＬＨに対して陽性のＴ細胞応答を示す（１００％）。実施例化合物のＣＤ４＋Ｔ細胞応答の頻度および強さの分析を表７に示す。
ドナー全員が、ＫＬＨに対して陽性のＴ細胞応答を示す（１００％）。実施例化合物のＣＤ４＋Ｔ細胞応答の頻度および強さの分析を表７に示す。
【表8】
【0106】
細胞分裂指数（「ＣＤＩ」）：刺激された試料および刺激されていない試料における、ＣＤ４＋Ｔ細胞の総数に対する分割ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合。
【0107】
これらのデータは、試験された実施例化合物では、陽性のＣＤ４＋Ｔ細胞応答（ＣＤＩ＞２．５）の頻度が低く、実施例２の群に属する唯一の陽性ドナーにおいては応答強度が低い（ＣＤＩ＜３）ことを示している。したがって、このアッセイに基づくと、これらの化合物は免疫原性のリスクが低い。
【0108】
アミノ酸配列
配列番号１
ＧＩＰ １－４２（ヒト）
配列番号２
ＧＬＰ－１（７－３６）アミド（ヒト）
配列番号３
グルカゴン（ヒト）
配列番号４
配列番号１
ＧＩＰ １－４２（ヒト）
【表9】
ＧＬＰ－１（７－３６）アミド（ヒト）
【表10】
グルカゴン（ヒト）
【表11】
【表12】
【配列表】