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特許7522911未処理血漿または脱クリオ血漿からプロトロンビン複合体濃縮物（ＰＣＣ）および第ＩＸ因子を精製するための方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-07-17
(45)【発行日】2024-07-25
(54)【発明の名称】未処理血漿または脱クリオ血漿からプロトロンビン複合体濃縮物（ＰＣＣ）および第ＩＸ因子を精製するための方法
(51)【国際特許分類】
C07K 1/18 20060101AFI20240718BHJP
C07K 14/745 20060101ALI20240718BHJP
C12N 7/04 20060101ALI20240718BHJP
【ＦＩ】
C07K1/18
C07K14/745
C12N7/04
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2023503244
(86)(22)【出願日】2021-07-28
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-08-08
(86)【国際出願番号】 EP2021071181
(87)【国際公開番号】W WO2022023431
(87)【国際公開日】2022-02-03
【審査請求日】2023-01-17
(31)【優先権主張番号】20188209.9
(32)【優先日】2020-07-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】521262714
【氏名又は名称】ザルトリウス ビーアイエー セパレーションズ ディー．オー．オー．
(74)【代理人】
【識別番号】110001519
【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ジョシク、ジューロ
(72)【発明者】
【氏名】ベージック、マリヤ
(72)【発明者】
【氏名】アンドイェルコヴィチュ、ウロシュ
【審査官】西澤 龍彦
(56)【参考文献】
【文献】JOSIC, D et al.，Preparation of vitamin K-dependent proteins, such as clotting factors II, VII, IX and X and clotting inhibitor Protein C，Journal of Chromatography B，2003年，Vol. 790，pp. 183-197
【文献】BRGLES, M et al.，Selectivity of monolithic supports under overloading conditions and their use for separation of human plasma and isolation of low abundance proteins，Journal of Chromatography A，2011年，Vol. 1218，pp. 2389-2395
【文献】BRANOVIC, K et al.，Application of monoliths for downstream processing of clotting factor IX，Journal of Chromatography A，2000年，Vol. 903，pp. 21-32
【文献】BRANOVIC, K et al.，Application of semi-industrial monolithic columns for downstream processing of clotting factor IX，Journal of Chromatography B，2003年，Vol. 790，pp. 175-182
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ
Ｃ１２Ｎ
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
未処理血漿（complete plasma）または脱クリオ血漿（cryo-poor plasma）からモノリス型固定相を使用するクロマトグラフィーによってプロトロンビン複合体濃縮物（ＰＣＣ）を精製するための方法であって、ａ）陰イオン交換体で未処理血漿または脱クリオ血漿に対する第１のサンプル置換クロマトグラフィー工程を実施して、ＰＣＣに富む第１の分画を得ることを含む、
方法。
【請求項2】
前記脱クリオ血漿は希釈されていない、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記第１のサンプル置換クロマトグラフィー工程は弱陰イオン交換体または強陰イオン交換体を用いて実施される、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項4】
ｂ）前記第１のサンプル置換クロマトグラフィー工程から前記ＰＣＣに富む第１の分画を溶出させた後、前記ＰＣＣに富む第１の分画に対する第２のクロマトグラフィー工程を陰イオン交換体を用いて実施して、ＰＣＣに富む第２の分画を得ることをさらに含む、請求項１～請求項３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
前記第２のクロマトグラフィー工程の前記陰イオン交換体は、バルク材料またはモノリス型材料である、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
ｃ）前記ＰＣＣに富む第２の分画に対する第３のクロマトグラフィー工程を陽イオン交換体を用いて実施して、第ＩＸ因子に富み、前記ＰＣＣの他の成分は枯渇しているまたは除去されている第３の分画を得ることをさらに含む、請求項４または請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記ＰＣＣの他の成分は第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、および第Ｘ因子である、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記陽イオン交換体は－ＳＯ３基、－ＳＯ４基、または－ＰＯ４基を有する、請求項６または請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記第３のクロマトグラフィー工程の前記陽イオン交換体は、バルク材料またはモノリス型材料である、請求項６～請求項８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
前記第１の分画、前記第２の分画および前記第３の分画の少なくとも１つに安定化剤が加えられる、請求項６～請求項９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
前記安定化剤は正に荷電したアミノ酸である、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記第１の分画、前記第２の分画および前記第３の分画の少なくとも１つに対してウイルスろ過工程が行われる、請求項６～請求項１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
前記第１の分画、前記第２の分画および前記第３の分画の少なくとも１つにヘパリンが加えられる、請求項６～請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
溶媒／界面活性剤によるウイルス不活化工程をさらに含む、請求項１～請求項１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
溶媒／界面活性剤によるウイルス不活化工程をさらに含み、前記溶媒／界面活性剤によるウイルス不活化工程が前記第３のクロマトグラフィー工程の前に実施される、請求項６～請求項１３のいずれか１項に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、未処理血漿（complete plasma）または脱クリオ血漿（cryo-poor plasma）からクロマトグラフィーを使用してプロトロンビン複合体濃縮物（ＰＣＣ）および第ＩＸ因子を精製するための方法、ならびに、本発明の方法によりそれぞれ得ることが可能なＰＣＣを含む分画および第ＩＸ因子を含む分画に関する。
【背景技術】
【0002】
第ＩＸ因子複合体としても知られるプロトロンビン複合体濃縮物（ＰＣＣ）は、血液凝固第ＩＩ因子、第ＩＸ因子、および第Ｘ因子で構成される製剤である［１］。一部の製剤（version）には第ＶＩＩ因子も含まれている［２］。これは、血友病Ｂの出血を治療および予防するために純粋な第ＩＸ因子が利用できない場合に使用される［１］［３］。また、ワルファリン療法などの他の理由により、タンパク質Ｋ（protein K）依存性凝固因子およびインヒビターが十分でない患者に使用される場合もある［３］。これは、ゆっくりとした静脈注射によって、静脈中にゆっくりと注入することによって与えられる［１］。プロトロンビン複合体濃縮物は１９６０年代に医療用途に使用されるようになった［５］。プロトロンビン複合体濃縮物は世界保健機関の必須医薬品リストに載っており、医療システムで必要とされる最も安全で最も効果的な医薬品である［６］［７］。プロトロンビン複合体濃縮物はヒトの血漿から作製される［４］。組み換え法によって作製され、第ＩＸ因子だけを含む製剤（version）も入手可能である［８］。
【0003】
ＰＣＣは、ワルファリンおよび他のビタミンＫ拮抗薬の抗凝固薬の効果を中和して（reverse）、凝固障害がある患者が著しく出血した場合に使用される。そのような人が緊急手術治療を受けなければならない場合にも使用される［９］。他の用途には、先天性または肝疾患による凝固因子の１つの欠乏、および、血友病Ｂが含まれる。Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｓｔ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓからのガイドラインを含むいくつかのガイドラインでは、重度の出血を伴う患者のワルファリンの中和（reversal）にＰＣＣが推奨されている［１０］［１１］［１２］［１３］。
【0004】
ＥＰ０５４９９６４Ａ２には、ビタミンＫ依存性凝固因子プロトロンビン（第ＩＩ因子）、プロコンバーチン（第ＶＩＩ因子）、スチュアート・プロワー因子（第Ｘ因子）および血友病Ｂ因子（第ＩＸ因子）、ならびにビタミンＫ依存性凝固インヒビターであるタンパク質Ｃ、タンパク質Ｓおよびタンパク質Ｚを含むウイルス不活性化されたプロトロンビン複合体濃縮物（ＰＣＣ調製物）の製造方法であって、安定化された脱クリオ血漿に対するクロマトグラフィーをイオン交換材料で実施する製造方法が開示されている。クリオプレシピテーションおよびクリオグロブリン除去の後、クエン酸塩で安定化された血漿はＱＡＥ修飾デキストランを用いた陰イオン交換材料で処理される。溶出後、得られた分画に対する第１の限外ろ過が適切な緩衝液を用いて行われ、そうして得られた粗ＰＰＳＢ抽出物に対するクロマトグラフィーがＤＥＡＥ修飾デキストランまたはアガロース（セファロース）で行われ、続いて適切な緩衝液で溶出される。
【発明の概要】
【0005】
本発明の根底にある目的は、サンプル置換クロマトグラフィーの原理を利用する方法によって解決される。そのようなクロマトグラフィーは、精製プロセスの第１の（initial）段階でモノリス型陰イオン交換分離媒体とともに使用される。
【0006】
本発明の主題は、未処理血漿または脱クリオ血漿（特に、希釈されていない脱クリオ血漿）からモノリス型固定相を使用するクロマトグラフィーによってプロトロンビン複合体濃縮物（ＰＣＣ）を精製するための方法であって、
ａ）陰イオン交換体で未処理血漿または脱クリオ血漿に対する第１のサンプル置換クロマトグラフィー工程を実施して、ＰＣＣに富む第１の分画を得ることを含む、
方法である。
ａ）陰イオン交換体で未処理血漿または脱クリオ血漿に対する第１のサンプル置換クロマトグラフィー工程を実施して、ＰＣＣに富む第１の分画を得ることを含む、
方法である。
【0007】
いくつかの実施形態では、さらなるクロマトグラフィー工程が用いられる。
【0008】
本発明の実施形態では、第１のクロマトグラフィー工程は弱陰イオン交換体または強陰イオン交換体を用いて実施されてもよい。
【0009】
本発明の別の実施形態では、方法は、
ｂ）第１のサンプル置換クロマトグラフィーからＰＣＣに富む第１の分画を溶出させた後、ＰＣＣに富む第１の分画に対する第２のクロマトグラフィー工程を陰イオン交換体を用いて実施して、ＰＣＣに富む第２の分画を得ることをさらに含み得る。
ｂ）第１のサンプル置換クロマトグラフィーからＰＣＣに富む第１の分画を溶出させた後、ＰＣＣに富む第１の分画に対する第２のクロマトグラフィー工程を陰イオン交換体を用いて実施して、ＰＣＣに富む第２の分画を得ることをさらに含み得る。
【0010】
本発明のさらに別の実施形態では、方法は、
ｃ）ＰＣＣに富む第２の分画に対する第３のクロマトグラフィー工程を陽イオン交換体を用いて実施して、第ＩＸ因子に富み、ＰＣＣの他の成分（すなわち、第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、および第Ｘ因子）は枯渇していてもよいまたは除去されていてもよい分画を得ることをさらに含んでいてもよい。
ｃ）ＰＣＣに富む第２の分画に対する第３のクロマトグラフィー工程を陽イオン交換体を用いて実施して、第ＩＸ因子に富み、ＰＣＣの他の成分（すなわち、第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、および第Ｘ因子）は枯渇していてもよいまたは除去されていてもよい分画を得ることをさらに含んでいてもよい。
【0011】
本発明の方法を実施することによって希釈されていない脱クリオ血漿を使用できるという予想外の知見により、本方法は、血漿を２倍以上、多くの場合５倍も希釈する必要がある［１５］で言及されている従来技術に対して有利である。これにより、生理活性タンパク質の活性が失われるのを防ぐ。
【0012】
本発明のさらに別の実施形態では、陽イオン交換体は－ＳＯ３基、－ＳＯ４基、または－ＰＯ４基を備えていてもよい。ＳＯ４（硫酸塩）モノリスからの溶出は、塩勾配またはｐＨ勾配のどちらかによって実施され得る。
【0013】
本発明のさらなる実施形態では、第２のクロマトグラフィー工程および／または第３のクロマトグラフィー工程の陰イオン交換体および／または陽イオン交換体は、それぞれバルク材料またはモノリス型材料であり得る。
【0014】
本発明の実施形態は、溶媒／界面活性剤によるウイルス不活化工程を含んでいてもよい。溶媒／界面活性剤によるウイルス不活化工程は第３のクロマトグラフィー工程の前に実施され得る。
【0015】
本発明の別の実施形態は、第１の分画、第２の分画および第３の分画の少なくとも１つに安定化剤を加えることを提供することができ、安定化剤は、特に、正に荷電したアミノ酸（リシンなど）であり得る。本発明の方法のこの段階では、第１の分画、第２の分画および第３の分画の少なくとも１つにヘパリンが加えられてもよい。
【0016】
本発明のさらなる実施形態は、第１の分画、第２の分画および第３の分画の少なくとも１つに対して行われ得るウイルスろ過工程を提供することができる。
【0017】
本発明の主題はまた、以下の工程を含む方法により得ることが可能な第ＩＸ因子を含む分画である：
（１）希釈されていない脱クリオ血漿を提供すること、
（２）希釈されていない脱クリオ血漿を用いたサンプル置換クロマトグラフィーを、約６μｍの細孔を有するモノリス型の弱陰イオン交換材料または強陰イオン交換材料（ＤＥＡＥまたはＱモノリス型材料など）を用いて実施すること、
（３ａ）約１００ｍＭ～約３００ｍＭ（特に、約２００ｍＭ）のＮａＣｌを含む第１のＮａＣｌ緩衝液を用いて弱陰イオン交換モノリス型材料または強陰イオン交換モノリス型材料を洗浄すること、
（３ｂ）続いて、約２００ｍＭ～約３５０ｍＭ（特に、約２８０ｍＭ）のＮａＣｌを含むより高い濃度の第２のＮａＣｌ緩衝液を用いて洗浄すること、
（３ｃ）約１Ｍ～約２．５Ｍ（特に、約２Ｍ）のＮａＣｌを含むＮａＣｌ緩衝液を用いた溶出、
（４）続いて、弱陰イオン交換材料または強陰イオン交換材料を用いたクロマトグラフィーを実施し、任意に（optionally）、工程（４）の後に得られた分画の一部をＰＣＣ製造のために使用すること、
（５）約０．１％のＬ－リシンモノクロリドを用いた安定化、
（６）約０．３％（ｗ／ｗ）ＴｎＢＰ、約１％（ｗ／ｗ）Ｔｗｅｅｎ８０を用いた２６～２８℃での６～８時間のウイルス不活化、
（７）陽イオン交換クロマトグラフィー、
（８）ＣＩＭモノリスでのウイルスろ過、
（９）第ＩＸ因子１ＩＵあたり約０．１ＩＵのヘパリンを加えること、
（１０）任意に、陽イオン交換材料から溶出物を分離すること。
（１）希釈されていない脱クリオ血漿を提供すること、
（２）希釈されていない脱クリオ血漿を用いたサンプル置換クロマトグラフィーを、約６μｍの細孔を有するモノリス型の弱陰イオン交換材料または強陰イオン交換材料（ＤＥＡＥまたはＱモノリス型材料など）を用いて実施すること、
（３ａ）約１００ｍＭ～約３００ｍＭ（特に、約２００ｍＭ）のＮａＣｌを含む第１のＮａＣｌ緩衝液を用いて弱陰イオン交換モノリス型材料または強陰イオン交換モノリス型材料を洗浄すること、
（３ｂ）続いて、約２００ｍＭ～約３５０ｍＭ（特に、約２８０ｍＭ）のＮａＣｌを含むより高い濃度の第２のＮａＣｌ緩衝液を用いて洗浄すること、
（３ｃ）約１Ｍ～約２．５Ｍ（特に、約２Ｍ）のＮａＣｌを含むＮａＣｌ緩衝液を用いた溶出、
（４）続いて、弱陰イオン交換材料または強陰イオン交換材料を用いたクロマトグラフィーを実施し、任意に（optionally）、工程（４）の後に得られた分画の一部をＰＣＣ製造のために使用すること、
（５）約０．１％のＬ－リシンモノクロリドを用いた安定化、
（６）約０．３％（ｗ／ｗ）ＴｎＢＰ、約１％（ｗ／ｗ）Ｔｗｅｅｎ８０を用いた２６～２８℃での６～８時間のウイルス不活化、
（７）陽イオン交換クロマトグラフィー、
（８）ＣＩＭモノリスでのウイルスろ過、
（９）第ＩＸ因子１ＩＵあたり約０．１ＩＵのヘパリンを加えること、
（１０）任意に、陽イオン交換材料から溶出物を分離すること。
【0018】
本発明の第ＩＸ因子を含む分画は、１２０ＩＵ／ｍｇタンパク質よりも高い第ＩＸ因子比活性という特徴を有していてもよい。他のタンパク質Ｋ依存性凝固因子およびインヒビターは微量存在するとしても検出限界を下回る。
【0019】
本発明の別の主題は、以下の工程を含む方法により得ることが可能なＰＣＣを含む分画である：
（１）希釈されていない脱クリオ血漿を提供すること、
（２）希釈されていない脱クリオ血漿を用いたサンプル置換クロマトグラフィーを、約６μｍの細孔を有するモノリス型の弱陰イオン交換材料または強陰イオン交換材料（ＤＥＡＥまたはＱモノリス型材料など）を用いて実施すること、
（３ａ）約１００ｍＭ～約３００ｍＭ（特に、約２００ｍＭ）のＮａＣｌを含む第１のＮａＣｌ緩衝液を用いて弱陰イオン交換モノリス型材料または強陰イオン交換モノリス型材料を洗浄すること、
（３ｂ）続いて、約２００ｍＭ～約３５０ｍＭ（特に、約２８０ｍＭ）のＮａＣｌを含むより高い濃度の第２のＮａＣｌ緩衝液を用いて洗浄すること、
（３ｃ）約６００ｍＭ～約２．５Ｍ（特に、約１ ２Ｍ）のＮａＣｌを含むＮａＣｌ緩衝液を用いた溶出、
（４）続いて、弱陰イオン交換材料または強陰イオン交換材料（ＣＩＭ ＤＥＡＥクロマトグラフィー材料など）を用いてクロマトグラフィーを実施すること、
（５）任意に、弱陰イオン交換材料または強陰イオン交換材料から溶出物を分離すること。
（１）希釈されていない脱クリオ血漿を提供すること、
（２）希釈されていない脱クリオ血漿を用いたサンプル置換クロマトグラフィーを、約６μｍの細孔を有するモノリス型の弱陰イオン交換材料または強陰イオン交換材料（ＤＥＡＥまたはＱモノリス型材料など）を用いて実施すること、
（３ａ）約１００ｍＭ～約３００ｍＭ（特に、約２００ｍＭ）のＮａＣｌを含む第１のＮａＣｌ緩衝液を用いて弱陰イオン交換モノリス型材料または強陰イオン交換モノリス型材料を洗浄すること、
（３ｂ）続いて、約２００ｍＭ～約３５０ｍＭ（特に、約２８０ｍＭ）のＮａＣｌを含むより高い濃度の第２のＮａＣｌ緩衝液を用いて洗浄すること、
（３ｃ）約６００ｍＭ～約２．５Ｍ（特に、約１ ２Ｍ）のＮａＣｌを含むＮａＣｌ緩衝液を用いた溶出、
（４）続いて、弱陰イオン交換材料または強陰イオン交換材料（ＣＩＭ ＤＥＡＥクロマトグラフィー材料など）を用いてクロマトグラフィーを実施すること、
（５）任意に、弱陰イオン交換材料または強陰イオン交換材料から溶出物を分離すること。
【0020】
本発明のＰＣＣを含む分画は、２～１０ＩＵ／ｍｇタンパク質の凝固第ＩＸ因子比活性とそれに対応してバランスのとれたビタミンＫ依存性凝固因子およびインヒビター両方の濃度という特徴を有し得る。
【発明を実施するための形態】
【0021】
イオン交換クロマトグラフィーでは、溶質イオンおよび固定相の電荷に基づく溶質イオンと固定相の相互作用によって、どのイオンがどの程度結合するかが決まる。固定相が陰イオンを引き付ける陽性の基を有する場合、固定相は陰イオン交換体と呼ばれる。固定相に陰性の基があると、陽イオンが引き寄せられ、固定相は陽イオン交換体である。イオンと固定相の間の引力は、イオン交換体として使用される有機粒子である樹脂にも依存する。
【0022】
陰イオン交換クロマトグラフィーは、正に荷電した基（ジエチル－アミノエチル基（ＤＥＡＥ）など）を含有するイオン交換樹脂を用いて、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび物質の電荷に基づいて物質を分離する方法である。溶液中では、樹脂は正に荷電した対イオン（陽イオン）で覆われている。陰イオン交換樹脂は負に荷電した分子に結合し、対イオンを置換する。陰イオン交換クロマトグラフィーは、一般に、タンパク質、アミノ酸、糖類／炭水化物、およびより高いｐＨレベルで負電荷を有する他の酸性物質を精製するために使用される。物質と樹脂の間の結合の強さは、物質の負電荷の強さによって決まる。
【0023】
当業者は、強陰イオン交換体と弱陰イオン交換体という２種の異なる陰イオン交換体を区別している。「強」イオン交換体は、カラムが平衡化されてもマトリックスが電荷を失わないため、多様なｐＨ緩衝液を使用することができる。「弱」イオン交換体には、電荷が維持されるｐＨ値の範囲が存在する。弱イオン交換カラムに用いられる緩衝液のｐＨがマトリックスの許容範囲を超えると、カラムの電荷分布が損なわれ、目的とする分子を見失う場合がある。弱イオン交換体はｐＨ範囲が狭いが、特異性がより高いため、強イオン交換体よりも使用されることが多い。一部の実験では、弱イオン交換体の保持時間は、高い特異性で目的のデータを取得するのに十分な長さである。
【0024】
陰イオン交換カラムの樹脂（「ビーズ」と呼ばれることが多い）は官能基（弱塩基／強塩基など）を有していてもよい。強イオン交換樹脂の官能基の例としては、陰イオン交換体である第４級アンモニウムカチオン（Ｑ）、および、陽イオン交換体であるスルホン酸（Ｓ、－ＳＯ２ＯＨ）がある。これらのタイプの交換体は、０～１４のｐＨ範囲において電荷密度を維持することができる。弱イオン交換樹脂の官能基としては、陰イオン交換体であるジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ、－Ｃ２Ｈ４Ｎ（ＣＨ２Ｈ５）２）、および、陽イオン交換体であるカルボキシメチル（ＣＭ、－ＣＨ２－ＣＯＯＨ）が挙げられる。これら２タイプの交換体は、５～９のｐＨ範囲においてカラムの電荷密度を維持することができる。
【0025】
本発明によれば、未処理血漿または脱クリオ血漿からのプロトロンビン複合体濃縮物（ＰＣＣ）は、モノリス型陰イオン交換体で未処理血漿または脱クリオ血漿（特に、希釈されていない脱クリオ血漿）に対する第１のサンプル置換クロマトグラフィー工程を実施して、ＰＣＣに富む第１の分画を得ることによって精製される。
【0026】
本発明によれば、第１のクロマトグラフィー工程は、モノリス型の弱陰イオン交換体または強陰イオン交換体を用いて実施される。
【0027】
ＵＳ５，４５３，１８５Ａには、モノリス型分離材料が開示されている。モノリスは、クロマトグラフィーにおける粒子系の固定相の選択肢として見なすことができる。シリカモノリスとポリマーモノリスは両方とも、分離効率を大幅に損なうことなく高速分離することを可能にする。特に有用なのは、６μｍの細孔を有するＤＥＡＥまたはＱイオン交換モノリスである。
【0028】
本発明によれば、サンプル置換クロマトグラフィーを可能とするローディング条件を調節することが重要である。逆相モードおよびイオン交換モードのサンプル置換クロマトグラフィー（ＳＤＣ）は約２０年前に導入された。この方法は、サンプル混合物中の成分の相対的な結合親和性を利用している。クロマトグラフィー分離の開始時では、分離される溶質の混合物（本発明の場合は未処理血漿または脱クリオ血漿）が、高い保持性を促進するように選択された条件下でモノリス型分離材料を備えたカラムに付与される。親和性の高い溶質はカラムのヘッド付近で優先的に保持され、親和性の低い溶質は下流へと移動する。最速で移動する成分は、下流で純粋な帯域を形成し始める。その他の成分の帯域も形成し始めるが、カラムのヘッドで混合フィードを継続的に供給すると十分な分離が妨げられる。ローディング中、各サンプル成分間の固定相の表面への収着が競合する。
【0029】
ＳＤＣは、タンパク質の分取精製に最初に使用された。後に、この種のクロマトグラフィーは、イオン交換モード、アフィニティーモード、および疎水性相互作用モードでも実施できることが立証された。ＳＤＣは、分析スケールと分取スケール両方において、モノリス型支持体およびメンブレン系支持体を用いて実施できることも示されている。最近では、イオン交換モードおよび疎水性相互作用モードのＳＤＣを用いたモノクローナル抗体調製物からの微量タンパク質の除去、および、ヒト血漿からの存在量が少ないタンパク質の濃縮にも成功した。このレビューでは、ＳＤＣの原理が紹介され、微量分析スケール、分析スケール、および分取スケールでのタンパク質とペプチドの分離の可能性について検討されている［１４］。
【0030】
ローディング後、弱陰イオン交換体または強陰イオン交換体（特に、モノリス型材料）は、約１００ｍＭ～約３００ｍＭ（特に、約２００ｍＭ）のＮａＣｌを含む第１のＮａＣｌ緩衝液を用いて洗浄され得る。続いて、約２００ｍＭ～約３５０ｍＭ（特に、約２８０ｍＭ）のＮａＣｌを含むより高い濃度の第２のＮａＣｌ緩衝液を用いて洗浄され得る。
【0031】
第１の分画の溶出は、約１Ｍ～約２．５Ｍ（特に、約２Ｍ）のＮａＣｌを含むＮａＣｌ緩衝液を用いて行われる。
【0032】
第１のサンプル置換クロマトグラフィーからＰＣＣに富む第１の分画を溶出させた後、ＰＣＣに富む第１の分画に対する第２のクロマトグラフィー工程をバルクまたはモノリス型分離材料（特に、モノリス型のＣＩＭ ＤＥＡＥ材料またはＱ材料）を用いた陰イオン交換体を用いて実施して、溶出後、ＰＣＣに富む第２の分画を得てもよい。溶出物はＰＣＣ製造に使用され得る。
【0033】
ＰＣＣに富む第２の分画に対して第３のクロマトグラフィー工程を実施して、第ＩＸ因子を得てもよい。第３のクロマトグラフィー工程は陽イオン交換体を用いて実施され、第ＩＸ因子に富み、ＰＣＣの他の成分（すなわち、第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、および第Ｘ因子）は枯渇しているまたは除去されている第３の分画が得られる。
【0034】
陽イオン交換体は－ＳＯ３基、－ＳＯ４基、または－ＰＯ４基を有していてもよい。陽イオン交換体も陰イオン交換体と同様に粒状材料またはモノリス型材料であり得る。
【0035】
溶媒／界面活性剤によるウイルス不活性化工程は、規制当局による要求事項（regulatory requirements）により、治療用途に必須である。溶媒／界面活性剤によるウイルス不活化工程は、第３のクロマトグラフィー工程の前に実施され得る。ウイルス不活化の適切な方法はＥＰ０１３１７４０Ａ２に記載されている。
【0036】
第１の分画、第２の分画および第３の分画の少なくとも１つに安定化剤を加えることが有利である。安定化剤は、特に、正に荷電したアミノ酸（リシンなど）である。また、本発明の方法のこの段階で、第１の分画、第２の分画および第３の分画の少なくとも１つにヘパリンが加えられてもよい。
【0037】
規制当局による命令（regulatory orders）によって要求される場合、第１の分画、第２の分画、および第３の分画の少なくとも１つに対してウイルスろ過［１６］工程が行われてもよい。
【0038】
本発明の方法は、第ＩＸ因子を含む分画を提供する。各第ＩＸ因子含有分画は、以下の工程を含む方法により得ることが可能である：
（１）希釈されていない脱クリオ血漿を提供すること、
（２）希釈されていない脱クリオ血漿を用いたサンプル置換クロマトグラフィーを、約６μｍの細孔を有するモノリス型の弱陰イオン交換材料または強陰イオン交換材料（ＤＥＡＥまたはＱモノリス型材料など）を用いて実施すること、
（３ａ）約１００ｍＭ～約３００ｍＭ（特に、約２００ｍＭ）のＮａＣｌを含む第１のＮａＣｌ緩衝液を用いて弱陰イオン交換モノリス型材料または強陰イオン交換モノリス型材料を洗浄すること、
（３ｂ）続いて、約２００ｍＭ～約３５０ｍＭ（特に、約２８０ｍＭ）のＮａＣｌを含むより高い濃度の第２のＮａＣｌ緩衝液を用いて洗浄すること、
（３ｃ）約１Ｍ～約２．５Ｍ（特に、約２Ｍ）のＮａＣｌを含むＮａＣｌ緩衝液を用いた溶出、
（４）続いて、弱陰イオン交換材料または強陰イオン交換材料を用いたクロマトグラフィーを実施し、任意に、工程（４）の後に得られた分画の一部をＰＣＣ製造のために使用すること、
（５）約０．１％のＬ－リシンモノクロリドを用いた安定化、
（６）約０．３％（ｗ／ｗ）ＴｎＢＰ、約１％（ｗ／ｗ）Ｔｗｅｅｎ８０を用いた２６～２８℃での６～８時間のウイルス不活化、
（７）陽イオン交換クロマトグラフィー、
（８）ＣＩＭモノリスでのウイルスろ過、
（９）第ＩＸ因子１ＩＵあたり約０．１ＩＵのヘパリンを加えること、
（１０）任意に、陽イオン交換材料から溶出物を分離すること。
（１）希釈されていない脱クリオ血漿を提供すること、
（２）希釈されていない脱クリオ血漿を用いたサンプル置換クロマトグラフィーを、約６μｍの細孔を有するモノリス型の弱陰イオン交換材料または強陰イオン交換材料（ＤＥＡＥまたはＱモノリス型材料など）を用いて実施すること、
（３ａ）約１００ｍＭ～約３００ｍＭ（特に、約２００ｍＭ）のＮａＣｌを含む第１のＮａＣｌ緩衝液を用いて弱陰イオン交換モノリス型材料または強陰イオン交換モノリス型材料を洗浄すること、
（３ｂ）続いて、約２００ｍＭ～約３５０ｍＭ（特に、約２８０ｍＭ）のＮａＣｌを含むより高い濃度の第２のＮａＣｌ緩衝液を用いて洗浄すること、
（３ｃ）約１Ｍ～約２．５Ｍ（特に、約２Ｍ）のＮａＣｌを含むＮａＣｌ緩衝液を用いた溶出、
（４）続いて、弱陰イオン交換材料または強陰イオン交換材料を用いたクロマトグラフィーを実施し、任意に、工程（４）の後に得られた分画の一部をＰＣＣ製造のために使用すること、
（５）約０．１％のＬ－リシンモノクロリドを用いた安定化、
（６）約０．３％（ｗ／ｗ）ＴｎＢＰ、約１％（ｗ／ｗ）Ｔｗｅｅｎ８０を用いた２６～２８℃での６～８時間のウイルス不活化、
（７）陽イオン交換クロマトグラフィー、
（８）ＣＩＭモノリスでのウイルスろ過、
（９）第ＩＸ因子１ＩＵあたり約０．１ＩＵのヘパリンを加えること、
（１０）任意に、陽イオン交換材料から溶出物を分離すること。
【0039】
本発明の第ＩＸ因子を含む分画は、１２０ＩＵ／ｍｇタンパク質よりも高い第ＩＸ因子比活性という特徴を有していてもよく、他のタンパク質Ｋ依存性凝固因子およびインヒビターは存在するとしても検出限界を下回る［１６］。
【0040】
本発明の方法は、ＰＣＣを含む分画を提供する。各ＰＣＣ含有分画は、以下の工程を含む方法によって得ることが可能である：
（１）希釈されていない脱クリオ血漿を提供すること、
（２）希釈されていない脱クリオ血漿を用いたサンプル置換クロマトグラフィーを、約６μｍの細孔を有するモノリス型の弱陰イオン交換材料または強陰イオン交換材料（ＤＥＡＥまたはＱモノリス型材料など）を用いて実施すること、
（３ａ）約１００ｍＭ～約３００ｍＭ（特に、約２００ｍＭ）のＮａＣｌを含む第１のＮａＣｌ緩衝液を用いて弱陰イオン交換モノリス型材料または強陰イオン交換モノリス型材料を洗浄すること、
（３ｂ）続いて、約２００ｍＭ～約３５０ｍＭ（特に、約２８０ｍＭ）のＮａＣｌを含むより高い濃度の第２のＮａＣｌ緩衝液を用いて洗浄すること、
（３ｃ）約６００ｍＭ～約２．５Ｍ（特に、約１ ２Ｍ）のＮａＣｌを含むＮａＣｌ緩衝液を用いた溶出、
（４）続いて、弱陰イオン交換材料または強陰イオン交換材料（ＣＩＭ ＤＥＡＥクロマトグラフィー材料など）を用いてクロマトグラフィーを実施すること、
（５）任意に、弱陰イオン交換材料または強陰イオン交換材料から溶出物を分離すること。
（１）希釈されていない脱クリオ血漿を提供すること、
（２）希釈されていない脱クリオ血漿を用いたサンプル置換クロマトグラフィーを、約６μｍの細孔を有するモノリス型の弱陰イオン交換材料または強陰イオン交換材料（ＤＥＡＥまたはＱモノリス型材料など）を用いて実施すること、
（３ａ）約１００ｍＭ～約３００ｍＭ（特に、約２００ｍＭ）のＮａＣｌを含む第１のＮａＣｌ緩衝液を用いて弱陰イオン交換モノリス型材料または強陰イオン交換モノリス型材料を洗浄すること、
（３ｂ）続いて、約２００ｍＭ～約３５０ｍＭ（特に、約２８０ｍＭ）のＮａＣｌを含むより高い濃度の第２のＮａＣｌ緩衝液を用いて洗浄すること、
（３ｃ）約６００ｍＭ～約２．５Ｍ（特に、約１ ２Ｍ）のＮａＣｌを含むＮａＣｌ緩衝液を用いた溶出、
（４）続いて、弱陰イオン交換材料または強陰イオン交換材料（ＣＩＭ ＤＥＡＥクロマトグラフィー材料など）を用いてクロマトグラフィーを実施すること、
（５）任意に、弱陰イオン交換材料または強陰イオン交換材料から溶出物を分離すること。
【0041】
本発明のＰＣＣを含む分画は、２～１０ＩＵ／ｍｇタンパク質の凝固第ＩＸ因子比活性とそれに対応してバランスのとれたビタミンＫ依存性凝固因子およびインヒビター両方の濃度という特徴を有し得る。
【0042】
本発明を以下の非限定的な実施例によってさらに説明する。
【0043】
実施例１
分析方法：
［１６］に公開されているように実施される第ＩＸ因子活性を決定するための分析、モノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体を用いた免疫ブロット、およびＬＣ－ＭＳ／ＭＳによるタンパク質同定－凝固第ＩＸ因子。第ＩＸ因子および他のタンパク質については［１７］を参照。
分析方法：
［１６］に公開されているように実施される第ＩＸ因子活性を決定するための分析、モノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体を用いた免疫ブロット、およびＬＣ－ＭＳ／ＭＳによるタンパク質同定－凝固第ＩＸ因子。第ＩＸ因子および他のタンパク質については［１７］を参照。
【0044】
実施例２
脱クリオ血漿をクロアチアのザグレブにあるＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｌｏｇｙから入手した。提供検体（donations）を、非営利のドナーの同意と上記研究所の倫理委員会の承認の後、ウイルス安全性（血液媒介性のエンベロープウイルスおよび非エンベロープウイルス）について試験した。遠心分離とろ過の後、血漿を２２℃に調節し、モノリス型クロマトグラフィーカラムに直接付与した。
脱クリオ血漿をクロアチアのザグレブにあるＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｌｏｇｙから入手した。提供検体（donations）を、非営利のドナーの同意と上記研究所の倫理委員会の承認の後、ウイルス安全性（血液媒介性のエンベロープウイルスおよび非エンベロープウイルス）について試験した。遠心分離とろ過の後、血漿を２２℃に調節し、モノリス型クロマトグラフィーカラムに直接付与した。
【0045】
サンプル：希釈されていない新鮮凍結血漿、導電率；σ～１２ｍＳ／ｃｍ
サンプル準備：
１）４℃で１００００ｒｐｍ、２０分間の血漿遠心分離。
２）５μｍメンブレン（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州、米国）を用いたろ過。
サンプル準備：
１）４℃で１００００ｒｐｍ、２０分間の血漿遠心分離。
２）５μｍメンブレン（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州、米国）を用いたろ過。
【0046】
実施例３
ＰＣＣの製造
２６５ｍＬの希釈されていない脱クリオ血漿に対するサンプル置換クロマトグラフィーを、約６μｍの細孔を有するモノリス型の弱陰イオン交換材料または強陰イオン交換材料（ＤＥＡＥまたはＱモノリス型材料（ＤＥＡＥ ＣＩＭカラム、８ｍＬ）など）（ＢＩＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｄ．ｏ．ｏ．、アイドフシュチナ、スロベニア）を用いて実施した。脱クリオ血漿を付与した後、まず、陰イオン交換モノリス型材料を２００ｍＭのＮａＣｌ緩衝液を用いて５カラム容量洗浄し、続いて、２８０ｍＭのＮａＣｌを含むより高い濃度の第２の緩衝液を用いて５カラム容量洗浄した。ＰＣＣを２ＭのＮａＣｌを用いて溶出させた。回収したＰＣＣに対してＣＩＭ ＤＥＡＥを用いたクロマトグラフィーを実施し、ＰＣＣを溶出させた。得られたＰＣＣは、５ＩＵ／ｍｇタンパク質の凝固第ＩＸ因子比活性とそれに対応してバランスのとれたビタミンＫ依存性凝固因子およびインヒビター両方の濃度を示した。
ＰＣＣの製造
２６５ｍＬの希釈されていない脱クリオ血漿に対するサンプル置換クロマトグラフィーを、約６μｍの細孔を有するモノリス型の弱陰イオン交換材料または強陰イオン交換材料（ＤＥＡＥまたはＱモノリス型材料（ＤＥＡＥ ＣＩＭカラム、８ｍＬ）など）（ＢＩＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｄ．ｏ．ｏ．、アイドフシュチナ、スロベニア）を用いて実施した。脱クリオ血漿を付与した後、まず、陰イオン交換モノリス型材料を２００ｍＭのＮａＣｌ緩衝液を用いて５カラム容量洗浄し、続いて、２８０ｍＭのＮａＣｌを含むより高い濃度の第２の緩衝液を用いて５カラム容量洗浄した。ＰＣＣを２ＭのＮａＣｌを用いて溶出させた。回収したＰＣＣに対してＣＩＭ ＤＥＡＥを用いたクロマトグラフィーを実施し、ＰＣＣを溶出させた。得られたＰＣＣは、５ＩＵ／ｍｇタンパク質の凝固第ＩＸ因子比活性とそれに対応してバランスのとれたビタミンＫ依存性凝固因子およびインヒビター両方の濃度を示した。
【0047】
実施例４
第ＩＸ因子の製造
２６５ｍｌの希釈されていない脱クリオ血漿に対するサンプル置換クロマトグラフィーを、約６μｍの細孔を有するＤＥＡＥモノリス型材料（ＤＥＡＥ ＣＩＭカラム、８ｍＬ）（ＢＩＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｄ．ｏ．ｏ．、アイドフシュチナ、スロベニア）を用いて実施した。脱クリオ血漿を付与した後、まず、陰イオン交換モノリス型材料を２００ｍＭのＮａＣｌ緩衝液を用いて洗浄し［５カラム容量（５ＣＶ）］、続いて、２８０ｍＭのＮａＣｌを含むより高い濃度の第２の緩衝液を用いて洗浄した［５カラム容量（５ＣＶ）］。２ＭのＮａＣｌ緩衝液を用いて溶出したＰＣＣ分画に対してＤＥＡＥモノリス型材料を用いたクロマトグラフィーを実施した。得られた分画を０．１％Ｌ－リシンを用いて安定化させた。続いて、溶媒／界面活性剤法によるウイルス不活化を、例えば１％（ｖ／ｗ）Ｔｗｅｅｎ８０および０．３％（ｖ／ｗ）ＴｎＢＰを用いて実施した［１８］。
第ＩＸ因子の製造
２６５ｍｌの希釈されていない脱クリオ血漿に対するサンプル置換クロマトグラフィーを、約６μｍの細孔を有するＤＥＡＥモノリス型材料（ＤＥＡＥ ＣＩＭカラム、８ｍＬ）（ＢＩＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｄ．ｏ．ｏ．、アイドフシュチナ、スロベニア）を用いて実施した。脱クリオ血漿を付与した後、まず、陰イオン交換モノリス型材料を２００ｍＭのＮａＣｌ緩衝液を用いて洗浄し［５カラム容量（５ＣＶ）］、続いて、２８０ｍＭのＮａＣｌを含むより高い濃度の第２の緩衝液を用いて洗浄した［５カラム容量（５ＣＶ）］。２ＭのＮａＣｌ緩衝液を用いて溶出したＰＣＣ分画に対してＤＥＡＥモノリス型材料を用いたクロマトグラフィーを実施した。得られた分画を０．１％Ｌ－リシンを用いて安定化させた。続いて、溶媒／界面活性剤法によるウイルス不活化を、例えば１％（ｖ／ｗ）Ｔｗｅｅｎ８０および０．３％（ｖ／ｗ）ＴｎＢＰを用いて実施した［１８］。
【0048】
陽イオン交換クロマトグラフィー：
サンプル：ＣＩＭカラムを用いた２回のＤＥＡＥクロマトグラフィー工程後のヒトプロトロンビン複合体（実施例３を参照）。２０ＩＵの凝固第ＩＸ因子（４ｍｇタンパク質）を含有する溶出物を、ＣＩＭｍｉｃ硫酸塩ＳＯ４ ０．２ｍｌ モノリス型カラム、Ａｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｙｓｔｅｍ、２ｍｌサンプルループにロードした。
ＢＣＡタンパク質分析キット、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ（商標）、Ｃａｔ．＃２３２２５／２３２２７。
マウスで産生されたモノクローナル抗第ＩＸ因子抗体、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ダルムシュタット、ドイツ、Ｃａｔ．＃Ｆ２６４５。
ヤギ抗マウスＩｇＧ、ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、Ｍｉｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州、米国、Ｃａｔ．＃１２－３４９。
ウサギで産生された第Ｘ因子ポリクローナル抗体、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、イリノイ州、米国、Ｃａｔ．＃ＰＡ５－２９１１８。
ヤギ抗ウサギＩｇＧ、ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、Ｍｉｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州、米国、Ｃａｔ．＃１２－３４８。
抗第ＶＩＩ因子抗体、マウスモノクローナル、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｆ８１４６。
プロトロンビンモノクローナル抗体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃ＬＦ－ＭＡ０１７１。
サンプル：ＣＩＭカラムを用いた２回のＤＥＡＥクロマトグラフィー工程後のヒトプロトロンビン複合体（実施例３を参照）。２０ＩＵの凝固第ＩＸ因子（４ｍｇタンパク質）を含有する溶出物を、ＣＩＭｍｉｃ硫酸塩ＳＯ４ ０．２ｍｌ モノリス型カラム、Ａｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｙｓｔｅｍ、２ｍｌサンプルループにロードした。
ＢＣＡタンパク質分析キット、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ（商標）、Ｃａｔ．＃２３２２５／２３２２７。
マウスで産生されたモノクローナル抗第ＩＸ因子抗体、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ダルムシュタット、ドイツ、Ｃａｔ．＃Ｆ２６４５。
ヤギ抗マウスＩｇＧ、ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、Ｍｉｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州、米国、Ｃａｔ．＃１２－３４９。
ウサギで産生された第Ｘ因子ポリクローナル抗体、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、イリノイ州、米国、Ｃａｔ．＃ＰＡ５－２９１１８。
ヤギ抗ウサギＩｇＧ、ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、Ｍｉｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州、米国、Ｃａｔ．＃１２－３４８。
抗第ＶＩＩ因子抗体、マウスモノクローナル、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｆ８１４６。
プロトロンビンモノクローナル抗体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃ＬＦ－ＭＡ０１７１。
【0049】
検出方法：
第ＩＸ因子活性を測定するための分析は［１６］を参照のこと。
モノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体を用いた免疫ブロット、およびＬＣ－ＭＳ／ＭＳによるタンパク質同定－凝固第ＩＸ因子－上記参考文献（血友病）、第ＩＸ因子および他のタンパク質については参考文献［１９］を参照のこと。
第ＩＸ因子活性を測定するための分析は［１６］を参照のこと。
モノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体を用いた免疫ブロット、およびＬＣ－ＭＳ／ＭＳによるタンパク質同定－凝固第ＩＸ因子－上記参考文献（血友病）、第ＩＸ因子および他のタンパク質については参考文献［１９］を参照のこと。
【0050】
クロマトグラフィー：
緩衝液と溶出順序：
平衡化：緩衝液Ａ、４００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ５、３９ｍＳ／ｃｍ、
洗浄：緩衝液Ａ、１０カラム容量
溶出：分画１、緩衝液１：３００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ５、３０．４ｍＳ／ｃｍ、５カラム容量、
分画２、緩衝液２：２５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ５．０３、２６ｍＳ／ｃｍ、５カラム容量、
分画３、緩衝液３：２５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ６、２５．９ｍＳ／ｃｍ、５カラム容量、
分画４、緩衝液４：２５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．２、２５．９ｍＳ／ｃｍ、５カラム容量、
分画５、緩衝液５：５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．２２５、７．７６ｍＳ／ｃｍ、５カラム容量、
分画６、緩衝液６：２０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．２、４．７ｍＳ／ｃｍ、５カラム容量、
分画７、緩衝液７：１０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ８、１．６３ｍＳ／ｃｍ、１０カラム容量。
緩衝液と溶出順序：
平衡化：緩衝液Ａ、４００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ５、３９ｍＳ／ｃｍ、
洗浄：緩衝液Ａ、１０カラム容量
溶出：分画１、緩衝液１：３００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ５、３０．４ｍＳ／ｃｍ、５カラム容量、
分画２、緩衝液２：２５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ５．０３、２６ｍＳ／ｃｍ、５カラム容量、
分画３、緩衝液３：２５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ６、２５．９ｍＳ／ｃｍ、５カラム容量、
分画４、緩衝液４：２５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．２、２５．９ｍＳ／ｃｍ、５カラム容量、
分画５、緩衝液５：５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．２２５、７．７６ｍＳ／ｃｍ、５カラム容量、
分画６、緩衝液６：２０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．２、４．７ｍＳ／ｃｍ、５カラム容量、
分画７、緩衝液７：１０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ８、１．６３ｍＳ／ｃｍ、１０カラム容量。
【0051】
第ＩＸ因子の精製を目的とする場合、４００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ５を用いたカラム平衡化が最良の結果を示すことが判明した。
【0052】
第ＩＸ因子の大部分は、２５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．２を用いて分画４に溶出される。免疫ブロットによって、同じ分画４中に第Ｘ因子がごく少量存在するものの、この分画において第Ｘ因子凝固活性は検出できなかったことが示される。第ＩＸ因子の収率は７０～８０％であった。凝固第ＩＸ因子の比活性は約１９０ＩＵ／ｍｇタンパク質であった。理論上の比活性は約２５０ＩＵ／ｍｇタンパク質である［１６］。
【0053】
第ＩＩ因子および第ＶＩＩ因子は所与の条件ではカラムに結合しない。他の不純物については分析しなかった。主な不純物は通常、ビトロネクチンである［１６］。
【0054】
ＣＩＭモノリスでのウイルスろ過については［１６］に記載されている。
【0055】
得られた第ＩＸ因子は１５０ＩＵ／ｍｇタンパク質よりも高い比活性を有する。他のタンパク質Ｋ依存性凝固因子およびインヒビターは存在するとしても検出限界を下回る。
【0056】
「本明細書において引用されているすべての参考文献は、それらの取り込みが本明細書における明示的な教示と矛盾しない限り、参照により完全に取り込まれる。」
〔付記〕
本開示には下記の態様＜１＞～＜１４＞も含まれる。
＜１＞
未処理血漿（complete plasma）または脱クリオ血漿（cryo-poor plasma）（特に、希
釈されていない脱クリオ血漿）からモノリス型固定相を使用するクロマトグラフィーによってプロトロンビン複合体濃縮物（ＰＣＣ）を精製するための方法であって、
ａ）陰イオン交換体で未処理血漿または脱クリオ血漿に対する第１のサンプル置換クロマトグラフィー工程を実施して、ＰＣＣに富む第１の分画を得ることを含む、
方法。
＜２＞
前記第１のクロマトグラフィー工程は弱陰イオン交換体または強陰イオン交換体を用いて実施される、＜１＞に記載の方法。
＜３＞
ｂ）前記第１のサンプル置換クロマトグラフィーから前記ＰＣＣに富む第１の分画を溶出させた後、前記ＰＣＣに富む第１の分画に対する第２のクロマトグラフィー工程を陰イオン交換体を用いて実施して、ＰＣＣに富む第２の分画を得ることをさらに含む、＜１＞または＜２＞に記載の方法。
＜４＞
ｃ）前記ＰＣＣに富む第２の分画に対する第３のクロマトグラフィー工程を陽イオン交換体を用いて実施して、第ＩＸ因子に富み、前記ＰＣＣの他の成分（すなわち、第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、および第Ｘ因子）は枯渇しているまたは除去されている分画を得ることをさらに含む、＜３＞に記載の方法。
＜５＞
前記陽イオン交換体は－ＳＯ ３ 基、－ＳＯ ４ 基、または－ＰＯ ４ 基を有する、＜４＞に記載の方法。
＜６＞
前記第２のクロマトグラフィー工程および／または前記第３のクロマトグラフィー工程の前記陰イオン交換体および／または前記陽イオン交換体は、それぞれバルク材料またはモノリス型材料である、＜１＞～＜５＞のいずれか１つに記載の方法。
＜７＞
溶媒／界面活性剤によるウイルス不活化工程をさらに含む（好ましくは、溶媒／界面活性剤によるウイルス不活化工程が前記第３のクロマトグラフィー工程の前に実施される）、＜１＞または＜５＞のいずれか１つに記載の方法。
＜８＞
前記第１の分画、前記第２の分画および前記第３の分画の少なくとも１つに安定化剤が加えられる、＜１＞～＜７＞のいずれか１つに記載の方法。
＜９＞
前記安定化剤は正に荷電したアミノ酸（リシンなど）である、＜８＞に記載の方法。
＜１０＞
前記第１の分画、前記第２の分画および前記第３の分画の少なくとも１つに対してウイルスろ過工程が行われる、＜１＞～＜９＞のいずれか１つに記載の方法。
＜１１＞
前記第１の分画、前記第２の分画および前記第３の分画の少なくとも１つにヘパリンが加えられる、＜８＞に記載の方法。
＜１２＞
以下の工程を含む方法により得ることが可能な第ＩＸ因子を含む分画：
（１）希釈されていない脱クリオ血漿を提供すること、
（２）前記希釈されていない脱クリオ血漿を用いたサンプル置換クロマトグラフィーを、約６μｍの細孔を有するモノリス型の弱陰イオン交換材料または強陰イオン交換材料を用いて実施すること、
（３ａ）約１００ｍＭ～約３００ｍＭ（特に、約２００ｍＭ）のＮａＣｌを含む第１のＮ
ａＣｌ緩衝液を用いて前記弱陰イオン交換モノリス型材料または前記強陰イオン交換モノリス型材料を洗浄すること、
（３ｂ）続いて、約２００ｍＭ～約３５０ｍＭ（特に、約２８０ｍＭ）のＮａＣｌを含むより高い濃度の第２のＮａＣｌ緩衝液を用いて洗浄すること、
（３ｃ）約１Ｍ～約２．５Ｍ（特に、約２Ｍ）のＮａＣｌを含むＮａＣｌ緩衝液を用いた溶出、
（４）続いて、弱陰イオン交換材料または強陰イオン交換材料を用いたクロマトグラフィーを実施し、任意に（optionally）、工程（４）の後に得られた分画の一部をＰＣＣ製造のために使用すること、
（５）約０．１％のＬ－リシンを用いた安定化、
（６）ウイルス不活化、
（７）陽イオン交換クロマトグラフィー、
（８）ＣＩＭモノリスでのウイルスろ過、
（９）第ＩＸ因子１ＩＵあたり約０．１ＩＵのヘパリンを加えること、
（１０）任意に（optionally）、前記陽イオン交換材料から溶出物を分離すること。
＜１３＞
以下の工程を含む方法により得ることが可能なＰＣＣを含む分画：
（１）希釈されていない脱クリオ血漿を提供すること、
（２）前記希釈されていない脱クリオ血漿を用いたサンプル置換クロマトグラフィーを、約６μｍの細孔を有するモノリス型の弱陰イオン交換材料または強陰イオン交換材料（ＤＥＡＥまたはＱモノリス型材料など）を用いて実施すること、
（３ａ）約１００ｍＭ～約３００ｍＭ（特に、約２００ｍＭ）のＮａＣｌを含む第１のＮａＣｌ緩衝液を用いて前記弱陰イオン交換モノリス型材料または前記強陰イオン交換モノリス型材料を洗浄すること、
（３ｂ）続いて、約２００ｍＭ～約３５０ｍＭ（特に、約２８０ｍＭ）のＮａＣｌを含むより高い濃度の第２のＮａＣｌ緩衝液を用いて洗浄すること、
（３ｃ）約６００ｍＭ～約２．５Ｍ（特に、約１．２Ｍ）のＮａＣｌを含むＮａＣｌ緩衝液を用いた溶出、
（４）続いて、弱陰イオン交換材料または強陰イオン交換材料（ＣＩＭ ＤＥＡＥクロマトグラフィー材料など）を用いてクロマトグラフィーを実施すること、
（５）任意に（optionally）、前記弱陰イオン交換材料または前記強陰イオン交換材料から溶出物を分離すること。
＜１４＞
１２０ＩＵ／ｍｇタンパク質よりも高い比活性を特徴とする第ＩＸ因子を含む（好ましくは、２～１０ＩＵ／ｍｇタンパク質の凝固第ＩＸ因子比活性とそれに対応してバランスのとれたビタミンＫ依存性凝固因子およびインヒビター両方の濃度を特徴とするＰＣＣを含む）、＜１２＞に記載の分画。
〔付記〕
本開示には下記の態様＜１＞～＜１４＞も含まれる。
＜１＞
未処理血漿（complete plasma）または脱クリオ血漿（cryo-poor plasma）（特に、希
釈されていない脱クリオ血漿）からモノリス型固定相を使用するクロマトグラフィーによってプロトロンビン複合体濃縮物（ＰＣＣ）を精製するための方法であって、
ａ）陰イオン交換体で未処理血漿または脱クリオ血漿に対する第１のサンプル置換クロマトグラフィー工程を実施して、ＰＣＣに富む第１の分画を得ることを含む、
方法。
＜２＞
前記第１のクロマトグラフィー工程は弱陰イオン交換体または強陰イオン交換体を用いて実施される、＜１＞に記載の方法。
＜３＞
ｂ）前記第１のサンプル置換クロマトグラフィーから前記ＰＣＣに富む第１の分画を溶出させた後、前記ＰＣＣに富む第１の分画に対する第２のクロマトグラフィー工程を陰イオン交換体を用いて実施して、ＰＣＣに富む第２の分画を得ることをさらに含む、＜１＞または＜２＞に記載の方法。
＜４＞
ｃ）前記ＰＣＣに富む第２の分画に対する第３のクロマトグラフィー工程を陽イオン交換体を用いて実施して、第ＩＸ因子に富み、前記ＰＣＣの他の成分（すなわち、第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、および第Ｘ因子）は枯渇しているまたは除去されている分画を得ることをさらに含む、＜３＞に記載の方法。
＜５＞
前記陽イオン交換体は－ＳＯ ３ 基、－ＳＯ ４ 基、または－ＰＯ ４ 基を有する、＜４＞に記載の方法。
＜６＞
前記第２のクロマトグラフィー工程および／または前記第３のクロマトグラフィー工程の前記陰イオン交換体および／または前記陽イオン交換体は、それぞれバルク材料またはモノリス型材料である、＜１＞～＜５＞のいずれか１つに記載の方法。
＜７＞
溶媒／界面活性剤によるウイルス不活化工程をさらに含む（好ましくは、溶媒／界面活性剤によるウイルス不活化工程が前記第３のクロマトグラフィー工程の前に実施される）、＜１＞または＜５＞のいずれか１つに記載の方法。
＜８＞
前記第１の分画、前記第２の分画および前記第３の分画の少なくとも１つに安定化剤が加えられる、＜１＞～＜７＞のいずれか１つに記載の方法。
＜９＞
前記安定化剤は正に荷電したアミノ酸（リシンなど）である、＜８＞に記載の方法。
＜１０＞
前記第１の分画、前記第２の分画および前記第３の分画の少なくとも１つに対してウイルスろ過工程が行われる、＜１＞～＜９＞のいずれか１つに記載の方法。
＜１１＞
前記第１の分画、前記第２の分画および前記第３の分画の少なくとも１つにヘパリンが加えられる、＜８＞に記載の方法。
＜１２＞
以下の工程を含む方法により得ることが可能な第ＩＸ因子を含む分画：
（１）希釈されていない脱クリオ血漿を提供すること、
（２）前記希釈されていない脱クリオ血漿を用いたサンプル置換クロマトグラフィーを、約６μｍの細孔を有するモノリス型の弱陰イオン交換材料または強陰イオン交換材料を用いて実施すること、
（３ａ）約１００ｍＭ～約３００ｍＭ（特に、約２００ｍＭ）のＮａＣｌを含む第１のＮ
ａＣｌ緩衝液を用いて前記弱陰イオン交換モノリス型材料または前記強陰イオン交換モノリス型材料を洗浄すること、
（３ｂ）続いて、約２００ｍＭ～約３５０ｍＭ（特に、約２８０ｍＭ）のＮａＣｌを含むより高い濃度の第２のＮａＣｌ緩衝液を用いて洗浄すること、
（３ｃ）約１Ｍ～約２．５Ｍ（特に、約２Ｍ）のＮａＣｌを含むＮａＣｌ緩衝液を用いた溶出、
（４）続いて、弱陰イオン交換材料または強陰イオン交換材料を用いたクロマトグラフィーを実施し、任意に（optionally）、工程（４）の後に得られた分画の一部をＰＣＣ製造のために使用すること、
（５）約０．１％のＬ－リシンを用いた安定化、
（６）ウイルス不活化、
（７）陽イオン交換クロマトグラフィー、
（８）ＣＩＭモノリスでのウイルスろ過、
（９）第ＩＸ因子１ＩＵあたり約０．１ＩＵのヘパリンを加えること、
（１０）任意に（optionally）、前記陽イオン交換材料から溶出物を分離すること。
＜１３＞
以下の工程を含む方法により得ることが可能なＰＣＣを含む分画：
（１）希釈されていない脱クリオ血漿を提供すること、
（２）前記希釈されていない脱クリオ血漿を用いたサンプル置換クロマトグラフィーを、約６μｍの細孔を有するモノリス型の弱陰イオン交換材料または強陰イオン交換材料（ＤＥＡＥまたはＱモノリス型材料など）を用いて実施すること、
（３ａ）約１００ｍＭ～約３００ｍＭ（特に、約２００ｍＭ）のＮａＣｌを含む第１のＮａＣｌ緩衝液を用いて前記弱陰イオン交換モノリス型材料または前記強陰イオン交換モノリス型材料を洗浄すること、
（３ｂ）続いて、約２００ｍＭ～約３５０ｍＭ（特に、約２８０ｍＭ）のＮａＣｌを含むより高い濃度の第２のＮａＣｌ緩衝液を用いて洗浄すること、
（３ｃ）約６００ｍＭ～約２．５Ｍ（特に、約１．２Ｍ）のＮａＣｌを含むＮａＣｌ緩衝液を用いた溶出、
（４）続いて、弱陰イオン交換材料または強陰イオン交換材料（ＣＩＭ ＤＥＡＥクロマトグラフィー材料など）を用いてクロマトグラフィーを実施すること、
（５）任意に（optionally）、前記弱陰イオン交換材料または前記強陰イオン交換材料から溶出物を分離すること。
＜１４＞
１２０ＩＵ／ｍｇタンパク質よりも高い比活性を特徴とする第ＩＸ因子を含む（好ましくは、２～１０ＩＵ／ｍｇタンパク質の凝固第ＩＸ因子比活性とそれに対応してバランスのとれたビタミンＫ依存性凝固因子およびインヒビター両方の濃度を特徴とするＰＣＣを含む）、＜１２＞に記載の分画。
【0057】
参考文献
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［１０］ ”ＡＣＣＰ ２０１２ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ： ’Ｅｖｉｄｅｎｃｅ－Ｂａｓｅｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ｓｅｃｔｉｏｎ ９．３ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ｂｌｅｅｄｉｎｇ’”． Ｃｈｅｓｔ Ｊｏｕｒｎａｌ．
［１１］ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｔａｓｋ Ｆｏｒｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｉｎ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ． Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｏｎ ｏｒａｌ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ： ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ． Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ． １９９８；１０１：３７４－３８７．
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［１４］ Ｓａｍｐｌｅ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｓ ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｉｘｔｕｒｅｓ； Ｍａｒｔｉｎａ Ｓｒａｊｅｒ Ｇａｊｄｏｓｉｋ，１ Ｊａｍｅｓ Ｃｌｉｆｔｏｎ，２ ａｎｄ Ｄｊｕｒｏ Ｊｏｓｉｃ．
［１５］ Ｊｏｓｉｃ， Ｄ． Ｈｏｆｆｅｒ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ａｉｍｉｎｇ ａｔ ｌｏｗ ｔｈｒｏｍｂｏｇｅｎｉｃｉｔｙ， Ｔｈｒｏｍｂ． Ｒｅｓ． １００（５）， （２０００） ４３３－４４１．
［１６］ Ｊｏｓｉｃ Ｄ．， Ｋａｎｎｉｃｈｔ Ｃ．， Ｌｏｓｔｅｒ Ｋ．， Ｐｏｃｋ Ｋ．， Ｉｂｅｒｅｒ Ｇ．， Ｂｕｃｈａｃｈｅｒ Ａ．， ”Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ ｉｎ ｃｌｏｔｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ＩＸ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ， Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ ７ （３） （２００１） ２５０－２５７， ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０４６／ｊ．１０３６５－２５１６．２００１．００５０３．ｘ．
［１７］ Ｃｌｉｆｔｏｎ Ｊ．， Ｈｕａｎｇ Ｆ．， Ｇａｓｏ－Ｓｏｋａｃ Ｄ．， Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｋ．， Ｈｉｘｓｏｎ Ｄ．， Ｊｏｓｉｃ Ｄ．： Ｕｓｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｆｏｒ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｃｌｏｔｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ＩＸ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ７３ （３） （２０１０） ６７８． ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｐｒｏｔ．２００９．０９．０２０．
［１８］ Ｊｏｓｉｃ Ｄ．， Ｂａｌ Ｆ．， Ｓｃｈｗｉｎｎ， Ｈ．： Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｃｌｏｔｔｉｎｇ ｃａｓｃａｄｅ ｂｙ ｈｅｐａｒｉｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ６３２ （１９９３） １－１０． ＤＯＩ：１０．１０１６／００２１－９６７３（９３）８００１９－５．
［１９］ Ｃｌｉｆｔｏｎ Ｊ．， Ｈｕａｎｇ Ｆ．， Ｇａｓｏ－Ｓｏｋａｃ Ｄ．， Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｋ．， Ｈｉｘｓｏｎ Ｄ．， Ｊｏｓｉｃ Ｄ．： Ｕｓｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｆｏｒ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｃｌｏｔｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ＩＸ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ７３ （３） （２０１０） ６７８． ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｐｒｏｔ．２００９．０９．０２０
［１］ Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ （２００９）． Ｓｔｕａｒｔ ＭＣ， Ｋｏｕｉｍｔｚｉ Ｍ， Ｈｉｌｌ ＳＲ （ｅｄｓ．）． ＷＨＯ Ｍｏｄｅｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ ２００８． Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ． ｐｐ． ２５９－６０． ｈｄｌ：１０６６５／４４０５３． ＩＳＢＮ ９７８９２４１５４７６５９．
［２］ Ｐｅｒｋｉｎｓ ＪＣ （２０１４）． Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ／Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｅｍｅｒｇｅｎｃｉｅｓ， Ａｎ Ｉｓｓｕｅ ｏｆ Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｃｌｉｎｉｃｓ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ． Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ． ｐ． ７２０． ＩＳＢＮ ９７８０３２３３２０２９０．
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［１１］ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｔａｓｋ Ｆｏｒｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｉｎ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ． Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｏｎ ｏｒａｌ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ： ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ． Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ． １９９８；１０１：３７４－３８７．
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