特許 7521856 ＣＡＲＭ１によるＰｏｎｔｉｎのアルギニンメチル化による自己捕食調節方法及びその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-07-16

(45)【発行日】2024-07-24

(54)【発明の名称】ＣＡＲＭ１によるＰｏｎｔｉｎのアルギニンメチル化による自己捕食調節方法及びその用途

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/48 20060101AFI20240717BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20240717BHJP

   C12N 15/54 20060101ALN20240717BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/48 Z ZNA

C12N15/12

C12N15/54

【請求項の数】 5

(21)【出願番号】P 2023531622

(86)(22)【出願日】2021-11-12

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-12-04

(86)【国際出願番号】 KR2021016485

(87)【国際公開番号】W WO2022114622

(87)【国際公開日】2022-06-02

【審査請求日】2023-05-24

(31)【優先権主張番号】10-2020-0160027

(32)【優先日】2020-11-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】521081975

【氏名又は名称】ソウル ナショナル ユニヴァーシティ アール アンド ディービー ファウンデーション

(74)【代理人】

【識別番号】110002860

【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ペク，ソンヒ

(72)【発明者】

【氏名】ユ，ヨンソク

(72)【発明者】

【氏名】シン，ハイ－チャイ

(72)【発明者】

【氏名】キム，ドンハ

【審査官】堀内 建吾

(56)【参考文献】

【文献】韓国登録特許第１０－１７７１８５１（ＫＲ，Ｂ１）

【文献】韓国公開特許第１０－２０１３－００７８８６５（ＫＲ，Ａ）

【文献】特表２０１７－５２７５９４（ＪＰ，Ａ）

【文献】Pontin arginine methylation by CARM1 is crucial for epigenetic regulation of autophagy.，Nature communications，2020年，11(1)，6297

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｑ １／４８

Ｃ１２Ｎ １５／１２

Ｃ１２Ｎ １５／５４

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

メチルトランスフェラーゼであるＣＡＲＭ１（Ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｒｇｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １）によるＰＯＮＴＩＮタンパク質のメチル化調節を介して自己捕食を調節する物質をスクリーニングする方法であって、前記方法は、ブドウ糖欠乏状態でＣＡＲＭ１及び前記メチルトランスフェラーゼＣＡＲＭ１の基質としてＰＯＮＴＩＮタンパク質を発現する細胞を培養する第１の段階と、
前記細胞にメチルトランスフェラーゼＣＡＲＭ１の前記ＰＯＮＴＩＮに対するメチル化活性を抑制するものと期待される試験物質を処理する第２の段階と、
前記ＰＯＮＴＩＮタンパク質を前記細胞から分離する第３の段階と、
前記分離されたＰＯＮＴＩＮタンパク質の配列番号１に基づいて３３３番及び３３９番目の残基におけるメチル化の程度を測定する第４の段階と、
前記測定結果、試験物質で処理されていない対照群と比較して、試験物質で処理された場合、前記メチル化が増加または減少した場合、これを自己捕食を調節する候補物質として選別する第５の段階を含み、前記メチル化の増加は、自己捕食の増加、前記メチル化の減少は、自己捕食の抑制を示すものである、ＣＡＲＭ１及びＰＯＮＴＩＮによって調節される自己捕食調節剤スクリーニング方法。

【請求項2】

前記第１の段階は、ＦＯＸＯ３ａタンパク質をさらに発現し、
前記第４の段階の代わりに、またはそれに加えて、前記ＰＯＮＴＩＮ及びＦＯＸＯ３ａタンパク質の結合を測定する段階を含み、前記測定結果、前記タンパク質間の結合の増加は、自己捕食の増加、結合の減少は、自己捕食の抑制を示すものである、請求項１に記載のＣＡＲＭ１及びＰＯＮＴＩＮによって調節される自己捕食調節剤スクリーニング方法。

【請求項3】

前記ＰＯＮＴＩＮは、配列番号２に基づいて前記ＦＯＸＯ３ａタンパク質の６２４、６２７、６２８、６４０及び６４２残基を介して結合するものである、請求項２に記載のＣＡＲＭ１及びＰＯＮＴＩＮによって調節される自己捕食調節剤スクリーニング方法。

【請求項4】

前記第４の段階に加えて、前記細胞から分離されたヒストン４（Ｈ４）タンパク質のアセチル化の有無を測定する段階を含み、前記測定結果、前記Ｈ４タンパク質のアセチル化増加は、自己捕食の増加、結合の減少は、自己捕食の抑制を示すものである、請求項１～請求項３のいずれかに記載のＣＡＲＭ１及びＰＯＮＴＩＮによって調節される自己捕食調節剤スクリーニング方法。

【請求項5】

前記ヒストン４のアセチル化は、配列番号３の配列に基づいて６、９、１３及び１７番目のリシン残基で発生するものである、請求項４に記載のＣＡＲＭ１及びＰＯＮＴＩＮによって調節される自己捕食調節剤スクリーニング方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は、自己捕食調節方法及びその用途に関する。

【背景技術】

【0002】

自己捕食（Ａｕｔｏｐｈａｇｙ）は、細胞内栄養分が不足した環境で、細胞が自分の不要なタンパク質、老化した小器官などを脂質二重層から構成された自己捕食素体（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖａｃｕｏｌｅ，ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅ）が取り囲んだ後、リソソームと合わせて取り囲まれた内部物質を分解するように誘導するリソソーム－依存方式で細胞内構成物質を変動、調整する過程（Ｌｅｖｉｎｅ ａｎｄ Ｋｌｉｏｎｓｋｙ，（２００４）Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ ６，４６３－３７７）で、欠陥のある巨大タンパク質複合体及び細胞内小器官を除去し、細胞成長、生存及び恒常性に重要な役割を果たす。

【0003】

したがって、自己捕食調節に異常がある場合、変性タンパク質（ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）の蓄積がもたらされ、これにより神経変性疾患が発生することが知られている（Ｋｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，（２００６），Ｎａｔｕｒｅ，４４１，８８０－８８４）。

【0004】

また、自己捕食は、がん細胞で活性化（Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２００９），Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．，８（７），２０３６－２０４５）され、自己捕食阻害剤が抗がん治療剤として作用することが知られている（Ｍａｉｕｒｉ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８，７４１－７５２）。また、がん及び神経変性疾患に加えて、自己捕食は、肝疾患、心臓疾患、筋肉疾患及び膵臓疾患に関連していることが知られている（Ｌｅｖｉｎｅ ａｎｄ Ｋｒｏｅｍｅｒ，（２００８），Ｃｅｌｌ，１３２，２７－４２；Ｆｏｒｔｕｎａｔｏ ａｎｄ Ｋｒｏｅｍｅｒ，（２００９），Ａｕｔｏｐｈａｇｙ，５（６））。

【0005】

したがって、細胞の自己捕食の調節による様々な治療剤の開発に関する研究が進められている。

【0006】

大韓民国登録特許第１０－１５９４１６８号には、ｐ６２のＺＺ領域によって媒介される自己捕食調節方法及びその用途について開示されている。

【0007】

米国公開特許公報第２０１０－０２３３７３０号は、治療のための自己捕食調節に関するもので、細胞に試験物質を処理した後、代謝ストレスを加えてオートファゴソーム（ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅ）の細胞内変化観察を通じて、自己捕食調節剤を選別する方法を開示している。

【0008】

しかし、これらは細胞質で作用する自己捕食タンパク質基盤の技術として、核内における転写過程や後成遺伝学的作用機序に基づく自己捕食調節技術については知られておらず、より根本的な調節のために核内で作用する機序に基づく自己捕食調節剤の開発が必要である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本願は、核内で作用する機序に基づく自己捕食調節方法、それを用いたスクリーニング方法を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0010】

一態様において、本願は、メチルトランスフェラーゼであるＣＡＲＭ１（Ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｒｇｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １）によるＰＯＮＴＩＮタンパク質のメチル化調節を介して自己捕食を調節する物質をスクリーニングする方法を提供する。

【0011】

一具現例において、前記方法は、ブドウ糖欠乏状態でＣＡＲＭ１及び前記メチルトランスフェラーゼＣＡＲＭ１の基質としてＰＯＮＴＩＮタンパク質を発現する細胞を培養する第１の段階、前記細胞にメチルトランスフェラーゼＣＡＲＭ１の前記ＰＯＮＴＩＮに対するメチル化活性を抑制するものと期待される試験物質を処理する第２の段階と、前記ＰＯＮＴＩＮタンパク質を前記細胞から分離する第３の段階、前記分離されたＰＯＮＴＩＮタンパク質の配列番号１に基づいて３３３番及び３３９番目の残基におけるメチル化の程度を測定する第４の段階、及び

【0012】

前記測定結果、試験物質で処理されていない対照群と比較して、試験物質で処理された場合、前記メチル化が増加または減少した場合、これを自己捕食を調節する候補物質として選別する第５の段階を含み、前記メチル化増加は、自己捕食の増加、前記メチル化の減少は、自己捕食の抑制を示す。

【0013】

他の具現例において、前記第１の段階は、ＦＯＸＯ３ａタンパク質をさらに発現し、前記第４の段階の代わりに、またはそれに加えて、前記ＰＯＮＴＩＮ及びＦＯＸＯ３ａタンパク質の結合を測定する段階を含み、前記測定結果、前記タンパク質間の結合の増加は、自己捕食の増加、結合の減少は、自己捕食の抑制を示す。

【0014】

さらに他の具現例において、本願によるＰＯＮＴＩＮは、配列番号２に基づいて前記ＦＯＸＯ３ａタンパク質の６２４、６２７、６２８、６４０及び６４２残基を介してＦＯＸＯ３ａと結合する。

【0015】

さらに他の具現例において、本願に記載の方法は、前記第４の段階に加えて、前記細胞から分離されたヒストン４（Ｈ４）タンパク質のアセチル化の有無を測定する段階を含み、前記測定結果、前記Ｈ４タンパク質のアセチル化の増加は、自己捕食の増加、結合の減少は、自己捕食の抑制を示す。

【0016】

さらに他の具現例において、前記ヒストン４のアセチル化は、配列番号３の配列に基づいて６、９、１３及び１７番目のリシン残基で発生する。

【発明の効果】

【0017】

自己捕食は、栄養分欠乏、代謝ストレス、ウイルス感染、老化などの様々なストレス状況で活性化されて細胞の生存及び恒常性の維持に重要な役割を果たすメカニズムで、自己捕食信号の調節に問題が生じたとき、がんと退行性脳疾患などの様々な疾患と関連が深い。核内で作用するメカニズムに基づく自己捕食調節方法をスクリーニングを通じて知ることができれば、自己捕食の異常に起因する疾患（がん、退行性脳疾患など）の新しい治療標的を発掘する過程で理論的な基盤知識を提供しうる。

【0018】

そこで、本願によるＣＡＲＭ１－ＰＯＮＴＩＮ－ＦＯＸＯ３ａシグナル伝達系を標的とする自己捕食調節方法は、様々なレベルで自己捕食調節問題による様々な疾患の治療剤の開発に有用に使用されてもよい。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】図１は、ＣＡＲＭ１によってＰｏｎｔｉｎのＲ３３３、Ｒ３３９残基がアルギニンメチル化される。（ａ）ＨＥＫ２９３Ｔに発現させたＦｌａｇ－ＣＡＲＭ１をＦｌａｇ－Ｍ２ ａｇａｒｏｓｅを用いてｐｕｌｌｄｏｗｎする。Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ分析を通じてブドウ糖欠乏状態でＣＡＲＭ１と結合するタンパク質であるＰｏｎｔｉｎを究明した。（ｂ）ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙから得られたｅｌｕａｔｅでＣＡＲＭ１の結合蛋白質としてＰｏｎｔｉｎをｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔで示す。（ｃ）ＣＡＲＭ１とＰｏｎｔｉｎ／Ｒｅｐｔｉｎの結合をＧＳＴ ｐｕｌｌｄｏｗｎ実験で示す。（ｄ）Ｈｉｓ－ＰｏｎｔｉｎとＨＡ－ＣＡＲＭ１ ＷＴ／Ｒ１６９Ａ突然変異を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏメチル化実験の結果、（ｅ）ＧＳＴ－Ｐｏｎｔｉｎ ＷＴとＲ３３３／３３９Ａ突然変異をＨＡ－ＣＡＲＭ１を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏメチル化させる。その後、Ｒｍｅ２ａ抗体でｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔした結果（ｆ）Ｐｏｎｔｉｎ ＷＴ，Ｒ３３３Ｋ／Ｒ３３９Ｋ，Ｒ３３３Ａ／Ｒ３３９Ａ突然変異を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏメチル化実験の結果。ＲＩを用いたバージョン（ｇ）Ｐｏｎｔｉｎの構造とＲ３３３、Ｒ３３９残基（ｈ）いくつかの種におけるＰｏｎｔｉｎタンパク質配列と保存されたＲ３３３、Ｒ３３９残基。（ｉ）作製したＰｏｎｔｉｎメチル化抗体をｄｏｔ ｂｌｏｔを通じて確認。使用したペプチドＭｅｔｈｙｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＩＶＩＦＡＳＮＲ（ｍｅ２）ＧＮＣＶＩＲ（ｍｅ２）ＧＴＥＤＩＴＳ；Ｎｏｎ－ｍｅｔｈｙｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＩＶＩＦＡＳＮＲＧＮＣＶＩＲＧＴＥＤＩＴＳ。（ｊ）ＧＳＴ－Ｐｏｎｔｉｎ ＷＴ、Ｒ３３３Ａ、Ｒ３３９Ａ、Ｒ３３３／３３９ＡとＣＡＲＭ１を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏメチル化の進行。その後、Ｒｍｅ２ａ抗体でｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ。（ｋ）ＧＳＴ－Ｐｏｎｔｉｎ ＷＴ、Ｒ３３３Ｋ、Ｒ３３９Ｋ、Ｒ３３３／３３９Ｋで前記と同様の実験結果。Ｒｍｅ２ａ抗体とＰｏｎｔｉｎメチル化抗体の使用。（ｌ）Ｈｉｓ－ＰｏｎｔｉｎとＨＡ－ＣＡＲＭ１ ＷＴ／Ｒ１６９Ａを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏメチル化実験の進行。Ｐｏｎｔｉｎメチル化抗体で確認した結果である。

【図2】図２は、ＣＡＲＭ１によるＰｏｎｔｉｎのメチル化は、ブドウ糖欠乏状態で核内で起こる。（ａ）ブドウ糖欠乏１８時間の状況でＨｅＬａ細胞におけるＣＡＲＭ１とＰｏｎｔｉｎの結合（ｂ）ＣＡＲＭ１ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＥＺＭ２３０２（１００ｎＭ）、ＥＰＺ０２５６５４（１００ｎＭ）を９６時間処理した後、Ｐｏｎｔｉｎのメチル化測定。（ｃ）ＣＡＲＭ１ ＷＴ ＭＥＦとｋｎｏｃｋｏｕｔ ＭＥＦでのブドウ糖欠乏状態におけるＰｏｎｔｉｎメチル化の変化（ｄ）ＣＡＲＭ１ ＫＯ ＭＥＦにＣＡＲＭ１ ＷＴまたはＲ１６９Ａを発現させた後、Ｐｏｎｔｉｎメチル化の変化（ｅ）ＭＥＦの核と細胞質におけるＰｏｎｔｉｎメチル化の変化（ｆ）Ｐｏｎｔｉｎメチル化とＣＡＲＭ１を撮ったｃｏｎｆｏｃａｌイメージ。

【図3】図３は、Ｐｏｎｔｉｎのメチル化が欠乏依存的自己捕食の増加に重要である。（ａ）Ｐｏｎｔｉｎ ｆ／ｆ ＭＥＦにＦｌａｇ－Ｐｏｎｔｉｎ ＷＴ ｏｒ Ｒ３３３Ａ／Ｒ３３９Ａ（ＲＡ）ｓｔａｂｌｅに発現させる方法モデル（ｂ）Ｐｏｎｔｉｎのｐｒｏｔｅｉｎ発現レベル（ｃ）Ｐｏｎｔｉｎ ｆ／ｆ＋Ｆｌａｇ Ｐｏｎｔｉｎ ＷＴ／ＲＫ、ＲＡ ＭＥＦにｃｒｅ処理後、Ｐｏｎｔｉｎメチル化抗体でＩＰ（ｄ）代表的なＧＦＰ－ＬＣ３ ｐｕｎｃｔａイメージ。Ｓｃａｌｅ ｂａｒ ２０ｕｍ、グラフは、ＬＣ３－ｐｏｓｉｔｉｖｅ細胞数を定量化したもの（ｅ）Ｐｏｎｔｉｎ ＷＴ、ＲＡ ＭＥＦでｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ結果。数字は、ＬＣ３－ＩＩ／ｂａｃｔｉｎ比率（ｆ）ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ Ａｌ処理の有無による代表的なＧＦＰ－ＬＣ３ ｐｕｎｃｔａイメージ。（ｇ）Ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ ＡｌとＣｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ処理の有無による自己捕食ｆｌｕｘ測定。数字は、ＬＣ３－ＩＩ／ｂａｃｔｉｎ比率（ｈ）ＣＹＴＯ－ＩＤを用いて染色後の代表的なｃｏｎｆｏｃａｌイメージ（ｉ）ＰｏｎｔｉｎＷＴ、ＲＡ ＭＥＦでｍＣｈｅｒｒｙ－ＧＦＰ－ＬＣ３を用いた代表的なｃｏｎｆｏｃａｌイメージ。ｍＣｈｅｒｒｙとＧＦＰシグナルが一緒にある黄色いｐｕｎｃｔａの場合、リソソームと結合していない自己捕食胞子（ファゴフォア、オートパゴソーム）であり、赤いｐｕｎｃｔａは、酸性化された自己捕食胞子（アムビゾーム、オートリソソーム）である。

【図4】図４は、多くの自己捕食とリソソーム遺伝子がＰｏｎｔｉｎのメチル化によって調節されることをＲＮＡ－ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇを通じて確認した。（ａ）ＲＮＡ－ｓｅｑ分析方式（ｂ）Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇを通じて４１３１個のＤＥＧが生成される（ｃ）遺伝子群１に対するＤＡＶＩＤを用いてＧｅｎｅ ｏｎｔｏｌｏｇｙとＫＥＧＧ ｐａｔｈｗａｙ分析（ｄ）代表的なＧＳＥＡ結果（ｅ）自己捕食過程に分類したＰｏｎｔｉｎメチル化依存的な遺伝子（ｆ）Ｐｏｎｔｉｎメチル化依存的な自己捕食またはリソソーム関連遺伝子のｑＲＴ－ＰＣＲ結果（ｇ）ブドウ糖欠乏状態でのＰｏｎｔｉｎ ＷＴ，ＲＫ，ＲＡでのターゲットタンパク質の発現程度をｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔで確認した結果である。

【図5】図５は、ＰｏｎｔｉｎとＦＯＸＯ３ａがメチル化を介して結合する。（ａ）ＥｎｒｉｃｈＲを用いたＰｏｎｔｉｎメチル化依存的な遺伝子の転写因子の分析（ｂ）Ｐｏｎｔｉｎメチル化ＣｈＩＰ－ｓｅｑ結果を用いたＢｉｎｄｉｎｇ ｍｏｔｉｆ分析（ｃ）Ｐｏｎｔｉｎと様々な自己捕食関連転写因子との結合有無の確認（ｄ）Ｐｏｎｔｉｎ ＷＴ，ＲＫ，ＲＡとＦＯＸＯ３ａの結合有無の確認（ｅ，ｆ）ＣＡＲＭ１ＫＯでＰｏｎｔｉｎとＦＯＸＯ３ａの結合有無の確認（ｇ）ＣＡＲＭ１ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒであるＥＺＭ２３０２とＥＰＺ０２５６５４処理後ＰｏｎｔｉｎとＦＯＸＯ３ａの結合有無の確認（ｈ）ｉｎ ｖｉｔｒｏメチル化実験後に行われたＧＳＴ ｐｕｌｌｄｏｗｎ実験手順及び結果（ｉ）Ｐｏｎｔｉｎメチル化有無ペプチドを用いたｉｍｍｕｎｏｄｏｔ実験結果（ｊ）ＰｏｎｔｉｎとＦＯＸＯ３ａの様々なａｒｏｍａｔｉｃ残基突然変異と結合有無の確認（ｋ）ＦＯＸＯ３ａＷＴとＦ６４０／６４２Ｌ突然変異を用いてＰｏｎｔｉｎとの結合有無を確認した結果である。

【図6】図６は、メチル化されたＰｏｎｔｉｎとＴｉｐ６０がＦＯＸＯ３ａターゲット遺伝子をＨ４ ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎを通じて活性化させる。（ａ）Ｐｏｎｔｉｎ ＷＴ／ＲＫを用いたルシフェラーゼ実験結果（ｂ）ＦＯＸＯ３ａ ＷＴ，Ｆ６４０／６４２Ｌを用いたルシフェラーゼ実験結果（ｃ）Ｐｏｎｔｉｎメチル化ＣｈＩＰ－ｓｅｑ結果を用いてＴＳＳ近くのｐｅａｋと遠くにあるｐｅａｋをＨｅａｔｍａｐで示した結果。（ｄ）Ｍａｐ１ｌｃ３ｂのプロモーターとエンハンサー付近でのＰｏｎｔｉｎメチル化ＣｈＩＰ－ｓｅｑ ｐｅａｋ表示（ｅ）ＣＡＲＭ１ ＷＴ／ＫＯ ＭＥＦにおいてＦＯＸＯ３ａ結合部位でのＣＨＩＰ結果（ｆ）Ｐｏｎｔｉｎの有無によるＦＯＸＯ３ａとＴｉｐ６０の結合（ｇ）Ｐｏｎｔｉｎ ＷＴ／ＲＫとＴｉｐ６０の結合を確認した結果である。

【図7】図７は、Ｐｏｎｔｉｎのメチル化依存的な自己捕食遺伝子の活性においてＴｉｐ６０が重要である。（ａ）Ｔｉｐ６０ ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ有無による自己捕食ｆｌｕｘ程度。数字は、ＬＣ３－ＩＩ／ｂａｃｔｉｎ比率（ｂ）Ｔｉｐ６０ ｋｎｏｃｋｄｏｗｎの有無によるＰｏｎｔｉｎメチル化依存的／非依存的遺伝子のｍＲＮＡ発現の変化（ｃ）Ｔｉｐ６０ ｋｎｏｃｋｄｏｗｎした細胞でＦＯＸＯ３ａ、Ｐｏｎｔｉｎメチル、Ｈ４アセチル化、Ｔｉｐ６０に対するＣｈＩＰ結果（ｄ）Ｔｉｐ６０ ｋｎｏｃｋｄｏｗｎの有無とＰｏｎｔｉｎ ＷＴ／ＲＡによるＰｏｎｔｉｎメチル化依存的遺伝子の発現パターン（ｅ）Ｔｉｐ６０ ｋｎｏｃｋｄｏｗｎの有無とＰｏｎｔｉｎ ＷＴ／ＲＡによるＬＣ３発現の差異。数字は、ＬＣ３－ＩＩ／ｂａｃｔｉｎ比率（ｆ）モデル図である。

【図8】図８は、ＣＡＲＭ１－Ｐｏｎｔｉｎ－ＦＯＸＯ３ａ軸が自己捕食遺伝子のエンハンサーの活性に役割を果たす。（ａ，ｂ）ＦＯＸＯ３ａ、Ｐｏｎｔｉｎメチル、Ｈ４アセチル、Ｔｉｐ６０、Ｈ３Ｒ１７ｍｅ２を用いてＭａｐ１ＬＣ３ｂ、Ｃｔｎｓ、Ａｔｇ１４においてＦＯＸＯ３ａ結合部位（ａ）、ＴＦＥＢ結合部位（ｂ）でＣｈＩＰした結果。Ｐｏｎｔｉｎ ＷＴ、ＲＫで進行。（ｃ）Ｍａｐ１ＬＣ３ｂのプロモーターとエンハンサー部分の結合を確認するために行われた３Ｃ結果。ＰＣＲ後にＤＮＡ ｇｅｌで確認したデータ。右側はそのモデル。（ｄ）Ｐｏｎｔｉｎ ＷＴ／ＲＡ ＭＥＦで自己捕食とリソソーム関連遺伝子のｅＲＮＡをｑＲＴ－ＰＣＲで確認した結果である。

【図9】図９は、本願で究明された機序を示すモデル図である。

【発明を実施するための形態】

【0020】

本願では、ＣＡＲＭ１－＞ＰＯＮＴＩＮ－＞ＦＯＸＯ３につながる経路がブドウ糖欠乏
状態で細胞の自己捕食の調節に重要な機序であることを究明した。具体的には、ＣＡＲＭ１は、ＰＯＮＴＩＮをメチル化し、メチル化されたＰＯＮＴＩＮ（Ｔｉｐ６０と結合）は、ＦＯＸＯ３と結合して複合体を形成し、これらの複合体は、自己捕食に関与する遺伝子から発見されるエンハンサーに結合してこれら遺伝子の転写を調節する方式で自己捕食の調節に関与し、自己捕食が増加する。

【0021】

細胞において栄養分代謝の恒常性の維持は、細胞の健康と機能にとって重要である。自己捕食は、栄養分不足状態で代表的な防御機序の一つで、栄養分が不足すると自己捕食を通じて栄養分が自ら供給されて生存に役立つ。

【0022】

本願において自己捕食（ａｕｔｏｐｈａｇｙまたはａｕｔｏｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）とは、リソソームを用いて細胞内に不要または変性されたタンパク質を含む様々な細胞構成成分を除去する異化作用をいう。自己捕食の調節に異常がある場合、変性タンパク質（ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）の蓄積がもたらされ、これにより神経変性疾患が発生することが知られている（Ｋｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，（２００６），Ｎａｔｕｒｅ，４４１， ８８０－８８４）。また、自己捕食は、がん細胞において活性化（Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２００９）、ＭｏI．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．，８（７），２０３６－２０４５）され、自己捕食阻害剤が抗がん治療剤として作用することが知られている（Ｍａｉｕｒｉ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８，７４１－７５２）。また、がん及び神経変性疾患に加えて、自己捕食は、肝疾患、心臓疾患、筋肉疾患及び膵臓疾患に関連していることが知られている（Ｌｅｖｉｎｅ ａｎｄ Ｋｒｏｅｍｅｒ，（２００８），Ｃｅｌｌ，１３２，２７－４２；Ｆｏｒｔｕｎａｔｏ ａｎｄ Ｋｒｏｅｍｅｒ，（２００９），Ａｕｔｏｐｈａｇｙ，５（６））。したがって、本願に開示された技術を用いた自己捕食調節剤、調節方法は、自己捕食調節異常による様々な疾患の治療または予防に効果的に使用されてもよい。

【0023】

そこで、一態様において本願は、メチルトランスフェラーゼであるＣＡＲＭ１（Ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｒｇｉｎｅ ｍｅｔｈｙIｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １）によるＰＯＮＴＩＮタンパク質のメチル化調節を介して自己捕食を調節する物質をスクリーニングする方法に関する。

【0024】

一具現例において、前記方法は、ブドウ糖欠乏状態でＣＡＲＭ１及び前記メチルトランスフェラーゼＣＡＲＭ１の基質としてＰＯＮＴＩＮタンパク質を発現する細胞を培養する第１の段階、前記細胞にメチルトランスフェラーゼＣＡＲＭ１の前記ＰＯＮＴＩＮに対するメチル化活性を抑制するものと期待される試験物質を処理する第２の段階、前記ＰＯＮＴＩＮタンパク質を前記細胞から分離する第３の段階、前記分離されたＰＯＮＴＩＮタンパク質の配列番号１に基づいて３３３番目及び３３９番目の残基におけるメチル化の程度を測定する第４の段階、及び前記測定結果、試験物質で処理されていない対照群と比較して、試験物質で処理された場合、前記メチル化が増加または減少した場合、これを自己捕食を調節する候補物質として選別する第５の段階を含み、前記メチル化の増加は自己捕食増加、前記メチル化の減少は自己捕食抑制を示す。

【0025】

本願において調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）とは、特定の生物学的機能の活性化、刺激または上向き調節、または低下または下向き調節、またはその両方を含み、インビトロ状態での調節、インビボ状態での調節、エックスビボ状態での調節をすべて含む。

【0026】

本願による方法に使用されるＣＡＲＭ１（ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １）またはＰＲＭＴ４（ｐｒｏｔｅｉｎ ａｒｇｉｎｉｎｅ Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ４）は、αヘリックス及びβシートから構成されるＳ－アデノシル－Ｌ－メチオニンからアル
ギニン残基の側鎖窒素のメチル化を触媒する酵素であり、哺乳動物においてＣＡＲＭ１の遺伝子及びタンパク質配列は公知であり、例えば、ヒト遺伝子及びタンパク質配列は、Ｇｅｎｅ ＩＤ：１０４９８、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ：ＮＰ＿９５４５９２．１として公知されている。本願による方法では、前記のようなメチル化酵素機能を有する限り、様々な由来、及び各由来のタンパク質配列及びそれと実質的に同じ配列を有する全長または断片が使用されてもよい。

【0027】

本願による前記方法においてＣＡＲＭ１の基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）は、ＰＯＮＴＩＮである。

【0028】

本願において、ＰＯＮＴＩＮは、ＡＴＰａｓｅとＤＮＡヘリカーゼ機能を有するクロマチンリモデリング因子（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）であり、例えば、ヒト遺伝子及びタンパク質配列は、それぞれＧｅｎｅ ＩＤ：８６０７、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ：ＮＰ＿００３６９８．１として公知されている。本願による方法では、前記のようなメチル化酵素機能を有する限り、様々な由来、及び各由来のタンパク質配列、及びそれと実質的に同じ配列を有する全長または断片が使用されてもよい。

【0029】

ＰＯＮＴＩＮは、ＣＡＲＭ１タンパク質によって配列番号１の配列に基づいて３３３番及び３３９番目のアルギニン残基がメチル化される。

【0030】

メチル化されたＰＯＮＴＩＮは、次の段階でＦＯＸＯ３ａと結合する。

【0031】

メチル化されたＰＯＮＴＩＮは、ＦＯＸＯ３ａの６２４、６２７、６２８、６４０及び６４２番目の残基（配列番号２の配列基準）と接触して結合する。

【0032】

本願においてＦＯＸＯ３ａは、Ｆｏｒｋｈｅａｄ ｂｏｘ ｐｒｏｔｅｉｎ３ａの略字であり、細胞成長、増殖、分化、寿命と恒常性の維持に関与する転写調節因子である。その遺伝子及びタンパク質配列は、それぞれＧｅｎｅ ＩＤ：２３０９、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ：ＮＰ＿００１４４６．１として公知されている。本願による方法では、前記のようなメチル化酵素機能を有する限り、様々な由来、及び各由来のタンパク質配列及びそれと実質的に同じ配列を有する全長または断片が使用されてもよい。

【0033】

本願では、特にＣＡＲＭ１によるＰＯＮＴＩＮメチル化がＦＯＸＯ３ａの結合を誘導し、最終的にＣＡＲＭ１－Ｐｏｎｔｉｎ－ＦＯＸＯ３ａ軸がＨ４アセチル化を介してエンハンサーで作用し、自己捕食関連遺伝子のｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒとして作動できることを究明した。

【0034】

そこで、本願による方法は、ヒストン４のアセチル化をさらに測定しうる。ヒストンは、染色質（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ）を構成する中心タンパク質で、ＤＮＡ鎖を巻く糸巻きの役割をしてＤＮＡを凝縮し、遺伝子発現に重要な役割を果たすことが知られている。ヒストンタンパク質にはＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３及びＨ４などが存在し、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３及びＨ４がそれぞれ２つずつ集まって８量体であるコアヒストンを形成し、Ｈ１は連結体である。コアヒストンは、非常によく保存された配列を有し、様々な変異体も見出され、そのような配列は、公開されたヒストンＤＢ２．０を参照しうる。（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ＨｉｓｔｏｎｅＤＢ２．０／ｉｎｄｅｘ．ｆｃｇｉ／ｂｒｏｗｓｅ／）。本願で究明された機序に関与するヒストンＨ４の配列（Ｇｅｎｅ ＩＤ：８３５９、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ：ＮＰ＿００３５２９．１）においてＨ４の６、９、１３及び１７番目のリシン残基（配列番号３の配列を基準）をアセチル化させる。

【0035】

実質的に同一とは、タンパク質及び核酸配列レベルにすべて適用され、参照または基準となる配列と比較して、塩基またはアミノ酸残基に１つ以上の置換、欠損、または付加があり得るが、全体的に見ると機能に差がないか、または機能を悪くしないレベルの機能を持つことを意味する。相同性とは、対象となる配列を最大限対応するようにアラインし、当業界で通常用いられるアルゴリズムを用いてアラインされた配列を分析した場合に、最低６１％の相同性、より好ましくは、７０％の相同性、より好ましくは、８０％の相同性、最も好ましくは、９０％以上、特に９５％以上の相同性を示す配列を意味する。配列比較のためのアライメント方法は、当業界に公知されている。例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．（１９８１）２：４８２；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．（１９７０）４８：４４３；Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８８）２４：３０７－３１；Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ（１９８８）７３：２３７－４４；Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）５：１５１－３；Ｃｏｒｐｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８８）１６：１０８８１－９０；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐ．Ａｐｐｌ．ＢｉｏＳｃｉ．（１９９２）８：１５５－６５及びＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９４）２４：３０７－３１に開示されている。ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ ＬｏｃａＩ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９０）２１５：４０３－１０）は、ＮＢＣＩなどでアクセス可能であり、ｂｌａｓｔ，ｂｌａｓｔｐ，ｂｌａｓｍ，ｂｌａｓｔｘ，ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘなどの配列分析プログラムと連動して利用してもよい。ＢＬＳＡＴは、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／でアクセス可能であり、このプログラムを用いた配列相同性比較方法は、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ＿ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌで確認しうる。

【0036】

一具現例において、本願による方法は、前記タンパク質を発現する細胞を用いて行われてもよい。細胞を用いて行われる場合、タンパク質はそれを発現する細胞として提供しうる。

【0037】

本願によるＰＯＮＴＩＮタンパク質のメチル化の程度も当業界に公知の方法を用いて行われてもよく、例えば、本願の実施例に記載された方法を参考してもよい。

【0038】

本願の方法において使用される試験物質は、ＣＡＲＭ１－ＰＯＮＴＩＮ－ＦＯＸＯ３ａシグナル伝達システムに作用してブドウ糖が欠乏した状態でＰＯＮＴＩＮメチル化を調節することが期待される物質で、低分子量化合物、高分子量化合物、化合物の混合物（例えば、天然抽出物または細胞または組織培養物）、またはバイオ医薬品（例えば、タンパク質、抗体、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ、アプタマー、ＲＮＡｚｙｍｅ及びＤＮＡｚｙｍｅ）、または糖及び脂質などを含むが、これに限定されるものではない。

【0039】

本願による一具現例において、低分子化合物が試験物質として使用されてもよい。前記試験物質は、合成または天然化合物のライブラリーから得られており、そのような化合物のライブラリーを得る方法は、当業界に公知されている。合成化合物ライブラリーは、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（ＵＫ），Ｃｏｍｇｅｎｅｘ（ＵＳＡ），Ｂｒａｎｄｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（ＵＳＡ），Ｍｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ（ＵＳＡ）及びＳｉｇｍａ－ＡＩｄｒｉｃｈ（ＵＳＡ）から購入可能であり、天然化合物のライブラリーは、Ｐａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＵＳＡ）及びＭｙｃｏＳｅａｒｃｈ（ＵＳＡ）から購入可能である。試験物質は、当業界に公知の様々な組合せライブラリー法によって得ることができ、例えば、生物学的ライブラリー、空間アドレッシブルパラレルパラレル固相または液相ライブラリー（ｓｐａｔｉａｌｌｙ ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｏｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｐｈａｓｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）、デコンボリューションが要求される合成ライブラリー法、「１－ビーズ１－化合物」ライブラリー法、及び親和性クロマトグラフィー選別を用いる合成ライブラリー法によって得られる。分子ライブラリーの合成方法は、ＤｅＷｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０，６９０９、１９９３；Ｅｒｂ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１，１１４２２，１９９４；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７，２６７８，１９９４；Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１，１３０３，１９９３；Ｃａｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３，２０５９，１９９４；Ｃａｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３，２０６１；Ｇａｌｌｏｐ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７，１２３３，１９９４などに開示されている。例えば、薬物のスクリーニング目的のために化合物は、低分子量の治療効果を有することが使用されてもよい。例えば、重量が４００Ｄａ、６００Ｄａまたは８００Ｄａなどの約１０００Ｄａ内外の化合物が使用されてもよい。目的に応じてそのような化合物は、化合物ライブラリーの一部を構成してもよく、ライブラリーを構成する化合物の数字も数十個から数百万個まで多様である。そのような化合物ライブラリーは、ペプチド、ペプトイド及びその他の環状または線状のオリゴマー化合物、及び鋳型に基づく低分子化合物、例えば、ベンゾジアゼピン、ヒダントイン、バイアリル、カルボサイクル及びポリサイクル化合物（例えば、ナフタレン、フェノチアジン、アクリジン、ステロイドなど）、カーボハイドレート及びアミノ酸誘導体、ジヒドロピリジン、ベンズヒドリル及びヘテロサイクル（例えば、トリアジン、インドール、チアゾリジンなど）を含んでもよいが、これは単なる例示的なものであり、これに限定されるものではない。

【0040】

また、例えば、バイオロジックスがスクリーニングに使用されてもよい。バイオロジックスは、細胞またはバイオ分子を指すもので、バイオ分子とは、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質または生体内及び生体外で細胞システムなどを用いて産生された物質を指すものである。バイオ分子を単独で、または他のバイオ分子または細胞と組み合わせて提供されてもよい。バイオ分子は、例えば、ポリヌクレオチド、ペプチド、抗体、またはその他の血漿から発見されるタンパク質または生物学的有機物質を含むものである。

【0041】

本願で使用されるタンパク質は、当業界に公知の方法を使用して製造されてもよい。特に遺伝子組換え技術を用いるものである。例えば、前記タンパク質をコーディングする相応の遺伝子を含むプラスミドを原核または真核細胞、例えば昆虫細胞、哺乳類細胞に伝達して過発現させた後、精製して使用してもよい。前記プラスミドは、例えば、本願の例示的な具現例において使用したものと同じ動物細胞株にトランスファクションした後、発現されたタンパク質を精製して使用してもよいが、これに制限されるものではない。この場合、タンパク質は、検出の便宜のために様々な標識物質、例えば、ビオチン、蛍光物質、アセチル化、放射線同位体などの公知の方法または市販のタンパク質標識キットを使用して標識されてもよく、標識された物質に適した検出機器を使用して検出されてもよい。

【0042】

またはスクリーニングタンパク質を暗号化するＤＮＡまたはＲＮＡ配列を適当な宿主細胞で発現させてその細胞破砕物を作製するか、または前記スクリーニングタンパク質のｍＲＮＡを試験管内で翻訳した後、当業界に公知のタンパク質分離方法によりスクリーニングタンパク質を精製してもよい。通常、細胞残渣（Ｃｅｌｌ ｄｅｂｒｉｓ）などを除去するために、前記細胞破砕物または試験管内で翻訳した結果物を遠心分離した後、沈殿、透析、各種カラムクロマトグラフィーなどを適用する。イオン交換クロマトグラフィー、ゲル浸透クロマトグラフィー、ＨＰｌＣ、逆相－ＨＰｌＣ、プレップ用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、親和性カラムなどはカラムクロマトグラフィーの例である。親和性カラムは、例えば、抗スクリーニングタンパク質抗体を用いて作製してもよい。

【0043】

本願による方法においてメチル化測定結果、試験物質で処理されていない対照群と比較して、試験物質で処理された場合、ＰＯＮＴＩＮ ３３３及び３３９番目の残基のメチル化が増加または減少した場合、これを自己捕食を調節する候補物質として選別し、これを様々な疾患の治療剤として開発しうる。
実験結果、試験物質と接触していない対照群と比較して、試験物質の存在下で自己捕食を調節する物質を候補物質として選別する。対照群と比較して約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、または約１００％以上、またはこれ以上を増加または減少したものを候補物質として選別してもよい。

【0044】

本願による方法では、ＰＯＮＴＩＮとＦＯＸＯ３ａの結合を検出する段階を追加して、またはＰＯＮＴＩＮのメチル化の代わりに含んでもよい。タンパク質－タンパク質相互作用は、当業界で公知の様々な方法を用いて測定されてもよい。例えば、細胞内タンパク質の結合／相互作用を確認するイーストツーハイブリッド法、コンポカル顕微鏡法、共同免疫沈降法、表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）及びスペクトロスコーピ法を含んでもよいが、これに制限されるものではなく、これらの方法に関する比較及び詳細な実験法に関するさらなる参考文献は、Ｂｅｒｇｇａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（２００７）「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」，ＰＲＯＴＥＯＭＩＣＳ Ｖｏｌ７：ｐｐ２８３３－２８４２に記載されているものを参考してもよい。

【0045】

本願による様々なスクリーニング方法において使用されるタンパク質の量、細胞の種類及び試験物質の量及び種類などは、使用する具体的な実験方法及び試験物質の種類によって異なり、当業者であれば適切な量を選択できるだろう。

【0046】

本願による様々なスクリーニング方法によってスクリーニングされてもよい自己捕食調節剤は、自己捕食に異常がある場合に変性されたタンパク質の蓄積のために、様々な疾患または自己捕食の過剰活性に関連した疾患の治療または予防に使用されてもよい。

【0047】

例えば、これに制限されるものではないが、神経退行性疾患を含む神経変性疾患、肝疾患、自己免疫疾患、心血管疾患、代謝疾患、過誤腫症候群、遺伝性筋肉疾患、筋疾患またはがん（Ｈａｒａ ｔ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ ２００６，Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ ｎ
ｅｔ ａｌ Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．２００７，Ｔａｋａｍｕｒａ ａ ｅｔ ａｌ
Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．２０１１，Ｒａｔｕｏ ｐ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２０１０などを参照）などの予防または治療に使用できる物質である。例えば、神経変性疾患は、例えば、副腎白質ジストロフィー（Ａｄｒｅｎａｌ Ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、アルコール中毒、アレキサンダー病（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、アルパー病（Ａｌｐｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症 （ａｔａｘｉａｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ）、バトン病（Ｂａｔｔｅｎ ｄｉｓｅａｓｅ）、牛海綿状脳症（ｂｏｖｉｎｅ ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）、カナバン病（Ｃａｎａｖａｎ ｄｉｓｅａｓｅ）、脳性麻痺、コケイン症候群（ｃｏｃｋａｙｎｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、皮質基底退化（ｃｏｒｔｉｃｏｂａｓａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、クロイツフェルト・ヤコブ病（Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ－Ｊａｋｏｂ ｄｉｓｅａｓｅ）、致死性家族性不眠症（ｆａｍｉｌｉａｌ ｆａｔａｌ ｉｎｓｏｍｎｉａ）、前頭葉側頭葉変性症（ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｌｏｂａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、ＨＩＶ関連認知症、ケネディ病（Ｋｅｎｎｅｄｙ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、クラベ病（Ｋｒａｂｂｅ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、レビー小体型認知症（Ｌｅｗｙ ｂｏｄｙ ｄｅｍｅｎｔｉａ）、神経ボレリア症（ｎｅｕｒｏｂｏｒｒｅｌｉｏｓｉｓ）、マチャド・ジョセフ病（Ｍａｃｈａｄｏ－Ｊｏｓｅｐｈ ｄｉｓｅａｓｅ）、多系統萎縮症（ｍｕIｔｉｐｌｅ ｓｙｓｔｅｍ ａｔｒｏｐｈｙ）、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、睡眠発作（ｎａｒｃｏｌｅｐｓｙ）、ニーマンピック病（Ｎｉｅｍａｎｎ Ｐｉｃｋ ｄｉｓｅａｓｅ）、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、ペリツェウス・メルツバッハー病（Ｐｅｌｉｚａｅｕｓ－Ｍｅｒｚｂａｃｈｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ）、ピック病（Ｐｉｃｋ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、原発性側索硬化症（ｐｒｉｍａｒｙ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、プリオン病（ｐｒｉｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ）、進行性核上性麻痺（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｓｕｐｒａｎｕｃｌｅａｒ ｐａｌｓｙ）、レフサム病（Ｒｅｆｓｕｍ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、サンドホフ病（Ｓａｎｄｈｏｆｆ ｄｉｓｅａｓｅ）、シルダー病（Ｓｃｈｉｌｄｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、有毒性貧血続発性の脊髄の亜急性連合変性（ｓｕｂａｃｕｔｅ
ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｔｏ ｐｅｒｎｉｃｉｏｕｓ ａｎａｅｍｉａ）脊髄性筋萎縮症（ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）、スピールマイヤー－フォークト－ショーグレン－バットン病（Ｓｐｉｅｌｍｅｙｅｒ－Ｖｏｇｔ－Ｓｊｏｇｒｅｎ－Ｂａｔｔｅｎ ｄｉｓｅａｓｅ）、脊髄小脳変性症（ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ａｔａｘｉａ）、スティール・リチャードソン・オルゼウスキー病（Ｓｔｅｅｌｅ－Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ－Ｏｌｓｚｅｗｓｋｉ ｄｉｓｅａｓｅ）、脊髄梅毒（Ｔａｂｅｓ ｄｏｒｓａｌｉｓ）、中毒性脳症（ｔｏｘｉｃ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）を含んでもよいが、これに制限されるものではない。本願による一具現例において、タンパク質変性に関連した疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、脊髄小脳変性症または球脊髄性筋萎縮症（ｓｐｉｎｏｂｕｌｂａｒ ｍｕｓｃｌｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）を含む。

【0048】

さらに他の具現例において、本願による方法が使用されてもよい自己免疫疾患は、アロペシア・グレアタ（ａｌｏｐｅｃｉａ ｇｒｅａｔａ）、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫アジソン疾患、副腎の自己免疫疾患、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎及び精巣炎、自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、腹腔スプルー皮膚炎（ｃｅｌｉａｃ ｓｐｒｕｅ－ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、慢性疲労免疫異常症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、Ｃｈｕｒｇ－Ｓｔｒａｕｓｓ症候群、瘢痕性類天疱瘡、ＣＲＥＳＴ症候群、寒冷凝集素症、クローン病、円板状皮疹、混合性本態性クリオグロブリン血症、線維筋痛－繊維筋炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑症、ＩｇＡ神経炎、燃焼性関節炎、扁平苔腺、紅斑性ループス、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、タイプＩまたは免疫－媒介糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発軟骨炎、多腺性自己免疫症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎と皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、スティッフパーソン症候群、全身性紅斑性ループス、紅斑性ループス、高安動脈炎、一時的動脈炎、巨細胞動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、白斑症及びウェゲナー肉芽腫症からなる群から選ばれる自己免疫疾患である。

【0049】

さらに他の具現例において、本願による方法が使用されてもよい心血管疾患は、管動脈性心臟病、心筋症、高血圧性心疾患、心不全、肺性心、心律動障害、心臓内膜炎、炎症性心肥大症、心筋炎、心臓弁膜症、脳血管障害、下肢動脈疾患、先天性心疾患及び心臓リウマチからなる群から選ばれる心血管疾患である。

【0050】

さらに他の具現例において、本願による方法が使用されてもよい代謝疾患は、肥満、糖
尿病、異常脂肪血症、脂肪肝、高血圧、動脈硬化、高脂血症及び高インスリン血症からなる群から選ばれる代謝疾患である。

【0051】

さらに他の具現例において、本願による方法が使用されてもよいがんは、下垂体腺腫、神経膠腫、脳腫瘍、上咽頭がん、喉頭がん、胸腺腫、中皮腫、乳がん、肺がん、胃がん、食道がん、大腸がん、肝がん、膵臓がん、膵内分泌腫瘍、胆嚢がん、陰茎がん、尿管がん、腎細胞がん、前立腺がん、膀胱がん、非ホジキン性リンパ腫、骨髄異形成症からなる群から選ばれるがんである。

【0052】

以下、本発明の理解を助けるために実施例を提示する。しかし、以下の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものであり、本発明が以下の実施例に限定されるものではない。

【実施例】

【0053】

実験方法及び実験材料

【0054】

ＰｏｎｔｉｎのＲ３３３、Ｒ３３９を認知する抗体は、該当ペプチドを用いてＰｅｐｔｒｏｎで作製した。

【0055】

Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｎｔｉｎ^ｆ／ｆＭＥＦｓ及び細胞培養

【0056】

Ｐｏｎｔｉｎ ｆ／ｆ ＭＥＦは、Ｐｏｎｔｉｎ ＫＯマウスを用いて３Ｔ３方式で作製した。

【0057】

Ｐｏｎｔｉｎ ｆ／ｆ ＭＥＦにＦｌａｇ－ｔａｇｇｅｄ Ｐｏｎｔｉｎ ＷＴ、ＲＫ、ＲＡをレンチウイルスで感染させた後、ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎを用いて１週間ｓｅｌｅｃｔｉｏｎした。

【0058】

親和度精製によるＣＡＲＭ１結合タンパク質の究明

【0059】

ＨＥＫ２９３ＴにＦｌａｇ－ｔａｇｇｅｄ ＣＡＲＭ１を発現させる。Ｆｌａｇ Ｍ２
ａｆｆｉｎｉｔｙ ｇｅｌ（１００ｕ１ ｏｆ ５０％ ｓｌｕｒｒｙ）（ｓｉｇｍａ）でＣＡＲＭ１を引いた後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．９），１５％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏ１（ＤＴＴ），０．２ｍＭ ＰＭＳＦ，０．０５％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０，ａｎｄ １５０ｍＭ ＫＣ１でｗａｓｈして非特異的結合を低下させる。その後、Ｆｌａｇペプチド（０．２ｍｇ／ｍ１）を用いてｂｅａｄからＣＡＲＭ１及び複合体を低下させる。その後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを介してジェルをつけた後、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを通じてタンパク質情報を分析する。

【0060】

Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ＧＳＴ ｐｕｌｌ－ｄｏｗｎ ａｓｓａｙ

【0061】

ＧＳＴ－ｔａｇｇｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔは、Ｒｏｓｅｔｔａ Ｅ．ｃｏＩｉにｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎされた後、タンパク質の発現に用いる。その後、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｂｅａｄで抽出する。Ｈｉｓ－ｔａｇｇｅｄ Ｐｏｎｔｉｎの場合、Ｍｌ５［ｐＲＥＰ４］Ｅ．ｃｏＩｉで育てた後、Ｎｉ－ＮＴＡ ｂｅａｄを介して抽出する。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓ１ａｔｅｄタンパク質は、ＴＮＴ Ｑｕｉｃｋ ＣｏｕｐＩｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／ＴｒａｎｓＩａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の説明書に従って抽出する。抽出したタンパク質とｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓＩａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎは、ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（１２５ｍＭ ＮａＣ
ｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ［ｐＨ７．５］、１０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．１％ ＮＰ４０、ａｎｄ ０．５ｍＭ ＤＴＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）でＧＳＴ ｐｕｌｌｄｏｗｎ実験に用いる。その後、４回のｗａｓｈ後、ＳＤＳ ｓａｍｐＩｅ ｂｕｆｆｅｒ処理後にｇｅｌをつける。

【0062】

Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ

【0063】

Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ実験は、ビーズと結合されたＨｉｓ－ＰｏｎｔｉｎまたはＧＳＴ－Ｐｏｎｔｉｎとともに購入したｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＣＡＲＭｌ（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ，３１３４７）タンパク質またはＨＡ－ＣＡＲＭ１ ＷＴ／Ｒ１６９Ａ突然変異タンパク質とともに行う。反応は、ＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒで３０度３時間行われ、５Ｘ ｓａｍｐｌｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを入れて５分間煮沸して終結する。ＳＤＳ－ＰＡＧＥに取り付けられた後、ＰＶＤＦ ｍｅｍｂｒａｎｅにｓｅｍｉ－ｄｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔｔｅｒを通じて移す。Ｒｍｅ２ａ ｏｒ Ｐｏｎｔｉｎ－ｍｅ抗体を通じてｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔを行う。

【0064】

Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｕｓｉｎｇ ３Ｈ－ＳＡＭ

【0065】

ＧＳＴ－Ｐｏｎｔｉｎとともに購入したｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＣＡＲＭ１（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ，３１３４７）タンパク質をｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣ１ ｐＨ ８．５， ２０ｍＭ ＫＣ１，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，ａｎｄ ２５０ｍＭ ｓｕｃｒｏｓｅ）ｗｉｔｈ １ μＣｉ ｏｆ ３Ｈ－ＳＡＭに入れた後、３０℃で一日置く。Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ除去後、２Ｘ ｓａｍｐｌｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを入れた後、１０分間沸騰後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに取り付けられた後、フィルムを用いて観察する。

【0066】

Ｉｍｍｕｎｏｄｏｔ ｂｌｏｔ ａｓｓａｙ

【0067】

Ｎｏｎ－ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ Ｐｏｎｔｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅとｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ Ｐｏｎｔｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅをｍｅｍｂｒａｎｅに点でつける。十分に乾かした後、ＰＢＳＴに溶かした５％ ｍｉｌｋで１時間ｂｌｏｃｋｉｎｇを行う。ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＧＳＴ－ＦＯＸＯ３ａ ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１μｇ／ｍ１）を入れたｐｒｏｔｅｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ ＮａＣｌ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ７．６］，１０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ，０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０，２％ ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ ｐｏｗｄｅｒ ａｎｄ １ｍＭ ＤＴＴ）を用いてｍｅｍｂｒａｎｅに結合させる。その後、ＧＳＴ ａｎｔｉｂｏｄｙを用いたｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔを行う。

【0068】

Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ

【0069】

３Ｘ Ｆｌａｇ－Ｐｏｎｔｉｎ ＷＴ、ＲＫ ａｎｄ ＲＡはｐＬＶＸ ｖｅｃｔｏｒ、ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｓｈＲＮＡ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓは、ｐＬＫＯ．１ ｖｅｃｔｏｒにクローニングした。Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓは、ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ（ｐｓＰＡＸ２ ａｎｄ ＶＳＶ－Ｇ）とともにＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、４８時間後に０．４５μｍ ｆｉｌｔｅｒを通じて培養液を集める。ｓｈＲＮＡシーケンス情報Ｔｉｐ６０；
５’－ＧＣＡＡＣＧＣＣＡＣＴＴＧＡＣＣＡＡＡＴＧ－３’，Ｐｏｎｔｉｎ；
５’－ＧＴＧＧＣＧＴＣＡＴＡＧＴＡＧＡＡＴＴＡ Ａ－３’，ＦＯＸＯ１／３／４；
５’－ＣＴＧＴＧＴＧＣＣＣＴＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡ－３’。

【0070】

Ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ ｖａｃｕｏｌｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ

【0071】

Ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ ｖａｃｕｏｌｅｓは、Ｃｙｔｏ－ＩＤ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＥＮＺ－５１０３１）を用いて染色した。細胞は、ｃｏｖｅｒｓｌｉｐｓに２ｘ１０＾４個とともにＣｙｔｏ－ＩＤ ｇｒｅｅｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（１：５００）とＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（１：１０００）を混合したメディアを入れる。３７℃で３０ｍｉｎ置いた後、ＰＢＳでｗａｓｈ後、２％ ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ／ＰＢＳを入れた後、常温で１０分間固定。その後、ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｚｅｉｓｓ，ＬＳＭ７００）でイメージ撮影。

【0072】

Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ

【0073】

ＭＥＦｓに６Ｘ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ＦＯＸＯ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅＩｅｍｅｎｔ（６ｘ ＤＢＥ－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）とともにｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎして行う。Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙは、ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ後、３６時間後に測定し、ｂｅｔａ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ発現によって定量した。

【0074】

ＲＮＡ－ｓｅｑ ａｎａｌｙｓｉｓ

【0075】

ＲＮＡ－ｓｅｑ ｌｉｂｒａｒｉｅｓは、ＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡ ｓａｍｐｌｅ ｐｒｅｐ ｋｉｔ ｖ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）方式で作製した。ＲＮＡ－ｓｅｑ ｌｉｂｒａｒｉｅｓは、ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ方式でＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ４０００（Ｍａｃｒｏｇｅｎ）を介してシーケンシングされる。ＲＮＡ－ｓｅｑ ｄａｔａは、Ｔｏｐｈａｔ ｐａｃｋａｇｅを介してｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ（ｍｍ９）にｍａｐｐｉｎｇする。Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ａｎａｌｙｓｉｓは、ＥｄｇｅＲ ｐａｃｋａｇｅを通じて分析される。Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓは、ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ（ＦＤＲ）ｃｕｔ－ｏｆｆ １ｘ１０＾－５。Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ分析は、あらゆる状況における遺伝子発現数値とする。Ｗａｒｄ’ｓ ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ ｆｏｒ ｇｅｎｅｓ ｗｉｔｈ １－（ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）が ｄｉｓｔａｎｃｅ ｍｅａｓｕｒｅに使用される。 Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｈｅａｔｍａｐは、ｚ－ｓｃｏｒを基準として描く。Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＧＯＢＰｓ ａｎｄ ＫＥＧＧ ｐａｔｈｗａｙｓは、ＤＡＶＩＤ ｓｏｆｔｗａｒｅを介して行われ、Ｇｅｎｅ ｓｅｔ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓは、ＧＳＥＡ （ｖｅｒｓｉｏｎ ３．０）ｓｏｆｔｗａｒｅを用いる。Ｔｈｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｌａｂｅｌ ｆｏｒ ＧＳＥＡ ｗａｓ ｓｅｔ ＷＴ＿ｎｏｒｍａｌ：ＷＴ＿Ｇｌｃ ｓｔａｒｖ．：ＲＡ＿ｎｏｒｍａｌ：ＲＡ＿Ｇ１ｃ ｓｔａｒｖ．＝１：３：１：１．７，ｔｈｅｎ Ｐｅａｒｓｏｎ ｃｏｒｒｅ１ａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｗａｓ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｐｅｒ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｒａｎｋｉｎｇ．Ｇｅｎｅ ｓｅｔｓは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＭＳｉｇＤＢ）ｖ６．２から得られる。

【0076】

ＣｈＩＰ－ｓｅｑ ａｎａｌｙｓｉｓ

【0077】

ＣｈＩＰ－ｓｅｑ ｌｉｂｒａｒｉｅｓは、ＴｒｕＳｅｑ ＤＮＡ Ｓａｍｐｌｅ ｐｒｅｐ Ｋｉｔ方式で作製した。ＣｈＩＰ－ｓｅｑ ｌｉｂｒａｒｉｅｓは、ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ方式でＩｌｌｕｍｉｎａ ｐＩａｔｆｏｒｍ（ＭＡＣＲＯＧＥＮ）でシーケンスされる。ＣｈＩＰ－ｓｅｑ ｒｅａｄｓは、ｍｏｕｓｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｏｍｅ（ＧＲＣｍ３８／ｍｍ１０）にＢｏｗｔｉｅ２を用いてｍａｐｐｉｎｇする。ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ Ｐｏｎｔｉｎ ｐｅａｋの場合、Ｈｏｍｅｒ（ｖ４．７．２）を介し
て作製する。我々が作製したＰｏｎｔｉｎメチル化抗体を使用した。

【0078】

実施例１．ＰｏｎｔｉｎのＲ３３３、Ｒ３３９アミノ酸残基がＣＡＲＭ１により３３３と３３９残基のアルギニンがメチル化されることを究明

【0079】

ブドウ糖欠乏状態で自己捕食関連転写調節を行うことが知られているＣＡＲＭ１の結合パートナーを探すために、ｔａｎｄｅｍ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎを介してＣＡＲＭ１と結合するタンパク質を分離した。興味深いことに、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを通じてＰｏｎｔｉｎというクロマチン再配置因子が抽出された（図１ａ）。ＰｏｎｔｉｎとＣＡＲＭ１が実際に結合するかどうかを確認するため、前記で抽出したＣＡＲＭ１複合体ｅｌｕａｔｅにＰｏｎｔｉｎを認知する抗体で確認した（図１ｂ）。ＰｏｎｔｉｎとＣＡＲＭ１が直接的に結合するかどうがを確認するために、Ｇｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ
Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧＳＴ）を付着したＣＡＲＭ１とｉｎ ｖｉｔｒｏで抽出したＰｏｎｔｉｎタンパク質との結合をＧＳＴ ｐｕｌｌｄｏｗｎ ａｓｓａｙを通じて確認した。Ｐｏｎｔｉｎと複合体をなすことがよく知られているＲｅｐｔｉｎも同様に確認した。実験結果、ＣＡＲＭ１は、Ｒｅｐｔｉｎと結合せずにＰｏｎｔｉｎと選択的に結合した（図１ｃ）。

【0080】

次に、ＣＡＲＭ１ ＷＴと酵素活性が壊れたＲ１６９Ａ突然変異を用いて、ＰｏｎｔｉｎがＣＡＲＭ１によってアルギニンメチル化できるかをｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｓｓａｙを通じて確認した。単にＣＡＲＭ１ ＷＴを入れたときのみ、Ｐｏｎｔｉｎがｉｎ ｖｉｔｒｏメチル化されることを確認した（図１ｄ）。これにより、ＣＡＲＭ１の酵素活性がＰｏｎｔｉｎのアルギニンメチル化にとって重要であることが確認された。次に、ＣＡＲＭ１によってメチル化されるＰｏｎｔｉｎがアミノ酸残基を探すために、インターネット上でオープンされたメチル化予測プログラムを使用し、予測されたアルギニン残基をアラニンに置き換えた突然変異を作製した。実験の結果、アルギニンＲ３３３とＲ３３９をそれぞれ一つずつアラニンに置き換えた突然変異においてメチル化が減少していることを確認し、２つを同時に突然変異させたとき、Ｐｏｎｔｉｎのメチル化が完全に消失することを確認した（図１ｅ）。放射線同位元素^３Ｈ－Ｓ－Ａｄｅｎｏｓｙｌ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ（ＳＡＭ）を用いてＰｏｎｔｉｎ ＷＴと様々な突然変異においてｉｎ ｖｉｔｒｏメチル化実験を行った場合にもＰｏｎｔｉｎのＷＴは、メチル化される反面、３３３及び３３９番目のアルギニンをアラニンやリジンに突然変異する場合、メチル化されないことが確認された（図１ｆ）。実際にＰｏｎｔｉｎの構造を確認したとき、Ｒ３３３とＲ３３９は近い位置に存在し（図１ｇ）、様々な種においても２つのアルギニンだけでなく周辺のアミノ酸残基も種間によく保存されていることを確認した（図１ｈ）。

【0081】

さらなる研究のために、Ｐｏｎｔｉｎのアルギニンメチル化を認知できる抗体を作製した。Ｄｏｔ ｂｌｏｔを通じて我々が作製したＰｏｎｔｉｎメチル化抗体がよく作動することを確認し（図１ｉ）、ｉｎ ｖｉｔｒｏメチル化実験によっても抗体の特異性が確認された（図１ｊ）。Ｒ３３３／３３９ＡだけでなくＲ３３３／３３９Ｋ突然変異においても同様に抗体がよく作動することを確認した（図１ｋ）。ＣＡＲＭ１のＷＴと酵素活性が壊れた突然変異を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏメチル化実験を行ったとき、ＷＴによってのみＰｏｎｔｉｎのメチル化が増加することを直接作製した抗体で再確認した（図１１）。Ｐｏｎｔｉｎのアルギニンメチル化が他のアルギニンメチル化酵素においても起こることが報告されたので、Ｐｏｎｔｉｎメチル化抗体がＣＡＲＭ１でない他のアルギニンメチル化酵素によって起こるメチル化を捕捉するかを確認した。実験の結果、Ｐｏｎｔｉｎの場合、ＣＡＲＭ１／ＰＲＭＴ４だけでなくＰＲＭＴ５、ＰＲＭＴ６とも結合できたが（結果示さず）、我々が作製したＰｏｎｔｉｎメチル化抗体は、ＣＡＲＭ１によるメチル化のみ認知することを確認した。まとめると、我々は、ＣＡＲＭ１によってＰｏｎｔｉｎのアルギニン３３３、３３９番残基がメチル化されることをｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験を通じて証明した。

【0082】

実施例２．ＣＡＲＭ１によるＰｏｎｔｉｎのメチル化の機序の究明：ブドウ糖欠乏状態で核内で発生

【0083】

ＣＡＲＭ１のタンパク質がブドウ糖欠乏状態で増加することが知られていたので、ＰｏｎｔｉｎとＣＡＲＭ１の結合が欠乏状態で増加するかを確認した。ＣＡＲＭ１とＰｏｎｔｉｎの結合がブドウ糖欠乏状態で増加することが確認した（図２ａ）。次に、我々はこのように増加した結合によってＰｏｎｔｉｎがメチル化が増加するかを確認した。我々はブドウ糖欠乏状態でＰｏｎｔｉｎのメチル化が増加する反面、ＣＡＲＭ１特異的阻害剤であるＥＺＭ２３０２（ＣＡＳ Ｎｏ．：１６２８８３０－２１－６）とＥＰＺ０２５６５４（ＣＡＳ Ｎｏ：１８８８３２８－８９－９）を処理したとき、Ｐｏｎｔｉｎのメチル化があまり増加しないことが確認された（図２ｂ）。ＣＡＲＭ１ ＷＴ ＭＥＦとＣＡＲＭ１ ｋｎｏｃｋｏｕｔＭＥＦ細胞を用いて観察したとき、ＣＡＲＭ１が存在する細胞でのみブドウ糖欠乏特異的なＰｏｎｔｉｎのメチル化の増加を観察した（図２ｃ）。また、ＣＡＲＭ１ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ＭＥＦにＣＡＲＭ１ ＷＴと酵素活性突然変異を発現させたとき、ＣＡＲＭ１ ＷＴでのみＰｏｎｔｉｎのメチル化が回復することを確認した（図２ｄ）。これにより、Ｐｏｎｔｉｎのメチル化がＣＡＲＭ１依存的であることを再び確認した。以前の報告によると、ＣＡＲＭ１は核内で安定化されているので、我々はｃｅｌｌｕｌａｒ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ実験（図２ｅ）とｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎａｌｙｓｉｓ（図２ｆ）を用いてＰｏｎｔｉｎのメチル化を確認したところ、ブドウ糖欠乏特異的核内で増加することを確認した。

【0084】

ＰｏｎｔｉｎとＲｅｐｔｉｎは、核内でｈｅｔｅｒｏ－ｄｏｄｅｃａｍｅｒ複合体をなすことが知られているので、Ｐｏｎｔｉｎのメチル化が複合体に及ぼす影響を確認した。Ｉｎ ｖｉｔｒｏメチル化実験後、ｉｎｖｉｔｒｏ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙを行った場合、ＰｏｎｔｉｎとＲｅｐｔｉｎの複合体の形成にＰｏｎｔｉｎのメチル化が影響を及ぼしていないことが分かった（結果示さず）。また、アルギニン突然変異も複合体の形成に影響を及ぼさなかった（結果示さず）。まとめると、我々はＰｏｎｔｉｎのメチル化がＣＡＲＭ１のＲｅｐｔｉｎとの結合に影響を及ぼしていないことをを確認した。

【0085】

実施例３．Ｐｏｎｔｉｎのメチル化がブドウ糖欠乏依存的自己捕食の増加に重要であることを究明

【0086】

ブドウ糖欠乏状態で増加するＰｏｎｔｉｎのメチル化の役割を調べるために、我々は Ｆｌａｇ－ｔａｇｇｅｄ Ｐｏｎｔｉｎ ＷＴとアルギニン突然変異（Ｒ３３３／３３９Ｋ、Ｒ３３３／３３９Ａ）を発現させたＰｏｎｔｉｎ ｆ／ｆ ＭＥＦを作製した（図３ａ）。このように作製された細胞は、Ｃｒｅウイルスに感染させると、元の細胞のＤＮＡから発現されたｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｐｏｎｔｉｎが除去され、細胞内に我々が発現させたＦｌａｇ－ｔａｇｇｅｄ Ｐｏｎｔｉｎのみが存在することになる。実際に我々が作製した細胞を確認すると、ｃｒｅ処理後にｅｎｄｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｐｏｎｔｉｎは消失することを確認し、発現させたＰｏｎｔｉｎ ＷＴ、ＲＫ、ＲＡがｅｎｄｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｐｏｎｔｉｎの発現量だけ発現することを確認した（図３ｂ）。このように作製された細胞を用いてさらなる実験を行った。Ｐｏｎｔｉｎのメチル化は、Ｐｏｎｔｉｎ ＷＴ
ＭＥＦでは観察されたが、ＲＫ、ＲＡ ＭＥＦでは観察されなかった（図３ｃ）。ブドウ糖欠乏だけでなく、Ｒａｐａｍｙｃｉｎ処理やアミノ酸欠乏状態でもＰｏｎｔｉｎのメチル化が増加した（結果示さず）。我々は以前にＰｏｎｔｉｎ ＫＯ ＭＥＦで自己捕食が壊れていることをＧＦＰ－ＬＣ３ ｐｕｎｃｔａ ａｓｓａｙを通じて確認した（結果示さず）。Ｐｏｎｔｉｎのメチル化による自己捕食の変化を確認するために、我々が作製
した細胞でＧＦＰ－ＬＣ３ ｐｕｎｃｔａ実験を行った。実験の結果、ＰｏｎｔｉｎＷＴ
ＭＥＦでは、ＧＦＰ－ＬＣ３ ｐｕｎｃｔａがブドウ糖欠乏が特異的に増加することが示されたが、Ｐｏｎｔｉｎ ＲＡ ＭＥＦでは変化しないことが分かった（図３ｄ）。Ｒａｐａｍｙｃｉｎ処理やアミノ酸欠乏状態でも同じ結果が得られた（結果示さず）。また、ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔを介して自己捕食の活性度の尺度の一つであるＬＣ３－ＩＩのｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ比を確認したとき、Ｐｏｎｔｉｎ ＷＴ ＭＥＦではＬＣ－３ ＩＩが増加したが、Ｐｏｎｔｉｎ Ｒｋ，ＲＡ ＭＥＦでは増加しないことを確認した（図３ｅ）。

【0087】

次に、我々は自己捕食ｆｌｕｘを確認するために自己捕食のｍａｔｕｒａｔｉｏｎを妨げる物質であるＢａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ ＡｌやＣｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅを処理した。ＧＦＰ－ＬＣ３ ｐｕｎｃｔａ実験を通じてＰｏｎｔｉｎ ＷＴ ＭＥＦの場合、自己捕食のｆｌｕｘを遮断したときにＧＦＰ－ＬＣ３ ｐｕｎｃｔａが蓄積することが分かったが、Ｐｏｎｔｉｎ ＲＡ ＭＥＦでは蓄積しないことを確認した（図３ｆ）。Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ実験によってもＢａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ ＡｌやＣｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅを処理した場合、ＬＣ３－ＩＩはＷＴでは増加するが、ＲＡでは大きく増加しないことが分かった（図３ｇ）。さらに自己捕食ｖａｃｕｏｌｅを染色するＣｙｔｏ－ＩＤを利用したときにも類似した結果が得られた（図３ｈ）。自己捕食の進行過程でどの段階が壊れているかを確認するためにｍＣｈｅｒｒｙ－ＧＦＰ－ＬＣ３リポーターを利用した実験を行った。自己捕食過程中、オートパゴソームは、リソソームと結合しつつｐＨが低くなるが、このとき、ＧＦＰの緑色シグナルが弱くなる。一方、ｍＣｈｅｒｒｙの赤色は、ｐＨの影響を受けないため、オートパゴソームの場合、緑色と赤色が合わさった黄色い光を帯びるのに対し、リソソームと結合したオートリソソームは、赤い光を帯びることになる。これを用いて実験した場合、Ｐｏｎｔｉｎ ＲＡ ＭＥＦでは、ブドウ糖欠乏状態でオートファゴソームとオートリソソームの比率が変わらず、全体的な個数がＷＴ ＭＥＦに比べて減少することが分かった（図３ｉ）。このデータを通じて我々は、ＣＡＲＭ１によるＰｏｎｔｉｎのメチル化が、自己捕食そのものの増加において重要であることが分かった。

【0088】

Ｐｏｎｔｉｎのメチル化による自己捕食の調節が普遍的な自己捕食調節機序であるかを確認するために、ＭＥＦ細胞だけでなくＨｅｐＧ２、ＨｅＬａなどのヒト細胞でも確認した。ブドウ糖欠乏状態において、両方の細胞において、ＣＡＲＭ１の核内での増加とＰｏｎｔｉｎのメチル化の増加が確認された（結果示さず）。ＨｅｐＧ２、ＨｅＬａでもｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｐｏｎｔｉｎをｋｎｏｃｋｄｏｗｎさせた後、Ｐｏｎｔｉｎ ＷＴとＲＡを発現させた。我々はこれらの細胞でもＰｏｎｔｉｎ ＷＴ細胞においてＢａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ Ａｌ依存的にＬＣ３－ＩＩが増加することを確認し、Ｐｏｎｔｉｎ ＲＡ細胞ではそうではないことを確認した。我々はこのデータを通じてＰｏｎｔｉｎのメチル化による自己捕食の調節が様々な細胞でも共通していることを確認した。

【0089】

細胞において栄養分代謝の恒常性の維持は、細胞の健康と機能にとって重要である。自己捕食は、栄養分不足状態で代表的な防御機序の一つで、栄養分が不足すると自己捕食を通じて栄養分が自ら供給されて生存に役立つ。Ｐｏｎｔｉｎのメチル化による細胞生存を確認するために、Ｐｏｎｔｉｎ ＷＴとＲＫ ＭＥＦの細胞成長率を確認した。Ｐｏｎｔｉｎ ＷＴ ＭＥＦの場合、ブドウ糖欠乏１５～１８時間から成長が増加できず、２４時間後から早く死に始める。しかし、Ｐｏｎｔｉｎ ＲＫ ＭＥＦの場合、ブドウ糖欠乏１２時間まではＷＴ ＭＥＦと大きな差異がないが、１２時間後に早く死に始めた（結果示さず）。次に、我々は細胞の生存率を確認した。成長率と同様に、Ｐｏｎｔｉｎ ＷＴ ＭＥＦの場合、ブドウ糖欠乏２４時間後に細胞生存率が減少することが分かった。しかし、Ｐｏｎｔｉｎ ＲＫ ＭＥＦの場合、ブドウ糖欠乏の１８時間後から生存率が減少した（結果示さず）。まとめると、我々の結果は、Ｐｏｎｔｉｎのメチル化によってブドウ糖欠乏状態で細胞の成長と生存に影響を及ぼし、持続する欠乏状態で細胞の生存において自己捕食の転写調節の重要性を示す。

【0090】

実施例４．多数の自己捕食とリソソーム遺伝子がＰｏｎｔｉｎのメチル化によって調節されることを究明

【0091】

Ｐｏｎｔｉｎのメチル化がブドウ糖欠乏状態において核内で増加するので、我々はＰｏｎｔｉｎのメチル化が自己捕食遺伝子調節にとって重要であると仮定した。どの遺伝子がＰｏｎｔｉｎメチル化によって調節されるかを確認するために、我々はＰｏｎｔｉｎ ＷＴ、ＲＡ ＭＥＦにブドウ糖欠乏の有無に応じてＲＮＡ－ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇを行った（図４ａ）。ＰＣＡを通じて我々はＰｏｎｔｉｎ ＷＴ、ＲＡ ＭＥＦが正常な状況では類似した遺伝子発現パターンを有するが、ブドウ糖欠乏状態では、全体的な遺伝子発現パターンが異なることを確認した（結果示さず）。我々は、ＤＥＧを６つの遺伝子群に分けたヒートマップを得た（図４ｂ）。遺伝子群を用いてＧｅｎｅ ｏｎｔｏｌｏｇｙとｐａｔｈｗａｙを察し見るとき、遺伝子群１番で自己捕食とリソソーム関連遺伝子が非常に多く出てきた（図４ｃ）。実際、自己捕食とリソソームに影響を及ぼす遺伝子群を探すために、我々はＧｅｎｅ Ｓｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｎｅｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＧＳＥＡ）を行った。我々は、結果を通じて自己捕食の調節とリソソームの調節、及びファゴフォアの形成に関連した遺伝子群と遺伝子群の１番が相関関係が高いことを見出した（図４ｄ）。

【0092】

次に、我々はメチル化されたＰｏｎｔｉｎが自己捕食の過程でどのように重要な役割を果たすかを察し見た。自己捕食の調節を中心にＲＮＡ－ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇデータを分析した。興味深いことに、自己捕食の開始とパゴフォアｎｕｃｌｅａｔｉｏｎと膨張、及びｃａｒｇｏ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ／ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇに関連した遺伝子がＰｏｎｔｉｎ ＲＡ ＭＥＦで低いことを確認した（図４ｅ）。Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ
ＲＴ－ＰＣＲとｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔを通じて実際にこのような遺伝子とタンパク質の発現がＰｏｎｔｉｎメチル化依存的であることを確認した（図４ｆ，ｇ）。また、ＨｅｐＧ２とＨｅＬａなどの他の細胞でも同じ結果が得られており、Ｒａｐａｍｙｃｉｎ処理やアミノ酸欠乏状態でも類似した結果が得られた。まとめると、我々は栄養素欠乏状態で増加するＰｏｎｔｉｎのメチル化が自己捕食とリソソーム関連遺伝子を活性化させるのに重要であり、このような調節が自己捕食の初期段階から影響を及ぼすことがあるという事実を明らかにした

【0093】

実施例５．メチル化されたＰｏｎｔｉｎとＦＯＸＯ３ａの結合

【0094】

Ｐｏｎｔｉｎの場合、様々な転写因子のコアクチベーターとして知られているので、我々はＰｏｎｔｉｎのメチル化が特定の転写因子との結合に影響を及ぼすのではないかと考えた。Ｐｏｎｔｉｎメチル化依存的に結合する転写因子を探すために、我々はＲＮＡ－ｓｅｑから得られたターゲット遺伝子を用いて転写因子スクリーニングを行った。これにより、我々は自己捕食に関連したくつかの候補転写因子を得ることができた（図５ａ）。さらに我々はＰｏｎｔｉｎメチル化抗体を用いてＣｈＩＰ－ｓｅｑを行った。Ｐｏｎｔｉｎのメチル化が結合するクロマチンのモチーフ分析を通じて、我々はＦＯＸＯ３ａ結合部分が高いことを確認した（図５ｂ）。我々は、候補転写因子が実際にＰｏｎｔｉｎと結合するかを確認するために、ブドウ糖欠乏状態で結合するかどうかを確認した。実験の結果、ＰｏｎｔｉｎがＦＯＸＯ３ａとは結合するが、他の候補転写因子とは結合しないことを確認した（図５ｃ）。ＰｏｎｔｉｎとＦＯＸＯ３ａの結合はメチル化依存的であり、Ｐｏｎｔｉｎ ＷＴは結合できるが、Ｐｏｎｔｉｎ ＲＡ、ＲＫは、結合できないことを確認した（図５ｄ）。ＰｏｎｔｉｎとＦＯＸＯ３ａの結合においてメチル化が重要であるかどうかをより確実にするために、我々はＣＡＲＭ１による２つのタンパク質の結合を確認した。ＣＡＲＭ１ ＫＯ ＭＥＦにおいてＰｏｎｔｉｎとＦＯＸＯ３ａが結合できないことを確認し（図５ｅ，ｆ）、ＣＡＲＭ１特異的なｉｎｈｉｂｉｔｏｒを処理したとき、ＰｏｎｔｉｎとＦＯＸＯ３ａの結合が減少することを確認した（図５ｇ）。これにより、ＰｏｎｔｉｎとＦＯＸＯ３ａの結合において、ＣＡＲＭ１によるメチル化が重要であることが分かった。

【0095】

次に、我々はＰｏｎｔｉｎとＦＯＸＯ３ａの直接的な結合を確認するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＧＳＴ ｐｕｌｌｄｏｗｎ実験を行った。Ｉｎ ｖｉｔｒｏメチル化を通じてＰｏｎｔｉｎをメチル化させた後、我々はＧＳＴ－ＦＯＸＯ３ａとの結合を確認した。実験の結果、ＦＯＸＯ３ａとメチル化されたＰｏｎｔｉｎは結合するのに対し、メチル化させないＰｏｎｔｉｎは、結合できないことが確認した（図５ｈ）。さらに、Ｉｍｍｕｎｏｄｏｔ ｂｌｏｔ実験を通じてＦＯＸＯ３ａがメチル化されたＰｏｎｔｉｎペプチドと結合するのに対し、メチル化されていないＰｏｎｔｉｎペプチドには結合しないことを確認した（図５ｉ）。ＦＯＸＯ３ａのどの位置にＰｏｎｔｉｎが結合するかを調べるために、我々はＦＯＸＯ３ａの様々な突然変異を用いてＰｏｎｔｉｎとの結合を確認した。我々は、ＦＯＸＯ３ａの４１８－６７３アミノ酸部分にＰｏｎｔｉｎが結合することを確認し、さらなる実験を通じて、ＦＯＸＯ３ａのＣＲ３ ｄｏｍａｉｎである６１０－６５０アミノ酸部分でＰｏｎｔｉｎとの結合が起こることを見出した。

【0096】

アルギニンメチル化を認知できるアルギニンメチル化認知ドメインの場合、ａｒｏｍａｔｉｃ残基によってメチル化が認知されることが報告されている。我々はＦＯＸＯ３ａのメチル化認知残基を見出すために、一番目にＣＲ３ ｄｏｍａｉｎに存在するａｒｏｍａｔｉｃ残基を１つずつ突然変異させた。実験の結果、ＦＯＸＯ３ａのＦ６４０とＦ６４２をロイシンでそれぞれ突然変異させた場合、Ｐｏｎｔｉｎとの結合が減少することを確認し、２つのフェニルアラニンをすべてロイシンに置き換えた場合、Ｐｏｎｔｉｎとの結合が完全に消失することを確認した（図５ｊ）。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＧＳＴ ｐｕｌｌｄｏｗｎを通じてＦＯＸＯ３ａ Ｆ６４０／６４２１突然変異がメチル化されたＰｏｎｔｉｎと結合しないことを確認した（図５ｋ）。これにより、我々はＦＯＸＯ３ａのＦ６４０とＦ６４２がＰｏｎｔｉｎのメチル化認知に重要であると考えた。

【0097】

一方、我々はＦＯＸＯ３ａとＰｏｎｔｉｎの構造を通じてメチル化認知構造をモデリングを通じて予測した。ＦＯＸＯ３ａは、ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ残基であるＭ６２４、Ｉ６２７、Ｉ６２８がＰｏｎｔｉｎのメチル化を認知できるものと予想された。これを確認するために、我々は、前記３つの残基をすべて突然変異させたＦＯＸＯ３ａ ３Ａ突然変異とＷＴを用いてＰｏｎｔｉｎとの結合を確認した。ＧＳＴ ｐｕｌｌｄｏｗｎ実験を通じて、我々はＦＯＸＯ３ａ ３Ａ突然変異の場合、Ｐｏｎｔｉｎと結合しないことを確認し、細胞実験によっても同じ結果を確認した。これによって我々は、ＦＯＸＯ３ａのＭ６２４、Ｉ６２７、Ｉ６２８もＰｏｎｔｉｎのメチル化認知において重要であると考えた。

【0098】

実施例６．メチル化ＰｏｎｔｉｎとＴｉｐ６０がＦＯＸＯ３ａターゲット遺伝子をＨ４
ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎを通じて活性化させることを究明

【0099】

メチル化されたＰｏｎｔｉｎがＦＯＸＯ３ａのコアクチベーターとして機能することを確認するために、ＦＯＸＯ結合位置を有するｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒを用いてｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ実験を行った。Ｐｏｎｔｉｎ ＷＴでは、ブドウ糖欠乏状態でｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性が増加したが、Ｐｏｎｔｉｎ ＲＫ、ＲＡ突然変異では増加しなかった（図６ａ）。また、ＦＯＸＯ３ａ Ｆ６４０／６４２Ｌや３Ａ突然変異では、Ｐｏｎｔｉｎによるさらなる転写活性の増加が確認されなかった（図６ｂ）。メチル化されたＰｏｎｔｉｎがどのようなＦＯＸＯ３ａターゲット遺伝子を調節するかを確認するために、Ｐｏｎｔｉｎメチル化ＣｈＩＰ－ｓｅｑデータを察し見た。我々はメチル化されたＰｏｎｔｉｎが転写開始周辺部だけでなく、Ｈ３Ｋ４ｍｅｌとＨ３Ｋ２７Ａｃが高いエンハンサー部分にも結合できることを確認した（図６ｃ）。興味深いことに、メチル化Ｐｏ
ｎｔｉｎ ｐｅａｋのうち、ＦＯＸＯ３ａモチーフを持っているものの３６％がＴＳＳから遠く離れていた。代表的な自己捕食遺伝子であるＭａｐｌｌｃ３ｂの遺伝子付近でＰｏｎｔｉｎメチル化ＣｈＩＰ－ｓｅｑ ｐｅａｋを察し見たとき、転写開始部位だけでなく遠い部分でも結合することを確認した（図６ｄ）。我々はＣｈＩＰを介してブドウ糖欠乏状態でＰｏｎｔｉｎが遺伝子転写開始部分の近く（－１．２ｋｂ）だけでなく、遠い部分（－１１．３ｋｂ、－５ｋｂ）まで結合できることを確認した（結果示さず）。しかし、Ｐｏｎｔｉｎ ＲＡ ＭＥＦでは、Ｐｏｎｔｉｎのｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔが壊れることを確認した（結果示さず）。これらのデータを通じて、我々はＰｏｎｔｉｎのメチル化によるＦＯＸＯ３ａとの結合を通じてＦＯＸＯ３ａのコアクチベーターとして作動できることを示した。

【0100】

次に、我々はＰｏｎｔｉｎの結合がどのようにＦＯＸＯ３ａターゲット遺伝子の転写活性を高めることができるかを察し見た。Ｐｏｎｔｉｎは、よく知られているＴｉｐ６０の複合体の１つの要素であり、Ｔｉｐ６０複合体の場合、ヒストンアセチル化を通じて転写活性に重要な役割を果たす。これを確認するために、我々はＦＯＸＯ３ａ結合位置にＰｏｎｔｉｎとともにＴｉｐ６０とＨ４アセチル化が変化するかを確認した。ＣｈＩＰ実験を通じて、我々はＴｉｐ６０とともにＨ４アセチル化がブドウ糖欠乏特異的に増加することを確認した（図６ｅ）。興味深いことに、Ｔｉｐ６０とＨ４アセチル化がＣＡＲＭ１ ＫＯ ＭＥＦではｒｅｃｒｕｉｔされないことによって、Ｐｏｎｔｉｎのメチル化状態が依存的であることが分かった（図６ｅ）。ＦＯＸＯ３ａとＴｉｐ６０の結合は、Ｐｏｎｔｉｎが存在するときに増加することが確認できたが（図６ｆ）、ＰｏｎｔｉｎとＴｉｐ６０の結合は、メチル化の有無に関連性がなかった（図６ｇ）。まとめると、我々はメチル化されたＰｏｎｔｉｎがＴｉｐ６０をＦＯＸＯ３ａ位置に移して自己捕食関連遺伝子のｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒとして作動できることを明らかにした。

【0101】

実施例７．Ｐｏｎｔｉｎのメチル化依存的な自己捕食遺伝子の活性においてＴｉｐ６０が重要であることを究明

【0102】

自己捕食遺伝子の調節においてＴｉｐ６０の重要性を確認するために、ｓｈＲＮＡを用いたＴｉｐ６０ ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ＭＥＦを作製した。Ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ Ａ１を処理して自己捕食ｆｌｕｘを察し見た場合、Ｔｉｐ６０がなければ、ＬＣ３－ＩＩの増加はよく観察されなかった（図７ａ）。これにより、Ｔｉｐ６０が自己捕食の増加にも関与していることを確認した。次に、ｑＲＴ－ＰＣＲを通じて前述したＰｏｎｔｉｎメチル化依存的なターゲット遺伝子がＴｉｐ６０がない場合にどのように変化するかを確認した。ブドウ糖欠乏特異的に転写が増加するＭａｐｌｌｃ３ｂ、Ｓｉｒｔ１、Ｂｎｉｐ３、Ｃｔｎｓは、ＷＴでよく上がるが、Ｔｉｐ６０のない場合には増加できないことを確認した（図７ｂ）。一方、Ｐｏｎｔｉｎのメチル化に依存的でない自己捕食遺伝子の場合、Ｔｉｐ６０とも関連性がなかった（図７ｂ）。これにより、我々はＰｏｎｔｉｎのメチル化とＴｉｐ６０が関連していることをもう一度確認した。次に、我々はＣｈＩＰ実験を通じて、Ｔｉｐ６０がない場合にＦＯＸＯ３ａとＰｏｎｔｉｎ、及びＨ４アセチル化がどのように変化するかを確認した。Ｔｉｐ６０がない場合、ＦＯＸＯ３ａとメチル化されたＰｏｎｔｉｎはよくｒｅｃｒｕｉｔされるが、Ｈ４アセチルの増加が壊れることをＣｈＩＰ実験を通じて確認した（図７ｃ）。

【0103】

Ｔｉｐ６０をｋｎｏｃｋｄｏｗｎするか、またはＰｏｎｔｉｎのメチル化を壊したとき、ＦＯＸＯターゲット遺伝子の増加が同様に壊れることが分かり、２つを同時に壊したとき、さらなる減少は見られなかった（図７ｄ）。これにより、我々はＴｉｐ６０と伴うＨ４アセチル化によるＦＯＸＯターゲット遺伝子調節がＰｏｎｔｉｎのメチル化によって起こることが分かった。また、ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔによるＬＣ３－ＩＩの増加も類似した結果を示した（図７ｅ）。まとめると、Ｐｏｎｔｉｎのメチル化がＴｉｐ６０のＦＯＸＯ３ａ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ結合に重要であり、これによるＨ４アセチル化が自己捕食遺伝子の活性において重要であることを明らかにした（図７ｆ）。

【0104】

実施例８．ＣＡＲＭ１－Ｐｏｎｔｉｎ－ＦＯＸＯ３ａ軸が自己捕食遺伝子のエンハンサーの活性に役割を果たすことを究明

【0105】

以前の研究において、我々はＡＭＰＫによるＦＯＸＯ３ａリン酸化がＳｋｐ２抑制に重要であることを明らかにした。Ｐｏｎｔｉｎのメチル化によってＳｋｐ２が調節可能であるかを確認したが、Ｓｋｐ２ ｍＲＮＡの減少に影響がなく、Ｓｋｐ２ ｐｒｏｍｏｔｅｒにもＰｏｎｔｉｎとＨ４アセチル化がｒｅｃｒｕｉｔされなかった。また、Ｐｏｎｔｉｎのメチル化が壊れてもＣＡＲＭ１の安定化には影響がないことが分かった。我々は、以前の研究で増加したＣＡＲＭ１がＴＦＥＢと結合してＨ３Ｒ１７メチル化を増加させることを明らかにした。Ｍａｐ１ｌｃ３ｂの場合、２つの転写因子ＴＦＥＢとＦＯＸＯ３ａによって調節されるため、ＣＡＲＭ１－Ｐｏｎｔｉｎ－ＦＯＸＯ３ａ軸とＴＦＥＢ－ＣＡＲＭ１軸がどのように作動するかを察し見た。

【0106】

ＣＡＲＭ１はＦＯＸＯ３ａ結合部分とＴＦＥＢ結合部分の両方に関与しているので、我々はＣＡＲＭ１が両方の部分に結合できるかを確認した。ＣｈＩＰを通じて察し見ると、ＴＦＥＢ結合部位であるＣＬＥＡＲモチーフではＣＡＲＭ１が結合し、Ｈ３Ｒ１７ｍｅ２の増加が確認されたが、ＦＯＸＯ３ａ結合部位ではＣＡＲＭ１の結合は確認されなかった。我々はＦＯＸＯ結合部位ではメチル化されたＰｏｎｔｉｎを始めとしたＴｉｐ６０とＨ４アセチル化がよく増加することを確認した。しかし、Ｐｏｎｔｉｎ ＲＫ、ＲＡ突然変異では、Ｐｏｎｔｉｎを始めとしたＴｉｐ６０、Ｈ４アセチル化の増加が確認されなかった（図８ａ）。一方、ＴＦＥＢ結合部位では、ＦＯＸＯ３ａ、Ｐｏｎｔｉｎ、Ｔｉｐ６０がすべてｒｅｃｒｕｉｔされておらず、Ｐｏｎｔｉｎのメチル化の有無にかかわらず、Ｈ３Ｒ１７ｍｅ２が増加していることを確認した（図８ｂ）。まとめると、ＣＡＲＭ１－Ｐｏｎｔｉｎ－ＦＯＸＯ３ａ軸とＴＦＥＢ－ＣＡＲＭ１軸が同じ遺伝子を調節するが、それぞれの結合部位で独立して作動することを確認した。

【0107】

ＦＯＸＯ３ａの場合、エンハンサーでも作動できることが知られていたので、Ｐｏｎｔｉｎ－Ｔｉｐ６０が結合する部分がエンハンサーとして作動できるかを確認した。Ｍａｐ１ｌｃ３ｂの－１１．３ｋｂと－５ｋｂに結合するＰｏｎｔｉｎ－Ｔｉｐ６０がＭａｐ１ｌｃ３ｂのエンハンサーとして作動できるかを確認するために、３Ｃ実験を行った。３Ｃ実験を通じてＭａｐ１ｌｃ３ｂの－１１．３ｋｂと－５ｋｂ部分がプロモーター部分に近接していることを確認した（図８ｃ）。次に、我々はエンハンサーの活性の有無を確認するために、ｅＲＮＡをｑＲＴ－ＰＣＲを通じて確認した（図８ｄ）。Ｐｏｎｔｉｎ ＷＴ
ＭＥＦではブドウ糖欠乏特異的にｅＲＮＡが増加することが確認されたが、Ｐｏｎｔｉｎ ＲＡ ＭＥＦでは増加しないことが観察された。まとめると、ＣＡＲＭ１－Ｐｏｎｔｉｎ－ＦＯＸＯ３ａ軸がＨ４アセチル化を通じてエンハンサーで作動できることを明らかにした。

【0108】

以上、本願の例示的な実施例について詳細に説明したが、本願の権利範囲は、これに限定されるものではなく、以下の請求範囲で定義している本願の基本概念を用いた当業者の様々な変形及び改良形態も本願の権利範囲に属する。

【0109】

本発明で使用されるすべての技術用語は、特に定義されない限り、本発明の関連分野で通常の当業者が一般的に理解するのと同じ意味で使用される。本明細書に参考文献として記載されるすべての刊行物の内容は、本発明に導入される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

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