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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-07-16
(45)【発行日】2024-07-24
(54)【発明の名称】ラマン分光法を使用してウイルス力価を決定するための方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/70 20060101AFI20240717BHJP
C12Q 1/06 20060101ALI20240717BHJP
G01N 21/65 20060101ALI20240717BHJP
G01N 33/483 20060101ALI20240717BHJP
G01N 33/569 20060101ALI20240717BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/70
C12Q1/06
G01N21/65
G01N33/483 C
G01N33/569 G
【請求項の数】
29
(21)【出願番号】P 2021536747
(86)(22)【出願日】2019-12-23
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-18
(86)【国際出願番号】 GB2019053695
(87)【国際公開番号】W WO2020136376
(87)【国際公開日】2020-07-02
【審査請求日】2022-12-22
(31)【優先権主張番号】1821206.8
(32)【優先日】2018-12-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(73)【特許権者】
【識別番号】518318299
【氏名又は名称】セル・セラピー・カタパルト・リミテッド
【氏名又は名称原語表記】Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｃａｔａｐｕｌｔ Ｌｉｍｉｔｅｄ
(74)【代理人】
【識別番号】100080791
【弁理士】
【氏名又は名称】高島 一
(74)【代理人】
【識別番号】100136629
【弁理士】
【氏名又は名称】鎌田 光宜
(74)【代理人】
【識別番号】100125070
【弁理士】
【氏名又は名称】土井 京子
(74)【代理人】
【識別番号】100121212
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 弥栄子
(74)【代理人】
【識別番号】100174296
【弁理士】
【氏名又は名称】當麻 博文
(74)【代理人】
【識別番号】100137729
【弁理士】
【氏名又は名称】赤井 厚子
(74)【代理人】
【識別番号】100151301
【弁理士】
【氏名又は名称】戸崎 富哉
(72)【発明者】
【氏名】チャーチウェル、ジョン
(72)【発明者】
【氏名】バラデス、マーク オリヴィエ
(72)【発明者】
【氏名】マーシャル、ダミアン
【審査官】西村 亜希子
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２００９／０１４９３４４（ＵＳ，Ａ１）
【文献】韓国公開特許第１０－２０１５－００２５２２０（ＫＲ，Ａ）
【文献】中国特許第１０５６３０７４３（ＣＮ，Ｂ）
【文献】米国特許出願公開第２０１２／００７１３５２（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２００９／００８２２２０（ＵＳ，Ａ１）
【文献】Journal of Raman Spectroscopy，2019年01月10日，Vol.50, No.5，pp.620-628
【文献】PLOS ONE，2010年04月19日，VOL:5, NR:4，PAGE(S):E10222(1-9)，http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0010222
【文献】JOURNAL OF BIOMEDICAL OPTICS，2018年09月04日，VOL:23, NR:9，PAGE(S):097001(1-7)，http://dx.doi.org/10.1117/1.JBO.23.9.097001
【文献】Laser Phys. Lett.，2013年，Vol.10，035602(1-5)，http://dx.doi.org/10.1088/1612-2011/10/3/035602
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ
Ｃ１２Ｎ ７／
Ｇ０１Ｎ
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ラマン分光法を使用してウイルス培養物中のウイルス力価を定量化する方法であって、前記方法は、（ａ）未処理のウイルス培養培地を提供し、前記未処理のウイルス培養培地を光源で照射するステップと、
（ｂ）複数の波数範囲のそれぞれ１つの中でラマン散乱光の総強度を測定して、前記ウイルス培養物についての波数信号強度データセットを取得するステップであって、前記複数の波数範囲は、事前に選択されており、前記ウイルス培養物内のウイルスに特徴的であるステップと、
（ｃ）前記波数信号強度データセットに対して数学的データ処理ステップを実行するステップと、
（ｄ）前記数学的データ処理ステップの出力に基づいて前記ウイルス力価を定量化するステップとを含む、方法。
【請求項2】
数学的データ処理を実行し、前記ウイルス力価を定量化するステップは、（ｉ）前記波数信号強度データセットに多変量回帰アルゴリズムを適用することによってモデルパラメータを取得するステップと、
（ｉｉ）前記多変量回帰アルゴリズムを前記波数信号強度データセットに適用して取得された前記モデルパラメータを使用して、前記ウイルス力価を定量化するステップとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ステップ（ｉ）の前に、数学的データ処理を実行し、前記ウイルス力価を定量化するステップは、１つ以上の前処理分析法を使用して前記波数信号強度データセットを前処理することにより、前記波数信号強度データセットを正規化するステップを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記前処理分析法は、一次微分法、二次微分法、標準正規変量（ＳＮＶ）法、多項式フィッティング法、マルチ多項式フィッティング法、モリファイア法、ピースワイズ多項式フィッティング（ＰＰＦ）法、または適応型の反復的に再重み付けされたペナルティ付き最小二乗（ａｉｒＰＬＳ）法である、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記多変量回帰アルゴリズムは、部分最小二乗（ＰＬＳ）回帰アルゴリズムである、請求項２に記載の方法。
【請求項6】
前記部分最小二乗（ＰＬＳ）回帰アルゴリズムは、非線形反復部分最小二乗（ＮＩＰＡＬＳ）回帰アルゴリズムまたはニューラルネットワークである、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記未処理のウイルス培養培地を照射するために使用される光源はレーザであり、前記未処理のウイルス培養培地は、７８５ｎｍの波長を有する光で照射され；かつ／または、前記ラマン散乱光は、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）を使用して検出される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
（Ａ）測定されるラマンスペクトル内の前記複数の波数範囲は、以下に列挙される、変数重要度指標（ＶＩＰ）が１．００以上である、波数範囲：（Ａ－ｉ）４２０～４３８ｃｍ－１；（Ａ－ｉｉ）４５７～４９７ｃｍ－１；（Ａ－ｉｉｉ）５０３～５５２ｃｍ－１；（Ａ－ｉｖ）５７６～５８０ｃｍ－１；（Ａ－ｖ）５８８～５８９ｃｍ－１；（Ａ－ｖｉ）６０４～６０８ｃｍ－１；（Ａ－ｖｉｉ）６１７～６２１ｃｍ－１；（Ａ－ｖｉｉｉ）７９６～８０５ｃｍ－１；（Ａ－ｉｘ）８０８～８０９ｃｍ－１；（Ａ－ｘ）８２４～９１１ｃｍ－１；（Ａ－ｘｉ）９１８～９３９ｃｍ－１；（Ａ－ｘｉｉ）９７１～１１６８ｃｍ－１；（Ａ－ｘｉｉｉ）１１９１～１１９７ｃｍ－１；（Ａ－ｘｉｖ）１２０６～１２１２ｃｍ－１；（Ａ－ｘｖ）１２３４～１２３７ｃｍ－１；（Ａ－ｘｖｉ）１２４６～１２５２ｃｍ－１；（Ａ－ｘｖｉｉ）１２５９～１４８１ｃｍ－１；（Ａ－ｘｖｉｉｉ）１４９７～１５００ｃｍ－１；（Ａ－ｘｉｘ）１５２６～１５４０ｃｍ－１；（Ａ－ｘｘ）１５４５～１５５０ｃｍ－１；（Ａ－ｘｘｉ）１５８４～１５９１ｃｍ－１；（Ａ－ｘｘｉｉ）１５９８～１６８５ｃｍ－１；（Ａ－ｘｘｉｉｉ）１６９９～１６９９ｃｍ－１；（Ａ－ｘｘｉｖ）１７１７～１７１９ｃｍ－１；（Ａ－ｘｘｖ）１７５４～１７５４ｃｍ－１；（Ａ－ｘｘｖｉ）１７６８～１７７１ｃｍ－１；（Ａ－ｘｘｖｉｉ）１７８２～１７８３ｃｍ－１および（Ａ－ｘｘｖｉｉｉ）１７８９～１８００ｃｍ－１のうちの５個以上を含むか、もしくは、
測定されるラマンスペクトル内の前記複数の波数範囲は、ＶＩＰが１．００以上である、上記波数範囲（Ａ－ｉ）～（Ａ－ｘｘｖｉｉｉ）のうちの１０個以上を含むか、もしくは、
測定されるラマンスペクトル内の前記複数の波数範囲は、ＶＩＰが１．００以上である、上記波数範囲（Ａ－ｉ）～（Ａ－ｘｘｖｉｉｉ）のうちの１５個以上を含むか、もしくは、
測定されるラマンスペクトル内の前記複数の波数範囲は、ＶＩＰが１．００以上である、上記波数範囲（Ａ－ｉ）～（Ａ－ｘｘｖｉｉｉ）のうちの２０個以上を含むか、もしくは、
測定されるラマンスペクトル内の前記複数の波数範囲は、ＶＩＰが１．００以上である、上記波数範囲（Ａ－ｉ）～（Ａ－ｘｘｖｉｉｉ）のうちの２５個以上を含むか、もしくは、
測定されるラマンスペクトル内の前記複数の波数範囲は、ＶＩＰが１．００以上である、上記波数範囲（Ａ－ｉ）～（Ａ－ｘｘｖｉｉｉ）のうちの２８個すべてを含み；または、
（Ｂ）
測定されるラマンスペクトル内の前記複数の波数範囲は、以下に列挙される、変数重要度指標（ＶＩＰ）が１．２５以上である、波数範囲：（Ｂ－ｉ）４２０～４２１ｃｍ－１；（Ｂ－ｉｉ）４２６～４２９ｃｍ－１；（Ｂ－ｉｉｉ）４３４～４３６ｃｍ－１；（Ｂ－ｉｖ）４５９～４８６ｃｍ－１；（Ｂ－ｖ）４９０～４９６ｃｍ－１；（Ｂ－ｖｉ）５０４～５４９ｃｍ－１；（Ｂ－ｖｉｉ）７９８～８００ｃｍ－１；（Ｂ－ｖｉｉｉ）８３４～８８５ｃｍ－１；（Ｂ－ｉｘ）８９２～９０７ｃｍ－１；（Ｂ－ｘ）９１９～９３８ｃｍ－１；（Ｂ－ｘｉ）９７３～９７３ｃｍ－１；（Ｂ－ｘｉｉ）９８１～９８３ｃｍ－１；（Ｂ－ｘｉｉｉ）９９０～１１４５ｃｍ－１；（Ｂ－ｘｉｖ）１２０７～１２１１ｃｍ－１；（Ｂ－ｘｖ）１２４８～１２５０ｃｍ－１；（Ｂ－ｘｖｉ）１２７０～１３２２ｃｍ－１；（Ｂ－ｘｖｉｉ）１３２８～１３３１ｃｍ－１；（Ｂ－ｘｖｉｉｉ）１３４６～１３８０ｃｍ－１；（Ｂ－ｘｉｘ）１３８３～１４７３ｃｍ－１；（Ｂ－ｘｘ）１４７６～１４７８ｃｍ－１；（Ｂ－ｘｘｉ）１４９８～１４９９ｃｍ－１；（Ｂ－ｘｘｉｉ）１５２８～１５２８ｃｍ－１；（Ｂ－ｘｘｉｉｉ）１５９０～１５９０ｃｍ－１；（Ｂ－ｘｘｉｖ）１５９９～１６０２ｃｍ－１；（Ｂ－ｘｘｖ）１６０９～１６１３ｃｍ－１；（Ｂ－ｘｘｖｉ）１６１６～１６２０ｃｍ－１；（Ｂ－ｘｘｖｉｉ）１６２８～１６３４ｃｍ－１；（Ｂ－ｘｘｖｉｉｉ）１６４０～１６７２ｃｍ－１；（Ｂ－ｘｘｉｘ）１６７８～１６７９ｃｍ－１；（Ｂ－ｘｘｘ）１７６９～１７６９ｃｍ－１および（Ｂ－ｘｘｘｉ）１８００～１８００ｃｍ－１のうちの５個以上を含むか、もしくは、
測定されるラマンスペクトル内の前記複数の波数範囲は、ＶＩＰが１．２５以上である、上記波数範囲（Ｂ－ｉ）～（Ｂ－ｘｘｘｉ）のうちの１０個以上を含むか、もしくは、
測定されるラマンスペクトル内の前記複数の波数範囲は、ＶＩＰが１．２５以上である、上記波数範囲（Ｂ－ｉ）～（Ｂ－ｘｘｘｉ）のうちの１５個以上を含むか、もしくは、
測定されるラマンスペクトル内の前記複数の波数範囲は、ＶＩＰが１．２５以上である、上記波数範囲（Ｂ－ｉ）～（Ｂ－ｘｘｘｉ）のうちの２０個以上を含むか、もしくは、
測定されるラマンスペクトル内の前記複数の波数範囲は、ＶＩＰが１．２５以上である、上記波数範囲（Ｂ－ｉ）～（Ｂ－ｘｘｘｉ）のうちの２５個以上を含むか、もしくは、
測定されるラマンスペクトル内の前記複数の波数範囲は、ＶＩＰが１．２５以上である、上記波数範囲（Ｂ－ｉ）～（Ｂ－ｘｘｘｉ）のうちの３０個を含むか、もしくは、
測定されるラマンスペクトル内の前記複数の波数範囲は、ＶＩＰが１．２５以上である、上記波数範囲（Ｂ－ｉ）～（Ｂ－ｘｘｘｉ）のうちの３１個すべてを含み；または、
（Ｃ）
測定されるラマンスペクトル内の前記複数の波数範囲は、以下に列挙される、変数重要度指標（ＶＩＰ）が１．５０以上である、波数範囲：（Ｃ－ｉ）４２０～４２０ｃｍ－１；（Ｃ－ｉｉ）４６７～４７１ｃｍ－１；（Ｃ－ｉｉｉ）４７４～４８１ｃｍ－１；（Ｃ－ｉｖ）５０５～５２９ｃｍ－１；（Ｃ－ｖ）５３７～５４３ｃｍ－１；（Ｃ－ｖｉ）８３６～８８４ｃｍ－１；（Ｃ－ｖｉｉ）８９７～９０２ｃｍ－１；（Ｃ－ｖｉｉｉ）９１９～９３７ｃｍ－１；（Ｃ－ｉｘ）９９５～１０４３ｃｍ－１；（Ｃ－ｘ）１０４６～１０４６ｃｍ－１；（Ｃ－ｘｉ）１０４９～１０７１ｃｍ－１；（Ｃ－ｘｉｉ）１０８４～１１４４ｃｍ－１；（Ｃ－ｘｉｉｉ）１２０９～１２１０ｃｍ－１；（Ｃ－ｘｉｖ）１２７１～１２７３ｃｍ－１；（Ｃ－ｘｖ）１２７７～１３０２ｃｍ－１；（Ｃ－ｘｖｉ）１３４７～１３６６ｃｍ－１；（Ｃ－ｘｖｉｉ）１３８６～１４３３ｃｍ－１；（Ｃ－ｘｖｉｉｉ）１４４４～１４６１ｃｍ－１；（Ｃ－ｘｉｘ）１４６７～１４６９ｃｍ－１；（Ｃ－ｘｘ）１６１０～１６１２ｃｍ－１；（Ｃ－ｘｘｉ）１６２９～１６３０ｃｍ－１および（Ｃ－ｘｘｉｉ）１６５５～１６７１ｃｍ－１のうちの５個以上を含むか、もしくは、
測定されるラマンスペクトル内の前記複数の波数範囲は、ＶＩＰが１．５０以上である、上記波数範囲のうちの１０個以上を含むか、もしくは、
測定されるラマンスペクトル内の前記複数の波数範囲は、ＶＩＰが１．５０以上である、上記波数範囲のうちの１５個以上を含むか、もしくは、
測定されるラマンスペクトル内の前記複数の波数範囲は、ＶＩＰが１．５０以上である、上記波数範囲のうちの２０個以上を含むか、もしくは、
測定されるラマンスペクトル内の前記複数の波数範囲は、ＶＩＰが１．５０以上である、上記波数範囲のうちの２２個すべてを含み；かつ／または、
（Ｄ）
測定されるウイルス力価は、レンチウイルス力価である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
（Ａ’）測定されるラマンスペクトル内の前記複数の波数範囲は、以下に列挙される、ＶＩＰが１．００以上である、波数範囲：（Ａ’－ｉ）４２０～４２０ｃｍ－１；（Ａ’－ｉｉ）５１０～５１７ｃｍ－１；（Ａ’－ｉｉｉ）８４４～８６３ｃｍ－１；（Ａ’－ｉｖ）９９２～１０３７ｃｍ－１；（Ａ’－ｖ）１０５７～１０６９ｃｍ－１；（Ａ’－ｖｉ）１１１２～１１３７ｃｍ－１；（Ａ’－ｖｉｉ）１１８２～１１８４ｃｍ－１；（Ａ’－ｖｉｉｉ）１１９３～１１９９ｃｍ－１；（Ａ’－ｉｘ）１３３３～１３８０ｃｍ－１；（Ａ’－ｘ）１４１０～１４６１ｃｍ－１；（Ａ’－ｘｉ）１５８３～１５８６ｃｍ－１および（Ａ’－ｘｉｉ）１５９４～１６９２ｃｍ－１のうちの４個以上を含むか、もしくは、
測定されるラマンスペクトル内の前記複数の波数範囲は、ＶＩＰが１．００以上である、上記波数範囲（Ａ’－ｉ）～（Ａ’－ｘｉｉ）のうちの６個以上を含むことができるか、もしくは、
測定されるラマンスペクトル内の前記複数の波数範囲は、ＶＩＰが１．００以上である、上記波数範囲（Ａ’－ｉ）～（Ａ’－ｘｉｉ）のうちの８個以上を含むことができるか、もしくは、
測定されるラマンスペクトル内の前記複数の波数範囲は、ＶＩＰが１．００以上である、上記波数範囲（Ａ’－ｉ）～（Ａ’－ｘｉｉ）のうちの１０個以上を含むことができるか、もしくは、
測定されるラマンスペクトル内の前記複数の波数範囲は、ＶＩＰが１．００以上である、上記波数範囲（Ａ’－ｉ）～（Ａ’－ｘｉｉ）のうちの１２個すべてを含むことができ；または、
（Ｂ’）
測定されたラマンスペクトル内の前記複数の波数範囲は、以下に列挙される、ＶＩＰが１．２５以上である、波数範囲：（Ｂ’－ｉ）５１２～５１５ｃｍ－１；（Ｂ’－ｉｉ）８４６～８６２ｃｍ－１；（Ｂ’－ｉｉｉ）９９３～１０３６ｃｍ－１；（Ｂ’－ｉｖ）１０６０～１０６６ｃｍ－１；（Ｂ’－ｖ）１１１５～１１３４ｃｍ－１；（Ｂ’－ｖｉ）１３５２～１３７６ｃｍ－１；（Ｂ’－ｖｉｉ）１４１５～１４５５ｃｍ－１；（Ｂ’－ｖｉｉｉ）１５９６～１６１１ｃｍ－１；（Ｂ’－ｉｘ）１６２６～１６２６ｃｍ－１および（Ｂ’－ｘ）１６３５～１６７８ｃｍ－１のうちの４個以上を含むか、もしくは、
測定されるラマンスペクトル内の前記複数の波数範囲は、ＶＩＰが１．２５以上である、上記波数範囲（Ｂ’－ｉ）～（Ｂ’－ｘ）のうちの６個以上を含むか、もしくは、
測定されるラマンスペクトル内の前記複数の波数範囲は、ＶＩＰが１．２５以上である、上記波数範囲（Ｂ’－ｉ）～（Ｂ’－ｘ）のうちの８個以上を含むか、もしくは、
測定されるラマンスペクトル内の前記複数の波数範囲は、ＶＩＰが１．２５以上である、上記波数範囲（Ｂ’－ｉ）～（Ｂ’－ｘ）のうちの１０個すべてを含み；または、
（Ｃ’）
測定されるラマンスペクトル内の前記複数の波数範囲は、以下に列挙される、ＶＩＰが１．５０以上である、波数範囲：（Ｃ’－ｉ）８４８～８６１ｃｍ－１；（Ｃ’－ｉｉ）９９４～１０３５ｃｍ－１；（Ｃ’－ｉｉｉ）１１１９～１１２９ｃｍ－１；（Ｃ’－ｉｖ）１３５５～１３６３ｃｍ－１；（Ｃ’－ｖ）１４２５～１４３１ｃｍ－１；（Ｃ’－ｖｉ）１５９７～１６０８ｃｍ－１；（Ｃ’－ｖｉｉ）１６３８～１６４４ｃｍ－１および（Ｃ’－ｖｉｉｉ）１６５２～１６５８ｃｍ－１のうちの４個以上を含むか、もしくは、
測定されるラマンスペクトル内の前記複数の波数範囲は、ＶＩＰが１．５０以上である、上記波数範囲（Ｃ’－ｉ）～（Ｃ’－ｖｉｉｉ）のうちの６個以上を含むことができるか、もしくは、
測定されるラマンスペクトル内の前記複数の波数範囲は、ＶＩＰが１．５０以上である、上記波数範囲（Ｃ’－ｉ）～（Ｃ’－ｖｉｉｉ）のうちの８個すべてを含むことができ；かつ／または、
（Ｄ’）
測定された前記ウイルス力価は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）力価である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
測定された前記ウイルス力価は、物理的ウイルス力価または機能的ウイルス力価である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
（ｉ）測定された前記ウイルス力価は、ＨＩＶ－１またはＨＩＶ－１ウイルス様粒子（ＨＩＶ－１ ＶＬＰ）の力価ではなく；かつ／または、（ｉｉ）前記ラマン分光法は、表面増強ラマン分光法ではない、
請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記ウイルス力価は、インサイチューで前記ウイルス培養物から取得された波数信号強度データセットから定量化される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記方法は、最初の時点での前記ウイルス培養物中の前記ウイルス力価を定量化する第１のステップと、後の時点での前記ウイルス培養物中の前記ウイルス力価を定量化する１つ以上のさらなるステップとを含み、時点間の前記ウイルス培養物中のウイルス力価の変化を測定するステップをさらに含み、各定量化ステップは、請求項１に記載の方法によって実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
（ｉ）各定量化ステップは、同じ方法によって実行され；かつ／または、（ｉｉ）ウイルス力価は、リアルタイムでウイルス力価の変化の測定値を提供するために、ある期間にわたって繰り返し定量化され；かつ／または、
（ｉｉｉ）前記ウイルス培養物中のウイルス力価の変化を使用して、ウイルス産生プロセスの開始段階、産生段階、および／もしくは定常段階を決定する、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
（ｉ）前記方法は、ウイルス産生プロセスの最適条件を決定するために使用され；かつ／または、（ｉｉ）前記方法は、ウイルス産生プロセスの下流のプロセスを評価するために使用される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記方法は、それによって取得された前記ウイルス力価を、代替の方法によって同じウイルス培養物から取得されたウイルス力価と比較するステップを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記代替の方法は、ＲＴ－ｑＰＣＲまたはｐ２４ ＥＬＩＳＡである、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
ラマン分光法を使用してウイルス培養物中のウイルス力価を定量化する方法であって、前記方法は、（ａ）前記ウイルス培養物についての波数信号強度データセットを提供するステップであって、前記波数信号強度データセットは、前記ウイルス培養物内の未処理のウイルス培養培地を光源で照射し、複数の波数範囲のそれぞれ１つの中でラマン散乱光の総強度を測定することによって取得されたものであり、ラマンスペクトルの前記複数の波数範囲は、前記ウイルス培養物内のウイルスの特徴として選択されたものであるステップと、
（ｂ）前記波数信号強度データセットに対して数学的データ処理ステップを実行するステップと、
（ｃ）前記数学的データ処理ステップの出力に基づいて前記ウイルス力価を定量化するステップとを含む、方法。
【請求項19】
前記方法は、請求項２～１７のいずれか一項に記載されたステップに従って実行される、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
ウイルス培養物について取得されたラマン分光法の波数信号強度データセットから前記ウイルス培養物中のウイルス力価の定量化を提供することができる多変量データ処理モデルを構築する方法であって、（ａ）前記ウイルス培養物を提供し、前記ウイルス培養物内の未処理のウイルス培養培地を光源で照射するステップと、
（ｂ）複数の波数範囲のそれぞれ１つの中でラマン散乱光の総強度を測定して、前記ウイルス培養物についての波数信号強度データセットを取得するステップと、
（ｃ）前処理分析法を使用して前記波数信号強度データセットを前処理することにより、正規化された波数信号強度データを取得するステップと、
（ｄ）前記前処理された波数信号強度データに多変量回帰アルゴリズムを適用することによってモデルパラメータを取得するステップであって、キャリブレーションが実行され、前記前処理された信号強度データは、非ラマン分光法を使用して同じウイルス培養物条件で取得されたウイルス力価データと比較されるステップと、
（ｅ）前記前処理されたデータから取得されたモデルパラメータを使用して応答値を推測するステップと、
（ｆ）変数選択を実行し、ラマンスペクトル変数を特定するステップとを含み、
ウイルス培養物中のウイルス力価は、前記多変量データ処理モデルから導出された前記特定されたラマンスペクトル変数に対して取得された前記モデルパラメータを使用して定量化される、方法。
【請求項21】
前記前処理分析法は、一次微分法、二次微分法、標準正規変量（ＳＮＶ）法、多項式フィッティング法、マルチ多項式フィッティング法、モリファイア法、ピースワイズ多項式フィッティング（ＰＰＦ）法、または適応型の反復的に再重み付けされたペナルティ付き最小二乗（ａｉｒＰＬＳ）法である、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記多変量回帰アルゴリズムは、部分最小二乗（ＰＬＳ）回帰アルゴリズムである、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項23】
前記部分最小二乗（ＰＬＳ）回帰アルゴリズムは、非線形反復部分最小二乗（ＮＩＰＡＬＳ）回帰アルゴリズムまたはニューラルネットワークである、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記非ラマン分光法は、ｑＰＣＲおよびｐ２４ ＥＬＩＳＡである、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
変数選択は、変数重要度指標（ＶＩＰ）である、請求項２０～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
ステップ（ｄ）～（ｆ）を再適用することにより、モデリングの１つ以上のさらなるラウンドが実行され、重要でない変数が削除される、請求項２０～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
サンプル中のウイルス力価を定量化するためのラマン分光法の使用であって、前記サンプルは、未処理のウイルス培養物であり、前記ウイルス力価は、インサイチューで前記サンプルから取得されたラマン散乱光の強度の測定値に基づいて定量化され、ここで、前記サンプル中の前記ウイルス力価は、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法を実施することによって定量化され、ラマン散乱光の前記強度は、前記サンプル中のウイルスの特徴であるラマンスペクトルの複数の波数範囲から測定される、使用。
【請求項28】
前記サンプル中の前記ウイルス力価は、最初の時点および１つ以上の後の時点で定量化され、時点間の前記サンプル中のウイルス力価の変化が計算される、請求項２７に記載の使用。
【請求項29】
前記サンプル中の前記ウイルス力価は、ウイルス力価の変化の測定値をリアルタイムで提供するために繰り返し定量化される、請求項２８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ウイルス力価のモニタリングおよび評価のためのラマン分光法の使用に関する。
【背景技術】
【0002】
ウイルスベクターの製造は、多くの細胞の産生および遺伝子治療にとって重要なプロセスステップであり、この業界の成長により、ウイルスベクターの供給に対する需要が高まっている。これを考慮して、ウイルスベクター産生プロセスをモニタリングおよび最適化できること、およびウイルスベクター産物を定量化および特性評価できることを保証するための分析ツールが利用可能であることが重要である。ウイルスベクターの需要と産生コストの両方が、産生中に良好なウイルスベクター力価を達成することを特に重要視している。現在、物理的ウイルス力価の測定は、通常、標準的な分析技術によって実行され、例えば、レンチウイルス力価の場合、ｐ２４を評価するためのＥＬＩＳＡまたはウイルスＲＮＡの測定のためのｑＰＣＲ、およびＡＡＶの場合、ＩＴＲを標的とするプライマーを使用したＲＴ ｑＰＣＲが頻繁に使用される。しかしながら、これらの方法は時間がかかり、多くの場合不正確であり、培地のサンプリングが必要である。したがって、これらの方法は、ウイルス濃度の遡及的測定のみを提供する。したがって、ウイルス力価を測定するための新しい方法が必要である。
【0003】
ラマン分光法は振動型の分光法であり、分子情報が必要なプロセス分析技術（ＰＡＴ）用途に特に有用であることが示されている。この手法は、サンプル内に存在する分子によって非弾性的に散乱された光子の波長シフトの検出に基づいている（このような光子の波長の違いは、基底状態から第１励起状態へ特定の分子の振動状態を変更することによって光子から失われるエネルギーに関連するか、または励起された振動状態から基底状態への下方遷移分子からの光子によって得られるエネルギーに関連する）。この手法には、ＰＡＴ用途で以前に使用された方法論に比べて多くの利点があり、特に、他のシステムと比較して水によって生成される信号が比較的弱いため、溶液中のバイオプロセスモニタリング、細胞培養分析、およびタンパク質分析が容易になる。ラマン分光法は、例えば、分散試験に、そして原材料および細胞培養培地の同一性を決定するため、高分子製品を特徴づけるため、薬物製剤、バッチ間の変動、汚染、培地の分解、生細胞密度および総細胞密度を含む細胞密度、タンパク質構造、およびタンパク質の安定性を分析するため、ポリマーおよび繊維分析のため、材料ＩＤテストのため、およびグルコース、グルタミン、乳酸塩、およびアンモニアの定量のために使用されてきた。ＢｕｃｋｌｅｙおよびＲｙｄｅｒ（２０１７）は、ラマン分光法の適用性のレビューを提供している。
【0004】
しかしながら、従来のラマン分光法は、生物学分野でしばしば必要とされる高感度の定量分析への使用に影響を与えることが報告されている弱い信号の生成に関連している。実際、従来のラマン分光法を使用したグルコース検出の濃度限界は０．６ｍＭであると報告されており、フェニルアラニンの濃度限界は１．１ｍＭである（それぞれ０．１１ｍｇ／ｍｌおよび０．１８ｍｇ／ｍｌと等価であると推定される）と報告されている（ＢｕｃｋｌｅｙおよびＲｙｄｅｒ， ２０１７， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ， ７１， ｐ１０８５－１１１６）。これを考慮して、従来のラマン分光法は、主に当技術分野で細胞培養培地および細胞増殖を評価するために使用されてきており、例えば、ウイルス粒子などの、従来のラマン分光法の報告された検出限界未満のエンティティを検出するために、より感度の高い測定が必要な場合は、他の方法が採用されてきた。この点で、Ｌｅｅら（２０１５）は、ＨＩＶ－１の検出のための表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）の使用について説明している。ＳＥＲＳは、従来のラマンとは異なり、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｕなどのナノスケールで粗面化された金属表面に付着した分子からの信号を増強する。Ｌｅｅらでは、結合した抗ｇｐ１２０抗体フラグメントを含むＡｕナノドットで製造されたインジウムスズ酸化物基板をＨＩＶ－１ウイルス様粒子の特異的結合に使用して、ＨＩＶ－１ウイルス様粒子検出のための増強された信号の生成を確実にした。しかしながら、ＳＥＲＳには、適切な免疫相互作用分子を使用して基板を事前に準備する必要があるなどの制限があり、これは技術の一般的な用途を制限し、これに関連するコストが増加する。さらに、ＳＥＲＳは、対象のエンティティに結合するという要件の性質上、サンプル内では常に侵襲的である。
【0005】
したがって、ウイルスなどの敏感な信号または弱い信号に関連する可能性のあるエンティティを特徴付けて評価し、そのようなエンティティをインサイチューで評価するために、さらなる方法が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
驚くべきことに、当技術分野における教示とは正反対に、本発明者らは、従来のラマン分光法を使用して、リアルタイムにインサイチューでウイルス力価を正確かつ高感度に定量化できることを示した。本発明者らは、従来のラマンスペクトルによって決定されるようなウイルス力価が、（例えば、ＲＴ－ｑＰＣＲおよびｐ２４ ＥＬＩＳＡなどのオフラインアッセイによって測定されるような）オフライン力価測定に匹敵すること、および従来のラマン分光法がウイルス力価を評価するために代替の迅速で信頼できる方法を提供できることを示した。前述のように、この発見は、従来のラマン分光法が弱いシグナルの生成に関連し、例えばバルク溶液システム、特に散乱変動が大きく、不要な蛍光バックグラウンドシグナルが存在するシステムに適用した場合、溶液中の低濃度のウイルスが従来のラマン分光法を使用することによる典型的な検出下限を下回ると理解されていた従来技術を考慮すると、特に予想外である。
【0007】
特に、本発明者らは、リアルタイムラマン分光法データを処理するモデルで予測を可能にしてリアルタイムウイルス力価の測定を達成するのに重要な一連のスペクトル変数を特定した。本発明者らは、ラマン分光法を使用する場合のウイルス力価の正確な予測のための変数範囲を提供するために、異なる重要性閾値を有する増加する数の変数の層化範囲を確立した。本発明者らは、ラマン分光法を使用して、ウイルス産生プロセスの開始、産生段階、および終了を特定できることを示した。
【0008】
したがって、本発明は、サンプル中のウイルス力価のモニタリングおよび／または評価のためのラマン分光法の使用に関する。別の見方をすると、本発明は、多変量モデルを使用してウイルスを含むサンプルのラマンスペクトルを分析し、ウイルス力価を決定するステップを含む、サンプル中のウイルス力価をモニタリングおよび／または評価するための方法に関する。そのような方法は、サンプルに対してラマン分光法を実行するステップ、すなわちスペクトルを得るためのステップをさらに含むことができる。
【0009】
本発明はさらに具体的に、ウイルス産生プロセスの開始、産生段階、および／または終了のモニタリングおよび／または評価のためのラマン分光法の使用に関する。本発明者らは、上記のように、ラマン分光法をウイルス力価の決定に使用できることを特定し、特に本発明者らは、この目的のために評価を必要とする具体的な波数範囲を特定した。そのようなピークの強度は、本発明の方法で決定することができ、そのようなピークの強度は、ウイルス力価を決定するために多変量モデルで評価することができるフィンガープリントの生成をもたらすことができる。本発明の好ましい一実施形態において、モニタリングおよび／または評価されるウイルス力価は、レンチウイルス力価である。
【0010】
本発明の１つの利点は、ウイルス力価をリアルタイムに継続的にモニタリングできることである。ウイルス力価の推定値を生成するために培地からサンプルを採取する必要はなく、必要に応じてインサイチューで測定を行うことができる。したがって、汚染のリスクなしに、ウイルス力価のより正確な傾向を生み出すことができる。したがって、本発明の方法は、オフラインの方法よりも高速で単純である。特に、培養物の産生段階をはるかにより正確に測定できるため、ウイルス産生の終了／採取段階のタイミングがより正確になり、適切な時点でプロセスを停止でき、産生プロセスのコストを潜在的に削減する。
【課題を解決するための手段】
【0011】
したがって、本発明は、ラマン分光法を使用してサンプル中のウイルス力価を定量化する方法であって、本方法は、
（ａ）サンプルを提供し、サンプルを光源で照射するステップと、
（ｂ）複数の波数範囲のそれぞれ１つの中でラマン散乱光の総強度を測定して、サンプルの波数強度データのセットを取得するステップであって、複数の波数範囲は、事前に選択されており、サンプル内のウイルスに特徴的であるステップと、
（ｃ）波数強度データに対して数学的データ処理ステップを実行するステップと、
（ｄ）数学的データ処理ステップの出力に基づいてウイルス力価を定量化するステップとを含む、方法を提供する。
（ａ）サンプルを提供し、サンプルを光源で照射するステップと、
（ｂ）複数の波数範囲のそれぞれ１つの中でラマン散乱光の総強度を測定して、サンプルの波数強度データのセットを取得するステップであって、複数の波数範囲は、事前に選択されており、サンプル内のウイルスに特徴的であるステップと、
（ｃ）波数強度データに対して数学的データ処理ステップを実行するステップと、
（ｄ）数学的データ処理ステップの出力に基づいてウイルス力価を定量化するステップとを含む、方法を提供する。
【0012】
上記で定義された方法において、数学的データ処理を実行し、ウイルス力価を定量化するステップは、
（ｉ）任意選択で、一次微分法、二次微分法、標準正規変量（ＳＮＶ）法、多項式フィッティング法、マルチ多項式フィッティング法、モリファイア法、ピースワイズ多項式フィッティング（ＰＰＦ）法、または適応型の反復的に再重み付けされたペナルティ付き最小二乗（ａｉｒＰＬＳ）法などの１つ以上の前処理分析法を使用して信号強度データを前処理することにより、波数信号強度データを正規化するステップと、
（ｉｉ）波数信号強度データに部分最小二乗（ＰＬＳ）回帰アルゴリズムなどの多変量回帰アルゴリズムを適用することによってモデルパラメータを取得するステップであって、任意選択で、ＰＬＳアルゴリズムは、非線形反復部分最小二乗（ＮＩＰＡＬＳ）回帰アルゴリズムまたはニューラルネットワークであるステップと、
（ｉｉｉ）多変量回帰アルゴリズムを信号強度データに適用して取得されたモデルパラメータを使用して、ウイルス力価を定量化するステップとを含むことができる。
（ｉ）任意選択で、一次微分法、二次微分法、標準正規変量（ＳＮＶ）法、多項式フィッティング法、マルチ多項式フィッティング法、モリファイア法、ピースワイズ多項式フィッティング（ＰＰＦ）法、または適応型の反復的に再重み付けされたペナルティ付き最小二乗（ａｉｒＰＬＳ）法などの１つ以上の前処理分析法を使用して信号強度データを前処理することにより、波数信号強度データを正規化するステップと、
（ｉｉ）波数信号強度データに部分最小二乗（ＰＬＳ）回帰アルゴリズムなどの多変量回帰アルゴリズムを適用することによってモデルパラメータを取得するステップであって、任意選択で、ＰＬＳアルゴリズムは、非線形反復部分最小二乗（ＮＩＰＡＬＳ）回帰アルゴリズムまたはニューラルネットワークであるステップと、
（ｉｉｉ）多変量回帰アルゴリズムを信号強度データに適用して取得されたモデルパラメータを使用して、ウイルス力価を定量化するステップとを含むことができる。
【0013】
上記で定義された方法のいずれにおいても、サンプルを照射するために使用される光源はレーザとすることができ、サンプルは、７８５ｎｍの波長を有する光で照射することができる。
【0014】
上記で定義された方法のいずれにおいても、ラマン散乱光は、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）を使用して検出することができる。
【0015】
上記で定義された方法の一実施形態では、測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、表１に列挙されるような、変数重要度指標（ＶＩＰ）が１．００以上である、波数範囲１～２８のうちの５個以上を含むことができるか、または、測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、表１に列挙されるような、ＶＩＰが１．００以上である、波数範囲１～２８のうちの１０個以上を含むことができるか、または、測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、表１に列挙されるような、ＶＩＰが１．００以上である、波数範囲１～２８のうちの１５個以上を含むことができるか、または、測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、表１に列挙されるような、ＶＩＰが１．００以上である、波数範囲１～２８のうちの２０個以上を含むことができるか、または、測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、表１に列挙されるような、ＶＩＰが１．００以上である、波数範囲１～２８のうちの２５個以上を含むことができるか、または、測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、表１に列挙されるような、ＶＩＰが１．００以上である、波数範囲１～２８のうちの２８個すべてを含むことができる。これらの方法のいずれにおいても、測定されるウイルス力価は、好ましくはレンチウイルス力価とすることができる。
【0016】
測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、その代わりに、表１に列挙されるような、変数重要度指標（ＶＩＰ）が１．２５以上である、波数範囲２９～５９のうちの５個以上を含むことができるか、または、測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、表１に列挙されるような、ＶＩＰが１．２５以上である、波数範囲２９～５９のうちの１０個以上を含むことができるか、または、測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、表１に列挙されるような、ＶＩＰが１．２５以上である、波数範囲２９～５９のうちの１５個以上を含むことができるか、または、測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、表１に列挙されるような、ＶＩＰが１．２５以上である、波数範囲２９～５９のうちの２０個以上を含むことができるか、または、測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、表１に列挙されるような、ＶＩＰが１．２５以上である、波数範囲２９～５９のうちの２５個以上を含むことができるか、または、測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、表１に列挙されるような、ＶＩＰが１．２５以上である、波数範囲２９～５９のうちの３０個を含むことができるか、または、測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、表１に列挙されるような、ＶＩＰが１．２５以上である、波数範囲２９～５９のうちの３１個すべてを含むことができる。これらの方法のいずれにおいても、測定されるウイルス力価は、好ましくはレンチウイルス力価とすることができる。
【0017】
測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、その代わりに、表１に列挙されるような、変数重要度指標（ＶＩＰ）が１．５０以上である、波数範囲６０～８１のうちの５個以上を含むことができるか、または、測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、表１に列挙されるような、ＶＩＰが１．５０以上である、波数範囲６０～８１のうちの１０個以上を含むことができるか、または、測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、表１に列挙されるような、ＶＩＰが１．５０以上である、波数範囲６０～８１のうちの１５個以上を含むことができるか、または、測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、表１に列挙されるような、ＶＩＰが１．５０以上である、波数範囲６０～８１のうちの２０個以上を含むことができるか、または、測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、表１に列挙されるような、ＶＩＰが１．５０以上である、波数範囲６０～８１のうちの２２個すべてを含むことができる。これらの方法のいずれにおいても、測定されるウイルス力価は、好ましくはレンチウイルス力価とすることができる。
【0018】
上記で定義された方法の別の一実施形態では、測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、表２に列挙されるような、ＶＩＰが１．００以上である、波数範囲１～１２のうちの４個以上を含むことができる。測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、表２に列挙されるような、ＶＩＰが１．００以上である、波数範囲１～１２のうちの６個以上を含むことができる。測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、表２に列挙されるような、ＶＩＰが１．００以上である、波数範囲１～１２のうちの８個以上を含むことができる。測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、表２に列挙されるような、ＶＩＰが１．００以上である、波数範囲１～１２のうちの１０個以上を含むことができる。測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、表２に列挙されるような、ＶＩＰが１．００以上である、波数範囲１～１２のうちの１２個すべてを含むことができる。これらの方法のいずれにおいても、測定されるウイルス力価は、好ましくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）とすることができる。
【0019】
測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、表２に列挙されるような、ＶＩＰが１．２５以上である、波数範囲１３～２２のうちの４個以上を含むことができる。測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、表２に列挙されるような、ＶＩＰが１．２５以上である、波数範囲１３～２２のうちの６個以上を含むことができる。測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、表２に列挙されるような、ＶＩＰが１．２５以上である、波数範囲１３～２２のうちの８個以上を含むことができる。測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、表２に列挙されるような、ＶＩＰが１．２５以上である、波数範囲１３～２２のうちの１０個すべてを含むことができる。これらの方法のいずれにおいても、測定されるウイルス力価は、好ましくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）とすることができる。
【0020】
測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、表２に列挙されるような、ＶＩＰが１．５０以上である、波数範囲２３～３０のうちの４個以上を含むことができる。測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、表２に列挙されるような、ＶＩＰが１．５０以上である、波数範囲２３～３０のうちの６個以上を含むことができる。測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、表２に列挙されるような、ＶＩＰが１．５０以上である、波数範囲２３～３０のうちの８個すべてを含むことができる。これらの方法のいずれにおいても、測定されるウイルス力価は、好ましくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）とすることができる。
【0021】
上記で定義された方法のいずれにおいても、測定されるウイルス力価は、物理的ウイルス力価とすることができる。
【0022】
上記で定義された方法のいずれにおいても、測定されるウイルス力価は、機能的ウイルス力価とすることができる。
【0023】
上記で定義された方法のいずれにおいても、測定されるウイルス力価は、ＨＩＶ－１またはＨＩＶ－１ウイルス様粒子（ＨＩＶ－１ ＶＬＰ）の力価ではない可能性がある。
【0024】
上記で定義された方法のいずれにおいても、サンプル内で検出されるウイルス粒子が表面に固定化されるように、サンプルは処理されない。したがって、上記で定義された方法のいずれにおいても、ウイルス粒子は表面に固定化されない。
【0025】
上記で定義された方法のいずれにおいても、ラマン分光法は、表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）ではない。
【0026】
上記で定義された方法のいずれにおいても、サンプルはウイルス培養物とすることができ、ウイルス力価は、インサイチューで培養物から取得された波数強度データのセットから定量化することができる。
【0027】
上記で定義された方法のいずれにおいても、サンプルは、ウイルス培養物の培地から取得されたサンプルとすることができ、ウイルス力価は、サンプルから取得された波数強度データのセットから定量化することができる。
【0028】
上記で定義された方法のいずれにおいても、本方法は、最初の時点でのサンプル中のウイルス力価を定量化する第１のステップと、後の時点でのサンプル中のウイルス力価を定量化する１つ以上のさらなるステップとを含むことができる。方法は、時点間のサンプル中のウイルス力価の変化を測定するステップをさらに含むことができ、各定量化ステップは、上記で定義された方法のいずれかによって実行され、好ましくは、各定量化ステップは、同じ方法によって実行される。そのような方法のいずれにおいても、ウイルス力価は、リアルタイムでウイルス力価の変化の測定値を提供するために、ある期間にわたって繰り返し定量化することができる。そのような方法のいずれにおいても、サンプル中のウイルス力価の変化を使用して、ウイルス産生プロセスの開始段階、産生段階、および／または定常段階を決定することができる。
【0029】
上記で定義された方法のいずれにおいても、本方法を使用して、ウイルス産生プロセスの最適条件を決定することができる。
【0030】
上記で定義された方法のいずれにおいても、本方法は、ウイルス産生プロセスの下流のプロセスを評価するために使用することができる。
【0031】
上記で定義された方法のいずれにおいても、本方法は、それによって取得されたウイルス力価を、代替の方法によって同じサンプルから取得されたウイルス力価と比較するステップを含むことができ、任意選択で、代替の方法は、ＲＴ－ｑＰＣＲまたはｐ２４ ＥＬＩＳＡである。
【0032】
本発明はまた、ラマン分光法を使用して個人のウイルス感染の程度を決定する方法であって、本方法は、サンプル中のウイルス力価を定量化する上記で定義された方法のいずれかを実施することによってサンプル中のウイルス力価を定量化するステップを含み、サンプルは個人から以前に取得されたサンプルである。そのような方法のいずれにおいても、サンプルは、血液、唾液、喀痰、血漿、血清、脳脊髄液、尿、または糞便のサンプルとすることができる。そのような方法において、対象からのサンプル中のウイルス力価は、個人の感染段階の予後を提供するために、個人の感染について以前に取得された１つ以上のウイルス力価測定値と比較することができる。
【0033】
本発明はまた、ラマン分光法を使用してサンプル中のウイルス力価を定量化する方法であって、本方法は、
（ａ）サンプルについての波数強度データのセットを提供するステップであって、データのセットは、サンプルを光源で照射し、複数の波数範囲のそれぞれ１つの中でラマン散乱光の総強度を測定することによって取得されたものであり、ラマンスペクトルの複数の波数範囲は、サンプル内のウイルスの特徴として選択されたものであるステップと、
（ｂ）波数強度データに対して数学的データ処理ステップを実行するステップと、
（ｃ）数学的データ処理ステップの出力に基づいてウイルス力価を定量化するステップとを含む。
（ａ）サンプルについての波数強度データのセットを提供するステップであって、データのセットは、サンプルを光源で照射し、複数の波数範囲のそれぞれ１つの中でラマン散乱光の総強度を測定することによって取得されたものであり、ラマンスペクトルの複数の波数範囲は、サンプル内のウイルスの特徴として選択されたものであるステップと、
（ｂ）波数強度データに対して数学的データ処理ステップを実行するステップと、
（ｃ）数学的データ処理ステップの出力に基づいてウイルス力価を定量化するステップとを含む。
【0034】
この特定の方法は、サンプル中のウイルス力価を定量化する上記で定義された方法のいずれか１つで定義されたステップに従って実行することができる。
【0035】
本発明はまた、サンプルについて取得されたラマン分光法の波数強度データのセットからサンプル中のウイルス力価の定量化を提供することができる多変量データ処理モデルを構築する方法であって、
（ａ）サンプルを提供し、サンプルを光源で照射するステップと、
（ｂ）複数の波数範囲のそれぞれ１つの中でラマン散乱光の総強度を測定して、サンプルについての波数強度データのセットを取得するステップと、
（ｃ）一次微分法、二次微分法、標準正規変量（ＳＮＶ）法、多項式フィッティング法、マルチ多項式フィッティング法、モリファイア法、ピースワイズ多項式フィッティング（ＰＰＦ）法、または適応型の反復的に再重み付けされたペナルティ付き最小二乗（ａｉｒＰＬＳ）法などの前処理分析法を使用して信号強度データを前処理することにより、正規化された波数信号強度データを取得するステップと、
（ｄ）前処理された信号強度データに部分最小二乗（ＰＬＳ）回帰アルゴリズムなどの多変量回帰アルゴリズムを適用することによってモデルパラメータを取得するステップであって、任意選択で、ＰＬＳアルゴリズムは、非線形反復部分最小二乗（ＮＩＰＡＬＳ）回帰アルゴリズムまたはニューラルネットワークであり、キャリブレーションが実行され、前処理された信号強度データは、ｑＰＣＲおよびｐ２４ ＥＬＩＳＡなどの非ラマン分光法を使用して同じサンプル条件で取得されたウイルス力価データと比較されるステップと、
（ｅ）前処理されたデータから取得されたモデルパラメータを使用して応答値を推測するステップと、
（ｆ）変数選択、任意選択で変数重要度指標（ＶＩＰ）を実行し、ラマンスペクトル変数を特定するステップと、
（ｇ）任意選択で、ステップ（ｄ）～（ｆ）を再適用することにより、モデリングの１つ以上のさらなるラウンドを実行し、重要でない変数を削除するステップとを含み、
サンプル中のウイルス力価は、多変量データ処理モデルから導出された特定されたラマンスペクトル変数に対して取得されたモデルパラメータを使用して定量化される、方法を提供する。
（ａ）サンプルを提供し、サンプルを光源で照射するステップと、
（ｂ）複数の波数範囲のそれぞれ１つの中でラマン散乱光の総強度を測定して、サンプルについての波数強度データのセットを取得するステップと、
（ｃ）一次微分法、二次微分法、標準正規変量（ＳＮＶ）法、多項式フィッティング法、マルチ多項式フィッティング法、モリファイア法、ピースワイズ多項式フィッティング（ＰＰＦ）法、または適応型の反復的に再重み付けされたペナルティ付き最小二乗（ａｉｒＰＬＳ）法などの前処理分析法を使用して信号強度データを前処理することにより、正規化された波数信号強度データを取得するステップと、
（ｄ）前処理された信号強度データに部分最小二乗（ＰＬＳ）回帰アルゴリズムなどの多変量回帰アルゴリズムを適用することによってモデルパラメータを取得するステップであって、任意選択で、ＰＬＳアルゴリズムは、非線形反復部分最小二乗（ＮＩＰＡＬＳ）回帰アルゴリズムまたはニューラルネットワークであり、キャリブレーションが実行され、前処理された信号強度データは、ｑＰＣＲおよびｐ２４ ＥＬＩＳＡなどの非ラマン分光法を使用して同じサンプル条件で取得されたウイルス力価データと比較されるステップと、
（ｅ）前処理されたデータから取得されたモデルパラメータを使用して応答値を推測するステップと、
（ｆ）変数選択、任意選択で変数重要度指標（ＶＩＰ）を実行し、ラマンスペクトル変数を特定するステップと、
（ｇ）任意選択で、ステップ（ｄ）～（ｆ）を再適用することにより、モデリングの１つ以上のさらなるラウンドを実行し、重要でない変数を削除するステップとを含み、
サンプル中のウイルス力価は、多変量データ処理モデルから導出された特定されたラマンスペクトル変数に対して取得されたモデルパラメータを使用して定量化される、方法を提供する。
【0036】
多変量データ処理モデルを構築する上記で定義された方法では、サンプル内で検出されるウイルス粒子が表面に固定化されるように、サンプルは処理されない。したがって、多変量データ処理モデルを構築する上記で定義された方法では、ウイルス粒子は表面に固定化されない。多変量データ処理モデルを構築する上記で定義された方法では、ラマン分光法は、表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）ではない。
【0037】
本発明はまた、サンプル中のウイルス力価を定量化するためのラマン分光法の使用を提供する。
【0038】
そのような使用において、サンプルは、ウイルス培養物またはウイルス培養物からのサンプルとすることができ、ウイルス力価は、インサイチューでサンプルから取得されたラマン散乱光の強度の測定値に基づいて定量化することができ、ラマン散乱光の強度は、サンプル中のウイルスの特徴であるラマンスペクトルの複数の波数範囲から測定される。
【0039】
そのような使用において、サンプル中のウイルス力価は、最初の時点および１つ以上の後の時点で定量化することができ、時点間のサンプル中のウイルス力価の変化が計算される。サンプル中のウイルス力価は、ウイルス力価の変化の測定値をリアルタイムで提供するために繰り返し定量化することができる。サンプル中のウイルス力価は、ラマン分光法を使用してサンプル中のウイルス力価を定量化するための上記で定義された方法のいずれかを実施することによって定量化することができる。
【0040】
そのような使用において、サンプル内で検出されるウイルス粒子が表面に固定化されるように、サンプルは処理されない。したがって、そのような使用において、ウイルス粒子は表面に固定化されない。そのような使用において、ラマン分光法は、表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）ではない。
【図面の簡単な説明】
【0041】
【図1】赤外線の吸収／放出の量子エネルギー遷移を示すヤブロンスキー図。この図は、ストークス遷移と反ストークス遷移の両方を伴うレイリー（弾性散乱）およびラマン（非弾性散乱）を示している。
【図2】ＶＶラマンプロジェクトレンチウイルスバイオリアクターのランからの前処理されたラマンスペクトルの例。挿入図は、１０００ｃｍ－１の領域の拡大図である。ＣＣＤ読み出し時間約１５分後、スペクトルは１０秒間、７５回の累積で取得され、合計積分時間は約１２分３０秒であった。
【図3】ウイルスベクターラマンプロジェクトにおけるバイオリアクタートランスフェクションの代表的なｑＰＣＲレンチウイルス力価の結果を示す棒グラフであり、ｃｐ数＝コピー数である。
【図4】１０回の交差検証と２０回のモンテカルロ繰り返し後の予測の平均二乗誤差（ＭＳＥＰＣＶ）が、ＰＬＳ潜在変数／成分（スペクトル変数選択前）の数の関数としてどのように変化するかを示すグラフ。
【図5-1】図５（Ａ）：最初の１０成分のＰＬＳ－Ｒモデルから計算された変数重要度指標（ＶＩＰ）のプロット。円はＶＩＰ＞１．５のスペクトル変数を示し、この情報を使用して図５（Ｂ）に示された範囲を決定した。
【図6】潜在変数または成分数の関数としての交差検証後の予測の平均二乗誤差の変化を示すプロット。ＶＩＰ＞１．５を使用して控えめなスペクトル変数の削減後に取得。
【図7】オフラインｑＰＣＲデータと共にスペクトル変数の削減（ＶＩＰ＞１．５）後のレンチウイルスのラン１バイオリアクター４からのラマンコピー数／ｍＬのＰＬＳ－Ｒ予測（１０ＬＶ）を示すプロット。Ｔは「トランスフェクトされた」を意味し、ＮＴは「トランスフェクトされていない」を意味する。
【図8】オフラインｑＰＣＲデータと共にスペクトル変数の削減（ＶＩＰ＞１．５）後のレンチウイルスのラン２バイオリアクター１～４からのラマンコピー数のＰＬＳ－Ｒ予測（１０ＬＶ）を示すプロット。
【図9】オフラインｑＰＣＲデータと共にスペクトル変数の削減後のレンチウイルスのラン３バイオリアクター１～４からのラマンコピー数のＰＬＳ－Ｒ予測（１０ＬＶ）を示すプロット。
【図10】ＲＴ－ｑＰＣＲの結果とｐ２４ ＥＬＩＳＡの結果の比較。ｐ２４ ＥＬＩＳＡアッセイは、いくつかのオフラインサンプルでレンチウイルス力価を取得するためにのみ使用された。
【図11】ウイルス力価のリアルタイムラマン導出モデルを適用して、ウイルス産生プロセスの開始、産生段階、および終了を特定する例。モデル（黒い実線）から、３つの指標のセットもリアルタイムで計算される。ウイルス力価のモデル推定と共に、指標曲線の形状は、（グラフに重ねられたテキストで説明されるように）ウイルス産生の様々な段階を示す。ＲＴ－ｑＰＣＲ法および／またはＥＬＩＳＡ法のいずれかを使用して遡及的に計算された物理的力価は、リアルタイムデータと遡及的オフラインデータの間の全体的な一致を示すためにグラフ（四角および破線）に重ね合わされている。ラマンスペクトルから追加のピークを含めると、ラマンモデルの品質を向上させることができるが、このプロットは、ウイルス産生の主な段階を特定するために必要な最小数の領域を使用して生成された。
【図12】ウイルス力価を定量化するための式の概略図式を示す。この式は、正規化されたラマン信号強度データに適用された多変量回帰アルゴリズムから取得されたモデルパラメータ（この場合は回帰係数）に適用される。
【図13】レンチウイルス力価の推定値を提供するために必要な波数範囲の最小数を示すために、波数範囲の数の関数としてのＲ２（１－残差平方和／総平方和）のプロットを示す。
【図14】ＡＡＶラマンプロジェクトバイオリアクターのランからの前処理されたラマンスペクトルの例。挿入図は、１０００～１２００ｃｍ－１の領域の拡大図である。ＣＣＤ読み出し時間約１５分後、スペクトルは１０秒間、７５回の累積で取得され、合計積分時間は約１２分３０秒であった。
【図15】ＡＡＶラマンプロジェクトにおけるバイオリアクタートランスフェクションの代表的なｑＰＣＲ ＡＡＶウイルス力価の結果を示す棒グラフ。
【図16】１０回の交差検証と２０回のモンテカルロ繰り返し後の予測の平均二乗誤差（ＭＳＥＰＣＶ）が、ＰＬＳ潜在変数／成分（スペクトル変数選択前）の数の関数としてどのように変化するかを示すグラフ。
【図17-1】図１７（Ａ）：最初の１５成分のＰＬＳ－Ｒモデルから計算された変数重要度指標（ＶＩＰ）のプロット。円はＶＩＰ＞１．０のスペクトル変数を示し、この情報を使用して図１７（Ｂ）に示された範囲を決定した。
【図18】潜在変数または成分数の関数としての交差検証後の予測の平均二乗誤差の変化を示すプロット。ＶＩＰ＞＝１．０を使用してスペクトル変数の削減後に取得。
【図19】オフラインｑＰＣＲデータと共にスペクトル変数の削減後のラン４バイオリアクター１～４からのラマンコピー数のＰＬＳ－Ｒ予測（９ＬＶ）を示すプロット。
【図20】ＡＶＶウイルス力価の推定値を提供するために必要な波数範囲の最小数を示すために、波数範囲の数の関数としてのＲ２（１－残差平方和／総平方和）のプロット。
【発明を実施するための形態】
【0042】
開示された方法の異なる用途は、当技術分野における特定のニーズに合わせて調整され得ることが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、本発明の特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。
さらに、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、内容が明確に別段の指示をしない限り、複数形の参照を含む。
本明細書で引用されたすべての刊行物、特許、および特許出願は、上記または下記を問わず、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
さらに、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、内容が明確に別段の指示をしない限り、複数形の参照を含む。
本明細書で引用されたすべての刊行物、特許、および特許出願は、上記または下記を問わず、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0043】
ウイルス力価
本発明は、ウイルス力価をモニタリングおよび評価するためのラマン分光法の使用を包含する。
本発明は、ウイルス力価をモニタリングおよび評価するためのラマン分光法の使用を包含する。
【0044】
本明細書で定義される場合の「ウイルス力価」は、所与の体積に存在するウイルスの量を指す。任意のタイプのウイルス力価を本発明で評価することができ、例えば、物理的ウイルス力価、機能的ウイルス力価（感染性ウイルス力価とも呼ばれる）、または形質導入ウイルス力価を評価することができる。特定の一実施形態では、物理的ウイルス力価を評価することができる。物理的ウイルス力価は、サンプル中のウイルス粒子の濃度の尺度であり、通常、ｐ２４などのウイルスタンパク質またはウイルス核酸の存在に基づいている。物理的力価は、ｍＬ当たりのウイルス粒子（ＶＰ／ｍＬ）、ｍＬ当たりのウイルスゲノム（ｖｇ／ｍＬ）、ｍＬ当たりのウイルスコピー、またはｍＬ当たりのＲＮＡコピーとして表すことができ、物理的力価を測定するための従来のアッセイには、ｐ２４のＥＬＩＳＡ（例えば、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ｐ２４ Ｒａｐｉｄ Ｔｉｔｅｒキット（Ｔａｋａｒａ）、またはＬｅｎｔｉｖｉｒｕｓ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐ２４ ＥＬＩＳＡキット（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ））、ｑＰＣＲまたはｄｄＰＣＲ（ＡＡＶリアルタイムＰＣＲ滴定キット（Ｔａｋａｒａ）、Ａｄｅｎｏ Ｘ ｑＰＣＲ滴定キット（Ｔａｋａｒａ）））が含まれる。物理的力価の測定では、空のウイルス粒子または欠陥のあるウイルス粒子と、細胞に感染する可能性のある粒子を常に区別するとは限らない。したがって、物理的ウイルス力価は、産生された粒子のいくつが細胞に感染できるかを決定する機能的力価または感染力価、および機能的ウイルス粒子のいくつが目的の遺伝子を含むかを決定する形質導入ウイルス力価（例えば、ウイルスベクターの産生に対して、形質導入ウイルス力価が関連している可能性がある）と区別することができる。したがって、サンプル中のすべての粒子が機能的でない限り、物理的力価の決定は機能的力価の決定と等しくはない。実際、機能的力価はしばしば、物理的力価の１００～１０００分の１である。
【0045】
あるいはまた、上記のように、機能的または感染力価は、本発明で測定または評価することができ、機能的または感染力価は、標的細胞に感染することができる特定の体積に存在するウイルス粒子の量の尺度である。機能的力価は、１ｍＬ当たりのプラーク形成単位（ｐｆｕ／ｍＬ）または１ｍＬ当たりの感染単位（ｉｆｕ／ｍＬ）として表すことができる。機能的または感染力価を測定するために使用できるオフラインアッセイには、プラークアッセイ、焦点形成アッセイ、エンドポイント希釈アッセイ、またはフローサイトメトリーが含まれる。上記のように、形質導入力価は、標的細胞に感染することができ、目的の遺伝子を含む、特定の体積に存在するウイルス粒子の量の尺度である。形質導入力価は、形質導入単位／ｍＬとして表すことができ、目的の遺伝子の存在を決定できる任意の既知のアッセイ、例えばＰＣＲと共に、上記の機能的力価を評価するために使用されるアッセイを使用して評価することができる。当業者は、機能的力価または感染力価が、物理的力価について取得された任意の値を縮小することによって決定できることを理解するであろう。上記のように、物理的力価と機能的力価または形質導入力価との間の倍率の違いは、当技術分野で十分に理解されている。したがって、本発明の一態様では、機能的または形質導入力価は、本発明の方法によって間接的に（例えば、物理的力価について取得された値を縮小することによって）決定することができる。したがって、本発明の方法は、物理的力価の決定を縮小して、機能的または形質導入力価を決定する追加のステップを含むことができる。
【0046】
本発明の方法が、任意の血清型の任意のウイルス、例えば、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ－１およびＨＩＶ－２）およびガンマレトロウイルスなどのレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（例えば、ＡＡＶ１－１１、特にＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、およびＡＡＶ８、および自己相補的ＡＡＶ）のウイルス力価を決定することができることは、当業者によって理解されるであろう。典型的には、単一のウイルスタイプのウイルス力価を本発明で評価することができるが、本発明の方法は、混合ウイルスサンプル、例えば、２つ以上のウイルスタイプを含むサンプルの力価を評価することができるであろう。
【0047】
この点に関して、本発明に従って生成されたラマンスペクトルは、ウイルスを直接検出するか、ウイルスを間接的に検出するか、または直接的および間接的の両方でウイルスを検出するかのいずれかとすることができる。したがって、ラマンスペクトルに生成され、示される波数ピークは、ウイルスに関連するいくつかの異なる化合物または分子のいずれか１つを示している可能性がある。当業者は、本発明の性能にとっては、特定された各波数ピークがどの化合物／分子に関連するかを正確に特定する必要がないことを理解するであろう。代わりに、スペクトルは特定の条件下（例えば、培養条件、ウイルス、プロデューサー細胞株、および測定するウイルス力価のタイプなど）でフィンガープリントとして機能し、ウイルス力価は、特定の多変量モデル（通常、同一または同様の条件下で生成されたもの）を用いて本明細書に開示されている波数範囲の各々での信号の強度の分析によって決定することができる。多変量モデルについては、本明細書で詳しく説明する。したがって、特定の波数で特定のラマンスペクトルに対して取得されるピークは、ウイルス性の分子／化合物（例えば、キャプシドタンパク質など）に対応する場合もあれば、非ウイルス性の分子／化合物（例えば、ウイルス産生細胞によって産生される、例えば、培養中の代謝物）に対応する場合もある。このように、本発明で使用されるラマン分光法は、ウイルス力価に直接関連する化合物を検出するのみならず、またはその代わりに、ウイルス力価に間接的に関連する化合物も検出することができる。
【0048】
各波数範囲での信号の強度は異なる可能性があり、異なる条件（例えば、異なるウイルスの産生、異なるプロデューサー細胞株の使用、または異なる培地またはバイオリアクターの使用）の下で取得されたラマンスペクトルのウイルス力価に異なる対応をする可能性があるが、評価され得る波数範囲（例えば、ウイルス力価に関連すると決定されたもの）は、同じままであることが期待される。さらに、任意の所与の条件のセットについて、ユーザは、本明細書に記載され、当技術分野で知られている原理に基づいて多変量モデルを作成し、本明細書に記載され、その後同じ条件のセットを使用して生成される同じ波数範囲からの異なる信号強度データを分析するときにこのモデルを適用できることを理解するであろう。これは、ユーザが本明細書に記載の波数範囲を使用してラマン分光法を介してウイルス力価を計算でき、データは異なる条件が適用されるシステムで生成されることを意味する。
【0049】
本明細書で使用される波数範囲のレンチウイルス評価は、ウイルス力価の評価において重要である範囲を特定した。レンチウイルスはその化学組成の点で特に複雑なウイルスであることが知られているため、レンチウイルスに存在する成分の一部を有する単純なウイルスの化学成分は、（波数範囲のいずれか１つ以上がウイルスを直接検出する場合、）特定された波数の一部、例えば、特定された波数範囲のうちの少なくとも５個に含まれる関連信号を生成する可能性がある。したがって、本明細書で提供される波数範囲のサブセットを使用して、レンチウイルス以外のウイルスの力価を評価することができる。さらに、ウイルス力価に相関すると特定された波数範囲の１つ以上が間接的にウイルスを検出する場合、ウイルストランスフェクションは培養物に同様の代謝変化をもたらす可能性が高いため、そのような波数範囲は、あらゆるシステムにおけるウイルス力価の評価に役立つ可能性がある。
【0050】
本発明の特定の一実施形態では、レンチウイルス力価がモニタリングおよび評価される。一態様では、ウイルスは、ＨＩＶ－１またはＨＩＶ－１ウイルス様粒子ではない可能性がある。
【0051】
「ウイルス」は通常、別の生物の生細胞内でのみ複製できる小さな感染性病原体（通常は細菌よりも小さい）である。ウイルスは、ＲＮＡまたはＤＮＡベースのゲノムを有し得る。本明細書で使用される場合の「ウイルス」は、任意のウイルス、改変ウイルス、またはウイルスベクターを指す。したがって、任意の野生型ウイルスのウイルス力価を本発明に従って評価することができるが、本発明の有用性は、特に、変異ウイルスまたは改変ウイルス（すなわち、野生型または天然に存在するウイルスと比較して、１つ以上の核酸の置換、挿入、欠失、または転位を含むか、またはウイルスタンパク質をコードする遺伝物質の大部分が存在しない）またはウイルスベクターのウイルス力価の評価にまで及ぶ可能性があることが理解されるであろう。ウイルスベクターは野生型ウイルスに基づくことができるが、それらは一般的に野生型ウイルスと比較して改変されており、遺伝物質を標的細胞に導入するために一般的に使用される（例えば、治療用途の遺伝子）。したがって、ウイルスベクターには、例えば、遺伝子治療、細胞治療、またはその他の分子応用に対して、特定の有用性があり、それらの産生は遺伝子治療および細胞治療産業にとって非常に重要である。例えば、遺伝子および／または細胞治療用のウイルスベクターの安全性を改善するために、または例えばベクターによって運ばれ得る遺伝子のサイズを改善するために改変がなされ得ることがよく理解されるであろう。ウイルスベクターを作成するために行うことができる改変は、複製に重要であるウイルスゲノムの一部の欠失を含むことができ、細胞に感染することができるが、新しいビリオンの産生に必要とされる欠落タンパク質を提供するためにヘルパーウイルスの存在を必要とするウイルスベクターをもたらす。他の改変には、その標的細胞に対するウイルスベクターの毒性を低下させるための、および／またはウイルスの安定性を改善するための、例えば、ゲノムの再配列を減らすための改変が含まれ得る。
【0052】
ウイルスベクターは、典型的には、ＨＥＫ２９３細胞などのパッケージング細胞株において、ウイルスタンパク質をコードし、必要な遺伝物質を運ぶ１つ以上のプラスミドでパッケージング細胞株を形質導入することによって産生することができる。例えば、レンチウイルス産生のために、ＨＥＫ２９３細胞は１つ以上のプラスミド、例えば、キャプシドや逆転写酵素などのビリオンタンパク質をコードし、ベクターによって送達される遺伝物質を運ぶ３つまたは４つのプラスミドで形質導入することができる。これは転写されて一本鎖ＲＮＡウイルスゲノムを生成し、ｐｓｉ配列の存在によってマークされ、これはゲノムがその後ビリオンにパッケージングされることを保証する。したがって、特に、レンチウイルスベクターは、プロデューサー細胞株における３つ（第２世代システムの場合）または４つ（第３世代システムの場合）のプラスミドの形質転換および発現によって産生することができる。ウイルスベクターを産生するためのプラスミドは市販されており、例えば、Ｌｅｎｔｉ－ＰａｃおよびＡＡＶＰｒｉｍｅ（ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ）である。
【0053】
特に、細胞株をパッケージングすることによって産生されるウイルスベクターの力価は、本発明の方法によってモニタリングまたは評価することができる。前述のように、遺伝子治療および細胞治療の分野では、生成された力価を高感度で測定できることが特に重要であり、これにより、例えば、プロデューサー細胞株からの産生などの産生プロセスを正確にモニタリングおよび管理できる。したがって、ウイルスは、本発明の方法によってモニタリングまたは評価されるために完全に機能的または野生型である必要はない。
【0054】
上記のように、本発明の方法は、ウイルス力価を「モニタリングまたは評価」することができる。したがって、本発明の方法は、ウイルス力価、例えば、サンプル中に存在するウイルス粒子のレベル、量、または濃度を決定することができる。したがって、特に、本方法は、ウイルスのレベル、量、または濃度が、（例えば、異なる時点でサンプルをアッセイすることによって）時間の経過とともに増加するか、またはプラトーになるか、または（例えば、同一または同等の時点でアッセイされた）異なるサンプルと比較して変化する（例えば、増加、減少、または同等である）かどうかを決定することができる。このように、本発明の方法は、例えば、高レベルのウイルスの検出または決定が効率的な方法を示し、低レベルのウイルスが次善の産生方法を示し得る場合、例えば、ウイルスの産生方法の効率を評価するために使用できるか、または、例えば、（同じウイルスまたは異なるウイルスに対して）他の改変された産生方法の間に測定されたウイルス力価と比較することによって、ウイルスの産生方法における特定の要因の重要性を判断するために使用できる。本明細書に記載の方法によって検出されることが期待される物理的力価は、１×１０１０～１×１０１１粒子／ｍＬの範囲である。本明細書に記載の方法によって検出されることが期待される感染力価は、１×１０８～１×１０９粒子／ｍＬの範囲である。したがって、測定されるウイルス力価の差をもたらす因子の改変（例えば、測定されるウイルス力価の少なくとも５、１０、２０、３０、４０、または５０％の差異をもたらす因子の改変）は、産生方法にとって重要であると判定することができる。そのような要因には、インキュベーション温度、使用される培地、培地で使用される％グルコースまたはアミノ酸、使用される攪拌の存在、不在、または量、または使用される培養フラスコまたは容量などが含まれ得る。
【0055】
したがって、本発明の方法を使用して、ウイルスを産生する可能性のあるプロデューサー細胞を培養するために利用可能な異なるシステム、例えば、シェーカーフラスコ、Ｑｕａｎｔｕｍシステム（Ｔｅｒｕｍｏ）、Ａｍｂｒシステム（例えば、Ａｍｂｒ １５または２５０（ＴＡＰ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））の評価を含む、ウイルス産生の最適条件を決定することができる。
【0056】
本発明の方法は、ウイルス産生プロセスの下流の任意のプロセスを評価するために、例えば、そのようなプロセスがウイルス力価に影響を及ぼしているかどうかを判断するために、さらに使用することができる。特に、本発明の方法は、使用され得る精製方法を評価するために、例えば、そのような精製方法が力価に何らかの影響を及ぼしたかどうか、例えば、精製前のサンプルに存在していたウイルス力価と比較して、そのような精製後に力価が増加したか、減少したか、または同等のままであったかどうかを判断するために、使用することができる。本発明の方法は、ウイルスの、例えば、遺伝子治療用のウイルスベクターの製造に特に重要であり得るウイルスベクターの、大規模製造を評価するためにさらに使用することができる。
【0057】
本明細書で使用される場合のウイルス力価の増加は、測定値が比較されているウイルス力価の５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％を超える増加とすることができ、本明細書で使用される場合のウイルス力価の減少は、測定値が比較されているウイルス力価の５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％を超える減少とすることができる。同等のウイルス力価は、測定値が比較されているウイルス力価の５％以内とすることができる。
【0058】
これに関して、いくつかの目的のために、ウイルス力価に変化または変動が生じたかどうかを判断するために、方法の実施前、ならびに方法後および／または方法中にウイルス力価を評価することが望ましい場合があることが理解されるであろう。本発明の方法はまた、例えば、（同等または異なる時点での）異なるサンプル内の、または異なる時点での同じサンプル内のウイルス力価との、ウイルス力価の比較のステップをさらに含むことができる。
【0059】
本発明のさらなる一実施形態において、本方法は、対象におけるウイルス感染の程度を決定するために、例えば、感染症がうまく治療されているか、軽減されているかを判断するために使用され得る。そのような方法では、ウイルス力価が時間の経過とともに増加するか、減少するか、または同等のままであるかどうかを判断するために、サンプル中の、例えば、異なる時点での対象からの同じタイプのサンプル中のウイルス力価を比較することが望ましい場合がある。代替的または追加的に、ある個体からのサンプル中のウイルス力価を、ある状態について以前に取得された、例えば感染の段階および／または予後を示し得るウイルス力価測定値と比較することが望ましい場合がある。
【0060】
あるいはまた、本発明の方法は、サンプル中のウイルスの実際の量、レベル、または濃度を決定しなくてもよいが、量、レベル、または濃度が許容可能な閾値を上回るか下回るかを判定することができ、例えば、ある製造方法において、閾値は、サンプル内に許容レベルのウイルス粒子があるかどうかを判定することができる。上記のように、本発明の方法は、ウイルス力価のレベルが以前にアッセイされたサンプルのレベルに対して増加、減少、または匹敵するかどうかを判定することができ、したがって、特定の用途では、実際のウイルス力価（例えば、存在するウイルスの量または濃度）を決定する必要がない可能性があることが理解されるであろう。
【0061】
本発明は、サンプル中のウイルス力価をモニタリングおよび／または評価するためのラマン分光法の使用を包含するため、ウイルス産生プロセスの開始、産生段階、および終了のいずれか１つを特定することができる。異なる量または濃度のウイルスおよび／または代謝産物が、異なる産生段階でサンプル中に存在することが理解されるであろう。例えば、産生の開始時にウイルス力価、特に物理的ウイルス力価は、０～１０５の範囲にある可能性があり、活性ウイルス産生の間、ウイルス力価、特に物理的ウイルス力価は、１０５～１０９の範囲にある可能性があり、ウイルス産生の終了時には、ウイルス力価、特に物理的ウイルス力価は、１０９～１０１２の範囲にある可能性がある。しかしながら、一般的に、経時的なウイルス力価のモニタリングは、例えば、増加した量またはピーク量がプロセスの産生段階に関連している可能性があり、早期の少量はプロセスの開始に関連している可能性があり、後の量の停滞はプロセスの終了に関連している可能性がある、特定のパッケージング細胞株中の、特定のウイルスの産生の異なる段階を特定することができる。前に説明したように、この情報を特定のプロセスに使用して、産生が停滞、減少（例えば、産生のピーク点と比較して少なくとも５０％まで減少）、または終了した後に培養が維持されないことを保証することができる。
【0062】
本発明の方法はまた、適応製造を支援し、さらにシステムにおけるウイルス力価の生成を増加させるために使用することができる。この点で、異なる条件下で異なるシステムを使用して取得されたウイルス力価が比較され、ウイルス産生のための最適な条件を決定することができる。
【0063】
本明細書で使用される場合の「サンプル」という用語は、ウイルスを含む任意のサンプル（例えば、ウイルスベクターを含む任意のサンプル）を指す。特に、本発明では、サンプル中のウイルス力価は、ラマン分光法によってリアルタイムにインサイチューで測定することができるか、またはサンプルに対してエクスサイチューで実施することができる。
【0064】
「インサイチュー」とは、ウイルス粒子を産生できる培養物中のラマン散乱光の強度を取得するための測定が、一次培養環境から抽出されたサンプルからではなく、ウイルス粒子が生成される一次培養環境から行われることを意味する。したがって、「インサイチューで」測定を行うことにより、液体ハンドリングステップの必要条件はない。したがって、その環境からのサンプルの除去は、本発明の特定の用途には必要ではない可能性があり、サンプルのインサイチュー測定が好ましい場合がある。サンプルのインサイチュー測定は、サンプルの一部が除去される実際のサンプリングステップを必要とせずに、サンプル中のウイルス力価の定期的な評価を可能にし得る。この点でのウイルス力価評価は、コストとエラーを引き起こす可能性のある追加のステップを必要とせずに、リアルタイムに正確かつ高感度に測定できる。以下でさらに詳細に説明するように、ラマン分光法は、例えば、サンプルの内部または外部のいずれかに配置できるプローブを提供し、必要に応じてインサイチューでの測定を可能にする。
【0065】
あるいはまた、本発明の方法は、エクスサイチューでサンプルに対して実施することができる。「エクスサイチュー」とは、ウイルス粒子を産生できる培養物中のラマン散乱光の強度を取得するための測定が、ウイルス粒子が１つ以上の液体ハンドリングステップに従って産生される一次培養環境から抽出されたサンプルから行われることを意味する。特定の実施形態では、本発明の方法は、サンプリングのステップを含むことができる。
【0066】
本発明の方法で使用されるサンプルの起源は、ウイルスが産生されている細胞培養物とすることができる。したがって、サンプルは培地（例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、またはＳＦＩＩ、任意選択で血清、Ｌ－グルタミン、および／または他の成分を含む）の１つとすることができ、これは、例えば、ウイルス産生プロセス中に採取された場合、パッケージング細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）をさらに含むことができるか、または、例えば、マーケティング、販売、または使用の前に、例えば、品質テストが必要である、医療用のウイルスのサンプルとすることができる。サンプルはさらに、ウイルスに感染している疑いのある対象（例えば、ヒトまたは哺乳動物の対象）からのサンプル、例えば、血液、唾液、喀痰、血漿、血清、脳脊髄液、尿、または糞便のサンプルとすることができる。サンプルの他のソースには、開放水域（оｐｅｎ ｗａｔｅｒ）または公共水道からのものが含まれる。
【0067】
ラマン分光法
ラマン分光法は、サンプルによって散乱された単色光の波数の変化を測定して、サンプルの化学組成、物理的状態、および環境に関する情報を提供する。これは、入射光子がサンプルを構成する分子に存在する振動モードと相互作用する方法のために可能である。これらのモードは、所与の物理的条件のセットの下で特定の振動周波数と散乱強度を備えており、これにより、対象となる所与の分析物の量を定量化することができる。広帯域光源からの異なるエネルギーの光の吸収が測定される赤外線吸収分光法とは異なり、ラマン分光法では、単色の入射光と散乱光のエネルギーの差が測定され（図１）、これはラマンシフトとして知られている。
ラマン分光法は、サンプルによって散乱された単色光の波数の変化を測定して、サンプルの化学組成、物理的状態、および環境に関する情報を提供する。これは、入射光子がサンプルを構成する分子に存在する振動モードと相互作用する方法のために可能である。これらのモードは、所与の物理的条件のセットの下で特定の振動周波数と散乱強度を備えており、これにより、対象となる所与の分析物の量を定量化することができる。広帯域光源からの異なるエネルギーの光の吸収が測定される赤外線吸収分光法とは異なり、ラマン分光法では、単色の入射光と散乱光のエネルギーの差が測定され（図１）、これはラマンシフトとして知られている。
【0068】
通常、ストークス散乱光は、測定された信号が周囲温度でより強くなるようにモニタリングされる。図２は、いくつかのスペクトル例を示しており、異なるピークは、異なる振動モードの存在を表しており、一部のバンドは、いくつかの基礎となるピークの重複領域である。単純な混合物の場合、分析対象物のｎ－１に固有である明確なバンドを特定し、一定の温度と圧力での強度の変化を測定して、適切な較正後に組成を完全に定量化することができる。しかしながら、生体媒体などの複雑なシステムの場合、この単純なアプローチを厳密に適用することはできず、重複するバンドが多すぎ、これは直接割り当てることをできなくしている。代わりに、元のデータマトリックスのモデリングに加えて、対象分析物の濃度との共分散を最大化する変数（波長／波数）の線形結合を取得する高度なケモメトリックスモデルを使用する必要がある。その後、新しいサンプルの組成を予測できる。
【0069】
ラマンスペクトルは「分子フィンガープリント」を提供し、生物学的サンプルなどのサンプルの定性的および定量的分析を可能にする。ラマンスペクトルは一般的に、温度およびｐＨなどの物理的条件の変化に敏感である。多くの場合、生物学的サンプルから取得されたラマンスペクトルは、高い頻度で、そのようなサンプルには天然のフルオロフォアが含まれているので、バックグラウンド蛍光シグナルを含んでいる可能性がある。従来のラマン分光法では、このバックグラウンドは、最適なレーザ波数の選択と、従来から利用可能ないくつかのアルゴリズムのうちの１つを使用して除去された残りの蛍光によって制限されるはずである。
【0070】
ラマン分光法は、当技術分野で知られている技術である。本発明では、リアルタイムラマン分光法を上記のようにインサイチューで使用することができ、ウイルス力価の連続測定を可能にする。
【0071】
本明細書で使用される場合の「ラマン分光法」は、基板と目的の標的分子（例えば、ラマンによって検出される分子）との間の結合、例えば、免疫相互作用を必要としないすべてのタイプのラマン分光法を指す。基板と標的分子との間の結合は、直接的に、または任意のタイプの結合分子、ストレプトアビジン／ビオチンなど、または抗体フラグメントを使用して間接的に起こり得る。「免疫相互作用」は、サンプル中の目的の分子に特異的に結合するために基板に付着され得る抗体または抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖｓなど）の使用を含む。特に、本明細書で使用される場合の「ラマン分光法」は、表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）、例えば、（例えば、金属（例えば、Ａｕの）ナノドットを含み得る）基板との間の免疫相互作用を必要とするＳＥＲＳを除外する。ＳＥＲＳでは、検出される分析物を表面に固定化する必要がある。本発明の方法では、表面に固定化されたサンプル中の分析物を検出するためにラマン分光法は実行されない。特に、ラマン分光法は、サンプル中または表面に固定化されたサンプルからウイルス粒子を検出するために実行されない。
【0072】
ＳＥＲＳは、本発明に係るラマン分光法とは異なり、特に、ＳＥＲＳは、対象の分析物を表面に固定化または結合するための特定の実験的設計を必要とし、これは、ＳＥＲＳ方法論を使用して増強された信号強度をもたらす。しかしながら、分析物のそのような固定化は、サンプルの処理を必要とし、それは、サンプルがそのようなシステムから採取される状況を含めて、バイオリアクター内部の状態の汚染またはバイオリアクター内部の状態との干渉につながる可能性がある。一般的に、ＳＥＲＳは、本明細書で定義された方法にしたがってウイルスを処理するためのバイオリアクターまたは生物学的サンプルに見られるような成分の複雑な混合物よりも、サンプルに汚染物質がほとんどない、対象の分析物を含む「単純な」サンプルを含む方法により適している。したがって、ＳＥＲＳは、ウイルス力価の評価のためのウイルス粒子を含むサンプルを含む、複雑なサンプルの直接モニタリング、またはインラインまたはインサイチューモニタリング用に設計されてはいないが、代わりに、処理されたサンプルであって、検出される分析物は精製され、その後、表面に固定化されたサンプルの分析に適用できる。
【0073】
また、ＳＥＲＳは再現性のある結果をもたらさないことが一般的に知られている。ＳＥＲＳを使用した場合の信号の増強は再現性があるが、その増強の大きさはかなり変動する可能性がある。このような変動は、ＳＥＲＳプローブ表面／基板のペアが高度に制御された状況で製造された場合（例えば、クリーンルームでエッチングされたシリコンウェーハ）でも発生することが知られている。この再現性の欠如は、本発明によって想定されるような定量的方法にとっては特に欠点である。
【0074】
対照的に、本明細書で定義される場合のラマン分光法を使用する本発明の方法は、サンプル中に存在する分析物の表面付着なしに、特にウイルス粒子の表面付着または固定化なしに、サンプル中の分析物、特にウイルス粒子をインライン／インサイチューで検出することができる。したがって、本明細書で定義される本発明は、ＳＥＲＳの使用を含む方法と比較して、より高度な柔軟性を提供する。
【0075】
本発明で定義される場合のラマン分光法は、特に、従来のタイプのラマン分光法、および誘導ラマン分光法（ＳＲＳ）、ピコラマン、空間オフセットラマン（ＳＯＲＳ）、逆ＳＯＲＳ、シースルーラマン分光法、コヒーレント反ストークスラマン分光法（ＣＡＲＳ）、コヒーレントストークスラマン分光法（ＣＳＲＳ）、共鳴ラマン分光法（ＲＲ分光法）、および全内部反射ラマン分光法（ＴＩＲ）ラマンなどの他のタイプのラマン分光法を含む。ラマン分光法用の機器は、様々なサプライヤー、例えば、Ｒｅｎｉｓｈａｗ、ＷＩＴｅｃ、Ｈｏｒｉｂａ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手できる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｐｔｉｑｇａｉｎ．ｃｏｍ／、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｉｍｅｇａｔｅ．ｃｏｍ／およびｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｅｗｐｏｒｔ．ｃｏｍ／もまた参照。
【0076】
データ処理および多変量モデリング
本明細書で使用される場合の「多変量」データは、各サンプルに対して複数の変数が測定されるデータを指し、「多変量モデル」は、そのような多変量データを使用して構築されたモデルである。（例えば、細胞培養物から一定期間にわたって生成された）ラマンスペクトルは、多変量データを含み、測定された各サンプルまたは時点に対して、複数の波数での強度を記録することができる。
本明細書で使用される場合の「多変量」データは、各サンプルに対して複数の変数が測定されるデータを指し、「多変量モデル」は、そのような多変量データを使用して構築されたモデルである。（例えば、細胞培養物から一定期間にわたって生成された）ラマンスペクトルは、多変量データを含み、測定された各サンプルまたは時点に対して、複数の波数での強度を記録することができる。
【0077】
本発明では、培養中のウイルス産生のインサイチューモニタリングから得られる、ラマンスペクトルおよびスペクトルを構成する多変量データを分析して、モデル予測がリアルタイムのウイルス力価の測定を達成することを可能にするのに最も重要な一連のスペクトル変数を特定した。１０または１２成分の多変量モデルから計算された変数重要度指標（ＶＩＰ）のプロットが作成され、例えば、表１に示されているデータに関するように、波数変数の重要度が確立された。８または１５成分の多変量モデルから計算された変数重要度指標（ＶＩＰ）のプロットもまた作成され、例えば、表２に示されているデータに関するように、波数変数の重要度が確立された。したがって、本発明者らは、ラマンスペクトル測定からの多変量データを、従来のアッセイからのウイルス力価に関連するオフラインデータとともに使用して、ウイルス力価を決定するときに評価できる波数範囲を特定し、特定の条件下でウイルス含有サンプルに対して達成された任意のラマンスペクトルから、指定された波数範囲で信号の強度を分析してウイルス力価を決定できる多変量モデルをさらに構築した。本明細書に記載の任意のタイプのウイルス力価は、力価を予測するために使用される多変量モデルが、関連性のあるタイプのウイルス力価に関するオフラインデータを使用して構築されているという条件で、本発明の方法を使用して決定することができる。
【0078】
複雑な生物学的サンプルでは、波数範囲を特定の分析物に明確に割り当てることは、しばしば困難または不可能である。細胞培養培地中の水またはグルコースのような他の高濃度化合物によって信号が不明瞭になる可能性があるため、低濃度の分析物にも問題がある。不明瞭な信号が強すぎる場合、それらに関連するノイズは、基礎となる対象分析物に由来する測定された変動よりも大きく、対象成分の信号強度は検出限界を下回る。ラマンスペクトルの分析、取得されたデータのモデリング、およびウイルス力価のオフライン測定によるデータの較正によって、本発明者らは、サンプル中のウイルス力価の増加と相関する一連の波数範囲を特定した。これらの波数範囲は、ウイルス力価と経時的に一貫した強い相関関係を示すため、特定の分析物に範囲を割り当てる必要はない。したがって、高濃度の成分によって信号が不明瞭になるという問題は、本発明の方法ではそのような問題とはならない。
【0079】
本発明で使用するための波数範囲を特定するために、多変量モデルパラメータが取得された。その後、これらのパラメータは、後続の分析で応答値を推測し、ウイルス力価の計算に使用する重要な変数を選択するために使用された。この場合、ウイルス含有サンプルから取得されたラマンデータに対して回帰が実行された。
【0080】
この特定のケースでは、本発明者らは、前処理されたラマンデータに対して回帰を実行した。これに関して、分光計から取得された生のラマンスペクトルデータは、バックグラウンド蛍光などのいくつかの干渉信号の補正を必要とする場合がしばしばあり、絶対強度の全体的な変化を補正するためにサンプルに対して取得された生のスペクトルを正規化することがしばしば重要であることが理解されるであろう。したがって、当業者は、そのような問題に対処するためにスペクトルの前処理を実行する必要があるかもしれないことを理解するであろう。
【0081】
取得されたラマンスペクトルの前処理は、科学文献で利用可能な多くのアルゴリズムのいずれかを使用して実行できる。特に、一次導関数、二次導関数（Ｓａｖｉｔｚｋｙら、１９６４）、および標準正規変量（ＳＮＶ）正規化、ならびに多項式バックグラウンドフィッティングおよび除去を、例えば使用することができる。Ｂａｒｎｅｓら（１９８９）は、標準正規変量法について説明している。ＬｉｅｂｅｒとＭａｈａｄｅｖａｎ－Ｊａｎｓｅｎ（２００３）は、最小二乗多項式カーブフィッティングの修正に基づいて、生物学的ラマンスペクトルから蛍光を差し引くための自動化された方法について説明している。Ｚｈａｏら（２００７）は、修正された複数の多項式フィッティングに基づく蛍光除去のための改良された自動化されたアルゴリズムを説明している。Ｋｏｃｈら（２０１７）は、ラマンスペクトルの前処理のための「軟化子」ベースのベースライン補正アルゴリズムを説明している。Ｈｕら（２０１８）は、区分的多項式フィッティング（ＰＰＦ）に基づくベースライン補正の方法を説明している。Ｚｈａｎｇら（２０１０）は、適応型の反復的に再重み付けされたペナルティ付き最小二乗（ａｉｒＰＬＳ）アルゴリズム法を説明している。Ｈｕａｎら（２０１０）もまた、参照のこと。
【0082】
ラマンスペクトルを前処理するためのステップが実行されると、必要に応じて、データモデリング用のパラメータが取得される。この点に関して、ラマンデータ、特に前処理されたラマンデータの回帰は、ウイルス力価、または代謝マーカーの分析に使用できるＣｕＢｉＡｎおよびＬＣ－ＭＳを決定できる、例えば、ｑＰＣＲおよびｐ２４ ＥＬＩＳＡ、プラークアッセイなどの他の技術を使用して取得されたオフライン応答に基づいて実行できる。したがって、回帰には、前処理されたラマンスペクトルとオフラインデータの比較が含まれる場合がある。多変量回帰の典型的なアプローチでは、部分最小二乗回帰（ＰＬＳ－Ｒ）を使用できる。
【0083】
具体的には、標準直交スコアＰＬＳ－Ｒ分析では、ラマンスペクトルＸの配列と応答ｙとの間に線形関係が求められる（例えば、ｙは、各要素が各サンプルの力価を表すベクトルとすることができる。
ｙ＝α＋Ｘβ＋Ｅ
式中、αとβは未知のパラメータであり、Ｅは誤差強度または残差の行列である）。ｙに各サンプルに対しての単一の応答値が含まれるか複数の応答値が含まれるかに応じて、異なる基本的なＰＬＳ－Ｒアルゴリズムを使用でき、ＰＬＳ１アルゴリズムは単一の応答値に使用することができ、ＰＬＳ２アルゴリズムは複数の応答値に使用することができる。ラマンスペクトルからウイルス力価を予測する場合、ｙは通常、各サンプルの単変量パラメータであるため、通常はＰＬＳ１を使用できる。
ｙ＝α＋Ｘβ＋Ｅ
式中、αとβは未知のパラメータであり、Ｅは誤差強度または残差の行列である）。ｙに各サンプルに対しての単一の応答値が含まれるか複数の応答値が含まれるかに応じて、異なる基本的なＰＬＳ－Ｒアルゴリズムを使用でき、ＰＬＳ１アルゴリズムは単一の応答値に使用することができ、ＰＬＳ２アルゴリズムは複数の応答値に使用することができる。ラマンスペクトルからウイルス力価を予測する場合、ｙは通常、各サンプルの単変量パラメータであるため、通常はＰＬＳ１を使用できる。
【0084】
簡単に言うと、ＰＬＳ１アルゴリズムは次のように機能する。まず、Ｘとｙの変数は平均が中央に位置している（各変数の平均はＸの列の各要素から減算することができ、ｙの平均値はｙの各要素から減算することができる。いくつかの基礎となる因子Ａは、線形結合で使用できる因子であるモデルに対して、Ｘをモデル化するために選択できる。最初のステップでは、Ｘをｙに射影して重みを見つけることができ、これらの重みは、ｙと最大の共分散を有するＸのベクトル／因子空間の方向を定義する。次に、これらの重みは、単位長を有するように正規化される。その後、Ｘスコアは、これらの正規化された重みにＸを射影することによって計算することができる。次に、Ｘの負荷量は、スコアにＸを射影することによって計算することができる。同様に、ｙの負荷量は、これらのスコアにｙの転置を射影することによって計算することができる。現在の成分の寄与は、所与の成分の寄与を差し引くことによってＸとｙを収縮させることによって、Ｘとｙの両方から削除できる。これは、成分のそれぞれのスコアと負荷量ベクトルを乗算し、結果の配列またはベクトルを実行中のＸ配列およびｙベクトルからそれぞれ減算することによって実行できる。
次に、収縮したＸとｙを、反復手順の後続の各成分に対して同じ方法で再度使用でき、つまり、すべてのＡ成分が使い果たされ、それ以上の収縮が実行されなくなるまで、重み、スコア、および負荷量を連続的に決定する。このＰＬＳ法とＮＩＰＡＬＳアルゴリズムへの参照は、例えばＷｏｌｄら（２００１）に見つけることができる。
次に、収縮したＸとｙを、反復手順の後続の各成分に対して同じ方法で再度使用でき、つまり、すべてのＡ成分が使い果たされ、それ以上の収縮が実行されなくなるまで、重み、スコア、および負荷量を連続的に決定する。このＰＬＳ法とＮＩＰＡＬＳアルゴリズムへの参照は、例えばＷｏｌｄら（２００１）に見つけることができる。
【0085】
各反復中に、計算された重み、スコア、および負荷量のベクトルとスカラーは、それら自身の配列またはベクトルに順番に格納され、つまり、反復ごとに、関連するベクトルまたはスカラーは、既存のベクトルまたはスカラーが前の反復から取得されたものであり得るベクトル内の配列または要素内に新しい列または行として配置され得る。後続のデータモデリングのためのパラメータとして回帰係数が使用される場合、回帰係数βは、最終的な重み行列に最終的なＸブロック負荷量配列の転置の射影の逆数を乗算することによって取得できる。成分の最適な数は、反復モデル構築手順で使用されなかった前処理されたラマンスペクトルのテストセットの予測誤差を調査することによって決定できる。
【0086】
ウイルス力価の予測は、回帰係数βなどのモデルパラメータを使用して、かつオフラインアッセイデータ、例えば、ｑＰＣＲ／Ｐ２４ Ｅｌｉｓａ／プラークアッセイの平均二乗誤差（ＭＳＥ）との比較によって、上記のように行うことができる。予測のＭＳＥが最小に達したときに、基礎となる成分Ａの最適な数を選択できる。
【0087】
例えば、上記の手順を使用して、最初のＰＬＳ－Ｒモデルの構築後、最も重要な変数は、多くの利用可能な変数選択法のうちの１つ、ｙの予測ならびにＸの分散の説明に最も重要であり得る変数を特定する変数重要度指標（ＶＩＰ）を使用して選択できる。ＶＩＰはＸの行と同じ長さのＶＩＰベクトルを生成することができ、つまり、ＶＩＰベクトルにはＸの各変数に対応する要素が含まれ、各要素の数値は、その変数の重要度の尺度であり得る。一般的なアプローチは、ＶＩＰまたは他の変数選択法によって決定されたような最も重要な変数のみを使用してモデルを再構築することにより、上記の初期モデルを改良することである。どの変数が重要であるかを決定するために、閾値アプローチが選択される。ＶＩＰ閾値は、これがＶＩＰパラメータの平均値であるため、通常１に設定できるが、当業者は、これが本質的に任意であり、他のより高い閾値、例えば１．５を選択できることを理解するであろう。
【0088】
以下に論じるように、本発明においてウイルス力価の決定に重要であると特定された波数範囲は、ＶＩＰパラメータを少なくとも１．００以上に設定することに基づいている。したがって、本発明では、この段階で１．００を超えるピーク強度を生成しなかった波数範囲は除外された。
【0089】
当業者は、ＶＩＰパラメータの選択後にＰＬＳ１アルゴリズムを再度実行できることを理解しているであろうが、この場合、ＶＩＰ閾値を下回るＸの変数を削除して、より短い負荷量ベクトルとより短い回帰係数のβベクトルによって、新しい多変量モデルを生成できる。
【0090】
以下に示す波数範囲は、波長７８５ｎｍのレーザを使用してラマン分光法を実施した結果である。本発明には、７８５ｎｍ以外の異なる波長のレーザを使用することができることが含まれる。異なる波長のレーザを使用して得られる波数範囲は、ラマンシフト（つまり、ラマン散乱を誘発するために使用される単色レーザビームからの非弾性散乱ラマン光の波長の違い）が波長にほとんど依存しないため、同じになるであろう。
【0091】
本明細書で使用される場合の「波数」
は、単位距離あたりの波長の数であり、ｃｍ－１単位で測定される。通常、
、ただし、λは波長である。
は、単位距離あたりの波長の数であり、ｃｍ－１単位で測定される。通常、
【0092】
本発明の好ましい一実施形態では、１．５を超えるピーク（変数重要度指標（ＶＩＰ））は、ウイルスの存在の判定およびウイルス力価の決定に重要である可能性が高い波数範囲を示す。特定の波数範囲の信号強度を決定することは、本発明の方法によってウイルス力価を予測するために不可欠である。１．５ＶＩＰ閾値は、本発明の一実施形態において、どの波数範囲がウイルス力価の予測に重要であるかを決定するために使用される。したがって、好ましい一実施形態では、本発明は、ラマン分光法を使用してウイルス力価を評価または予測する方法であって、前記サンプルから取得されたラマンスペクトルから、これらの波数範囲の５つ以上での信号の強度を決定するステップを含む方法を包含する。測定された前処理された信号は、予測に使用される。任意の後続のスペクトル、つまり予測が行われるモデル構築後のスペクトルでは、ＰＬＳモデルのトレーニングと構築に使用されるデータと全く同じ方法を使用した前処理が必要である。
【0093】
本発明の方法のいずれも、複数の波数範囲のそれぞれ１つの中でラマン散乱光の総強度を測定して、サンプルについての波数強度データのセットを取得するステップであって、複数の波数範囲は、事前に選択されており、サンプル内のウイルスに特徴的であるステップを含む。
【0094】
本発明の方法のいずれにおいても、測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、以下の表１に列挙されるような、ＶＩＰが１．００以上である、波数範囲１～２８のうちの５個以上を含むことができる。測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、以下の表１に列挙されるような、ＶＩＰが１．００以上である、波数範囲１～２８のうちの１０個以上を含むことができる。測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、以下の表１に列挙されるような、ＶＩＰが１．００以上である、波数範囲１～２８のうちの１５個以上を含むことができる。測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、以下の表１に列挙されるような、ＶＩＰが１．００以上である、波数範囲１～２８のうちの２０個以上を含むことができる。測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、以下の表１に列挙されるような、ＶＩＰが１．００以上である、波数範囲１～２８のうちの２５個以上を含むことができる。測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、以下の表１に列挙されるような、ＶＩＰが１．００以上である、波数範囲１～２８のうちの２８個すべてを含むことができる。
【0095】
本発明の方法のいずれにおいても、測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、以下の表１に列挙されるような、ＶＩＰが１．２５以上である、波数範囲２９～５９のうちの５個以上を含むことができる。測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、以下の表１に列挙されるような、ＶＩＰが１．２５以上である、波数範囲２９～５９のうちの１０個以上を含むことができる。測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、以下の表１に列挙されるような、ＶＩＰが１．２５以上である、波数範囲２９～５９のうちの１５個以上を含むことができる。測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、以下の表１に列挙されるような、ＶＩＰが１．２５以上である、波数範囲２９～５９のうちの２０個以上を含むことができる。測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、以下の表１に列挙されるような、ＶＩＰが１．２５以上である、波数範囲２９～５９のうちの２５個以上を含むことができる。測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、以下の表１に列挙されるような、ＶＩＰが１．２５以上である、波数範囲２９～５９のうちの３０個を含むことができる。測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、以下の表１に列挙されるような、ＶＩＰが１．２５以上である、波数範囲２９～５９のうちの３１個すべてを含むことができる。
【0096】
本発明の方法のいずれにおいても、測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、以下の表１に列挙されるような、ＶＩＰが１．５０以上である、波数範囲６０～８１のうちの５個以上を含むことができる。測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、以下の表１に列挙されるような、ＶＩＰが１．５０以上である、波数範囲６０～８１のうちの１０個以上を含むことができる。測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、以下の表１に列挙されるような、ＶＩＰが１．５０以上である、波数範囲６０～８１のうちの１５個以上を含むことができる。測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、以下の表１に列挙されるような、ＶＩＰが１．５０以上である、波数範囲６０～８１のうちの２０個以上を含むことができる。測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、以下の表１に列挙されるような、ＶＩＰが１．５０以上である、波数範囲６０～８１のうちの２２個すべてを含むことができる。
【0097】
【表1】
【0098】
ウイルス力価は、表１に関して上記のようにラマンスペクトル内の複数の波数範囲を使用して測定することができる。本発明の好ましい一実施形態において、表１に関して上記のようにラマンスペクトル内の複数の波数範囲を使用して測定されるウイルス力価は、レンチウイルス力価である。
【0099】
本発明の別の好ましい一実施形態では、１．５を超えるピーク（変数重要度指標（ＶＩＰ））は、ウイルスの存在の判定およびウイルス力価の決定に重要である可能性が高い波数範囲を示す。特定の波数範囲の信号強度を決定することは、本発明の方法によってウイルス力価を予測するために不可欠である。本発明の一実施形態では、１．５ＶＩＰ閾値を使用して、どの波数範囲がウイルス力価の予測に重要であるかを決定する。したがって、好ましい一実施形態では、本発明は、ラマン分光法を使用してウイルス力価を評価または予測する方法であって、前記サンプルから取得されたラマンスペクトルから、これらの波数範囲の４個以上での信号の強度を決定するステップを含む方法を包含する。測定された前処理された信号は、予測に使用される。任意の後続のスペクトル、つまり予測が行われるモデル構築後のスペクトルでは、ＰＬＳモデルのトレーニングと構築に使用されるデータとまったく同じ方法を使用した前処理が必要である。
【0100】
本発明の方法のいずれも、複数の波数範囲のそれぞれ１つの中でラマン散乱光の総強度を測定して、サンプルについての波数強度データのセットを取得するステップであって、複数の波数範囲は、事前に選択されており、サンプル内のウイルスに特徴的であるステップを含む。
【0101】
本発明の方法のいずれにおいても、測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、以下の表２に列挙されるような、ＶＩＰが１．００以上である、波数範囲１～１２のうちの４個以上を含むことができる。測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、以下の表２に列挙されるような、ＶＩＰが１．００以上である、波数範囲１～１２のうちの６個以上を含むことができる。測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、以下の表２に列挙されるような、ＶＩＰが１．００以上である、波数範囲１～１２のうちの８個以上を含むことができる。測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、以下の表２に列挙されるような、ＶＩＰが１．００以上である、波数範囲１～１２のうちの１０個以上を含むことができる。測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、以下の表２に列挙されるような、ＶＩＰが１．００以上である、波数範囲１～１２のうちの１２個すべてを含むことができる。
【0102】
本発明の方法のいずれにおいても、測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、以下の表２に列挙されるような、ＶＩＰが１．２５以上である、波数範囲１３～２２のうちの４個以上を含むことができる。測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、以下の表２に列挙されるような、ＶＩＰが１．２５以上である、波数範囲１３～２２のうちの６個以上を含むことができる。測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、以下の表２に列挙されるような、ＶＩＰが１．２５以上である、波数範囲１３～２２のうちの８個以上を含むことができる。測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、以下の表２に列挙されるような、ＶＩＰが１．２５以上である、波数範囲１３～２２のうちの１０個すべてを含むことができる。
【0103】
本発明の方法のいずれにおいても、測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、以下の表２に列挙されるような、ＶＩＰが１．５０以上である、波数範囲２３～３０のうちの４個以上を含むことができる。測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、以下の表２に列挙されるような、ＶＩＰが１．５０以上である、波数範囲２３～３０のうちの６個以上を含むことができる。測定されるラマンスペクトル内の複数の波数範囲は、以下の表２に列挙されるような、ＶＩＰが１．５０以上である、波数範囲２３～３０のうちの８個すべてを含むことができる。
【0104】
【表2】
【0105】
ウイルス力価は、表２に関して上記のようにラマンスペクトル内の複数の波数範囲を使用して測定することができる。本発明の好ましい一実施形態において、表２に関して上記のようにラマンスペクトル内の複数の波数範囲を使用して測定されるウイルス力価は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）力価である。本発明の特に好ましい一実施形態では、表２に関して上記のようにラマンスペクトル内の複数の波数範囲を使用して測定されるウイルス力価は、アデノ随伴ウイルス血清型８（ＡＡＶ８）力価である。
【0106】
各所望の波数範囲での信号の強度を決定するステップは、所望の波数範囲内で特定された任意のピークのレベルの決定を必要とする。上記のように、ウイルス力価に関連すると考えられる任意の波数範囲内の信号の強度は任意のレベルである可能性があり、適切な多変量モデルで分析された場合のそのような強度の測定が、ウイルス力価の決定を可能にするであろうことを、当業者は理解するであろう。したがって、以下でさらに詳細に論じられるように、本発明は、多変量モデルを使用して測定された信号強度を分析することによってウイルス力価を評価または計算するステップを含むことができる。そのような多変量モデルは、本発明を実施する前に、あるいは本発明の方法の一部として準備することができ、その場合、方法は、多変量モデルを構築するステップをさらに含むことができる。
【0107】
本発明の方法は、本明細書で特定された波長範囲に加えて、さらなる波数範囲での信号強度を決定することを含むことができる。
【0108】
ニューラルネットワークはまた、ラマンスペクトルに基づく分類にも使用でき、例えば、病理学における病変組織と健康組織の分析においてである。ニューラルネットワークはまた、本明細書に記載されているように、ウイルス産生のモニタリングのためにラマンデータを適用する際に直面する問題のような回帰問題にも使用することができる。
【0109】
より洗練されたアプローチでは、畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）（ディープラーニング）と呼ばれるものを利用し、多くの場合、オブジェクト指向Ｐｙｔｈｏｎプログラミング言語でスクリプトを作成するためにＧｏｏｇｌｅのＴｅｎｓｏｒＦｌｏｗバックエンドとＫｅｒａｓＡＰＩを使用する。畳み込み層を使用する利点は、ネットワークがスペクトル自体を前処理して最適な力価／濃度を予測するための完璧な方法を本質的に「学習」するため、前処理の必要性がますます少なくなることである。本明細書に記載のデータ処理ステップで使用するためのそのようなニューラルネットワークは、当業者によく知られている。さらなる情報は、例えば、以下で見つけることができる。
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｆｏｒｂｅｓ．ｃｏｍ／ｓｉｔｅｓ／ｂｅｒｎａｒｄｍａｒｒ／２０１８／０９／２４／ｗｈａｔ－ａｒｅ－ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ－ｎｅｕｒａｌ－ｎｅｔｗｏｒｋｓ－ａ－ｓｉｍｐｌｅ－ｅｘｐｌａｎａｔｉｏｎ－ｆｏｒ－ａｂｓｏｌｕｔｅｌｙ－ａｎｙｏｎｅ／＃２ｃ９４４２ａ９１２４５
ｈｔｔｐ：／／ｐａｇｅｓ．ｃｓ．ｗｉｓｃ．ｅｄｕ／～ｂｏｌｏ／ｓｈｉｐｙａｒｄ／ｎｅｕｒａｌ／ｌｏｃａｌ．ｈｔｍｌ
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｆｏｒｂｅｓ．ｃｏｍ／ｓｉｔｅｓ／ｂｅｒｎａｒｄｍａｒｒ／２０１８／０９／２４／ｗｈａｔ－ａｒｅ－ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ－ｎｅｕｒａｌ－ｎｅｔｗｏｒｋｓ－ａ－ｓｉｍｐｌｅ－ｅｘｐｌａｎａｔｉｏｎ－ｆｏｒ－ａｂｓｏｌｕｔｅｌｙ－ａｎｙｏｎｅ／＃２ｃ９４４２ａ９１２４５
ｈｔｔｐ：／／ｐａｇｅｓ．ｃｓ．ｗｉｓｃ．ｅｄｕ／～ｂｏｌｏ／ｓｈｉｐｙａｒｄ／ｎｅｕｒａｌ／ｌｏｃａｌ．ｈｔｍｌ
【0110】
上記のように、多変量データモデルパラメータが取得され、本明細書で定義されるようなウイルス力価の定量化のための方法で使用することができる。このようなモデルパラメータはまた、必要に応じて、本明細書で定義されているような代替の多変量データモデルを構築する際にも使用することができる。本発明者らは、多変量アルゴリズムをラマンスペクトル波数信号強度データに適用して、その後ウイルス力価の定量化に使用されるモデルパラメータを取得した。具体的には、本発明者らは、多変量アルゴリズムを適用して、モデルパラメータとして使用される回帰係数を取得した。しかしながら、当業者は、選択されたモデルの性質に応じて、代替のモデルパラメータが取得され、使用され得ることを理解するであろう。したがって、本明細書で定義される方法のいずれにおいても、多変量データモデルパラメータは、適切に選択されることができ、任意選択で回帰係数を含むことができる。モデルパラメータを取得するために、任意の適切な多変量アルゴリズムをラマンスペクトル波数信号強度データに適用することができる。部分最小二乗（ＰＬＳ）回帰アルゴリズムなどの多変量回帰アルゴリズムを使用でき、任意選択で、ＰＬＳアルゴリズムは、非線形反復部分最小二乗（ＮＩＰＡＬＳ）回帰アルゴリズムである。ニューラルネットワークを含むアルゴリズムを使用して、モデルパラメータを取得することもできる。
【0111】
ウイルス力価を推定するためのモデル
ラマンスペクトルのケモメトリックモデリングは、リアルタイムのウイルス力価の増加と、ラマンスペクトルに見られる波数範囲の固有性および強度との間の相関関係を特定するために、本明細書に記載されているように実施された。特定された波数範囲は、上に記載されている。
ラマンスペクトルのケモメトリックモデリングは、リアルタイムのウイルス力価の増加と、ラマンスペクトルに見られる波数範囲の固有性および強度との間の相関関係を特定するために、本明細書に記載されているように実施された。特定された波数範囲は、上に記載されている。
【0112】
前述のように、本発明は、ウイルス力価の評価において重要であると判定された波数範囲の４または５以上での信号強度の評価、および構築された多変量モデル（較正後または未較正の多変量モデルのいずれか）を使用する強度のさらなる分析を必要とする。
【0113】
当業者は、分析されるサンプルに応じて異なる多変量モデルを構築することができ、多変量モデルを構築するための方法は、当技術分野で周知であること（例えば、本明細書で引用される参考文献を参照）を理解するであろう。したがって、例えば、異なるタイプのウイルス、異なる細胞培養培地、または異なるプロデューサー細胞を含むサンプル中でのウイルス力価の決定には、異なる多変量モデルが必要となる場合がある。
【0114】
本発明の一実施形態では、多変量モデルは、以下のアプローチを使用して構築することができる。
ｉ）上記のように、ｑＰＣＲおよびｐ２４ ＥＬＩＳＡ、プラークアッセイなどの他の手法を使用して取得されたオフライン応答での前処理されたラマンデータの回帰において、回帰には前処理されたラマンスペクトルの比較が含まれる場合がある。
ｉｉ）取得された回帰係数を使用して、前処理されたデータを使用して応答値を予測する。これらの予測の質は、多変量回帰に使用される成分／因子の基礎となる数を調整することで最適化できる。
ｉｉｉ）既知の方法、例えば、Ｘの説明に加えて、Ｙを予測するために強力／重要な変数を特定する変数重要度指標（ＶＩＰ）を使用して変数選択を実行する。
ｉｖ）洗練されたモデルの構築において、重要なスペクトル変数の特定に続いて、ステップ（ｉｉ）で説明したものと同じアプローチを使用してモデリングのさらなるラウンドを実行できるが、変数選択によって無関係と見なされた前処理されたラマンスペクトルの配列内の変数または列は、モデルが構築される前に削除される。これにより、無関係な変動の多くが削除された、データに基づいて構築されたより単純なモデルが得られる。（ｉｉ）の場合と同様に、基礎となる成分の数は、基礎となる因子の数が最も少ないモデルを選択することで最適化でき、成分間の変動に最小の予測誤差を与える。
ｖ）（ｉｖ）で決定された、使用された回帰係数を使用して将来の予測を行い、ここでは、新しい前処理されたラマンスペクトルに、推定値を生成するために取得された回帰係数を掛けることができる。
ｉ）上記のように、ｑＰＣＲおよびｐ２４ ＥＬＩＳＡ、プラークアッセイなどの他の手法を使用して取得されたオフライン応答での前処理されたラマンデータの回帰において、回帰には前処理されたラマンスペクトルの比較が含まれる場合がある。
ｉｉ）取得された回帰係数を使用して、前処理されたデータを使用して応答値を予測する。これらの予測の質は、多変量回帰に使用される成分／因子の基礎となる数を調整することで最適化できる。
ｉｉｉ）既知の方法、例えば、Ｘの説明に加えて、Ｙを予測するために強力／重要な変数を特定する変数重要度指標（ＶＩＰ）を使用して変数選択を実行する。
ｉｖ）洗練されたモデルの構築において、重要なスペクトル変数の特定に続いて、ステップ（ｉｉ）で説明したものと同じアプローチを使用してモデリングのさらなるラウンドを実行できるが、変数選択によって無関係と見なされた前処理されたラマンスペクトルの配列内の変数または列は、モデルが構築される前に削除される。これにより、無関係な変動の多くが削除された、データに基づいて構築されたより単純なモデルが得られる。（ｉｉ）の場合と同様に、基礎となる成分の数は、基礎となる因子の数が最も少ないモデルを選択することで最適化でき、成分間の変動に最小の予測誤差を与える。
ｖ）（ｉｖ）で決定された、使用された回帰係数を使用して将来の予測を行い、ここでは、新しい前処理されたラマンスペクトルに、推定値を生成するために取得された回帰係数を掛けることができる。
【0115】
分析のための波数範囲が特定されると、上記のようなステップ（ｉ）～（ｉｉｉ）を繰り返す必要がない場合があることが理解されるであろう。特に、この場合、モデルの構築にはステップｉｖ）のみが必要になる場合がある。さらに、回帰係数以外のデータモデリングパラメータを使用してもよい。
【0116】
本発明のさらなる一態様では、本方法は、多変量モデルを準備または構築する追加のステップを含むことができる。
【0117】
上記のステップｖ）で説明したように、生成された多変量モデルからの回帰係数を使用して、１つ以上のサンプルから取得したラマンスペクトルからウイルス力価の推定値を取得できる。したがって、本発明では、本方法は、多変量モデルからの回帰係数を使用してウイルス力価を決定するステップを含むことができる。同じ前処理方法を、モデルのトレーニング／構築に使用することができる。
【0118】
本発明は、さらなる限定として解釈されるべきではない以下の実施例によってさらに説明される。本出願を通して引用されたすべての図およびすべての参考文献、特許、ならびに公開された特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【実施例】
【0119】
実施例１－産生プロセス中の様々な段階でのレンチウイルスの濃度の計算
実施例のウイルス産生プロセス中の様々な段階で予想されるｍｇ／ｍｌでの推定レンチウイルス濃度を提供するために計算が実行された。濃度は、レンチウイルスの既知の浮遊密度および物理的力価を使用して計算された。結果を下の表に示す。
実施例のウイルス産生プロセス中の様々な段階で予想されるｍｇ／ｍｌでの推定レンチウイルス濃度を提供するために計算が実行された。濃度は、レンチウイルスの既知の浮遊密度および物理的力価を使用して計算された。結果を下の表に示す。
【0120】
【表3-1】
【0121】
【表3-2】
【0122】
示されるように、推定レンチウイルス濃度は、２．０３Ｅ－０２～２．０３Ｅ－０５ｍｇ／ｍｌの範囲であることが見出された。
【0123】
比較のために、ＢｕｃｋｌｅｙおよびＲｙｄｅｒ（２０１７， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ， ７１， ｐ１０８５－１１１６）から取得したグルコースおよびフェニルアラニンの検出限界に基づくいくつかの有益な計算を以下に示す。
【0124】
グルコース
ｍｗ＝１８０．１５６ｇ／モル
検出限界０．６ｍＭ（ＢｕｃｋｌｅｙおよびＲｙｄｅｒを参照）
モル＝体積／１０００×モル濃度
１／１０００×０．０００６－１ｍｌ中
＝０．００００００６モル
質量＝モル×ｍｗ
＝０．００００００６×１８０．１５６
＝０．０００１１ｇ／ｍｌ
推定濃度＝０．１１ｍｇ／ｍｌ
ｍｗ＝１８０．１５６ｇ／モル
検出限界０．６ｍＭ（ＢｕｃｋｌｅｙおよびＲｙｄｅｒを参照）
モル＝体積／１０００×モル濃度
１／１０００×０．０００６－１ｍｌ中
＝０．００００００６モル
質量＝モル×ｍｗ
＝０．００００００６×１８０．１５６
＝０．０００１１ｇ／ｍｌ
推定濃度＝０．１１ｍｇ／ｍｌ
【0125】
フェニルアラニン
ｍｗ＝１６５．１９ｇ／モル
ＬｏＤ＝１．１ｍＭ（ＢｕｃｋｌｅｙおよびＲｙｄｅｒ論文を参照）
モル＝体積／１０００×モル濃度
１／１０００×０．００１１－１ｍｌ中
＝０．０００００１１モル
質量＝モル×ｍｗ
＝０．０００００１１モル×１６５．１９ｇ／モル
＝０．０００１８ｇ
推定濃度＝０．１８ｍｇ／ｍｌ
ｍｗ＝１６５．１９ｇ／モル
ＬｏＤ＝１．１ｍＭ（ＢｕｃｋｌｅｙおよびＲｙｄｅｒ論文を参照）
モル＝体積／１０００×モル濃度
１／１０００×０．００１１－１ｍｌ中
＝０．０００００１１モル
質量＝モル×ｍｗ
＝０．０００００１１モル×１６５．１９ｇ／モル
＝０．０００１８ｇ
推定濃度＝０．１８ｍｇ／ｍｌ
【0126】
グルコースおよびフェニルアラニンの検出限界に対するｍｇ／ｍｌ単位の濃度は、控えめな物理的力価に見合った楽観的な推定濃度よりも５～１０倍高くなっている。
【0127】
上記に基づいて、培地中のレンチウイルスのｍｇ／ｍＬ単位のおおよその濃度は、ラマン分光法を使用した検出限界と考えられる濃度を下回ると予想される。
【0128】
実施例２－ＨＥＫ２９３過渡的プロセスからのレンチウイルス産生
実験方法
細胞培養と一過性トランスフェクション
ＨＥＫ２９３培養物は、３７℃で追加のサプリメントなしでＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３発現培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）のＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ＤＡＳｂｏｘ ＢｉｏＢＬＵ３００バイオリアクターで増殖させた。細胞を攪拌し、一過性トランスフェクションの前に２日間増殖させて、レンチウイルスを産生した。細胞にｇａｇ－ｐｏｌ、ｖｓｖ－ｇ、およびｅＧＦＰをコードするゲノムをトランスフェクトし、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ製のＰＥＩＰｒｏを使用してＬＶ粒子を産生した。
実験方法
細胞培養と一過性トランスフェクション
ＨＥＫ２９３培養物は、３７℃で追加のサプリメントなしでＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３発現培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）のＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ＤＡＳｂｏｘ ＢｉｏＢＬＵ３００バイオリアクターで増殖させた。細胞を攪拌し、一過性トランスフェクションの前に２日間増殖させて、レンチウイルスを産生した。細胞にｇａｇ－ｐｏｌ、ｖｓｖ－ｇ、およびｅＧＦＰをコードするゲノムをトランスフェクトし、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ製のＰＥＩＰｒｏを使用してＬＶ粒子を産生した。
【0129】
プロセス全体を通して、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用してウイルス力価を測定するために、各バイオリアクターから１０個または１２個のサンプルを取得し、Ｐ２４ ＥＬＩＳＡで確認した。ラマンスペクトルは、増殖およびウイルス産生段階を通して取得された。
【0130】
ＲＴ－ｑＰＣＲ
使用したＰＣＲキット：Ｌｅｎｔｉ－Ｘ（商標名） ｑＲＴ－ＰＣＲ滴定キット（Ｔａｋａｒａ製、カタログ番号６３１２３５）
サプライヤー：Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
作用機序：キットは、ワンステップの逆転写およびＰＣＲ増幅キットである。このキットのプライマーは、パッケージングシグナルに隣接するＨＩＶ－１ゲノムの保存領域をターゲットとしている。アンプリコンはＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ蛍光によって検出され、最終的な力価は標準曲線の作成に使用されるｓｓＲＮＡ標準から決定される。ウイルス力価の最終的な定量化は、ウイルスゲノム／ｍｌとして提供される。
使用したＰＣＲキット：Ｌｅｎｔｉ－Ｘ（商標名） ｑＲＴ－ＰＣＲ滴定キット（Ｔａｋａｒａ製、カタログ番号６３１２３５）
サプライヤー：Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
作用機序：キットは、ワンステップの逆転写およびＰＣＲ増幅キットである。このキットのプライマーは、パッケージングシグナルに隣接するＨＩＶ－１ゲノムの保存領域をターゲットとしている。アンプリコンはＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ蛍光によって検出され、最終的な力価は標準曲線の作成に使用されるｓｓＲＮＡ標準から決定される。ウイルス力価の最終的な定量化は、ウイルスゲノム／ｍｌとして提供される。
【0131】
Ｐ２４－ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡキット：ＱｕｉｃｋＴｉｔｅｒ（商標名）レンチウイルス力価キット（レンチウイルス随伴ＨＩＶ ｐ２４）（カタログ番号ＶＰＫ－１０７）
サプライヤー：Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ
作用機序：キットは、レンチウイルス随伴ＨＩＶ－１ ｐ２４コアタンパク質のみの検出と定量化のために開発された酵素免疫測定法である。ウイルス随伴ｐ２４は、レンチウイルス粒子当たり約２０００分子のｐ２４があると仮定して、ｐ２４力価（ｎｇ／ｍｌ）または粒子／ｍｌとして定量化できる。
ＥＬＩＳＡキット：ＱｕｉｃｋＴｉｔｅｒ（商標名）レンチウイルス力価キット（レンチウイルス随伴ＨＩＶ ｐ２４）（カタログ番号ＶＰＫ－１０７）
サプライヤー：Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ
作用機序：キットは、レンチウイルス随伴ＨＩＶ－１ ｐ２４コアタンパク質のみの検出と定量化のために開発された酵素免疫測定法である。ウイルス随伴ｐ２４は、レンチウイルス粒子当たり約２０００分子のｐ２４があると仮定して、ｐ２４力価（ｎｇ／ｍｌ）または粒子／ｍｌとして定量化できる。
【0132】
ラマン分光法
ラマン測定は、Ｋａｓｉｅｒ Ｏｐｔｉｃｓ ＲｘＮ２ラマン分光計を使用して実行された。この分光計は、４つのプローブチャネルを順番にモニタリングする機能を有する。ＲｘＮ２励起源は、各プローブヘッドでの公称出力が約２７０ｍＷの７８５ｎｍ近赤外ダイオードレーザであった。サンプルは、４つのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ｄａｓＢｏｘ ＢｉｏＢＬＵ使い捨てシステムの内容物で構成されていた。ビームは、４つのＫａｉｓｅｒ Ｏｐｔｉｃｓのフィルター付き光ファイバーＭＲプローブとＢｉｏＯｐｔｉｃ２２０を各バイオリアクターに１セット使用して各サンプルバイオリアクターまで送達された。インプロセス測定の前に、ＲｘＮ２システムを１時間安定させた後、４つのプローブチャネルのそれぞれをＲｘＮ２の内部自動較正標準器を使用して較正し、さらに、ＣＣＤ感度補正を米国国立標準技術研究所（ＮＩＳＴ）認定の光源（ＨＣＡ）を使用して各プローブチャネルで実行した。散乱光は、ビーム送達に使用されたものと同じＢｉｏＯｐｔｉｃ ２２０およびＭＲプローブを使用して収集された。各ＭＲプローブ内で、散乱光は第２の光ファイバーを介してＲｘＮ２ ｆ＼１．８イメージング分光器に送達された。ホログラフィックノッチフィルターを使用してレイリー散乱光をフィルタリングした後、ラマン散乱光はＫａｓｉｅｒ Ｏｐｔｉｃｓのホログラフィック透過型回折格子に向けられ、熱電冷却された１０２４ピクセルＣＣＤ検出器上に結像された。システムの有効帯域幅は、１００～３４２５ｃｍ－１であり、解像度は４ｃｍ－１である。ラマンスペクトルは、ＣＣＤ読み出し時間を含む約１５分／チャネルの積分時間で１００～３４２５ｃｍ－１から取得され、１０秒間の取得が、各測定スペクトルを生成するために７５回の累積で平均化された。各チャネルは、順番に測定された。プロセス全体の様々な時点で、液体サンプルが各バイオリアクターから取得され、オフラインアッセイデータを対応するラマンスペクトルに事後的に一致させることができるように、それらの時点は書き留められた。
ラマン測定は、Ｋａｓｉｅｒ Ｏｐｔｉｃｓ ＲｘＮ２ラマン分光計を使用して実行された。この分光計は、４つのプローブチャネルを順番にモニタリングする機能を有する。ＲｘＮ２励起源は、各プローブヘッドでの公称出力が約２７０ｍＷの７８５ｎｍ近赤外ダイオードレーザであった。サンプルは、４つのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ｄａｓＢｏｘ ＢｉｏＢＬＵ使い捨てシステムの内容物で構成されていた。ビームは、４つのＫａｉｓｅｒ Ｏｐｔｉｃｓのフィルター付き光ファイバーＭＲプローブとＢｉｏＯｐｔｉｃ２２０を各バイオリアクターに１セット使用して各サンプルバイオリアクターまで送達された。インプロセス測定の前に、ＲｘＮ２システムを１時間安定させた後、４つのプローブチャネルのそれぞれをＲｘＮ２の内部自動較正標準器を使用して較正し、さらに、ＣＣＤ感度補正を米国国立標準技術研究所（ＮＩＳＴ）認定の光源（ＨＣＡ）を使用して各プローブチャネルで実行した。散乱光は、ビーム送達に使用されたものと同じＢｉｏＯｐｔｉｃ ２２０およびＭＲプローブを使用して収集された。各ＭＲプローブ内で、散乱光は第２の光ファイバーを介してＲｘＮ２ ｆ＼１．８イメージング分光器に送達された。ホログラフィックノッチフィルターを使用してレイリー散乱光をフィルタリングした後、ラマン散乱光はＫａｓｉｅｒ Ｏｐｔｉｃｓのホログラフィック透過型回折格子に向けられ、熱電冷却された１０２４ピクセルＣＣＤ検出器上に結像された。システムの有効帯域幅は、１００～３４２５ｃｍ－１であり、解像度は４ｃｍ－１である。ラマンスペクトルは、ＣＣＤ読み出し時間を含む約１５分／チャネルの積分時間で１００～３４２５ｃｍ－１から取得され、１０秒間の取得が、各測定スペクトルを生成するために７５回の累積で平均化された。各チャネルは、順番に測定された。プロセス全体の様々な時点で、液体サンプルが各バイオリアクターから取得され、オフラインアッセイデータを対応するラマンスペクトルに事後的に一致させることができるように、それらの時点は書き留められた。
【0133】
ラマンデータ分析
すべてのデータ分析は、ＭＡＴＬＡＢ（Ｔｈｅ ＭａｔｈＷｏｒｋｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）バージョンＲ２０１７ｂで実行された。生のラマンスペクトルは、スペクトル全体を約３０００ｃｍ－１の水バンドのピーク強度に正規化することによって前処理された。中程度の蛍光バックグラウンドシグナルは、４２０～１８００ｃｍ－１の領域で除去された。この範囲の下限は、ＢｉｏＯｐｔｉｃ－２２０のサファイアウィンドウから発生する可能性がある、またはラマン機器とプローブの光学設計のアーティファクトである可能性があるラマンバンドを回避するように選択された。次に、縮小された正規化されたスペクトルに、明らかな外れ値とアーティファクトがないかを調べた。オフラインサンプリング時点に関連するスペクトルが特定され、前処理されたスペクトルのモデルトレーニングサブセットが作成された。次に、前処理されたスペクトルのトレーニングセットが、ケモメトリックモデリングに使用された。ケモメトリックモデリングの前に、スペクトルは平均を中央に配置した。重要な分析物とウイルス力価に対する潜在構造へのいくつかの初期射影－回帰（ＰＬＳ－Ｒ）モデルが構築された。これらのモデルを使用すると、既知の濃度の興味深い分析物（ウイルス力価）を含むサンプルに対して多変量ラマンスペクトルを回帰できる。これらの計算に基づいて、分析物の濃度は将来予測することができる。モデルは、トレーニングデータに対して１０分割の交差検証手順を使用して準備された。つまり、データの１／１０がランダムに選択され、トレーニングデータから削除され、モデルのパフォーマンスを評価するために使用された。これは１０回行われ、エラー値、モデルの精度／パフォーマンスの統計値は、１０倍のトレーニングセットのそれぞれについて取得された平均値である。基礎となる成分または基底ベクトルの数を選択することは、ＰＬＳ－Ｒなどの教師あり線形モデルを構築する上で重要なステップである。この作業では、成分数の関数としての交差検証後の予測の平均二乗誤差（ＭＳＥＣＶ）のプロットを調べることにより、基礎となる成分の最適な数が特定された。最小値は、ＰＬＳ成分の最適な数を特定する。予測に最も重要な波数／変数のみを選択して構築されたモデルを最適化するには、変数選択の第２段階が必要である。これは、変数重要度指標（ＶＩＰ）法を使用して実行された。しかしながら、変数の選択を行う多くの方法が存在する。典型的なＶＩＰプロットを図５に示す。通常、ＶＩＰ値が１より大きい変数が最終モデルに使用される。しかしながら、ここでは、いくつかのＶＩＰ閾値を使用してモデルを構築および評価し、良好な予測を行うために必要なスペクトル変数の最小数と、オフラインＲＴ－ｑＰＣＲデータのモデル化ができなくなる閾値を特定した。ＶＩＰ閾値が増加するにつれて、特定されるスペクトル変数の数が減少する。各ＶＩＰ閾値に対して有意な変数が決定されると、最終モデルが構築された。その後、これらのモデルを使用して、中間のウイルス力価値、つまり、利用可能なすべてのランの各オフラインデータポイント間のウイルス力価値を予測した。
すべてのデータ分析は、ＭＡＴＬＡＢ（Ｔｈｅ ＭａｔｈＷｏｒｋｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）バージョンＲ２０１７ｂで実行された。生のラマンスペクトルは、スペクトル全体を約３０００ｃｍ－１の水バンドのピーク強度に正規化することによって前処理された。中程度の蛍光バックグラウンドシグナルは、４２０～１８００ｃｍ－１の領域で除去された。この範囲の下限は、ＢｉｏＯｐｔｉｃ－２２０のサファイアウィンドウから発生する可能性がある、またはラマン機器とプローブの光学設計のアーティファクトである可能性があるラマンバンドを回避するように選択された。次に、縮小された正規化されたスペクトルに、明らかな外れ値とアーティファクトがないかを調べた。オフラインサンプリング時点に関連するスペクトルが特定され、前処理されたスペクトルのモデルトレーニングサブセットが作成された。次に、前処理されたスペクトルのトレーニングセットが、ケモメトリックモデリングに使用された。ケモメトリックモデリングの前に、スペクトルは平均を中央に配置した。重要な分析物とウイルス力価に対する潜在構造へのいくつかの初期射影－回帰（ＰＬＳ－Ｒ）モデルが構築された。これらのモデルを使用すると、既知の濃度の興味深い分析物（ウイルス力価）を含むサンプルに対して多変量ラマンスペクトルを回帰できる。これらの計算に基づいて、分析物の濃度は将来予測することができる。モデルは、トレーニングデータに対して１０分割の交差検証手順を使用して準備された。つまり、データの１／１０がランダムに選択され、トレーニングデータから削除され、モデルのパフォーマンスを評価するために使用された。これは１０回行われ、エラー値、モデルの精度／パフォーマンスの統計値は、１０倍のトレーニングセットのそれぞれについて取得された平均値である。基礎となる成分または基底ベクトルの数を選択することは、ＰＬＳ－Ｒなどの教師あり線形モデルを構築する上で重要なステップである。この作業では、成分数の関数としての交差検証後の予測の平均二乗誤差（ＭＳＥＣＶ）のプロットを調べることにより、基礎となる成分の最適な数が特定された。最小値は、ＰＬＳ成分の最適な数を特定する。予測に最も重要な波数／変数のみを選択して構築されたモデルを最適化するには、変数選択の第２段階が必要である。これは、変数重要度指標（ＶＩＰ）法を使用して実行された。しかしながら、変数の選択を行う多くの方法が存在する。典型的なＶＩＰプロットを図５に示す。通常、ＶＩＰ値が１より大きい変数が最終モデルに使用される。しかしながら、ここでは、いくつかのＶＩＰ閾値を使用してモデルを構築および評価し、良好な予測を行うために必要なスペクトル変数の最小数と、オフラインＲＴ－ｑＰＣＲデータのモデル化ができなくなる閾値を特定した。ＶＩＰ閾値が増加するにつれて、特定されるスペクトル変数の数が減少する。各ＶＩＰ閾値に対して有意な変数が決定されると、最終モデルが構築された。その後、これらのモデルを使用して、中間のウイルス力価値、つまり、利用可能なすべてのランの各オフラインデータポイント間のウイルス力価値を予測した。
【0134】
予備的なウイルス力価モデルの評価およびと範囲の選択
ケモメトリックモデリングに使用される場合の実施例の前処理されたラマンスペクトルを図２に示す。
ケモメトリックモデリングに使用される場合の実施例の前処理されたラマンスペクトルを図２に示す。
【0135】
プロジェクト全体を通してウイルス力価をモニタリングした。ＲＴ－ｑＰＣＲで取得した代表的な力価を図３にまとめる。
【0136】
初期ＰＬＳ－Ｒモデルの交差検証後の予測の平均二乗誤差のプロットを図４に示す。すべてのスペクトル変数またはチャネルを使用した場合、１２個のＰＬＳ成分を使用したときに最小の有効予測誤差が発生することが分かった。
【0137】
したがって、このプロット（図４）から、予測誤差の最小化とモデルの単純さの間の最良の妥協点は、１２成分モデルにあると結論付けることができる。成分の数を増やすことで予測力のわずかな改善が得られる可能性があるが、これはおそらく、ノイズを組み込み、モデルをトレーニングセットに過剰適合させた単なる結果である。つまり、トレーニングデータのみを予測し、新しい見えないデータを予測せず、測定された変数と従属／応答変数との間の疑似相関に基づくモデルを構築している。
【0138】
最初の１２成分モデルの準備に続いて、様々な変数選択方法を評価して、最終モデルの最適な／最も予測的なスペクトル変数を選択した。ここでの目的は、モデルから不要なスペクトルチャネル／変数を削除して、その単純性を強化し、物理的に意味のある情報のみを含めることであった。変数重要度指標（ＶＩＰ）が最終的に計算され、ウイルスのコピー数を予測する上でどのスペクトル変数が最も重要であるかを決定した（図５Ａ）。許容可能な物理的力価予測を行うために必要なスペクトル変数の最小数を評価および特定するために、保持された変数の基準としていくつかの変数重要度の閾値が調査された。通常、ＶＩＰ閾値１が使用され、閾値１．００～１．７５が調査された。図５Ｂは、ＶＩＰアルゴリズムが最も重要と見なされる領域、つまり選択された閾値（この場合は１．５）よりも大きい領域として特定する変数または波数の範囲を示している。図５Ｃは、これらの波数の範囲を重要度の順に示している。
【0139】
スペクトル変数の数が削減された後、基礎となる潜在変数の数のさらなる評価が実行された。ＰＬＳ成分の最適な数は、モデルで使用されるスペクトル変数または波数の数によって異なる可能性がある。１．５の閾値を使用してスペクトル変数を削減した後、ＰＬＳ潜在変数の最適な数は１０であることが分かった。図６は、基礎となる成分の数が異なる洗練されたモデルのＭＳＥＣＶプロットを示している。基礎となる成分の数が多いほど、予測の平均二乗誤差が増加するという事実は、１０個を超えるＰＬＳ成分が含まれている場合、生成されたモデルがトレーニングセットに過剰適合していることを示している。
【0140】
１０－潜在変数およびＶＩＰ＞＝１．５の選択されたスペクトル変数（控えめな）モデルから取得された回帰係数を使用して推定された３回のランのそれぞれのＲＴ－ｑＰＣＲウイルスコピー数のモデル予測を、それぞれ以下において図７、８、および９に示す。結果は、ラマン分光法データを使用したモデルが、経時的なウイルス力価のオフライン測定と一致していることを示している。ＲＴ－ｑＰＣＲアッセイおよびＰ２４ ＥＬＩＳＡから取得された力価の比較を図１０に示す。
【0141】
図１１は、本発明の方法を使用して、ウイルス産生培養の段階をモニタリングする方法を説明している。ラマン分光法はリアルタイムで連続的に使用されるため、本発明の方法では、ウイルスの産生速度の変化を正確に追跡することができる。したがって、開始から産生段階への変化、および産生段階から終了段階への変化を特定することができる。
【0142】
実施例３－洗練されたウイルス力価モデルの評価と範囲の選択
ウイルス力価評価のための波数範囲の選択をさらに洗練するために、実施例２について上で説明したのと同じ方法論を使用して、追加のサンプルを使用するさらなる研究を実施した。このアプローチを使用して、１．００以上の変数重要度指標（ＶＩＰ）閾値を適用することにより、ウイルス力価の計算に使用する様々な波数範囲が特定された。１．２５以上の変数重要度指標（ＶＩＰ）閾値を適用することにより、追加の波数範囲が特定され、１．５０以上の変数重要度指標（ＶＩＰ）閾値を適用することにより、さらなる波数範囲が特定された。結果は、上記の表１に示されている。
ウイルス力価評価のための波数範囲の選択をさらに洗練するために、実施例２について上で説明したのと同じ方法論を使用して、追加のサンプルを使用するさらなる研究を実施した。このアプローチを使用して、１．００以上の変数重要度指標（ＶＩＰ）閾値を適用することにより、ウイルス力価の計算に使用する様々な波数範囲が特定された。１．２５以上の変数重要度指標（ＶＩＰ）閾値を適用することにより、追加の波数範囲が特定され、１．５０以上の変数重要度指標（ＶＩＰ）閾値を適用することにより、さらなる波数範囲が特定された。結果は、上記の表１に示されている。
【0143】
図１２に、ウイルス力価を定量化するための式の概略図式を示している。この式は、正規化されたラマン信号強度データに適用された多変量回帰アルゴリズムから取得された回帰係数に適用される。
【0144】
ウイルス力価の正確な推定値を提供するために使用できる波数範囲の数を分析するために、さらなる分析が実行された。
【0145】
ウイルスベクター産生にとって重要であると特定された範囲、すなわち、拡張スペクトル範囲（約４２０～１８００ｃｍ－１）を使用した最初のＰＬＳモデリング後に１．００以上の変数重要度指標（ＶＩＰ）によって重要であると特定された範囲（すなわち上記の表１に列挙された波数範囲１～２８）が特定され、さらなる分析を実行した。
【0146】
データは、ランダムに選択されたトレーニングデータとテストデータのペアブロックに４：１の比率で、つまり、モデル構築（８０％）とモデルテスト（２０％）用のラマンスペクトルおよびそれらに関連するオフラインウイルス力価データに分割された。
【0147】
ＶＩＰによって重要と見なされる範囲の様々な組み合わせが、様々なトレーニングとテストのペアに対して、つまり、範囲１～２８のうちのそれぞれｒ個の総数に対して確率的に評価され、モデルのパフォーマンスＲ２統計（注：Ｒ２＝１－残差平方和／総平方和）に基づいて多くの組み合わせが評価され、様々なモデルのパフォーマンスの標準偏差を評価して、信頼区間を生成した。範囲の最小数は、データのいくつかのトレーニング／テストペアの平均Ｒ２値の平均が約０．５である範囲の数を選択することによって特定された。図１３は、波数範囲の数の関数としてのＲ２のプロットを示している。
【0148】
この分析により、ウイルス力価の推定値を提供するために必要な波数範囲の最小数として５が特定された。
【0149】
したがって、本発明の方法のいずれにおいても、本明細書でより詳細に説明されるように、１．００以上のＶＩＰ閾値で特定される表１に示されるような波数範囲１～２８のうちの５個以上を使用してウイルス力価を計算することができる。本発明の方法のいずれにおいても、好ましくは、本明細書でより詳細に説明されるように、１．２５以上のＶＩＰ閾値で特定される表１に示されるような波数範囲２９～５９のうちの５個以上を使用してウイルス力価を計算することができる。本発明の方法のいずれにおいても、より好ましくは、本明細書でより詳細に説明されるように、１．５０以上のＶＩＰ閾値で特定される表１に示されるような波数範囲６０～８１のうちの５個以上を使用してウイルス力価を計算することができる。これらの方法のいずれにおいても、好ましくは、本明細書でより詳細に記載されるように、波数範囲の１０個以上、より好ましくは１５以上、さらにより好ましくは２０以上を使用して、ウイルス力価を計算することができる。
【0150】
実施例４－ＨＥＫ２９３過渡プロセスからのＡＡＶ８産生
実験方法
細胞培養と一過性トランスフェクション
ＨＥＫ２９３Ｆ培養物は、３７℃で４ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｆｉｓｈｅｒ）を含むＢａｌａｎＣＤ培地（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ＤＡＳｂｏｘ ＢｉｏＢＬＵ３００バイオリアクターで増殖させた。細胞を攪拌し、一過性トランスフェクションの前に２４時間増殖させて、ＡＡＶ８を産生した。無血清Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で、ｒｅｐ、ｃａｐ、ゲノムにコードされたｅＧＦＰプラスミド、およびヘルパープラスミド（Ｅ２Ａ、Ｅ４）を細胞にトランスフェクトし、ＰＥＩＰｒｏ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）でＡＡＶ８粒子を産生した。
実験方法
細胞培養と一過性トランスフェクション
ＨＥＫ２９３Ｆ培養物は、３７℃で４ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｆｉｓｈｅｒ）を含むＢａｌａｎＣＤ培地（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ＤＡＳｂｏｘ ＢｉｏＢＬＵ３００バイオリアクターで増殖させた。細胞を攪拌し、一過性トランスフェクションの前に２４時間増殖させて、ＡＡＶ８を産生した。無血清Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で、ｒｅｐ、ｃａｐ、ゲノムにコードされたｅＧＦＰプラスミド、およびヘルパープラスミド（Ｅ２Ａ、Ｅ４）を細胞にトランスフェクトし、ＰＥＩＰｒｏ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）でＡＡＶ８粒子を産生した。
【0151】
プロセス全体を通して、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用してウイルス力価を測定するために、各バイオリアクターから１２個のサンプルを取得した。ラマンスペクトルは、増殖およびウイルス産生段階を通して取得された。
【0152】
ＲＴ－ｑＰＣＲ
ＡＡＶ８サンプルのウイルス力価は、ＴａｑＭａｎ（商標名）ベースのリアルタイムｑＰＣＲを使用して測定され、最終的な定量はウイルスゲノム／ｍＬ（ＶＧ／ｍＬ）として提供された。アッセイのプライマーは、ＡＡＶ８ウイルスゲノムのＩＴＲ２配列を標的とした。アンプリコンは、ＴａｑＭａｎ（商標名）蛍光発生プローブによって検出された。ウイルス力価は、直線化されたプラスミドから作成された標準曲線から決定された。
ＡＡＶ８サンプルのウイルス力価は、ＴａｑＭａｎ（商標名）ベースのリアルタイムｑＰＣＲを使用して測定され、最終的な定量はウイルスゲノム／ｍＬ（ＶＧ／ｍＬ）として提供された。アッセイのプライマーは、ＡＡＶ８ウイルスゲノムのＩＴＲ２配列を標的とした。アンプリコンは、ＴａｑＭａｎ（商標名）蛍光発生プローブによって検出された。ウイルス力価は、直線化されたプラスミドから作成された標準曲線から決定された。
【0153】
ラマン分光法
ラマン測定は、Ｋａｓｉｅｒ Ｏｐｔｉｃｓ ＲｘＮ２ラマン分光計を使用して実行された。この分光計は、４つのプローブチャネルを順番にモニタリングする機能を有する。ＲｘＮ２励起源は、各プローブヘッドでの公称出力が約２７０ｍＷの７８５ｎｍ近赤外ダイオードレーザであった。サンプルは、４つのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ｄａｓＢｏｘ ＢｉｏＢＬＵ使い捨てシステムの内容物で構成されていた。ビームは、４つのＫａｉｓｅｒ Ｏｐｔｉｃｓのフィルター付き光ファイバーＭＲプローブとＢｉｏＯｐｔｉｃ２２０を各バイオリアクターに１セット使用して各サンプルバイオリアクターまで送達された。インプロセス測定の前に、ＲｘＮ２システムを１時間安定させた後、４つのプローブチャネルのそれぞれをＲｘＮ２の内部自動較正標準器を使用して較正し、さらに、ＣＣＤ感度補正を米国国立標準技術研究所（ＮＩＳＴ）認定の光源（ＨＣＡ）を使用して各プローブチャネルで実行した。散乱光は、ビーム送達に使用されたものと同じＢｉｏＯｐｔｉｃ ２２０およびＭＲプローブを使用して収集された。各ＭＲプローブ内で、散乱光は第２の光ファイバーを介してＲｘＮ２ ｆ＼１．８イメージング分光器に送達された。ホログラフィックノッチフィルターを使用してレイリー散乱光をフィルタリングした後、ラマン散乱光はＫａｓｉｅｒ Ｏｐｔｉｃｓのホログラフィック透過型回折格子に向けられ、熱電冷却された１０２４ピクセルＣＣＤ検出器上に結像された。システムの有効帯域幅は、１００～３４２５ｃｍ－１であり、解像度は４ｃｍ－１である。ラマンスペクトルは、ＣＣＤ読み出し時間を含む約１５分／チャネルの積分時間で１００～３４２５ｃｍ－１から取得され、１０秒間の取得が、各測定スペクトルを生成するために７５回の累積で平均化された。各チャネルは、順番に測定された。プロセス全体の様々な時点で、液体サンプルが各バイオリアクターから取得され、オフラインアッセイデータを対応するラマンスペクトルに事後的に一致させることができるように、それらの時点は書き留められた。
ラマン測定は、Ｋａｓｉｅｒ Ｏｐｔｉｃｓ ＲｘＮ２ラマン分光計を使用して実行された。この分光計は、４つのプローブチャネルを順番にモニタリングする機能を有する。ＲｘＮ２励起源は、各プローブヘッドでの公称出力が約２７０ｍＷの７８５ｎｍ近赤外ダイオードレーザであった。サンプルは、４つのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ｄａｓＢｏｘ ＢｉｏＢＬＵ使い捨てシステムの内容物で構成されていた。ビームは、４つのＫａｉｓｅｒ Ｏｐｔｉｃｓのフィルター付き光ファイバーＭＲプローブとＢｉｏＯｐｔｉｃ２２０を各バイオリアクターに１セット使用して各サンプルバイオリアクターまで送達された。インプロセス測定の前に、ＲｘＮ２システムを１時間安定させた後、４つのプローブチャネルのそれぞれをＲｘＮ２の内部自動較正標準器を使用して較正し、さらに、ＣＣＤ感度補正を米国国立標準技術研究所（ＮＩＳＴ）認定の光源（ＨＣＡ）を使用して各プローブチャネルで実行した。散乱光は、ビーム送達に使用されたものと同じＢｉｏＯｐｔｉｃ ２２０およびＭＲプローブを使用して収集された。各ＭＲプローブ内で、散乱光は第２の光ファイバーを介してＲｘＮ２ ｆ＼１．８イメージング分光器に送達された。ホログラフィックノッチフィルターを使用してレイリー散乱光をフィルタリングした後、ラマン散乱光はＫａｓｉｅｒ Ｏｐｔｉｃｓのホログラフィック透過型回折格子に向けられ、熱電冷却された１０２４ピクセルＣＣＤ検出器上に結像された。システムの有効帯域幅は、１００～３４２５ｃｍ－１であり、解像度は４ｃｍ－１である。ラマンスペクトルは、ＣＣＤ読み出し時間を含む約１５分／チャネルの積分時間で１００～３４２５ｃｍ－１から取得され、１０秒間の取得が、各測定スペクトルを生成するために７５回の累積で平均化された。各チャネルは、順番に測定された。プロセス全体の様々な時点で、液体サンプルが各バイオリアクターから取得され、オフラインアッセイデータを対応するラマンスペクトルに事後的に一致させることができるように、それらの時点は書き留められた。
【0154】
ラマンデータ分析
すべてのデータ分析は、ＭＡＴＬＡＢ（Ｔｈｅ ＭａｔｈＷｏｒｋｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）バージョンＲ２０１９ｂで実行された。生のラマンスペクトルは、スペクトル全体を約３０００ｃｍ－１の水バンドのピーク強度に正規化することによって前処理された。中程度の蛍光バックグラウンドシグナルは、４２０～１８００ｃｍ－１の領域で除去された。この範囲の下限は、ＢｉｏＯｐｔｉｃ－２２０のサファイアウィンドウから発生する可能性がある、またはラマン機器とプローブの光学設計のアーティファクトである可能性があるラマンバンドを回避するように選択された。次に、縮小された正規化されたスペクトルに、明らかな外れ値とアーティファクトがないかを調べた。オフラインサンプリング時点に関連するスペクトルが特定され、前処理されたスペクトルのモデルトレーニングサブセットが作成された。次に、前処理されたスペクトルのトレーニングセットが、ケモメトリックモデリングに使用された。ケモメトリックモデリングの前に、スペクトルは平均を中央に配置した。重要な分析物とウイルス力価に対する潜在構造へのいくつかの初期射影－回帰（ＰＬＳ－Ｒ）モデルが構築された。これらのモデルを使用すると、既知の濃度の興味深い分析物（ウイルス力価）を含むサンプルに対して多変量ラマンスペクトルを回帰できる。これらの計算に基づいて、分析物の濃度は将来予測することができる。モデルは、トレーニングデータに対して１０分割の交差検証手順を使用して準備された。つまり、データの１／１０がランダムに選択され、トレーニングデータから削除され、モデルのパフォーマンスを評価するために使用された。これは１０回行われ、エラー値、モデルの精度／パフォーマンスの統計値は、１０倍のトレーニングセットのそれぞれについて取得された平均値である。基礎となる成分または基底ベクトルの数を選択することは、ＰＬＳ－Ｒなどの教師あり線形モデルを構築する上で重要なステップである。この作業では、成分数の関数としての交差検証後の予測の平均二乗誤差（ＭＳＥＣＶ）のプロットを調べることにより、基礎となる成分の最適な数が特定された。最小値は、ＰＬＳ成分の最適な数を特定する。予測に最も重要な波数／変数のみを選択して構築されたモデルを最適化するには、変数選択の第２段階が必要である。これは、変数重要度指標（ＶＩＰ）法を使用して実行された。しかしながら、変数の選択を行う多くの方法が存在する。典型的なＶＩＰプロットを図（１８）に示す。通常、ＶＩＰ値が１より大きい変数が最終モデルに使用される。しかしながら、ここでは、いくつかのＶＩＰ閾値を使用してモデルを構築および評価し、良好な予測を行うために必要なスペクトル変数の最小数と、オフラインＲＴ－ｑＰＣＲデータのモデル化ができなくなる閾値を特定した。ＶＩＰ閾値が増加するにつれて、特定されるスペクトル変数の数が減少する。各ＶＩＰ閾値に対して有意な変数が決定されると、最終モデルが構築された。その後、これらのモデルを使用して、中間のウイルス力価値、つまり、利用可能なすべてのランの各オフラインデータポイント間のウイルス力価値を予測した。
すべてのデータ分析は、ＭＡＴＬＡＢ（Ｔｈｅ ＭａｔｈＷｏｒｋｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）バージョンＲ２０１９ｂで実行された。生のラマンスペクトルは、スペクトル全体を約３０００ｃｍ－１の水バンドのピーク強度に正規化することによって前処理された。中程度の蛍光バックグラウンドシグナルは、４２０～１８００ｃｍ－１の領域で除去された。この範囲の下限は、ＢｉｏＯｐｔｉｃ－２２０のサファイアウィンドウから発生する可能性がある、またはラマン機器とプローブの光学設計のアーティファクトである可能性があるラマンバンドを回避するように選択された。次に、縮小された正規化されたスペクトルに、明らかな外れ値とアーティファクトがないかを調べた。オフラインサンプリング時点に関連するスペクトルが特定され、前処理されたスペクトルのモデルトレーニングサブセットが作成された。次に、前処理されたスペクトルのトレーニングセットが、ケモメトリックモデリングに使用された。ケモメトリックモデリングの前に、スペクトルは平均を中央に配置した。重要な分析物とウイルス力価に対する潜在構造へのいくつかの初期射影－回帰（ＰＬＳ－Ｒ）モデルが構築された。これらのモデルを使用すると、既知の濃度の興味深い分析物（ウイルス力価）を含むサンプルに対して多変量ラマンスペクトルを回帰できる。これらの計算に基づいて、分析物の濃度は将来予測することができる。モデルは、トレーニングデータに対して１０分割の交差検証手順を使用して準備された。つまり、データの１／１０がランダムに選択され、トレーニングデータから削除され、モデルのパフォーマンスを評価するために使用された。これは１０回行われ、エラー値、モデルの精度／パフォーマンスの統計値は、１０倍のトレーニングセットのそれぞれについて取得された平均値である。基礎となる成分または基底ベクトルの数を選択することは、ＰＬＳ－Ｒなどの教師あり線形モデルを構築する上で重要なステップである。この作業では、成分数の関数としての交差検証後の予測の平均二乗誤差（ＭＳＥＣＶ）のプロットを調べることにより、基礎となる成分の最適な数が特定された。最小値は、ＰＬＳ成分の最適な数を特定する。予測に最も重要な波数／変数のみを選択して構築されたモデルを最適化するには、変数選択の第２段階が必要である。これは、変数重要度指標（ＶＩＰ）法を使用して実行された。しかしながら、変数の選択を行う多くの方法が存在する。典型的なＶＩＰプロットを図（１８）に示す。通常、ＶＩＰ値が１より大きい変数が最終モデルに使用される。しかしながら、ここでは、いくつかのＶＩＰ閾値を使用してモデルを構築および評価し、良好な予測を行うために必要なスペクトル変数の最小数と、オフラインＲＴ－ｑＰＣＲデータのモデル化ができなくなる閾値を特定した。ＶＩＰ閾値が増加するにつれて、特定されるスペクトル変数の数が減少する。各ＶＩＰ閾値に対して有意な変数が決定されると、最終モデルが構築された。その後、これらのモデルを使用して、中間のウイルス力価値、つまり、利用可能なすべてのランの各オフラインデータポイント間のウイルス力価値を予測した。
【0155】
予備的なウイルス力価モデルの評価と範囲の選択
ＡＡＶのケモメトリックモデリングに使用される場合の実施例の前処理されたラマンスペクトルを図（１４）に示す。
ＡＡＶのケモメトリックモデリングに使用される場合の実施例の前処理されたラマンスペクトルを図（１４）に示す。
【0156】
プロジェクト全体を通してＡＡＶ力価をモニタリングし、ＲＴ－ｑＰＣＲによって取得された代表的な力価を図（１５）にまとめている。
【0157】
初期ＰＬＳ－Ｒモデルの交差検証後の予測の平均二乗誤差のプロットを図（１６）に示す。すべてのスペクトル変数またはチャネルを使用した場合、１５個のＰＬＳ成分を使用したときに最小の有効な予測誤差が発生することが分かった。
【0158】
したがって、このプロット（図１６）から、予測誤差の最小化とモデルの単純さの間の最良の妥協点は、１５成分モデルにあると結論付けることができる。
最初の１５成分モデルの準備に続いて、様々な変数選択方法を評価して、最終モデルに最適な／最も予測的なスペクトル変数を選択した。ここでの目的は、モデルから不要なスペクトルチャネル／変数を削除して、その単純性を強化し、物理的に意味のある情報のみを含めることであった。変数重要度指標（ＶＩＰ）が最終的に計算され、ウイルスのコピー数を予測する上でどのスペクトル変数が最も重要であるかを決定した（図（１７）Ａ）。許容可能な物理的力価予測を行うために必要なスペクトル変数の最小数を評価および特定するために、保持された変数の基準としていくつかの変数重要度の閾値が調査された。通常、ＶＩＰ閾値１が使用され、閾値１．００～１．７５が調査された。図（１７）Ｂは、ＶＩＰアルゴリズムが最も重要と見なされる領域、つまり選択された閾値（この場合は１．０）より大きい領域として特定する変数または波数の範囲を示している。図（１７）Ｃは、これらの波数の範囲を重要度の順に示している。
最初の１５成分モデルの準備に続いて、様々な変数選択方法を評価して、最終モデルに最適な／最も予測的なスペクトル変数を選択した。ここでの目的は、モデルから不要なスペクトルチャネル／変数を削除して、その単純性を強化し、物理的に意味のある情報のみを含めることであった。変数重要度指標（ＶＩＰ）が最終的に計算され、ウイルスのコピー数を予測する上でどのスペクトル変数が最も重要であるかを決定した（図（１７）Ａ）。許容可能な物理的力価予測を行うために必要なスペクトル変数の最小数を評価および特定するために、保持された変数の基準としていくつかの変数重要度の閾値が調査された。通常、ＶＩＰ閾値１が使用され、閾値１．００～１．７５が調査された。図（１７）Ｂは、ＶＩＰアルゴリズムが最も重要と見なされる領域、つまり選択された閾値（この場合は１．０）より大きい領域として特定する変数または波数の範囲を示している。図（１７）Ｃは、これらの波数の範囲を重要度の順に示している。
【0159】
スペクトル変数の数が削減された後、基礎となる潜在変数の数のさらなる評価が実行された。ＰＬＳ成分の最適な数は、モデルで使用されるスペクトル変数または波数の数によって異なる可能性がある。１．０の閾値を使用してスペクトル変数を削減した後、ＰＬＳ潜在変数の最適な数は９であることが分かった。図（１８）は、基礎となる成分の数が異なる洗練されたモデルのＭＳＥＣＶプロットを示している。基礎となる成分の数が多いほど、予測の平均二乗誤差が増加するという事実は、９個を超えるＰＬＳ成分が含まれている場合、生成されたモデルがトレーニングセットに過剰適合していることを示している。
【0160】
９－潜在変数およびＶＩＰ＞１．０の選択されたスペクトル変数（控えめな）モデルから取得された回帰係数を使用して推定された４つのバイオリアクターの実行例のＲＴ－ｑＰＣＲウイルスコピー数のモデル予測を以下の図（１９）に示す。結果は、ラマン分光法データを使用したモデルが、経時的なウイルス力価のオフライン測定と一致していることを示している。
【0161】
実施例５－ＡＡＶの洗練されたウイルス力価モデルの評価と範囲の選択
実施例４に記載されたものに対するさらなる分析を実施して、ＡＡＶウイルス力価の正確な推定を提供するために使用することができる波数範囲の数を分析した。
実施例４に記載されたものに対するさらなる分析を実施して、ＡＡＶウイルス力価の正確な推定を提供するために使用することができる波数範囲の数を分析した。
【0162】
ウイルスベクター産生にとって重要であると特定された範囲、すなわち、拡張スペクトル範囲（約４２０～１８００ｃｍ－１）を使用した最初のＰＬＳモデリング後に１．００以上の変数重要度指標（ＶＩＰ）によって重要であると特定された範囲（すなわち上記の表２に列挙された波数範囲１～１２）が特定され、さらなる分析を実行した。
【0163】
データは、ランダムに選択されたトレーニングデータとテストデータのペアブロックに４：１の比率で、つまり、モデル構築（８０％）とモデルテスト（２０％）用のラマンスペクトルおよびそれらに関連するオフラインウイルス力価データに分割された。
【0164】
ＶＩＰによって重要と見なされる範囲の様々な組み合わせが、様々なトレーニングとテストのペアに対して、つまり、範囲１～１２のうちのそれぞれｒ個の総数に対して確率的に評価され、モデルのパフォーマンスＲ２統計（注：Ｒ２＝１－残差平方和／総平方和）に基づいて多くの組み合わせが評価され、様々なモデルのパフォーマンスの標準偏差を評価して、信頼区間を生成した。範囲の最小数は、データのいくつかのトレーニング／テストペアの平均Ｒ２値の平均が約０．５である範囲の数を選択することによって特定された。図２０は、波数範囲の数の関数としてのＲ２のプロットを示している。
【0165】
この分析により、ＡＡＶウイルス力価の推定値を提供するために必要な波数範囲の最小数として４が特定された。
【0166】
したがって、本発明の方法のいずれにおいても、本明細書でより詳細に説明するように、１．００以上のＶＩＰ閾値で特定される表２に示されるような波数範囲１～１２のうちの４個以上を使用して、ウイルス力価を計算することができる。これらの方法のいずれにおいても、好ましくは６個以上の波数範囲を使用して、より好ましくは８個以上、さらにより好ましくは１０個以上、または最も好ましくは１２個すべてを使用して、本明細書でより詳細に記載されるようにウイルス力価を計算することができる。本発明の方法のいずれにおいても、本明細書でより詳細に説明するように、１．２５以上のＶＩＰ閾値で特定される表２に示される波数範囲１３～２２のうちの４個以上を使用して、ウイルス力価を計算することができる。これらの方法のいずれにおいても、好ましくは６個以上の波数範囲を使用して、より好ましくは８個以上、または最も好ましくは１０個すべてを使用して、本明細書でより詳細に記載されるようにウイルス力価を計算することができる。本明細書でより詳細に説明されるように、１．５０以上のＶＩＰ閾値で特定される表２に示されるような波数範囲２３～３０のうちの４個以上を使用して、ウイルス力価を計算することができる。これらの方法のいずれにおいても、好ましくは６個以上の波数範囲を使用して、または最も好ましくは８個すべてを使用して、本明細書でより詳細に記載されるようにウイルス力価を計算することができる。
【0167】
参考文献
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17-1】
【図17-2】
【図18】
【図19】
【図20】
