【図1A】 図１Ａ～Ｂは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を図示する。図１Ａは、ｇＲＮＡを含むＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を図示する。

【図1B】 図１Ｂは、ｓｇＲＮＡを含むＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を図示する。

【図2A】 図２Ａ～Ｃは、１０個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについての標的ＤＮＡ配列、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列、およびｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖（reverse strand）を示す。図２Ａは、１０個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについての標的ＤＮＡ配列を示す。

【図2B】 図２Ｂは、１０個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについての単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列を示す。

【図2C】 図２Ｃは、１０個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについてのｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖を示す。

【図2D】 図２Ｄ～Ｆは、４個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについての、標的ＤＮＡ配列、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列およびｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖を示す。図２Ｄは、４個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについての標的ＤＮＡ配列を示す。

【図2E】 図２Ｅは、４個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについての単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列を示す。

【図2F】 図２Ｆは、４個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについての、ｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖を示す。

【図2G】 図２Ｇ～Ｉは、１個のｓｇＲＮＡ配列についての、標的ＤＮＡ配列、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列およびｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖を示す。図２Ｇは、１個のｓｇＲＮＡ配列についての標的ＤＮＡ配列を示す。

【図2H】 図２Ｈは、１個のｓｇＲＮＡ配列についての単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列を示す。

【図2I】 図２Ｉは、１個のｓｇＲＮＡ配列についての、ｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖を示す。

【図3】 図３は、野生型ロドプシン遺伝子をターゲティングするｇＲＮＡのオンターゲット編集効率および変異体Ｐ２３Ｈロドプシン遺伝子をターゲティングするｓｇＲＮＡのオフターゲット編集効率を示す。

【図4】 図４は、変異体Ｐ２３Ｈロドプシン遺伝子をターゲティングするｓｇＲＮＡのオンターゲット編集効率およびオフターゲット編集効率を示す。

【図5A】 図５Ａ～Ｄは、ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９バージョン１（ｓＥＦ１αプロモーター）、ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９バージョン２（ｓＥＦ１αプロモーター）、非－ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９（ｓＥＦ１αプロモーター）ならびにｐＳＩＡ０１０およびｐＳＩＡ０１１のＡＡＶ配列の構造的配置を示す。図５Ａは、ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９バージョン１（ｓＥＦ１αプロモーター）の構造的配置を示す。

【図5B】 図５Ｂは、ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９バージョン２（ｓＥＦ１αプロモーター）の構造的配置を示す。

【図5C】 図５Ｃは、非－ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９（ｓＥＦ１αプロモーター）の構造的配置を示す。

【図5D】 図５Ｄは、ｐＳＩＡ０１０およびｐＳＩＡ０１１のＡＡＶ配列の構造的配置を示す。ｐＳＩＡ０１０は、配列番号５２９０を含むｓｇＲＮＡをコードするＡＡＶ配列を含むプラスミドである。ｐＳＩＡ０１１は、配列番号５２９１を含むｓｇＲＮＡをコードするＡＡＶ配列を含むプラスミドである。

【図6A-D】 図６Ａ～Ｎは、Ｐ２３Ｈ ２０マー（mer）ｓｇＲＮＡ（配列番号５２９０を含むｓｇＲＮＡ）をコードするＡＡＶ配列を含むプラスミドである、ｐＳＩＡ０１０、またはＰ２３Ｈ １９マーｓｇＲＮＡ（配列番号５２９１を含むｓｇＲＮＡ）をコードするＡＡＶ配列を含むプラスミドである、ｐＳＩＡ０１１、および（１）ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９バージョン１（ｓＥＦ１αプロモーター）、（２）ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９バージョン２（ｓＥＦ１αプロモーター）または（３）非－ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９（ｓＥＦ１αプロモーター）、のいずれかで共トランスフェクトされている２つの異なるＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞株についてのフローサイトメトリーデータを示す。図６Ａは、Ｃａｓ９標的部位として野生型ＲＨＯ遺伝子を有し、（１）ｐＳＩＡ０１０および（２）ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９バージョン１（ｓＥＦ１α）で共トランスフェクトされているＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞についてのフローサイトメトリーデータを示す。図６Ｂは、Ｃａｓ９標的部位として野生型ＲＨＯ遺伝子を有し、（１）ｐＳＩＡ０１１および（２）ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９バージョン１（ｓＥＦ１α）で共トランスフェクトされているＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞についてのフローサイトメトリーデータを示す。図６Ｃは、Ｃａｓ９標的部位としてＰ２３Ｈ変異を有し、（１）ｐＳＩＡ０１０および（２）ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９バージョン１（ｓＥＦ１α）で共トランスフェクトされているＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞についてのフローサイトメトリーデータを示す。図６Ｄは、Ｃａｓ９標的部位としてＰ２３Ｈ変異を有し、（１）ｐＳＩＡ０１１および（２）ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９バージョン１（ｓＥＦ１α）で共トランスフェクトされているＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞についてのフローサイトメトリーデータを示す。

【図6E-H】 図６Ｅは、Ｃａｓ９標的部位として野生型ＲＨＯ遺伝子を有し、（１）ｐＳＩＡ０１０および（２）ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９バージョン２（ｓＥＦ１α）で共トランスフェクトされているＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞についてのフローサイトメトリーデータを示す。図６Ｆは、Ｃａｓ９標的部位として野生型ＲＨＯ遺伝子を有し、（１）ｐＳＩＡ０１１および（２）ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９バージョン２（ｓＥＦ１α）で共トランスフェクトされているＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞についてのフローサイトメトリーデータを示す。図６Ｇは、Ｃａｓ９標的部位としてＰ２３Ｈ変異を有し、（１）ｐＳＩＡ０１０および（２）ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９バージョン２（ｓＥＦ１α）で共トランスフェクトされているＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞についてのフローサイトメトリーデータを示す。図６Ｈは、Ｃａｓ９標的部位としてＰ２３Ｈ変異を有し、（１）ｐＳＩＡ０１１および（２）ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９バージョン２（ｓＥＦ１α）で共トランスフェクトされているＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞についてのフローサイトメトリーデータを示す。

【図6I-N】 図６Ｉは、Ｃａｓ９標的部位として野生型ＲＨＯ遺伝子を有し、（１）ｐＳＩＡ０１０および（２）非－ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９（ｓＥＦ１α）で共トランスフェクトされているＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞についてのフローサイトメトリーデータを示す。図６Ｊは、Ｃａｓ９標的部位として野生型ＲＨＯ遺伝子を有し、（１）ｐＳＩＡ０１１および（２）非－ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９（ｓＥＦ１α）で共トランスフェクトされているＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞についてのフローサイトメトリーデータを示す。図６Ｋは、Ｃａｓ９標的部位として野生型ＲＨＯ遺伝子を有し、いかなるＤＮＡでもトランスフェクトされないＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞についてのフローサイトメトリーデータを示す。図６Ｌは、Ｃａｓ９標的部位としてＰ２３Ｈ変異を有し、（１）ｐＳＩＡ０１０および（２）非－ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９（ｓＥＦ１α）で共トランスフェクトされているＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞についてのフローサイトメトリーデータを示す。図６Ｍは、Ｃａｓ９標的部位としてＰ２３Ｈ変異を有し、（１）ｐＳＩＡ０１１および（２）非－ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９（ｓＥＦ１α）で共トランスフェクトされているＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞についてのフローサイトメトリーデータを示す。図６Ｎは、Ｃａｓ９標的部位としてＰ２３Ｈ変異を有し、いかなるＤＮＡでもトランスフェクトされないＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞についてのフローサイトメトリーデータを示す。

【図7A】 図７Ａ～Ｂは、Ｐ２３Ｈ ２０マーｓｇＲＮＡ（配列番号５２９０を含むｓｇＲＮＡ）をコードするＡＡＶ配列を含むプラスミドである、ｐＳＩＡ０１０、またはＰ２３Ｈ １９マーｓｇＲＮＡ（配列番号５２９１を含むｓｇＲＮＡ）をコードするＡＡＶ配列を含むプラスミドである、ｐＳＩＡ０１１、および（１）ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９バージョン１（ｓＥＦ１αプロモーター）、（２）ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９バージョン２（ｓＥＦ１αプロモーター）または（３）非－ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９（ｓＥＦ１αプロモーター）、のいずれかで共トランスフェクトされている２つの異なるＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞株についてのウエスタンブロットデータを示す。図７Ａは、Ｃａｓ９標的部位として野生型ＲＨＯ遺伝子を有するＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞におけるＳａＣａｓ９、アクチンおよびＧＦＰ発現を示すウエスタンブロットである。これらのＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞は、ｐＳＩＡ０１０またはｐＳＩＡ０１１のいずれかでトランスフェクトされている。ＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞はまた、（１）ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９バージョン１（ｓＥＦ１αプロモーター）、（２）ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９バージョン２（ｓＥＦ１αプロモーター）、または（３）非－ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９（ｓＥＦ１αプロモーター）のいずれかでトランスフェクトされている。

【図7B】 図７Ｂは、Ｃａｓ９標的部位としてＰ２３Ｈ変異を有するＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞におけるＳａＣａｓ９、アクチンおよびＧＦＰ発現を示すウエスタンブロットである。これらのＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞は、ｐＳＩＡ０１０またはｐＳＩＡ０１１のいずれかでトランスフェクトされている。ＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞はまた、（１）ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９バージョン１（ｓＥＦ１αプロモーター）、（２）ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９バージョン２（ｓＥＦ１αプロモーター）、または（３）非－ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９（ｓＥＦ１αプロモーター）のいずれかでトランスフェクトされている。

【図8】 図８は、青色蛍光タンパク質へと融合されたＣａｓ９標的部位（Ｐ２３Ｈ変異を含む野生型ＲＨＯ遺伝子またはＲＨＯ遺伝子のいずれか）を含むドナープラスミドを示す。

【図9A】 図９Ａ～Ｂは、相同組換え修復（ＨＤＲ）を介してゲノムＤＮＡへと導入されたＰ２３Ｈ変異およびヒトロドプシン遺伝子のコドン２３の一塩基変異（single nucleotide mutation）を示す。図９ＡはＨＤＲを介してゲノムＤＮＡへと導入されたＰ２３Ｈ変異を示す。

【図9B】 図９Ｂは、ヒトロドプシン遺伝子のコドン２３での一塩基変異を示す。

【図10】 図１０は、野生型ロドプシン遺伝子をターゲティングする合成ｓｇＲＮＡのオンターゲット／オフターゲット編集効率およびＰ２３Ｈ変異体ロドプシン遺伝子をターゲティングする合成ｓｇＲＮＡのオンターゲット／オフターゲット編集効率を記載する。

【図11】 図１１は、Ｐ２３Ｈ変異体ロドプシン遺伝子をターゲティングするｓｇＲＮＡをコードするプラスミドのオンターゲット／オフターゲット編集効率を記載する。

【図12】 図１２は、Ｐ２３Ｈ変異体ロドプシン遺伝子をターゲティングするｓｇＲＮＡをコードするプラスミドのオンターゲット／オフターゲット編集効率を記載する。

【図13】 図１３は、非－ＳＩＮ ＡＡＶ－ＳａＣａｓ９およびｐＳＩＡ０１０が網膜下注射を介してＰ２３Ｈ－ｈＲＨＯ－ＲＦＰマウスおよび対照ｈＲＨＯ－ＧＦＰマウスへと送達されたｉｎ ｖｉｖｏ実験を示す。