特許 7522804 分子分析及び同定のための方法及び装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-07-17

(45)【発行日】2024-07-25

(54)【発明の名称】分子分析及び同定のための方法及び装置

(51)【国際特許分類】

   G01N 27/00 20060101AFI20240718BHJP

   G01N 37/00 20060101ALI20240718BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20240718BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20240718BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALN20240718BHJP

【ＦＩ】

G01N27/00 Z

G01N37/00 101

C12M1/00 A

C12N15/09 Z

C12Q1/6869 Z

【請求項の数】 10

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2022162344

(22)【出願日】2022-10-07

(62)【分割の表示】P 2019538574の分割

【原出願日】2017-10-02

(65)【公開番号】P2023012466

(43)【公開日】2023-01-25

【審査請求日】2022-11-01

(31)【優先権主張番号】62/403,690

(32)【優先日】2016-10-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】519199510

【氏名又は名称】ジェンヴィーダ テクノロジー カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100109070

【弁理士】

【氏名又は名称】須田 洋之

(74)【代理人】

【識別番号】100067013

【弁理士】

【氏名又は名称】大塚 文昭

(74)【代理人】

【識別番号】100086771

【弁理士】

【氏名又は名称】西島 孝喜

(74)【代理人】

【氏名又は名称】上杉 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120525

【弁理士】

【氏名又は名称】近藤 直樹

(74)【代理人】

【識別番号】100139712

【弁理士】

【氏名又は名称】那須 威夫

(72)【発明者】

【氏名】ソウ ダニエル ワイ－チョン

(72)【発明者】

【氏名】ホ チ イップ

【審査官】村田 顕一郎

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１４－０１０１０９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１２－１１８０３９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００４－１５０８０４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１２－５２６５５６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００５－１５９３５３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００６－３４４２１６（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１５／００２１１８３（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ２７／００－２７／１０

Ｇ０１Ｎ ２７／１４－２７／２４

Ｇ０１Ｎ ３７／００

Ｃ１２Ｍ １／００－３／１０

Ｃ１２Ｎ １５／０９

Ｃ１２Ｑ １／００－３／００

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

生物学的物質を含む試料液体を分析するための装置において使用するための構造であって、
１つの入口１５０１および複数の出口１５０２を備える一連の案内チャネルであって、前記一連の案内チャネルはＨツリー構造を有し、前記入口１５０１から前記複数の出口１５０２のいずれかまでの経路長は、同一である、一連の案内チャネル、
を備え、
前記試料液体は前記入口１５０１に供給され、前記複数の出口の各々に到達するために前記一連の案内チャネルの階層的流体ネットワーク内の各連続するレベルにおいて小さいけれども等しい容積に分割される、
生物学的物質を含む試料液体を分析するための装置において使用するための構造。

【請求項2】

前記生物学的物質は分子を含む、請求項１に記載の構造。

【請求項3】

前記複数の出口は複数のナノ細孔を備えるナノ細孔型シーケンシングチップに接続され、前記複数の出口の各々は前記複数のナノ細孔の各々に別々に接続される、請求項１に記載の構造。

【請求項4】

前記生物学的物質はｄｓＤＮＡであり、前記構造は、
ａ．ニック入りｄｓＤＮＡを形成するために前記ｄｓＤＮＡを特定の制限部位にニッキングするためのニッキング機構を備えるチャンバ１４０１と、
ｂ．制御された形で前記ニック入りｄｓＤＮＡを複数のｓｓＤＮＡの短鎖に解離するための解離機構を備える解離ゾーンと、
ｃ．前記複数のｓｓＤＮＡの短鎖を輸送するための前記一連の案内チャネル内の一連の案内電極と、
をさらに備え、
前記複数のｓｓＤＮＡの短鎖を前記一連の案内チャネルに供給するために前記解離ゾーンは前記チャンバを前記１つの入口に接続し、前記一連の案内電極は、前記入口に入り込んだ前記複数のｓｓＤＮＡの短鎖の各々を異なるチャネルに割り当て、連結アルゴリズムを用いて再構築されるように、わかっている順序で前記ｓｓＤＮＡが前記複数の出口の各々に到達するのを確実にする、
請求項１に記載の構造。

【請求項5】

前記ニッキング機構は、突然変異したＩＩ Ｓ型エンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９由来のニッカーゼ、及びＴＡＬＥＮ様ｆｏｋＩ型ニッカーゼからなる群から選択される１又は２以上のニッカーゼを備える、請求項４に記載の構造。

【請求項6】

前記突然変異したＩＩ Ｓ型エンドヌクレアーゼはｆｏｋＩ型ニッカーゼである、請求項５に記載の構造。

【請求項7】

前記解離機構は、加熱、ヘリカーゼ、バクテリオファージＴ７遺伝子産物４、又はバクテリオファージＴ７遺伝子産物ｇｐ４である、請求項４に記載の構造。

【請求項8】

前記解離ゾーンは、前記ニック入りｄｓＤＮＡを真っ直ぐに伸ばすための矯正機構（ｓｔｒａｉｇｈｔｅｎｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）をさらに備える、請求項４に記載の構造。

【請求項9】

前記矯正機構はマイクロピラー又はナノピラー又はＤＮＡポンプのアレイを備える、請求項８に記載の構造。

【請求項10】

前記一連の案内電極は前記Ｈツリー構造を有する前記一連の案内チャネルに配置される、請求項３に記載の構造。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、一般に分子分析及び同定に関し、具体的には、ポータブルなナノ細孔型リアルタイム分子分析装置を提供することに関する。

【背景技術】

【0002】

全ての生命体には、核酸、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及び／又はリボ核酸（ＲＮＡ）が存在し、これらは独特な配列を有する。このことは、必然的に様々な生物学的作用物質の最終的な同定として役立つ。従って、生命体の研究では、本明細書では概してゲノム分析と呼ぶ核酸、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡの分析が非常に有用である。しかしながら、現在商業的に利用できるマイクロアレイ法、パイロシーケンシング法、合成によるシーケンシング法及びライゲーションによるシーケンシング法などの核酸シーケンシング技術は、様々な面で大きく制限されている。例えば、これらの技術の一部又は全部は、リアルタイム分析を行うことができず、（ポリメラーゼ連鎖反応などの）長い試料核酸増幅手順及びプロトコルを必要とし、所要時間が長く（通常は、試料核酸の小断片を分析するのに約数日から数週間掛かる）、運用コストが高く（高価な化学試薬を使用するものもある）、偽陽性誤り率が高く、携帯することができない。

【0003】

このような現在の核酸シーケンシング技術の制限により、医療専門家、保安要員、科学者などの現場で働く人々は、その場で局所的にゲノム分析を行うことができない。それどころか、現場の作業員は、試料を収集して専門研究所に輸送し、試料内に存在する核酸を同定するために数日間又は数週間にわたって分析を行う必要がある。このような長期にわたる冗長なプロセスは、特に英国における口蹄疫の流行、アジアにおける重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）の大流行、並びにメキシコ及び米国における最近の（一般に豚インフルエンザとしても知られている）Ｈ１Ｎ１インフルエンザの大流行などの流行的発生中に今日のゲノム分析のニーズをほとんど満たすことができない。当局が現在の核酸シーケンシング技術を使用して非常に大きな安全上の及び経済的な影響を社会に与える可能性がある十分な情報に基づいた素早い決定を下すことは、不可能ではないにせよ困難である。

【0004】

このような核酸シーケンシング技術の不十分さに対処するために、科学者らは様々なナノ細孔型シーケンシング技術を発展させた。近頃、オックスフォード大学のＨａｇａｎ Ｂａｙｌｅｙ教授及びその共同研究者らは、バイオナノ細孔実験においてαヘモリシンを用いた９９．８％の精度でのロングリードを実証した。確立された検出速度に基づけば、一般に約３０分以内にヒトゲノム全体を分析するのに２５６×２５６のナノ細孔アレイで十分である。バイオナノ細孔アレイを上手く実現できた場合には、このことが大きな転換的偉業になると思われる。しかしながら、バイオナノ細孔の１つの欠点は、バイオナノ細孔の形成において使用されるタンパク質及び酵素の、典型的には数時間から数日間という比較的短い寿命である。

【0005】

固体ナノ細孔は、その構築時にバイオ試薬を伴わないため、バイオナノ細孔のさらにロバストな代替案である。しかしながら、半導体産業で使用されている従来のリソグラフィ技術は、固体ナノ細孔型シーケンシング技術に必要な２ｎｍの特徴部サイズを定めることができない。これまでは、ナノ細孔を１つずつ連続して形成するために、例えば電子／イオンミリングなどの異なる加工技術が使用されてきた。しかしながら、これらの技術は、手頃なコスト及び合理的な製作時間で２５６×２５６のアレイを生産するように拡張することができない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【文献】Ｋｌｅｔｓｏｖ他著、「１ｎｍナノ細孔確証第３世代シーケンシングにおけるＤＮＡヌクレオチド塩基を通る横方向伝導の第一原理電子伝播関数計算（Ａｂ ｉｎｉｔｉｏ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｐｒｏｐａｇａｔｏｒ ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ＤＮＡ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｂａｓｅｓ ｉｎ １－ｎｍ ｎａｎｏｐｏｒｅ ｃｏｒｒｏｂｏｒａｔｅ ｔｈｉｒｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）」、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、第１８６０巻、第１号、Ｐａｒｔ Ａ、２０１６年１月、１４０～１４５頁

【文献】Ｌｉｎ、Ｙｏｎｇ他著、「次世代シーケンシング技術のための新規アセンブリツールの比較研究（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｄｅ ｎｏｖｏ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）」、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２０１１年８月１日、２７（１５）、２０３１～２０３７頁

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

添付図面の図に本発明を限定ではなく一例として示す。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】ナノ細孔型シーケンサ及び関連するナノ細孔型シーケンシングバイオチップの一実施形態を示す図である。

【図2A】ナノ細孔型核酸シーケンシングの検出及び分析中における分子の転位過程の一実施形態を示す図である。

【図2B】空の細孔のバックグラウンド信号と比べた対応する例示的な核酸配列の電気的読み取り値を示す図である。

【図3】ナノパントグラフィにおいてエッチング及び堆積の両方に使用されるアインツェルレンズの一実施形態の側面図及び上面図である。

【図4A】ナノ細孔及び／又はナノ細孔アレイを加工する減法の一実施形態を示す図である。

【図4B】ナノ細孔及び／又はナノ細孔アレイを加工する減法の一実施形態を示す図である。

【図4C】ナノ細孔及び／又はナノ細孔アレイを加工する減法の一実施形態を示す図である。

【図4D】ナノ細孔及び／又はナノ細孔アレイを加工する減法の一実施形態を示す図である。

【図4E】ナノ細孔及び／又はナノ細孔アレイを加工する減法の一実施形態を示す図である。

【図5A】ナノ細孔及び／又はナノ細孔アレイを加工する加法の一実施形態を示す図である。

【図5B】ナノ細孔及び／又はナノ細孔アレイを加工する加法の一実施形態を示す図である。

【図5C】ナノ細孔及び／又はナノ細孔アレイを加工する加法の一実施形態を示す図である。

【図5D】ナノ細孔及び／又はナノ細孔アレイを加工する加法の一実施形態を示す図である。

【図5E】ナノ細孔及び／又はナノ細孔アレイを加工する加法の一実施形態を示す図である。

【図5F】ナノ細孔及び／又はナノ細孔アレイを加工する加法の一実施形態を示す図である。

【図5G】ナノ細孔及び／又はナノ細孔アレイを加工する加法の一実施形態を示す図である。

【図5H】ナノ細孔及び／又はナノ細孔アレイを加工する加法の一実施形態を示す図である。

【図5I】ナノ細孔及び／又はナノ細孔アレイを加工する加法の一実施形態を示す図である。

【図6A】ナノリングの一実施形態及びナノスリットの一実施形態を示す図である。

【図6B】ウェハ上に配置された薄膜上の漏斗状ナノ細孔の実施形態を示す図である。

【図7】測定チャンバの下部キャビティを形成するように接合されたナノ細孔アレイウェハ及び集積回路ウェハの一実施形態を示す図である。

【図8】測定チャンバの上部キャビティを形成するように接合された上部ウェハ及び複合ウェハの一実施形態を示す図である。

【図9】ナノ細孔型シーケンサと共に動作できる電圧バイアス機構及び電流検知回路の一実施形態を示す図である。

【図10A】ナノ細孔型シーケンサの一実施形態を示す図である。

【図10B】複数の測定チャンバの一実施形態を示す図である。

【図11】試料取り入れ口からマイクロ流体チャネル及びナノ流体チャネルに沿って測定チャンバを通じて試料出口に至る選択した経路に沿ったナノ細孔型シーケンサの一実施形態の断面図である。

【図12】埋め込み電極を有する３層バイオチップ構造の一実施形態を示す図である。

【図13A】ナノ細孔検出のためのバイアス及び検知機構の一実施形態を示す図である。

【図13B】平面電極実装の一実施形態を示す図である。

【図13C】平面電極実装における検知電極及びナノスリットの一実施形態の上面図である。

【図14A】ニック入りｄｓＤＮＡを真っ直ぐに伸ばすための実施形態を示す図である。固定位置に固定されてＤＮＡプロセシングモータとしての役割を指向的に果たすことができる、例えばＦｔｓＫタンパク質ファミリーなどのＤＮＡ転位タンパク質として定められるＤＮＡポンプ１４０３を使用して、案内電極１４０４を含むチャネル内にニック入りｄｓＤＮＡ１４０２の一端を能動的に輸送し、この案内電極がニック入りｄｓＤＮＡ１４０２を解離ゾーン１４０５に輸送し、ここでｄｓＤＮＡを加熱によってｓｓＤＮＡ１４０６の短鎖に解離させた後で、案内電極によって下流に輸送する。

【図14B】図１４ＡのＤＮＡポンプをマイクロ／ナノピラーのアレイ１４０７に置き換えた実施形態を示す図である。

【図14C】解離ゾーンにおいて熱の代わりにヘリカーゼ１４０８を使用する点を除いて図１４Ａと同じ実施形態を示す図である。

【図14D】解離ゾーンにおいて熱の代わりにヘリカーゼ１４０８を使用する点を除いて図１４Ｂと同じ実施形態を示す図である。

【図14E】ニック入りｄｓＤＮＡを真っ直ぐに伸ばすことなく直接解離ゾーンに供給する実施形態を示す図である。

【図15】１つの入口１５０１と複数の出口１５０２とが存在するＨツリー構造を有する一連のチャネルを示す図である。このＨツリー構造は、入口１５０１からいずれかの出口１５０２までの経路長が同じであることを保証する。

【図16】連結アルゴリズムのフローチャートを示す図である。オリゴヌクレオチドシーケンシング結果の利用可能性の順序は、ニック入りｄｓＤＮＡからオリゴヌクレオチドを解離させる順序に厳密に従うので、待ち行列、スタック、リンクリスト又はハッシュテーブルなどの比較的単純なデータ構造を用いて一時ストレージＴＳ－１及びＴＳ－２を実装することができる。

【図17】リアルタイムｄＰＣＲバイオチップにおけるウェルアレイ及びＨツリーネットワークの例を示す図である。

【図18】完全なリアルタイムｄＰＣＲモジュールの例を示す図である。

【図19】ナノ細孔型シーケンサの一実施形態の高水準ハードウェアアーキテクチャを示す図である。

【図20】ナノ細孔型シーケンサの一実施形態における、オペレーティングシステム及びゲノム分析ソフトウェアのソフトウェアコンポーネント及び関連するハードウェアコンポーネントの高水準アーキテクチャを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0009】

以下の説明では、本発明の実施形態を完全に理解できるように、特定のコンポーネント、装置、方法の例などの数多くの具体的な詳細を示す。しかしながら、当業者には、これらの具体的な詳細を使用して本発明の実施形態を実施する必要はないことが明らかであろう。その他の場合、本発明の実施形態を不必要に曖昧にしないように、周知の材料又は方法については詳細に説明していない。

【0010】

以下、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質及びポリマーなどの分子、並びにカーボンナノチューブ、シリコンナノロッド及びコーティングされた／されていない金ナノ粒子などのナノメートルサイズの粒子の分析及び同定を行う装置及び方法の様々な実施形態について説明する。なお、以下の説明では、概念を示すために分子分析、すなわちゲノム分析の一例に焦点を当てている。当業者であれば、本明細書で開示する技術を一般に分子の分析及び同定に適用することもできると容易に認識するであろう。１つの実施形態では、ナノ細孔型シーケンサがポータブルゲノム分析システムである。図１に、ポータブルナノ細孔型シーケンサ１１０及び関連するナノ細孔型シーケンシングバイオチップ１２０の一実施形態を示す。検出及び分析中、試験用試料内の分子は、図２Ａに示すように溶液中でナノスケールの細孔（ナノ細孔とも呼ばれる）を通って電気泳動的に駆動される。いくつかの実施形態では、ナノ細孔のサイズが約２ｎｍである。なお、異なる実施形態ではナノ細孔のサイズが異なることができる。例えば、いくつかの実施形態では、ナノ細孔が一定の同一サイズである。いくつかの別の実施形態では、ナノ細孔が異なるサイズである。さらに、ナノ細孔の形状も、同じ実施形態又は異なる実施形態において、円形、長円形、細長いスリットなどのように異なることができる。図２Ｂに示すように、ナノ細孔に閉じ込められた空間内の分子の相対的サイズ及び移動速度に応じて、異なる振幅及び継続時間の電流パルスなどの様々な電気的特性が観察され、これを利用して分子を同定することができる。この結果、試験用分子を破壊することなく、核酸配列の直接的な読み取りを行うことができる。換言すれば、核酸配列を手付かずの状態にしたまま核酸配列に対する測定を行うことができる。１つの実施形態では、電気的読み取り値が、分子のターンオン電圧及び／又はコンダクタンス／電流である。別の実施形態では、これらの分子を、ＤＮＡ鎖からのヌクレオチドとすることができる。対応する各ヌクレオシドの理論値がＫｌｅｔｓｏｖ他によって取得されている（Ｋｌｅｔｓｏｖ他著、「１ｎｍナノ細孔確証第３世代シーケンシングにおけるＤＮＡヌクレオチド塩基を通る横方向伝導の第一原理電子伝播関数計算（Ａｂ ｉｎｉｔｉｏ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｐｒｏｐａｇａｔｏｒ ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ＤＮＡ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｂａｓｅｓ ｉｎ １－ｎｍ ｎａｎｏｐｏｒｅ ｃｏｒｒｏｂｏｒａｔｅ ｔｈｉｒｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）」、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、第１８６０巻、第１号、Ｐａｒｔ Ａ、２０１６年１月、１４０～１４５頁を参照）。

【0011】

いくつかの実施形態では約２ｎｍの細孔のアレイを含むナノ細孔アレイを本質的限界なく大量生産するために、複数の加工技術を利用することができる。以下、概念を示すために、いくつかの例示的な加工技術の細部を詳細に説明する。当業者であれば、他の同等の加工技術又はその変形例を使用してナノ細孔アレイを生産することもできると理解するであろう。ナノ細孔型シーケンサは、マイクロ／ナノ流体チャネルのネットワークに組み込まれることにより、人間の介入を伴わずにゲノムをかつてない速度で正確に解読することができる。

【0012】

ナノ細孔型シーケンサのいくつかの実施形態は、小型のフォームファクタ及びゲノム分析速度に加えて以下のさらなる利点をもたらす。１つの利点は、生物学的作用物質のあらゆる突然変異に対して古くならない準備できた製品（ｒｅａｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）という点である。これが可能である理由は、ナノ細孔型シーケンシングが直接的な読み取り技術であり、その結果が試験用ゲノムの予備知識を必要としないからである。さらに、ナノ細孔型シーケンサのいくつかの実施形態は、ナノ細孔が常にナノ細孔型シーケンシングバイオチップ内に閉じ込められて、全体的な分析プロセス中に望ましくない異物に全く曝されないことによって、ナノ細孔の無菌性及び清潔性が常に保証されるので、極端な条件及び汚れた環境で動作することができる。

【0013】

ハンドヘルド型のポータブル装置としてのナノ細孔型シーケンサのいくつかの実施形態は、多くの異なる業界及び科学の進歩を加速させることができる。例えば、商業及び研究開発では、このナノ細孔型シーケンサのいくつかの実施形態が、基礎研究、薬理ゲノミクス、細菌診断、病原体検出、農業、食品産業、バイオ燃料などで役立つことができる。さらなる例として、ナノ細孔型シーケンサのいくつかの実施形態は、迅速なＤＮＡ科学捜査、通関手続き地の生物学的スクリーニングなどで役立つこともできる。

【0014】

ナノ細孔型シーケンシングのためのナノ細孔アレイ
１９７０年代、ＤｅＢｌｏｉｓ及びその同業者らは、コールターカウンターの抵抗パルス技術に基づいて粒子をそのサイズ及び電気泳動移動度によって特徴付ける上で、単一のサブミクロン直径の細孔を使用する実証に成功した。その後、Ｄｅａｍｅｒは、遺伝子シーケンシングにナノメートルサイズの細孔を使用する考えを提案した。Ｄｅａｍｅｒ及びその同業者らは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子及びＲＮＡ分子を細孔形成タンパク質に通し、このナノ細孔を通るイオン電流に対する影響によってこれらの分子を検出できることを実証した。最近実証された高いシーケンシング速度を考慮すると、ナノ細孔型シーケンシングの進歩は、迅速なゲノム分析のための大型ナノ細孔アレイを形成する安価な並列書き込み加工プロセスが存在しないことによって大きく妨げられている。従来のリソグラフィ法、電子ミリング法、イオンミリング法及びシリコンエッチバック法の多くは、リアルタイムゲノム分析に必要なナノ細孔アレイを製造するための実行可能な手段ではない。最近まで、ヒューストン大学のＤｏｎｎｅｌｌｙ及びその同業者らは、２ｎｍのナノ細孔アレイをほぼ制限なく大量生産できるナノパントグラフィのいくつかの実施形態を構築していた。Ｄｏｎｎｅｌｌｙのシミュレーション結果によれば、ナノパントグラフィは、１ｎｍ程の小さなサイズの孔又は点を定めることができる。ナノパントグラフィは、マイクロ／ナノ流体工学技術を取り入れることによって、リアルタイム又は近リアルタイムゲノム分析システムを実現する可能性を開くものである。

【0015】

ナノパントグラフィでは、例えばドープシリコン（Ｓｉ）ウェハなどの導電性基板上に加工された（図３に示すようなアインツェルレンズとも呼ばれる）サブミクロン直径の静電レンズアレイに幅広い平行な単一エネルギーのイオンビームを向ける。レンズ電極に適切な電圧を付与することにより、レンズに入射する「ビームレット」をレンズの直径よりも１００倍小さなスポットに集束させる。このことは、現在の半導体加工で使用されるフォトリソグラフィ技術で扱うことができる１００ｎｍのレンズによって１ｎｍの特徴部を画定できることを意味する。また、各レンズは、基板上に独自のナノメートルの特徴を書き込み、従ってナノパントグラフィは、集束電子ビーム又はイオンビームの順次書き込みとは大きく異なる並列書き込みプロセスである。レンズアレイが基板の一部であるため、この方法は、振動又は熱膨張によって生じる位置不良に実質的に影響されない。ナノメートル特徴部のサイズは、同じ又は異なる直径を有することができる所定のレンズのサイズによって制御され、すなわち同じ又は異なるナノメートル特徴部のアレイを実質的に同時に加工することができる。Ｃｌ₂ガスの存在下でＡｒ＋ビームを使用して、直径１０ｎｍ、深さ１００ｎｍのエッチングされたＳｉ孔が実証されている。エッチングは、イオンビームレットが集束するように上部金属層に電圧が付与される孔内でしか行うことができない。残りの孔では上部金属層に電圧が付与されないためビームレットが集束せず、従っていずれかの感知できるエッチングを引き起こすには電流密度が小さすぎる。

【0016】

ナノパントグラフィでは、ゲノム分析のためのナノ細孔を加工する２つの方法、すなわち減法と加法とが存在する。以下では、最初に直接エッチング法の一実施形態を説明し、その後に間接エッチング法の一実施形態を説明する。

【0017】

Ａ．ナノ細孔及び／又はナノ細孔アレイを加工する減法の一実施形態
図４Ａ～図４Ｅに、ナノ細孔及び／又はナノ細孔アレイを加工する減法の一実施形態を示す。図４Ａに示すように、Ｓｉ（１００）ウェハ４１０上に窒化物４２０を堆積させる。図４Ｂにおいて、ドープシリコン又は金属である下部導電材料４２２を堆積させ、その後に誘電体スペーサ４２４及び上部金属層４２６を堆積させる。その後に、複数のアインツェルレンズを画定する。図４Ｃに示すように、導電材料４２２上でナノパントグラフィエッチングを行って、窒化物層４２０におけるナノ細孔エッチングのためのハードマスクとして使用されるナノメートル孔４３０を画定する。図４Ｄにおいて、アインツェルレンズを取り除く。次に、ナノ細孔４３０を保護のために酸化物４３５でコーティングする。最後に、図４Ｅにおいて、シリコン基板４１０の裏面に対する化学機械研磨（ＣＭＰ）、リソグラフィ法及び水酸化カリウム（ＫＯＨ）エッチングによって測定チャンバの下部キャビティ４４０を形成する。その後、酸化物層４３５を取り除いてナノ細孔４３０を露出させる。

【0018】

Ｂ．ナノ細孔及び／又はナノ細孔アレイを加工する加法の一実施形態
図５Ａ～図５Ｉに、ナノ細孔及び／又はナノ細孔アレイを加工する加法の一実施形態を示す。図５Ａに示すように、Ｓｉ（１００）ウェハ５１０上に窒化物５２０を堆積させる。図５Ｂにおいて、ドープシリコン又は金属である下部導電材料５２２、誘電体スペーサ５２４及び上部金属層５２６を堆積させる。その後に、アインツェルレンズを画定する。図５Ｃにおいて、ナノロッド又はナノチューブ成長のためのナノシード５３０を堆積させる。図５Ｄにおいて、ナノロッド又はナノチューブ５３５を成長させる。図５Ｅにおいて、酸化物５４０を堆積させる。図５Ｆにおいて、ナノロッド又はナノチューブ５３５を取り除く。残りの酸化物ナノメートル孔５５０は、導電層及び窒化物層のためのハードマスクとして使用する。図５Ｇにおいて、酸化物層５４０から導電層５２２に、その後に窒化物層５２０にパターンを転写する。図５Ｈにおいて、アインツェルレンズを取り除き、その後に酸化物層５４０を取り除く。ナノ細孔は、保護のために酸化物５５２でコーティングする。最後に、図５Ｉにおいて、シリコン基板５１０の裏面に対するＣＭＰ、リソグラフィ技術及びＫＯＨエッチングによって測定チャンバの下部キャビティ５６０を形成する。その後、酸化物層５５２を取り除いてナノ細孔５６５を露出させる。

【0019】

図６Ａに、本発明のいくつかの実施形態において使用できるナノスリットの一実施形態及びナノリングの一実施形態を示す。（上述した）アインツェルレンズを用いた減法のいくつかの実施形態は、それぞれ図６Ａに示すような矩形及び半円形の開口部を有する細長いナノサイズのナノスリット６１０及びナノリング６２０を画定することができる。当業者には、本明細書で行う開示に基づいて、同様のパターニング技術を用いてあらゆる二次元形状を画定できることが明らかであろう。いくつかの実施形態では、ウェハステージがプロセス全体にわたって実質的に静止しているので、この非円形パターニング法が、ウェハステージを傾ける従来の方法が直面する主な技術課題のうちの少なくとも３つを解決する。第１に、ウェハステージの傾斜角及び速度を精密に制御する必要がない。第２に、この方法は、一般に入射イオンビームに対してウェハを傾けることによってもたらされる線幅拡大効果及び線幅不均一性を克服する。第３に、この方法では、異なる形状及びサイズのパターンをほぼ同時に画定することができる。１つの実施形態では、ナノパントグラフィが、ウェハ上に配置された薄膜上に漏斗状ナノ細孔のアレイを形成する。図６Ｂに、ウェハ上に配置された薄膜上の漏斗状ナノ細孔の例を示す。漏斗状ナノ細孔６０１の各々は、一方の表面に大きな開口部６０２を有し、他方の表面に小さな開口部６０３を有する。１つの実施形態では、大きい方の開口部６０２が分子の受け取りを容易にし、小さい方の開口部６０３が、１つの分子を空間内に閉じ込めて同定パラメータを測定するためのものである。小さな開口部６０３は、分子サイズと同等の寸法を有する。１つの実施形態では、小さな開口部が、１、２又は３ｎｍの直径を有する。１つの実施形態では、薄膜が、複数の層を含む複合薄膜である。薄膜は、誘電体層６０５を挟んだ２つの導電層６０４を含む少なくとも３つの層で構成することができる。２つの導電層６０４は、グラフェンなどの炭素系材料、又はイリジウムなどの金属とすることができる。１つの実施形態では、導電層６０４を、分子の同一性を検出するための電極として機能するようにさらに加工することができる。誘電材料６０５は、窒化シリコン、酸化アルミニウム、酸化ハフニウム又は酸化ジルコニウムなどの高誘電率（ｈｉｇｈ－ｋ）誘電材料とすることができる。１つの実施形態では、ｈｉｇｈ－ｋ誘電材料の層６０５が、２つの導電材料の層６０４を電気的に絶縁して、この２つの導電材料の層６０５間に漏れ電流が流れるのを防ぐように機能する。誘電体層６０５の１、２又は３ｎｍの厚みは、ｓｓＤＮＡの個々のヌクレオチドなどの単一分子が薄膜上のナノ細孔６０１を通過する際に、この分子を正確に特定する高分解能を可能にする。漏斗状ナノ細孔は多層薄膜を貫通しているので、各層は、ナノ細孔の部分に円形の貫通孔６０６を形成し、導電層上のナノ細孔の開口部は中心軸の周囲で対称であるため、これによって中心軸からのあらゆる分子の傾斜が同様の読み取り値をもたらすことが確実になる。挟まれた層は分子の同一性を検出するので、この構造を貫通するナノ細孔の部分は、正確な検出を保証する１、２又は３ｎｍの直径を有する。薄膜は、構造的支持、又は周囲環境からの電気的絶縁をもたらすことなどの目的のために、酸化シリコン又は窒化シリコンなどのさらなる上部誘電材料層６０７及び下部誘電材料層６０８をさらに含むことができる。これらのさらなる層は、漏斗状ナノ細孔がさらに大きくなって、検出が行われるナノ細孔の最後の１、２又は３ｎｍへの分子の転移を容易にする薄膜の部分を構成する。上述したナノ細孔の１ｎｍ～３ｎｍの範囲の直径及びｈｉｇｈ－ｋ誘電材料の厚みは、特に核酸のために選択される。当業者であれば、アミノ酸、タンパク質又はペプチドなどの他の分子についても、検出信号を最適化するように容易に寸法を調整するであろう。

【0020】

ナノ細孔型シーケンシングバイオチップ
減法又は加法のいずれかを用いてナノ細孔アレイを形成した後には、図７に示すように、予め加工されている集積回路７２０及びマイクロ流体チャネル７３０を有するウェハ上にナノ細孔アレイウェハ７５０を接合することができる。これによって、測定チャンバの下部キャビティの形成が完了する。核酸試料は、必要に応じて底部ウェハ上のマイクロ流体チャネルを通じてバイオチップから抽出することができる。

【0021】

同様に、いくつかの実施形態では、接合されたナノ細孔ウェハ８４０及び底部ウェハ８５０を含む複合ウェハ上に集積回路８２０及び／又は流体チャネル８３０を有する上部ウェハ８１０を接合することによって測定チャンバの上部キャビティが形成される。図８に、この３層ウェハ構造８００を示す。図９には、電圧バイアス機構９１０及び関連する電流検知回路９２０の一実施形態を示す。その後、３層複合ウェハ８００は、デッドボリュームが最小であるような適切な流体Ｉ／Ｏ接続部を用いてワイヤボンディング又はベルグリッドワイヤボンディングの支持フレームに取り付けられる。例えばエポキシ封入法及びセラミックパッケージング法などの典型的なパッケージング技術を用いてアセンブリ全体を取り囲み、ナノ細孔型シーケンシングバイオチップを形成することができる。或いは、検知及びバイアスに関連するような集積回路をナノ細孔ウェハ８４０上に加工して、集積回路を有する別のウェハの代わりに空の基板に接合することもできる。

【0022】

さらに、いくつかの実施形態では、図１０Ａ及び図１１に示すように、上部ウェハ８１０に２つのさらなる特徴部、すなわちマイクロ流体チャネル１０１０に沿った試料案内電極１０１５と、測定チャンバ１０３０に通じるナノ流体チャネル１０１３とが埋め込まれる。以下、ナノ細孔型シーケンシングバイオチップを通る試料の流れをさらに示すために１つの例を詳細に説明する。

【0023】

緩衝液取り入れ口（ｂｕｆｆｅｒ ｉｎｔａｋｅ）１０２５及び緩衝液出口１０２７は、マイクロ流体チャネル１０１０、ナノ流体チャネル１０１３及び測定チャンバ１０３０のネットワークを検出試料の取り込み前に予め湿らせて満たしておくためのものである。検出中、マイクロ流体チャネル内の流体流は、オンチップ又はオフチップマイクロポンプ及びマイクロバルブを用いて緩衝液流取り入れ口及び出口の流量によって調整することができる。

【0024】

１つの例では、一本鎖核酸分子のリン酸デオキシリボース骨格が各塩基セグメントについて負電荷を帯び、分子の５’末端に２つの負電荷が存在する。試料取り入れ口コネクタ１０２３を通じて受け入れ容器１０２０から目的の測定チャンバ１０３０に至る試料案内電極チェーン１０１５に沿って脈動する正電圧により、受け入れ容器１０２０から核酸分子を抽出して、予め割り当てられた測定チャンバに送出することができる。同様に、底部ウェハ上にも、マイクロ流体チャネル１０１０に沿って、ナノ細孔型シーケンシングバイオチップから同様に試料を抽出するための試料案内電極１０１７が埋め込まれる。

【0025】

測定チャンバ１０４０の数は、流体チャネルのネットワークに沿った同様の試料案内電極の機構を用いて１つよりも多くに拡張することができる。図１０Ｂに、ツリー構造で配置された測定チャンバの例を示す。いくつかの実施形態では、複数の単独分析を行う能力に加えて、試料受け入れ容器１０２０からＤＮＡ断片を抽出する際のＤＮＡ断片の順序を各測定チャンバに予め割り当てる。図１０Ｂに示すように、測定チャンバ１０４０には２桁の数字を付している。最初の桁は分岐番号を示し、２番目の桁は分岐内の測定チャンバの位置を示す。測定チャンバ１０４０の割り当て順は、単純に昇順とすることができ、すなわち最初に最も小さな番号のチャンバを使用した後で、次に大きな番号のチャンバを使用することができる。このように、分岐内の全ての測定チャンバを使用した後で次の分岐に移行することができる。或いは、各分岐の最も小さな番号のチャンバに試料を割り当てて最初に最も小さな分岐番号を使用することもでき、すなわち現在の例では、１１、２１、３１、４１の後に１２、２２、３２、４２などとすることができる。この割り当て法によれば、中央マイクロ流体チャネルから最も距離が離れた各分岐の測定チャンバに最初に割り当てを行った後に、各分岐の次に離れたチャンバに割り当てを行うことができる。この方法は、中央マイクロ流体チャネル内の試料案内電極の電気信号が測定信号に干渉するのを抑えることができる。全体的な測定が完了すると、断片の抽出順に従ってＤＮＡ試料全体の配列を体系的に組み立てることができる。これにより、混成プロセスによって元々の試料配列が無作為化されて再び正しい配列に継ぎ合わせるために計算集約的で誤りを生じやすい検出後分析が必要なマイクロアレイ法などの他の従来のシーケンシング法に必要な時間の掛かる検出後分析を排除することができる。さらに、断片の抽出順が記録されるので、再び断片を組み合わせて元々のＤＮＡ試料を形成することができる。他の従来のシーケンシング法では、通常は元々の試料が破壊され、将来的な使用のために回復させることができない。

【0026】

再び図１０Ａを参照すると、上部ウェハと複合ウェハとのウェハボンディングによって形成されたナノ流体チャネル１０１３は、フィルタ、試料流速コントローラ及び分子ストレッチャとしての役割を果たすことができる。いくつかの実施形態では、このナノ流体チャネルが、上部ウェハの上部電極をオン及びオフに切り替えることによってフィルタとしての役割を果たし、マイクロ流体チャネルから選択的に試料を引き込むことができる。いくつかの実施形態では、ナノ流体チャネルが、上部電極及び下部電極の電圧を調整することによって試料流速コントローラとしての役割を果たし、ナノ流体チャネルを通る試料の流速を制御することができる。また、図１１に示すように、ナノ流体チャネル１０１３は、一本鎖核酸分子１１０１がナノ流体チャネル１０１３を通過する際にこれを自然な丸まった状態から引き延ばすことができるので、分子ストレッチャとしての役割を果たすこともできる。

【0027】

いくつかの実施形態では、ナノ流体チャネルの速度制御特性を利用してさらに正確な分子の分析を可能にする。図１２に示すように、ナノ細孔１２２５に検知電極１２０５を埋め込むと、ナノ細孔１２２５を通る分子の流れを制御する上でのマイクロ／ナノチャネルネットワークの不可欠な部分になる。ナノ流体チャネルに加えて、付与されるＤＣ電圧も、ナノ細孔１２２５を通過する際の分子の速度及び方向を微調整するように設計される。統計的誤りを排除することによって分子同定の精度を高め、すなわち偽陽性誤り率を低減するために、上部駆動電極１２３０及び下部駆動電極１２３５、並びに埋め込み検知電極１２０５に付与するＤＣバイアス電圧の大きさをそれぞれ交互に入れ替えることによって、ナノ細孔１２２５を通じて試験用分子を前後に複数回引き寄せて分析を繰り返すことができる。

【0028】

ナノ細孔に検知電極が組み込まれたいくつかの従来の方法とは異なり、ＤＮＡ内の各塩基がナノ細孔を通過する時間は数ナノ秒しか掛からないこともある。このような移動時間は、あらゆる有意義な測定にとって短すぎる。この欠点に照らして、ナノ細孔を通る分子の動きを遅くする他の従来の方法が開発されている。１つの従来の手法は、ナノ細孔にさらなる電極を埋め込むことによって分子の速度を制御する電圧閉じ込めスキームを提案する。提案される電圧閉じ込めスキームは、互いに積み重なって間に誘電材料を挟むことによって互いに電気的に絶縁された導電性電極を４つ又は５つ以上必要とするため実装が困難である。この多層膜上に必要とされる２～３ｎｍのナノ細孔形態は、３０：１を上回るアスペクト比を有することができ、現在の集積回路加工技術を用いてこれを達成することは、不可能ではないにせよ困難である。

【0029】

図１３Ａに示すように、付与されるＡＣ検知電圧１３１０は、ナノ細孔１３２５を分子が通過している間にこれらを調べるためのものである。この結果、例えば抵抗の変化、静電容量の変化、位相の変化及び／又はトンネリング電流などの様々な検知機構を用いて分子を同定することができる。埋め込み検知電極１３０５と試験用分子とが非常に近いので、信号対雑音比を改善することもできる。

【0030】

上記の例示的な試料供給及びフィルタリング機構は、ナノ細孔測定チャンバのアレイをどのよう実装できるかを示す一例として機能するものである。当業者であれば、異なる実施形態では上記の供給及びフィルタリング機構の変形例を使用することもできると認識するであろう。さらに、図示の方法を用いて異なるサイズの細孔アレイを実現することもできる。また、αヘモリシンなどのタンパク質細孔及び上述した固体ナノ細孔のアレイと共に、バイオナノ細孔のアレイを実現することもできる。いくつかの実施形態では、上述した異なる導電層上の積層電極の代わりに、両検知電極を同じ導電層上に配置することもできる。図１３Ｂに、この平面電極実装の一実施形態を示す。この平面電極実装では、両検知電極１３０７が同じ導電層上に配置され、検知電極１３０７間にナノスリット１３２７が画定される。図１３Ｃに、検知電極１３０７及びナノスリット１３２７の上面図を示す。上述したように、ナノ細孔及びナノスリットは、いずれもナノパントグラフィを用いて画定することができる。

【0031】

例えば一塩基多型の認識などの、いくつかの実施形態における低コストで高速で正確なゲノム分析では、実質的にリアルタイムで分子検出を行う能力、検出前試料増幅を伴わずに単一分子検出を行う能力、複数かつ実質的に同時の検出を行う能力、マルチパス検出を行う能力、計算集約的な検出後分析を伴わずに試料を同定する能力、及び／又は将来的な使用のために検出後に試料を保持する能力が非常に重要である。

【0032】

本発明では、計画的な制限部位又はその付近でニッキング作用（ｎｉｃｋｉｎｇ ａｃｔｉｏｎｓ）が生じるように、二本鎖ＤＮＡであるｄｓＤＮＡをニッカーゼで前処理する。解離ゾーンにおいて個々のオリゴヌクレオチドがそのｄｓＤＮＡ上の順序に従ってニック入りｄｓＤＮＡから解離する前に、ニック入りｄｓＤＮＡを線形化することができる。その後、各オリゴヌクレオチドは、例えばＨツリー構造チャネルなどの案内チャネルの異なるアーム部に案内電極によって引き寄せられる。その後、下流のナノ細孔チップが各オリゴヌクレオチドの配列を検出する。一連のＨツリー構造チャネルを使用する場合、バランスのとれたＨツリー内の単一の入口から葉までの経路長は同じであるように設計されているので、各オリゴヌクレオチドがナノ細孔に到達する時間は、ｄｓＤＮＡ上のオリゴヌクレオチドの順序を大まかに反映する。この順序を使用して検出結果を組み立てて、参照配列を使用せずに元々のｄｓＤＮＡの配列を取得することができる。ｄｓＤＮＡ内の２つの鎖は互いに相補的であるため、ナノ細孔チップにほぼ同時に到達する２つのオリゴヌクレオチドは互いに相補的である可能性が高く、このような各オリゴヌクレオチドの対の検出された配列は、互いの正確さを逆チェック、すなわち自己チェックする。２つの最大限に相補的なオリゴヌクレオチドを対にする時には、ｄｓＤＮＡ上の制限部位の散在性によって生じる各オリゴヌクレオチドの２つの末端の突出部の配列を、隣接するオリゴヌクレオチドの対を探し当てる際の一致基準、すなわち自動案内として使用する。この内蔵された自己チェック及び自動案内機構により、参照配列を伴わずにオリゴヌクレオチドの検出された配列を互いに組み立て、すなわち新たなシーケンシングを達成することができる。

【0033】

１つの実施形態では、チャンバ１４０１に、ＤＮＡ１４０２の少なくとも１つの鎖の特定の制限部位をニッキングする酵素を含む長いｄｓＤＮＡが供給される。１つの実施形態では、ｄｓＤＮＡが、酵素によってニッキングされた後に真っ直ぐに伸びる。図１４に、ｄｓＤＮＡを真っ直ぐに伸ばすための実施形態を示す。ｄｓＤＮＡをニッキングする酵素としては、ｆｏｋＩ型ニッカーゼなどの突然変異したＩＩ Ｓ型エンドヌクレアーゼ、他の新たに発見されたニッカーゼ、又はニューイングランド州ＢｉｏＬａｂ社のＲＥＢＡＳＥデータベースに含まれている人工的に操作されたニッカーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９由来のニッカーゼ、及びＴＡＬＥＮ様ｆｏｋＩ型（ＴＡＬＥＮ ｌｉｋｅ ｆｏｋＩ ｂａｓｅｄ）ニッカーゼが挙げられる。その後、酵素的にニッキングされたニック入りＤＮＡは、酵素活性が生じた場所の下流の位置又は分離したチャンバ内で、例えば熱又は酵素によってｓｓＤＮＡの短鎖に分解される。ニック入りＤＮＡは、酵素修飾後にニッキングされたにもかかわらず長い二重螺旋としての状態を保つので、長いニック入りｄｓＤＮＡは、長いｄｓＤＮＡからｓｓＤＮＡの短鎖が制御された形で１つずつ解離する解離ゾーンに向かって供給されるように（例えば、案内電極によって）制御することができる。この解離は、加熱又はヘリカーゼなどの酵素によって行うことができる。１つの実施形態では、これらの酵素が、バクテリオファージＴ７遺伝子産物４、すなわちｇｐ４、野生型タンパク質、又は突然変異誘導体を含む。その後、ｓｓＤＮＡの短鎖は、複数の出口に通じる単一の入口を介して下流に供給される。入口から出口に通じる経路の全長は、ｓｓＤＮＡの出口到達時間が元々のｄｓＤＮＡ上のｓｓＤＮＡの順序を示唆するように、どれも同じになるように設計されている。案内電極は、入口に入り込んだｓｓＤＮＡを異なるチャネルに割り当てる。１つの実施形態では、ｓｓＤＮＡの出口到達を確実にするように、案内電極がチャネル全体に沿って存在する。１つの実施形態では、一連のチャネルがＨツリー構造を有する。図１５に、Ｈツリー構造の例を示す。各出口では、ｓｓＤＮＡがナノ細孔を通過して配列が読み取られる。元々の長鎖ＤＮＡ上のｓｓＤＮＡの順序が分かっているので、個々のｓｓＤＮＡが読み取られた後には、配列全体を再び容易に継ぎ合わせることができる。図１６に、参照配列を伴わずにオリゴヌクレオチド配列をｄｓＤＮＡ配列に組み立てる連結アルゴリズムの例を示す。

【0034】

Ｌｉｎ及びその同業者らは、それぞれがデュアルクアッドコアＸｅｎｏｎプロセッサ（２．４ＧＨｚ）及び１２ＧＢ ＲＡＭを有する８台のコンピュータサーバのクラスタを用いて７つの新規アセンブリアルゴリズムに関する比較を行い、これらの７つのアルゴリズムのアセンブリ時間が、Ｃ．エレガンス（２０．９Ｍｂｐ、メガ塩基対）では数分から数時間の範囲であることに気付いた（Ｌｉｎ、Ｙｏｎｇ他著、「次世代シーケンシング技術のための新規アセンブリツールの比較研究（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｄｅ ｎｏｖｏ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）」、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２０１１年８月１日、２７（１５）、２０３１～２０３７頁を参照）。

【0035】

上述したニッカーゼ試料の調製及び関連するアセンブリアルゴリズムの改善を実証するために、デュアルコアｉ５プロセッサ（２．５ＧＨｚ）及び１６ＧＢ ＲＡＭを備えたＭａｃＢｏｏｋ ＰｒｏラップトップにＰｙｔｈｏｎを用いてニッキング作用及びアセンブリアルゴリズムを実装した。他の７つの新規アセンブリアルゴリズムとの公正な比較のために、２０Ｍｂｐの長さのｄｓＤＮＡの配列をランダムに生成し、予め定めた制限部位のパターンに従ってｄｓＤＮＡの二本鎖に沿ったニックを生成し、最後に短縮ｓｓＤＮＡの配列に従ってライブラリ（ハッシュテーブル）を生成した。ｓｓＤＮＡの読み取り及びアセンブリを連続して行う際には、他の７つの新規アセンブリアルゴリズムと同調して複数の事例のシミュレーションを行い、すなわちｓｓＤＮＡの全ての結果が利用可能になって初めてアセンブリプロセスを開始した。本発明の方法を用いた典型的なアセンブリ時間は５分未満であり、このことは、ポータブルシステムを用いて試料ＤＮＡに対するリアルタイム分析を実行できることを意味する。図１６のフローチャートに示すように、このアセンブリ時間は、ｓｓＤＮＡの読み取りとアセンブリとを同時に処理した場合には実質的に短くなると予想される。

【0036】

１つの実施形態では、液体生検及び無細胞ＤＮＡ分析の場合と同様の希少な対立遺伝子又は超少量の配列などのＤＮＡ配列をナノ細孔において読み取るように処理する前に、デジタルＰＣＲ、ｄＰＣＲによってＤＮＡ試料を増幅する。別の実施形態では、ｄＰＣＲがシーケンシング系とは別に存在する。本発明のｄＰＣＲは、上述したようなＨツリー構造を有する一連のチャネルを含む。１つの実施形態では、これらの一連のチャネルを、フロリナート、３Ｍ社から市販されている合成油、又は鉱油などの、水よりも沸点が高い疎水性流体で満たす。ＤＮＡ試料を水性のＰＣＲ検定用試薬と混合した後に一連のＨツリーチャネルの単一の入口に供給し、複数の出口の各々において少量のＤＮＡ試料及び試薬をウェル内に分注する。１つの実施形態では、これらのウェルが、シリコンウェハ上に加工された細孔のアレイである。別の実施形態では、各ウェルの直径が１０～１０００μｍである。ＰＣＲに必要な温度の制御は、ウェルのアレイを有するシリコンウェハにセンサ及び加熱素子を埋め込むことによって、或いは温度制御された環境内にウェハ全体を配置することによって行う。１つの実施形態では、各ウェルに結合されたＣＭＯＳ又はＣＣＤが各ウェルからの蛍光信号を記録する。シーケンシング系内のｄＰＣＲについては、１又は２以上の選択されたウェルからの試料が、漏斗状ナノ細孔におけるＤＮＡ配列の読み取りに必要な処理のために下流に進むことができる。ｄＰＣＲが単独装置として存在する時には、１つの開口部においてＨツリー構造チャネルの出口に接続された細孔のアレイを、ＤＮＡ試料を回収すべき場合に除去できる膜によってシールする。図１７及び図１８に、本発明における単独のｄＰＣＲの実施形態を示す。この実施形態では、ｄＰＣＲが、ウェルアレイ及びＨツリーマイクロ流体ネットワークから成る。Ｈツリーマイクロ流体ネットワークの各出口は、加工時にウェルアレイ上の対応するウェルに接続される。ウェルアレイ１７０１のマイクロ流体ネットワークに接続されていない方の面は透明膜で覆われて上部チャネルを形成し、Ｈツリーマイクロ流体ネットワーク１７０２のウェルアレイに接続されていない方の面は支持スラブで覆われる。透明膜及び支持スラブは、いずれも明確にするために図１７からは省いている。Ｉ／Ｏポートも図１７から省いている。図１８には、完全なリアルタイムｄＰＣＲモジュールを示す。オイル及び試料の投入口、並びに余剰分レセプタクルは含めているが、透明膜は省略している。１つの実施形態では、ｄＰＣＲの試料装入が、１）モジュールを合成油で部分的に満たし、２）チャネル内に試料液体を装入し、３）さらなる合成油をポンプ注入して試料液体をウェル内に押し込む、ことによって行われる。例えばＨツリーマイクロ流体ネットワークのように流体チャネルが正しく設計され製造されている場合、試料液体は各ウェルに均等に分布すると予想される。試料液体は、装入後に前面及び背面においてオイルに捕らえられる。蒸発によって水が失われることはなく、すなわち試料装入プロセス全体を通じて分析物の濃度は維持される。投入される試料液体の容積には限界があり、アレイ内の全てのウェルの全容積よりも小さいと予想されるので、試料液体の初期体は、階層的流体ネットワーク内の各連続するレベルにおいて小さいけれども等しい容積に分割される。最後には、異なるウェル内に最終的な「小滴」が分配される。各小滴の位置は、温度サイクル前、温度サイクル中及び温度サイクル後にアレイ内に固定される。外部撮像装置を用いて、温度サイクルにおける各サイクルの異なる波長の蛍光画像を取り込むことができる。このことは、ＰＣＲの進行をリアルタイムでモニタできること、すなわちリアルタイムｄＰＣＲを意味する。必要時には、針を用いて透明膜を穿孔し、さらなるプロセスのために注射器又は中空光ファイバを用いてウェルから関心小滴を抽出することができる。ｄＰＣＲチップは、ウェルのサイズに基づいて、以下の技術のうちの１つ又は２つ以上によって加工することができる。１つの実施形態では、数百ミクロンの直径を有するウェルを加工するために３Ｄ印刷又は成形を使用する。別の実施形態では、数百～数十ミクロンの直径を有するウェルを加工するためにナノ３Ｄ印刷又はマイクロ成形を使用する。さらなる実施形態では、数十～数ミクロンの直径を有するウェルを加工するために熱プラスチック上のナノインプリント又はシリコン上の半導体製造技術を使用する。シリコンチップの場合には、高速熱サイクルのためにチップ上に加熱素子を組み込むことができる。

【0037】

当業者であれば、Ｈツリー構造を他の用途に使用することもできると容易に認識するであろう。１つの実施形態では、ＤＮＡ分子の代わりに個別細胞などの他の生物学的物質を異なるウェルに取り込んで複数の単一細胞実験を行うことができる。

【0038】

ナノ細孔型シーケンサ
ナノ細孔型シーケンサは、ポータブルゲノム検出及び分析システムを提供する。いくつかの実施形態では、ナノ細孔型シーケンサが、２つの主要コンポーネント、すなわちハードウェア及びソフトウェアを含む。以下、高水準アーキテクチャ及びサブユニットのいくつかの実施形態について説明する。

【0039】

Ａ．ハードウェアシステム
いくつかの実施形態では、ナノ細孔型シーケンサのハードウェアシステムが、２つの主要ユニット、すなわち計算、通信及び制御ユニット、並びにナノ細孔型シーケンシングバイオチップインターフェイスユニットと、様々なモジュールとを含む。図１９に、高水準アーキテクチャの一実施形態を示す。以下、様々な要素の詳細についてさらに説明する。

【0040】

Ｉ．計算、通信及び制御ユニット
１つの実施形態では、ハードウェアシステム１９００が、ディスプレイ装置を有するポータブルコンピュータシステム１９１０を含む。ポータブルコンピュータシステム１９１０は、タブレット、ラップトップ、ネットブック、オールインワン型デスクトップコンピュータ、スマートホン、携帯情報端末（ＰＤＡ）、又はいずれかのハンドヘルドコンピュータ装置などを用いて実装することができる。ポータブルコンピュータシステム１９１０は、オペレーティングシステム（ＯＳ）を実行し、データ分析ソフトウェアを実行し、データを記憶し、ナノ細孔型シーケンシングバイオチップの動作を制御し、ナノ細孔型シーケンシングバイオチップからデータを収集する、中央装置としての役割を果たす。

【0041】

１つの実施形態では、ハードウェアシステム１９００が、ネットワーク通信モジュール１９２０をさらに含む。ネットワーク通信モジュール１９２０は、ＷｉＦｉ、ＷｉＭＡＸ、イーサネット、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ、電話機能、衛星リンク及び全地球測位システム（ＧＰＳ）などのうちの１つ又は２つ以上を含む。ネットワーク通信モジュール１９２０は、データ共有、プログラム更新、データ分析などのために中央コンピュータシステムと通信し、データを共有して複数のコンピュータ装置において並行してデータ分析を実行できるように他のコンピュータ装置と通信し、データ共有、プログラム更新などのために他のＢｌｕｅｔｏｏｔｈ対応装置（例えば、携帯電話機、プリンタなど）と通信し、ＧＰＳ信号を送受信する、通信ハブとしての役割を果たす。

【0042】

１つの実施形態では、ハードウェアシステム１９００が、入力装置１９３０をさらに含む。入力装置１９３０は、キーボード、タッチ画面、マウス、トラックボール、赤外線（ＩＲ）ポインティングデバイス及び音声認識装置などのうちの１つ又は２つ以上を含むことができる。入力装置１９３０は、コマンド入力及びデータ入力のためのヒューマンインターフェイスとしての役割を果たす。

【0043】

１つの実施形態では、ハードウェアシステム１９００が、フラッシュメモリカードインターフェイス、ＩＥＥＥ１３９４インターフェイス、及びユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）インターフェイスなどを含むことができる入力／出力（Ｉ／Ｏ）ポート１９４０をさらに含む。Ｉ／Ｏポート１９４０は、他の電子装置とのシリアルインターフェイス、二次データ記憶インターフェイス、及びナノ細孔型シーケンシングバイオチップの測定データＩ／Ｏとしての役割を果たす。

【0044】

ＩＩ．ナノ細孔型シーケンシングバイオチップインターフェイスユニット
いくつかの実施形態では、ナノ細孔型シーケンシング（ｎＳｅｑ）バイオチップインターフェイスユニット１９５０が、ｎＳｅｑ電子モジュール１９６０、流体制御モジュール１９７０、化学物質貯蔵及び流体Ｉ／Ｏ接続モジュール１９８０、並びにｎＳｅｑ流体制御及び試料Ｉ／Ｏ接続モジュール１９９０に結合する。ｎＳｅｑ電子モジュール１９６０は、核酸モジュールの分配を制御し、ナノ流体チャネルの流速を制御し、測定データを収集し、計算、通信及び制御ユニットにデータを出力する。

【0045】

いくつかの実施形態では、流体制御モジュール１９７０が、緩衝液取り入れ口／出口コネクタと、オンチップ又はオフチップマイクロポンプ及びマイクロバルブの使用とを通じて、化学物質貯蔵庫とｎＳｅｑバイオチップとの間の流体流を制御する。化学物質貯蔵及び流体Ｉ／Ｏ接続モジュール１４８０は、必要に応じてｎＳｅｑバイオチップに化学物質を供給するとともに、化学物質及び／又はバイオ廃棄物貯蔵庫としての役割を果たすこともできる。ｎＳｅｑ流体制御及び試料Ｉ／Ｏ接続モジュール１９９０は、ｎＳｅｑバイオチップ内の流体及び試料の流れを制御するとともに、ｎＳｅｑバイオチップの試料の取り入れ及び排出を制御することもできる。例えば、再び図１０Ｂを参照すると、測定チャンバ＃１１において検出を行いたいと望む場合には、分岐＃１の緩衝液出口が開いて他の全ての緩衝液出口が閉じる。この結果、流体が試料取り入れ口から分岐＃１に向かって流れ、マイクロ流体チャネル沿いの試料案内電極と同期的に連動して測定チャンバ＃１１に試料を送達する。

【0046】

Ｂ．ソフトウェアアーキテクチャ
図２０に、ナノ細孔型シーケンサの一実施形態におけるオペレーティングシステム及びゲノム分析ソフトウェアのソフトウェアコンポーネント及び関連するハードウェアコンポーネントの高水準アーキテクチャを示す。図示のソフトウェアアーキテクチャ内の様々な論理処理モジュールは、コンピュータ可読媒体内に具体化された命令を実行する（図１９のポータブルコンピュータシステム１９１０などの）処理装置が実装することができる。コンピュータ可読媒体は、コンピュータ（例えば、サーバ、パーソナルコンピュータ、ネットワーク装置、携帯情報端末、製造ツール、１又は２以上のプロセッサの組を有するいずれかの装置など）がアクセスできる形の情報を提供（すなわち、記憶及び／又は送信）するいずれかの機構を含む。例えば、コンピュータ可読媒体は、記録可能／記録不可能媒体（例えば、リードオンリメモリ（ＲＯＭ）、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、磁気ディスク記憶媒体、光学記憶媒体、フラッシュメモリデバイスなど）などを含む。

【0047】

上述したように、オペレーティングシステム２０１０は、計算、通信及び制御ユニットにインストールされる。オペレーティングシステム２０１０は、Ｗｉｎｄｏｗｓ、Ｌｉｎｕｘ（登録商標）、又はコンピュータ装置に適したいずれかのオペレーティングシステムを含むことができる。ゲノム解析ソフトウェアは、計算、通信及び制御ユニットにインストールされたオペレーティングシステム２０１０とは別に、５つの処理モジュール、すなわちグラフィカルユーザインターフェイス（ＧＵＩ）２０２０、データビューア２０３０、ゲノムデータ分析器インターフェイス２０４０、ゲノムデータ分析器２０５０及びゲノムデータベース２０６０を含む。以下、図２０を参照しながら、オペレーティングシステム２０１０と、上記の処理モジュール２０２０～２０６０と、他のハードウェアコンポーネントとの間の相互作用のいくつかの実施形態について説明する。

【0048】

いくつかの実施形態では、ゲノムデータ分析器インターフェイス２０４０が、ゲノム分析ソフトウェアアーキテクチャにおけるデータフロー制御ユニットとして機能する。オペレーティングシステム２０１０は、入力装置からコマンド及び／又は入力データを取得した後に、ゲノムデータ分析器インターフェイス２０４０を介してゲノムデータ分析器２０５０に情報を送信する。この結果、これに応じてゲノムデータ分析器２０５０が動作する。ゲノムデータ分析器インターフェイス２０４０は、適切なコマンド（例えば、ＧＥＴ、ＡＤＤなど）を用いてＩ／Ｏポート２０７０とゲノムデータベース２０６０との間のデータフローを制御し、従ってデータベース２０６０に記憶されたデータを送出又は更新することができる。同様に、Ｉ／Ｏポート２０７０及び／又は入力装置２０８０を介して分析器ソフトウェアを定期的に更新することもできる。ゲノムデータ分析器インターフェイス２０４０は、ｎＳｅｑバイオチップインターフェイス２０９０にも結合されてｎＳｅｑバイオチップをモニタする。ｎＳｅｑバイオチップの状態は、分析器インターフェイス２０４０を介してモニタされ、（図１９のポータブルコンピュータシステム１９１０内のディスプレイ装置などの）表示ユニットに表示される。ゲノムデータ分析器インターフェイス２０４０は、ゲノムデータ分析器２０５０からの結果も取得して表示ユニットに表示する。

【0049】

いくつかの実施形態では、ゲノムデータ分析器２０５０が、ゲノム分析ソフトウェアの主要データ分析ユニットである。ゲノムデータ分析器２０５０は、ｎＳｅｑバイオチップから測定結果を取得して分析を行った後に、これらの結果をデータベース２０６０に記憶されているデータと比較して生物学的作用物質を同定する。これらの分析結果は、表示ユニットに表示して、将来的に参照できるようにデータベース２０６０に記憶することができる。

【0050】

ゲノムデータベース２０６０は、既存の生物学的作用物質及び新たに発見された核酸配列を記憶するためのデータリポジトリである。データビューア２０３０は、他のユニットの一部又は全部からデータ及び情報を取得してこれらをディスプレイ装置上に表示するソフトウェアルーチンを含む。

【0051】

以上、ポータブルなリアルタイムの分子分析及び同定のための方法及び装置について説明した。上記の説明から、本発明の態様を少なくとも部分的にソフトウェアで具体化できることが明らかであろう。すなわち、これらの技術は、コンピュータシステム又はその他のデータ処理システムにおいて、これらのシステムのプロセッサがメモリに含まれる一連の命令を実行することに応答して実施することができる。様々な実施形態では、本発明を実施するためにハードワイヤード回路をソフトウェア命令と組み合わせて使用することができる。従って、これらの技術は、ハードウェア回路とソフトウェアとの特定の組み合わせに限定されるものではなく、或いはデータ処理システムが実行する命令のいずれかの特定のソースに限定されるものでもない。また、説明を単純化するために、本明細書全体を通じて様々な機能及び動作をソフトウェアコードによって実行され又は引き起こされるものとして説明していることがある。しかしながら、当業者であれば、このような表現が意味するところは、プロセッサ又はコントローラがコードを実行した結果としてこれらの機能が行われるということであると理解するであろう。

【0052】

本発明は、１つの実施形態において、ニック入り二本鎖ＤＮＡから解離した一本鎖ＤＮＡの短鎖の順序を維持するための装置であって、上記ニック入り二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡの短鎖に解離するための解離ゾーンと、単一の入口及び複数の出口を含む一連のチャネルと、一連のチャネル内の案内電極の組とを備え、上記入口から上記複数の出口のいずれか１つまでの各チャネルの長さが同じであり、上記入口が解離ゾーンの下流に存在し、上記案内電極が、上記一連のチャネルにおける別個のチャネル内に各オリゴヌクレオチドを割り当てる、装置を提供する。

【0053】

１つの実施形態では、上記解離ゾーンが、ニック入り二本鎖ＤＮＡを真っ直ぐに伸ばすための機構を含む。別の実施形態では、上記機構が、マイクロピラー又はナノピラーのアレイを含む。さらなる実施形態では、上記機構がＤＮＡポンプを含む。

【0054】

１つの実施形態では、上記解離ゾーンが熱源を含む。

【0055】

１つの実施形態では、上記解離ゾーンがヘリカーゼを含む。

【0056】

１つの実施形態では、上記一連のチャネルがＨツリー構造を有する。

【0057】

１つの実施形態では、上記装置が、上記出口の各々にウェルを含む。

【0058】

本発明は、１つの実施形態において、デジタルＰＣＲのための装置であって、ニック入り二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡの短鎖に解離するための解離ゾーンと、単一の入口及び複数の出口を含む一連のチャネルと、一連のチャネル内の案内電極の組と、２つの面を含むウェルアレイとを備え、上記入口から上記複数の出口のいずれか１つまでの各チャネルの長さが同じであり、上記入口が解離ゾーンの下流に存在し、上記案内電極が、上記一連のチャネルにおける別個のチャネル内に各オリゴヌクレオチドを割り当て、上記２つの面の一方が、それぞれが一連のチャネルの出口に接続されたウェルを含み、上記２つの面の一方が透明膜を含む、装置を提供する。

【0059】

１つの実施形態では、上記解離ゾーンが、ニック入り二本鎖ＤＮＡを真っ直ぐに伸ばすための機構を含む。１つの実施形態では、上記機構は、マイクロピラー又はナノピラーのアレイを含む。１つの実施形態では、この機構は、ＤＮＡポンプを含む。

【0060】

１つの実施形態では、上記解離ゾーンが熱源を含む。

【0061】

１つの実施形態では、上記解離ゾーンがヘリカーゼを含む。

【0062】

１つの実施形態では、上記一連のチャネルがＨツリー構造を有する。

【0063】

本発明は、１つの実施形態において、本発明の装置に装入を行う方法であって、一連のチャネルを合成油で部分的に満たすステップと、上記一連のチャネルの入口に試料液体を装入するステップと、さらなる合成油をポンプ注入して上記試料液体をウェル内に押し込むステップと、を含む方法を提供する。

【0064】

本発明は、１つの実施形態において、ナノ細孔シーケンサであって、ニック入り二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡの短鎖に解離するための解離ゾーンと、単一の入口及び複数の出口を含む一連のチャネルと、この一連のチャネル内の案内電極の組と、複数のナノ細孔を含むナノ細孔アレイウェハとを備え、上記入口から上記複数の出口のいずれか１つまでの各チャネルの長さが同じであり、上記入口が解離ゾーンの下流に存在し、上記案内電極が、上記一連のチャネルにおける別個のチャネル内に各オリゴヌクレオチドを割り当て、上記複数のナノ細孔の各々が上記複数の出口のうちの１つに接続されたナノ細孔シーケンサを提供する。

【0065】

１つの実施形態では、上記解離ゾーンが、ニック入り二本鎖ＤＮＡを真っ直ぐに伸ばすための機構を含む。

【0066】

１つの実施形態では、上記解離ゾーンが、熱源又はヘリカーゼを含む。

【0067】

１つの実施形態では、上記一連のチャネルがＨツリー構造を有する。

【0068】

本発明は、１つの実施形態において、ナノスリット型シーケンシング法であって、ポータブル分子分析器内のナノスリット型シーケンシングチップから、ポータブル分子分析器に投入される分子の試料に関する測定データを受け取るステップと、この測定データの分析を行って試料内の分子を同定するステップとを含み、ナノスリット型シーケンシングチップが、上記分子の試料の１又は２以上の電気的特性を測定するように構成されて、それぞれが埋め込み検知電極の少なくとも１つの対を含む複数のナノスリットを画定する漏斗状ナノスリットアレイウェハを有し、上記埋め込み検知電極の各対がナノスリットの両側に配置される、方法を提供する。

【0069】

１つの実施形態では、上記ナノスリット型シーケンシングチップが、上記埋め込み検知電極の少なくとも１つの対を用いて上記複数のナノスリットのうちの少なくとも１つにおける抵抗の変化、静電容量の変化、位相の変化又は電流の変化を検出することによって上記測定データを取得する。１つの実施形態では、上記電流がトンネリング電流を含む。

【0070】

１つの実施形態では、複数のナノスリットの各々が、１又は２以上のナノ流体チャネル及び１又は２以上のマイクロ流体チャネルと流体連通する。

【0071】

１つの実施形態では、上記ナノスリット型シーケンシングチップが、上記記埋め込み検知電極の少なくとも１つの対を用いて電圧閉じ込めを行ってナノスリットを通る上記分子の移動速度を制御することによって測定データを取得する。

【0072】

１つの実施形態では、上記ナノスリット型シーケンシングチップが、ナノスリットを通る分子の転移中に、上記埋め込み検知電極の少なくとも１つの対を用いて交流電流を付与して電気信号を検出することによって測定データを取得する。

【0073】

１つの実施形態では、上記ナノスリット型シーケンシングチップが、複数のナノスリットの外部にある電極を用いて複数のナノスリットのうちの少なくとも１つに電圧電位を付与することによって測定データを取得する。

【0074】

本発明は、１つの実施形態において、請求項１に記載のシーケンシング法を実行するためのポータブル分子分析器であって、試料を受け取るように構成された試料取り入れ口と、試料の１又は２以上の電気的特性を測定するように構成されたナノスリット型シーケンシングチップとを備え、上記ナノスリット型シーケンシングチップが上記試料取り入れ口と流体連通し、上記ナノスリット型シーケンシングチップが、それぞれが埋め込み検知電極の少なくとも１つの対を含む複数のナノスリットを画定するナノスリットアレイウェハを有し、上記埋め込み検知電極の各対が上記ナノスリットの両側に配置された、ポータブル分子分析器を提供する。

【0075】

１つの実施形態では、上記複数のナノスリットの各々が、異なる材料で形成された複数の層を含む。

【0076】

１つの実施形態では、上記ナノスリットの長さに沿って同じ深さに存在する第１の電極及び第２の電極を有する。

【0077】

１つの実施形態では、複数の埋め込み検知電極が、少なくとも１つのナノスリットの少なくとも２つの層内に形成される。

【0078】

１つの実施形態では、複数の埋め込み検知電極が、少なくとも１つのナノスリットにおける抵抗の変化、静電容量の変化、位相の変化又は電流の変化を検出するように構成される。

【0079】

１つの実施形態では、上記電流がトンネリング電流を含む。

【0080】

１つの実施形態では、上記ポータブル分子分析器が、ポータブル分子分析器の複数のナノスリットの少なくとも１つの上方に固定された上部電極と、ポータブル分子分析器の少なくとも１つのナノスリットの下方に固定された下部電極とをさらに備え、上記少なくとも１つのナノスリットが、上部電極と下部電極との間に電気的連通のための経路をもたらす。

【0081】

１つの実施形態では、下部電極又は上部電極が集積回路と電気的に連通する。

【0082】

１つの実施形態では、集積回路が、電圧バイアス機構又は電流検知回路を含む。

【0083】

１つの実施形態では、ナノスリット型シーケンシングチップが、それぞれが１又は２以上のナノ流体チャネル及び１又は２以上のマイクロ流体チャネルと流体連通する複数のナノスリットを画定するナノスリットアレイウェハを有する。

【0084】

１つの実施形態では、上記１又は２以上のマイクロ流体チャネルが、１又は２以上のマイクロ流体チャネルに沿って試料を案内するように構成された案内電極を含み、或いは上記１又は２以上のナノ流体チャネルが、１又は２以上のナノ流体チャネルに沿って試料を案内するように構成された案内電極を含む。

【0085】

本発明は、１つの実施形態において、シーケンシング法を実行するためのポータブル分子分析器であって、試料を受け取るように構成された試料取り入れ口と、試料の１又は２以上の電気的特性を測定するように構成されたナノ細孔型シーケンシングチップとを備え、上記ナノ細孔型シーケンシングチップが上記試料取り入れ口と流体連通し、上記ナノ細孔型シーケンシングチップが、それぞれが埋め込み検知電極の少なくとも１つの対を含む複数のナノ細孔を画定するナノ細孔アレイウェハを有し、上記埋め込み検知電極の各対が上記ナノ細孔の両側に配置された、ポータブル分子分析器を提供する。

【0086】

１つの実施形態では、上記ナノ細孔型シーケンシングチップが、測定チャンバに向けて試料を案内する第１の１又は２以上の試料案内電極の組と、試料を測定チャンバから離れるように案内する第２の１又は２以上の試料案内電極の組と、複数のナノ細孔を含むナノ細孔アレイウェハと、ナノ細孔アレイウェハの上面に接合された上部ウェハと、ナノ細孔アレイウェハの底面に接合された底部ウェハと、上部ウェハ及びナノ細孔アレイウェハによって画定された１又は２以上のナノ流体チャネルと、底部ウェハ及びナノ細孔アレイウェハによって画定された１又は２以上のマイクロ流体チャネルと、それぞれがナノ細孔と上部駆動電極と下部駆動電極とを含む複数の測定チャンバと、を備えたナノ細孔型シーケンシングチップ、又は、誘電材料層を挟んだ２つの導電材料層と、複数のナノ細孔とを含むナノ細孔アレイウェハであって、複数のナノ細孔がナノ細孔アレイウェハの厚み全体を横切る、ナノ細孔アレイウェハと、ナノ細孔アレイウェハの上面に接合された上部ウェハと、ナノ細孔アレイウェハの底面に接合された底部ウェハと、上部ウェハ及びナノ細孔アレイウェハによって画定された１又は２以上のナノ流体チャネルと、底部ウェハ及びナノ細孔アレイウェハによって画定された１又は２以上のマイクロ流体チャネルと、を備え、上記複数のナノ細孔を通過する分子を調べるために上記２つの導電材料層にＡＣ検知電流が付与される、ナノ細孔型シーケンシングチップである。

【0087】

本明細書全体を通じ、「１つの実施形態（ｏｎｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」又は「ある実施形態（ａｎ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」との言及は、その実施形態に関連して説明する特定の特徴、構造又は特性が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味すると理解されたい。従って、本明細書の様々な部分における「いくつかの実施形態（ｓｏｍｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「１つの実施形態（ｏｎｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」又は「別の実施形態（ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」についての２又は３以上の言及は、必ずしも全てが同じ実施形態を示すとは限らないということを強調し、そのように理解されたい。さらに、これらの特定の特徴、構造又は特性は、本発明の１又は２以上の実施形態において適切に組み合わせることもできる。また、複数の実施形態の観点から本発明を説明したが、当業者であれば、本発明は説明した実施形態に限定されるものではないと認識するであろう。本発明の実施形態は、添付の特許請求の範囲において修正及び変更を伴って実施することができる。従って、本明細書及び図面は本発明を限定するものではなく、例示とみなすべきである。

【符号の説明】

【0088】

６０１ 漏斗状ナノ細孔
６０２ 大きな開口部
６０３ 小さな開口部
６０４ 導電層
６０５ 誘電体層
６０６ 貫通孔
６０７ 上部誘電材料層
６０８ 下部誘電材料層

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図5F】

【図5G】

【図5H】

【図5I】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図14D】

【図14E】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】