(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-07-18
(45)【発行日】2024-07-26
(54)【発明の名称】ヘリコバクター・ピロリ菌株の同定方法、および同定用キット
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20240719BHJP
C07K 14/195 20060101ALI20240719BHJP
C07K 17/00 20060101ALI20240719BHJP
G01N 33/543 20060101ALI20240719BHJP
G01N 33/569 20060101ALI20240719BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20240719BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 N
C07K14/195
C07K17/00
G01N33/543 501A
G01N33/569 F
G01N33/574 Z
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2020569692
(86)(22)【出願日】2020-01-29
(86)【国際出願番号】 JP2020003201
(87)【国際公開番号】W WO2020158811
(87)【国際公開日】2020-08-06
【審査請求日】2023-01-16
(31)【優先権主張番号】P 2019015399
(32)【優先日】2019-01-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】504179255
【氏名又は名称】国立大学法人 東京医科歯科大学
(74)【代理人】
【識別番号】100130845
【弁理士】
【氏名又は名称】渡邉 伸一
(72)【発明者】
【氏名】江石 義信
(72)【発明者】
【氏名】内田 佳介
(72)【発明者】
【氏名】掛川 智也
【審査官】三木 隆
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１８／１５３９９１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Yuichi Matsuo，Novel CagA ELISA exhibits enhanced sensitivity of Helicobacter pylori CagA antibody，World J Gastroenterol，2017年01月07日，Vol.23 No.1，Page.48-59
【文献】畠山昌則，ピロリ菌がん蛋白質CagA－その構造多型と胃発がんリスク，医学のあゆみ，2018年09月01日，Vol.266 No.9，Page.643-648
【文献】HATAKEYAMA M.，ONCOGENIC MECHANISMS OF THE HELICOBACTER PYLORI CagA PROTEIN，Nature Reviews. Cancer，2004年，Vol.4 No.9，Page.688-694
【文献】高田俊介等，Helicobactre pylori CagA hot spotに対するヒト血清抗体価測定系の確立，日本消化器病学会雑誌，2006年，Vol.103 臨時増刊号（総会），Page.A178
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／５３
Ｃ０７Ｋ １４／１９５
Ｃ０７Ｋ １７／００
Ｇ０１Ｎ ３３／５４３
Ｇ０１Ｎ ３３／５６９
Ｇ０１Ｎ ３３／５７４
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
被検者における東アジア型のピロリ菌感染とヨーロッパ型のピロリ菌感染とを血液試料を用いて判別するピロリ菌の型判別方法であって、（ｉ）被検者由来の血液試料を、東アジア型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドおよびヨーロッパ型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドと接触させる工程、および
（ｉｉ）血液試料中に含まれる前記ペプチドに対する抗体価を測定し、各測定値の比較に基づき東アジア型とヨーロッパ型の型判別を行う工程
を含む、ピロリ菌の型判別方法。
【請求項2】
東アジア型およびヨーロッパ型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドそれぞれに対する抗体価測定値を比較して決定される感染ピロリ菌株の型判定が、被検者における胃炎の程度および／または胃癌のリスク層別化の指標となる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
被検者における東アジア型のピロリ菌感染とヨーロッパ型のピロリ菌感染とを血液試料を用いて判別するピロリ菌の型判別方法であって、（ｉ）被検者由来の血液試料を、東アジア型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドおよびヨーロッパ型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドと接触させる工程、および
（ｉｉ）血中抗体価測定を行って、血液試料中に含まれる前記２種類のペプチドに対する抗体価測定値を取得する工程、
（ｉｉｉ）血中抗体価測定の結果に基づき、東アジア型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドに対する抗体価測定値（Ｄ）と、ヨーロッパ型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドに対する抗体価測定値（Ｃ）との比率を算出する工程、
（ｉｖ）血清測定値のＤ／Ｃ比に基づき、東アジア型とヨーロッパ型のピロリ菌型判別を行う工程
を含む、ピロリ菌の型判別方法。
【請求項4】
東アジア型およびヨーロッパ型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドそれぞれに対する抗体価測定値を比較して決定される感染ピロリ菌株の型判定が、被検者における胃炎の程度および／または胃癌のリスク層別化の指標となる、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記東アジア型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドおよび前記ヨーロッパ型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドが、それぞれ、配列番号１のアミノ酸配列もしくはその断片および配列番号２のアミノ酸配列もしくはその断片を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記東アジア型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドおよび前記ヨーロッパ型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドが、それぞれ、配列番号１のアミノ酸配列もしくはその断片および配列番号２のアミノ酸配列もしくはその断片からなる、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記東アジア型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドおよび前記ヨーロッパ型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドが、それぞれ、配列番号３のアミノ酸配列および配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項５または６に記載の方法。
【請求項8】
血液試料が血漿または血清である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
被検者がヒトである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
抗体価測定が、酵素結合免疫吸着、酵素免疫測定、ラジオイムノアッセイ、蛍光免疫測定、化学発光測定法、イムノブロット、ラテックス凝集法、金コロイド凝集法、ペーパーイムノクロマトグラフィ、ラテラルフローアッセイ、免疫沈降、比濁法、比ろう法、または比色法により行われる、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法に使用するための、東アジア型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドおよびヨーロッパ型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドを含む、感染ピロリ菌株の型判定用キット。
【請求項12】
被検者における胃炎および／または胃癌のリスク評価に使用するための、請求項１１に記載のキット。
【請求項13】
前記ペプチドが固相化担体上に固定されている、請求項１１または１２に記載のキット。
【請求項14】
被検者における胃炎の程度および／または胃癌のリスク層別化のための指標の取得方法であって、
（ｉ）被検者由来の血液試料を、東アジア型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来する配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド、およびヨーロッパ型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来する配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドと接触させる工程、ならびに
（ｉｉ）血中抗体価測定を行って、血液試料中に含まれる前記２種類のペプチドに対して反応陽性の抗体の抗体価測定値を取得する工程、
（ｉｉｉ）血中抗体価測定の結果に基づき、東アジア型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来する配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体価測定値（Ｄ）と、ヨーロッパ型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来する配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体価測定値（Ｃ）との比率を算出する工程、
（ｉｖ）血清測定値のＤ／Ｃ比に基づき、東アジア型とヨーロッパ型のピロリ菌型判別を行う工程
を含み、
東アジア型およびヨーロッパ型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドそれぞれに対する抗体価測定値を比較して決定される感染ピロリ菌株の型判定が、被検者における胃炎の程度および／または胃癌のリスク層別化の指標となる、指標の取得方法。
【請求項15】
請求項１４に記載の方法に使用するための、配列番号１、３および５～１８から成る群より選択される配列を含む東アジア型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチド、および
配列番号２、４および１９～２９から成る群より選択される配列を含むヨーロッパ型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドを含む、感染ピロリ菌株の型判定用キット。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【0001】
本願は、特願２０１９－０１５３９９号（出願日：２０１９年１月３１日）の優先権の利益を享受する出願であり、これは引用することによりその全体が本明細書に取り込まれる。
【技術分野】
【0002】
本発明は、ヘリコバクター・ピロリ菌株の同定方法に関し、詳細には、血中抗体価測定によるピロリ菌ＣａｇＡ遺伝子多型の同定方法に関する。本発明の一態様は、さらに、ヘリコバクター・ピロリ菌株の判別による胃炎・胃癌リスクの評価方法に関する。
【背景技術】
【0003】
ヘリコバクター・ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、以下「ピロリ菌」とも記載する）は、ヒト等の胃の粘膜に生息しているらせん型のグラム陰性微好気性細菌である。ピロリ菌は、慢性胃炎や胃癌の発症に関与する病原性細菌であることが報告されている。
【0004】
ピロリ菌の検出方法は、内視鏡により得られた組織から培養や組織学的検索により検出する方法と、血中抗体価測定、尿素呼気試験、糞便中抗原測定などの内視鏡を用いない非侵襲的方法とに大別される。特に本邦においては、胃癌リスク検診として従来行われてきたバリウム２重投影法に代わり、血中ピロリ菌抗体測定にペプシノーゲン濃度測定を組み合わせたＡＢＣ検診が普及しつつある。
【0005】
ピロリ菌には多くの病原因子が存在するが、中でも胃癌発症と最も関連性が高いことが示唆されている細胞毒素関連タンパク質（ＣａｇＡ）については様々な検討がなされている。例えば、特許文献１には、ＣａｇＡ＋ピロリ菌感染患者由来の抗体に結合しうるペプチドが開示されている。
【0006】
ピロリ菌は、ＣａｇＡタンパク質遺伝子に関して主に東アジア型とヨーロッパ型（欧米型ともいう）に大別されることが知られている。ＣａｇＡタンパク質の多型を判別する方法としては、非特許文献１に、糞便試料を用いたデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ：Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ）法により、ピロリ菌の１６Ｓ遺伝子の検出とＣａｇＡ病原性遺伝子のジェノタイピングを行ったことが報告されており、この方法によりピロリ菌の地理的疫学研究が容易になることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】国際公開第２０１８／１５３９９１号
【非特許文献】
【0008】
【文献】Ｔａｌａｒｉｃｏら著「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ｆｒｏｍ Ｓｔｏｏｌ ｕｓｉｎｇ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ Ｒｅｖｅａｌｓ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｌｏａｄｓ ｔｈａｔ Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｃａｇＡ Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ Ｇｅｎｅ Ｃａｒｒｉａｇｅ」Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ２０１５；２１：３２５～３３３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明は、簡便な方法で、ピロリ菌を検出すると同時に、ピロリ菌ＣａｇＡタンパク質の遺伝子型に関する情報を得るための方法を提供することを目的の一つとする。また、本発明は、東アジア型のピロリ菌株とヨーロッパ型のピロリ菌株とを判別して同定することにより、被検体における胃炎および／または胃癌のリスクを評価するための方法を提供することを別の目的の一つとする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者らは、東アジア型株とヨーロッパ型株のそれぞれに特異的なＣａｇＡ由来ペプチドを用いることにより、被検体の血液試料を使用して、簡便な方法で感染ピロリ菌株を同定および型分類できること、さらには東アジア型株とヨーロッパ型株とを判別して胃炎・胃癌のリスクをより精密に評価することができることを見出した。本発明は、これらの知見に基づくものであり、以下の態様を包含する。
【0011】
［態様１］ （ｉ）被検体由来の血液試料を、東アジア型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドおよび／またはヨーロッパ型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドと接触させる工程、および（ｉｉ）血液試料中に含まれる前記ペプチドに対して反応陽性の抗体の有無を決定する工程を含む、ピロリ菌の検出方法。
［態様２］ 工程（ｉ）において、血液試料を、少なくとも前記東アジア型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドと接触させる工程を含み、東アジア型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドに対して反応陽性の抗体の存在が、被検体における胃炎および／または胃癌のより高いリスクの指標となる態様１に記載の方法。
［態様３］ （ｉ）被検体由来の血液試料を、東アジア型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドおよび／またはヨーロッパ型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドと接触させる工程、および（ｉｉ）血液試料中に含まれる前記ペプチドに対して反応陽性の抗体の有無を決定する工程を含み、ピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドに対して反応陽性の抗体の存在が、被検体における胃炎および／または胃癌のリスクの指標となる、胃炎・胃癌リスクの評価方法。
［態様４］ 工程（ｉ）において、血液試料を、少なくとも前記東アジア型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドと接触させる工程を含み、東アジア型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドに対して反応陽性の抗体の存在が、被検体における胃炎および／または胃癌のより高いリスクの指標となる態様３に記載の方法。
［態様５］ 前記東アジア型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドおよび前記ヨーロッパ型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドが、それぞれ、配列番号１のアミノ酸配列もしくはその断片および配列番号２のアミノ酸配列もしくはその断片を含む態様１～４のいずれかに記載の方法。
［態様６］ 前記東アジア型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドおよび前記ヨーロッパ型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドが、それぞれ、配列番号１のアミノ酸配列もしくはその断片および配列番号２のアミノ酸配列もしくはその断片からなる態様１～５のいずれかに記載の方法。
［態様７］ 前記東アジア型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドおよび前記ヨーロッパ型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドが、それぞれ、配列番号３のアミノ酸配列および配列番号４のアミノ酸配列を含む態様５または６に記載の方法。
［態様８］ 血液試料が血漿または血清である態様１～７のいずれかに記載の方法。
［態様９］ 被検体がヒトである態様１～８のいずれかに記載の方法。
［態様１０］ 前記反応陽性の抗体の有無を決定する工程が、酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）、ペーパーイムノクロマトグラフィ、またはラテックス凝集法により行われる態様１～９のいずれかに記載の方法。
［態様１１］ 東アジア型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドおよび／またはヨーロッパ型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドを含む、ピロリ菌検出用キット。
［態様１２］ 被検体における胃炎および／または胃癌のリスク評価に使用するための態様１１に記載のキット。
［態様１３］ 前記ペプチドが固相化担体上に固定されている態様１１または１２に記載のキット。
［態様１４］ （ｉ）被検体由来の血液試料を、配列番号１の東アジア型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチド、および配列番号２のヨーロッパ型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドと接触させる工程、ならびに（ｉｉ）血液試料中に含まれる前記ペプチドに対して反応陽性の抗体の有無を決定する工程を含み、ピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドに対して反応陽性の抗体の存在が、被検体における胃炎および／または胃癌のリスクの指標となり、さらに、東アジア型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドに対して反応陽性の抗体の存在が、被検体における胃炎および／または胃癌のより高いリスクの指標となる、胃炎・胃癌リスクの評価方法。
［態様１５］ 配列番号１、３および５～１８から成る群より選択される配列を含む東アジア型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチド、および配列番号２、４および１９～２９から成る群より選択される配列を含むヨーロッパ型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドを含む、ピロリ菌検出用キット。
［態様２］ 工程（ｉ）において、血液試料を、少なくとも前記東アジア型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドと接触させる工程を含み、東アジア型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドに対して反応陽性の抗体の存在が、被検体における胃炎および／または胃癌のより高いリスクの指標となる態様１に記載の方法。
［態様３］ （ｉ）被検体由来の血液試料を、東アジア型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドおよび／またはヨーロッパ型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドと接触させる工程、および（ｉｉ）血液試料中に含まれる前記ペプチドに対して反応陽性の抗体の有無を決定する工程を含み、ピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドに対して反応陽性の抗体の存在が、被検体における胃炎および／または胃癌のリスクの指標となる、胃炎・胃癌リスクの評価方法。
［態様４］ 工程（ｉ）において、血液試料を、少なくとも前記東アジア型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドと接触させる工程を含み、東アジア型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドに対して反応陽性の抗体の存在が、被検体における胃炎および／または胃癌のより高いリスクの指標となる態様３に記載の方法。
［態様５］ 前記東アジア型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドおよび前記ヨーロッパ型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドが、それぞれ、配列番号１のアミノ酸配列もしくはその断片および配列番号２のアミノ酸配列もしくはその断片を含む態様１～４のいずれかに記載の方法。
［態様６］ 前記東アジア型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドおよび前記ヨーロッパ型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドが、それぞれ、配列番号１のアミノ酸配列もしくはその断片および配列番号２のアミノ酸配列もしくはその断片からなる態様１～５のいずれかに記載の方法。
［態様７］ 前記東アジア型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドおよび前記ヨーロッパ型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドが、それぞれ、配列番号３のアミノ酸配列および配列番号４のアミノ酸配列を含む態様５または６に記載の方法。
［態様８］ 血液試料が血漿または血清である態様１～７のいずれかに記載の方法。
［態様９］ 被検体がヒトである態様１～８のいずれかに記載の方法。
［態様１０］ 前記反応陽性の抗体の有無を決定する工程が、酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）、ペーパーイムノクロマトグラフィ、またはラテックス凝集法により行われる態様１～９のいずれかに記載の方法。
［態様１１］ 東アジア型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドおよび／またはヨーロッパ型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドを含む、ピロリ菌検出用キット。
［態様１２］ 被検体における胃炎および／または胃癌のリスク評価に使用するための態様１１に記載のキット。
［態様１３］ 前記ペプチドが固相化担体上に固定されている態様１１または１２に記載のキット。
［態様１４］ （ｉ）被検体由来の血液試料を、配列番号１の東アジア型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチド、および配列番号２のヨーロッパ型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドと接触させる工程、ならびに（ｉｉ）血液試料中に含まれる前記ペプチドに対して反応陽性の抗体の有無を決定する工程を含み、ピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドに対して反応陽性の抗体の存在が、被検体における胃炎および／または胃癌のリスクの指標となり、さらに、東アジア型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドに対して反応陽性の抗体の存在が、被検体における胃炎および／または胃癌のより高いリスクの指標となる、胃炎・胃癌リスクの評価方法。
［態様１５］ 配列番号１、３および５～１８から成る群より選択される配列を含む東アジア型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチド、および配列番号２、４および１９～２９から成る群より選択される配列を含むヨーロッパ型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドを含む、ピロリ菌検出用キット。
【発明の効果】
【0012】
本発明によれば、簡便な方法で、感染ピロリ菌株を同定し、特には東アジア型とヨーロッパ型とを判別することができる。さらに、本発明の一態様によれば、胃炎・胃癌のリスクをより精密に評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】本発明の一実施形態に係る方法を用いた、ピロリ菌の血中抗体価測定の結果である。
【図2】本発明の一実施形態に係る方法を用いた、感染ピロリ菌の東アジア型株とヨーロッパ型株の判別結果である。
【図3】本発明の一実施形態に係る方法を用いた、日本人胃癌患者と米国人胃癌患者の血清の解析結果である。
【図4】胃粘膜を解析した日本人胃癌患者の血清測定値と米国人胃癌患者血清の測定値を比較した結果である。
【発明を実施するための形態】
【0014】
上述のように、本発明者らは、東アジア型株とヨーロッパ型株のそれぞれに特異的なＣａｇＡ由来ペプチドを用いることにより、被検体の血液試料を使用して、簡便な方法で感染ピロリ菌株を同定および型分類できること、さらには東アジア型株とヨーロッパ型株とを判別して胃炎・胃癌のリスクをより精密に評価することができることを見出した。本発明の一実施形態に係る感染ピロリ菌の同定方法（検出方法）は、被検体由来の血液試料を用いて、特定のアミノ酸配列を有するＣａｇＡペプチドに対して反応陽性の抗体の有無を測定する工程を含む。
【0015】
［ＣａｇＡペプチド］
以下に本発明の方法において用いるＣａｇＡペプチドについて説明する。上述のとおり、ＣａｇＡタンパク質は、ピロリ菌が有する病原因子の中でも胃炎や胃癌との関連性が最も高いとされているエフェクター分子である。ＣａｇＡタンパク質のカルボキシル末端領域には、ＥＰＩＹＡモチーフをそれぞれ含むＡ配列、Ｂ配列、Ｃ配列、Ｄ配列と呼ばれる領域が存在し、Ａ配列、Ｂ配列、Ｃ配列は主に欧米人に感染するピロリ菌（以下、「ヨーロッパ型株」とも記載する）に高確率で存在し、Ａ配列、Ｂ配列、Ｄ配列は、主に東アジア人に感染するピロリ菌（以下、「東アジア型株」とも記載する）に高確率で存在する。
以下に本発明の方法において用いるＣａｇＡペプチドについて説明する。上述のとおり、ＣａｇＡタンパク質は、ピロリ菌が有する病原因子の中でも胃炎や胃癌との関連性が最も高いとされているエフェクター分子である。ＣａｇＡタンパク質のカルボキシル末端領域には、ＥＰＩＹＡモチーフをそれぞれ含むＡ配列、Ｂ配列、Ｃ配列、Ｄ配列と呼ばれる領域が存在し、Ａ配列、Ｂ配列、Ｃ配列は主に欧米人に感染するピロリ菌（以下、「ヨーロッパ型株」とも記載する）に高確率で存在し、Ａ配列、Ｂ配列、Ｄ配列は、主に東アジア人に感染するピロリ菌（以下、「東アジア型株」とも記載する）に高確率で存在する。
【0016】
ＣａｇＡタンパク質は、胃の上皮細胞に感染したピロリ菌の菌体内で産生されると、菌が保有するミクロの注射針様機構（ＩＶ型分泌機構）を介して細胞内に注入される。細胞に侵入したＣａｇＡタンパク質は、ＥＰＩＹＡモチーフのチロシン残基のリン酸化修飾によりヒトタンパク質ＳＨＰ－２と結合してＳＨＰ－２の異常活性化を引き起こし発がん活性を発揮すると考えられている。ここで、ＳＨＰ－２は、上記Ｃ配列およびＤ配列に結合すること、またＤ配列はＣ配列と比較してより強くＳＨＰ－２に結合することが報告されている。このことが、東アジア人に感染するピロリ菌による発がんリスクが高い一因と考えられる。
【0017】
したがって、ＣａｇＡタンパク質のＣ末端領域の多型を利用すれば、感染ピロリ菌株を同定すること、特には胃炎・胃癌のリスクに対する関与に違いのある東アジア型株とヨーロッパ型株とを判別すること、それにより胃炎・胃癌のリスクをより精密に評価することが可能となると考えられる。
【0018】
一実施形態では、本発明に係る方法に用いるＣａｇＡペプチドは、東アジア型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドおよび／またはヨーロッパ型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドである。さらに、一実施形態では、本発明に係る方法に用いるＣａｇＡペプチドは、東アジア型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に特異的な配列を有するペプチドおよび／またはヨーロッパ型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に特異的な配列を有するペプチドであり、例えば、下記表１に示す配列番号１のアミノ酸配列からなる４７アミノ酸長のペプチドもしくはその断片、または配列番号２のアミノ酸配列からなる３４アミノ酸長のペプチドもしくはその断片を含むものであることが好ましい。これらのペプチドは、東アジア型株およびヨーロッパ型株のピロリ菌が産生する抗体をそれぞれ特異的に検出することができる。なお、本発明に係る検出方法は、ピロリ菌の同定、定量、半定量、または測定にも利用されうる。
【0019】
また一実施形態では、本発明に係る方法に用いるＣａｇＡペプチドは、下記表１に示す配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドもしくはその断片、または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドの断片もしくはその断片であってもよい。一部の実施態様において、断片は例えば、全長の１５％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の長さを有する。これらの断片は、各株に対する特異性の観点から、配列番号３のＥＰＩＹＡ－Ｄ配列または配列番号４のＥＰＩＹＡ－Ｃ配列をそれぞれ含むことが好ましい。また、特異性の観点から、アミノ酸長が６以上、好ましくは８以上、より好ましくは１０以上のペプチドであることが好ましい。一方、ペプチド合成の容易さの観点からは、アミノ酸長が８０以下、例えば６０以下、５０以下であることが好ましい場合もある。一実施形態では、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドおよび／または配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドが用いられる。
【0020】
【表1】
【0021】
また一実施形態では、本発明に係る方法に用いるＣａｇＡペプチドは、上記配列番号１もしくは２のアミノ酸配列からなるペプチドまたはそれらの断片の変異体であってもよい。本明細書において、変異体とは、規定されたアミノ酸配列のうちの１または複数個のアミノ酸の変異（欠失、置換、挿入および／または付加）を有するペプチドを意味する。本明細書において、変異体は、規定されたアミノ酸配列との同一性（％）が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上であるペプチドを意味する。同一性の判定には、例えば、ＢＬＡＳＴプログラムを利用することができる。変異体は、目的の抗体に対する抗原エピトープとしての機能を保持している。このため、アミノ酸の変異は、典型的には、もとの配列の構造に関する特徴を実質的に変化させない変異であることが好ましい。このような変異としては、特定のアミノ酸残基を類似の物理化学的特徴を有する残基で置換する保存的置換（例えば、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＡｌａの相互置換などの脂肪族基含有アミノ酸残基間の置換、ＬｙｓおよびＡｒｇ、ＧｌｕおよびＡｓｐ、ＧｌｎおよびＡｓｎの相互置換などの極性残基の間の置換など）や、アミノ酸のヒドロパシー指数や親水性を考慮した非保存的置換が挙げられる。
【0022】
一部の実施形態において用いられ得るペプチド断片の配列を下記表２に例示する。
【0023】
【表2】
【0024】
また一実施形態では、本発明に係る方法に用いるＣａｇＡペプチドは、上記配列番号１または２のアミノ酸配列を有するペプチドもしくはそれらの断片、またはそれらの変異体のＮ末端および／またはＣ末端に付加的な配列を有するペプチドであってもよい。付加的な配列は、機能的な配列であっても機能を有さない配列であってもよい。付加的な配列の非限定的な例としては、後述する固相化に用いるＴａｇ配列、対照もしくは標準として用いる配列等が挙げられる。付加的な配列は、特異性やペプチド合成の容易さの観点で、好ましくは５０アミノ酸長以下、より好ましくは４０アミノ酸長以下、さらに好ましくは３０アミノ酸長以下である。
【0025】
本発明に係る方法に用いるＣａｇＡペプチドを製造する方法は特に限定されず、例えば所望の宿主細胞における発現系または無細胞発現系で発現させても、固相合成または液相合成等の化学合成により製造してもよい。発現系の非限定的な例としては、哺乳類細胞もしくは昆虫細胞、酵母、大腸菌、植物、枯草菌等を用いた発現系、または小麦胚芽、昆虫細胞、大腸菌等に由来する無細胞発現系が挙げられる。本発明の方法に用いるＣａｇＡペプチドは比較的低分子量のペプチドであるため、高収率で精製プロセスが容易な固相合成に向いているという利点もある。
【0026】
さらに一実施形態では、上記のＣａｇＡペプチドに、酵素、放射性同位体、色素、蛍光物質等の標識を施して、標識化抗原として用いてもよい。また、上記のＣａｇＡペプチドに、固定化用のタグを付加してもよい。
【0027】
［ピロリ菌株の同定（検出）／判別方法］
本発明に係る方法は、上記のＣａｇＡペプチドを被検体由来の血液試料と接触させて、ＣａｇＡペプチドに反応陽性の抗体の有無を決定する方法を含む。この工程により、東アジア型株またはヨーロッパ型株において産生される抗体を特異的に検出し、感染ピロリ菌株を同定することができる。本発明に係る方法は、ＰＣＲ法を用いて糞便試料を分析する方法に比べ、被検体からの試料の採取および解析プロセスが非常に簡便であるという利点を有する。
本発明に係る方法は、上記のＣａｇＡペプチドを被検体由来の血液試料と接触させて、ＣａｇＡペプチドに反応陽性の抗体の有無を決定する方法を含む。この工程により、東アジア型株またはヨーロッパ型株において産生される抗体を特異的に検出し、感染ピロリ菌株を同定することができる。本発明に係る方法は、ＰＣＲ法を用いて糞便試料を分析する方法に比べ、被検体からの試料の採取および解析プロセスが非常に簡便であるという利点を有する。
【0028】
ＣａｇＡペプチドに反応陽性の抗体の検出および測定は、さまざまなイムノアッセイを用いて行うことができる。本発明に係る方法において用いることができるイムノアッセイの非限定的な例としては、例えば、酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫測定（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定（ＦＩＡ）、化学発光測定法、イムノブロット、ラテックス凝集法、金コロイド凝集法、ペーパーイムノクロマトグラフィ、ラテラルフローアッセイ（ＬＦＡ）、免疫沈降、比濁法、比ろう法、比色法等が挙げられる。血清学的検査への応用の観点では、ＥＬＩＳＡ、ペーパーイムノクロマトグラフィ、（例えば金ナノ粒子を用いた）ラテラルフローアッセイ（ＬＦＡ）、ラテックス凝集法等を好ましく用いることができる。
【0029】
典型的な方法の一例としては、ＣａｇＡペプチドを固相化担体に固相化し、固相化したＣａｇＡペプチドに被検体由来の血液試料を接触させ、ＣａｇＡペプチドと血液試料中に存在する抗体とのＣａｇＡペプチド－抗体複合体を形成させ、結合した抗体を認識する二次抗体等を用いて複合体を間接的に検出する方法が挙げられる。
【0030】
固相化担体の非限定的な例としては、ポリスチレン等の疎水性プラスチック、セルロース、ニトロセルロース、アガロース、金等の金属、シリカ等の無機材料、ガラス、アルブミン等のタンパク質等が挙げられるがこれらに限定されない。固相化担体の形状としては、プレート、ラテックス、ナノ粒子、マイクロビーズ、多孔質ビーズ、膜等が挙げられるがこれらに限定されない。
【0031】
二次抗体としては、標識化ＩｇＧ抗体、抗Ｆｃ抗体等が挙げられる。標識の非限定的な例としては、酵素標識（ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ルシフェラーゼ等）、蛍光標識（フルオレセイン、ローダミン等の蛍光色素、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）等の蛍光タンパク質等）、放射性同位元素標識（イオウ（３５Ｓ）、炭素（１４Ｃ）、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、およびトリチウム（３Ｈ等）、ビオチン標識等が挙げられる。
【0032】
本発明に係る方法は、上記イムノアッセイにより、定性的、半定量的、または定量的に行うことができる。
【0033】
本発明に係る方法において、ピロリ菌株の同定は、ＣａｇＡ東アジア型ペプチドおよびＣａｇＡヨーロッパ型ペプチドのいずれか一方を用いて行ってもよいし、ＣａｇＡ東アジア型ペプチドとＣａｇＡヨーロッパ型ペプチドの両方を用いて行ってもよい。
【0034】
特に東アジア型株の感染は、胃炎・胃癌の高リスクに関連すると考えられるが、現状では、内視鏡を用いない非侵襲的方法により、簡便な方法で感染ピロリ菌株を同定する方法は確立されておらず、ＡＢＣ検診についても感染ピロリ菌株を考慮したリスク診断は全く確立されていない。ＣａｇＡ東アジア型ペプチドに対して反応陽性の抗体の存在は被検体における胃炎および／または胃癌のより高いリスクの指標となり得ることから、本発明に係る方法では、少なくともＣａｇＡ東アジア型ペプチドを用いることが好ましい。しかし、ピロリ菌の感染を漏れなく同定すると共にピロリ菌の型分類を行うという観点からは、ＣａｇＡ東アジア型ペプチドとＣａｇＡヨーロッパ型ペプチドの両方を用いることが好ましい。これらＣａｇＡ東アジア型ペプチドとＣａｇＡヨーロッパ型ペプチドはそれぞれ、異なる固相化担体上に固定されていても、同一の固相化担体上に固定されていてもよいが、型判別を行う観点からは異なる固相化担体上に固定されていることが好ましい。さらに、ピロリ菌の感染を漏れなく同定する観点から、本発明に係る方法を既存のピロリ菌検出方法と組み合わせて使用してもよい。
【0035】
また、一実施形態では、ＣａｇＡ東アジア型ペプチドとＣａｇＡヨーロッパ型ペプチドの両方を用いて血中抗体価測定を行い、各被検体におけるＣａｇＡヨーロッパ型ペプチドに対する抗体価とＣａｇＡ東アジア型ペプチドに対する抗体価とを相対値に換算して評価する。これにより、東アジア型株とヨーロッパ型株とをより正確に判別することができ、胃炎・胃癌のリスク評価をより精密に行うことができる。
【0036】
相対値の定義、閾値、バックグラウンド値の設定は、採用するイムノアッセイの特性を考慮して適宜設定することができる。一例として、実施例において後述するＥＬＩＳＡを例に説明する。ＣａｇＡ東アジア型ペプチドとＣａｇＡヨーロッパ型ペプチドの両方を用いて同条件で血中抗体価測定を行い、各被検体におけるＣａｇＡヨーロッパ型ペプチドに対する抗体価「Ｃ」とＣａｇＡ東アジア型ペプチドに対する抗体価を「Ｄ」との比率を算出する。「Ｃ／Ｄ」が０．７未満、好ましくは０．５以下、より好ましくは０．２以下であれば東アジア型株、「Ｄ／Ｃ」が０．７未満、好ましくは０．５以下、より好ましくは０．２以下であればヨーロッパ型株と判別することができる。
【0037】
本発明の一実施形態は、（ｉ）被検体由来の血液試料を、東アジア型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドおよび／またはヨーロッパ型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドと接触させる工程、および（ｉｉ）血液試料中に含まれる前記ペプチドに対して反応陽性の抗体の有無を決定する工程を含み、ピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドに対して反応陽性の抗体の存在が、被検体における胃炎および／または胃癌のリスクの指標となる、胃炎・胃癌リスクの評価方法に関する。さらに、一実施形態は、（ｉ）被検体由来の血液試料を、少なくとも東アジア型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドと接触させる工程、および（ｉｉ）血液試料中に含まれる前記ペプチドに対して反応陽性の抗体の有無を決定する工程を含み、東アジア型のピロリ菌ＣａｇＡタンパク質に由来するペプチドに対して反応陽性の抗体の存在が、被検体における胃炎および／または胃癌のより高いリスクの指標となる、胃炎・胃癌リスクの評価方法に関する。胃炎および／または胃癌のリスクが高いと評価された被検体に対しては、内視鏡検査、バイオプシー、ピロリ菌の除菌、胃炎および／もしくは胃癌の予防措置、または胃炎および／もしくは胃癌の治療を行うことができる。よって、本発明の一部の実施形態は、これらの工程を含む予防または治療方法に関する。
【0038】
［被検体］
ピロリ菌は広く哺乳類に感染し得ることから、被検体としては、ヒト、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、およびウマ等の哺乳動物が挙げられ、特にはヒトである。特に、ピロリ菌ＣａｇＡタンパク質多型と疾患リスクとの関連が推定されることから、本発明に係る方法は、表層性胃炎、慢性活動性胃炎、萎縮性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍等の胃炎や胃癌の疾患リスクのあるヒトにおいて有効である。
ピロリ菌は広く哺乳類に感染し得ることから、被検体としては、ヒト、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、およびウマ等の哺乳動物が挙げられ、特にはヒトである。特に、ピロリ菌ＣａｇＡタンパク質多型と疾患リスクとの関連が推定されることから、本発明に係る方法は、表層性胃炎、慢性活動性胃炎、萎縮性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍等の胃炎や胃癌の疾患リスクのあるヒトにおいて有効である。
【0039】
本発明に係る方法に用いる血液試料としては、被検体由来の血液、例えば、被検体から得られた全血、血漿、血清、もしくはその他の前処理を施された血液等を用いることができ、好ましくは単離された血漿または血清である。本発明の一部の実施形態は、被検者から血液を採取する工程、および／または被検者由来の血液を処理して血漿または血清を分離する工程をさらに含みうる。
【0040】
［ピロリ菌検出用キット］
本発明のさらなる一態様は、上記のＣａｇＡペプチドを含む、被検体におけるピロリ菌株の同定もしくは検出、または胃炎および／もしくは胃癌のリスク評価に使用するためのキットに関する。本実施形態に係るキットは好ましくは血液試料用である。キットは、ＣａｇＡペプチドに加えて、サンプル前処理用試薬、サンプル希釈剤、ブロッキング試薬、発色試薬（基質等を含む）、反応停止用試薬、説明書、容器等をさらに含んでもよい。キットに含まれるＣａｇＡペプチドは、例えば、プレートやビーズなどの固相化担体上にあらかじめ固定されていてもよい。
本発明のさらなる一態様は、上記のＣａｇＡペプチドを含む、被検体におけるピロリ菌株の同定もしくは検出、または胃炎および／もしくは胃癌のリスク評価に使用するためのキットに関する。本実施形態に係るキットは好ましくは血液試料用である。キットは、ＣａｇＡペプチドに加えて、サンプル前処理用試薬、サンプル希釈剤、ブロッキング試薬、発色試薬（基質等を含む）、反応停止用試薬、説明書、容器等をさらに含んでもよい。キットに含まれるＣａｇＡペプチドは、例えば、プレートやビーズなどの固相化担体上にあらかじめ固定されていてもよい。
【実施例】
【0041】
以下に、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【0042】
（実施例１）
１．ヒト検体の調製
抗体価の測定に用いるヒト血漿は、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０を含むＰＢＳにて１：５０で希釈を行った。本検討ではすでにピロリ菌感染が判明している２名とピロリ菌非感染者２名の計４名の血漿を用いた。
１．ヒト検体の調製
抗体価の測定に用いるヒト血漿は、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０を含むＰＢＳにて１：５０で希釈を行った。本検討ではすでにピロリ菌感染が判明している２名とピロリ菌非感染者２名の計４名の血漿を用いた。
【0043】
２．ピロリ菌ＣａｇＡペプチド
抗体価測定の際に固相化抗原として用いる合成ペプチドはユーロフィンジェノミクス株式会社に依頼し作製した。合成に使用した配列はヨーロッパ型のＣａｇＡを同定するためのＮＨ２－ＧＦＰＬＫＲＨＤＫＶＤＤＬＳＫＶＧＲＳＶＳＰＥＰＩＹＡＴＩＤＤＬＧＧ－ＣＯＯＨ（ＥＰＩＹＡ－Ｃ型ペプチド；配列番号２）および東アジア型のＣａｇＡを同定するためのＮＨ２－ＡＩＮＲＫＩＤＲＩＮＫＩＡＳＡＧＫＧＶＧＧＦＳＧＡＧＲＳＡＳＰＥＰＩＹＡＴＩＤＦＤＥＡＮＱＡＧ－ＣＯＯＨ（ＥＰＩＹＡ－Ｄ型ペプチド；配列番号１）を用いた。
抗体価測定の際に固相化抗原として用いる合成ペプチドはユーロフィンジェノミクス株式会社に依頼し作製した。合成に使用した配列はヨーロッパ型のＣａｇＡを同定するためのＮＨ２－ＧＦＰＬＫＲＨＤＫＶＤＤＬＳＫＶＧＲＳＶＳＰＥＰＩＹＡＴＩＤＤＬＧＧ－ＣＯＯＨ（ＥＰＩＹＡ－Ｃ型ペプチド；配列番号２）および東アジア型のＣａｇＡを同定するためのＮＨ２－ＡＩＮＲＫＩＤＲＩＮＫＩＡＳＡＧＫＧＶＧＧＦＳＧＡＧＲＳＡＳＰＥＰＩＹＡＴＩＤＦＤＥＡＮＱＡＧ－ＣＯＯＨ（ＥＰＩＹＡ－Ｄ型ペプチド；配列番号１）を用いた。
【0044】
３．ピロリ菌のＣａｇＡペプチドに対する抗体価の測定
ピロリ菌ＣａｇＡのそれぞれのペプチドに対する抗体価の測定はＥＬＩＳＡによって行った。平底９６穴プレート（ＮＵＮＣ社、４７５０９４）をＥＬＩＳＡプレートとして用いた。ＥＰＩＹＡ－ＣペプチドおよびＥＰＩＹＡ－ＤペプチドをＰＢＳで１μｇ／ｍｌに調整し、１ウェルあたり５０μｌずつ分注し室温で２時間反応させて固相化した。洗浄後、１：５０に希釈したヒト血漿を１ウェルあたり５０μｌ分注し、３７℃で９０分反応させた。洗浄後、２次抗体としてビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、Ａ２４４８０）を０．２％Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳで１：４０００に希釈し、１ウェルあたり５０μｌづつ分注し、室温３０分反応させた。洗浄後、ＨＲＰ標識ストレプトアビジン（ＤＡＫＯ社、Ｐ０３９７）を０．２％Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳで１：５０００に希釈し、１ウェルあたり５０μｌづつ分注し、室温３０分反応させた。洗浄後、０．３％ｏ－フェニレンジアミン二塩酸塩、０．０４％Ｈ２Ｏ２を加えたクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．４）を１ウェルあたり５０μｌ加え遮光し、室温１５分発色させた。その後、２Ｎ－ＨＣｌを１ウェルあたり２５μｌ加え発色反応を停止させた。その後プレートリーダーにて４９０ｎｍの吸光度を測定した。各反応間の洗浄は０．２％Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳ、１ウェルあたり２５０μｌで５回行った。
ピロリ菌ＣａｇＡのそれぞれのペプチドに対する抗体価の測定はＥＬＩＳＡによって行った。平底９６穴プレート（ＮＵＮＣ社、４７５０９４）をＥＬＩＳＡプレートとして用いた。ＥＰＩＹＡ－ＣペプチドおよびＥＰＩＹＡ－ＤペプチドをＰＢＳで１μｇ／ｍｌに調整し、１ウェルあたり５０μｌずつ分注し室温で２時間反応させて固相化した。洗浄後、１：５０に希釈したヒト血漿を１ウェルあたり５０μｌ分注し、３７℃で９０分反応させた。洗浄後、２次抗体としてビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、Ａ２４４８０）を０．２％Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳで１：４０００に希釈し、１ウェルあたり５０μｌづつ分注し、室温３０分反応させた。洗浄後、ＨＲＰ標識ストレプトアビジン（ＤＡＫＯ社、Ｐ０３９７）を０．２％Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳで１：５０００に希釈し、１ウェルあたり５０μｌづつ分注し、室温３０分反応させた。洗浄後、０．３％ｏ－フェニレンジアミン二塩酸塩、０．０４％Ｈ２Ｏ２を加えたクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．４）を１ウェルあたり５０μｌ加え遮光し、室温１５分発色させた。その後、２Ｎ－ＨＣｌを１ウェルあたり２５μｌ加え発色反応を停止させた。その後プレートリーダーにて４９０ｎｍの吸光度を測定した。各反応間の洗浄は０．２％Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳ、１ウェルあたり２５０μｌで５回行った。
【0045】
４．結果
すでにピロリ菌感染の有無が判明している、各２名の血漿サンプルを用いてＥＰＩＹＡ－ＣおよびＥＰＩＹＡ－Ｄのペプチドに対する抗体価を測定した（図１）。結果は同時に測定したＥＰＩＹＡ－ＣおよびＥＰＩＹＡ－Ｄのペプチドに対する抗体価の比を用いて解析した（図２）。ピロリ菌感染者はいずれもＥＰＩＹＡ－Ｄのペプチドに対し反応を認め、ＥＰＩＹＡ－Ｃのペプチドに対しては反応が認められなかった。ピロリ菌非感染者の２名についてはいずれのペプチドに対しても反応は認められなかった。
すでにピロリ菌感染の有無が判明している、各２名の血漿サンプルを用いてＥＰＩＹＡ－ＣおよびＥＰＩＹＡ－Ｄのペプチドに対する抗体価を測定した（図１）。結果は同時に測定したＥＰＩＹＡ－ＣおよびＥＰＩＹＡ－Ｄのペプチドに対する抗体価の比を用いて解析した（図２）。ピロリ菌感染者はいずれもＥＰＩＹＡ－Ｄのペプチドに対し反応を認め、ＥＰＩＹＡ－Ｃのペプチドに対しては反応が認められなかった。ピロリ菌非感染者の２名についてはいずれのペプチドに対しても反応は認められなかった。
【0046】
（実施例２）
実施例１と同様な方法を用いて、日本人の胃癌患者３９０名と米国人の胃癌患者３２名の血清を解析した。日本人胃癌患者の血清は、東京医科歯科大学バイオリソースセンターから入手した。米国人胃癌患者の血清は、ＢｉｏＩＶＴ社（米国）から入手した。結果を図３に示す。
実施例１と同様な方法を用いて、日本人の胃癌患者３９０名と米国人の胃癌患者３２名の血清を解析した。日本人胃癌患者の血清は、東京医科歯科大学バイオリソースセンターから入手した。米国人胃癌患者の血清は、ＢｉｏＩＶＴ社（米国）から入手した。結果を図３に示す。
【0047】
その結果、日本人胃癌患者の場合は、ＥＰＩＹＡ－Ｄのペプチドに対する抗体価がＥＰＩＹＡ－Ｃのペプチドに対する抗体価を上回っており（すなわち、ほとんどがＤ＞Ｃ）、東アジア型のピロリ菌感染が主であることが示されたのに対し、米国人胃癌患者の場合は、Ｄ＜Ｃの症例がＤ＞Ｃの症例よりも多く、ヨーロッパ型のピロリ菌感染が優勢であることが示された。これらの結果は、実施例１の結果をさらに裏付けるものであり、本解析方法の有用性を実証するものであると言える。
【0048】
（実施例３）
次に、血清測定値のＤ／Ｃ比を図４に示すように「Ａ２」、「Ａ１」、「？」、「Ｗ」の４群に層別し、各群の胃粘膜感染株をＰＣＲ法で解析した。各検体の組織サンプルは、東京医科歯科大学バイオリソースセンターから入手した。ＰＣＲプライマーとプローブは欧米株検出用にＥＰＩＹＡ－Ｃ－Ｆ（５’－ＴＣＡＧＴＴＡＧＣＣＣＴＧＡＡＣＣ－３’；配列番号３０）、ＥＰＩＹＡ－Ｃ－Ｒ（５’－ＧＣＣＣＴＡＣＣＴＴＡＣＴＧＡＧＡＴ－３’；配列番号３１）、ＥＰＩＹＡ－Ｃ－ＰＢ（５’［ＨＥＸ］－ＴＣＣＧＣＣＧＡＧＡＴＣＡＴＣＡＡＴＣＧＴＡＧＣ－［ＢＨＱ１］３’；配列番号３２）、東アジア株検出用にＥＰＩＹＡ－Ｄ－Ｆ（５－ＴＣＡＡＣＴＡＧＣＣＣＴＧＡＡＣＣ－３’；配列番号３３）、ＥＰＩＹＡ－Ｄ－Ｒ（５’－ＧＡＡＡＧＣＣＣＴＡＣＴＴＴＡＣＴＧＡＧ－３’；配列番号３４）、ＥＰＩＹＡ－Ｄ－ＰＢ（５’［ＦＡＭ］－ＡＡＧＣＣＴＧＣＴＴＧＡＴＴＴＧＣＣＴＣＡＴＣＡＡＡ－［ＢＨＱ１］３’；配列番号３５）の配列を用いた。ＰＣＲ解析の手順は以下のようにしておこなった。まず、ＰＣＲ混合液として各プライマーの最終濃度が２００ｎｍｏｌ／Ｌ、プローブが８０ｎｍｏｌ／Ｌになるように滅菌蒸留水で２倍に希釈したＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＡＢｇｅｎｅ社、英国）に加えた。さらにそこに５μｌのサンプルを加え最終５０μｌとした。その後９５℃で５分加熱し、ＰＣＲ反応を９５℃で５秒、６０℃で６０秒の設定で５０サイクル行った。解析にはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いた。結果を下記表３に示す。
次に、血清測定値のＤ／Ｃ比を図４に示すように「Ａ２」、「Ａ１」、「？」、「Ｗ」の４群に層別し、各群の胃粘膜感染株をＰＣＲ法で解析した。各検体の組織サンプルは、東京医科歯科大学バイオリソースセンターから入手した。ＰＣＲプライマーとプローブは欧米株検出用にＥＰＩＹＡ－Ｃ－Ｆ（５’－ＴＣＡＧＴＴＡＧＣＣＣＴＧＡＡＣＣ－３’；配列番号３０）、ＥＰＩＹＡ－Ｃ－Ｒ（５’－ＧＣＣＣＴＡＣＣＴＴＡＣＴＧＡＧＡＴ－３’；配列番号３１）、ＥＰＩＹＡ－Ｃ－ＰＢ（５’［ＨＥＸ］－ＴＣＣＧＣＣＧＡＧＡＴＣＡＴＣＡＡＴＣＧＴＡＧＣ－［ＢＨＱ１］３’；配列番号３２）、東アジア株検出用にＥＰＩＹＡ－Ｄ－Ｆ（５－ＴＣＡＡＣＴＡＧＣＣＣＴＧＡＡＣＣ－３’；配列番号３３）、ＥＰＩＹＡ－Ｄ－Ｒ（５’－ＧＡＡＡＧＣＣＣＴＡＣＴＴＴＡＣＴＧＡＧ－３’；配列番号３４）、ＥＰＩＹＡ－Ｄ－ＰＢ（５’［ＦＡＭ］－ＡＡＧＣＣＴＧＣＴＴＧＡＴＴＴＧＣＣＴＣＡＴＣＡＡＡ－［ＢＨＱ１］３’；配列番号３５）の配列を用いた。ＰＣＲ解析の手順は以下のようにしておこなった。まず、ＰＣＲ混合液として各プライマーの最終濃度が２００ｎｍｏｌ／Ｌ、プローブが８０ｎｍｏｌ／Ｌになるように滅菌蒸留水で２倍に希釈したＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＡＢｇｅｎｅ社、英国）に加えた。さらにそこに５μｌのサンプルを加え最終５０μｌとした。その後９５℃で５分加熱し、ＰＣＲ反応を９５℃で５秒、６０℃で６０秒の設定で５０サイクル行った。解析にはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いた。結果を下記表３に示す。
【0049】
【表3】
【0050】
表２において、一番左の列は検体の番号を示している。２番目の列は、本菌ＬＰＳに対する抗体価でピロリ菌感染の確認結果を示している。３番目の列はＥＰＩＹＡ－Ｄのペプチドに対する抗体価とＥＰＩＹＡ－Ｃのペプチドに対する抗体価の比を示している。４番目の列は、Ｄ／Ｃ比に基づく分類の判定結果を示している。５番目の列および６番目の列はそれぞれ、ＰＣＲを用いた胃粘膜感染菌株の解析結果を示している。
【0051】
結果として、本発明による血清抗体価の解析結果と内視鏡で採取した胃粘膜感染株のＰＣＲ法による解析結果が一致することが判明した。ＥＰＩＹＡで欧米株と判定されたＷ群は１例でＰＣＲ－Ｗ陽性、ＥＰＩＹＡで東アジアと判定されたＡ１群、Ａ２群はほとんどの症例でＰＣＲ－Ａ陽性となっており、ＥＰＩＹＡペプチドによる判定精度の高さが明らかとなった。これらの結果は、本解析方法の有用性および信頼性を実証するものであると言える。
【産業上の利用可能性】
【0052】
上述のとおり、本発明によれば、従来の非侵襲的方法では困難であった感染ピロリ菌株の同定が可能となる。特に、本発明に用いるＣａｇＡペプチドは、東アジア型株およびヨーロッパ型株それぞれに対する特異性が高いため、両株を正確に判別することが可能であり、胃炎・胃癌のリスクを精密に評価することができる。また、本発明の方法は、株特異的な２種類のペプチドを用いるため、従来のピロリ菌検出方法に比べて偽陽性／偽陰性判定の確率が低いという利点もある。さらに、本発明の方法は、ＰＣＲ等の遺伝子解析を用いた手法に比べて簡便であり、また、被検体の血液試料を用いるために、血清学的検査に広く応用可能である。このような特徴から、本発明の方法は、胃炎・胃癌のリスクを有する対象の評価、ピロリ菌治療後の対象の追跡調査、疫学的研究等に幅広く利用することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】