特許 7521134 ＡＳＭタンパク質に特異的に結合する抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-07-12

(45)【発行日】2024-07-23

(54)【発明の名称】ＡＳＭタンパク質に特異的に結合する抗体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/40 20060101AFI20240716BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240716BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240716BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240716BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240716BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240716BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240716BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240716BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20240716BHJP

【ＦＩ】

C07K16/40 ZNA

C12N15/13

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

G01N33/53 D

【請求項の数】 12

(21)【出願番号】P 2023572866

(86)(22)【出願日】2022-05-26

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2024-06-18

(86)【国際出願番号】 KR2022095105

(87)【国際公開番号】W WO2022250520

(87)【国際公開日】2022-12-01

【審査請求日】2024-01-24

(31)【優先権主張番号】10-2021-0068075

(32)【優先日】2021-05-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2022-0047295

(32)【優先日】2022-04-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】518148227

【氏名又は名称】アイエスユー アブクシス カンパニー，リミティッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000729

【氏名又は名称】弁理士法人ユニアス国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ホン、スン ボム

(72)【発明者】

【氏名】ホン、ミ リム

【審査官】藤山 純

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０２０／０２５５８３９（ＵＳ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１６／０１０１０７０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】ROUSSON, R et al.，Preparation of an anti-acid sphingomyelinase monoclonal antibody for the quantitative determination and polypeptide analysis of lysosomal sphingomyelinase in fibroblasts from normal and Niemann-Pick type A patients，J Immunol Methods ，160(2)，1993年04月02日，pp.199-206

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ １６／４０

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ１２Ｎ １／１５

Ｃ１２Ｎ １／１９

Ｃ１２Ｎ １／２１

Ｃ１２Ｎ ５／１０

Ｃ１２Ｐ ２１／０８

Ｇ０１Ｎ ３３／５３

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＡＳＭ（ａｃｉｄ ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅ）タンパク質に特異的に結合する、抗体又はその抗原結合断片であって、
配列番号２５、２６及び２７でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４３、４４及び４５でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号２８、２９及び３０でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４６、４７及び４８でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号３１、３２及び３３でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４９、５０及び５１でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号３４、３５及び３６でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号５２、５３及び５４でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号３７、３８及び３９でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される重鎖ＣＤＲ１、 ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号５５、５６及び５７でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；又は
配列番号４０、４１及び４２でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号５８、５９及び６０でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；を含む、抗体又はその抗原結合断片。

【請求項2】

上記抗体又はその抗原結合断片は、ＡＳＭタンパク質のＮ末端から５３～７２番目のアミノ酸断片、１０１～１２３番目のアミノ酸断片、１３５～１５９番目のアミノ酸断片、１３５～１５５番目のアミノ酸断片、２１８～２２８番目のアミノ酸断片、及び２５９～２６９番目のアミノ酸断片からなる群から選択されるいずれか１つ以上のエピトープに結合する、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項3】

上記抗体又はその抗原結合断片は、配列番号６８～７３でそれぞれ示されるポリペプチドからなる群から選択されるいずれか１つ以上のエピトープに結合する、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項4】

上記ＡＳＭタンパク質は、哺乳動物に由来するものである、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項5】

上記ＡＳＭタンパク質は、配列番号６６又は６７で示されるアミノ酸配列で構成されるポリペプチドである、請求項１に記載の抗体又はその結合断片。

【請求項6】

請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードする、核酸。

【請求項7】

請求項６に記載の核酸を含む、発現ベクター。

【請求項8】

請求項６に記載の核酸、又は請求項７に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。

【請求項9】

請求項８に記載の宿主細胞を培養して抗体又はその抗原結合断片を生産するステップを含む、ＡＳＭタンパク質に特異的に結合する、抗体又はその抗原結合断片の生産方法。

【請求項10】

請求項１～５のうちのいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む、ＡＳＭタンパク質検出用の組成物。

【請求項11】

請求項１～５のうちのいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む、ＡＳＭタンパク質検出用のキット。

【請求項12】

請求項１～５のうちのいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片を試料と反応させるステップを含む、インビトロにおけるＡＳＭタンパク質の検出方法（但し、人間を手術する方法を除く）。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＡＳＭ（ａｃｉｄ ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅ）タンパク質に特異的に結合する抗体に関する。

【背景技術】

【0002】

スフィンゴ脂質代謝は、正常な細胞のシグナル伝達を調節し、スフィンゴ脂質代謝の異常な変化は、アルツハイマー病を含む種々の神経変性疾患に影響を及ぼす。スフィンゴ脂質代謝を調節する酵素であるＡＳＭ（ａｃｉｄ ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅ）タンパク質は、ほぼ全種類の細胞で発現されるタンパク質であり、スフィンゴ脂質代謝及び細胞膜のターンオーバー（ｔｕｒｎｏｖｅｒ）に重要な役割をする。

【0003】

アルツハイマー病のような神経変性疾患者の脳では、健常者に比べてＡＳＭタンパク質の活性が著しく増加されている。これと関連して、韓国特許登録第１０－１５２１１１７号には、過剰発現したＡＳＭタンパク質の活性を阻害したり、ＡＳＭタンパク質への発現を抑制することで、βアミロイドの蓄積が抑制され、学習能力や記憶力が改善され、神経変性疾患を治療できることが開示されている。また、近年、うつ病のような神経疾患においてもＡＳＭタンパク質の活性が増加されており、上記ＡＳＭタンパク質の発現又は活性を抑制することでうつ病を改善する効果があることが知られている。

【0004】

しかし、ＡＳＭタンパク質の発現又は活性を直接抑制する物質は開発されておらず、但し、ＡＳＭタンパク質の発現を間接的に抑制する数種類の抑制剤が同定されている。例えば、うつ病の治療に使用されている三環系抗うつ剤（ｔｒｉｃｙｃｌｉｃ ａｎｔｉｄｅｐｒｅｓｓａｎｔ）があり、アミトリプチリン（ａｍｉｔｒｉｐｔｙｌｉｎｅ）、デシプラミン（ｄｅｓｉｐｒａｍｉｎｅ）、ミプラミン（ｍｉｐｒａｍｉｎｅ）などが挙げられる。このような三環系抗うつ剤は、ＡＳＭタンパク質抑制剤として開発されたものではないが、種々の研究結果から、ＡＳＭタンパク質抑制の効果を示すことが証明されている。三環系抗うつ剤の主な薬理機構は、神経細胞における神経伝達物質の再吸収を抑制し、これらの活性を増加させることであり、ＡＳＭ抑制剤としての作用は付随的な作用であると確認されている。しかし、三環系抗うつ剤は、神経系及び神経細胞に作用してカスミ目、光感受性増加、嘔吐などの副作用を誘発することがある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明の目的は、ＡＳＭタンパク質に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供することにある。

【0006】

本発明の他の目的は、上記抗体又はその抗原結合断片の製造方法を提供することにある。

【0007】

本発明のまた他の目的は、上記抗体又はその抗原結合断片のＡＳＭタンパク質の検出用途を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0008】

上記のような目的を達成するため、本発明は、ＡＳＭ（ａｃｉｄ ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅ）タンパク質に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0009】

また、本発明は、上記抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を提供する。

【0010】

また、本発明は、上記核酸を含む発現ベクターを提供する。

【0011】

また、本発明は、上記核酸又は発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。

【0012】

また、本発明は、上記宿主細胞を培養して抗体又はその抗原結合断片を生産するステップを含む、ＡＳＭタンパク質に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片の生産方法を提供する。

【0013】

また、本発明は、上記抗体又はその抗原結合断片を含む、ＡＳＭタンパク質検出用の組成物及びキットを提供する。

【0014】

さらに、本発明は、上記抗体又はその抗原結合断片を試料と反応させるステップを含む、ＡＳＭタンパク質の検出方法を提供する。

【発明の効果】

【0015】

本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、ＡＳＭタンパク質に特異的に高結合力で結合することで、ＡＳＭタンパク質の検出、又はＡＳＭタンパク質の過剰発現により発生する疾患の診断などに有用に使用できる。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】本発明の一実施例で製造された抗体の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す模式図である。

【図2】本発明の一実施例で製造された抗体のＡＳＭタンパク質との結合をＥＬＩＳＡ分析方法で確認した結果を示すグラフである。

【図3】本発明の一実施例で製造された抗体が結合する抗原結合部位をＡＳＭタンパク質構造のモデルに表示した模式図である。

【図4】本発明の一実施例で製造された抗体によるＡＳＭタンパク質サポシン（ｓａｐｏｓｉｎ）ドメインにおける重水素置換のヒートマップの結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0017】

以下、本発明について詳述する。

【0018】

本発明は、ＡＳＭ（ａｃｉｄ ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅ）タンパク質に特異的に結合する、抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0019】

本明細書中の用語「ＡＳＭ（ａｃｉｄ ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅ）タンパク質」とは、スフィンゴ脂質代謝を調節するＳＭａｓｅ（ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅ）ファミリー中の一つである酵素を意味する。上記ＡＳＭタンパク質は、スフィンゴミエリン（ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ）をセラミド（ｃｅｒａｍｉｄｅ）及びホスホリルコリン（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）に分解する過程を触媒し、最適な酵素活性を示すｐＨによって、アルカリ性、中性又は酸性に区分することができる。

【0020】

上記ＡＳＭタンパク質は、当該技術分野で周知のあらゆる種類のＡＳＭタンパク質を含むことができる。具体的には、上記ＡＳＭタンパク質は、哺乳動物に由来するものであり、より具体的には、人間、猿、ラット又はマウスに由来するものであり得る。また、上記ＡＳＭタンパク質は、当該技術分野においてＡＳＭタンパク質として知られた全てのアミノ酸配列を含むことができる。一例として、上記ＡＳＭタンパク質は、配列番号６６及び６７でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成されるポリペプチド、又はこれをコードする核酸であり得る。

【0021】

上記ＡＳＭタンパク質は、これと同一又は相応する生物学的活性を維持する限り、配列番号６６又は６７で示されるアミノ酸配列から一つ又はそれ以上のアミノ酸が付加、欠失又は置換されたものであってもよい。なお、アミノ酸の置換は、全タンパク質の電荷、即ち、極性又は疎水性への影響がないか影響が少ない範囲内で行われる保存的置換であってもよい。また、上記ＡＳＭタンパク質は、配列番号６６及び６７でそれぞれ示されるアミノ酸配列と、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上又は９９％以上の相同性を有することができる。また、上記ＡＳＭタンパク質は、これと同一又は相応する生物学的活性を維持する限り、ＡＳＭタンパク質の一部のみが含んでもよい。

【0022】

本明細書中の用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」とは、抗原と結合して抗原の作用を阻害したり抗原を除去したりする免疫タンパク質を意味する。上記抗体は、当該技術分野におけるあらゆる種類の抗体を含むことができる。具体的には、上記抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥを含むことができ、これらは、それぞれ、重鎖定常領域をコードする遺伝子である、μ、δ、γ、α、及びεからなる重鎖を含むことができる。抗体技術では、通常、主にＩｇＧが使用されるが、これは、また、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４の同種（ｉｓｏｔｙｐｅ）から構成され、これらのそれぞれの構造及び機能的特性は相違し得る。上記抗体は、非ヒト抗体に由来する最小の配列を含むヒト化抗体、ヒトに由来する配列で構成されたヒト抗体、又は異種由来の配列が混合されたキメラ抗体を全て含むことができる。

【0023】

上記ＩｇＧは、約５０ｋＤａの重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）タンパク質２個と、約２５ｋＤａの軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）タンパク質２個とからなるＹ字型の非常に安定した構造（約１５９ｋＤａ）を形成することができる。抗体を構成する軽鎖及び重鎖は、抗体間でアミノ酸配列が異なる可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）、及びアミノ酸配列が同一である定常領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）に分けられる。このとき、重鎖定常領域は、ＣＨ１、ヒンジ（ｈｉｎｇｅ、Ｈ）、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインを含み、各ドメインは、二つのβシート（β－ｓｈｅｅｔ）で構成され、分子内のジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）で連結され得る。また、軽鎖定常領域は、ＣＬドメインを含むことができる。なお、重鎖及び経鎖可変領域２つが組み合わされて抗原結合部位（ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）が形成され、上記抗原結合部位は、Ｙ字型の２つの腕にそれぞれ１つずつ存在することができる。全長抗体において、抗原と結合できる領域をＦａｂ（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）と、抗原と結合できない領域をＦｃ（ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）と呼び、Ｆａｂ及びＦｃは、ヒンジを介して連結され得る。本発明の一実施例において、上記ＩｇＧは、マウス由来のＩｇＧであり、具体的には、配列番号７４で示されるアミノ酸配列で構成されるマウスのＩｇＧ重鎖定常領域、及び配列番号７６で示されるアミノ酸配列で構成されるマウスの軽鎖λ定常領域を含むことができる。また、上記マウス由来のＩｇＧは、配列番号７５で示される塩基配列で構成されるマウスのＩｇＧ重鎖定常領域、及び配列番号７７で示される塩基配列で構成されるマウスの軽鎖λ定常領域を含むことができる。

【0024】

本発明に係る抗体は、全長抗体だけでなく、その抗原結合断片を含むことができる。具体的には、上記抗原結合断片は、抗原との結合刺激を細胞や補体などに伝達する機能をするＦｃを除いた部分を意味することができる。一例として、抗体の抗原結合断片は、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）_２及びＦｖを含み、シングルドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）やミニボディー（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）などのような第３世代の抗体切片を含んでもよい。

【0025】

本発明の一側面において、上記抗体又は抗原結合断片は、ＡＳＭタンパク質のＮ末端から５３～７２番目のアミノ酸断片、１０１～１２３番目のアミノ酸断片、１３５～１５９番目のアミノ酸断片、１３５～１５５番目のアミノ酸断片、２１８～２２８番目のアミノ酸断片、及び２５９～２６９番目のアミノ酸断片からなる群から選択されるいずれか一つ以上のエピトープに結合することができる。このとき、上記ＡＳＭタンパク質は、上述のような特徴を有することができる。本発明の一実施例において、上記ＡＳＭタンパク質のＮ末端から５３～７２番目のアミノ酸断片は、配列番号６８（TAINLGLKKEPNVARVGSVA）で示されるアミノ酸配列で構成されるポリペプチドであり、１０１～１２３番目のアミノ酸断片は、配列番号６９（VWRRSVLSPSEACGLLLGSTCGH）で示されるアミノ酸配列で構成されるポリペプチドであり、１３５～１５９番目のアミノ酸断片は、配列番号７０（PTVPKPPPKPPSPPAPGAPVSRILF）で示されるアミノ酸配列で構成されるポリペプチドであり、１３５～１５５番目のアミノ酸断片は、配列番号７１（PTVPKPPPKPPSPPAPGAPVS）で示されるポリペプチドであり、２１８～２２８番目のアミノ酸断片は、配列番号７２（SGLGPAGPFDM）で示されるアミノ酸配列で構成されるポリペプチドであり、２５９～２６９番目のアミノ酸断片は、配列番号７３（VRKFLGPVPVY）で示されるアミノ酸配列で構成されるポリペプチドであり得る。即ち、本発明の他の側面において、上記抗体又は抗原結合断片は、配列番号６８～７３でそれぞれ示されるポリペプチドからなる群から選択されるいずれか一つ以上のエピトープに結合することができる。

【0026】

上記「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）」とは、抗体が識別し得る抗原の特定部位のことであり、抗体が特異的に結合できる抗原決定基を意味する。上記エピトープは、抗原決定部位（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ、ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）と同じ意味で通用されている。上記エピトープは、化学的に活性を持つ表面分子群、例えば、アミノ酸又は糖側鎖で構成され、一般的に、特定の３次元の構造的特徴だけでなく、特定の電荷特性を有している。

【0027】

本発明の一側面において、上記抗体又はその抗原結合断片は、配列番号６１で示されるアミノ酸配列で構成される重鎖ＣＤＲ１（Ｘ_１ＹＸ_２ＭＳ）、配列番号６２で示されるアミノ酸配列で構成される重鎖ＣＤＲ２（Ｘ_３ＩＸ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０ＹＹＡＤＳＶＫＧ）、及び配列番号２７、３０、３３、３６、３９及び４２でそれぞれ示されるアミノ酸配列からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号６３で示されるアミノ酸配列で構成される軽鎖ＣＤＲ１（X_１１ＧＳＳＳＮＩＧＸ_１２ＮＸ_１３ＶＸ_１４）、配列番号６４で示されるアミノ酸配列で構成される軽鎖ＣＤＲ２（Ｘ_１５Ｘ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８ＲＰＳ）、及び配列番号６５で示されるアミノ酸配列で構成される軽鎖ＣＤＲ３（Ｘ_１９Ｘ_２０ＷＤＸ_２１ＳＬＸ_２２Ｘ_２３ＹＶ）を含む軽鎖可変領域を含むことができる。

【0028】

上記「ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）」とは、抗体の重鎖及び軽鎖可変領域内に抗体ごとに異なるアミノ酸配列を有する部位である超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）であり、実際に抗原と結合する部位を意味する。抗体の立体構造において、ＣＤＲは、環状（ｌｏｏｐ）で抗体の表面に位置し、環の下にはこれを構造的に支持するＦＲ（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ）が存在し得る。重鎖及び軽鎖は、いずれもそれぞれ３つずつ環構造が存在し、これら６つの環構造が合わさって抗原に直接接触することができる。 上記６つの環構造を有する抗原結合部位であるＣＤＲを、それぞれ、便宜上、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３と指称する。

【0029】

一例として、上記配列番号６１で示されるアミノ酸配列で構成される重鎖ＣＤＲ１（Ｘ_１ＹＸ_２ＭＳ）中、Ｘ_１及びＸ_２は、それぞれ、酸性及び中性アミノ酸から選択され得る。具体的には、上記Ｘ_１は、酸性又は中性アミノ酸であり、Ｘ_２は、中性アミノ酸であり得る。 例えば、上記Ｘ_１及びＸ_２は、それぞれ、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ、Ａｓｎ）、グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｇｌｙ）、セリン（ｓｅｒｉｎｅ、Ｓｅｒ）、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｄ、Ａｓｐ）、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ、Ａｌａ）、及びチロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ、Ｔｙｒ）からなる群から選択され得る。具体的には、上記Ｘ_１は、アスパラギン、グリシン、セリン又はアスパラギン酸であり、Ｘ_２は、アラニン又はチロシンであり得る。本発明の一実施例において、上記重鎖ＣＤＲ１は、配列番号２５、２８、３１、３４、３７又は４０で示されるアミノ酸配列で構成され得る。

【0030】

また、上記配列番号６２で示されるアミノ酸配列で構成される重鎖ＣＤＲ２（Ｘ_３ＩＸ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０ＹＹＡＤＳＶＫＧ）中、Ｘ_３～Ｘ_１０は、それぞれ中性及び塩基性アミノ酸から選択され得る。具体的には、上記Ｘ_３及びＸ_４～Ｘ_９は、それぞれ中性アミノ酸であり、Ｘ_１０は、中性又は塩基性アミノ酸であり得る。例えば、上記Ｘ_３～Ｘ_１０は、それぞれ、グリシン、ロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ、Ｌｅｕ）、アラニン、セリン、チロシン、プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ、Ｐｒｏ）、アスパラギン、リシン（ｌｙｓｉｎｅ、Ｌｙｓ）及びイソロイシン（ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ、Ｉｌｅ）からなる群から選択され得る。具体的には、上記Ｘ_３は、グリシン、ロイシン、アラニン又はセリンであり、Ｘ_４は、チロシン又はセリンであり、Ｘ_５は、プロリン又はチロシンであり、Ｘ_６は、アスパラギン又はグリシンであり、Ｘ_７及びＸ_８は、それぞれ、グリシン又はセリンであり、Ｘ_９は、アスパラギン又はセリンであり、Ｘ_１０は、リシン又はイソロイシンであり得る。本発明の一実施例において、上記重鎖ＣＤＲ２は、配列番号２６、２９、３２、３５、３８又は４１で示されるアミノ酸配列で構成され得る。

【0031】

また、上記配列番号６３で示されるアミノ酸配列で構成される軽鎖ＣＤＲ１（Ｘ_１１ＧＳＳＳＮＩＧＸ_１２ＮＸ_１３ＶＸ_１４）中、Ｘ_１１～Ｘ_１４は、それぞれ、中性アミノ酸から選択され得る。例えば、上記Ｘ_１１～Ｘ_１４は、それぞれ、トレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ、Ｔｈｒ）、セリン、アスパラギン、アラニン、プロリン及びチロシンからなる群から選択され得る。具体的には、上記Ｘ_１１は、トレオニン又はセリンであり、Ｘ_１２は、アスパラギン又はセリンであり、Ｘ_１３は、アラニン、プロリン、トレオニン又はチロシンであり、Ｘ_１４は、アスパラギン、チロシン又はセリンであり得る。本発明の一実施例において、上記軽鎖ＣＤＲ１は、配列番号４３、４６、４９、５２、５５又は５８で示されるアミノ酸配列で構成され得る。

【0032】

また、上記配列番号６４で示されるアミノ酸配列で構成される軽鎖ＣＤＲ２（Ｘ_１５Ｘ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８ＲＰＳ）中、Ｘ_１５～Ｘ_１８は、それぞれ、酸性、塩基性及び中性アミノ酸から選択され得る。具体的には、上記Ｘ_１５及びＸ_１６は、それぞれ、酸性又は中性アミノ酸であり、Ｘ_１７は、中性アミノ酸であり、Ｘ_１８は、塩基性又は中性アミノ酸であり得る。例えば、上記Ｘ_１５～Ｘ_１８は、それぞれ、チロシン、アラニン、アスパラギン酸、セリン、アスパラギン、ヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ、Ｈｉｓ）、グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、Ｇｌｎ）、及びリシンからなる群から選択され得る。具体的には、Ｘ_１５は、チロシン、アラニン、アスパラギン酸又はセリンであり、Ｘ_１６は、アスパラギン酸又はアスパラギンであり、Ｘ_１７は、セリン又はアスパラギンであり、Ｘ_１８は、ヒスチジン、グルタミン又はリシンであり得る。本発明の一実施例において、上記軽鎖ＣＤＲ２は、配列番号４４、４７、５０，５３、５６又は５９で示されるアミノ酸配列で構成され得る。

【0033】

また、上記配列番号６５で示されるアミノ酸配列で構成される軽鎖ＣＤＲ３（Ｘ_１９Ｘ_２０ＷＤＸ_２１ＳＬＸ_２２Ｘ_２３ＹＶ）中、Ｘ_１９～Ｘ_２３は、それぞれ、中性アミノ酸から選択され得る。例えば、上記Ｘ_１９～Ｘ_２３は、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン酸及びアスパラギンからなる群から選択され得る。具体的には、Ｘ_１９は、グリシン又はアラニンであり、Ｘ_２０は、アラニン、セリン又はトレオニンであり、Ｘ_２１は、チロシン、セリン、アラニン又はアスパラギン酸であり、Ｘ_２２は、セリン又はアスパラギンであり、Ｘ_２３は、アラニン又はグリシンであり得る。本発明の一実施例において、上記軽鎖ＣＤＲ３は、配列番号４５、４８、５１，５４、５７又は６０で示されるアミノ酸配列で構成され得る。

【0034】

本発明の他の側面において、上記抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２５、２８、３１、３４、３７及び４０で示されるアミノ酸配列からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１、配列番号２６、２９、３２、３５、３８及び４１でそれぞれ示されるアミノ酸配列からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ２、及び、配列番号２７、３０、３３、３６、３９及び４２でそれぞれ示されるアミノ酸配列からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに、配列番号４３、４６、４９、５２、５５及び５８でそれぞれ示されるアミノ酸配列からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４４、４７、５０、５３、５６及び５９でそれぞれ示されるアミノ酸配列からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２、及び、配列番号４５、４８、５１、５４、５７及び６０でそれぞれ示されるアミノ酸配列からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むことができる。

【0035】

また、上記抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２５、２６及び２７でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、配列番号２８、２９及び３０でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、配列番号３１、３２及び３３でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、配列番号３４、３５及び３６でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、配列番号３７、３８及び３９でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び、配列番号４０、４１及び４２でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域からなる群から選択される重鎖可変領域、並びに、配列番号４３、４４、及び４５でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、配列番号４６、４７及び４８でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、配列番号４９、５０及び５１でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、配列番号５２、５３及び５４でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、配列番号５５、５６及び５７でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、及び、配列番号５８、５９及び６０でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域からなる群から選択される軽鎖可変領域を含むことができる。

【0036】

さらに、上記抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２５、２６及び２７でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに、配列番号４３、４４及び４５でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；配列番号２８、２９及び３０でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに、配列番号４６、４７及び４８でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；配列番号３１、３２及び３３でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに、配列番号４９、５０及び５１でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；配列番号３４、３５及び３６でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに、配列番号５２、５３及び５４でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；配列番号３７、３８及び３９でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに、配列番号５５、５６及び５７でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；又は、配列番号４０、４１及び４２でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに、配列番号５８、５９及び６０でそれぞれ示されるアミノ酸配列で構成される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；を含むことができる。

【0037】

一例として、上記重鎖可変領域は、配列番号１、３、５、７、９又は１１で示されるアミノ酸配列で構成されるポリペプチドであり、上記軽鎖可変領域は、配列番号１３、１５、１７、１９、２１又は２３で示されるアミノ酸配列で構成されるポリペプチドであり得る。

【0038】

また、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、必要に応じて変形したものであり得る。具体的には、上記抗体又はその抗原結合断片は、接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）、グリコシル化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、標識付け又はこれらの組み合わせで変形してもよい。具体的には、上記抗体又はその抗原結合断片は、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、アルカリフォスファターゼ、ハプテン（ｈａｐｔｅｎ）、ビオチン、ストレプトアビジン、蛍光物質、放射性物質、量子ドット、ＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ヒスチジン標識などに変形され得る。さらに、上記抗体又はその抗原結合断片は、必要に応じて他の薬物が接合されてもよい。

【0039】

上記抗体又はその抗原結合断片は、当該技術分野で周知のモノクローナル抗体の製造方法により製造することができ、上記製造方法は、当業者によって適宜変形可能である。一例として、上記抗体は、抗原で免疫化された動物から得られたＢリンパ球を用いてハイブリドーマを製造することで、又は、ファージディスプレイ法を用いて製造することで得ることができる。

【0040】

また、本発明は、上記抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を提供する。

【0041】

本発明に係る核酸がコードする抗体又はその抗原結合断片は、上記のような特徴を有することができる。本発明に係る抗体又はその抗原結合断片を構成するアミノ酸配列が公知であるところ、これをコードする核酸配列は、当業者にとって自明である。また、上記核酸配列は、それから翻訳される抗体又はその抗原結合断片の活性を維持する限り、１つ又はそれ以上の塩基が付加、欠失又は置換されたものであり得る。

【0042】

一例として、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片に含まれる重鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号２、４、６、８、１０又は１２で示される塩基配列で構成されるポリヌクレオチドであり、軽鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号１４、１６、１８、２０、２２又は２４で示される塩基配列で構成されるポリヌクレオチドであり得る。

【0043】

また、本発明は、上記核酸を含む発現ベクターを提供する。

【0044】

本発明に係る発現ベクターに含まれる核酸は、上述のような特徴を有する抗体又はその抗原結合断片がコードされたものであり得る。

【0045】

本明細書中の用語「発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）」とは、宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための手段であって、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクター、ウイルスベクターなどが挙げられる。上記発現ベクターは、これに含まれる核酸からペプチドを生成するために必要な要素を含むことができる。具体的には、上記発現ベクターは、シグナル配列、複製起点、マーカー遺伝子、プロモーター、転写終結配列などを含むことができる。このとき、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片をコードした核酸は、プロモーターと作動可能に連結され得る。

【0046】

一例として、原核細胞用発現ベクターは、転写を行うプロモーター、解毒の開始のためのリボソーム結合位置、及び転写と解毒の終結配列を含むことができる。なお、真核細胞用発現ベクターは、哺乳動物又は哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター、及びポリアデニル化配列を含むことができる。

【0047】

また、上記発現ベクターに含まれるマーカー遺伝子としては、当該技術分野で公知のものであれば、いずれも使用可能であり、具体的には、抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。具体的に、上記抗生物質耐性遺伝子は、アンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、テトラサイクリンなどのような、抗生物質に対して耐性を示す遺伝子であり得る。

【0048】

また、本発明は、上記核酸又は発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。

【0049】

本発明に係る宿主細胞に含まれる核酸又は発現ベクターは、上述のような特徴を有することができる。一例として、上記核酸は、本発明に係るＡＳＭタンパク質に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片をコードすることができ、上記発現ベクターは、上述のような核酸を含むことができる。

【0050】

上記宿主細胞としては、当該技術分野において抗体又はその抗原結合断片を生産するために使用可能なものとして知られたあらゆる種類の細胞を使用することができる。具体的には、上記宿主細胞は、原核細胞、酵母又は真核細胞であり得る。上記原核細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス属菌株、ストレプトマイセス属菌株、シュードモナス属菌株、スタフィロコッカス属菌株などが挙げられ、上記酵母としては、サッカロマイセス・セレビシエなどが挙げられる。また、上記真核細胞としては、ＣＯＳ－７、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＨＯＫ１、ＤＸＢ－１１、ＤＧ－４４、ＣＨＯ／－ＤＨＦＲ、ＣＶ１、ＨＥＫ２９３、ＴＭ４、ＶＥＲＯ、ＨＥＬＡ、ＭＤＣＫ、ＢＲＬ ３Ａ、Ｗ１３８、Ｈｅｐ Ｇ２、ＳＫ－Ｈｅｐ、ＭＭＴ、ＴＲＩ、ＭＲＣ ５、ＦＳ４、３Ｔ３、ＲＩＮ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＰＥＲＣ６、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、Ｕ２０Ｓ、及びＨＴ１０８０などが挙げられる。

【0051】

また、上記宿主細胞は、当該技術分野で公知の常法に従って上述のような核酸又は発現ベクターが形質注入されたものであり得る。具体的には、上記形質注入は、一過性形質感染（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、微細針、形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）、細胞融合、リン酸カルシウム沈殿法、リポソーム仲介性形質感染（ｌｉｐｏｓｏｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、ＤＥＡＥデキストラン仲介性形成感染（ＤＥＡＥ ｄｅｘｔｒａｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｓｆｅｃｔｉｏｎ）、ポリブレン仲介性形質感染（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｓｆｅｃｔｉｏｎ）、電気穿孔法、遺伝子銃（ｇｅｎｅ ｇｕｎ）などの方法で行うことができる。なお、上記のような方法は、当業者によって適宜変形可能である。

【0052】

さらに、本発明は、上記宿主細胞を培養して抗体又はその抗原結合断片を生産するステップを含むＡＳＭタンパク質に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片の生産方法を提供する。

【0053】

本発明に係る生産方法により生産される抗体又はその抗原結合断片は、上記のような特徴を有することができる。

【0054】

上記培養は、生産に使用される宿主細胞の種類に応じて適切な培養培地を用いて行うことができ、必要に応じて適切な補充物を含んでもよい。また、上記培養は、宿主細胞の種類によって適切な環境下で行うことができる。

【0055】

本発明に係る生産方法は、宿主細胞で生産された抗体又はその抗原結合断片を回収するステップをさらに含むことができる。上記回収は、当該技術分野で公知の常法に従って行うことができ、必要に応じて当業者によって適宜変形可能である。一例として、上記回収は、遠心分離又は限外ろ過を用いて不純物を除去し、さらに、得られた結果物をクロマトグラフィーなどで精製することで行うことができる。上記クロマトグラフィーとしては、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオンクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーなどが挙げられる。

【0056】

また、本発明は、上記抗体又はその抗原結合断片を含むＡＳＭタンパク質検出用の組成物及びキットを提供する。

【0057】

本発明に係るＡＳＭタンパク質検出用の組成物及びキットに含まれる抗体又はその抗原結合断片は、上記のような特徴を有することができる。

【0058】

また、上記組成物は、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片に特異的に結合し得るリガンドを含むことができる。上記リガンドは、発色酵素、蛍光物質、放射性同位体又はコロイドなどの検出体が標識された接合体、及びストレプトアビジン又はアビジン処理が施されたリガンドであり得る。本発明による検出用組成物は、上述した試薬の他に、これらの構造を安定に維持させるための蒸留水又は緩衝液をさらに含んでもよい。

【0059】

なお、上記キットは、これに含まれる抗体又はその抗原結合断片の洗浄や複合体の分離などのような後続ステップを容易にするため、固形基質に結合されてもよい。このとき、固形基質としては、合成樹脂、ニトロセルロース、ガラス基板、金属基板、ガラス繊維、微細球体、又は微細ビーズが挙げられる。また、合成樹脂としては、ポリエステル、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリプロピレン、ＰＶＤＦ、又はナイロンなどが挙げられる。

【0060】

また、上記キットは、当該技術分野で公知の常法に従って製造することができ、緩衝液、安定化剤、不活性タンパク質などをさらに含むことができる。

【0061】

さらに、本発明は、上記抗体又はその抗原結合断片を試料と反応させるステップを含むＡＳＭタンパク質の検出方法を提供する。

【0062】

本発明に係るＡＳＭタンパク質の検出方法に使用される抗体又はその抗原結合断片は、上記のような特徴を有することができる。

【0063】

上記試料は、ＡＳＭタンパク質を検出しようとする試料であれば、あらゆる種類の試料を使用することができる。また、抗体又はその抗原結合断片を用いて標的タンパク質を検出する方法は、当該技術分野で公知であり、必要に応じて、当業者によって適宜変形可能である。

【実施例】

【0064】

以下、本発明を後述の実施例に基づいて詳述する。但し、後述の実施例は、本発明の例示に過ぎず、本発明は、これらの実施例によって制限されない。本発明の特許請求の範囲に記載の技術的思想と実質的に同様な構成を有し、同様な作用効果を示すものであれば、いずれも本発明の技術的範囲に含まれる。

【0065】

［実施例１：ＡＳＭ（ａｃｉｄ ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅ）タンパク質に特異的に結合する抗体の作製］
ヒトＡＳＭタンパク質（配列番号６６）及びマウスＡＳＭタンパク質（配列番号６７）に特異的に結合する抗体を、次のような方法で製造した。

【0066】

具体的には、組換えヒト及びマウスＡＳＭタンパク質、及びヒト合成ｓｃＦＶファージライブラリを用いて常法に従ってパンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）を行い、ヒトＡＳＭタンパク質又はマウスＡＳＭタンパク質に特異的に結合するｓｃＦｖを有するファージを選別した。選別されたｓｃＦｖをコードする核酸配列を分析し、これから生成されるアミノ酸配列を確認した。確認されたｓｃＦｖ配列の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のそれぞれのカルボキシ末端（ｃａｒｂｏｘｙ ｔｅｒｍｉｎｕｓ）に、配列番号７５及び７７でそれぞれ示される塩基配列で構成されるマウス重鎖定常領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）及びマウス軽鎖λ定常領域が連結された形態で発現されるように発現ベクターを製造した。このとき、製造された発現ベクターに含まれたｓｃＦｖを構成する重鎖可変領域のアミノ酸配列及び核酸配列を下記表１に、軽鎖可変領域のアミノ酸配列及び核酸配列を下記表２に示す。

【0067】

【表1】

【0068】

【表2】

【0069】

このとき、発現ベクターとしては、哺乳類発現ベクター（ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）を使用した。製造された発現ベクターをＣＨＯ又はＨＥＫ２９３細胞株に形質転換させてヒトＡＳＭタンパク質に結合し、又はヒト及びマウスのＡＳＭタンパク質に全て結合する全長の抗体を製造した。

【0070】

［実施例２：相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）の決定］
上記で製造されたｓｃＦＶにおいて相補性決定領域を常法に従って確認し、その結果を、重鎖可変領域のＣＤＲ配列を表３に、軽鎖可変領域のＣＤＲ配列を表４に示す。

【0071】

【表3】

【0072】

【表4】

【0073】

［実験例１：ＡＳＭタンパク質との結合確認］
上記で製造されたＡＳＭタンパク質に特異的に結合する抗体のＡＳＭタンパク質との結合をＥＬＩＳＡ分析方法で確認した。

【0074】

まず、マルチアレイ９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に、１μｇ／ｍｌの組換えヒトＡＳＭタンパク質（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を１００μｌ添加し、４℃で１６時間放置し、プレートをコーティングした。コーティングされたプレートに、５％ＢＳＡが含まれた２００μｌのＰＢＳを添加し、３７℃で２時間反応させて前処理した後、０．０５％のツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）が含まれたＰＢＳでこれを３回洗浄した。ここに、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、１０又は１００ｎＭの抗ＡＳＭ抗体を処理し、３７℃で１時間反応させた。反応後、プレートを０．０５％のツイーンが含まれたＰＢＳで３回洗浄し、二次抗体として１００μｌのヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）抗体を添加した。これを３７℃でさらに１時間反応させ、０．０５％のツイーンが含まれたＰＢＳで３回洗浄した。ここに、１００μｌのＴＭＢ基質（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）を添加し、さらに常温で５分間反応させた後、１００μｌの２Ｎ硫酸溶液で反応を停止し、４５０ｎｍの波長で吸光度を測定した。その結果を、測定された吸光度を図２に、吸光度値から計算された抗体のＥＣ_５０値を表５に示す。

【0075】

【表5】

【0076】

図２に示されるように、上記で製造された５種類の抗体が全て濃度依存的にＡＳＭタンパク質に結合している。特に、表５に示されるように、＃９１０１抗体が最も低いＥＣ_５０値を示し、ＡＳＭタンパク質に対する結合力が最も高かった。

【0077】

［実験例２：ＡＳＭタンパク質との結合親和性の確認］
上記で製造されたＡＳＭタンパク質に特異的に結合する抗体のＡＳＭタンパク質との結合親和性及び相互作用動力学を、Ｏｃｔｅｔ（商標）ＱＫ３８４システム（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて測定した。

【0078】

まず、ＡＲ２Ｇセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）に、２０ｍＭの１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及び４０ｎＭのＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ－ＮＨＳ）溶液を処理してカルボキシ基を活性化させた。なお、１０μｇ／ｍｌの組換えヒトＡＳＭタンパク質又は２．５μｇ／ｍｌの組換えマウスＡＳＭタンパク質は、１０ｎＭのナトリウムアセテート（ｐＨ５．０）（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）溶液に希釈して準備した。上記ＡＳＭタンパク質が希釈された溶液を、カルボキシ基が活性化されたＡＲ２Ｇセンサーに加え、組換えヒト又はマウスＡＳＭタンパク質が固定されたＡＲ２Ｇセンサーを得た。得られたＡＳＭタンパク質が固定されたセンサーに、１Ｍのエタノールアミン（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を添加し、未反応の残存カルボキシ基を不活性化させた。ここに、０．４、２又は１０ｎＭ濃度の実施例１で製造された抗体を添加し、約９００秒間反応物の結合相を観察した。次に、１×動力学緩衝液（ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｂｕｆｆｅｒ）（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を添加し、約１，２００秒間反応物の分離相を観察した。Ｏｃｔｅｔ（商標）分析ソフトウェア（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、各抗体に対する結合定数（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ：Ｋｏｎ）、解離定数（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ：Ｋｄｉｓ）及び平衡解離定数（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ：ＫＤ）を決定した。その結果を、組換えヒトＡＳＭタンパク質に対する分析結果を表６に、組換えマウスＡＳＭタンパク質に対する分析結果を表７に示す。

【0079】

【表6】

【0080】

【表7】

【0081】

表６に示されるように、実施例１で製造された５種類の抗体が、１０^－１０～１０^－９Ｍレベルの結合力でヒトＡＳＭタンパク質に結合している。なお、表７に示されるように、マウスＡＳＭタンパク質に対しては、＃９１０２、＃９１０４又は＃９１０８の抗体だけが、１０^－１０～１０^－９Ｍレベルの結合力を示している。

【0082】

［実験例３：ＡＳＭタンパク質の抗原決定部位の確認］
本発明に係る抗体がＡＳＭタンパク質に結合する部位である抗原決定部位をＨＤＸ－ＭＳ（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）方法で確認した。

【0083】

まず、１，０００μｇ／ｍｌのＡＳＭタンパク質、１，０００μｇ／ｍｌの＃９１０１ｍＩｇＧ１，１，２５０μｇ／ｍｌの＃９１０２ｍＩｇＧ２、１，０００μｇ／ｍｌの＃９１０４ｍＩｇＧ４、１，０００μｇ／ｍｌの＃９１０８ｍＩｇＧ１、３，３００μｇ／ｍｌの＃９１１３ｍＩｇＧ１、又は２，９３２μｇ／ｍｌの＃９１２３ｍＩｇＧ１抗体を連続して２倍数ずつ希釈し、１２８倍の希釈液まで準備した。準備された希釈液を１μｌずつ取り、同量の１０ｍｇ／ｍｌのシナピン酸マトリックス（Ｋ２００ ＭＡＬＤＩ ｋｉｔ、ＣｏｖａｌＸ）と混合し、上記混合物の１μｌをＳＣＯＵＴ３８４ ＭＡＬＤＩプレートに分注し、常温で結晶化させた。次に、上記結晶を、ＭＡＬＤＩ質量分析器（ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）を用いて測定した。一方、非共有結合相互作用の分析のためのクロスリンク（ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋ）データのため、１μｌの１２８倍希釈液を、同量の２ｍｇ／ｍｌのＫ２００安定化溶液（Ｋ２００ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ ｒｅａｇｅｎｔ、Ｋ２００ ＭＡＬＤＩ Ｋｉｔ、ＣｏｖａｌＸ）と混合し、これを３時間常温で反応させた。反応終了後、１μｌの混合液を用いて、上記と同様にＭＡＬＤＩ質量分析器で測定し、測定結果は、ハイマスＭＡＬＤＩ ＭＳ（ｈｉｇｈ－ｍａｓｓ ＭＡＬＤＩ ＭＳ）モードで分析した。その結果を、ＡＳＭタンパク質内重水素挿入による顕著な差が確認された部位のアミノ酸配列を下記表８に、ヒトＡＳＭタンパク質構造モデルに各抗体の結合位置を表示した結果を図３に示す。また、ＡＳＭタンパク質のうちサポシン（ｓａｐｏｓｉｎ）ドメインにおける各抗体の重水素置換率のヒートマップを図４に示す。

【0084】

【表8】

【0085】

表８及び図３に示されるように、本発明による抗体は、ＡＳＭタンパク質のＮ末端から５３～７２番目のアミノ酸断片（配列番号６８：TAINLGLKKEPNVARVGSVA）、１０１～１２３番目のアミノ酸断片（配列番号６９：VWRRSVLSPSEACGLLLGSTCGH）、１３５～１５９番目のアミノ酸断片（配列番号７０：PTVPKPPPKPPSPPAPGAPVSRILF）、１３５～１５５番目のアミノ酸断片（配列番号７１：PTVPKPPPKPPSPPAPGAPVS）、２１８～２２８番目のアミノ酸断片（配列番号７２：SGLGPAGPFDM）又は２５９～２６９番目のアミノ酸断片（配列番号７３：VRKFLGPVPVY）に結合している。特に、図４に示されるように、本発明による抗体は、サポシンドメインにおけるαヘリックス１及びαヘリックス２の部位に主に結合している。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

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