(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-07-17
(45)【発行日】2024-07-25
(54)【発明の名称】二重膜構造細胞内小器官ＤＮＡ標的薬
(51)【国際特許分類】
C07K 7/06 20060101AFI20240718BHJP
C07K 7/08 20060101ALI20240718BHJP
A61K 31/675 20060101ALI20240718BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240718BHJP
A61K 38/08 20190101ALI20240718BHJP
A61K 38/10 20060101ALI20240718BHJP
【ＦＩ】
C07K7/06
C07K7/08 ZNA
A61K31/675
A61P35/00
A61K38/08
A61K38/10
【請求項の数】
2
(21)【出願番号】P 2021507430
(86)(22)【出願日】2020-03-19
(86)【国際出願番号】 JP2020012498
(87)【国際公開番号】W WO2020189779
(87)【国際公開日】2020-09-24
【審査請求日】2023-02-06
(31)【優先権主張番号】P 2019053528
(32)【優先日】2019-03-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】502285457
【氏名又は名称】学校法人順天堂
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】永瀬 浩喜
(72)【発明者】
【氏名】渡部 隆義
(72)【発明者】
【氏名】越川 信子
(72)【発明者】
【氏名】安井 七海
【審査官】松田 芳子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１２／１３３８９６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】日本分子生物学会大会講演要旨集，2017年，vol.90th，3AW06-5
【文献】遺伝子医学，2019年01月01日，vol.9, no.1，p.6-9, 83-89
【文献】村上 圭 編，遺伝子医学MOOK 35 ミトコンドリアと病気，メディカルドゥ，2020年05月10日，p.218-223
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／０９
Ｃ０７Ｋ ７／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
次式（Ｖ）、（ＶＩ）、（Ｘ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＶ）、（ＸＶ）、（ＸＶＩ）、（ＸＶＩＩ）、（ＸＶＩＩＩ）、（ＸＩＸ）、（ＸＸ）、（ＸＸＩ）、（ＸＸＩＩ）、（ＸＸＩＩＩ）及び（ＶＩＩ－ＴＰＰ）から選ばれる構造を有する複合体。
【化1】
【請求項2】
請求項１記載の複合体を含有する、ミトコンドリアＤＮＡ変異に起因する疾患の治療用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、二重膜構造細胞内小器官ＤＮＡを標的にした低分子量化合物の複合体に関する。
【背景技術】
【0002】
脂溶性カチオンなどがミトコンドリアや葉緑体などの二重膜構造細胞内小器官へ薬剤を送達する技術として開発され（非特許文献１）、ミトコンドリア関連疾患の治療への応用が試みられている（特許文献２～５）。一方、ミトコンドリアＤＮＡの遺伝子変異がミトコンドリア病のみでなく、生活習慣病やがんで病変部位に蓄積していることも確認されている。ミトコンドリアＤＮＡ配列を標的にすることでミトコンドリア遺伝子の転写を調節できることも報告され（非特許文献２）、ヘアピン型のピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）により病因性ミトコンドリアＤＮＡ配列を標的にし、病的遺伝子配列を持つミトコンドリア数を減少させることが出来る可能性も報告されている（特許文献１）。しかし変異ミトコンドリアＤＮＡを持つ細胞に効率的に生理活性を誘導する方法はいまだ確立していない。
【0003】
ミトコンドリア病の多くがミトコンドリアＤＮＡに病的変異を有し、そのコピー数が増加することで発症する。またミトコンドリアＤＮＡに病因性変異を有する細胞が増加することで生活習慣病などの様々な疾患が発症することも報告されている。さらにがん細胞においては、ミトコンドリアＤＮＡに変異を有し、その変異がホモプラスミー（すべて変異ミトコンドリアＤＮＡに置き換わった状態）になっている多くの症例が報告されている（非特許文献３）。これらのミトコンドリアＤＮＡの病的変異を有する病態に対し、直接ミトコンドリアＤＮＡ変異を標的にした治療法は開発されていない。
【0004】
本発明者らは、ミトコンドリアＤＮＡの変異を認識し、長期にミトコンドリアに貯留し、ミトコンドリアＤＮＡに特異的な変異をもつ細胞において生理活性を起こす化合物の探索研究に鋭意取り組み、ミトコンドリア浸透性化合物と低分子の直鎖状ＤＮＡ副溝結合化合物を連結部分を介して結合した複合体が、高効率に特異的ミトコンドリアＤＮＡ配列を有する細胞に生理活性を有することを発見し本発明に至った。さらに脂溶性カチオン複合体が植物細胞に影響し、葉緑体へも浸透できる可能性が報告されているが（非特許文献４、５）、実際に植物の根や葉の生細胞内に二重膜構造細胞内小器官ＤＮＡを標的にした低分子量化合物の複合体が浸透できることは明らかにされていなかったが、確認でき植物への応用の可能性も明らかにされた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】国際公開第WO2012/133896号
【文献】国際公開第WO2011/150494号
【文献】特表2011-501731
【文献】特表2016-523926
【文献】国際公開第CN2008/801154230号
【非特許文献】
【0006】
【文献】Chem Rev. 2017 117(15)10043-10120
【文献】J. Am. Chem. Soc., 2017, 139 (25) 8444-8447
【文献】Sci Rep. 2017 Nov 14;7(1):15535.
【文献】Plant Physiol. (1983) 73, 169-174
【文献】Mitochondrion (2019)46, 164-171 Available online May 01 2018
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
ミトコンドリアＤＮＡ変異関連病変
ミトコンドリアは植物を含む高等生物に存在し、ヒトミトコンドリアＤＮＡは、Ｂ－ＤＮＡ二重螺旋構造を有し、３７遺伝子をコードし、そのうち１３が構造遺伝子として、呼吸鎖複合体Ｉ, ＩＩＩ, ＩＶ, Ｖのサブユニットをコードし、呼吸鎖を活性化、ＡＴＰ生産、活性酸素の産生に関与し、そのＤＮＡ変異が様々な病態と関連している。ミトコンドリアは一細胞内に数千個存在し、ミトコンドリアＤＮＡも数千コピー存在し、ＤＮＡ変異を含むものが含まれることが多いが、コピー数が一定以上になることで、ミトコンドリアの機能異常が誘発され、ミトコンドリア病や老化、生活習慣病、がんなどの疾患に関与する。特にがんでは、ホモプラスミーと呼ばれるミトコンドリアＤＮＡ変異がほぼ全てとなる現象も報告されている。
ミトコンドリア標的化合物
ミトコンドリアに関係する病態を治療するために、ミトコンドリアを標的にした様々な化合物の開発が試みられているが、いまだ変異ミトコンドリアＤＮＡを標的にした根本的治療法は開発されていない。ミトコンドリアへの薬物送達には、原形質膜電位差及びミトコンドリア二重膜の電位を利用した脂溶性カチオンによる化合物の送達技術が開発され、ミトコンドリアマトリックス中に処理濃度の１００～５００倍蓄積することが報告されている。
ＤＮＡ副溝結合化合物
放線菌などが産生する抗生物質には、ＤＮＡの副溝を配列特異的に認識する化合物があることが知られている。この配列認識機構を応用して二本鎖Ｂ－ＤＮＡを認識するヘアピン型ＰＩポリアミドが研究され、核内及びミトコンドリア内への送達が確認され、核内ＤＮＡやミトコンドリアＤＮＡへ結合し、ゲノム構造等へ影響することで疾患治療に利用できる可能性が示唆されてきた。ヘアピン型ＰＩポリアミドやディスタマイシンなどの直鎖ＤＮＡ結合化合物の一部が核内ではなくミトコンドリアに送達されることが報告されているが、長期には貯留できずＥＲやゴルジに移行し、ミトコンドリアにおいて長期間生物活性を示すことはできないことを示唆することが報告され、発明者らも確認している（Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 11 (2001) 769-772）。
ミトコンドリア標的化合物とヘアピン型ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）複合体
ミトコンドリアを標的にしたミトコンドリア浸透性ペプチドＭｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ（ＭＰＰ）とミトコンドリアＤＮＡ標的ヘアピン型ピロール・イミダゾールポリアミド化合物の複合体がミトコンドリアに貯留し、ミトコンドリア遺伝子の発現を調節できることが報告され、本発明者らも脂溶性カチオンであるｔｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ（ＴＰＰ）を用いてヘアピン型ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）を送達し、変異ミトコンドリアＤＮＡのコピー数を統計的に有意ではないが減少させる傾向を報告した。しかし、ヘアピン型ＰＩＰは分子量が大きく合成工程が複雑で薬剤開発には必ずしも適切ではない。
ミトコンドリアは植物を含む高等生物に存在し、ヒトミトコンドリアＤＮＡは、Ｂ－ＤＮＡ二重螺旋構造を有し、３７遺伝子をコードし、そのうち１３が構造遺伝子として、呼吸鎖複合体Ｉ, ＩＩＩ, ＩＶ, Ｖのサブユニットをコードし、呼吸鎖を活性化、ＡＴＰ生産、活性酸素の産生に関与し、そのＤＮＡ変異が様々な病態と関連している。ミトコンドリアは一細胞内に数千個存在し、ミトコンドリアＤＮＡも数千コピー存在し、ＤＮＡ変異を含むものが含まれることが多いが、コピー数が一定以上になることで、ミトコンドリアの機能異常が誘発され、ミトコンドリア病や老化、生活習慣病、がんなどの疾患に関与する。特にがんでは、ホモプラスミーと呼ばれるミトコンドリアＤＮＡ変異がほぼ全てとなる現象も報告されている。
ミトコンドリア標的化合物
ミトコンドリアに関係する病態を治療するために、ミトコンドリアを標的にした様々な化合物の開発が試みられているが、いまだ変異ミトコンドリアＤＮＡを標的にした根本的治療法は開発されていない。ミトコンドリアへの薬物送達には、原形質膜電位差及びミトコンドリア二重膜の電位を利用した脂溶性カチオンによる化合物の送達技術が開発され、ミトコンドリアマトリックス中に処理濃度の１００～５００倍蓄積することが報告されている。
ＤＮＡ副溝結合化合物
放線菌などが産生する抗生物質には、ＤＮＡの副溝を配列特異的に認識する化合物があることが知られている。この配列認識機構を応用して二本鎖Ｂ－ＤＮＡを認識するヘアピン型ＰＩポリアミドが研究され、核内及びミトコンドリア内への送達が確認され、核内ＤＮＡやミトコンドリアＤＮＡへ結合し、ゲノム構造等へ影響することで疾患治療に利用できる可能性が示唆されてきた。ヘアピン型ＰＩポリアミドやディスタマイシンなどの直鎖ＤＮＡ結合化合物の一部が核内ではなくミトコンドリアに送達されることが報告されているが、長期には貯留できずＥＲやゴルジに移行し、ミトコンドリアにおいて長期間生物活性を示すことはできないことを示唆することが報告され、発明者らも確認している（Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 11 (2001) 769-772）。
ミトコンドリア標的化合物とヘアピン型ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）複合体
ミトコンドリアを標的にしたミトコンドリア浸透性ペプチドＭｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ（ＭＰＰ）とミトコンドリアＤＮＡ標的ヘアピン型ピロール・イミダゾールポリアミド化合物の複合体がミトコンドリアに貯留し、ミトコンドリア遺伝子の発現を調節できることが報告され、本発明者らも脂溶性カチオンであるｔｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ（ＴＰＰ）を用いてヘアピン型ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）を送達し、変異ミトコンドリアＤＮＡのコピー数を統計的に有意ではないが減少させる傾向を報告した。しかし、ヘアピン型ＰＩＰは分子量が大きく合成工程が複雑で薬剤開発には必ずしも適切ではない。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明では、ミトコンドリアＤＮＡ変異に対してより有効でより適切な薬剤候補を開発するために鋭意努力し、直鎖状配列認識ＤＮＡ副溝結合化合物を脂溶性カチオンと結合させた複合体が、ヘアピン型ＰＩポリアミドとの複合体に比べ合成反応ステップ数を減少でき、分子量を半減でき、さらにミトコンドリアＤＮＡ変異を有する細胞においてミトコンドリアの自食（マイトファジー）の誘導、ミトコンドリアＤＮＡコピー数の増加、変異ミトコンドリアＤＮＡコピー数の減少、変異ミトコンドリアＤＮＡがホモプラスミーもしくはそのコピー数が多い細胞において細胞死を誘導できることを見出した。これらのことから、本発明により薬剤開発により適した、効果的に生物活性が得られる化合物を合成できることが明らかになったことより本発明に至った。さらに細胞死に抵抗性の細胞が存在し、この抵抗性の細胞には細胞死抑制因子阻害剤等の投与で細胞死が誘導できることも確認された。また植物の根、葉の生細胞内への送達が確認されたことより植物等細胞壁をもつ生物への効果も期待される。
【0009】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１] 二重膜構造細胞内小器官ＤＮＡの配列に特異的に結合する直鎖状ＤＮＡ結合化合物と、二重膜構造細胞内小器官局在性化合物との複合体。
[２] 複合体が二重膜構造細胞内小器官であるミトコンドリアに集積し、二重膜構造細胞内小器官ＤＮＡ配列特異的に二重膜構造細胞内小器官の機能を変更する、[１]の複合体。
[３] 二重膜構造細胞内小器官ＤＮＡ配列が、ミトコンドリアもしくは葉緑体ＤＮＡ配列、ミトコンドリア病病因変異ＤＮＡ配列、ミトコンドリア関連疾患変異ＤＮＡ配列、ミトコンドリアＤＮＡ多型を含む病変細胞におけるコピー数が正常細胞に比べ多い配列、並びに遺伝子データベースに登録される二重膜構造細胞内小器官ＤＮＡ配列からなる群から選択される少なくとも１つ以上である、[１]又は[２]の複合体。
[４] ＤＮＡ結合化合物がＢｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（架橋化核酸）、Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）、ＰＮＡ、直鎖状ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）、直鎖状ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）修飾物、ＤＮＡ結合蛋白質、及びＤＮＡ結合蛋白質複合体からなる群から選択される、[１]～[３]のいずれかの複合体。
[５] 二重膜構造細胞内小器官局在性化合物が、脂溶性カチオンである、[１]～[４]のいずれかの複合体。
[６] 脂溶性カチオンがＴＰＰ（ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ）である、[５]の複合体。
[７] [１]～[６]のいずれかの複合体を含む、ミトコンドリアＤＮＡ変異及び多型を認識する配列特異的ミトコンドリアＤＮＡ集積性化合物。
[８] 下式(Ｉ)で表される[１]の複合体：
[１] 二重膜構造細胞内小器官ＤＮＡの配列に特異的に結合する直鎖状ＤＮＡ結合化合物と、二重膜構造細胞内小器官局在性化合物との複合体。
[２] 複合体が二重膜構造細胞内小器官であるミトコンドリアに集積し、二重膜構造細胞内小器官ＤＮＡ配列特異的に二重膜構造細胞内小器官の機能を変更する、[１]の複合体。
[３] 二重膜構造細胞内小器官ＤＮＡ配列が、ミトコンドリアもしくは葉緑体ＤＮＡ配列、ミトコンドリア病病因変異ＤＮＡ配列、ミトコンドリア関連疾患変異ＤＮＡ配列、ミトコンドリアＤＮＡ多型を含む病変細胞におけるコピー数が正常細胞に比べ多い配列、並びに遺伝子データベースに登録される二重膜構造細胞内小器官ＤＮＡ配列からなる群から選択される少なくとも１つ以上である、[１]又は[２]の複合体。
[４] ＤＮＡ結合化合物がＢｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（架橋化核酸）、Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）、ＰＮＡ、直鎖状ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）、直鎖状ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）修飾物、ＤＮＡ結合蛋白質、及びＤＮＡ結合蛋白質複合体からなる群から選択される、[１]～[３]のいずれかの複合体。
[５] 二重膜構造細胞内小器官局在性化合物が、脂溶性カチオンである、[１]～[４]のいずれかの複合体。
[６] 脂溶性カチオンがＴＰＰ（ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ）である、[５]の複合体。
[７] [１]～[６]のいずれかの複合体を含む、ミトコンドリアＤＮＡ変異及び多型を認識する配列特異的ミトコンドリアＤＮＡ集積性化合物。
[８] 下式(Ｉ)で表される[１]の複合体：
【0010】
【化1】
【0011】
[Ｘは―ＣＨ２－、－ＮＨ―、―ＣＯ―、―ＣＨ２ＣＨ２Ｏ―又は―Ｏ―であり、
Ｙは―ＣＨ－又は―Ｎ―であり、
Ｒ１は－ＣＨ３、－ＯＨ、標識物質（蛍光、放射性、ビオチン、クリックケミストリー標識など）又はＴＰ（二重膜構造細胞内小器官局在性化合物であるミトコンドリア浸透部位）であり、
Ｒ２はそれぞれ独立した－ＣＨ３、－ＮＨ２、標識物質又はＴＰであり、
ｊは１から６であり、
ｋは１から２であり、
ｌは１から４であり、
ｍは０から１０であり、
ｎは０から６であり、
ｏは０から６である]。
[９] 下式（ＩＩ）で表される[８]に記載の複合体：
Ｙは―ＣＨ－又は―Ｎ―であり、
Ｒ１は－ＣＨ３、－ＯＨ、標識物質（蛍光、放射性、ビオチン、クリックケミストリー標識など）又はＴＰ（二重膜構造細胞内小器官局在性化合物であるミトコンドリア浸透部位）であり、
Ｒ２はそれぞれ独立した－ＣＨ３、－ＮＨ２、標識物質又はＴＰであり、
ｊは１から６であり、
ｋは１から２であり、
ｌは１から４であり、
ｍは０から１０であり、
ｎは０から６であり、
ｏは０から６である]。
[９] 下式（ＩＩ）で表される[８]に記載の複合体：
【0012】
【化2】
【0013】
[Ｘは―ＣＨ２－、－ＮＨ―、―ＣＯ―、―ＣＨ２ＣＨ２Ｏ―又は―Ｏ―であり、
Ｙは―ＣＨ－又は―Ｎ―であり、
Ｒ１は－ＣＨ３、－ＯＨ、標識物質又はＴＰであり、
Ｒ２はそれぞれ独立した－ＣＨ３、－ＮＨ２、標識物質又はＴＰである]。
[１０] 前記複合体が下式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）で表される構造を有する[８]又は[９]の複合体：
Ｙは―ＣＨ－又は―Ｎ―であり、
Ｒ１は－ＣＨ３、－ＯＨ、標識物質又はＴＰであり、
Ｒ２はそれぞれ独立した－ＣＨ３、－ＮＨ２、標識物質又はＴＰである]。
[１０] 前記複合体が下式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）で表される構造を有する[８]又は[９]の複合体：
【0014】
【化3】
【0015】
又は
【0016】
【化4】
【0017】
[Ｙは―ＣＨ－又は―Ｎ―であり、
Ｒ１は－ＣＨ３、－ＯＨ、標識物質又はＴＰであり、
Ｒ２はそれぞれ独立して－ＣＨ３、－ＮＨ２、標識物質又はＴＰである]。
[１１] 前記複合体が下式（ＸＩＶ）で表される構造を有する[８]又は[９]の複合体：
Ｒ１は－ＣＨ３、－ＯＨ、標識物質又はＴＰであり、
Ｒ２はそれぞれ独立して－ＣＨ３、－ＮＨ２、標識物質又はＴＰである]。
[１１] 前記複合体が下式（ＸＩＶ）で表される構造を有する[８]又は[９]の複合体：
【0018】
【化5】
【0019】
[１２] 前記複合体が下式（ＸＶ）～（ＸＸＩ）のいずれかで表される構造を有する[８]又は[９]の複合体：
【0020】
【化6】
【0021】
【化7】
【0022】
【化8】
【0023】
【化9】
【0024】
【化10】
【0025】
【化11】
【0026】
【化12】
[１３] 前記複合体が下式（ＸＸＩＩ）又は（ＸＸＩＩＩ）で表される構造を有する[８]又は[９]の複合体：
【0027】
【化13】
【0028】
【化14】
[１４] [８]～[１３]のいずれかの複合体を含むミトコンドリア疾患関連ミトコンドリアＤＮＡ配列に結合する組成物。
[１５] [１]～[６]及び[８]～[１３]のいずれかの複合体を含む医薬組成物。
[１６] 医薬組成物が抗がん剤である、[１５]の医薬組成物。
[１７] [１]～[６]及び[８]～[１３]のいずれかの複合体を含むキット。
[１８] [１]～[６]及び[８]～[１３]のいずれかの複合体を含む研究試薬キット。
[１９] [１]～[６]及び[８]～[１３]のいずれかの複合体を含む治療用キット。
[２０] [１]～[６]及び[８]～[１３]のいずれかの複合体を含む診断用キット。
[２１] [１５]又は[１６]の医薬組成物及び細胞除去薬を組合せて含むキット。
[２２] 細胞除去薬が、Canagliflozin、Canagliflozin、Ipragliflozin、Dapagliflozin、Luseogliflozin、Tofogliflozin、Sergliflozin etabonate、Remogliflozin etabonate、Ertugliflozin、sotagliflozin、Dasatinib、Quercetin、Navitoclax (ABT-263)、ABT-737、A1331852、A1155463、17-(Allylamino)-17-demethoxygeldanamycin、Fisetin、Panobinostat、Azithromycin、Roxithromycine、Piperlongumine、Hyperoside (Quercetin 3-galactoside)、2,3,5-Trichloro-6-(2-piperidin-1-yl-1,3-thiazol-5-yl)cyclohexa-2,5-diene-1,4-dione、2,5-Dichloro-3-(1-piperidinyl)-6-[2-(1-piperidinyl)-1,3-thiazol-5-yl]benzo-1,4-quinone、2,5-Dichloro-3-morpholin-4-yl-6-(2-piperidin-1-yl-1,3-thiazol-5-yl)cyclohexa-2,5-diene-1,4-dione、2,5-Dichloro-3-(phenylamino)-6-(2-piperidin-1-yl-1,3-thiazol-5-yl)cyclohexa-2,5-diene-1,4-dione、2,5-Dichloro-3-(2-morpholin-4-yl-1,3-thiazol-5-yl)-6-piperidin-1-ylcyclohexa-2,5-diene-1,4-dione、Obatoclax、Venetoclax、2,5-dichloro-3-(4-methyl-1-piperazinyl)-6-[2-(1-piperidinyl)-1,3-thiazol-5-yl]benzo-1,4-quinone、及びこれらのいずれかの誘導体からなる群から選択される、[２１]のキット。
[２３] 細胞除去薬と併用するための[１５]又は[１６]の医薬組成物。
[２４] 細胞除去薬が、Canagliflozin、Canagliflozin、Ipragliflozin、Dapagliflozin、Luseogliflozin、Tofogliflozin、Sergliflozin etabonate、Remogliflozin etabonate、Ertugliflozin、sotagliflozin、Dasatinib、Quercetin、Navitoclax (ABT-263)、ABT-737、A1331852、A1155463、17-(Allylamino)-17-demethoxygeldanamycin、Fisetin、Panobinostat、Azithromycin、Roxithromycine、Piperlongumine、Hyperoside (Quercetin 3-galactoside)、2,3,5-Trichloro-6-(2-piperidin-1-yl-1,3-thiazol-5-yl)cyclohexa-2,5-diene-1,4-dione、2,5-Dichloro-3-(1-piperidinyl)-6-[2-(1-piperidinyl)-1,3-thiazol-5-yl]benzo-1,4-quinone、2,5-Dichloro-3-morpholin-4-yl-6-(2-piperidin-1-yl-1,3-thiazol-5-yl)cyclohexa-2,5-diene-1,4-dione、2,5-Dichloro-3-(phenylamino)-6-(2-piperidin-1-yl-1,3-thiazol-5-yl)cyclohexa-2,5-diene-1,4-dione、2,5-Dichloro-3-(2-morpholin-4-yl-1,3-thiazol-5-yl)-6-piperidin-1-ylcyclohexa-2,5-diene-1,4-dione、Obatoclax、Venetoclax、2,5-dichloro-3-(4-methyl-1-piperazinyl)-6-[2-(1-piperidinyl)-1,3-thiazol-5-yl]benzo-1,4-quinone、Nutlin-3、MI-63、及びこれらのいずれかの誘導体からなる群から選択される、[２３]の医薬組成物。
[２５]（１）ミトコンドリアＤＮＡ配列に特異的に結合するようにＤＮＡ結合化合物を設計する工程、
（２）設計した前記ＤＮＡ結合化合物と脂溶性カチオンとを結合させる工程を含む、ミトコンドリアに貯留しミトコンドリアＤＮＡ配列に特異的に結合する複合体の製造方法。
[２６] ミトコンドリアＤＮＡ配列が、ミトコンドリア病病因変異ＤＮＡ配列、ミトコンドリア関連疾患変異ＤＮＡ配列、ミトコンドリア多型を含む病態細胞におけるＤＮＡコピー数が正常細胞に比べ多い配列、並びに遺伝子データベースに登録されるミトコンドリア関連分子からなる群から選択される少なくとも１つである、[２５]の製造方法。
[２７] ＤＮＡ結合化合物がＢｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（架橋化核酸）、Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）、ＰＮＡ、直鎖状ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）、直鎖状ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）修飾物、ＤＮＡ結合蛋白質、及びＤＮＡ結合蛋白質複合体からなる群から選択される、[２５]又は[２６]の製造方法。
[２８] 二重膜構造細胞内小器官局在性化合物が、二重膜構造細胞内小器官ＤＮＡの特定の塩基配列に対して結合する官能基を有する化合物である、[２５]～[２７]のいずれかの複合体の製造方法。
[２９] 二重膜構造細胞内小器官局在性化合物がＴＰＰ（ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ）である、[２８]の製造方法。
【0029】
また、本発明は以下のとおりである。
（１）ミトコンドリアなどの二重膜構造細胞内小器官ＤＮＡ配列に特異的に結合する直鎖状ＤＮＡ結合化合物と、脂溶性カチオンとの複合体。
（２）ミトコンドリアなどの二重膜構造細胞内小器官機能異常と関連するＤＮＡ配列に結合し、二重膜構造細胞内小器官に結合ＤＮＡ配列を持つ細胞に生物活性をもたらすための、（１）に記載の複合体。
（３）二重膜構造細胞内小器官ＤＮＡ配列がミトコンドリア機能低下、ＲＯＳ産生等のミトコンドリア病、脳神経系疾患、循環器系疾患、糖尿病、腎疾患、筋疾患、難聴等の耳鼻咽喉科疾患、網膜症等の眼科疾患、がん、並びに遺伝子データベースに登録されるミトコンドリア関連疾患群から選択される少なくとも１つ以上に認められる多型もしくは変異に対して結合する、（１）又は（２）に記載の複合体。
（４）直鎖状ＤＮＡ結合化合物がＢｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（架橋化核酸）、Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）、ＰＮＡ、ＤＮＡ副溝結合抗生物質、ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）、ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）修飾物、ＤＮＡ結合蛋白質、及びＤＮＡ結合蛋白質複合体からなる群から選択される（１）～（３）のいずれか１つに記載の複合体。
（５）脂溶性カチオンが、原形質膜電位差及びミトコンドリア二重膜の電位を利用してミトコンドリアマトリックス内に送達可能な官能基として有する化合物である、（１）～（４）のいずれか１つに記載の複合体。
（６）脂溶性カチオンがＴＰＰである、（５）に記載の複合体。
（７）（１）～（６）のいずれか１つに記載の複合体を含む、ミトコンドリア関連疾患特異的配列に結合可能な直鎖状ＤＮＡ結合化合物と脂溶性カチオンとの複合体。
（８）下式（Ｖ）又は（ＶＩ)で表される（１）及び（２）に記載の複合体。
（１）ミトコンドリアなどの二重膜構造細胞内小器官ＤＮＡ配列に特異的に結合する直鎖状ＤＮＡ結合化合物と、脂溶性カチオンとの複合体。
（２）ミトコンドリアなどの二重膜構造細胞内小器官機能異常と関連するＤＮＡ配列に結合し、二重膜構造細胞内小器官に結合ＤＮＡ配列を持つ細胞に生物活性をもたらすための、（１）に記載の複合体。
（３）二重膜構造細胞内小器官ＤＮＡ配列がミトコンドリア機能低下、ＲＯＳ産生等のミトコンドリア病、脳神経系疾患、循環器系疾患、糖尿病、腎疾患、筋疾患、難聴等の耳鼻咽喉科疾患、網膜症等の眼科疾患、がん、並びに遺伝子データベースに登録されるミトコンドリア関連疾患群から選択される少なくとも１つ以上に認められる多型もしくは変異に対して結合する、（１）又は（２）に記載の複合体。
（４）直鎖状ＤＮＡ結合化合物がＢｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（架橋化核酸）、Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）、ＰＮＡ、ＤＮＡ副溝結合抗生物質、ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）、ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）修飾物、ＤＮＡ結合蛋白質、及びＤＮＡ結合蛋白質複合体からなる群から選択される（１）～（３）のいずれか１つに記載の複合体。
（５）脂溶性カチオンが、原形質膜電位差及びミトコンドリア二重膜の電位を利用してミトコンドリアマトリックス内に送達可能な官能基として有する化合物である、（１）～（４）のいずれか１つに記載の複合体。
（６）脂溶性カチオンがＴＰＰである、（５）に記載の複合体。
（７）（１）～（６）のいずれか１つに記載の複合体を含む、ミトコンドリア関連疾患特異的配列に結合可能な直鎖状ＤＮＡ結合化合物と脂溶性カチオンとの複合体。
（８）下式（Ｖ）又は（ＶＩ)で表される（１）及び（２）に記載の複合体。
【0030】
【化15】
【0031】
又は
【0032】
【化16】
【0033】
（９）（８）に記載の複合体を含むミトコンドリア関連疾患特異的配列に結合可能な直鎖状ＤＮＡ結合化合物と脂溶性カチオンとの複合体。
（１０）（８）に記載の複合体を含むミトコンドリア呼吸鎖遺伝子、配列に結合可能な直鎖状ＤＮＡ結合化合物と脂溶性カチオンとの複合体。
（１１）（１）～（６）、（８）～（１０）のいずれか１つに記載の複合体を含む医薬組成物。
（１２）医薬組成物が抗がん剤である（１１）に記載の医薬組成物。
（１３）（１）～（６）、（８）～（１０）のいずれか１つに記載の複合体を含むキット。
（１４）（１）～（６）、（８）～（１０）のいずれか１つに記載の複合体を含む研究試薬キット。
（１５）（１）～（６）、（８）～（１０）のいずれか１つに記載の複合体を含む治療用キット。
（１６）（１）ミトコンドリアなどの二重膜構造細胞内小器官ＤＮＡ配列に特異的に結合する直鎖状ＤＮＡ結合化合物を設計する工程、
（２）設計したＤＮＡ結合化合物と脂溶性カチオンとを結合させる工程を含む、ミトコンドリアなどの二重膜構造細胞内小器官ＤＮＡ配列に特異的に結合する複合体の製造方法。
（１７）遺伝子配列がミトコンドリア関連疾患病因変異配列である、（１６）に記載の製造方法。
（１８）ＤＮＡ結合化合物がＢｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（架橋化核酸）、Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）、ＰＮＡ、ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）、ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）修飾物又はＤＮＡ結合蛋白質、及びＤＮＡ結合蛋白質複合体からなる群から選択される、（１６）又は（１７）に記載の製造方法。
（１９）脂溶性カチオンが、原形質膜電位差及びミトコンドリア二重膜の電位を利用してミトコンドリアマトリックスなどの二重膜構造細胞内小器官内に送達可能な官能基として有する化合物である、（１６）～（１８）のいずれか１つに記載の製造方法。
（２０）脂溶性カチオンがＴＰＰである、（１９）に記載の製造方法。
（１０）（８）に記載の複合体を含むミトコンドリア呼吸鎖遺伝子、配列に結合可能な直鎖状ＤＮＡ結合化合物と脂溶性カチオンとの複合体。
（１１）（１）～（６）、（８）～（１０）のいずれか１つに記載の複合体を含む医薬組成物。
（１２）医薬組成物が抗がん剤である（１１）に記載の医薬組成物。
（１３）（１）～（６）、（８）～（１０）のいずれか１つに記載の複合体を含むキット。
（１４）（１）～（６）、（８）～（１０）のいずれか１つに記載の複合体を含む研究試薬キット。
（１５）（１）～（６）、（８）～（１０）のいずれか１つに記載の複合体を含む治療用キット。
（１６）（１）ミトコンドリアなどの二重膜構造細胞内小器官ＤＮＡ配列に特異的に結合する直鎖状ＤＮＡ結合化合物を設計する工程、
（２）設計したＤＮＡ結合化合物と脂溶性カチオンとを結合させる工程を含む、ミトコンドリアなどの二重膜構造細胞内小器官ＤＮＡ配列に特異的に結合する複合体の製造方法。
（１７）遺伝子配列がミトコンドリア関連疾患病因変異配列である、（１６）に記載の製造方法。
（１８）ＤＮＡ結合化合物がＢｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（架橋化核酸）、Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）、ＰＮＡ、ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）、ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）修飾物又はＤＮＡ結合蛋白質、及びＤＮＡ結合蛋白質複合体からなる群から選択される、（１６）又は（１７）に記載の製造方法。
（１９）脂溶性カチオンが、原形質膜電位差及びミトコンドリア二重膜の電位を利用してミトコンドリアマトリックスなどの二重膜構造細胞内小器官内に送達可能な官能基として有する化合物である、（１６）～（１８）のいずれか１つに記載の製造方法。
（２０）脂溶性カチオンがＴＰＰである、（１９）に記載の製造方法。
【0034】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2019-053528号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【0035】
本発明により、ミトコンドリアなどの二重膜構造細胞内小器官ＤＮＡ配列に結合し、ミトコンドリアなどの二重膜構造細胞内小器官機能を修飾できる複合体が提供される。本発明の好ましい態様によれば、本発明の複合体は、医薬組成物又は抗ミトコンドリア病剤、抗生活習慣病剤、抗がん剤、抗老化剤、抗生物質等として用いることができる。
【0036】
本発明の複合体により、ミトコンドリアＤＮＡ配列を認識することで、ミトコンドリアＤＮＡの複製、転写、さらにミトコンドリアの自食（マイトファジー）、ミトコンドリア自食に対する自動制御によるミトコンドリア活性化・ミトコンドリアＤＮＡコピー数の増減、及び変異ミトコンドリアＤＮＡがホモプラスミーもしくはそれに近い状態においては細胞死もしくは細胞老化の誘導が誘発されると考えられる。これらの現象により本発明の複合体は、ミトコンドリアなどの二重膜構造細胞内小器官を有する動植物を含む真核生物、生体細胞及び実験系においてミトコンドリア等の機能を調節することが出来る様々な様態を創生することが容易に想起出来る。
【0037】
つまり、本発明は、ミトコンドリア等のゲノム配列に結合する低分子化合物をミトコンドリア等に送達する技術及びそのデザイン・合成法を提供するものであり、この技術を応用することで病的もしくは不良ミトコンドリアが持つＤＮＡ変異配列を特異的に認識できるミトコンドリア関連疾患治療薬をより簡便に次々にデザイン・合成することを可能とするものである。既存のミトコンドリア病に対する治療薬もしくは機能性表示食品、特定保健用食品が対処的な予防・治療に留まっていることに対して本発明による複合体は根本的な予防・治療効果を示す化合物を提供できることを容易に予想できる。さらに細胞治療や正常ミトコンドリア送達技術に応用し、変異ミトコンドリアＤＮＡを持つ不良ミトコンドリアや不良細胞の診断及び除去によるクオリティーコントロール等にも応用が可能となる幅広い用途が考えられる。
【0038】
本発明の複合体は、変異ミトコンドリアＤＮＡコピー数が多い細胞においては、細胞死を誘導する。一方、変異ミトコンドリアＤＮＡに対し正常ミトコンドリアＤＮＡの割合が一定数以上含まれる場合、変異ミトコンドリアＤＮＡのコピー数を徐々に減少させること及び変異ミトコンドリアＤＮＡの減少と同時に総ミトコンドリア数の増加・活性化を促すことで細胞や生体への影響を最小限にしたうえで変異ミトコンドリアＤＮＡを減少させる理想的な治療薬として、新たな画期的治療薬の開発を可能とするものである。今後、本発明の複合体は、臨床試験開始に向けた開発研究（物性試験、安全性試験、薬物動態、ＧＭＰでの大量合成）の推進が期待されている。また、本発明の方法を応用すれば、同様若しくは相加的・相乗的な効果を奏するさらなる画期的な治療薬の開発が可能となると想起される。
【0039】
本発明の複合体は、変異ミトコンドリアＤＮＡコピー数が多い細胞においては、細胞死を誘導するが、細胞死に抵抗性の細胞が存在し、老化様の変化が確認された。近年抗老化研究においてｓｅｎｏｌｙｔｉｃ ｄｒｕｇｓ老化細胞除去薬の研究が進み、老化細胞の細胞死誘導に有効なＢＣＬ２、ＢＣＬ―ＸＬ、ＢＣＬ－Ｗ、ＭＤＭ２などの阻害剤の臨床応用が試みられており、本発明の複合体は、細胞老化様細胞を誘導でき、老化細胞除去薬による治療との併用により、老化細胞除去薬の効果を増強する合成致死効果を奏することで、さらなる画期的な上乗せ治療法等の開発を可能とすると想起される。
【0040】
老化細胞除去薬としては、後述する。
【0041】
本発明の複合体は、ミトコンドリアゲノムが１６，５６９塩基対と小さいため複合体のＤＮＡ副溝認識部位の短小化が可能であり、分子量の小さな単鎖型化合物でも効果が確認され、皮膚透過性が確認された。本発明の方法と経皮吸収型製剤化を組み合わせることで投与経路を拡張できるとともに、局所治療効果の増強による局在性病変や老化の局所治療薬、予防薬といった画期的な治療法の開発が可能となると想起される。
【図面の簡単な説明】
【0042】
【図1-1】ＭＥＬＡＳのミトコンドリアＤＮＡ Ａ３２４３Ｇ変異を標的にしたＦＩＴＣ標識ヘアピン型ポリアミド（ＣＣＣ００１８－ＦＩＴＣ）の化学構造を示す図である。
【図1-2】ＭＥＬＡＳのミトコンドリアＤＮＡ Ａ３２４３Ｇ変異を標的にしたＦＩＴＣ標識ヘアピン型ポリアミド（ＣＣＣ００１８－ＦＩＴＣ）の経時的細胞内局在を示す図である。
【図2】ピリビディウムインドールＴＰＰ複合体によるミトコンドリア局在を示す図である。図２ＡはピリビディウムインドールＴＰＰ複合体のミトコンドリアとの共局在を示し、図２Ｂはピリビディウムインドールのミトコンドリア非共局在を示す。
【図3】ＭＥＬＡＳのミトコンドリアＤＮＡ Ａ３２４３Ｇ変異を標的にしたヘアピン型ポリアミドとＴＰＰ複合体（ＣＣＣ０１９－ＴＰＰ）合成スキームとその構造及びＨＰＬＣ,質量解析結果を示す図である。
【図4】ＣＣＣ０１９－ＴＰＰのミトコンドリアとの共局在を示す図である。
【図5】ＨｅＬａ（３２４３Ｇ Ｌｏｗ）サイブリッドへのＣＣＣ０１９－ＴＰＰ投与実験における総ミトコンドリアＤＮＡコピー数が増加する結果を示す図である。図５Ａは４８日後の結果を示し、図５Ｂは６３日後の結果を示す。
【図6】ＨｅＬａ（３２４３Ｇ Ｌｏｗ）細胞へのＣＣＣ０１９－ＴＰＰ投与実験における正常ミトコンドリアＤＮＡコピー数が変異ミトコンドリアコピー数に対し比率が増加する結果を示す図である。図６Ａは４８日後の結果を示し、図６Ｂは６３日後の結果を示す。
【図7】ＨｅＬａ（３２４３Ｇ Ｈｉｇｈ）細胞及びＨｅＥＢ１細胞へのＣＣＣ０１８－ＴＰＰ投与実験におけるミトコンドリア自食を示すマイトファジー（ＬＣ３陽性）が誘導される結果を示す図である。
【図8】ＭＥＬＡＳのミトコンドリアＤＮＡ Ａ３２４３Ｇ変異を標的にした直鎖型ポリアミドとＴＰＰ複合体（ＣＣＣ０２０－ＴＰＰ）合成スキームとその構造及びＨＰＬＣ，質量解析結果を示す図である。
【図9】ＣＣＣ０２０－ＴＰＰのミトコンドリアとの共局在を示す図である。
【図10】ＨｅＬａｍｔＨｅＬａ細胞（図１０Ａ）、ＨｅＬａ（３２４３Ｇ Ｌｏｗ）細胞（図１０Ｂ）及びＨｅＬａ（３２４３Ｇ Ｈｉｇｈ）細胞（図１０Ｃ）へのＣＣＣ０２０－ＴＰＰ投与による細胞増殖の抑制をＷＳＴアッセイによって検討した結果にＩＣ５０値を付記して示した図である。
【図11-1】ＨｅＬａ（３２４３Ｇ Ｈｉｇｈ）細胞へのＣＣＣ０２０－ＴＰＰ投与による細胞死（アポトーシス）の誘導を核の凝縮、断片化及びＣｌｅａｖｅｄ Ｃａｓｐａｓｅ ３のアポトーシスを示す細胞の割合を棒グラフに示した図である。
【図11-2】ＨｅＬａ（３２４３Ｇ Ｈｉｇｈ）細胞へのＣＣＣ０２０－ＴＰＰ投与による細胞死（アポトーシス）の誘導を核の凝縮、断片化及びＣｌｅａｖｅｄ Ｃａｓｐａｓｅ ３の染色像で示した図である。
【図12】ＨｅＬａｍｔＨｅＬａ細胞及びＨｅＬａ（３２４３Ｇ Ｈｉｇｈ）細胞へのＣＣＣ０２０－ＴＰＰ投与によってＨｅＬａ（３２４３Ｇ Ｈｉｇｈ）細胞においてｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅのｉｎｈｉｂｉｔｏｒであるｐ２１の発現上昇（図１２Ａ）、プロアポトーシス関連遺伝子であるＢａｘの発現上昇（図１２Ｂ）、アンチアポトーシス関連遺伝子であるＭｃｌ１の発現減少（図１２Ｃ）が有意に確認されたことを示した図である。
【図13】Ａ５４９細胞に認められる非同義置換Ａ１４５８２Ｇ多型を標的にした直鎖型ポリアミドとＴＰＰ複合体（ＣＣＣ０２１－ＴＰＰ）の構造及びＨＰＬＣ，質量解析結果を示す図である。
【図15】Ａ５４９細胞（図１５Ａ）及びＰＣ１４細胞（図１５Ｂ）へのＣＣＣ０２１－ＴＰＰもしくはＤＭＳＯの長期投与による細胞増殖を検討した結果を示した図である。Ａ５４９細胞においてＣＣＣ０２１－ＴＰＰ投与は有意に増殖を抑制した。
【図16】ＣＣＣ０２１－ＴＰＰ投与２４時間後の細胞内局在を抗ＴＰＰ抗体およびマイトトラッカー染色によるミトコンドリア局在の検討の結果を示す図である。Ａは抗ＴＰＰ抗体染色の結果を、Ｂはミトトラッカー染色の結果を示す。
【図17】ＣＣＣ０２１－ＴＰＰがＡ５４９細胞の増殖を抑制したが、細胞死を誘導せず老化細胞様の形態変化を誘導したことを示すＭＴＴアッセイの結果を示す図である。ＡはＡ５４９の結果を、ＢはＰＣ１４の結果を示す。ＣはＡ５４９及びＰＣ１４のＩＣ５０を示す。
【図18】ＣＣＣ０２１－ＴＰＰ投与５日後のＰＣ１４細胞（Ａ)及びＡ５４９細胞（Ｂ)の細胞形態を示す図である。ＣはＢの枠内の拡大図である。
【図19】ＣＣＣ０２１－ＴＰＰ投与５日後のＰＣ１４細胞及びＡ５４９細胞のトリパンブルーアッセイの結果を示す図である。
【図20】Ａ５４９細胞（Ａ）及びＰＣ１４細胞（Ｂ）をＣＣＣ０２１－ＴＰＰ処理した場合のＳＡ－β－Ｇａｌ（細胞老化随伴βガラクトシダーゼ）発現の誘導をＳＡ－β－Ｇａｌ染色により示す図である。
【図21】ＳＡ－β－Ｇａｌ染色により染色された細胞数をカウントし定量化した結果を示す図である。
【図22】Ａ５４９細胞及びＰＣ１４細胞をＣＣＣ０２１－ＴＰＰ処理した場合の細胞老化随伴分泌現象を示す場合である。ＡはＩＬ－１Ａの分泌を、ＢはＩＬ－１Ｂの分泌を、ＣはＩＬ－６の分泌を、ＤはＩＬ－８の分泌を示す。
【図23】Ａ５４９細胞（Ａ)及びＰＣ１４細胞（Ｂ）をＣＣＣ０２１－ＴＰＰ処理した場合のマイトファジーの誘導を示す図である。
【図24】ＣＣＣ０２１－ＴＰＰ処理により、Ａ５４９細胞のミトコンドリアで特異的なマイトファジーが起きていることを示す図である。
【図25】ＣＣＣ０２１－ＴＰＰ投与24時間後のＡ５４９細胞での活性酸素(ＲＯＳ)産生の著名な増強を示す図である。
【図26】ＣＣＣ０２１－ＴＰＰ処理したＡ５４９細胞及びＰＣ１４細胞におけるＢＣＬ２Ｌ１（Ａ）、ＢＡＸ（Ｂ）、ＢＣＬ２（Ｃ）及びＢＩＲＣ５（Ｄ）の発現レベルを示す図である。
【図27】ＣＣＣ０２１－ＴＰＰ単独処理、ＡＢＴ－２６３単独処理及びこれらの併用処理した場合の２日目及び４日目の細胞形態を示す図である。
【図28】皮膚透過性確認実験の方法の概要（Ａ）及びマウスへの投与部位（Ｂ）を示す図である。
【図29】単鎖型ＰＩＰ－ＴＰＰ（ＣＣＣ１４９－ＴＰＰ）の構造式を示す図である。
【図30】ＣＣＣ１４９－ＴＰＰのＨＰＬＣ（Ａ）及び質量解析（Ｂ）の結果を示す図である。
【図31】ＰＩＰ－ＴＰＰの皮膚透過性を示す図である。
【図32】Ｄｐ－Ｐｙ－Ｐｙ－ＴＰＰの合成法を示す図である。
【図33-1】ライブラリー化合物、２環状構造化合物から８環状化合物を示す図である（その１）。
【図33-2】ライブラリー化合物、２環状構造化合物から８環状化合物を示す図である（その２）。
【図33-3】ライブラリー化合物、２環状構造化合物から８環状化合物を示す図である（その３）。
【図33-4】ライブラリー化合物、２環状構造化合物から８環状化合物を示す図である（その４）。
【図33-5】ライブラリー化合物、２環状構造化合物から８環状化合物を示す図である（その５）。
【図33-6】ライブラリー化合物、２環状構造化合物から８環状化合物を示す図である（その６） 。
【図34】合成した２環状構造化合物ＣＣＣ１０２-ＴＰＰの構造を示す図である。
【図35】ＣＣＣ１０２-ＴＰＰの高速液体クロマトグラフィー（Ａ）および質量分析（Ｂ）の結果を示す図である。
【図36】合成した３環状構造化合物ＣＣＣ１０６-ＴＰＰの構造を示す図である。
【図37】ＣＣＣ１０６-ＴＰＰの高速液体クロマトグラフィー（Ａ）および質量分析（Ｂ）の結果を示す図である。
【図38】合成した４環状構造化合物ＣＣＣ１１４-ＴＰＰの構造を示す図である。
【図39】ＣＣＣ１１４-ＴＰＰの高速液体クロマトグラフィー（Ａ）および質量分析（Ｂ）の結果を示す図である。
【図40】合成した５環状構造化合物ＣＣＣ１７５-ＴＰＰの構造を示す図である。
【図41】ＣＣＣ１７５-ＴＰＰの高速液体クロマトグラフィー（Ａ）および質量分析（Ｂ）の結果を示す図である。
【図42】合成した６環状構造化合物ＣＣＣ２０６-ＴＰＰの構造を示す図である。
【図43】ＣＣＣ２０６-ＴＰＰの高速液体クロマトグラフィー（Ａ）および質量分析（Ｂ）の結果を示す図である。
【図44】合成した７環状構造化合物ＣＣＣ１２８３-ＴＰＰの構造を示す図である。
【図45】ＣＣＣ１２８３-ＴＰＰの高速液体クロマトグラフィー（Ａ）および質量分析（Ｂ）の結果を示す図である。
【図46】合成した８環状構造化合物ＣＣＣ１３９４-ＴＰＰの構造を示す図である。
【図47】ＣＣＣ１３９４-ＴＰＰの高速液体クロマトグラフィー（Ａ）および質量分析（Ｂ）の結果を示す図である。
【図48】ＣＣＣ１２８３－ＴＰＰ（直鎖型ＰＩＰ）のＨｅＬａ細胞（Ａ）およびＣ３３Ａ（Ｂ）に対する増殖抑制を示す図である。
【図49】１０環状構造化合物ＣＣＣ５３１－ＴＰＰの構造を示す図である。
【図50】ＣＣＣｈ５３１－ＴＰＰの高速液体クロマトグラフィー分析（Ａ）および質量分析（Ｂ）の結果を示す図である。
【図51】ＣＣＣｈ５３１－ＴＰＰのＨｅＬａ細胞（Ａ）およびＣ３３Ａ（Ｂ）に対する増殖抑制を示す図である。
【図52】１０環状構造化合物ＣＣＣｈ５６０－ＴＰＰの構造を示す図である。
【図53】ＣＣＣｈ５６０－ＴＰＰの高速液体クロマトグラフィー分析（Ａ）および質量分析（Ｂ）の結果を示す図である。
【図54】ＣＣＣｈ５６０－ＴＰＰのＣ３３Ａ（Ａ）、ＨｅＬａ細胞（Ｂ）、ＨＤＦ（Ｃ）、Ｓｉｈａ（Ｄ）、Ｃａｓｋｉ（Ｅ）およびＭＥ１８０（Ｆ）に対する増殖抑制を示す図である。
【図55-1】代表的な老化細胞除去薬を示す図である（その１）。
【図55-2】代表的な老化細胞除去薬を示す図である（その２）。
【図55-3】代表的な老化細胞除去薬を示す図である（その３）。
【図55-4】代表的な老化細胞除去薬を示す図である（その４）。
【図55-5】代表的な老化細胞除去薬を示す図である（その５）。
【図55-6】代表的な老化細胞除去薬を示す図である（その６）。
【図55-7】代表的な老化細胞除去薬を示す図である（その７）。
【図55-8】代表的な老化細胞除去薬を示す図である（その８）。
【図55-9】代表的な老化細胞除去薬を示す図である（その９）。
【図55-10】代表的な老化細胞除去薬を示す図である（その１０）。
【図55-11】代表的な老化細胞除去薬を示す図である（その１１）。
【図56】ＢＣＬ－ＸＬ阻害剤であるＡ１１５５４６３とＣＣＣ０２１－ＴＰＰ併用処理した場合の細胞の形態を示す図である。
【図57】ＦＩＴＣ－ＣＣＣ１０５－ＴＰＰの構造式を示す図である。
【図58】ＦＩＴＣ－ＣＣＣ１０５－ＴＰＰの高速液体クロマトグラフィー分析（Ａ）および質量分析（Ｂ）の結果を示す図である。
【図59】植物生細胞透過実験の結果を示す図であり、Ａは主根でのＦＩＴＣ蛍光を示し、Ｂは発芽後４日の根の蛍光像を示す。
【図60】Ｈ２Ｂ(ヒストンＨ２Ｂ)―ＧＦＰ発現シロイヌナズナの葉をＦＩＴＣ－ＣＣＣ１０５－ＴＰＰ処理した場合の、葉でのＨ２ＢによるＧＦＰ蛍光（Ａ）及びＣＣＣ１０５－ＴＰＰによるＦＩＴＣの蛍光（Ｂ）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0043】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0044】
本発明は、ミトコンドリア等の二重膜構造細胞内小器官のＤＮＡの特異的配列に結合するＤＮＡ結合化合物と二重膜構造細胞内小器官局在性の化合物との複合体ならびにそのデザインと合成法を提供する。同複合体によりミトコンドリア等の二重膜構造細胞内小器官のＤＮＡに作用することにより、二重膜構造細胞内小器官の機能を変更などの特異的配列をもつミトコンドリア等の二重膜構造細胞内小器官のコピー数の減少やミトコンドリア等の二重膜構造細胞内小器官の機能不全による細胞死の誘導などによりミトコンドリア等の二重膜構造細胞内小器官の関連病態の予防、治療、診断法を可能にする。
【0045】
二重膜構造細胞内小器官は、ミトコンドリアの他に葉緑体等が含まれる。
【0046】
二重膜構造細胞内小器官のＤＮＡの特異的配列として、ミトコンドリアＤＮＡ配列、ミトコンドリア病病因変異ＤＮＡ配列、ミトコンドリア関連疾患変異ＤＮＡ配列、ミトコンドリアＤＮＡ多型を含む病変細胞におけるＤＮＡコピー数が正常細胞に比べ多い配列、並びに遺伝子データベースに登録される二重膜構造細胞内小器官ＤＮＡ配列等が挙げられる。
【0047】
ミトコンドリアＤＮＡは母親由来で1細胞あたり数百から数千コピー存在し、核膜のような防御機構が存在しない細胞質内小器官に局在するため内的要因として活性酸素種（ＲＯＳ）や外的要因として発がん物質や放射線などにより変異が発生する頻度が高い。さらに、数千コピーあるミトコンドリアＤＮＡはランダムに複製され、確率法則に従って娘細胞に不等分配されるため変異型ミトコンドリアＤＮＡが生じると、正常型ミトコンドリアＤＮＡと混在する、ヘテロプラスミーの状態になるという特性がある。ゆえに、親細胞が正常型ミトコンドリアＤＮＡと変異型ミトコンドリアＤＮＡの両方を持っていても、細胞分裂した娘細胞の中にはどちらか一方の型のみ存在するというホモプラスミーが生じることもある。このようにして不良ミトコンドリアのコピー数が増加した体細胞は、個体の様々な病態を発症させる要因となる。
【0048】
ミトコンドリア病は主に特徴的な中枢神経症状を基準に診断され、骨格筋、心臓をはじめとして内分泌腺に到るまで、体の諸臓器に異常をきたす(http://www.nanbyou.or.jp/entry/335)。代表的なミトコンドリア病であるＭＥＬＡＳ（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｐａｔｈｙ, ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄｏｓｉｓ, ａｎｄ ｓｔｒｏｋｅ―ｌｉｋｅ ｅｐｉｓｏｄｅｓ）(Nature, 348(6302):651-3, 1990)では、ミトコンドリアＤＮＡ (ｍｔＤＮＡ)にコードされているロイシンのｔＲＮＡ（ＭＴ―ＴＬ１）遺伝子の中の、３２４３番目の塩基がアデニン残基からグアニン残基へ点変異しているＡ３２４３Ｇ変異が、最も多い変異型として特定されている。ミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・ 脳卒中様症候群と呼ばれるこの疾患はミトコンドリア病の中で最も患者数が多い。また、Ａ３２４３Ｇ変異はミトコンドリア糖尿病を引き起こす変異型としても知られ、特に日本人の糖尿病患者約７００万人のうち、約１％にＡ３２４３Ｇ変異が認められるという報告がある(Nat genet. 1(5):368-71, 1992, N Engl J Med. 330(14):962-8, 1994)。Ａ３２４３Ｇ変異はｔＲＮＡのロイシンに変異を起こし、タウリン修飾の欠損を起こす。そして、呼吸鎖複合体Iの機能が低下し、ミトコンドリア機能不全に陥る(Am J Hum Genet. 49(3):590-9, 1991)。ＭＥＬＡＳにおいては、上記よりタウリンが医薬品として承認されタウリンの大量摂取により症状の改善がみられるが、ミトコンドリア病では臓器間で正常型ｍｔＤＮＡと変異型ｍｔＤＮＡの比率が異なり、その比率の差が疾患の重症度や症状の決定要因であることが知られるため(Proc Natl Acad Sci USA, 88(23):10614-8, 1991)、根本的な治療法としては変異型ｍｔＤＮＡの割合を減少させる治療法の開発が期待されている。
【0049】
また、がんとミトコンドリア異常の関連性は、今なおその論争は続いているが、ルイス肺がん由来培養細胞株におけるｍｔＤＮＡの変異ががん転移と相関があることが報告され (Science, 320(5876):661-4, 2008)、さらに、ｍｔＤＮＡ異常をもつマウスにおいてＲＯＳ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒの投与で糖尿病や腫瘍発生が抑制されることが報告された(Proc Natl Acad Sci USA, 109(26):10528-33, 2012)。高転移性のＡ１１細胞由来のＧ１３９９７Ａ変異をもつｍｔＤＮＡが呼吸鎖複合体Iの活性を低下させ、ＲＯＳの産生増加及びＡＴＰ産生減少、また、核に存在する転移関連遺伝子であるＭｃｌ－１,Ｈｉｆ－１αを活性化し、それによりがん転移が増加するとするものと考えられる (Science, 320(5876):661-4, 2008)。また、大腸がん患者及び肺がん患者におけるＮＤ遺伝子の病因性変異ががん転移と相関があることが報告された(Sci Rep. 7(1):15535, 2017)。転移性原発巣と非転移性原発巣との間でミトコンドリア呼吸鎖複合体機能低下を誘引する疑いのある変異の数を比較した結果、転移を有する原発巣は非転移性原発巣よりもｍｔＤＮＡ変異率が有意に高く、ヘテロプラスミーが多くみられることが明らかとなった(Sci Rep. 7(1):15535, 2017, Oncogene, 36(31):4393-4404, 2017)。また、がんにおいてはホモプラスミーも多くの例で観察されることが特徴としてみられた。このことから、ｍｔＤＮＡの変異はミトコンドリア病だけでなくがんにおいてもその悪性度を左右すると考えられるとともに変異ミトコンドリアＤＮＡを標的にすることでがん治療が可能であることが示唆されている。
【0050】
二重膜構造細胞内小器官のＤＮＡの特異的配列に結合するＤＮＡ結合化合物は、ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ、ＰＩポリアミドともいう）を含む。二重膜構造細胞内小器官のＤＮＡの特異的配列に結合するＤＮＡ結合化合物をＤＮＡ副溝結合化合物ともいう。
【0051】
本発明で用いる二重膜構造細胞内小器官のＤＮＡの特異的配列に結合するＤＮＡ結合化合物は直鎖状ＤＮＡ結合化合物である。
【0052】
本発明で用いる二重膜構造細胞内小器官のＤＮＡの特異的配列に結合するＤＮＡ結合化合物はｍｔＤＮＡ配列認識直鎖状ＰＩＰ化合物ともいう。
【0053】
ＰＩＰは、細菌が産生する天然化合物ディスタマイシン、デュオカルマイシンといった天然抗生物質構造をヒントに合成されたＮ－メチルピロール（Ｐｙ）とＮ－メチルイミダゾール（Ｉｍ）からなるオリゴマーであり、水素結合を介してＤＮＡの副溝に結合する。塩基配列認識はＰｙとＩｍの組み合わせに依存し、Ｐｙ/ＰｙがＡ/Ｔ又はＴ/Ａ、Ｐｙ/ＩｍがＣ/Ｇ、Ｉｍ/ＰｙがＧ/Ｃをそれぞれ認識するため、天然化合物に多い直鎖状構造ではなくよりＤＮＡ結合の強いヘアピン構造により２量体を形成させ、任意の二本鎖ＤＮＡを塩基配列特異的に認識するように合成され用いられている (Bioorg Med Chem. 9(9):2215-35, 2001)。また、ＰＩＰは、塩基配列特異的にＤＮＡと結合することで、遺伝子の転写を阻害し遺伝子発現を抑制することが報告されている。直鎖状ポリアミドであるディスタマイシンがミトコンドリア、ゴルジ、ＥＲに局在することも報告されており（Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 11 (2001) 769-772）、ヘアピン型ＰＩＰによるミトコンドリアゲノムへの介入が可能であることも公知である。しかし変異ミトコンドリアＤＮＡコピー数を減らし、正常ミトコンドリアＤＮＡを増やす効率的方法は開発されていない。さらにその過程でミトコンドリア機能を維持できる方法であり、しかも合成が容易で薬剤開発により適した化合物は考案されていない。
【0054】
この現状の問題点に基づきミトコンドリアに低分子量のＤＮＡ副溝結合化合物を送達、貯留させる複合体を合成することで問題が解決すると考え、鋭意研究を進めた。このことによって特異的なｍｔＤＮＡ配列を有するミトコンドリアを排除し、正常ミトコンドリアを増加させる化合物、もしくは特異的なｍｔＤＮＡ配列コピーを多く持つ細胞に細胞死を誘導する複合体化合物を創出できる可能性があること、さらに複合体の合成が容易であり、安価な製造と臓器、細胞、ミトコンドリアへの送達がより効率的に行える可能性があることが考えられる。この新規の考えに基づき本発明の化合物のデザイン及び合成を試み、合成された複数の複合化合物において変異ｍｔＤＮＡを認識することによると考えられる変異ｍｔＤＮＡコピー数の減少、総ｍｔＤＮＡコピー数の上昇及び細胞死の誘導が確認されたことによりミトコンドリア関連病態に対する根本的な治療法を得ることが出来る薬剤となりうることを見出した。
【0055】
本発明の実施例の結果から、配列特異的なｍｔＤＮＡ配列認識直鎖状ポリアミド化合物と脂溶性カチオンなどのミトコンドリア送達物質との複合化合物を合成する方法を用いれば、当該問題が解決でき、特異的ＤＮＡ配列を持つミトコンドリアにおいてマイトファジーを誘導し、病的細胞の細胞死を誘導する、ミトコンドリア関連病態を根本的に治療できる可能性のある治療剤を合成できると考えられる。
【0056】
本発明の複合体の構成要素であるｍｔＤＮＡ配列認識直鎖状ポリアミドは、ｍｔＤＮＡの多型及び体細胞変異配列を含む配列を認識するように設計されたポリアミドである。ｍｔＤＮＡ配列及びその多型及び変異配列はＭＩＴＯＭＡＰ （Ａ ｈｕｍａｎ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｅ ｄａｔａｂａｓｅ）、ＧｉｉＢ―ＪＳＴ ｍｔＳＮＰ（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、ＭｉｔｏＤａｔ（Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒion）、ＣＯＳＭＩＣ（ｔｈｅ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ Ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ）、ＧＯＢＡＳＥ（Ａ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ａｎｄ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）などのデータベースより得られるがこのデータベースに限られるものではない。ｍｔＤＮＡ配列を認識するとは、ｍｔＤＮＡの塩基配列認識ポリアミドが結合等(例えば水素結合又は架橋形成（クロスリンキング）による結合等）することを意味する。ｍｔＤＮＡ配列認識化合物としては、上記のピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）の他、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＰＮＡ）、Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（架橋化核酸）、Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）、ジンクフィンガー等のＤＮＡ結合蛋白質やそのキメラ蛋白質、ガイドＲＮＡ蛋白質複合体等のＤＮＡ結合化合物を挙げることができる。さらには、ＤＮＡに対する結合能力を維持又は向上するように修飾した修飾物も含まれる。ＰＩＰ修飾物としては、例えば、ＰＩＰのNメチルピロールやN-メチルイミダゾールのメチル基からアルキル鎖を伸長しアミンを有した修飾物又はアミノ基を側鎖に持つリシンやアルギニン、カルボキシル基を側鎖に持つグルタミン酸、また前記修飾物をＦＩＴＣやビオチン等の分子で修飾した修飾物、ＰＩＰのＮ末端をＦＩＴＣやビオチン等の分子で修飾した修飾物、Ｃ末端がイソフタル酸等の分子で修飾した修飾物等が挙げられる。本発明の好ましい様態においては、二重膜構造細胞内小器官ＤＮＡ、植物においては葉緑体ＤＮＡの配列を認識する構成要素を含む。
【0057】
ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）は、Ｎ－メチルピロール単位（Ｐｙ）とＮ－メチルイミダゾール単位（Ｉｍ）と直鎖アミノ酸誘導体部分とを含むポリアミドであり、ＰｙとＩｍと直鎖アミノ酸とは互いにアミド結合（－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－）で連結される（Trauger et al,Nature,382,559-61(1996)；White et al,Chem.Biol.,4,569-78(1997)；及びDervan,Bioorg.Med.Chem.,9,2215-35(2001)）。ＰＩＰは、２量体を形成し、ＰｙとＩｍとを含む２本の鎖が並列に並ぶことで２本の鎖の間のＰｙとＩｍの対が特定の組み合わせ（Ｐｙ／Ｉｍ対、Ｉｍ／Ｐｙ対、Ｐｙ／Ｐｙ対、又はＩｍ／Ｉｍ対）のときに、ＤＮＡ中の特定の塩基対に高い親和性で結合することができる。例えば、Ｐｙ／Ｉｍ対はＣ－Ｇ塩基対に結合することができ、Ｉｍ／Ｐｙ対はＧ－Ｃ塩基対に結合することができる。また、Ｐｙ／Ｐｙ対はＡ－Ｔ塩基対及びＴ－Ａ塩基対の両方に結合することができる。この2量体形成をより安定にするために核内ゲノムなどを標的とする場合などは、直鎖アミノ酸誘導体を介して全体が折りたたまれたコンフォメーションのＰＩＰを合成することでより強い結合が得られ、汎用されている（White et al,Chem.Biol.,4,569-78(1997)；Dervan:Bioorg.Med.Chem.,9,2215-35(2001)）。しかしこのヘアピン上の折りたたまれたコンフォメーションの形成には分子量のより大きな複合体を形成する必要があり、ゲノムサイズが小さい二重膜構造細胞内小器官のＤＮＡに対しては直鎖状のＤＮＡ認識化合物で配列認識が十分可能と考えられた。また、ＰＩＰには、他に３－ヒドロキシピロール（Ｈｐ）、又はβアラニンが含まれていてもよい。Ｈｐについては、Ｈｐ／Ｐｙ対はＴ－Ａ塩基対に結合することができる（White at al,Nature,391,468-71(1998)）。またＰＩＰのＮ末端はアセチル基だけでなくＦＩＴＣやビオチン等の分子が修飾されていてもよい。βアラニン／βアラニンについては、Ｔ－Ａ塩基対若しくはＡ－Ｔ塩基対に結合することができる。よって、標的のＤＮＡ配列に合わせてＰｙとＩｍの対の組み合わせ等を変更することにより、標的遺伝子の調節領域を認識するＰＩＰを設計することができる。ＰＩＰの設計方法及び製造方法は公知である（例えば、特許第３０４５７０６号公報、特開２００１－１３６９７４号公報及び国際公開第ＷＯ２０１３／０００６８３号）。
【0058】
Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（架橋化核酸）又はＬｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）は標的遺伝子の調節領域を認識するように配列認識させ、ＲＮＡの２’位酸素原子と４’位炭素原子間をメチレン鎖にて架橋した２’、４’－ＢＮＡ又はＲＮＡの２’位酸素原子と４’位炭素原子間をエチレン鎖にて架橋した２’、４’－ＥＮＡ(Ｅｔｈｙｌｅｎｅ‐Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ）として合成することができる。ＬＮＡはＰｒｏｌｉｇｏ社からも入手可能である。
【0059】
すなわち、本発明の複合体のＤＮＡ結合化合物は、Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（架橋化核酸）、Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）、ＰＮＡ、ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）、ピロール・イミダゾールポリアミド（ＰＩＰ）修飾物、ＤＮＡ結合蛋白質、及びＤＮＡ結合蛋白質複合体からなる群から選択される。
【0060】
様々な脂溶性カチオンなどが二重膜構造細胞内小器官へ局在し、それらの小器官への送達化合物として利用可能である。すなわち、本発明の複合体の本特許に利用できる二重膜構造細胞内小器官へ局在性の送達物質は脂溶性カチオンを含む。脂溶性カチオンとしてはＴＰＰ（ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ）、ａｌｋｙｌｔｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ ｃａｔｉｏｎｓ、ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、ｃｙａｎｉｎｅ ｃａｔｉｏｎｓ, ｃａｔｉｏｎｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ、ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ、ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ、ｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ，３－ｐｈｅｎｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌｆｕｒｏｘａｎ、Ｆ１６，２，３－ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏ－ｌｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ、ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１９、ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３やＤＱＡなどが挙げられる。
【0061】
この中でも脂溶性カチオンとしてＴＰＰ（ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ）が好適に用いられる。ＴＰＰは、安定性が高く、ＴＰＰを含む複合体が既に臨床に応用され安全性も確認されている（Adv Ther. 2016 Jan;33(1):96-115.）。ＴＰＰは、原形質膜電位差によって細胞外から細胞質内に処理濃度の５～１０倍取り込まれることが実証され、ミトコンドリア膜電位によりミトコンドリアマトリックス中にさらに処理濃度の１００～５００倍蓄積することが可能である。ＴＰＰは脂質二重層を直接通過するため、特異的な取り込みシステムを必要とせずにミトコンドリアに分布する。また、ＴＰＰはビタミンＥをはじめとする様々な物質、ペプチド等をミトコンドリアへ送達することが報告されている(Proc Natl Acad Sci USA, 100(9):5407-12, 2003)。このようにＴＰＰは本発明における薬剤開発において優位性を持つミトコンドリア内送達物質であり本発明における好ましい様態といえる。ＴＰＰの構造を以下に示す。
【0062】
【化17】
【0063】
植物においては脂溶性カチオンであるＴＰＰおよびそのデリバティブＳｋＱ１が葉緑体に送達されることも報告されている（Biochemistry (Mosc). 2015 Apr;80(4):417-23. doi: 10.1134/S0006297915040045.）。このことより、二重膜構造細胞内小器官であるミトコンドリア及び葉緑体において本発明の化合物はＤＮＡ配列特異的に干渉し、様々な生物活性を誘導できるものと考えられる。
【0064】
二重膜構造細胞内小器官へ局在性の送達物質は、ミトコンドリア等の二重膜構造細胞内小器官へ浸透するので、二重膜構造細胞内小器官浸透部位（ミトコンドリア浸透部位）ともいう。
【0065】
ＰＩＰは、遺伝子配列を認識できることより、例えば、図１及び図８に示すようにＭＥＬＡＳのＡ３２４３Ｇ変異を標的にしたヘアピンもしくは直鎖状のデザインを行い、ＰＩＰ化合物を合成することが出来、さらにミトコンドリアにおける長期貯留を計るために脂溶性カチオンであるＴＰＰとの複合体を設計でき、合成することが出来る。このＭＥＬＡＳのＡ３２４３Ｇ変異はミトコンドリア病で最も頻度が高い変異であるが、糖尿病やがんにおいてもこの変異が関与することが報告されている。また病態の発症には直接関係しないかも知れないｍｔＤＮＡの多型に関してもその多型を持つｍｔＤＮＡと病因となる変異が共存する場合、ｍｔＤＮＡの多型の配列を標的としてＰＩＰをデザインし、図１３のようにｍｔＤＮＡのＡ１４５８２Ｇ多型に対する複合化合物を合成することもできる。この多型を標的にした複合体においても病的ｍｔＤＮＡを結果的に標的にでき、同一多型の異なる配列をもつ正常ミトコンドリアには影響しない治療薬としてデザイン合成が可能となると考えられる。
【0066】
本発明の複合体は上記ポリアミドと上記二重膜構造細胞内小器官への局在物質とを結合すること等により合成することができる。「結合」は、直接でもよいし、リンカーを介してもよい。リンカーとしては、アルキル化剤の作用を妨げず、かつ二重膜構造細胞内小器官ＤＮＡ配列の認識を妨げないものであれば特に限定されず、例えば、アミド結合、ホスホジスルフィド結合、エステル結合、配位結合、エーテル結合等を例示することができる。
【0067】
また、本発明の複合体は標識物質を含んでいてもよい。
【0068】
本発明の複合体として、下の式（Ｉ）～（ＩＩＩ）の化合物が挙げられる。
【0069】
【化18】
【0070】
[Ｘは―ＣＨ２－、－ＮＨ―、―ＣＯ―、―ＣＨ２ＣＨ２Ｏ―又は―Ｏ―であり、
Ｙは―ＣＨ－又は―Ｎ―であり、
Ｒ１は－ＣＨ３、－ＯＨ、標識物質（蛍光、放射性、ビオチン、クリックケミストリー標識など）又はＴＰ（二重膜構造細胞内小器官局在性化合物であるミトコンドリア浸透部位）であり、
Ｒ２はそれぞれ独立した－ＣＨ３、－ＮＨ２、標識物質又はＴＰであり、
ｊは１から６であり、
ｋは１から２であり、
ｌは１から４であり、
ｍは０から１０であり、
ｎは０から６であり、
ｏは０から６である]。
Ｙは―ＣＨ－又は―Ｎ―であり、
Ｒ１は－ＣＨ３、－ＯＨ、標識物質（蛍光、放射性、ビオチン、クリックケミストリー標識など）又はＴＰ（二重膜構造細胞内小器官局在性化合物であるミトコンドリア浸透部位）であり、
Ｒ２はそれぞれ独立した－ＣＨ３、－ＮＨ２、標識物質又はＴＰであり、
ｊは１から６であり、
ｋは１から２であり、
ｌは１から４であり、
ｍは０から１０であり、
ｎは０から６であり、
ｏは０から６である]。
【0071】
下式（ＩＩ）を有する（Ｉ）に記載の化合物
【0072】
【化19】
【0073】
[Ｘは―ＣＨ２－、－ＮＨ―、―ＣＯ―、―ＣＨ２ＣＨ２Ｏ―又は―Ｏ―であり、
Ｙは―ＣＨ－又は―Ｎ―であり、
Ｒ１は－ＣＨ３、－ＯＨ、標識物質又はＴＰであり、
Ｒ２はそれぞれ独立した－ＣＨ３、－ＮＨ２、標識物質又はＴＰである]。
Ｙは―ＣＨ－又は―Ｎ―であり、
Ｒ１は－ＣＨ３、－ＯＨ、標識物質又はＴＰであり、
Ｒ２はそれぞれ独立した－ＣＨ３、－ＮＨ２、標識物質又はＴＰである]。
【0074】
前記化合物が下式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）に記載される構造を含む（Ｉ）又は（ＩＩ）に記載される化合物
【0075】
【化20】
【0076】
又は
【0077】
【化21】
【0078】
[Ｙは―ＣＨ－又は―Ｎ―であり、
Ｒ１は－ＣＨ３、－ＯＨ、標識物質又はＴＰであり、
Ｒ２はそれぞれ独立した－ＣＨ３、－ＮＨ２、標識物質又はＴＰである]。
Ｒ１は－ＣＨ３、－ＯＨ、標識物質又はＴＰであり、
Ｒ２はそれぞれ独立した－ＣＨ３、－ＮＨ２、標識物質又はＴＰである]。
【0079】
本発明のＤＮＡ結合化合物と二重膜構造細胞内小器官への局在物質との複合体は、二重膜構造細胞内小器官のＤＮＡを修飾することができる。該ＤＮＡ結合化合物は、ミトコンドリアなどのＤＮＡ配列を標的とし、ミトコンドリア変異及び多型を認識し、ミトコンドリアに対するマイトファジーを誘導などの生物活性を示す。すなわち、上記のミトコンドリア関連疾患などの病態を標的とし得る。
【0080】
本発明の複合体は、使用目的に応じ、本発明の複合体に加えて、担体や添加物を含むものであってもよい。このような担体及び添加物として、水、酢酸、有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、界面活性剤等が挙げられる。本発明の複合体の使用量は、使用目的に応じて適宜調節することができる。
【0081】
本発明の複合体として、以下のものが例示できる。該複合体は、ピロール・イミダゾールポリアミド（ＴＰＰ）の末端βリンカーを介してＴＰＰを結合させた複合体である。下の式（Ｖ）で表される該複合体を、ＣＣＣ０２０-ＴＰＰと呼ぶ。構造式はＣ６６Ｈ８０Ｎ１６Ｏ９Ｐで表され、分子量は１２７２．４２である。また、下の式（ＶＩ）で表される該複合体を、ＣＣＣ０２１-ＴＰＰと呼ぶ。構造式はＣ６８Ｈ８２Ｎ１４Ｏ９Ｐで表され、分子量は１２７２．４４である。
【0082】
【化22】
【0083】
【化23】
【0084】
また、分子量の小さな単鎖型化合物（単鎖型ＰＩＰ－ＴＰＰ）を用いることもできる。単鎖型化合物として、図２９及び式（ＸＩＶ）に構造式を示すＣＣＣ１４９－ＴＰＰが例示できる。分子量の小さな単鎖型化合物は皮膚透過性を示すので、経皮吸収型製剤化が可能である。
【0085】
本発明の化合物のライブラリーを図３３－１～図３３－６に示す。ライブラリー化合物は図３２に記載の方法で合成することができる。図３３－１～図３３－６には、２環状構造化合物から８環状化合物を示す。２環状構造化合物は４つの化合物が合成でき、３に環状構造化合物は８つの化合物が合成でき、４環状構造化合物はβアラニンを挿入することで４つの４環状構造化合物にそれぞれ１６化合物が合成でき、５環状構造化合物はβアラニンを挿入することで４つの５環状構造化合物にそれぞれ３２化合物が合成できる。６環状構造化合物はβアラニンを１つ以上挿入することで６４化合物がそれぞれ合成できる。７環状構造化合物も同様でありβアラニンを１つ含んだ想定できる化合物でそれぞれ１２８化合物が合成できる。８環状構造化合物も同様でありβアラニンを１つ以上含んだ想定できる化合物でそれぞれ２５６化合物が合成できる。
【0086】
９環状構造化合物以上も同様にして合成が可能である。
【0087】
これらライブラリーの化合物のうち、２環状構造化合物ＣＣＣ１０２-ＴＰＰ（構造を図３４及び式ＸＶに示す）、３環状構造化合物ＣＣＣ１０６-ＴＰＰ（構造を図３６及び式ＸＶＩに示す）、４環状構造化合物ＣＣＣ１１４-ＴＰＰ（構造を図３８及び式ＸＶＩＩに示す）、５環状構造化合物ＣＣＣ１７５-ＴＰＰ（構造を図４０及び式ＸＶＩＩＩに示す）、６環状構造化合物ＣＣＣ２０６-ＴＰＰ（構造を図４２及び式ＸＩＸに示す）、７環状構造化合物ＣＣＣ１２８３-ＴＰＰ（構造を図４４及び式ＸＸに示す）、及び８環状構造化合物ＣＣＣ１３９４-ＴＰＰ（構造を図４６及び式ＸＸＩに示す）を本発明の複合体として例示することができる。
【0088】
さらに、本発明の複合体として、図４９及び式ＸＸＩＩに構造を示す、１０環状構造化合物ＣＣＣｈ５３１－ＴＰＰ、及び図５２及び式ＸＸＩＩＩに構造を示す、１０環状構造化合物ＣＣＣｈ５６０－ＴＰＰが挙げられる。
【0089】
本発明の複合体は、ミトコンドリアＤＮＡ変異及び多型を認識して、配列特異的にミトコンドリアに集積するので、ミトコンドリアＤＮＡ変異及び多型を認識する配列特異的ミトコンドリア集積性化合物として用いることができる。
【0090】
本発明の複合体は、変異ミトコンドリアＤＮＡコピー数が多い細胞においては、細胞死を誘導する。一方、細胞死に抵抗性の細胞に対しては、細胞老化を誘導する。本発明の複合体と老化細胞除去薬との併用により、老化細胞除去薬の効果を増強する合成致死効果を奏することができる。従って、本発明は本発明の複合体と老化細胞除去薬の組合せ医薬も包含し、例えば本発明の複合体と細胞除去薬の組合せキットを含む。さらに、本発明は老化細胞除去薬と併用するための本発明の複合体を包含する。
【0091】
老化細胞除去薬としては、抗アポトーシスＢＣＬファミリー阻害剤やＭＤＭ２阻害剤が挙げられ、図５５－１～５５－１１に構造及び化学式を示すCanagliflozin、Canagliflozin、Ipragliflozin、Dapagliflozin、Luseogliflozin、Tofogliflozin、Sergliflozin etabonate、Remogliflozin etabonate、Ertugliflozin、sotagliflozin、Dasatinib、Quercetin、Navitoclax (ABT-263)、ABT-737、A1331852、A1155463、17-(Allylamino)-17-demethoxygeldanamycin、Fisetin、Panobinostat、Azithromycin、Roxithromycine、Piperlongumine、Hyperoside (Quercetin 3-galactoside)、2,3,5-Trichloro-6-(2-piperidin-1-yl-1,3-thiazol-5-yl)cyclohexa-2,5-diene-1,4-dione、2,5-Dichloro-3-(1-piperidinyl)-6-[2-(1-piperidinyl)-1,3-thiazol-5-yl]benzo-1,4-quinone、2,5-Dichloro-3-morpholin-4-yl-6-(2-piperidin-1-yl-1,3-thiazol-5-yl)cyclohexa-2,5-diene-1,4-dione、2,5-Dichloro-3-(phenylamino)-6-(2-piperidin-1-yl-1,3-thiazol-5-yl)cyclohexa-2,5-diene-1,4-dione、2,5-Dichloro-3-(2-morpholin-4-yl-1,3-thiazol-5-yl)-6-piperidin-1-ylcyclohexa-2,5-diene-1,4-dione、Obatoclax、Venetoclax、2,5-dichloro-3-(4-methyl-1-piperazinyl)-6-[2-(1-piperidinyl)-1,3-thiazol-5-yl]benzo-1,4-quinone、Nutlin-3、MI-63、UBX0101、UBX1967等やそれらの誘導体が挙げられる。その他、米国特許第10550378号明細書、米国特許第10517866号明細書、米国特許第10519197号明細書、米国特許第10478432号明細書、米国特許第10426788号明細書、米国特許第1041354号明細書、米国特許第10378002号明細書、米国特許第1032807号明細書、及び米国特許第10195213号明細書に記載の老化細胞除去薬を用いることができる。
【0092】
本発明の医薬組成物は、上記複合体を含む組成物である。該組成物はミトコンドリア疾患関連ｍｔＤＮＡ配列に結合する。当該医薬組成物を生体内に投与することにより、種々の疾患を治療及び予防をすることができる。本発明の医薬組成物は、二重膜構造細胞内小器官二本鎖ＤＮＡを生体制御に利用する植物を含むあらゆる生物とくに哺乳動物（例、ヒト、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）の疾患を対象にすることができる。本発明の医薬組成物の対象疾患は、ｍｔＤＮＡの変異を伴う疾患、例えば、ミトコンドリア病、がん、心臓循環器疾患、脳神経疾患／精神性疾患、筋疾患、腎疾患、肝疾患、生活習慣病、睡眠障害、皮膚科、眼科、又は耳鼻科領域の局所症状の強い疾患及び感染症、アレルギー性疾患、細胞老化が関与する疾患、老化、並びに消化器疾患等が挙げられる。対象疾患のうちミトコンドリア病としては、慢性進行性外眼麻痺症候群、赤色ぼろ線維・ミオクローヌスてんかん症候群、ミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様症候群（ＭＥＬＡＳ）、Ｌｅｉｇｈ脳症（リー脳症）などが挙げることができる。がんとしては、例えば、皮膚がん（悪性黒色腫、基底細胞皮膚がん等）脳腫瘍、頭頚部がん、食道がん、舌がん、肺がん、乳がん、膵がん、胃がん、小腸又は十二指腸のがん、大腸がん（結腸がん、直腸がん）、膀胱がん、腎がん、肝がん、前立腺がん、子宮がん、卵巣がん、甲状腺がん、胆嚢がん、咽頭がん、肉腫（例えば、骨肉腫、軟骨肉腫、カポジ肉腫、筋肉腫、血管肉腫、線維肉腫等）、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）及び急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、リンパ腫、多発性骨髄腫（ＭＭ）等）、小児固形腫瘍（脳腫瘍、神経芽腫、肝芽腫、腎芽腫、ユーイング肉腫等）、網膜芽腫及びメラノーマ等を挙げることができる。生活習慣病としては、特に限定されず、例えば、高血圧、糖尿病等を挙げることができる。皮膚科、眼科、又は耳鼻科領域の局所症状の強い疾患及び感染症としては、例えば、難聴、乾癬、慢性皮膚炎、副鼻腔炎、緑内障、網膜変性症等を挙げることができる。アレルギー性疾患としては、アトピー性皮膚炎、花粉症等を挙げることができる。細胞老化が関与する疾患としては、例えば、皮膚の皺、たるみ、色素沈着等を挙げることができる。脳神経疾患／精神性疾患としては、例えば、痙攣、ミオクローヌス、失調、脳卒中様症状、知能低下、偏頭痛、精神症状、ジストニア、ミエロパチー、双極性障害、パーキンソン病、痴呆等を挙げることができる。筋疾患としては、筋力低下、易疲労性、高ＣＫ血症、ミオパチーなどを上げることができる。心臓循環器疾患としては、伝導障害、ウォルフ・パーキンソン・ホワイト（ＷＰＷ）症候群、心筋症、肺高血圧症などを上げることができる。腎疾患としては、ファンコーニ症候群、尿細管機能障害、糸球体病変、ミオグロビン尿などを上げることが出来る。肝疾患としては、肝機能障害、肝不全などを上げることができる。
【0093】
本発明の医薬組成物の好ましい対象疾患は、二重膜構造細胞内小器官二本鎖ＤＮＡが関与する全ての病態・疾患が含まる。ミトコンドリア関連疾患に由来する全ての疾患も含まれる。本発明の医薬組成物は、標的配列をもつミトコンドリアＤＮＡコピー数の割合の多い細胞に対してより効果的に作用して、マイトファジーを促進し、標的配列を持つミトコンドリアの減少、もしくは特定の細胞においてはミトコンドリア機能不全による細胞死メカニズムを誘導することによって疾患原因細胞を正常化もしくは死滅させ、疾患の治療及び予防をすることができる。
【0094】
本発明の医薬組成物は、経口投与及び非経口投与のいずれの剤形でもよい。これらの剤形は常法にしたがって製剤化することができ、医薬的に許容される担体や添加物を含むものであってもよい。このような担体及び添加物として、水、酢酸、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。
【0095】
上記添加物は、本発明の医薬組成物の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせから選ばれる。剤形としては、経口投与の場合は、錠剤、カプセル剤、細粒剤、粉末剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤、外用剤等として噴霧剤、塗布剤、点眼剤、又は適当な剤型により投与が可能である。非経口投与の場合は、注射剤型等が挙げられる。注射剤型の場合は、例えば点滴等の静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射、腫瘍内注射等により全身又は局部的に投与することができる。
【0096】
例えば、注射用製剤として使用する場合、本発明の医薬組成物を溶剤（例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液、０．１％酢酸、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等）に溶解し、これに適当な添加剤（ヒト血清アルブミン、ＰＥＧ、マンノース修飾デンドリマー、シクロデキストリン結合体等）を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥用賦形剤としては、例えば、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコールや糖類、デキストランなどの重合多糖類を使用することができる。
【0097】
例えば、経皮吸収型製剤として使用する場合、本発明の医薬組成物を溶剤（例えば白色ワセリン、流動パラフィン、ミリスチン酸イソプロピル、ミツロウ、ラノリン、ステアリン酸、ステアリルアルコール、セタノール、グリセリン、プロピレングリコール、1, 3-ブチレングリコール、エタノール、イソプロパノール等）に溶解し、これに適当な添加剤（モノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸ソルビタン、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、ポリソルベート６０、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピル、フェノキシエタノール、チモール、亜硫酸水素ナトリウム、アスコルビン酸、トコフェロール、ジブチルヒドロキシトルエン、エデト酸ナトリウム水和物、ベンゾトリアゾール、クエン酸水和物、クエン酸ナトリウム水和物、乳酸、ジイソプロパノールアミン、酢酸、酢酸ナトリウム水和物、ラウロカプラム、ピロチオデカン等）を加えたものを使用することができる。
【0098】
本発明の医薬組成物又は本発明の化合物の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なる。投与量は、例えば成人（６０ｋｇ）の場合、１日当たり０．０１～１０００ｍｇ、好ましくは０．１～１００ｍｇ、より好ましくは１～３０ｍｇである。投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択する。投与は、例えば数日間隔に１回、１日当たり、１回又は２～４回に分けてもよい。
【0099】
本発明の医薬組成物は、抗がん剤として用いることができる。対象になるがんの種類は、例えば、大腸がん、膵臓がん、結腸直腸がん、甲状腺がん、肺がん、頚部がん、子宮内膜がん、骨髄異形成症候群、甲状腺及び結腸の腺腫、神経芽腫等であるが、これに限定されることはなく、がん及びその周囲微小環境を構成する細胞において、正常細胞と異なる特異的ｍｔＤＮＡ配列を有するがん若しくは正常細胞も有するが優位にその多型配列を持つｍｔＤＮＡのコピー数が増加したがん及びその周囲微小環境を構成する細胞が対象である。本発明の抗がん剤は、上述の医薬組成物と同様に使用目的に応じて担体や組成物を含んでもよい。
【0100】
本発明はキットも包含し、該キットは、本発明の化合物の他、医薬的に許容される担体や添加物、試薬類、補助剤、専用容器、その他の必要なアクセサリー、説明書等を含むものである。本発明のキットは、がん治療用キット、細胞治療用キット、二重膜構造細胞内小器官導入治療キット、診断用キット、研究試薬キットとしても使用することができる。
【実施例】
【0101】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
[実施例１]
二重膜構造細胞内小器官二本鎖ＤＮＡは、ヒト、動植物を含む真核生物に存在する細胞小器官例えばミトコンドリアや葉緑体に存在し、呼吸や光合成など、それら生物のエネルギー産生などに深く関与するとともに、活性酸素などの生理作用及び病理作用を有する物質の産生にも関与する。さらに細胞質内、核膜の外に存在するＤＮＡであるために核内ＤＮＡに比べ、損傷を受けやすく新たな変異が蓄積しやすい性質を有し、加齢に伴い変異が蓄積し、成人の体細胞で変異型ｍｔＤＮＡと正常型ｍｔＤＮＡが混在した「ヘテロプラスミー」という状態となる。また変異型ｍｔＤＮＡの比率が一定以上になるとミトコンドリアの機能が低下し、ミトコンドリア病などを発症する原因となる。ｍｔＤＮＡの変異は、ミトコンドリア病のみに留まらず糖尿病やがんなどの後天性のいわゆる生活習慣病と呼ばれる疾患群の原因となることも知られている。本実施例では、ｍｔＤＮＡ塩基配列を認識してＤＮＡ副溝に結合する直鎖型ピロールイミダゾールポリアミドに脂溶性カチオンであるＴＰＰを縮合させることで変異ｍｔＤＮＡ配列もしくはｍｔＤＮＡ多型配列を認識するＰＩＰ－ＴＰＰ（ＣＣＣ０２０-ＴＰＰ及びＣＣＣ０２１-ＴＰＰ）を合成した。この化合物及び下の式（ＶＩＩ）のヘアピン型ＰＩＰ－ＴＰＰ該複合体(ＣＣＣ０１８－ＴＰＰと呼ぶ)を用いて、標的ｍｔＤＮＡ配列を有する細胞における生物活性を検討した。ミトコンドリア持続局在確認実験、ミトコンドリアＤＮＡコピー数解析実験、関連遺伝子の発現解析実験、ミトコンドリア自食反応確認実験、変異ミトコンドリア保有細胞の細胞死誘導の実験、プログラムされた細胞死確認実験、合成致死誘導実験、皮膚透過性確認実験、植物生細胞透過性確認実験を行った。さらに様々なＰＩＰを合成し、ＴＰＰとの複合体の合成を実施し、ライブラリー化に成功した。ライブラリー化合物中婦人科癌細胞のミトコンドリア変異を標的可能な（ＣＣＣ１３０－ＴＰＰとＣＣＣ５３１－ＴＰＰ）およびミトコンドリアDNA多型を標的とした（ＣＣＣ５６０－ＴＰＰ）によるミトコンドリアDNAに標的配列をもつがん細胞において細胞増殖抑制が誘導実験を行った。
[実施例１]
二重膜構造細胞内小器官二本鎖ＤＮＡは、ヒト、動植物を含む真核生物に存在する細胞小器官例えばミトコンドリアや葉緑体に存在し、呼吸や光合成など、それら生物のエネルギー産生などに深く関与するとともに、活性酸素などの生理作用及び病理作用を有する物質の産生にも関与する。さらに細胞質内、核膜の外に存在するＤＮＡであるために核内ＤＮＡに比べ、損傷を受けやすく新たな変異が蓄積しやすい性質を有し、加齢に伴い変異が蓄積し、成人の体細胞で変異型ｍｔＤＮＡと正常型ｍｔＤＮＡが混在した「ヘテロプラスミー」という状態となる。また変異型ｍｔＤＮＡの比率が一定以上になるとミトコンドリアの機能が低下し、ミトコンドリア病などを発症する原因となる。ｍｔＤＮＡの変異は、ミトコンドリア病のみに留まらず糖尿病やがんなどの後天性のいわゆる生活習慣病と呼ばれる疾患群の原因となることも知られている。本実施例では、ｍｔＤＮＡ塩基配列を認識してＤＮＡ副溝に結合する直鎖型ピロールイミダゾールポリアミドに脂溶性カチオンであるＴＰＰを縮合させることで変異ｍｔＤＮＡ配列もしくはｍｔＤＮＡ多型配列を認識するＰＩＰ－ＴＰＰ（ＣＣＣ０２０-ＴＰＰ及びＣＣＣ０２１-ＴＰＰ）を合成した。この化合物及び下の式（ＶＩＩ）のヘアピン型ＰＩＰ－ＴＰＰ該複合体(ＣＣＣ０１８－ＴＰＰと呼ぶ)を用いて、標的ｍｔＤＮＡ配列を有する細胞における生物活性を検討した。ミトコンドリア持続局在確認実験、ミトコンドリアＤＮＡコピー数解析実験、関連遺伝子の発現解析実験、ミトコンドリア自食反応確認実験、変異ミトコンドリア保有細胞の細胞死誘導の実験、プログラムされた細胞死確認実験、合成致死誘導実験、皮膚透過性確認実験、植物生細胞透過性確認実験を行った。さらに様々なＰＩＰを合成し、ＴＰＰとの複合体の合成を実施し、ライブラリー化に成功した。ライブラリー化合物中婦人科癌細胞のミトコンドリア変異を標的可能な（ＣＣＣ１３０－ＴＰＰとＣＣＣ５３１－ＴＰＰ）およびミトコンドリアDNA多型を標的とした（ＣＣＣ５６０－ＴＰＰ）によるミトコンドリアDNAに標的配列をもつがん細胞において細胞増殖抑制が誘導実験を行った。
【0102】
ミトコンドリア変異ＤＮＡコピー数の変化を検討するため、ヒト子宮頸がん由来細胞株であるＨｅＬａ細胞からｍｔＤＮＡを欠いたρ０細胞をまず作製した。そこにＭＥＬＡＳ患者由来のＡ３２４３Ｇ変異のｍｔＤＮＡを含む血小板を融合させる事により変異型ミトコンドリアＤＮＡを異なる割合で導入した３２４３Ｇ Ｌｏｗ細胞（ＨｅＬａｍｔ３２４３変異ｍｔＤＮＡ ５５％含有細胞）及び３２４３Ｇ Ｈｉｇｈ細胞（ＨｅＬａｍｔ３２４３変異ｍｔＤＮＡ ８２％含有細胞）、また野生株のＨｅＬａ細胞の非変異ミトコンドリアＤＮＡ を融合させる事により得たＨｅＥＢ１（ＨｅＬａｍｔＨｅＬａ）細胞を作成した。細胞は1０％ Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ:ｇｉｂｃｏ、米国）、１％ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ―Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ｇｉｂｃｏ）、０．１ｍｇ/ｍｌ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｓｉｇｍａ―Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）、５０ｍｇ/ｍｌ Ｕｒｉｄｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ―Ａｌｄｒｉｃｈ）含有Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ Ｄ５７９６:Ｓｉｇｍa-Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。
【0103】
化合物ＣＣＣ０１８は、ミトコンドリア病の一種であるＭＥＬＡＳやミトコンドリア糖尿病の原因変異であるミトコンドリアＤＮＡのＡ３２４３Ｇ変異配列ＧＧＧＣＣＣＴを標的にしたヘアピン型ＰＩＰであり、国際公開第ＷＯ2012/133896号の記載に即して合成した。ＣＣＣ０１９は、ミトコンドリアＤＮＡに結合し、変異ミトコンドリアのコピー数の減少を誘導する可能性が予想された。しかしながら国際公開第ＷＯ2012/133896号の記載の実験を行ったところ再現性が得られなかった。
【0104】
【化24】
【0105】
この結果及び（Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 11 (2001) 769-772）に記載の通り、ＤＮＡ副溝結合化合物は、ミトコンドリアへ局在し、ｍｔＤＮＡに結合すると予測されるが、ゴルジ体及び滑面小胞体に移行することで、分泌小胞、分泌顆粒、リソソーム及びエンドソームの形成などによる細胞外への排出系に移行し、ｍｔＤＮＡとの有効な結合状態が持続的に維持されないと考えられた。
【0106】
このことを確認するためＣＣＣ０１８に蛍光ラベルを行ったＣＣＣ０１８－ＦＩＴＣを合成し（図１－１）、ＭＥＬＡＳ患者由来のＡ３２４３Ｇ変異のｍｔＤＮＡを含む血小板を融合させることにより変異型ｍｔＤＮＡを異なる割合で導入した３２４３Ｇ Ｈｉｇｈ細胞（ＨｅＬａｍｔ３２４３ 変異ｍｔＤＮＡ ８２％含有細胞）の培養下でミトコンドリアをマイトトラッカーによる赤色蛍光、ＣＣＣ０１８－ＦＩＴＣを緑色蛍光での蛍光局在の観察実験を行った。
【0107】
３５ｍｍ ｇｌａｓｓ ｂａｓｅ ｄｉｓｈ（ＩＷＡＫＩ、生岡）に３２４３Ｇ Ｈｉｇｈ細胞を１×１０５ ｃｅｌｌｓ/ｄｉｓｈとなるように播種し、２４時間培養後にＣＣＣ０１８-ＦＩＴＣで終濃度１μＭとなるように処理した。さらに２４及び４８時間後に培養液を除き、５０ｎＭとなるようにＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標） Ｒｅｄ ＣＭＸＲｏｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）入りの培養液を添加し、１０分後に新しい培養液に交換して共焦点レーザー顕微鏡ＳＰ８（Ｌｅｉｃａ、ドイツ）で観察した。
【0108】
図１－２に示す通り、文献（Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 11 (2001) 769-772）と同様に、ＣＣＣ０１８－ＦＩＴＣ投与２４時間後では、一部のミトコンドリア赤色蛍光と緑色蛍光の共局在が認められたが、４８時間後には緑色蛍光はミトコンドリアとの共局在は認められず、ゴルジ体や割面小胞体に移行したと考えられる蛍光像が確認された。このことより、ヘアピン型ＰＩＰではミトコンドリアへの局在が限定され、変異ミトコンドリアを効率的に減少させることが出来ないと考えられた。
【0109】
上記問題点を解決するため、ミトコンドリア局在が報告されている脂溶性カチオンをヘアピン型ＰＩＰと縮合することでミトコンドリア局在を改善できると考え、（４-Ｃａｒｂｏｘｙｂｕｔｙｌ）ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈoｓｐｈｏｎｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ（ＴＰＰ、シグマアルドリッチ）を購入し、ミトコンドリア局在の確認を行った。ピリディジウム基にインドールをリンカーとしてＴＰＰを結合させたＰｙｒｉｄｉｎｉｕｍ―Ｉｎｄｏｌｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ-ＴＰＰ（下の式（ＶＩＩＩ））及び比較としてＴＰＰを付加していないＰｙｒｉｄｉｎｉｕｍ―Ｉｎｄｏｌｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ（下の式（ＩＸ））の細胞内局在を上記のように処理後２時間と４８時間で観察した。図２に示す通り、Ｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ―Ｉｎｄｏｌｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ-ＴＰＰはミトコンドリアと共局在し、４８時間でも共局在が認められたが、ＴＰＰを付加していないＰｙｒｉｄｉｎｉｕｍ―Ｉｎｄｏｌｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅはミトコンドリアとの共局在は認められなかった。
【0110】
【化25】
【0111】
【化26】
【0112】
上記に基づき、さらにｍｔＤＮＡのＡ３２４３Ｇ変異配列ＣＣＴＧＣＣＡを標的にしたヘアピン型ＰＩＰ、ＣＣＣ０１９にＴＰＰを縮合したＰＩＰ－ＴＰＰ化合物、ＣＣＣ０１９－ＴＰＰ（下の式（Ｘ））を図３に示す通り合成した。ＣＣＣ０１９はＣＣＣ０１８同様にＡ３２４３Ｇ変異配列を認識するが、イミダゾール基の連続した結合を少なくすることで合成効率をより向上させた化合物である。
【0113】
【化27】
【0114】
ＣＣＣ０１８－ＴＰＰの細胞内局在を下記の如く検討した。３５ｍｍ ｇｌａｓｓ ｂａｓｅ ｄｉｓｈ（ＩＷＡＫＩ）にｍｔＤＮＡ変異細胞株３２４３Ｇ Ｌｏｗ（ＨｅＬａｍｔ３２４３変異ミトコンドリアＤＮＡ ５５％含有細胞）及び３２４３Ｇ Ｈｉｇｈ細胞を２×１０４ｃｅｌｌｓ/ｄｉｓｈとなるように播種し、２４時間培養後にＣＣＣ０１８-ＴＰＰで３２４３Ｇ Ｌｏｗ細胞には終濃度５００ｎＭ、３２４３Ｇ Ｈｉｇｈ細胞には終農度１００ ｎＭとなるように処理した。３２４３Ｇ Ｌｏｗ細胞はコンフルエントになる前に２×１０４ｃｅｌｌｓ/ｄｉｓｈになるようにまき直し、新鮮なＣＣＣ０１８-ＴＰＰを含む培養液と交換し１４日間処理した。また、３２４３Ｇ Ｈｉｇｈ細胞は培養液を交換せず３日間処理した。ＣＣＣ０１８-ＴＰＰ処理終了後に４％Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ（ＰＦＡ）/ＰＢＳで３０分間室温で固定した。固定後、ＰＢＳにより洗浄し、１０％ ＦＢＳ/０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ１００/ＴＢＳ（ＴＢＳＴ）で１０分間ブロッキングを行った。ＴＢＳは、終濃度１５０μＭ塩化ナトリウムと終濃度２０μＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）の混合溶液である。ブロッキング終了後、ＴＢＳＴで希釈した一次抗体を４℃で一晩反応させた。使用した一次抗体はラビット抗ＴＰＰ抗体（英国 ケンブリッジ大学 Dr. M. Murphyより供与）１:５００希釈、マウス抗Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）１:５００希釈を使用し、一次抗体との反応終了後、ＴＢＳにより３回洗浄し、ＴＢＳＴで希釈した二次抗体Ｇｏａｔ ａｎｔｉ Ｒａｂｂｉｔ Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国） １:１０００希釈とＧｏａｔ ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） １:１０００希釈を用い１５分間反応させた。二次抗体との反応終了後、ＴＢＳにより３回洗浄し、ＤＡＢＣＯ/ＰＶＡ封入剤（Ｓｉｇｍａ―Ａｌｄｒｉｃｈ）で封入して、共焦点レーザー顕微鏡ＳＰ８（Ｌｅｉｃａ）で観察した。
【0115】
ＣＣＣ０１８-ＴＰＰを３２４３Ｇ変異を持つ２種類の細胞へ処理した結果、ミトコンドリア内膜内にあるＣｙｔＣと共局在する所見がＣＣＣ０１８-ＴＰＰ投与３日後の３２４３Ｇ Ｈｉｇｈ細胞、及び変異ミトコンドリア数の少ない３２４３Ｇ Ｌｏｗ細胞へのＣＣＣ０１８-ＴＰＰ投与１４日後においても観察された（図４）。このことからＣＣＣ０１８-ＴＰＰがミトコンドリアへ送達され長期間貯留することが確認された。
【0116】
ＣＣＣ０１９-ＴＰＰ処理後の総ミトコンドリアＤＮＡコピー数の変化を解析するため、下記のＰＣＲによる定量実験を行った。
【0117】
３５mm ｄｉｓｈ（Ｆａｌｃｏｎ、米国）に３２４３Ｇ Ｌｏｗ細胞を２×１０４ｃｅｌｌｓ/ｗｅｌｌとなるように播種し、２４時間培養後にＣＣＣ０１９-ＴＰＰで終濃度１μＭ及び５μＭとなるように処理した。２日に１回培地を交換し、ＣＣＣ０１９-ＴＰＰの連続投与を行った。さらに４８、６３日後に、Ａｌｌｐｒｅｐ ＤＮＡ/ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、ドイツ）を使用して、取扱説明書に従いＤＮＡを抽出した。抽出後、ＮＡＮＯＤＲＯＰ ２０００ｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ＤＮＡの収量を測定した。ＤＮＡサンプルを調製し、ＰＣＲ反応及び解析を行った。使用したプライマー、反応条件を以下に示す。
・ＣＯＩＩ
Forward primer:ACA CAT TCG AAG AAC CCG TAT（配列番号１）
Reverse primer:TTT AGT TGG GGC ATT TCA CTG（配列番号２）
・β actin（インターナルコントロール）
Forward primer:TGA CGG GGT CAC CCA CAC TGT GCC CAT CTA（配列番号３）
Reverse primer:CTA GAA GCA TTT GCG GTG GAC GAT GGA GGG（配列番号４）
反応条件は以下に示す。
・ＣＯＩＩ（２０サイクル）
Ｉｎｉｔｉａｌ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ９４℃ １分
Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ９４℃ ３０秒
Ａｎｎｅａｌｉｎｇ ５３℃ ３０秒
Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ７２℃ １分
Ｆｉｎａｌ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ７２℃ １分
・β ａｃｔｉｎ（２５サイクル）
Ｉｎｉｔｉａｌ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ９６℃ ５分
Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ９６℃ ３０秒
Ａｎｎｅａｌｉｎｇ ５９℃ ３０秒
Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ７２℃ ３０秒
Ｆｉｎａｌ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ７２℃ ５分
ＰＣＲ反応終了後、ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで電気泳動した後、Ｅｔｈｉｄｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅで染色してＰＣＲ産物のバンドを検出し、解析ソフト（Ｉｍａｇｅ Ｊ）でバンド定量を行った。
・ＣＯＩＩ
Forward primer:ACA CAT TCG AAG AAC CCG TAT（配列番号１）
Reverse primer:TTT AGT TGG GGC ATT TCA CTG（配列番号２）
・β actin（インターナルコントロール）
Forward primer:TGA CGG GGT CAC CCA CAC TGT GCC CAT CTA（配列番号３）
Reverse primer:CTA GAA GCA TTT GCG GTG GAC GAT GGA GGG（配列番号４）
反応条件は以下に示す。
・ＣＯＩＩ（２０サイクル）
Ｉｎｉｔｉａｌ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ９４℃ １分
Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ９４℃ ３０秒
Ａｎｎｅａｌｉｎｇ ５３℃ ３０秒
Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ７２℃ １分
Ｆｉｎａｌ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ７２℃ １分
・β ａｃｔｉｎ（２５サイクル）
Ｉｎｉｔｉａｌ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ９６℃ ５分
Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ９６℃ ３０秒
Ａｎｎｅａｌｉｎｇ ５９℃ ３０秒
Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ７２℃ ３０秒
Ｆｉｎａｌ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ７２℃ ５分
ＰＣＲ反応終了後、ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで電気泳動した後、Ｅｔｈｉｄｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅで染色してＰＣＲ産物のバンドを検出し、解析ソフト（Ｉｍａｇｅ Ｊ）でバンド定量を行った。
【0118】
ＣＣＣ０１９-ＴＰＰを４８、６３日間処理した３２４３Ｇ Ｌｏｗ細胞のｍｔＤＮＡの総コピー数を推測するために、ミトコンドリア呼吸鎖複合体ＩＶを構成するＣＯＩＩ遺伝子についてＰＣＲを行った結果、ＣＣＣ０１９-ＴＰＰ濃度依存的にｍｔＤＮＡの総コピー数が増加する傾向が４８、６３日間処理した両方の実験で観察された（図５）。
【0119】
ＣＣＣ０１９-ＴＰＰ処理による正常型・変異型ｍｔＤＮＡの割合の変化を解析するためにＰＣＲ―ＲＦＬＰ法による解析を以下の如く行った。
【0120】
３５mm ｄｉｓｈ（Ｆａｌｃｏｎ）に３２４３Ｇ Ｌｏｗ細胞を２×１０４ｃｅｌｌｓ/ｗｅｌｌとなるように播種し、２４時間培養後にＣＣＣ０１９-ＴＰＰで終濃度１μＭ及び５μＭとなるように処理した。２日に１回培地を交換し、ＣＣＣ０１９-ＴＰＰの連続投与を行った。さらに４８、６３日後に、Ａｌｌｐｒｅｐ ＤＮＡ/ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、取扱説明書に従いＤＮＡを抽出した。抽出後、ＮＡＮＯ ＤＲＯＰ ２０００（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ＤＮＡの収量を測定した。ＤＮＡサンプルを調製し、ＰＣＲ反応を行った。使用したプライマーと反応条件は以下に示す。
・ｍｔ３２４３
Forward primer:TTC ACA AAG CGC CTT CCC CCG T（配列番号５）
Reverse primer:GCG ATG GTG AGA GCT AAG GTC GG（配列番号６）
反応条件は以下に示す。（２５サイクル）
Ｉｎｉｔｉａｌ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ９５℃ ５分
Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ９５℃ ３０秒
Ａｎｎｅａｌｉｎｇ ５７℃ ３０秒
Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ７２℃ ３０秒
Ｆｉｎａｌ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ７２℃ ５分
ＰＣＲ産物はＡｐａＩによる制限酵素処理を以下の如く行い解析した。ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、取扱説明書に従い精製した。精製後、ＮＡＮＯＤＲＯＰ ２０００ｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ＤＮＡの収量を測定した。測定後、ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国）ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）で増幅した反応産物をＡｐａＩによる制限酵素処理を３７℃で５時間行った。反応終了後、サンプル１５ｎｇを２％アガロースゲルで電気泳動した後、Ｅｔｈｉｄｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅで染色してＰＣＲ産物のバンドを検出し、解析ソフト（Ｉｍａｇｅ Ｊ）でバンド定量を行った。
・ｍｔ３２４３
Forward primer:TTC ACA AAG CGC CTT CCC CCG T（配列番号５）
Reverse primer:GCG ATG GTG AGA GCT AAG GTC GG（配列番号６）
反応条件は以下に示す。（２５サイクル）
Ｉｎｉｔｉａｌ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ９５℃ ５分
Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ９５℃ ３０秒
Ａｎｎｅａｌｉｎｇ ５７℃ ３０秒
Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ７２℃ ３０秒
Ｆｉｎａｌ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ７２℃ ５分
ＰＣＲ産物はＡｐａＩによる制限酵素処理を以下の如く行い解析した。ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、取扱説明書に従い精製した。精製後、ＮＡＮＯＤＲＯＰ ２０００ｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ＤＮＡの収量を測定した。測定後、ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国）ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）で増幅した反応産物をＡｐａＩによる制限酵素処理を３７℃で５時間行った。反応終了後、サンプル１５ｎｇを２％アガロースゲルで電気泳動した後、Ｅｔｈｉｄｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅで染色してＰＣＲ産物のバンドを検出し、解析ソフト（Ｉｍａｇｅ Ｊ）でバンド定量を行った。
【0121】
正常型及び変異型ｍｔＤＮＡの割合の変化を調べるために、ＣＣＣ０１９-ＴＰＰを４８、６３日間処理した３２４３Ｇ Ｌｏｗ細胞から抽出したＤＮＡを用いて、ＰＣＲ―ＲＦＬＰ法を行った結果、ＣＣＣ０１９-ＴＰＰ濃度依存的に野生型ミトコンドリアＤＮＡの割合が増加し変異型ミトコンドリアＤＮＡの割合が減少する傾向が４８、６３日間処理した両方の実験で観察された（図６）。
【0122】
ＰＩＰ－ＴＰＰによる変異ｍｔＤＮＡの減少が、ミトコンドリアの自食反応によるものであることを検討するために以下の実験を行った。３５ｍｍ ｇｌａｓｓ ｂａｓｅ ｄｉｓｈ（ＩＷＡＫＩ）にｍｔＤＮＡ変異細胞株３２４３Ｇ Ｈｉｇｈ細胞を２×１０４ｃｅｌｌｓ/ｄｉｓｈとなるように播種し、２４時間培養後に終農度１００ ｎＭとなるように処理した。処理５２時間後に４％Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ（ＰＦＡ）/ＰＢＳで３０分間室温で固定した。固定後、ＰＢＳにより洗浄し、１０％ＦＢＳ/０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ１００/ＴＢＳ（ＴＢＳＴ）で１０分間ブロッキングを行った。ＴＢＳは、終濃度１５０μＭ塩化ナトリウムと終濃度２０μＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）の混合溶液である。ブロッキング終了後、ＴＢＳＴで希釈した一次抗体を４℃で一晩反応させた。使用した一次抗体はラビット抗ＬＣ３抗体（ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ） １:２００ 希釈、マウス抗Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国） １:５００希釈を使用し、一次抗体との反応終了後、ＴＢＳにより３回洗浄し、ＴＢＳＴで希釈した二次抗体Ｇｏａｔ ａｎｔｉ ｒａｂｂｉｔ ｏｒｅｇｏｎ ｇｒｅｅｎ ４８８ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） １:１０００希釈とＧｏａｔ ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） １:１０００希釈を用い１５分間反応させた。二次抗体との反応終了後、ＴＢＳにより３回洗浄し、ＤＡＢＣＯ/ＰＶＡ封入剤（Ｓｉｇｍａ―Ａｌｄｒｉｃｈ）で封入して、共焦点レーザー顕微鏡ＳＰ８（Ｌｅｉｃａ）で観察した。
【0123】
図７に示す通り、ＣｙｔＣによりミトコンドリアが赤色に自食作用のマーカーであるＬＣ３が緑色に蛍光を示すが、ＰＩＰの処理では、自食作用が細胞質内に散見されるが、ミトコンドリアの蛍光とは全く共局在した所見は認められない。しかしＰＩＰ－ＴＰＰを処理した細胞では、細胞質に赤色と緑色が共局在することによる黄色からオレンジ色の蛍光が強く認められ、ミトコンドリアと自食作用が共局在していることが明確に観察される。このことからＰＩＰ－ＴＰＰの処理により、ミトコンドリアが自食されるマイトファジーが誘導されていることが示唆される。
【0124】
ヘアピン型のＰＩＰは、分子量が１７００前後で分子量が大きくまた固相合成におけるカップリング反応のステップが多く収率の問題も生じる。一方ミトコンドリアゲノムは、ヒトを含むほ乳類では１６．５ ｋｂ程度の単一環状であり、核内のヒトゲノムに比較して極めて小さい。このことよりＤＮＡ結合配列特異性を向上させるためのヘアピン構造を持つＭＧＢであるヘアピン型ＰＩＰを合成する必要があるのかは疑問である。また放線菌などの菌類の産生するＭＧＢは、直鎖状のものが多く、ミトコンドリアゲノムと類似する菌類や菌類の持つプラスミド等のゲノムを標的にした抗生物質であり、直鎖状であっても生物活性を得ると考えられる。直鎖状であれば分子量も小さく合成ステップも少なく、安価で動態に優れた薬物として創薬が可能と考えられる。そこで本発明における直鎖状のＰＩＰと脂溶性カチオンの複合体によるミトコンドリアゲノムの修飾方法を考案するに至り、以下の直鎖状ＰＩＰ－ＴＰＰによるミトコンドリアＤＮＡ配列特異的な生物活性効果の判定実験を行った。
【0125】
以下の式（ＸＩ）の化合物ＣＣＣ０２０は、ＣＣＣ０１８同様、ミトコンドリア病の一種であるＭＥＬＡＳやミトコンドリア糖尿病の原因変異であるミトコンドリアＤＮＡのＡ３２４３Ｇ変異配列ＧＧＧＣＣＣを標的にした直鎖型ＰＩＰであり、ミトコンドリアＤＮＡ、３２４３Ｇ変異配列に結合し、ＴＰＰとの複合体を形成することで効果的に変異ミトコンドリアのコピー数の減少を誘導する可能性が予想される。
【0126】
【化28】
【0127】
ＣＣＣ０２０－ＴＰＰの合成：
固相樹脂であるβ―ａｌａｎｉｎｅ―Ｎｏｖａ―ＰＥＧ―ｗａｎｇ ｒｅｓｉｎ（メルク）２０ｍｇを固相合成用Ｌｉｂｒａ Ｔｕｂｅ８本にそれぞれ量り取り、自動ペプチド合成機ＰＳＳＭ-８（島津製作所）にセットし、ＮＭＰ１ ｍｌずつを加えて１時間膨潤させた。次にＨＣＴＵ(ペプチド研究所)を２．０ｇと超脱水ＮＭＰ （ｗａｋｏ）１６．８ｍｌを５０ｍｌチューブに加えよく溶解させＨＣＴＵ溶液を作成した。次に２．０ｍｌ丸底エッペンドルフチュ-ブ２４本にＦｍｏｃ―Ｐｙ―ＣＯＯＨ（和光純薬)を３６．２ｍｇずつ、８本にＦｍｏｃ―Ｉｍ―ＣＯＯＨ（ｗａｋｏ）を３６．３ｍｇ、１６本にＮ-β―Ｆｍｏｃ-β―ａｌａｎｉｎｅ(メルク)３１．４ｍｇずつをそれぞれ量り取り、ＨＣＴＵ溶液をそれぞれ３００μｌずつ加え、３０分間の超音波処理により完全に溶解させＰＳＳＭ-８内にＡ１４５８２Ｇの配列（ｒｅｓｉｎ―Ｐｙ―Ｐｙ-β―ＩｍＰｙ―Ｐｙ-β）に従って各エッペンドルフチューブを設置した。次にＰＳＳＭ-８に設置したＬｉｂｒａ ｔｕｂｅのＮＭＰを吸引除去し、ＰＳＳＭ-８の合成プログラムに従い、脱保護、縮合反応、アセチルキャッピングの繰り返し反応を実行させた。チューブ１本当たりの各反応は以下のように行った。脱保護反応は３０％ピペリジン（和光純薬）/ＮＭＰ溶液１ｍｌを加えて１０分間行い、反応後０．９ｍｌのＮＭＰで５回繰り返し洗浄を行った。縮合反応は３００μｌの反応溶液にＤＩＥＡ４０μｌを加えて溶解させ、Ｎ２によるバブリングで３０分間撹拌させ、反応後、０．９ｍｌのＮＭＰで５回洗浄することで行った。アセチルキャッピングは３０％無水酢酸（和光純薬）/ＮＭＰ０．９ｍｌを加えて１０分間反応させ、反応後、０．９ｍｌのＮＭＰで5回洗浄することで行った。この繰り返し反応をＡ１４５８２Ｇの配列に従って行い、最後のβアラニンの縮合が終了した後、３０％ピペリジン/ＮＭＰ溶液０．９ ｍｌでのＦｍｏｃの脱保護を行い、０．９ｍｌのＮＭＰで５回洗浄したのちに、全ての樹脂を１５ｍｌのチューブに回収した。次に５０ｍｌチューブに（４-Ｃａｒｂｏｘｙｂｕｔｙｌ）ｔｒｉｐｈｅｎｙｌ―ｐｈａｓｐｈｏｎｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ（ＴＰＰ、シグマアルドリッチ）を３５４．４ｍｇと１-（３-Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）-３-ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＥＤＣ・ＨＣｌ メルク）を１５３．４ｍｇ量り取り、２．４ｍLの超脱水ＮＭＰを加え溶解し、溶液全てを樹脂が入ったチューブに加えた後にＮ，Ｎ―ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ （ＤＩＥＡ）を３００μｌ加え一晩振盪させた。反応後、樹脂を吸引ろ過により回収し、過剰のＮＭＰで１０回洗浄した。洗浄後、樹脂をスクリューキャップ付きの１．５ｍｌエッペンドルフチューブ４本に移し、Ｎ,Ｎ―ｄｉｍｅｔｈｙｌ-１,３-ｐｒｏｐａｎｅ ｄｉａｍｉｎｅ（Ｄｐ、和光純薬)及びＮＭＰをそれぞれ０．５ ｍｌずつ加え振盪機付きヒートブロック上で６５℃で２時間撹拌して、樹脂上からの目的化合物の脱離反応を行った。反応後、吸引ろ過により反応液を回収後、ＨＰＬＣで精製を行い(流速１０ｍｌ／ｍｉｎ、０．１％ ＡｃＯＨ／Ｈ２Ｏ―ＣＨ３ＣＮ，０－１００％ ２０分 リニアグラジエント, 波長３１０ ｎｍ)目的のフラクションを回収後エバポレーターで濃縮し、ＬＣ/ＭＳ２０２０（島津製作所）で質量分析を行った（［Ｍ＋１］+＝１２７１．５）。最後に凍結乾燥機で粉末にすることで最終生成物である以下の式（ＸＩＩ）のＣＣＣ０３３－ＴＰＰを白色の粉末として得た（図８）。
固相樹脂であるβ―ａｌａｎｉｎｅ―Ｎｏｖａ―ＰＥＧ―ｗａｎｇ ｒｅｓｉｎ（メルク）２０ｍｇを固相合成用Ｌｉｂｒａ Ｔｕｂｅ８本にそれぞれ量り取り、自動ペプチド合成機ＰＳＳＭ-８（島津製作所）にセットし、ＮＭＰ１ ｍｌずつを加えて１時間膨潤させた。次にＨＣＴＵ(ペプチド研究所)を２．０ｇと超脱水ＮＭＰ （ｗａｋｏ）１６．８ｍｌを５０ｍｌチューブに加えよく溶解させＨＣＴＵ溶液を作成した。次に２．０ｍｌ丸底エッペンドルフチュ-ブ２４本にＦｍｏｃ―Ｐｙ―ＣＯＯＨ（和光純薬)を３６．２ｍｇずつ、８本にＦｍｏｃ―Ｉｍ―ＣＯＯＨ（ｗａｋｏ）を３６．３ｍｇ、１６本にＮ-β―Ｆｍｏｃ-β―ａｌａｎｉｎｅ(メルク)３１．４ｍｇずつをそれぞれ量り取り、ＨＣＴＵ溶液をそれぞれ３００μｌずつ加え、３０分間の超音波処理により完全に溶解させＰＳＳＭ-８内にＡ１４５８２Ｇの配列（ｒｅｓｉｎ―Ｐｙ―Ｐｙ-β―ＩｍＰｙ―Ｐｙ-β）に従って各エッペンドルフチューブを設置した。次にＰＳＳＭ-８に設置したＬｉｂｒａ ｔｕｂｅのＮＭＰを吸引除去し、ＰＳＳＭ-８の合成プログラムに従い、脱保護、縮合反応、アセチルキャッピングの繰り返し反応を実行させた。チューブ１本当たりの各反応は以下のように行った。脱保護反応は３０％ピペリジン（和光純薬）/ＮＭＰ溶液１ｍｌを加えて１０分間行い、反応後０．９ｍｌのＮＭＰで５回繰り返し洗浄を行った。縮合反応は３００μｌの反応溶液にＤＩＥＡ４０μｌを加えて溶解させ、Ｎ２によるバブリングで３０分間撹拌させ、反応後、０．９ｍｌのＮＭＰで５回洗浄することで行った。アセチルキャッピングは３０％無水酢酸（和光純薬）/ＮＭＰ０．９ｍｌを加えて１０分間反応させ、反応後、０．９ｍｌのＮＭＰで5回洗浄することで行った。この繰り返し反応をＡ１４５８２Ｇの配列に従って行い、最後のβアラニンの縮合が終了した後、３０％ピペリジン/ＮＭＰ溶液０．９ ｍｌでのＦｍｏｃの脱保護を行い、０．９ｍｌのＮＭＰで５回洗浄したのちに、全ての樹脂を１５ｍｌのチューブに回収した。次に５０ｍｌチューブに（４-Ｃａｒｂｏｘｙｂｕｔｙｌ）ｔｒｉｐｈｅｎｙｌ―ｐｈａｓｐｈｏｎｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ（ＴＰＰ、シグマアルドリッチ）を３５４．４ｍｇと１-（３-Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）-３-ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＥＤＣ・ＨＣｌ メルク）を１５３．４ｍｇ量り取り、２．４ｍLの超脱水ＮＭＰを加え溶解し、溶液全てを樹脂が入ったチューブに加えた後にＮ，Ｎ―ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ （ＤＩＥＡ）を３００μｌ加え一晩振盪させた。反応後、樹脂を吸引ろ過により回収し、過剰のＮＭＰで１０回洗浄した。洗浄後、樹脂をスクリューキャップ付きの１．５ｍｌエッペンドルフチューブ４本に移し、Ｎ,Ｎ―ｄｉｍｅｔｈｙｌ-１,３-ｐｒｏｐａｎｅ ｄｉａｍｉｎｅ（Ｄｐ、和光純薬)及びＮＭＰをそれぞれ０．５ ｍｌずつ加え振盪機付きヒートブロック上で６５℃で２時間撹拌して、樹脂上からの目的化合物の脱離反応を行った。反応後、吸引ろ過により反応液を回収後、ＨＰＬＣで精製を行い(流速１０ｍｌ／ｍｉｎ、０．１％ ＡｃＯＨ／Ｈ２Ｏ―ＣＨ３ＣＮ，０－１００％ ２０分 リニアグラジエント, 波長３１０ ｎｍ)目的のフラクションを回収後エバポレーターで濃縮し、ＬＣ/ＭＳ２０２０（島津製作所）で質量分析を行った（［Ｍ＋１］+＝１２７１．５）。最後に凍結乾燥機で粉末にすることで最終生成物である以下の式（ＸＩＩ）のＣＣＣ０３３－ＴＰＰを白色の粉末として得た（図８）。
【0128】
【化29】
【0129】
ＣＣＣ０２０－ＴＰＰの細胞内局在を検討するため、以下の実験を行った。３５ｍｍ ｇｌａｓｓ ｂａｓｅ ｄｉｓｈ（ＩＷＡＫＩ）にｍｔＤＮＡ変異細胞株３２４３Ｇ Ｈｉｇｈ細胞を２×１０４ｃｅｌｌｓ/ｄｉｓｈとなるように播種し、２４時間培養後にＣＣＣ０３３-ＴＰＰ終農度２５μＭとなるように処理し、ＣＣＣ０２０-ＴＰＰ処理２４時間後に４％Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ（ＰＦＡ）/ＰＢＳで３０分間室温で固定した。固定後、ＰＢＳにより洗浄し、１０％ ＦＢＳ/０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ１００/ＴＢＳ（ＴＢＳＴ）で１０分間ブロッキングを行った。ＴＢＳは、終濃度１５０μＭ塩化ナトリウムと終濃度２０μＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）の混合溶液である。ブロッキング終了後、ＴＢＳＴで希釈した一次抗体を４℃で一晩反応させた。使用した一次抗体はラビット抗ＴＰＰ抗体（英国 ケンブリッジ大学 Dr. M. Murphyより供与） １:５００希釈、マウス抗Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国） １:５００希釈を使用し、一次抗体との反応終了後、ＴＢＳにより３回洗浄し、ＴＢＳＴで希釈した二次抗体Ｇｏａｔ ａｎｔｉ Ｒａｂｂｉｔ Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国） １:１０００希釈とＧｏａｔ ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） １:１０００希釈を用い１５分間反応させた。二次抗体との反応終了後、ＴＢＳにより３回洗浄し、ＤＡＢＣＯ/ＰＶＡ封入剤（Ｓｉｇｍａ―Ａｌｄｒｉｃｈ）で封入して、共焦点レーザー顕微鏡ＳＰ８（Ｌｅｉｃａ）で観察した。
【0130】
図９に示す通り、ミトコンドリアがＣｙｔＣの赤色蛍光で、ＣＣＣ０２０－ＴＰＰは緑色傾向で示され、共局在による黄色傾向が強く認められ、ＣＣＣ０２０－ＴＰＰがミトコンドリアに局在することが示された。
【0131】
ＣＣＣ０２０－ＴＰＰのミトコンドリアＡ３２４３Ｇ変異を持つ細胞に対する増殖抑制効果をＷＳＴ ａｓｓａｙによって評価した。９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にミトコンドリアＤＮＡ変異細胞株、正常細胞株ともに１×１０３ｃｅｌｌｓ/ｗｅｌｌとなるように播種し、２４時間培養後、ＣＣＣ０２０－ＴＰＰで終濃度０、０．１、１、１０、２０、５０μＭとなるように処理した。さらに５日間培養後、光学顕微鏡ＩＸ７１（ＯＬＹＭＰＵＳ、東京）で細胞の形態を観察した。その後Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ－８（ＤＯＪＩＮＤＯ、熊本）を使用して、取扱説明書に従い細胞生存率を算定した。対照としてＤＭＳＯ（Ｗａｋｏ）を終濃度１％で細胞に添加した。
【0132】
また、ＩＣ５０は以下の計算式を用いて算出した。
ＩＣ５０＝１０（ＬＯＧ（Ａ/Ｂ）×（５０－Ｃ）/（Ｄ―Ｃ）＋ＬＯＧ（Ｂ））
Ａ:細胞生存率５０％を挟む濃度の高い方
Ｂ:細胞生存率５０％を挟む濃度の低い方
Ｃ:細胞生存率５０％を挟む濃度の低い方における阻害率
Ｄ:細胞生存率５０％を挟む濃度の高い方における阻害率
ＣＣＣ０２０－ＴＰＰの細胞増殖に対する影響をＷＳＴ ａｓｓａｙを行った結果、変異ｍｔＤＮＡを持たないＨｅＥＢ１細胞では細胞増殖が抑制されないのに対して、変異ｍｔＤＮＡを有する３２４３Ｇ Ｌｏｗ細胞、３２４３Ｇ Ｈｉｇｈ細胞においては細胞の増殖抑制効果が顕著に認められた（図１０）。
ＩＣ５０＝１０（ＬＯＧ（Ａ/Ｂ）×（５０－Ｃ）/（Ｄ―Ｃ）＋ＬＯＧ（Ｂ））
Ａ:細胞生存率５０％を挟む濃度の高い方
Ｂ:細胞生存率５０％を挟む濃度の低い方
Ｃ:細胞生存率５０％を挟む濃度の低い方における阻害率
Ｄ:細胞生存率５０％を挟む濃度の高い方における阻害率
ＣＣＣ０２０－ＴＰＰの細胞増殖に対する影響をＷＳＴ ａｓｓａｙを行った結果、変異ｍｔＤＮＡを持たないＨｅＥＢ１細胞では細胞増殖が抑制されないのに対して、変異ｍｔＤＮＡを有する３２４３Ｇ Ｌｏｗ細胞、３２４３Ｇ Ｈｉｇｈ細胞においては細胞の増殖抑制効果が顕著に認められた（図１０）。
【0133】
ＣＣＣ０２０－ＴＰＰによる細胞増殖抑制が細胞死の誘導であることを確認するため３５ ｍｍ ｇｌａｓｓ ｂａｓｅ ｄｉｓｈ（ＩＷＡＫＩ）に３２４３Ｇ Ｈｉｇｈ細胞を５×１０４ｃｅｌｌｓ/ｄｉｓｈとなるように播種し、２４時間培養後にＣＣＣ０２０－ＴＰＰで終濃度２５μＭとなるように処理した。さらにＣＣＣ０２０－ＴＰＰを添加後、５日培養し、それぞれ４％ ＰＦＡ/ＰＢＳで３０分間室温で固定した。固定後、ＰＢＳにより洗浄し、５％ ｎｏｒｍａｌ ｇｏａｔ血清含有ＴＢＳＴで１時間ブロッキングを行った。ブロッキング終了後、ＴＢＳＴで希釈した一次抗、体ラビット抗Ｃｌｅａｖｅｄ Ｃａｓｐａｓｅ―３抗体（５日間処理の細胞：Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） １:２００を１時間反応させた。
【0134】
３２４３Ｇ Ｈｉｇｈ細胞にＣＣＣ０２０－ＴＰＰを処理し、５日後にＤＡＰＩによる核染色を行った結果、約６０％の細胞で核の断片化が起きていることが確認された（図１１－１）。次に、３２４３Ｇ Ｈｉｇｈ細胞にＣＣＣ０２０－ＴＰＰを処理し、５日後に抗Ｃｌｅａｖｅｄ Ｃａｓｐａｓｅ－３抗体による免疫蛍光染色を行った結果、ＣＣＣ０２０－ＴＰＰ処理により約半数の細胞がＣｌｅａｖｅｄ Ｃａｓｐａｓｅ－３陽性であり、アポトーシスを起こしていることが確認された（図１１－２）。
【0135】
ＣＣＣ０２０－ＴＰＰ投与による細胞増殖抑制効果の機序を解明するためｍＲＮＡレベルにおける発現解析をＲｅａｌ―ｔｉｍｅ ＰＣＲによって以下の如く解析した。６ ｃｍ ｄｉｓｈ（Ｆａｌｃｏｎ）にｍｔＤＮＡ変異細胞株（３２４３Ｇ Ｈｉｇｈ）を５×１０５ ｃｅｌｌｓ/ｄｉｓｈ、正常細胞株（ＨｅＥＢ１）を１×１０５ｃｅｌｌｓ/ｄｉｓｈとなるように播種し、２４時間培養後にＣＣＣ０２０－ＴＰＰで終濃度２５μＭとなるように処理した。さらに３日間培養後、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、取扱説明書に従いＲＮＡを抽出した。抽出後、ＮＡＮＯ ＤＲＯＰ ２０００（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆic）を用いて、ＲＮＡの収量を測定した。ＲＮＡの逆転写反応は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、1サンプルあたり５００ ｎｇのＲＮＡの逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡは超純水で５倍に希釈した。
【0136】
Ｒｅａｌ―ｔｉｍｅ ＰＣＲは、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、ｃＤＮＡサンプルの調製、ＰＣＲ反応及び解析を行った。使用したプライマーと反応条件は以下に示す。
・ＢＡＸ
Forward primer:CTG AGC AGA TCA TGA AGA CA（配列番号７）
Reverse primer:AGT TTG CTG GCA AAG TAG AA（配列番号８）
・ｐ２１
Forward primer:GCA CTC AGA GGA GGC GCC ATG TCA （配列番号９）
Reverse primer:GGA CGA GAC GAC GTC CCC TGT C（配列番号１０）
・ＭＣＬ１
Forward primer:GCT TGC TTG TTA CAC ACA CAG GTC（配列番号１１）
Reverse primer:GCA GAA CAA TCA GCA ATT TCA AGG（配列番号１２）
・ＧＡＰＤＨ（インターナルコントロール）
Forward primer:CGA CCA CTT TGT CAA GCT CA（配列番号１３）
Reverse primer:AGG GGT CTA CAT GGC AAC TG（配列番号１４）
ＰＣＲ反応条件は以下に示す。
Ｈｏｌｄｉｎｇ ｓｔａｇｅ ５０℃ ２分 →９５℃１０分
Ｃｙｃｌｉｎｇ ｓｔａｇｅ ９５℃ １５秒 → ６０℃ １分（４０サイクル）Ｍｅｌｔ Ｃｕｒｖｅ ｓｔａｇｅ ９５℃ １５秒 → ６０℃ １分 → ９５℃ １５秒→６０℃ １５秒
ＣＣＣ０２０－ＴＰＰ処理細胞を用いた細胞周期停止及びアポトーシス関連遺伝子に関して、ＨｅＥＢ１細胞及び３２４３Ｇ Ｈｉｇｈ細胞にＣＣＣ０２０－ＴＰＰを処理し、３日後に抽出したＲＮＡを用いてＲｅａｌ―ｔｉｍｅ ＰＣＲを行った結果、ｍｔＤＮＡ変異を有する３２４３Ｇ Ｈｉｇｈ細胞においては細胞周期停止関連遺伝子であるＰ２１、プロアポトーシス関連遺伝子であるＢＡＸの両遺伝子の発現が有意に上昇し、アンチアポトーシス関連遺伝子であるＭＣＬ１の発現が有意に減少した。これに対し、ｍｔＤＮＡ変異を持たないＨｅＥＢ１細胞では発現変化が認められなかった（図１２）。このことから、３２４３Ｇ Ｈｉｇｈ細胞にＣＣＣ０２０－ＴＰＰがアポトーシスを誘導していることが示唆された。
・ＢＡＸ
Forward primer:CTG AGC AGA TCA TGA AGA CA（配列番号７）
Reverse primer:AGT TTG CTG GCA AAG TAG AA（配列番号８）
・ｐ２１
Forward primer:GCA CTC AGA GGA GGC GCC ATG TCA （配列番号９）
Reverse primer:GGA CGA GAC GAC GTC CCC TGT C（配列番号１０）
・ＭＣＬ１
Forward primer:GCT TGC TTG TTA CAC ACA CAG GTC（配列番号１１）
Reverse primer:GCA GAA CAA TCA GCA ATT TCA AGG（配列番号１２）
・ＧＡＰＤＨ（インターナルコントロール）
Forward primer:CGA CCA CTT TGT CAA GCT CA（配列番号１３）
Reverse primer:AGG GGT CTA CAT GGC AAC TG（配列番号１４）
ＰＣＲ反応条件は以下に示す。
Ｈｏｌｄｉｎｇ ｓｔａｇｅ ５０℃ ２分 →９５℃１０分
Ｃｙｃｌｉｎｇ ｓｔａｇｅ ９５℃ １５秒 → ６０℃ １分（４０サイクル）Ｍｅｌｔ Ｃｕｒｖｅ ｓｔａｇｅ ９５℃ １５秒 → ６０℃ １分 → ９５℃ １５秒→６０℃ １５秒
ＣＣＣ０２０－ＴＰＰ処理細胞を用いた細胞周期停止及びアポトーシス関連遺伝子に関して、ＨｅＥＢ１細胞及び３２４３Ｇ Ｈｉｇｈ細胞にＣＣＣ０２０－ＴＰＰを処理し、３日後に抽出したＲＮＡを用いてＲｅａｌ―ｔｉｍｅ ＰＣＲを行った結果、ｍｔＤＮＡ変異を有する３２４３Ｇ Ｈｉｇｈ細胞においては細胞周期停止関連遺伝子であるＰ２１、プロアポトーシス関連遺伝子であるＢＡＸの両遺伝子の発現が有意に上昇し、アンチアポトーシス関連遺伝子であるＭＣＬ１の発現が有意に減少した。これに対し、ｍｔＤＮＡ変異を持たないＨｅＥＢ１細胞では発現変化が認められなかった（図１２）。このことから、３２４３Ｇ Ｈｉｇｈ細胞にＣＣＣ０２０－ＴＰＰがアポトーシスを誘導していることが示唆された。
【0137】
また、ＣＣＣ０２０－ＴＰＰ処理細胞の形態を光学顕微鏡で観察した結果、ＨｅＥＢ１細胞及び３２４３Ｇ Ｌｏｗ細胞においては細胞の形態変化が認められなかったのに対して、３２４３Ｇ Ｈｉｇｈ細胞において顕著にアポトーシスを起こしていると考えられる細胞が観察された。
【0138】
これらのことより、ＣＣＣ０２０－ＴＰＰは、ミトコンドリアに共局在し、３２４３Ｇ変異が少ない細胞より３２４３Ｇ変異を多く持つ細胞でアポトーシスによる細胞死をより強く誘導し、変異を持たない細胞では細胞死を誘導しないことが確認された。
【0139】
正常ミトコンドリアには、多型が存在し、その多型が疾患によっては集積することがあることが報告されている。そこで我々はミトコンドリアの健常者に存在する多型が集積した細胞においても上記実施例同様にミトコンドリア多型を認識し、細胞死を誘導できるかを検討することとした。肺がんのＡ５４９細胞は、ｍｔＤＮＡ Ａ１４５８２Ｇの多型を有する。上の「ＣＣＣ０２０－ＴＰＰの合成」に記した方法により、以下の式(ＸＩＩＩ）のＣＣＣ０２１－ＴＰＰを合成した（図１３）。
【0140】
【化30】
【0141】
ＣＣＣ０２１－ＴＰＰのＡ１４５８２ＧｍｔＤＮＡ変異を持つ細胞に対する増殖抑制効果をＷＳＴ ａｓｓａｙによって評価した。９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にミトコンドリアＤＮＡ変異細胞株Ａ５４９、及び変異を持たないＰＣ１４細胞株ともに１×１０３ｃｅｌｌｓ/ｗｅｌｌとなるように播種し、２４時間培養後、ＣＣＣ０２１－ＴＰＰで終濃度０、１、５、１０、２０、２５、５０、１００μＭとなるように処理した。さらに４日間培養後、光学顕微鏡ＩＸ７１（ＯＬＹＭＰＵＳ、東京）で細胞の形態を観察した。その後Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ－８（ＤＯＪＩＮＤＯ、熊本）を使用して、取扱説明書に従い細胞生存率を算定した。対照としてＤＭＳＯ（Ｗａｋｏ）を終濃度１％で細胞に添加した。
【0142】
また、ＩＣ５０は以下の計算式を用いて算出した。
ＩＣ５０＝１０（ＬＯＧ（Ａ/Ｂ）×（５０－Ｃ）/（Ｄ―Ｃ）＋ＬＯＧ（Ｂ））
Ａ:細胞生存率５０％を挟む濃度の高い方
Ｂ:細胞生存率５０％を挟む濃度の低い方
Ｃ:細胞生存率５０％を挟む濃度の低い方における阻害率
Ｄ:細胞生存率５０％を挟む濃度の高い方における阻害率
ＣＣＣ０２１－ＴＰＰの細胞増殖に対する影響をＷＳＴ ａｓｓａｙを行った結果、変異ｍｔＤＮＡを持たないＰＣ１４細胞では細胞増殖が抑制によるＩＣ５０を算出できなかったが、変異をもつＡ５４９細胞では細胞死が誘導され、ＩＣ５０が７８．８９μＭであった。（図１４）。
ＩＣ５０＝１０（ＬＯＧ（Ａ/Ｂ）×（５０－Ｃ）/（Ｄ―Ｃ）＋ＬＯＧ（Ｂ））
Ａ:細胞生存率５０％を挟む濃度の高い方
Ｂ:細胞生存率５０％を挟む濃度の低い方
Ｃ:細胞生存率５０％を挟む濃度の低い方における阻害率
Ｄ:細胞生存率５０％を挟む濃度の高い方における阻害率
ＣＣＣ０２１－ＴＰＰの細胞増殖に対する影響をＷＳＴ ａｓｓａｙを行った結果、変異ｍｔＤＮＡを持たないＰＣ１４細胞では細胞増殖が抑制によるＩＣ５０を算出できなかったが、変異をもつＡ５４９細胞では細胞死が誘導され、ＩＣ５０が７８．８９μＭであった。（図１４）。
【0143】
細胞増殖抑制をさらに長期間の前述のＡ５４９及びＰＣ１４細胞で観察を行った。上記の培養条件（ｍｔＤＮＡ変異細胞株Ａ５４９、及び変異を持たないＰＣ１４細胞株ともに１×１０３ ｃｅｌｌｓ/ｗｅｌｌとなるように播種し、２４時間培養後、ＣＣＣ０２１－ＴＰＰで終濃度２０μＭとなるように処理）で、８日間観察し、細胞数を計測した。
【0144】
図１５に示す通り、Ａ５４９では、ＣＣＣ００２１－ＴＰＰ処理により有意に細胞数が少なく、増殖抑制が有意であることが観察されたが、ＰＣ１４では細胞数に有意な差は認められず、細胞増殖抑制効果が認められなかった。このことからＣＣＣ００２１－ＴＰＰは標的ミトコンドリアＤＮＡ配列を有するがん細胞株で優位に細胞死を誘導し、標的ミトコンドリアＤＮＡ配列を有しないがん細胞株では有意な細胞死を誘導できず、ミトコンドリア変異配列特異的にがん細胞の細胞死を誘導すると考えられた。
[実施例２] 合成致死実験
実験に先立ち、培養細胞株Ａ５４９およびＰＣ１４でＣＣＣ０２１－ＴＰＰがミトコンドリアに局在するかをＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒＲＥＤと抗ＴＰＰ抗体を用いた免疫染色で調べた。３５ｍｍ ｇｌａｓｓ ｂａｓｅ ｄｉｓｈ（ＩＷＡＫＩ、生岡）にＡ５４９細胞を５×１０３ ｃｅｌｌｓ/ｄｉｓｈ、ＰＣ１４細胞を１×１０４ ｃｅｌｌｓ/ｄｉｓｈとなるように播種し、２４時間培養後にＣＣＣ０２１－ＴＰＰで終濃度２０μＭとなるように処理した。さらに２４時間後に培養液を除き、１００ｎＭとなるようにＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標） Ｒｅｄ ＣＭＸＲｏｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）入りのDMEM培養液を添加し、3０分後にＰＢＳで２回Ｗａｓｈ後、４％ＰＦＡで３０分固定後、ＰＢＳに置換し４℃で保存、実施例１記載の方法で免疫抗体染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡ＳＰ８（Ｌｅｉｃａ、ドイツ）で観察した。その結果、ＴＰＰとＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒＲＥＤが共局在しており、ＣＣＣ０２１－ＴＰＰがミトコンドリア内に貯留している事が判明した（図１６）。Ａ５４９およびＰＣ１４をそれぞれ９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに５×１０２ ｃｅｌｌｓずつ１６ｗｅｌｌに播種し、２４時間培養後にＣＣＣ０２１－ＴＰＰを０，１，２，５，１０，２５，５０μＭとそれぞれ２ｗｅｌｌずつ処理し、５日後にＣｙｔｏＳｅｌｅｃｔＴＭ ＭＴＴ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（コスモバイオ）を使用し、２時間室温で反応後、SPECTRAFLUOR Plus（ＴＥＣＡＮ）で５９０ｎｍの吸光度を測定し、細胞増殖の再チャレンジ実験を行った。その結果、図１７に示すＭＴＴアッセイの結果のとおり、Ａ５４９のＩＣ５０は７．９７μM、ＰＣ１４は算出不能であった（図１７）。さらにＡ５４９細胞ではＣＣＣ０２１－ＴＰＰ投与後、細胞が巨大化し、形もゆがんで細胞内に無数の空胞が生じる特徴的な形態である老化形態と考えられる細胞形態を示した（図１８）。さらに７日後、Ａ５４９細胞、ＰＣ１４細胞の生細胞数の変化をトリパンブルー染色によって生細胞数を測定し、細胞生存率を調べる実験をおこなった。トリパンブルーアッセイではＡ５４９細胞、ＰＣ１４細胞ともにｖｉａｂｉｌｉｔｙには影響を与えない事が判明し（図１９）、ＣＣＣ０２１－ＴＰＰは細胞殺傷能力を示さず、Ａ５４９細胞での細胞増殖に影響を及ぼしている事が示唆された。つまりＣＣＣ０２１－ＴＰＰではＡ５４９の細胞増殖は抑制したが、生細胞の数に変化は見られず、細胞死の誘導は認められなかったが細胞老化を示す可能性が示唆された。
[実施例２] 合成致死実験
実験に先立ち、培養細胞株Ａ５４９およびＰＣ１４でＣＣＣ０２１－ＴＰＰがミトコンドリアに局在するかをＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒＲＥＤと抗ＴＰＰ抗体を用いた免疫染色で調べた。３５ｍｍ ｇｌａｓｓ ｂａｓｅ ｄｉｓｈ（ＩＷＡＫＩ、生岡）にＡ５４９細胞を５×１０３ ｃｅｌｌｓ/ｄｉｓｈ、ＰＣ１４細胞を１×１０４ ｃｅｌｌｓ/ｄｉｓｈとなるように播種し、２４時間培養後にＣＣＣ０２１－ＴＰＰで終濃度２０μＭとなるように処理した。さらに２４時間後に培養液を除き、１００ｎＭとなるようにＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標） Ｒｅｄ ＣＭＸＲｏｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）入りのDMEM培養液を添加し、3０分後にＰＢＳで２回Ｗａｓｈ後、４％ＰＦＡで３０分固定後、ＰＢＳに置換し４℃で保存、実施例１記載の方法で免疫抗体染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡ＳＰ８（Ｌｅｉｃａ、ドイツ）で観察した。その結果、ＴＰＰとＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒＲＥＤが共局在しており、ＣＣＣ０２１－ＴＰＰがミトコンドリア内に貯留している事が判明した（図１６）。Ａ５４９およびＰＣ１４をそれぞれ９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに５×１０２ ｃｅｌｌｓずつ１６ｗｅｌｌに播種し、２４時間培養後にＣＣＣ０２１－ＴＰＰを０，１，２，５，１０，２５，５０μＭとそれぞれ２ｗｅｌｌずつ処理し、５日後にＣｙｔｏＳｅｌｅｃｔＴＭ ＭＴＴ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（コスモバイオ）を使用し、２時間室温で反応後、SPECTRAFLUOR Plus（ＴＥＣＡＮ）で５９０ｎｍの吸光度を測定し、細胞増殖の再チャレンジ実験を行った。その結果、図１７に示すＭＴＴアッセイの結果のとおり、Ａ５４９のＩＣ５０は７．９７μM、ＰＣ１４は算出不能であった（図１７）。さらにＡ５４９細胞ではＣＣＣ０２１－ＴＰＰ投与後、細胞が巨大化し、形もゆがんで細胞内に無数の空胞が生じる特徴的な形態である老化形態と考えられる細胞形態を示した（図１８）。さらに７日後、Ａ５４９細胞、ＰＣ１４細胞の生細胞数の変化をトリパンブルー染色によって生細胞数を測定し、細胞生存率を調べる実験をおこなった。トリパンブルーアッセイではＡ５４９細胞、ＰＣ１４細胞ともにｖｉａｂｉｌｉｔｙには影響を与えない事が判明し（図１９）、ＣＣＣ０２１－ＴＰＰは細胞殺傷能力を示さず、Ａ５４９細胞での細胞増殖に影響を及ぼしている事が示唆された。つまりＣＣＣ０２１－ＴＰＰではＡ５４９の細胞増殖は抑制したが、生細胞の数に変化は見られず、細胞死の誘導は認められなかったが細胞老化を示す可能性が示唆された。
【0145】
細胞老化が誘導されたかを検討するためにＳＰｉＤＥＲ－β―Ｇａｌ（ＤＯＩＮＤＯ）による老化マーカーβ-ガラクトシダーゼの活性をＣＣＣ０２１－ＴＰＰ投与後にＡ５４９細胞およびＰＣ１４細胞で判定した。３５ｍｍＤｉｓｈに１０００細胞を播種後、２４時間培養後、終濃度２０μＭとなるようＣＣＣ０２１－ＴＰＰを投与し５日間培養、Ｈａｎｋｓ‘ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ） （ｐＨ ７．３）で２度Ｗａｓｈ後、４％パラホルムアルデヒド５００μＬで室温３分処理後、再びＨＢＳＳで２度Ｗａｓｈ後ＳＰｉＤＥＲ－β―ＧａｌＷｏｒｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ５００μｌで３７℃３０分処理後、ＨＢＳＳで一度Ｗａｓｈ、ＳＰ8コンフォーカル顕微鏡で観察した。
【0146】
その結果、ＣＣＣ０２１－ＴＰＰを投与したＡ５４９細胞において、SA-β-Gal染色でβ-ガラクトシダーゼの活性の上昇を示す青色の染色が確認された（図２０）。このSA-β-Gal 染色により染色された細胞数をカウントし定量化した棒グラフを図２１に示す。
【0147】
老化した細胞では炎症性サイトカインなどの炎症関連遺伝子の発現が上昇する。このことによりＳＡＳＰ（Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ―ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ;細胞老化随伴分泌現象）と言われる現象が誘導される事が知られている。この現象がＡ５４９細胞で誘導されているかを検討するため、ＲＴ―ｑＰＣＲで実施例１と同様にＣＣＣ０２１－ＴＰＰ処理５日後、細胞を回収し、実施例１と同様にＲＮＡ抽出、ＲＮＡ逆転写、ｃＤＮＡ合成、ＲＴ―ｑＰＣＲを行い炎症性サイトカイン（ＩＬ－１Ａ、ＩＬ－１Ｂ、ＩＬ－６、ＩＬ－８）の発現をＡ５４９細胞およびＰＣ１４細胞で調べた。それぞれの遺伝子の増幅に使用したプライマーを下に示す。ｑＰＣＲはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ(登録商標） ７５００リアルタイムＰＣＲシステムを用い、５０℃ 2 ｍｉｎ →９５℃ １０ｍｉｎのＨｏｌｄｉｎｇ ｓｔａｇｅ 後、Ｃｙｃｌｉｎｇ ｓｔａｇｅ ９５℃ １５秒 →６０℃ １ｍｉｎ で４０ ｃｙｃｌｅｓの条件で増幅を行い、Ｍｅｌｔ ｃｕｒｖｅ ｓｔａｇｅ ９５℃ １５ｓｅｃ →６０℃ １ｍｉｎ → ９５℃ １５ｓｅｃ→６０℃ １５secで増幅後の解離曲線解析を行い、プライマーダイマー副産物等がＰＣＲ産物に含まれていないことで反応特異性を確認した。
【0148】
IL-1A
Forward 5’ CATTGGCGTTTGAGTCAGCA 3’（配列番号１５）
Reverse 5’ CATGGAGTGGGCCATAGCTT 3’（配列番号１６）
IL-1B
Forward 5’ CAGAAGTACCTGAGCTCGCC 3’（配列番号１７）
Reverse 5’ AGATTCGTAGCTGGATGCCG 3’（配列番号１８）
IL-6
Forward 5’ GTTGTGCAAGGGTCTGGTTT 3’（配列番号１９）
Reverse 5’ GGATGGTGTCTCTTGCAGGA 3’（配列番号２０）
IL-8
Forward 5’ ATGACTTCCAAGCTGGCCGT 3’（配列番号２１）
Reverse 5’ TCCTTGGCAAAACTGCACCT 3’（配列番号２２）
Ａ５４９細胞ではＩＬ－１Ａ、ＩＬ－８の発現が有意に上昇している事が確認され、ＩＬ－６も増加傾向にみられた。これらｑＰＣＲの結果からＣＣＣ０２１－ＴＰＰによってＳＡＳＰが誘導されている事が考えられた（図２２）。
【0149】
細胞老化を引き起こした原因として変異ミトコンドリアがＣＣＣ０２１－ＴＰＰの投与によりミトコンドリア特異的なオートファジー（マイトファジー）を誘導していると考えられる。それに伴い活性酸素の過剰産生を引き起こしたことが細胞老化の誘導に関与したと考えられる。このためＡ５４９細胞でのオートファジーを実施例１と同様に抗ＬＣ３抗体とチトクロームＣ抗体による免疫蛍光染色によりＣＣＣ０２１－ＴＰＰ２０μＭ４日間処理後に確認した。
【0150】
ＣＣＣ０２１－ＴＰＰ投与により、Ａ５４９細胞でＰＣ１４細胞に比べ抗ＬＣ３抗体による強い蛍光がみとめられ、抗ＬＣ３抗体による蛍光がチトクロームＣ抗体による蛍光と細胞内局在が一致することが確認でき、オートファジーマーカーとミトコンドリアマーカーが共局在することが観察されたことよりＡ５４９細胞にマイトファジーが誘導されたと考えられた。（図２３）
さらにマイトファジーによりＬＣ３がミトコンドリアに局在することを確認するため、蛍光蛋白ＧＦＰとＬＣ３の複合蛋白ＧＦＰ―ＬＣ３をｐＣＭＸ－ＳＡＨ/Ｙ１４５Ｆ－ＬＣ３Ｂ－ＧＦＰ発現ベクターを用いてＡ５４９細胞にトランスフェクションし、外因性のＬＣ３蛋白がオートファジー領域に集積するかを検討した。５ｘ１０４細胞を播種し、２４時間培養後、ＯｐｔｉＭＥＭ５００μＬにベクターＤＮＡ１０μｇ（Ｐ３０００ ｒｅａｇｅｎｔ７．５μＬ）に２０μＬ Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標） ３０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を加え室温５分放置しトランスフェクション、２４時間培養後、継代１０００細胞を播種し、２０μＭのＣＣＣ０２１－ＴＰＰで４日間培養後、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄによる蛍光観察により確認した。
さらにマイトファジーによりＬＣ３がミトコンドリアに局在することを確認するため、蛍光蛋白ＧＦＰとＬＣ３の複合蛋白ＧＦＰ―ＬＣ３をｐＣＭＸ－ＳＡＨ/Ｙ１４５Ｆ－ＬＣ３Ｂ－ＧＦＰ発現ベクターを用いてＡ５４９細胞にトランスフェクションし、外因性のＬＣ３蛋白がオートファジー領域に集積するかを検討した。５ｘ１０４細胞を播種し、２４時間培養後、ＯｐｔｉＭＥＭ５００μＬにベクターＤＮＡ１０μｇ（Ｐ３０００ ｒｅａｇｅｎｔ７．５μＬ）に２０μＬ Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標） ３０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を加え室温５分放置しトランスフェクション、２４時間培養後、継代１０００細胞を播種し、２０μＭのＣＣＣ０２１－ＴＰＰで４日間培養後、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄによる蛍光観察により確認した。
【0151】
蛍光蛋白との複合蛋白ＧＦＰ―ＬＣ３の緑色蛍光がＣＣＣ０２１－ＴＰＰ処理細胞でＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄの赤色蛍光と共局在し、外因性のＬＣ３がミトコンドリアに集積することが確認され、ミトコンドリアで特異的なマイトファジーが起きていると考えられた（図２４）。
【0152】
マイトファジーによる活性酸素種（ＲＯＳ）の産生誘導を確認するためＭｉｔｏＳＯＸ Ｒｅｄ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による活性酸素の産生を蛍光観察した。Ａ５４９，ＰＣ１４細胞１０４細胞を播種し１０時間培養後、ＣＣＣ０２１－ＴＰＰ１０μＭ２４時間処理後にＰＢＳで洗浄し、１３μＬのＤＭＳＯに溶解した、ＭｉｔｏＳＯＸ Ｒｅｄを終濃度５μＭになるようＰＢＳで希釈し３７℃１０分処理、ＰＢＳで洗浄後、ＳＰ８コンフォーカル顕微鏡で観察した。
【0153】
ＣＣＣ０２１－ＴＰＰ投与により、ＰＣ１４細胞ではほとんどＲＯＳ産生の促進が観察されなかったが、Ａ５４９細胞では細胞質内で過剰にＲＯＳ産生が誘導されていることが観察された（図２５）。
【0154】
ＣＣＣ０２１－ＴＰＰの投与により細胞老化がＡ５４９細胞で確認されたことより、老化細胞における細胞死（アポトーシス）の抑制機構であるＢＣＬ２、ＢＣＬ-ＸＬ、ＢＣＬ－Ｗ、ＭＤＭ２などの活性化が起こっていると考えられた。そこでアポトーシスの回避による老化細胞の維持が抗アポトーシス因子であるＢＣＬ－ＸＬ、ＢＣＬ２、Ｓｕｒｖｉｖｉｎとアポトーシス促進因子であるＢＡＸのＣＣＣ０２１－ＴＰＰ処理による発現変化についてＲＴ―ｑＰＣＲで上記のようにＣＣＣ０２１－ＴＰＰ処理５日後、細胞を回収し、実施例１と同様にＲＮＡ抽出、ＲＮＡ逆転写、ｃＤＮＡ合成、ＲＴ―ｑＰＣＲを行いアポトーシス関連因子（ＢＣＬ－ＸＬ、ＢＣＬ２、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＢＡＸ）の発現をＡ５４９細胞およびＰＣ１４細胞で調べた。それぞれの遺伝子の増幅に使用したプライマーを下記に示す。ｑＰＣＲはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標） ７５００リアルタイムＰＣＲシステムを用い、５０℃ 2 ｍｉｎ →９５℃ 10ｍｉｎの Ｈｏｌｄｉｎｇ ｓｔａｇｅ 後、Ｃｙｃｌｉｎｇ ｓｔａｇｅ ９５℃ １５ｓｅｃ →６０℃ 1ｍｉｎ で４０ ｃｙｃｌｅｓの条件で増幅を行い、Ｍｅｌｔ ｃｕｒｖｅ ｓｔａｇｅ ９５℃ １５ｓｅｃ →６０℃ １ｍｉｎ → ９５℃ １５ｓｅｃ→６０℃ １５secで増幅後の解離曲線解析を行い、プライマーダイマー副産物等がＰＣＲ産物に含まれていないことで反応特異性を確認した。
【0155】
BCL-XL
Forward 5‘ CGGTACCGGCGGGCATTCAG 3’（配列番号２３）
Reverse 5‘ CGGCTCTCGGCTGCTGCATT 3’（配列番号２４）
BAX
Forward 5‘ CTGAGCAGATCATGAAGACA 3’（配列番号２５）
Reverse 5‘ AGTTTGCTGGCAAAGTAGAA 3’（配列番号２６）
BCL2
Forward 5‘ CTTTGAGTTCGGTGGGGTCA 3’（配列番号２７）
Reverse 5‘ GGGCCGTACAGTTCCACAAA 3’（配列番号２８）
Survivin
Forward 5‘ GGACCACCGCATCTCTACAT 3’（配列番号２９）
Reverse 5‘ GTTCCTCTATGGGGTCGTCA 3’（配列番号３０）
アポトーシス阻害経路では、上流でＢＣＬ－２、ＢＣＬ－ＸＬ、下流でＳｕｒｖｉｖｉｎが働いている。ＣＣＣ０２１－ＴＰＰ処理したＡ５４９細胞において、上流の抗アポトーシス因子であるＢＣＬ－ＸＬの発現が上昇している事が判明した（図２６）。このことでアポトーシスへの移行を妨げている事が示唆された。しかしながら、アポトーシス促進因子であるＢＡＸの上昇と下流のＳｕｒｖｉｖｉｎの減少も同時に確認され、細胞死の誘導と阻害が拮抗している状態である可能性が示唆された。
【0156】
Ａ５４９細胞の細胞老化における細胞死の抑制がＢＣＬ経路によると考えられたため、ＣＣＣ０２１－ＴＰＰによって細胞老化が誘引された細胞をｓｅｎｏｌｙｔｉｃ ｄｒｕｇｓ 老化細胞除去薬でありＢＣＬ経路阻害剤であるＡＢＴ－２６３（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を併用することでアポトーシスに誘導できると考え、ＣＣＣ０２１－ＴＰＰ処理およびＢＣＬ２，ＢＣＬ－ＸＬ阻害剤であるＡＢＴ－２６３併用で老化細胞に細胞死を導くことが出来るか光学顕微鏡で観察し、細胞形態の変化を観察した。９６wellプレートにＡ５４９細胞５００細胞を播種し２４時間培養後、非投与および２０μＭのＣＣＣ０２１-ＴＰＰおよび１０μＭのＡＢＴ－２６３でそれぞれ単独と併用投与後経時的光学顕微鏡で観察し、２日目と４日目の細胞形態を撮影した。
【0157】
ＤＭＳＯコントロール、ＡＢＴ-２６３処理のみ、ＣＣＣ０２１－ＴＰＰ処理のみの細胞ではアポトーシスを起こした細胞は検出されなかったが、ＣＣＣ０２１－ＴＰＰとＡＢＴ－２６３の二剤併用処理したＡ５４９細胞では、明らかにアポトーシスを起こした細胞が投与２日後には既に認められ、４日後にはさらに顕著に観察された（図２７）。
【0158】
Ａ５４９細胞の細胞老化における細胞死の抑制がＢＣＬ経路によると考えられることをＢＣＬ２およびＢＣＬ－ＸＬ特異的阻害剤で確認し、どのＢＣＬ経路阻害を併用することでＡ５４９細胞に老化細胞に細胞死アポトーシスを誘導できるかを検討した。９６ｗｅｌｌプレートにＡ５４９細胞５００細胞を播種し２４時間培養後、非投与ＤＭＳＯ処理およびＣＣＣ０２１－ＴＰＰ２０μＭおよびＢＣＬ２阻害剤であるＡＢＴ－１９９ （図５５－１０の３３番の化合物Ｖｅｎｅｔｏｃｌａｘ)１０μＭ、ＢＣＬ－ＸＬ阻害剤であるＡ１１５５４６３（図５５－６の１６番の化合物）１０μＭ単独処理および同濃度のＣＣＣ０２１－ＴＰＰに同濃度のＡＢＴ－１９９もしくはＡ１１５５４６３を併用処理4日後に光学顕微鏡で、細胞形態の変化を撮影した。
【0159】
ＤＭＳＯコントロール、ＣＣＣ０２１－ＴＰＰ、ＡＢＴ－１９９、Ａ１１５５４６３、ＡＢＴ－１９９とＣＣＣ０２１－ＴＰＰ併用投与4日後では、細胞死を示す所見は認められないが、Ａ１１５５４６３とＣＣＣ０２１－ＴＰＰ併用処理では矢印で示すアポトーシスを起こした細胞、および平坦で大きな形態を示す老化様の形態の細胞が顕著に増加していることが観察された（図５６）。
[実施例３] 皮膚透過性確認実験
非近交系マウスＩＣＲは、オリエンタル酵母より購入、分子量１２７４．７の単鎖型ＰＩＰ－ＴＰＰ（ＣＣＣ１４９-ＴＰＰ）を用いてマウス背部への投与実験を行った。５週齢のＩＣＲマウスの背部皮膚を剃毛し、毛周期に至っていないことを確認後６週齢で図２８の通り背部４カ所にそれぞれ、ＰＩＰ－ＴＰＰを含まないＤＭＳＯの塗布、３０ ｍｇ/ｃｍ２ となるよう調整した（ＤＭＳＯ溶解、９５％ ＤＭＳＯ/５％ Ｌａｕｒｏｃａｐｒａｍ（経皮吸収促進剤）溶解および角質層除去後２４時間に９５％ ＤＭＳＯ/５％ Ｌａｕｒｏｃａｐｒａｍ溶解）ＰＩＰ－ＴＰＰをそれぞれ塗布し、１８時間後にマウスを安楽死し、皮膚組織を取得、４％パラホルムアルデヒド固定後にパラフィンブロックを作成、抗ＴＰＰ抗体による免疫組織染色とＤＡＰＩ染色による核の同時染色を行い、皮皮膚及び細胞への皮下組織内への薬剤皮膚透過性を検証した。
[実施例３] 皮膚透過性確認実験
非近交系マウスＩＣＲは、オリエンタル酵母より購入、分子量１２７４．７の単鎖型ＰＩＰ－ＴＰＰ（ＣＣＣ１４９-ＴＰＰ）を用いてマウス背部への投与実験を行った。５週齢のＩＣＲマウスの背部皮膚を剃毛し、毛周期に至っていないことを確認後６週齢で図２８の通り背部４カ所にそれぞれ、ＰＩＰ－ＴＰＰを含まないＤＭＳＯの塗布、３０ ｍｇ/ｃｍ２ となるよう調整した（ＤＭＳＯ溶解、９５％ ＤＭＳＯ/５％ Ｌａｕｒｏｃａｐｒａｍ（経皮吸収促進剤）溶解および角質層除去後２４時間に９５％ ＤＭＳＯ/５％ Ｌａｕｒｏｃａｐｒａｍ溶解）ＰＩＰ－ＴＰＰをそれぞれ塗布し、１８時間後にマウスを安楽死し、皮膚組織を取得、４％パラホルムアルデヒド固定後にパラフィンブロックを作成、抗ＴＰＰ抗体による免疫組織染色とＤＡＰＩ染色による核の同時染色を行い、皮皮膚及び細胞への皮下組織内への薬剤皮膚透過性を検証した。
【0160】
図２９に単鎖型ＰＩＰ－ＴＰＰ（ＣＣＣ１４９－ＴＰＰ）の構造式を示す。図３０にＣＣＣ１４９－ＴＰＰのＨＰＬＣ及び質量解析の結果を示す。図３１に示す通りＤＭＳＯ単独では抗ＴＰＰ抗体で染色は認められなかったが、ＣＣＣ１４９－ＴＰＰは皮膚基底膜細胞に存在し、経皮吸収促進剤を用いると皮下組織の細胞核周囲にＴＰＰの染色が認められ、角質層除去および経皮吸収促進剤を用いることでさらに皮下組織、筋層までの染色がより鮮明に認められた。このことより、ＰＩＰ－ＴＰＰは皮膚透過性を示すことが確認出来、経皮吸収型製剤化した治療法の開発が可能となると想起された。
【0161】
【化31】
【0162】
[実施例４] ライブラリー化とその合成
ライブラリー化合物の合成の一例としてＤｐ－Ｐｙ－Ｐｙ－ＴＰＰの合成法を図３２に記す。
ライブラリー化合物の合成の一例としてＤｐ－Ｐｙ－Ｐｙ－ＴＰＰの合成法を図３２に記す。
【0163】
実施例１と同様に固相合成により固相樹脂からβアラニンを介して伸長させた２つ以上のヘテロ環化合物のＮ末端にＢｏｃで保護されたβアラニンを付加した図３２の化合物１を合成したのち、Ｃ末端がカルボン酸になるよう処理し図３２の化合物2を合成する。２を単離したのち、縮合剤としてN,N-ジメチル-1,3-プロパンジアミンを用いて反応させ、図３２の化合物３を合成する。その後、Ｎ末端の保護基を除去し図３２の化合物４を得た後、（３－Ｃａｒｂｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ （ＴＰＰ）を縮合剤として用いて反応させ目的の図３２の化合物５を得、HPLCを用いて精製した。
【0164】
図３３にライブラリー化合物、２環状構造化合物から８環状化合物を示す。２環状構造化合物は４つの化合物が合成でき、３に環状構造化合物は８つの化合物が合成でき、４環状構造化合物はβアラニンを挿入することで４つの４環状構造化合物にそれぞれ１６化合物が合成でき、５環状構造化合物はβアラニンを挿入することで４つの５環状構造化合物にそれぞれ３２化合物が合成できる。６環状構造化合物はβアラニンを１つ以上挿入することで６４化合物がそれぞれ合成できる。７環状構造化合物も同様でありβアラニンを１つ含んだ想定できる化合物でそれぞれ１２８化合物が合成できる。８環状構造化合物も同様でありβアラニンを１つ以上含んだ想定できる化合物でそれぞれ２５６化合物が合成できる。
【0165】
９環状構造化合物以上も同様にして合成が可能である。
【0166】
化合物の合成および分析例を下記に示す。
【0167】
図３４には合成した２環状構造化合物ＣＣＣ１０２-ＴＰＰの構造を示す。
【0168】
図３５にＣＣＣ１０２-ＴＰＰの高速液体クロマトグラフィーおよび質量分析の結果を示す。
【0169】
図３６には合成した３環状構造化合物ＣＣＣ１０６-ＴＰＰの構造を示す。
【0170】
図３７にＣＣＣ１０６-ＴＰＰの高速液体クロマトグラフィーおよび質量分析の結果を示す。
【0171】
図３８には合成した４環状構造化合物ＣＣＣ１１４-ＴＰＰの構造を示す。
【0172】
図３９にＣＣＣ１１４-ＴＰＰの高速液体クロマトグラフィーおよび質量分析の結果を示す。
【0173】
図４０には合成した５環状構造化合物ＣＣＣ１７５-ＴＰＰの構造を示す。
【0174】
図４１にＣＣＣ１７５-ＴＰＰの高速液体クロマトグラフィーおよび質量分析の結果を示す。
【0175】
図４２には合成した６環状構造化合物ＣＣＣ２０６-ＴＰＰの構造を示す。
【0176】
図４３にＣＣＣ２０６-ＴＰＰの高速液体クロマトグラフィーおよび質量分析の結果を示す。
【0177】
図４４には合成した７環状構造化合物ＣＣＣ１２８３-ＴＰＰの構造を示す。
【0178】
図４５にＣＣＣ１２８３-ＴＰＰの高速液体クロマトグラフィーおよび質量分析の結果を示す。
【0179】
図４６には合成した８環状構造化合物ＣＣＣ１３９４-ＴＰＰの構造を示す。
【0180】
図４７にＣＣＣ１３９４-ＴＰＰの高速液体クロマトグラフィーおよび質量分析の結果を示す。
【0181】
【化32】
【0182】
【化33】
【0183】
【化34】
【0184】
【化35】
【0185】
【化36】
【0186】
【化37】
【0187】
【化38】
【0188】
【0189】
ミトコンドリアＮＤ１遺伝子の Ｔ４２１６Ｃ変異を認識できる化合物であり、子宮頸がん細胞株Ｃ３３Ａ がその変異を有する。同じ子宮頸がん細胞株で野生型のＨｅＬａ 細胞との細胞増殖アッセイを実施例１と同様に行った。９６ｗｅｌｌプレートに１０００細胞を播種、ＣＣＣ１２８３－ＴＰＰは、０．５、１，５，１０，２０μＭを投与し５日後にＷＳＴアッセイを行った。
【0190】
図４８に示す通り、ＣＣＣ１２８３－ＴＰＰ（直鎖型ＰＩＰ）はＨｅＬａ細胞の増殖は抑制しなかったが、Ｃ３３Ａでは増殖抑制傾向が観察された。
【0191】
１０環状構造化合物ＣＣＣｈ５３１－ＴＰＰの実施例を示す。
ミトコンドリアＮＤ１遺伝子のＴ４２１６Ｃ変異を認識できる化合物であり、子宮頸がん細胞株Ｃ３３Ａ がその変異を有する。同じ子宮頸がん細胞株で野生型のＨｅＬａ 細胞との細胞増殖アッセイを実施例１と記載同様に行った。９６ｗｅｌｌプレートに１０００細胞を播種、ＣＣＣｈ５３１－ＴＰＰは、０．５、１，５，１０，２０μＭを投与し５日後にＷＳＴアッセイを行った。
ミトコンドリアＮＤ１遺伝子のＴ４２１６Ｃ変異を認識できる化合物であり、子宮頸がん細胞株Ｃ３３Ａ がその変異を有する。同じ子宮頸がん細胞株で野生型のＨｅＬａ 細胞との細胞増殖アッセイを実施例１と記載同様に行った。９６ｗｅｌｌプレートに１０００細胞を播種、ＣＣＣｈ５３１－ＴＰＰは、０．５、１，５，１０，２０μＭを投与し５日後にＷＳＴアッセイを行った。
【0192】
図４９に１０環状構造化合物ＣＣＣ５３１－ＴＰＰの構造を示す。
【0193】
図５０にＣＣＣｈ５３１－ＴＰＰの高速液体クロマトグラフィー分析および質量分析の結果を示す。
【0194】
図５１に示す通り、またＣＣＣｈ５３１－ＴＰＰ（ヘアピン型）はＨｅＬａ細胞でＩＣ５０＝１１．８２μＭ、Ｃ３３ＡではＩＣ５０＝３．３４μＭとＣ３３Ａで強い増殖抑制を認めた。
【0195】
【化39】
【0196】
体細胞での後天性のミトコンドリア変異ではなく、ヒト集団に認められるミトコンドリア遺伝子ＡＴＰ６の Ａ８８６０Ｇ 多型に対する１０環状構造化合物ＣＣＣｈ５６０－ＴＰＰについて、この多型をホモプラスミーで有するがん細胞株Ｃ３３Ａ、ＨｅLａ、Ｓｉｈａ、Ｃａｓｋｉ、ＭＥ１８０および ヒト非腫瘍皮膚由来線維芽細胞ＨＤＦ 細胞についてミトコンドリアＤＮＡ多型に対する化合物５日間処理においても細胞増殖抑制が認められるかについて細胞増殖アッセイを実施例１の記載同様に行って検討した。９６ｗｅｌｌプレートに１０００細胞を播種、ＣＣＣｈ５６０－ＴＰＰは、０．５、１，５，１０，２０μＭを投与し５日後にＷＳＴアッセイを行った。
【0197】
図５２に１０環状構造化合物ＣＣＣｈ５６０－ＴＰＰの構造を示す。
【0198】
図５３にＣＣＣｈ５６０－ＴＰＰの高速液体クロマトグラフィー分析および質量分析の結果を示す。
【0199】
図５４に示す通り、ＣＣＣｈ５６０－ＴＰＰはヒト非腫瘍細胞ＨＤＦ（ヒト皮膚繊維芽細胞）では増殖を抑制する傾向は認められたがＩＣ５０を算出できなかった。しかし腫瘍細胞株Ｃ３３Ａ, Ｈｅｌａ, Ｓｉｈａ, Ｃａｓｋｉ, ＭＥ１８０ではそれぞれＩＣ５０＝１．６５、７．７５、１２．６、５．５、３．２４μＭと腫瘍細胞で有意に強い増殖抑制が認められた。
【0200】
【化40】
【0201】
[実施例６] 植物生細胞透過実験
脂溶性カチオンであるＴＰＰ及びその複合体が葉緑体、酵母へ透過し、植物へ影響することが報告されている（非特許文献４、５）が、ＤＮＡ認識化合物とＴＰＰの複合体が植物生細胞内へ送達されることは明らかにされていない。ＦＩＴＣ蛍光色素でラベルしたＣＣＣ１０５－ＴＰＰを用いてシロイロナズナの根及び葉を用いて植物生細胞内への透過性を検討した。
脂溶性カチオンであるＴＰＰ及びその複合体が葉緑体、酵母へ透過し、植物へ影響することが報告されている（非特許文献４、５）が、ＤＮＡ認識化合物とＴＰＰの複合体が植物生細胞内へ送達されることは明らかにされていない。ＦＩＴＣ蛍光色素でラベルしたＣＣＣ１０５－ＴＰＰを用いてシロイロナズナの根及び葉を用いて植物生細胞内への透過性を検討した。
【0202】
図５７にＦＩＴＣ－ＣＣＣ１０５－ＴＰＰの構造式を示す。
【0203】
図５８にＦＩＴＣ－ＣＣＣ１０５－ＴＰＰの高速液体クロマトグラフィー分析および質量分析の結果を示す。
【0204】
シロイヌナズナＣｏｌ－０の主根を切断し、１/２ ＭＳ 培地０．０５％ ＭＥＳ （ｐＨ５．７）に７００ ｎＭのＦＩＴＣ－ＣＣＣ１０５－ＴＰＰ（ＤＭＳＯ 終濃度 ０．１％）を加え３時間培養後，ＭｉｌｉＱ水で２度洗浄し、蛍光顕微鏡で観察した。発芽後４日の根は１/２ ＭＳ 培地に７００ ｎＭのＦＩＴＣ－ＣＣＣ１０５－ＴＰＰ（ＤＭＳＯ 終濃度 ０．１％）を加え３時間培養後，ＭｉｌｉＱ水で２度洗浄し、蛍光顕微鏡で同様の観察を行った。
【0205】
図５９のＡに主根でのＦＩＴＣ蛍光を示す。主根細胞内に強い蛍光強度を示す球状の核（破線矢印）および細胞質内にも蛍光が観察された（実線矢印）、Ｂに発芽後４日の根の蛍光像を示す。細胞内核（破線矢印）と細胞質に蛍光（実線矢印）を示す領域が観察された。
【0206】
２週齢のＨ２Ｂ(ヒストンＨ２Ｂ)―ＧＦＰ発現シロイヌナズナの葉を切断し、１/２ ＭＳ 培地 に700 ｎＭのＦＩＴＣ－ＣＣＣ１０５－ＴＰＰ(ＤＭＳＯ 終濃度 ０．１％)に１６時間処理後，ＭｉｌｉＱ水で２度洗浄し、蛍光顕微鏡で観察した。
【0207】
図６０のＡに葉でのＨ２ＢによるＧＦＰ蛍光が葉の核に認められていることが観察される。ＢにＣＣＣ１０５－ＴＰＰによるＦＩＴＣの蛍光が葉の核に観察されている。
【0208】
ＦＩＴＣ－ＣＣＣ１０５－ＴＰＰが細胞壁をもつ植物で細胞内の核および細胞質内に透過することが確認されたことより植物等細胞壁を有する生物への効果も期待される。
【産業上の利用可能性】
【0209】
本発明の複合体は、二重膜構造細胞内小器官ＤＮＡの配列を認識し、ミトコンドリア自食反応を促し、変異ミトコンドリアコピー数の減少及び変異ミトコンドリアを有する細胞の細胞死を誘導し、ミトコンドリア関連疾患等の医薬組成物の有効成分として用いることができる。
【配列表フリーテキスト】
【0210】
配列番号１～３０ プライマー
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図1-1】
【図1-2】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11-1】
【図11-2】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33-1】
【図33-2】
【図33-3】
【図33-4】
【図33-5】
【図33-6】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【図44】
【図45】
【図46】
【図47】
【図48】
【図49】
【図50】
【図51】
【図52】
【図53】
【図54】
【図55-1】
【図55-2】
【図55-3】
【図55-4】
【図55-5】
【図55-6】
【図55-7】
【図55-8】
【図55-9】
【図55-10】
【図55-11】
【図56】
【図57】
【図58】
【図59】
【図60】
【配列表】